Klonierung von Matrix- metalloproteinasen und deren Expressions

Forschungszentrum Karlsruhe
Technik und Umwelt
Wissenschaftliche Berichte
FZKA 55518
Klonierung von Matrixmetalloproteinasen
und deren Expressionsmuster in der Maus
AP-1 (Fos/Jun)- abhängige
Expression von Kollagenase I
im Knochen
S. Gack
Institut für Genetik -
Februar 1995
Forschungszentrum Karlsruhe
Technik und Umwelt
Wissenschaftliche Berichte
FZKA 5551 B
Klonierung von Matrixmetalloproteinasen und deren
Expressionsmuster in der Maus
AP-1 (Fos/Jun)- abhängige Expression von Kollagenase I
im Knochen
Sabine Gack
Institut für Genetik
Dissertation, genehmigt von
der naturwissenschaftlich-mathematischen Gesamtfakultät
der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg
Forschungszentrum Karlsruhe GmbH, Karlsruhe
1995
Als Manuskript gedruckt
Für diesen Bericht behalten wir uns alle Rechte vor
Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Postfach 3640, 76021 Karlsruhe
ISSN 0947-8620
ZUSAMMENFASSUNG
Die Extrazelluläre Matrix (ECM) übernimmt im Organismus die Funktion der strukturellen und
mechanischen Unterstützung und dient zusätzlich als Barriere zwischen verschiedenen Zellen
bzw. Organen. Aufgrund dessen ist für ihre Aufrechterhaltung ein dynamisches Gleichgewicht
zwischen Synthese und Abbau der Matrixkomponenten erforderlich.
Matrixmetalloproteinasen (MMPs) sind für den spezifischen Abbau der einzelnen Komponenten
der ECM verantwortlich. Aus diesem Grund sind diese Enzyme in weitem Umfang am ECMUmbau im Organismus beteiligt. Besonders während embryonalen Prozessen, wo ein intensiver
Gewebeumbau stattfindet, wird auch eine hohe MMP-Expression erwartet.
In der Zellkultur konnten die Substratspezifitäten und die Expression in verschiedenen Zelltypen,
auch als Antwort auf extrazelluläre Stimuli, für MMPs der Spezies Mensch, Ratte und
Kaninchen gezeigt werden. Ob diese "in vitro" identifizierten Eigenschaften dieser Enzyme auf
die Situation des Gesamtorganismus zu übertragen sind, konnte bisher noch nicht nachgewiesen
werden.
In der vorliegenden Arbeit ist die Klonierung der mausspezifischen MMPs Stromelysin 1,
Stromelysin 2, Kollagenase I und 72 kD Kollagenase IV gelungen. Mit Hilfe dieser cDNA
Proben konnte die gewebespezifische Expression der vier Metalloproteinasen im Embryo und im
adulten Organismus nachgewiesen werden. Im embryonalen Gewebe wird Kollagenase I und
Kollagenase IV (72 k:D), nicht aber Stromelysin 1 und Stromelysin 2 exprimiert. Während
Kollagenase IV (72 k:D) Transkripte in vielen Geweben mesenchymalen Ursprungs gefunden
wurden, ist Kollagenase I ganz spezifisch im sich entwickelnden Knochengewebe exprimiert. Im
Gegensatz zum embryonalen Gewebe ist im adulten Organismus eine Expression von
Stromelysin 1 und Stromelysin 2 nachweisbar. Dabei werden Stromelysin 1 und Kollagenase IV
in Herz und Lunge koordiniert exprimiert. Eine basale Stromelysin 2 Expression ist in jedem der
untersuchten Gewebe, außer im Hoden nachweisbar, und ist vor allem im Herz und in der Niere
deutlich. Hohe Transkriptmengen an Kollagenase I findet man im Muskel, der Niere und im
Knochen; geringere Mengen sind im Herz, der Milz und der Lunge zu beobachten. Dieses
Expressionsmuster unterscheidet sich deutlich von dem der anderen drei MMPs.
Obwohl Kollagenase I, Stromelysin 1 und Stromelysin 2 im Zellkultursystem durch
extrazelluläre Substanzen sehr ähnlich reguliert werden, geben diese Unterschiede in der
Expression im Gesamtorganismus einen deutlichen Hinweis auf eine spezifische Funktion der
einzelnen MMPs beim Abbau verschiedener Komponenten der ECM. Die AP-1 (cJun/cFos)abhängige Expression konnte in Zellkultur für die MMPs Stromelysin 1, Stromelysin 2 und
Kollagenase I der Maus bestätigt werden. Die Existenz von transgenen Mäusen, bei denen die
Expression einer Komponente des Transkriptionsfaktors AP-1, das c-jos Gen, verändert war, bot
die Möglichkeit, die AP-1 (c-jos)- abhängige Expression der MMPs in Bezug auf den
Gesamtorganismus zu untersuchen. Unter "in vivo" Bedingungen zeigte sich Kollagenase I als
einzige der klonierten MMPs als AP-1-abhängige Metalloproteinase. In Mäusen, die einen
induzierbaren c-jos Expressionsvektor als Transgen tragen, findet man sechs Stunden nach
Induktion eine erhöhte Kollagenase I Expression in der Milz, dem Thymus, der Leber und im
Knochen. Interessanterweise korrelierten die Gewebe mit einer erhöhten Kollagenase Expression
mit den Geweben, die infolge einer langzeitig erhöhten c-jos Expression in transgenen Mäusen
phänotypische Veränderungen aufweisen. Für das veränderte Knochengewebe in c-jos transgenen
Mäusen konnte gezeigt werden, daß im Vergleich zum normalen Knochengewebe von Wildtyp
Mäusen auch hier die Kollagenase I Expression um mehr als 100-fach erhöht ist. Auch c-josdefiziente Mäuse zeigen erhebliche Störungen in ihrer Knochenentwicklung. Im Gewebe dieser
Tiere gehen die phänotypischen Veränderungen mit einer veränderten, in diesem Falle
reduzierten, Kollagenase I Expression einher.
Ob Kollagenase I für die Entstehung bzw. die Aufrechterhaltung des veränderten Phänotyps,
ausgelöst durch das c-jos Transgen oder die c-jos Null-Mutation, verantwortlich ist, bleibt zu
zeigen. Kollagenase I könnte jedoch als Markergen für pathologische Veränderungen, vor allem
der Knochenhomöostase, dienen.
ABSTRACT
Cloning of matrix metalloproteinases and their expression pattern in the mouse.
AP-1 (Fos/Jun)- dependent expression of collagenase I in the bone
The extracellular matrix (ECM) functions as structural and mechanical support in the organism
and additionally serves as a barrier between different cell types and organs. The maintenance of
a dynamic equilibrium between synthesis and degradation of matrix components is therefore
necessary. Matrix metalloproteinases (MMPs) are responsible for the specific degradation of the
respective components of the ECM. These enzymes are thus involved in ECM remodelling.
During embryonie processes, where an especially intense tissue remodeHing occurs, a high
expression of MMPs is expected. In cell culture, substrate specificities and expression of MMPs
in different cell types and in response to extracellular stimuli, has been shown in human, rat and
rabbit. Whether the in vitro properties of these enzymes are transferable to the in vivo situation
has not been shown so far.
In the work presented here, the cloning of the mouse specific MMPs Stromelysin 1, stromelysin
2, collagenase I and the 72 kD collagenase IV was achieved. With these cDNA probes, the tissue
specific expression of the four metalloproteinases could be demonstrated in the embryo as well
as in the adult organism. In the embryonie tissue, collagenase I and collagenase IV (72 kD) were
expressed, while Stromelysin 1 and Stromelysin 2 were not found. Whereas collagenase IV (72
kD) transcripts were expressed in many tissues of mesenchymal origin, collagenase I was
specifically expressed in the developing bone tissue. Unlike in embryonie tissue, in the adult
organism the expression of stromelysin 1 and Stromelysin 2 could be shown. Stromelysin 1 and
collagenase IV were coordinately expressed in heart andin lung. Basalexpression of Stromelysin
2 could be found in all of the examined tissues, except in testis; higher expression of this gene
was seen in heart and kidney. High amounts of collagenase I could be found in muscle, kidney
and bone; smaller amounts were observed in heart, spieen and in lung. This expression pattern
clearly differs from the one seen for the other three MMPs.
Although in cell culture collagenase I, stromelysin 1 and Stromelysin 2 are regulated in very
similar ways, the different expression pattern in the organism point to their respective function
in the degradation of the various components of the ECM. An AP-1 (cFos/cJun)- dependent
expression in cell culture was demonstrated for the mouse MMPs stromelysin 1, Stromelysin 2
and collagenase I. The existence of transgenic miee, where the expression of one component of
the transcription factor AP-1, the c-jos gene, is altered offers the possibility to study the AP-1
(c-jos)- dependent expression of the MMPs in vivo.
In the c-jos transgenic mouse, collagenase I was shown as the only one of the cloned MMPs to
be an AP-1- dependent metalloproteinase. In mice carrying an indudble c-jos expression vector
as a transgene, an increased collagenase I expression was found in spieen, thymus, liver and in
bone six hours after induction. Interestingly, tissues with elevated collagenase I expression
correlated with the tissues that show phenotypic alterations as a result of constitutively elevated
c-jos expression in the transgenic mice. In the altered bone tissue in c-jos transgenic mice it
could be demonstrated that the expression of collagenase I is elevated more than 100 times
compared with normal bone tissue in wild type mice. In addition, c-jos deficient mice also show
considerable impairments in their bone development. In the tissues of these mice the phenotypic
alterations correlate with an altered, in this case reduced, collagenase I expression. Whether
collagenase I is responsible for the formation or maintenance of the altered phenotype triggered
by the c-jos transgene or the c-jos null-mutation, respectively, remains tobe shown. Collagenase
I, however, could serve as a marker gene for pathological alterations, especially in bone
homeostasis.
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKÜRZUNGEN
IV
1.
EINLEITUNG
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
Funktion und Zusammensetzung der Extrazellulären Matrix (ECM)
1
2
3
6
9
Matrixmetalloproteinasen: ECM abbauende Proteasen
Struktur und Substratspezifität von Metalloproteinasen
Regulation der Synthese und Aktivität der Metalloproteinasen
Kontrolle von MMPs durch Wachstumsfaktoren bei embryonalen Prozessen
Dietransgene Fos-Maus: ein Sytem zur Untersuchung der Regulation der MMP
Expression "in vivo"
11
1.7
Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
11
2.
MATERIALIEN
13
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
Bezugsquellen
13
Radiochemikalien
Verwendete Primer
15
15
15
16
17
17
3.
METHODEN
18
Bakterien und eukaryontische Zellinien
Mausstämme
Kulturmedien
Plasmide
3.1 Behandlung von Nukleinsäuren
3.1.1
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
3.1.2
Phenol/Chloroform-Extraktion
3.1.3
Präzipitation von Nukleinsäuren aus wässrigen Lösungen
3.2 Transformation von Bakterien
3.2.1
Herstellung kompetenter Bakterien
3.2.2
Transformation von kompetenten Zellen
3.2.3
Herstellung von Selektiv-Agarplatten
3.3 DNA Präparation
3.3.1
Mini-Plasmid DNA Präparation
I
18
18
18
18
18
18
19
19
19
19
3.3.2
3.4
20
Plasmid DNA Präparation
20
Klonierungstechniken
3.4.1
Fragmentierung von DNA-Molekülen durch Restriktionsendonukleasen
20
3.4.2
Dephosphorylierung von DNA
21
3.4.3
Phosphorylierung von Oligonukleotiden und Linkern
21
3.4.4
Auffüllen von 5'-Überhängen
21
3.4.5
Ligation von DNA-Fragmenten
21
3.4.6
cDNA-Synthese (Erststrangsynthese)
22
3.4.7
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
22
3.4.8
Sequenzierung von DNA
22
3.5
23
DNA-Gelelektrophorese
3.5 .1
Agarose-Gelelektrophorese
23
3.5.2
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
23
3.5.3
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
23
3.5 .4
Denaturierende Polyacrylamid-Harnstoff-Gele
24
3.6
25
Zellkultur
3.6.1
Trypsinieren von Zellen
25
3.6.2
Einfrieren und Auftauen von Zellen
25
3.6.3
Behandlung von Zellen mit Induktoren
25
3.7
Poly A + -RNA-Präparation
25
3. 8
Radioaktive Markierung von DNA und RNA
26
3.8.1
Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
26
3.8.2
Radioaktive Markierung von RNA durch "in vitro" Transkription
26
3.9
RNA-Transfer auf eine Nylonmembran ("Northern Blot") und Hybridisierung
3. 9.1
RNA-Transfer auf eine Nylonmembran
3.9.2
Hybridisierung radioaktiv markierter DNA-Fragmente an die filtergebundene
RNA
27
27
28
3.10 "In situ" Hybridisierung
28
3.10.1
Behandlung von Objektträgern, Deckgläsern, Glaskästen und Glasfarbegestellen
28
3.10.2
Fixierung, Einbettung von Geweben und Anfertigung von Schnitten
29
3 .1 0.3
Vorhybridisierung der Schnitte
29
3.10.4
Hybridisierung der Schnitte
30
3.10.5
Waschen der Schnitte
30
3.10.6
Beschichten der Objektträger mit einer Photoemulsion
31
3.10.7
Entwickeln, Färben und Mikroskopieren der Schnitte
31
II
4.
ERGEBNISSE
4.1
Klonierung mausspezifischer MMP cDNAs und ihre Homologie zu den entsprechenden
4.2
33
Sequenzen in Mensch und Ratte
33
Transkriptionelle Regulation der Maus-MMPs in Zellkultur
38
4.2.1
Induktion der MMP-Expression durch TPA und cAMP
38
4.2.2
Induktion der MMP-Expression durch UV-Bestrahlung
40
Gewebespezifische Expression der Maus Metalloproteinasen
41
4. 3
4.3.1
Expression der MMPs während der Embryonalentwicklung der Maus
41
4.3.2
Expression der MMPs in Geweben des adulten Organismus
55
4.4
Expression der Kollagenase I in Geweben von cjos transgenen Mäusen
60
4.4.1
Induzierte Expression von Kollagenase I in Mäusen mit induzierter cjos Expression
60
4.4.2
Kollagenase I Expression in konstitutiv cjos exprimierenden transgenen Mäusen
62
4.5
Expression der Kollagenase I in Geweben von cjos-negativen Mäusen
4.5 .1
Expression der Kollagenase I in Embryonen von cjos-negativen Mäusen
4.5.2
Kollagenase I Expression zum Zeitpunkt des Auftreten phänotypischer Veränderungen
(2 Wochen alte Tiere)
64
64
67
5.
DISKUSSION
71
5.1
Die Matrix-abbauenden Enzyme der Maus lassen sich in die Familie der Metalleproteinasen einordnen
72
5.2
Fos/Jun als die limitierenden Kontrollfaktoren der MMPs in Kulturzellen
74
5.3
Die Expression der MMPs während der Embryogenese ist gewebespezifisch und nicht
überlappend
76
5.4
Unterschiede in der MMP Expression im Embryo und im adulten Organismus
81
5.5
Expression von Kollagenase I in cjos transgenen und cjos "Null" Mäusen: Ist
Kollagenase I ein Markergen für cFos abhängige pathologische Veränderungen im
6.
Knochenmetabolismus
83
LITERATURVERZEICHNIS
88
III
ABKÜRZUNGEN
Abb.
Abbildung
AMV
Avian Myoblastosis Virus
AP-1
Aktivatorprotein 1
bFGF
basischer Fibroblasten Wachstumsfaktor
bp
Basenpaare
BSA
Rinder-Serumalbumin
ATP
Adenosintriphosphat
cAMP
zyklisches Adenosinmonophosphat
cDNA
komplementäre DNA
cFOS
zelluläres Pos-Protein
c-jos
zelluläres Fos-Gen
cJun
zelluläres Jun-Protein
c-jun
zelluläres Jun-Gen
Ci
Curie
CIP
Intestinale alkalische Phosphatase vom Kalb
cpm
counts per minute
CTAB
Cetyl-trimethyl-ammoniumbromid
dATP
Desoxyadenosintriphosphat
dCTP
Desoxycytidintriphosphat
dGTP
Desoxyguanosintriphosphat
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DNase
Desoxyribonuklease
dNTP
Desoxynukleosidtriphosphat
dTTP
Desoxythymidintriphosphat
DTT
Dithiothreitol
E
Extinktion
ECM
Extrazelluläre Matrix
E. coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EGF
epidermaler Wachstumsfaktor
EPIF
Extrazellulärer Proteinsynthese-induzierender Faktor
f.c.
Endkonzentration (final concentration)
FCS
Fötales Kälberserum
FBJ Osteosarkomavirus
Finkel-Biskis-Jinkis Maus Osteosarkomavirus
g
Gramm
IV
g
Erdbeschleunigung
h
Stunden
IL-1
Interleukin 1
J
Joule
kD
Kilodalton
Liter
LB
Luria-Bertani-Medium
LTR
Long terminal repeat
M
Molarität
MBq
Megabequerel
MCS
Multiple Cloning site (Polylinker)
min
Minuten
MMP
Matrixmetalloproteinase
MOPS
3-N-(Morpholino )-Propan-Sulfonsäure
mRNA
messenger RNA
NGF
Nervenwachstumsfaktor
OD
Optische Dichte
PBS
Phosphat-gepufferte Salzlösung
PCR
Polymerasekettenreaktion
PDGF
aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor
RNA
Ribonukleinsäure
RNase
Ribonuklease
RNasin
RNase-Inhibitor
rNTP
Ribonukleosidtriphosphat
rpm
Umdrehungenper Minute
rRNA
ribosomale RNA
RT
Raumtemperatur
SDS
Natriumdodecylsulfat
SV40
Simian Virus 40
TEMED
N, N, N', N'-tetramethyl-ethylendiamin
TGF
transformierender Wachstumsfaktor
TNF
Tumornekrosefaktor
TPA
12-0-Tetradecanoyl-Phorbol-13-Acetat
TRE
TP A responsive element
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-amino-methan
tRNA
transfer RNA
·u
units (Enzymeinheiten)
uv
Ultraviolette Strahlung
UTP
U ridintriphosphat
V
1. EINLEITUNG
1.1 Funktion und Zusammensetzung der Extrazellulären Matrix (ECM)
Die Entwicklung und das Wachsturn vielzelliger Organismen erfordern eine perfekte
Koordination von Einzelprozessen, wie z. B. Proliferation, Differenzierung und Wanderung von
Zellen. Die Koordination dieser Prozesse beinhaltet, daß Gene zum richtigen Zeitpunkt in einer
Zelle exprimiert werden ("differentielle Genexpression"), aber auch daß diese Zellen an ihren
späteren Wirkungsort, das entsprechende Organ, gelangen (Positionsinformation). Für diese
Positionseinnahme ist die Wechselwirkung der
Zellen untereinander,
aber
auch
die
Wechselwirkung mit ihrer Umgebung erforderlich. Eine wichtige Rolle bei diesen embryonalen
Prozessen spielt die Extrazelluläre Matrix (ECM), die in diesem Zusammenhang als Substrat
für Zelladhäsion und Zellbewegung dient (als Übersichtsartikel: Matrisian und Hogan, 1990;
Matrisian, 1992).
Im adulten Organismus übernimmt die ECM die Funktion der strukturellen und mechanischen
Unterstützung, z. B. in Form von Knorpel, Knochen und Sehnen (Goldberg und Rabinovitch;
1989) und dient als Barriere zwischen verschiedenen Zelltypen bzw. Organen (Woolley, 1984).
Auch die Weiterleitung von Signalen aus dem extrazellulären Raum ins Zellinnere kann durch
die Extrazelluläre Matrix beeinflußt werden. Zum Beispiel werden durch Wechselwirkung der
Zellen mit Komponenten der ECM, mittels der Integrin-Rezeptorfamilie, sowohl Veränderungen
des Zytoskeletts als auch biochemische Signale ausgelöst, die sich in der Aktivierung von
Tyrosinkinasen als Teil einer Kaskade zytoplasmatischer Proteinkinasen äußern, und somit die
Genexpression reguliert (Juliano und Haskill, 1993).
Die ECM setzt sich aus einem Geflecht von spezifischen Glykoproteinen (Kollagen, Fibronektin,
Laminin) und Proteoglykanen zusammen, das von einer Reihe verschiedener Zellen sezerniert
wird (als Übersichtsartikel siehe Goldberg und Rabinovitch, 1989; Matrisian und Hogan, 1990;
Matrisian, 1990; Gilbert, 1991).
Die Familie der Kollagene repräsentiert dabei mit mehr als zehn verschiedenen Kollagentypen
den Hauptanteil aller Strukturproteine; sie machen fast die Hälfte des gesamten Körperproteins
aus. Das Hauptmerkmal aller Kollagenmoleküle ist dabei ihre starre, dreistrangige Struktur. Drei
Kollagen Polypeptidketten, a-Ketten, sind in Form einer regelmäßigen Helix umeinander
gewunden, um ein faserartiges Kollagenmolekül (Tripel-Helix) von ungefähr 300 nm Länge und
15 nm Durchmesser zu bilden (Goldberg und Rabinovitch, 1989). Typ I Kollagen, das als
Bestandteil der Extrazellulären Matrix vieler Gewebe (Haut, Sehnen, Knochen, Dentin) zu
finden ist, ist die am häufigsten vorkommende Komponente (90% des gesamten Kollagens).
1
Andere Kollagene, Kollagen Typ IV und V, sind vor allem Bestandteile der Basalmembranen
(Woolley, 1984; Goldberg und Rabinovitch, 1989; Gilbert, 1991).
Für die Aufrechterhaltung der ECM ist ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Synthese und
Abbau der Matrixkomponenten erforderlich (als Übersichtsartikel: Matrisian und Hogan, 1990).
Defekte in der Synthese, dem Abbau und der Zusammensetzung der Matrixkomponenten können
daher tiefgreifende Auswirkungen auf die normale Entwicklung eines Organismus haben. Als
Beispiel einer gestörten Synthese von Matrixkomponenten gilt die Insertion eines Retrovirus
(Mov13) in das erste Intron des a1 Typ I Kollagen Gens. Diese Mutation führt zu einem Verlust
der Typ I Kollagensynthese in homozygoten Embryonen. Aufgrund der fehlenden Typ I
Kollagen Expression sterben diese Embryonen am Tag 13.5 der Entwicklung, infolge zu dünner
Blutgefäßwände (Schnieke et al., 1983; Löhler et al., 1984; Kratochwil et al., 1986).
