Dokument_39.

Biochemische und molekularbiologische Charakterisierung des neuartigen
Influenza-A-Virus Proteins PB1-F2
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur Erlangung des Doktorgrades
Vorgelegt von
David Mitzner
aus Lichtenfels
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität
Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 12. März 2009
Vorsitzender der Prüfungskommision: Prof. Dr. Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. Ulrich Schubert
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung........................................................................................................
1
1.1 Summary................................................................................................................... 2
2. Einleitung....................................................................................................................... 4
2.1 Die Familie der Orthomyxoviren.............................................................................
4
2.2 Epidemiologie und Tropismus des Influenza-A-Virus............................................ 5
2.3 Morphologie und Replikation des Influenza-A-Virus............................................. 7
2.4 Influenza und die virusinduzierte Apoptose............................................................
10
2.5 Die influenzainduzierte Signaltransduktion und die Rolle der PKC-Aktivierung..
14
2.6 PB1-F2, das 11. Influenzaprotein............................................................................
17
3. Zielsetzung..................................................................................................................... 23
4. Material und Methoden................................................................................................ 24
4.1 Material.................................................................................................................... 24
4.1.1 Verbrauchsmaterial..........................................................................................
24
4.1.2 Chemikalien und Reagenzien........................................................................... 24
4.1.3 Standard Puffer und Lösungen......................................................................... 25
4.1.4 Synthetische Peptide......................................................................................... 26
4.1.5 Antikörper......................................................................................................... 26
4.1.6 Plasmide und Oligonukleotide.......................................................................... 27
4.1.7 Bakterien und Bakterienkulturreagenzien......................................................... 27
4.1.8 Eukaryotische Zellen und Medien.................................................................... 28
4.1.9 Virus-Stocklösungen......................................................................................... 29
4.2 Methoden.................................................................................................................. 29
4.2.1 Standardmethoden............................................................................................. 29
4.2.2 Kultivierung eukaryotischer Zellen................................................................... 30
4.2.2.1 Inkubation und Passagieren von eukaryotischen Zellen................................ 30
4.2.2.2 Kultivierung von primären Zellen.................................................................. 30
4.2.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen.............................................................. 31
4.2.2.4 Virusherstellung in Zellkultur........................................................................ 31
4.2.2.5 Virusinfektionen von Zellen........................................................................... 31
4.2.2.6 Plaque-Assay und Virustiter-Bestimmung.................................................... 32
4.2.3 Apoptosemessungen......................................................................................... 32
4.2.3.1 Annexin-V-Färbung zur FACS-Analyse....................................................... 32
Inhaltsverzeichnis
4.2.3.2 Caspase-3-Aktivitätsmessung........................................................................ 33
4.2.3.3 JC1-Färbung.................................................................................................. 33
4.2.4 Phosphorylierungsexperimente........................................................................ 33
4.2.4.1 Herstellung von S10-Extrakten..................................................................... 33
4.2.4.2 In-vitro-Phosphorylierung............................................................................. 34
4.2.4.3 In-vivo-Phosphorylierung.............................................................................. 34
4.2.4.4 Immunopräzipitation der radioaktiven Proben.............................................. 35
4.2.5 Chemisches Crosslinking.................................................................................. 35
5. Ergebnisse
5.1 Kinetik der PB1-F2 Expression in IAV infizierten Zellen.................................. 37
5.2 Untersuchung der pro-apoptotischen Wirkung von exogenem und endogenem
PB1-F2 in Zellkultur............................................................................................... 38
5.2.1 Inkubation von Epithelzelllinien mit synthetischem PB1-F2 und Analyse
mittels Annexin-V-Färbung............................................................................. 38
5.2.2 Exogenes sVpr, aber nicht sPB1-F2, induziert Apoptose in T-Lymphozyten. 40
5.2.3 Die Expression von endogenem PB1-F2 in 293T-Zellen hat keinen Einfluss
auf die Caspase-3-Aktivität.............................................................................. 41
5.2.4 Exogenes sPB1-F2 hat keinen Einfluss auf die apoptotische Sensibilisierung
verschiedener Zelllinien................................................................................... 43
5.2.5 PB1-F2 verstärkt die virusinduzierte Apoptose in humanen Monozyten......... 44
5.3 Das IAV-Protein PB1-F2 wird von der Proteinkinase C phosphoryliert.......... 45
5.3.1 PB1-F2 enthält mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen mit PKC- und
CK2-Konsensussequenzen............................................................................... 46
5.3.2 sPB1-F2 wird von der Protein-Kinase-C (PKC) in-vitro-phosphoryliert......... 47
5.3.3 PB1-F2 wird in transfizierten 293T-Zellen phosphoryliert.............................. 49
5.3.4 PB1-F2 wird an den PKC-Phosphorylierungsstellen Serin-35 und
Threonin-27 in vitro phosphoryliert................................................................. 51
5.3.5 Mutationsanalysen zur Identifikation der relevanten Phosphorylierungsstellen von PB1-F2 in vivo............................................................................... 52
5.3.6 Die PB1-F2-Phosphorylierungsstelle Serin-35 ist in zahlreichen humanpathogenen Isolaten konserviert....................................................................... 54
5.3.7 Die Mutation der PB1-F2-Phosphorylierungsstellen resultiert in einer
reduzierten Caspase-3-Aktivierung in primären humanen Monozyten............ 54
Inhaltsverzeichnis
5.4 Biochemische Charakterisierung der Oligomerisierung des PB1-F2-Proteins. 56
5.4.1 Das PB1-F2-Protein zeigt eine deutliche Tendenz zur Ausbildung
von Oligomeren................................................................................................ 56
5.4.2 Das N-terminale PB-(1-40)- und C-terminale PB-(50-87)-Fragment von
PB1-F2 besitzt die inhärente Fähigkeit zu oligomerisieren.............................. 57
5.4.3 Das Cystein in Position 42 ist durch die Ausbildung von Disulfidbrücken
an der Oligomerisierung von PB1-F2 beteiligt................................................. 60
6. Diskussion
6.1 PB1-F2, ein viraler Pathogenitätsfaktor und die Frage nach den molekularen
Mechanismen............................................................................................................ 62
6.2 Die Expression von PB1-F2 ist zeitlich reguliert..................................................... 64
6.3 Exogenes sPB1-F2 zeigt keine zytotoxischen Effekte in Zellkultur........................ 65
6.4 PB1-F2 ist ein Phosphoprotein und wird von der Proteinkinase C phosphoryliert. 67
6.5 PB1-F2 besitzt die intrinsische Eigenschaft, Oligomere auszubilden.....................
70
7. Abkürzungsverzeichnis................................................................................................ 73
8. Literaturverzeichnis...................................................................................................... 76
Zusammenfassung/Summary
1. Zusammenfassung
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen und biochemischen Charakterisierung des
im Jahre 2001 entdeckten 11. Influenza-A-Virus-(IAV)-Proteins PB1-F2. Vor kurzem wurde
im Mausmodell gezeigt, dass PB1-F2 die Virulenz hochpathogener IAV-Isolate verstärkt.
Weiterhin besitzt PB1-F2 funktionelle Ähnlichkeit zum pro-apoptotischen Vpr-Protein von
HIV-1, weshalb zunächst untersucht wurde, ob extrazelluläres PB1-F2, ähnlich dem
transduzierenden Vpr-Protein in der Lage ist, apoptotische Prozesse einzuleiten. Grundlage
für diese Arbeitshypothese war die bekannte Tatsache, dass PB1-F2 in den Mitochondrien
lokalisiert und pro-apoptotische Funktionen in einem noch nicht verstandenen Mechanismus
vermittelt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass weder extrazelluläres synthetisches (s)PB1-F2
noch intrazelluläres, durch Plasmid exprimiertes PB1-F2 ausreichend ist, um in verschiedenen
Zelllinien Apoptose zu induzieren. Des Weiteren konnte hier gezeigt werden, dass nach der
Infektion von primären humanen Monozyten ein apoptoseverstärkender Effekt in Gegenwart
von PB1-F2 gemessen werden kann. Wurden dieselben Zellen mit einem PB1-F2-defizienten
Virus infiziert, war die Apoptoseinduktion deutlich reduziert. Diese Befunde legen nahe, dass
PB1-F2 nur im Kontext einer Virusinfektion pro-apoptotisch wirkt und dieser Effekt
zellspezifisch ist, was in späteren Publikationen anderer Labore bestätigt wurde.
Ein weiterer Schwerpunkt war die Untersuchung einer möglichen posttranslationalen
Modifikation von PB1-F2. Es konnte hier erstmals gezeigt werden, dass PB1-F2 ein
Phosphoprotein ist und direkt mit der Proteinkinase C (PKC) interagiert. Das virale Protein
wurde von einem Extrakt aus verschiedenen konventionellen PKC-Isoformen sowie den
Zellextrakten verschiedener Zelllinien effizient in vitro phosphoryliert. Die radioaktive
32
P-
Markierung von transfizierten 293-T-Zellen und infizierten MDCK-Zellen ergab, dass PB1F2 in vivo phopshoryliert wird. Die in vitro und in vivo Phosphorylierung konnte in
Gegenwart PKC-spezifischer Inhibitioren dosisabhängig inhibiert und durch den Aktivator
PMA verstärkt werden. Es wurde mehrfach berichtet, dass die PKC nach einer IAV-Infektion
aktiviert vorliegt, jedoch ist nur wenig über die Funktion dieser Aktivierung im Kontext der
Virusreplikation bekannt. Als PB1-F2-relevante Phosphorylierungsstellen wurden in dieser
Arbeit die Aminosäuren Threonin in Poistion 27 und Serin in Position 35 ermittelt, wobei die
letztere in verschiedenen Isolaten konserviert ist, was eine Grundvoraussetzung für eine
mögliche funktionelle Bedeutung der PB1-F2-Phosphorylierung wäre. Ein rekombinantes
Virus, das für die Phosphorylierungsstellen in PB1-F2 mutiert wurde, zeigte nach der
Infektion von primären Monozyten einen vergleichbaren Phänotyp wie eine Mutante, die
durch gezielte Austauschmutationen nicht mehr in der Lage ist, PB1-F2 zu exprimieren.
1
Zusammenfassung/Summary
Beide Virusmutanten waren im Vergleich zum Wildtyp-Virus in ihrer Fähigkeit
eingeschränkt, effektiv Apoptose zu induzierten. Ob die Phosphorylierung von PB1-F2 auch
für die kürzlich beschriebenen immunmodulatorischen Effekte des Proteins im Tiermodell
von Bedeutung ist und in welchem Zusammenhang sie zur IAV-aktivierten, zellulären
Signaltransduktion steht, bleibt noch Gegenstand zukünftiger Untersuchungen.
PB1-F2 besitzt die inhärente Fähigkeit zu oligomerisieren. Dieses Phänomen wurde durch die
Behandlung von sPB1-F2 mit chemischen Crosslinkern und anschließenden WesternblotAnalysen untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl ein N-terminales als auch C-terminales
Fragment von PB1-F2 Oligomere ausbildet, was mit dem in silico Befund übereinstimmt,
dass das Protein je eine Oligomerisierungsdomäne im N- und C-terminalen Bereich besitzt,
wobei die C-terminale Domäne ein deutlich größeres Potential zur Multimerisierung aufweist.
Unter chemisch reduzierenden Bedingungen konnte gezeigt werden, dass das Cystein in
Position 42 maßgeblich an der Ausbildung der dimeren Spezies von PB1-F2 durch
Disulfidbindung beteiligt ist, wohingegen die PB1-F2-Multimerisierung ausschließlich auf die
Integrität der Oligomerisierungsdomänen zurückgeführt werden kann. Über die funktionelle
Relevanz der Oligomerisierung von PB1-F2 wurde bisher viel spekuliert. Die prominenteste
Hypothese
ist,
dass
PB1-F2
Membranporen
ausbildet
und
möglicherweise
zur
Destabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials beiträgt und damit funktionell der
Gruppe der Viroporine zugeordnet werden kann.
1.1 Summary
This study is focused on the functional and biochemical characterization of the novel 11th
influenza A virus (IAV) protein PB1-F2. Recently, it was shown that PB1-F2 contributes to
the increased virulence of highly pathogenic IAV strains and enhances the effects of
secondary bacterial coinfection in mice. This results in severe pneumonia which is the major
cause of influenza related mortality. PB1-F2 shares functional similarities to the pro-apoptotic
Vpr protein of HIV-1. Initial experiments in this work are based on the hypothesis that
extracellular synthetic (s)PB1-F2 might be able to induce apoptosis in cell culture, similar to
the membrane transducing Vpr protein. PB1-F2 is predominantely located in the mitochondria
of transfected or infected cells and mediates pro-apoptotic functions by a so far unknown
mechanism. No cytotoxic effects were detected after incubation of different cell lines with
extracellular PB1-F2. Also the plasmid mediated expression of PB1-F2 after transfection of
293T cells showed no influence on apoptosis induction. Additional experiments revealed that
PB1-F2 is an enhancer of virus induced apoptosis after infection of primary human
2
Zusammenfassung/Summary
monocytes, measured by caspase 3 acitivity. Therefore it was concluded that the pro-apoptotic
effects of PB1-F2 are predominantly mediated after virus infection and in a cell-type-specific
manner.
Further studies shown in this work describe the discovery of PB1-F2 phopshorylation, which
is a totally new finding in the field. PB1-F2 is phopshorylated in vitro by an extract
containing the conventional isoforms of the protein kinase C (PKC) and by cellular S10
extract of different cell lines. 32P radiolabelling of transfected 293T cells and infected MDCK
cells revealed that PB1-F2 is phosphorylated after expression in cell culture. The in vitro and
in vivo phosphorylation of PB1-F2 is sensitive to inhibitors of PKC and could be increased by
the PKC activator PMA. Several studies have shown that activation of the PKC occurs
subsequent to influenza virus infection. However, the function of the PKC activation in the
context of virus replication is unknown. The threonine in position 27 and the serine in
position 35 have been identified as the relevant PKC phopshorylation sites of PB1-F2 with the
latter being conserved in different influenza isolates which is a prerequisite for a general
function of the phosphorylation phenomenon. A recombinant virus which is mutated for the
PB1-F2 phopshorylation sites was impaired in its ability to induce apoptosis, similar to a
mutant virus which is knocked out for PB1-F2 expression. If PB1-F2 phopshorylation is also
important for the recently described immunomodulatory effects and pathogenicity remains to
be investigated. PB1-F2 displays the inherent ability to undergo oligomerization. This
phenomenon was characterized by the use of sPB1-F2 with chemical crosslinkers and western
blot analysis. In silico analysis revealed that the protein displays two oligomerization domains
in the C-terminus and a much weaker domain in the N-terminus, which is consistent with the
finding that both, a N-terminal and a C-terminal fragment of PB1-F2 are able to form
multimers, while the C-terminal fragment has a much higher propensity for oligomerization.
Under chemically reducing conditions it was shown that the cystein in position 42 mediates
the dimerization of PB1-F2 by disulfid-bridges whereas the protein multimerization depends
mainly on the integrity of the oligomerization sites.
There has been much speculation about the functional relevance of the oligomerization
phenomenon. The most prominent hypothesis suggests that PB1-F2 oligomerization results in
the formation of membrane-pores and therefore contributes to the destabilization of the
mitochondrial membrane potential, suggesting that PB1-F2 mediates a viroporin-like
function.
3
Einleitung
2. Einleitung
2.1 Die Familie der Orthomyxoviren
Die Familie der Orthomyxoviren zeichnet sich durch ein einzelsträngiges RNA-Genom mit
negativer Polarität aus, das linear segmentiert vorliegt, wodurch sie sich von anderen RNAViren deutlich abgrenzen und ein hohes Maß an genetischer Flexibilität besitzen. Die
Bezeichnung leitet sich vom griechischen „myxa“ (Schleim) ab, da die Vertreter dieser
Familie eine hohe Affinität zu Schleimhäuten besitzen. Orthomyxoviren werden in vier
Gattungen unterteilt (Leahy, Dessens et al. 1997; Pringle 1998). Zu ihnen gehören, wie in
Tabelle 1 dargestellt, die Influenza-Viren A, B und C, das Thogotovirus, zusammen mit dem
Dhorivirus und das Isavirus (Infectious Salmon Anemia Virus), das jedoch keine eigene
Gattung bildet (Klenk 1995; Falk, Namork et al. 1997; Regenmortel 2000). Die Aufteilung
der Influenza-Viren in die Genera A, B und C erfolgt aufgrund der serologischen
Unterschiede in ihrem Nukleoprotein (NP) bzw. Matrixprotein (M). Die Anzahl der RNASegmente variiert zwischen den verschiedenen Gattungen: acht Segmente bei Influenza A und
B und dem Isavirus, sieben Segmente bei Influenza C und dem Dhorivirus und sechs für das
Thogotovirus. Eine weitere Unterteilung erfolgt durch die Hüllproteine der Viren. Nur
Influenza-A und -B-Viren besitzen die Oberflächenproteine Hämagglutinin (HA) und
Neuraminidase (NA). Bei Influenza-C ist die NA durch ein glykosyliertes HämagglutininEsterase-Fusionsprotein (HEF) ersetzt (Herrler and Klenk 1991). Das Thogoto- und
Dhorivirus haben nur ein einziges Glykoprotein auf der Oberfläche, welches bei anderen
Influenza-Viren nicht zu finden ist (Morse, Marriott et al. 1992). Die Influenza-A-Viren
werden je nach Antigenität ihrer HA- und NA-Proteine in mehrere Subtypen klassifiziert. Im
Augenblick sind 16 HA (H1, H2, usw.) und 9 NA (N1, N2, usw.) antigene Subtypen
beschrieben (Fouchier, Munster et al. 2005), für die Influenza-B und -C-Viren sind bisher
keine Subtypen bekannt. Durch die WHO (World Health Organisation) wurde eine
einheitliche Nomenklatur für Influenza-A-Viren eingeführt. Sie bezeichnet den Typ, den Ort
der Isolierung, die Nummer des Isolates und das Jahr, in dem das Virus isoliert wurde, z.B.
der Influenza-A-Virus (IAV) Stamm A/Puerto Rico/8/34 (H1N1).
Der Krankheitsverlauf des Influenza-C-Virus ist beim Menschen von geringer Bedeutung,
und auch das Influenza-B-Virus verursacht eher selten ernsthafte Erkrankungen (Chen and
Holmes 2008). Einzig die Gattung der Influenza-A-Viren stellt eine alljährliche und globale
Bedrohung dar, die neben extremen ökonomischen und gesundheitspolitischen Problemen
auch die aktuelle Diskussion einer möglichen bevorstehenden Pandemie durch das
Vogelgrippevirus entfacht hat (Korteweg and Gu 2008; Lee and Saif 2008).
4
Einleitung
Gattung
Wirte
Influenza-A-Virus
Mensch,Vogel,
Segmentzahl
Oberflächenproteine
HA, NA
Schwein, Pferd,
8
Robbe
Influenza-B-Virus
Mensch, Robbe
Influenza-C-Virus
Mensch, Schwein,
8
7
Hund
HA, NA
HEF
Isavirus
Lachs
8
HA, Esterase
Thogotovirus
Zecke, Rinder,
6
1 Glykoprotein
Schafe, Nagetiere
Tab. 1 Die Familie der Orthomyxoviren mit ihren natürlichen Wirten und taxonomischen
Unterscheidungsmerkmalen.
2.2 Epidemiologie und Tropismus des Influenza-A-Virus
Die Evolution humaner Influenza-A-Viren erfolgt durch zwei primäre Mechanismen
(Webster, Bean et al. 1992; Wright 2001). Beim sogenannten „antigenic drift“ bilden sich in
einem langsam fortschreitenden Prozeß von Punktmutationen subtile Varianten von aktuell
zirkulierenden Viren. Diese Mutanten sind für die Influenza-A-Virus Epidemien
verantwortlich, wie sie in den meisten Ländern jährlich vorkommen. Im Gegensatz dazu steht
der „antigenic shift“, der sich auf den Austausch ganzer RNA-Segmente zwischen
verschiedenen Influenza-A-Viren innerhalb eines Wirtes zurückführen lässt.
Der primäre Wirt der Influenza-A-Viren sind Wasservögel, die ein riesiges, permanent
präsentes und globales Reservoir an Influenzaviren darstellen (Webster, Bean et al. 1992;
Webby and Webster 2001). Alle 16-HA und 9-NA Subtypen konnten bisher aus ihnen isoliert
werden, wohingegen beim Menschen nur H1, H2, H3 und N1 sowie N2 nachgewiesen
wurden (Webster, Bean et al. 1992). Dabei besteht die eher seltene Möglichkeit, dass es
entweder zu einer direkten Übertragung einer aviären Variante auf den Menschen kommt,
oder dass im sogenannten „genetic reassortment“ ein Austausch von Segmenten aktuell
zirkulierender humaner Viren mit einem Vogelgrippevirus zur Bildung eines neuen,
hochpathogenen und auf den Menschen übertragbaren Virus führt. Dieser Prozess wird als
„reassortment“ bezeichnet und findet in einem Zwischenwirt, wie z.B. dem Schwein statt, das
als „mixing vessel“ fungiert, in dem neue Viren mit heterogenen Oberflächenantigenen
gebildet werden.
Besonders hervorzuheben sind die vier großen Pandemien des vergangenen Jahrhunderts,
bekannt als die „Asiatische Grippe“ von 1957, die „Hongkong Grippe“ von 1968 und die
5
Einleitung
„Russische Grippe“ von 1977, mit jeweils einer Million Opfer weltweit (Cox and Subbarao
2000) und die berüchtigte „Spanische Grippe“ von 1918, die nach heutigen Schätzungen etwa
25% der damaligen Weltbevölkerung infiziert und zwischen 20 und 40 Millionen Menschen
getötet hat (Taubenberger, Reid et al. 2000; Taubenberger, Reid et al. 2001). Es gilt
inzwischen als wahrscheinlich, dass sich die Spanische Grippe auf einen aviären Ursprung
zurückführen lässt (Taubenberger, Reid et al. 2005). Dabei wächst die Befürchtung, dass die
Bildung solcher hochpathogener Viren jederzeit wieder erfolgen kann, wobei die größten
Bedenken in der Mensch zu Mensch Übertragung eines reassortierten Vogelgrippevirus
liegen, da sich in keiner humanen Population Antikörper gegen H5, H7 oder H9 befinden
(Webby and Webster 2001) (Abb. 2.2).
Eine entscheidende biologische Barriere hierfür ist der unterschiedliche Tropismus zwischen
Vogelgrippeviren und humanen Viren. Zur Bindung an die Zelloberfläche nutzen InfluenzaViren Sialinsäure, welche über die Galactose mit Zuckerresten verknüpft ist. Aviäre
Influenza-Viren
binden
bevorzugt
an
Sialylsäureoligosaccharide
mit
einer
α2,3-
galactosidischen Bindung, wie sie vor allem auf Zellen des Darmtraktes von Vögeln zu finden
ist, wohingegen humane Influenza-Viren eine α2,6-Verknüpfung präferieren, eine Variante,
die für tracheale Epithelzellen typisch ist (Suzuki, Ito et al. 2000; Wright 2001).
Abb. 2.2 Weltkarte mit allen Ländern, in denen das H5N1 Virus nachgewiesen werden konnte.
(Nach dem U.S. Department of Health and Human Services, www.hhs.gov).
6
Einleitung
Jedoch befinden sich im menschlichen Respirationstrakt Bereiche von zilienbildenden Zellen,
welche α2,3-verknüpfte Sialinsäurerezeptoren exponieren und ausreichend sind, um eine
Vogelgrippevirus-Infektion zu ermöglichen (Matrosovich, Matrosovich et al. 2004). Die
Tatsache, dass es bisher nur 385 belegte Fälle einer solchen Übertragung auf den Menschen
gibt, verdeutlicht, dass es sich hier um ein eher seltenes Ereignis handelt.
2.3 Morphologie und Replikation des Influenza-A-Virus
Das Influenza-Viruspartikel ist vielgestaltig (pleiomorph), da die Partikelgröße und -form
stark variieren kann. Hauptsächlich lassen sich sphärische Formen mit einem Durchmesser
von etwa 80-120 nm vorfinden (Abb. 2.3.1A), aber auch filamentöse Partikel mit einer Länge
von bis zu 300 nm sind bekannt. Die Virushülle besteht aus einer Lipidmembran, die von
Glykoproteinen durchsetzt ist. Bei diesen handelt es sich um vereinzelte OberflächenproteinCluster, die in einem HA/NA-Verhältnis von etwa 5:1 stehen. Die Innenseite der Hülle ist
durch das Matrixprotein (M1) ausgekleidet und von einigen Ionenkanälen, bestehend aus dem
Tetramer des M2-Proteins, durchsetzt.
Das Genom des Influenza-A-Virus besteht aus einzelsträngiger RNA mit negativer
Orientierung (-RNA). Die Genomgröße beträgt 13,5 Kilobasen (kB), welche sich auf acht
Segmente, die viralen Ribonukleoproteinkomplexe (vRNP`s) aufteilen. Diese Komplexe sind
zwischen 50 und 130 nm lang, besitzen eine helikale Symmetrie und bestehen aus
Nukleoproteinen
(NP’s)
mit
gebundener
RNA
und
einem
assoziierten
RNA-
Polymerasekomplex, der sich aus den „basischen“ viralen Polymerasen PB1 und PB2 sowie
der „sauren“ PA-Untereinheit zusammensetzt (Abb. 2.3.1B).
Jedes funktionsfähige Virusparitkel benötigt zur effizienten Infektion einen zellulären
Rezeptor. Dieser wurde für Influenza bereits vor 50 Jahren als Sialinsäure beschrieben
(Gottschalk 1959). Seitdem ist bekannt, dass das Virus über sein HA- Glykoprotein an die
Sialinsäurereste der Zelloberfläche bindet (Abb. 2.3.2), wie sie auf zellulären Glykoproteinen
oder Lipiden zu finden sind (Skehel and Wiley 2000). Als typische Wirtszelle der humanen
Influenza gilt die Lungenepithelzelle des Respirationstraktes mit einer α2,6-verknüpften
Sialinsäure auf der apikalen Plasmamembran (Baum and Paulson 1990). Die Aufnahme des
Viruspartikels erfolgt durch rezeptorvermittelte Endozytose (Patterson, Oxford et al. 1979;
Matlin, Reggio et al. 1981), wobei das HA-Protein auch als Fusionsprotein von Bedeutung ist
(Skehel and Wiley 2000). Nach der Ausbildung eines sogenannten späten endosomalen
Kompartimentes erfolgt die Freisetzung (uncoating) in das Zytoplasma (Bui, Whittaker et al.
7
Einleitung
1996). Diesem Prozess geht eine vorhergehende Ansäuerung des Viruspartikels voraus,
welche über den M2-Ionenkanal vermittelt wird (Pinto, Holsinger et al. 1992).
