Analyse der transportgesteuerten Genregulation

Analyse der transportgesteuerten Genregulation
anhand des Mlc-PtsG Systems von
Escherichia coli
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Sabine Seitz
Universität Konstanz
mathematisch-naturwissenschaftliche Sektion
Fachbereich Biologie
Lehrstuhl für Mikrobiologie
Konstanz, April 2005
Tag der mündlichen Prüfung: 17.06.2005
1. Referent: Prof. Dr. W. Boos
2. Referentin: PD. Dr. C. Schlatterer
Danksagung
Danksagung
Herzlich bedanken möchte ich mich bei meinem Betreuer Winfried Boos. Nicht nur dafür,
dass er mir ermöglichte diese Arbeit durchzuführen, sondern auch dafür, dass ich auf meine
Art mit den Aufgaben wachsen konnte, indem er eigene Wege ebenso zuließ, so wie er stets
mit Rat und Tat zur Seite stand. Es war schön an ihrem Beispiel mitzuerleben, dass man auch
in langen Berufsjahren die Begeisterung für das Forschen nicht über die alltäglichen Dinge
verliert. Und, wenn man es auch nicht immer gerne hören wollte, Danke für die humorvolle
und direkte Art, mit der man so manches Mal einen Schubs in die richtige Richtung
bekommen hat.
Ein Danke an Michael Dahl, im Gedenken, und an Uli Dahl, im Besonderen, dafür, dass sie
mir die ersten Schritte in Konstanz um so vieles schöner und leichter gemacht haben.
Meinen Kollegen in M1040 möchte ich sagen, es ist einfach klasse eine von euch zu sein.
Danke, nicht nur für die Hilfe, die Diskussion, sondern auch für die Freundschaft, den
Einblick in ferne Kulturen, und dafür dass auch die langen Stunden im Labor mit Leben und
Freude ausgefüllt waren.
Ein herzliches „Danke Schön“ an alle in der AG Boos, mit denen ich in den vergangenen
Jahren zusammengearbeitet habe, für viele wertvolle Ratschläge, praktische Hilfe oder
einfach nur für geduldiges Zuhören.
Ein besonderes Danke geht an Angie, Tina, Pari, Stefan und Daniel. Zu sagen weshalb würde
noch mal ein Werk der Größe dieser Arbeit erfordern.
Mein Dank gilt auch allen Praktikanten und HiWis für die einerseits motivierte Unterstützung
bei den verschiedenen Projekten und die vielen erfrischenden Fragen.
Und zum Schluss möchte ich auch die nicht vergessen, die durch ihren Beitrag zum Gelingen
und zur Vollendung dieser Arbeit beitrugen wie Jacqueline Plumbridge in Paris, Ann-Katrin
Becker und Knut Jahreis in Osnabrück, Tino Pohlen und Volker Wendisch in Jülich, Uwe
Völker in Greifswald für die Zusammenarbeit, den fleißigen Korrekturlesern in der AG Boos
und Christina Schlatterer dafür, dass sie die Aufgabe der Zweitgutachterin übernommen hat.
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
I
V
VIII
Zusammenfassung
X
1. Einleitung......................................................................................................................
1
1.1 Einführung.........................................................................................................
1
1.2 Das Phosphotransferasesystem (PTS)...............................................................
2
1.2.1
Die Aufnahme von Glukose über das PTS............................................
3
1.3 Katabolitenrepression und Induktorausschluss..................................................
7
1.3.1
Glukose - vermittelte Katabolitenrepression und Induktorausschluss..
7
1.3.2
Stimulation der Adenylatcyclase-Aktivität durch EIIAGlc....................
9
1.3.3
Katabolitenrepression und Induktorausschluss durch Nicht-PTSSubstrate................................................................................................
10
1.4 Mlc.....................................................................................................................
11
1.4.1
Ein globaler Regulator zuckerverwertender Systeme...........................
11
1.4.2
Durch Mlc regulierte Gene....................................................................
13
1.4.3
Glukoseinduktion der pts Gene.............................................................
16
1.4.4
Die Inaktivierung des Repressors Mlc..................................................
17
1.5 Das Protein YeeI beeinflusst die Mlc regulierten Gene....................................
20
1.6 Zielsetzung........................................................................................................
21
2. Material und Methoden..............................................................................................
23
2.1 Abkürzungen......................................................................................................
23
2.2 Verwendete Bakterienstämme, Phagen, Plasmide und Oligonukleotide..........
24
2.3 Medien und Wachstumsbedingungen................................................................
28
2.3.1
Medien...................................................................................................
28
2.3.2
Medienzusätze und Kohlenstoffquellen................................................
29
2.3.3
Kulturbedingungen................................................................................
30
2.3.4
Zelldichtemessung.................................................................................
30
2.4 Genetische und molekularbiologische Methoden..............................................
30
2.4.1
Standardmethoden mit Nukleinsäuren..................................................
30
2.4.2
Konstruktion von Plasmiden.................................................................
31
2.4.3
Stammkonstruktionen............................................................................
31
2.4.4
Transkriptomanalyse..............................................................................
33
Inhaltsverzeichnis
2.4.4.1 Präparation von RNA aus Bakterien..........................................
33
2.4.4.2 Formaldehyd Agarose Gelelektophorese...................................
34
2.4.4.3 Chip-Herstellung........................................................................
35
2.4.4.4 Auswertung der Arraydaten.......................................................
36
EMSA – Electromobility Shift Assay…………………………………
38
2.5 Biochemische Mehtoden....................................................................................
39
2.4.5
2.5.1
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)..........................
39
2.5.2
Westernblot............................................................................................
39
2.5.3
Bestimmen der Proteinkonzentration....................................................
40
2.5.4
Bestimmen der β-Galaktosidase-Aktivität............................................
40
2.5.5
Bestimmen der Aktivität der Alkalischen Phosphatase.......................
42
2.5.6
Reinigung von Protein...........................................................................
43
2.5.6.1 Affinitätschromatographie.........................................................
43
2.5.6.2 Gelfiltration................................................................................
45
2.5.7
3.
II
Bestimmen des Polymerisierungsgrades von Mlc und YeeI mittels
Gelfiltration............................................................................................
45
2.5.8
Reinigen des Komplexes aus Mlc und IIBGlc (Koelution).....................
46
2.5.9
Bindetests zwischen Mlc und EIICBGlc (PtsG)......................................
47
2.5.10 Bindetests zwischen Mlc und YeeI (Surface Plasmone Resonace).......
49
2.5.11 Bindetests zwischen EIIAGlc und CyaA (Adenylatcyclase)..................
50
2.5.12 Zellextrakte für 2D-Gelelektrophorese..................................................
52
Ergebnisse..................................................................................................................
53
3.1 Mlc und PtsG – Analyse verschiedener Mlc- und EIIBGlc-Varianten
bezüglich ihrer Rolle bei der Bindung der Proteine und des Einflusses auf die
Mlc regulierten Gene.........................................................................................
53
3.1.1
53
3.1.2
Der C-Terminus von Mlc.......................................................................
Glc
Membranbindetests mit PtsG (EIICB ) enthaltenden Membranen
und den Mlc-Varianten..........................................................................
3.1.3
54
Membranbindetests mit unterschiedlichen IIBGlc-Varianten und
MlcWT...................................................................................................
56
3.1.4
Die Mlc-Varianten und ihr Einfluss auf die Mlc regulierten Gene.......
62
3.1.5
Die DNA-Bindung der Mlc-Varianten mit C-terminaler Deletion........
67
3.1.6
Bestimmen der Quartiärstruktur von Wildtyp Mlc und den MlcVarianten................................................................................................
69
III
Inhaltsverzeichnis
3.1.7
Koelution von MlcWT mit der löslichen B-Domäne von PtsG...........
3.1.8
Überblick zu den Untersuchungen an den Mlc- und der EIIBGlc-
78
Varianten................................................................................................
80
3.2 Bindung zwischen Mlc und YeeI.......................................................................
81
3.2.1
Bestimmen des Oligomerisierungsgrades von YeeI..............................
81
3.2.2
Oberflächenresonanzspektroskopie.......................................................
83
3.2.3
Beeinflusst YeeI die Bindung von Mlc an PtsG ?.................................
85
3.3 Einfluss von Zuckerphosphaten auf die Interaktion zwischen EIIAGlc und der
Adenylatcyclase.................................................................................................
87
Nachweis der Interaktion zwischen EIIAGlc und der Adenylatcyclase..
87
3.3.1
3.3.2
Glc
Analyse der Interaktion zwischen EIIA
und den Domänen der
Adenylatcyclase.....................................................................................
3.3.3
Nachweis der Interaktion zwischen EIIAGlc und der Adenylatcyclase
bei Zugabe von Zuckerphossphat..........................................................
3.3.4
92
96
Auswirkungen der EIIAGlc Phosphorylierung auf die Interaktion
zwischen EIIAGlc und Adenylatcyclase.................................................
3.4 Identifizieren weiterer Mlc regulierter Gene
97
98
....................................................
3.4.1
DNA-Microarray
99
...................................................................................
3.4.2
Überprüfung der Chipdaten...................................................................
3.4.3
Proteonomanalyse – Muster der in der Zelle synthetisierten Proteine
im mlc Hintergrund verglichen mit der Mlc-Überproduktion...............
4.
101
102
Diskussion.................................................................................................................. 107
4.1 Untersuchungen zur Interaktion zwischen Mlc und dem EIICBGlc (PtsG)........
107
4.1.1
Die Rolle des C-Terminus von Mlc....................................................... 107
4.1.2
Der Widerspruch: Mlc-Dimere in der Kristallstruktur und Tetramer
unter nativen Pufferbedingungen........................................................... 110
4.1.3
Die Regulation der Mlc abhängigen Gene durch unterschiedliche
Mlc-Varianten........................................................................................ 111
4.1.4
Membranassoziation ist die Voraussetzung für die Inaktivierung von
Mlc......................................................................................................... 112
4.1.5
Die Phosphorylierungsabhängige Bindung von EIIBGlc und Mlc..........
115
4.2 Die Wechselwirkung zwischen Mlc und YeeI................................................... 118
Inhaltsverzeichnis
4.3 Die Interaktion zwischen EIIAGlc und der Adenylatcyclase..............................
IV
120
4.4 Das Mlc-Regulon............................................................................................... 125
5.
Literatur..................................................................................................................... 129
6.
Anhang....................................................................................................................... 144
Abbildungsverzeichnis
V
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:
Bestandteile des PTS (Phosphotransferasesystem)...............................
3
Abbildung 2:
Glukose-PTS – Regulatorische Funktion der PTS-Komponenten........
6
Abbildung 3:
HTH-Motiv von Mlc und NagC............................................................
12
Abbildung 4:
DNA-Bindemotive von NagC und Mlc.................................................
13
Abbildung 5:
Mlc regulierte Gene...............................................................................
15
Abbildung 6:
Inaktivierung von Mlc...........................................................................
18
Abbildung 7:
Aufsicht auf die amphipatische α-Helix................................................
54
Abbildung 8:
Mlc-Varianten........................................................................................
54
Abbildung 9:
Membranbindungstest von Mlc mit PtsG enthaltenden Membranen....
55
Abbildung 10: Membranbindetests mit den Mlc-Varianten..........................................
56
Abbildung 11: Bindung von MlcWT an Gp8-IIBGlc......................................................
57
Abbildung 12: Bindung von MlcWT an die Gp8-IIBGlc Varianten unter nicht
phosphorylierenden Bedingungen.........................................................
60
Abbildung 13: Bindetests unter phosphorylierenden Bedingungen mit Membranen
aus dem Stamm IT1168 und MlcWT...................................................
61
Abbildung 14: Auswirkung von MlcWT, Mlc∆9, Mlc∆18 und Mlc110 auf die malTlacZ Expression.....................................................................................
63
Abbildung 15: Auswirkung von MlcWT, Mlc∆9 und Mlc∆18 auf die ptsG-lacZ
Expression.............................................................................................
64
Abbildung 16: Auswirkung von MlcWT, MlcH52, Mlc_AYA und Mlc_SYS auf die
ptsG-lacZ Expression............................................................................
64
Abbildung 17: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der
malT-lacZ Expression............................................................................
66
Abbildung 18: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der
ptsG-lacZ Expression............................................................................
Abbildung 19: Electromobility Shift Assay…………………………………………
66
68
Abbildung 20: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur der MlcVarianten...............................................................................................
70
Abbildung 21: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcWT und Mlc∆9,
Mlc∆18..................................................................................................
71
Abbildung 22: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in
Tris-Puffer.............................................................................................
72
VI
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 23: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in
Tris-Puffer mit ß-Mercaptoethanol.......................................................
73
Abbildung 24: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in
Glycinpuffer..........................................................................................
74
Abbildung 25: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in
Kristallisationspuffer.............................................................................
76
Abbildung 26: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcH52 in
Kristallisationspuffer.............................................................................
76
Abbildung 27: Analyse augewählter Peakfraktionen bei der Gelfiltration zur
Bestimmung des Molekulargewichtes von MlcH52.............................
Glc
Abbildung 28: Elutionsprofil der Koelution von Mlc und IIB (His6x).....................
Glc
77
79
Abbildung 29: Koelution von Mlc und IIB (His6x)...................................................
79
Abbildung 30: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur von YeeI...........
82
Abbildung 31: Bestimmen des Molekulargewichtes von YeeI.....................................
83
Abbildung 32: Oberflächenresonanzspektroskopie; Bindung von an den Chip
gebundenen Mlc mit YeeI.....................................................................
84
Abbildung 33: Bindung der Mlc-Varianten an chipgebundenes YeeI..........................
85
Abbildung 34: Membranbindetests mit Mlc, YeeI und mit PtsG angereicherten
Membranvesikeln..................................................................................
86
Abbildung 35: Überproduktion der Adenylatcyclase (CyaA).......................................
88
Abbildung 36: Bindung von EIIA an die Adenylatcyclase (CyaA)..............................
90
Abbildung 37: Bindetests zwischen Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag und
gereinigtem EIIAGlc...............................................................................
91
Abbildung 38: Bindetests zwischen den Domänen der Adenylatcyclase mit Nterminalem His-tag und gereinigtem EIIAGlc........................................
93
Abbildung 39: Wachstum der Adenylatcyclase-Varianten auf Minimalmedium mit
Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle................................................
95
Abbildung 40: Bindetests zwischen der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase
und gereinigtem EIIAGlc........................................................................
95
Abbildung 41: Einfluss von Zuckerphospat auf die Bindung zwischen der
Adenylatcyclase und EIIAGlc in Zellextrakten......................................
96
Abbildung 42: Bindetests mit (His6x)Adenylatclyse und gereinigtem nicht
phosphoryliertem EIIA..........................................................................
97
Abbildung 43: 2D-Gele des Vergleiches mlc-Mutante gegen Mlc-Überproduktion.....
104
Abbildungsverzeichnis
VII
Abbildung 44: Struktur des MlcH52 Dimer..................................................................
109
Abbildung 45: Aktivierung/Inaktivierung der Adenylatcyclase....................................
124
Tabellenverzeichnis
VIII
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Bakterienstämme.........................................................................................
24
Tabelle 2: Phagen.........................................................................................................
25
Tabelle 3: Plasmide…………………………………………………………………...
25
Tabelle 4: Oligonukleotide…………………………………………………………...
27
Tabelle 5: Medienzusätze.............................................................................................
29
Tabelle 6: Kohlenstoffquellen......................................................................................
29
Tabelle 7: Plasmide - Überproduktion von Protein......................................................
43
Tabelle 8: Plasmide für die Überproduktion von EIIBCGlc und IIB-Varianten............
48
Tabelle 9: Plasmide - Überproduktion der Adenylatcyclasevarianten für
Membranbindungstests................................................................................
51
Tabelle 11: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcWT, Mlc∆9
und Mlc∆18.................................................................................................
71
Tabelle 12: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in
Trispuffer.....................................................................................................
73
Tabelle 13: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52
inTrispuffer mit ß-Mercaptoethanol............................................................
74
Tabelle 14: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in
Glycinpuffer.................................................................................................
75
Tabelle 15: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in
Kristallisationspuffer...................................................................................
77
Tabelle 16: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von YeeI...................
81
Tabelle 17: Statistische Auswertung der DNA-Microarray-Daten................................
100
Tabelle 18: Auswertung der 2D-Gelelektrophorese. Vergleich der synthetisierten
Proteine einer mlc-Mutante mit denen bei Mlc-Überproduktion................
105
Tabelle 19: Vergleich der durch die Microarrays erhaltenen Daten, mit denen der
2D-Gelelektrophorese..................................................................................
106
Tabelle 20: Liste von Gram negativen Bakterien mit zu Mlc und YeeI ähnlichen
Proteinen......................................................................................................
118
Tabelle 21: Gemeinsamkeiten und Charakteristika der möglicherweise durch Mlc
regulierten Gene..........................................................................................
127
Tabelle 22: Normalisierte Ratio of Median – WT gegen mlc – Teil 1...........................
144
Tabelle 23: Normalisierte Ratio of Median – WT gegen mlc – Teil 2...........................
146
Tabellenverzeichnis
IX
Tabelle 24: Normalisierte Ratio of Median – mlc gegen Mlc-Überproduktion –
Teil 1............................................................................................................
149
Tabelle 25: Normalisierte Ratio of Median – mlc gegen Mlc-Überproduktion –
Teil 2............................................................................................................
150
X
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mlc, von Escherichia coli, ist ein globaler, transkriptioneller Regulator, der die Expression
verschiedener Systeme zur Aufnahme und Verwertung von Kohlenstoffen repremiert. Die
Mlc regulierten Gene werden andererseits durch den cAMP/CAP Komplex aktiviert. Unter
den durch Mlc repremierten Genen befinden sich solche, deren Genprodukte Komponenten
des PEP abhängigen Phosphotransferasesystems (PTS) darstellen. Die PTS-Komponenten
selbst haben ebenfalls regulatorische Funktion. So beeinflusst das EIIAGlc die Aktivität des
Enzyms Adenylatcyclase, welches cAMP aus ATP bildet. Mlc selbst wird durch Bindung an
PtsG, dem Glukose spezifischen EIICB, inaktiviert. Mlc wird an dephosphoryliertes PtsG
gebunden wie man es bei aktiven Transport von Glukose vorfindet. So ist die Bildung des
Aktivators cAMP/CAP und die Aktivität des Repressors Mlc im Mlc-PtsG-System in
Abhängigkeit von dem Transport von Glukose über PtsG reguliert.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass für die Bindung von Mlc an PtsG, die lösliche,
cytoplasmatische B-Domäne von PtsG ausreicht, auch wenn diese unabhängig vom Rest des
Proteins als separates Polypeptid exprimiert wird. Jedoch nur, wenn die B-Domäne mittels
eines Membranankers membrangebunden ist und der Repressor Mlc dadurch an der Membran
fixiert wird, wird zusätzlich eine Derepression der Mlc-regulierten Gene erreicht. Dabei kann
IIBGlc an ein Membranprotein fusioniert sein, das keine Ähnlichkeit zur C-Domäne von PtsG
hat. Gezeigt wurde zudem, dass Mlc an Bereiche der B-Domäne bindet, die mit der
Bindestelle
des
EIIAGlc
überlappen
und
die
sich
in
unmittelbarer
Nähe
der
Phosphorylierungsstelle der B-Domäne, dem Cystein 421, befinden. Das auch an der
Stabilisierung der Phosphatbindung beteiligte Arg424 von PtsG ist für die Mlc-Bindung
unbedingt erforderlich.
Die Bestimmung des Molekulargewichtes von Mlc ergab, dass das Protein unter nativen
Bedingungen als Tetramer vorliegt. Die C-terminalen 18 Aminosäuren von Mlc bilden
möglicherweise eine amphipatische α-Helix. Die hier durchgeführten Experimente ergaben,
dass die Helix eine wichtige Funktion bei der Ausbildung der korrekten Tertiär und
Quartiärstruktur des Proteins hat. Eine um die 18 Aminosäuren verkürzte Mlc-Variante
bildete unter nativen Bedingungen lediglich ein Dimer und hatte die Fähigkeit verloren an
PtsG oder an die DNA zu binden.
Zusammenfassung
XI
In weiteren Bindetests wurde bewiesen, dass Mlc neben PtsG auch an YeeI bindet. YeeI ist
ein lösliches Protein, dass bei Überproduktion die Expression der Mlc regulierten Gene
positiv beeinflusst. Für YeeI konnte unter nativen Bedingungen die Bildung eines Dimers
nachgewiesen werden. In den in vitro Bindetests konnte die Mlc-PtsG-Bindung auch nicht
durch Zugabe eines Überschusses an YeeI gelöst werden.
Ebenfalls wurde eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen der Adenylatcyclase und
dem EIIAGlc nachgewiesen. Entgegen dem vorherrschenden Modell, das die Bindung von
phosphoryliertem EIIAGlc propagierte, erfolgte die Bindung von dephosphoryliertem EIIAGlc.
Eine Bindung von phosphoryliertem EIIAGlc konnte weder bewiesen noch ausgeschlossen
werden. Für die Bindung von EIIAGlc ist die N-terminale katalytische Domäne der
Adenylatcyclase ausreichend.
Eine genomweite Suche nach weiteren Mlc regulierten Genen wurde mit Hilfe von DNAMicroarrays durchgeführt. Durch die nachfolgende Analyse der erhaltenen Daten mittels
transkriptioneller Reportergenfusionen, konnten einige der falsch positiven Ergebnisse
ausgeschlossen werden, aber keine weiteren Zielgene der Mlc-Regulation ermittelt werden.
1
1. Einleitung
1. Einleitung
1.1 Einführung
Escherichia coli, ein Gram-negatives, stäbchenförmiges, fakultativ anaerobes Eubakterium
zeichnet sich durch eine große Variabilität seiner Lebensräume aus. Es kann neben seinem
normalen Lebensraum im Darm von Mensch und Tier auch in deren Umgebung überleben.
Optimale Wachstumsbedingungen im Labor, die sich im schnellen Wachstum wiederspiegeln,
sollten in den natürlichen Ökosystemen kaum vorkommen. Hier herrschen Mangel
(Nährstoffe, Phosphat-, Stickstoffquellen, usw.) und Stress (O2, pH, Temperatur, osmotischer
Druck, usw.) vor (59, 69).
Das wiederum erfordert eine fein abgestimmte, koordinierte Kontrolle sämtlicher zellulärer
Vorgänge um die Anpassung an diese veränderlichen Umweltbedingungen zu erreichen und
im Konkurrenzkampf mit anderen Organismen zu bestehen. Komplexe regulatorische
Netzwerke bewirken, dass nur der Teil an zellulären Systemen gebildet wird oder aktiv ist,
der eine Anpassung an die jeweilige Lebenssituation erlaubt. Beispielhaft ist die Fähigkeit
von Bakterien ein energetisch hochwertigeres Substrat unter anderen zu erkennen, sich
daraufhin zuzubewegen und Systeme für den Transport und Metabolismus der vorhandenen
Substrate einer Hierarchie entsprechend zu exprimieren und aktivieren. Glukose stellt für E.
coli eine der bevorzugten Kohlenstoffquellen dar, da sie gekoppelt an den Transport in die
Zelle über ein von Phosphoenolpyruvat abhängiges Phosphotransferasesystem (PTS) zu
Glukose-6-Phosphat
phosphoryliert
wird
und
ohne
weitere
Modifizierungen
in
Stoffwechselwege wie beispielsweise der Glykolyse eingehen kann. Die Expression des PTS
wird abhängig von der Verfügbarkeit des Substrates durch unterschiedliche Mechanismen
reguliert, während wiederum die Proteine selbst die Aktivität anderer Systeme beeinflussen
(42, 99). Einen Teil dieses umfangreichen regulatorischen Netzwerkes stellt das Mlc-PtsGSystem dar.
Mlc als globaler Regulator bewirkt eine koordinierte Kontrolle von Genen, die für PTSKomponenten kodieren. Diese Kontrolle erfolgt selbstreguliert, da die Aktivität von Mlc
durch den Transport von Glukose über das Glukose-spezifische EIICBGlc(PtsG) reguliert wird
(119). Im folgenden werden die an diesem regulatorischen Netzwerk beteiligten
Komponenten beschrieben.
2
1. Einleitung
1.2 Das Phosphotransferasesystem (PTS)
Das PTS zeichnet sich dadurch aus, dass durch den Mechanismus der Gruppenübertragung,
ein Phosphatrest, ausgehend von PEP (Phosphoenolpyruvat), in unmittelbare Nähe einer
Permease übertragen wird. Ermöglicht wird dies durch die Phosphorylierung und
Dephosphorylierung verschiedener allgemeiner oder Substrat spezifischer Proteine. Das
aufgenommene Substrat kann gekoppelt an den Transport phosphoryliert und somit
energetisiert werden. (124, 136)
Die allgemeinen und löslichen Komponenten des PTS sind HPr (heatstable oder Histidin
carrying protein, ptsH) und EI (EnzymI, ptsI), welche von allen Substrat spezifischen PTSKomponenten in E. coli genutzt werden (siehe Abb.1). Eine Ausnahme bildet das FruktosePTS, dass ein HPr ähnliches Protein beinhaltet, welches bei konstitutiver Expression HPr
funktionell komplementieren kann (46). EI wird am Histidin-189 durch PEP phosphoryliert.
Voraussetzung für die Phophorylierbarkeit von EI ist die Dimerisierung des Proteins und das
Vorhandensein zweiwertiger Kationen. Das phosphorylierte Dimer zerfällt in Monomere,
welche dann HPr an dessen in Position 15 befindlichen Histidin phosphorylieren. Ein
limitierender
Schritt
der
Phosphorylierungskaskade
ist
die
Reassoziation
der
dephosphorylierten Monomere (166, 168, 169). HPr überträgt das Phosphat auf die EIIA der
Zucker spezifischen Transportkomplexe (siehe Abb. 1).
Die Zucker spezifischen Transportkomplexe, auch EII (EnzymII) genannt, bestehen aus drei
bis vier funktionellen Komponenten, bezeichnet mit IIA, IIB, IIC und gelegentlich IID. Sie
sind entweder einzelne Proteine und dann als Untereinheiten eines Komplexes anzusehen,
oder Teil eines aus mehreren Domänen bestehenden Proteins. Die Domänen sind dann durch
flexible Linker miteinander verbunden. EIIA und EIIB sind hydrophile Proteine oder
Domänen. EIIC und D sind Membranproteine (siehe Abb. 1).
Aufgrund der Verteilung der Domänen auf ein oder mehrere Proteine und der Anordnung der
Domänen innerhalb der Proteine wurden für E. coli und S. typhimurium mehrere PTSFamilien definiert. Funktionelle Komplementation zwischen Domänen der gleichen Familie
ist möglich, nicht aber zwischen den Familien (124, 136, 145).
1. Einleitung
3
Abb. 1: Bestandteile des PTS (Phosphotransferase System)
Phosphatgruppenübertrag von PEP über die allgemeinen, löslichen PTS-Komponenten EI und HPr auf die
zuckerspezifischen EII. Beispielhaft dargestellt sind die EII zur Aufnahme von Mannose, Glukose und N-AcetylGlukosamin mit unterschiedlicher Anzahl 3-4 und unterschiedlicher Verbindung der Komponenten als Domänen
von einem oder zweier Proteine. Die Dimerisierung von EI ist eine Voraussetzung für dessen
Phophorylierbarkeit. Die Phosphorylierung/Dephosphorylierung der PTS-Komponenten ist reversibel.
1.2.1 Die Aufnahme von Glukose über das PTS
Das Glukose-spezifische PTS gehört zur Glukose-Sucrose Familie. Bei all diesen PTS sind
IIC und IIB Domänen eines Proteins. EIIA liegt frei (Glukose) oder gebunden vor
(EIICBANag, N-Acetyl-Glukosamin). Verschiedene Systeme haben kein eigenes EIIA und
nutzen das des Glukose-PTS. Die Phosphorylierung der aufgenommenen Zucker erfolgt am
C-6 des Glukopyranosidringes (124, 133). Glukose wird transportiert und über eine Kaskade
von Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen der PTS-Komponenten von PEP
ausgehend phosphoryliert (siehe Abb. 2). Das EIIAGlc wird dabei durch die allgemeine
Komponente HPr am Histidin 90 phosphoryliert (35, 126). EIIAGlc wiederum überträgt das
Phosphat auf ein Cystein (Cys 421) in der B-Domäne von EIICBGlc(ptsG) (91). Die über IIC
aufgenommene Glukose wird schließlich ausgehend von IIB phosphoryliert (siehe Abb. 2).
4
1. Einleitung
Die pts-Gene werden abhängig vom Substratvorkommen, Metabolismus, Stressfaktoren und
vom Redox-Zustand der Zelle durch unterschiedliche Mechanismen reguliert. Sowohl die
Transkription des Operons ptsHIcrr (HPr, EI, EIIAGlc), als auch die von ptsG (EIICBGlc) wird
negativ durch Mlc und positiv durch den cAMP/CAP Komplex reguliert (115, 116).
Daneben beeinflussen weitere Regulatoren die Transkription der pts-Gene. So werden die ptsGene als Teil des Hitzeschockregulons, vermittelt durch den alternativen Sigmafaktor σ32, bei
Hitzestress vermehrt expremiert (144). Auch FruR (oder Cra: catabolite repressor activator),
der Repressor des Fruktose-spezifischen PTS, repremiert neben Genen der Glykolyse zudem
schwach
ptsH
(119).
Am
ausgeprägtesten
jedoch
zeigen
sich
die
vielfältigen
Regulationsmechanismen bei der Kontolle der ptsG Transkription. ArcA bindet bei
Veränderungen des Redoxzustandes der Zelle (70) an die ptsG Promotoren und das Nukleoid
assoziierte Protein Fis verstärkt sowohl die Repression durch Mlc als auch die Aktivierung
durch cAMP/CAP (143).
Neben der Regulation auf Ebene der Transkription wird ptsG zusätzlich posttranskriptionell
reguliert. Die Anhäufung von Zuckerphosphaten, sei es durch Blockieren der Glykolyse oder
durch Zugabe eines nicht abbaubaren Substratanalogons, bewirkt einen schnellen Abbau der
ptsG mRNA durch einen RNaseE abhängigen Prozess. So könnte die Anhäufung von
Zuckerphosphaten darauf hinweisen, dass der Abbau des Substrates langsamer abläuft als
dessen Aufnahme. Durch den Abbau der ptsG mRNA könnte verhindert werden, dass durch
die nachfolgende Translation noch mehr Transporter gebildet wird, der die Transportrate
zusätzlich erhöhen würde (73, 76, 96, 163).
Allein durch das Zusammenspiel dieser Regulatoren bei der Expression der pts-Gene, ist das
Glukose-PTS in diverse regulatorische Netzwerke eingebunden, die eine Anpassung an
verschiedenste Umweltfaktoren erlauben. Dieses Bild erweitert sich um ein Vielfaches, wenn
man die regulatorischen Funktionen mit einbezieht, die die PTS-Proteine selbst ausüben.
Bedingt durch die zuckerabhängige Dephosphorylierung beziehungsweise der PEP
abhängigen Phosphorylierung, liegen die PTS-Proteine entweder vermehrt in ihrer
dephosphorylierten oder vorwiegend in der phosphorylierten Form vor. Eine merkbare
zuckerabhängige Dephosphorylierung der PTS-Komponenten erfolgt letztendlich dadurch,
dass, wie zuvor beschrieben, die Dimerisierung der Komponente EI eine Voraussetzung für
5
1. Einleitung
deren Phosphorylierbarkeit und somit der Geschwindigkeitsbestimmende Schritt der
Phosphorylierungskaskade ist.
Auf diese Weise nehmen das nicht phosphorylierte EI und PEP über CheA Einfluss auf die
Chemotaxis (88, 124). Phosphoryliertes EI dagegen kann das Phosphat auf die Acetatkinase
übertragen. Dies könnte eine Verbindung zwischen PTS und dem TCA (Tricarbonsäure)Zyklus darstellen (45). Das Protein HPr kann den Antiterminator BglG des bglGFB Operons
phosphorylieren
(49).
Zusätzlich
vermittelt
HPr,
durch
Interaktion
mit
der
Glykogenphosphorylase, möglicherweise eine Abstimmung zwischen der Substrataufnahme
und dem Aufbau des Kohlehydratspeichers (142).
Die Bindung von nicht phophoryliertem EIIAGlc an FrsA (fermentation/respiration switch)
beeinflusst die Rate von oxidativen Abbau und Vergärung der Glukose (79).
Dephophoryliertes EIIAGlc verursacht außerdem Induktorausschluss (siehe Kap. 1.3.1),
während EIIAGlc-Phosphat durch Aktivierung der Adenylatcyclase die Bildung des Aktivators
cAMP/CAP steigert, wodurch die Transkription der pts-Gene selbst und die anderer Gene
aktiviert wird (siehe Kap1.3.1).
Letztendlich hat auch der Transportkomplex (EIICBGlc = PtsG) an sich positive Auswirkung
auf die Expression der pts-Gene und die weiterer Transportsysteme, da der globale Regulator
Mlc durch nicht phosphoryliertes PtsG inaktiviert wird (siehe Kap. 1.4).
1. Einleitung
6
Abb. 2: Glukose-PTS – Regulatorische Funktion der PTS-Komponenten
Überblick über die am Transport von Glukose beteiligten PTS-Proteine (gelb) und die
Phosphorylierungsreaktionen ausgehend von PEP über EI, HPr, EIIA auf EIIB. Phosphat wird von EIIB auf die
transportierte Glukose übertragen. Der Regulator Mlc (orange) bindet an dephosphoryliertes EIICB.
Dephosphoryliertes EIIAGlc bindet an LacY, MalK und GlpK. Positive und negative Einflüsse der PTS-Proteine
auf andere Transportsysteme und Enzyme (türkis) werden mit (+) und (-) dargestellt. (P) kennzeichnet die
Phosphorylierung eines Proteins.
7
1. Einleitung
1.3 Katabolitenrepression und Induktorausschluss
Katabolitenrepression ist ein Mechanismus, bei dem die Transkription von Genen kataboler
Systeme durch die Aufnahme und Verwertung einer bevorzugten Kohlenstoffquelle gehemmt
wird. In E. coli beruht dies auf der fehlenden Aktivierung cAMP/CAP abhängig
transkribierter Gene. Die direkte Bindung von dephosphoryliertem EIIAGlc an Permeasen oder
Enzyme verschiedener kataboler Systeme, verhindert die Aufnahme oder die Bildung des
Induktors dieser Systeme und wird als Induktorausschluss bezeichnet.(137)
Da beide Mechanismen von dem Transport von Glukose über das EIICBGlc (PtsG) abhängig
sein können und der cAMP/CAP Komplex der Aktivator der Mlc regulierten Gene ist, sind
auch
die
Katabolitenrepression
und
der
Induktorausschluss
als
Parameter
der
transportgesteuerten Genregulation im Mlc-PtsG System mit einzubeziehen.
1.3.1 Glukose - vermittelte Katabolitenrepression und Induktorausschluss
Glukose und andere PTS-Zucker werden im Anschluss an den Transport mit einer
energiereichen Phosphatgruppe versehen. Derartige Kohlenstoffquellen werden von E. coli
präferenziell aufgenommen und inhibieren den Transport und die Verwertung anderer (42,
137).
Der Transport von Glukose über das PTS bewirkt, wie zuvor beschrieben, dass die PTSProteine vorwiegend in ihrer dephosphorylierten Form vorliegen. Dephosphoryliertes EIIAGlc
hemmt die Aufnahme oder die Bildung des Induktors anderer kataboler Systeme (siehe
Abb.2), indem es direkt an Permeasen oder Enzyme dieser Systeme bindet. Die Bindung
erfolgt jedoch nur in Anwesenheit des Substrates des jeweiligen Systemes. Vermutlich
bewirkt die Substratbindung eine Änderung der Konformation der betroffenen Proteine,
welche die EIIAGlc Bindung ermöglicht. Auf diese Weise wird verhindert, dass EIIAGlc
austitriert wird, wenn die Substrate dieser Systeme nicht vorhanden sind und diese Regulation
unnötig ist. Dieser Mechanismus wird als Induktorausschluss bezeichnet (124).
1. Einleitung
8
Beispielsweise bindet EIIAGlc an LacY, die Laktosepermease, und verhindert den Transport
von Laktose, bei gleichzeitiger Anwesenheit von Glukose im Medium (101, 107, 108, 149).
Induktorausschluss ist der maßgebliche Mechanismus der die Glukose-Laktose-Diauxie
bedingt. Ein weiteres Beispiel ist die Bindung von EIIAGlc an die ATPase MalK, die Teil des
Maltose/Maltodextrin ABC(ATP-binding-cassette)-Transportsystemes ist (33, 81). Im Falle
der Bindung von EIIAGlc an GlpK (Glycerinkinase) wird die Bildung des Inuktors Glycerin-3Phosphat aus Glycerin blockiert (67, 123).
Andererseits wird die Adenylatcyclase, welche die Bildung von cAMP aus ATP katalysiert,
unter Bedingungen aktiviert unter denen EIIAGlc phosphoryliert ist (siehe Kap. 1.3.2). cAMP
wird durch CAP (catabolite activator protein; crp) gebunden. Die daraus resultierende
Konformationsänderung ermöglicht es dem Regulator spezifisch an DNA-Sequenzen, den
CAP-Boxen, zu binden (90, 167). Die Ähnlichkeit der Sequenzen der CAP-Boxen zu einem
22 bp langen, palindromen Konsensusmotiv (5’-AAATGTGATCT+AGATCACATTT3’)(10), die Lage der CAP-Boxen bezüglich des Transkriptionsstartes oder kooperative
Bindung mit weiteren transkriptionellen Regulatoren, bewirkt eine unterschiedliche Affinität
des cAMP-CAP-Komplexes zu den Operatoren. Dies geht einher mit einer unterschiedlich
starken Beeinflussung der Transkription an den Promotoren der katabolitsensitiven Gene.
Daraus ergibt sich zudem, ob cAMP/CAP als positiver oder negativer Regulator wirkt.(2, 3,
23, 24, 78)
Unter Bedingungen, unter denen EIIAGlc hauptsächlich dephosphoryliert vorliegt, wie etwa
bei dem Transport von Glukose, erfolgt keine Aktivierung der Adenylatcyclase. Der niedrige
cAMP und cAMP/CAP Spiegel reicht nicht aus um die meisten der cAMP/CAP abhängigen
Gene zu aktivieren.
Unter diesen Genen sind solche, die für Proteine kodieren, die für den
Transport und den Abbau alternativer Kohlenstoffquellen gebraucht werden. Dieser Effekt
wird als Katabolitenrepression bezeichnet.
9
1. Einleitung
1.3.2 Stimulation der Adenylatcyclase-Aktivität durch EIIAGlc
Die Adenylatcyclase (cyaA) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 95 kDa, das aus
zwei Domänen besteht, einer N-terminalen katalytischen- und einer C-terminalen
regulatorischen Domäne. Ein Modell, entwickelt aus genetischen Untersuchungen, besagt,
dass die regulatorische Domäne die Aktivität der katalytischen Domäne hemmt (63, 135).