Im Folgenden soll jedoch auf die Mechanismen des physiologischen und pathologischen Abbaus
der ECM eingegangen werden.
1.2 Matrixmetalloproteinasen: ECM abbauende Proteasen
Am Ab- und Umbau der ECM sind eine Reihe von proteolytischen Enzymen, z. B. Serin-,
Cystein- und Aspartatproteinasen beteiligt. Die bedeutendste Rolle kommt hier jedoch der
Familie der Matrixmetalloproteinasen (MMPs) zu, da ihre Mitglieder aufgrund ihrer
Substratspezifität für den spezifischen Abbau der einzelnen ECM -Komponenten verantwortlich
sind. Diese Enzyme sind alleinig für die anfangliehe Spaltung der Matrixkomponenten
verantwortlich und machen diese damit für den weiteren Verdau durch andere Proteasen
zugänglich. Um die Dynamik der ECM aufrechtzuerhalten, muß ein regulierbarer Mechanismus
von Synthese und Abbau vorhanden sein. Den kontrollierten Abbau der ECM-Komponenten
besorgen dabei die Mitglieder der Familie der MMPs.
Wird das fein ausbalancierte Gleichgewicht zwischen Synthese und Abbau der ECM durch eine
unkontrollierte MMP-Expression gestört, kann dies zu pathologischen Veränderungen, wie
chronischen Entzündungsreaktionen (z. B. Rheumatische Arthritis) oder einer Ausbreitung von
Tumorzellen führen: Eine erhöhte MMP-Aktivität wurde in den Gelenkflüssigkeiten von
Rheumapatienten und auch in Kulturmedien von Synovialfibroblasten von Rheumapatienten
beobachtet und konnte auch in den entsprechenden Bereichen der Gewebezerstörung
nachgewiesen werden (Okada et al., 1990; Birkedal-Hansen et al., 1993 und Referenzen darin).
In invasiven und metastasierenden Tumoren konnte im Vergleich zu normalem Gewebe oder
gutartigen Tumoren eine erhöhte Expression verschiedener MMPs gefunden werden (Salo et al.,
1983; Matrisian et al., 1986a; Garbisa et al., 1987; Krieget al., 1988; Ostrowski et al., 1988).
Diese erhöhten MMP-Aktivitäten könnten die Tumorzellen in die Lage versetzen, die
Bindegewebsbarrieren zu durchqueren.
2
1.3 Struktur und Substratspezifität von Metalloproteinasen
Matrixmetalloproteinasen sind metallabhängige Endopeptidasen, die in den extrazellulären Raum
sezerniert werden. Thre maximale Aktivität besitzen sie bei einem neutralen pH-Wert. Aufgrund
einer charakteristischen Domänenstruktur und aufgrund ihrer Substratspezifität, werden die
einzelnen Enzyme in folgende Klassen eingeteilt (Abb.1; nach Matrisian, 1992; Birkedal-Hansen
et al., 1993):
1. Kollagenasen vom Typ I (interstitielle und neutrophile)
2. Stromelysine (Stromelysin 1 und 2)
3. Gelatinasen:
-Gelatinase A (72 kD Typ IV Kollagenase)
-Gelatinase B (92 kD Typ IV Kollagenase)
4. Andere MMPs (Stromelysin 3, "putative" Metalloproteinase PUMP, MakrophagenElastase)
PRÄ
PRO
0~
D~
0~
0~
HEMOPEXIN
AKTIVES ZENTRUM
ZN
ZN
ZN
ZN
I
I
I
I
PUMP
STROMELYSIN-I
STROMEL YSIN-2
ll~illllllll~l~l!lllll~~~~~lll~~llil
KOLLAGENASE I
FIBRONEKTIN
0~1
I~El
72 kD KOLLAGENASE IV
(GELA TINASE A)
KO
0~1
I~EJ
•
92 kD KOLLAGENASE IV
(GELATINASE B)
Abb.l: Domänenstruktur der MMPs (Matrisian 1990). PRÄ: Die Prädomäne kodiert für das Signalpeptid, das für die
Ausschleusung des Proteins aus der Zelle verantwortlich ist. PRO: Die Prodomäne ist verantwortlich für die Latenz
des Enzyms. Durch ihre Abspaltung wird das Enzym in die aktive Form umgewandelt. ZN: Die Zink-bindende
Domäne beinhaltet das aktive Zentrum des Moleküls. HEMOPEXIN: Domäne, die für die Substratbindung
verantwortlich sein könnte. FlBRONEKTIN: Die Fibronektindomäne zeigt Ähnlichkeiten zur kollagenbindenden
Domäne des Fibronektins. Sie ist typisch für Kollagenasen vom Typ IV. KOLLAGEN: Die Kollagendomäne zeigt
Ähnlichkeit zur ~-Kette des Typ V Kollagens. Sie ist typisch für die 92 kD Typ IV Kollagenase.
Kollagenase vom Typ I, die sowohl von Fibroblasten (FIB-CL) als auch von polymorphkernigen
Leukozyten (PMN-CL) sezerniert wird, ist als einziges Enzym der MMP-Familie in der Lage
Kollagen vom Typ I, II und III spalten (Tab.1). Die Spaltung erfolgt spezifisch zwischen den
3
Aminosäureresten GLY775 und ILE776 in den a-Ketten der Tripel-Helix. Durch die Spaltung
entstehen Fragmente mit einer Länge von 3/4 und 1/4 des Kollagenmoleküls. Dies führt zur
Entwindung der helikalen Struktur und die Abbauprodukte sind für die weitere proteolytische
Spaltung durch andere Proteinasen zugänglich (Goldberg et al., 1986; Wilhelm et al., 1986;
Whitham et al., 1986).
Das Kollagenasemolekül läßt sich aufgrund von spezifischen Sequenzhomologien in folgende
Domänen unterteilen (Abb.1):
Die "Prä"-Domäne beinhaltet das Signalpeptid, das für die Ausschleusung des Enzyms aus der
Zelle verantwortlich ist. Es wird während dieses Prozesses durch proteolytische Spaltung
entfernt. Die "Pro"-Domäne (Aminosäuren 18-99) ist für die Inaktivität des sezernierten
Enzyms verantwortlich. Sie enthält ein Cystein-Rest an Position 73, der als vierte
Koordinationsstelle für die Komplexbildung mit drei Aminosäuren (Histidine) der "Zink"bindenden Domäne dient. Durch die Abspaltung der "Pro"-Domäne wird die vierte
Koordinationsstelle durch ein Wassermolekül ersetzt und dadurch die inaktive Form in die aktive
Form überführt (Grant et al., 1987; Springman et al., 1990). Die Funktion der "Hemopexin"Domäne
(C-Terminus),
die mit Ausnahme der Metalloproteinase PUMP
("putative"
Metalloproteinase) in allen anderen Mitgliedern der Familie zu finden ist, ist noch nicht
eindeutig bekannt. Sie könnte jedoch bei Substratspezifität, Inhibitorbindung (s. folgendes
Kapitel 1.4) oder Bindung an ECM-Komponenten involviert sein (Muller et al., 1988; Matrisian,
1992). Die Entfernung der C-terminalen Domäne der Kollagenase I führt zum Verlust der
Spezifität für tripelhelikales Kollagen, während die Aktivität gegenüber Gelatin kaum verändert
ist (Murphy et al., 1992).
Die Stromelysine, die eine vergleichbare Domänenstruktur besitzen wie Kollagenase (Abb .1;
Sanchez-Lopez et al., 1988), zeigen eine sehr viel breitere Substratspezifität (Tab.1). Sie können
Proteoglykane, Laminin, Fibronektin, Elastin und denaturiertes Kollagen abbauen. Begrenzte
enzymatische Aktivität besitzen sie auch gegenüber Typ IV und Typ V Kollagen, keine Aktivität
dagegen gegenüber nativem Typ I Kollagen (Whitham et al., 1986; Wilhelm et al., 1987;
Breathnach et al., 1987).
Gelatinase A (72 kD Typ IV Kollagenase) enthält ein zusätzliches Sequenzmotiv, das
Ähnlichkeiten zur kollagenbindenden Domäne des Fibronektin hat. Diese Domäne könnte
ebenfalls bei der Bestimmung der Substratspezifität oder an der Bindung und Lokalisierung des
Enzyms an der Extrazellulären Matrix mitwirken (Alexander und Werb, 1989). Das Enzym
erkennt Gelatine, Typ IV, V und VII Kollagen sowie Fibronektin als Substrat (Tab .1 ), während
natives Typ I Kollagen nicht abgebaut wird (Salo et al., 1983; Collier et al., 1988; Reponen et
4
al., 1992). Die B-Form der Gelatinasen (92 kD Typ IV Kollagenase) unterscheidet sich durch
den Besitz einer weiteren Domäne, die Homologie zur
~-Kette
des Typ V Kollagen zeigt. Ihre
Substratspezifität ist vergleichbar mit der der A-Form (Wilhelm et al., 1989; Huhtala et al.,
1991).
Enzym
ECM-Substrat
Kollagenasen
interstitielle (FIB-CL)
Kollagen I, II, I1I (III> > 1), VII, VIII, X, Gelatine
neutrophile (PMN-CL)
wie interstitielle Kollagenase, (I> > III)
Stromelysine
Stromelysin 1
Fibronektin, Laminin, Kollagen IV, V, IX, X, Elastin,
Gelatine, Proteoglyk:ane
Stromelysin 2
wie Stromelysin 1
Gelatinasen
72 kD Typ IV Kollagenase
Gelatine, Kollagen IV, V, VII, X, XI, Elastin, Fibronektin
(Gelatinase A)
92 kD Typ IV Kollagenase
wie 72 kD Typ IV Kollagenase
(Gelatinase B)
AndereMMPs
PUMP
Fibronektin, Laminin, Kollagen IV, Gelatine, Elastin,
Proteoglyk:ane
Stromelysin 3
nicht bestimmt
Makrophagen-Elastase
Elastin, Fibronektin
Tab.1: Substratspezifität der Mitglieder der Familie der Metalloproteinasen (Matrisian, 1992; Birkedal-Hansen et al.,
1993). Die MMPs werden aufgrund ihrer Substratspezifität in die Subklassen Kollagenasen, Stromelysine, Gelatinasen
und andere MMPs eingeteilt.
Betrachtet man sich die Anzahl der existierenden Enzyme gegenüber der beschriebenen Menge
von Kollagenen (> 10 Typen, s. a. Abschnitt 1.1) ist klar, daß es nicht für jeden einzelnen Typ
von Kollagen ein Enzym mit spezifischer Aktivität gibt. Welche Enzyme für den Abbau all
dieser Kollagentypen verantwortlich sind, ist noch nicht geklärt. Zum einen besitzen die Enzyme
überlappende Substratspezifitäten und vielleicht sind die bisher "in vitro" bestimmten
Substratspezifitäten unter physiologischen Bedingungen noch sehr viel weiter gestreut. Weiterhin
5
könnten zusätzliche Mitglieder der MMP-Familie existieren, die bisher noch nicht identifiziert
werden konnten.
Aufgrund der
signifikanten Homologie im
aktiven Zentrum der hier beschriebenen
Metalloproteinasen und Zink-Endopeptidasen von niedrigen Organismen, wie Bakterien (z. B.
Thermolysin) oder dem Flußkrebs Astacus astacus L. (Astacus Proteinase=Astacin) könnte eine
strukturelle Verwandtschaft zwischen diesen Zinkendopeptidasen und den hier aufgeführten
MMPs höherer Organismen bestehen (Murphy et al., 1991). Die Tatsache, daß bestimmte
Aminosäuren (Histidine) aus dem Bereich des aktiven Zentrums während der Evolution erhalten
geblieben sind, während die benachbarten Sequenzen eine sehr viel geringere Homologie
aufweisen, verdeutlicht die essentielle Funktion dieser Aminosäuren. Aufgrund der Selektion
dieser Aminosäuren dürfte die katalytische Maschinerie der Säuger-MMPs weitgehend der den
bakteriellen Endopeptidasen entsprechen (Springman et al., 1990).
1.4 Regulation der Synthese und Aktivität der Metalloproteinasen
Metalloproteinasen werden, wie viele andere sezernierte Enzyme, streng kontrolliert. Dies mag
in Zusammenhang stehen mit der vermuteten Bedeutung dosierter Aktivität bei vielen Prozessen
des Wachstums, der Morphogenese und der Wanderung von Zellen. Eine ungehemmte Aktivität
dieser Enzyme kann deshalb, wie bereits erwähnt (s. 1.2), zu massiven Gewebeschäden führen
und deshalb erhebliche Auswirkungen auf den betroffenen Organismus haben. Tatsache ist, daß
mehrere Ebenen der Kontrolle entdeckt wurden: die Regulation auf der Ebene der Transkription
und die Kontrolle der Aktivität des sezernierten Enzyms.
Die Regulation der Transkription von Kollagenase I und Stromelysin 1 wird durch eine Reihe
von extrazellulären Stimuli, z. B. Wachstumsfaktoren oder Cytokine, aber auch durch
verschiedene Umweltnoxen (Strahlung, chemische Karzinogene) reguliert.
So wird beispielsweise eine erhöhte Expression der Wachstumsfaktoren PDGF-A, TGF-cx und
TGF-ß während des Blastozysten Stadiums zum gleichen Zeitpunkt gefunden, zu dem die Menge
an MMP-Transkripten erhöht ist (Rappolee et al., 1988). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß
11
11
in vitro kultivierte, kapillare Rinderendothelzellen bei der Invasion durch eine menschliche
Basalmembran des Amnions erhöhte Mengen an Proteasen, darunter auch MMPs, synthetisieren
als Antwort auf den angiogenen, basischen Fibroblasten Wachstumsfaktor (bFGF) (Gross et al.,
1983; Moscatelli et al., 1986; Presta et al., 1986; Mignatti et al., 1989).
In Zellkultur ist der Einfluß von Wachstumsfaktoren auf die Expression von MMPs gut
untersucht. So führt die Behandlung von Zellen mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)
oder dem, aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) zu einer erhöhten
6
Expression an MMPs (Kerr et al., 1988; Matrisian et al., 1986b). Auch Faktoren, wie das
Interleukin-1 (IL-1) und der Tumornekrose-Faktor
a.,
(TNF-u), die im Organismus als Antwort
auf Entzündungsreaktionen von Makrophagen sezerniert werden (Frisch und Ruley, 1987;
Brenner et al., 1989b), zeigen diesen Effekt. Weiterhin haben auch Faktoren, die in Folge von
UV-Bestrahlung von Zellen freigesetzt werden, darunter IL-1u und bFGF, eine ähnliche
Wirkung auf die Expression von Metalloproteinasen (Schorpp et al., 1984; Krämer et al., 1993).
Die meisten dieser extrazellulären Substanzen imitieren ihre Wirkung auf die Expression
spezifischer Gene durch Bindung an den entsprechenden Oberflächenrezeptor an der
Zellmembran.
Dadurch
wird
ein
Signal
ausgelöst,
welches
dann
über
eine
Signaltransduktionskaskade im Cytoplasma in den Zellkern weitergeleitet wird. Bestandteile
dieser Signaltransduktionskaskade sind Proteinkinasen (darunter Proteinkinase C)
und
Phosphatasen, die durch Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung andere Proteine aktivieren
oder reprimieren (Juliano und Haskill, 1993; Derijard et al., 1994). Der Phorbolester TPA (120-Tetradecanoyl-Phorbol-13-Acetat) imitiert die Wirkung von Wachstumsfaktoren auf die Zelle
(Angel et al., 1987a,b; Angel und Karin, 1991), und wird deshalb zur Erforschung von
Signaltransduktion und Genexpression in Zellkultursystemen eingesetzt. TP A wirkt dabei, indem
es direkt mit der Proteinkinase C interagiert und diese aktiviert (Nishizuka, 1984; 1986). Am
Ende dieser Signalkette steht unter anderem die Aktivierung der Mitglieder der nukleären
Protoonkogen-Familienjun undjos. Die Proteine dieser Protoonkogen-Familien bilden entweder
Homodimer- (Jun/Jun), oder Heterodimer-Komplexe (Jun/Fos). Diese als AP-1 (Aktivatorprotein
1) bezeichneten Komplexe binden an ein 8 bp konserviertes Element, die AP-1 Bindungsstelle
oder TRE-Sequenz ("TPA-responsive element"), die sowohl im Promoter des Kollagenase- als
auch des Stromelysin 1-Gens vorkommt und für die Expression dieser Gene notwendig ist. "In
vivo" und "in vitro" DNA/Protein Bindungsstudien (Footprinting) zeigten, daß eine verstärkte
Bindung an die AP-1-Stelle im Kollagenase Promoter nach TPA-Behandlung erfolgt (Angel et
al., 1987b; König et al., 1992).
Die AP-1 Bindungsstelle der Kollagenase I ist notwendig und ausreichend für eine
Transkriptionsaktivierung durch TPA, wenngleich auch weitere Bindungsstellen für DNA
bindende Proteine, z. B. "PEA3", stromaufwärts von der AP-1-Stelle im Kollagenase-, aber
auch im Stromelysin-Promoter, identifiziert werden konnten, die für die volle Aktivität
notwendig sind (Gutman und Wasylyk, 1990; 1992; H.-P. Auer, persönliche Mitteilung).
Um im Organismus die Expression der MMPs wieder gezielt auf den Basalwert
zurückzubringen, müssen auch Mechanismen existieren, die die AP-1 Aktivität reprimieren.
Die zwei am besten untersuchten Beispiele von zellulären, bzw. viralen Komponenten, die die
AP-1 Aktivität, und davon abhängig, auch die Expression von MMPs (Kollagenase I und
7
Stromelysin 1) hemmen, sind Steroidhormonrezeptoren (darunter das Streßhormon Cortisol,
Parillo und Bauci, 1979; Frisch und Ruley, 1987; Jonat et al., 1990; Schüle et al., 1991; Ponta
et al., 1992) und das E1A Genprodukt von Adenoviren (Offringa et al., 1990). Die
reprimierende Wirkung dieser Proteine auf die MMP-Expression findet auf Transkriptionsebene
durch Hemmung der DNA Bindung (durch E1A; Hagmeyer et al., 1993) oder durch Hemmung
der Transaktivierungseigenschaften von Fos/Jun (durch Steroidhormonrezeptoren; Schüle et al.,
1991; Schüle und Evans, 1991; König et al., 1992) statt.
Der therapeutische Effekt künstlicher Steroide (z. B. Dexamethason) ist wahrscheinlich auf diese
Repression von Fos/Jun und damit der Hemmung der MMP Expression zurückzuführen, und
könnte somit für die klinische Therapie Bedeutung haben (Allison, 1988).
In Zellkultur wird eine Wachstumsfaktor-induzierte (z. B. durch EGF oder bFGF) Expression
von Metalloproteinasen durch Wachstumsfaktoren der TGF-ß-Familie inhibiert (Edwards et al.,
1987; als Übersichtsartikel: Matrisian und Hogan, 1990). Diese Repression erfolgt nicht über
das TRE, sondern über eine weitere konservierte Sequenz TIE ("TGF-ß1 inhibitory element") im
Promoter des Stromelysin 1-Gens, und auch der Kollagenase- und Metalloelastase-Gene. Ein
Protein des multimeren Komplexes, der an die "TIE" Konsensussequenz bindet, konnte als
Produkt des c-jos Gens identifiziert werden. Seine Induktion durch TGF-ß 1 ist für die
vermittelte Hemmung des Stromelysin 1 Gens notwendig (Kerr et al., 1990).
Die Regulation der MMP-mRNA Halbwertszeit könnte, wenn auch nur in weit geringerem
Ausmaß als die transkriptioneile Regulation, eine weitere Möglichkeit der Kontrolle darstellen.
So wurde eine Erhöhung der Halbwertszeit der Kollagenase I mRNA nach TPA-Behandlung
(Brinckerhoff et al., 1986) und eine Verlängerung der Halbwertszeit der 72 kD Kollagenase IV
mRNA nach einer TGF-ß Stimulierung beobachtet (Overall et al., 1991).
Neben der Regulation auf der Ebene der Transkription wird die Aktivität der MMPs auch auf
posttranslationaler Ebene kontrolliert.
Kollagenase I und Stromelysin 1, als auch die Gelatinasen A und B, werden in zwei Formen mit
unterschiedlichem Molekulargewicht von Zellen sezerniert. Das höhere Molekulargewicht der
seltener vorkommenden Form ist auf eine partielle N-Glykosylierung zurückzuführen (Goldberg
et al., 1986; Wilhelm et al., 1986; 1987; Wilhelm et al., 1989; Reponen et al., 1992). Die
Funktion dieser Modifikationen ist nicht bekannt. Sie könnten jedoch für die Ausschleusung der
unterschiedlichen MMP-Formen in verschiedene Kompartimente der ECM verantwortlich sein.
Die Sekretion dieser Enzyme erfolgt als inaktives Pro-Enzym. Unter physiologischen
Bedingungen wird die Aktivierung durch die Abspaltung der Prodomäne (Abb .1) durch bisher
unbekannte Proteasen bewerkstelligt. Bei diesem Prozeß könnten jedoch Serinproteinasen
8
(Plasmin) als Komponenten einer Enzymkaskade wirken, die in der Aktivierung der
Prokollagenase und des Prostromelysins endet (Reich et al., 1988; He et al., 1989; Matrisian,
1992). In vitro Daten sprechen auch für eine direkte Beteiligung von Stromelysin, welches an
der "in vivo" Aktivierung der Kollagenase involviert sein könnte (Fini et al., 1987b; Murphy et
al., 1987; Ito und Nagase, 1988).