A
B
NP
Abb. 2.3.1 Aufbauf des Influenza-A-Virions und RNP-Komplexes.
(A) Das Influenza-A-Virus besitzt 11 Proteine, welche durch 8 einzelsträngige RNA-Segmente in
negativer Orientierung kodiert werden und ist von einer Lipiddoppelschicht umhüllt, in welche die
Hüllproteine eingelagert sind (Abb. nach Webster et al. 1992). Zu den Influenzaproteinen zählen die
Neuraminidase (NA), Hämagglutinin (HA), der virale Polymerase-Komplex mit dem basischen
Protein 1, 2 (PB1, PB2) und dem sauren Protein (PA), das RNA bindende Nukleoprotein (NP), Matrix
1 und 2 (M1, 2), die Nicht-Strukturproteine (NS 1, 2) und das akzessorische PB1-F2-Protein aus dem
offenen Leserahmen 2 des PB1-Gens.
(B) Modell der Ribonukleoproteinstruktur. Die einzelsträngige virale RNA (vRNA) umwickelt die
NP-Monomere und bildet eine Haarnadelstruktur aus. Die 5’- und 3’-Enden bilden eine kurze
doppelsträngige Region aus, welche an die heterotrimere RNA-Polymerase (PA, PB1, PB2) bindet
(Abb. nach Portela und Digard, 2002).
Dies ist auch der Angriffspunkt für Amantadin, eine antivirale Sustanz, welche den
Ionenkanal und somit die Nukleokapsidfreisetzung blockiert (Bukrinskaya, Vorkunova et al.
1982; Martin and Helenius 1991). Durch den niedrigen pH-Wert ändert sich die
Konformation der aminoterminalen Region des HA-Proteins, so dass die endosomale und
virale Membran miteinander fusionieren. Die zunehmende Ansäuerung des Partikels führt zu
einer erneuten Konformationsänderung des HA und löst die Interaktion zwischen den
Nukleoproteinen
und
RNP-Partikeln
mit
den
M1-Hüllstrukturproteinen,
was
die
Voraussetzung für die Freisetzung der viralen RNA in das Zytoplasma ist (Bui, Whittaker et
al. 1996). Die RNPs gelangen durch einen Mechanismus, der bisher nicht eindeutig geklärt
ist, in den Zellkern, den Ort der viralen Transkription (Herz, Stavnezer et al. 1981).
Voraussetzung hierfür ist die Passage des RNPs durch die Kernmembran. Für einen passiven
8
Einleitung
Diffusionsprozess sind die Komplexe zu groß (Paine 1975). Alle Proteine des RNP,
einschließlich der Polymeraseproteine besitzen eine NLS (nuclear localization sequence)
(Nath and Nayak 1990; Nieto, de la Luna et al. 1994). Die aktive Aufnahme in den Kern
erfolgt über das NP, welches hierfür an das Kernporenprotein Importin-α bindet, einer
wichtigen Komponente des Kernimport-Systems (Gorlich, Prehn et al. 1994).
Abb. 2.3.2 Der IAV-Replikationszyklus. Nach der rezeptorspezifischen Bindung des viralen HA an
die Zelloberfläche (1) erfolgt die endozytotische Aufnahme des Viruspartikels (2) und die Freisetzung
des Nukleokapsides in das Zytosol der Wirtszelle (3). Dieses wandert in den Kern, welcher der Ort der
viralen RNA-Replikation ist (4). Die Translation der viralen Oberflächenproteine erfolgt in das
endoplasmatische Retikulum (ER), und ein Teil der für die RNA-Replikation notwendigen
Virusproteine gelangt wieder in den Kern (5). Am Ende der Replikation steht die Generierung und der
Kernexport eines Ribonukleoproteinkomplexes (6), welcher zur Zelloberfläche gelangt und mit den
viralen Oberflächenproteinen unter Ausbildung eines neuen Viruspartikels abgeschnürt wird (Abb. der
ViroLogik GmbH Erlangen).
Die virale RNA hat im Zellkern zwei wesentliche Funktionen: Sie dient als Matrize zur
Synthese viraler mRNA und neuer genomischer RNA. Zu den früh translatierten
Virusproteinen zählen PB1, PB2, PA, NP, NS1 und NS2, die nach der Synthese wieder in den
9
Einleitung
Kern zurück gelangen. Im Kern erfolgt die Initiation der RNA-Synthese durch die virale
RNA-abhängige RNA-Polymerase, die sich aus den PB1-, PB2- und PA-Proteinen
zusammensetzt. Zur Replikation der viralen RNA (vRNA) wird zunächst copy-RNA (cRNA)
synthetisiert, die einen Anteil von nur etwa 5-10% der gesamten viralen RNA ausmacht (Hay,
Lomniczi et al. 1977; Herz, Stavnezer et al. 1981) und weder eine Cap-Struktur aufweist,
noch polyadenyliert ist. Ein weiterer bedeutender Faktor der Replikation ist das NP. Es wird
spekuliert, dass seine Bindung an vRNA den Übergang der viralen mRNA- zur cRNASynthese reguliert (Klumpp, Ruigrok et al. 1997). Nach der Synthese viraler RNA bilden sich
neue RNPs, die sich aus den drei Untereinheiten des viralen Polymerasekomplexes und der
einzelsträngigen v-RNA, die unspezifisch an NP gebunden ist, zusammensetzt (Huang, Palese
et al. 1990). Nach dem Kernexport der RNPs assembliert das Influenza-A-Virus in
Epithelzellen an der apikalen Plasmamembran (Bachi, Gerhard et al. 1969), wobei die viralen
Proteine HA, NA und M2 unabhängig voneinander vom endoplasmatischen Retikulum über
den Golgiapparat zur Zellmembran transportiert werden (Gottlieb, Gonzalez et al. 1986). Die
HA-
und
NA-
Glykoproteine
werden
zu
cholesterinreichen
Mikrodomänen
der
Zelloberfläche, den sogenannten „lipid rafts“, gesteuert (Barman and Nayak 2000), von denen
aus die Viruspartikel assembliert werden (Scheiffele, Rietveld et al. 1999; Takeda, Leser et al.
2003). Ob der Transport der RNP-Komplexe und des viralen M1 zur Zellmembran
ungerichtet (Patterson, Gross et al. 1988) oder, wie neuere Daten andeuten, gerichtet ist (Ali,
Avalos et al. 2000), bleibt kontrovers. Das virale M1-Protein dient als Adaptermolekül
zwischen der Zellmembran und dem RNP als auch zwischen dem RNP und dem
zytosolischen Teil der viralen Glykoproteine HA, NA, M2 (Barman, Ali et al. 2001), und das
so assoziierte neue Viruspartikel wird durch Abknospung von der Membran freigesetzt
(Webster, Bean et al. 1992).
2.4 Influenza und die virusinduzierte Apoptose
Die Untersuchung der Apoptoseinduktion durch das Influenza-Virus ist von zunehmender
Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen der viralen Pathogenität (Benedict, Norris et
al. 2002; Yewdell and Garcia-Sastre 2002; Lowy 2003).
Unter Apoptose versteht man eine biochemisch und morphologisch definierte Form des
programmierten Zelltodes, welche von einer Zelle aktiv durchgeführt wird (Kerr, Wyllie et al.
1972) und für eine Vielzahl von Viruserkrankungen von Bedeutung ist (Razvi and Welsh
1995). Dabei können die komplexen und verzweigten apoptotischen Prozesse in eine
mitochondriale (intrinsische) und eine Todesrezeptor-abhängige (extrinsische) Signalkaskade
unterteilt werden (Abb. 2.4), welche beide in der Aktivierung der spezifischen Caspasen
10
Einleitung
(Cystein Aspartasen) konvergieren (Cohen 1997). Apoptose-induzierende Caspasen werden
hauptsächlich in Initiatorcaspasen, wie die Procaspasen-8 und -9, und in die Effektorcaspasen
wie zum Beispiel Caspase-3, -6 und -7, unterteilt. Die Procaspasen dienen als Vermittler
zwischen apoptotischen, zellulären Signalen und der proteolytischen Aktivierung der
Effektorcaspasen. Sind letztere erst einmal aktiviert, erfolgt der gezielte und irreversible
proteolytische Abbau von zellulären Proteinen und Strukturen sowie die Fragmentierung der
Kern-DNA (Kroemer, Dallaporta et al. 1998; Thornberry and Lazebnik 1998).
Es gibt eine Vielzahl biochemischer und morphologischer Apoptosemarker, welche in der
Vergangenheit zur Detektion des IAV-induzierten Zelltodes verwendet wurden. Zu den
wichtigsten biochemischen Markern zählen die Detektion von extrazellulär exponiertem
Phosphatidylserin durch Annexin-V, die Messung des mitochondrialen Membranpotentials
und einsetzender Depolarisation, die Freisetzung von Cytochrom-c aus dem mitochondrialen
Membranzwischenraum und die spezifische Caspasen-Aktivierung, im Besonderen die der
Caspasen-8 und -3 (Lowy 2003). Die Zeiosis, eine spezielle und apoptosetypische
morphologische Erscheinung, die sich durch Zytoplasmaschrumpfung und Abschnürung
kleiner membranumhüllter Bläschen (membrane blebbing) äußert, ist im Kontext einer IAVInfektion nur schwer und in bestimmten Zellen nachweisbar (Wyllie, Kerr et al. 1980; Lowy
and Dimitrov 1997; Fujimoto, Takizawa et al. 1998). Apoptotische Prozesse werden durch
Influenza-A- und -B-Viren induziert und können sowohl in Zellkultur als auch in vivo
nachgewiesen werden (Fesq, Bacher et al. 1994; Hinshaw, Olsen et al. 1994; Mori, Komatsu
et al. 1995; Ito, Kobayashi et al. 2002). Neben den Lungenepithelzellen wurde die IAVinduzierte Apoptose in verschiedenen Tiermodellen auch in Milz, Thymus, Leber, Nieren und
sogar dem Gehirn festgestellt (Mori, Komatsu et al. 1995; Ito, Kobayashi et al. 2002; Lowy
2003). Auch in Zellen, welche die IAV-Replikation nicht produktiv unterstützen, z.B. TLymphozyten oder Monozyten, sind apoptotische Prozesse deutlich nachweisbar (Fesq,
Bacher et al. 1994). Besonders schwere IAV-Infektionen werden meist im Kontext einer
virusbedingten Lymphopenie beschrieben (Suarez and Schultz-Cherry 2000; Tumpey, Lu et
al. 2000; Zitzow, Rowe et al. 2002). Für die Depletion von T-, B- und dendritischen Zellen
werden in verschiedenen Studien vor allem extrinsische Faktoren wie Interferone oder die
Liganden der TNF- (tumor necrosis factor) Familie verantwortlich gemacht (Toth, Szegezdi
et al. 1999; Oh and Eichelberger 2000; Sedger, Hou et al. 2002). Die Depletion von
Immunzellen verläuft zudem häufig synergistisch mit einer bakteriellen Koinfektion, weshalb
schwere Krankheitsverläufe in einer durch bakterielle Superinfektion induzierten Pneumonie
resultieren (Sweet and Smith 1980; Colamussi, White et al. 1999; Engelich, White et al.
11
Einleitung
2002). Die IAV-induzierte Apoptose verläuft überwiegend nach extrinsischen Mechanismen
in einer autokrinen oder parakrinen Stimulation, wobei die Interferone-α/β und -γ sowie der
TNF und TGF-β (transforming growth factor) als relevante pro-apoptotische Faktoren
identifiziert wurden (Lowy 2003).
Extrinsic pathway
Intrinsic pathway
2.4 Schematische Darstellung der extrinsischen und intrinsischen apoptotischen Signalkasksade.
Der extrinsische Pfad wird durch eine spezifische Ligand-Rezeptor-Bindung (TNF-Rezeptor,
Fas/CD95) induziert, was zur Ausbildung eines DISC-Komplexes (death inducing signalling
complex) führt. Durch die membranständige DISC-Formation werden mehrere Caspase 8 Moleküle
rekrutiert, aktiviert und in das Zytosol freigesetzt. Die Caspase 8 ist je nach Zelltyp (Typ I+II) in der
Lage, entweder direkt die zentrale Effektorcaspase-3 zu aktivieren oder durch die proteolytische
Spaltung des pro-apoptotischen Bid-Proteins die mitochondriale Apoptose zu induzieren. Der
intrinsische Pfad kann durch zelluläre Stresssignale oder nach einer Infektion durch pathogene
Faktoren gezielt aktiviert werden, wie es beispielsweise für die akzessorischen Virusproteine Vpr
(HIV), p13 (HTLV) oder PB1-F2 (IAV) bekannt ist. Im weiteren Verlauf erfolgt die Freisetzung von
Cytochrom-c, dem AIF (apoptosis inducing factor) und SMAC (second mitochondria-derived
activator of caspase) aus dem mitochondrialen Membranzwischenraum. Cytochrom-c bildet mit
Apaf-1 (apoptotic protease activating factor) einen Komplex, der zunächst die Procaspase 9 und
daraus folgend die Effektorcaspase-3 aktiviert. (Abbildung aus V.Jesenberger und S.Jensch, nature
reviews, 2002).
12
Einleitung
Weiterhin gibt es Befunde, die schwere, virusbedingte Gewebsschäden in der Lunge mit der
Generierung von ROS-Radikalen (reactive oxigen species) in Verbindung bringen (Oda,
Akaike et al. 1989).
Gegenstand neuerer Untersuchungen ist die Rolle der Transaktivatoren NF-κB (nuclear
factor kappa B) und AP-1 (activator protein 1), die zumindest indirekt durch die Modulation
der Zytokin- und Interferonantwort sowie Aktivierung von Stress-Kinasekaskaden die
apoptotischen Prozesse nach einer IAV-Infektion gleichsam regulieren (Pahl and Baeuerle
1995; Abraham, Stojdl et al. 1999; Balachandran, Roberts et al. 2000; Lin, Zimmer et al.
2001; Ludwig, Ehrhardt et al. 2001).
Von zentraler Bedeutung ist das Fas-Rezeptor-System (Takizawa 93, Fujimoto 98), welches
auch mit der Aktivierung der RNA-abhängigen Proteinkinase R (PKR) nach einer IAVInfektion in Zusammenhang gebracht wurde (Takizawa, Ohashi et al. 1996), wodurch der
Zelltod letztlich über den FADD/Caspase8-Pfad (Fas-associated death domain protein)
vermittelt wird (Balachandran, Roberts et al. 2000). Das Fas-FasL-System scheint weiterhin
an der virusinduzierten humanen Lymphopenie beteiligt zu sein, da die CD95 Expression in
CD 8+, 4+ und 3+ T-Zellen sowie in mononuklearen Leukozyten nach einer Infektion deutlich
gesteigert ist (Nichols, Niles et al. 2001). Von den Virusproteinen wurden das NS1-Protein
und das M1-Protein im Kontext pro-apoptotischer und anti-apoptotischer Prozesse
beschrieben (Schultz-Cherry, Dybdahl-Sissoko et al. 2001; Zhirnov, Konakova et al. 2002;
Zhirnov, Ksenofontov et al. 2002). Weiterhin ist bekannt, dass auch die virale NA proapoptotisch wirkt, da sie die latente Form des exogenen Apoptoseinduktors TGF-β aktiviert
(Schultz-Cherry and Hinshaw 1996).
Die Regulierung apoptotischer Prozesse nach einer IAV-Infektion wird durch die zellulären
Caspasen vermittelt, wobei die zentrale Stellung der Effektorcaspase-3 bereits beschrieben
wurde (Zhirnov, Konakova et al. 1999; Lin, Holland et al. 2002; Wurzer, Planz et al. 2003).
Die Caspase-3 wird in einem Zeitraum von 12 h bis 36 h nach der IAV-Infektion aktiviert,
wobei ihre Funktion für die Virusreplikation noch umstritten ist (Fesq, Bacher et al. 1994;
Ludwig, Pleschka et al. 1999). Grundsätzlich wird die Apoptose als zellulärer
Abwehrmechanismus gegen eine Vielzahl von Pathogenen betrachtet. Es konnte jedoch
gezeigt werden, dass die Überexpression des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 in einer
reduzierten Virusproduktion und HA-Fehlglykosylierung resultiert (Hinshaw, Olsen et al.
1994; Olsen, Kehren et al. 1996). Die Virusvermehrung ist in der Gegenwart von Caspase-3Inhibitoren ebenfalls stark eingeschränkt, was auch in Zellen gezeigt werden konnte, die
shRNA gegen die Caspase-3 exprimierten (Wurzer, Planz et al. 2003). Dieser Effekt wird mit
13
Einleitung
einer Retention des viralen RNP-Komplexes im Nukleus in Verbindung gebracht, die letztlich
die Ausbildung von Viruspartikeln verhindert (Wurzer, Planz et al. 2003). Die Tatsache, dass
das überexprimierte, virale NS1-Protein pro-apoptotisch wirkt, wurde als zusätzlicher Beleg
dafür betrachtet, das die virusinduzierte Apoptose im Kontext einer produktiven Replikation
steht (Schultz-Cherry, Dybdahl-Sissoko et al. 2001). Im Gegensatz hierzu konnte gezeigt
werden, dass ein NS1-defizientes Virus in einer verstärkten Apoptoseinduktion resultiert und
NS1 demnach anti-apoptotische Funktion besitzt (Zhirnov, Konakova et al. 2002), wofür auch
die IFN-α/β-antagonistische Funktion des Proteins sprechen würde (Balachandran, Roberts et
al. 2000). Weiterhin ist bekannt, dass das virale NP ein Substrat des Caspase-vermittelten
proteolytischen Abbaus ist, was als ein zusätzliches Argument der antiviralen Funktion
zellulärer Apoptose gilt (Zhirnov, Konakova et al. 1999).
Ob die virusinduzierte Apoptose letztlich replikationsfördernde Elemente besitzt oder ein
reiner zellulärer Abwehrmechanismus ist, bleibt Gegenstand weiterer Untersuchungen
(Ludwig, Pleschka et al. 2006).
2.5 Die influenzainduzierte Signaltransduktion und die Rolle der PKC-Aktivierung
Virale Infektionen resultieren in der unmittelbaren Aktivierung einer Vielzahl zellulärer
Signale und Faktoren (Ludwig, Pleschka et al. 2006). In Zellkultur konnte gezeigt werden,
dass nach einer IAV-Infektion alle bekannten Mitglieder der sogenannten MAPK-Familie
(Mitogen-activated protein kinase) durch Phosphorylierungskaskaden aktiviert werden
(Kujime, Hashimoto et al. 2000; Ludwig, Ehrhardt et al. 2001; Pleschka, Wolff et al. 2001).
Zu ihnen zählen als Kinase-Prototypen ERK (extracellular signal regulated kinase), JNK
(Jun-N-terminal kinase, BMK-1/ERK5 (Big MAP kinase) und die p38-MAPK (Pearson,
Robinson et al. 2001). Durch die MAPK-Kaskade werden zelluläre Prozesse der
Differenzierung und Proliferation wie auch die Aktivierung der Immunantwort reguliert
(Dong, Davis et al. 2002). Beispielsweise resultiert die p38-MAPK-Aktivierung in der
Expression von IL-8 (Interleukin-8) und des Chemokins RANTES (Regulated on Activation,
Normal T Expressesd and Secreted), welches für das gezielte Rekrutieren von TLymphozyten und Makrophagen sowie von Eosinophilen und Neutrophilen an den
Entzündungsherd von Bedeutung ist (Kujime, Hashimoto et al. 2000).
Die von doppelsträngiger RNA (dsRNA) abhängige Aktivierung der Kinase-JNK hat einen
deutlich antiviralen Effekt, da sie Prozesse in Gang setzt, welche die Expression des Zytokins
IFNβ (Interferon β) induziert (Ludwig, Ehrhardt et al. 2001; Samuel 2001). Im Gegensatz
hierzu scheint die Aktivierung der Raf/MEK/ERK-Kaskade für die Virus-Replikation von
14
Einleitung
Vorteil zu sein (Pleschka, Wolff et al. 2001). Die Inhibition der Kinase-MEK oder Expression
dominant-negativer ERK- oder Raf-Mutanten führten zur reduzierten Virusfreisetzung nach
der Infektion durch das Influenza-A und -B-Virus (Ludwig, Wolff et al. 2004). Mechanistisch
resultierte die ERK-Inhibition in der Retention der viralen RNP-Komplexe im Zellkern, was
sich unmittelbar auf die Replikation auswirkt. Da die Inhibition der Kinase MEK
virusspezifisch und effektiv gegen beide Virusgattungen wirkt, werden MEK-Inhibitoren als
antivirale Substanzen für eine eventuelle klinische Anwendung zur Zeit untersucht (Planz,
Pleschka et al. 2001; Ludwig, Pleschka et al. 2006).
Ein weiterer wichtiger Faktor, der nach einer IAV-Infektion durch die Akkumulation viraler
RNA und anschließender IKKβ-Stimulation aktiviert wird, ist der IκB/NFκB Kinasekomplex
(Julkunen, Melen et al. 2000; Hiscott, Kwon et al. 2001). Durch Phosphorylierung des NFκBInhibitors IκB (inhibitor of NFκB) erfolgt dessen proteasomaler Abbau und die Translokation
des NFκB-Dimers in den Zellkern (Ghosh, May et al. 1998; Karin and Delhase 2000). Die
Transkriptionsfaktoren, welche zur NF-κB-Familie zählen, regulieren über 150 verschiedene
Gene, welche hauptsächlich immunologische und inflammatorische Prozesse steuern, unter
anderem die Expression von Zytokinen, Chemokinen sowie von pro- und anti-apoptotischen
Proteinen (Pahl 1999). Gleich der Kinase JNK reguliert auch die NFκB-Aktivierung die
Expression der bedeutenden antiviralen Faktoren IFNβ und TNFα (Maniatis, Falvo et al.
1998; Chu, Ostertag et al. 1999; Taniguchi and Takaoka 2002).
Eine weitere Kinase, die häufig im Kontext viraler Infektionen beschrieben wurde und eine
Vielzahl
von
Effektor-Signalkaskaden
reguliert,
ist
die
Proteinkinase
C
(PKC)
(Constantinescu, Cernescu et al. 1991; Toker 1998; Warrilow, Gardner et al. 2006). Die PKCFamilie besteht aus 13 bekannten Isoformen (Tab. 2), welche in 3 Klassen unterteilt werden
können, basierend auf der Abhängigkeit von Ca2+ und Phorbolesteraktiverung (Abb. 2.5.1) (Li
and Gobe 2006).
PKC Subfamilie
Isoforme
cPKC
α, βI, βII, γ
nPKC
Δ, ε, η, θ, ζ
aPKC
ξ, ι/λ, ν, μ
Tab.2 Die Protein-Kinase-C-(PKC)-Subfamilien und ihre Isoformen.
Die PKC Familie wird in die konventionellen (cPKC), neuartigen (nPKC) und atypischen (aPKC)
unterteilt. Zum aktuellen Zeitpunkt sind 13 Isoforme bekannt.
15
Einleitung
Abb. 2.5.1 Schematischer Aufbau der PKC-Subfamilien. Die verschiedenen Subtypen lassen sich
in vier konservierte (C 1-4) und fünf isoenzym-spezifische, variable (V 1-5) Regionen unterteilen. Die
Mitglieder der konventionellen PKC Isoformen besitzen neben der C-terminalen katalytischen
Domäne auch eine Ca2+-, Phosphatidylserin (PS)- und Diacylglycerin (DAG)-Bindestelle, welche alle
zur vollständigen Aktivierung benötigt werden. Die neuartigen und atypischen PKC Isoformen sind
Ca2+-unabhängig.
Die Bedeutung der PKC hinsichtlich der Regulation des Viruseintritts in die Zellen konnte
durch die PKC-Inhibitoren Staurosporin und H7 für verschiedene umhüllte Viren gezeigt
werden (Vesicular stomatitis-virus, herpes simplex-I, vaccinia virus, poliomyelitis virus)
(Constantinescu, Cernescu et al. 1991). Nach einer IAV-Infektion oder HA-Inkubation von
Zellen konnte eine sofortige Aktivierung der konventionellen PKC Isoformen detektiert
werden (Arora and Gasse 1998; Kunzelmann, Beesley et al. 2000; Root, Wills et al. 2000).
Der PKC spezifische Inhibitor Bisindolylmaleimid (BIM), sowie eine Reihe hochselektiver
Inhibitoren (CalphostinC, Gö6976) waren in der Lage, den frühen IAV-Eintrittsprozess in die
Zelle dosisabhängig und reversibel zu inhibieren (Abb. 2.5.2) (Root, Wills et al. 2000).
Durch die Expression einer phosphorylierungs-defizienten Mutante und den Einsatz selektiver
PKC-Inhibitoren, konnte eine Funktion der PKCβII-Isoform im Kontext der Regulation der
späten Endosomen und blockierter RNP-Freisetzung identifiziert werden (Sieczkarski, Brown
et al. 2003). Die PKC-Aktivierung betrifft jedoch auch Ereignisse des späten
Replikationszyklusses durch die indirekte Regulation von Effektormolekülen in der
Signaltransduktion. Beispielsweise wird die Phosphorylierung der Raf-Kinase ebenfalls durch
verschiedene PKC-Isoforme reguliert (Kolch, Heidecker et al. 1993; Cai, Smola et al. 1997),
was letztlich in der Aktivierung der mitogenen Raf/MEK/ERK-Kaskade resultiert (siehe
oben). Die Aktivierung der PKCα durch HA-Akkumulation an den lipid rafts in späten
Stadien des Replikationszyklusses und die daraus resultierende Raf-Phosphorylierung konnte
sogar direkt bestätigt werden (Abb. 2.5.2), (Marjuki, Alam et al. 2006). Auch wenn die
genauen Mechanismen der PKC-Aktivierung durch das Influenza-A-Virus und deren
Interaktion mit der zellulären Signaltransduktion noch nicht geklärt sind, zeichnet sich
16
Einleitung
dennoch die zentrale Rolle der konventionellen-α/β-Isoformen ab, welche ubiquitär in allen
bisher untersuchten Zellen vorhanden sind (Li and Gobe 2006).
Abb. 2.5.2 Die Rolle der PKC-Aktivierung im Replikationszyklus von IAV. Nach der Infektion
bzw. HA-Inkubation von Zellen erfolgt die Aktivierung der konventionellen PKCßII-Kinase, die vom
Zytosol zur Zellmembran transloziert und über den N-Terminus der regulatorischen Domäne (R) im
Zytoplasma verankert ist. Die katalytische Domäne (C) wird durch diesen Vorgang durch eine
Konformationsänderung freigesetzt und aktiviert. Die spezifische und selektive Inhibition der PKC
oder die Expression einer funktionell depletierten PKC-Mutante (dnPKCβII) resultiert in der Retention
der viralen RNPs im späten Endosom. Im Gegensatz hierzu wird erst spät im Replikationszyklus die
Raf/MEK/ERK-Kaskade durch die Einlagerung von HA-Proteinen in lipid-rafts während der VirusAssemblierung aktiviert. Die gezielte Inhibition der PKCα resultierte in einem analogen
Aktivitätsverlust der ERK-Kinase und der RNP-Retention im Nukleus.