Der Phosphorylierungszustand der PTS-Proteine ist ausschlaggebend für die Regulation der
Aktivität der Adenylatcyclase. Ein niedriger cAMP Spiegel findet sich in Zellen mit
verringerter
Phosphorylierung
der
PTS-Proteine.
Entweder
verursacht
durch
eine
Unterbrechung der Phosphorylierungskaskade mittels Mutation von ptsH, ptsI (78, 124) oder
crr (44, 100) oder durch den Transport von Glukose. Ein vergleichbarer Effekt wird durch
eine Mutation in EIIAGlc erreicht, die dessen Phosphorylierung verhindert, oder bei einer
Insertion in cyaA (58). Nur unter Bedingungen, unter denen EIIAGlc überwiegend
phosphoryliert vorliegt, erfolgt eine Aufhebung des inhibitorischen Effektes der
regulatorischen Domäne und damit ein Anstieg des cAMP-Spiegels in der Zelle (113).
Dass die C-terminale regulatorische Domäne der Adenylatcyclase für diesen Prozess von
Bedeutung ist, zeigt sich darin, dass bei Mutanten, denen die regulatorische Domäne fehlt, die
Aktivität
der
Adenylatcyclase
konstitutiv
vorhanden
ist
und
nicht
mehr
durch
Glukoseaufnahme oder crr-Deletion inhibiert wird (113, 135). Bislang ist nicht bekannt, ob
die negative Ladung von EIIAGlc-P (P: Phosphat) (130) oder eine direkte Interaktion zwischen
EIIAGlc und der Adenylatcyclase oder beides die Aktivierung der Adenylatcyclase bewirken.
Man weiß ebenfalls wenig darüber, inwieweit weitere Faktoren daran beteiligt sind. So wurde
diskutiert, ob auch eine Phosphorylierung der Adenylatcyclase durch EIIAGlc-P möglich ist,
da sich um das Histidin-609 der Adenylatcyclase eine potentielle Phosphorylierungsstelle
befindet (31). Auch das CAP-Protein ist an der Regulation der Adenylatcyclase-Aktivität
beteiligt. Mutanten ohne CAP-Protein produzieren große Mengen an cAMP. Die gesteigerte
Produktion ist abhängig von EIIAGlc, da sie bei zusätzlicher crr-Mutation unterbleibt (31, 68,
125, 155). Weitere Faktoren, die bekanntermaßen die Aktivität der Adenylatcyclase positiv
beeinflussen, sind das Vorkommen von anorganischem Phosphat (Pi) (5) und die
Verfügbarkeit von ATP (131).
10
1. Einleitung
1.3.3 Katabolitenrepression und Induktorausschluss durch Nicht-PTSSubstrate
Auch die Nutzung von Nicht-PTS-Substraten ist aufeinander abgestimmt reguliert. Ebenfalls
werden schneller verwertbare Substrate bevorzugt genutzt und inhibieren die Expression und
Aktivität weiterer kataboler Systeme. Nicht-PTS-Substrate, wie Glukose-6-P, Glukonat,
Laktose,
Glycerin,
Glycerin-3-P
bewirken
im
unterschiedlichen
Ausmaß
Katabolitenrepression (62). Im Falle von Glukose-6-P entspricht die Reduktion von cAMP
und die Dephosphorylierung von EIIAGlc der bei Transport von Glukose herbeigeführten (61).
Durch die Bestimmung der Aktivität von chromosomal kodierter ß-Galaktosidase (LacZ), die
im Operon lacZYA cAMP/CAP abhängig exprimiert wird, sieht man, dass die
Katabolitenrepression durch Glukose-6-P nicht von EIIAGlc abhängig ist. Sie ist aber abhängig
von cAMP/CAP. Die Expression von lacZ mit veränderter Promotorsequenz erfolgt
unabhängig von der Aktivierung durch cAMP/CAP. In diesem Stamm bewirkt Glukose-6-P
nur eine geringe Repression von lacZ. Sowohl die CAP, als auch die cAMP Konzentration
wird
durch
Glukose-6-P
erniedrigt.
Letzteres
bedingt
durch
eine
verringerte
Adenylatcyclaseaktivität (62). Es wird postuliert, dass die cAMP-Konzentration mit der
Transportaktivität korreliert, da der Transport des nicht abbaubaren 2-Deoxy-Glukose-6-P
eine Abnahme der Adenylatcyclaseaktivität zur Folge hat (36). Die fehlende Aktivierung der
Adenylatcyclase, verbunden mit einer niedrigen Konzentration des cAMP/CAP-Komplexes,
ist auch hier der Mechanismus der Katabolitenrepression.
Auch im Falle von Glukose-6-P wird die Inhibierung anderer Zucker verwertender Systeme
durch Induktorausschluss mittels dephosphoryliertem EIIAGlc erreicht. Anders als bei Glukose
bewirkt der Transport von Glukose-6-P keine Veränderung im Verhältnis von
phosphoryliertem zu nicht phosphoryliertem EIIAGlc. Es wird jedoch vermutet, dass der
weitere Stoffwechsel über die Glykolyse das PEP zu Pyruvat Verhältnis verändert, welches
dann zu einer verringerten Phosphorylierung der PTS-Proteine führt (61).
Im Gegensatz dazu kommt es bei der Aufnahme von Glycerin und Glycerin-3-P zu keiner
wesentlichen Dephosphorylierung von EIIAGlc (39, 61). Untersuchungen zum mal-Regulon
zeigen aber, dass die Expression dieser Gene bei Wachstum auf den beiden
Kohlenstoffquellen sehr wohl repremiert wird. Verursacht wird diese Repression durch das
Auftreten von Glycerin-3-P. Die Produkte weiterer Stoffwechselschritte sind dafür nicht
nötig. Untersuchungen mit transkriptionellen und translationellen Reportergenfusionen zu
11
1. Einleitung
malT, dessen Genprodukt MalT der transkriptonelle Aktivator der mal-Gene ist, weisen auf
die Möglichkeit hin, dass zwei unterschiedliche Mechanismen diese Repression bewirken.
Einer betrifft die Transkription und ist abhängig von cAMP/CAP und EIIAGlc, während ein
posttranskriptioneller Mechanismus von cAMP/CAP und EIIAGlc unabhängig ist. Weitere
Experimente führten zu einem Modell, nach dem das Signal für die Anwesenheit eines NichtPTS-Substrates das daraus resultierende Zuckerphosphat ist. EIIAGlc ist der Rezeptor für
dieses Signal und wird direkt oder indirekt daran gehindert die Adenylatcyclase zu aktivieren.
Dies bewirkt wie bereits zuvor erläutert Katabolitenrepression. Die translationale Regulation
geschieht vermutlich in Folge einer pH-Wert Erniedrigung in Kulturen, denen eine
Kohlenstoffquelle im Überschuss zur Verfügung steht. Der weitere Mechanismus ist bislang
nicht aufgeklärt.(39-41)
1.4 Mlc
1.4.1 Ein globaler Regulator zuckerverwertender Systeme
Mlc (making large colonies)
wird durch ein offenes Leserater bei 35,9 min des E.coli
Chromosoms kodiert. In seiner Rolle als Regulator für Systeme zur Aufnahme und
Verwertung von diversen Kohlenstoffquellen wurde es auf unterschiedlichen Wegen entdeckt,
was sich auch in einer unterschiedlichen Namensgebung wiederspiegelt. So wurde es
zunächst bei der Untersuchung von E. coli Stämmen mit einer ptsG-Mutation (EIICBGlc) und
einer Suppressormutation entdeckt. Unter anaeroben Bedingungen nehmen diese Mutanten
Glukose und das Substratanalogon 2-Deoxyglukose über die Mannose spezifischen EII auf.
Das Gen, in dem sich die Suppressormutation befindet wird dgsA (deoxy-glucose-sensitive)
genannt (134). Davon unabhängig entdeckte man es, als man das Wachstum von E. coli auf
Vollmedium mit Glukose optimieren wollte. Die Überexpression eines unbekannten Genes,
später mlc genannt, bewirkte eine langsame Verwertung der Glukose und verhinderte die
dabei auftretende Akkumulierung von Acetat. Im Vergleich zu Wildtypzellen bilden Zellen,
die plasmidkodiertes Mlc überproduzieren große Kolonien
identisch.
(66). Mlc und DgsA sind
1. Einleitung
12
Mlc ist der ROK (repressor, open reading frame, kinases)-Familie zugeordnet. Darin sind drei
Klassen von Proteinen zusammengefasst (57, 159). Eine Klasse (O), die durch bislang nicht
charakterisierte offene Leseraster kodiert ist, eine Klasse (R) von transkriptionellen
Repressoren und eine (K), in der Fruktose- oder Glukose-Kinasen zusammengefasst sind.
Letzteren fehlen im Vergleich zu den Repressorproteinen 100 Aminosäuren am N-Terminus,
welche bei den Regulatoren das HTH (helix-turn-helix)-Motiv, die DNA-Bindedomäne,
enthalten. Mlc und der ebenfalls zur ROK-Familie gehörende Regulator NagC weisen 40%
Identidät und 80% Ähnlichkeit zueinander auf (34, 118). NagC ist der transkriptionelle
Repressor der N-Acetyl-Glucosamin (GlcNAc) spezifischen EII und von Enzymen des
GlcNAc-Abbaus. Am markantesten ist diese Übereinstimmung zu Mlc auf Proteinebene
bezüglich des HTH-Motives. Die Aminosäuresequenz der Erkennungshelix (Helix 2) des
HTH-Motivs von Mlc und NagC ist nahezu identisch (siehe Abb.3).
Abb.3:HTH-Motiv von Mlc und NagC.
Vergleich des N-terminalen DNA-Bindemotivs von NagC (AS: 33-56) und Mlc (AS: 31-54) mit Helix 1 und der
Erkennungshelix 2.
Beide Regulatorproteine erkennen nahezu identische Operatoren. Um eine zentrale Position 0
führt die Anordnung GCGC an Position –4 bis –1/+1 bis +4 zu einer erhöhten Bindung an den
Operator. Aber auch bei Abweichungen dazu ist der Abstand von 9 Basenpaaren zwischen
den absolut konservierten Basen TT bei –5/-6 und AA bei +5/+6 unbedingt erforderlich. An
Position –7 bis –10/+7 bis +10 befinden sich ausschließlich die Basen T oder A. Einziger
Sequenzunterschied zwischen einem Mlc und einem NagC Operator sind die Basen G oder C
an Position –11/+11 bei NagC bzw. A/T bei Mlc. Beide Proteine binden in vitro mit
unterschiedlicher Affinität an die Bindestellen des jeweils anderen, wobei unter
1. Einleitung
13
physiologischen Regulatorkonzentrationen in vivo keine übergreifende Regulation beobachtet
werden kann (118).
Abb.4: DNA-Bindemotive von NagC und Mlc
Auswahl von DNA-Bindestellen von NagC bzw. Mlc regulierten Genen: S steht für die Basen
Guanin/Cytosin (G/C), W für die Basen Adenin/Thymin (A/T), N für A, T, C, oder G;
1.4.2 Durch Mlc regulierte Gene
Mlc repremiert die Transkription des Operons ptsHIcrr, das für HPr und EI, den allgemeinen
PTS-Komponenten, und das EIIAGlc kodiert (74, 116). Ebenfalls reguliert durch Mlc ist ptsG,
das für das EIICBGlc kodiert (75, 115) und das Operon manXYZ (114), das die Mannose
spezifischen PTS-Komponenten kodiert. Des weiteren repremiert Mlc die Expression von
malT, das für den Aktivator der mal-Gene kodiert. Über letzteren beeinflusst Mlc die
Expression sämtlicher MalT regulierten Gene. Mlc selbst ist schwach autoreguliert (34). Der
mlc p2 Promotor (siehe Abb. 5) wird sowohl durch den Sigmafaktor σ70, als auch durch σ32
erkannt, wodurch die mlc Transkription als ein Teil des Hitzeschockregulons bei erhöhter
Temperatur gesteigert wird (144).
14
1. Einleitung
Der Vergleich der regulatorisch wichtigen DNA-Regionen von Mlc und NagC regulierten
Genen zeigt, dass die NagC-Bindestelle bevorzugt die –35 Region ersetzt, und dass bei der
Regulation eine Schleifenbildung der DNA und somit die kooperative Bindung von zwei
NagC-Bindestellen erforderlich ist. Mlc Bindestellen findet man meist überlappend mit oder
in unmittelbarer Nähe des Transkriptionsstarts. Eine Bindestelle scheint für den
repressorischen Effekt ausreichend. Auch wenn man bei ptsG (sowohl bei Promotor p1, als
auch bei p2) zwei Bindestellen findet, konnte eine kooperative Bindung nicht nachgewiesen
werden (siehe Abb. 5).
Alle Mlc regulierten Gene werden durch die Überproduktion von Mlc stark repremiert. Die
Expression der Gene ist unter dieser Bedingung nahezu nicht mehr detektierbar. Dies zeigt
auch, dass Mlc unter physiologischen Bedingungen limitiert ist und die vorhandenen
Bindestellen möglicherweise nur partiell besetzt sind. Dennoch zeigen sich Unterschiede in
der Regulation der Gene, die mit der unterschiedlichen Affinität des negativen Regulators
Mlc und des Aktivatorkomplexes cAMP/CAP zu den jeweiligen Bindestellen zu erklären sind
(34, 74, 75, 114-116).
Mlc beeinflußt die Expression der man-Gene, von malT und mlc in vergleichbarer Weise. Bei
Wachstum auf Glycerin führt die Deletion von mlc zu einer um das 2 – 5 fach gesteigerten
Expression dieser Gene. Das Wachstum eines mlc+ aber auch eines mlc Stammes auf Glukose
resultiert in einer merkbaren aber erniedrigten Expression der oben genannten Gene. Das ist
bedingt durch die fehlende Aktivierung durch den bei Wachstum auf Glukose niedrigen
cAMP/CAP Spiegel. Die Expression beispielsweise der man-Gene lässt sich bei Wachstum
auf Glycerin durch Zugabe von cAMP auch in einem mlc+ Stamm um das 14-fache erhöhen.
Zusammengefasst
stehen
diese
Gene
unter
der
durch
Glukose
vermittelten
Katabolitenrepression, werden negativ durch Mlc reguliert und aktiviert durch cAMP/CAP,
wobei der cAMP/CAP Effekt den Mlc Effekt überwiegt (34, 114).
1. Einleitung
15
Abb.5: Mlc regulierte Gene
Vergleich der Promotorregion der Mlc regulierten Gene mit der des durch NagC regulierten nagE-BACD
Operons, abgewandelt nach (34, 74, 75, 114-116). Die Mlc Bindestellen, gekennzeichnet mit Mlc, erscheinen als
graue Rechtecke; die CAP Bindestellen, gekennzeichnet mit CAP, als weiße Rechtecke. Die Bindestellen
werden bezüglich ihrer Lage zum Transkriptionsstart (+1) der genannten Gene gezeigt.
1. Einleitung
16
Die Expression der pts-Gene (ptsG, ptsHI) wird positiv durch cAMP/CAP reguliert, wobei
der repremierende Effekt von Mlc dem aktivierenden durch cAMP/CAP entgegen gerichtet
ist. Bei Wachstum auf Glycerin, weist die mlc-Mutante im Vergleich zum mlc+ Stamm eine
um das 20-fache höhere ptsG-Expression und eine 3-4 fach höhere ptsHI-Expression auf. Bei
Wachstum auf Glukose werden sowohl im mlc, als auch im mlc+ Stamm die Expression von
ptsG etwa 8-fach und die Expression von ptsHI 3-4 fach erhöht. Die pts-Gene werden durch
Glukose induziert. Bei Wachstum einer cyaA-Mutante (Adenylatcyclase) auf Glycerin und
unter Zugabe von cAMP zeigt sich keine signifikante Erhöhung der ptsG-Expression, bei
zusätzlicher mlc-Mutation aber ein 23-facher Anstieg (74, 75, 115, 116).
Die Zugabe von Glukose führt zu einer Derepression der Mlc-regulierten Gene, aber auch zu
Katabolitenrepresion durch die Abnahme des Aktivators cAMP/CAP. Die Expression der
Mlc-regulierten Gene ist abhängig von der verbleibenden Menge an cAMP/CAP und der
Affinität des Komplexes zu seinen Bindestellen (119). Die relative Affinität der zwei
regulatorischen Proteine (cAMP/CAP und Mlc) zu ihren Bindestellen und die Lokalisierung
der Bindestellen bestimmt die unterschiedlichen Effekte von Glukose auf die Expression der
verschiedenen Operone und Gene.
1.4.3 Glukoseinduktion der pts Gene
Wie im vorangegangenen Kapitel angedeutet, hat der Transport von externer Glukose
Einfluss auf die Expression der pts Gene. Bewirkt wird dies durch eine Modulation der MlcAktivität. Bezieht man sich auf die Übereinstimmungen zwischen Mlc und NagC würde man
erwarten, dass in gleicher Weise wie GlcNAc-6-P NagC inaktiviert (121), Mlc durch Glukose
oder ein Glukose-Derivat inaktiviert wird. Diese Erwartung besteht schon im Hinblick darauf,
dass durch Mlc Operone und Gene reguliert werden, deren Produkte mit dem
Glukosestoffwechsel verknüpft sind. Allerdings konnte kein derartiger Induktor identifiziert
werden (34, 75, 115).
Bezüglich der Glukoseinduktion gibt es Hinweise aus genetischen Studien, dass die PTSProteine eine Rolle bei der Signaltransduktion spielen. Mutationen in ptsHIcrr, ptsIcrr oder
ptsI alleine, die zum Verlust der allgemeinen PTS-Komponenten HPr, EI und des Glukose-
1. Einleitung
17
spezifischen EIIA führen, bewirken eine konstitutive Expression der pts-Gene (32, 116). Wie
bereits beschrieben bewirken auch Mutationen in Mlc eine konstitutive Expression der ptsGene. Mutationen in ptsG hingegen sind dominant. Sowohl der Glukosetransport, als auch die
Induktion der pts-Gene werden verhindert.
Des weiteren konnte gezeigt werden, dass auch die Aufnahme anderer PTS-Zucker, die eine
Dephosphorylierung der PTS-Komponenten bewirken, die Expression der pts Gene erhöht.
Diese Form der Induktion erfolgt ebenfalls nur in Anwesenheit von intaktem PtsG. Das über
PtsG transportierte, phosphorylierte, aber nicht verwertbare Substratanalogon α-methylGlukosid bewirkt die Dephosphorylierung der PTS-Komponenten und wirkt als Induktor der
Transkription der pts-Gene. All diese Versuche zusammengefasst bedeuten, dass PtsG bei der
Glukoseinduktion eine entscheidende Rolle spielt, wobei der Phosphorylierungszustand
ausschlaggebend ist. Die Unterbrechung der Phosphorylierungskaskade zwischen PEP und
PtsG und der Transport von Glukose führen zur Dephosphorylierung von PtsG und zu einer
erhöhten Expression der pts-Gene. Transport von Glukose über PtsG und die damit
verbundene Dephosphorylierung des Proteins ist das induzierende Signal. (32 , 74, 75, 115,
116, 158)
Es wurde diskutiert, ob durch externe Glukose ein Signal vergleichbar einem ZweiKomponent-Systems (60) auf Mlc übertragen wird. Der die B-Domäne enthaltende Cterminus von EIICBGlc hat 39% Ähnlichkeit zum Transmitter Konsensus Motiv von SensorKinasen (77). Demnach könnte Mlc durch PtsG phosphoryliert werden und wie verschiedene
andere Antwort-Regulatoren das Signal auf die Mlc regulierten Gene übertragen. Dem
widerspricht, dass das Signal durch nicht phosphoryliertes PtsG übertragen wird, und dass
eine Phosphorylierung von Mlc nicht nachgewiesen werden konnte (74).
1.4.4 Die Inaktivierung des Repressors Mlc
Durch Bindetests mit PtsG enthaltenden Membranvesikeln (84, 98) und durch Koprezipitation
von gereinigtem PtsG mit daran gebundenen Mlc (157), kann gezeigt werden, dass Mlc mit
PtsG eine direkte Protein-Protein Interaktion eingeht. Die Experimente beweisen, dass Mlc an
1. Einleitung
18
nicht phosphoryliertes PtsG bindet und zeigen somit einen neuen Weg der Inaktivierung
eines Repressors durch Protein-Protein-Interaktion mit einem Membranprotein.
Beide Ansätze führen zu einem Modell nach dem PtsG bei Aufnahme von externer Glukose
hauptsächlich in der dephosphorylierten Form vorliegt. Mlc wird durch dephosphoryliertes
PtsG an der Membran gebunden, was zu einer Derepression der Mlc regulierten Gene führt.
Bei Abwesenheit von Glukose oder anderen PTS-Zuckern sollte PtsG hauptsächlich
phosphoryliert vorliegen. Mlc wird dann nicht an PtsG gebunden und bindet an die jeweiligen
Bindestellen an den Promotoren der Mlc regulierten Gene (84, 98, 157) (siehe Abb. 6).
Abb.6: Inaktivierung von Mlc
Dem Modell zufolge ist PtsG (EIICB) vorwiegend phosphoryliert wenn keine Glukose transportiert wird (rechte
Bildseite). Mlc bleibt an seine Operatoren gebunden. Die Expression Mlc regulierter Gene unterbleibt. Während
des Transports von Glukose ist PtsG überwiegend dephosphoryliert (linke Bildseite). Mlc wird an PtsG
gebunden und von den DNA-Bindestellen hin zur Membran abgezogen. Die Mlc regulierten Gene sind
derepremiert. Schematische Darstellung mit Veränderungen nach (84).
Während die lösliche B-Domäne von PtsG ausreicht um Mlc zu binden (84, 98), ist die
Überproduktion der löslichen B-Domäne nicht ausreichend, um eine Derepression der Mlc
regulierten Gene zu bewirken. Um herauszufinden, welche Bereiche von PtsG für die Mlc
Bindung benötigt werden, wurden verschiedene Deletionsmutanten von PtsG getestet. Eine
trunkierte Variante von PtsG (AS: 321-477) umfast den C-terminalen Bereich der C-Domäne,
den Linker zwischen C- und B-Domäne und die lösliche IIB-Domäne von PtsG (84). Die
genannten Bereiche werden minimal benötigt um sowohl die Bindung von Mlc an die IIB-
1. Einleitung
19
Domäne zu erhalten und um zusätzlich die Derepression der Mlc regulierten Gene erreichen.
Nicht geklärt ist, ob diese Bereiche von PtsG alle eine direkte Interaktion mit Mlc eingehen.
Es könnte aber ebenfalls sein, dass der verbleibende Rest der C-Domäne bewirkt, dass die
getestete trunkierte Variante von PtsG (AS: 321-477) membrangebunden ist und somit Mlc in
Richtung Membran von der DNA abgezogen wird. Nach einem Modell von Buhr und Erni
(1993) (21) werden die acht Transmembranhelices des PtsG von den Aminosäuren 17 – 323
gebildet. Diesem Bereich folgen eine lösliche cytoplasmatische Region (AS: 324-380), ein
konservierter Linker (AS: 381-388) und die lösliche B-Domäne (AS:389-477). Die trunkierte
PtsG-Variante (AS:321-477) ist nach diesem Model nicht membrangebunden. Bei Bindetests
zwischen Mlc und dieser Variante, konnte Mlc aber in den Membranfraktionen nachgewiesen
werden (84). Nach einem Modell von Lengeler et al. (1994) (85) befindet sich die 8. Helix
von PtsG zwischen den Aminosäuren 354 und 372 wodurch die trunkierte PtsG-Variante
einen Membrananker besitzt (84). Mlc würde in diesem Fall durch die trunkierte PtsGVariante an die Membran gebunden. Das wäre ein Hinweis darauf, dass die Bindung von Mlc
an weitere Bereiche außerhalb der B-Domäne nicht ausschlaggebend ist für die Derepression
der Mlc reguliert Gene, wohl aber die Titration des Repressors an die Membran.
In vitro Tests mit PtsG enthaltenden Membranen zeigen, dass die PEP abhängige
Phosphorylierung von PtsG reduziert wird, sobald Mlc an die Membranen gebunden ist. In
vergleichbaren Ansätzen wird auch die Phosphorylierung des Substratanalogons α-methylGlukosid reduziert (84). Dies könnte für die Zelle eine Möglichkeit sein, die, durch erhöhte
Expression des Transporters PtsG, ansteigende Glukoseaufnahme zu regulieren. Unklar ist, ob
dieser Effekt unter physiologischen Bedingungen auch auftritt oder nur artifiziell bei einem
Überschuss an Mlc im in vitro Test (84). Die Dissoziationskonstante KD für die Interaktion
von Mlc mit seinen Operatoren (ptsG p1; ptsHI p0 ~10-8; mlc ~10-7) ist nur etwa 10x
niedriger als die von Mlc zum EIICBglc (~10-7). Bedenkt man aber, dass in vivo etwa 100x
mehr PtsG als Mlc vorhanden ist, sollte Mlc während des Transportes von Glukose komplett
von den Operatoren abgelöst werden (98). Andererseits sollte in vivo genug Transporter von
Mlc ungebunden vorliegen um den Transport von Glukose nicht zu beeinträchtigen (84).
Neben dem bekannten Modell der Inaktivierung eines Repressors durch ein Induktormolekül,
kann der Mechanismus der Inaktivierung von Transkriptionsfaktoren durch Bindung an die
Membran durch weitere Beispiele belegt werden. In gleicher Weise wird der Aktivator des
mal-Regulon, MalT, abhängig von der Transportaktivität, von der membranständigen ATPase
1. Einleitung
20
MalK gebunden (111). Gezeigt werden kann dies auch am Beispiel des AmtB-GlnK-Systems,
bei welchem GlnK(PII Signaltransduktions-Protein) über den Ammoniumtransporter AmtB an
die Membran gebunden wird und dabei der Transport von extrazellulären Ammonium auf die
intrazelluläre Verfügbarkeit von Stickstoff abgestimmt wird (30).
1.5 Das Protein YeeI beeinflusst die Mlc regulierten Gene
Ein Hinweis darauf, dass weitere Faktoren die Aktivität von Mlc beeinflussen könnten, ergab
bei der Suche nach Genen, deren Produkte die Aktivität oder die Expression von
Komponenten des Glukose-PTS beeinflussen. Einer dieser Faktoren ist das Protein YeeI. Eine
yeeI Mutante zeigt im Vergleich zum Wildtyp (i) eine verlängerte Generationszeit bei
Wachstum auf Glukose oder Mannose, (ii) eine früher einsetzende und kontinuierlich
ansteigende Expression von lacZ während des Wachstums auf Glukose und Laktose und (iii)
eine reduzierte Expression von malT, mlc, ptsG und manXYZ. Die aufgeführten Effekte sind
durch eine zusätzliche mlc Deletion suppremierbar. Überproduktion von YeeI bewirkt eine
Erhöhung der Menge an Mlc, PtsG, MalT und ManXYZ. Möglicherweise greift auch YeeI in
die Regulation der Mlc regulierten Gene ein, indem es Mlc durch Protein-Protein-Interaktion
inaktiviert (8, 9).
21
1. Einleitung
1.6 Zielsetzung
Die Aufnahme von Glukose in E. coli K-12 erfolgt hauptsächlich über ein Glukosespezifisches PTS. Die Regulation der Expression der beteiligten Komponenten erfolgt durch
Mlc, cAMP/CAP, sowie weiterer unter anderem posttranskriptioneller Mechanismen. Mlc ist
ein transkriptionaler Regulator, der neben ptsG (EIICBGlc) und den Genen der allgemeinen
PTS–Komponenten ptsHI (HPr, EI), auch die Gene manXYZ (Mannose spezifische PTSKomponenten) und malT (transkriptioneller Aktivator der mal-Gene)
Aktivität
von
Mlc
und
die
Konzentration
von
repremiert. Die
cAMP/CAP ist abhängig vom
Phosphorylierungszustand der PTS–Komponenten und damit von dem Transport von Glukose
über PtsG. Zum einen wird Mlc durch die Bindung an dephosphoryliertes PtsG inaktiviert.
Zum anderen aktiviert phosphoryliertes EIIA die Adenylatcyclase, was zur Bildung von
cAMP und nachfolgend zu der des cAMP/CAP-Komplexes führt, der die Expression der oben
genannten Gene positiv reguliert. Die Regulation der Gene, die für die am Transport
beteiligten Komponenten kodieren, ist somit wiederum abhängig vom Transport des
Substrates. Thema dieser Arbeit ist
die Analyse der transportgesteuerten Genregulation
anhand des Mlc-PtsG Systems von Escherichia coli.
Ein erster Ansatzpunkt ist, die Interaktion zwischen PtsG (EIICBGlc) und Mlc weiter zu
charakterisieren. Es sollen die Bereiche in Mlc und PtsG gefunden bzw. näher charakterisiert
werden, die für die Bindung der beiden Proteine aneinander benötigt werden.
Bei dem Protein YeeI könnte es sich um einen zusätzlichen Faktor handeln, der Mlc in seiner
Funktion als Repressor inaktiviert. Es soll daher überprüft werden, ob eine direkte Interaktion
von YeeI mit Mlc besteht.
Die Aufnahme von Glukose und anderen PTS–Zuckern führt zur Dephosphorylierung von
EIIAGlc. Unter dieser Bedingung ist der cAMP/CAP Spiegel in der Zelle niedrig, da aufgrund
der fehlenden Aktivierung der Adenylatcyclase nahezu kein cAMP gebildet wird. Da die
Transkription vieler kataboler Systeme eine Aktivierung durch den cAMP/CAP-Komplex
benötigt, hat dies die Katabolitenrepression von Genen zur Folge, die für Komponenten zur
Aufnahme und des Abbaus anderer Kohlenstoffquellen kodieren. Daneben können auch
Nicht–PTS–Zucker Katabolitenrepression hervorrufen. Gezeigt wurde dies unter anderen
anhand des Glycerineffektes auf die Expression der mal-Gene. Hier zeigt sich, dass Glycerin-
1. Einleitung
22
3-Phosphat die Aktivierung der Adenylatcyclase durch EIIAGlc beeinflusst. Es sollte deshalb
die Frage geklärt werden, ob eine Bindung zwischen EIIAGlc und der Adenylatcyclase
möglich ist und, ob diese durch Glycerin-3-Phosphat oder andere Zucker-Phosphate
unterbunden werden kann.
Durch Mlc werden Gene reguliert, deren Genprodukte Teile von Transportsystemen
darstellen und zum Teil auch Enzyme für den Abbau der transportierten Substrate. In all
diesen Fällen wirkt Mlc als transkriptioneller Repressor.
Hingegen bei der anaeroben
Lactatdehydrogenase (ldhA) wirkt Mlc vermutlich indirekt als Aktivator (71). Die daraus
resultierenden Fragen sind. (i) Lassen sich weitere Mlc regulierte Gene finden? (ii) Wenn ja,
wirkt Mlc stets als Repressor? (iii) Sind nur Gene betroffen, die für Proteine kodieren, die für
die Aufnahme und dem Metabolismus von Kohlenstoffquellen benötigt werden? Dies sollte
über die Anwendung von DNA-Microarrays geklärt werden und durch die anschließende
Verifizierung dieser Ergebnisse mittels weiterer Methoden.
2. Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1 Abkürzungen
ABC
AS
Amp
APS
bp
ß-Gal
BSA
cAMP
CAP
cat
Cm, Cam
c. p. m.
Da, kDa
DEPC
DMSO
DTT
EDTA
g
Glc
GlcNAc
Glyc
IPTG
Kan
LB
Mal
MMA
MOPS
NZA
ODx
ONPG
PCR
psi
PTS
rpm [engl.]
r
SDS [engl.]
Spec
TEMED
Tet
Tris
U
X-Gal
XP
ATP binding cassette
Aminosäure(n)
Ampicillin
Ammoniumperoxidsulfat
Basenpaare
ß-Galaktosidase
Albumin aus Rinderserum
3’,5’-cyclo-Adenosinmonophosphat
„cAMP receptor protein“
chloramphenicol acetyl transferase; verleiht Cm-Resistenz
Chloramphenicol
counts per minute
Dalton, Kilodalton
Diethylpyrocarbonat
Dimethylsulfoxid
Dithiothreitol
Ethylendiamin-Tetraessigsäure (Dinatriumsalz)
Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)
Glucose
N-Acetyl-Glucosamin
Glycerin
Isopropyl-ß-D-Thiogalaktopyranosid
Kanamycin
Luria Bertani Broth
Maltose
Minimalmedium A
3-[N-Morpholino] Propansulfonsäure
NZ-Amine
optische Dichte bei der Wellenlänge x nm
Orthonitrophenyl ß-D-Galaktopyranosid
Polymerasekettenreaktion
pound-force per square inch (1 psi = 6,895 kPa)
Phosphotransferasesystem
Umdrehungen pro Minute
resistent
Natrium Dodecyl Sulfat
Spectinomycin
N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin
Tetracyclin
Trishydroxymethylenaminomethan
Units
5-Bromo-4-Chloro-3-Indoyl-ß-D-Galaktopyranosid
5-Bromo-4-Chloro-3-Indoyl-Phosphat
23
24
2. Material und Methoden
2.2 Verwendete Bakterienstämme, Phagen, Plasmide und Oligonukleotide
Stammname
relevanter Genotyp
Referenz oder Quelle
DHB4
F’lacIq pro ∆(ara-leu)7697 araD139∆lacX74
galE galK rpsL
phoR ∆phoA (PvuII) ∆malF3 thi
F- lam- IN(rrnD-rrnE)1 rph-1 deoC
ptsG::Tn5(kan)
JM101(supE thi-1 ∆(lac-proAB) [F’ traD36
proAB lacIqZ∆M15] ) ptsG+ptsG-lacZ mlc::tet
JM101(supE thi-1 ∆(lac-proAB) [F’ traD36
)
ptsGproAB
lacIqZ∆M15]
lacZ(transkriptionale Fusion)
ptsG::cat
ptsHIcrr::kan
F- araD139 ∆(argF-lac) U169
rpsL150 relA1deoC1 ptsF25 rbsR flbB5301
F´[lacIq lacZM15 proAB traD36] hsdD5
supE thi (lac-pro) (pro-lac)
F- Θ80d lacZ ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169
recA endA1 hsdR17 (rK—mK+) sup E44 λ- thi-1
gyrA relA1
araD139 deoC1 flbB5301 ptsF25 rbsR relA1
rpsL150 ∆(argF-lac)U169 øP[(malT-lacZ) (λ
placMu50)] ∆cya crp* ilv+ mlc::kan
(127)
IT1168
JM-G2
JM-G77
MC4100
TG1
DH5α
ET104
ET25
KD413
Bre2071
MV198
SH10
SE40
SE70
MC1061
HA18
CH4
RD15
DG102
CV5200
SA1
SA2
SA5
SA6
(154)
(115)
(115)
(27)
(26)
(56)
(39)
(39)
Katja Decker; Doktorarbeit, UniKonstanz
araD139 deoC1 flbB5301 θ(proV-lacZ) hyb2 Bremer, 1992
(λ placMu15) osmZ200 ptsF25 rbsR relA1
rpsL150 ∆(argF-lac)U169
agn`-lacZ (agn=flu)
(55)
Jennifer Ross, John Hopkins
F araC-lacZ leu str ∆lac araD
University
MC4100 trp-1 ssuE`-lacZ ∆ssuADCB
(161)
(161)
MC4100 Θ(tauC-lacZ) (λ placMu9)
hsdR mcrB araD139 ∆(araABC-leu)7679 (27)
∆lacX174 galU galK rpsL thi
araD139 deoC1 flbB5301 ptsF25 rpsL150 A. Hartmann, Diplomarbeit Uni∆(argF-lac)U169 ∆(phoA20)
Konstanz
Braun
araD139 flbB5301 øP[malK-lacZ] ptsF25 Christiane
Vertiefungskurs Uni-Konstanz
rbsR relA1 rpsL150 ∆(argF-lac)U169 ∆cya
araD139 deoC1 flbB5301 ptsF25 rbsR relA1 Renate Dippel, Uni-Konstanz
rpsL150 ∆(argF-lac)U169 øP[(malT-lacZ)(λ
placMu50)] ∆cya::kan
Epstein, 1989
HfrKL16 thi ∆ptsHIcrr
(163)
MG1655 ∆lac X74 PsgrS-lacZ
MC4100 ptsG ::TN5(kan)
diese Arbeit
KD413 ptsG ::TN5(kan)
diese Arbeit
Bre2071 mlc::tet
diese Arbeit
MV198 mlc::tet
diese Arbeit
MC4100; Φ(malT-lacZ) ∆cya crp* ilv+
MC4100; mlc::tet
25
2. Material und Methoden
Stammname
relevanter Genotyp
Referenz oder Quelle
SA7
SA12
SA13
SA14
SA15
SA17
SA19
SA20
SA21
SA22
SA23
SA24
SA25
SA 26
SA27
SA28
SA29
SA30
SA31
SA32
SA33
SA34
SA35
SA36
SH10 mlc::kan
SE70 mlc::tet
SE40 mlc::tet
MC1061ptsG::TN5(kan)
ET25 ptsG::TN5(kan)
CH4 ptsG ::Tn5(kan)
HA18mlc ::Tn10(tet)
SA19 araB+ araB-phoA
SA19 yabM+ yabM-phoA
HA18 araB+ araB-phoA
HA18 yabM+ yabM-phoA
KS413 yeeR+ yeeR-lacZ
KD413 tbpA+ tbpA-lacZ
KD413 araC+ araC-lacZ
KD413 araC+ araC-lacZ
KD413 yabN+ yabN-lacZ
KD413 araC+ araC-lacZ
MC1061 araC+ araC-lacZ
MC4100 araC+ araC-lacZ
MC4100 yabN+ yabN-lacZ
MC4100 yeeR+ yeeR-lacZ
MC4100 araC-lacZ
MC4100 tbpA+ tbpA-lacZ
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
MC1061 ∆cya::kan
Tabelle1. Bakterienstämme – Die Nomenklatur entspricht der von Bachman (1990).
Bei den Reportergenfusionen der Stämme SA20 bis SA35 handelt es sich um transkriptionelle Fusionen.