Um pathologischen Veränderungen vorzubeugen, ist es notwendig das Ausmaß des ECM-Abbaus
und somit die Aktivität der MMPs zu kontrollieren. Dies setzt voraus, daß neben der
Abschaltung der Transkription der MMP Gene, die aktiven Metalloproteinasen selbst auch rasch
wieder inaktiviert werden können. Dies wird spezifisch durch die Mitglieder einer Familie von
Gewebeinhibitoren ("tissue inhibitor of metalloproteinases" = TIMP) bewerkstelligt. Diese
Glykoproteine, die in einer Reihe von menschlichen Geweben und Gewebeflüssigkeiten gefunden
werden, bilden einen irreversiblen Komplex mit der aktiven Form der MMPs in einem
stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 (Welgus und Stricklin, 1983; Docherty et al., 1985;
Stetler-Stevenson et al., 1989). Eine "Netto"-Enzymaktivität resultiert nur dann, wenn die
transkriptioneile Aktivierung des Metalloproteinase-Gens die Expression des Inhibitors
übersteigt. Wird das normale Gleichgewicht zwischen MMP und Inhibitor extrem gestört, treten
pathologische Veränderungen auf. So erwerben nichtmetastasierende NIH3T3 Zellen, nach
Reduktion der TIMP mRNA Menge durch die Transfektion von antisense TIMP-Konstrukten,
tumorigene und metastatische Eigenschaften (Khokha et al., 1989). Es konnte auch gezeigt
werden, daß eine erhöhte Kollagenase-Aktivität in metastasierenden Zellen, gegenüber
nichtmetastasierenden, auf eine reduzierte TIMP-Genexpression zurückzuführen ist (Ponton et
al., 1991).
1.5 Kontrolle von MMPs durch Wachstumsfaktoren bei embryonalen Prozessen
Über die Wirkung von einzelnen Wachstumsfaktoren auf die Expression von Metalloproteinasen
im Zellkultursystem existieren eine Vielzahl von Daten. Dagegen ist über die Wirkung dieser
Faktoren in Bezug auf den Gesamtorganismus, wo viele verschiedene Prozesse gleichzeitig
ablaufen, sehr viel weniger bekannt.
Während im adulten Organismus viele Vorgänge, die einen Gewebeumbau erfordern, nur noch
in einem reduzierten Ausmaß stattfinden, laufen solche Prozesse, wie Organogenese,
Angiogenese, Neurogenese und Knochenentwicklung während der Embryonalentwicklung in
großem Umfang in eng begrenzten Zeiträumen ab. Hierbei findet ein hoher ECM-Umbau statt
und deshalb wird auch eine hohe Aktivität der Enzyme zu diesem Zeitpunkt erwartet. Für einige
wenige Prozesse konnte dies bisher nachgewiesen werden.
So werden während der
Trophoblasten Invasion eine Reihe von MMPs produziert, deren Expression zu späteren Stadien
9
der Entwicklung stark reduziert ist. Die Invasion des menschlichen Trophoblasten kann dabei
durch spezifische Antikörper gegen die 92 kD Typ IV Kollagenase vollständig gehemmt werden
(Librach et al., 1991). Eine Erhöhung der MMP-Transkriptmenge und MMP-Aktivitäten wird
auch während des Blastozysten-Stadiums des Mausembryos beobachtet (Brenner et al., 1989a).
In diesem Zusammenhang wird auch die Expression von Kollagenase I postuliert. Die vermutete
Kollagenase I mRNA (2.0 kb) stimmt aufgrund ihrer Länge jedoch nicht mit der vor kurzem
isolierten Kollagenase I cDNA (2.9 kb) der Maus überein (Henriett et al., 1992; Gack et al.,
1994) und kodiert wahrscheinlich für eine andere MMP. Weiterhin konnten Stromelysin 3 RNATranskripte in mehreren Regionen eines achtwöchigen menschlichen Embryos durch "in situ"
Hybridisierung gefunden werden. Eine Expression war z. B. in den zwischen den Fingern
liegenden Regionen der Armanlagen zu beobachten (Basset et al., 1990).
Auf die mögliche Beteiligung von MMPs während des Prozesses der Knochenentwicklung soll
hier, in Bezug auf die vorliegende Arbeit, im Besonderen eingegangen werden.
Zu Beginn der Organogenese des Mausembryos, zwischen dem achten und neunten Tag der
Entwicklung, wird ein knorpeliges Skelettmodell, das hauptsächlich aus Typ li-Kollagen besteht,
aus aggregierten Mesenchymzellen aufgebaut. Beginnend am Tag 14 wird dieses Knorpelmodell
dann nach und nach durch eine verknöcherte Form, die vor allem aus Typ I-Kollagen besteht,
ersetzt. Dieser Vorgang wird als "endochondrale Ossifizierung" bezeichnet (Rugh, 1968; Jee,
1989; Kaufman, 1992). Hierbei könnte Kollagenase I eine wichtige Rolle spielen, da sie die
einzige Metalloproteinase ist, die eine spezifische Substratspezifität gegenüber nativem Kollagen
vom Typ I, II und III zeigt.
Bei diesen Prozessen üben Wachstumsfaktoren und Hormone eine wesentliche Funktion aus. Das
Parathormon (PTH) und Vitamin D3 stimulieren die Knochenresorption sowohl in Zellkultur, als
auch "in vivo" und induzieren darüberhinaus auch die Expression von Kollagenase I in
kultivierten, knochenspezifischen Zellen (Heath et al., 1984; Delaisse et al., 1988; Matrisian und
Hogan, 1990). Weiterhin könnten auch die Mitglieder der TGF-ß-Familie an der Regulation und
Koordination
von
Knochenmatrixsynthese
und
-resorption
sowohl
während
der
Embryonalentwicklung, als auch im adulten Organismus beteiligt sein. Die Knochenentwicklung
liefert daher ein fast einmaliges System, in welchem die Regulation der Synthese von ECMKomponenten und die Regulation der Matrix abbauenden Enzyme durch Wachstumsfaktoren und
Hormone eine Schlüsselrolle spielen könnte (als Übersichtsartikel: Matrisian und Hogan, 1990).
10
1.6 Die transgene Fos-Maus: ein System zur Untersuchung der Regulation der MMP
Expression "in vivo"
Um die Regulation und die genaue Funktion von Metalloproteinasen in Geweben des Embryos,
als auch des adulten Organismus untersuchen zu können, war es notwendig ein dafür geeignetes
System auszuwählen. Die Maus ist der am besten untersuchte Säugerorganismus und inzwischen
sind gezielte Eingriffe in die Keimbahn möglich. Durch solche Eingriffe in die Keimbahn
konnten mittlerweile Mausstämme etabliert werden, bei denen das cjos Gen, eine HauptKomponente des für die Regulation der Kollagenase I notwendigen Transkriptionsfaktors AP-1,
konstitutiv exprimiert ist ("Transgene ") oder durch homologe Rekombination inaktiviert wurde
("Knack out") (Rüther et al., 1987; 1988; 1989; Johnson et al., 1992; Wang et al., 1992). Diese
Tiere zeigen mehrere phänotypische Veränderungen, hauptsächlich des Knochengewebes:
Transgene Mäuse, die das cjos Gen konstitutiv exprimieren, entwickeln mit hoher Inzidenz
Schwellungen (lokale Hyperosteosen) in den Röhrenknochen, aus denen sich mit einer Rate von
18 Prozent invasive Turnare bilden (Rüther et al., 1989). Darüberhinaus besitzen sie eine
vergrößerte Milz und ihre T-Zell Entwicklung im Thymus ist gestört (Rüther et al., 1988). Auch
die Knochenentwicklung der '}os-negativen" Mäuse ist erheblich beeinträchtigt. Die Tiere zeigen
ein verzögertes Wachstum, ihre Röhrenknochen sind verkürzt, die Zahnbildung ist gestört und
sie neigen zu Osteopetrose. Auch die Blutzellentwicklung ist beeinflußt (Johnson et al., 1992;
Wang et al., 1992).
1. 7 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
Diese beobachteten pathologischen Veränderungen spezifischer Gewebe, vor allem im Knochen
einerseits, und die Spezifität von Kollagenase I für die Kollagentypen I und li andererseits, die
vorwiegend im Knochen- und Knorpelgewebe zu finden sind, könnten auf eine Beteiligung dieser
MMP im Knochenmetabolismus hinweisen. Daher bieten die cjos transgenen und die cjos
defizienten
Tiere
ein
ideales
System
um
eine
AP-1-abhängige
Expression
von
Metalloproteinasen, im Besonderen der Kollagenase I, bzw. deren postulierte Funktion im
Gesamtorganismus zu untersuchen.
Der
erste
Schritt
zur
Untersuchung,
ob
Kollagenase
I
tatsächlich
während
der
Knochenentwicklung exprimiert wird, ob Veränderungen ihrer Expression in den MausMutanten auftreten, und ob sich die Expression von Kollagenase I von anderen MMPs
unterscheidet, war die Klonierung von mausspezifischen MMP cDNAs. Bislang wurde nur für
die Gelatinase A eine gewebespezifische Expression sowohl in adulten, als auch in embryonalen
Geweben der Maus gezeigt (Reponen et al.,1992).
11
Die Klonierung von cDNA Fragmenten der vier Maus Metalloproteinasen Stromelysin 1,
Stromelysin 2, Kollagenase I und Kollagenase IV (72 k:D) war im Verlauf dieser Arbeit möglich.
Mit Hilfe dieser cDNA Proben sollten folgende Fragen beantwortet werden:
1. Wie werden die MMPs der Maus in Zellkultur als Antwort auf verschiedene extrazelluläre
Stimuli reguliert? Ist dieser Regulationsmechanismus mit demjenigen im Organismus
vergleichbar?
2. Gibt es Unterschiede in der Expression der MMPs zwischen embryonalen und adulten
Geweben?
3. Wird die MMP-Expression durch die veränderte Expression der AP-1 Komponente cFos in c-
jos transgenen und c-jos defizienten Mäusen beeinflußt? Spielt Kollagenase I eine Rolle bei der
Entstehung der beobachteten Gewebeveränderungen in diesen Tieren?
12
2. MATERIALIEN
2.1 Bezugsquellen:
Acrylamid
Serva, Heidelberg
Agarose Typ II, Typ VII
Sigma, München
Alkalische Phosphatase
Boehringer, Mannheim
3-Aminopropyltriethoxy-Silan (fESPA)
Sigma, München
Ammoniumperoxodisulfat
Bio Rad Laboratories, München
Ampicillin
Sigma, München
AMV -Reverse Transkriptase
Stratagene, Heidelberg
Azur-Eosin-Methylenblau-Lösung (Giemsa)
Merck, Darmstadt
Bacto-Agar
Difco Laboratories, Detroit
Bacto-Hefeextrakt
Difco Laboratories, Detroit
Bacto-Trypton
Difco Laboratories, Detroit
8-Bromoadenosin-3 ';5 '-zyklisches Monophosphat
Sigma, München
BSA
Serva, Heidelberg
Cäsiumchiarid
Biomol, Ilvesheim
CTAB
Sigma, München
Desoxy-Nukleosidtriphosphate
Boehringer, Mannheim
Didesoxy-Nukleosidtriphosphate·
Boehringer, Mannheim
Dimethyldichlorsilan
Fluka, Buchs
Dithiothreitol
BRL Inc., Neu-Isenburg
DMEM
Gibco, Eggenstein
DMSO
Fluka, Buchs
DNA-Polymerase I (Klenow)
Bio Labs, Schwalbach
Einbettkassetten
Leica Vertrieb GmbH, Bensheim
Elutip-Säulen
Schleicher und Schuell, Dassei
Emulsifier Safe
Packard Instrument Company, Illinois
Entellan (Schnell eindeckmittel für die Mikroskopie)
Merck, Darmstadt
Essigsäureanhydrid
Merck, Darmstadt
Ethanol
Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid
Sigma, München
Pieoll
Sigma, München
Formamid
Sigma, München
Fötales Kälberserum
Gibco, Eggenstein
Glycerin
BRL Inc., Neu-Isenburg
Harnstoff
Bio Rad Laboratories, München
13
Heringssperma-DNA Typ III
Sigma, München
Histowax
Leica Vertrieb GmbH, Bensheim
Hybond N+
Amersham, Braunschweig
Hyperfilm™-MP
Amersham, Braunschweig
LM-1 Emulsion für die Autoradiographie
Amersham, Braunschweig
Lysozym
Boehringer, Mannheim
ß-Mercaptoethanol
Serva, Heidelberg
N ,N' -Methylenbisacrylamid
Bio Rad Laboratories, München
Objektträger
Bender und Hobein, Karlsruhe
Oligo-d(T)-Cellulose
Pharmacia, Freiburg
Paraformaldehyd
Merck, Darmstadt
Penicillin/Streptomycin
Gibco, Eggenstein
Polyoxymethylen Färbegestelle
Bender und Hobein, Karlsruhe
Polyoxymethylen Färbetröge
Bender und Hobein, Karlsruhe
Polyvinylpyrrolidon (PVP)
Sigma, München
Proteinase K
Sigma, München
Restriktionsendonukleasen
USB, Cleveland
Boehringer, Mannheim
Pharmacia, Freiburg
Promega Biotec, Heidelberg
RNase A
Boehringer, Mannheim
Silan GF31
Wacker Chemie, München
Silikon-Lösung
Serva, Heidelberg
Sodiumthiosulfat
Sigma, München
Tag-Polymerase
Amersham, Braunschweig
T4-DNA-Ligase
Promega Biotec, Heidelberg
T4-Polynukleotid-Kinase
USB, Cleveland
T7-Sequenase-Kit
USB, Cleveland
TEMED
Bio Rad Laboratories, München
TPA
Sigma, München
Triethanolamin
Sigma, München
UV-Lampe (254 nm)
Vetter, Wiesloch
Whatman 3MM-Papier
Bender u. Hobein, Karlsruhe
Zellkulturschalen
Greiner, Nürtingen
14
2.2 Radiochemikalien
a-32P-dCTP (370 MBq/ml)
a-35S-dATP (296 MBq/ml)
a-35S-UTP (370 MBq/ml)
Alle Radiochemikalien wurden von der Firma Amersham, Braunschweig bezogen.
2.3 Bakterien und eukaryontische Zellinien
E. coli XLl blue: (F': :TnlOproA + B+ laclq d(lacZ)MlS/recAl endAl gyrA96 (Nalr) thi
hsdR17 (rk-mk+) supE44 relAllac.
E. coli K12/Cl\1K 603: (thr-, leu-, supE, recBC, lacY-).
F9 tk-: embryonale Maus-Teratokarzinom-Zellen. Erhalten von Dr. Peter Angel, Institut für
Genetik, Kernforschungszentrum Karlsruhe.
NIH3T3: embryonale Maus-Fibroblasten. Entsprechen der NIH 3T3-Zelle der American Type
Culture Collection.
LuSVX: SV40 transformierte Maus Lungen-Fibroblasten. Erhalten von Dr. Hans Weiher,
Institut für Genetik, Kernforschungszentrum Karlsruhe.
rat2pEJ: mit dem T24-ras-Onkogen transformierte rat2-Fibroblasten aus Fisher-Ratten. Poly A +
RNA
aus
diesen Zellen erhalten von Dr.
Martin Hofmann,
Institut für
Genetik,
Kernforschungszentrum Karlsruhe.
2.4 Mausstämme:
CFW x Balb/c Hybridmäuse, infiziert mit einem rekombinanten Retrovirus (Mpv17 Mäuse,
heterozygot). Die heterozygoten Tiere zeigen keinen veränderten Phänotyp. Embryonen dieser
Mäuse wurden von Dr. Hans Weiher, Institut für Genetik, Kernforschungszentrum Karlsruhe zur
Verfügung gestellt.
Mäuse (genetischer Hintergrund C57BL/6 x SJL), homozygot transgen mit dem H2-c:fosLTR
Genkonstrukt (LTR des Moloney Sarkomavirus). RNA aus den Geweben dieser Mäuse wurde
von Dr. Ulrich Rüther, Institut für Molekularbiologie, Medizinische Hochschule Hannover zur
Verfügung gestellt.
15
Mäuse (genetischer Hintergrund C57BL/6 x SJL) transgen mit dem Mx-c:fosD Genkonstrukt.
RNA aus den Geweben dieser Mäuse wurde von Dr.
Ulrich Rüther, Institut für
Molekularbiologie, Medizinische Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
Mäuse (genet. Hintergrund C57BL/6), bei denen das endogene c:fos Gen durch homologe
Rekombination inaktiviert wurde (homozygot). Paraffinschnitte von Geweben dieser Mäuse
wurden von Dr. Agamemnon Grigoriadis, Forschungsinstitut für Molekulare Pathologie, Wien
zur Verfügung gestellt.
2.5 Kulturmedien
L-Broth:
0.5% Bacto-Hefeextrakt, 1.0% NaCl, 1.0% Bacto-Trypton
PSI-Medium:
2% Bacto-Trypton, 0.5% Bacto-Hefeextrakt, 0.4% MgS04 , 10 mM KCl, pH 7.7
SOB:
0.5% Bacto-Hefeextrakt, 2% Bacto-Trypton, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgC12 ,
10 mMMgS04
SOC:
SOB mit 20 mM Glucose
Bakterienselektionsmedium:
L-Broth mit 100
~g/ml
Ampicillin
Einfriermedium:
90% L-Broth, 10% DMSO
Kulturmedium für LuSVX- und Nlli3T3-Zellen:
DMEM mit 10% FCS, 100 U/ml Penicillin, 100
~g/ml
Streptomycin
Kulturmedium für F9-Zellen:
DMEM-F12 (1:1) mit 2 mM Glutamin, 10-3 M ß-Mercaptoethanol, 10% FCS, 100 U/ml
Penicillin, 100 ~g/ml Streptomycin
Einfriermedium (Zellkultur):
DMEM mit 10% FCS, 10% DMSO
16
2.6 Plasmide:
pAZ: Minimal-Klonierungsvek:tor mit bakteriellem Origin, ß-Lactamasegen und Polylinker
(MCS). (pSP65-Derivat; U. Günthert, pers. Mitteilung)
2.7 Verwendete Primer:
1
coll-7: 5 -ATGAGAAAACCAAGATGTGGAGTGCCTGATGT-3
1
(entspricht Nukleotid 258-
289 der Ratten Kollagenase I, Quinn et al., 1990)
1
1
coll-8: 5 -TTGGCGGGGACGCCCATTTTGATGATGATGA-3 (entspricht Nukleotid 570-601
der Ratten Kollagenase I, Quinn et al., 1990)
1
coll-12: 5 -AGACAGCATCTACTTTGTCGCCAATTCCAGG-3
1
(entspricht Nukleotid 1259-
1290 der Ratten Kollagenase I, Quinn et al., 1990))
1
coll-13: 5 -TCCTTGGAGTGGTCCAGACCGAGGGAGTGGCCAAGCTCATGGGCAGCAAC1
3 (entspricht Nukleotid 641-691 der Ratten Kollagenase I, Quinn et al., 1990))
coll-15: 5 1-GGATATCTAGATGCGAAAGCCACGGTGCGGCA/GTI ACCCAGA-3 1 (entspricht
Nukleotid 202-230 der menschlichen 72 kD Typ IV Kollagenase, Collier et al., 1988)
1
coll-16: 5 -CCAGATCTCGAGTGGCCGAACTCATGGGCCC/TGCCACGC/AG-3
1
(entspricht
Nukleotid 1108-1137 der menschlichen 72 kD Typ IV Kollagenase, Collier et al., 1988)
17
3.MEmODEN
3.1 Behandlung von Nukleinsäuren
3.1.1 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Zur Konzentrationsbestimmung wurde die Extinktion der wässrigen Nukleinsäurelösung bei
einer Wellenlänge von 260 nm photometrisch bestimmt. Eine Extinktion von 1 entspricht 50
~tglml
(doppelsträngiger) DNA,
40
Jtglml
Ribonukleinsäure
(RNA)
oder 20
~tglml
Oligonukleotid DNA.
3.1.2 Phenol/Chloroform Extraktion
Zur Reinigung der Nukleinsäure-Lösung von Proteinen wurde die Probe mit Wasser auf
mindestens 100
~tl
aufgefüllt. Nach Zugabe des gleichen Volumens Phenol (mit 1x TNE
gesättigt; 1x TNE: 100 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8) wurde gut geschüttelt
und nach Zugabe eines weiteren Volumens Chloroform:Isoamylalkohol (24: 1) nochmals gut
gemischt. Die Phasen wurden durch 3 min Zentrifugieren wieder getrennt. Die Oberphase wurde
abgenommen und noch zweimal mit dem gleichen Volumen Chloroform auf die gleiche Weise
extrahiert.
3.1.3 Präzipitation von Nukleinsäuren aus wässrigen Lösungen
Die Nukleinsäure-Lösung wurde mit Natriumacetat (pH 4.8) bis zu einer Endkonzentration von
0.25-0.3 M versetzt. Nach Zugabe des 2.5-fachen Volumens Ethanol wurde 30 min bei -80°C
oder über Nacht bei -20°C gefällt und anschließend 10 bis 30 min bei 13000xg zentrifugiert. Zur
Entfernung von Salz wurde das Präzipitat nochmal mit 80% Ethanol gewaschen und
anschließend im Vakuum-Konzentrator ("speed vac") getrocknet.
3.2 Transformation von Bakterien
3.2.1 Herstellung kompetenter Bakterien
Der Bakterienstamm XL1 blue oder K12/CMK 603 wurde auf einer Agarplatte mit LB-Medium
ausgestrichen und bei 37°C für 16 h inkubiert. Von dieser Platte wurde eine Einzelkolonie
gepickt und damit eine 6 ml Kultur mit PSI-Medium angeimpft. Diese Kultur wurde unter
Schütteln bei 37°C bis zu einer OD von 0,28 (bei 600 nm) inkubiert. Mit diesem Ansatz wurde
eine 100 ml Kultur mit PSI-Medium angeimpft und unter Schütteln bei 37°C bis zu einer OD
von 0,48 (bei 600 nm) wachsen gelassen. Danach wurden die Bakterien sofort auf Eis gestellt.
18
Nach Sedimentation der Bakterien bei 1500xg für 10 min bei 4°C, wurden diese in 10 ml
vorgekühltem (4°C) TFBI-Puffer (100 rnM RbC1 2 , 50 rnM MnC1 2 , 30 rnM KAC, 10 rnM CaC12 ,
pH 7.2 mit 0.2 M Essigsäure eingestellt, sterilfiltriert) für 3 h auf Eis gestellt. Nach dieser Zeit
wurden die Bakterien bei 1500xg für 5 min bei 4°C sedimentiert, in 10 ml vorgekühltem TFBIIPuffer (10 rnM MOPS pH 7, 10 rnM RbC1 2 , 75 rnM CaC12 , 15% Glycerin) resuspendiert und in
100 p1 Aliquots abgefüllt. Die Lagerung erfolgte bei -80°C.