2.6 PB1-F2, das 11. Influenzaprotein
Im Jahr 2001 wurde ein elftes IAV-Genprodukt mit der Bezeichnung PB1-F2 beschrieben
(Chen, Calvo et al. 2001). Entdeckt wurde das Protein bei einem Screening nach MHC-I
Epitopen, die sich von viralen Polypeptiden ableiten lassen, die außerhalb des StandardLeserahmens der Influenza-Virusproteine exprimiert werden. PB1-F2 ist das einzige IAVProtein, welches in einem zweiten, alternativen +1-Leserahmen (F2, frame 2) kodiert wird,
der innerhalb des pb1-Gens der viralen RNA-Polymerase (PB1) liegt (Abb. 2.6.1). Dies wird
17
Einleitung
durch das sogenannte „ribosomale Scanning“ ermöglicht, einem Vorgang, bei dem die 40SUntereinheit des Ribosoms nach weiteren AUG Startcodons innerhalb eines Leserahmens
„scannt“, um die Translation zu initiieren (Jackson 2005). Voraussetzung hierfür ist eine
ideale Initiationssequenz, welche auch als „Kozaksequenz“ (Kozak 1991) bezeichnet wird
und am Startcodon von PB1-F2 vorhanden ist.
Abb. 2.6.1 DNA und Aminosäuresequenz von PB1-F2 im Leserahmen von PB1. Das PB1-F2
Startcodon (rot) befindet sich downstream vom bekannten ATG Initiations-Triplett (gelb,
unterstrichen) und zwei weiteren potentiellen ATG-Abfolgen (gelb) (Abbildung verändert nach Chen
et al. 2001).
Das vom IAV-Laborstamm A/PuertoRico/8/34(H1N1) (IAVPR8) exprimierte Protein, welches
in anfänglichen Studien untersucht wurde, hat ein Molekulargewicht von 11 kDa und eine
Länge von 87 A.s. (Chen, Calvo et al. 2001). Die neuesten Sequenzanalysen zeigen, dass
PB1-F2 in den meisten humanen und Vogelgrippe-Isolaten als funktionelles Protein mit einer
Länge von 78 bis 90 A.s. vorliegt. In Influenza-B-Virusisolaten ist PB1-F2 nicht präsent
(Chen, Calvo et al. 2001; Zell, Krumbholz et al. 2007). Interessanterweise exprimiert ein
Großteil der seit 1950 zirkulierenden humanen H1N1-Isolate ein C-terminal verkürztes PB1F2 mit einer Länge von nur 57 A.s. (Zell, Krumbholz et al. 2007). Strukturanalysen
vorangegangener Arbeiten haben gezeigt, dass PB1-F2 unter hydrophoben Bedingungen zwei
kleinere α-Helices im N-Terminus und eine große α-Helix von Position Ile-53 bis Lys-85 im
C-Terminus ausbildet (Abb. 2.6.2) (Bruns, Studtrucker et al. 2007). Der strukturierte CTerminus umfasst alle bis jetzt beschriebenen funktionellen Regionen des Proteins. Zu ihnen
zählen die Oligomerisierungsdomänen (OD), welche für die intrinsische Fähigkeit von PB1F2 verantwortlich sind, Dimere und Multimere auszubilden, und die mitochondriale
Zielseqeunz (MTS) (Gibbs, Malide et al. 2003; Bruns, Studtrucker et al. 2007). Es wird
spekuliert, dass die Oligomerisierung von PB1-F2 der Funktion dient, Poren in biologischen
Membranen auszubilden, was für eine mögliche Destabilisierung der mitochondrialen
18
Einleitung
Membran und anschließender Depolarisierung des Membranpotentials von Bedeutung sein
könnte (Chanturiya, Basanez et al. 2004; Zamarin, Garcia-Sastre et al. 2005). Weiterhin
Abb. 2.6.2 Sekundärstruktur des PB1-F2-Proteins vom IAV-Stamm A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
mit allen bisher bekannten funktionellen Domänen und C-terminaler α-Helix.
konnte gezeigt werden, dass virales PB1-F2 nach radioaktiver 35S Markierung von infizierten
MDBK-Zellen in drei kurz aufeinanderfolgenden Banden im SDS-Gel migriert, was auf einer
möglichen posttranslationalen Modifikation des Proteins beruhen könnte (Chen and Holmes
2008). Erste in-silico-Sequenzanalysen gaben Hinweise darauf, dass PB1-F2 mehrere
potentielle Phosphorylierungsstellen besitzt, was im Rahmen dieser Arbeit experimentell
bestätigt werden konnte (Henklein, Bruns et al. 2005).
Die exakte biologische Funktion von PB1-F2 und seine Bedeutung im Kontext der zellulären
IAV-Replikation sind bis heute ungeklärt. Ursprünglich wurde PB1-F2 als pro-apoptotisch
und als ein Verstärker der IAV-induzierten Apoptose in infizierten Monozyten beschrieben
(Chen, Calvo et al. 2001). Das Protein ist sowohl im Zytoplasma als auch in den
Mitochondrien von transfizierten und infizierten Zellen lokalisiert und ist bei Letzteren
partiell auch im Nukleus vorzufinden (Chen, Calvo et al. 2001). Die mitochondriale
Lokalisation von PB1-F2 und der Befund, dass die Präsenz von nanomolaren Mengen an
synthetischem sPB1-F2 im Zellkulturmedium zur Cytochrom-c Freisetzung in HeLa-Zellen
führt, gaben Hinweise darauf, dass PB1-F2 das erste IAV-Protein ist, das den intrinsischen
Apoptosepfad induziert (Chen, Calvo et al. 2001; Lowy 2003). Andererseits wurde berichtet,
dass Plasmid-exprimiertes PB1-F2 nicht ausreichend ist, um in Epithelzellen Apoptose
auszulösen. In der Gegenwart von apoptotischen Stimuli wie UV-Strahlung oder Cisplatin
konnte jedoch eine verstärkte Apoptoseinduktion in PB1-F2 transfizierten 293T-Zellen im
Vergleich zu nicht transfizierten Zellen beobachtet werden (Zamarin, Garcia-Sastre et al.
2005).
In
Koimmunopräzipitationsstudien
wurden
die
beiden
Untereinheiten
des
mitochondrialen PTPC (Permeabiltiy transition Pore complex) als zelluläre Bindungspartner
von PB1-F2 identifiziert (Zamarin, Garcia-Sastre et al. 2005). Ob PB1-F2 durch diese
Interaktion
pro-apoptotische
Prozesse
vermittelt
oder
durch
seine
multimerisieren und Membranporen zu bilden, ist bis heute nicht geklärt.
19
Fähigkeit
zu
Einleitung
Für die virale Replikation scheint PB1-F2 entbehrlich zu sein, was sowohl in Zellkultur als
auch nach der Infektion von Mäusen gezeigt werden konnte (Zamarin, Ortigoza et al. 2006).
Ein attenuiertes Virus eines mauspathogenen WSN-Isolates, das nicht mehr in der Lage ist,
PB1-F2 zu exprimieren, zeigte in den Lungen der Tiere während den ersten 3 Tagen nach der
Infektion vergleichbare Titer wie das Wildtyp-Virus. PB1-F2 scheint vielmehr als
akzessorisches IAV-Protein von Bedeutung zu sein, ähnlich dem Influenza-NS1-(non
structural 1)-Protein, von dem bekannt ist, dass es die virusinduzierte Apoptose reguliert
(Zhirnov, Konakova et al. 2002; Lowy 2003) und die antiviralen Mechanismen der Wirtszelle
durch die Inhibition der Typ-1-Interferonantwort reprimiert (Zhirnov, Konakova et al. 2002;
Lowy 2003). Des Weiteren hat PB1-F2 funktionelle Ähnlichkeiten mit anderen proapoptotischen Hilfsproteinen, wie z.B. dem p13-Protein von HTLV (D'Agostino, Ranzato et
al. 2002; Silic-Benussi, Cavallari et al. 2004) oder dem Vpr-Protein von HIV-1 (Muthumani,
Hwang et al. 2002; Sherman and Greene 2002), welche ebenso in den Mitochondrien und
dem Nukleus von infizierten Zellen lokalisiert sind. Neuere Daten lassen darauf schließen,
dass PB1-F2 als Pathogenitätsfaktor vor allem im Kontext hochpathogener Isolate von
Bedeutung sein könnte (Zamarin, Conenello, Auley). So wurden in den Lungen von Mäusen,
die mit einem PB1-F2-exprimierenden Virus vom WSN-Isolat infiziert waren, nach sechs
Tagen deutlich mehr Viruspartikel detektiert als in den Lungen der Tiere, die mit einem
rekombinanten, PB1-F2 defizienten Virus desselben Isolates infiziert wurden (Zamarin,
Ortigoza et al. 2006). Dieser Befund bekräftigte die Hypothese, dass PB1-F2
immunmodulatorische Funktion besitzt, da die Virusneutralisierung durch das Immunsystem
des Wirtes in einem noch nicht bekannten Mechanismus in Abhängigkeit von PB1-F2
verzögert wird. Interessanterweise war ein Aminosäureaustausch innerhalb der PB1-F2Sequenz von Asn-66 zu Ser-66 ausreichend, um ein Virus von moderater Pathogenität (H5N1,
HK/156/97) in ein hochpathogenes zu konvertieren (Conenello, Zamarin et al. 2007). Ebenso
zeigte ein rekombinantes IAV-Isolat der Spanischen Grippe, das für PB1-F2 in Position 66
mutiert war, eine deutlich geringere Lethalität in infizierten Mäusen als das Wildtyp-Virus.
Neuere Studien zeigten, dass PB1-F2 in der Lage ist, die Pathogenität der virusinduzierten
und sekundären bakteriellen Pneumonie zu verstärken (McAuley, Hornung et al. 2007). Um
die PB1-F2-spezifischen Effekte zu untersuchen, wurde ein mausadaptiertes PR8-Isolat mit
dem PB1-F2-Knock-out-Virus desselben Isolates verglichen. Die bakterielle Koinfektion mit
Streptococcus pneumoniae erfolgte sieben Tage nach der Virusinfektion. Dabei zeigte sich,
dass die Expression von PB1-F2 im Vergleich zum PB1-F2-defizienten Virus mit einer
erhöhten Zahl an Neutrophilen, Makrophagen und T-Zellen in der Lungenlavage der Tiere
20
Einleitung
und mit einer gesteigerten Entzündung des alveolaren Parenchyms korreliert. Vergleichbare
Effekte wurden erzielt, wenn die Tiere mit einem synthetischen Peptid behandelt wurden, das
den C-Terminus von IAVPR8 einschließlich der MTS umfasst. Die anschließende bakterielle
Infektion führte innerhalb von acht Tagen zum Tod aller Tiere, die mit dem C-terminalen
Peptid vorbehandelt wurden, wohingegen ein N-terminales Kontrollpeptid keine Mortalität in
den Tieren induzierte. Noch dramatischere Effekte zeigten sich nach der Infektion mit einem
rekombinanten PR8-Virus, dessen PB1-F2-Protein durch gezielte Mutationen an die Sequenz
des Proteins aus einem Isolat der Spanischen Grippe von 1918 angepasst wurde (McAuley,
Hornung et al. 2007). Im Gegensatz zum PR8- und WSN-Wildtyp-Virus zeigte sich eine
gesteigerte Virulenz, die durch größere Plaque-Morphologie und schnellere Virusreplikation
innerhalb der ersten Tage nach der Infektion in Zellkultur angezeigt wurde. Zusätzlich wurden
die inflammatorischen Effekte in Mäusen im Kontext einer bakteriellen Koinfektion in
Gegenwart des PB1-F2-Proteins der Spanischen Grippe im Vergleich zum Wildtyp-PR8Isolat dramatisch gesteigert. Diese Ergebnisse sind von großer Bedeutung, da die
Hauptursache für die hohen Sterblichkeitsraten, welche von einigen humanpathogenen
Influenzavarianten hervorgerufen werden, in einer sekundären, bakteriellen Superinfektion
begründet ist, die zu lebensgefährlichen Pneumonien führen kann (Beveridge 1991;
McCullers 2006).
Erst vor kurzem wurde das virale PB1-Protein als Interaktionspartner von PB1-F2
beschrieben (Mazur, Anhlan et al. 2008). In Koimmunopräzipitationsstudien konnte gezeigt
werden, dass PB1-F2 das PB1-Protein, aber nicht PB2, NP oder M1 präzipitiert, was
weitestgehend die Möglichkeit ausschließt, dass PB1-F2 ein Teil des RNP-Komplexes ist. Die
Interaktion könnte jedoch für eine zeitlich regulierte Retention des PB1-Proteins im Nukleus
verantwortlich sein, da in einem PB1-F2-defizienten Virus das PB1-Protein für 7 h nach der
Infektion im Zytoplasma lokalisiert ist, wohingegen es im Wildtyp-Virus zu diesem Zeitpunkt
noch überwiegend im Nukleus zu finden ist. Die Interaktion von PB1-F2 und PB1 könnte
auch für die unterschiedliche Plaque-Morphologie verantwortlich sein, die mehrfach in
Abhängigkeit von PB1-F2 detektiert wurde (McAuley, Hornung et al. 2007; Mazur, Anhlan et
al. 2008). Das zuvor erwähnte rekombinante PR8-Isolat, welches eine PB1-F2-Variante der
Spanischen Grippe exprimiert, bildete in Zellkultur größere Plaques aus als der Wildtpy
(McAuley, Hornung et al. 2007). Der gleiche Effekt wurde nach der Infektion von IAVPR8Virus im Vergleich zur PB1-F2-defizienten Mutante beobachtet. In Abwesenheit von PB1-F2
war die Plaque-Größe deutlich reduziert (Mazur, Anhlan et al. 2008). Die Mechanismen der
PB1-F2-vermittelten Phänomene sind bis heute nicht geklärt. Vor allem im Kontext
21
Einleitung
hochpathogener Isolate zeichnet sich die Bedeutung dieses scheinbar multifunktionellen
Proteins zusehends ab, weshalb PB1-F2 inzwischen zu Recht als kleines Protein mit großer
Wirkung bezeichnet wird (Conenello and Palese 2007).
22
Zielsetzung
3. Zielsetzung
Im Rahmen dieser Arbeit sollten zunächst die molekularen Mechanismen der proapoptotischen Funktion von PB1-F2 in Zellkultur untersucht werden. Vor allem sollte geklärt
werden, ob und wie extrazelluläres PB1-F2 zytotoxische Effekte vermittelt und somit ähnlich
dem Vpr-Protein von HIV-1 transduzierende Eigenschaften besitzt.
Für das neuartige PB1-F2-Protein waren bisher keinerlei posttranslationale Modifikationen
bekannt. Da Virusproteine häufig multifunktionell und modifiziert sind, sollte durch in-vitround in-vivo-Experimente untersucht werden, ob PB1-F2 ein Phosphoprotein darstellt und
wenn ja, welche Funktionen durch diese Modifizierung reguliert werden.
Abschließend wurde die inhärente Eigenschaft von PB1-F2 untersucht, Dimere und
Multimere auszubilden. Dabei sollte geklärt werden, ob die Oligomerisierung von PB1-F2
durch Disulfidbrücken oder spezifische Multimerisierungsdomänen vermittelt wird, und in
welcher Region des Proteins enstprechende Sequenzabschnitte lokalisiert sind.
23
Material und Methoden
4. Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Verbrauchsmaterial
1,5 ml Reaktionsgefäße
15 ml Reaktionsgefäße
50 ml Reaktiongefäße
Zellkultur-Platten
BioMax-Filme MR
Zellkultur-Cryo-Gefäße
Sarstedt, Nümbrecht
BD Falcon, Heidelberg
BD Falcon, Heidelberg
BD Falcon, Heidelberg
Kodak, Stuttgart
Nunc, Wiesbaden
Hybond-P Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran
Amersham Biosciences, Freiburg
Mikropipettenspitzen
Reaktionsgefäße für die PCR
Serologische Pipetten
Whatman-Papier
Zellkulturflaschen
Zellkulturschalen
Greiner, Frickenhausen
Biozym, Oldendorf
Corning, Schiphol-Rijk, Niederl.
Whatman, USA
Nunc, Wiesbaden
BD Falcon, Heidelberg
4.1.2 Chemikalien und Reagenzien
Produkt
2-Mercaptoethanol
Acrylamid (30%), Bisacrylamid (1%)
Adenosin-5’Triphosphat (ATP)
Agar (gereinigt)
Albumin (Protease frei)
Ammoniumperoxidsulfat (APS)
Ampicillin
Annexin-V
BioRad Protein Assay-Stammlösung
Bisindolylmaleimid
Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3)
Bovines Albumin 35%
Bromphenolblau
Coomassie-Brilliant Blue R-250
Calciumchlorid
Cisplatin
D-MEM (4500 mg/l Glucose, GlutaMAXI)
DEAE Dextran
DMSO (Dimethylsulfoxid)
Dithiotreitol (DTT)
Disuccinimidylsuberat (DSS)
EDTA (Na-Ethylendiamintetraacetat)
Essigsäure
Ethanol, technisch (96%)
Ethidiumbromid
Ethylenglykol Disuccinat
Etoposid
Fötales Kälberserum (FCS)
Hersteller
Roth (Karlsruhe)
Roth (Karlsruhe)
Sigma (St.Louis)
Oxoid (Wesel)
Roth (Karlsruhe)
Roth (Karlsruhe)
Sigma (St. Louis, USA)
Invitrogen (Hamburg)
BioRad (München)
Calbiochem (Schwalbach)
Pierce (Rockford, USA)
MP Biomedicals
Fluka (Buchs, Schweiz)
Fluka (Buchs, Schweiz)
Fluka (Buchs, Schweiz)
Sigma (St. Louis, USA)
Gibco/PAA (Paisley)
Amersham (Little Chalfont)
Sigma (St. Louis)
Roth (Karlsruhe)
Pierce (Rockford, USA)
Roth (Karlsruhe)
Roth (Karlsruhe)
Roth (Karlsruhe)
Roth (Karlsruhe)
Pierce (Rockford, USA)
Calbiochem (Schwalbach)
PAA (Pasching)
24
Material und Methoden
D(+)-Glucose
Glutaraldehyd (GA)
Glycerin
Glycin
Glycerol
HEPES
Isopropanol
JC1
Kaliumchlorid
Lipofectamin 2000
Magnesiumchlorid-Hexahydrat
MEM (+GlutaMAX I)
MEM 10x (-L-Glutamin, -NaHCO3)
Methanol
Milchpulver
Natriumacetat
Natiumazid
Natriumchlorid
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Natriumhydroxid
Natriumhydrogenphosphat
Natriumorthovanadat
Nonidet P40
OptiMEM I
Orthophosphat 32P
PBS 1x
Penicillin/Streptamycin
Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA)
PMSF
Propidiumiodid
Protein Ladder (Page Ruler)
Protein G-Sepharose
RPMI 1640
Staurosporin
Salzsäure
SDS (Sodium Dodecylsulfat)
Tris
Triton X-100
Trypanblau
Tween 20
Wasserstoffperoxid 30%
Roth (Karlsruhe)
Pierce (Rockford, USA)
Roth (Karlsruhe)
Roth (Karlsruhe)
Sigma (St. Louis)
Roth (Karlsruhe)
Roth (Karlsruhe)
Sigma (St. Louis, USA)
Roth (Karlsruhe)
Gibco (Paisley)
Roth (Karlsruhe)
Gibco (Paisley)
Gibco (Paisley)
Fluka (Buchs, Schweiz)
Saliter (Obergünzburg)
Roth (Karlsruhe)
Roth Karlsruhe)
Roth (Karlsruhe)
Roth (Karlsruhe)
Roth (Karlsruhe)
Roth (Karlsruhe)
Sigma (St. Louis, USA)
Sigma (St. Louis, USA)
Gibco (Paisley)
Amersham (Uppsala, Schweden)
Invitrogen (Karlsruhe)
Invitrogen (Karlsruhe)
Sigma (St. Louis, USA)
Sigma (St. Louis, USA)
Invitrogen (Hamburg)
Fermentas (Litauen)
Amersham (Uppsala, Schweden)
Gibco (Paisley)
Calbiochem (Darmstadt)
Roth (Karlsruhe)
Sigma (St. Louis, USA)
Roth (Karlsruhe)
Sigma (St. Louis, USA)
Gibco (Paisley)
Sigma (St. Louis)
Merck (Darmstadt)
4.1.3 Standard Puffer und Lösungen
je 2,5 mM (Fa. Eppendorf, Hamburg)
Desoxyribonukleotide
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
50 mg Luminol (Fa. Sigma, Deisenhofen) in 200 ml 0,1 M
ECL-Lösung A
Tris/HCl, pH 8,6
11 mg p-Hydroxycumarinsäure (Fa. Sigma, Deisenhofen) in
ECL-Lösung B
10 ml DMSO
25
Material und Methoden
0,1 % (v/v) Tween 20 in PBS
1M
Tris-HCl, pH 6.8
1,5 M
Tris-HCl, pH 8.8
Tris, pH 6.8
x) 25 mM
192 mM
Glycin
0,1% (w/v)
SDS
100 mM
Tris pH 6.8
SDS-Probenpuffer (1 x)
2 % (w/v)
SDS
5 % (v/v)
Glyzerol
10 % (v/v)
ß-Mercaptoethanol
0,02 % (w/v)
Bromphenolblau
10 mM
Tris-HCl, pH 8.0
TE-Puffer
1 mM
EDTA
40 mM
Tris-HCl
TAE-Puffer (1 x)
20 mM
Natriumacetat
Tris
25 mM
Glycin
192 mM
Transferpuffer (1 x)
10% (v/v)
Methanol
(nach Towbin)
Coomassie Brilliant Blau R 250
0.5% (w/v)
Coomassie-Färbelösung
Isopropanol
25% (v/v)
10% (v/v)
Essigsäure
25% (v/v)
Isopropanol
Coomassie10% (v/v)
Essigsäure
Entfärbelösung
PBS-Tween
Sammelgelpuffer
Trenngelpuffer
SDS-Laufpuffer (1
(nach Laemmli)
4.1.4 Synthetische Peptide
Synthetisches PB1-F2 (sPB1-F2) wurde unter Verwendung der solid phase peptide synthesis
(SPPS) und der anschließenden nativen chemischen Ligation (NCL) synthetisiert (Henklein et
al. 2005; Röder et al. 2008).
Bezeichnung
sPB1-F2 (PR8)
Isolat
A/Puerto Rico/8/34(H1N1)
Herkunft
Henklein, Charite Berlin
NH2-MGQEQDTPWI-LSTGHISTQK-RQDGQQTPKL-EHRNSTRLMG-HCQKTMNQVVMPKQIVYWKQ-WLSLRNPILV-FLKTRVLKRW-RLFSKHE-COOH
sPB1-F2 (SFII)
A/Brevig Mission/1/18 (H1N1)
Henklein, Charite Berlin
NH2-MGQEQDTPWI-LSTGHISTQK-REDGQQTPRL-EHHNSTRLMD-HCQKTMNQVVMPKQIVYWKQ-WLSLRSPTPV-SLKTRVLKRW-RLFSKHEWTS-COOH
sPB1-F2 (BFII)
Konsensussequenz (H5N1)
Henklein, Charite Berlin
NH2-MEQEQDTPWT-QSTEHINIQK-RGNGQRTQRL-EHPNSIRLMD-HCLRIMSRVGMHKQIVYWKQ-WLSLKNPTQG-SLKTRVLKRW-KLFSKQEWIN – COOH
sPB1-F2 (20mer) Fragmente
(Henklein et al. 2005)
A/Puerto Rico/8/34(H1N1)
4.1.5 Antikörper
AntiInfluenza A/PR8/34-PB1-F2, polyklonal
Henklein, Charite Berlin
Bezugsquelle
Seramun, (Henklein, Bruns et al. 2005)
26
Material und Methoden
Influenza-A PB1, monoklonal
Influenza-A NP, polyclonal
PARP, monoklonal
GFP, monoklonal
ß-Aktin, nonoklonal
anti-mouse, IgG-HRP
anti-rabbit, IgG-HRP
Santa Cruz (Heidelberg)
Serotec (Düsseldorf)
BD Bioscience (San Jose, USA)
Gene Tex
Sigma
Amersham (Little Chalfont)
Amersham (Little Chalfont)
4.1.6 Plasmide und Oligonukleotide
Plasmide
Plasmide
pBC12/CMV MCSI
pBC12/CMV PB1-F2
pBC12/CMV PP1-F2-His
pBC12/CMV PB1-F2-S35/N
pBC12/CMV PB1-F2-T27/N
pBC12/CMV PB1-F2-S84/N
pBC12/CMV PB1-F2-T27,S35/N
pHW2000 PB1
pcDNA3
Herkunft
Stratagene (Heidelberg)
Nicole Studtrucker
Nicole Studtrucker
David Mitzner
David Mitzner
David Mitzner
David Mitzner
Anhlan Darisuren (Münster)
Invitrogen (Karlsruhe)
Oligonukleotide
Die aufgeführten Oligonukleotide wurden von der Fa. Biomers (Ulm) bezogen und für die
Mutagenese-PCR der PB1-F2 Phosphorylierungsstellen verwendet.
Name
Sequenz
P27(5’)
P27(3’)
P35(5’)
P35(3’)
P84(5’)
P84(3’)
5’-AAGATGGACAACAAAACCCGAAACTGGAGCAC-3’
5’-GTGCTCCAGTTTCGGGTTTTGTTGTCCATCTT-3’
5’-CTGGAGCACCGCAACAACACCCGATTGATGGGC-3’
5’-GCCCATCAATCGGGTGTTGTTGCGGTGCTCCAG-3’
5’-GATGGAGGTTGTTCAACAAACACGAGGCGGG-3’
5’-CCCGCCTCGTGTTTGTTGAACAACCTCCATC-3’
4.1.7 Bakterien und Bakterienkulturreagenzien
Bakterien
Für Transformationen wurde der ultrakompetente Escherichia coli (E. coli) Stamm XL2-blue
(Stratagene, Heidelberg) verwendet. Die Lagerung erfolgte bei -80°C.
27
Material und Methoden
Bakterienkulturreagenzien
1 % (w/v)
LB-Medium
0,8 % (w/v)
0,5 % (w/v)
LB–Agarplatten
Pepton
NaCl
Bacto-Hefe-Extrakt
pH 7.2; autoklaviert
Bactoagar in LB-Medium
1,5 % (w/v)
Zur Selektion transformierter Bakterienklone wurde dem Kulturmedium, bzw. den LBAgarplatten Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugesetzt.