Phage
Eigenschaften/bekannter Genotyp
P1vir
λInCH1
transduzierender Phage
Laborsammlung
(18)
lytischer und lysogener Zyklus möglich;
homologe Berreiche zu pBR322;
ermöglicht das einfügen stabiler lacZ-Fusionen
in die λatt-site von E. coli;
Tabelle 2. Phagen
Referenz
Plasmid
Eigenschaften/bekannter Genotyp
Referenz
pGDR11
pQE31 Derivat, lacIq Ap (IPTG induzierbar;
Expressionsvektor; N-term. His-tag-Fusion)
pGDR11 + orf: mlc (BamHI/PstI)
pGDR11 + orf: mlc (BamHI/PstI) ∆18bp
pGDR11 + orf: mlc (BamHI/PstI) ∆36bp
entspricht pSL104; mlc∆ Basen562-573
pQE60 Derivat, lacIq, AP ; IPTG induzierbar;
(112)
pSL104
pMlc410
pMlc401
pmlc110
pCS19
(84)
dieseArbeit
diese Arbeit
diese Arbeit; (103)
(150)
26
2. Material und Methoden
Plasmid
Eigenschaften/bekannter Genotyp
Referenz
pSL105
pTSG11
pTZ19R
Expressionsvektor;
C-terminale
His-tagFusion
pCS19 + orf: mlc (NcoI/BamHI)
Plac, lacI,APR, gesammter orf von ptsG
Plac, lacI, CAP binding site; bla;entwickelt aus
pUC19
pTZ19 + Gp8 des Phagen M13
(84)
(22)
GenBank/EMBL
accession
number Y14835
J. Plumbridge in(141)
pTZ-Gp8
pTZ-Gp8-IIB
pTZ-Gp8IIB(Cys421Ser)
pTZ-Gp8IIB(Cys421Asp)
pTZ-Gp8IIB(Arg424Ala)
pTZ-Gp8IIB(Arg424His)
pTZ-Gp8IIB(Arg424Lys)
pTZ-Gp8IIB(Arg426Ala)
pTZ-Gp8IIB(Asp419Ala)
pSA1
pTAC3575
pSA2
pSA3
pSA4
pSA5
pRS415
pSA6
pBCP206
pJFBH
pSA9
pBAD18
pSA8
pTZ19 + Gp8 des Phagen M13 + Sequenz der
B-Domäne des Enzyms IIBC (PtsG);
entsprechend Aminosäure 391-477
pTZ-Gp8-IIB (Aminosäureaustausch Cys421
zu Ala)
pTZ-Gp8-IIB (Aminosäureaustausch Cys421
zu Asp)
pTZ-Gp8-IIB (Aminosäureaustausch Arg424
zu Ala)
pTZ-Gp8-IIB (Aminosäureaustausch Arg424
zu His)
pTZ-Gp8-IIB (Aminosäureaustausch Arg424
zu Lys)
pTZ-Gp8-IIB (Aminosäureaustausch Arg426
zu Ala)
pTZ-Gp8-IIB (Aminosäureaustausch Asp419
zu Ala)
pQE60 Derivat, lacIq, AP ; IPTG induzierbar;
Expressionsvektor;
ermöglicht transkriptionelle lacZ und phoAFusionen; APR
pTAC3575 + potentielle Promotorregion 5`zu
yabN
pTAC3575 + potentielle Promotorregion 5`zu
araC
pTAC3575 + regulatorische Region zwischen
araC und araB
pTAC3575 + potentielle Promotorregion 5`zu
tbpA
ermöglicht transkriptionelle lacZ-Fusionen;
APR
pRS415 + potentielle Promotorregion 5`zu
yeeR
crr unter Ptac; lacIq;APR
ColE1ori lacI Ptac, Sequenz kodierend für
Aminosäure 390-477 von ptsG in frame an
His-tag kodierende Region (C-Terminaler Histag)
pGDR11 + crr (EIIA E.coli)
Expressionsvektor, Indukton durch Arabinose,
APR, araC, ParaB
pBAD18 + cyaA
J. Plumbridge in(141)
J. Plumbridge in(141)
J. Plumbridge in(141)
J. Plumbridge in(141)
J. Plumbridge in(141)
J. Plumbridge in(141)
J. Plumbridge in(141)
J. Plumbridge in(141)
diese Arbeit
(6)
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
(147)
diese Arbeit
(162)
(22)
diese Arbeit
(54)
diese Arbeit
27
2. Material und Methoden
Plasmid
Eigenschaften/bekannter Genotyp
pSA12
pBAD18 + cyaA (Adenylatcyclase E.coli); diese Arbeit
pQE32
pSA11
pSA16
pQE31
pSA13
pREP4
pHIHO101
pQE60
pmlc_wt
pmlc_AYA
pmlc_SYS
pTZ19R
pTZ-C9
pTZ-M26
pTZ-M120
katalytische Domäne (AS:0-535 von wt AC.)
Expression mit Arabinose induzierbar
Expressionsvektor, Indukton durch IPTG, Ptac ,
APR ; N-term. His-tag-Fusion
pQE32 + cyaA (Adenylatcyclase E.coli)
pQE32 +
cyaA (Adenylatcyclase E.coli);
regulatorische Domäne (AS:538-848 von wt
AC.)
Expressionsvektor, Indukton durch IPTG, Ptac ,
APR ;N-term. His-tag-Fusion
pQE31 + cyaA (Adenylatcyclase E.coli);
katalytische Domäne (AS:87-535 von wt AC.);
lacIq, KanR
=pREP4 Austausch von KanR gegen SpecR
Referenz
(129)
diese Arbeit
diese Arbeit
(129)
diese Arbeit
(129)
Markus Hinderhofer;
Konstanz
Uni-
Expressionsvektor, Indukton durch IPTG, Ptac ,
APR ;
pQE60 + Wildtyp mlc
Kinga Gerber, Uni-Konstanz
pQE60
+
mlc
mit
Austausch
in Kinga Gerber, Uni-Konstanz
Metallbindestelle Cystein-Tyrosin-Cystein(AS:
257 – 259) nach Alanin-Tyrosin-Alanin
pQE60
+
mlc
mit
Austausch
in Kinga Gerber, Uni-Konstanz
Metallbindestelle Cystein-Tyrosin-Cystein(AS:
257 – 259) nach Serin-Tyrosin-Serin
pTZ19R + C9 (NagC-Bindesequenz)
(118)
pTZ19R + C9 (Mlc-Bindesequenz)
(118)
pTZ19R + C9 (Mlc-Bindesequenz mit Ver- (118)
änderung dh. Negativkontrolle)
Tabelle 3: Plasmide
Oligonukleotid
Leserichtung Sequenz
BamHI_yab
HindIII_yab
araC_PstI
araC_BamHI
BglII_ara
HindIII_ara
XbaI_tbp
SalI_tbp
BamHI_yeeR
EcoRI_yeeR
BamH1-mlc
pSA2-for
pSA2-rev
pSA3_for
pSA3-rev
pSA4_for
pSA4-rev
pSA5_for
pSA5-rev
pSA6_for
pSA6-rev
pMlc410-for
5`- aaagaggcggatccagaaag-3´
5`- ccagttcgttaagctttgtgt –3`
5`- gtaaacccactgcagataccattc-3´
5`-gcgtcaggtaggatccgctaatc–3`
5`- cgacgctaagatctgcaagc-3
5`-gtgagattgagaatataagctttcattcc–3`
5`- cgccatcttctagagccacc-3´
5`- caactaatctggtcgacttcgc–3
5`- aggggaggatccagcagacc-3´
5`-tttggcgaattcacctcatcc–3`
5´-cggatccgatggttgctgaaaaccagcc-3´
28
2. Material und Methoden
Oligonukleotid
Leserichtung Sequenz
mlc-∆410-419-PstI
BamH1-mlc
mlc-∆401-419-PstI
crr_BglII
crr_NcoI
cyaA_KpnI
crr-BamHI
crr-PstI
SphI_cya
PstI_cya
cyaA_KpnI
SphI_cya_katDom
BamHI_cya_regDom
PstI_cya
pMlc410-rev
pMlc401-for
pMlc401-rev
pSA7-for
pSA7-rev
pSA8-for
pSA9-for
pSA9-rev
pSA10-for
pSA10-rev
pSA12-for
pSA12-rev
pSA15-for
pSA15-rev
5´-aactgcagttaaccgttatacatcgcgtcttttacc-3´
5´-cggatccgatggttgctgaaaaccagcc-3´
5´-aactgcagttatgcacgcgcctgccatcgtgc -3´
5`-gcaagaaagatctcttgatgcg -3´
5`-ggagaagaccatgggtttgttc–3`
5`-gaaaagtggtaccggttacctttg -3´
5'-actgcttaggaggatcccatg-3'
5'-catttttcactgcagcaagaattac-3'
5'-CGATACGGCATGCACCTCTATATTG-3'
5'-GCTAAGACTGCAGGCCGGATAAG-3'
5'-GAAAAGTGGTACCGGTTACCTTTG-3'
5'- tgtgcatgcaggtcagcgcag -3'
5'- gcacggatcccgaaggcgc -3'
5'- gctaagactgcaggccggataag -3'
Tabelle4. Oligonukleotide
Die über die Oligonukleotide eingefügten Schnittstellen für Restriktionsenzyme wurden unterstrichen.
2.3 Medien und Wachstumsbedingungen
2.3.1 Medien
Die Zusammensetzung der Medien erfolgte nach Miller (92) und Silhavy (146). Abgesehen
von hitzelabilen Substanzen, wurden sie durch autoklavieren (20 min, 120°C, 1 bar)
sterilisert. Hitzelabile Substanzen wurden sterilfiltriert und den Medien nach dem Abkühlen
auf 50°C zugegeben. Zur Herstellung von Festmedien wurde vor dem Autoklaviern zusätzlich
15 g/l Difco Bactoagar eingewogen. Flüssigmedien wurden bei Raumtemperatur, Festmedien
bei +4°C gelagert.
eingewogene Menge auf 1l deionisiertes Wasser:
LB
Bacto-Trypton
Hefeextrakt
NaCl
10 g
5g
10 g
NZA NZA
10 g
Hefeextrakt
5g
NaCl
7,5 g
29
2. Material und Methoden
MMA K2HPO4
10,5 g
KH2PO4
4,5 g
(NH4)2SO4
1g
Natriumcitrat
0,5 g
MgSO4
10 mM
Kohlenstoffquelle
[getrennt autoklaviert]
0,2 bzw.0,4% (w/v) [sterilfiltriert]
2.3.2 Medienzusätze und Kohlenstoffquellen
Die folgenden Substanzen wurden sterilfiltriert (1) oder gesondert autoklaviert (2) und den
unter 2.3.1 genannten Medien nach dem Abkühlen zugegeben.
Substanz
Lösungsmittel
Endkonzentraion
Ampicillin
(1)
H2O
100 µg/ml
Chloramphenicol
(1)
70% Ethanol
25 µg/ml
IPTG
(1)
H2O
10 µM-1 mM
Kanamycin
(1)
H2O
100 µM
Natriumcitrat
(2)
H2O
20 mM
Spectinomycin
(1)
H2O
100 µg/ml
Tetracyclin
(1)
70% Ethanol
Tryptophan
(1)
H2O
10 µg/ml
X-Gal
Dimethylformamid
40 µg/ml
XP
Dimethylformamid
40 – 50 µg/ml
Lösungsmittel
Endkonzentraion
5 -25 µg/ml
Tabelle5. Medienzusätze
Substanz
Arabinose
(1)
H2O
0,4
% (w/v)
CAA
(2)
H2O
1 - 1,5% (w/v)
Glukose
(2)
H2O
0,2
% (w/v)
Glukose-6-P
(1)
H2O
0,4
% (w/v)
30
2. Material und Methoden
Glycerin
(2)
H2O
0,4
% (w/v)
Maltose
(1)
H2O
0,2
% (w/v)
Tabelle6. Kohlenstoffqellen
2.3.3 Kulturbedingungen
Die Bakterienkulturen wurden bei 28°C bzw. 37°C, aber stets aerob angezogen.
Flüssigkulturen wurden in Reagenzgläsern im Reagenzglasroller oder in Erlenmeyerkolben
auf dem Schütteltisch oder im Schüttelwasserbad inkubiert. War eine stärkere Durchlüftung
der Kultur erforderlich, wurden Schikanekolben verwendet. Die Inkubation auf Festmedium
erfolgte im 28°C bzw. 37°C oder 42°C Brutschrank. Die langfristige Aufbewahrung erfolgt in
Form von DMSO Dauerkulturen (126µl DMSO auf 1,7 ml Kultur) bei –70°C.
2.3.4 Zelldichtemessung
Das Wachstum einer Bakterienkultur wurde durch das Messen der optischen Dichte bei
578nm (OD578) verfolgt. Nach Miller (92)entspricht einer OD578 von 1 bezogen auf 1 ml
Kultur in etwa 8 x 108 Zellen und 107 µg Gesamtprotein.
2.4 Genetische und molekularbiologische Methoden
2.4.1 Standardmethoden mit Nukleinsäuren
Zur Präparation von Plasmiden wurde der QIAprep Spin Miniprep-Kit (Qiagen, Hilden) bzw.
GFXTM Micro Plasmid Prep-Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg), je nach Angaben des
Herstellers verwendet oder eine STET-Lyse durchgeführt (64).
Zur Präparation von chromosomaler DNA wurde der QIAamp Tissue-Kit (Qiagen, Hilden)
nach Angaben des Herstellers verwendet oder ein Protokoll zur Präparation von
chromosomaler DNA aus gram-/gram+ Bakterien(122) angewandt.
31
2. Material und Methoden
Die
Durchführung
von
Methoden
wie
PCR,
Restriktionsverdau,
Ligation
und
Agarosegelelektrophorese folgten den Anleitungen in Sambrook (138) und Maniatis (89)
unter einbeziehen der Herstellerangaben für die entsprechenden Enzyme.
DNA-Fragmente wurden zur Reinigung über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und
mittels QiaQuick Gel Extraction-Kit (Quiagen, Hilden) eluiert.
Die Herstellung kompetenter Zellen und Transformation von Bakterien erfolgte chemisch
mittels der Rubidiumchlorid-Methode (129) oder PEG-DMSO-Methode (29).
Die Sequenzierung von DNA wurde von der Firma GATC (Konstanz) durchgeführt.
2.4.2 Konstruktion von Plasmiden
Die Plasmide in Tabelle 3 wurden konstruiert, indem die eingefügten Sequenzen mittels der in
Tabelle 4 genannten Primer an chromosomaler DNA amplifiziert wurden und über
Restriktion (siehe markierte Schnittstellen) und Ligation in die entsprechenden Vektoren
eingefügt wurden. Oder durch Umklonieren, indem Sequenzen über Restiktionsverdau aus
einem Plasmid ausgeschnitten wurden und in einen Vektor mit entsprechenden Schnittstellen
durch Ligation eingefügt wurden.
2.4.3 Stammkonstruktionen
Alle für diese Arbeit verwendeten E.coli Stämme, außer denen, denen eine Reportergenfusion
eingefügt wurde, wurden mit Hilfe von P1-Transduktion (92, 93) hergestellt. Nach der
Konstruktion wurden die Stämme auf das Vorhandensein des jeweilige Phänotyps getestet.
Stämme mit Reportergenfusion wurden mittels des Phagen λInCH (18) hergestellt. Hierbei
wurde die Promotor-Reportergenfusion zunächst in ein Plasmid kloniert. Die verwendeten
Plasmide waren aus dem Plasmid pBR322 hervorgegangen. Auch die DNA des Phagen
enthält Bereiche, die mit pBR322 übereinstimmen. Ein mit dem jeweiligen Plasmid
transformierter
Stamm
wurde
mit
Phagen
infiziert.
Dieser
Stamm
war
nun
32
2. Material und Methoden
Kanamycinresistent (Phage) und Ampicillinresistent (Plasmid). Zu einem gewissen Anteil
findet eine homologe Rekombination zwischen Phagen- und Plasmid-DNA statt und ein Teil
der aus diesen Bakterien präparierten Phagen trug nun das Reportergenkonstrukt. Dadurch
ging unter anderen die Kanamycinresistenzkassette des Phagen verloren. Der Phage nahm
aber mit der Plasmid-DNA nicht nur das Reportergenkonstrukt, sondern auch die kodierende
Sequenz (bla) für eine ß-Lactamase auf, die Ampicillinresistenz vermittelte. Mit diesem
Phagenlysat wurde ein weiterer Bakterienstamm infiziert und die Selektion erfolgte auf die
Lysogene, die Phagen mit dem Reportergenkonstrukt enthielten. Dabei inserierte die PhagenDNA in die att-site des bakteriellen Chromosoms. Wachstum bei 28°C stellte sicher, dass
kein weiterer lytischer Phagenzyklus ablief, der zur Lyse der Bakterienzelle führen würde.
Die Phagen-DNA enthält zudem Sequenzen, die mit Bereichen des Bakterinchromosoms in
unmittelbarer Nähe der att-site übereinstimmen. Rekombination zwischen diesen DNABereichen führte zum Verlust der meisten Phagen spezifischen Gene. Auch bei einem
Temperaturwechsel
nach
42°C
fand
kein
lytischer
Phagenzyklus
statt.
Das
Reportergenkonstrukt war stabil in das bakterielle Chromosom integriert. Zusätzlich wurde
dies über PCR überprüft. Mit den gleichem Primerpaar würden durch PCR an der DNA des
Ausgangsstammes, des Lysogens und der stabil integrierten Fusion DNA-Fragmente mit
unterschiedlicher Länge amplifiziert werden. Auf diese Weise wurden merodiploide,
transkriptionelle Reportergenfusionen hergestellt, da die Fusion an einer definierten Stelle in
das Chromosom integriert wurde und das Ausgangsgen dabei nicht deletiert wurde.
Primer für Test-PCR:
gal_f
att_r
int_R
IG_r
5´-CTTGCTGAGTACGTGAGTTC-3´
5´-AAGCAGGCTTCAACGGATTC-3´
5´-GGACACCATGGCATCACAGT-3´
5´-ACGTTGGAGTCCACGTTCTT-3´
Längen der amplifizierten PCR-Fragmente:
Primer1
gal_f
gal_f
gal_f
Primerpaar
Primer2
att_r
int_R
IG_r
Ausgangsstamm
977 bp
---------------
PCR-Fragment in:
Lysogen
Stamm mit
Reportergenfusion
977 bp
-------1128 bp
--------------1148 bp
2. Material und Methoden
33
2.4.4 Transkriptomanalyse
Die Transkriptomanalyse wurde mit DNA-Microarrays durchgeführt. Die Präparation der
dazu benötigten RNA wurde in Konstanz durchgeführt. Die Herstellung der DNA-Chips, das
Umschreiben der RNA in cDNA, die Hybridisierung der cDNA mit dem Chip und die
Auswertung der Signale wurden von Dr. Tino Polen und Dr. Volker Wendisch am
Forschungszentrum in Jülich durchgeführt. Da es ein besseres Verständnis der erhaltenen
Daten zur Folge hat, werden auch die nicht selbst durchgeführten Methoden in Kürze
beschrieben.
Für die Herstellung von RNase-freien Wassser wurde Millipore-gefiltertes oder entsalztes
Wasser mit 0,1% DEPC versetzt, geschüttelt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Um das
DEPC wieder zu entfernen, wurde für mindestens eine Stunde gekocht oder autoklaviert.
DEPC wird dabei hydrolysirt.
2.4.4.1 Präparation von RNA aus Bakterien
Unterschiedliche E. coli Kulturen wurden in 50 ml MMA (Minimalmedium A nach Miller)
(93) mit 0,4% Glycerin angezogen. Antibiotika wurden soweit erforderlich zugegeben. Bei
den Ansätzen mit KD413 pCS19 bzw. pSA1 wurde die Überexpression bei OD578 = 0,1 durch
Zugabe von IPTG (Endkonzentration 10 µM) induziert. 35 ml einer exponentiell wachsenden
Kultur (OD578, 0,5 – 0,6) wurde mit 70 ml RNA Bacteriaprotect Reagent (Qiagen) vermischt
und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur für
10 Minuten bei 4000 x g abzentrifugiert und die Pellets in 350 µl Puffer RTL des RNeasy
Mini Kits (Qiagen, Hilden) resupendiert. Alternativ wurden 35 ml Zellen zu 15 ml gefrorenen
Killingbuffer (20 mM Tris/HCl pH7,5; 5 mM MgCl2, 20 mM NaN3) gegeben und für 10
Minuten bei 4000 x g und 4°C abzentrifugiert. Die Pellets wurden sofort in 350 µl Puffer RTL
gelöst.
Für den Zellaufschluss wurden die Proben zu 0,5 g 0,1 mm Zirconia/Silica Glasbeads (Roth,
Karlsruhe) gegeben und fünfmal für 30 Sekunden gevortext. Dies mit Pausen von 20 – 30
Sekunden. Die so aufgeschlossenen Zellen inklusive der Glasbeads wurden für eine Minute
bei 13000 x g zentrifugiert. Die Überstände wurden auf Säulen des RNeasy Mini Kits
2. Material und Methoden
34
gegeben und die weitere RNA-Präparation erfolgte nach Angabe des Herstellers. Die RNA
wurde mit zweimal 50 µl Millipore (pH 7,3) eluiert. Reinheit und Konzentration der Proben
wurde spektrometrisch bestimmt. Die hier meist noch in den Proben enthaltene DNA würde
bei den Folgeexperimenten zu falschen Ergebnissen führen. Deshalb wurde nochmals 350 µl
Puffer RTL zu dem Eluat gegeben, dieses auf ein frisches RNeasy Mini Kit Säulchen geladen
und das Protokol für RNA-Präparation mit On column DNaseI digestion (Qiagen) angewandt.
Die Reinheit und Konzentration der RNA wurde nun sowohl spektrometrisch als auch mittels
Formamid Agarose Gelelektophorese bestimmt. Präpariert wurde die gesamte RNA der
Zellen, die unter anderen die mRNA enthält, die als Maß für die Expression in den Zellen in
cDNA umgeschrieben werden soll.
2.4.4.2 Formaldehyd Agarose Gelelektophorese
Puffer
10x FA Puffer
1x FA Laufpuffer (1 l)
200 mM MOPS
100 ml 10x FA Puffer
50 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
20 ml 37% (12,3 M) Formaldehyd
880 ml Rnase-freies Wasser
pH 7,0 mit NaOH
1,2% FA-Gel
für ein Gel der Größe: 10 x 14 x 0,7 cm
1,2 g Agarose
10 ml 10x FA Puffer
auf 100 ml mit Rnase-freiem Wasser auffüllen
Die Mischung wurde in der Mikrowelle erhitzt bis die Agarose geschmolzen war und auf
65°C abgekühlt. Dann wurden 1,8 ml 37% (12,3 M) Formaldehyd zugegeben und das Gel
gegossen.
Das fertige Gel wurde vor dem Beladen für 30 Min. in 1x FA-Puffer äquillibriert.
5x RNA Ladepuffer
16 µl gesättigte, wässrige Bromphenolblau-Lösung
80 µl 500 mM EDTA, pH 8,0
720 µl 37% (12,3 M) Formaldehyd
2. Material und Methoden
35
2 ml 100% Glycerin
3,084 ml Formamid
4 ml 10x FA Puffer
mit Rnase-freiem Wasser auf 10 ml auffüllen.
Elektrophorese
Die Proben wurden vor dem Auftragen für 3 – 5 Min. bei 65°C denaturiert. Die
Elektrophorese erfolgte bei 4 –5V/cm.
2.4.4.3 Chip-Herstellung
PCR-Produkte aufbringen
Glasobjektträger werden mit einer Polylysinschicht überzogen. Dies ermöglicht eine Bindung
zwischen den ε-Aminogruppen des Lysins und dem Phosphaten der DNA. DNA-Spots
werden an definierten Positionen aufgebracht, die in einer Anordnung in Reihen, Säulen und
Blöcken resultiert, was später die Zuordnung von Signalen zu bestimmten Genen ermöglicht.
Von 4844 möglichen Plätzen wurden 80 mit genomischer DNA aus E. coli LJ110 und
MG1655 belegt. Dies ist die Positivkontrolle, da hier stets cDNA, die ja aus RNA von E.coli
hergestellt wurde, hybridisieren sollte. Weitere 443 Plätze sind mit DNA belegt, die
unterschiedlichen offenen Leserastern von Corynebakterium gluthamicum entspricht. Dies ist
die Negativkontrolle. Hier sollte nur wenig cDNA hybridiseren. Die restlichen Plätze wurden
mit PCR-Produkten belegt, die den bekannten offenen Leseratern in E. coli K12 entsprechen.
Davon waren bei allen hier verwendeten Arrays 4210 belegt. An 111 Plätzen fehlte ein Spot,
war fehlerhaft belegt oder war zu schwach. Die beschichteten und mit Spots versehenen
Arrays wurden rehydratisiert und für wenige Sekunden bei 130°C getrocknet. Durch UVCross-Linking (65mJ Stradalinker) wurden die Spots letztendlich fixiert. Freie εAminogruppen werden nach dem Aufbringen der DNA-Spots mit Bernsteinsäureanhydrid
behandelt, um zu verhindern, dass DNA unspezifisch an den Chip bindet.
cDNA
Die mRNA je zweier Zellkulturen wurde durch reverse Transkription in cDNA
umgeschrieben. Dafür wurde je 25 µg einer RNA-Präparation verwendet. Dabei wurde der
2. Material und Methoden
36
Kontrollansatz mit dem floureszierenden Farbstoff Cy3 markiert und der zu analysierende
Ansatz mit dem Farbstoff Cy5 und umgekehrt. Diese werden als FlouroLinkTM Cy3-dUTP
bzw. FlouroLinkTM Cy5-dUTP (Amersham Pharmacia) in die entstehende cDNA eingebaut.
Um möglichst die mRNA aller expremierten ORFs umzuschreiben wurden Zufallsprimer
(Hexamere) verwendet.
Hybridisierung
Um die cDNA mit den PCR-Produkten des Chips hybridisieren zu können, wird die Cy3cDNA und die Cy5-cDNA vermischt, mit einem Kompetitor (Poly(A) oder E.coli rRNA)
versetzt und einem Puffergemisch aus HEPES, Natiumcitrat und NaCl. Die Lösung wird auf
100°C erhitzt, abgekühlt und bei 65°C für 5h zur Hybridisierung auf den Chip gegeben. Dem
folgen mehrere Waschschritte und das Trocknen des Chips.
2.4.4.4 Auswertung der Arraydaten
In den Tabellen 23 bis 26 (Kap. 6.4) wird die „normalisierte Ratio of Median“ gezeigt. Für
jeden Vergleich war wie in Kapitel 2.4.4.3 beschrieben die cDNA des einen Stammes mit
dem fluoreszierenden Farbstoff Cy3, die des anderen mit Cy5 markiert und das Gemisch mit
den Spots auf dem Chip hybridiesiert worden. Die Fluoreszenz bei 532 nm (Cy3-dUTP) und
635 nm (Cy5-dUTP) wurde bei einer Auflösung von 10 µm mit Hilfe des Axon Inc.GenePix
4000 Laser Scanner ermittelt. Die Fluoreszenzdaten wurden als TIFF Image gespeichert und
dieses mit Hilfe der GenePix Pro 3.0 software (Axon) ausgewertet. Jede Spotregion besteht
aus etwa 100 Pixeln und einem Hintergrund von etwa 600 Pixeln. Der Median des Cy3 und
des Cy5 Signals wurde verwendet um den Hintergrund vom Signal abzuziehen und daraus
die Cy5(Signal-Hintergrund)/Cy3 (Signal-Hintergrund) „Ratio of Median“ für jeden Spot zu
berechnen (7).
Berechnung der Ratio of Median.
P,λ2 = Pixelintensitäten gemessen bei der einen Wellenlänge;
P,λ1 = Pixelintensitäten gemessen bei der anderen Wellenlänge;
B,λ = Pixelintensitäten der Hintergrundpixel;
n/m = Anzahl der gemessenen Pixel; med = Median;
2. Material und Methoden
37
Die Ratio of Median der 80 E. coli Kontrollgene wurde herangezogen, um den
Normalisierungsfaktor zu berechnen. Der Mittelwert aller detektierbaren Signale wird
benutzt, um ein einzelnes Signal zu normalisieren. So sollen Variationen ausgeglichen
werden, die z.B. auf der Methode der Hybridisierung beruhen oder dem unterschiedlichem
Ausbleichen der Farbstoffe. Die zugrundeliegende Idee ist, dass es keine gravierenden
Änderungen in der Expression der meisten Gene gibt. Diese würden das durchschnittliche
Signal verändern. Dazu wurden diejenigen Spots herangezogen, bei denen die Hybridisierung
erfolgreich war. Bei den durchgeführten Experimenten waren das jeweils 71 – 79. Die Signal
zu Hintergrund Ratio sollte sowohl für das Cy3, als auch das Cy5 Signal größer drei sein. Das
traf je nach Array auf 26 – 63 Spots zu. Aus der Ratio of Median dieser Spots wurde der
Mittelwert berechnet. 1 geteilt durch den Mittelwert ergibt den Normalisierungsfaktor. Die
Ratio of Median der Kontrollspots wurde mit dem Normalisierungsfaktor multipliziert. Bildet
man nun zur Kontrolle den Mittelwert von den normalisierten Ratios of Median ist dieser 1.
Die normalisierten Ratios of Median werden nun herangezogen um zu berechnen, welche
Werte als signifikant gelten und welche nicht, indem zunächst die Standardabweichung und
daraus die Signifikanz (2x1+Standardabweichung) berechnet wird.
Mit den 4210 zu analysierenden Spots, die als Einzelspots den Offenen Leserastern des E. coli
Genoms entsprechen, wird nun ähnlich verfahren. Spots mit unzureichender Hybridisierung
werden aussortiert. Nur solche Spots werden betrachtet, bei denen entweder die Signal zu
Hintergrund Ratio des Cy3 Signals oder des Cy5 Signals größer drei ist. Die Ratio of Median
wird mit den Normalisierungsfaktor multipliziert. Am Ende wird nach den normalisierten
Ratios of Median gesucht, die als signifikant gelten. Das sind die Gene, deren Expression
nach dem oben berechneten Wert vermutlich signifikant verändert war.
2. Material und Methoden
38
2.4.5 EMSA – Electromobility Shift Assay
Im EMSA wird die Bindung von Protein an DNA sichtbar, indem ein an Protein gebundenes
Operatorfragment im Vergleich zu freier DNA im Gel verzögert wird. Dazu wurden die
Ansätze einmal im 1,5 % Agarose-Gel aufgetrennt und die DNA mit Ethidiumbromid gefärbt.
Zum anderen wurde die DNA mit [γ-32P]-ATP markiert und im nativen 8 % Polyacrylamidgel
aufgetrennt.
Die getesteten Operatorfragmente waren C9 (pTZ-C9), das einer NagC-Bindestelle entspricht,
M26 (pTZ-M26), das eine Mlc-Bindestelle beinhaltet und M120 (pTZ-M120), eine
Negativkontrolle. Die Fragmente wurden mit den oben genannten Plasmiden als Template
und den Primern N14E und N15B (118) mittels PCR amplifiziert.
Für die im Ethidiumbromid gefärbten Gel aufgetrennten Ansätze wurde je 1 µg der MlcVarianten (MlcWT, Mlc∆9 und Mlc ∆18) mit 100 – 200 ng Operatorfragment und einer
entsprechenden Menge von 2x Bindepuffer (25 mM HEPES; 100 mM Kaliumglutamat; 0,5
mg/ml BSA; pH 8,0) gemischt. Die Ansätze wurden für 10 min bei Raumtemperatur
inkubiert, dann 10 min bei 13 000 rpm (Minifuge, Eppendorf) abzentrifugiert. Die Proben
wurden mit einer adäquaten Menge Probenpuffer (2x Bindepuffer in 40 % Glycerin) versetzt
und auf das 1,5 % Agarosegel aufgetragen.
Zur Herstellung der
32
P-markierten DNA wurden die Operatorfragmente wie oben
beschrieben amplifiziert und das Phosphat an das 5´-Hydroxyl-Ende angefügt. Die
Markierungsreaktion erfolgte mittels [γ-32P]-ATP und einer T4 Polynukleotidkinase (MBI
Fermentas), die Reinigung der DNA-Fragmente mit den Mini Quick Spin Columns (Roche);
beides je nach Herstellerangabe. Die Operatorfragmente (7000 c.p.m), 500 ng der jeweiligen
Mlc-Variante, 0,5 µg Poly dI dC (Roche) als Kompetitor-DNA und 5 µl 2x Bindepuffer
wurden vermischt und mit Milliporewasser auf 10 µl aufgefüllt. Die Ansätze wurden für 10
min bei Raumtemperatur inkubiert und für 10 min bei 13 000 rpm (Minifuge, Eppendorf)
abzentrifugiert. Die Proben wurden wie oben mit Probenpuffer versetzt und mittels eines
nativen 8 % Polyacrylamidgeles aufgetrennt. Um aufgetrennten Banden sichtbar zu machen
wurde ein Röntgenfilm aufgelegt. Die Exposition erfolgte bei Raumtemperatur und über
Nacht.
2. Material und Methoden
39
2.5 Biochemische Methoden
2.5.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Proteine wurden unter denaturierenden Bedingungen über SDS-PAGE nach Laemmli, 1970
(82) aufgetrennt. Zur Orientierung wurde ein Gemisch von Proteinen bekannter Größe
aufgetragen (Low molecular weight marker, Pharmacia: 94, 67, 43, 30, 20,1, 14,4 kDa).
Proteine wurden mit Coomassie Brilliant Blue G250 (Fluka) gefärbt und sichtbar gemacht
(43, 146). Bei Ganzzellextrakten, beispielsweise Induktionskontrollen, wurde 1 ml Zellen
abzentrifugiert, das Pellet in 2x Auftragepuffer (140 mM TrisHCl, 16 % ß-Mercaptoethanol, 4
% SDS, 0,1 % Bromphenolblau, 40 % Glycerin, pH6,8) gelöst und dabei eine OD von 13,5
eingestellt (146). Die Proben wurden für 10 min gekocht und je 20 µl auf das Gel aufgetragen.
Gereinigtes Protein bzw. Membranpräparationen wurden im Verhältnis 1:2 mit 2x
Auftragepuffer vermischt.
2.5.2 Westernblot
Diese Methode ermöglicht den Nachweis bestimmter Proteine mittels polyklonaler
Antikörper (138). Die im SDS-Gel aufgetrennten Proteine wurden im Semi-Dry-Verfahren
auf eine Polyvinyliden-Difluorid-Membran (PVDF von Pall mit einer Porengrösse von
0,2µm) geblottet. Die spätere Zuordnung der Signale ermöglichte ein vorgefärbter
Proteinstandard (Precision Plus Protein Standard Biorad: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15,
10 kDa). Die Membran wurde in TBS Puffer (10 mM Tris/HCl pH 7,5; 150 mM NaCl)
gewaschen und in Puffer TBS-Tween/Triton (20 mM Tris/HCl pH 7,5; 500 mM NaCl; 0,05 %
[v/v] Tween; 0,2 % [v/v] Triton X-100) mit 2 % BSA geblockt. Der primäre Antikörper zur
Bindung an das zu analysierende Protein wurde entsprechend den Herstelleranweisungen
bzw. Qualität in der Blocking-Lösung verdünnt und 1h bis über Nacht mit dem Blot inkubiert.
Die Membran wurde zweimal in TBS-Tween/Triton Puffer gewaschen und in TBSTween/Triton mit 2% BSA und sekundärem Antikörper für mindestens 1h inkubiert. Als
sekundärer Antikörper wurde Anti-Mouse bzw. Anti-Rabbit IgG mit gekoppelter Alkaliner
Phosphatase (Sigma) verwendet. Dieser Antikörper wurde in Verdünnung 1:10000 zugesetzt.
Danach wurde die Membran dreimal in TBS-Tween/Triton Puffer und einmal in Puffer A
40
2. Material und Methoden
(100 mM Tris/HCl pH 9,5; 100 mM NaCl; 5 mM MgCl2) gewaschen. Die Farbreaktion
erfolgt durch Zugabe einer Lösung von NBT (Nitro Blue Tetrazolium) und XP (5-Bromo-4Chloro-3-Indolyl-Phosphat) in Puffer A. Zum Abstoppen der Farbreaktion wurde die
Membran mit deionisiertem Wasser gewaschen (Methode verändert nach Qiagen (128)).
2.5.3 Bestimmen der Proteinkonzentration
Proteinkonzentrationen wurden mit dem Coomassie Protein Assay Reagent (Biorad) nach der
Methode von Bradford (19) bestimmt.
2.5.4 Bestimmen der β-Galaktosidase-Aktivität
Die β-Galaktosidase (LacZ) aus E. coli spaltet neben seinem natürlichen Substrat auch das
Substratanalogon
ONPG
(Ortho-Nitrophenyl-ß-Galaktopyranosid). Es wird
Ortho-
Nitrophenol abgespalten, das im alkalischen Milieu einen gelben Farbstoff mit
Absorptsmaximum bei 405 nm ergibt. Ein promotorloses lacZ-Gen wurde an die potentielle
Promotorregion zu analysierender Genes fusioniert. Die Gelbfärbung im Assay ist als Maß für
die Expression dieses Genes unter Versuchsbedingung anzusehen.
Die Messungen wurden meist mit über Nacht-Kulturen (Wachstum für 18 +/- 1h)
durchgeführt, aber auch Wachstumsphasenabhängig. Dafür wurden von der wachsenden
Kultur alle 60 min 1ml Aliquots für den Assay entnommen. Die Zellen wurden in
Minimalmedium A nach Miller (93) unter Zusatz verschiedener Kohlenstoffquellen (siehe
Tabelle 6), falls nicht anders angegeben bei 37°C inkubiert. War die Induktion der Expression
eines plasmidkodierten Genes erforderlich, wurden die Kulturen bis zu einer OD578 = 0,5 (+/0,05) angezogen, geteilt, nur einem Teil 10-100 µM IPGT zugegeben und über Nacht weiter
inkubiert. Abweichungen zu dieser Standardprozedur werden je nach Experiment gesondert
angegeben. Der Test erfolgte mit Veränderungen nach der Methode nach Miller (92). Das
Pellet von 1ml Kultur wurde in 1ml Z-Puffer (Na2HPO4 60 mM, NaH2PO4 40 mM, KCl 10
2. Material und Methoden
41
mM, MgSO4 1 mM) resuspendiert und davon bzw. einer Verdünnung in Z-Puffer die OD bei
578 nm bestimmt. Zu 0,8 ml dieser Zellen wurden je 25 µl 0,1% SDS und Chloroform
gegeben, für 10 sek. gevortext und für 10 min bei RT inkubiert. Zu den nun permeabilisierten
Zellen wurde 140 µl ONPG (4 mg/ml in Z-Puffer) gegeben (= Start der Reaktion). War bei
einem Ansatz eine leichte Gelbfärbung zu erkennen, wurde die Reaktion mit Na2CO3 (1M)
abgestoppt. Die Zeit zwischen Start und Stop der Reaktion wurde gemessen. Der Ansatz
wurde für 10 min. (14500 rpm, RT, Eppendorf Minifuge Plus) abzentrifugiert und von 1ml
Überstand die Absorption bei 405 nm gemessen.
Die Enzymaktivitäten wurden wie folgt berechnet (11, 92):
-
Menge an umgesetztem ONPG pro Zeit in U[µmol x min-1]
-
spezifische Aktivität (U bezogen auf die Menge an Protein im Ansatz = U x mg-1)
Alle Messungen wurden mindestens zweimal mit voneinander unabhängigen Kulturen
durchgeführt.
2. Material und Methoden
42
2.5.5 Bestimmen der Aktivität der Alkalischen Phosphatase
Bakterienkulturen für diesen Test wurden analog denen in Kapitel 2.5.4 für den ßGalaktosidase-Test kultiviert. 0,2 ml einer Kultur wurden mit 0,8 ml TN-Puffer (10 mM
Tris/HCl pH8,0; 150 mM NaCl) vermischt. Die Verdünnung wurde abzentrifugiert ( 1 min,
RT, 14500 rpm, Ependorf Minifuge Plus) und zweimal in 1 ml TN-Puffer gewaschen. Das
Pellet wurde erneut in 1 ml TN-Puffer resuspendierd. 900 µl wurden zur Bestimmung der OD
bei 600 nm herangezogen, 100 µl wurden mit 900 µl Puffer2 (1 M Tris/HCl pH8,0; 0,1 M
ZnCl2) verdünnt und in den Test eingesetzt. Die Zellen wurden durch Zugabe von je 25 µl 0,1
% SDS und Chloroform, 10 sek vortexen und 10 minütiger Inkubation bei RT permeabilisiert.