3.2.2 Transformation von kompetenten Zellen
Ein 100 p1 Aliquot mit kompetenten Bakterien (s. 3.2.1) wurde auf Eis aufgetaut, 5 JLl des
Ligationsansatzes zugemischt, und eine Stunde auf Eis gestellt. Nach 90 Sekunden Hitzeschock
bei 42°C und 2 min auf Eis wurden 3 ml SOC-Medium (0.5% Bacto-Hefeextrakt, 2% BactoTrypton, 10 rnM NaCl, 2.5 rnM KCl, 10 rnM MgC12 , 10 rnM MgS0 4 , 20 rnM Glukose)
zugegeben und 60 min bei 37°C geschüttelt. 200 JLl der Bakteriensuspension wurden danach auf
eine Selektiv-Agarplatte ausgestrichen.
3.2.3 Herstellung von Selektiv-Agarplatten
In einem 2 1 Kolben wurden 5 g Hefeextrakt, 10 g Bacto-Trypton, 10 g NaCl und 15 g BactoAgar auf 1 Liter mit Wasser aufgefüllt. Diese Mischung wurde autoklaviert. Nach Abkühlen auf
etwa 45°C wurde Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 JLg/ml zugegeben. Damit
konnten etwa 30 Agarplatten (9 cm Durchmesser) gegossen werden. Luftblasen wurden durch
Überstreichen mit einer Bunsenbrennerflamme entfernt. Nach Erstarren des Agars wurden die
Platten bei 4°C gelagert.
3.3 DNA Präparation
3.3.1 Mini-Plasmid DNA Präparation
Die Bakterien wurden in 2 ml Nährmedium mit dem Antibiotikum Ampicillin (100 JLg/ml) über
Nacht bei 37°C geschüttelt. 1.5 ml der Kultur wurden 5 min bei 4000xg zentrifugiert. Das
Sediment wurde in 200 JLl STET-Puffer (8% Saccharose, 0.1% Triton X-100, 50 rnM EDTA pH
8.0, 50 rnM Tris pH 8.0) und 20 JLl Lysozym (10 mg/ml) resuspendiert und 10 min bei RT
inkubiert. Nach 1-minütigem Kochen wurde die Lösung 10 min bei 13000xg zentrifugiert. Das
Sediment wurde mit einem Zahnstocher entfernt, zum Überstand wurden 8 JLl CTABIonenaustauscher (5% CTAB in 500 rnM NaCl) zugegeben. Nach 10 min Zentrifugation bei
13000xg wurde der Überstand verworfen, das Sediment in 300 JLl 1.2 M NaCl aufgenommen
und die Plasmid-DNA durch Zugabe von 750 JLl Ethanol 10 min bei -70°C gefallt. Die
19
ausgefallene Plasmid-DNA wurde dann 10 min bei 13000xg pelletiert und nochmals mit 70%
Ethanol gewaschen.
3.3.2 Plasmid DNA Präparation
Die Bakterien wurden in 2 m1 Nährmedium (L-Broth) mit dem Antibiotikum Ampicillin (100
J.tg/ml) etwa 4 Stunden bei 37°C geschüttelt. 500 J.tl dieser Vorkultur dienten zum Animpfen von
250 m1 Selektionsmedium. Die Bakterien wurden dann über Nacht bei 37°C im ErlenmeyerKolben geschüttelt.
Die über Nacht inkubierte Bakterien-Suspension wurde 10 min bei 3600xg und 4°C
abzentrifugiert. Das Sediment wurde in 5 m1 einer Tris-Saccharose-Lösung (50 mM Tris pH 8.0,
25% Saccharose) resuspendiert und in Reckmann SW40 Zentrifugenröhrchen gefüllt. Dann
wurden 5 m1 einer Lysozym-Lösung (2 mg/ml Lysozym, 100 mM EDTA pH 8.0, 0.1% Triton
X-100) zugegeben. Das Gemisch wurde bei RT 10 min geschüttelt und anschließend 10 min bei
70°C inkubiert. Die Lösung wurde dann 1 Stunde in einer Reckman Ultrazentrifuge bei 30000xg
(4°C) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand in ein Zentrifugenglas gefüllt
und 10 m1 einer PEG-Lösung (20% PEG 6000, 1 M NaCl, 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA
pH 8.0) dazugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei RT wurde das Gemisch bei 2400xg
zentrifugiert. Das Sediment wurde in TE-Puffer (pH 8.0) 1 Stunde bei 37°C gelöst. Nach
Zugabe von 4.2 g CsCl und 150
~-tl
Ethidiumbromid (10 mg/ml) wurde die Lösung in Reckman
VTi65 Ultrazentrifugenröhrchen verteilt und 16 Stunden bei 55000 rpm und 20°C in einer
Reckman Ultrazentrifuge (Rotortyp: VTi65-Vertikalrotor) zentrifugiert. Die Plasmidbanden
wurden anschließend mit Hilfe einer Spritze abgezogen und nochmals für weitere 6 Stunden
unter den selben Bedingungen zentrifugiert. Nach Abziehen der Plasmidbanden wurden zwei
Teile Wasser zu der Lösung gegeben und das Ethidiumbromid mit wassergesättigtem 1-Butanol
extrahiert. Die DNA wurde aus der wässrigen Phase mit Ethanol präzipitiert.
3.4 Klonierungstechniken
3.4.1 Fragmentierung von DNA-Molekülen durch Restriktionsendonukleasen
In einer wässrigen DNA-Lösung wurde durch Zugabe von 10-fach konzentrierten Puffer/SalzLösungen ein, für die jeweilige Restriktionsendonuklease notwendiges Milieu, entsprechend den
Herstellerangaben, eingestellt. Pro 1-tg DNA wurden 2-3 U Restriktionsendonuklease zugegeben.
Das Reaktionsvolumen betrug dabei mindestens das 10-fache des Volumens der zugesetzten
Enzym/Glycerin-Lösung. Die Inkubation der Reaktionsansätze erfolgte (wenn vom Hersteller
nicht anders empfohlen) bei 37°C für mindestens 2 h.
20
3.4.2 Dephosphorylierung von DNA
Die DNA wurde mit 1
~tl
(2U/~tl)
Alkalischer Phosphatase
in einem Endvolumen von 50
~tl
1x
CIP-Puffer (50 mM Tris pH 9, 1 mM MgC12 , 0.1 mM ZnC12 , 1 mM Spermidin) versetzt. Die
Abspaltung der Phosphatgruppe erfolgte bei 5' -überhängenden Enden durch 30 min Reaktion bei
37°C. Danach wurde erneut 1
~tl
Enzym zugesetzt und für weitere 30 min bei 37°C inkubiert.
Bei 3'-überhängenden und glatten Enden wurde 15 min bei 37°C und 15 min bei 56°C
dephosphoryliert, dann 1
~tl
Enzym zugefügt und nochmals je 15 min bei 37°C und 56°C
dephosphoryliert. In beiden Fällen wurden 42.5
Tris pH 8, 1mM EDTA pH 8) und 2.5
~tl
~tl
H20, 10
~tl
TNE (1x: 100 mM NaCl, 10 mM
20% SDS zugegeben und 15 min bei 68°C inkubiert.
Danach erfolgt eine Phenol/Chloroform-Extraktion und die Präzipitation der DNA.
3.4.3 Phosphorylierung von Oligonukleotiden und Linkern
Etwa 2 Jtg Oligonukleotid oder Linker-DNA wurden mit 1
Polynukleotid-Kinase (10
U/~tl)
~tl
10 mM ATP und 1
~tl
mit Linker-Kinase-Puffer (66
in einem Endvolumen von 10
~tl
T4-
mM Tris pH 7.6, 10 mM MgC1 2 , 15 mM DTT, 1 mM Spermidin, 1 mM ATP, 0.2 mg/ml BSA)
versetzt. Die Reaktion wurde nach einer Stunde Inkubation bei 37°C durch Einfrieren bei -20°C
abgestoppt.
3.4.4 Auffüllen von 5 1-Überhängen
Die DNA wurde mit 2
~tl
10 mM DTT, 1 ~tl 10 mM dNTP-Mix (10 mM dATP, 10 mM dCTP,
10 mM dGTP, 10 mM dTTP, 10 mM Tris pH 7.5) und 1
(Klenow-Fragment, 5
U/~tl)
in einem Endvolumen von 20
~tl
~tl
E. coli DNA-Polymerase I
1x Polymerase-Puffer (7 mM Tris
pH 7.5, 7 mM MgC12 , 50 mM NaCl) versetzt. Nach 30 min Reaktion bei RT erfolgte eine
Phenol/Chloroform-Extraktion. 3'-Überhänge werden bei dieser Prozedur abgebaut.
3.4.5 Ligation von DNA-Fragmenten
Die zu ligierenden DNA-Fragmente wurden mit 2
U/~tl)
versetzt und in einem Endvolumen von 20
~tl
10 mM ATP und 1
~tl
T4 DNA-Ligase (2
~tl
in 50 mM Tris pH 7.4, 10 mM MgC12 , 10
mM DTT, 1 mM Spermidin, 1 mM ATP für 16 h bei 15°C inkubiert. Wenn sich die zu
ligierenden DNA-Fragmente in "low-melting" Agarose befanden, wurde diese 10 min bei 68°C
geschmolzen und nach dem Abkühlen auf 42°C sofort mit obigen Lösungen versetzt. Für LinkerLigationen wurden 2 ~tl des phosphorylierten Linkers benutzt.
21
3.4.6 cDNA-Synthese (Erststrangsynthese)
5 tJ-g poly A + -RNA wurden mit 1,25 tJ-1 Oligo d(T) 18 (200 ng/tJ-1) in einem Endvolumen von 30
tJ-l 10 min bei 90°C erhitzt und in Eiswasser abgekühlt. Nach Zugabe von 5 !J-l lOx RTC-Puffer
(500 mM Tris pH 8.15 [bei 41°C], 60 mM MgC1 2 , 400 mM KCl, 10 mM DTT), 2,5 tJ-1 lOx
dNTPs (25 mM), 1,5 tJ-1 RNasin (40 U/tJ-1) und 1 tJ-1 AMV-Reverser Transkriptase (20-30 U/tJ-1)
wurde der Ansatz in einem Volumen von 50 !J-l eine Stunde bei 41 °C inkubiert.
Für PCR-Amplifikationen wurde der Ansatz nach thermischer Inaktivierung der Reversen
Transkriptase (30 min bei 52°C) mit TE auf 500 !J-l aufgefüllt.
3.4.7 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
5
tJ-l
einer
Erststrangreaktion
(siehe
cDNA-Synthese)
wurden
mit
je
250
ng
Amplifikationsprimern, die für das 3'- und 5'-Ende des zu amplifizierenden DNA-Fragmentes
spezifisch waren, in 1x PCR-Puffer (10 mM Tris pH 8.9 (bei 25°C), 40 mM NaCl, 2 mM
MgC1 2 , 0.01% Gelatine), 250 !J-M dNTPs und 5 U Tag-Polymerase in einer 100 tJ-l Reaktion
amplifiziert. Dabei wurden meist 35 Zyklen mit den folgenden Grenzwerten durchgeführt:
Denaturierung:
1 min bei 94°C
Annealing:
2 min bei 45°C
Extension:
2 min bei 72°C
Nach Beendigung der programmierten Zyklen wurden 10 !J-l aus der Reaktion auf einem
Polyacrylamidgel analysiert.
3.4.8 Sequenzierung von DNA
Cäsiumchlorid-gereinigte Plasmid-DNA wurde nach der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode von
Sanger et al. (1977) mit dem "T7-Sequenase-Kit" der Firma USB, Cleveland Ohio sequenziert.
Die Durchführung der Reaktion erfolgte nach den Angaben des Herstellers. 5 tJ-g Plasmid-DNA
wurden mit 0.2 mM EDTA, 0.2 M NaOH denaturiert. Die denaturierte DNA wurde mit 2.5 ng
bzw. 40 ng der entsprechenden Sequenzier-Primer oder den für die Polymerase-Kettenreaktion
verwendeten Oligonukleotide gemischt, auf 65°C erhitzt und langsam auf RT abgekühlt. Nach
einer kurzen Strangverlängerung mit a-35S-dATP erfolgt die eigentliche Kettenabbruch-Reaktion
mit den vier Didesoxy-Nukleosidtriphosphaten. Nach Abstoppen der Reaktion mit FormamidProbenpuffer (20 mM EDTA pH 7.8, 99% Formamid, 0.03% Xylencyanol, 0.03%
Bromphenolblau) und 3 min Kochen wurden die Proben auf einem denaturierenden 6%
Polyacrylamid/8.3 M Harnstoff Gel aufgetragen.
22
3.5 DNA-Gelelektrophorese
3.5.1 Agarose-Gelelektrophorese
Je nach Größe der aufzutrennenden Fragmente wurden 0.8% bis 1.5% Agarose-Gele benutzt. Es
handelt sich hierbei um Mini-Gele: Gelvolumen 50 ml, Puffervolumen 100 ml, Taschenvolumen
25
~tl.
Das Gel ist völlig von Puffer bedeckt. Die entsprechende Menge Agarose Typ II wurde in
50 ml1x TBE (90 mM Tris pH 8.3, 90 mM krist. Borsäure, 2.5 mM EDTA pH 8) gegeben und
5 min im Mikrowellenherd aufgekocht. Für "low melting" Gele wurde Agarose Typ VII
verwendet. Nach Zugabe von 3
~tl
Ethidiumbromid (10 mg/ml) wurde das Gel gegossen und ca.
30 min abkühlen gelassen. Nach Eingießen des Laufpuffers (1x TBE) wurde der Kamm entfernt
und die Proben in Glycerin-Probenpuffer (10 mM EDTA, 10% Glycerin, 0.1% SDS, 0,02%
Bromphenolblau) aufgetragen. Die Auftrennung erfolgte bei etwa 100 V. Die DNA-Banden
werden unter UV (256 nm) sichtbar gemacht.
3.5 .2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Je nach Größe der aufzutrennenden Fragmente wurden 6% bis 10% Polyacrylamid-Gele
verwendet. Das Gel wurde zwischen zwei 14 x 15 cm große Glasplatten mit 1 mm dicken
Abstandshaltern gegossen. Für ein 6%
Gel benötigt man 6 ml einer deionisierten
Acrylamid:Bisacrylamid (30:0.8) Stammlösung, die mit 3 ml TBE (1x: 90 mM Tris pH 8.3, 90
mM krist. Borsäure, 2.5 mM EDTA pH 8.0) und 21 ml Wasser versetzt wird. Nach Zufügen
und Mischen von 25 pl TEMED und 150 ,ul 10% Ammoniumperoxidsulfat-Lösung wurde das
Gel gegossen und ein geeigneter Kamm eingesetzt. Nach Auspolymerisieren des Gels wurde der
Kamm entfernt und die Taschen mit Wasser ausgespült. Die Gelplatten wurden senkrecht in eine
Elektrophorese-Apparatur eingespannt und als Anoden- und Kathodenpuffer je etwa 400 ml 1x
TBE eingefüllt. Nach Auftragen der Proben in Glycerin-Probenpuffer (10 mM EDTA pH 8.0,
10% Glycerin, 0.1% SDS, 0.02% Bromphenolblau)
er.~olgte
die Auftrennung bis zum
Einwandern der Proben ins Gel bei 100 V und danach bei 240 V. Nach Ende der Elektrophorese
wurde das Gel von den Glasplatten entfernt und 15 min unter leichtem Schütteln in 200 ml 1x
Wasser mit 1
~tg/ml
Ethidiumbromid gefärbt. Unter UV (256 nm) werden die DNA-Banden
sichtbar.
3.5.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die Präparation von DNA-Fragmenten nach vorhergehender Auftrennung in Agarosegelen
wurde mit Hilfe von "Elutip"-Ionenaustauschersäulen durchgeführt. Die DNA wurde zuvor in
"low-melting"-Gelen elektrophoretisch aufgetrennt und die gewünschte Bande ausgeschnitten.
23
Nach Schmelzen der Agarose in einem 10 m1 Röhrchen bei 65°C wurden 5 ml NiedrigsalzPuffet (100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.6, 1 mM EDTA) zugegeben und weitere 30 min bei
65°C inkubiert. Eine Elutip-Säule wurde zwischenzeitlich mit 1 m1 Hochsalz-Puffer (1 M NaCl,
20 mM Tris pH 7.6, 1 mM EDTA) hydriert und mit 5 m1 Niedrigsalz-Puffer äquilibriert. Die
geschmolzene Agarose in Niedrigsalz-Puffer wurde dann über die Säule gegeben und die
adsorbierte DNA mit 3 ml Niedrigsalz-Puffer gewaschen. Anschließend wurde die DNA mit 400
~tl
Hochsalz-Puffer eluiert und mit Ethanol präzipitiert.
3.5 .4 Denaturierende Polyacrylamid-Harnstoff-Gele
Diese
Gele dienen zur
Auftrennung
von
DNA unter
denaturierenden Bedingungen,
hervorgerufen durch die 8.3 M Harnstoff-Konzentration und die hohe Temperatur während der
Auftrennung. Es wurden 20x39 cm große Glasplatten und 0.1 mm dicke Abstandshaltern
benutzt. Um diese dünnen Gele an die Glasplatte zu polymerisieren, wurden die beiden
Glasplatten vorbehandelt. Auf der Glasplatte mit dem Ausschnitt wurden 1.5 ml 5 %-iges
Dimethyldichlor-Silan (gelöst in Tetrachlorkohlenstoff), auf der ungeschnittenen Glasplatte eine
Mischung von 3.3 ml Haftsilan und 100
~tl
100% Essigsäure verteilt und trocknen gelassen.
Danach wurden die Glasplatten gut poliert und mit den 0.1 mm dicken Abstandshaltern
zusammengebaut. Für ein 6% Gel werden 30 m1 einer 6% Acrylamid-Lösung mit 8.3 M
Harnstoff benötigt [100 ml einer deionisierten Acrylamid:Bisacrylamid (30:0.8) Stammlösung
werden mit 50 ml lOx TBE (1x: 90 mM Tris pH 8.3, 90 mM krist. Borsäure, 2.5 mM EDTA
pH 8.0) versetzt und darin 250 g Harnstoff gelöst. Die mit Wasser auf 500 ml aufgefüllte
Lösung wird noch steril filtriert und bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt]. Nach Zufügen von 30
TEMED und 300
~tl
~tl
10% Ammoniumperoxidsulfat-Lösung wurde das Gel gegossen und der
Kamm eingesetzt. Nach etwa 30 min ist das Gel polymerisiert.
Die Gelplatte wurde dann senkrecht in eine Elektrophorese-Apparatur eingespannt und zur
gleichmäßigen Wärmeverteilung mit einer Aluminiumplatte bedeckt.
Als Anoden- und
Kathodenpuffer dienten je etwa 375 m1 1x TBE. Der Kamm wurde entfernt und die Taschen mit
einer Spritze ausgespült. Zur Erwärmung des Gels diente ein Vorlauf von 30 min bei 25 bis 30
Watt. Die in 3
~tl
Formamid-Probenpuffer (20 mM EDTA pH 7.8, 99% Formamid, 0.03%
Xylencyanol, 0.03% Bromphenolblau) gelösten Proben wurden 3 min auf 95°C erhitzt und dann
auf Eis gestellt. Nachdem die Taschen nochmals ausgespült wurden, wurden die Proben
aufgetragen. Die Auftrennung erfolgte bei 25 bis 30 Watt bis zur gewünschten Laufstrecke. Mit
einem dünnen Spatel wurde dann die Dimethyldichlor-Silan beschichtete Glasplatte abgehoben.
Durch sofortiges Einlegen in 10% Essigsäure für 10 min wurde der Harnstoff herausgelöst. Das
Gel wurde dann, nach Spülen mit Wasser, für etwa zwei Stunden bei 80°C auf der Glasplatte
getrocknet und anschließend bei -80°C autoradiographiert.
24
3.6 Zellkultur
3.6.1 Trypsinieren von Zellen
Die Zellen wurden nach Absaugen des Mediums und einmal Waschen mit PBS mit 0.05%
Trypsin gespült und mit 0.05% Trypsin (1ml pro 10 cm Kulturschale) bis zu ihrem Ablösen bei
37°C im Brutschrank inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden in 5 ml Kulturmedium
aufgenommen. Vor dem Ausplattieren von Zellen wurden diese aus dem trypsinhaltigen Medium
abzentrifugiert (3 min, 300-400xg) und in neuem Kulturmedium aufgenommen.
3.6.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Logarithmisch wachsende Zellen wurden abtrypsiniert,
abzentrifugiert und in kaltem
Einfriermedium aufgenommen. Die Zellen wurden zunächst 30 min auf Eis inkubiert, dann in
einem Styrorpor-Behälter auf -80°C abgekühlt (über Nacht) und schließlich in flüssigem
Stickstoff aufbewahrt.
Das Auftauen von eingefrorenen Zellen erfolgte im Wasserbad bei 37°C. Danach wurden die
Zellen in 10 ml Kulturmedium aufgenommen, abzentrifugiert und zur Kultivierung erneut in
Medium aufgenommen und auf Zellkulturschalen verteilt.
3.6.3 Behandlung von Zellen mit Induktoren
Die Induktion von Zellen mit dem Phorbolester TPA (Endkonzentration: 60 ng/ml) oder dem
cAMP-Analogon 8-Bromoadenosin-3 1 ;5 1-zyklisches Monophosphat (Endkonzentration: 1 mM)
erfolgte durch direkte Zugabe der Substanzen ins Medium.
Bei UV -Bestrahlung wurden die Zellen nach zweimaligem Waschen mit PBS ohne Puffer oder
Medium in der Petrischale mit offenem Deckel mit 30 Jfm2 bestrahlt. Das ursprüngliche Medium
wurde zurück auf die Zellen gegeben. Die Kontrollzellen wurden, mit Außnahme der
Bestrahlung, in gleicher Weise behandelt.