4.1.8 Eukaryotische Zellen und Medien
Eukaryotische Zelllinien und primäre Zellen
Humane Zervixkarzinomzelllinie (Scherer et al. 1953).
HeLa SS6:
HEK 293T:
Humane
embryonale
Nierenzelllinie
(HEK:
„human
embryonic kidney“). Diese Zellen wurden durch Einbringen
von gescherter Adenovirus-DNA in embryonale Zellen
hergestellt (Graham, Smiley et al. 1977). Die Zelllinie 293T
ist ein Subklon, der zusätzlich das SV40 (simian virus 40)
T-Antigen exprimiert.
Jurkat
T-Zell Leukämiezelllinie (Weiss, Wiskocil et al. 1984).
MDCK
Madin Darby Canine Kidney, Nierenkarzinom vom
Cockerspaniel, entnommen 1958.
MDBK
Madin Darby Bovine Kidney, Nierenkarzinom vom Rind,
entnommen 1957.
Primäre Monozyten
Aufgereinigte humane Spender-Monozyten (Reinheit 7095%,
CD14+)
wurden
von
der
Dermatologie
der
Universitätsklinik Erlangen bezogen (Erdmann, Dorrie et
al. 2007).
Dendritische Zellen
Dendritische Zellen wurden von der Dermatologie der
Universitätsklinik
Erlangen
bezogen
(Prof.
Dr.
Steinkasserer).
Zellkulturmedien
Die Zellkulturmedien DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium), MEM (Minimum
Essential Medium) bzw. RPMI (Roswell Park Memorial Institute), wurde von der Fa.
Gibco/BRL, Karlsruhe bezogen und mit 10 % (v/v) hitzeinaktiviertem FKS (Fa. Gibco/BRL,
28
Material und Methoden
Karlsruhe), 2 mM L-Glutamin, 170 mM Penicillin und 40 mM Streptomycin (Fa. Sigma,
Deisenhofen) supplementiert. Für die Monozytenkultivierung wurde DMEM mit 10 % (v/v)
humanem Serum, 1% Natriumpyruvat (SIGMA), 170 mM Penicillin und 40 mM
Streptomycin verwendet.
4.1.9 Virus-Stocklösungen
Stamm
Herkunft
Humanes IAV Virusisolat recA/Puerto-Rico/8/34(H1N1) (PR8)
Anhlan Darisuren (Münster)
Rekombinanten humanes Virusisolat A/Puerto-Rico/8/34 Anhlan Darisuren (Münster)
(H1N1) (PR8) F2C (PB1-F2 ATG95→ACG)
Rekombinanten humanes Virusisolat A/Puerto-Rico/8/34 Anhlan Darisuren (Münster)
(H1N1) (PR8) F2C (PB1-F2 ATG95→ACG, TCA128→TGA)
Wird auch als IAVPR8(2xΔF2) bezeichnet.
Rekombinanten humanes Virusisolat A/Puerto-Rico/8/34 Anhlan Darisuren (Münster)
(H1N1) (PR8) F2C (PB1-F2 Thr198→Ile, Ser222→Leu)
4.2 Methoden
4.2.1 Standardmethoden
- PCR Produkte wurden mit dem QIAquickTM PCR Purification Kit von Quiagen (Hilden)
aufgereinigt.
- Agarosegelelektrophorese wurde nach Sambrook (Sambrook, 1989) durchgeführt.
- Die präparative Plasmidisolierung wurde mit dem QIAprep Miniprep Kit oder dem Plasmid
Maxi Kit der Firma Qiagen (Hilden) durchgeführt.
- Seqeunzierungen von DNA wurden mit dem BigDye3.1TM Sequenzierer der Firma ABI
(Weiterstadt) in dem Gerät Master Cycler Gradient der Firma Eppendorf (Hamburg)
amplifiziert, aufgereinigt, und in dem Sequenzier-Automaten ABI PRISM 3100 der Firma
Applied Biosystems (USA) analysiert. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte durch das
Programm VectorNTI 7.0.
- Die Mutagenese PCR QuikChange® II wurde nach den Herstellerangaben (STRATAGENE,
La Jolla, USA) durchgeführt.
- Die Anzucht und Transformation von E.coli erfolgte nach den von Ausubel und Sambrook
beschriebenen Protokollen (SAMBROOK 1989).
- Die photometrische Bestimmung der DNA-Reinheit und -Konzentration wurde nach
Standardprotokollen vorgenommen (SAMBROOK 1989).
29
Material und Methoden
- Lipofektamintransfektion erfolgte mit dem Reagenz Lipofectamine2000 der Firma
Invitrogen (Karlsruhe) nach den Herstellerangaben.
- Proteinkonzentrationen wurden mit Hilfe des BCATM Protein Assay der Firma Pierce (USA)
in dem ELISA-Reader Soft Max Pro (Molecular Devices, USA) quantitativ bestimmt.
- Proteine wurden mittels SDS PAGE nach Lämmli (1970) und für Trizin-Gele nach Schägger
und Jagow (1987) aufgetrennt.
- Der Westernblot Proteintransfer erfolgte mittels Semi-dry-Blotter der Firma BioRad
(München) entsprechend den Angaben des Herstellers auf Nitrozellulosemembranen der
Firma Amersham Bioscience (UK). Immunoblot Analysen erfolgten nach Angaben der
Hersteller.
Nachweis von HRP horse-radish-Peroxidase-konjugierten Antikörpern im Immunoblot
erfolgte in der Entwicklermaschine M35 X-OMAT Prozessor der Firma Kodak mittels
HyperfilmTM-Filmen der Firma Amersham Bioscience (UK).
- Quantifizierung von Gelbanden erfolgte mit dem Programm AIDA Image-Analyzer Version
3.10.
- Durchflusszytometrische Analysen (FACS) wurden mit Hilfe des FACS Calibur der Firma
BD Bioscience (USA) bestimmt und mit dem Software Programm FACS Express V2
ausgewertet.
4.2.2 Kultivierung eukaryotischer Zellen
4.2.2.1 Inkubation und Passagieren von eukaryotischen Zelllinien
Sämtliche Zellkulturarbeiten fanden bei sterilen Bedingungen unter einer Sterilwerkbank statt.
Zellen wurden in Zellkultur-Schalen oder belüfteten Zellkultur-Flaschen in einem Inkubator
bei 37°C, 80% relativer Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 kultiviert. Für 293T-, MDBK- und
HeLa-Zellen wurde DMEM (Gibco), für MDCK-Zellen MEM (Gibco) und für Jurkat-Zellen
RPMI (Gibco) als Kulturmedium unter Zugabe von 5% FKS (PAA) verwendet. Dichte und
Morphologie der Zellkulturen wurden regelmäßig am Lichtmikroskop kontrolliert. Bei einer
Konfluenz einer Adhäsions-Kultur von ca. 90% wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit 1
ml Trypsin-EDTA abgelöst, in frischem Medium resuspendiert und in einem geeigneten
Verhältnis in neue Zellkulturflaschen passagiert. Im Falle der Jurkat-Suspensionszellen wurde
als Standard-Passage im Verhältnis 1:10 gesplittet.
4.2.2.2 Kultivierung von primären Zellen
Primäre Monozyten und unreife dendritische Zellen wurden im jeweiligen Zellkulturmedium
aufgetaut und je nach Verwendungszweck in Zellkulturflaschen (Nunc) oder Multiwell30
Material und Methoden
Platten ausgesät (Nunc, Falcon). Primäre Monozyten wurden für mindestens 3 Tage und
maximal 10 Tage in Monozytenmedium (DMEM mit 10 % (v/v) humanem Serum, 1%
Natriumpyruvat (SIGMA), 170 mM Penicillin und 40 nM Streptomycin) je nach
Verwendungszweck kultiviert. Unreife dendritische Zellen wurden in RPMI-Medium (250 U
IL-4/ml, 800 U GM-CSF/ml) mit 10% autologem Serum aufgetaut, gewaschen und 24 h
später für apoptotische Messungen verwendet.
4.2.2.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zur Konservierung von Zelllinien wurden Zellen im jeweiligen Medium mit 20% FKS und
10% DMSO resuspendiert und Aliquots von mindestens 1 Mio. Zellen in Cryo-Gefäßen
langsam gekühlt und zunächst bei -20°C, nach 24 h bei -80°C eingefroren. Eingefrorene
Aliquots wurden schnell bei 37°C aufgetaut und vor der Kultivierung zweifach mit
vorgewärmtem DMEM gewaschen.
4.2.2.4 Virusherstellung in Zellkultur
Der humanpathogene PR8 Stamm wurde in MDCK-Zellen vermehrt. Dazu wurde eine
konfluente 175 cm2 Flasche Zellen mit 15 ml Infektionsmedium (MEM, 1mM MgCl2, 0,9
mM CaCl2, 100 Units/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,2% Bovines Albumin)
überschichtet. Dazu wurden 1x104 bis 1x105 „plaque forming units“ (pfu) des Virus
zupipettiert und für 24 h inkubiert. Nach 24 h wurde der virushaltige Mediumüberstand
abgenommen, die toten Zellen abzentrifugiert und verworfen. Der Überstand wurde bei -80°C
eingefroren. Die Bestimmung des Virustiters erfolgte ebenfalls mittels Plaque-Assay auf
MDCK Zellen.
4.2.2.5 Virusinfektionen von Zellen
Vor einer Infektion wurden alle Zellen mit PBS gewaschen, um Serum sowie Zelltrümmer zu
entfernen. Die jeweilige Virus-Lösung wurde in PBS (mit 1 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, 100
Units/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,2% Bovines Albumin) aufgenommen bzw.
verdünnt. Die Zellen wurden mit 0,5 bis 1 ml Infektionslösung (PBS supplementiert durch 1
mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, 100 Units/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,2%
Bovines Albumin) überschichtet und für 30 min bei 37°C im Brutschrank infiziert. Im
Anschluss wurde die Infektionslösung entfernt und durch serumfreies Medium (jeweiliges
Zellmedium supplementiert mit 1 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, 100 Units/ml Penicillin, 0,1
31
Material und Methoden
mg/ml Streptomycin und 0,2% Bovines Albumin) ersetzt. Danach wurden die infizierten
Zellen, je nach Verwendungszweck, weiter behandelt.
4.2.2.6 Plaque-Assay und Virustiter Bestimmung
Die Anzahl der infektiösen Viruspartikel wurde mittels Plaque-Assay auf MDCK-Zellen
bestimmt. Dazu wurde eine logarithmische Verdünnungsreihe der zu untersuchenden
Virusüberstände erstellt. Die Viruslösungen für die Verdünnungsreihe wurden in PBS (mit 1
mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, 100 Units/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin und 0,2%
Bovines Albumin) verdünnt. Die MDCK-Zellen wurden in 6-Well Platten mit 500 µl der
jeweiligen Virusverdünnung 30 min lang bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Danach wurde
die Viruslösung entfernt und mit einem Medium-Agar Gemisch (1% Dextran, 3 ml BSA, 85
ml ddH2O, 250 ml 2xMEM, dazu wurden 15 ml 46°C warmer Oxoid-Agar auf 35 ml Medium
zugegeben) überschichtet. Humane Influenza-Stämme benötigen außerdem die Zugabe von
Trypsin (0,025% v/v), da das Hämagglutinin humanpathogener Influenza Viren tryptisch
gespalten werden muss.
Die Zellen wurden im Brutschrank für weitere 2-3 Tage inkubiert bis zur sichtbaren Bildung
von Plaques. Zuletzt wurden die Plaques mit Neutralrot (in PBS gelöst) oder Coomassie-Blau
(0,1% Coomassie-Brilliant-Blue G-250 in 40% Methanol und 10% Essigsäure) angefärbt und
ausgezählt.
4.2.3 Apoptosemessungen
4.2.3.1 Annexin-V-Färbung zur FACS-Analyse
Um apoptotische Zellen im FACS zu detektieren wurden sie nach Behandlung mit dem zu
untersuchenden apoptoseinduzierenden Reagenz bzw. nach einer Transfektion/Infektion mit
Hilfe des Vybrant® Apoptosis Assay Kits (Invitrogen) gefärbt.
Dazu wurden die behandelten Zellen nach der Inkubation einmal mit eiskaltem PBS und
nochmals mit Annexin-Bindepuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH 7,4)
gewaschen.
Danach wurden die Zellen auf 1x106 Zellen/ml mit Bindepuffer eingestellt und 100 µl dieser
Suspension mit 5 µl Annexin-V-Lösung (25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH
7,4, 0,1% BSA, Alexa Fluor 488 Annexin-V) sowie 1 µl Propidiumiodid-Lösung (1mg/ml PI,
dH2O) versetzt. Nach 15 minütiger Inkubation (im Dunkeln) wurden 400 µl Bindepuffer je
Ansatz zugegeben, die Suspension auf Eis gestellt und im direkten Anschluss am FACS
gemessen.
32
Material und Methoden
4.2.3.2 Caspase-3-Aktivitätsmessung
Mit Hilfe des Caspase-Glo® 3/7 Assays (Promega) kann die Apoptoseinduktion in Zellkultur
standardisiert und schnell gemessen werden. Das Prinzip beruht auf der Lyse der Zellen,
wodurch die Effektor-Caspasen-3 und -7 freigesetzt werden und ein Aminoluciferingekoppeltes Substrat, welches bereits im Lysispuffer vorhanden ist und eine DEVDAminosäuresequenz enthält, spalten. Dabei entsteht ein durch eine rekombinante Luciferase
umsetzbares Produkt. Bei dieser Umsetzung entsteht Lumineszenz, welche mittels ELISAReader ausgewertet werden kann. Der Ansatz erfolgte im 96-well Format wobei im Falle der
Apoptosemessungen in primären Monozyten 2x105 Zellen in 200 µl Medium je well ausgesät
wurden. Nach Infektion oder Induktion mit einem apoptotischen Stimulus wurden die
Monozyten über Nacht in 100 µl Medium weiter inkubiert und zur Zell-Lyse 100 µl CaspaseGlo®-Lysis/Reaktionspuffer direkt auf das Medium mit den Zellen zugegeben. Nach 1-2 h
Lysat-Inkubation bei R.T. erfolgte die Messung am ELISA-Reader bei 590/30 nm.
4.2.3.3 JC1-Färbung
5,5’6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyaniniodid
(JC1)
ist
ein
kationischer Farbstoff, der in den Mitochondrien in Abhängigkeit des Potentials akkumuliert.
In apoptotischen Zellen kann am FACS-Gerät ein shift vom Rot-Bereich (590 nm) in den
Grün-Bereich (525 nm) beobachtet werden. In proliferierenden Zellen nimmt die rot-Intensität
zu.
Die zu untersuchenden Zellen wurden auf eine Suspension von 1x106 Zellen/ml eingestellt,
mit 10 µg/ml JC1 (Molecular Probes) für 15 min bei 37°C behandelt und 2x mit PBS
gewaschen und anschließend am FACS analysiert.
4.2.4 Phosphorylierungsexperimente
4.2.4.1 Herstellung von S10-Extrakten
Die Herstellung von S10-Extrakten aus verschiedenen adhärenten Zelllinien wurde, wie zuvor
publiziert durchgeführt (Schubert, Schneider et al. 1992). Konfluente Monolayer wurden 2x
mit PBS gewaschen und für 2 min bei 37°C abtrypsiniert (0,03% Trypsin, 5 mM EDTA). Die
so abgelösten Zellen wurden bei 2000 rpm für 5 min abzentrifugiert, in PBS gewaschen und
in S10-Puffer auf Eis resuspendiert (10 mM Tris HCl, pH 7.5, 6 mM MgCl2, 80 mM KCl, 2
mM Dithiothreitol, 0,1% Triton X-100). Das Lysat wurde anschließend bei 10 000 g für 10
min bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände wurden aliquotiert und sofort bei -80°C gelagert
oder unmittelbar im Ansatz verwendet.
33
Material und Methoden
4.2.4.2 In-vitro-Phosphorylierung
Die enzymatische Reaktion zur In-vitro-Phosphorylierung von synthetischem PB1-F2 und
überlappenden Peptiden wurde in 20 µl Reaktionspuffer (20 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 mM
MgCl2, 100 µM CaCl2, 1 mM DTT) in Gegenwart von 2 µg PB1-F2, 2 µCi [γ32]-ATP und 10
mU gereinigter PKC aus Rattenhirn (Calbiochem) oder 5 mU gereinigter CKII (Roche)
durchgeführt. Für die Phosphorylierung mit S10-Extrakt wurden 15 µg Zelllysat verwendet
und die Proteinkonzentration zuvor mit dem BCA Protein-Assay ermittelt (Pierce). Die PKC
Inhibitoren Staurosporin und Bisindolylmaleimid (Calbiochem) wurden in getrennten
Ansätzen bis zu einer Endkonzentration von 5 µM zugegeben. Die Reaktion wurde mit der
Zugabe des Enzyms gestartet. Die Inkubation erfolgte bei 30°C und wurde nach 20 min durch
2xSDS Probenpuffer abgestoppt. Die Proteine bzw. Peptide wurden in einem 15%igen
PAA/SDS-Gel aufgetrennt und für 1 h im Vakuum getrocknet. Abschließend wurde das Gel
bei -80°C mit einem BioMax MR X-ray-Film (Kodak) oder mit einer Phosphoimagerplatte
(FUJIFILM) exponiert und die Proteinphosphorylierung durch Autoradiographie detektiert.
4.2.4.3 In-vivo-Phosphorylierung
Vor der radioaktiven Markierung erfolgte die Transfektion von PB1-F2 exprimierenden
Plasmiden bzw. entsprechenden Phsophorylierungsmutanten in 293T Zellen (70-90%
Konfluenz) mit einer anschließenden 20 h Inkubationsphase. Die Zellen wurden anschließend
für 3 h in phosphatfreiem Medium (Gibco) mit 1% FKS (Dialysiert mit TBS) inkubiert und
danach mit Markierungsmedium (DMEM, 200 µCi/ml-orthophosphat (Amersham)) für
weitere 4 h behandelt. In den Ansätzen mit PKC-Inhibitoren (Staurosporin (500 nM),
Bisindolylmaleimid (10 µM)) wurden diese 15 min vor der radioaktiven Markierung
zugegeben, wohingegen der PKC-Aktivator Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA (100
ng/ml)) 30 min vor dem Ende der Markierung durch Mediumwechsel zugegeben wurde. Im
Falle der IAVPR8-Infektion wurden MDCK-Zellen (70-90% Konfluenz) für 4 h nach der
Infektion mit phosphatfreiem Medium inkubiert und danach für weitere 4 h radioaktiv
markiert. Nach der radioaktiven Markierung wurden die Zellen 2x mit eiskaltem TBS
gewaschen, mittels Zellschaber abgelöst, in 1 ml TBS resuspendiert und anschließend
pelletiert (3000 rpm, 4°C, 4 min). Die Pellets wurden in 200 µl RIPA-Puffer (50 mM
TrisHCl, 150 mM NaCl, pH 8.5, 1% Nonidet P40, 0,5% Natriumdesoxicholat, 0,1% NatriumSDS, 5 mM EDTA) für 10 min auf Eis lysiert und für 15 min zentrifugiert (14000 rpm, 4°C).
Der Überstand wurde für die Immunopräzipitation verwendet.
34
Material und Methoden
4.2.4.4 Immunopräzipitation der radioaktiven Proben
Zur Immunopräzipitation wurden 20 µl einer G-Sepharose bead-Lösung 3x mit Triton
Waschpuffer (50 mM Tris HCl, pH 7.4, 300 nM NaCl, 0,1% Triton X100, 1 mM PMSF)
gewaschen und die beads in 500 µl desselben Puffers resuspendiert, mit 3 µl Serumantikörper
gegen das PB1-F2 Gesamtprotein (Seramun) für weitere 1,5 h bei 4°C mittels Drehrad
inkubiert und anschließend 3x mit Waschpuffer gewaschen. Das radioaktive Lysat (200 µl)
wurde mit der Beadlösung (500 µl) vereinigt und PB1-F2 bei 4°C über Nacht
immunopräzipitiert. Danach wurden die beads 2x mit Waschpuffer und 1x mit SDS-DocPuffer (50 mM Tris HCl, pH 7.4, 300 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.1% Desoxycholat, 1 mM
PMSF) gewaschen. Abschließend wurden die beads in 40 µl 2xSDS Probenpuffer
resuspendiert, gebundenes Protein für 10 min bei 70°C denaturiert und der proteinhaltige
Überstand in einem 15%igen SDS/PAA-Gel aufgetrennt. Nach dem Trocknen des Gels
erfolgte die Detektion der Phosphoproteine wie unter 4.2.4.2 beschrieben. Für
Westernblotkontrollen wurden die Proteinkonzentration der Lysate bestimmt (BCA, Pierce)
und gleiche Proteinmengen in einem 15%igen SDS/PAA-Gel aufgetrennt, auf Nitrozellulose
transferiert und das jeweilige Protein mittels spezifischen Antikörper nachgewiesen. Die
Exposition und Detektion erfolgte mittels BioMax MR X-ray-Film (Kodak).
4.2.5 Chemisches Crosslinking
Für das chemische Crosslinking wurde sPB1-F2 oder die überlappenden Fragmente PB-(140), PB-(30-70), und PB-(50-87) bei R.T. in PBS mit einem 0.002 bis 2000-fachen molaren
Verhältnis der Crosslinker BIS /(Sulfosuccinimidyl)suberate, Pierce), EGS (ethylene-glycoldisuccinate di(N-succinimidyl)ester, Pierce), GA (glutaraldeyhde, Pierce) und DSS
(disuccinimidylsuberate, Pierce) inkubiert. Nach 30 min wurde die Crosslinkreaktion durch
die Zugabe von Glycin (25 mM) und 10 µl SDS Probenpuffer (2% SDS, 1% βmercaptoethanlol, 10% Glycerol in 65 mM Tris/HCl, pH 6.8) abgestoppt. Die Proben wurden
für 5 min bei 95°C denaturiert und über ein 12%iges SDS-Gel aufgetrennt und mittels
Westernblot unter Verwendung eines Serum-Antikörpers (Henklein et al. 2005) gegen das
Gesamtprotein detektiert. Um die Oligomerisierung mittels Coomassiefärbung zu analysieren
wurden 250 µg/ml des sProteins oder der Fragmente bei R.T. in PBS inkubiert. DSS wurde in
einem 2- oder 20-fachen molaren Überschuss zugegeben. Nach 30 min wurde die Reaktion
mit 25 mM Glycin gestoppt. Die Crosslink-Proben wurden in SDS Puffer (0,2% SDS, 10%
Glycerol, 65 mM Tris/HCl, pH 6.8 mit oder ohne 5% β-mercaptoethanol für 5 min bei 55°C
gekocht und mittels 15%igem SDS Gel aufgetrennt. Nach der Coomassiefärbung (0,5%
35
Material und Methoden
Coomassie Brilliant Blue G-250, 10% Essigsäure, 25% Isopropanol) wurde das Gel entfärbt
(25% Methanol, 10% Essigsäure) und analysiert.
36
Ergebnisse
5. Ergebnisse
5.1 Kinetik der PB1-F2 Expression in IAV infizierten Zellen
Anfängliche pulse-chase-Experimente anderer Arbeitsgruppen zur Untersuchung der PB1-F2Expression nach einer IAV-Infektion zeigten, dass die Halbwertszeit des Proteins in MDBKLysaten bei nur etwa 30 min liegt und durch die irreversible Inhibition des Proteasoms
verlängert werden konnte (Chen, Calvo et al. 2001). Die maximale Proteinsynthese wurde 5 h
nach der Infektion detektiert. Ausgehend von diesem Befund wurde untersucht, ob die virale
PB1-F2-Expression zellspezifisch ist und das Expressionsmuster möglicherweise in
verschiedenen Zelllinien variiert. Hierfür wurden die Epithelzelllinien HeLa und A549
infiziert, wobei die letztere für das Virus permissiv ist und eine produktive Infektion erlaubt
(Chen, Calvo et al. 2001), sowie die nicht-permissive Jurkat-CD4+-T-Zelllinie, da PB1-F2
möglicherweise immunzellspezifische Funktionen vermittelt (Lowy 2003; Conenello and
Palese 2007). Wie an der Expression der viralen Proteine PB1 und NP zu sehen ist, wurden
alle drei Zelllinien mit dem IAVPR8-Laborstamm produktiv und mit gleicher Effizienz infiziert
(Abb. 5.1).
Abb. 5.1 PB1-F2 Expressionskinetik nach Infektion der Zelllinien Jurkat, HeLa und A549 im
Vergleich zu den viralen Proteinen PB1 und NP. Die Zelllinien Jurkat, HeLa und A549 wurden mit
IAVPR8 (5 MOI) infiziert und direkt nach der Infektion (0 h) bzw. nach 2, 4, 8 und 24 h mit PBS
gewaschen und lysiert. Die Lysate wurden im 12%igen SDS-Gel aufgetrennt und im Westernblot mit
einem PB1-F2 spezifischen Serumantikörper analysiert. Das Experiment wurde in Kooperation mit der
Arbeitsgruppe Stephan Ludwig am Institut für Molekulare Virologie in Münster durchgeführt.
Beide Virusproteine zählen zu den früh exprimierten IAV-Genprodukten und können bereits
2 h nach Viruseintritt detektiert werden. Die PB1-F2-Expression korreliert anfänglich in allen
Zelltypen mit der zunehmenden PB1 Synthese, wie sie bereits nach 4 h zu sehen ist. Obwohl
die PB1-Expression in der Jurkat und A549 Zelllinie über 24 h relativ konstant bleibt und die
37
Ergebnisse
Synthese des viralen Nukleoproteins in allen Zelllinien weiter ansteigt, kann PB1-F2 für 24 h
nach der Infektion nicht mehr detektiert werden. Die β-Aktin Kontrolle zeigt auf, dass in den
Lysaten zu allen Zeitpunkten vergleichbare Proteinmengen vorhanden waren.
5.2 Untersuchung der pro-apoptotischen Wirkung von exogenem und endogenem PB1F2 in Zellkultur
In vorangegangenen Studien wurde berichtet, dass die Präsenz von 50 nM sPB1-F2 im
Zellkulturmedium ausreichend war, um nach 4 h Inkubation zytotoxische Effekte in der
adhärenten MDBK-Zelllinie zu induzieren (Chen, Calvo et al. 2001). Auf diesem Befund
basieren die folgenden Experimente.
5.2.1 Inkubation von Epithelzelllinien mit sPB1-F2 und Analyse mittels Annexin-VFärbung
Zur Untersuchung einer möglichen exogenen Funktion von PB1-F2 wurde ein über
Festphasen-Peptidsynthese hergestelltes, synthetisches Peptid verwendet, welches hochrein
und in biologisch aktiver Form erhältlich war (Abb. 5.2.1A) (Chanturiya, Basanez et al. 2004;
Henklein, Bruns et al. 2005). Mit einer Sequenz von 87 A.s. und einem Molekulargewicht
von 11 kD entspricht das sPB1-F2 dem vom IAVPR8-exprimierten Wildtyp-Protein und zeigt
die gleichen biochemischen Eigenschaften wie das virale Protein (Henklein, Bruns et al.