Der folgende Enzymtest wurde bei 28°C durchgeführt. Zum starten der Reaktion wurde 100
µl des Substrates pNPP (para-Nitrophenyl Phosphat; 0,4 %) zugegeben und gevortext. Bei
Eintreten einer leichten Gelbfärbung wurde die Reaktion durch Zugabe von 120 µl 2,5 M
K2HPO4 gestoppt. Die Zeit zwischen Start und Stop der Reaktion wurde gemessen. Der
Ansatz wurde für 10 min bei 14500 rpm, RT zentrifugiert und danach 1 ml zum Bestimmen
der OD bei 405 nm abgenommen.
Die Azymaktivität wurde in Miller Units und wie folgt berechnet (92):
43
2. Material und Methoden
2.5.6 Reinigung von Protein
Die Proteine Mlc, EIIAGlc und IIBGlc wurden unter nativen Bedingungen mittels
Affinitätschromatographie und Gelfiltration gereinigt.
E. coli DHB4 wurde mit den in Tabelle 7 genannten Plasmiden transformiert und je nach
Effektivität der Überproduktion in 1-8 l LB- bzw. NZA-Medium bei 28°C bzw. 37°C
angezogen. Bei allen Plasmiden handelt es sich um Derivate von pQE-Vektoren der Firma
Qiagen, denen das lacIq-Gen, das für den Lamda-Repressor kodiert, eingefügt wurde (siehe
Tabelle 3). Die Überexpression wurde durch Zugabe von IPTG (10-100 µM/ml) zum in
Tabelle 7 genannten Zeitpunkt induziert. Nach weiteren 3 –5 h wurden die Kulturen geerntet
(4000 x g; 10 min; 4°C) und die Pellets bei –70°C eingefroren.
Plasmid
überproduziertes Protein
Induktion bei Wachstum bei
OD578 =
x°C
pSL104
Mlc mit N-terminalem His-tag
0,8
37
pMlc410
Mlc mit einer Deletion von 9 AS am C- 0,8
37
terminalem Ende; mit N-terminalem His-tag
pMlc401
Mlc mit einer Deletion von 18 AS am C- 0,8
37
terminalem Ende; mit N-terminalem His-tag
pSA9
pJFBH
EIIAGlc mit N-terminalem His-tag
Glc
IIB
mit C-terminalem His-tag
1,0
28
0,8
28
Tabelle 7. Plasmide - Überproduktion von Protein
2.5.6.1 Affinitätschromatographie
Die mit einem His-tag fusionierten Proteine wurden durch Ni2+-Affinitätschromatographie
gereinigt. Dazu wurde einerseits die Biorad Workstation und Säulen mit 2 – 5 ml Ni-NTASuperflow-Resin (Qiagen, Hilden) benutzt, anderseits der Äkta Purifier (Pharmacia) und 1ml
bzw. 5 ml HiTrap ChelatingHP-Säulen (Ammersham Pharmacia, Freiburg). Diese Säulen
wurden vor der Reinigung mit Ni2+, in Form von einem Säulenvolumen 0,1M NiSO4, beladen.
44
2. Material und Methoden
Die gefrorenen Zellpellets (siehe 2.5.6) wurden in 10 – 15 ml Lysispuffer (50 mM NaH2PO4,
300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) gelöst und die Zellen mit Hilfe der French Pressure Cell
(20K) aufgeschlossen. Zellbruchstücke wurden bei
27000 x g, 45min und 4°C
abzentrifugiert. Die Überstände wurden daraufhin filtriert (Porengröße 0,45 µm) oder
nochmals mit der Ultrazentrifuge mit 100000 xg, 30min, 4°C abzentrifugiert . Die Überstände
mit löslichem Protein wurden dann auf die Säule geladen.
Die Säulen wurden zuvor mit 5 Säulenvolumen Millipore-Wasser gewaschen und mit 5
Säulenvolumen Lysispuffer äquillibriert. Nach dem Laden der Zellextrakte wurde mit
Waschpuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol) nicht gebundenes Protein
von der Säule gewaschen bis die Absorption bei 280 nm unter 20 mAU (Milli-AbsorptionUnits) sank. An der Biorad Workstation wurde das gebundene Protein mit verschiedenen
Elutionspuffern mit steigendem Imidazolanteil eluiert:
Elutionspuffer
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
+
Elutionspuffer1
Elutionspuffer2
Elutionspuffer3
50 mM Imidazol
250 mM Imidazol
500 mM Imidazol
jeweils 3 – 5 Säulenvolumen
Am Äkta Purifier wurde durch Mischen des Wasch- und des Elutionspuffers (50 mM
NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazol) ein ansteigender Imidazolgradient erzeugt.
Die Flussrate betrug 1 ml/min und wurde bei sehr zähflüssigen Zellextrakten entsprechend
reduziert. Während des Ladens und Waschens wurden 5 ml-Fraktionen gesammelt, während
der Elution 0,5 ml-Fraktionen. Aliquots (10 – 15 µl) der Elutionsfraktionen wurden auf SDSGele aufgetragen und analysiert.
2. Material und Methoden
45
2.5.6.2 Gelfiltration
Elutionsfraktionen, die das gesuchte Protein enthielten, wurden vereinigt und weiter durch
Gelfiltration gereinigt. Dabei wurden die Proteine entsprechend ihrer Größe aufgetrennt und
damit konnten Proteine, die zuvor unspezifisch an die Ni-Säule gebunden hatten, abgetrennt
werden. Ein positiver Nebeneffekt ist, dass das Protein dabei umgepuffert und entsalzt wird.
Verwendet wurden die Biorad Workstation mit der Säule Superdex 200 HR 10/30
(Pharmacia, Freiburg) und der Äkta Purifier mit den Säulen Superdex 200 HR 10/30 und
HiLoad Superdex 200 HR 16/60 (Pharmacia, Freiburg). Die Säulen wurden mit 1
Säulenvolumen Millipore-Wasser und 1 Säulenvolumen 0,5 M NaOH regeneriert und mit 1,5
Säulenvolumen Laufpuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 7,5) äquillibriert. Die Säule
Superdex 200 HR 10/30 wurde mit bis zu 250 µl beladen, die Säule HiLoad Superdex 200 HR
16/60 mit bis zu 5 ml Proteinlösung. Die Elution erfolgte über weitere 1,5 Säulenvolumen mit
Laufpuffer. Dabei wurden Fraktionen von 1,0 – 1,2 ml gesammelt. Fraktionen mit erhöhter
Absorption bei 280 nm wurden mittels SDS-PAGE analysiert.
2.5.7 Bestimmen des Oligomerisierungsgrades von Mlc und YeeI mittels
Gelfiltration (4)
Die Methode der Gelfiltration (Größenausschlußchromatographie) kann verwendet werden
um das Molekulagewicht und die Größe eines Proteins abzuschätzen. Bei der Verwendung
vergleichbarer Moleküle mit unterschiedlicher Größe besteht eine Verbindung zwischen dem
Elutionsvolumen bzw. verschiedenen Elutionsparametern wie der Diffusionskonstanten Kav
und dem Logarithmus der Molekulargewichte. Dabei werden größere Moleküle weniger
leicht in der Säule zurückgehalten und eluieren vor kleineren Molekülen. Um einen möglichst
korrekte Bestimmung der Molkulargewichte der zu untersuchenden Proteine zu erhalten,
sollten die Vergleichssubstanzen, also die Proteine, mit denen die Säule geeicht wird, eine
vergleichbare Relation zwischen Molekulargewicht und molekularer Größe aufweisen. Da
dies gerade bei dem Vergleich von Proteinen unter nativen Bedingungen nicht immer der Fall
ist, liegt hierin eine gewisse Ungenauigkeit der Methode begründet.
2. Material und Methoden
46
Um das Molekulargewicht und den Polymerisierungsgrad von Mlc und YeeI unter nativen
Bedingungen zu bestimmen wurde wiederum die Methode der Gelfiltration wie oben
beschrieben angewandt. Es wurde der Äkta Purifier mit der Säule Superdex 200 HR 10/30
(Pharmacia; Säulenvolumen = 23,56 ml) verwendet. Die Säule wurde zunächst mit
Standardproteinen des HMW und LMW Calibration Kits (Pharmcia, Freiburg) geeicht. Das
Leervolumen der Säule wurde mit der Substanz Blue Dextran 2000 (2000 kDa) bestimmt.
Unter Einbeziehen des Elutionsvolumens, des Säulenvolumens und des Leervolumens wurde
für jedes Protein die entsprechende Diffussionskonstante Kav ermittelt. Aus den
Molekulargewichten (y-Achse, logarithmische Skalierung) und Diffusionskkonstanten (xAchse, lineare Skalierung) der Calibration Kit Proteine wurde eine Eichgerade erstellt. Das zu
untersuchende Protein wurde unter gleichen Bedingungen auf der Säule analysiert. Über das
Elutionsvolumen wurde der Kav-Wert berechnet und mit diesem und der Eichgerade das
Molekulargewicht des zu untersuchenden Proteins abgeschätzt.
2.5.8 Reinigen des Komplexes aus Mlc und IIBGlc (Koelution)
Die Reinigung der B-Domäne (IIBGlc) von PtsG mit C-terminalem His-tag erfolgte wie in
Kapitel 2.5.6 beschrieben. Eingesetzt wurden Zellen aus 8 l Bakterienkultur, was einen
Zellpellet von etwa 5 g entsprach. Das Protein wurde zwischen Affinitätschromatographie
und Gelfiltration mit einem 3 kDa-Filter konzentriert.
Zur Herstellung von Zellextrakten mit überproduziertem Mlc ohne His-tag wurde Stamm
IT1168 (ptsG::kan) transformiert mit Plasmid pSA1 verwendet. Die Zellen wurden in 2 l LBMedium (Amp100µg/ml) bei 37°C inkubiert. Bei einer OD578 von 0,7 wurde mit 100 µM IPTG
induziert und anschließend für weitere 5 h inkubiert. Die Zellen wurden bei 4000 x g, 4°C, 10
2. Material und Methoden
47
min geerntet und die Pellets bei –70°C eingefroren. Für den Test wurden die Zellen in 10 ml
Lysispuffer (20 mM HEPES, 0,8 mM NaH2PO4, 5 mM KCl, 137 mMNaCl, pH 7,0)
resuspendiert und mittels French Pressure Cell (20K) aufgeschlossen.
Die Koelution wurde am Äkta Purifier (Amersham, Pharmacia, Freiburg) mit der 5 ml HiTrap
ChelatingHP-Säule durchgeführt. Gereingtes IIBGlc wurde erneut über den His-tag an die Säule
gebunden. Dies geschah bei niedrigen Flussraten von 0,1 – 0,3 ml/min. Der Durchfluss wurde
nochmals geladen um auch noch Reste von IIBGlc an die Säule zu binden. Danach wurde der
Mlc Zellextrakt, ebenfalls bei niedrigen Flussraten (0,1 – 0,3 ml/min) geladen. Der Durchfluss
wurde noch zweimal wieder über die Säule gegeben um den im Zellextrakt enthaltenen Mlc
die Möglichkeit zu geben an das an der Säule gebundene IIBGlc zu binden. Dem Laden der
Proteine folgte das Auswaschen von nicht gebundenen Proteinen mit Waschpuffer
(Lysispuffer mit 10 mM Imidazol) bei einer Flussrate von 1 ml/min. Dies erfolgte solange bis
die Absorption bei 280 nm unter 100 mAU (Milli-Absorption-Units) gesunken war. Durch
Mischen von Waschpuffer und Elutionspuffer (Lysispuffer + 500 mM Imidazol) wurde ein
steigender Imidazolgradient bis hin zu 500 mM Imidazol angelegt und damit die an der Säule
gebundenen Proteine eluiert. Die Flussrate von 1 ml/min wurde beibehalten. Während des
Ladens der Protein und des Waschens der Säule wurden 5 ml Fraktionen gesammelt, während
der Elution Fraktionen von 0,5 ml. Fraktionen, die eine erhöhte Absorption bei 280 nm
aufwiesen wurden mittels SDS-PAGE analysiert.
2.5.9 Bindetests zwischen Mlc und EIICBGlc (PtsG)
Für die Bindetests zwischen Mlc und PtsG wurde Mlc mit N-terminalem His-tag und auch die
Mlc-Varianten (Mlc∆9 und Mlc∆18) mit N-terminalem His-tag wie unter 2.5.6.1 und 2.5.6.2
beschrieben gereinigt.
Für die Herstellung der invertierten Membranvesikel, die überproduziertes PtsG oder die
überproduzierten Fusionsproteine aus Gp8 und der IIB-Domäne von PtsG bzw.Gp8-IIBVarianten mit Punktmutationen, enthielten wurde folgende Methode angewandt. Der Stamm
IT1168 (ptsG::Tn5(kan)) oder Stamm JM-G77 (∆ptsG ∆ptsHIcrr) wurde mit den
entsprechenden Plasmiden transformiert (siehe Tabelle 8). Die Zellen wurden in MMA 0,4 %
2. Material und Methoden
48
Glycerin bei 37°C angezogen. Die Induktion mit 50 – 100 µM IPTG erfolgt bei OD578 = 0,5
(+/- 0,05) und über Nacht. Die Zellen wurden geerntet (4000 x g; 4°C; 10 min) und die Pellets
bei –70°C eingefroren.
Die Zellen wurden zweimal mit 0,9 % NaCl gewaschen, und ein Pellet aus 500 ml Zellkultur
wurde in 5 ml Bindepuffer (20 mM HEPES, 0,8 mM Na2HPO4, 5 mM KCl, 137 mM NaCl,
pH 7,0) resuspendiert. Die Zellen wurden mittels French press aufgebrochen und
Zellbruchstücke bei 27000 xg, 4°C, 15 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde
abgenommen, auf Eis aufbewahrt und die Proteinkonzentration nach Bradford bestimmt. Die
Menge an Überstand, die 2 mg an Gesamtprotein enthielt, wurde bestimmt und in 170 µl –
Schritten mit der Airfuge (Beckmann) bei 132000 x g; RT; 1 min abzentrifugiert. Das so
erhaltene Pellet wurde in 100 µl Bindepuffer resuspendiert. Dieser Ansatz enthält nun
Membranen, jedoch keine löslichen Proteine. Enthielten die Membranen PtsG gesamt wurde
2 µg gereinigtes Mlc zugegeben, enthielten sie die IIB-Domäne; versehen mit einem
Membrananker, wurde 1 µg Mlc zugegeben. Die Ansätze wurden 10 min bei RT inkubiert
und darauf nochmals für 1 min, RT, 132000 x g abzentrifugiert. Die Überstände, die lösliches
Protein, folglich auch nicht gebundenes Mlc, enthielten, wurden abgenommen und auf Eis
aufbewahrt. Die Pellets, die Membranen, Membranproteine und daran gebundene Proteine
(auch an PtsG gebundenes Mlc) enthielten, wurden erneut in 100 µl Bindepuffer
resuspendiert. Je 5 – 10 µl der Pellet und Überstandsfraktionen wurde auf 12 %ige SDS-PAAGele aufgetragen und anschließend mittels Westernblots mit Anti-IIB, Anti-Mlc oder AntiPenta-His-Antikörpern analysiert.
Als Negativkontrolle dienten Membranpräparationen von Stamm IT1168 oder von JM-G77,
die mit keinem Plasmid transformiert waren.
Plasmid
klonierte EIIB-Variante
pTZ-Gp8
Gp8-Protein des Phagen M13
pTZ-Gp8-IIB
Gp8 + Sequenz der B-Domäne des Enzyms IIBC (PtsG) des Glukose
PTS (Phosphotransferasesystem); entsprechend Aminosäure 391-477
pTZ-Gp8-IIB(Cys421Asp) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Cystein421 zu Aspartat)
pTZ-Gp8-IIB(Arg424Ala)
Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg424 zu Ala)
pTZ-Gp8-IIB(Arg424His)
Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg424 zu His)
2. Material und Methoden
Plasmid
klonierte EIIB-Variante
pTZ-Gp8-IIB(Arg424Lys)
Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg424 zu Lys)
pTZ-Gp8-IIB(Arg426Ala)
Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg426 zu Ala)
49
pTZ-Gp8-IIB(Asp419Ala) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Asp419 zu Ala)
pTZ-Gp8-IIB(Cys421Ser)
Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Cys421 zu Ala)
pTSG11
PtsG gesamt
Tabelle 8. Plasmide für die Überproduktion von EIIBCGlc und IIB-Varianten
Die Plasmide mit den kodierenden Sequenzen der Gp8-IIB-Varianten wurden von J.
Plumbridge (Institut de Biologie Physico-Chimique; Paris) bereitgestellt.
2.5.10 Bindetests zwischen Mlc und YeeI (Surface Plasmone Resonace) (13,
14)
Um zu testen ob eine Bindung zwischen Mlc und YeeI möglich ist wurde die Methode der
Messung der Oberflächenplasmonresonanz angewandt. Verwendet wurde dafür die BiacoreX
(Pharmacia) und der CM5 Sensorchip. Bei dem optischen Biosensor handelt es sich um einen
Basis-Chip mit einer 50 nm dicken Goldfolie auf einer Glasplatte, an deren Oberfläche eine
Carboxylierte Dextranmatrix aufgebracht ist. Proteine können über eine Amidbindung direkt
an die Carboxygruppen gekoppelt werden. Nicht gebundene Carboxygruppen werden mit
Ethanolamin abgesättigt. Im Gerät ergeben sich über dem Chip zwei von einander
unabhängige Flusszellen, die Rerferenzzelle (Flusszelle 1/F1) und die Messzelle (Flusszelle
2/F2). Das ermöglicht die Bindung eines Kontrollproteins in F1. Hier sollte ein später
zugegebener Analyt nicht binden. Der zu untersuchende Ligand wird in Flusszelle 2
gekoppelt. Der potentielle Bindepartner (=Analyt) des gebundenen Liganden wird in HBSEP-Puffer (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % Polysorbat) gelöst. Der pHWert des Puffer sollte dabei eins unter dem theoretisch ermittelten pI des Analyten liegen.
Der Analyt wird mit konstanter Flussgeschwindigkeit durch beide Flusszellen geleitet. Die
Bindung eines Proteins, sei es die Kopplung des Liganden oder die Bindung des Analyten,
2. Material und Methoden
50
entspricht einer Massenzunahme auf dem Chip, die mittels einer optischen Einheit detektiert
wird und in Responseunits (RU) angegeben wird. 1000 RU entsprechen 1 ng
Massenzunahme. Indem die erhaltene Signalhöhe der Referenzzelle, von der der Messzelle
abgezogen wird, erhält man ein Differenzsensorgramm, in welchen die möglicherweise
unspezifischen Bindungen des Analyten berücksichtigt sind. Im Differenzsensorgramm
erkennt man die Injektion des Analyten durch einem Anstieg der Signalhöhe, der
Assoziationskurve, und das Ende der Injektion in einem Abfall der Signalhöhe, die
Dissozialtionskurve (siehe Kap.3.2.1). Die verwendeten Proteine und Flussraten werden zu
den jeweiligen Experimenten in Kapitel 3.2.1 genannt.
2.5.11 Bindetests zwischen EIIAGlc und CyaA (Adenylatcyclase)
Dieser Test wurde vergleichbar dem Bindetest zwischen EIICBGlc und Mlc durchgeführt
(Kapitel 2.5.9). Es wurde davon ausgegangen, dass eine ausreichende Menge Adenylatcyclase
membranassoziert war. Von Stämmen, die die Adenylatcyclase oder deren Domänen
überproduziert hatten wurden Membranen präpariert, die unter in vitro Bedingungen
invertierte Membranvesikel bildeten. Die Membranen wurden mit gereinigtem EIIAGlc oder
mit Zellextrakten, die überproduziertes EIIAGlc enthielten inkubiert. Die Ansätze wurden 10
min bei RT inkubiert und darauf für 1 min, RT, 132000 x g abzentrifugiert. Die Überstände,
die lösliches Protein, folglich auch nicht gebundenes EIIAGlc enthielten, wurden abgenommen
und auf Eis aufbewahrt. Die Pellets, die Membranen, Membranproteine und daran gebundene
Proteine enthielten, wurden erneut in 100 µl Bindepuffer resuspendiert. Ein Unterschied zum
voherigen Test bestand darin, dass die Membranpellets P1 des ersten Zentrifugationsschrittes
nach der Inkubation der Membranen mit EIIAGlc nochmals in 100 µl Bindepuffer gelöst und
wieder abzentrifugiert wurden. Daraus hervor gingen Membranpellet 2 (P2) und Überstand 2
(S2). Für die Membranpräparationen wurden die Stämme (SA14; SA17; SA36) ohne
Adenylatcyclase (∆cyaA) bzw. ohne PtsG (∆ptsG) mit Plasmiden transformiert, die entweder
die Sequenz für die gesamte Adenylatcyclase trugen oder für deren Domänen (siehe Tabelle
9). Die Stämme wurden in MMA mit 0,4 % Glycerin und 0,5 % CAA angezogen. Die
Induktion der Expression mit 50 µM IPTG erfolgte sofort mit Beginn der Kultivierung der
Zellen und dann für 2-3 h oder je nach Plasmid mit 0,2 % Arabinose (siehe Tabelle 9), dann
bei OD578=0,8 und für 5h. Die Zellpellets wurden nach dem Waschen in einem modifizierten
51
2. Material und Methoden
Bindepuffer (siehe Kapitel 2.5.9, aber pH 8,5 und mit 5 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM ßMercaptoethanol) gelöst. Für den Bindetest wurde, je nach Qualität der Überproduktion, eine
Menge an Überstand verwendet, die 5 – 6 mg Gesamtprotein enthält. Als Negativkontrolle
dienten Membranpräparationen von Stamm SA15 (ptsG::TN5(kan), ∆cya crp*). Als
Bindepartner wurde, wie unter 2.5.6.1 beschrieben, gereinigtes EIIAGlc mit N-terminalem Histag verwendet oder Zellextrakte, die überproduziertes EIIAGlc ohne His-tag (Stamm
DHB4/JJ3 ∆cya ∆crr bzw. DG102 ∆ptsHIcrr mit Plasmid pBCP206) enthielten. Membranen
wurden durch Ultrazentrifugation bei 100000 x g, 8°C und 30 min entfernt. Für den Bindetest
wurde 2 µg gereinigtes Protein oder eine Menge an EIIA-Zellextrakt verwendet, die 5 bzw. 10
mg Gesamtprotein enthält. Pellet- und Überstandfraktionen wurden mittels Westernblot mit
Anti-Penta-His und Anti-EIIAGlc-Antikörpern analysiert.
Stamm
Plasmid
Induktion mit
SA14
pSA8 (cyaA)
Arabinose
SA17
pSA12 (cyaA)
Arabinose
pSA11 (cyaA mit N-terminalem His-tag)
IPTG
pSA16 (cyaA; regulatorische Domäne mit N-terminalem His- IPTG
tag)
pSA13 (cyaA ; katalytische Domäne mit N-terminalem IPTG
His-tag)
Tabelle 9. Plasmide - Überproduktion der Adenylatcyclasevarianten für Membranbindungstests
2. Material und Methoden
52
2.5.12 Zellextrakte für 2D-Gelelektrophorese (39)
Die 2D-Gelelektrophorese-Analysen und MALDI-Experimente wurden im Labor von Prof.
Dr. U. Völker in Greifswald durchgeführt.
Stamm KD413 mit pCS19 bzw. pSA1 wurde wie in Kapitel 2.4.4.1 beschrieben kultiviert.
Die Zellen wurden abzentrifugiert, zweimal in TE-PMSF (10 mM Tris pH7,5; 1 mM EDTA;
0,3mg/ml PMSF) gewaschen und das Pellet in 3ml TE-PMSF resuspendiert. Die Zellen
wurden mittels French pressure Cell aufgebrochen und Zelltrümmer bei 10000 x g, 4°C für 10
min abzentrifugiert. Dem folgte ein weiterer Zentrifugationsschritt für 1 h bei 100000 x g.
Die Gesamtproteinkonzentration im Zellextrakt wurde nach Bradford bestimmt und der
Extrakt bei –70°C eingefroren bis er auf Trockeneis verschickt wurde.
3. Ergebnisse
53
3. Ergebnisse
3.1 Mlc und PtsG – Analyse verschiedener Mlc- und EIIBGlc-Varianten
bezüglich ihrer Rolle bei der Bindung der Proteine und des Einflusses auf
die Mlc regulierten Gene
3.1.1 Der C-Terminus von Mlc
Frühere Untersuchen ergaben, dass eine Variante von Mlc, die einen C-terminalen His-tag
besitzt, weniger gut an PtsG enthaltende Membranen gebunden wurde als eine andere
Variante, die einen N-terminalen His-tag besitzt (Sung-Jae Lee, persönliche Mitteilung). Ein
weiterer Hinweis, dass der C-Terminus von Mlc eine gewisse Bedeutung für die Bindung von
Mlc an PtsG haben könnte, erfolgte durch S. Roseman, der bemerkte, dass durch die letzten
18 Aminosäuren des C-Terminus von Mlc eine möglicherweise amphipatische α-Helix
gebildet wird (siehe Abb.7). Derartige Helices besitzen eine vorwiegend polare, hydrophile
Seite und eine unpolare,
hydrophobe Seite und spielen eine wichtige Rolle bei der
Membranassoziation verschiedener Proteine (12, 165). In vergleichbarer Weise könnten die
hydrophoben Bereiche der Helix auch an der Interaktion von Mlc mit PtsG beteiligt sein.
Dementsprechend wurden zwei C-terminal trunkierte Varianten von Mlc hergestellt. Mlc∆9
besitzt einen um 9 Aminosäuren verkürzten C-Terminus, was der Hälfte der potentiellen
amphipatischen α-Helix entspricht. Mlc∆18 besitzt einen um 18 Aminosäuren verkürzten CTerminus, was der gesamten α-Helix entspricht (siehe Abb. 8). Alle 3 Proteine, die Cterminal trunkierten Varianten und MlcWT, besitzen einen N-terminalen His-tag und können
mittels Ni2+-Affinitätschromatographie gereinigt werden (siehe Kap. 2.5.6.1).
3. Ergebnisse
54
Abb. 7: Aufsicht auf die amphipatische α-Helix.
Gezeigt sind die 18 Aminosäuren des C-Terminus von Mlc, die die potentielle amphipatische α-Helix bilden .
Geladene Aminosären wurden mit +/- gekennzeichnet und befinden sich auf der linken Seite der Helix, während
sich auf der rechten Seite vorwiegend hydrophobe Aminosäuren befinden.
Abb. 8: Mlc-Varianten
Schematische Darstellung der überproduzierten Mlc-Varianten. Die mit Hilfe von pmlc410 und pmlc401
exprimierten Proteine weisen einen im Vergleich zum Wildtyp Mlc um 9 bzw. 18 Aminosäuren (AS) verkürzten
C-Terminus auf. Alle drei Proteine besitzen einen N-terminalen His-tag.
3.1.2 Membranbindetests mit PtsG (EIICBGlc) enthaltenden Membranen
und den Mlc-Varianten
Bindungstests mit Membranen, angereichert mit PtsG, und den Mlc-Varianten zeigten, dass
die ∆9 AS Variante von Mlc vergleichbar zu MlcWT durch PtsG an die Membran gebunden
wird, während die ∆18 AS Variante diese Fähigkeit verloren hat.
Die mit PtsG angereicherten invertierten Membranvesikel wurden wie in Kapitel 2.5.9
beschrieben hergestellt. Durch Zugabe von 2 µg der jeweiligen Mlc Variante wurde der
Bindetest (siehe Kap.2.5.9) gestartet. Nach dem Abzentrifugieren in der Ultrazentrifuge
3. Ergebnisse
55
befinden sich alle Membranen, Membranproteine und daran gebundene Proteine im Pellet.
Lösliche Proteine befinden sich wiederum im Überstand.
In Abbildung 9 ist der Westerblot dargestellt, der mit Antikörpern gegen Mlc durchgeführt
wurde und der die spezifische Bindung von Mlc an PtsG zeigt. Nur an die mit PtsG
angereicherten Membranen ist Mlc gebunden. Die Bindung von Mlc geschieht folglich über
PtsG und erfolgt nicht unspezifisch an die Membran. Fehlt PtsG, befindet sich Mlc
ungebunden als lösliches Protein im Überstand.
Abb. 9: Membranbindungstest von Mlc mit PtsG enthaltenden Membranen.
Bindungstests mit MlcWT und invertierten Membranvesikeln, die links kein PtsG enthalten (---) und rechts mit
PtsG (EIICB) angereichert sind. Die Überproduktion von PtsG erfolgte mit Stamm IT1168 (ptsG::Tn5(kan)),
tranformiert mit Plasmid pTSG11 (EIICBGlc= PtsG). Membranen wurden aus einem Volumen Zellextrakt
präpariert, das 2 mg Gesamtprotein enthielt. In welchen Fraktionen Mlc vorhanden ist, wurde mittels
Antikörpern gegen Mlc detektiert. Mlc ist nur in den Membranpellets (P) der mit PtsG angereicherten
Membranen vorhanden. Es bindet nicht an Membranen ohne PtsG und ist dann als lösliches Protein in der
Überstandfraktion (S) zu finden. Zu sehen ist die 37 und die 50 kDa Bande des Precision Plus All Blue
Standardes von Biorad (std).
Abbildung 10 zeigt den Bindetest zwischen PtsG und den Mlc Varianten. Wildtyp Mlc war
wie zuvor vorwiegend in der Pelletfraktion zu finden, ebenso die ∆9AS Variante von Mlc.
Beide Proteine wurden durch PtsG an die Membran gebunden. Die ∆18AS Variante von Mlc
befand sich im Überstand und wurde folglich nicht mehr durch PtsG an die Membran
gebunden.
3. Ergebnisse
56
Abb. 10: Membranbindetests mit den Mlc-Varianten
MlcWT, Mlc∆9, und Mlc∆18 wurden bezüglich ihrer Fähigkeit an PtsG haltige Membranen zu binden getestet.
Mlc wurde mit Mlc-Antikörpern detektiert. Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet, Überstandfraktionen mit
S. Zu sehen ist die 50 kDa Bande des Precision Plus All Blue Standardes von Biorad (std) in der ersten Spur und
zur Kontrolle eine zu den Bindetests vergleichbare Menge gereinigtes Mlc ohne Zugabe von
Membranpräparationen in der äußersten rechten Spur. Membranen wurden aus einem Volumen Zellextrakt
präpariert, das 2 mg Gesamtprotein enthielt.
3.1.3 Membranbindetests mit unterschiedlichen IIBGlc-Varianten und
MlcWT
Die Bindetests ergaben, dass die lösliche cytoplasmatische B-Domäne von PtsG ausreicht, um
Mlc zu binden und die Derepression der Mlc regulierten Gene zu bewirken, aber nur wenn die
B-Domäne mittels eines Membranankers an die Membran gebunden ist. Untersuchungen an
IIB-Mutanten mit einem Aminosäureaustausch in der exponierten Oberfläche in und um das
phosphorylierbare Cys421 zeigen, dass die Aminosäure Arg424 für die Bindung von Mlc
essenziell ist.
Es war bereits bekannt, dass die lösliche IIB-Domäne von PtsG genügt, um Mlc zu binden
(98). Dennoch wird Mlc in seiner Funktion als Repressor durch die Überproduktion der IIBDomäne nicht inaktiviert und die Expression der Mlc regulierten Gene unterbleibt (84). Eine
bereits in Kapitel 1.4.4 beschriebene deletierte Variante von PtsG vermittelt aber wieder
beides, die Bindung von Mlc und die Derepression der Mlc regulierten Gene. Bei dieser
Variante blieben Teile der C-Domäne von PtsG und der Linker zwischen B- und C-Domäne
3. Ergebnisse
57
erhalten. Eine Frage, die geklärt werden sollte, war, ob eine potentielle neunte Helix von PtsG
und der Linker zur B-Domäne für die B-Domäne einen Membrananker darstellen und Mlc
deshalb von der DNA abtitriert wurde, oder ob diese Sequenzen eine Erkennungssequenz für
Mlc darstellen.
Um dies zu testen wurde die löslichen IIB-Domäne mit ihren N-Terminus an das Gp8 Protein
des Phagen M13 fusioniert. Gp8 wird mittels einer Transmembranhelix in die
Cytoplasmamembran von E. coli eingelagert. Die B-Domäne von PtsG erhält dadurch einen
Membrananker, der keinerlei PtsG ähnliche Sequenzen enthält (50).
Die Bindetests mit dem Fusionsprotein ergaben, dass Mlc nur an die Membranen gebunden
wurde, die mit PtsG oder dem Fusionsprotein Gp8-IIB angereichert waren, nicht an jene, die
keines der Proteine oder nur den Membrananker enthalten. Das bedeutet: (I) Mlc bindet nicht
unspezifisch an die Membran an sich oder den Membrananker Gp8. (II) Die IIB-Domäne von
PtsG, ohne die ptotentielle neunte Helix und dem Linker, ist für die Bindung von Mlc
ausreichend (siehe Abb. 11).
Abb. 11: Bindung von MlcWT an Gp8-IIBGlc.
Die Membranen wurden aus Stamm JM-G77(∆ptsG ∆ptsHIcrr) präpariert, der aufgrund der Deletion der ptsGene PtsG und EIIBGlc nicht phosphorylieren konnte. Zu sehen sind die Bindetests mit Membranvesikeln, die
kein überproduziertes Protein enthalten (----), PtsG (EIICBGlc) von pTSG11, das Gp8-Protein des Phagen M13
(pTZ-Gp8) oder das GP8-IIB Fusionsprotein (pTZ-Gp8-IIB). Oben Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc,
unten mit Antikörpern gegen IIB. Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet, Überstandfraktionen mit S. Zu
sehen sind die 37 und die 50 kDa Standardbande (oben) oder die im Bild benannten Standardbanden (unten).
58
3. Ergebnisse
Obwohl für die Membranpräparation gleiche Mengen an Zellextrakt verwendet wurden, ob
nun EIICBGlc oder das Fusionsprotein Gp8-IIBGlc überproduziert wurde, ist im Falle des Gp8IIB-Fusionsproteins eine sättigende Mlc Bindung früher erreicht, so dass nur 1 µg Mlc, statt
wie bei Bindetests zu PtsG 2 µg, eingesetzt wurde. Die Kontrolle der Membranfraktionen mit
gegen EIIBGlc gerichteten Antikörpern zeigt ein Signal in den Spuren, in denen PtsG oder das
Fusionsprotein enthaltende Membranpellets aufgetragen waren. Das Fusionsprotein Gp8-IIB
wird in die Membran eingebaut und in etwa gleicher Menge gebildet wie PtsG, wobei dies,
bedenkt man die Färbung der Blots mit Alkaliner Phosphatase, nur eine grobe Schätzung
darstellt (siehe Abb. 11).
Mlc bindet nur an dephosphoryliertes PtsG, wie man es bei aktiven Transport von Glukose
vorfindet. Es könnte sein, dass Mlc überlappend mit der Phosphorylierungsstelle von PtsG,
dem Cystein421 im Bereich der B-Domäne, an PtsG bindet. In einer durch NMR
Spektroskopie ermittelten Struktur der löslichen IIB-Domäne findet man das Cys421
innerhalb einer konvexen Oberfläche. Es ist Teil eines polaren Bereichs, der von hydrophoben
Aminosäureresten und einem Halbkreis aus hydrophilen Aminosäureresten umgeben ist (25,
37). Es konnten weitere Aminosäuren ermittelt werden, die an der Stabilisierung des
gebundenen Phosphates, sowie am Phosphattransfer beteiligt sind. Diese Aminosäuren
befinden sich in der erwähnten Region um das Cys421 (25, 47). Deshalb wurden B-Domäne
Varianten
überprüft,
die
jeweils
einen
Aminosäureaustausch
in
oder
um
die
Phosphorylierungsstelle enthielten.
Es sollte einerseits der Frage nachgegangen werden, ob Mlc möglicherweise die Thiolgruppe
des Cys421 für die Bindung an PtsG nutzt. Deshalb wurde Cys421 durch Aminosäuren ohne
Thiolgruppe ausgetauscht. Andererseits sollte überprüft werden, ob die negative Ladung, des
an PtsG gebundenen Phosphates, die Bindung von Mlc verhindert. Der Austausch von
Cys421 nach Serin(Ser) bzw. Aspartat(Asp) soll die dephosphorylierte und die
phosphorylierte Spezies des Proteins imitieren. Dabei orientierte man sich an den Bacillus
subtilis Proteinen HPr (170) und LicT (160). Bei den beiden Proteinen führte der Austausch
von Serin (Ser/ bei HPr) oder His (bei LicT) nach Aspartat (Asp) dazu, dass die Proteine
aufgrund der negativen Ladung des Aspartats die Charakteristika eines phosphorylierten
Proteins besitzen. Mlc bindet jedoch nach wie vor an beide IIB-Varianten (siehe Abb. 12a).
Weder die zusätzlich negative Ladung, noch der Verlust der Thiolgruppe des Cysteins
verhinderten die Bindung an die Gp8-EIIBGlc-Varianten.
59
3. Ergebnisse
Die Bindung von Mlc an die IIB-Variante mit dem Austausch Asp419Ala konnte ebenfalls
nachgewiesen werden (siehe Abb. 12a).
Für Argenin 424 und Argenin (Arg)426 von PtsG wurde postuliert, dass sie eine
Stabilisierung der Phosphatbindung an PtsG bewirken, und dass sie für den Phosphattransfer
von EIIB auf Glukose benötigt werden (83). Im Bindetest wurde Mlc nach wie vor an die
IIB-Variante mit dem Austausch Arg426Ala gebunden. Im Gegensatz dazu erfolgt keine
Bindung von Mlc an die IIB-Variante mit dem Austausch Arg424Ala. Arg 424 scheint daher
an der Mlc Bindung beteiligt zu sein (siehe Abb. 12 a).
Bei dem Austausch von Arg 424Ala oder Arg424 gegen Lysin (Lys) befand sich im Bindetest
alles Mlc als lösliches Protein im Überstand. Wurde Arg424 hingegen durch Histidin (His)
ausgetauscht blieb ein Rest von Bindungsaktivität erhalten. Diese Bindung war aber weniger
stabil und lies sich durch nochmaliges abzentrifugieren und lösen des Membranpellets
auswaschen, was vor allem in den S2- Fraktionen (Überstand 2, nach dem Waschen der
Pellets) in Abbildung 12b zu sehen ist.
Die Bindetests wurden zudem mit Membranen aus Stamm IT1168 durchgeführt, in dem die
PTS
abhängige
Kulturbedingungen
Phosphorylierung
(siehe
der
Kap.2.5.9)
IIB-Varianten
kann
man
möglich
davon
ist.
ausgehen,
Aufgrund
dass
der
sowohl
phosphorylierte, als auch dephosphorylierte IIB-Varianten in den Membranen vorhanden
waren. Im Vergleich zu obigen Bindetests zeigte sich kein Unterschied in der Bindung von
Mlc an die IIB-Varianten mit dem Cys421 und dem Arg424Ala Austausch. Die Bindung zu
IIB ohne Mutation und dem Austausch Arg426Ala ist jedoch reduziert (siehe Abb. 13). IIB
ohne Mutation wurde jedoch durch IT1168 weniger überproduziert als durch JM-G77, so dass
hier vermutlich die zu geringe IIB Menge der Grund für die reduzierte Bindung ist (siehe
Abb. 13).
