PowerPoint bemutató

Mikroskopie II.
Szilvia Barkó
2016
Zusammenfassung der Vorlesung
 Fluoreszenzmikroskopie
 Fluorophoren
 Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops
 Konfokalmikroskopie
 Evaneszentfeldmikroskopie
 Multiphotonenmikroskopie
 Höchstauflösungsmikroskopie
 STED
 SIM
www.medizin.pte.hu
Jablonski-Schema
www.medizin.pte.hu
Fluoreszenzmikroskopie
http://www.olympusmicro.com/primer/lightandcolor/fluorointroduction.html
www.medizin.pte.hu
Fluorophoren
http://columbiabiosciences.homestead.com/dylightdyes.html
http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_and_secondary_antibodies
http://www.rcsb.org/pdb/101/static101.do?p=education_discussio
n/educational_resources/GFP_activity.html
www.medizin.pte.hu
Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops
www.medizin.pte.hu
Klassische mikroskopische Methoden I.
Konfokale Mikroskopie (LSCM)
www.medizin.pte.hu
3D Bild eines Pollenkorns
http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/confocalintro.html
www.medizin.pte.hu
Klassische mikroskopische Methoden
II. Total Internal Reflection Fluorescence
(TIRFM)=Evaneszenzfeldmikroskopie
Pubs.rsc.org
www.medizin.pte.hu
Totalreflexion
www.medizin.pte.hu
α
1
2
β
1
𝑠𝑖𝑛𝛼 𝑛2
=
𝑠𝑖𝑛𝛽 𝑛1
2
1
2
www.medizin.pte.hu
Die Intensität des evaneszenten elektrischen
Kraftfeldes nimmt senkrecht zur Grenzfläche
zwischen den beiden Brechmedien
exponentiell ab:
http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/tirf/tirfintro.html
z: der Abstand von der Grenzfläche
d: die Eindringtiefe bei Wellen, die unter einem
größeren als dem kritischen Winkel einfallen
http://cammer.net/historical/aif/instructions/tirf/index.htm
www.medizin.pte.hu
Multiphotonenmikroskopie
Normale Fluoreszenz
Multiphoton Fluoreszenz
1 kurzwelliges Anregungsphoton
≥ 2 langwellige Anregungsphotonen
1 langwelliges Emissionsphoton
1 kurzwelliges Emissionsphoton
https://www.univie.ac.at/mikroskopie/3_fluoreszenz/fluoreszenz_mikroskop/5d_multiphoton.htm
www.medizin.pte.hu
Jablonskidiagramm für 1 und 2-Photonen-Anregung von Molekülen vom
Grundzustand S0 in höhere Singulett Niveaus (S1,S2).
hvA ist die Energie eines Photons bei Ein- bzw Zwei-Photonen-Anregung,
hvF die Energie des induzierten Fluoreszenzphotons und hvP die Energie eines
Phosphoreszenzphotons nach Intersystem-Crossing.
http://www.biophotonics.uni-hannover.de/a2biophotonik.html
www.medizin.pte.hu
Höchstauflösungsmikroskopie
www.medizin.pte.hu
Stimulated Emission Depletion
(STED)
Nobelpreis für den Vater der Höchstauflösungsmikroskopie
Stefan Hell 2014
www.medizin.pte.hu
 Stimulierte Emission: Ein Lichtquant trifft
auf ein Atom, das sich bereits im
angeregten Zustand befindet.
 Unter Aussendung von zwei
Lichtquanten kann das Atom in den
Grundzustand zurückzukehren.
 Die beiden Photonen (Lichtquanten) sind
exakte Kopien des eingefallenen
Photons: Dadurch entsteht eine
Vervielfältigung einer
quantenphysikalisch genau bestimmten
Sorte von Photonen.
www.medizin.pte.hu
Übersättigung
 Übersättigen der Abregung bedeutet,
dass eine höhere Intensität verwendet
wird als die zu einer weitgehenden
Abregung des Markers gebraucht
wird.
 Die Population des angeregten
Zustands und somit nimmt die
Fluoreszenz exponentiell mit der
Intensität des stimulierenden
Lichtstrahls ab.
 Wenn eine bestimmte
Schwellenintensität überschritten ist,
ist das Abregen quasi komplett.
http://www.mpg.de/815357/forschungsSchwerpunkt?c=166398&force_lang=de
https://www.youtube.com/watch?v=uyMZPFTcXG4
www.medizin.pte.hu
www.medizin.pte.hu
www.medizin.pte.hu
Structured Illumination Mikroskopie (SIM)
 Eine strukturierte Beleuchtung wird benutzt (Interferenzeffekt,
Moire-Effekt).
 Die fluoreszierende Probe wird mit einem Streifenmuster
angestrahlt.
Überlagerung des bekannten Gittermusters und der unbekannten Struktur.
www.medizin.pte.hu
http://www.laborwelt.de/spezialthemen/mikroskopie/3d-zeitserien-live.html
Aktin-Zellskelett (rot) und mit Clathrin überzogene Vesikel (CCV, grün) in einer HeLaZelle, abgebildet mit klassischer Weitfeldmikroskopie (a) und Mikroskopie mit
strukturierter Beleuchtung (b). Farbstoffe: Lifeact-tdTomato zur Visualisierung von FAktin, Clathrin-mEmerald zur Visualisierung der CCV. Maßstabsleiste: 5 Mikrometer.
www.medizin.pte.hu