2005). Vorausgegangene Untersuchungen zeigten, dass die Präsenz von 50 nM sPB1-F2 im
Zellkulturmedium zytotoxische Effekte in MDBK-Zellen und 300 nM sPB1-F2 Cytochromc-Freisetzung in HeLa-Zellen induziert (Chen, Calvo et al. 2001). Auf diesen Arbeiten
basierend, wurden HeLa Zellen für 4 h mit 300 nM sPB1-F2 inkubiert und die Zellen zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der Inkubation mit dem Apoptosemarker Annexin-V gefärbt
und mittels FACS analysiert (Abb. 5.2.1B). Diese Methode erlaubt eine präzise Angabe des
prozentualen Anteils aller apoptotischer und nekrotischer Zellen, die durch Propidiumiodid(PI)-Kofärbung detektiert wurden. Wie in Abbildung 5.2.1B zu sehen ist, zeigten die mit
exogenem sPB1-F2 inkubierten HeLa-Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle keine
prozentuale Zunahme an apoptotischen Zellen, wohingegen eine mit UV-Strahlung induzierte
Positivkontrolle einen Teil der Zellen bereits direkt nach der vierstündigen Inkubationsphase
(t = 0 h) zur Apoptose stimulierte. Da apoptotische Prozesse, je nach Stimulus, bis zum
Einsetzen der zellulär messbaren Induktion zeitlich stark variieren können, wurde die
Messreihe bis zu 50 h fortgesetzt. Eine Zunahme an apoptotischen Zellen in dem mit sPB1-F2
inkubierten Ansatz konnte jedoch in diesem Zeitraum nicht gemessen werden. Die UVinduzierten Kontrollzellen waren bereits nach 15 h vollständig apoptotisch oder nekrotisch.
38
Ergebnisse
Um den Anteil des an die Zelloberfläche gebundenen bzw. aufgenommenen sPB1-F2Proteins nachzuweisen, wurden parallel zu jedem Zeitpunkt Zelllysate erstellt und sPB1-F2
mit einem spezifischen Serumantikörper (Henklein, Bruns et al. 2005) im Westernblot
nachgewiesen (Abb. 5.2.1C). Sowohl das sPB1-F2-Monomer (11 kD) als auch das Dimer (21
kD) konnten noch bis zu 5 h nach dem Entfernen des Proteins durch Mediumwechsel
nachgewiesen werden und waren noch nach 15 h in Spuren präsent.
Abb. 5.2.1 Kinetik und FACS-Analyse von sPB1-F2 inkubierten HeLa-Zellen. (A) Qualitative
Kontrolle von 2 µg (s)PB1-F2 durch Coomassie Färbung. (B) 1x106 HeLa-Zellen wurden für 4 h mit
sPB1-F2 inkubiert, 2x mit PBS gewaschen und zur anschließenden FACS-Analyse Annexin-V
gefärbt. Die Zahl der apoptotischen Zellen wurde in einem Zeitraum bis zu 50 h nach der Inkubation
gemessen und in Prozent angegeben. (C) Für jeden Zeitpunkt nach der Inkubation mit sPB1-F2
wurden 1x105 Zellen 2x mit PBS gewaschen und in SDS-Probenpuffer lysiert. Anschließend erfolgte
die Auftrennung in einem 15%igen SDS-Gel, und PB1-F2 wurde mittels serumspezifischenAntikörper im Westernblot detektiert.
Dieser Befund spricht dafür, dass die exogene Stabilität von sPB1-F2 deutlich größer ist als
die beschriebene Halbwertszeit des endogenen, viralen Proteins von nur 30 min (Chen, Calvo
et al. 2001), was eine wichtige Voraussetzung für ein funktionell exogen agierendes
Virusprotein wäre. Dennoch war die alleinige Präsenz von sPB1-F2 im Zellkulturmedium
nicht ausreichend, um zytotoxische Effekte in HeLa-Zellen zu induzieren. Im Rahmen dieser
Arbeit wurde festgestellt, dass eine Erweiterung der experimentellen Bedingungen auf
erhöhte sPB1-F2-Konzentrationen (bis zu 10 µM), permanente Präsenz des sPB1-F2-Proteins
im Medium (bis zu 72 h) und die Inkubation verschiedener Epithelzelllinien (MDBK, MDCK,
293T) sowie primärer Zellen (Monozyten, dendrititsche Zellen) in keiner detektierbaren
Apoptoseinduktion resultierten (Daten nicht gezeigt). Demnach kann davon ausgegangen
39
Ergebnisse
werden, dass exogenes PB1-F2 nicht ausreicht, um zytotoxische Effekte in Zellkultur zu
generieren.
5.2.2 Exogenes sVpr, aber nicht sPB1-F2, induziert Apoptose in T-Lymphozyten
Neuere Ergebnisse sprechen für eine immunmodulatorische Bedeutung des PB1-F2-Proteins
vor allem in hochpathogenen IAV-Isolaten (Conenello and Palese 2007). Eine Hypothese geht
davon aus, dass PB1-F2 Immunzellen im Kontext einer akuten Infektion eliminiert und dies
möglicherweise exogen vermittelt wird, indem das Protein von einer infizierten Zelle
freigesetzt wird und Nachbarzellen transduziert, wie es bereits für das akzessorische VprProtein bekannt ist (Lowy 2003; Bruns, Studtrucker et al. 2007). Um zu klären, ob exogenes
PB1-F2 spezifische Lymphozyten-Zytotoxizität vermittelt, wurden Jurkat-T-Zellen für 8 bzw.
24 h mit sPB1-F2 oder sVpr inkubiert (Abb. 5.2.2.1). Als Positivkontrolle wurden die
Jurkatzellen mit dem chemischen Stimulus Etoposid in die Apoptose überführt. Während der
prozentuale Anteil der apoptotischen und nekrotischen Zellen in der unbehandelten Kontrolle
und in den mit sPB1-F2 inkubierten Zellen bei 4-6% konstant blieb, konnte in den mit sVpr
behandelten Zellen ein deutlicher zytotoxischer Effekt mit einem Anteil von 18%
apoptotischer Zellen nach 8 h detektiert werden (Abb. 5.2.2.1).
Kontrolle
sPB1-F2
Data.001
10
2
10
1
88,77%
10
0
10
3
10
2
10
1
0,05%
88,02%
4,58%
10
1
2
10
FL1-H
10
3
10
7,02%
4
10
0
1
3
10
2
10
1
89,50%
10
0
10
4
10
3
10
2
10
1
4,09%
10
1
2
10
FL1-H
10
3
3
10
2
10
1
18,65%
62,34%
10
4
10
0
2
10
FL1-H
10
3
10
6,50%
89,35%
4
10
0
10
4
10
3
10
2
10
1
1
4
10
3
10
2
10
1
0,13%
1
2
10
FL1-H
10
3
10
13,69%
27,80%
18,84%
10
4
10
0
58,38%
10
1
2
10
FL1-H
10
3
10
4
10
0
10,98%
10
4
10
3
10
2
10
1
14,23%
10
1
2
10
FL1-H
10
3
10
4
Data.010
0,06%
74,73%
4,04%
10
10
Data.008
0,11%
FL2-H
10
6,31%
Data.004
0,17%
Data.009
0,10%
FL2-H
FL2-H
24 h
4
10
4,91%
10
Data.007
10
10
FL2-H
3
6,64%
Data.005
4
FL2-H
10
0,01%
4
Etoposid
sVpr
Data.006
10
FL2-H
4
FL2-H
FL2-H
8h
10
2
10
FL1-H
10
3
10
4
0,05%
37,21%
8,12%
10
0
54,62%
10
1
2
10
FL1-H
10
3
10
4
nekrotische Zellen
apoptotische Zellen
Abb. 5.2.2.1 Annexin-V-Färbung von Jurkat-T-Zellen nach Inkubation mit sVpr oder sPB1-F2.
Jurkat-T-Zellen wurden für 8 bzw. 24 h mit 3 µM sPB1-F2 oder sVpr inkubiert, in PBS gewaschen
und mit dem Apoptosemarker Annexin-V bzw. mit Propidiumiodid zur Detektion der nekrotischen
Population inkubiert. Der chemische Stimulus Etoposid (60 µM) diente als Positivkontrolle.
40
Ergebnisse
Um auszuschließen, dass die PB1-F2-vermittelte Apoptoseinduktion zu einem späteren
Zeitpunkt verläuft, wurden die Zellen bis zu 72 h mit sPB1-F2 bzw. sVpr inkubiert (Abb.
5.2.2.2). Es zeigte sich, dass exogenes PB1-F2 zu keinem Zeitpunkt zu einer signifikant
gesteigerten Zytotoxizität im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen beigetragen hat.
Wie zu erwarten, nimmt die durch sVpr vermittelte Apoptose zeitabhängig ab, da das Protein
im Gegensatz zu starken Stimuli wie UV-Strahlung oder der Chemikalie Etoposid nicht in
allen Zellen Apoptose induziert und die sVpr-Stabilität im Zellkulturmedium zeitlich limitiert
ist (Sherman, Schubert et al. 2002).
5.2.2.2 72 h-Inkubation von Jurkatzellen mit sPB1-F2.
Jurkat-Zellen wurden bis zu 72 h mit sVpr oder sPB1-F2 inkubiert (3 µM) und die Apoptoseinduktion
durch Annexin-V-positive Zellen am FACS gemessen.
5.2.3 Die Expression von endogenem PB1-F2 in 293T-Zellen hat keinen Einfluss auf die
Caspase-3-Aktivität
PB1-F2 wurde usrsprünglich als pro-apoptotisches Protein beschrieben, das hauptsächlich in
den Mitochondrien von IAV-infizierten oder transient transfizierten Zellen lokalisiert ist und
dort morphologische Veränderungen der tubulären Mitochondrienstruktur zu einer
sphärischen Form hin induziert und zu gesteigerter Cytochrom-c-Freisetzung beiträgt (Chen,
Calvo et al. 2001; Zamarin, Garcia-Sastre et al. 2005). Damit ist PB1-F2 das einzige bisher
bekannte Influenza Protein, welches die sogenannte intrinsische apoptotische Signalkaskade
aktiviert (Lowy 2003). Ein Schlüsselenzym zur Messung apoptotischer Induktion nach einer
IAV-Infektion
ist
die
Effektorcaspase-3,
welche
sowohl
durch
die
extrinsische,
rezeptorvermittelte (z.B. Fas-Ligand) als auch intrinsische, mitochondirale Kaskade aktiviert
wird (Ludwig, Pleschka et al. 2006). Ein zelluläres Substrat der aktiven Caspase-3 ist die
Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), welche von der Caspase gespalten wird und daher
41
Ergebnisse
als spezifischer Apoptosemarker Anwendung findet (Nicholson, Ali et al. 1995). Um zu
untersuchen, ob zellulär exprimiertes PB1-F2 die Caspase-3-Aktivität stimuliert, wurden
293T-Zellen mit Plasmiden transfiziert, die entweder für PB1-F2 oder zur Kontrolle das virale
PB1-Protein exprimieren.
Abb. 5.2.3 Zellulär exprimiertes PB1-F2 ist nicht ausreichend, um apoptotische Effekte in 293TZellen zu induzieren.
(A) 24 h nach transienter Transfektion von 293T-Zellen mit Plasmiden, die für PB1-F2 oder die virale
Polymerase PB1 codieren, wurden die Lysate in einem 12%igen SDS-Gel aufgetrennt und mit
spezifischen Antikörpern im Westernblot analysiert. (B) In den Lysaten von 1x105-Zellen je
transfiziertem Ansatz wurde durch ein spezifisches Substrat (Z-DEVD) die Caspase-3-Aktivität
luminometrisch ermittelt.
Die Apoptoseinduktion wurde durch PARP-Spaltung im Westernblot analysiert (Abb. 5.2.3).
PB1-F2 konnte in 293T-Zellen exprimiert und mit einem spezifischen Serumantikörper
(Henklein, Bruns et al. 2005) im Vergeich zu einer MOCK-transfizierten Kontrolle deutlich
detektiert werden. Interessanterweise war die Transfektion der für PB1 kodierenden Plasmid
DNA-Sequenz bereits ausreichend, um die Expression von PB1-F2-downstream nach dem
zuvor beschriebenen Mechanismus der alternativen Startcodon-Erkennung zu initiieren (siehe
Einleitung). Ein Spaltprodukt für PARP (c-PARP) mit einem erwarteten Molekulargewicht
von 87 kD konnte nur in den mit Staurosporin bzw. Etoposid behandelten Zellen detektiert
werden, jedoch nicht in den transfizierten Zellen, wobei die Sensitivität der Methode in
diesem System aufgrund des schwachen Bandensignals der apoptotischen Positivkontrollen
nicht zufriedenstellend war. Deshalb wurden die transfizierten Zellen parallel in einem
kommerziellen Caspase-3-Luziferase-Aktivitätsassay untersucht. Im Vergleich zu den
unbehandelten Kontrollzellen konnte in keinem der transfizierten Ansätze eine gesteigerte
Caspaseaktivität gemessen werden (Abb.5.2.3B). Diese Ergebnisse stimmen mit später
42
Ergebnisse
publizierten Daten überein, wonach endogen exprimiertes PB1-F2 alleine nicht in der Lage
ist, Apoptose in Epithelzellen zu induzieren (Zamarin, Garcia-Sastre et al. 2005).
5.2.4 Exogenes sPB1-F2 hat keinen Einfluss auf die apoptotische Sensibilisierung
verschiedener Zelllinien
Nach der Transfektion der Eptihelzelllinien 293T und A549 konnte gezeigt werden, dass
endogenes PB1-F2 die Effekte zellulärer pro-apoptotischer Stimuli verstärkt (Zamarin,
Garcia-Sastre et al. 2005). Um zu überprüfen, ob extrazelluläres PB1-F2 gleichfalls zu einer
gesteigerten Apoptoserate beiträgt, wurden HeLa-Zellen für 5 h mit sPB1-F2 präinkubiert und
danach UV- bestrahlt.
A
M1
C ount
120
M2
100
80
M2
M2
60
40
20
0
0
1
10
10
B
´
2
10
FL1-H
3
4
10
10
C
14, 000
35000
12, 000
30000
10, 000
25000
8, 000
20000
6, 000
15000
4, 000
10000
2, 000
5000
0, 000
0
Kontr ol l e
sPB1-F2 [10 µM]
STS[0,5 µM]
Kont rolle
STS[0,5 µM] +sPB1F2 [10 µM]
Et oposid [ 100 Et oposid [ 100
µM]
UV [ 200 mJ]
UV [ 200 mJ] +
µM] + sPB1-F2
sPB1-F2 [ 10
[ 10 µM]
µM]
Abb. 5.2.4 Exogenes sPB1-F2 hat keinen verstärkenden Einfluss auf apoptotische Stimuli.
(A) 1x106 HeLa-Zellen wurden mit oder ohne sPB1-F2 (10 µM) inkubiert, UV-bestrahlt (250mJ/cm2)
und nach 6 h mit dem Mitochondrienpoteinial-sensitiven Farbstoff JC1 am FACS gemessen. Die UVbehandelten Zellen (roter Graph) und die Zellen, die zusätzlich mit sPB1-F2 behandelt wurden (blauer
Graph), zeigen keine signifikanten Unterschiede. (B) 5x104 Jurkat-Zellen wurden für 12 h mit sPB1F2 (10µM) inkubiert und anschließend mit 0,5 µM STS behandelt oder ohne den Stimulus inkubiert. 6
h nach der Induktion wurden die Zellen lysiert und die Caspase-3-Aktivität in den Lysaten gemessen.
(C) Nach sPB1-F2 Inkubation (wie in B) wurde die Apoptose von 5x104-MDCK-Zellen entweder mit
Etoposid [100 µM] oder UV-Strahlung [200 mJ/cm2] induziert und nach weiteren 6 h die Caspase-3Aktivität bestimmt.
43
Ergebnisse
Nach weiteren 4,5 h erfolgte die Messung mit dem Mitochondrienpotential-sensitiven JC1Farbstoff mittels FACS-Analyse (Abb. 5.2.4A). Die UV-bestrahlten Zellen zeigen für 5 h
nach der Induktion einen deutlich einsetzenden shift in den Grünkanal für 24% der
Gesamtpopulation, der eine Destabilisierung des mitochondrialen Potentials dieser Zellen
anzeigt (roter Graph, M2) und bei den unbehandelten Kontrollzellen nicht vorhanden war
(schwarzer Graph, 2%). Dabei konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den nur UVbestrahlten HeLa Zellen und den Zellen, die sowohl UV-bestrahlt als auch mit sPB1-F2
inkubiert wurden (blauer Graph, 31% der Population) festgestellt werden. Um weitestgehend
auszuschließen, dass eine mögliche exogene Sensibilisierung durch PB1-F2 zellspezifisch
vermittelt wird, wurden Jurkat- bzw. MDCK- Zellen für 10 h mit sPB1-F2 präinkubiert,
anschließend mit den Apoptosestimuli Staurosporin (STS) oder Etoposid behandelt und die
Caspase-3-Aktivität
bestimmt
(Abb.
5.2.4B).
In
beiden
Ansätzen
konnte
keine
Aktivitätssteigerung durch die Präsenz von 10 µM sPB1-F2 im Zellkulturmedium
nachgewiesen werden, wodurch erneut bestätigt wurde, dass exogenes sPB1-F2 für die
Induktion zytotoxischer Effekte nicht relevant ist.
5.2.5 PB1-F2 verstärkt die virusinduzierte Apoptose in primären humanen Monozyten
Nachdem in vorangegangenen Arbeiten durch Annexin-V-Färbung gezeigt werden konnte,
dass die Apoptoserate nach einer Infektion mit Wildtyp-IAVPR8 in der humanen monozytären
Zelllinie U937 um etwa 40% höher liegt als bei einer Virusmutante, die für PB1-F2 deletiert
ist (Chen, Calvo et al. 2001), sollte untersucht werden, ob sich dieses Phänomen auch in
primären, elutrierten Monozyten von gesunden Spendern reproduzieren lässt. Hierfür wurden
die Monozyten entweder mit dem Wildtyp-IAVPR8 infiziert, oder mit einer Deletionsmutante
IAVPR82xΔF2, die kein Startcodon zur Expression von PB1-F2 besitzt und zusätzlich ein
Stopcodon nach 12 Aminosäuren innerhalb des +1 überlappenden Leserahmens von PB1
integriert hat (Mazur, Anhlan et al. 2008). Die Caspase-3-Aktivität der Zelllysate wurde für 4,
8, 16 und 20 h nach der Infektion gemessen. Es konnte festgestellt werden, dass die von
beiden Viren induzierten apoptotischen Effekte bereits nach 16 h deutlich detektierbar sind,
was mit früheren Publikationen übereinstimmt, die eine messbare Aktivität der Caspase-3 für
einen Zeitraum von 16 h bis 30 h beschreiben (Lowy 2003) (Abb. 5.2.5A). Im Vergleich dazu
erfolgte die einzige im Westernblot detektierbare PB1-F2-Expression nach 8 h, was mit dem
Peak in anderen Zelltypen übereinstimmt (vgl. Abb. 5.1), wohingegen das PB1-F2-defiziente
Virus wie erwartet keine Expression aufweist. Die Differenz der relativen Caspase-3-Aktivität
des Zelllysates der Wildtyp-Virus-infizierten Zellen im Vergleich zum Lysat der
44
Ergebnisse
Virusmutante, welche für 16 h bzw. 20 h nach der Infektion gemessen wurde, entspricht in
etwa dem Anteil der zuvor durch FACS-Analysen prozentual ermittelten gesteigerten Anzahl
apoptotischer Monozyten von 30% - 40% (Chen, Calvo et al. 2001). Dieses Ergebnis
verdeutlicht, dass das PB1-F2 defiziente Virus weniger Apoptose in primären Monozyten
induziert als das Wildtyp-Virus.
Abb. 5.2.5 Die Induktion der Caspase-3-Aktivität ist in PB1-F2-defizienten Viren reduziert.
(A) Primäre humane Monozyten (2x105 Zellen) wurden mit Wildtyp-Virus (IAVPR8) oder
einer PB1-F2-deletierten Mutante (IAVPR82xΔF2) infiziert (MOI 5) und die Caspase-3-Aktivität
der Lysate zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Infektion luminometrisch gemessen. (B)
Westernblotkontrolle der Infektionskinetik. Die PB1-F2 Expression konnte nur für 8 h nach
der Infektion nachgewiesen werden.
5.3 Das IAV-Protein PB1-F2 wird von der Proteinkinase C phosphoryliert
Ursprünglich wurde PB1-F2 als ein Protein beschrieben, das nach der Infektion von [35S]Met-markierten MDBK-Zellen und anschließender Immunopräzipitation in einem Muster von
drei dicht nebeneinander lokalisierten Proteinbanden detektiert werden kann (Chen, Calvo et
al. 2001). Auf dieser Beobachtung basieren die nachfolgenden Untersuchungen, um zu klären,
ob PB1-F2 durch posttranslationale Modifikationen, wie z.B. Phosphorylierung, modifiziert
wird und welche Kinasen in diesen Prozess involviert sind.
45
Ergebnisse
5.3.1 PB1-F2 enthält mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen mit PKC- und CK2Konsensussequenzen
Die Analyse der PB1-F2-Sequenz des IAV-Isolates A/Puerto Rico/8/34(H1N1) (IAVPR8)
wurde in silico mit dem Programm „NetPhos“ erstellt. Die Phosphorylierungsstellen in
Position Thr-18, Thr-27, Ser-35 und Ser-84 besitzen die größte vorausgesagte
Phosphorylierungswahrscheinlichkeit von insgesamt 13 potentiellen Phosphoaminosäuren
(Ser/Thr/Tyr) innerhalb der Sequenz (Abb. 5.3.1, rechter Abschnitt). Der prediction score
(Pscore) für jede der möglichen Phosphorylierungsstellen liegt zwischen 0 (0%) und 1 (100%)
und wird im Kontext der die Phosphorylierungsstelle umgebenden Aminosäuresequenz
kalkuliert, wobei berücksichtigt werden muss, dass vorhergesagte Phosphorylierungsstellen
nur relevant sind, wenn ihr Pscore > 0,5 ist (Blom, Gammeltoft et al. 1999).
Abb. 5.3.1 In-silico-Sequenzanalyse von PB1-F2 unter Darstellung der potentiellen
Phosphorylierungsstellen. Mehrere spezifische Erkennungsmotive für die PKC und eines für die
CKII befinden sich inerhalb der Proteinsequenz. Der rechte Abschnitt zeigt die numerische
Wahrscheinlichkeit (Pscore) mit der jede der identifizierten Phosphorylierungsstellen innerhalb einer
spezifischen Konsensussequenz tatsächlich phosphoryliert wird.
Weiterhin ist es möglich, dass eine Phosphorylierungsstelle von mehreren Kinasen
phosphoryliert wird (Blom, Sicheritz-Ponten et al. 2004). Zur Analyse der potentiellen
Kinasen-Konsensusmotive innerhalb der PB1-F2-Sequenz wurde das Programm „PROSITE“
verwendet
(Abb.
5.3.1).
Dabei
wurden
insgesamt
drei
relevante
PKC-
Phosphorylierungsstellen für die A.s. in Position 18 (Thr), 27 (Thr) und 35 (Ser) identifiziert,
welche auf dem minimalen Konsensus-Motiv S/TXK/R basieren (Woodgett, Gould et al.
1986) und ein C-terminales S/KH/E-Motiv für die Casein-Kinase-2 (CK-2). Nach neuesten
Strukturanalysen besitzt PB1-F2 zwei kleinere α-Helices im N-Terminus und ein große αHelix von A.s. Ile-53 bis Lys-85 im C-Terminus (vgl. Abb. 2.6.2), welche die bisher
bekannten funktionellen Regionen des Proteins umfasst (Bruns, Studtrucker et al. 2007). Die
potentiellen Phosphorylierungsstellen befinden sich in der unstrukturierten Region von PB1F2, was frühere Beobachtungen bestätigt, dass spezifische Kinasen-Erkennungsmotive häufig
in den unstrukturierten Bereichen eines Proteins vorliegen, aufgrund der idealen sterischen
Zugänglichkeit für die Bindetasche der jeweiligen Kinase (Roach 1991; Blom, Gammeltoft et
al. 1999).
46
Ergebnisse
5.3.2 sPB1-F2 wird von der Protein-Kinase-C (PKC) in-vitro-phosphoryliert
Nachdem die PKC und CK-2 als potentielle Kinasen der PB1-F2-Phosphorylierung in silico
identifiziert wurden, sollten In-vitro-Experimente aufzeigen, ob diese Vorhersagen tatsächlich
zutreffen. Hierfür wurden synthetisch hergestellte PB1-F2 Proteine vom IAVPR8-Isolat
(Henklein, Bruns et al. 2005) oder vom Spanischen-Grippe-Isolat A/Brevig Mission/1/18
(H1N1) (IAVSF2) (Roder, Bruns et al. 2008) verwendet und mit kommerziell erhältlicher,
aufgereinigter PKC bzw. CK-2 in Gegenwart von [γ32]-ATP inkubiert (Abb. 5.3.2.1A).
Während das sPB1-F2 beider Isolate deutlich von der PKC phosphoryliert wird, zeigt sich für
die Caseinkinase unter gleichen Bedingungen nur ein schwaches Phosphorylierungssignal,
obwohl das Enzym vollkommen aktiv ist, was durch die Autophosphorylierung seiner
regulatorischen und katalytischen Untereinheiten (α+β-UE) deutlich zu sehen ist
(Bodenbach). Die PKC-Phosphorylierung erfolgte mit aufgereinigtem Rattenhirnextrakt,
welches hauptsächlich die konventionellen PKC-Isoformen α, β1, β2 und γ enthält (Kikkawa,
Go et al. 1986).
A
B
C
Abb. 5.3.2.1 Das sPB1-F2-Protein wird von der PKC in vitro phosphoryliert und die
Phosphorylierung wird durch PKC-Inhibitoren deutlich reduziert. (A) sPB1-F2, welches
entweder der Sequenz des IAVPR8- oder IAVSF2-Isolates entspricht, wurde verwendet, um die
32
Phophorylierung in Gegenwart von gereinigter PKC aus Rattenhirn oder der CK-2 und [γ ]-ATP zu
untersuchen. (B) Phosphorylierung von sPB1-F2 durch HeLa Zellextrakt (S10-Extrakt). Für die invitro-Inhibition der PKC wurden verschiedene Konzentrationen der Inhibitoren STS umd BIM
eingesetzt. (C) Die PB1-F2-Phosphorylierung mittels S10-Extrakt wurde durch einen Kontrollinhibitor
bis zu 10 µM nicht reduziert.