3. Ergebnisse
60
Abb. 12: Bindung von MlcWT an die Gp8-IIBGlc Varianten unter nicht
phophorylierenden Bedingungen.
Die Membranen wurden aus Stamm JM-G77 (∆ptsG ∆ptsHIcrr) präpariert, der aufgrund der Deletion der ptsGene PtsG und EIIBGlc nicht phosphorylieren konnte. In a) sind die Bindetests mit Membranvesikeln gezeigt, die
überproduzierte GP8-IIB Fusionsproteine enthalten, welche je einen im Bild gekennzeichneten
Aminosäureaustausch besitzen. Die Überproduktion erfolgte mittels pTZ-Gp8-IIB mit der entsprechenden
Mutation in IIB (siehe Tabelle 3 und Kap. 2.5.9). Oben Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc, unten mit
Antikörpern gegen IIB.
Bei den Bindetests in b) wurde ein zusätzlicher Waschschritt der Membranpellets durchgeführt. Daraus
resultieren die Fraktionen P2 (Pellet2) und S2 (Überstand2). Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet,
Überstandfraktionen mit S und der Standard (Precision Plus All Blue Standards von Biorad) mit std.
3. Ergebnisse
61
Abb. 13: Bindetests unter phosphorylierenden Bedingungen mit Membranen aus dem
Stamm IT1168 und Mlc WT.
Bindetest mit Membranvesikeln, die überproduzierte GP8-IIB Fusionsproteine enthalten, welche je einen im
Bild gekennzeichneten Aminosäureaustausch besitzen. Membranen wurden von Stamm IT1168
(ptsG::Tn5(kan)), transfomiert mit den entsprechenden Plasmiden, präpariert .In diesem Stamm ist die PTS
abhängige Phosphorylierung der IIB-Varianten möglich. Oben Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc, unten
mit Antikörpern gegen IIB. Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet, Überstandfraktionen mit S. Zu sehen
sind die 37 und die 50 kDa (oben) Bande und die im Bild benannten Banden (unten) des Precision Plus All Blue
Standardes von Biorad(std).
Die Fähigkeit der IIB-Varianten Mlc zu inaktivieren wurde zudem durch Messung der ptsGlacZ Reportergenfusion (ß-Galaktosidase Test) überprüft. Stamm JM-G77, der neben den
Deletionen von ptsG und ptsHIcrr auch noch eine transkriptionelle ptsG-lacZ-Fusion besitzt,
wurde mit den entsprechenden Plasmiden transformiert. Da in diesem Stamm die PTS
abhängige Phosphorylierung nicht stattfinden kann, liegen die IIB-Varianten dephosphoryliert
vor. Die Bindung von chromosomal kodiertem Mlc sollte, sofern möglich, sehr effektiv
erfolgen und einen deutlichen Anstieg der Expression von ptsG-lacZ bewirken. Zellen,
welche jene IIB-Varianten überproduzierten, die im in vitro Bindetest fähig waren Mlc zu
binden, zeigten eine um 10 –13 fach erhöhte ß-Galaktosidaseaktivität im Vergleich zu den
Zellen, die die IIB-Varianten überexpremierten, die den Austausch des Arg424 nach Ala, His
oder Lys besitzen und nicht mehr fähig waren Mlc zu binden (J. Plumbridge, persönliche
Kommunikation und in (141)). Mlc wurde durch das Gp8-EIIBGlc Fusionsprotein nicht nur an
die Membran gebunden, sondern auch in seiner Funktion als Repressor inaktiviert.
3. Ergebnisse
62
3.1.4 Die Mlc-Varianten und ihr Einfluss auf die Mlc regulierten Gene
Die für die Bindetests verwendeten Mlc-Varianten, MlcWT, Mlc∆9, Mlc∆18 und zudem
Mlc110 wurden bezüglich ihrer Fähigkeit die Mlc-regulierten Gene zu repremieren getestet.
Getestet wurde der Einfluss auf eine transkriptionelle malT- und eine transkriptionelle ptsGlacZ-Fusion. Mlc∆9 repremierte die Transkription der Reportergenfusionen vergleichbar zu
MlcWT. Mlc∆18 und Mlc110 haben ihre Funktion als Repressor komplett eingebüst und
zeigten keinerlei Repression der Reportergenfusionen. Eine Mlc-Variante mit einem
Aminosäureaustausch im HTH-Motiv zeigte die Charakteristika des MlcWT, während der
Austausch von Aminosäuren in einem potentiellen Zink-Bindemotiv (Mlc_AYA und
Mlc_SYS) zu einem Mlc mit stark eingeschränkter Repressorfunktion führte.
Die Expression von plamidkodiertem MlcWT und Mlc∆9 vermittelte eine starke Repression
der Reportergenfusionen, bis zu 24–fach bei malT-lacZ (siehe Abb. 14) und bis zu 112-fach
bei ptsG-lacZ (siehe Abb. 15). Mlc∆18 nahm keinen Einfluss auf die Transkription der Mlcregulierten Gene. Die ß-Galaktosidaseaktivität bei Überproduktion dieser Variante entsprach
der der Vektorkontrolle. Ebenfall keine Auswirkung auf die malT-lacZ Transkription hatte
eine weitere Mlc-Variante, Mlc110. Eine in frame Deletion führt bei dieser Variante zum
Verlust der Aminosäuren 188-191 von Mlc. Diese Mutation in Mlc entstand spontan bei
Wachstum von E. coli unter Glukoselimitation im Chemostaten (103). Die Sequenz dieser
Mlc-Mutante wurde amplifiziert und ebenfalls in einen Expressionsvektor kloniert. Für die Cterminal trunkierte Variante Mlc∆18 sah man nach der Reinigung des Proteins im SDS-Gel
eine definierte Proteinbande, die der Größe eines Monomers entsprachen. Es waren keine
Abbauprodukte zu erkennen. Im Gegensatz dazu gelang es bislang nicht Mlc110 zu reinigen,
da das Protein stets schon vor dem Zellaufschluss abgebaut wurde. Die fehlende
Repressorfunktion von Mlc110 lässt sich daher mit dem schnellen Abbau des Proteins
erklären (Daten nicht gezeigt).
Eine kristallisierte Mlc-Variante (MlcH52) besitzt eine Mutation im HTH (Helix-turn-Helix)
Motiv, einen Austausch des Arginin an Position 52 gegen Histidin (48, 139). Um zusätzliche
Hinweise über die Zuverlässigkeit der Kristallstruktur zu erhalten, sollte überprüft werden, ob
MlcH52 gleiche Charakteristika wie MlcWT besitzt. Im Zusammenhang mit der
Kristallstruktur wurde eine Metallbindestelle identifiziert. Durch diese wird ein Zinkion
gebunden. Das Motiv CYC (Cystein-Tyrosin-Cystein) befindet sich an Position 257 – 259
3. Ergebnisse
63
und wurde einmal verändert zu AYA (Alanin-Tyrosin-Alanin) oder zu SYS (Serin-TyrosinSerin). Wie zuvor wurden die Auswirkungen auf die Transkription einer ptsG-lacZ-Fusion
gemessen. MlcH52 repremierte die Expression von ptsG-lacZ in vergleichbarer Weise wie
MlcWT. Im Vergleich zur Vektorkontrolle war die ß-Galaktosidaseaktivität bei MlcWT und
MlcH52 um 96-360 fach reduziert. Beide Varianten mit Mutation im Metallbindemotiv,
Mlc_AYA und Mlc_SYS, bewirkten dagegen nur noch eine stark eingeschränkte Repression
um den Faktor 2,7-2,9 (siehe Abb. 16).
Abb. 14: Auswirkung von MlcWT, Mlc∆
∆9, Mlc∆
∆18 und Mlc110 auf die malT-lacZ
Expression.
Stamm ET104, der eine Mutation in mlc, cyaA, crp* und eine transkriptionelle malT-lacZ-Fusion besitzt, wurde
mit den Plasmiden pSL104 (MlcWT), pmlc410 (Mlc∆9), pmlc401 (Mlc∆18), pmlc110 (Mlc110) und zur
Kontrolle mit dem Vektor pGDR11 transformiert. Die crp*-Mutation hat die Expression eines CAP-Proteins zur
Folge, das unabhängig von cAMP aktiv ist. So kann der Effekt der Mlc-Überproduktion auf malT-lacZ ohne
Beeinflussung durch die Katabolitenrepression gemessen werden. Die Zellen waren in Minimalmedium mit 1%
CAA gewachsen und je eine Hälfte der Ansätze wurde mit 50 µM IPTG induziert (schwarze Balken). Die ßGalaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die
Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen.
3. Ergebnisse
64
Abb. 15: Auswirkung von MlcWT, Mlc∆
∆9 und Mlc∆
∆18 auf die ptsG-lacZ Expression.
Stamm JM-G2, der eine Mutation in mlc und eine transkriptionelle ptsG-lacZ-Fusion besitzt, wurde mit den
Plasmiden pSL104 (Mlc WT), pmlc410 (Mlc ∆9 AS), pmlc401 (Mlc ∆18 AS) und zur Kontrolle mit dem Vektor
pGDR11 transformiert. Die Zellen wurden in Minimalmedium mit 1% CAA inkubiert und je eine Hälfte der
Ansätze wurde mit 50 µM IPTG induziert (schwarze Balken). Die ß-Galaktosidaseaktivität wird als spezifische
Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen.
Abb. 16: Auswirkung von MlcWT, MlcH52, Mlc_AYA und Mlc_SYS auf die ptsG-lacZ
Expression.
Stamm JM-G2, der eine Mutation in mlc und eine transkriptionelle ptsG-lacZ-Fusion besitzt, wurde mit den
Plasmiden pmlc_wt, pmlc_H52, pmlc_AYA, pmlc_SYS und zur Kontrolle mit dem Vektor pQE60
transformiert. Die Zellen wurden in Minimalmedium mit 1% CAA inkubiert. Die ß-Galaktosidaseaktivität wird
als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigen
Messungen.
3. Ergebnisse
65
Bei der Aufnahme von externer Glukose ist PtsG überwiegend dephophoryliert (siehe Kap.
1.3 und 1.4). Ergänzend zu den Bindetests sollte gezeigt werden, in wie weit die Bindung der
Mlc-Varianten an das durch Glukosetransport dephosphoryliertes PtsG zu einer Derepression
der Mlc regulierten Gene führt. Geringe Mengen der plasmidkodierten Mlc-Varianten
werden auch ohne zusätzliche Induktion durch IPTG expremiert (siehe Abb. 14 und 15). Um
die Derepression der Reportergenfusion bei Wachstum auf Glukose zu untersuchen, wurde
die mlc-Transkription nicht mit IPTG induziert um die Mlc Mengen niedrig zu halten und es
damit zu ermöglichen, dass Mlc komplett von der DNA abgezogen und an PtsG gebunden
wurde. Bei den Zellen, die MlcWT oder Mlc∆9 exprimierten, zeigte sich eine etwa 2,2 - 2,6
fach höhere ß-Galaktosidaseaktivität, wenn die Zellen auf Glukose gewachsen waren. Ansätze
von Zellen mit Mlc∆18 haben eine vergleichbare ß-Galaktosidaseaktivität wie jene von
Zellen, die mit Vektor ohne Insert transformiert waren. Wobei zu bemerken ist, dass auch bei
der Vektorkontrolle die ß-Galaktosidaseaktivität der auf Glukose gewachsenen Zellen um 1,5
fach erhöht ist. Diese ist aber bei Mlc WT oder Mlc ∆9 AS mit 2,2 –2,6 fach stärker erhöht.
Zellen, die MlcWT oder Mlc∆9 exprimierten, bewirkten die Repression der Mlc abhängigen
malT-lacZ Fusion, welche durch Wachstum auf Glukose derepremiert wurde (siehe Abb. 17).
Das Messen der ß-Galaktosidaseaktivität nach Wachstum auf Glukose gab einen Hinweis
darauf, dass Varianten mit Mutation im Metallbindemotiv vermutlich nicht mehr oder nur
noch eingeschränkt an PtsG gebunden werden, da die verbleibende Repression nicht weiter
aufgehoben wird. Ein deutlicheres Ergebnis könnte in diesem Fall ein in vitro Bindetest zu
PtsG liefern. Im Gegensatz dazu führt die durch Glukose herbeigeführte Derepression von
MlcWT und MlcH52 zu einer um 15-30 fach erhöhten ß-Galaktosidaseaktivität (siehe Abb.
18).
3. Ergebnisse
66
Abb. 17: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der malT-lacZ
Expression.
Stamm ET104, transformiert mit den Plasmiden pSL104 (MlcWT), pmlc410 (Mlc∆9), pmlc401 (Mlc∆18) und
dem Vektor pGDR11 wurde auf Minimalmedium mit 1% CAA (graue Balken) und mit 0,5% CAA + 0,2%
Glukose (schwarze Balken) angezogen. Die Expression von mlc wurde nicht zusätzlich durch IPTG induziert.
Die ß-Galaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die
Mittelwerte aus zwei unabhängigen Messungen.
Abb. 18: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der ptsG-lacZ
Expression.
Stamm JM-G2, transformiert mit den Plasmiden pmlc_wt, pmlc_H52, pmlc_AYA, pmlc_SYS und pQE60
wurde auf Minimalmedium mit 1% CAA (graue Balken) und mit 0,5% CAA + 0,2% Glukose (schwarze Balken)
angezogen. Die Expression von mlc wurde nicht zusätzlich durch IPTG induziert. Die ß-Galaktosidaseaktivität
wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei
unabhängigen Messungen.
67
3. Ergebnisse
3.1.5 Die DNA-Bindung der Mlc-Varianten mit C-terminaler Deletion
Obwohl aus den Experimenten mit den Reportergenfusionen schon deutlich wird, dass Mlc
∆18 AS vermutlich nicht mehr an die Promotoren der Mlc-regulierten Gene binden kann,
wurden noch EMSA (Electromobility shift assays) mit drei unterschiedlichen DNAFragmenten und den C-terminal deletierten Mlc-Varianten durchgeführt. Die DNAFragmente
gingen
aus
einem
SELEX-Experiment
hervor
(118),
mit
dem
die
Konsensussequenz eines Mlc bzw. eines NagC Operators bestimmt werden sollte. M26 (pTZM26) enspricht einer idealen Mlc-Bindestelle, C9 (pTZ-C9) einer NagC-Bindestelle und
M120 (pTZ-M120) einer Negativkontrolle.
Die DNA-Fragmente wurden zusammen mit den MlcVarianten inkubiert und die Proben auf
ein 1,5% Agarosegel aufgetragen. Zur Kontrolle wie weit ungebundene DNA in das Gel
einläuft, wurde auch diese aufgetragen. Migriert ein DNA-Fragment weniger weit durch das
Gel, hat es ein höheres Molekulargewicht, da es durch den Repressor gebunden wurde. Weder
das DNA-Fragment C9 noch M120 wurde durch eine der Mlc-Varianten gebunden. Es gibt
also keine unspezifische Bindung an die NagC-Bindestelle oder die Negativkontrolle. Für
M26 zeigt sich eine Verzögerung der Bande für Ansätze, denen MlcWT und Mlc∆9
zugegeben wurde. MlcWT und Mlc∆9 binden an die DNA, nicht aber Mlc∆18 (siehe Abb. 19
a).
Da die DNA im ersten Versuch nicht komplett geshiftet war, wurde das Experiment
wiederholt. Diesmal wurden die DNA-Fragmente radioaktiv markiert. Auch hier zeigt sich:
MlcWT und Mlc∆9 binden an die DNA nicht aber Mlc∆18 (siehe Abb. 19 b).
3. Ergebnisse
68
Abb. 19: Electromobility Shift Assay.
Bindung von MlcWT und den Mlc-Varianten (Mlc410=Mlc∆9 und Mlc401=Mlc∆18) an das Mlc-OperatorFragment M26 und die Negativkontrollen M120 und C9 a) im 1,5 % Agarosegel mit Ethidiumbromidfärbung der
DNA und b) im nativen 8 % PAA-Gel mit 32P-markierter DNA. Bindet Protein an DNA entsteht ein Molekül mit
größeren Molekulargewicht, welches nicht so weit in das Gel einlaufen kann und als Shift der DNA-Bande
sichtbar wird.
3. Ergebnisse
69
3.1.6 Bestimmen der Quartiärstruktur von Wildtyp Mlc und den MlcVarianten
Mlc bindet über das N-terminale HTH-Motiv an eine palindrome DNA-Bindesequenz. Dies
ist nur möglich, wenn Mlc zumindest ein Dimer aus zwei Mlc Monomeren bildet, wobei jedes
an eine Halbseite des Operators bindet (110). Die Bestimmung der Quartiärstruktur unter
nativen Bedingungen ergab, dass MlcWT und die ∆9 AS Variante Tetramere bilden. Die ∆18
AS Variante von Mlc eluiert mit der Größe, die einem Dimer entspricht, von der Säule.
MlcH52, wurde unter verschiedenen Pufferbedingungen getestet. Auch für diese Variante
konnte gezeigt werden, dass unter den meisten Pufferbedingungen eine Tetramerisierung
stattfindet. In einem Puffer (0,8 M MgSO4) wie er für die Kristallisation von MlcH52
verwendet wurde (48), zeigen sich jedoch verschiedene Oligomerisierungszustände von
MlcH52. Im Vergleich zu den Eichproteinen eluiert ein Teil des Proteins mit der Größe eines
Tetramers, Trimers oder Dimers, während der Hauptteil mit der Größe eines Monomers
eluiert.
Zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcWT und den Mlc-Varianten, wurde das
Molekulargewicht von Mlc mittels Gelfiltration unter nativen Bedingungen, wie in Kapitel
2.5.7 beschrieben, bestimmt. Aus dem Elutionsvolumen (siehe Abb. 20) wurde die
Diffusionskonstante Kav verschiedener Eichproteine ermittelt und gegen den Logarithmus der
Molekulargewichte aufgetragen (siehe Abb. 21). Aus der damit erhaltenen Eichgerade und der
für die Mlc-Varianten ermittelten Kav wurde das Molekulargewicht der Mlc-Varianten
abgeschätzt (siehe Tab. 11). Das Monomer des gereinigten Mlc mit N-terminalem His-tag hat
ein vorhergesagtes und mittels SDS-PAGE bestätigtes Molekulargewicht von 46 kDa. Geht
man von maximal einem Tetramer aus hätte dieses ein Molekulargewicht von 184 kDa. Für
Mlc WT ergab sich aus der Gelfiltration ein Molekulargewicht von 183 kDa und für Mlc∆9
eines von 173 kDa, was in beiden Fällen für ein Tetramer aus vier Mlc Monomeren spricht.
Mlc∆18 eluierte als ein Protein mit dem Molekulargewicht von 94 kDa, was in etwa der
Größe eines Dimers entspricht
(siehe Abb. 20 und Tab. 11). Dass Mlc unter nativen
Bedingungen als Tetramer vorliegt, war auch schon von Nam et. al. (2001) (98) bestätigt
worden.
3. Ergebnisse
70
71
3. Ergebnisse
Abb. 20: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur der Mlc-Varianten.
Gezeigt sind die Elutionsprofile (von oben nach unten) von Bluedextran2000, der Eichproteine Catalase,
Albumin und ChymotrypsinogenA, der Eichproteine Aldolase und Ovalbumin, von MlcWT, Mlc∆9 und
Mlc∆18. Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mAU
(Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des
jeweiligen Proteins (Markierung – Inject). Das für die Proteine ermittelte Elutionsvolumen ist in der Abbildung
angegeben.
Abb. 21: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcWT und Mlc∆
∆9, Mlc∆
∆18.
Die Gelfiltrationssäule Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia) wurde mit Calibration Kit Proteinen mit einen
Molekulargewicht von 25 – 232 kDa geeicht (Vierecke/siehe Abb. 20 und Tab.11). Die aus dem
Elutionsvolumen ermittelten Kav-Werte wurden gegen den Logarithmus der Molekulargewichte aufgetragen.
Die Molekulargewichte der Mlc-Varianten (Kreise) wurden mit Hilfe der Kav-Werte und der Eichgerade
ermittelt. Die entsprechenden Werte sind in Tab. 11 aufgeführt.
Protein
eingesetzte Menge Elutionsvolumen Kav
Molekulargewicht
[mg/ml]
[kDa]
Catalse
5
10,673
0,1994
232
Aldolase
2
11,949
0,27867
158
Albumin
7
12,5
0,3129
67
Ovalbumin
7
13,39
0,3682
43
Chymotrypsinogen A
3
15,962
0,52798
25
MlcWT
2,56
10,9
0,21331
182,97
Mlc∆9
3
11,03
0,2214
172,88
Mlc∆18
2,3
12,4
0,3069
94,91
Tab. 11: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcWT, Mlc∆
∆9 und Mlc∆
∆18
3. Ergebnisse
72
MlcH52 ist die Mlc-Variante, die kristallisiert werden konnte. In einer Einheitszelle des
Kristalls befinden sich zwei Mlc Dimere. Um zu klären, ob dieser Widerspruch, Dimer im
Kristall und Tetramer in Lösung, durch die Mutation im HTH-Motiv dieser Variante oder
durch den bei der Kristallisation verwendeten Puffer zustande kommt, wurde das
Molekulargewicht von MlcH52 mit Hilfe der Gelfiltration mit unterschiedlichen Puffern
untersucht. Zunächst wurde es unter nativen Bedingungen in Tris-Puffer wie MlcWT zuvor
untersucht. Für MlcH52, dessen Monomer ein Molekulargewicht von 44 kDa hat, lies sich ein
Molekulargewicht von 189– 193 kDa ermitteln und liegt ebenfalls als Tetramer vor (siehe
Abb. 22 und Tab. 12). Gereinigtes MlcH52 wurde von K. Gerber (Uni-Konstanz)
bereitgestellt.
Abb. 22: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in TrisPuffer.
Gezeigt sind die erste und zweite Größenbestimmung von MlcH52 unter nativen Bedingungen (Puffer: 50 mM
Tris/HCl pH 7,5; 300 mM NaCl). Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm
bestimmt und ist in mAU (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das
Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung – Inject). Das für die Proteine
ermittelte Elutionsvolumen und Molekulargewicht ist in der Abbildung angegeben.
73
3. Ergebnisse
Protein
Elutionsvolumen
Kav
[ml]
Molekulargewicht
[kDa]
Thyroglobolin
9,68
0,1114
669
Ferritin
11,08
0,201
440
Aldolase
12,92
0,3188
158
Albumin
14,24
0,4033
67
Ovalbumin
15,15
0,4616
43
MlcH52
12,35
0,2823
192,88
MlcH52
12,39
0,2849
188,84
Tab. 12: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Trispuffer
Das Experiment wurde wiederholt
mit selbigem Puffer, der jedoch nun 10 mM ß-
Mercaptoethanol enthielt. Damit wurden reduzierende Bedingungen geschaffen wie man sie
im Zellinneren vorfindet. Das ermittelte Molekulargewicht von 203 kDa entsprach noch
einem Tetramer. An der Oligomerisierung scheinen keine Cysteine beteiligt zu sein, da diese
unter den Pufferbedingungen reduziert werden würden (siehe Abb. 23 und Tab. 13).
Abb. 23: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in TrisPuffer mit ß-Mercaptoethanol.
Gezeigt ist die Größenbestimmung von MlcH52 unter reduzierenden Bedingungen (Puffer: 50 mM Tris/HCl pH
7,5; 300 mM NaCl, 10 mM ß-Mercaptoethanol). Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption
bei 280 nm bestimmt und ist in mAU (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das
Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung – Inject). Das ermittelte
Elutionsvolumen und Molekulargewicht ist in der Abbildung angegeben.
74
3. Ergebnisse
Protein
Elutionsvolumen
Kav
[ml]
Molekulargewicht
[kDa]
Ferritin
11,24
0,2113
440
Aldolase
12,82
0,3124
158
Albumin
14,16
0,3982
67
MlcH52
12,44
0,2881
202,6
Tab. 13: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 inTrispuffer mit ßMercaptoethanol
Als nächstes wurde das Laufverhalten von MlcH52 in dem Glycinpuffer getestet, in dem das
Protein vor der Kristallisation gereinigt wurde. Das ermittelte Molekulargewicht von 246 kDa
liegt zwischen einem Penta- und einem Hexamer (siehe Abb. 24 und Tab. 14).
Abb. 24: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in
Glycinpuffer.
Gezeigt ist die Größenbestimmung von MlcH52 in Glycinpuffer (10 mM Glycin/NaOH, 50 mM NaCl; pH 9,5).
Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mAU (MilliAbsorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des
jeweiligen Proteins (Markierung – Inject). Das ermittelte Elutionsvolumen und Molekulargewicht ist in der
Abbildung angegeben.
75
3. Ergebnisse
Protein
Elutionsvolumen
Kav
[ml]
Molekulargewicht
[kDa]
Ferritin
10,68
0,1755
440
Aldolase
12,82
0,3124
158
Albumin
14,41
0,4142
67
MlcH52
11,87
0,2516
245,7
Tab. 14: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Glycinpuffer
Zusätzlich wurde das Laufverhalten im Kristalisationspuffer überprüft. Im Elutionsprofil war
eine Vielzahl an Peaks zu sehen, die zum Teil ineinander übergingen (siehe Abb. 25 und Tab.
15). Der zuerst erscheinende Peak bei einem Elutionsvolumen von 12,55 ml entspricht,
verglichen mit den Eichproteinen, einem Mlc Tetramer mit einer Größe von 201 kDa, der
größte Peak bei 15,74 ml einem Monomer der Größe von 46 kDa. Die Peaks mit einem
Elutionsvolumen größer als 15,74 ml würden, im Vergleich mit den Eichproteinen, Proteine
kleiner als ein Monomer ergeben (siehe Abb. 26 und Tab. 15). Trägt man jedoch Aliquots aus
den gesammelten Fraktionen dieser Peaks auf ein SDS-PAA-Gel auf, erhält man stets ein Mlc
Monomer mit einer Größe von 44 kDa. Es sind keine kleineren Banden zu erkennen, die auf
einen Abbau des Proteins hinweisen würden (siehe Abb. 27). Eine möglich Erklärung wäre,
dass Mlc in diesem Puffer leicht als Komplex ausfällt, wenn es konzentriert wird. Letzteres
geschieht zunächst beim Laden des Proteins auf die Säule, und vermutlich kann deshalb nicht
alles Protein, das geladen wurde, gleichzeitig in die Säule einlaufen. Dieses wurde dann nach
und nach freigesetzt, so dass sich im Grunde verschiedene Elutionsprofile überlagern.
Deshalb ist es fraglich, ob man bei dem Lauf in diesem Puffer wirklich eine Mischung
unterschiedlicher Oligomere erhalten hat.
3. Ergebnisse
76
Abb. 25: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in
Kristallisationspuffer.
Gezeigt ist die Größenbestimmung von MlcH52 in Kristallisationspuffer (0,8 M MgSO4; 50 mM MES; 25 mM
NaCl; pH 6,3). Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in
mAU (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der
Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung – Inject). Die ermittelte Elutionsvolumina und Molekulargewichte
sind teilweise ist in der Abbildung angegeben (vgl. Tab. 15).
Abb. 26: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcH52 in Kristallisationspuffer.
Die Gelfiltrationssäule Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia) wurde mit Calibration Kit Proteinen mit einen
Molekulargewicht von 43 – 669 kDa geeicht (Vierecke/siehe Tab. 15). Die für die Eichproteine berechneten KavWerte wurden gegen den Logarithmus der Molekulargewichte aufgetragen. Die Molekulargewichte von MlcH52
(Kreise) wurden mit Hilfe der Kav-Werte und der Eichgerade ermittelt. Gezeigt sind die Werte für einige
beispielhaft herausgegriffene Peaks (vgl. Abb. 25).
77
3. Ergebnisse
Protein
Elutionsvolumen[ml] Kav
Thyroglobulin
Ferritin
Aldolase
Albumin
Ovalbumin
Peak 1 (MlcH52)
Peak 2 (MlcH52)
Peak 3 (MlcH52)
Peak 4 (MlcH52)
Peak 5 (MlcH52)
Peak 6 (MlcH52)
Peak 7 (MlcH52)
Peak 8 (MlcH52)
Peak 9 (MlcH52)
Peak 10 (MlcH52)
10,17
10,46
13,6
14,64
15,83
12,55
12,66
12,9
13,42
15,6
15,74
17,74
18,59
19,54
20,26
0,1428
0,1613
0,3624
0,4289
0,5051
0,2951
0,3022
0,3175
0,3508
0,4904
0,4994
0,6274
0,6818
0,7426
0,7887
Molekulargewicht
[kDa]
669
440
158
67
43
201,2
- Tetramer
191,2
171,2
134,7
- Trimer
49,3
46,2
- Monomer
18,4
12,4
8,02
5,75
Tab. 15: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Kristallisationspuffer.
Abb. 27: Analyse augewählter Peakfraktionen bei der Gelfiltration zur Bestimmung des
Molekulargewichtes von MlcH52.
Analyse der Peakfraktionen, die zur Berechnung der Mlc-Molekulargewichte herangezogen wurden. Die
dazugehörigen Chromatogramme sind in Abb. 22 (Puffer1/Tris), in Abb. 23 (Puffer2/Tris+ß-Mercaptoethanol),
in Abb. 24 (Puffer3/Glycin) und in Abb. 25 (Puffer4/0,8 M MgSO4/Kristallisation) gezeigt. Alle ausgewählten
Peaks enthalten Mlc, mit einer Größe von 44 kDa im 12% SDS-PAA-Gel.
78
3. Ergebnisse
3.1.7 Koelution von Mlc WT mit der löslichen B-Domäne von PtsG
Die lösliche B-Domäne von PtsG reicht aus, um Mlc zu binden (98). Dann sollte es auch
möglich sein, den Komplex aus Mlc und EIIBGlc zu reinigen, einerseits für die mögliche
Kristallisation des Komplexes, andererseits als zusätzlichen Beweis, dass Mlc wirklich
effektiv durch die IIB-Domäne gebunden werden kann, auch wenn diese nicht
membranassoziiert ist.
Wie in Kapitel 2.5.8 beschrieben, wurde die gereinigte IIB-Domäne von PtsG, versehen mit
einem
C-terminalen
His-tag,
an
eine
HiTrap
Chelating
Säule
(Ni2+-Affinität
Chromatographie) gekoppelt. Die Säule wurde dann langsam mit Zellextrakten, die
überproduziertes Mlc ohne His-tag enthielten, beladen. EIIBGlc bindet über den His-tag an die
Säule. Mlc bleibt nur an die Säule gebunden, wenn es an EIIBGlc bindet. Die ungebundenen
Proteine wurden ausgewaschen und die an die Säule gebundenen Proteine mit einem
steigenden Imidazolgradienten eluiert. Ausgewählte Fraktionen (siehe Abb. 28) wurden
mittels SDS-PAGE analysiert (siehe Abb. 29). Die Aliquots der letzten Waschschritte vor der
Elution enthalten kein Mlc oder IIB (siehe Spur 9 in Abb. 29/Fraktion 45 in Abb.28). Beide
Proteine sind an die Säule gebunden und eluieren erst bei steigender Imidazolkonzentration.
Man erhält Elutionsfraktionen mit drei oder zwei dominanten Proteinen. Bei der, relativ zu
den anderen, höher im Gel laufenden Bande handelt es sich um Mlc mit einem
Molekulargewicht von 44 kDa, bei der am weitesten in das Gel eingelaufenen Bande um IIB
(His 6x) mit einem Molekulargewicht von 12 kDa (Spur 22 –25 in Abb. 29). Bei der mittleren
Bande könnte es sich um EIIAGlc handeln, welches ebenfalls an IIB binden kann und das
entsprechende Molekulargewicht von etwa 20 kDa besitzt (Spur 20 und 26 – 28 in Abb. 29).
Die Fraktionen 88-100 enthalten nur Mlc und IIB(His6x), welche erst bei erhöhter
Imidazolkonzentration gemeinsam von der Säule eluierten. Das bedeutet, dass Mlc und
IIB(His6x) in diesen Fraktionen aneinander gebunden hatte.
3. Ergebnisse
79
Abb. 28: Elutionsprofil der Koelution von Mlc und IIBGlc(His6x).
Das gesamte Elutionsprofil der Koelution von Mlc und IIB(His6x) wird in der oberen Bildhälfte und ein
Ausschnitt (Elutionsfraktionen) aus diesem wird in der unteren Bildhälfte gezeigt. Die Proteinkonzentration
(blaue Kurve) wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mAU (Milli-AbsorptionUnits/ linke Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml. Die Konzentration an Puffer B
(in %: Elutionspuffer mit 500 mM Imidazol) im Gemisch mit dem Laufpuffer (mit 10 mM Imidazol) ist grün
dargestellt (rechte Y-Achse).
Abb. 29: Koelution von Mlc und IIBGlc(His6x).
Wie in Kapitel 2.5.8 beschrieben, wurde ein Komplex aus EIIBGlc mit C-terminalem His-tag und Mlc ohne Histag von einer HiTrap Chelating Säule koeluiert. EIIB wurde mit Stamm IT1168, transformiert mit Plasmid
pJFBH, überproduziert. Das dazugehörige Elutionsprofil ist in Abb. 28 zu sehen. Ausgewählte Fraktionen
wurden auf ein 12% SDS-PAA-Gel aufgetragen und die Gele nach dem Lauf mit Coomassie gefärbt. – Spur 19: Auswaschen von ungebundenen Protein – ab Spur 10: Elution gebundener Proteine mit steigenden
Imidazolgradienten. – Spur 22- 25: gemeinsame Elution von Mlc und EIIBGlc;
3. Ergebnisse
80
3.1.8 Überblick zu den Untersuchungen an den Mlc- und der EIIBGlcVarianten
Kapitel 3.1 zusammengefasst bedeutet, dass Mlc an membrangebundenes PtsG bindet (3.1.2).
Die lösliche IIB-Domäne von PtsG ist ausreichend um Mlc zu binden (3.1.3 und 3.1.7). Die
Derepression der Mlc kontrollierten Gene und damit die Inaktivierung von Mlc erfolgt nur,
wenn die IIB-Domäne durch einen Membrananker membrangebunden ist (3.1.3). Der
Membrananker muss dabei keine Ähnlichkeit zu PtsG aufweisen.
Arg424 eine der Aminosäuren, die in einer exponierten Region um die Phosphorylierungstelle
(Cys421) von PtsG zu finden ist, scheint für die Mlc-Bindung essenziell zu sein (3.1.3).
Das C-terminal deletierte Mlc∆9 bindet an PtsG (3.1.2), repremiert die Mlc regulierten Gene
(3.1.4 und 3.1.5) und bildet wie MlcWT ein Tetramer (3.1.6), während Mlc∆18 weder an
PtsG (3.1.2), noch an DNA bindet und somit die Mlc regulierten Gene nicht mehr repremiert
(3.1.4 und 3.1.5). Mlc∆18 bildet im Gegensatz zu den anderen Varianten nur noch ein Dimer
(3.1.6). Der C-Terminus von Mlc bewirkt direkt die Tetramerisierung oder wird für den Erhalt
der Gesamtstruktur benötigt, welche dann die Tetramerisierung ermöglicht. Die Bildung des
Tetramers ist eine Voraussetzung für die Bindung an die DNA und an PtsG.
Die Mlc-Variante MlcH52, mit einem Aminosäureaustausch im HTH-Motiv, zeigt zu Mlc
WT identische Eigenschaften (3.1.4 und 3.1.6). Die Varianten Mlc_AYA und Mlc_SYS, mit
Veränderungen in der Metallbindestelle, repremieren die Mlc regulierten Gene nur noch stark
eingeschränkt (3.1.4). Mlc110, die Variante mit einer in frame Deletion, die zum Verlust von
drei Aminosäuren führt, zeigt keine Repression und lässt sich nicht als intaktes Protein
reinigen (3.1.4).
81
3. Ergebnisse
3.2 Bindung zwischen Mlc und YeeI
Mit diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass Mlc nicht nur durch dephosphoryliertes
PtsG, sondern auch durch das vermutlich lösliche Protein YeeI gebunden wird. An PtsG
gebundenes Mlc konnte nicht, auch nicht durch einen Überschuss an YeeI, von PtsG abtitriert
werden. Unter nativen Pufferbedingungen liegt YeeI als Dimer vor.
3.2.1 Bestimmen der Quartiärstruktur von YeeI
Dies wurde, wie bereits unter Kapitel 2.5.7 und Kapitel 3.1.6 beschrieben, durch Gelfiltration
unter nativen Bedingungen untersucht. Für die Kalibrierung der Säule wurden die in Tabelle
16 genannten Eichproteine verwendet. Die Kav Werte wurden, wie in Kapitel 2.5.7
beschrieben, berechnet und gegen den Logaritmus der Molekulargewichte in ein Diagramm
eingetragen (siehe Abb. 31). Mittels dieser Eichgerade und den für YeeI ermittelten Kav
Werten (Tab. 16), wurde das Molekulargewicht für YeeI bestimmt. Die ermittelten
Molekulargewichte von 51– 52 kDa sind etwas kleiner als zweimal das aus der Primärstruktur
von YeeI abgeleitete Molekulargewicht von 31 kDa, weisen aber dennoch auf die Bildung
eines Dimers hin (siehe Abb. 30/31 und Tab. 16).
Protein
Elutionsvolumen[ml] Kav
Molekulargewicht
[kDa]
Aldolase
11,99
0,267
158
Albumin
13,24
0,346
67
Ovalbumin
14,5
0,426
43
Chymotrypsinogen A
15,9
0,515
25
YeeI - Elution 1
14,17
0,405
51,55
YeeI - Elution 2
14,19
0,407
50,8
Tab. 16: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von YeeI.
3. Ergebnisse
82
Abb. 30: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur von YeeI.
Gezeigt sind die Elutionsprofile (von oben nach unten) der Eichproteine Aldolase, Albumin, Ovalbumin und
ChymotrypsinogenA, und von zwei verschiedenen Läufen mit gereinigtem YeeI. Die Proteinkonzentration
wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mAU (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse)
dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung –
Inject). Das für die Proteine ermittelte Elutionsvolumen und Molekulargewicht ist in der Abbildung angegeben.
3. Ergebnisse
83
Abb. 31: Bestimmen des Molekulargewichtes von YeeI.
Die Gelfiltrationssäule Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia) wurde mit Calibration Kit Proteinen mit einen
Molekulargewicht von 43 – 669 kDa geeicht (Vierecke). Die aus dem Elutionsvolumen berechneten Kav-Werte
wurden gegen den Logarithmus der Molekulargewichte aufgetragen. Die Molekulargewichte von YeeI
(überlagerte Kreise) wurden mit Hilfe der Kav-Werte und der Eichgerade ermittelt. Bezogen auf das
Elutionsprofil siehe Abb. 30.