3. 7 Poly A +-RNA-Präparation
Jede Petrischale wurde zweimal mit 1Ö'm1 kaltem PBS (123 mM NaCl, 17 mM NA2HP04 , 2.5
mM KH2P04 , pH 7.3) gewaschen. Die Zellen eines Probenpunktes wurden in insgesamt 10 ml
kaltem STE (100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA pH 7.8), 300 J.tg/ml Proteinase
Kund 0.5% SDS mit einem Gummischaber abgeschabt und in ein 50 ml Zentrifugen-Röhrchen
überführt. Dann wurde das Lysat 30 Sekunden mit einem Ultra-Turrax-Homogenisator
homogenisiert. Danach erfolgte eine Inkubation für 60 min bei 37°C. Der Lösung wurde NaCl
bis zu einer Endkonzentration von 0.5 M zugesetzt und etwa 100 mg Oligo-dT-VII-Cellulose (in
25
HSB [0.3 M NaCl, 10 mM Tris pH 7.5, 5 mM EDTA, pH 8.0, 0.1% SDS] resuspendiert)
zugegeben. Durch Mischen über Nacht auf einer Rotationsapparatur wurde die poly A +-RNA an
die Oligo-dT-VII-Cellulose adsorbiert. Die Oligo-dT-VII-Cellulose wurde 2 min bei 2000xg
zentrifugiert und dreimal mit 10 m1 HSB gewaschen. Die E260 des HSB nach dem dritten
Waschgang sollte
< 0.05 sein, wenn die rRNA zum größten Teil abgetrennt wurde. Die RNA
wurde dann mit sterilem Wasser von der Oligo-dT-VII-Cellulose eluiert. Dazu wurde die OligodT-VII-Cellulose dreimal mit je 1 m1 Wasser und einmal mit 1.5 m1 Wasser gewaschen. Der
erste Milliliter wurde verworfen und die restlichen 3.5 ml RNA-Lösung vereinigt und
anschließend nochmals zentrifugiert, um die Oligo-dT-VII-Cellulose vollständig abzutrennen.
300
~-tl
davon wurden zur Konzentrationsbestimmung abgenommen. Zu den restlichen 3.2 m1
wurden in einem 15 m1 Zentrifugen-Röhrchen 10 ftg tRNA gegeben und die RNA mit Ethanol
ausgefallt Die Oligo-dT-VII-Cellulose wurde durch zweimaliges Waschen mit 10 m1 0.1 M
NaOH, 5 mM EDTA pH 8.0, fünfmaliges Waschen mit Wasser und zweimaliges Waschen mit
HSB regeneriert.
3.8 Radioaktive Markierung von DNA und RNA
3.8.1 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
50 bis 100 ng eines gereinigten DNA-Fragments wurden mit 5 ~-tl a-32P-dCTP mit Hilfe des
Prime it™-Kits (Stratagene) gemäß dem Herstellerprotokoll radioaktiv markiert. Um nicht
eingebaute radioaktive Nukleotide abzutrennen, wurde die DNA dreimal mit Ethanol gefallt, mit
200
~-tl
Ethanol (80%) gewaschen und die getrocknete DNA in 200
~-tl
Wasser gelöst. Der
Gesamteinbau betrug im Durchschnitt 5x 105 cpm/ng DNA.
3.8.2 Radioaktive Markierung von RNA durch "in vitro" Transkription.
Für die "in vitro" Transkription wurde der Vektor pGEM-4 (Promega) mit Promotersequenzen
für SP6- und T7-Bakteriophagen-RNA-Polymerase ausgewählt, in den die MMP-cDNA
Fragmente einkloniert wurden. Um die Transkription von Plasmid DNA zu vermeiden wurden
die Konstrukte durch Restriktionsverdau linearisiert. Dies geschieht durch Schneiden mit
Restriktionsenzymen, deren Erkennungsstelle in der MCS liegt, die sich distal zur RNAPolymerase Initiationsstelle befindet. Da der pGEM-Vektor beidseitig der MCS eine
Phagenpromotersequenz besitzt, können durch unterschiedliche Restriktionsverdaus eines
jeweiligen Konstrukts sowohl antisense, als auch sense RNA-Transkripte hergestellt werden.
Nach dem Verdau wurden die linearisierten Plasmide mit Phenol/Chloroform extrahiert und
präzipitiert. Nach dem Waschen und Trocknen der DNA wurde sie in sterilem Wasser gelöst
und die Konzentration auf 1 ~-tgl~-tl eingestellt.
26
Zur radioaktiven Markierung des Transkripts wurde a-35S-UTP als Nukleotid verwendet. In
einem 20 ~tl Transkriptionsansatz wurden 0.5 Jtg/pJ DNA in 1x TSC-Puffer (40 mM Tris pH 8,
10 mM MgC1 2 , 20 mM DTT, 10 mM NaCl, 4 mM Spermidin, 50 ~tglml BSA) mit 20 mM
DTT, 2 U RNasin, 625 ~tM rNTPs (ohne UTP), 50 ~tCi a-35S-UTP und 30 U Phagenpolymerase
(T7 oder SP6) inkubiert.
Danach wurde die Plasmid DNA 15 min bei 37°C unter Zugabe von 7.5 Jtg tRNA und 3 U RQ1
DNase verdaut. Danach wurden die Proteine durch eine Phenol/Chlorform-Extraktion extrahiert.
Das RNA-Transkript wurde zur Entfernung nicht eingebauter Nukleotide zweimal mit 2 M
NH 4Ac und 2.5 Volumen Ethanol gefällt. Nach der letzten Zentrifugation (10 min bei 13000
rpm) wurde das Pellet getrocknet und in 50
3 ml Szintillationslösung gemessen, 2
~tl100
~tl
mM DTT aufgenommen. 1 ~tl davon wurde in
wurden auf einem denaturierenden Acrylamid-
Harnstoffgel aufgetrennt. Die restliche Probe wurde wieder in 2 M NH 4Ac und 2.5 Volumen
Ethanol aufgenommen und bis zum Gebrauch bei -80°C aufbewahrt.
3.9 RNA-Transfer auf eine Nylonmembran ("Northern-Blot") und Hybridisierung.
3.9.1 RNA-Transfer auf eine Nylonmembran (nach McMaster und Carmichael1977, sowie
Thomas 1980).
Entprechende Mengen Poly A + RNA wurden in der Vakuumzentrifuge getrocknet, in 5
sterilem Wasser gelöst und in 15
~tl
~tl
Denaturierungspuffer (10 mM NaH2P04/Na2HP04 pH 6.85,
50% DMSO, 30% deionisiertes Glyoxal) aufgenommen und 3 min bei 50°C denaturiert.
Anschließend wurden die Proben auf Eis abgekühlt und 2 ~tl Ladepuffer (50% Glycerin, 10 mM
NaH2P04/Na2HP0 4 pH 6.85, 0.1% Bromphenolblau) zugegeben. Die RNA wurde in einem 1%
Agarosegel aufgetrennt, das zwischen zwei Glasplatten mit 5 mm dicken Abstandshaltern
gegossen war. Am unteren Ende war das Gel mit einem Acrylamidkissen abgedichtet. Die
Elektrophorese erfolgte mit 1x PB (10 mM NaH2P04/Na2HP04 pH 6.85) als Laufpuffer bei 100
V für ca. 3 h. Danach wurde das Gel zur Anfärbung der 'RNA 15 min bei RT in 300 ~tglml
Acridinorange in 1x PB gefärbt, dreimal je 15 min mit 1x PB entfärbt und anschließend die
augefärbte RNA unter UV (256 nm) sichtbar gemacht.
Für den Transfer wurde folgender Aufbau verwendet: In eine Plastikwanne mit 500 ml 20x SSC
(3 M NaCl, 0.3 M Na-Citrat pH 6.5) als Laufmittel wurde eine Glasplatte auf einen
Plasikständer gelegt. Auf die Glasplatte wurden drei mit 20x SSC getränkte 3MM WhatmanFilter gelegt, die seitlich in das Laufmittel hängen. Auf die Filter kam das gefärbte Agarosegel
und darauf eine Nylonmembran (Hybond N+, Amersham), die zuvor mit 20x SSC getränkt war.
Auf die Nylonmembran wurde nochmals ein 3MM Whatman-Filter gelegt. Zwischen den
Schichten darf es keine Luftblasen geben. Schließlich wurde ein Pack Papierhandtücher und eine
Glasplatte zum Beschweren aufgelegt. Durch das nach oben in die Papierhandtücher gesaugte
27
Laufmittel wird die RNA auf die Nylonmembran transferiert. Nach 12-16 h ist der Transfer
abgeschlossen. Die Nylonmembran wurde dann 10 min in 20x SSC gewaschen und mit 0.5 M
NaOH die RNA auf der Membran fixiert.
3.9.2 Hybridisierung radioaktiv markierter DNA-Fragmente an die filtergebundene RNA.
Zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen wurde die Membran (in Folie eingeschweißt) in
50 ml Hybridisierungslösung (4x SSC, 0.02% BSA, 0.02% Ficoll, 0.02% PVP, 3.3% PIPPI
[0.2 M NaH 2P04 , 0.3 M Na2HP04 , 1.5% Na4P20 7), 0.1% SDS) für 1 h bei 65°C inkubiert
und nach Zugabe von 20 p.g/ml Heringssspermien-DNA nochmals für 3 h bei 65°C inkubiert.
Das Volumen der Hybridisierungslösung errechnet sich aus der Fläche der Membran
multipliziert
mit
dem
Faktor
13
und
Addition
von
30%
dieses
Wertes.
Die
Hybridisierungslösung bestand aus: 50 bis 100 ng/ml radioaktiv markierte DNA, 20 p.g/ml
denaturierte Heringsspermien-DNA, 4x SSC, 10 mM EDTA, 0.1% SDS. Die markierte DNA
und Heringsspermien-DNA wurden durch Kochen für 15 min denaturiert und im Eisbad
abgeschreckt, bevor die übrigen Lösungen des Hybridisierungspuffers zugegeben wurde. Die
Hybridisierungslösung wurde zu der Membran in eine Plastikhülle gegeben, zugeschweißt und
schließlich über Nacht in feuchter Atmosphäre bei 65°C inkubiert.
Das Waschen erfolgte für jeweils 30 min bei 65°C in 200 ml:
-2x SSC, 3.3% PIPPI, 0.1% SDS
-1x SSC, 3.3% PIPPI, 0.1% SDS
-1x SSC, 3.3% PIPPI, 0.1% SDS
-0,5x SSC, 3.3% PIPPI, 0.1% SDS
Danach wurde der Filter erneut eingeschweißt und autoradiographiert.
3.10 "In situ" Hybridisierung (nach Wilkinson und Green, 1990)
3.10.1 Behandlung von Objektträgern, Deckgläsern, Glaskästen und Glasfärbegestellen.
Die Objektträger wurden durch aufeinanderfolgendes Eintauchen in 10% HCl/70% Ethanol,
Wasser und 96% Ethanol gespült und im Ofen 5 min bei 150°C getrocknet. Die Beschichtung
erfolgte dann durch 10 sekündiges Eintauchen der Objektträger in eine 2% TESP AlAcetonLösung. Nach zweimaligem Waschen in 100% Aceton und einmal Waschen in Wasser wurden
die Objektträger 15 min bei 42°C im Ofen getrocknet.
Die Deckgläschen wurden in eine Silikon-Lösung getaucht und bei RT getrocknet. Dann wurden
sie in 100% Ethanol durch kurzes Eintauchen gewaschen und ebenfalls bei RT trocknen
gelassen. Die Deckgläschen wurden dann in einem Becherglas gesammelt und im Ofen bei
160°C gebacken.
28
Zur Beseitigung von Spuren von RNase wurden die Glaskästen und Glasfärbegestelle im Ofen
bei 250°C für zwei Stunden gebacken.
3.10.2 Fixierung, Einbettung und Schnitte der Embryonen und Gewebe.
Die aus Mäusen isolierten Embryonen und Gewebe werden über Nacht in einer 4%-igen
Paraformaldehydlösung (4% Paraformaldehyd in lx PBS) bei 4°C fixiert. Dann wurde jedes
Gewebe mit einer Pinzette in eine Einbettkassette transferiert und in einem 1 Liter Becherglas 4
bis 5 hin 600 ml PBS und anschließend für die gleiche Dauer und im gleichen Volumen in einer
0.83%-igen NaCl-Lösung gewässert. Danach wurden sie in einem Becherglas für 5 h unter
ständigem Rühren in 50%-igem Ethanol gehalten. Die weitere Entwässerung und die
darauffolgende Einbettung erfolgte in einem 2 Liter Gewebeeinbettautomaten (Shandon,
Frankfurt) mit folgenden Schritten:
-70% Ethanol: 1x 1 h
-100% Ethanol: 3x 1 h
-Aceton: 2x 1 h
-Xylol: 1x 2 h
-Xylol/Histowax (1:1): 1x 3 h bei 59°C
-Histowax: lx 3 h bei 59°C
Nach Ablauf dieser Prozedur wurden die Gewebe aus den Kassetten herausgenommen und in
vorgewärmte Einbettformen (59°C; Reichert und Jung, Nußloch) gelegt. Die Einbettformen
wurden dann mit flüssigem Wachs (Histowax; 59°C) aufgefüllt und eine Einbettkassette
daraufgedrückt Nach Erkalten des Wachses wurden die Wachsblöcke aus den Einbettformen
genommen.
Zur Herstellung von Gewebeschnitten wurden die Wachsblöcke in die Halterung eines
Mikrotoms (Rotationsmikrotom 2035, Reichert und Jung, Nußloch) eingespannt und parallel
zum Messer ausgerichtet. Es wurden dann Schnitte von 6 bis 8 p.m angefertigt. Diese wurden in
einem Wasserbad bei 42°C geglättet und auf die beschichteten Objektträger aufgezogen.
3.10.3 Vorhybridisierung der Schnitte
Je 19 Objektträger mit Gewebeschnitten, die zur Hybridisierung vorgesehen waren, wurden in
ein Glasfärbegestell transferiert. Die Vorhybridisierung der Schnitte erfolgte durch Eintauchen
der Gestelle in die mit 250 ml der folgenden Lösungen vorbereiteten Glaskästen:
Um die Schnitte zu entwachsen wurden die Färbegestelle je 2x 10 min in Xylol inkubiert. Durch
die folgende absteigende Alkoholreihe wurden die Schnitte gewässert (100% , 95%, 90%, 80%,
70%, 30% Ethanol, je 2 min). Nach zwei Waschschritten in 1x PBS und 0.83% NaCl (je 5 min)
wurden die Schnitte 20 min in 4%-igem Paraformaldehyd/1x PBS fixiert. Nach zweimal
29
Waschen in 1x PBS Ge 5 min) erfolgte ein RNase Verdau im Gewebe mit Proteinase K
(Endkonzentration: 500
~tl/250
ml) in 20 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA für 10 min. Nach
nochmaligem 5 min Waschen in 1x PBS erfolgte eine weitere Fixierung in 4%
Paraformaldehyd/1x PBS für 5 min und nochmaliges Waschen in 1x PBS (5 min). Die
darauffolgende 10 minütige Inkubation in einer Triethanolamin!Essigsäureanhydridlösung (3, 125
ml:0,625 ml/250ml Wasser) diente zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen. Nach jeweils
5 min Waschen in 1x PBS und 0.83% Na Cl wurden die Gewebeschnitte in einer aufsteigenden
Alkoholreihe (s. o.) entwässert und danach bei RT getrocknet.
3.10.4 Hybridisierung der Schnitte
Die in Ethanol aufbewahrte radioaktiv markierte RNA Probe (s. 3.8.2) wurde 10 min bei
13000xg abzentrifugiert und einmal mit 70%-igem Ethanol gewaschen und nochmals
zentrifugiert.
Das
Präzipitat
Hybridisierungsvolumens)
wurde
getrocknet und
aufgenommen.
Für
19
in
100
mM
Objektträger
DTT
(1/10
des
wurden
900
m1
Hybridisierungspuffer (1x Hyb-Salz [10x Hyb-salt: 0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.38% NaH2P04
pH 6.8, 50 mM EDTA, 3M NaCl, 0.1 M Tris pH 8], 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 10
mM DTT, 1 p.l tRNA [10 mg/ml]) angesetzt. Vor Zugabe der Probe zum Hybridisierungspuffer
wurde diese 5 min bei 80°C denaturiert. Dann wurden 40 p.l Hybridisierungslösung mit einer
Probenkonzentration von 1 bis 2x 105 cpm/ p.l auf dem Objektträger mit den vorhybridisierten
Schnitten gleichmäßig verteilt und mit einem silikonisierten Deckgläschen abgedeckt. Zur
Inkubation der Objektträger wurde eine Glasschale mit drei Lagen 3MM Whatman-Filter und
einer Lage Aluminiumfolie ausgelegt. Das Filterpapier wurde mit 2x SSC, 50% Formamid
getränkt. Die Objektträger wurden in die Schale gelegt, diese mit einem Deckel abgedichtet und
über Nacht bei 50°C im Wasserbad inkubiert.
3.10.5 Waschen der Schnitte
Nach der Inkubation wurden die Objektträger aus der feuchten Kammer genommen und wieder
in die Glasfärbegestelle gestellt. Das Waschen der Schnitte erfolgt unter stringenten Bedingungen
durch Eintauchen der Gestelle in die mit 250 m1 der folgenden Lösungen vorbereiteten
Glaskästen:
-2x SSC, 50% Formamid, 20 mM ß-Mercaptoethanol: 15 min bei 37°C
-2x SSC, 50% Formamid, 20 mM ß-Mercaptoethanol: 30 min bei 65°C
-2x SSC, 50% Formamid, 20 mM ß-Mercaptoethanol: 2 h bei 37°C
-NTE (0,5 M NaCl, 10 mM Tris pH 8.0, 5 mM EDTA): 15 min bei 37°C
-NTE mit RNase (Endkonz.: 20 p.g/ml): 15 min bei 37°C
-NTE: 15 min bei 37°C
30
-2x SSC, 50% Formamid, 20 mM ß-Mercaptoethanol: 30 min bei 37°C
-2x SSC: 15 min bei RT
-O.lx SSC: 15 min bei RT
Eine Entwässerung der Schnitte erfolgte in einer aufsteigenden Alkoholreihe für je 2 min:
-30% Ethanol, 0.25 M NH40Ac
-50% Ethanol, 0.25 M NH40Ac
-70% Ethanol, 0.25 M NH 40Ac
-80% Ethanol
-90% Ethanol
-95% Ethanol
-100% Ethanol
Anschließend wurden die Objektträger bei RT getrocknet, mit einem Klebeband in einer
Expositionskassette befestigt, und über Nacht ein Röntgenfilm (Hyper™-MP) aufgelegt.
3.10.6 Beschichten der Objektträger mit einer Photoemulsion
Die LM-1 Photoemulsion wurde in der Dunkelkammer in einem Wasserbad bei 42°C
geschmolzen und 5 m1 davon mit Wasser 1: 1 verdünnt. Das Gemisch wurde dann möglichst
blasenfrei in ein Gefäß eingefüllt, das speziell zur Beschichtung der Objektträger angefertigt
wurde. Diese Vorrichtung wurde dann in das Wasserbad (42°C) gestellt, um die Photoemulsion
flüssig zu halten. Die Blasen wurden aus der Photoemulsion entfernt, dann wurden die
Objektträger nacheinander, durch Eintauchen, mit der Photoemulsion beschichtet. Dabei sollte
die Photoemulsion so gleichmäßig wie möglich auf den Objektträgern verteilt sein. Die
beschichteten Objektträger wurden im Dunkeln 2 h getrocknet. Danach wurden sie in
Polyoxymethylen Färbegestelle gestellt, in die entsprechenden Färbetröge eingepackt und mit
Aluminiumfolie umwickelt. Die Objektträger wurden so 10 bis 14 Tage bei 4°C exponiert.
3.10.7 Entwickeln, Färben und Mikroskopieren der Schnitte
Nach Ablaufen der Expositionsdauer wurden die Objektträger in folgenden Lösungen entwickelt:
-16% Kodak D-19 Entwickler: 3 min
-2,5% Eisessig: 1 min
-30% Sodiumthiosulfat: 3 min
-Wasser: 2x 10 min und 1x 30 min
Die Schnitte wurden getrocknet und mit einer Giemsa-Lösung (4%
Giemsa, 4 mM
NaH2P04 /Na2HP0 4, pH 6.0) gefärbt. Nach Trocknen der Objektträger wurden sie mit dem
Eindeckmittel Entellan eingedeckelt Die so hergestellten Präparate wurden anschließend im
Zeiss Axioskop-Mikroskop im Hell- und Dunkelfeld analysiert und photographiert. Zur
31
Betrachtung im Dunkelfeld mit Objektiven von kleiner Vergrößerung (1,25x, 2.5x, Sx) wurde
ein Dunkelfeldilluminator der Firma Zeiss verwendet, der ins Mikroskop anstelle des
Kondensors eingesetzt wurde. Zur Photographie wurden Farbdiafilme (Kodak Extrachrome 320T
für Kunstlicht) oder Schwarzweißbildfilme (Ilford HPS 400) verwendet.
32
4. ERGEBNISSE
Eine Reihe von physiologischen Prozessen benötigt einen regelmäßigen und kontrollierten
Matrixauf- und abbau, damit die Gewebemorphologie und -funktion aufrecht erhalten wird.
Matrixmetalloproteinasen sind in weitem Umfang am spezifischen Abbau der ECM
Komponenten beteiligt. Eine besonders hohe MMP-Aktivität wird während embryonaler
Prozessen erwartet, bei denen ein schneller Matrixumbau notwendig ist (Matrisian, 1992). Aber
auch unter pathologischen Bedingungen (z. B. bei chronischen Entzündungskrankheiten) sind
hohe, unkontrollierte MMP-Aktivitäten die Regel (Alexander und Werb, 1989).
"In vitro", d. h. im Zellkultursystem, ist die Substratspezifität der verschiedenen Enzyme, als
auch ihre Regulation der Aktivität, sowohl auf RNA-Ebene als auch auf Proteinebene gut
untersucht. Ob diese "in vitro" Daten auf die Situation des Gesamtorganismus übertragbar sind,
konnte bislang noch nicht gezeigt werden.
Mit der Maus als Modellsystem und der schnellen Entwicklung der molekularbiologischen
Methoden besteht nun die Möglichkeit Gene im Mausorganismus konstitutiv zu exprimieren
("Transgene") oder durch homologe Rekombination zu eliminieren ("Knock out"). Somit kann
die Funktion eines Enzyms per se, entweder durch Funktionsverlust, oder mittels einer
konstitutiv erhöhten Aktivität untersucht werden. Letzteres könnte ein Modellsystem für
verschiedene pathologische Prozesse darstellen. Unbedingte Voraussetzung für die Untersuchung
der Expression, der Regulation, und der Funktion von Metalloproteinasen im Maussystem war
die Klonierung von mausspezifischen MMP-Proben.