47
Ergebnisse
Die In-vitro-Experimente wurden weiterführend auch mit zellulären HeLa-Extrakten (S10Extrakte) vollzogen (Schubert, Schneider et al. 1992). Die Inkubation von sPB1-F2 mit [γ32]ATP resultierte in der deutlichen Phosphorylierung von PB1-F2, die in Abhängigkeit der
PKC-Inhibitorenkonzentration von Staurosporin (STS) und Bisindolylmaleimid (BIM)
blockiert wurde (Abb. 5.3.2.1B). Dabei muss berücksichtigt werden, dass Zellextrakte ein
Gemisch aus allen zellulärer Kinasen darstellen und PB1-F2 möglicherweise noch mit
anderen Kinasen interagiert, so dass eine völlige Inhibition mit PKC-spezifischen Inhibitoren
unter diesen Bedingungen nicht erzielt werden kann. Obwohl STS ein sehr potenter Inhibitor
aller PKC-Isoformen ist (Tamaoki, Nomoto et al. 1986), können auch andere Kinasen
inhibiert werden, wie z.B. die Protein-Kinase-A (PKA) oder die virale p60-src-kinase (p60vsrc) (Nakano, Kobayashi et al. 1987; Ruegg and Burgess 1989). Im Gegensatz dazu ist BIM
ein selektiverer PKC-Inhibitor, der vor allem für die konventionellen PKC Isoformen sensitiv
ist (Toullec, Pianetti et al. 1991; Gescher 1998). Dass die Phosphorylierung von PB1-F2
vornehmlich von Serin- oder Threoninkinasen vermittelt wird und Tyrosinkinasen nicht
beteiligt sind, wird dadurch bestätigt, dass BIM bereits ab einer Konzentration von 0,5 µM
nachweislich zur Inhibition der PB1-F2-Zellextrakt-Phosphorylierung beiträgt (Abb.
5.3.2.1B) und dieser Inhibitor erst ab einer 100fach höheren Konzentration unspezifisch
Tyrosinkinasen inhibiert (Toullec, Pianetti et al. 1991). Interessanterweise zeigt die Kontrolle
mit einem sensitiven Inhibitor der Phosphoinositol-3- Kinase (PI3-Kinase), die ebenfalls im
Kontext der IAV-Infektion aktiviert wird (Ludwig, Pleschka et al. 2006; Ehrhardt, Wolff et al.
2007), dass die S10-Extrakt-vermittelte PB1-F2-Phosphorylierung selbst für mikromolare
Konzentrationen des PI3-sensitiven Inhibitors Wortmannin nicht beeinträchtigt wird (Abb.
5.3.2.1C), wohingegen Staurosporin die Phosphorylierung durch das S10-Extrakt vollständig
blockiert.
Die primären Wirtszellen der Influenza-A-Viren im Menschen sind die alveolaren
Epithelzellen der Lunge (Suzuki, Ito et al. 2000; Wright 2001). Daher wurden A549Lungenepithelzellen mit Zelllinien verglichen, die gleichsam permissiv für IAV sind und eine
produktive Replikation erlauben (Chen, Calvo et al. 2001), und untersucht, ob sich in vitro
Unterschiede im PB1-F2-Phosphorylierungsmuster zeigen. Wie in Abbildung 5.3.2.2 zu
sehen, wurde PB1-F2 von allen hier verwendeten Epithelzellextrakten phosphoryliert. Am
effizientesten erfolgte die Phosphorylierung mit dem Extrakt aus A549-humanen
Lungenepithelzellen, den eigentlichen Zielzellen des Virus. Die Westernblotkontrolle (Abb.
5.3.2.2B) zeigte, dass vergleichbare Mengen sPB1-F2 in allen Ansätzen vorhanden sind. Die
48
Ergebnisse
A
B
Abb. 5.3.2.2 PB1-F2 wird von den Extrakten verschiedener Zelllinien phosphoryliert. (A) S10Extrakte verschiedener Zelllinien (15 µg je Ansatz) wurden in vitro zusammen mit sPB1-F2 und 32PATP inkubiert und mittels Autoradiographie detektiert. (B) Die Westernblottkontrolle mit einem
spezifischen PB1-F2-Serumantikörper bestätigt, dass in allen Ansätzen vergleichbare Mengen an
sPB1-F2 vorhanden waren.
Expression und Verteilung der verschiedenen PKC-Isoformen kann stark zwischen
verschiedenen Zelltypen und Geweben schwanken. Einige Isoforme wie z.B. die PKCα
werden ubiquitär exprimiert, wohingegen andere, z.B. die PKCγ extrem gewebsspezifisch
sind (Webb, Hirst et al. 2000). Die effiziente PB1-F2-Phosphorylierung durch A549-Extrakt
steht im Einklang mit vorangegangenen Publikationen, welche die PKCα als die dominante
Isoforme in A549-Zellen beschrieben haben (Levesque, Dean et al. 1997) und der bereits
zuvor angesprochenen Tatsache, dass sPB1-F2 durch die überwiegend konventionellen
Isoformen des Rattenhirns effizient phosphoryliert wird.
5.3.3 PB1-F2 wird in transfizierten 293T-Zellen phosphoryliert
Um die Frage zu klären, ob PB1-F2 auch in vivo phosphoryliert wird, wurden 293T-Zellen
mit einem Expressionskonstrukt, welches das pb1-f2-Gen exprimiert, transient transfiziert.
Anschließend wurden die Zellen mit [32P]-Orthophosphat radioaktiv markiert und PB1-F2 mit
einem spezifischen Serumantikörper immunopräzipitiert (Henklein, Bruns et al. 2005). Wie in
Abbildung 5.3.3 (Reihe 2) deutlich zu sehen ist, zeigt sich eine radioaktive Proteinbande mit
dem erwarteten Molekulargewicht von 11 kDa in den PB1-F2-exprimierenden 293T-Zellen,
jedoch nicht in der MOCK-transfizierten Kontrolle (Reihe 1). Um zu bestätigen, dass es sich
hierbei tatsächlich um PB1-F2 handelt, und um die Menge an exprimierten PB1-F2 in
Relation zum Signal des radioaktiven Proteins setzen zu können, wurde eine zusätzliche
49
Ergebnisse
Westernblot-Kontrolle erstellt (siehe Unterhalb). In weiteren Experimenten wurde untersucht,
ob die in-vivo-Phosphorylierung von PB1-F2 im Kontext der PKC-Aktivität steht. Hierfür
wurden die transfizierten 293T-Zellen mit Reagenzien behandelt, welche die PKC entweder
aktivieren (Phorbol-Myristyl-Acetat, PMA) oder inhibieren (BIM, STS, vgl. 5.3.2). Nach 30
min Inkubation mit PMA konnte die PB1-F2-Phosphorylierung verdoppelt werden (nach
densitometrischer Analyse mit dem AIDA Software-Programm). Im Gegensatz dazu war das
Phosphorylierungssignal in Gegenwart der Inhibitoren BIM bzw. STS deutlich reduziert.
Diese Daten bestätigen auch die zuvor in vitro ermittelte Phosphorylierung von PB1-F2 durch
die PKC, von der bekannt ist, dass sie nach einer IAV-Infektion aktiviert vorliegt (Kurokawa,
Ochiai et al. 1990; Sieczkarski, Brown et al. 2003).
A
B
Abb. 5.3.3 PB1-F2 wird nach transienter Transfektion phosphoryliert, und die Signalintensität
kann durch PMA gesteigert oder mit PKC-spezifischen Inhibitoren reduziert werden.
(A) Autoradiographie eines 293T-Zell-Lysates für 24 h nach der Transfektion mit einem
Kontrollvektor (Reihe 1) oder einem PB1-F2-Expressionsvektor (pPB1-F2). Die Zellen wurden für 4 h
vor der Lyse 32P radioaktiv markiert und PB1-F2-immunopräzipitiert (IP). Die Westernblot-Kontrolle
der IP-Proben ist unterhalb zu sehen.
(B) Die Signalintensität der Autoradiographie von PB1-F2-transfizierten unbehandelten Zellen (Reihe
1) wurde mit Zellen, die entweder PMA (100ng/ml, Reihe 2) oder mit den Kinaseinhibitoren BIM (10
µM, Reihe 3 bzw. STS (500 nM, Reihe 4) während der Radioaktiven 32P-Markierung behandelt
wurden, verglichen. Die Westernblot-Kontrolle der IP-Proben unterhalb zeigt, dass die
Proteinexpression von PB1-F2 durch die Präsenz des chemischen Aktivators oder der Inhibitoren nicht
beeinträchtigt wurde.
50
Ergebnisse
5.3.4 PB1-F2 wird an den PKC-Phopshorylierungsstellen Serin-35 und Threonin-27 in
vitro phosphoryliert
Nachdem gezeigt wurde, dass PB1-F2 ein Phosphoprotein ist, galt es, die relevanten
Phosphorylierungsstellen innerhalb des Proteins zu ermitteln. Hierfür wurden 15 synthetische
Peptide mit einer Länge von 20 A.s. (20mere) verwendet, welche die gesamte Sequenz von
PB1-F2 umfassen (Abb. 5.3.4) (Henklein, Bruns et al. 2005). Jedes einzelne Fragment wurde
in vitro mit S10-Extrakt aus HeLa-Zellen in Gegenwart von [γ32]-ATP inkubiert. In diesem
Ansatz konnten nur die Peptide phosphoryliert werden, welche die A.s. Thr-27 und Ser-35
umgebenden PKC-Motive besitzen. Während das Peptid PB-(16-35), das nur die
Phosphoaminosäure Thr-27 in zentraler Position enthält, schwach phosphoryliert wurde,
zeigten sich für die Fragmente PB-(21-40) und PB-(26-45) deutlichere Signale, was bereits
als ein Hinweis für die entscheidende Rolle der Phosphoaminosäure Ser-35 gewertet werden
kann.
Abb. 5.3.4 Bestimmung der PB1-F2 Phosphorylierungsstellen durch überlappende Peptide.
Die PB1-F2-Sequenz-überlappende 20mer-Peptide wurden in vitro mit HeLa-S10-Extrakt inkubiert, in
einem 15%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Autoradiographie analysiert. Nur die Peptide PB21-40
und PB26-45 wurden effizient durch zelluläre Kinasen phosphoryliert. Dasselbe PhosphorylierungsMuster ergab sich, wenn das Experiment mit der PKC aus Rattenhirn wiederholt wurde (Abbildung
unterhalb).
Das Experiment wurde anschließend unter Verwendung der aufgereinigten, kommerziellen
PKC wiederholt. Wie bereits für den S10-Extrakt gezeigt, konnten vor allem die Peptide,
welche ein zentral lokalisiertes Serin in Position 35 aufweisen effizient phosphoryliert werden
(Abb. 5.3.4, Unterhalb). Um genauer festlegen zu können, welche der beiden A.s. Thr-27
bzw. Ser-35 effizient phosphoryliert werden, wurde das Peptid PB-(21-40) in vitro mit
aufgereinigter PKC phosphoryliert und massenspektrometrisch untersucht. Nach einer ESI51
Ergebnisse
MS-Analyse konnte nur eine Monophosphorylierung des Peptidfragmentes für das Serin in
Position 35 detektiert werden. Eine Analyse des Gesamtlängen-Proteins nach S10-ExtraktPhosphorylierung war aus methodischen Gründen nicht möglich (Daten nicht gezeigt).
5.3.5 Mutationsanalysen zur Identifikation der relevanten Phosphorylierungsstellen von
PB1-F2 in vivo
Um die zentrale Rolle von Ser-35 für die PB1-F2-Phosphorylierung näher zu bestimmen,
wurde eine mutierte sPB1-F2-Variante mit einem Aminosäureaustausch von Ser-35 zu Asn35 (S35N) unter den gleichen Bedingungen wie das synthetische Wildtyp-Protein mit HeLaS10-Extrakt in vitro phosphoryliert (Abb. 5.3.5A). Obwohl dieser Aminosäureaustausch in
einer dramatischen Reduktion der PB1-F2-Phosphorylierung resultierte, konnte noch ein
Restsignal detektiert werden, was auf die Präsenz einer weiteren Phosphorylierungsstelle
schließen lässt. Diese Beobachtung steht im Einklang mit dem Phosphorylierungsmuster der
überlappenden Peptidfragmente, welches bereits oberhalb gezeigt wurde (Abb. 5.3.4). In
einem
weiteren
Experiment
wurden
293T-Zellen
mit
CMV-Promotor-regulierten
Expressionsplasmiden transient transfiziert, welche entweder für Wildtyp-PB1-F2 oder für
entsprechende Mutanten des Proteins mit Aminosäure-Austauschmutationen innerhalb der
Phopshorylierungsstellen Thr-27 (T27N), Ser-35 (S35N), Ser-84 (S84N) oder eine
Doppelmutation (T27S35N) exprimieren. Die Zellen wurden mit [32P] radioaktiv markiert und
die verschiedenen PB1-F2-Varianten immunopräzipitiert, auf einem SDS-Proteingel
aufgetrennt und mittels Autoradiographie detektiert (Abb. 5.3.5B). Gleichzeitig wurden
Proben der so isolierten Proteine im Westernblotverfahren analysiert, um eventuelle
Schwankungen der Proteinmengen zwischen den verschiedenen Ansätzen detektieren zu
können (siehe unterhalb). In Relation zur jeweils im Westernblot observierten Proteinmenge,
konnte für die Mutanten PB1-F2-S84N oder PB1-F2-T27N kein Einfluss auf die
Proteinphosphorylierung festgestellt werden, wohingegen die PB1-F2-S35N-Mutante einen
deutlichen Signalverlust aufweist. Des Weiteren führte die Mutation von beiden
Phosphorylierungsstellen in Position Thr-27 und Ser-35 zum völligen Verlust des
radioaktiven Signals, wodurch Thr-27 eindeutig als alternative Phosphorylierungsstelle
identifiziert und Ser-84 ausgeschlossen werden konnte. Abschließend wurde getestet, ob die
identifizierten Phosphorylierungsstellen auch für virales PB1-F2 von Bedeutung sind. Hierfür
wurden MDCK-Zellen mit dem IAVPR8-Stamm infiziert, der das Wildtpy-PB1-F2 exprimiert,
oder
mit
einem
rekombinanten
Virus,
welches
ein
27
mutiertes
35
Aminosäureaustausch in Position Thr-27 und Ser-35 besitzt (T I/S L).
52
PB1-F2
mit
Ergebnisse
Abb. 5.3.5 Mutationsanalysen zur Identifizierung der PB1-F2 Phosphorylierungsstellen.
(A) Das sPB1-F2-Protein mit einer Aminosäure-Austauschmutation von Serin 35 zu Asparagin (S35N)
wurde in vitro mit S10-Extrakt aus HeLa-Zellen inkubiert und mittels Autoradiogrpahie des 15%igen
SDS Gels analysiert. Die MOCK-Kontrolle verdeutlicht, dass kein Hintergrundsignal vorhanden war.
(B) Transfektion von 293T-Zellen mit entweder dem pCMV-PB1-F2-Wildtyp-Expressionsvektor oder
Mutanten, welche Aminosäure-Austauschmutationen in Position 27, 35 und 84 besitzen oder einer
Doppelmutante für die Positionen 27 und 35. Die Westernblot-Kontrolle unterhalb zeigt die
Proteinmenge der IP in Relation zum Phosphorylierungssignal an.
(C) Radioaktive 32P-Markierung von MDCK-Zellen, welche mit IAVPR8-Wildtyp-Virus oder der
IAVPR8-Mutante T27I/S35L infiziert und 8 h inkubiert wurden. Die Virusprotein-Menge in den
Zelllysaten wurde im Westernblot detektiert. PB1-F2 wurde durch einen spezifischen Antikörper
immunopräzipitiert und mittels Autoradiographie detektiert.
Die Austauschmutationen wurden so gewählt, dass es zu keinen Änderungen im Leserahmen
des pb1-Gens der viralen Polymerase kommen konnte. Die Westernblot-Kontrolle erfolgte
mit Antikörpern, die spezifisch für das virale Nukleoprotein und zelluläres β-Actin sind, um
detektieren zu können, ob die Infektion tatsächlich erfolgt ist und vergleichbare Mengen an
IAV Protein für das Wildtyp-Virus als auch das mutierte Virus vorhanden sind (Abb. 5.3.5C).
Während in Wildtyp-IAVPR8 infizierten Zellen phosphoryliertes PB1-F2 deutlich detektiert
werden kann, zeigte sich im Ansatz mit der Doppelmutante kein Signal, obwohl in beiden
Ansätzen wie in der Westernblot-Kontrolle zu sehen ist, vergleichbare Mengen virales PB1F2 im Zelllysat vorhanden waren. Dieser Befund steht im Einklang mit den zuvor in vitro
erstellten Daten und unterstreicht die zentrale Bedeutung der PKC-Phosphorylierungsstellen
Thr-27 und Ser-35 für PB1-F2 im Kontext IAV infizierter Zellen.
53
Ergebnisse
5.3.6 Die PB1-F2-Phosphorylierungsstelle Serin-35 ist in zahlreichen humanpathogenen
Isolaten konserviert
Nachdem die PB1-F2-Phosphorylierungsstellen identifiziert waren, sollte geklärt werden, ob
diese auch in den Sequenzen anderer humanpathogener Virusisolate zu finden sind, was eine
Voraussetzung für eine generelle biologische Funktion der Phosphorylierung von PB1-F2
wäre. Hierfür wurden 2324 Sequenzen von verschiedenen Isolaten verglichen, die entweder
für das komplette PB1-F2-Protein oder eine verkürzte, ebenfalls häufig auftretende Variante
kodieren (Tab. 2). Es zeigte sich, dass das Serin in Position 35 in den meisten Isolaten
annähernd zu 100% konserviert ist, besonders in dem aktuell zirkulierenden H3N2-Isolat, das
in dieser Analyse mit annähernd 50% aller bekannten Sequenzen vertreten ist, wohingegen
Thr-27 in den H1N1- bzw. H3N2-Isolaten kaum vertreten ist. Auffälligerweise ist in den
wenigen Isolaten, die kein Serin in Position 35 besitzen, das Thr-27 zu 100% konserviert, was
ein Hinweis darauf sein könnte, dass Thr-27 als alternvative Phosphorylierungsstelle dient.
IAV Isolat
H1N1*
90/87A.s.
57A.s.
H1N2
90A.s.
H2N2
90A.s.
H3N2**
90A.s.
H5N1*** 90A.s.
H9N2***90/92A.s.
Anzahl der
Sequenzen
20
343
25
29
1435
102
6
Konservierung von
Thr-27 [%]
85
17,5
0
100
25,7
100
100
Konservierung von
Ser-35 [%]
95
99,7
100
0
94,6
100
100
Tab. 2 Sequenzanalyse der PB1-F2 Phosphorylierungsstellen von humanen IAV Isolaten.
Sequenzabgleich von 2324 Isolaten, welche für humane IAV-Infektionen relevant sind. Die
Konservierung der identifizierten Phosphorylierungsstellen wurde unter Berücksichtigung der
Proteinlänge und der Anzahl der vorhandenen Sequenzen bestimmt. *Die aktuell zirkulierenden
Isolate exprimieren überwiegend ein C-terminal-verkürztes PB1-F2 mit einer Länge von 57 A.s.,
**7,2% der Sequenzen sind kürzer als 90 A.s., ***keine humanen Isolate, aber dennoch relevant, da
direkte Infektionen von Menschen bekannt sind. Diese Analysen wurden zum Teil in Kooperation mit
Dr. Viktor Wray und Hr. Karsten Bruns vom HZI in Braunschweig durchgeführt.
5.3.7 Die Mutation der PB1-F2-Phosphorylierungsstellen resultiert in einer reduzierten
Caspase-3-Aktivierung in primären humanen Monozyten
Um zu überprüfen, ob die Mutation der PKC-Phosphorylierungsstellen einen möglichen
Einfluss auf die zuvor beschriebene und durch PB1-F2-verstärkte Apoptoseinduktion in
monozytären Zellen hat (Chen, Calvo et al. 2001), wurden primäre humane Monozyten mit
dem IAVPR8 Wildtyp-Virus, dem Phosphorylierungsstellen-Mutierten IAVPR8 (T27I/S35L) oder
durch ein PB1-F2-defizientes Virus (PR82xΔF2) in einem Mehrfachansatz infiziert. Zuvor
54
Ergebnisse
wurden die Titer der verschiedenen Virus-Stocklösungen mittels Plaque-Assay bestimmt und
auf eine MOI von 1 normalisiert, um zu gewährleisten, dass alle Ansätze mit der gleichen
Zahl an infektiösen Viruspartikeln infiziert wurden. Im Vergleich zu den MOCK-infizierten
Kontrollzellen konnte in den infizierten Monozyten nach 20 h eine deutlich gesteigerte
Aktivität der apoptotischen Effektorcaspase-3 gemessen werden. Während das Wildtyp-Virus
die maximale Caspase-3-Aktivität induziert, war die Aktivität für das PB1-F2-(T27I/S35L)Phosphorylierungsstellen-mutierte Virus oder die (PR82xΔF2)-Mutante deutlich reduziert
(Abb.5.3.7). Jeder Ansatz wurde achtfach wiederholt um mögliche Fehlerschwankungen
innerhalb
der
Infektionen
oder
der
Caspasen-Aktivitätsmessungen
statistisch
zu
berücksichtigen. Im Gegensatz zu den bisher verwendeten Epithelzelllinien verläuft die
Infektion und IAV-Replikation in Monozyten unproduktiv. Deshalb wurde der Ansatz mit
denselben Stocklösungen und einer höheren MOI von 5 wiederholt, um die zelluläre
Expression von Virusprotein (NP) nach der IAVPR8-Wildtyp-Infektion mit der Proteinmenge
der mutierten Viren im Westernblot vergleichen zu können (Abb. 5.1.7B).
A
B
Caspase 3-Aktivität [RLU]
Caspase 3-Aktivierung in prim ären Monozyten für 20 h
nach einer IAV(PR8) Infektion (MOI 1)
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
Kontrolle
PR8-Wildtyp
PR8PR8ΔPB1-F2
(27+35)PB1-F2
Abb. 5.3.7 Caspase-3-Aktivierung nach der Infektion von primären humanen Monozyten.
(A) Primäre Monozyten wurden mit einer MOI von 1 mit dem PR8-Wildtyp-Virus, einer PB1-F2Virusmutante mit Aminosäureaustausch in Position Thr-27 und Ser-35 oder einer PB1-F2-deletierten
Mutante infiziert und nach 20 h lysiert. Die Lysataktivität der apoptotischen Caspase-3 wurde über ein
spezifisches Substrat mittels Lumineszenz gemessen. (B) Westernblot-Kontrolle infizierter Monozyten
(MOI 5) nach 20 h. Die Expression an viralem Nukleoprotein (NP) ist zu diesem Zeitpunkt bei allen
Virusvarianten vergleichbar.
Die Zelllysate der verschiedenen Ansätze zeigten 20 h nach der Infektion eine quantitativ
vergleichbare NP Expression, was belegt, dass die eingeführten Mutationen keinen
signifikanten Einfluss auf die virale Proteinsynthese oder Replikation haben. Dieses Resultat
55
Ergebnisse
kann als Indiz gewertet werden, dass die PKC-Phosphorylierungsstellen relevant sind für eine
mögliche funktionelle Bedeutung in der PB1-F2-verstärkten Apoptose. Im Gegensatz hierzu
gibt es Befunde, dass die Mutation der PB1-F2-Phosphorylierungsstellen keinen Einfluß auf
die Apoptoseinduktion in MDCK-Zellen hat und auch die IAV-Replikation in diesen Zellen
nur geringfügig und zeitabhängig beeinträchtigt wird (Daten nicht gezeigt).
5.4 Biochemische Charakterisierung der Oligomerisierung des PB1-F2-Proteins
In vorangegangenen Arbeiten unseres Labors konnte mit einem spezifischen Antikörper
gegen PB1-F2 im Westernblot gezeigt werden, dass sowohl sPB1-F2 als auch virales PB1-F2
selbst unter denaturierenden Bedingungen nach der Auftrennung im Standard-SDS-Gel in der
Lage ist, Dimere auszubilden (Henklein, Bruns et al. 2005). Des Weiteren ist bekannt, dass
PB1-F2 mit biologischen Membranen interagiert und zu deren Destabilisierung beiträgt
(Chanturiya, Basanez et al. 2004), was für membraninteragierende, oligomerisierende
Proteine charakteristisch ist und möglicherweise zur pro-apoptotischen Funktion des Proteins
beiträgt (Zamarin, Garcia-Sastre et al. 2005).
5.4.1 Das PB1-F2-Protein zeigt eine deutliche Tendenz zur Ausbildung von Oligomeren
Um das Oligomerisierungsphänomen genauer charakterisieren zu können, wurden molekular
quervernetzende Substanzen, sogenannte chemische Crosslinker verwendet, welche im Falle
einer Protein-Protein-Interaktion eine kovalente Bindung ausbilden, die auch unter den
denaturierenden Bedingungen eines SDS-Gels erhalten bleibt. Die hier verwendeten
chemischen Crosslinker geben bis zu einem 101fachen molaren Überschuss zum jeweiligen
Protein eine spezifische Indikation für eine Interaktion mit potentiellen molekularen
Bindungspartnern (Herstellerangaben). Die Behandlung von sPB1-F2 mit einer Variation an
Crosslinkern resultierte in der Ausbildung von hochmolekularen, deutlich definierten
Multimeren des Proteins bis hin zum Pentamer, welche im Westernblot detektiert werden
konnten (Abb.5.4.1). Alle hier verwendeten Crosslinker, „bis(sulfosuccinimidyl)suberate“
(BS3), „ethylene glycol disuccinate di(N-succinimidyl)ester“ (EGS), „glutaraldehyde“ (GA)
und „disuccinimidyl suberate“ (DSS) generierten ein spezifisches Oligomerisierungsmuster,
welches auch im Crosslinker-Unterschuss (e-g) in der Ausbildung von dimeren (EGS, GA)
oder trimeren (BS3, DSS) Formen des sPB1-F2-Proteins resultierte. Interessanterweise zeigte
sich bei allen Crosslinker-Spezies im 103fachen Überschuss fast kein oder ein nur
abgeschwächtes Bandenmuster (Reihe a), was darauf zurück zu führen ist, dass sich bei
extremer Quervernetzung hochmolekulare Komplexe bilden, die im SDS-Gel nicht mehr
56
Ergebnisse
aufgetrennt werden können, woraus eine reduzierte Signalintensität der verbleibenden
Multimere resultiert (Bruns, Studtrucker et al. 2007).