3.2.2 Oberflächenresonanzspektroskopie
Die Durchführung der Bindetests zwischen Mlc und YeeI (siehe Kap. 2.5.10) erfolgte unter
Anleitung von Kerstin Mahr (FAU Erlangen-Nünberg) und in Kooperation mit Ann-Katrin
Becker (Universität Osnabrück). Die Kontrollproteine Bld (Streptomyces coelicolor), CcpA
(Lactobacillus cassei) und HPr (Streptomyces coelicolor) wurden von Kerstin Mahr zur
Verfügung gestellt, YeeI (E. coli) von Ann-Katrin Becker. Dargestellt sind die Versuche mit
gereinigtem Protein (für Mlc siehe Kap. 2.5.6).
Im ersten Experiment wurde Mlc mit C-terminalen His-tag in Flusszelle 2 (F2) an den Chip
gekoppelt und als Kontrolle Bld aus Streptomyces coelicolor in Flusszelle 1 (F1). YeeI mit Nterminalen His-tag wurde mit einer Flussrate von 20 µl/min über den Chip geleitet. Die
Differenz zwischen F2 und F1 betrug 230 RU (Responseunits) (Abb.32). Die in F2 höhere
Massenzunahme als in F1 gibt einen Hinweis auf eine Bindung zwischen Mlc und YeeI. Der
Chip wurde durch Zugabe von 0,5 M NaCl regeneriert. Als weitere Kontrolle, ob die Bindung
von YeeI an Mlc spezifisch erfolgte, wurde Bld aus Streptomyces coelicolor und CcpA aus
Lactobacillus cassei durch die Flusszellen geleitet. Für diese Proteine wurde keine Bindung
an Mlc nachgewiesen.
3. Ergebnisse
84
Abb. 32: Oberflächenresonanzspektroskopie; Bindung von an den Chip gebundenen
Mlc mit YeeI.
Mlc WT wurde an einen CM5 Sensorchip gebunden (siehe Kap. 2.5.10) und YeeI darübergeleitet. Zu sehen ist
das Differenzsensorgramm der gemessenen Responseunits (RU) in Flusszelle2 – Flusszelle1. Gezeigt ist die
Veränderung der Responseunits (y-Achse) bezogen auf die Zeitspanne, zu der der Analyt (YeeI) zugegeben
wurde (min/x-Achse). Die Differenz der RU in F2-F1 steht für die Massenzunahme durch an Mlc gebundenes
YeeI. Diese beträgt 230 RU. Letzteres weist auf eine Bindung zwischen beiden Proteinen hin.
In einem zweiten Experiment wurde YeeI in F2 an den Chip gekoppelt und in F1 zur
Kontrolle CcpA aus Lactobacillus cassei. Danach wurde in drei aufeinanderfolgenden
Schritten je 20 µl einer 50 nM Lösung von MlcWT mit N-terminalen His-tag, Mlc∆9 und
Mlc∆18 mit N-terminalen His-tag als Analyt durch die Flusszellen geleitet. Zwischen den
Schritten wurde der Chip mit 0,5 M NaCl regeneriert. Die Flussrate betrug auch hier 10
µl/min. Die Differenz der Massenzunahme (F2-F1) betrug für MlcWT 2490 RU, für Mlc∆9
500 RU und für Mlc∆18 0 RU. MlcWT bindet an YeeI, die Bindung von Mlc∆9 an YeeI ist
stark reduziert und Mlc∆18 ist nicht mehr fähig an YeeI zu binden (siehe Abb. 33). Als
zusätzliche Kontrollen wurden Bld und Hpr aus Streptomyces coelicolor durch die Flusszellen
geleitet. Damit konnte keine unspezifische Bindung an YeeI dedektiert werden.
3. Ergebnisse
85
Abb. 33: Bindung der Mlc-Varianten an chipgebundenes YeeI.
YeeI (30 µl von 0,2 mg/ml Protein) wurde in Flusszelle 2 gebunden, CcpA (Lactobacillus cassei) (10 µl von
0,13 mg/ml Protein) in Flusszelle1. Dargestellt ist die Veränderung der Responseunits (y-Achse) bezogen auf die
Zeitspanne, zu der der Analyt (Mlc-Varianten/je 20 µl einer 50 nM Lösung) zugegeben wurde (min/x-Achse).
Die Differenz der Massenzunahme in Flusszelle 2 und 1 (F2-F1) beträgt für MlcWT 2490 RU, für Mlc∆9 500
RU und für Mlc∆18 0 RU.
3.2.3 Beeinflußt YeeI die Bindung von Mlc an PtsG ?
Um diese Frage zu klären, wurden, wie zuvor beschrieben (Kap. 2.5.9 und 3.1.1-3.1.3),
Bindetests zwischen mit PtsG angereicherten Membranvesikeln und gereinigtem Mlc
durchgeführt. Zu diesen Ansätzen wurde, während der Phase der Inkubation von Mlc mit den
PtsG-Membranen, gereinigtes YeeI in unterschiedlichen Konzentrationen gegeben. Die
nachfolgenden Zentrifugationsschritte wurden wie bei den Bindetests zuvor durchgeführt. Die
Konzentration von PtsG in den Membranen lässt sich nicht leicht bestimmen. Deshalb wurden
die eingesetzten Mengen der Monomere der gereinigten Proteine, Mlc und YeeI miteinander
verglichen. Bedenkt man die Größe eines Monomers von MlcWT mit N-terminalen His-tag
(= 46,263 kDa) und die Konzentration der Proteinreinigung (= 0,75 µg/µl) so hat man 16,2
µmol Mlc in 1 µl Lösung. Für 16,2 µmol YeeI mit N-terminalen His-tag (≈31 kDa) benötigt
3. Ergebnisse
86
man 0,42 µl der Reinigung mit einer Konzentration von 1,2 µg/µl. Es wurde stets 1 µl Mlc in
den Tests eingesetzt.
Auf diese Art und Weise wurden Mlc und YeeI in den verschiedenen Ansätzen bis hin zu
einem 72-fachen Überschuss von YeeI über Mlc zugegeben. Betrachtet man Mlc als Tetramer
und YeeI als Dimer, so hätte man einen 141- fachen Überschuss an YeeI. In keinem dieser
Ansätze wurde die Bindung von Mlc an PtsG beeinträchtigt. Kein Mlc ist in der
Überstandfraktion zu finden, wo es sein müsste, falls es an das ebenfalls lösliche YeeI
gebunden hätte bzw. wenn YeeI die Bindung von Mlc an PtsG ansonsten gemindert hätte
(siehe Abb. 34).
Abb. 34: Membranbindetests mit Mlc, YeeI und mit PtsG angereicherten
Membranvesikeln.
Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc. Membranen für die Bindetests wurden aus Stamm IT1168 (ptsG::kan)
transformiert mit pTSG11 (EIICBGlc) präpariert. Für die Membranpräparation wurde ein Volumen an Zellextrakt
verwendet, der 2 mg Protein enthielt. P steht für Pelletfraktion, die Membranen und an die Membran gebundene
Proteine enthält. S steht für Überstand (Supernatant), der die löslichen Proteine enthält. 19,2 µg (16 µl), 24 µg
(20 µl) und 36 µg (1170 µmol - 30 µl) YeeI wurde zugegeben. Es wurde 16,2 µmol Mlc (0,75 µg/1µl)
eingesetzt. Im Bild sind als Beispiel für alle durchgeführten Bindetests, die mit den höchsten YeeI
Konzentrationen gezeigt. std.: Precision Plus Protein standard (All blue/Biorad);
87
3. Ergebnisse
3.3 Einfluß von Zuckerphosphaten auf die Interaktion zwischen EIIAGlc
und der Adenylatcyclase
Der cAMP/CAP Komplex ist der positive Regulator aller bekannten durch Mlc regulierten
Gene. Nicht nur die Aufnahme von Glukose, sondern auch die Aufnahme und Verwertung
von Nicht-PTS-Substraten bewirkt einen niedrigen cAMP Spiegel in der Bakterienzelle. Die
aus den Substraten entstehenden Zuckerphosphate nehmen Einfluss auf die Interaktion
zwischen der Adenylatcyclase (cyaA) und EIIAGlc (crr). Die Aktivierung der Adenylatcyclase
unterbleibt (siehe Kap. 1.3.3). Zunächst sollte ein Test entwickelt werden, mit dessen Hilfe
die Einflussnahme der Zuckerphosphate gezeigt werden könnte. Dafür sollte in einem ersten
Schritt geklärt werden, ob eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen EIIAGlc und der
Adenylatcyclase besteht, und in einem zweiten Schritt, ob diese Interaktion durch die Zugabe
von Zuckerphosphaten unterbunden werden kann.
Die Protein-Protein-Interaktion zwischen EIIAGlc und der Adenylatcyclase konnte gezeigt
werden. Sie erfolgte unabhängig davon, ob die phosphorylierte und die dephosphorylierte
Form von EIIAGlc zusammen vorlagen, oder ob ausschließlich die dephosphorylierte Form
zugegeben wurde. Eine Bindung konnte auch nachgewiesen werden, wenn die katalytische
Domäne der Adenylatcyclase als separates Polypeptid exprimiert wurde. Die Zugabe von
Zuckerphosphaten zu dem in vitro Bindetest hatte keinen Einfluss auf die Bindung zwischen
den beiden Proteinen.
3.3.1 Nachweis der Interaktion zwischen EIIAGlc und der Adenylatcyclase
Es gibt unterschiedliche Informationen über die Löslichkeit der Adenylatcyclase und die
Möglichkeit, das Protein unter nativen Bedingungen zu reinigen. Im Gegensatz zu früheren
Behauptungen (134) scheint nur ein sehr geringer Prozentsatz der Adenylatcyclase
membranassoziiert
zu
sein,
wobei
nicht
geklärt
ist
wie
der
Kontakt
zu
der
Cytoplasmamembran zustande kommt (170).
Da durch die Überproduktion von plasmidkodierter Adenylatcyclase auch die Menge an
Protein erhöht sein dürfte, die membranassoziiert ist, wurde versucht, die Bindung zu EIIAGlc
3. Ergebnisse
88
in Membranbindungstests, vergleichbar zu denen mit Mlc und PtsG, zu untersuchen (siehe
Kap. 2.5.9 und 3.1.1-3.1.3).
Die Überproduktion der Adenylatcyclase wurde getestet, indem während des Wachstums der
Bakterien 1 ml Proben aus der Kultur entnommen und mittels SDS-PAGE analysiert wurden
(siehe Abb. 35). Spezifische Antikörper für den Nachweis durch einen Westernblot waren
nicht verfügbar.
Abb. 35: Überproduktion der Adenylatcyclase (CyaA).
Überproduktion der Adenylatcyclase erfolgte mit Stamm SA14, transformiert mit pSA8. Die Adenylatcyclase
wurde hier mit der Shine Dalgarno Sequenz und dem Startcodon (TTG) von cyaA kloniert. Die Expression ist
durch Arabinose induzierbar Die Induktionskontrollen (1 ml Probe der Bakterienkultur) wurden vor (v I) und 5
h nach (n I) der Induktion genommen. Das Pellet von 1ml Bakterienkultur wurde mit 2xPAP
(Proteinauftragepuffer) auf eine OD=13,5 eingestellt und je 10 µl auf das Gel aufgetragen. Eine Bande bei etwa
94 kDa ist leicht verstärkt. Dies würde in etwa dem kalkulierten Molekulargewicht der Adenylatcyclase
entsprechen. Std.: LMW (low molecular weight) Standard, Pharmacia.
Da EIIAGlc auch an PtsG binden kann, wurden die Membranen grundsätzlich von Stämmen
präpariert, bei denen ptsG deletiert war. Die Bindung von EIIAGlc an solche Membranen
wurde verglichen, die, aufgrund einer Mutation in cyaA, keine Adenylatcyclase exprimierten
(Cya-) mit denen, die die Adenylatcyclase plasmidkodiert überexprimierten (Cya+).
3. Ergebnisse
89
Die in Abbildung 36 a gezeigten Bindetest mit gereinigtem EIIAGlc wurden wie in Kapitel
2.5.11 beschrieben durchgeführt. Dass EIIAGlc nur in den Membranpellets (P2) der Cya+
Ansätze erhalten
blieb, zeigt deutlich, dass EIIAGlc an die membranassoziierte
Adenylatcyclase gebunden hatte. Um zu sehen, ob EIIAGlc unter den Versuchsbedingungen
Komplexe bildet und ausfällt bzw. deshalb abzentrifugiert wird, wurde gereinigtes EIIAGlc,
ohne die Zugabe von Membranen, wie die Bindetests behandelt. Die Membranfraktionen
(Pellet1/P1) des ersten Zentrifugationsschrittes nach der Inkubation mit EIIAGlc enthielten
sowohl im Cya- als auch im Cya+ Ansatz EIIAGlc. In Pellet 1 der Kontrolle ohne Membranen
war kein EIIAGlc bzw. eine kaum detektierbare Bande zu sehen. In Überstand 1 (S1) aller
Ansätze war ungebundenes EIIAGlc vorhanden. Das Membranpellet 1 (P1) wurde nochmals
resuspendiert (gewaschen) und abzentrifugiert. EIIAGlc war im Pellet 2 (P2) der CyaMembranen nicht mehr zu detektieren und wurde folglich ausgewaschen. Ebenfalls kein
EIIAGlc befand sich im Pellet 2 der Ansätze ohne Membranen. EIIAGlc blieb jedoch im Pellet
2 der Membranen des Cya+ Ansatzes erhalten (siehe Abb. 36 a). Stämme ohne
Adenylatcyclase besitzen das crp* Allel. Durch letzteres wird ein CAP Protein gebildet, dass
unabhängig von cAMP aktiv ist. So wurde sichergestellt, dass auch im cya-Stamm alle
cAMP/CAP abhängigen Gene transkripiert wurden, obwohl keine Adenylatcyclase vorhanden
ist und, dass die ausbleibende EIIAGlc-Bindung nur auf das Fehlen der Adenylatcyclase
zurückzuführen ist und nicht auf das Fehlen einer cAMP/CAP abhängigen transkripierten
Membrankomponente.
Da unterschiedlichste Faktoren an der Regulation der Aktivität der Adenylatcyclase beteiligt
sind (siehe Kap. 1.3.2), könnte es sein, dass weitere lösliche Faktoren benötigt werden, um
den Einfluss der Zuckerphosphate auf die Bindung zwischen EIIAGlc und der Adenylatcyclase
zu bewirken und nachzuweisen. Deshalb wurde versucht die Bindetests mit Zellextrakten
durchzuführen, die überproduziertes EIIAGlc ohne His-tag enthielten (siehe Abb. 36 b). Der
zugegebene EIIAGlc-Zellextrakt enthielt nur lösliche Proteine. Es zeigt sich, dass bei dem
Einsatz von Zellextrakten die Membranfraktion ein weiteres Mal gewaschen werden müsste,
da in Pellet 2 (P2) der Cya- Membranen noch EIIAGlc enthalten ist. An Membranpellet 2 (P2)
des Cya+ Stammes ist aber deutlich mehr EIIAGlc gebunden, so dass auch dieses Experiment
auf eine direkte Interaktion zwischen EIIAGlc der Adenylatcyclase hinweist.
3. Ergebnisse
90
Abb. 36: Bindung von EIIA an die Adenylatcyclase(CyaA).
Westernblot mit Antikörpern gegen EIIA. Der Bindetest wurde wie in Kap. 2.5.11 beschrieben durchgeführt. P1:
Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIAGlc mit den Membranen; S: Überstand
1; P2: entsteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde. Die Überproduktion
der Adenylatcyclase (Cya+) erfolgte in Stamm SA14, transformiert mit pSA8 (=pBAD_cya).
Gezeigt sind in a)die Membranbindetests mit gereinigtem EIIAGlc an: (i) oben (----) Kontrolle ohne Membranen,
(ii) Mitte (cya--) Membranen von einem Stamm ohne Adenylatcyclase (CyaA) und (iii) unten (cya+) Membranen
von einem Stamm mit CyaA.
In b) wurden Zellextrakte mit überproduziertem EIIAGlc zugegeben.
3. Ergebnisse
91
Die Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag (99 kDa) konnte im Westernblot mit PentaHis-Antikörpern in den Membranfraktionen des Cya+ Stammes nachgewiesen werden (siehe
Abb. 37 a). Zusätzlich wurde mit dem Penta-His-Antikörper eine Bande bei etwa 30 kDa
detektiert. Es handelt sich hierbei nicht um ein Abbauprodukt der Adenylatcyclase, sondern
um ein Membranprotein ohne His-tag, da man das Signal auch in der Cya- Kontrolle erhielt,
in der kein His-tag-Protein enthalten war. Der Bindetest wurde mit gereinigtem EIIAGlc
durchgeführt, das ebenfalls einen N-terminalen His-tag besitzt. Im Westernblot, der wie in
den Experimenten zuvor zur Auswertung der Bindetests genutzt wurde, konnten somit beide
Proteine mit dem Penta-His-Antikörper detektiert werden. Wiederum blieb das EIIAGlc-Signal
im Membranpellet P2 des Cya+ Stammes erhalten, während es in der Cya- Kontolle
ausgewaschen wurde. EIIAGlc bindet an Membranen, die überproduzierte Adenylatcyclase
enthalten (siehe Abb. 37 b).
Abb. 37: Bindetests zwischen Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag und
gereinigtem EIIAGlc.
Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation; S1: Überstand 1; P2:
entsteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde; S2: Überstand zu Pellet 2.
Die Adenylatcyclase wurde in Stamm Sa17 (∆cya ∆ptsG), transformiert mit pSA11, überproduziert.
In a) erfolgt der Nachweis, dass die (His6x)-Adenylatcyclase (99 kDa) in den Membranen enthalten ist und auch
in P2 erhalten bleibt. Dieser Test erfolgte ohne Zugabe von EIIAGlc. Auf Höhe der 100 kDa Standard Bande,
erscheint ein Signal () in den Membranfraktionen des Cya+ Stammes, nicht aber im Cya- Stamm. Bei der
unteren Bande(), die in allen Membranpellets erscheint, handelt es sich um ein Membranprotein ohne Histag, das durch den Antikörper erkannt wird.
In b) wurde sowohl EIIAGlc () als auch die Adenylatcyclase () mit dem Penta-His-Antikörper
nachgewiesen. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).
92
3. Ergebnisse
3.3.2 Analyse der Interaktion zwischen EIIAGlc und den Domänen der
Adenylatcyclase
Eine weitere Frage, die geklärt werden sollte, war, an welche der Domänen der
Adenylatcylase
EIIAGlc
bindet.
Die
Adenylatcyclase
ist
ein
Protein
mit
einem
Molekulargewicht von 95 kDa, das aus einer N-terminalen katalytischen (AS: 1-535) und
einer C-terminalen regulatorischen Domäne (AS: 536-848) besteht (134). Bei Fehlen der
regulatorischen Domäne hat die mit dem Transport von Glukose zusammenhängende
Dephosphorylierung von EIIAGlc keine negativen Auswirkungen mehr auf die Aktivität des
Enzyms. Einem Modell zufolge inhibiert die regulatorische Domäne die Aktivität der
Katalytischen. Die Anwesenheit von phosphoryliertem EIIAGlc hebt diese Inhibition auf (siehe
Kap. 1.3.2). EIIAGlc könnte demnach an die regulatorische Domäne binden und so deren
inhibitorischen Effekt verhindern. Aber auch in der katalytischen Domäne konnten drei
Aminosäuren (Arg188, Asp414, Glycin463) identifiziert werden, bei deren Austausch gegen
eine andere Aminosäure die Regulation der Adenylatcyclaseaktivität durch CAP verändert
wird (31). Da die CAP abhängige Reduktion der Adenylatcyclase-Aktivität wiederum EIIAGlc
benötigt, könnte es also auch möglich sein, dass EIIAGlc an die katalytische Domäne bindet.
Die getrennt voneinander klonierten Domänen wurden zur Expression gebracht und von
diesen
Stämmen,
wie
zuvor,
Membranen
präpariert.
Beide
Domänen
waren
membranassoziiert. Es erfolgte keine Bindung von EIIAGlc an die regulatorische Domäne.
Von der katalytischen Domäne wurden zwei unterschiedliche Varianten getestet. Bei einer
Variante wurden zusätzlich die N-terminalen 86 AS entfernt. Diese Variante zeigte ebenfalls
keine EIIAGlc Bindung. Jedoch eine Variante, ohne N-terminale Deletion, konnte wie
CyaAgesamt EIIAGlc binden.
Abbildung 38 a zeigt, dass beide Domänen membranassoziiert sind. Die Bindetests erfolgten
mit gereinigtem
Unterschied
EIIAGlc mit N-terminalen His-tag. Es erscheint so, als bestünde kein
zwischen
den
Membranfraktionen
P2
der
Membranen,
die
die
Adenylatcyclasedomänen enthalten und dem P2 der Negativkontrolle. EIIAGlc bindet an keine
der beiden Domänen, wenn diese als separate Polypeptidketten gebildet werden (siehe Abb.
38 b).
3. Ergebnisse
93
Abb. 38: Bindetests zwischen den Domänen der Adenylatcyclase mit N-terminalem Histag und gereinigtem EIIAGlc
Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation; S1: Überstand 1; P2:
ensteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde; S2: Überstand zu Pellet 2.
Die Adenylatcyclase-Domänen wurden in Stamm Sa17 (∆cya ∆ptsG), transformiert mit pSA13 und pSA16,
überproduziert.
In a) erfolgte der Nachweis, dass die Domänen der Adenylatcyclase in den Membranen enthalten sind. Hier
wurde kein EIIAGlc zugegeben. Bei der unteren Bande, die in allen Membranpellets erscheint, handelt es sich
nicht um ein Abbaubauprodukt der His-tag-Proteine, sondern um ein Membranprotein, an das der Penta-HisAntikörpers ebenfalls bindet, auch in der Kontrolle ohne Adenylatcyclase (Hisa6x).
In b) wurde sowohl EIIAGlc als auch die Adenylatcyclase mit dem Penta-His-Antikörper nachgewiesen.
Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).
3. Ergebnisse
94
Da ein Protein seine Tertiär-/Quartiärstruktur unter anderen durch die Interaktion der
Seitenketten der Aminosäuren untereinander aufrecht erhält, könnte es sein, dass die
Domänen, wenn separat exprimiert nicht korrekt gefaltet werden und deshalb die Bindung
von EIIAGlc unterbleibt. Zwar ist bekannt, dass die katalytische Domäne ohne die
regulatorische Domäne aktiv ist (62, 134) und deshalb korrekt gefaltet sein muss, dennoch
wurde dies für die klonierten Fragmente nochmals überprüft. E. coli Zellen, die keine
Adenylatcyclase besitzen, sind nicht mehr fähig auf Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle
zu wachsen, da die Transkription der Gene des Glycerintransporters und der Glycerinkinase
cAMP/CAP abhängig ist (65). Wird in diesen Bakterien plasmidkodierte Adenylatcyclase
oder deren katalytische Domäne zur Expression gebracht, sollten sie wieder auf Glycerin
wachsen können, vorausgesetzt das Protein oder die Domäne ist korrekt gefaltet und aktiv.
Abbildung 39 zeigt die daraus erhaltenen Wachstumskurven. Zellen, die die Adenylatcyclase
gesamt oder die katalytische Domäne exprimierten, zeigten vergleichbares Wachstum. Zellen,
die die regulatorische Domäne exprimierten oder mit der Vektorkontrolle transformiert waren,
zeigten kein Wachstum. Eine ausreichende Menge Adenylatcyclase gesamt oder der
katalytischen Domäne schien korrekt gefaltet und aktiv zu sein.
Der bislang getesteten His-tag Variante der katalytischen Domäne fehlen zusätzlich 86
Aminosäuren des N-Terminus. Dass diese Variante noch katalytisch aktiv ist, deckt sich mit
den Ergebnissen von Holland et al. (63). Bei den dort gezeigten Experimenten ging aus dem
Trypsinverdau der Adenylatcyclase ein Fragment hervor, das den Aminosäuren 82-341, des
aus 848 Aminosäuren bestehenden Proteins, entsprach. Dieses Fragment war noch immer
katalytisch aktiv. Eine weitere klonierte Variante der katalytischen Domäne, die im Rahmen
dieser Arbeit getestet wurde, umfasst die Aminosäuren 0-535 und hat also keine N-terminale
Deletion. Wurden die Membranen von E. coli Zellen präpariert, die diese Variante der
katalytischen Domäne überproduzierten, konnte eine Bindung von EIIAGlc nachgewiesen
werden (siehe Abb. 40). Das Signal in Membranpellet P2 bleibt erhalten, wenn diese
katalytische Domäne (KatDom) exprimiert wird, nicht aber bei den Membranen ohne
Adenylatcyclase (∆cya).
3. Ergebnisse
95
Abb. 39: Wachstum der Adenylatcyclase-Varianten auf Minimalmedium mit Glycerin
als einziger Kohlenstoffquelle.
Stamm CH4 (∆cya), transformiert mit Plasmid pHIHO101(lacIq) und den Plasmiden pSA11(=ges;
Adenylatcyclase gesamt) oder mit pSA13(=KD; katalytischen Domäne) oder mit pSA16(=RD; regulatorische
Domäne) oder pQE32(= Vektor), wurde auf Minimalmedium mit 0,4% Glycerin bei 37°C angezogen und die
Transkription der Adenylatcyclase-Varianten mit 50 µM IPTG induziert. In regelmäßigen Abständen wurden
Aliquots entnommen und das Wachstum durch Messung der OD bei 578 nm verfolgt.
Abb. 40 Bindetests zwischen der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase und
gereinigtem EIIAGlc
Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von
EIIAGlc mit den Membranen; S1: Überstand 1; P2: ging aus Membranpellet 1 hervor, das nochmals resuspendiert
und abzentrifugiert wurde. Im Vergleich zu Abbildung 38 wurde hier die gesamte katalytische Domäne (AS: 0 –
535) kloniert (pSA12) und in Stamm SA17 überproduziert. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard
(Presion All Blue; Biorad).
3. Ergebnisse
96
3.3.3 Nachweis der Interaktion zwischen EIIAGlc und der Adenylatcyclase
bei Zugabe von Zuckerphosphat
Da der von mir erstellte Test geeignet war, eine Bindung zwischen der Adenylatcyclase und
EIIAGlc nachzuweisen, sollte nun getestet werden, ob diese Bindung durch die Zugabe von
Zuckerphosphaten beeinflusst werden konnte.
Abb. 41: Einfluss von Zuckerphospat auf die Bindung zwischen der Adenylatcyclase
und EIIAGlc in Zellextrakten.
Westernblot mit Antikörper gegen EIIAGlc. Der Bindetest wurde wie in Kap. 2.5.11 beschrieben durchgeführt.
P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIAGlc mit den Membranen; S1:
Überstand 1; P2: Membranpellet 1 wurde nochmals resuspendiert und abzentrifugiert. Die Adenylatcyclase
wurde in Stamm SA14 ( ∆ptsG), transformiert mit pSA8 , überproduziert. EIIAGlc wurde mittels Stamm DHB4
und pJFBH überproduziert.
Bei dem Bindetest wurden während der Inkubation von EIIAGlc und der Adenylatcyclase die oben angegebenen
Zuckerphosphate zugegeben und danach der Assay wie in den Versuchen zuvor fortgesetzt. Verwendet wurde
ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).
Wieder wurden Membranvesikel präpariert. Einmal von einem Stamm, der die
Adenylatcyclase überproduziert hatte. Zum anderen von einem Stamm ohne Adenylatcyclase.
Im Bindetest wurden Zellextrakte zugegeben, die überproduziertes EIIAGlc enthielten. Zu
diesen Ansätzen wurden die Zuckerphosphate (50 mM) gegeben. In Abb. 41 ist beispielhaft
der Ansatz gezeigt, dem Glukose-6-P zugegeben wurde. Wieder zeigt sich ein Problem bei
97
3. Ergebnisse
der
Verwendung
von
EIIAGlc-Zellextrakten.
Es
wäre
ein
weiterer
Wasch/Zentrifugationsschritt nötig, um noch in Membranpellet P2 der Kontrolle gebundenes
EIIAGlc weiter zu entfernen. Dennoch zeigt ein Vergleich der Membranfraktion P2 der CyaKontrolle und des Cya+ Stammes, dass das Signal für EIIAGlc in der Fraktion des Cya+
Stammes intensiver ist, was für eine Bindung von EIIAGlc an die Cya+ Membranen spricht. Es
kann also davon ausgegangen werden kann, dass die Bindung zwischen der Adenylatcyclase
und EIIAGlc nicht durch die verwendeten Zuckerphosphate beeinträchtigt wurde (siehe Abb
41).
3.3.4 Auswirkungen der EIIAGlc Phosphorylierung auf die Interaktion
zwischen EIIAGlc und Adenylatcyclase
Abb. 42: Bindetests mit (His6x)Adenylatclyse und gereinigtem nicht phosphoryliertem
EIIA.
Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von
EIIAGlc mit den Membranen; S1: Überstand 1; P2: Membranpellet 1 wurde nochmals resuspendiert und
abzentrifugiert; S2: Überstand 2. Die Adenylatcyclase wurde in Stamm Sa17 ( ∆ptsG ∆cya), transformiert mit
pSA11 , überproduziert. EIIAGlc wurde mittels Stamm DG102 (∆ptsHIcrr) und pSA9 überproduziert. Beide
Bindepartner wurden mit dem Penta-His-Antikörper detektiert. Die Adenylatcyclase wurde mit 1, das EIIAGlc
mit 2 markiert. - std.: Prestained Protein marker/Biorad (Precision Plus – Dual colour).
Die nächste Frage war, ob EIIAGlc nur dann an die Adenylatcyclase binden kann, wenn es
phosphoryliert ist oder ob auch nicht phosphoryliertes EIIAGlc binden kann. Dafür wurden wie
3. Ergebnisse
98
im Experiment zuvor Membranvesikel präpariert, mit Adenylatcyclase mit N-terminalem Histag oder ohne Adenylatcyclase. EIIAGlc wurde in einem Stamm überproduziert, in dem die
Deletion des Operons ptsHIcrr zum Verlust der allgemeinen PTS-Komponenten HPr und EI
und des chromosomal kodiertem EIIAGlc führt. Die PTS-abhängige Phosphorylierung von
plasmidkodiertem EIIAGlc war nicht mehr möglich. Auch in diesem Experiment lies sich das
EIIAGlc aus den Membranpellets der Negativkontrolle (∆cya) auswaschen und blieb in
Membranpellet (P2) des Cya+ Stammes gebunden (siehe Abb. 42). Entgegen der überwiegend
vertretenen Meinung (siehe Kap. 1.3.2), dass dephosphoryliertes EIIAGlc keine Wirkung auf
die Adenylatcyclase hat, hatte, das in diesem Ansatz ausschließlich dephosphorylierte
EIIAGlc, an die membranassoziierte Adenylatcyclase gebunden.
3.4 Identifizieren weiterer Mlc regulierter Gene
Alle durch Mlc regulierten Gene, die bisher identifiziert werden konnten, werden negativ
durch Mlc und positiv durch cAMP/CAP reguliert. Ihnen ist gemeinsam, dass ihre
Genprodukte für die Aufnahme und die Verwertung einer Kohlenstoffquelle benötigt werden,
und dass als Folge des Stoffwechsels ein Glukose-Phosphat oder Glukose selbst entsteht
(119). Eine Ausnahme bildet die positive, jedoch indirekte Regulation von ldhA, das für die
anaerobe Laktatdehydrogenase kodiert (71). Zwei unterschiedliche Methoden führten zum
Auffinden neuer, möglicherweise durch Mlc regulierter Gene. Zum einen wurden
Transkriptomanalysen mit Hilfe von DNA-Microarrays durchgeführt (siehe Kap. 2.4.4 und
(17)). Die Durchführung und Auswertung der Microarrays erfolgte am Forschungszentrum
Jülich durch T. Polen und V. Wendisch, die Präparation der benötigten RNA wurde von mir
durchgeführt. Zum anderen wurde das Proteom mittels zweidimensionaler ProteinGelektrophorese untersucht. Hierfür präparierte ich die Zellextrakte. Die Gelelektrophorese
und deren Auswertung wurde durch U. Völker und Mitarbeiter in Marburg/Greifswald
durchgeführt. Beide Methoden ergaben Hinweise auf eine Vielzahl möglicherweise ebenfalls
durch Mlc regulierter Gene. Bislang konnte zwar für einen Teil dieser Gene ausgeschlossen
werden, dass sie durch Mlc reguliert werden. Aber es konnten noch keine weiteren Gene
identifiziert werden, deren Transkription tatsächlich durch Mlc reguliert ist, wobei eine
Überprüfung aller erhaltenen Daten noch nicht abgeschlossen ist.
3. Ergebnisse
99
3.4.1 DNA-Microarray
Das Transkriptom, der mRNA-Spiegel je zweier unterschiedlicher Bakterienstämme sollte
verglichen werden. Dieses wurde wie im Kapitel 2.4.4 beschrieben erstellt. Der Vergleich des
Wildtyps (WT) mit einer mlc-Mutante wurde dreimal durchgeführt (Tab. 22/23 S. 144-148).
Bei dem Wildtyp handelt es sich um E. coli MC4100. Der Vergleich einer ptsG-Mutante mit
einer ptsG/mlc-Doppelmutante erfolgte ebenfalls dreimal (Tab. 22/23, S. 144-148) und
zweimal der Vergleich einer mlc-Mutante mit der mlc-Überexpression (siehe Tab. 24/25 S.
149-152). Die Frage war, für welche Gene der RNA-Spiegel im mlc-Hintergrund signifikant
erhöht bzw. erniedrigt sein würde. Das gibt Aufschluss darüber, ob die Transkription eines
Genes durch Mlc beeinflusst ist. Ob dieser Einfluss von Mlc durch direkte Bindung des
Proteins in der regulatorisch wichtigen Region dieser Gene erfolgt, oder indirekt über weitere
Faktoren, kann damit nicht geklärt werden. Zunächst wurden deshalb die normalisierten
„Ratios of median“ der Gene in den Einzelexperimenten betrachtet (siehe Kap. 2.4.4.4). Die
Tabellen 22-25 im Anhang (S. 144-152 ) zeigen die Gene deren Werte der normalisierten
„Ratios of median“ über oder unter einer vorher anhand von Kontrollgenen ermittelten
Signifikanzgrenze lagen. Für die mlc-Mutante erhält man in allen acht Experimenten erhöhte
Signale für die meisten der bekannten Mlc regulierten Gene. Dies kann positiv für die
Aussagekraft der Chipergebnisse gewertet werden. Es wurden 39 Gene identifiziert, deren
Transkription in den mlc-Mutanten erhöht war (Tab. 23 S. 146), also negativ durch Mlc
reguliert werden könnten. Zudem wurde für 28 Gene gezeigt, dass deren Transkription in der
mlc-Mutante erniedrigt ist (Tab. 22 S. 144). Das weist auf die Möglichkeit hin, dass Mlc,
vergleichbar dem homologen transkriptionellen Regulator NagC (121), sowohl als Repressor,
als auch als Aktivator fungieren könnte. Bei den meisten, der so identifizierten Gene, lies sich
jedoch keine Konsensus-DNA-Bindestelle für Mlc finden (siehe Tab. 22-25 und Kap. 1.4.1).
Betrachtet man die Werte in den Tabellen 22-25 zeigt sich eine große Übereinstimmung
zwischen den Vergleichen des WT mit der mlc-Mutante und den Vergleichen der ptsGMutante mit der ptsG/mlc-Doppelmutante. Für den Vergleich der mlc-Mutante mit mlcÜberexpression zeigt sich eine große Variation in den Werten, zunächst schon in den beiden
Arrays dieses Experiments, aber ebenso zu den Ergebnissen der anderen Vergleiche. Die mlcÜberexpression simuliert demnach eher einen Ausnahmezustand der Zelle. Die Arrays, mit
Hilfe derer das Transkription des Wildtyps mit dem der mlc-Mutante verglichen wurde,
lieferten die zuverlässigeren und wiederholbaren Ergebnisse. Sie scheinen eher geeignet neue
Zielgene der Mlc-Regulation zu finden, als die Ergebnisse der mlc-
100
3. Ergebnisse
b#
Vergleich: mlcÜberexpression gegen
mlc- Mutante
(2 Arrays)
DurchName schnitt n Signifikanz
Vergleich: mlcMutante gegen
Wildtyp (3 Arrays)
DurchSignifikan
schnitt n
z
b0061 araD
0,85
1
0,24
b0064 araC
0,74
2
3,73
b0065 yabI
1,35
2
7,87
7,63
3,51
b0066 yabJ
0,91
2
b0067 yabK
0,74
2
b0069 yabN
0,96
1
b0459 maa
0,50
2
b1056 yceI
0,57
2
b1101 ptsG
0,10
2
**
*
**
2
*
Vergleich: mlc/ptsGMutante gegen ptsGMutante
(3 Arrays)
DurchSignifikan
schnitt n
z
0,24
3
**
L-Ribulose-5-Phosphate 4-Epimerase
2
5,85
3
**
transkriptioneller Regulator für das ara Operon
2
6,21
3
**
pot. Membranprotein
2
7,01
3
*
Thiamin Transp. pot. ATPase
2
3,33
3
*
Thiamin Transp. Permease
0,31
3
0,81
1
*
0,26
3
**
pot.Transportprotein
1,19
3
*
Maltosetransacetylase
2,43
3
5,54
3
*
2,72
3
**
Periplasmatisches Protein
*
2,30
3
**
PTS, Glucose-spezifisches IIBC
*
*
pot. transcriptioneller Regulator LysR-Typ
b1339 abgR
0,63
2
*
2,44
2
3,34
3
b1498 ydeN
0,33
2
**
0,92
2
1,11
3
b1505 ydeT
0,49
2
**
0,95
1
0,99
3
b1593 ynfK
0,84
1
0,70
1
0,57
3
b1594 mlc
39,34
2
0,59
3
*
0,67
b1817 manX
0,04
2
4,53
3
*
5,04
b1818 manY
0,06
2
3,63
3
*
b1819 manZ
0,09
2
3,04
3
*
b1820 yobD
0,23
2
2,27
2
b2000 flu
0,55
1
2,82
1
*
**
Produkt
pot. Sulfatase
pot. Protein der äußeren Membran
*
pot. Dethiobiotin Synthase
3
*
transkriptioneller Regulator
3
**
PTS(Mannose) EIIAB
4,06
3
**
PTS(Mannose) EIIC
3,32
3
**
PTS(Mannose) EIID
2,06
3
**
2,64
3
**
Pot. Membranprotein
Außenmembran “Fluffing Protein”, ähnlich zu
Adhesin
*
b2001 yeeR
0,82
2
4,61
1
3,09
3
b2028 ugd
0,37
2
**
1,24
1
1,24
2
UDP-Glukose 6-Dehydrogenase
Pot. Membranprotein
b2045 wcaK
0,51
2
*
1,10
1
0,86
2
pot. Galactokinase (EC 2.7.1.6).
b2053 gmd
0,08
2
*
n.d.