4.1 Klonierung mausspezifischer MMP cDNAs und ihre Homologie zu den entsprechenden
Sequenzen in Mensch und Ratte
Um mausspezifische MMP cDNA-Sequenzen zu isolieren, wurden die beiden Mauszellinien
NIH3T3 und LuSVX jeweils 8 und 10 Stunden mit dem Tumorpromoter TPA (12-0Tetradecanoyl-Phorbol-13-Acetat) behandelt. Ein Stimulation der Zellen mit TPA wurde deshalb
gewählt, da diese Substanz die Expression verschiedener Metalloproteinasen induziert, z. B. die
Expression der menschlichen MMPs Kollagenase I und Stromelysin 1 (Angel et al., 1987a,b),
wie auch die Expression von Stromelysin 1 und Stromelysin 2 der Ratte (Breathnach et al.,
1987). Tatsächlich konnte eine verstärkte MMP-Aktivität im Medium beider Zellinien, gemessen
mit der Hilfe des Zymogramm-Assays, nach TPA-Behandlung beobachtet werden (Rüdiger
Vallon, persönliche Mitteilung). Aus den TPA behandelten Zellen wurde die poly A + RNA
isoliert und mittels reverser Transkription einzelsträngige cDNA hergestellt. Diese cDNAs
wurden für eine Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) eingesetzt, in der mit spezifischen
Oligonukleotiden definierte cDNA-Bereiche amplifiziert werden sollten.
33
Die Auswahl der Oligonukleotide erfolgte anband eines Sequenzvergleiches zwischen den schon
bekannten Kollagenase I Nukleotidsequenzen von Mensch (Goldberg et al., 1986) und Ratte
(Quinn et al., 1990). Unter der Annahme, daß diese Regionen auch in den Maus MMPs
konserviert sind, wurden Bereiche mit sehr hoher Homologie (>90%) zwischen den beiden
Sequenzen zur Synthese spezifischer Oligonukleotide ausgewählt. Diese wurden dann in
folgenden Kombinationen für die PCR eingesetzt:
- coll-7/coll-13 (Sequenzen sind identisch zu den Bereichen zwischen Nukleotid 258-289 und
Nukleotid 641-691 der Ratten Kollagenase I, Quinn et al., 1990; s. Abb.2e)
- coll-8/coll-12 (Sequenzen sind identisch zu den Bereichen zwischen Nukleotid 570-601 und
Nukleotid 1259-1290 der Ratten Kollagenase I, Quinn et al., 1990; s. Abb.2e).
Aufgrund der hohen Homologie der verschiedenen Metalloproteinasen untereinander sollten die
ausgewählten Oligonukleotidsequenzen auch mit den entsprechenden Sequenzbereichen der
Stromelysine hybridisieren. Um die Sequenz der 72 kD Typ IV Kollagenase der Maus zu
isolieren, wurden Sequenzen aus den Bereichen der Pro-Domäne (coll-15: entspricht der Sequenz
im Bereich zwischen Nukleotid 202-230; s. Abb.2e) und der der Zink-bindenden Domäne (coll16: entspricht der Sequenz im Bereich zwischen Nukleotid 1108-1137; s. Abb.2e) der
menschlichen 72 kD Typ IV Kollagena$e zur Synthese spezifischer Oligonukleotide ausgewählt
(Collier et al., 1988).
Durch die PCR-Amplifikation wurde pro Oligonukleotidkombination ein cDNA-Fragment mit
einer spezifischen Länge erhalten. Die Fragmente wurden durch Gelelektrophorese aufgereinigt
und in den Vektor pAZ (ein Derivat von pSP65; U. Günthert, persönliche Mitteilung) kloniert
und anschließend sequenziert. Eine schematische Darstellung der Proteinbereiche, für die die
klonierten cDNAs kodieren, und ihre Lokalisation im gesamten MMP-Molekül zeigt Abb.2e.
Die Positionen der einzelnen Oligonukleotide ist in Form von Pfeilen markiert. Die erhaltenen
Nukleotidsequenzen wurden in der Sequenzdatenbank mit schon bekannten MMP-Sequenzen
anderer Spezies verglichen.
Aus der NIH3T3-Zellinie konnte mit der Oligonukleotid-Kombination coll-8/coll-12 ein 730 bp
Fragment isoliert werden. Der Sequenzvergleich ergab, daß die Sequenz eine 91 %-ige
Homologie zum Stromelysin 2 (MMP-10) der Ratte besaß (Breathnach et al., 1987), während
gegenüber dem Stromelysin 1 der Ratte (Matrisian et al., 1985) oder dem bereits klonierten
Stromelysin 1 der Maus (Ostrowski et al., 1988) nur eine 75%-ige bzw. 76%-ige Homologie zu
verzeichnen war. Dies läßt darauf schließen, daß es sich bei diesem Klon um die Sequenz des
Stromelysin 2 der Maus handelt. Die Homologie zur entsprechenden menschlichen Sequenz
(Muller et al., 1988) betrug nur 77% (Abb.2a). Aus der LuSVX-Zellinie konnten, je nach
Oligonukleotidkombination, Fragmente mit unterschiedlichen Längen isoliert werden. Die
Amplifikation mit der Oligonukleotid-Kombination coll-7/coll-13 ergab ein 430 bp Fragment,
34
dessen abgeleitete Aminosäuresequenz identisch zum Stromelysin 1 (MMP-3) war, das aus einem
Plattenepithelzellkarzinom der Maus isoliert wurde (Ostrowski et al., 1988). Ein Vergleich mit
den entsprechenden Sequenzen aus der Ratte (Matrisian et al., 1985) und vom Menschen
(Whitham et al., 1986) zeigte eine 93%-ige bzw. eine 83%-ige Homologie (Abb.2b). Die
Isolierung eines 935 bp Fragments war mit der Kombination coll-15/coll-16 aus der LuSVXZellinie möglich. Der Sequenzvergleich ergab, daß es mit der vor kurzem isolierten 72 kD Typ
IV Kollagenase aus NIH3T3 Zellen identisch ist (nicht dargestellt, Reponen et al., 1992). Wie
erwartet,
enthält
der
klonierte
cDNA-Bereich
die
Sequenz,
die
Ähnlichkeit
zur
kollagenbindenden Domäne des Fibronektin besitzt, und die typisch für Kollagenasen vom Typ
IV ist. Ein weiteres Fragment mit einer Länge von 730 bp (coll-8/coll-12) zeigte eine fast 100%ige Homologie zur kürzlich aus dem Knochengewebe des Schädeldaches isolierten Kollagenase I
cDNA Sequenz der Maus (Henriet et al., 1992). Die beiden Sequenzen unterschieden sich in nur
einem Basenpaar (G/ A) an Position 1239 bezüglich der von Renriet (1992) klonierten Sequenz.
Dies führt zu einem Aminosäureaustausch von Asparagin (Asn, N; Henriet) nach Serin (Ser, S;
hier klonierte Sequenz). Da die von Henriet et al. (1992) klonierte Sequenz an dieser Position
mit der Sequenz der Ratte übereinstimmt, wo an der entsprechenden Position auch ein Asparagin
zu finden ist (Quinn et al., 1990), dürfte der Unterschied im vorliegenden Fall auf einen Fehler
bei der PCR-Amplifikation zurückzuführen sein. Die Homologie der Kollagenase I Sequenz zur
entsprechenden Ratten- bzw. Menschsequenz betrug 93% und 53% (Abb.2c). In Abb.2d ist ein
Sequenzvergleich der abgeleiteten Proteinsequenzen der vier klonierten Maus MMP cDNAs
dargestellt, der 14 Aminosäuren vor dem aktiven Zentrum beginnt und im C-terminalen Bereich
endet. Die durch die Umrahmung markierte Sequenz kennzeichnet den Bereich des Zn2 +bindenden aktiven Zentrums, der einen sehr hohen Grad an Homologie zwischen den
verschiedenen Maus Metalloproteinasen aufweist.
Abb.2: Sequenzvergleichsanalyse der klonierten mausspezifischen MMP-cDNA-Sequenzen mit den entsprechenden
Sequenzen aus Mensch und Ratte. a. Nukleotidsequenzvergleich des Stromelysin 2 Gens der Maus (730 bp) mit den
entsprechenden Sequenzbereichen von Mensch (Nukleotid 645-1303, Muller et al.,1988) und Ratte (Nukleotid 6601315, Breathnach et al., 1987). b. Nukleotidsequenzvergleich des Stromelysin 1 Gens der Maus (430 bp) mit den
entsprechenden Sequenzbereichen von Mensch (Nukleotid 334-685, Whitham et al., 1986) und Ratte (Nukleotid 341692, Matrisian et al., 1985). c. Nukleotidsequenzvergleich des Kollagenase I Gens der Maus (730 bp) mit den
entsprechenden Sequenzbereichen von Mensch (Nukleotid 672-1325, Goldberget al., 1986) und Ratte (602-1258 bp,
Quinn et al., 1990). d. Proteinsequenzvergleich der vier Maus Metalloproteinasen Kollagenase N
(72 kD),
Kollagenase I, Stromelysin 2 und Stromelysin 1. Die durch die Umrahmung markierte Sequenz zeigt den Bereich des
aktiven Zentrums, das einen hohen Grad an Homologie aufweist. e. Schematische Darstellung der Domänenstruktur
von Matrixmetalloproteinasen. Die einzelnen Domänen des gesamten MMP-Moleküls sind in Abb.1 beschrieben. Die
Kästchen unterhalb des Gesamtmoleküls repräsentieren die klonierten Bereiche der vier verschiedenen Maus MMPcDNAs und ihre Lage im Vergleich zum GesamtmoleküL Die klonierte KollagenaseN Sequenz beinhaltet zusätzlich
einen Bereich, der Ähnlichkeit zur kollagenbindenden Domäne des Fibronektins zeigt. Die Pfeile markieren die
Bindungsstellen der verwendeten Oligonukleotide.
35
a
~=.anstrom2
GCACC~.TTTATTCCTCGTTGCTGCTCATGhhCTTGGCCACTCCCTGGGGCTCTTTCACT
GGACCAACTTATTCCTGGTTGCAGCCCATG~~CTTGGCCACTCCCTGGGTCTCTTTCATT
ratstrorr.2
humanstrorr.2
humancol I
AGGTGGACCAACAATTTCAGAGAGTACAACTTACATCGTGTTGCGGCTCATGAACTCGGC
rnousecol I
ACCTGGACAAGCAGTTCCAAAGGCTACAACTTGTTTATTGTTGTAGCCCATGAGCTTGGC
GGACCAATTTATTCCTGGTTGCTGCGCATG~~CTTGGTCACTCCCTGGGTCTCTTTCACT
ratcol I
ACCTGGACAAGCAGCTCCAAAGGCTACAACTTATTTATTGTTGCTGCCCATGAGCTTGGC
CAGCCAACACTGAAGCTTTGATGTACCCACTCTAC~~CTCATTCACAGAGCTCGCCCAGT
humancol I
CATTCTCTTGGACTCTCCCATTCTACTGATATCGGGGCTTTGATGTACCCTAGCTACACC
rnousecol I
CACTCCCTAGGTCTGGATCACTCCAAGGACCCAGGAGCCCTGATGTTTCCCATCTATACC
I 11111 11111111 11111 II IJIJIIIIIIIIIIIIIIIIIII 11111111 I
1111111 11111111111111 II 11111111111 11111111111111111111 I
.
.
I I 111 I
.
111
.
II 11111111111 111111
I
I 1111
I
II
I
I
11111
11111
II 11111 II 111
11111111111111 11111111111111111 1111111111
111111111111111
II
II
II
I II II
II
II
II
II
II
II
11111111
I
II
I
II II
111111
II I 111 111
mousestrorr.2
CCGACAAG~~~GAATCTCTGATGTACCCAGTCTACAGGTTCTCCACAAGCCCAGCT~~CT
ratstrorr.2
CAAACAACAAAGAATCTCTGATGTACCCAGTCTACAGGTTCTCCACGAGC~~GCCF~CA
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ratcol I
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humancol I
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mousecol I
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ratcol I
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humancol I
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mousestroml
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111
4.2 Transkriptionelle Regulation der Maus MMPs in Zellkultur
4.2.1 Induktion der MMP-Expression durch TPA und cAMP
Die isolierten cDNAs wurden benutzt um zu untersuchen, ob die MMP Expression in
Mauszellinien in ähnlicher Weise reguliert wird wie in Ratten oder menschlichen Zellen. In
menschlichen Zellinien, als auch in Rattenzellinien wird die Expression der Kollagenase I und
auch die Expression von Stromelysin 1 und Stromelysin 2 durch extrazelluläre Substanzen
induziert, die über eine Aktivierung der Proteinkinase C wirken (z. B. PDGF, TNF-a; Kerr et
al., 1988; Brenner et al.,1989b). Die Regulation der 72 kD Kollagenase IV Expression verläuft
dagegen über einen anderen Mechanismus.
Der Phorbolester TPA imitiert die natürliche Induktion der Zelle durch Wachstumsfaktoren oder
Hormone, da er aufgrund seiner Fettlöslichkeit in die Zellmembran eindringen und dort an die
Proteinkinase C binden und somit aktivieren kann (Nishizuka, 1984; 1986). Im Gegensatz dazu
wird die MMP Expression durch Substanzen, die durch eine Erhöhung des intrazellulären
cAMP-Spiegels die Proteinkinase A aktivieren, nicht beeinflußt oder sogar gehemmt (Angel und
Karin, 1992).
Zur Untersuchung der MMP Expression im Maussystem wurden LuSVX-Zellen 8 Stunden mit
dem
Phorbolester
TPA
oder
dem
cAMP-Analogon
8-Bromoadenosin-3';5'-zyklisches
Monophosphat behandelt. Danach wurde die poly A + RNA aus behandelten und unbehandelten
Zellen isoliert und diese in einer Northern Blot Analyse auf MMP-Transkripte hin untersucht.
Wie erwartet zeigten F9-Zellen, die aufgrund einer fehlenden AP-1 Aktivität (Kryszke et al.,
1987; Chiu et al., 1988; 1989) und einer fehlenden Gelatine-abbauenden Aktivität (Rüdiger
Vallon, pers. Mitteilung), als negative Kontrolle verwendet wurden, keine Expression der vier
verschiedenen Matrixmetalloproteinasen (Abb.3). Auch die als Positivkontrollen verwendeten Hras transformierten Rattenzellen (rat2) verhalten sich erwartungsgemäß: Sie zeigen, wie auch
andere ras-transformierte Zellen (Garbisa et al., 1987; Collier et al., 1988), eine hohe
Expression der MMPs (Abb.3).
Abb.3 zeigt, daß die Expression der Maus MMPs durch Substanzen induziert wird, die über eine
Aktivierung der Proteinkinase C wirken. Durch TPA, nicht aber durch cAMP, wird die
Expression von Stromelysin 1, Stromelysin 2 und Kollagenase I um ein Vielfaches des
Basalwertes induziert. Während Stromelysin 1 eine hohe basale Expression in den LuSVXZellen besitzt (Abb.3, Kontrolle), ist die basale Expression von Stromelysin 2 sehr niedrig. In
den nicht behandelten Zellen können für Kollagenase I keine Transkripte nachgewiesen werden
(Abb.3, Kontrolle).
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Abb.3: Expression der MMPs in TPA- und cAMP-behandelten Zellen. LuSVX-Zellen wurden nicht (co: Kontrolle)
oder 8 Stunden mit TPA (60 ng/ml) oder c.AMP (1 mM f.c.) behandelt. Danach wurde die poly A + RNA aus den
Zellen isoliert, je 10 pg RNA auf einem Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen. Die
Membran wurde nacheinander mit den 32P-markierten MMP cDNA Proben und einer 32P-markierten GAPDH
cDNA Probe hybridisiert (rechte Seite der Abbildung). RNA aus unbehandelten F9-Zellen und H-ras transformierten
rat2-Zellen dienten als Kontrollen (co).
Weder die TPA-, noch diecAMP-Behandlunghaben einen Einfluß auf die Expression der 72 kD
Kollagenase IV. Ihre Transkriptmenge ist in Kontrollzellen und behandelten Zellen annähernd
gleich (Abb.3). Dies entspricht den Expressionsdaten, die für die menschliche Kollagenase IV
gefunden werden (Collier et al., 1988).
Da die MMP-Sequenzen zwischen Maus und Ratte (s. Abb.2) einen hohen Grad an Homologie
aufweisen, ist eine Kreuzhybridisierung der Maus MMP-cDNA Proben mit MMP-Transkripten
der Ratte zu erwarten. Die gefundenen Transkripte in den Rattenzellen besitzen eine
vergleichbare Größe wie ihre homologen Partner in den Maus Zellen (die genaue
Transkriptgröße ist in Abb.15 angegeben). In den H-ras transformierten Zellen werden mit den
Stromelysin-1 und -2 Proben jeweils noch eine zusätzliche, größere Bande beobachtet. Dies ist
wahrscheinlich auf eine Kreuzhybridisierung mit einer MMP eines höheren Molekulargewichts
(evt. 92 kD Typ IV Kollagenase) zurückzuführen. In Übereinstimmung mit den weit geringeren
Homologien zu den entsprechenden menschlichen Sequenzen von Stromelysin 1, Stromelysin 2
39
und Kollagenase I (s. 3.1), konnte eine Kreuzhybridisierung mit menschlicher RNA unter sehr
stringenten Bedingungen nur für die 72 k:D Kollagenase IV der Maus gefunden werden (nicht
gezeigt). Wie oben beschrieben zeigt sie eine 97%-ige Homologie zur entsprechenden
menschlichen Kollagenase IV (Reponen et al., 1992).
4.2.2 Induktion der MMP-Expression durch UV-Bestrahlung
Die Antwort der Zelle auf eine Reihe von DNA schädigenden Substanzen (z. B. H20 2 , UVStrahlung, y-Strahlung) kann als allgemeine "Streß-Antwort" angesehen werden (Herrlich et al.,
1992). Um zu untersuchen, welchen Einfluß diese Agenzien auf die Expression der
Metalloproteinasen der Maus haben, wurde UV -Strahlung als ein Vertreter solcher Substanzen
ausgewählt.
Ebenso wie die Behandlung mit dem Phorbolester TP A führt die Behandlung von Zellen mit
UV -Strahlung zu einer Induktion des menschlichen Kollagenase I Gens. Im Gegensatz zu der
relativ frühen maximalen Induktion der Kollagenase I Expression nach TPA-Behandlung (nach 68 Stunden), ist eine maximale Kollagenase I Expression nach UV-Bestrahlung in den Zellen
jedoch erst nach 36 bis 48 Stunden zu beobachten. Der Grund dafür könnte sein, daß die
Signalkette von der Auslösung des Signals bis zur Induktion der Kollagenase I Expression über
eine extrazelluläre Schleife verläuft, bei der die Sekretion der Faktoren IL-1a und bFGF
(zusammenfassend als EPIF=extrazellulärer Proteinsynthese induzierender Faktor bezeichnet)
notwendig ist (Schorpp et al., 1984; Krämer et al., 1993).
Da die Expression der Maus Metalloproteinasen durch TPA in gleicher Weise induziert wird wie
die Expression von MMPs anderer Spezies, könnte man auch eine ähnliche Induktionskinetik der
Maus Kollagenase I nach Behandlung von Zellen mit UV-Strahlung erwarten. Um dies zu
überprüfen wurden LuSVX-Zellen 0, 24, 36 und 48 Stunden nach UV-Behandlung geerntet und
die poly A + RNA isoliert. Diese wurde dann in einer Northern Blot Analyse sowohl auf
Kollagenase I Expression, als auch auf die Expression der anderen MMPs untersucht.
Eine maximale Expression von Kollagenase I konnte 48 Stunden nach UV -Behandlung
beobachtet werden, während Stromelysin 2 eine maximale Expression zwischen 36 und 48
Stunden nach Bestrahlung zeigt (Abb.4). Eine induzierte Expression von Stromelysin 1 und
Kollagenase IV konnte durch die UV-Behandlung nicht beobachtet werden (nicht gezeigt).
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stromelysin
2
collagenase I
GAPDH
Abb.4: Expression der MMPs in UV bestrahlten LuSVX-Zellen. LuSVX-Zellen wurden nicht behandelt oder UV
bestrahlt (256 nm Wellenlänge, 30 J/m2). Zu den angegebenen Zeiten wurde aus unbehandelten Zellen (co) oder
Zellen nach UV-Behandlung (24, 36, 48 Stunden) die pol~ A + RNA isoliert und je 10 l'g der RNA für die Northern
Blot Analyse eingesetzt. Der Filter wurde nacheinander mit den 32P-markierten MMP-cDNA Proben und einer 32p_
markierten GAPDH-cDNA Probe (rechte Seite) hybridisiert. ~
4.3 Gewebespezifische Expression der Maus Metalloproteinasen
Die in Kapitel 4.2 beschriebenen Zellkulturexperimente suggerieren, daß die drei MMPs
Stromelysin 1, Stromelysin 2 und Kollagenase I durch Substanzen, die über die Proteinkinase C
wirken, koordiniert exprimiert werden. Die in Zellkultur durchgeführten Experimente haben
jedoch den Nachteil, daß die MMP-Gene als Gene der Proliferation auf jeden Fall im offenen
Chromatin vorliegen und der Differenzierungszustand der Zellen nicht mit jenem im Organismus
vergleichbar ist. Deshalb war es wichtig, die Expression der MMPs im Organismus direkt zu
untersuchen, um zu prüfen ob die in isolierten Zellinien gefundene hohe Expression von MMPs
auch im Gesamtorganismus nachzuweisen ist, oder ob eine MMP Expression auf solche Gewebe
beschränkt ist, die ECM-Komponenten enthalten, die ihrer Substratspezifität entsprechen.
4.3.1 Expression der :MMPs während der Embryonalentwicklung der Maus
Während der Embryonalentwicklung findet ein intensiver Gewebeumbau statt, bei dem ein
schneller Auf- und Abbau von ECM-Komponenten notwendig ist, um ein Wachstum und eine
Ausdehnung der Organe zu ermöglichen. Deshalb wird zu diesem Zeitpunkt eine hohe
Expression von Matrix-abbauenden Enzymen erwartet. Die isolierten Maus MMP cDNA Proben
41
stellen ein ideales Hilfsmittel dar, um die Expression dieser MMPs
während der
Embryonalentwicklung zu untersuchen.
Mit einer Northern Blot Analyse sollte vorab ermittelt werden, zu welchem Zeitpunkt der
Embryogenese eine Expression der verschiedenen MMPs zu erwarten ist. Die auffälligsten
Veränderungen im Embryo finden ab dem Tag 9 der Entwicklung statt, wenn die Organogenese
beschleunigt wird und sich gleichzeitig die generelle Architektur des Embryos verändert (Rugh,
1968). Deshalb wurde poly A + RNA aus Gesamt-Embryonen ab dem Alter von 9.5 Tage im
Abstand von einem Tag isoliert (bis 15.5 Tage) und die Menge an Kollagenase I Transkripten
durch eine Northern Blot Analyse bestimmt.