Abb. 5.4.1 Oligomerisierung von PB1-F2 in Abhängigkeit von verschiedenen chemischen
Crosslinkern. Jeweils 100 ng sPB1-F2 wurde mit verschiedenen Molaritäten der chemischen
Crosslinker BS3, EGS, GA und DSS im Bereich von 103 bis10-3 (a-g) inkubiert, mittels 12%igem
SDS-Gel aufgetrennt und im Westernblot mit einem serumspezifischen Antikörper analysiert.
5.4.2 Das N-terminale PB-(1-40)- und C-terminale PB-(50-87)-Fragment von PB1-F2
besitzt die inhärente Fähigkeit zu oligomerisieren
Das PB1-F2-Protein kann in einen unstrukturierten N-terminalen Teil und eine strukturierte,
α-helikale Region, die sich im C-Terminus von A.s. Ile-55 bis Lys-85 erstreckt, unterteilt
werden (Bruns, Studtrucker et al. 2007). Um eingrenzen zu können, welche der beiden
Regionen des Proteins für das Oligomerisierungsphänomen relevant ist, wurden für weitere
Untersuchungen Peptide verwendet, die entweder die ersten 40 A.s. (PB-(1-40)) oder den Cterminalen und strukturierten Bereich (PB-(50-87)) von PB1-F2 umfassen. Es zeigte sich,
dass das PB-(50-87)-Fragment das größere Potential zur Ausbildung von Oligomeren im
Vergleich zu PB-(1-40) besitzt (Abb. 5.3.2.1). PB-(50-87) war bereits in einem 10fach
molaren DSS-Überschuss in der Lage, Dimere auszubilden, wohingegen PB-(1-40) erst ab
einem 100fachen, unspezifischen DSS-Überschuss Multimere generiert (Abb. 5.4.2.1A). Die
Tendenz des Fragmentes PB-(50-87) zu dimerisieren (Sternmarkierung), war deutlich
57
Ergebnisse
ausgeprägter als bei dem N-terminalen Fragment und bei vergleichbarer Intensität auch noch
im DSS-Unterschuss zu sehen (Abb. 5.3.2.1A, unteres Feld). In einem weiteren Ansatz
wurden bei gleichbleibendem 1-molaren DSS-Überschuss verschiedene Konzentrationen der
Peptide von 100 ng bis 1 µg je Ansatz verwendet (Abb. 5.3.2.1B).
A
B
Abb. 5.4.2.1 Oligomerisierungsmuster der N- und C-terminalen Fragmente von PB1-F2.
(A) PB-(1-40) und PB-(50-87) wurden mit abnehmenden Konzentrationen DSS inkubiert, in einem
12%igen SDS-Gel separiert und im Westernblot mit einem Serumantikörper gegen sPB1-F2 detektiert.
In allen Ansätzen (a-g) wurden 25 ng Peptid aufgetrennt, im Feld unterhalb der PB-(50-87)-Sektion
wurden 50 ng Peptid verwendet. (B) 0,1-1 µg der Fragmente PB-(1-40) bzw. PB-(50-87) wurde mit
einem 1molaren Überschuss-DSS inkubiert, mittels 12%igem SDS Gel aufgetrennt und im
Westernblot analysiert.
Es zeigte sich, dass 400 ng des N-terminalen Fragmentes nötig waren um dasselbe
Oligomerisierungsmuster zu erhalten, wie für 100 ng PB-(50-87). Die Analyse eines
Fragmentes, das den mittleren Bereich des Proteins repräsentiert (PB-(30-70)), zeigte, dass
dieses zwar in der Lage ist, über das einzige Cystein des Proteins in Position 42 Dimere
auszubilden, aber im Vergleich zu den zuvor untersuchten Fragmenten PB-(1-40) und PB(50-87) keine Multimere aufweist (Daten nicht gezeigt). In einem weiteren Experiment sollte
untersucht werden, ob und bis zu welcher Intensität die zuvor beschriebenen N- und Cterminalen Peptidfragmente mit PB1-F2 interagieren können. Hierfür wurden je Ansatz 100
ng sPB1-F2 mit einer äquimolaren Menge an DSS und steigenden Konzentrationen der
58
Ergebnisse
jeweiligen Fragmente inkubiert (Abb. 5.4.2.2A+B). Die Intensität der heterogenen
Bandenmuster nimmt in Abhängigkeit der steigenden Fragmentkonzentrationen zu, wobei das
Peptid PB-(50-87) bereits ab 200 ng die maximale Ausbildung von Heterooligomeren
aufweist (Abb. 5.4.2.2B) und PB-(1-40) die 2,5fache Menge bis zum Intensitätsmaximum
benötigt (Abb. 5.4.2.2A).
A
B
Abb. 5.4.2.2 Fragmentinkubation von sPB1-F2 und Ausbildung von Heterooligomeren.
Zu jeweils 100 ng sPB1-F2 wurden steigende Konzentrationen von PB-(1-40) (A) und PB-(50-87) (B)
zugegeben, mit einer zu sPB1-F2 äquimolaren Menge DSS inkubiert und im Westernblot-Verfahren
analysiert. Die Heterooligomere sind mit einem Pfeil, die PB1-F2-Oligomere mit einem Stern
markiert.
Aus diesen Resultaten kann geschlussfolgert werden, dass sowohl das N-terminale als auch
das C-terminale Fragment zur Multimerisierung tendieren, wobei das Letztere ein höheres
Oligomerisierungspotential besitzt. Die Ergebnisse stimmen mit in silico Daten überein,
welche für den C-Terminus zwei potentielle Oligomerisierungsmotive für A.s. 54-58 und A.s.
68-72 und ein schwächeres Motiv für den N-Terminus mit A.s. 9-13 vorausgesagt hatten
(Bruns, Studtrucker et al. 2007).
59
Ergebnisse
5.4.3 Das Cystein in Position 42 ist durch die Ausbildung von Disulfidbrücken an der
Oligomerisierung von PB1-F2 beteiligt
Das PB1-F2-Protein besitzt nur ein einziges Cystein in Position 42 welches in der Lage wäre,
über seine Sulfhydryl-Gruppe eine Disulfidbindung einzugehen, um zur Selbstassoziation von
PB1-F2 beizutragen. Um den Einfluss dieses Phänomens auf die PB1-F2-Oligomerisierung
analysieren zu können, wurde das Protein in Gegenwart des chemischen Reduktionsmittels
DTT (1 mM) inkubiert und anschließend einer Crosslinker-Reaktion unterzogen (Abb.
5.4.3A). Dieser Ansatz zeigte annähernd dasselbe Oligomerisierungsmuster wie ein paralleler
Kontrollansatz ohne DTT. Die Ausbildung von trimeren und tetrameren Banden war jedoch
unter den stark reduzierenden Bedingungen weniger effizient. In einem weiteren
Kontrollansatz wurde das Experiment mit der 100fachen Menge an sPB1-F2 im Vergleich
zum vorangegangenen Ansatz wiederholt um die Detektion der Oligomere mittels
Coomassiefärbung zu ermöglichen und somit eine zum antikörperbasierten Westernblot
alternative Analyse vornehmen zu können. Die Ansätze wurden mit 2- oder 20fachem
molaren DSS-Überschuss in Gegenwart von β-Mercaptoethanol (βME) oder ohne das
Reduktionsmittel inkubiert. Bereits bei einem 2-molaren DSS-Überschuss zeigte sich das
maximal detektierbare Oligomerisierungsmuster, welches mit dem in der sensitiveren
Westernblot-Methode übereinstimmt, was belegt, dass alle oligomere Strukturen mit dem
Serumantikörper detektiert werden können (Abb. 5.4.3B).
A
B
Abb. 5.4.3 Analyse der PB1-F2 Oligomersierung unter reduzierenden Bedingungen.
(A) Jeweils 100 ng sPB1-F2 wurden mit einem 2fachen molaren Überschuss an DTT inkubiert und
anschließend einer Crosslink-Reaktion mit äquimolaren Mengen DSS unterzogen. Die Auftrennung
der Oligomere erfolgte in einem 12%igen SDS-Gel mit anschließender Detektion durch einen PB1-F2spezifischen Antikörper im Westernblot. (B) 2,5 µg sPB1-F2 wurden mit einem 2- oder 20fachen
Überschuss an DSS inkubiert und in einem 15%igen SDS-Gel unter reduzierenden (ßME) oder nicht
reduzierenden Bedingungen aufgetrennt um mit Coomassie-Blau gefärbt.
60
Ergebnisse
Die hochmolekularen Aggregate im 20fach molaren DSS-Überschuss konnten in diesem
Gelsystem nicht mehr aufgetrennt werden, woraus das abgeschwächte Signal für diesen
Ansatz resultiert. Des Weiteren zeigte sich ein deutlicher Einfluss des Reduktionsmittels βME
auf die Ausbildung von PB1-F2-Dimeren. Im Vergleich zum Standardansatz wurde die
dimerisierende Eigenschaft des Proteins in Gegenwart von βME annähernd neutralisiert,
wohingegen die Ausbildung von Multimeren nicht signifikant beeinträchtigt wurde.
Zusammenfassend wurde gezeigt, dass das Oligomerisierungsphänomen von PB1-F2 sowohl
auf sequenzspezifische Interaktion als auch auf die Ausbildung von Disulfidbindungen
zurückzuführen ist und mit dem C- oder N-terminalen Fragment in Gegenwart von sPB1-F2
Heterooligomere ausgebildet wurden, welche die inhärente Fähigkeit des Proteins zur
Selbstaggregation zusätzlich belegen.
61
Diskussion
6 Diskussion
6.1 PB1-F2, ein viraler Pathogenitätsfaktor und die Frage nach den molekularen
Mechanismen
Es sind bereits sieben Jahre vergangen seit in einem Screening nach MHC-I-Epitopen, die
sich nach einer IAVPR8-Infektion von viralen Polypeptiden ableiten lassen, welche außerhalb
des Standard-Leserahmens exprimiert werden, ein neuartiges Influenza-Protein mit der
Bezeichnung PB1-F2 entdeckt wurde. Seit dieser Zeit wurden zahlreiche Anstrengungen
unternommen, die molekularen Mechanismen der PB1-F2-vermittelten Funktionen zu klären.
Da zunächst beobachtet wurde, dass PB1-F2 eine mitochondriale Lokalisationssequenz
(MTS) besitzt und in den Mitochondrien von transfizierten und infizierten Zellen lokalisiert
ist, wurde angenommen, dass es sich um ein Regulatorprotein der virusinduzierten,
intrinsischen Apoptose handelt, welches pro-apoptotische Eigenschaften besitzt (Chen, Calvo
et al. 2001; Gibbs, Malide et al. 2003; Yamada, Chounan et al. 2004). Tatsächlich konnte in
Pull-down-Experimenten gezeigt werden, dass PB1-F2 mit den Untereinheiten des
mitochondrialen PTPC interagiert (Zamarin, Garcia-Sastre et al. 2005). Scheinbar konträr zu
diesen Befunden wurde berichtet, dass apoptoseverstärkende oder-inhibierende Effekte durch
PB1-F2 in den IAV-relevanten Epithelzelllinien MDCK, MDBK und A549, nach einer
Infektion von PB1-F2-defizientem Virus, im Vergleich zum Wildtyp-Virus nicht detektiert
werden konnten (Chen, Calvo et al. 2001). Dies war bereits ein erster Hinweis, dass die proapoptotischen Effekte des Proteins entweder zellspezifisch oder möglicherweise in Zellkultur
nicht relevant sind. Mitochondrienspezifische Apoptosemarker, welche direkt durch
intrazelluläres PB1-F2 aktiviert wurden, wie z.B. die Freisetzung von Cytochrom-c, konnten
bisher nur in vitro beobachtet werden. Nach der Transfektion von 293T-Zellen wurde ein
apoptoseverstärkender Effekt von PB1-F2 mittels PARP-Spaltung im Westernblot detektiert,
aber nur dann, wenn die Zellen vorher mit apoptotischen Stimuli zusätzlich sensibilisiert
wurden (Zamarin, Garcia-Sastre et al. 2005). Tatsächlich konnte bisher allein durch die
Präsenz von PB1-F2 in Zellkultur keine Apoptoseinduktion nachgewiesen werden, die zur
Generierung der typischen morphologischen Merkmale oder einem deutlich messbaren
Zelltod geführt hätte. Dementsprechend sind die molekularen Mechanismen einer möglichen
intrinsischen Apoptoseinduktion noch vollkommen ungeklärt.
Weiterhin zeigte PB1-F2 nach der Infektion mit dem PR8- oder WSN-Isolat keinerlei Einfluss
auf die IAV-Replikation in Zellkultur oder in der Maus (Zamarin, Ortigoza et al. 2006).
Durch ein attenuiertes, mauspathogenes Virus und einer PB1-F2-depletierten Mutante hiervon
62
Diskussion
konnte gezeigt werden, dass einige Tage nach der Infektion mit dem PB1-F2 defizienten
Virus deutlich weniger Viruspartikel in den Lungen der infizierten Tiere nachweisbar waren,
was auf eine mögliche immunmodulatorische Funktion von PB1-F2 rückschließen lässt.
Dafür spricht auch der Befund, dass der Virustiter-peak in den Lungen infizierter Mäuse, die
mit einem mutierten PR8-Virus infiziert wurden, welches das PB1-F2-Protein der Spanischen
Grippe exprimiert, schneller erreicht wurde als mit dem Wildtyp-PR8-Isolat, aber für beide
Viren zu keinem Zeitpunkt eine höhere Viurslast gemessen werden konnte (McAuley,
Hornung et al. 2007). Dass PB1-F2 für die IAV-Replikation nicht essentiell ist, scheint
schlüssig, da das Protein nicht in allen Isolaten präsent ist und auch nicht hinreichend geklärt
ist, ob die Expression in den PB1-F2-kodierenden Isolaten auch tatsächlich und vergleichbar
erfolgt. Es wird angenommen, dass PB1-F2 möglicherweise für die zellspezifische Zerstörung
alveolarer Makrophagen relevant sein könnte, da ein apoptoseverstärkender Effekt im Kontext
einer Virusinfektion bisher nur in einer monozytären Zelllinie gezeigt werden konnte (Chen,
Calvo et al. 2001; Lowy 2003). Molekulare Mechanismen, welche diese Hypothese stützen,
sowie eine mögliche pro-apoptotische Bedeutung von PB1-F2 im Kontext der Depletion von
Immunzellen, wie sie oftmals bei schwerwiegenden Influenza-Infektionen im Menschen zu
beobachten ist (Criswell, Couch et al. 1979), wurden bisher noch nicht experimentell erbracht.
Neuere Daten bestätigten die Rolle von PB1-F2 als viralen Pathogenitätsfaktor (Conenello,
Zamarin et al. 2007; McAuley, Hornung et al. 2007). Im Mausmodell wurde gezeigt, dass
eine singuläre A.s.-Austauschmutation im C-Terminus von PB1-F2 in Position 66
ausreichend war, um ein IAV-Isolat von moderater Pathogenität in ein hochpathogenes zu
konvertieren. Für dieses Phänomen konnte jedoch bisher keine funktionelle Erklärung
erbracht werden.
Ebenso interessante Daten lieferten die Insertionen von A.s.-Austauschmutationen in die
Sequenz eines vom IAVPR8-Isolat exprimierten PB1-F2-Proteins, das auf diese Weise an ein
PB1-F2-Protein aus einem Isolat der Spanischen Grippe adaptiert wurde. Das so veränderte
Virus zeigte neben gesteigerter Virulenz und Plaquegröße in Zellkultur auch dramatische
Effekte auf die Zerstörung des Lungengewebes von Mäusen im Kontext einer bakteriellen
Koinfektion, was zusammen mit einer erhöten Zytokin- und Chemokindetektion in der
Lungenlavage der Tiere beschrieben wurde (McAuley, Hornung et al. 2007). Trotz der
eindeutig sequenzspezifischen pathogenen Wirkung, die sich für virales PB1-F2 im
Tiermodell zeigt, ist es auch hierfür bisher nicht gelungen, die molekularen Mechanismen, die
für diese Effekte verantwortlich sind, zu klären. Es wurde auch diskutiert, dass die
pathogenen Effekte möglicherweise vollkommen unabhängig von der pro-apoptotischen
63
Diskussion
Funktion des Proteins zu betrachten sind, da keine Verbindung zum induzierten Zelltod und
dem zerstörten Lungengewebe der Versuchstierere hergestellt werden konnte, sondern
vielmehr als nekrotische Auswirkungen der Inflammation beschrieben wurden (McAuley,
Hornung et al. 2007). Nach neuesten Erkenntnissen interagiert PB1-F2 mit der viralen PB1Polymerase (Mazur, Anhlan et al. 2008). Der knock out von PB1-F2 resultierte in einer
reduzierten Polymeraseaktivität und einer kleineren Plaque-Morphologie, zeigte aber
keinerelei Unterschiede im Replikationsverhalten im Vergleich zum Wildtyp-Virus. Es
könnte sich hier wie im Falle der PB1-F2-induzierten Apoptose ebenfalls um einen Effekt
handeln, der in Zellkultur nur schwer zu detektieren ist, da MDCK-Zellen bezüglich der
Virusreplikation optimiert sind (Mazur, Anhlan et al. 2008). Die Infektion mit einer PB1-F2defizienten Mutante resultierte in der verfrühten Translokation des PB1-Proteins in das
Zytoplasma der infizierten Zelle. In diesem Zusammenhang wird spekuliert, dass PB1-F2
durch die gezielte Interaktion mit PB1, dessen Retention im Nukleus steuert, was wiederum
für eine effiziente RNA-Replikation von Bedeutung sein könnte.
Es zeichnet sich zusehends ab, dass PB1-F2 ganz ähnlich wie die akzessorischen Proteine Vpr
(HIV) oder p13 (HTLV) multifunktionell ist. Die Problematik, eindeutige Effekte des
Proteins in Zellkultur zu ermitteln, gestaltet eine funktionelle Aufklärung der molekularen
Mechanismen sehr schwierig und ist eine große aber auch notwendige Herausforderung für
weitere Untersuchungen der PB1-F2-vermittelten Pathogenität.
6.2 Die Expression von PB1-F2 ist zeitlich reguliert
Wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, wurde PB1-F2 nicht nur in Eptihel-Zelllinien,
sondern auch in CD4+-T-Zellen und primären Monozyten exprimiert. Bereits 4 h nach der
Infektion kann virales PB1-F2 im Westernblot detektiert werden, was zunächst in Korrelation
zu der jeweiligen Menge an neusynthetisiertem PB1 zu stehen scheint, welches zu den früh
exprimierten IAV-Genprodukten gezählt wird. Die maximale PB1-F2-Expression ist 6-8 h
nach einer Infektion erreicht, was im Einklang mit den zuvor beschriebenen
Expressionsstudien in infizierten MDBK-Zellen steht (Chen, Calvo et al. 2001). Nach etwa 12
h nimmt die PB1-F2-Expression dramatisch ab (Daten nicht gezeigt) und kann nach 24 h
nicht mehr detektiert werden, obwohl sich die PB1-Synthese kontinuierlich fortsetzt. Dieses
Phänomen scheint einem generellen Mechanismus zu unterliegen, da es sowohl in primären
Zellen (Monozyten) als auch allen hier untersuchten Zelllinien auftritt, wobei die molekulare
Ursache dieser zeitlich regulierten PB1-F2-Expression gänzlich unbekannt ist. Es kann daher
geschlussfolgert werden, dass die Expression von viralem PB1-F2 über mehr Mechanismen
64
Diskussion
reguliert wird als die ursprünglich beschriebene Initiation eines sekundären Start-Codons
(Chen, Calvo et al. 2001). In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Transfektion eines PB1
Expressions- Plasmids in 293T-Zellen ausreichend ist, um eine kontinuierliche PB1-F2Expression zu induzieren, die auch noch nach 24 h nachgewiesen werden kann. Dies ist ein
deutlicher Beleg dafür, dass die PB1-F2-Expression nach einer Infektion entweder durch
virale Faktoren oder zelluläre Faktoren, welche im Kontext der Infektion reguliert werden,
gesteuert wird. Bisher konnte nur das virale PB1-Protein bzw. die Komponenten des
mitochondrialen VDAC (Voltage Dependent Anion Channel) als Bindungspartner von PB1F2 identifiziert werden (Zamarin, Garcia-Sastre et al. 2005; Mazur, Anhlan et al. 2008). Die
PB1-PB1-F2-Interaktion wurde jedoch noch nicht in einen Zusammenhang mit der zeitlich
regulierten Expression von PB1-F2 gebracht. Dass es sich jedoch um eine posttranslationale
Regulation handelt, scheint sehr wahrscheinlich, denn PB1-F2 und PB1 teilen sich die gleiche
mRNA, so dass eine spezifische Herunterregulation der RNA-Synthese auch in einer deutlich
reduzierten PB1-Expression resultieren müsste. Weiterhin wurde gezeigt, dass die zeitlich
regulierte PB1-F2-Expression durch Proteasominhibitoren verlängert werden konnte (Chen,
Calvo et al. 2001). Ob und wie ein gezielter Abbau im Kontext der proteasomalen
Degradierung erfolgt und welche Faktoren dafür verantwortlich sind, bleibt noch Gegenstand
späterer Untersuchungen.
6.3 Exogenes sPB1-F2 zeigt keine zytotoxischen Effekte in Zellkultur
Nach ursprünglichen Angaben ist die Präsenz von 50 nM sPB1-F2 im Zellkulturmedium
ausreichend, um bereits nach 4 h zytotoxische Effekte zu induzieren (Chen, Calvo et al.
2001). Dies könnte auf zwei grundsätzlich unterschiedlichen Wegen geschehen. Zum einen
wäre es denkbar, dass exogenes PB1-F2 durch den Kontakt mit einem Zellmembran-Rezeptor
Signalkaskaden induziert, die letztlich den Zelltod herbeiführen. Andererseits besteht die
Möglichkeit, dass PB1-F2, ähnlich dem Vpr-Protein von HIV, als trojanisches Peptid die
Zellmembran durchdringt und direkt in den Mitochondrien apoptotische Prozesse in Gang
setzt. Dafür würden auch die membrandestabilisierenden Eigenschaften des synthetischen
Proteins sprechen, die zu einer transienten Porenbildung in der inneren und äußeren
Mitochondrienmembran führen können (Chanturiya, Basanez et al. 2004; Zamarin, GarciaSastre et al. 2005). Ebenso wäre es denkbar, dass die Aufnahme von sPB1-F2
rezeptorvermittelt ist. Noch 5 h nach der Inkubation von HeLa-Zellen mit 300 nM sPB1-F2
konnte das Protein in gewaschenen und lysierten Zellen nachgewiesen werden. Auch dimere
Spezies von PB1-F2 wurden im Westernblot detektiert, was zusätzlich für die Funktionalität
65
Diskussion
des synthetischen Proteins spricht, welches die gleichen biochemischen Eigenschaften wie
das virale PB1-F2 aufweist (Henklein, Bruns et al. 2005; Bruns, Studtrucker et al. 2007).
Sogar 25 h nach der Inkubation waren noch Spuren von zellulärem sPB1-F2 zu sehen, was
dafür spricht, dass das Protein ausreichend stabil ist, um eine mögliche exogene Funktion zu
vermitteln. Dennoch konnte in einem Zeitraum von bis zu 50 h keine PB1-F2-vermittelte
Apoptoseinduktion durch Annexinfärung oder zytotoxische Effekte durch parallele
Propidiumiodid-Färbung
gemessen
werden.
Im
Gegensatz
zu
bereits
publizierten
Beobachtungen (Chen, Calvo et al. 2001) konnte im Rahmen dieser Arbeit auch nach
extremer
Erhöhung der sPB1-F2-Konzentration auf bis zu 10 µM oder durch eine
Verlängerung der Inkubationszeit in verschiedenen Zelllinien keine Apoptose gemessen
werden.
Dabei war es überraschend festzustellen, dass sich neben der phosphatidylserinspezifischen
Annexin-V-Färbung und der Caspase-3-Aktivierung auch kein Effekt auf die Änderung des
mitochondrialen Potentiales messen ließ, selbst in der Präsenz von bis zu 10 µM sPB1-F2 und
Kostimulation durch UV-Strahlung, was durch den Mitochondrien-sensitiven Farbstoff JC1
angezeigt wurde. Die Inkubation von Jurkat-Zellen mit sVpr, resultierte deutlich in der
Generierung einer apoptotischen Zellpopulation, wie es bereits zuvor beschrieben wurde
(Sherman, Schubert et al. 2002). Im Gegensatz zum chemischen Stimulus Etoposid, der in
allen Zellen Apoptose induzierte, zeigte sich für sVpr ein zeitabhängiger Effekt, wobei in
Korrelation zur Peptidstabilität die stärkste Induktion bereits nach 8 h Inkubationszeit
gemessen wurde. Mit sPB1-F2 wurde zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Effekt detektiert.
Daher bleibt es bis heute unklar und rein hypothetisch, ob exogenes PB1-F2 in vivo für eine
pathogene Funktion wie z.B. der Depletion von Monozyten im Kontext einer IAV-Infektion
im Lungengewebe verantwortlich ist (Chen, Calvo et al. 2001; Lowy 2003). Andererseits
wurde durch intranasale Applikation von C-terminalem PB1-F2-Peptid in Mäusen das
Lungengewebe der Tiere für eine bakterielle Überinfektion extrem sensibilisiert, was durch
das N-terminate Kontrollpeptid nicht erfolgte (McAuley, Hornung et al. 2007). Der Befund,
dass PB1-F2 alleine nicht in der Lage ist, in Zellkultur Apoptose zu induzieren, wurde durch
später publizierte Daten bestätigt, welche aufzeigten, dass transfiziertes, Plasmid-exprimiertes
PB1-F2 in Epithelzellen keine apoptotische Wirkung zeigt (Zamarin, Garcia-Sastre et al.