0,83
1
GDP-D-Mannose Dehydratase
b2062 wza
0,23
2
*
1,39
1
0,98
2
pot. Polysaccharide Export Protein
b2091 gatD
0,42
2
*
1,03
3
1,23
3
Galactitol-1-Phosphate Dehydrogenase
b2094 gatA
0,47
2
**
0,96
3
1,15
3
PTS, Galactitol-spezifisches EIIA
b2095 gatZ
0,49
2
*
1,02
3
1,21
3
pot. Tagatose 6-Phosphate Kinase
b2253 yfbE
0,47
2
**
0,86
2
1,00
3
pot. Enzym
b2415 ptsH
0,32
2
*
1,63
2
2,65
3
*
Phosphocarrier Protein Hpr
b2416 ptsI
0,25
2
*
2,56
2
2,94
3
**
Phosphocarrier Protein EI
*
0,62
1
1,71
3
2,58
3
*
2,97
3
*
Maltodextrinphosphorylase
*
b2669 stpA
0,37
2
b3417 malP
0,18
2
b3418 malT
0,13
2
**
2,68
3
3,64
3
**
positiver Regulator des mal Regulon
b3419 yhgJ
0,22
2
*
2,30
3
3,46
3
*
RNA 3'-terminal Phosphatcyclase
b3561 yiaH
0,40
2
*
0,89
1
1,06
2
b3903 rhaA
0,41
2
**
1,61
2
2,25
3
*
b4032 malG
0,39
2
2,05
2
**
2,04
3
**
b4033 malF
0,15
2
3,10
3
*
4,06
3
*
L-Rhamnoseisomerase
Maltosetransport Membrankomponente(ABCTransporter)
Maltosetransport Membrankomponente(ABCTransporter)
**
DNA-Bindeprotein StpA
unbekannt
b4035 malK
0,19
2
2,67
3
*
4,22
3
**
ATB-Bindeprotein – Maltose ABC-Transporter
b4037 malM
0,10
2
3,17
3
**
4,35
3
*
Periplasmatisches Protein
b4062 soxS
1,12
2
1,29
3
1,81
3
*
Regulator
3. Ergebnisse
101
Tabelle 17: Statistische Auswertung der DNA-Microarray-Daten.
Die statistische Auswertung der Microarrays entspricht einer Liste von Genen, die in einem der acht
Experimente einen RNA-Spiegel (Ratio of median) <0,5 oder > 2 aufwiesen. Die Ratios of Median der Gene in
den Wiederholungen (je 2-3 Arrays) eines Vergleichs wurden zu einem Mittelwert zusammengefasst. Die
Signifikanz wurde mittels des Student’s t-Test bestimmt und ist für p<0,05 mit einem Stern (*) markiert, für
p<0,005 mit zwei Sternen (**). Die Mittelwerte der RNA-Spiegel sind dann rot hervorgehoben, wenn für diese
gilt, dass der RNA-Spiegel >2 und die Signifikanz p <0,05 ist. Die Mittelwerte der RNA-Spiegel sind grün
hervorgehoben, wenn für diese gilt, dass der RNA-Spiegel <0,5 und die Signifikanz p <0,05 ist.
Überexpression. Im zusätzlich durchgeführten Vergleich WT mit einer ptsG-Mutante zeigten
sich keine signifikanten Unterschiede (Daten nicht gezeigt).
Da man mit dieser Methode auch fälschlicherweise positive Ergebnisse erhält, müssen diese
Ergebnisse durch weitere Methoden wie Reportergenfusionen, Real Time PCR oder
Northernblots verifiziert werden.
Eine weitere Möglichkeit bietet die mehrmalige Wiederholung der Arrays mit anschließender
statistischer Auswertung. Die statistische Auswertung der acht Microarrays ist in Tabelle 17
dargestellt.
/
3.4.2 Überprüfung der Chipdaten
Zur Überprüfung der Microarray-Daten wurden folgende Reportergenfusionen im mlc+ und
im mlc Hintergrund bzw. mit und ohne Mlc-Überproduktion getestet:
-
proV-lacZ
-
agn(=flu)-lacZ
-
tauA-lacZ
-
ssuE-lacZ
-
yabN(=sgrR)-lacZ
-
yeeR-lacZ
-
araB-phoA
-
araC-lacZ
-
tbpA-lacZ
-
yabM-phoA
102
3. Ergebnisse
Bei den ß-Galaktosidasetests (siehe Kap.2.5.4) bzw. den PhoA-Tests (siehe Kap. 2.5.6)
konnten keine signifikante Änderung der Aktivitäten gemessen werden, so dass eine
Regulation dieser Gene durch Mlc nicht wahrscheinlich ist.
Bezogen auf die Arraydaten, ergab sich für die meisten dort genannten Gene, nur eine 2-5
fache Änderung des Signals. Eventuell eignen sich in diesem Fall Methoden wie der
Northernblot oder die RT-PCR, die die Menge der transkripierten mRNA nachweisen besser,
um die Microarray-Daten zu überprüfen, als wie bisher Reportergenfusionen zu testen. Dies
auch im Hinblick darauf, dass Mlc womöglich indirekt über weitere Faktoren auf die
Transkription der Gene einwirkt. Ein derartiger Faktor könnte beispielsweise eine sRNA sein
(51). Diese binden nicht in der Promotorregion eines Genes, sondern an Bereiche der mRNA
und verändern deren Stabilität. Mit einer Reportergenfusion zu der Promotorregion eines
Genes können solche Effekte nicht überprüft werden. Es erscheint nicht sinnvoll die
Ergebnisse der Einzelexperimente (Tab. 22-25 S. 144-152) zu überprüfen. Besser ist es, sich
im weiteren an der statistischen Auswertung in Tabelle 17 (S. 100) zu orientieren.
3.4.3 Proteonomanalyse – Muster der in der Zelle synthetisierten Proteine
im mlc Hintergrund verglichen mit der Mlc-Überproduktion
Um die aus den DNA-Microarrays erhaltenen Daten zu überprüfen und um einen Einblick zu
bekommen,
an
welcher
Stelle
zusätzlich
zur
transkriptionellen
Regulation
posttranskriptionelle Mechanismen wirksam sind, sollte untersucht werden, welche Proteine
in Abwesenheit von Mlc bzw. bei Mlc-Überproduktion vermehrt vorkommen. Dies geschah
mit der Einschränkung, dass nur die löslichen Proteine untersucht wurden. Transporter und
sonstige Membranproteine wurden nicht erfasst.
Die mlc-Mutante und Zellen, die Mlc überproduzierten wurden unter vergleichbaren
Bedingungen wie für die RNA-Präparation der Microarrays angezogen. Die Zellextrakte
wurden wie in Kapitel 2.5.14 beschrieben präpariert.
Abbildung 43 zeigt das 2D-Gel, mittels dessen die Proteine in den Zellextrakten aufgetrennt
wurden. Tabelle 18 zeigt die bislang identifizierten Proteine, die bei der mlc-Mutante oder die
103
3. Ergebnisse
bei Mlc-Überproduktion vermehrt vorkamen. Tabelle 19 zeigt die Gene/Proteine, deren
Expression sowohl bei den Microarrays, als auch im Experiment mit der 2DGelelektrophorese verändert war. In beiden Experimenten erhält man ein Signal für des
EIIABMan (manX), die allgemeine PTS-Komponente EI (ptsI) und für Mlc selbst. Diese sind
bekanntermaßen durch Mlc reguliert. Bislang unbekannte Gene/Proteine, die in beiden
Experimenten erkannt wurden, sind CysK (cysK), die O-Acetylserine-Lyase A , DanK
(dnaK), das Chaperon Hsp70, und AroF (aroF), eine DAHP Synthetase. Im 2D-Gel erhält
man das AroF-Signal in den Extrakten von Zellen, die Mlc überproduzierten, bei den DNAMicroarrays ist aroF aber in der mlc Mutante erhöht. Nur die Gene von PtsI, ManX, Mlc,
welche ja schon bekanntermaßen Mlc reguliert sind, sind auch in der statistischen
Auswertung der Chipdaten enthalten. Vor einer weiteren Auswertung dieser Daten, sollte
geprüft werden, welche Proteine eventuell nur deshalb vermehrt gebildet werden, da die
Überproduktion von Protein an sich erfolgte, wie man das für DanK vermuten könnte. Da
schon die Ergebnisse der Microarrays zeigten, dass der Vergleich Mlc-Überproduktion gegen
mlc-Mutante sehr unterschiedliche Ergebnisse lieferte, wäre es vermutlich aufschlussreicher,
das Proteom des Wildtyps mit dem einer mlc-Mutante zu vergleichen. Da die bisherige
Erfahrung
zeigt,
dass
Mlc
gleichermaßen
die
Bildung
löslicher
wie
die
von
Transportproteinen reguliert, wäre ein experimenteller Ansatz vorteilhaft, der auch die
Membranproteine mit einbezieht.
3. Ergebnisse
104
Abb. 43: 2D-Gele des Vergleiches mlc-Mutante gegen Mlc-Überproduktion.
Gezeigt ist das 2D-Gel, mittels dessen der Zellextrakt der mlc-Mutante (orange ) und des Stammes, der Mlc
überproduzierte (blau), aufgetrennt wurden. Proteine, die in einem der Ansätze vermehrt gebildet wurden,
wurden markiert (Mlc-x bzw. Mlc+x bzw. Bezeichnung des bereits identifiziertem Proteins). Die davon mittels
MALDI-Analysen identifizierten Spots sind in Tabelle 18 aufgelistet.
105
mlc-Mutante
3. Ergebnisse
Protein
PtsA/PtsI
GapA
TrpS
PtnA/ManX
BlaT
AroG
DnaK
RS1/RspA
CysK
Protein
GapA
NagC
Mlc-Überproduktion
Mlc
Alf/FbaA
AceE
AdhE
YcgT
TolB
TyrB(AAT)
AroF
Funktion
PEP-Protein PTS EI
Glyceraldeyd-3-P Dehydrogenase A
Tryptophan tRNA Synthetase
PTS; Mannose spezifisches EIIAB
ß-Laktamase TEM Vorläufer
3-Deoxy-D-Arabinoheptulosonat-7-PSynthase(DAHP
synthetase,
durch
Phenylalanin repremierbar); Tyr Regulon
Chaperon Hsp70
30S Ribosomale Untereinheit Protein S1
CyteinsynthaseA
Funktion
Glyceraldeyd-3-P Dehhydrogenase A
NagC
ähnlicher
transkriptioneller
Regulator
Transkriptioneller Regulator
Fructose-bis-P-aldolase; Klasse II
Pyruvatdehydrogenase (Decarboxylase);
Kofaktor: Thiaminpyrophossphat
CoA-linked Acetaldehyddehydrogenase;
Eisenabhängige Alkoholdehydrogenase;
Pyruvat-Format-Lyase (bei anaeroben
Bedingungen; Stickstoffmangel; Cra Box
vorhanden)
N-terminaler Teil der Dihydroxy-AcetonKinase(DHAK); ähnlich zu PTS Proteinen
periplasmatisches
Protein;
TonB
unabhängige Aufnahme von Colicin A
Aspartat Aminotransferase; Tyr Regulon
3-Deoxy-D-Arabinoheptulosonat-7-PSythase(DAHP
synthetase,
durch
Thyrosin repremierbar); Tyr Regulon
pI
4,78
6,61
6,27
5,74
5,69
6,14
MW(kDa)
63,522
35,51
37,14
34,9
31,5
37,99
4,83
4,89
5,83
pI
6,61
5,8
69,072
61,12
34,468
MW(kDa)
35,51
44,29
5,52
5,46
39,12
99,61
6,32
96,07
4,93
39,5
6,98
45,93
5,54
5,42
43,55
38,78
Tab. 18: Auswertung der 2D-Gelelektrophorese. Vergleich der synthetisierten Proteine einer mlc-Mutante
mit denen bei Mlc-Überproduktion.
106
erhöht
bei MlcÜberproduktion
Microarray
manX*
ptsI*
cysK
dnaK
aroF
mlc*
erhöht in
mlcMutante
3. Ergebnisse
2D-Gel
ManX
PtsI(EI)
CysK
DnaK
Mlc
AroF
Tab. 19: Vergleich der durch die Microarrays erhaltenen Daten mit denen der 2D-Gelelektrophorese.
107
4. Diskussion
4. Diskussion
4.1 Untersuchungen zur Interaktion zwischen Mlc und EIICBGlc(PtsG)
Die Regulation der Mlc regulierten Gene ist nicht nur deshalb ein interessantes Studienobjekt,
da Mlc als globaler Regulator die Aufnahme und erste Stoffwechselschritte verschiedener
Kohlenstoffe
reguliert,
sondern
auch
aufgrund
des
Mechanismus
mit
dem
der
transkriptionelle Regulator inaktiviert wird. Im Gegensatz zu dem klassischen Beispiel, in
dem ein Induktormolekül die Konformation des Repressor verändert, wodurch dieser
gehindert wird weiter an die DNA zu binden (28), wird Mlc durch die Bindung an ein
Membranprotein von den Operatoren abtitriert. Die Inaktivierung des Repressors abhängig
vom Transport des Substrates des repremierten Systems erfolgen zu lassen, bewirkt, dass die
für den Transport benötigten Komponenten nur dann vermehrt gebildet werden, wenn
Glukose extern vorliegt. Dabei handelt es sich nicht um einen Ausnahmefall. Der Vergleich
zu analogen Systemen, bei denen ein regulatorisches Protein an ein Protein eines
Transportkomplexes gebunden wird, zeigt dass es sich um einen alternativen Mechanismus
zur klassischen Induktion handelt. Die Vermutung liegt nahe, dass es sich dabei um eine
generelle
Methode
handelt,
mittels
derer
die
Bakterien
zudem
eine
gewisse
Kompartimentierung der Zelle erreichen. Vergleichbare Systeme finden sich bei der Bindung
von GlnK an den Ammoniumtransporter
AmtB (30), bei PutA, das an die
Cytoplasmamembran gebunden wird (97, 106), und auch in der Bindung des inaktiven MalT
an die ATPase MalK (111).
4.1.1 Die Rolle des C-Terminus von Mlc
Die in dieser Arbeit erbrachten Ergebnisse zeigen, dass die Sequenzen am carboxy-terminalen
Ende von Mlc eine wichtige Rolle bei der Tetramerisierung des Proteins, der DNA-Bindung
und der Bindung an den Transportkomplex EIICBGlc (PtsG) einnehmen. Dabei wurde eine 18
Aminosäuren umfassende Sequenz untersucht, durch welche eine α-Helix mit möglicherweise
amphipatischen Charakter gebildet wird. Es sollte die Frage geklärt werden, ob die ProteinProtein-Interaktion zu PtsG über die hydrophoben Bereiche der Helix erfolgt. In einem ersten
Versuch wurden zwei Deletions-Varianten von Mlc hergestellt. Die Variante Mlc∆9, der neun
4. Diskussion
108
C-terminale Aminosäuren und somit die Hälfte der Helix entfernt wurden, zeigt eine dem Mlc
WT vergleichbare Repression der Mlc regulierten Gene und Bindung an PtsG. MlcWT und
Mlc∆9 bilden unter nativen Pufferbedingungen Tetramere. Die Bildung von Mlc Tetrameren
durch MlcWT konnte schon früher durch ein vergleichbares Experiment dargestellt werden
(98). Im Gegensatz dazu bildet die Variante Mlc∆18 Dimere und besitzt weder die Fähigkeit
zur Bindung an PtsG, noch an die DNA.
Aus den Ergebnissen in Kapitel 3.1.2 ergaben sich keine direkten Hinweise auf eine
bestimmte Region von Mlc, die an der PtsG-Bindung beteiligt ist. Vielmehr zeigt sich, dass
die C-terminale Region die Struktur von Mlc an sich beeinflusst oder zumindest an der
Ausbildung einer korrekten Tertiär und/oder Quartiärstruktur beteiligt sein muss. Letzteres,
die Ausbildung des Tetramers, scheint eine Vorraussetzung für die Repressorfunktion des
Proteins zu sein. Ein Vergleich zu anderen transkriptionellen Repressoren wie LacI (16) oder
dem zu Mlc homologen NagC (120) zeigt, dass diese aufgrund der Tetramerisierung zwei
palindrome Operatorsequenzen binden können, was zur Ausbildung einer DNA-Schleife
führt, die zu einer effektiven Repression der Zielgene beiträgt. Jedoch nur im Bereich der
ptsG Promotoren sind zwei Bindestellen für Mlc zu finden (115) und auch hier findet keine
kooperative Bindung dieser Bindestellen statt. Weitere Zielgene werden repremiert, indem
Mlc an eine palindrome Bindestelle bindet, die man nahe oder überlappend mit dem
Transkriptionsstart vorfindet (34, 114, 116). So betrachtet wäre die Ausbildung eines Mlc
Dimers mit der Bindung je eines der HTH-Motive an je eine Operatorhälfte vollkommen
ausreichend (110). Die deletierten C-terminalen Bereiche scheinen daher direkt oder über die
Stabilisierung anderer Bereiche im Protein für die Stabilität des N-terminalen DNABindemotives nötig zu sein.
Betrachtet man die ∆18 AS Variante von Mlc und setzt deshalb voraus, dass der C-terminale
Bereich für die Tetramerisierung des Proteins benötigt wird, so könnte ein ähnlicher
Mechanismus der Tetramerisierung wie bei dem Lac-Repressor LacI vorliegen. Bei diesem
wird über mehrere C-terminale α-Helices ein Dimer aus zwei Dimeren gebildet (86). Die
Struktur von kristallisiertem Mlc konnte kürzlich gelöst werden (48, 139). In der
asymmetrischen Einheit des Kristalls findet man zwei Mlc Dimere. In Abbildung 44 ist die
Struktur eines der Dimere gezeigt. Die C-terminalen 18 Aminosäuren sind rot markiert. Der
C-Terminus faltet in diesem Modell zurück auf den N-Terminus. Es entsteht ein Protein mit
drei Domänen. Domäne 1 umfasst die Aminosäuren 1 –81 und enthält das HTH-Motiv (grün),
4. Diskussion
109
Domäne 2 (gelb/rot) die Aminosäuren 82 bis 194 und 381 bis 406. Domäne 3 (blau) enthält
die Aminosäuren 195 bis 380. Der Teil der potentiellen Helix, der in der ∆9 AS Variante
deletiert ist, ist in Kontakt mit Domäne 1 und stabilisiert möglicherweise das HTH-Motiv
bezüglich der Domäne 2. Die neun zusätzlich deletierten Aminosäuren der ∆18 AS Variante
haben Kontakt zu den hydrophoben Resten eines zentralen ß-Faltblatts in Domäne 2. Eine
Tetramerisierung über die C-terminale amphipatische Helix liegt, in Bezug auf diese Struktur,
im Bereich des Möglichen, würde aber die Rotation des HTH-Motives erfordern, damit der Cterminale Bereich nach außen falten und den Kontakt zwischen den Dimeren bilden kann. Die
Deletion der 18 Aminosäuren könnte zu zweierlei Konsequenzen führen. Einerseits könnte
Domäne 2 nicht mehr richtig gefaltet sein, mit Konsequenzen für das HTH-Motiv,
andererseits könnte die Flexibilität des HTH-Motivs selbst erhöht werden, was wiederum eine
effektive DNA-Bindung verhindert (139).
Abb. 44: Struktur des MlcH52 Dimers (138).
Die Abbildung zeigt die ermittelte Struktur eines der Dimere, das in der asymmetrischen Einheit des MlcKristalls zu finden ist. Domäne 2 ist gelb (und rot), Domäne 3 ist blau dargestellt. Die N-terminale Domäne 1
mit HTH-Motiv ist mit grün, die C-terminale amphipatische α-Helix ist mit rot gekennzeichnet. Ein gebundenes
Zn2+ Ion ist als graue Kugel dargestellt. Den Aminosäuren 1-11 und 61-79 in Domäne 1 konnte keine definierte
Struktur zugeordnet werden und sind deshalb ausgespart worden. Die Dimerkontakte finden über Domäne 3
statt.
110
4. Diskussion
Im Gegensatz zu dem Modell, das den C-Terminus von Mlc als den möglichen
Kontaktbereich zu PtsG betrachtet, wurden von Tanaka et al. (2004) Mlc-Varianten mit je
einem Aminosäureaustausch selektioniert, die zwar normale Repressorfunktion besitzen, aber
nicht mehr durch Glukose induziert werden können (156). Die Induktion durch Glukose kann
dabei als ein Maß für die Bindung an PtsG gesehen werden (siehe Kap. 1.4.3 und 1.4.4). Eine
Mutation (I34V) befindet sich in der ersten Helix des HTH-Motivs, die andere Mutation
(H86R) wäre, verglichen mit der Kristallstruktur, in Domäne 2, aber nicht an einer
exponierten Oberfläche zu finden. Unklar ist, ob diese Aminosäuren in direkten Kontakt mit
PtsG treten können, oder ob der Aminosäureaustausch indirekt auf die Bereiche einwirkt, die
für die PtsG-Bindung benötigt werden.
4.1.2 Der Widerspruch: Mlc-Dimere in der Kristallstruktur und Tetramer
unter nativen Pufferbedingungen
Die kristallisierte Variante von Mlc (MlcH52) hat einen Aminosäureaustausch (R52H) im
Bereich der Erkennungshelix 2 des HTH-DNA-Bindemotivs (vgl. Abb.3). Es konnte gezeigt
werden, dass diese Variante dennoch zu Mlc WT vergleichbare Repressorfunktion besitzt
(siehe Kap. 3.1.4 und 4.1.3). Unter nativen Pufferbedingungen bildet auch diese Variante
Tetramere aus. Die beiden Dimere in der asymmetrischen Einheit des Kristalls könnten ein
Tetramer bilden. Eine Frage, die daraus erwuchs, war, ob die Multimerisierung von Mlc in
dem
für
die
Kristallisation
verwendeten
Puffer
verschieden
war
zu
anderen
Pufferbedingungen. MlcH52 und verschiedene Eichproteine wurden in einer Gelfiltration, in
dem bei der Kristallisation verwendeten Puffer, miteinander verglichen. Im Vergleich zu dem
im Experiment verwendeten Eichproteinen, wurde für MlcH52 die Bildung von Tetrameren,
Trimeren, Dimeren, aber hauptsächlich das Vorkommen einer monomeren Form ermittelt. An
dieser Stelle könnte diskutiert werden, ob auch in vivo unterschiedliche Multimere von Mlc
vorhanden sind, eventuell je nach dem, ob Mlc an DNA oder an PtsG gebunden vorliegt.
Dennoch müssen diese Ergebnisse mit einer gewissen Vorsicht betrachtet werden. Die
Pufferbedingungen der Kristallisation (siehe Kap. 3.1.4) sind nicht ideal für die Auftrennung
von Proteinen mittels Gelfiltration. Zwar erhält man für die Vergleichsproteine eines
Calibration Kits definierte Peaks, was eine Zuordnung des Elutionsvolumens und das
Erstellen einer korrekten Eichgerade ermöglicht. Die Auftrennung von Mlc scheint aber
4. Diskussion
111
problematisch zu sein. Betrachtet man die erhaltenen Mlc Peaks (siehe Abb. 25; -S. 76), so
gehen viele ineinander über. Es werden nahezu Plateaus gebildet und in manchen Bereichen
sind kaum Spitzen auszumachen. Die Berechnung der Peaks zeigt weiter, dass unter diesen
Pufferbedingungen auch Abbau von Mlc stattfinden müsste, da Protein eluiert, dass im
Vergleich zur Eichgerade kleiner als ein Mlc Monomer sein müsste. Proben der
Peakfraktionen wurden im SDS-PAA-Gel aufgetrennt, Coomassie gefärbt oder mittels
Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc analysiert. Für keine der Peakfraktionen konnte ein
Abbau von Mlc festgestellt werden. Selbst Fraktionen, die Proteine enthalten, die kleiner als
das Monomer sein sollten, zeigen ein Signal auf der Höhe eines kompletten Mlc Monomers
von 44 kDa. Es könnte sein, dass Mlc unter diesen Pufferbedingungen zunächst Komplexe
bildet, die über dem Ausschlussvolumen der verwendeten Gelfiltrationssäule liegen und
deshalb nur ein Teil des geladenen Proteins einläuft. Vorbeiströmender Puffer könnte im
Laufe des Experimentes die Komplexe nach und nach gelöst haben. In diesem Fall hätte man
eine Überlagerung verschiedener Elutionsprofile erhalten und die potentiell monomere Form,
wäre ein nachträglich eluiertes Tetramer oder Dimer. Ob es sich in diesem Fall wirklich um
unterschiedliche Multimere von Mlc handelt oder um Artefakte, sollte zusätzlich mit anderen
Methoden, wie beispielsweise einer analytischen Ultrazentrifugation, geklärt werden.
4.1.3 Die Regulation der Mlc abhängigen Gene durch unterschiedliche MlcVarianten
Im welchen Maße die Mlc-Varianten im Vergleich zu MlcWT fähig waren die Mlc
regulierten Gene zu repremieren, wurde durch deren Einfluss auf transkriptionelle malT-lacZ
bzw. ptsG-lacZ-Fusionen gezeigt. Darüber lassen sich die Mlc-Varianten drei Kategorien
zuordnen.
Zu der ersten Kategorie gehören die Mlc-Varianten, die eine zu MlcWT vergleichbare
Repression bewirken, wie Mlc∆9 und MlcH52, dies obwohl sich der Austausch Arg52His in
der Erkennungshelix2 des HTH-DNA-Bindemotivs befindet.
4. Diskussion
112
Die zweite Kategorie bilden die Mlc-Varianten mit Mutation im Zinkbindemotiv, deren
Fähigkeit zu repremieren eingeschränkt ist. Die Zinkbindung scheint nötig zu sein, damit Mlc
eine Konformation einnehmen kann, die es ihm ermöglicht an die DNA zubinden.
Die dritte Gruppe bilden jene Mlc-Varianten, die die Fähigkeit die Mlc regulierten Gene zu
repremieren komplett eingebüßt haben, wie Mlc∆18 und Mlc110. So konnte für Mlc∆18
gezeigt werden, dass sich dies mit der Destabilisierung das DNA-Bindemotivs erklären lässt,
während Mlc110, die Variante mit einer in frame Deletion von drei Aminosäuren schnell
abgebaut wird und der Zelle nicht mehr zur Verfügung steht. Intressanterweise konnten im
gleichen unter Glukoselimitation (103) durchgeführten Experiment, in dem auch Mlc110
gefunden wurden, weitere Mlc-Mutationen isoliert werden, die denen der in dieser Arbeit
getesteten Varianten entsprechen. So führt bei einer Mutante eine Punktmutation zu einem
Stopcodon und das wiederum zu einem Mlc mit verkürztem C-Terminus. Die andere
Mutation befindet sich im Zinkbindemotiv von Mlc. Das deutet an, dass die Zellen unter
Glukoselimitation einen Vorteil haben, die keinen funktionstüchtigen Repressor bilden. Die
für den Transport von Glukose benötigten PTS-Komponenten werden dann einerseits stärker
expremiert, andererseits wird PtsG nicht durch gebundenes Mlc blockiert.
4.1.4 Membranassoziation ist die Voraussetzung für die Inaktivierung von
Mlc
Die lösliche, cytoplasmatische B-Domäne von PtsG (EIICBGlc) reicht aus um Mlc zu binden.
Wird sie an einen heterologen Membrananker fusioniert, vermittelt sie zudem die
Inaktivierung des Repressors Mlc und damit die Derepression der Mlc-regulierten Gene.
Indem lösliches EIIBGlc an eine Chipoberfläche gekoppelt wurde, konnte von Nam et al.
(2001) mit der Methode der Oberflächenresonanzspektroskopie bewiesen werden, dass dieser
Teil von PtsG ausreicht, um den löslichen Transkriptionsfaktor Mlc zu binden (98).
Vergleichbar dazu konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Mlc an EIIBGlc bindet, das mit
einem C-terminalen His-tag an eine mit Ni2+ beladene Säule gebunden war. Diese Bindung
hielt dem Auswaschen ungebundener Proteine stand. Mlc konnte zusammen mit EIIBGlc durch
Zugabe von Imidazol eluiert werden.
4. Diskussion
113
Die Überproduktion der B-Domäne bewirkt aber in vivo keine Derepression, was mittels
lacZ-Fusionen zu Promotoren von Mlc regulierten Genen gezeigt werden konnte (84).
Verschiedene PtsG Deletionsvarianten wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, in einem
Membranbindungstest Mlc stabil zu binden (84). Bleibt zusätzlich zur B-Domäne eine
potentielle neunte Helix von PtsG erhalten ((21, 85) siehe Kap. 3.1.4) und der Linker (83), der
die beiden Domänen des Proteins verbindet, dann erfolgt die Bindung von Mlc an die
Membran und die Derepression der Mlc regulierten Gene. Die Untersuchungen in dieser
Arbeit sollten nun zeigen, ob das Vorhandensein der neunten Helix und des Linker die
Inaktivierung von Mlc bewirkt. In diesem Fall würde man in diesem Bereich Aminosäurereste
vermuten, die an der Mlc Bindung mitwirken. Andererseits könnte dieser Bereich einfach nur
die Verankerung von EIIBGlc in der Membran bewirken. EIIBGlc wurde hierfür an das Gp8Protein, einem Hüllprotein des Phagen M13, fusioniert. Dieses bildet einen heterologen
Membrananker mit keinerlei Ähnlichkeit zu PtsG. Das exprimierte Fusionsprotein konnte in
den Membranfraktionen nachgewiesen werden. Es vermittelt wie PtsG die Membranbindung
von Mlc. In Zellen, die das EIIB-Gp8 Fusionsprotein unter nicht phosphorylierenden
Bedingungen überproduzierten, sind die Mlc regulierten Gene derepremiert. Die neunte Helix
und der Linker von PtsG haben daher die Funktion eines Membranankers. Mlc wird
inaktiviert, indem es über EIIBGlc an die Membran bindet. Dieses Ergebnis wurde durch
Tanaka et al. (2004)(156) bestätigt. Statt des Gp8-Proteins wurde hier die Laktosepermease
LacY als Membrananker an EIIBGlc fusioniert.
Wenn nun beide Formen der IIB-Domäne, die lösliche wie die membrangebundene, Mlc
binden, weshalb bewirkt nur die membrangebundene Variante die Inaktivierung von Mlc als
Repressor? Bislang wurde in keinem Experiment gezeigt, dass Mlc gleichzeitig an DNA und
an EIIBGlc bindet. Die von Tanaka et al. (2004)(156) gefundenen Mutationen im N-terminalen
Bereich von Mlc, die die Bindung von Mlc an PtsG verhinderten, sprechen auch mehr dafür,
dass beides nicht gleichzeitig erfolgen kann. Möglicherweise ist aber dieser Blick zu
eingeschränkt, wenn man bedenkt, dass für die DNA-Bindung von Mlc eine Dimere Form des
Repressors ausreichen würde. Die beiden Mlc Dimere, die in der asymmetrischen Einheit des
Mlc Kristalls gefunden wurden, besitzen jeweils eine monomere Kette, die mit der des
anderen Dimers übereinstimmt. Die jeweils andere monomere Kette ist strukturell
unterschiedlich, was Bereiche im Molekül andeutet, die eine gewisse Beweglichkeit erlauben.
Auswirkung hat diese Beweglichkeit auf die Anordnung der Helices im HTH-Motiv, so dass
das eine Dimer eher die DNA bindende Form beschreibt als das andere (139). Geht man nun
4. Diskussion
114
davon aus, dass sich beide Dimere auch im Mlc Tetramer wiederfinden und dass nur das
Dimer für die DNA Bindung benötigt würde, wäre die gleichzeitige Bindung von DNA und
EIIBGlc eventuell möglich. Diese Möglichkeiten könnte auch im Zusammenhang mit der seit
kurzem bekannten Tatsache, dass nicht alles PtsG in die Membran eingebaut wird, diskutiert
werden. Ein Teil des translatierten Proteins liegt als lösliche, monomere Form in der Zelle vor
(1), die unter Umständen ebenfalls an Mlc binden kann. Bezieht man sich wiederum auf die
Hypothese, dass für die Tetramerisierung von Mlc über die exponierte C-terminale Helix eine
Rotation des HTH-Motives notwendig, könnte man zwei Zustände von Mlc postulieren. Diese
sind eine dimere, DNA bindende Form und eine tetramere Form, die an PtsG bindet (138).
Letztendlich führen experimentelle Befunde und Modellvorstellungen abermals zu dem
Schluss, dass die Derepression der Mlc regulierten Gene eine direkte Folge des Abtitrierens
von Mlc an die Membran ist.
Eine mögliche Rolle der C-terminalen amphipatischen α-Helix könnte sein, dass dieser Teil
von Mlc, über die Bindung an PtsG hinaus, direkt an die Membran bindet. Bei Proteinen mit
ebenfalls einer amphipatischen Helix, wie EIIAGlc (165) oder MinD (153), vermittelt diese
Helix die Membranassoziation bzw. stabilisiert über den Kontakt mit der Membran die
Bindung an ein Membranprotein. Das wäre eine weitere Erklärungsmöglichkeit, weshalb die
∆18 AS Variante nicht stabil an die Membran gebunden wird. Die Idee, dass die Membran
oder Membrankomponenten für die Mlc-Inaktivierung von Bedeutung sein könnten, ergab
sich aus dem Vergleich zu Untersuchungen an dem Antiterminator BglG (49) aus E. coli und
ToxR aus Vibrio colerae (94, 109). Diese waren trotz der potentiell räumlichen Trennung,
bzw. Fixierung an einem Ort durch Membranbindung, regulatorisch aktiv. Diese Annahme
wird ebenfalls durch die Experimente von Tanaka (2004) (156) unterstützt. Das über den
Membrananker (LacY) an der Membran fixierte Mlc hatte im Gegensatz zu einem löslichen
Mlc-Fusionsprotein keine Repressoraktivität. Die Ergebnisse aus den Untersuchen der Gp8IIB-Fusionsproteine und der Mlc-Varianten, zusammen mit den von Tanaka (156) gemachten
Beobachtungen zeigen, dass PtsG Mlc in Abhängigkeit vom Glukosetransport an die
Membran bindet. Der Membrankontakt an sich und nicht die Bindung zu PtsG inaktiviert den
Repressor Mlc.
Auch, wenn in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass Bereiche von PtsG, die außerhalb
der B-Domäne liegen, im Bezug auf die Mlc-Bindung nur die Membranlokalisation
verursachen, so bestand dennoch ein Unterschied darin, ob im Membranbindetest das PtsG
4. Diskussion
115
(EIICBGlc) insgesamt vorlag oder die Gp8-IIB-Fusion. Bei Verwendung der Gp8-IIB-Fusion
war früher eine sättigende Bindung von Mlc erreicht. Im Bindetest konnte durch die mit PtsG
angereicherten Membranen 2 µg Mlc gebunden werden, durch Gp8-IIB aber nur 1 µg Mlc.
Das Gp8-IIB-Fusionsprotein könnte vergleichbar löslichem EIIBGlc als Monomer an die
Membran gebunden werden, während PtsG als Dimer vorliegt (173). Die ausbleibende
Oligomerisierung von EIIBGlc könnte dann die Affinität der Mlc Bindung verringern oder die
Stoichiometrie der Mlc – IIB Bindung verändern. Weitere Beobachtungen sprechen dafür,
dass die C-Domäne von PtsG zwar nicht direkt an der Bindung von Mlc beteiligt ist, aber die
B-Domäne derart beeinflussen könnte, dass die Mlc-Bindung mit höherer Affinität stattfindet.
So konnten für EIICGlc Mutationen beschrieben werden, deren Substratspezifität zum einen
verändert ist (80, 105) und zum anderen die Repression der Mlc regulierten Gene auch unter
nicht induzierenden Bedingungen teilweise aufheben (104, 117, 172). Die dabei erhaltenen
Mutationen befinden sich an Positionen in EIICGlc , die nicht in direkten Kontakt mit Mlc
treten können. Das Gp8-EIIBGlc ist daher ausreichend für die Bindung von Mlc und bewirkt
die Inaktivierung des Repressors durch dessen Bindung an die Membran. Unter normalen in
vivo Bedingungen mit Wildtyp PtsG erfolgt das induzierende Signal durch den Transport von
Glukose und der damit verbundenen Dephosphorylierung von PtsG. Ein möglicherweise
damit verbundener Einfluss der C-Domäne auf die in der B-Domäne gelegene Bindestelle von
Mlc könnte die Affinität der Mlc-Bindung erhöhen.
4.1.5 Die Phosphorylierungsabhängige Bindung von EIIBGlc und Mlc
Mlc bindet an dephosphoryliertes PtsG wie man es bei aktivem Transport von Glukose
vorfindet. Die Phosphorylierungsstelle von PtsG befindet sich an dem Cys421 innerhalb der
cytoplasmatischen B-Domäne von PtsG. In einer durch NMR Spektroskopie ermittelten
Struktur der löslichen IIB-Domäne findet man das Cys421 innerhalb einer konvexen
Oberfläche. Es ist Teil eines polaren Bereichs, der von hydrophoben Aminosäureresten und
einem Halbkreis an hydrophilen Aminosäureresten umgeben ist (25, 37, 47). Die Bindetests
mit Varianten des Gp8-IIB-Fusionsproteins zeigten, dass das in diesem Bereich befindliche
Arg424 für die Bindung von Mlc unbedingt erforderlich ist. Der Austausch von Arg424 nach
Ala, Lys oder His verhinderte die Bindung von Mlc an EIIBGlc.
4. Diskussion
116
Da die Bindung von Mlc an EIIBGlc davon abhängt, dass dieses dephosphoryliert vorliegt, war
zunächst die Phosphorylierungsstelle von PtsG, das Cys421, ein Ziel der Untersuchung. Dabei
wurden Gp8-IIBGlc-Fusionsproteine mit einem Austausch unterschiedlicher Aminosäuren, in
und um die Phosphorylierungsstelle, getestet. Beide Varianten mit Aminosäureaustausch
Cys421Ser oder Cys421Asp binden Mlc. Diese Bindung und die Derepression der Mlc
regulierten Gene ist konstitutiv, da EIIBGlc nicht mehr phosphoryliert werden kann. Eine
Möglichkeit wäre gewesen, dass die Thiolgruppe des Cysteins an der Mlc Bindung beteiligt
ist. Diese wäre bei dem phosphorylierten EIIBGlc nicht mehr zur Verfügung gestanden. Der
Aminosäureaustausch nach Serin und Aspartat sollte die dephosphorylierte und die
phosphorylierte Form simulieren (siehe Kap. 3.1.3) um herauszufinden, ob die durch das
gebundene Phosphat eingebrachte negative Ladung die Mlc Bindung verhindert. Der
Bindetest jedoch zeigte, weder wird die Thiolgruppe von Cys421 für die Mlc Bindung
benötigt, noch wird die Bindung durch die zusätzliche negative Ladung, wie sie bei der
Phosphorylierung zu erwarten ist, verhindert.