Eine schwache Kollagenase I Expression kann zum ersten Mal am Tag 14.5 der Entwicklung
beobachtet werden. Am Tag 15.5 ist eine starke Zunahme der Kollagenase I Expression zu
beobachten (Abb.5). Dem gegenüber kann eine Kollagenase IV Expression schon sehr früh, am
Tag 10.5, beobachtet werden, die sich bei fortschreitender Entwicklung in ihrer Intensität kaum
verändert (nicht gezeigt).
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collagenase I
GAPDH
Abb.5: Expression der MMPs während der Embryogenese. Poly A + RNA wurde aus Gesamt-Embryonen im
Abstand von einem Tag isoliert. Je 10 p,g RNA wurden für die Northern Blot Analyse verwendet. Der Filter wurde
nacheinander mit einer 32P-markierten Kollagenase I-cDNA Probe und einer 32P-markierten GAPDH-cDNA Probe
hybridisiert.
Um zu untersuchen, in welchen Geweben des Embryos eine Expression der verschiedenen
Metalloproteinasen zu finden ist, wurde die Methode der "in situ" Hybridisierung angewendet.
Damit läßt sich die Expression von Genen direkt im entsprechenden Gewebe auf Einzelzellebene
nachweisen (Wilkinson und Green, 1990).
In Paraformaldehyd fixierte Embryonen wurden durch eine aufsteigende Alkoholreihe entwässert
und in P,araffin eingebettet. Von den eingebetteten Embryonen wurden dann 6 bis 8 p,m dicke
Schnitte angefertigt und auf beschichtete Objektträger aufgezogen. Nach der Vorhybridisierung
42
wurden die Gewebeschnitte mit radioaktiv· markierten MMP antisense und sense RNA Proben
hybridisiert die, wie im Folgenden beschrieben, hergestellt wurden:
Um ein gutes Eindringen der Probe ins Gewebe zu ermöglichen, sind für die "in situ"
Hybridisierung RNA-Transkripte mit einer Länge zwischen 250 bis 350 Basenpaaren am besten
geeignet. Da die ursprünglich klonierten MMP-cDNAs (s. Abb.2e) für diese Verwendung zu
lang waren, wurden die MMP-cDNA Fragmente aus dem pAZ-Vektor in den pBluescript-Vektor
(Stratagene) umkloniert. Durch anschließenden Restriktionsverdau wurden die ursprünglichen
MMP cDNAs (Abb.2e) in kürzere DNA Fragmente gespalten. Die erhaltenen Subfragmente
wurden in den pGEM-4 Vektor kloniert. Abb.6 gibt die Restriktionsverdaus der ursprünglich
isolierten MMP-cDNAs (s. Abb.2e) im pBluescript und die dabei erhaltenen Fragmente an.
100 bp
~
Eco RI
Dra I
Eco RI
~
I
~~================~~
Bam HI
KOLLAGENASE I
Eco RI
~====================~~
Hind III
STROMELYSIN 2
Sac I
STROMELYSIN 1
Pvu II
Sac I
~~================~========~
Abb.6:
Schematische
Darstellung
der
durch
Restriktionsverdau
erhaltenen
KOLLAGENASE IV
MMP-Subfragmente.
Durch
Restriktionsverdau der vier ursprünglich isolierten MMP-cDNAs (s. Abb.2e) wurden folgende cDNA-Subfragmente
erhalten: 1: 126 bp Kollagenase I (Eco RI/Dra I); 2: 363 bp Kollagenase I (Dra 1/Eco Rl); 3: 223 bp Stromelysin 2
(Bam HI/Eco Rl [MCS]); 4: 302 bp Stromelysin 1 (Hind III/Sac I [MCS]); 5: 340 bp Kollagenase N (Pvu II!Sac I
[MCS]). MCS: schematische Darstellung der "Multiple Clonig Site" des pBluescript-Vektors. Der Balken über den
dargestellten cDNA-Fragmenten dient als Maßstab und zeigt die Länge von 100 bp an.
43
Der Verdau der Kollagenase I cDNA mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Dra I lieferte
zwei Fragmente mit einer Länge von 126 bp (Fragment 1) und 363 bp (Fragment 2). Der Verdau
der Stromelysin 2 cDNA mit Bam HI und Eco RI (Eco RI-Stelle in der MCS des pBluescript
liegend) resultierte in einem 223 bp Fragment (Fragment 3).
Die Stromelysin 1 und Kollagenase IV cDNAs wurden mit Sac I (Sac I-Stelle in der MCS des
pBluescript liegend) und entweder Hind III (Stromelysin 1) oder Pvu II (Kollagenase IV)
verdaut. Für Stromelysin 1 wurde ein 302 bp Fragment (Fragment 4), für Kollagenase IV ein
340 bp Fragment (Fragment 5) erhalten. Nach Klonierung der einzelnen Subklone in den pGEM4 Vektor wurde durch "in vitro" Transkription mit Hilfe der SP6- oder T7-Polymerase
35 S-UTP-
markierte antisense bzw. sense RNA hergestellt. Diese wurden für die im Folgenden
beschriebenen "in situ" Hybridisierungen verwendet.
Abb.7 zeigt den Längsschnitt eines 16.5 Tage alten Embryos. Die in der Hellfeldabbildung
gekennzeichneten Bereiche (mn), (mx), (rb), (sc) markieren Regionen der Skelettbildung
(Abb.7a). Die Signale einer Hybridisierung mit Kollagenase I (Fragment 2, Abb.6) bzw. der 72
kD Kollagenase IV (Fragment 5) sind in 7b bzw. 7c in der Dunkelfelddarstellung (weiße
Bereiche) abgebildet. Eine starke Expression der Kollagenase I findet man im Bereich des Unterund des Oberkiefers (mn, mx), im Schulterblatt, im Bereich des Hinterhauptes (exoccipital), im
Schlüsselbein (cl) und in den proximalen (dorsalen) Bereichen der Rippen (rb). Dagegen wird im
distalen (ventralen) Bereich der Rippen kein Signal beobachtet. Mit der kürzeren Kollagenase I
Probe (Fragment 1), die ebenfalls beim Restriktionsverdau mit Dra I/Eco RI entsteht, wurde in
den gleichen Bereichen ein Signal gefunden (nicht gezeigt), was für die Spezifität dieser Proben
spricht. Aufgrund des etwas höheren Hintergrundes bei der Hybridisierung wurde für alle
weiteren Analysen die längere Probe verwendet. Die Hybridisierung mit der Kollagenase IV
Probe zeigt ein deutlich unterschiedliches Expressionsmuster. Im Vergleich zu Kollagenase I ist
die Expression dieser MMP sehr viel weiter verbreitet. Auch im Bereich des Skeletts selbst
unterscheidet sich deren Expression. Während Kollagenase I innerhalb des entsprechenden
Skelettgewebes zu finden ist, ist das Kollagenase IV Signal in Form eines Ringes um das
Gewebe sichtbar. Interessanterweise konnte im Fuß des Embryos ein Signal im Knorpelgewebe
nachgewiesen werden, während für Kollagenase I zu diesem Zeitpunkt in diesem Bereich keine
Expression gefunden wird.
Abb.7: Expression der Kollagenase I und 72 kD Typ IV Kollagenase in Längsschnitten eines 16.5 Tage alten
Embryos. Die Schnitte wurden in der Hellfeldbeleuchtung (a) photographiert, um die Gewebemorphologie
darzustellen, und in der Dunkelfeldbeleuchtung (b: Kollagenase I antisense Probe; c: Kollagenase IV antisense Probe),
um das Hybridisierungssignal zu veranschaulichen. (br) Gehirn; (cl) Schlüsselbein; (he) Herz; (li) Leber; (lu) Lunge;
(mn) Mandibel; (mx) Maxille; (rb) Rippen; (sc) Schulterblatt; (to) Zunge. Maßstab: lmm.
44
45
Die für Kollagenase IV gefundenen Daten stimmen hierbei mit dem von Reponen et al. (1992)
beschriebenen Expressionsmuster überein und sind dort im Detail beschrieben. Im Folgenden
soll vor allem die Lokalisierung der Kollagenase I genauer untersucht werden. Mit den
verschiedenen sense RNA-Transkripten (Kollagenase I, Kollagenase IV), die als Kontrolle
mitgeführt wurden, konnte in keinem der durchgeführten Experimente ein Signal beobachtet
werden.
Abb.8 verdeutlicht die Expression der Kollagenase I im Bereich des Unter- und Oberkiefers. In
Abb.8a ist ein Längsschnitt durch den Oberkiefer eines 16.5 Tage alten Embryos zu sehen (s.
auch Abb.7a,b; mx). Die kleinen Pfeile geben den Bereich der Knochenbildung an. Die Region
ist in 8b,c vergrößert dargestellt. Hier weisen die großen Pfeile auf ein starkes Signal (schwarze
Granula) der Kollagenase I hin, die im Bereich der Knochenneubildung exprimiert wird. In
Abb.8d wird ein Längsschnitt durch den Unterkieferbereich des Embryos gezeigt (s. auch
Abb7a,b; mn). Die kleinen Pfeile markieren wiederum den Bereich der Knochenbildung, die sich
in der Region des "Meckel's cartilage" (mc) vollzieht. Die Region ist in Abb.8e,f vergrößert
dargestellt. In dieser Abb. ist deutlich zu erkennen, daß das Signal (schwarze Granula) in Zellen
erscheint, die sich im Bereich der neuentstehenden Knochenmatrix entlang der Knochenbälkchen
(große Pfeile) befinden. Die MMP könnte deshalb von Zellen exprimiert werden, die an der
Knochenneubildung (Osteoblasten) beteiligt sind. Die im Hellfeld beobachteten Signale (8b,e)
leuchten in der Dunkelfeldabbildung aufgrundder Lichtbrechung an den Granula weiß auf (8c,f).
Auch im proximalen (dorsalen) Bereich der Rippen (Abb.7b) wurde ein deutliches Signal
beobachtet. In Abb.9 wird dieser Bereich sowohl im Querschnitt, als auch im Längsschnitt
dargestellt. Abb.9a zeigt die Übersicht eines Querschnittes im Bereich des Brustkorbes. Der
Kreis markiert den Bereich des Rippenansatzes am Wirbel und ist in Abb.9b vergrößert
dargestellt. Hier ist der proximale Bereich der Rippen (rb) sichtbar (Abb.9b). Die Pfeile deuten
auf den Ansatz der Rippe am Wirbelbogen, der in Abb.9c weiter vergrößert dargestellt ist. Die
in Abb.9c eingezeichneten Pfeile weisen auf das Signal entlang der neuentstehenden
Knochenbälkchen hin. Wie auch der Längsschnitt durch den Gesamt-Embryo (Abb.7b) zeigt,
findet man im distalen (ventralen) Bereich der Rippen keine Expression der Kollagenase I (nicht
gezeigt).
Ein Längsschnitt durch die Rippenregion (rb; Abb.9d) läßt erkennen, daß Kollagenase I in der
zentralen Schaftregion der Rippen (Pfeile) exprimiert wird. Abb.9e,f stellt eine Vergrößerung
des markierten Bereiches im Hell- (e) und Dunkelfeld (f) dar und macht deutlich, daß das Signal
spezifisch im Bereich der endochondralen Knochenbildung (s. auch Abb.ll) zu finden ist,
während der Bereich des hypertrophen Knorpels (hc; s. auch Abb. 12, H) negativ ist.
46
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Abb.8: Expression der Kollagenase I im Ober- und Unterkiefer eines 16.5 Tage alten Embryos. (a) Oberkiefer
(Maxille); (d) Unterkiefer (Mandibel). Die mit kleinen Pfeilen markierten Bereiche sind in (b) und (e) vergrößert
dargestellt. Die großen Pfeile weisen auf das Signal hin. (c) und (f) Dunkelfelddarstellung von (b) bzw. (e). (mc)
"Meckel's cartilage"; (nc) Nasenhöhle; (tb) Zahnanlage; (th) Thymus; (vi) Schnurrbarthaar-Follikel. Maßstab: (a,d)
200
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(b,c,e,f) 100
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47
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Abb.9: Expression der Kollagenase I im Bereich der Rippen im 16.5 Tage alten Embryo. (a) Querschnitt im Bereich
des Brustkorbes. Der Kreis markiert die in (b) gezeigte Vergrößerung. Pfeile in (b) markieren den in (c) vergrößerten
Bereich. Pfeile in (c) markieren das Signal im Bereich der Knochenneubildung. (d) Längsschnitt durch die Rippen.
Pfeile markieren die in (e) dargestellte Vergrößerung. Pfeile in (e) markieren den Bereich der endochondralen
Ossifizierung. (f) Dunkelfelddarstellung von (e). (hc) hypertropher Knorpel; (li) Leber; (nt) Neuralrohr; (rb) Rippen;
(vt) Wirbel. Maßstab: (a) 1 mm; (b,d) 200 ~-tm; (c) 50 ~-tm; (e,f) 100 J-tm.
48
Vergleicht man die Kollagenase I Expressionsdaten mit einer spezifischen Färbung für Knochen(Alizarinrot) und Knorpelgewebe (Alcianblau) eines 16.5 Tage alten Embryos (Abb.lO) scheint
die rote Färbung, die die Ossifizierungszentren in diesem Embryo darstellt, mit der Lokalisation
der Kollagenase I Expression übereinzustimmen.
Abb .1 0: Alizarinrot-/ Alcianblau-Färbung eine
16.5 Tage alten Embryos (nach Kaufman, 1992)
Die rote Färbung zeigt spezifisch di
verknöcherten Bereiche des Skeletts. Die blau
Färbung stellt die Skelettbereiche dar, die au
Knorpel bestehen.
Zusätzlich zu den hier gezeigten Daten findet man, daß Kollagenase I zu diesem Zeitpunkt auch
in den Schaftregionen der Röhrenknochen von Arm und Bein, in den Wirbelkörpern
(Wirbelzentrum und -bögen), und in bestimmten Bereichen der Knochen des Schädeldaches
exprimiert ist. Ein schwaches Signal kann auch in den Fingerknochen beobachtet werden. Im
15.5 Tage alten Embryo ist eine Kollagenase I Expression in den gleichen Bereichen des Skeletts
in ähnlicher Stärke zu beobachten (nicht gezeigt).
Zum Verständnis der möglichen Funktion von Kollagenase I während dieser Stadien der
Embryonalentwicklung soll hier kurz auf den Prozeß der Knochenentwicklung eingegangen
werden.
Die Knochenbildung (Osteogenesis) erfolgt auf zwei Wegen, die zur Bildung des primären
Knochens
(Geflechtknochen)
führen.
Bei
der
desmalen
Ossifikation
entsteht
das
Knochengewebe direkt im ursprünglich mesenchymalen Bindegewebe. Diese Knochenbildung
führt zur Entstehung der Bindegewebsknochen. Durch desmale Ossifikation entstehen die flachen
Schädelknochen, der Oberkiefer und der größte Teil des Unterkiefers, die meisten
49
Gesichtsschädelknochen, der Hauptteil des Schlüsselbeins und die Knochenmanschette der
Röhrenknochen. Wird aus dem Mesenchym zuerst ein Knorpelmodell gebildet, das dann
schrittweise durch Knochengewebe ersetzt wird, nennt man diesen Vorgang endochondrale
Ossifikation (Knochen der Schädelbasis, der Wirbelsäule, des Becken und der Extremitäten). In
beiden Fällen wird ein Geflecht von Knochenbälkchen gebildet, das durch Matrixablagerung von
differenzierten Osteoblasten entsteht und als primäre Spongiosa bezeichnet wird. Die primäre
Spongiosa wird später durch den sekundären Lamellenknochen ersetzt oder unter Bildung der
Knochenmarkshöhle entfernt.
)EPIPHYSIS
bone
Endosreurr.
DIAPHYSIS
a
b
c
d
e
Abb.ll: Schematische Darstellung der Entwicklung eines Röhrenknochens (nach Jee, 1989). a. Knorpelmodell. b.
Bildung der perichondralen Knochenmanschette. c. Beginn der Knorpelverkalkung. d. Eintritt der Blutgefäße in den
verkalkten Knorpel (b-d: Bildung des primären Ossifikationszentrums). e. Blutgef'aße und vaskuläres Mesenchym
teilen sich in zwei Zonen der Ossifizierung (Wachstumszonen). f. Röhrenknochen des adulten Tieres mit den
Bereichen Epiphysis und Metaphysis, die aus Knochenbälkchen [cancellous hone] bestehen und durch den Bereich der
Wachstumszone [growth plate] getrennt sind. Diaphysis, Bereich der von kompaktem Knochen [cortical hone]
umgeben ist. Der Knochen wird außen von der Knochenhaut [Periosteum] überzogen; die Knochenmarkshöhle und
die Zwischenräume der Knochenbälkchen werden vom Endosteuro ausgekleidet. Im adulten Tier ist der hyaline
Knorpel im Bereich der Wachstumszone durch Knochensubstanz ersetzt [Fused growth plate].
50
Der Prozeß der endochondralen Ossifikation ist in Abb .11 schematisch dargestellt. Zu Beginn
entsteht ein Knorpelmodell, das sich aus einer Kondensation von mesenchymalen Zellen bildet
(lla). Dann bildet sich die perichondrale Knochenmanschette aus, die aus kompakten Knochen
besteht (llb). Der Knorpel beginnt im Bereich der Schaftregion zu verkalken (llc), daraufhin
treten Blutgefaße in den Bereich des verkalkten Knorpels ein (llb-d; Bildung des primären
Ossifikationszentrums). Die Blutgefaße und das vaskuläre Mesenchym teilen sich in zwei Zonen,
wodurch zwei Wachstumszonen entstehen (lle). Später treten dann auch Blutgefaße im Bereich
der Epiphysis (s. Abb.llf) ein, um die Ossifikationszentren in diesem Bereich zu bilden
(sekundäres Ossifikationszentrum). Abb.llf zeigt den adulten Röhrenknochen, der in drei
Bereiche unterteilt werden kann: 1. In den Bereich der Diaphysis, der zentralen Schaftregion mit
der Knochenmarkshöhle, die von kompakten Knochen (cortical bone) umgeben ist. 2. In den
Bereich der Metaphysis und 3. in den Bereich der Epiphysis, die hauptsächlich aus
Knochenbälkchen bestehen. Im noch wachsenden Tier wird die Epiphysis durch eine
Wachstumszone, die aus hyalinem Knorpel besteht, von der Metaphysis getrennt. In diesem
Bereich können noch Knochenbälkchen gebildet werden, was in einem Längenwachstum
resultiert. Der Bereich der Knochen-Knorpel-Grenze (Wachstumszone) ist in Abb.l2 dargestellt
und kann in folgende Zonen untergliedert werden:
1. Zone des Reserveknorpels (R)
2. Zone der Chondrozytenproliferation
(" Säulenknorpel" ;P)
3. Zone der Chondrozytenreifung (M)
4. Zone der Hypertrophie der Chondrozyten (H)
5. Zone der Knorpelverkalkung (cc)
6. Zone des Knorpelabbaus (Eröffnungszone) und der Knochenneubildung
(primäre Spongiosa; PS)
Abb.12: Knochen-Knorpel-Grenze der endochondralen Ossifikation im Bereich der epiphysalen-metaphysalen
Wachstumszone (nach Jee, 1989). Reserveknorpel (R), proliferierende (P), reüende (M), hypertrophe (H)
Knorpelzone, Knorpelverkalkung (cc) und primäre Spongiosa (P). x 125.
51
Die in Abb.S dargestellte Bestimmung der Kollagenase I Transkripte in Gesamt-Embryonen
zeigte, daß der früheste Zeitpunkt einer schwachen Expression am Tag 14.5 auftritt. Dieser
Zeitpunkt markiert auch das Auftreten der primären Ossifikationszentren (Kaufman, 1992). Die
Untersuchung mittels "in situ" Hybridisierung sollte nun aufklären, ob die gefundenen
Kollagenase I Transkripte tatsächlich von einer Expression in diesen Bereichen herrührt. Abb.l3
stellt Längsschnitte aus verschiedenen Ebenen eines 14.5 Tage alten Embryos (a,d) dar. Es zeigt,
daß Kollagenase I Transkriptenurin wenigen Geweben des 14.5 Tage alten Embryos gefunden
werden können. In 13a führt die Schnittebene durch die Schaftregion des Oberarmes (hu) und
den Bereich des Unterarmes. In 13d führt die Schnittebene durch die Region des Brustkorbes.
Die Mandibel (mn) und Maxille, das Schlüsselbein (cl), die Rippen (rb) und die Leber (li) sind
zu erkennen. Die Dunkelfeldabbildungen in Abb.13b,e zeigen die Hybridisierung mit der
Kollagenase I antisense Probe (Fragment 3), in Abb.13c,f ist die Hybridisierung mit der 72 kD
Kollagenase IV antisense Probe (Fragment 5) zu sehen.
Ein Kollagenase I spezifisches Hybridisierungssignal ist in der Schaftregion des Oberarmes (hu)
zu erkennen (Abb.13b), während im Bereich der Rippen (Abb.l3e) noch keine Expression
nachzuweisen ist. Dagegen findet man zu diesem Zeitpunkt eine weit verbreitete Expression der
Kollagenase IV. Ein deutliches Signal findet man im mesenchymalen Gewebe im Kopfbereich
(Abb.l3c) und, wie auch im 16.5 Tage alten Embryo, im Bereich des Oberarmes (hu), des
Schlüsselbeines (cl) und der proximalen Rippen (rb), in Form eines Ringes um das entstehende
Skelettgewebe (Abb.l3c,f). Im Bereich der distalen Rippen erscheint das Signal innerhalb des
Knorpelgewebes. Abb.14 verdeutlicht die Kollagenase I Expression in den Geweben des 14.5
Tage alten Embryos. Der Längsschnitt führt durch die Ebene der Wirbelsäule (vc; Abb.14a).
Die im Bereich der Maxille (mx) und des Gaumendaches (bo) mit Kreisen markierten Regionen
sind in 14b,c (Maxille) und 14d,e (Gaumendach) mit je 2 verschiedenen Vergrößerungen
dargestellt. Abb .14c gibt den in 14b markierten Bereich der Knochenbildung der Maxille (mb)
vergrößert wider. Einzelne Bereiche, in denen das Signal (schwarze Granula) zu sehen ist, sind
mit Pfeilen markiert.