2005). Diese Daten wurden durch Aktivitätsmessungen der zellulären Effektorcaspase-3 in
dieser Arbeit bestätigt und belegen, dass PB1-F2 auf den Kontext einer viralen Infektion oder
zellulären Sensibilisierung angewiesen ist, um apoptotische Prozesse zu modulieren. Für
endogen exprimiertes PB1-F2 konnte ein verstärkender Effekt auf die Apoptoseinduktion
66
Diskussion
durch PARP-Spaltung in 293T-Zellen gezeigt werden, wenn diese Zellen zuvor mit
apoptotischen Stimuli behandelt wurden (Zamarin, Garcia-Sastre et al. 2005). Die
Sensibilisierung verschiedener Zelllinien unter Verwendung unterschiedlicher Stimuli und
anschließende Inkubation mit sPB1-F2 resultierte in keiner verstärkten Apoptoseinduktion in
Gegenwart des exogenen Proteins. Daher ist es fraglich, ob PB1-F2 überhaupt
transduzierende Eigenschaften besitzt. Experimente, die eine exakte Unterscheidung zwischen
Zellmembran-assoziiertem und tatsächlich internalisiertem Protein ermöglichen, lieferten
bisher keine eindeutigen Ergebnisse. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass endogenes
PB1-F2 erst durch posttranslationale Modifikationen oder Protein-Interaktionen in einen
funktionellen Zustand versetzt wird, der im Rahmen einer Inkubation mit dem exogenen,
synthetischen Protein nicht gegeben ist. Die Modulation der virusinduzierten Apoptose ist
vermutlich nur eine von zahlreichen Eigenschaften des akzessorischen PB1-F2-Proteins und
scheint zellspezifisch zu sein. Im Kontext einer IAV Infektion der monozytären U937Zelllinie wurden nach Annexin-V-Färbung mehr apoptotische Zellen für ein PB1-F2exprimierendes Virus als für die entsprechende Knock-out-Mutante detektiert. In dieser Arbeit
wurde ebenfalls eine gesteigerte Caspase-3-Aktivität nach der Infektion von PB1-F2exprimierendem Virus in primären, humanen Monozyten gemessen, was für einen deutlich
zellspezifischen Effekt spricht. Im Gegensatz hierzu konnte kein Unterschied auf die
Apoptoseinduktion nach der Infektion von MDCK-Zellen mit dem IAVPR8-Wildtyp-Virus und
einem PB1-F2-deletierten PR8-Virus gemessen werden (Mazur, Anhlan et al. 2008). Daher
scheint es wahrscheinlich, dass pro-apoptotische Funktionen des PB1-F2-Proteins eher im
Kontext der Infektion von Immunzellen zu sehen sind (Lowy 2003), wobei die zentrale
Funktion des Proteins in vivo vermutlich eher in der Regulation der Chemokin- und
Zytokinantwort im Kontext einer bakteriellen Koinfektion liegt als in der Modulation der
Apoptose und diese Effekte möglicherweise sogar getrennt zu sehen sind (McAuley, Hornung
et al. 2007).
6.4 PB1-F2 ist ein Phosphoprotein und wird von der Proteinkinase C phosphoryliert
Nach einer IAV-Infektion werden eine Vielzahl intrazellulärer Signalwege und Faktoren
aktiviert, welche die zellulären Abwehrmechanismen regulieren oder den programmierten
Zelltod induzieren (Ludwig, Pleschka et al. 2006). Um diese Prozesse zu steuern, stehen dem
Influenza-A-Virus nur 11 bekannte Proteine zur Verfügung. Daraus folgt, dass die meisten
Virusproteine multifunktionell sind und posttranslational modifiziert werden. In dieser Arbeit
wurde gezeigt, dass PB1-F2 zu der wachsenden Liste der IAV-Phosphoproteine gehört
67
Diskussion
(Privalsky and Penhoet 1981; Richardson and Akkina 1991; Arrese and Portela 1996; SanzEzquerro, Fernandez Santaren et al. 1998). Erste Hinweise hierfür ergaben sich durch die
Beobachtung, dass PB1-F2 nach der Infektion von MDBK-Zellen in drei dicht nebeneinander
migrierenden Proteinbanden mittels radioaktiver Markierung detektiert werden konnte (Chen,
Calvo
et
al.
2001).
Die
In-silico-Vorhersage,
dass
PB1-F2
vier
potentielle
Phosphorylierungsstellen für die Proteinkinase C besitzt, steht dabei im Einklang mit der
Tatsache, dass die PKC in der frühen Phase nach einer IAV-Infektion aktiviert wird (Arora
and Gasse 1998; Root, Wills et al. 2000), also zu einem Zeitpunkt im Infektionsverlauf, der
parallel mit der maximalen Expression von PB1-F2 korreliert. Weiterhin konnte gezeigt
werden, dass der PKC-Inhibitor BIM den IAV-Eintritt in die Zelle dosisabhängig inhibieren
konnte (Root, Wills et al. 2000). Dabei muss berücksichtigt werden, dass BIM ein potenter
Inhibitor aller PKC Isoformen und im Besonderen für die konventionelle Subfamilie selektiv
ist (Toullec, Pianetti et al. 1991). Die dominante Rolle der konventionellen PKC-Isoformen
wurde inzwischen für frühe und späte Prozesse der IAV-Replikation beschrieben (Arora and
Gasse 1998; Root, Wills et al. 2000; Marjuki, Alam et al. 2006). In Übereinstimmung hierzu
konnte in einem Yeast Two Hybrid Screen die aktive PKCα als potentieller Bindungspartner
von PB1-F2 ermittelt werden (nicht publizierte Daten). Daher ist eine direkte Interaktion von
PB1-F2 mit der PKCα unmittelbar nach der Synthese der frühen Virusproteine sehr
wahrscheinlich. Die für PB1-F2 identifizierten Phosphorylierungsstellen in Position 27 und
35 befinden sich in der zentralen, unstrukturierten Region des Proteins, für die im Gegensatz
zum α-helikalen C-Terminus noch keine bekannte Funktion beschrieben ist. Die Lokalisation
der Phosphorylierungsstellen im unstrukturierten Bereich von PB1-F2 stimmt mit früheren
Untersuchungen überein, die potentielle Phosphorylierungsstellen in der unstrukturierten
Region von Proteinen generell für wahrscheinlicher halten, da hierdurch die maximale
Zugänglichkeit des aktiven Zentrums einer Kinase zum jeweiligen Erkennungsmotiv des
Substratproteins gewährleistet ist (Roach 1991; Blom, Gammeltoft et al. 1999). Weiterhin
wurde berichtet, dass sich besonders in den seit 1950 zirkulierenden H1N1-Isolaten zahlreiche
C-terminal verkürzte 57 A.s.-Varianten des PB1-F2-Proteins befinden (Zell, Krumbholz et al.
2007), welche demnach weder über eine MTS noch eine Oligomerisierungsdomäne verfügen,
aber immer noch beide potentielle Phosphorylierunsstellen besitzen, was im Rahmen der
Sequenzanalysen in dieser Arbeit dargestellt wurde. Annähernd 100% der analysierten
Sequenzen zeigten ein PKC-Motiv mit einem konservierten Serin in Position 35, wohingegen
das Threonin in Position 27 nicht konserviert war und möglicherweise als alternative
Phosphorylierungsstelle dient. Ob die Phosphorylierung von PB1-F2 für die publizierten pro68
Diskussion
apoptotischen Effekte relevant ist (Chen, Calvo et al. 2001; Zamarin, Garcia-Sastre et al.
2005), kann jedoch aus den Sequenzanlaysen nicht geschlossen werden, da die volle Funktion
von PB1-F2 möglicherweise erst durch die mitochondriale Lokalisation des phosphorylierten
Proteins in seiner vollen Länge vermittelt wird. In MDCK-Zellen konnte nach einer Infektion
mit dem IAVPR8-Laborstamm und einer entsprechenden Phosphorylierungsmutante hiervon
mit Austauschmutationen in Position 27 und 35 kein Unterschied bezüglich der
virusinduzierten PARP-Spaltung detektiert werden (nicht publizierte Daten). Im Gegensatz
hierzu konnte die PB1-F2-vermittelte Apoptose durch die effizientere Aktivierung der
apoptotischen Effektorcaspase-3 in primären Monozyten gemessen werden, was die
zellspezifische Rolle dieses Phänomens erneut bestätigt und die Phosphorylierung von PB1F2 als möglicherweise funktionell relevant für die Apoptoseinduktion in Immunzellen
erscheinen läßt. Dass die PB1-F2-Phopshorylierung auch intrazellulär mit der PKC im
Zusammenhang steht, konnte nach der Applikation von PMA zu PB1-F2 transfizierten 293T
Zellen gezeigt werden. Die Zugabe von PMA resultierte in einem verstärkten radioaktiven
Phosphorylierungssignal im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen. Dieses Ergebnis kann auf
die Aktivierung der konventionellen PKC-Isoformen zurückgeführt werden, die erst durch
Phorbolesterstimulation ihre volle Aktivität entfalten (Li and Gobe 2006). Komplementiert
wurde der Befund durch die signifikante Inhibition der PB1-F2-Phosphorylierung in
Gegenwart von Staurosporin, einem unspezifischen, aber potenten Inhibitor aller PKCIsoformen, sowie einem deutlich reduzierten Phsophorylierungssignal nach der Applikation
von BIM. Für eine direkte Interaktion zwischen der PKC und PB1-F2 spricht auch die starke
in-vitro-Phosphorylieung von PB1-F2 durch PKC-Extrakt aus Rattenhirn, welches sich
überwiegend aus den konventionellen Isoformen zusammensetzt (Kikkawa, Go et al. 1986)
und in der Lage war, sPB1-F2 vom PR8-Isolat und von einem Isolat der Spanischen Grippe
zu phopshorylieren. Die zentrale Rolle der PKC konnte weiterhin durch die dosisabhängige
Inhibition des durch S10-Extrakt phosphorylierten Proteins bestätigt werden, wohingegen der
Kontrollinhibitor Wortmannin selbst in hohen Konzentrationen keinerlei Einfluss auf das
Phosphorylierungssignal hatte.
Die Kinasen der PKC-Familie sind in eine Vielzahl von Signalwegen und zellulären
Funktionen involviert, wie z.B. der Proliferation, Differenzierung und Apoptose (Li and Gobe
2006). Im Gegensatz zur ursprünglichen Annahme, dass die Translokation der PKC zur
Zytoplasmamembran eine Voraussetzung für deren Aktivierung und die darauf folgende
Substratphosphorylierung
ist,
konnten
die
verschiedenen
PKC-Isoformen
in
den
unterschiedlichsten zellulären Kompartimenten gefunden werden, wie z.B. im Zytosol
69
Diskussion
(Ahmad, Lee et al. 1984), am Zytoskelett (Nishikawa, Hidaka et al. 1983) und im Zellkern
(Patskan and Baxter 1985). Nach einer Infektion ist PB1-F2 sowohl in den Mitochondrien als
auch im Zytoplasma und im Nukleus der Zellen lokalisiert (Chen, Calvo et al. 2001). Die
nukleäre Lokalisation des Proteins ist von mindestens einer viralen Komponente abhängig, da
transfiziertes PB1-F2 ausschließlich in den Mitochondrien der Zellen zu finden ist. Dies
schließt jedoch nicht aus, dass die Phosphorylierung von PB1-F2 möglicherweise für eine
Funktion im Zellkern von Bedeutung ist. In einer anderen Arbeitsgruppe konnte gezeigt
werden, dass die Mutation der Phosphorylierungsstellen in Position 27 und 35 in einem PB1F2-exprimierenden rekombinanten PR8-Virus in einer eingeschränkten Replikation in
MDCK-Zellen zwischen 24 h und 36 h nach der Infektion resultiert (nicht publizierte Daten).
Diese Beobachtung steht im Widerspruch zu bisherigen Publikationen, die für das PB1-F2Protein aus dem WSN- und PR8-Isolat keinen Einfluss auf die Replikation feststellen konnten
(Zamarin, Ortigoza et al. 2006). Da PB1-F2 ein multifunktionelles Protein ist, kann davon
ausgegangen werden, dass es sowohl replikationsfördernde, als auch beschränkende
Funktionen besitzt. Im Falle der PB1-F2-defizienten Viren sind beide Eigenschaften
möglicherweise aufgehoben, woraus kein messbarer Einfluss auf die Virusreplikation
resultiert. Die PB1-F2-Phosphorylierung hat möglicherweise eine replikationfördernde
Funktion, die in den Viren welche für die Phosphorylierungsstellen mutiert sind nicht mehr
vorhanden ist, so dass replikationsbeschränkende Eigenschaften von PB1-F2 überwiegen. Die
funktionelle Bedeutung der PB1-F2-Phosphorylierung durch die PKC bleibt noch Gegenstand
weiterer Untersuchungen und könnte ein erster Schritt sein, um die in vivo vermittelte
Pathogenität des Proteins auf molekularer Ebene zu klären.
6.5 PB1-F2 besitzt die intrinsische Eigenschaft, Oligomere auszubilden
NMR-Analysen zeigten, dass PB1-F2 eine ausgeprägte Tendenz zur Selbstassoziation in
wässriger Lösung besitzt und erst unter zunehmend hydrophoben Lösungsbedingungen αhelikale Abschnitte stabilisiert werden (Bruns, Studtrucker et al. 2007). Bisher ist es nicht
gelungen, größere Mengen des rekombinanten Proteins herzustellen, wie es vor allem für
Strukturanalysen nötig wäre. Zur Untersuchung des PB1-F2-Oligomerisierungsphänomens
wurde das synthetische Protein benutzt, da es eine Reihe von Vorteilen für diese Studien
aufweist. Zunächst kann es mit einer Länge von 87 A.s. mittels chemischer
Festphasensynthese hergestellt werden (Henklein, Bruns et al. 2005), und störende
Verunreinigungen, wie sie im Kontext einer klassischen Aufreinigung von rekombinantem
Protein auftreten könnten, sind weitestgehend ausgeschlossen. Weiterhin zeigt das
70
Diskussion
synthetische Protein die gleichen biochemischen Eigenschaften wie das virale PB1-F2 aus
dem PR8-Isolat, einschließlich der Fähigkeit, selbst unter den denaturierenden Bedingungen
eines SDS-Gels noch dimere und sogar trimere Strukturen auszubilden (Henklein, Bruns et al.
2005). Nach einer Mikroinjektion ist sPB1-F2 in den Mitochondrien lokalisiert (Chen, Calvo
et al. 2001) und besitzt die Fähigkeit, Mikroporen in einer physiologischen Membran
auszubilden und transmembrane Konduktivität zu generieren (Chanturiya, Basanez et al.
2004). Daher kann man davon ausgehen, dass sPB1-F2 vergleichbare biochemische
Eigenschaften besitzt wie das virale Protein.
Die chemischen Crosslink-Studien belegen, dass der N-terminale (PB-(1-40)) und der Cterminale (PB-(50-87)) Abschnitt von PB1-F2 die inhärente Fähigkeit besitzt zu
multimerisieren.
Das
zentrale
Fragment
PB-(30-70)
zeigt
keine
Tendenz
zur
Oligomerisierung, trägt aber durch einen Cystein-Rest in Position 42 zur ausgeprägten
Dimerisierung von PB1-F2 bei. In-silico-Analysen zeigten, dass sich eine schwächere
Oligomerisierungsdomäne (A.s. 9-13) im N-Terminus und eine starke Domäne (A.s. 68-72) in
der C-terminalen Region des Proteins befindet (Bruns, Studtrucker et al. 2007). Dieser
Befund stimmt mit den Daten der Crosslink-Studien überein, da die Multimerisierung von
PB-(50-87) bereits bei 10fach weniger DSS zu sehen war als für das N-terminale Fragment.
Interessanterweise war das C-terminale Fragment in der Lage, mit dem Gesamtlängenprotein
(PB1-F21-87) zu interagieren und intermediäre Spezies auszubilden. Dass dieses Ergebnis von
biologischer Relevanz sein könnte, wird durch in vivo Daten bestätigt, die aufzeigen, dass
nach einer IAVPR8-Infektion von MDCK-Zellen und anschließender radioaktiver
35
S-
Markierung neben der 10-kD-Hauptbande eine 6-kD-Spezies zu sehen ist, die als ein Cterminales Fragment von PB1-F2 identifiziert wurde (Zamarin, Ortigoza et al. 2006). Dieses
Fragment wird durch ein Start-Codon downstream des ursprünglich beschriebenen Codons
von PB1-F2 gebildet und konnte mit dem viralen PB1-F2 koimmunopräzipitiert werden, was
mit der in den Crosslink-Studien ermittelten starken Multimerisierungstendenz des Cterminalen Fragmentes übereinstimmt. Weiterhin wurde die starke Tendenz von PB1-F2 zu
oligomerisieren auch in dem Kontext seiner pro-apoptotischen Funktion diskutiert (Zamarin,
Garcia-Sastre et al. 2005). Neben der Fähigkeit des Proteins, mit beiden Untereinheiten des
VDAC zu interagieren, wäre es denkbar, dass es durch Multimerisierung zur Ausbildung von
Poren in der mitochondrialen Membran kommt und so die Destabilisierung des
Mitochondrienpotentials induziert wird. Sequenzanalysen haben ergeben, dass die
Ladungsverteilung innerhalb des helikalen C-Terminus von PB1-F2 diese Voraussetzung
erfüllt, indem das Protein in eine kationische, der negativen Membranoberfläche zugewandte
71
Diskussion
Seite und eine anionische, sterisch abgewandte Region, die mit einem potentiellen zweiten
PB1-F2-Molekül interagiert, eingeteilt werden kann (Bruns, Studtrucker et al. 2007). Die
biologische Funktion der PB1-F2-Multimerisierung ist noch nicht geklärt und wird sicherlich
noch Gegenstand späterer Untersuchungen sein. Die bisherigen Daten legen die Vermutung
nahe, dass PB1-F2 in die Gruppe der Viroporin-Proteine eingeteilt werden kann. Dabei
handelt es sich definitionsgemäß um Virusproteine, die den Durchtritt von Ionen und
kleineren Molekülen durch Membranen vermitteln (Gonzalez and Carrasco 2003). Sie sind in
fast allen Familien zu finden wie z.B. das M2-Protein der Orthomyxoviridae, Vpu vom HIV-1
der Retroviridae oder das 2B-Protein der Picornaviridae. Mit Ausnahme des M2-Proteins
sind diese Proteine für den Replikationszyklus meist nicht relevant oder deren Funktion
diesbezüglich, ähnlich wie bei PB1-F2, nicht geklärt. Des weiteren besitzt PB1-F2
Ähnlichkeit mit dem mitochondrialen Bax-Protein, einem pro-apoptotischen Vertreter der
Bcl-2 Familie, welches ebenfalls oligomere Strukturen ausbildet (Wei, Zong et al. 2001;
Chanturiya, Basanez et al. 2004). Leider war es bisher schwierig, PB1-F2-vermittelte-proapoptotische Effekte in Zellkultur zu studieren (Zamarin, Garcia-Sastre et al. 2005; Zamarin,
Ortigoza et al. 2006), wodurch neben der Entschlüsselung der molekularen Mechanismen
auch die Relevanz des Oligomerisierungsphänomens noch ungeklärt ist. Daher ist es nicht
verwunderlich, dass sich in diesem Forschungsbereich in den vergangenen Jahren die
deutliche Tendenz abzeichnete, in-vivo-Systeme im Mausmodell zu etablieren, um die
Bedeutung dieses Pathogenitätsfaktors zu klären, der immer öfter im Kontext der
dramatischen Auswirkungen hochpathogener Isolate erwähnt wird (Conenello, Zamarin et al.
2007; McAuley, Hornung et al. 2007; Basler and Aguilar 2008).
72
Abkürzungen
7.
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
α
Alpha
A.s.
Aminosäuren
Amp
Ampicillin
ATP
Adenosintriphosphat
β
Beta
βME
2-Mercaptoethanol
BIM
Bisindolylmaleimid
bp
Basenpaar
BS3
bis(sulfosuccinimidyl)suberate
BSA
Rinderserum Albumin
bzw
Beziehungsweise
°C
Grad Celsius
Ca2+
Calcium-Ion
CK-2
Casein-Kinase-2
CMV
Zytomegalovirus
ddH2O
Doppelt deionisiertes Wasser
D-MEM
Dulbecco’s modified eagle medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleosid-5’ –triphosphat
DSS
Disuccinimidyl suberate
DTT
Dithiotreithol
ECL
enhanced chemoluminescence
EGS
ethylene glycol disuccinate di(N-succinimidyl)ester
FKS
Fötales Kälberserum
FACS
Fluoreszenz-Aktivierter-Zellsortierer
g
Gramm
GA
glutaraldehyde
h
Stunde
HA
Hämagglutinin
H2O2
Wasserstoffperoxid
H7
1-(5-Isoquinolinesulfonyl)-2-methylpiperazine
IAV
Influenza-A-Virus
73
Abkürzungen
kDa
Kilodalton
l
Liter
Lsg.
Lösung
µ
Mikro
µl
Mikroliter
µCi
Mikrocurie
µM
Mikromolar
m
Milli
M
Molar
M1
Influenza-Matrix-Protein 1
M2
Influenza-Matrix-Protein 2
MEM
Minimal essential medium
min
Minute
ml
Milliliter
mM
Millimolar
MOI
Multiplicity of infection (infektiöse Viruspartikel pro Zelle)
MTS
Mitochondriale Lokalisierungssequenz
mU
Milliunits
NA
Neuraminidase
ng
Nanogramm
NP
Nukleoprotein
OD
Optische Dichte
ORF
Open Reading Frame
PB1
Influenza „basische Polymerase 1“
PB1-F2
Influenza “basische Polymerase 1, offener Leserahmen 2”
PBS
Phosphate buffered saline
pfu
Plaque forming units
pH
potentia Hydrogenii, Säurestärke
PI3
Phosphoinositol-3-Kinase
PKC
Protein-Kinase C
PMA
Phorbol-Myristyl-Acetat
PR8
Influenza A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
PTPC
Permeability transition pore complex
Rpm
Umdrehungen pro Minute
74
Abkürzungen
RNP
Influenza-Ribonukleoprotein-Komplex
RT
Raumtemperatur
SDS
sodium dodecyl sulfate
Sek
Sekunden
sPB1-F2
synthetisches PB1-F2
STS
Staurosporin
Tab.
Tabelle
Tris
Tris (hydroxymethylmethan) aminomethan
ÜN
über Nacht
VDAC
Voltage Dependent Anion Channel
Vpr
Virales Protein R (HIV)
WSN
William Smith (Neurotropic), (Virusisolat von 1933)
Kurzschreibweise der Aminosäuren:
Ala (A) Alanin
Gly (G) Glycin
Pro (P) Prolin
Arg (R) Arginin
His (H) Histidin
Ser (S) Serin
Asp (D) Asparaginsäure
Ile (I) Isoleucin
Thr (T) Threonin
Asn (N) Asparagin
Leu (L) Leucin
Trp (W) Tryptophan
Cys (C) Cystein
Lys (K) Lysin
Tyr (Y) Tyrosin
Glu (E) Glutaminsäure
Met (M) Methionin
Val (V) Valin
Gln (Q) Glutamin
Phe (F) Phenylalanin
75
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Danksagung
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Ulrich Schubert möchte ich für die Betreuung der Promotionsarbeit herzlichst
danken. Besonders hervorheben möchte ich dabei seine fachliche Unterstützung bei der
Erstellung der Veröffentlichung dieser Arbeit sowie die großartigen Rahmenbedingungen, die
einen erfolgreichen Abschluss der Promotion ermöglicht haben.
Herrn Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein danke ich für die Möglichkeit zur Promotion am
Institut für Klinische und Molekulare Virologie.
Herrn Prof. Dr. Andreas Burkovski danke ich für seine Bereitschaft zur Begutachtung dieser
Arbeit. Ebenso danke ich dem Prüfungsvorsitzenden Hr. Prof. Dr. Fritz Titgemeyer, dem
Vorsitzenden der Prüfungskomission Prof. Dr. Eberhard Bänsch für die Genehmigung der
Promotion sowie Herrn PD Dr. Robert Slany für die Bereitschaft zur Prüfung.
Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Nicole Studtrucker für die experimentelle Einarbeitung
und Unterstützung im Rahmen dieser Promotion. Ihr kollegiales und freundliches Verhalten
sowie die zahlreichen wissenschaftlichen Diskussionen waren eine wertvolle Hilfe.
Weitherhin möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Stephan Ludwig sowie seinen Mitarbeitern
Dr. Igor Mazur, Dr. Anhlan Darisuren, Frau Sabine Dudek sowie Frau Ludmilla Wixler für
eine großartige Kooperation bedanken, die entscheidend zum Erfolg dieser Arbeit beigetragen
hat. In gleicher Weise möchte ich Dr. Peter Henklein, Herrn Rene Roeder, Dr. Viktor Vray,
Herrn Karsten Bruns, Dr. Josef Wissing und Herrn Uwe Tessmer danken.
Meinen Kollegen vom Institut für Klinische und Molekulare Virologie sowie den Kollegen
der Virologik GmbH in Erlangen danke ich für die freundliche Zusammenarbeit und die
schöne Zeit, die wir gemeinsam verbringen konnten. Für die fachliche Unterstützung und
Diskussion danke ich ganz besonders Herrn Dr. Andreas Goldwich, Herrn Jörg Votteler, PD
Frank Neipel, Herrn Friedrich Hahn, Herrn André Eißman, Frau Annette Maczurek, Frau
Danijela Cvijetic, Herrn Torsten Walther, Frau Jana Pforr, Frau Sabine Hahn, Frau Liane
Neumann und Frau Ingrid Hercegfi und Herrn Dr. Völk.
Vielen Dank auch meinen Eltern, Geschwistern und Freunden, die mir in dieser Zeit
immerwährend zur Seite standen.
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Lebenslauf
Geburtsdaten:
Familienstand:
Staatsangehörigkeit:
Schulbildung
1981 – 1982
1982 – 1987
09/1987 – 06/1992
09/1992 – 07/1996
Zivildienst
11/1996-10/1997
Studium
11/1997-06/2003
10/2003-06/2007
Seit 07/2007
16.06.1975 in Lichtenfels (Bayern)
ledig
deutsch
Deutsche Grundschule Bagdad, Irak.
Pater Lunkenbein Volksschule in Ebensfeld.
Staatliche Realschule in Staffelstein.
Abschluss: Mittlere Reife (kaufm. Zweig).
Gymnasium Theresianum in Bamberg.
Abschluss: Abitur (Note 2,0)
Malteser Hilfsdienst in Bamberg
Biologie
Friedrich-Alexander-Universität in Erlangen
Hauptfach: Biochemie.
Diplomarbeit (November AG, Erlangen):
Thema: „Molekularbiologischer und
immunologischer Nachweis von Oligomeren
in einem technischen System“
Abschluss: Diplom Biologe
Note: 1,2
Promotion am Institut für Klinische und
Molekulare Virologie, der Friedrich-AlexanderUniversität in Erlangen.
Abschluss der Promotion in der ViroLogik
GmbH in Erlangen, Koordination des
Projektbereichs Influenza und Evaluierung
antiviraler Substanzen in Erlangen.
Publikationen:
Bruns, K., N. Studtrucker, et al. (2007). "Structural characterization and oligomerization of
PB1-F2, a proapoptotic influenza A virus protein." J Biol Chem 282(1): 353-63.
Mazur, I., D. Anhlan, et al. (2008). "The proapoptotic influenza A virus protein PB1-F2
regulates viral polymerase activity by interaction with the PB1 protein." Cell
Microbiol.
David Mitzner, Igor Mazur, et al. (2008). „Phosphorylation of the influenza A virus PB1-F2
protein by PKC is required for efficient virus propagation.”Cell Microbiol.
Eingereichte Publikation.
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