Untersuchungen an PtsG mit einem Austausch des Arg424 oder Arg426 nach Alanin, zeigen,
dass diese Proteine Glukose weder transportieren, noch phosphorylieren. Im in vitro Test
können diese Varianten nicht mehr durch Glukose dephosphoryliert werden und man geht
deshalb davon aus, dass die Aminosäurereste für den Phosphattransfer von EIIB auf Glukose
benötigt werden (83). Aus der NMR Struktur des EIIBGlc/EIIAGlc Komplexes geht hervor,
dass Arg424 und auch Arg426 durchaus in Kontakt zu EIIAGlc stehen und dass vor allem
Arg424 Teil eines Netzwerkes an Aminosäureresten ist, das die Thiolgruppe des Cys421 über
Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert (25). Die hier getesteten Gp8-IIB-Varianten mit
dem Austausch Arg426 oder Asp419 waren weiterhin fähig Mlc zu binden und die
Derepression der Mlc regulierten Gene zu vermitteln. Beides ist bei einem Austausch von
Arg424 nach Ala komplett aufgehoben. Durch den Austausch Arg424 nach His oder Lysin,
wird zwar der Aminosäurerest, aber nicht die Ladung in diesen Bereich des Proteins
verändert. Es erfolgte keine Bindung an Gp8-IIB (Arg424Lys), aber noch ein Rest an
Bindung an die Variante (Arg424His). Gebundenes Mlc kann aber durch zusätzliches
Resuspendieren und Abzentrifugieren der Membranen gelöst werden. Dies ist bei den
Varianten, an die Mlc stabil gebunden ist, nicht möglich. In vivo vermittelt keine der drei
Arg424-Varianten die Derepression durch Mlc repremierter Gene.
Die bisherigen Ergebnisse beziehen sich auf Versuche, die unter dem Ausschluss der PTS
abhängigen Phosphorylierung der Gp8-IIB-Varianten durchgeführt worden waren. Wurden
117
4. Diskussion
die Membranen von Zellen präpariert, die noch zur PTS abhängigen Phosphorylierung der
Gp8-IIB-Varianten fähig waren, so enthielten die Membranen eine Mischung aus
phosphorylierten und dephosphorylierten EIIBGlc. Die Ergebnisse dieser Bindetests
entsprachen weitestgehend den zuvor durchgeführten. Die Bindung von Mlc an das Wildtyp
EIIBGlc und die Variante EIIBGlc (Arg426Ala) war etwas reduziert, was sich im Falle des
Wildtyp EIIBGlc leicht durch eine geringere Menge des Proteins erklären ließ. Das zeigte ein
Westerblot mit Antkörpern gegen EIIBGlc, mit dem das Vorkommen der Gp8-IIB-Varianten in
der Membran miteinander verglichen wurde. EIIBGlc (Arg426Ala) konnte in in vitro
Phosphorylierungsassays weniger phophoryliert werden. Es wird vermutet, dass dies darauf
zurückzuführen ist, dass das Protein unter den in vitro Bedingungen weniger dephosphoryliert
wird und deshalb auch weniger durch das nachweisbare
32
P phosphoryliert wird (J.
Plumbridge, persönliche Mitteilung). Daraus konnte geschlossen werden, dass ein größerer
Anteil des Gp8-IIB (Arg426Ala) phosphoryliert war, als in den anderen Proben, was
letztendlich die reduzierte Bindung von Mlc bewirkte.
In begleitend durchgeführten Untersuchungen der Gp8-IIB-Varianten, wurde getestet, ob
deren Überproduktion die Repression einer ptsG-lacZ-Fusion verhindert. Um eine maximale
Bindung von Mlc an die IIB-Varianten zu erreichen wurde dies unter Bedingungen
durchgeführt, die keine PTS abhängige Phosphorylierung ermöglichten. Die nicht im
Bindetest analysierten Varianten Thr423Ala, Gln456Ala zeigten nur eine eingeschränkte
Derepression
und
die
Varianten
Arg424Ala/His/Cys,
sowie
die
Doppelmutante
Ile458//Gln456-Ala keinerlei Derepression der Mlc regulierten Gene (J. Plumbridge in (141)).
Die Bindetests zusammen mit den Ergebnissen, die sich auf die Repression und Induktion der
ptsG-lacZ-Fusion stützen, lassen vermuten, dass eine mögliche Mlc-Bindetstelle an EIIBGlc
mit dem Bereich überlappt, an den auch EIIAGlc gebunden wird und der die
Phosphorylierungsstelle, das Cys421, enthält (siehe auch (25)). Mittels NMR Spektroskopie
wurde durch die Phosphorylierung von Cys421 bezüglich der Region Ile422, Thr423, Arg424
eine potentielle Konformationsänderung gezeigt (47), welche von Mlc wahrgenommen
werden könnte.
118
4. Diskussion
4.2 Die Wechselwirkung zwischen Mlc und YeeI
YeeI ist ein weiteres Protein, das an Mlc bindet und es scheinbar in seiner Funktion als
Repressor inaktiviert (siehe Kap. 1.5 und 3.2). Bislang ist nichts über die Bedingungen unter
denen YeeI in den Zellen expremiert wird oder welche Rolle dieser zusätzliche
Regulationsmechanismus unter physiologischen Bedingungen hat bekannt. Mit Hilfe des
„Quick BlastP Search“ der Expasy Datenbank (Program: NCBI BLASTP 1.5.4-Paracel;
Database: EXPASY/UniProt) wurde nach Organismen gesucht, die zu Mlc oder YeeI
ähnliche Proteine besitzen. Bespielhaft sind wurden die Bakterien betrachtet, die ein Protein
mit mehr als 50 % Identität zu Mlc oder YeeI in E. coli besitzen. Interessanterweise zeigt
sich, dass man in allen Enterobacteriaceae, in denen man ein Protein findet, das mehr als 50
% Identität zu E . coli Mlc aufweist, auch ein Protein vorhanden ist, dass mehr als 50 %
Identität zu E. coli YeeI aufweist (siehe Tab. 20). Die mit (*) gekennzeichneten Bakterien
besitzen zudem ein Protein mit hoher Identität zu PtsG. In diesem Zusammenhang wäre es
interessant zu untersuchen, ob bei diesen Bakterien ein zu E . coli vergleichbares MlcRegulon zu finden ist und wenn ja, wie die Inaktivierung von Mlc in diesen Bakterien erfolgt.
YeeI
Stamm
E. coli O157:H7*
[ECs2774]
Mlc
Identität Positive Stamm
[%]
[%]
E. coli O157:H7
100
100
Identität
[%]
99
Positive
[%]
99
99
99
99
99
Salmonella
paratyphi-a
[mlc] *
Salmonella
typhimurium [mlc] *
91
96
91
96
[mlc]
*
Shigella flexneri
[mlc]
*
E. coli O6 [mlc] *
Shigella flexneri*
[S2148]
98
98
E. coli O6 * [yeeI]
Escherichia
fergusonii
Salmonella
paratyphi-a* [yeeI]
98
82
98
89
81
89
Salmonella *
typhimurium[yeeI]
pot. Membranprotein
Salmonella
typhimurium
[STY2208] *
Yersinia
pestis[YP1472]*
85
93
84
92
Salmonella *
typhimurium[STY1576]
90
96
66
80
Yersinia pestis *
Q8ZEB4_YERPE
[mlc]
Yersinia pestis *
Q8D0I0_YERPE [mlc]
73
85
73
85
119
4. Diskussion
YeeI
Mlc
Yersinia *
pseudotuberculosis
[YPTB1611]
Yersinia *
pseudotuberculosis
[ORF1]
Erwinia carotovora
* [ECA1680]
66
80
73
86
61
76
Yersinia *
pseudotuberculosis
[mlc]
73
85
Erwinia carotovora *
[ECA2258]
Photorhabdus
luminescens [mlc]
Photobacterium *
profundum [mlc]
71
84
54
74
50
72
Tabelle 20: Liste von Gram negativen Bakterien mit zu Mlc und YeeI ähnlichen Proteinen.
Zunächst wurde die Möglichkeit überprüft, ob YeeI Mlc durch Bindung von PtsG abzieht. Im
Bindetest zwischen Mlc und PtsG, bei dem YeeI im Überschuss zugegeben wurde, erfolgte
keine Ablösung von Mlc von den PtsG enthaltenden Membranen (siehe Kap. 3.2.2).
Die Möglichkeit, ob ein ternärer Komplex, PtsG/Mlc/YeeI, membrangebunden vorliegt,
wurde nicht überprüft. So hätte man sich vorstellen können, dass YeeI die Bindung von Mlc
an die Membran unterstützt. Dagegen spricht aber, dass bei der Durchführung der in vitro
Bindetests
zwischen
gereinigtem
EIIBGlc
bzw.
mit
PtsG
angereicherten
Membranpräparationen und Mlc keine cytoplasmatischen Komponenten benötigt werden, um
eine effektive Bindung von Mlc an die B-Domäne von PtsG zu bewirken.
YeeI scheint ein lösliches cytoplasmatisches Protein zu sein. So lässt es sich als lösliches
Protein unter nativen Pufferbedingungen reinigen (Ann-Katrin Becker, persönliche
Mitteilung). Verschiedene Programme zur Vorhersage einer möglichen Sekundärstruktur oder
potentieller Transmembranhelices zeigen keine signifikanten Bereiche, die auf ein
membrangebundenes Protein hinweisen würden (http://ca.expasy.org/tools/). Bedenkt man
jedoch, dass die Ergebnisse der Mlc-Inaktivierung durch PtsG darauf hinweisen, dass gerade
die Bindung an die Membran das Ereignis ist, das die Inaktivierung von Mlc ermöglicht,
scheint es erstaunlich, dass das in diesen Fall durch ein lösliches Protein ermöglicht werden
sollte. Allerdings scheint die Induktion der Mlc regulierten Gene durch Überproduktion von
YeeI insgesamt geringer zu sein, als die durch die Bindung von Mlc an PtsG. YeeI scheint
4. Diskussion
120
Mlc nicht vollständig zu inaktivieren. So konnte kein Einfluss auf die Expression der
allgemeinen PTS-Komponenten, kodiert im Operon ptsHIcrr, festgestellt werden (8, 9).
Hierbei wäre auch eine weitere Analyse nötig, ob Mlc YeeI in einer vergleichbaren Weise
bindet wie PtsG. Die Bindetests mit MlcWT und den C-terminal deletierten Mlc-Varianten
Mlc∆9, Mlc∆18, scheinen zunächst darauf hinzuweisen, da die Bindung der Variante Mlc∆18
an YeeI ebenso wie an PtsG unterbleibt. Da aber bei dieser Variante die Ausbildung der
korrekten Tertiär/Quartiärstruktur an sich gestört ist, kann keine Aussage darüber getroffen
werden, ob sich das nicht auch auf alternative Bindesequenzen auswirkt, die nur für die
Bindung an YeeI und nicht für die an PtsG benötigt werden. Ein Vergleich der Primärstruktur
von PtsG und YeeI zeigt keine signifikanten Übereinstimmungen.
4.3 Die Interaktion zwischen EIIAGlc und der Adenylatcyclase
Auch die Menge des transkriptionellen Aktivatorkomplexes cAMP/CAP im Mlc-PtsG-System
wird durch eine PTS-Komponente, dem EIIAGlc, reguliert. EIIAGlc beeinflusst die Aktivität
des Enzyms Adenylatcyclase, welche die Bildung von cAMP aus ATP katalysiert. Die
bisherigen Ergebnisse wurden indirekt durch Untersuchung der Adenylatcyclaseaktivität in
PTS-Mutanten und bei Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen erhalten (44, 78,
100, 124). Demnach wird die Aktivität der Adenylatcyclase stimuliert, wenn EIIAGlc
phosphoryliert ist, nicht aber, wenn EIIAGlc, aufgrund des Transportes und der
Phosphorylierung von PTS-Substraten (v. a. Glukose), dephosphoryliert vorliegt (124). Es
wurde postuliert, dass EIIAGlc-Phosphat an die Adenylatcyclase bindet. Diesem Modell
zufolge geschieht die Aktivierung, indem durch die EIIAGlc-Phosphat Bindung der
inhibitorische Effekt aufgehoben wird, den die regulatorische C-terminale Domäne der
Adenylatcyclase auf die eigene N-terminale katalytische Domäne ausübt (63, 135).
Die Adenylatcyclase kommt unter normalen, physiologischen Bedingungen nur in sehr
geringen Mengen vor, etwa 15 Moleküle pro Zelle. Durch Überproduktion von
plasmidkodierter Adenylatcyclase lässt sich eine Steigerung erreichen, die es erlaubt, dass
Protein mit konventionellen Methoden zu reinigen und in vitro Enzymtests damit
121
4. Diskussion
durchzuführen (132, 171). Über die Löslichkeit und Aktivität des Proteins gibt es
widersprüchliche Angaben. So wurde einerseits behauptet, dass die Assoziation des Proteins
an die Membran eine Voraussetzung für dessen Aktivität sei, da diese nur in permeabilisierten
Zellen nachweisbar war und nicht im zellfreien System (135). Es wurde weiter beschrieben,
dass etwa 75 % des Proteins in der Membranfraktion zu finden wären und etwa 25 % als
lösliches Protein im Cytoplasma vorliegen würde. Andere Methoden der Proteinreinigung
führten zu dem Ergebnis, dass nur etwa 15 % des Proteins in der Membranfraktion zu finden
sind und 85 % als lösliches Protein vorliegen (171). Wie der Kontakt der Adenylatcyclase zur
Membran zustande kommt ist unklar. Bisher konnte kein Protein identifiziert werden, dass die
Membranbindung indirekt vermitteln könnte. Auch verschiedene hydrophobe Bereiche der
Adenylatcyclase selbst sind an sich nicht ausreichend. Im Rahmen der hier durchgeführten
Experimente, konnte die Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag in der Membranfraktion
nachgewiesen
werden.
Eine
ausreichende
Menge
membranassoziiert, um damit Membranbindungstests
der
Adenylatcyclase
war
mit EIIAGlc durchzuführen. Die
gebundene Menge entsprach schätzungsweise den in (170) angegebenen 15 – 20 % des
gebildeten Proteins (Daten nicht gezeigt).
Die Ergebnisse in dieser Arbeit zeigen, dass in E .coli eine direkte Protein-Protein-Interaktion
zwischen dem EIIAGlc und der Adenylatcyclase stattfindet. Diese Interaktion schien,
zumindest unter in vitro Bedingungen, unabhängig vom Phosphorylierungszustand des
EIIAGlc zu erfolgen. Die Interaktion mit der Adenylatcyclase wurde mit gereinigtem EIIAGlc
getestet und mit Zellextrakten, die überproduziertes EIIAGlc enthielten. In beiden Fällen war
sowohl phosphoryliertes, als auch dephosphoryliertes EIIAGlc enthalten. Zusätzlich wurde die
Interaktion mit ausschließlich dephosphoryliertem EIIAGlc getestet. Die Frage, ob die
Adenylatcyclase an beide Formen von EIIAGlc bindet oder auch nur an dephosphoryliertes
EIIAGlc konnte mit dem durchgeführten Membranbindungstests nicht beantwortet werden, da
keine Probe verwendet wurde, die ausschließlich EIIAGlc-Phosphat enthielt, beziehungsweise
der Phophorylierungszustand des gebundenen EIIAGlc nicht nachgeprüft wurde.
Das oben beschriebene Modell der Regulation der Adenylatcyclaseaktivität muss aufgrund
dieser Ergebnisse neu bedacht werden. Geht man zunächst davon aus, dass sowohl die
phosphorylierte als auch die dephosphorylierte Form von EIIAGlc an die Adenylatcyclase
bindet, könnte der Phosphorylierungszustand von EIIAGlc entscheidend sein, ob das Protein
122
4. Diskussion
aktivierend oder deaktivierend auf die Adenylatcyclase wirkt. Das Signal könnte
beispielsweise über die negative Ladung des gebundenen Phosphat übertragen werden.
Entgegen dem vorherrschenden Modell, der Aktivierung der Adenylatcyclase durch EIIAGlcPhosphat, gab es auch Modelle, die von einer Inaktivierung des Enzyms durch
dephosphoryliertes EIIAGlc ausgingen. Bei dem Versuch die Regulation der Adenylatcyclase
in Zellextrakten zu erforschen, zeigte sich, dass die Zugabe von PTS-Komponenten und PEP
alleine nicht ausreichte um den cAMP Spiegel zu erhöhen. Diese erfolgt bei Zugabe von
anorganischem Phosphat (Pi). Im Gegensatz dazu inhibierte das dephosphorylierte EIIAGlc die
Adenylatcyclaseaktivität, wenn Pi zugegeben wurde (87, 124, 131). Es wurde vermutet, dass
bei Vorhandensein von Pyruvat Pi in Form von ATP abgezogen wird. Daraus wurde
geschlossen, dass dephosphoryliertes EIIAGlc die Adenylatcyclase in einem Pi abhängigen
Prozess inaktiviert. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen ebenfalls für die Möglichkeit der
Inaktivierung der Adenylatcyclase durch dephosphoryliertes EIIAGlc. Allerdings würde ein
Modell, dass nur von einer Deaktivierung durch dephosphoryliertes EIIAGlc ausgeht und die
Aktivierung der Adenylatcyclase durch phosphoryliertes EIIAGlc außer Acht lässt, nicht
erklären weshalb die cAMP Konzentration in crr (EIIAGlc) -Mutanten erniedrigt ist (siehe
Kap. 1.3.2).
Die Dephosphorylierung von EIIA während des Transports von externer Glukose hätte somit
zwei Konsequenzen. Zum einem würde die Bindung von EIIAGlc an Permeasen und katabole
Enzyme Induktorausschluss bewirken (124). Zum anderen würde die Bindung an die
Adenylatcyclase deren Inaktivierung zur Folge haben. Es würde sich also bei der
Inaktivierung
der
Adenylatcyclase
um
einen
dem
Induktorausschluss
ähnlichem
Mechanismus handeln.
Das Modell der Inaktivierung der Adenylatcyclase durch dephosphoryliertes EIIAGlc lässt sich
auf die durch Glukosetransport bewirkte Katabolitenrepression anwenden. Der Transport von
Glukose bewirkt eine starke Dephosphorylierung von EIIAGlc. Die Phosphorylierung des
Proteins könnte, wenn auch nicht geklärt wie, die Aktivierung der Adenylatcyclase bewirken.
Hierin könnte auch der Sinn der teilweisen Membranassoziation der Adenylatcyclase liegen.
So würde die Adenylatcyclase mit gebundenen EIIAGlc in die Nähe des EIICBGlc (PtsG)
gelangen. Die Phosphorylierung der PTS-Proteine ist reversibel. Phosphoryliertes EIICBGlc
könnte ein Zeichen dafür sein, dass keine Glukoseaufnahme mehr stattfindet und das
4. Diskussion
123
Phosphat auf EIIAGlc übertragen. EIIAGlc-Phosphat würde dann die Adenylatcyclase
aktivieren oder die Bindung zwischen den Proteinen lösen.
Bei der Katabolitenrepression durch Nicht-PTS-Zucker ist das Signal für die Anwesenheit des
Zuckers, das bei dessen Abbau gebildete Zucker-Phosphat. Sensor für dieses Signal ist das
EIIAGlc. Dessen Interaktion mit der Adenylatcyclase wird dahingehend beeinflusst, dass keine
Aktivierung der Adenylatcyclase stattfindet (39). Das Modell der Inaktivierung der
Adenylatcyclase durch EIIAGlc würde dann auch erklären, weshalb die Zugabe der
Zuckerphosphate (siehe Kap 3.3.3) die Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIAGlc
nicht beeinflusst hat. Die Inaktivierung des Enzyms durch dephosphoryliertes EIIAGlc konnte
so aufrecht erhalten werden. Nicht-PTS-Zucker rufen eine sehr unterschiedliche
Dephosphorylierung von EIIAGlc hervor. Diese ist meist wesentlich geringer als die durch den
Transport von Glukose bewirkte. Der Transport von Glycerin und dessen Verwertung bewirkt
nur eine etwa 14 % Dephosphorylierung von EIIAGlc (61). Diese Menge an
dephosphoryliertem EIIAGlc müsste dann ausreichen um die Adenylatcyclase zu inaktivieren.
Wenn man bedenkt, dass die Adenylatcyclase in sehr geringen Mengen von nur etwa 15
Molekülen (171) in der Zelle vorkommt und das EIIAGlc (95) mit etwa 15000 Molekülen,
wäre dies vorstellbar. Zumindest eine teilweise Inhibierung.
Die Klonierung der beiden Domänen der Adenylatcyclase als separate Polypeptide
ermöglichte es zu zeigen, dass EIIAGlc durch die katalytische Domäne des Enzyms gebunden
wird. Die nicht nachweisbare Bindung von EIIAGlc an die regulatorische Domäne der
Adenylatcyclase sollte vorsichtig diskutiert werden. Es ist nicht sicher, dass die unabhängig
vom Rest des Proteins exprimierte Domäne auch korrekt gefaltet war. Möglich wäre auch,
dass eine Bindung von EIIAGlc über beide Domänen erfolgt und die an die regulatorische
Domäne nur zu sehen ist, wenn die EIIAGlc Bindung über die Bindung an die katalytische
Domäne stabilisiert wird. Hinweise auf potentielle EIIAGlc Bindestellen in beiden Domänen
der Adenylatcyclase ergaben sich schon früher aus der Analyse von C-terminal trunkierten
Varianten der Adenylatcyclase und von solchen mit einem Aminosäureaustausch in der Nterminalen Hälfte des Enzyms (31, 135). Betreffend der Bindung von EIIAGlc an die
katalytische Domäne bestand ein Unterschied, ob eine Variante (AS: 87-535) getestet wurde,
deren N-terminale 86 Aminosäuren entfernt waren oder eine Variante (0-535) ohne diese
Deletion. Es erfolgte keine Bindung von EIIAGlc an die N-terminal trunkierte Variante. Die Nterminalen 86 Aminosäuren der Adenylatcyclase werden für die Bindung von EIIAGlc
4. Diskussion
124
benötigt. Bezieht man mit ein, dass ein Fragment, das den Aminosäuren 82-341 (62) bzw. 87
– 531 (siehe Kap. 3.3.2; Abb. 33) entspricht, katalytisch aktiv ist, EIIAGlc an den N-terminalen
Bereich der Adenylatcyclase bindet und die regulatorische Domäne für die Inhibierung der
Adenylatcyclaseaktivität benötigt wird, dann kann man sich ein vorläufiges in Abbildung 45
gezeigtes Modell vorstellen.
Abb. 45: Aktivierung/Inaktivierung der Adenylatcyclase.
A: Dephosphoryliertes EIIAGlc ist an den N-terminalen Bereich der Adenylatcyclase gebunden (und evt. an die
regulatorische Domäne). Die Adenylatcyclase liegt in einer Konformation vor, in der die regulatorische Domäne
die Aktivität der katalytischen Domäne inhibiert. Die Ausbildung dieser Konformation wäre auch dann
vorstellbar, wenn, beispielsweise in der crr (EIIAGlc)-Mutante, kein EIIAGlc gebunden wird.
B: Das gebundene EIIAGlc ist phosphoryliert. Elektrostatische Abstoßung aufgrund der negativen Ladung des
gebundenen Phosphates und/oder sterische Abstossung verhindern den Kontakt der regulatorischen Domäne zur
katalytischen Domäne. Die Adenylatcyclase ist aktiv.
C: Die EIIAGlc Bindung hat keinen Einfluss auf den minimal katalytischen Bereich (grün). Fehlt die
regulatorische Domäne erhält man ein Protein, dass unabhängig vom Phosphorylierungszustand von EIIAGlc oder
vom Vorhandensein von EIIAGlc aktiv ist.
Sicherlich ist der Test weiterer Adenylatcyclase Varianten in Verbindung mit der
Bestimmung der Adenylatcyclaseaktivität nötig, bevor ein Modell aufgestellt werden kann,
dass den tatsächlichen Gegebenheiten nahe kommt.
4. Diskussion
125
Zusammenfassend kann man also sagen, dass EIIAGlc eine direkte Interaktion mit der
Adenylatcyclase eingeht. Für diese Bindung ist die katalytische Domäne der Adenylatcyclase
ausreichend. Das Modell der Deaktivierung der Adenylatcyclase durch dephosphoryliertes
EIIAGlc ist mit früheren Erfahrungen und den in dieser Arbeit gemachten Ergebnissen
vereinbar. Nach wie vor nicht geklärt ist, wie die Zuckerphosphate auf die AdenylatcyclaseAktivität einwirken, ob dies beispielsweise auch über die Dephosphorylierung von EIIAGlc
erreicht wird. Wäre EIIAGlc aber nur der Inhibitor der Adenylatcyclase-Aktivität, würde man
in crr (EIIAGlc)-Mutanten einen Anstieg der Adenylatcyclase-Aktivität erwarten. Das
Gegenteil ist der Fall. Der cAMP-Spiegel in einer crr-Mutante ist niedrig im Vergleich zu
dem von Wildtypzellen. EIIAGlc wird auch für die Aktivierung des Enzyms benötigt.
4.4 Das Mlc-Regulon
Eine Frage, der ebenfalls in dieser Arbeit nachgegangen werden sollte, war, ob, außer den
bislang bekannten, noch weitere Gene durch Mlc reguliert werden. Um einen Überblick
darüber zu bekommen, wurde zum einen das Transkriptom einer mlc-Mutante mit dem des
Wildtyps verglichen beziehungsweise mit dem eines Stammes, der mlc überexprimierte.
Ergänzend wurde das Proteom eines Stammes mit mlc-Mutation mit dem eines Stammes
verglichen, der Mlc überproduzierte.
Obwohl bei den einzelnen DNA-Chip-Experimenten doch eine Vielzahl an Genen in der mlcMutante signifikant erhöht oder erniedrigt exprimiert waren, ließen sich diese umfangreichen
Ergebnisse durch eine statistische Auswertung auf eine Liste von 41 Genen einschränken. Die
Überprüfung der Daten mittels transkriptioneller lacZ- oder phoA-Fusionen, ermöglichte es
für die Gene proV, agn(=flu), tauC, ssuC, yabN (=sgrR), yeeR, araD, araC, tbpA
auszuschließen, dass diese durch Mlc reguliert werden. Das Gen yobD wird möglicherweise
zusammen mit den Genen manXYZ transkripiert (Daten nicht gezeigt). Bislang konnten keine
unbekannten Zielgene der Mlc-Regulation identifiziert werden.
4. Diskussion
126
Es zeigen sich mehr Übereinstimmungen zwischen den Chipexperimenten, in denen der
Wildtyp mit der mlc-Mutante verglichen wurde und dem Vergleich ptsG-Mutante mit
ptsG/mlc-Doppelmutante als zu dem Vergleich mlc-Mutante mit mlc-Überexpression. Im
Vergleich Wildtyp mit ptsG-Mutante war die Expression keines Genes signifikant erhöht oder
erniedrigt (Daten nicht gezeigt). Das zu den anderen Vergleichen unterschiedliche
Expressionsmuster im Experiment mit der mlc-Überexpression könnte schon darauf
zurückzuführen sein, dass die Überproduktion eines Proteines an sich einen gewissen Stress
für die Zelle bedeutet und so das Expressionsmuster der Zelle in diesem Sinne verändert
wird. Andererseits wird auch die mlc-Expression bei Hitzestress leicht erhöht (144). Die MlcÜberproduktion könnte so einen permanenten Stress simulieren, ohne dass in diesem Fall
andere Gene, die normalerweise bei Stress auch erhöht exprimiert werden, davon betroffen
sind. Der Ansatz mit mlc-Überexpression scheint am wenigsten geeignet zu sein die
Regulation durch Mlc zu definieren.
Dass die Microarrays aussagekräftig sind, zeigt das Vorhandensein von Signalen für die
bekannten Mlc regulierten Gene. Nahezu alle finden sich auch in der statistischen
Auswertung wieder (mlc, ptsG, ptsHI, manXYZ, malT => malP, malG, malF, malK, malM).
Aus den Untersuchungen mit transkriptionellen lacZ-Fusionen zu diesen Genen ist bekannt,
dass deren Expression in einer mlc-Mutante um etwa 2 –5 fach erhöht ist (34, 114). Eine
Ausnahme bildet dabei ptsG mit einer bis zu 20-fachen Erhöhung. Man würde folglich auch
für die unbekannten Mlc regulierten Gene einen Anstieg der Expression
um etwa 2-5
erwarten. Betrachtet man Gene, deren Expression nur derart gering verändert ist, können bei
der Auswertung, wie sie in Kap. 2.4.4 beschrieben ist, nicht alle Ungenauigkeiten
berücksichtigt werden. Bedenkt man nun die Schwankungen, die natürlicherweise bei der
Expression von Genen auftreten können, und zudem Schwankungen, die auf die Präparation
der RNA, Chipherstellung oder Hybridisierung der cDNA zurückzuführen sind, wird deutlich,
dass viele falsch positive Signale auftreten können und manche Signale verloren gehen. Darin
zeigt sich die Wichtigkeit der Wiederholung und der statistischen Auswertung der erhaltenen
Microarraydaten. Die Frage ist allerdings, wie viele Wiederholungen des Experimentes in
diesem Fall notwendig gewesen wären, um nur mit den Microarraydaten mit ausreichend
hoher Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass ein Gen Mlc abhängig exprimiert wird. Die
Ergebnisse aus den bisher durchgeführten acht Microarrays können daher eine Orientierung
sein, für welche Gene es sich lohnt, eine genauere Untersuchung mit anderen Methoden
durchzuführen. Ein signifikant erhöhtes Signal auf einem der Microarrays ist aber in diesem
4. Diskussion
127
Fall noch kein Beweis, dass das Gen tatsächlich Mlc abhängig exprimiert wird. Tabelle 21
zeigt einige Charakteristika oder auch Gemeinsamkeiten der Genprodukte der Gene, deren
Signal nach der statistischen Auswertung der Microarrays als signifikant erhöht/erniedrigt galt
(15, 20, 53, 102, 124, 140, 151, 164). Aber auch dadurch ließ sich kein Schema ableiten, das
die Suche nach den tatsächlich durch Mlc regulierten Gene erleichtern würde.
Gemeinsamkeit
beteiligt
an
Kohlehydratabbau/transport;
Aufbau
von
Polysacchariden;
Gene
araD, araC, yabN, ptsG, maa, abgR, mlc, manXYZ,
ugd, wcaK, gmd, wza, gatDAZ, ptsHI, malP, malT,
rhaA, malG, malF, malK, malM
transkriptionelle Regulatoren
Membranproteine/Teile von
Transportkomplexen
periplasmatische Proteine
Außenmembran/ -assoziiert
beeinflusst Koloniemorphologie/
beteiligt an Lipopolysaccharidsynthese
Histon-ähnlich/RNA Chaperon
zusätzlich σ32 abhängig transkripiert
Leseraster kodiert unmittelbar
stromabwärts und in gleicher
Leserichtung nach einem durch Mlc
repremierten Gen
oxidativer Stress/OxyR abhängig
von pH im Medium beeinflusst
araC, abgR, yabN, mlc, malT, stpA, soxS
ptsG, manXYZ, yobD(potentiell), yeeR, malG, malF,
malK, yabI, yabJ, yabK, yiaH(potentiell),manYZ
yceI, malE, malM
flu(AG43), wza, ydeT(potentiell), yfbE(arnB)
flu, ugd, wcaK, gmd, wza
stpA
ptsG, ptsHI, mlc
manXYZ => yobD
malT => yhgJ(=rtcA)
flu
malT, manX, yceI
Tab. 21: Gemeinsamkeiten und Charakteristika der möglicherweise durch Mlc regulierten Gene.
Interessanterweise ist StpA, zusammen mit dem Histon-ähnlichen Protein H-NS, auch an der
Regulation der mal-Gene beteiligt (72).
Bei YabN(=SgrR) handelt es sich vermutlich um einen Regulator, der als Sensor für das
erhöhte Vorkommen von Hexose-6-P in der Zelle dient und der daraufhin die Transkription
einer kleinen regulatorischen RNA (sgrS) aktiviert (163). Die Blockierung der Glykolyse
führte zu einer Anhäufung von möglicherweise für die Zelle toxischem Hexose-6-P und in der
Folge zum schnellen Abbau der ptsG (EIICBGlc) mRNA. Der Abbau der durch sgrS/Hfq
markierten ptsG mRNA erfolgt durch die RNaseE (73, 76, 96). Schon deshalb war yabN ein
interessanter Kandidat für die Mlc-Regulation. Für yabN erhielt man bei all jenen Microarrays
ein Signal, mittels denen der Vergleich Wildtyp mit mlc-Mutante oder ptsG-Mutante mit
ptsG/mlc-Doppelmutante durchgeführt wurde. Dabei war yabN in Anwesenheit von Mlc, also
4. Diskussion
128
im Wildtyp, 2-5-fach erhöht und in der mlc-Mutante erniedrigt. Untersuchungen mit
transkriptionellen lacZ-Fusionen zu yabN oder sgrS zeigen aber, dass deren Transkription
nicht von Mlc abhängt. Es muss sich also um einen indirekten Effekt handeln. In diesem Fall
war das Wildtyp yabN noch vorhanden und die yabN-lacZ Fusion in die att-site des
Bakterienchromosoms integriert. Möglicherweise ist die Methode bei einem gering
transkripiertem Gen wie yabN auch zu wenig sensitiv und ein möglicher Unterschied in der
Transkription ließe sich vielleicht durch RT-PCR zeigen. Bedingt durch die Promotorregion
der beiden entgegengesetzt angeordneten Gene, sgrS und yabN, kann yabN möglicherweise
nicht mehr transkripiert werden, wenn der Regulator die Transkription von sgrS aktiviert
(162). Dieses Ereignis könnte in der mlc-Mutante früher eintreten als im Wildtyp. Da die
Zellen für die RNA Präparation aber in der gleichen Wachstumsphase geerntet wurden, stellt
es sich als Unterschied in der Genexpression dar.
Ein Nebeneffekt der Akkumulation von Glukose-6-Phosphat ist die Induktion des cpsOperons (38, 52, 148). Das cps-Operon umfasst 19 Gene, welche für die Synthese von
„Colanic Acid“ (M-Antigen), einem extracellulären Polysaccharid benötigt werden (152).
Mehrere dieser Gene sind in der mlc-Mutante erhöht, wenn diese mit der mlc-Überexpression
verglichen wird. In der statistischen Auswertung der Microarrays sind immerhin noch drei
dieser Gene enthalten (wza, gmd, wcaK). Bislang wurden aber noch keine ergänzenden
Analysen durchgeführt, die die Microarraydaten bzgl. der cps-Gene bestätigen würden.
Auch der Vergleich des Proteoms einer mlc-Mutante verglichen mit einem Stamm, der Mlc
überproduzierte, lieferte bislang keine neuen Einsichten, ob es weitere Mlc regulierte Gene
gibt. Das mag auch auf die Umstände zurückzuführen sein, dass nur die löslichen Proteine
untersucht wurden, und dass mit der Mlc-Überproduktion die Ausnahmesituation untersucht
wurde. Der Vergleich eines Wildtyps mit einer mlc-Mutante wäre aufschlussreicher gewesen.
Die durchgeführten Experimente lassen zweierlei Erwartungen zu. Einmal besteht die
Möglichkeit, dass durch eine weitere Auswertung der erhaltenen Daten tatsächlich noch durch
Mlc-regulierte Gene gefunden werden. Zum anderen könnte es sein, dass es keine weiteren
Mlc regulierten Gene gibt. Dadurch, dass Mlc abhängig von dem Transport der PTS-Substrate
die Menge an PTS-Komponenten beeinflusst und diese vielfältige regulatorische Aufgaben in
der Zelle erfüllen, sind auch vielfältige indirekte Auswirkungen einer mlc-Mutation denkbar.
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6. Anhang
6. Anhang
Tabelle 22
- Tabellen: Microarrays
144
6. Anhang
Tabelle 22 – Fortsetzung
145
6. Anhang
Tabelle 23
146
6. Anhang
Tabelle 23 - Fortsetzung
147
6. Anhang
Tabelle 23 - Fortsetzung
148
149
6. Anhang
Tabelle 24
Gen
Funktion
relative mRNA Mengen aus dem Vergleich
von mlc-Überexpression gegen mlc
Array
1
mlc
ygjU
ygjV
ompF
artJ
fecA
tauC
yhaB
ydgR
deaD
yhbM
ddg
ycgF
dppC
ydfK
cspF
proP
ynaE
transkript. Regulator
unbekannt
pot. Membranprotein
Arginin Bindeprotein
Receptor Außenmembran
Taurine Transp. Permease
unbekannt
pot. Membranprotein
pot. RNA Helicase
Lipoprotein mlpI (precurser)
Acetyltransferase
unbekannt
Peptid-Aufnahme
unbekannt
cold shock prot. Homolog
Prolin Permease
unbekannt
47,1479
7,57636
4,221
3,50678
5,15096
3,02974
3,26022
2,85688
2,40664
MlcBindesequenz
2
31,521534
3,500922
(1)
3,999478
3,687329
7,295242
2,743161
2,661539
4,168237
2,811547
2,984718
6,687489
Tabelle 24: Normalisierte Ratio of Median – mlc gegen Mlc-Überproduktion – Teil 1.
Aufgeführt sind die nomalisierten Ratios of Median. Das Verhältnis von Signal zu Hintergrund war für alle
Werte >3. Der Vergleich wurde zweimal durchgeführt. Das Expressionsmuster der mlc-Mutante(KD413) mit
einem Plasmid (pSA1), das die Überexpression von mlc ermöglicht wurde mit dem der mlc-Mutante(KD413),
die mit dem Leervektor transformiert worden war, verglichen – 1+2: :mlc-Überexpression gegen mlc.. Die Werte
galten als signifikant, wenn sie bei Array1 >2,31 und bei Array2 >2,63 waren. Alle in dieser Tabelle gezeigten
Gene werden vermehrt expremiert, wenn Mlc in den Zellen vorhanden ist bzw. die Expression ist in der mlcMutante erniedrigt. D.h. die Expression dieser Gene wird direkt oder indirekt durch Mlc aktiviert. (1) für eine
bereits bestätigte Mlc-Bindesequenz – (2) für eine potentielle Mlc-Bindesequenz
6. Anhang
Tabelle 25
150
6. Anhang
Tabelle 25 - Fortsetzung
151
6. Anhang
Tabelle 25 - Fortsetzung
152
Erklärung über die Eigenständigkeit der erbrachten
wissenschaftlichen Leistung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter oder ohne
Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen
direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quelle
gekennzeichnet.
Bei der Auswahl und Auswertung folgender Experimente haben mir nachstehend aufgeführte
Personen, in der jeweils beschriebenen Weise, unentgeltlich geholfen.
1. V. Wendisch, T. Polen – Durchführung und Auswertung der DNA Microarrays
2. Ann-Katrin Becker – Kooperation bei den Bindetests zwischen YeeI und Mlc
-
Bereitstellen von gereinigtem YeeI
3. K. Mahr – Anleitung bei der Durchführung der Oberflächenresonanzspektroskopie
-
Bereitstellen von Kontrollproteinen
4. K. Gerber – Bereitstellen von gereinigtem MlcH52
5. D. Geiger – Klonierung von pmlc410
6. Die Quellen der von anderer Stelle erhaltenen Plasmide und Bakterienstämme sind in
den entsprechenden Listen angegeben.
Weitere Personen waren an der inhaltlichen Erstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt.
Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeldliche Hilfe von Vermittlungs- bzw.
Beratungsdiensten (Promotionsberater oder andere Personen) in Anspruch genommen.
Niemand hat von mir geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit
dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer
Prüfungsbehörde vorgelegt.