Abb.13: Expression der Kollagenase I in Längsschnitten eines 14.5 Tage alten Embryos. Die Schnitte wurden in der
Hellfeldbeleuchtung (a,d) photographiert, um die Gewebemorphologie darzustellen und im Dunkelfeld (b,e:
Kollagenase I antisense Probe; c,f: Kollagenase IV antisense Probe), um das Hybridisierungssignal zu
veranschaulichen. (a) zeigt einen Längsschnitt im Bereich des Oberarmes; (d) einen Längsschnitt im Bereich der
Rippen. (br) Gehirn; (cl) Schlüsselbein; (hu) Oberarm; (mn) Mandibel; (rb) Rippen. Maßstab: lmm.
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Abb.14: Expression der Kollagenase I im Bereich der Maxille und des Gaumendaches im 14.5 Tage alten Embryo.
(a) Übersicht eines Längsschnittes. Kreise markieren die in (b) und (d) vergrößerten Bereiche. (b) Vergrößerung im
Bereich der Maxille. Der Kreis markiert den in (c) gezeigten Ausschnitt im Bereich des Maxillenknochens. Pfeile
markieren das Signal im Bereich der Knochenbildung. (d) Vergrößerung im Bereich des Gaumendaches. Pfeile zeigen
den in (e) vergrößerten Ausschnitt. (e) Pfeile markieren einzelne Zellen in diesem Bereich, die Kollagenase I
exprimieren. (bo) Gaumendach; (br) Gehirn; (fe) Oberschenkel; (he) Herz; (mb) Maxillenknochen; (mx) Maxille; (to)
Zunge; (vc) Wirbelsäule. Maßstab: (a) lmm; (b,d) 200
~tm;
(c,e) 50
54
~tm·
Im Knorpelgewebe des Gaumendaches (bo) werden ebenfalls einzelne Zellen gefunden, die
Kollagenase I exprimieren (Pfeile, 14d). Die in 14e mit Pfeilen markierten Zellen entsprechen
den in der kleineren Vergrößerung markierten Zellen. Zu diesem Zeitpunkt wird außer in den in
Abb.13 und Abb.14 lokalisierten Geweben eine schwache Kollagenase I Expression auch im
Oberschenkel (fe) und in der Mandibel beobachtet. In den Rippen und auch in allen weiteren
Teilen des Skeletts konnte keine Expression nachgewiesen werden. Somit stimmte die am Tag
14.5 der Entwicklung erstmals auftretende Kollagenase I Expression in den beschriebenen
Geweben mit dem beobachteten Auftreten und der Lokalisation der ersten Ossifizierungszentren
überein (Kaufman, 1992). Kollagenase I könnte damit eine wichtige Funktion bei der Entstehung
des verknöcherten Skeletts spielen.
Bei der Untersuchung der Kollagenase I Expression zu einem früheren Stadium der Entwicklung
(Schnitte von 12.5 und 13.5 Tage alten Embryonen) konnte keine Expression der MMP
nachgewiesen werden. Dies ist in Übereinstimmung mit der Northern Blot Analyse (Abb.5) mit
RNA von Gesamt-Embryonen.
Zusammenfassend zeigen die in Abb. 7-14 gezeigten Daten, daß Kollagenase I spezifisch im sich
entwickelnden Skelettsystem zu dem Zeitpunkt und in denjenigen Bereichen exprimiert wird, in
denen die neue Knochenmatrix entsteht. Kollagenase IV (72 kD) dagegen kann sehr viel früher
als Kollagenase I nachgewiesen werden und wird in vielen Geweben mesenchymalen Ursprungs
exprimiert. In Bereichen des entstehenden Skeletts findet man eine Kollagenase IV Expression in
Form eines Ringes um das Knorpelgewebe. Zu keinem Stadium der Embryonalentwicklung
konnte dagegen eine Expression von Stromelysin 1 und Stromelysin 2 beobachtet werden (nicht
gezeigt).
4.3.2 Expression der MMPs in Geweben des adulten Organismus
Zum Zeitpunkt der Geburt ändert sich für viele Gene, z. B. Globine (ß-Globin; Charnay et al.,
1984; Wright et al., 1984) oder Lebergene (a-Fetoprotein; Tilghman und Belayew, 1982;
Krumlauf et al., 1985; Godbout et al., 1986), das Expressionsmuster signifikant. Es ist daher
denkbar, daß Metalloproteinasen mit ähnlichem Substratspektrum entweder im Embryo oder im
adulten Organismus ausschließlich Anwendung finden, zum Beispiel aus Gründen noch nicht
bekannter Proteineigenschaften. Die überraschend exklusive Expression von Kollagenase I und
IV (72 kD) in bestimmten Geweben des Embryos, und die Abwesenheit von Stromelysin 1 und 2
während der Embryogenese, sollte deshalb mit der Expression der MMPs im adulten
Organismus verglichen werden.
Um die Expression der verschiedenen klonierten MMPs im adulten Organismus zu untersuchen,
wurde die poly A + RNA aus verschiedenen Mausgeweben in einer Northern Blot Analyse auf
MMP Expression hin überprüft (Abb.15).
55
Ein 3. 0 kb Transkript der Kollagenase IV ist in Herz und Lunge zu finden. Die Expression
stimmt dabei mit der von Reponen · et al. (1992) beschriebenen Expression überein.
Interessanterweise kann in denselben Geweben mit der Stromelysin 1 Probe ein 1.9 kb
Transkript nachgewiesen werden. Eine schwache Expression von Stromelysin 1 kann auch im
Skelettmuskel und in der Milz beobachtet werden.
Die Stromelysin 2 Expression (1. 8 kb Transkript) unterscheidet sich deutlich von dem
beobachteten Kollagenase IV und Stromelysin 1 Expressionsmuster. Außer im Hoden kann in
jedem der untersuchten Geweben eine geringe Menge an Transkripten dieser MMP gefunden
werden. Im Herz und in der Niere ist eine höhere Transkriptmenge vorhanden.
Das Kollagenase I (2. 8 kb) Expressionsmuster unterscheidet sich ebenfalls von dem der anderen
MMPs. Eine hohe Expression ist im Muskel und in der Niere zu beobachten, eine geringere
Expression in Lunge, Herz und Milz. Keine Transkripte sind dagegen im Gehirn, der Leber und
im Hoden nachweisbar. Ähnlich wie während der Embryogenese wird Kollagenase I auch im
adulten Tier im Knochengewebe exprimiert (Abb .17, 18).
.....
CO
Q)
J:
s::::
CO
.....
.c
s::::
Q)
Q)
c.
t/)
Cl
s::::
..... ~
0
Q)
t/)
::s
::s > E
>
Q)
s::::
"C
t/)
-;::;
---l
~
t/)
Q)
!
...
stromelysin
..._ stromelysin
2
..._ collagenase IV
..._ collagenase
I
..._ ß-actin
Abb.15: Expression der Maus Metalloproteinasen in Geweben von adulten Tieren. Poly A + RNA wurde aus den
oben angegebenen Geweben (Herz [heart]; Gehirn [brain]; Milz [spieen]; Lunge [lung]; Leber [liver]; Skelettmuskel
[muscle]; Niere [kidney]; Hoden [testis]) isoliert. Je 2 jtg der hochgereinigten RNA wurden auf einem Agarosegel
aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen. Der RNA-Filter (MTN, Multiple Tissue Northern) wurde von
der Firma Clontech, Heidelberg bezogen. Der Filter wurde nacheinander mit den 32P-markierten MMP-cDNA
Proben und einer 32P-markierten ß-Aktin cDNA Probe (rechte Seite) hybridisiert. Folgende Transkriptgrößen konnten
fiir die einzelnen cDNAs gefunden werden: Stromelysin 1 (1.9 kb); Stromelysin 2 (1.8 kb); 72 kD KollagenaseN
(3.0 kb); Kollagenase I (2.8 kb). Sie wurden anhand eines RNA-Markers auf dem Filter bestimmt. Die ß-Aktin Probe
hybridisiert mit verschiedenen Spleißformen der ß-Aktin mRNA (1.6-2.0 kb).
56
Da Knochen auch im adulten Organismus eines der dominierenden Gewebe der Kollagenase I
Expression zu sein scheint (siehe auch Abb.17, 18), sollte mittels "in situ" Hybridisierung
gezeigt werden, in welchen Bereichen und in welchem Typ von Zellen Kollagenase I im adulten
Knochengewebe
Röhrenknochen
exprimiert
aus
zwei
wird.
Wochen
Dazu
alten
wurden
Gewebeschnitte
Mäusen
angefertigt
und
von
einer
eingebetteten
"in
situ"
Hybridisierungsanalyse unterzogen. Abb.16 zeigt die Kollagenase I Expression im Oberschenkel
einer zwei Wochen alten Maus. Abb.l6a stellt eine Übersicht des distalen Bereichs des
Oberschenkels dar. Die Epi-, die Meta- und die Diaphyse sind zu sehen (s. auch Abb.llf).
Abb.16b zeigt eine Vergrößerung des Oberschenkels. Im Bereich der Diaphyse ist die
Knochenmarkshöhle (bm), die vom kompakten Knochen (co) umgeben ist, zu erkennen. Abb.16c
zeigt die Dunkelfelddarstellung zu 16b. Ein starkes Signal (weiße Bereiche) ist im Grenzbereich
der W achstumszone, in der Metaphyse und entlang des kompakten Knochens der Diaphyse zu
beobachten. In Abb.16d ist eine Vergrößerung des in 16b mit einem Kreis markierten Bereich
aus der Region der Wachstumszone dargestellt. Das Signal (schwarze Granula) ist in der Zone
der Knorpelverkalkung (cc) und in Osteoblasten, die entlang der Oberfläche des Knochens
liegen, der sich im Bereich der Wachstumszone bildet, zu erkennen. In diesem Bereich sind auch
reife Chondrozyten und Osteoklasten zu finden. Es ist deshalb nicht auszuschließen, daß diese
Zellen ebenfalls Kollagenase I exprimieren (A. Grigoriadis, pers. Mitteilung). Im Bereich des
hypertrophen Knorpels (H), bzw. in der Zone der Chondrozytenreifung (M) kann dagegen keine
Expression der MMP beobachtet werden (Abb.16).
Zusammenfassend zeigen diese Daten deutliche Unterschiede in der Intensität und Lokalisation
der verschiedenen MMPs im Gesamtorganismus. Dies läßt darauf schließen, daß den
verschiedenen MMPs unterschiedliche Funktionen zukommen. Das Expressionsmuster im
adulten Organismus unterscheidet sich von dem im Embryo gefundenen Muster. Während im
Embryo keine Expression von Stromelysin 1 und 2 gefunden werden kann, sind die beiden
MMPs im adulten Tier in mehreren Geweben exprimiert. Auch Kollagenase I, die im Embryo
ausschließlich im entstehenden Knochen gefunden wird, wird im adulten Tier auch in anderen
Geweben exprimiert. Kollagenase IV, die während der Embryonalentwicklung weit verbreitet in
fast allen Organen des Embryos exprimiert ist, ist im adulten Tier auf wenige Gewebe reduziert.
57
Abb.16: Expression der Kollagenase I im Oberschenkel einer zwei Wochen alten Wildtyp Maus. (a) Übersicht des
Knochens. (b) Vergrößerung im Bereich der Meta- und der Diaphyse. Der Kreis markiert die in (d) vergrößerte
Region.
(c) Dunkelfelddarstellung von
(b).
(d)
Vergrößerung im Bereich
der Wachstumszone.
(bm)
Knochenmarkshöhle; (cc) Zone der Knorpelverkalkung; (co) kompakter Knochen im Bereich der Diaphyse; (H)
hypertropher Knorpel; (M) Zone der Chondrozytenreifung. Maßstab: (a) 1 mm; (b,c) 200
58
~m;
(d) 100 ~m.
\.
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#:
'
59
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4.4 Expression der Kollagenase I in Geweben von cjos transgenen Mäusen
4.4.1 Induzierte Expression von Kollagenase I in Mäusen mit induzierter cjos Expression
Aus den oben beschriebenen Zellkulturexperimenten wurde der Transkriptionsfaktor AP-1
(Fos/Jun) als entscheidender Regulator in der Aktivität des menschlichen Kollagenase I
Promoters (Angelet al., 1987a) und dem Stromelysin 1 Promoter vom Menschen und der Ratte
(Angelet al., 1987a; Breathnach et al., 1987) nachgewiesen. Möglicherweise trifft dies auch im
Organismus zu. Um dies zu untersuchen wurden Mäuse ausgewählt, die eine Komponente des
AP-1 Komplexes erhöht exprimieren, oder bei denen eine AP-1 Komponente inaktiviert wurde.
Transgene Mäuse, bei denen die Expression des cjos Gens induzierbar ist, bieten nun die
Möglichkeit die Expression dieser AP-1 abhängigen Gene "in vivo" zu untersuchen. In diesen
Tieren ist die Expression des cjos Gens unter der Kontrolle des Interferon-induzierbaren "Mx"
Promoters. Durch Behandlung der Tiere mit Poly I:C wird die endogene Interferon Produktion
in den transgenen Tieren angeschaltet. Da das 3'-untranslatierte Ende für die schnelle
Degradation der cjos mRNA verantwortlich ist (Rahmsdorf et al., 1987), wurde dieses deletiert
um die cjos mRNA zu stabilisieren (Konstrukt: Mx-cjosD, Bachiller und Rüther, 1990).
"In vitro" findet man nach TPA Behandlung eine schnelle cjos Induktion (30 min), die für die
maximale Kollagenase I Expression nach 6 Stunden notwendig zu sein scheint (König et al.,
1992). Aufgrund dieser Induktionskinetik wurde die Gesamt-RNA aus Geweben der Mx-cjosD
transgenen Mäuse sechs Stunden nach Poly I:C Behandlung isoliert und in einer Northern Blot
Analyse sowohl auf cjos, als auch auf Kollagenase I Expression untersucht. Zu diesem
Zeitpunkt konnte in der Milz, der Leber, der Niere und in der Haut eine sehr hohe Menge an
exogenen cjos Transkripten gefunden werden. Eine niedrigere Menge an Transkripten wurde im
Gehirn und im Knochen beobachtet (Abb .17, rechte Spalte). Die Expression des endogenen c-
jos, bzw. die basale Transkriptionsrate des Transgens liegt in Geweben von unbehandelten
Mäusen unterhalb der Nachweisgrenze (Abb.17, linke Spalte). Trotz der starken Expression des
cjos Transgens in den Geweben der transgenen Tiere kann nur in drei der untersuchten Gewebe
eine induzierte Kollagenase I Expression beobachtet werden. Während diese in der Milz und in
der Leber sehr niedrig ist, wird im Knochen eine starke Induktion gegenüber dem
Knochengewebe von nicht behandelten Mäusen gefunden (Abb.17,. rechte Spalte). Weiterhin
wurde in einem parallel durchgeführten Experiment auch im Thymus eine induzierte Expression
der Kollagenase I beobachtet (U. Rüther, pers. Mitteilung). In der Milz und der Niere von
unbehandelten Mäusen ist keine Expression von Kollagenase I nachweisbar, obwohl ein
Vorhandensein von Kollagenase
Transkripten
in
diesen
Geweben
in vorhergehenden
Experimenten nachgewiesen werden konnte (s. 4.3.2, Abb.15). Dies ist wohl auf die
Verwendung von sehr limitierten Mengen an RNA aus diesen Geweben zurückzuführen.
Während in dem hier durchgeführten Experiment die Gesamt-RNA (20 J,tg) untersucht wurde,
wurde in Kapitel 4.3.2 hochgereinigte poly A + RNA (2 J,tg) verwendet.
Eine Untersuchung der Gewebe auf Kollagenase IV-Transkripte, zeigte eine Expression in der
Niere, im Knochen und in der Haut. Dabei war kein Unterschied zwischen unbehandelten und
behandelten Tieren festzustellen (nicht gezeigt). Für Stromelysin 1 und Stromelysin 2 konnte
unter den hier verwendeten Bedingungen weder eine basale, noch eine induzierte Expression
beobachtet werden.
Abb.17: Induzierte Kollagenase I Expression in Geweben von transgenen Mäusen mit induzierter c-fos Expression.
Transgene Mäuse, in denen das c-fos Gen unter der Kontrolle des Interferon-induzierbaren Mx-Promoters (Mx-cfosD) steht, wurden nicht (non-induced) oder, zur Induktion der Interferon-Synthese, mit 800 1-1g Poly I:C behandelt
(induced). 6 Stunden nach Behandlung wurde die Gesamt-RNA aus den oben angegebenen Geweben isoliert (Milz
[spleen]; Leber [liver]; Niere [kidney]; Gehirn [brain]; Knochen [bone]; Haut [skin]). Je 20 1-1g Gesamt-RNA wurden
fiir die Northern Blot Analyse eingesetzt. Der Filter wurde nacheinander mit einer 32P-markierten Kollagenase 1cDNA Probe und mit einer 32P-markierten GAPDH-Probe (Mitte) hybridisiert.
Die hier vorliegenden Daten zeigen zum ersten Mal eine c-jos abhängige Expression eines AP-1regulierten Gens, Kollagenase I, im Gesamtorganismus. Dabei wird die Kollagenase I
Expression, trotz der stark erhöhten c-jos Expression in allen untersuchten Geweben, nur in der
Milz, der Leber (auch im Thymus, nicht gezeigt) und hauptsächlich im Knochen induziert. Die
c-jos abhängige Expression unter physiologischen Bedingungen scheint dabei, im Hinblick auf
die Mitglieder der MMP-Familie, spezifisch für Kollagenase I zu sein.
61
4.4.2 Kollagenase I Expression in konstitutiv cjos exprimierenden transgenen Mäusen.
In den Mx-cjosD transgenen Mäusen führt die Induktion einer stark erhöhten cjos Expression
zu einem schnellen Anschalten der Kollagenase I Expression. Interessanterweise führt die
langzeitige Expression von cjos in MT-cjosLTR, H2-cjos oder H2-cjosL TR transgenen
Mäusen zu phänotypischen Veränderungen im Knochen, der Milz und im Thymus (Rüther et al.,
1987; 1988; 1989). Vor allem in den Röhrenknochen entstehen Schwellungen (lokale
Hyperosteosen), die sich nach ungefähr vier bis 9 Monaten zu Tumoren entwickeln können
(Rüther et al., 1987; 1989). Da diese gewebespezifischen Veränderungen mit denjenigen
Geweben übereinstimmen, in denen eine Induktion der Kollagenase I in den Mx-transgenen
Mäusen nachweisbar war, war es offensichtlich zu untersuchen, ob die phänotypischen
Veränderungen, verursacht durch die konstitutive Expression von cjos, ebenfalls mit einer
erhöhten Kollagenase I Expression einhergehen.
Dazu wurde die Gesamt-RNA aus Geweben von Wildtyp Mäusen und aus Geweben von H2-c-
fosLTR transgenen Mäusen [anstelle des LTR des FBJ Osteosarkomavirus wie bei Rüther et al.
(1989) wurde hier das LTR des Moloney Sarkomavirus verwendet] zum Zeitpunkt der
Knochentumorbildung isoliert und mittels Northern Blot Hybridisierung auf eine Kollagenase
Expression hin untersucht.
In Wildtyp Mäusen kann eine schwache Kollagenase I Expression nach einer Expositionsdauer
des Filters von 7 Tagen in der Niere und im Knochen, nicht aber im Gehirn beobachtet werden
(Abb.18, linke Spalte). Die hier gefundenen Expressionsdaten stimmen dabei mit den Daten aus
unbehandelten Mx-cjosD transgenen Mäusen (Abb.17) bzw. Wildtyp Mäusen (Abb.15) überein.
Im pathologisch veränderten Knochengewebe der H2-cjosL TR transgenen Mäuse dagegen ist
schon nach einer Expositionsdauer von 30 Stunden eine starke Kollagenase I Expression zu
finden. Eine Expression in der Niere ist in den transgenen Tieren, wie beim Wildtyp, ebenfalls
erst nach 7 Tagen Expositionsdauer zu finden (Abb.18, rechte Spalte). Die cjos Expression ist
in den H2-cjosLTR transgenen Mäusen ungefähr 3-fach höher als in den Wildtyp Mäusen. Im
Knochengewebe der Wildtyp Mäuse liegt die cjos Expression unterhalb der Nachweisgrenze, im
pathologisch veränderten Knochengewebe der H2-cjosLTR Mäuse sind cjos Transkripte aber
zu finden (Abb.18). Eine schwach erhöhte Kollagenase IV Expression im Tumorgewebe der H2-
cjosLTR transgenen Mäuse konnte ebenfalls beobachtet werden (5-10-fach), die jedoch weitaus
geringer als im Falle von Kollagenase I war (nicht gezeigt). Die Expression von Kollagenase IV
in den anderen Geweben entsprach der Expression in den Geweben von Wildtyp Mäusen (s.
4.3.2).
62
wildtype
c
•...
.a
tranaganie
H2-cfoa
•c>"
ii
c
...111
.a
II
c
0
.a
collagenaae I (30 h)
collagenase I (7 d)
c-fos
GAPDH
Abb.18: Kollagenase I Expression in Geweben von konstitutiv c-:fos exprimierenden Iransgenen Mäusen. GesamtRNA wurde aus den oben angegebenen Geweben von Wildtyp Mäusen und aus den entsprechenden Geweben von
H2-c-:fosLTR Iransgenen Mäusen zum Zeitpunkt der Knochentumorbildung isoliert (Niere [kidney]; Gehirn [brain];
Knochen [hone]). Je 20 1-'g RNA wurden ffir die Northern Blot Analyse verwendet. Der Filter wurde nacheinander mit
einer 32P-markierten Kollagenase I cDNA-Probe und mit einer 32P-markierten GAPDH-cDNA Probe hybridisiert.
Da die gewebespezifische Kollagenase I Expression in den Mx-cjosD transgenen Mäusen mit
den Orten der phänotypischen Veränderungen in den langzeitig cjos exprimierenden transgenen
Mäusen (MT-cjosLTR, H2-cjos, H2-cjosLTR) korreliert und eine erhöhte Menge an
Kollagenase I Transkripten auch bei einer langzeitigen cjos Expression im phänotypisch
veränderten Gewebe nachgewiesen werden konnte, könnte Kollagenase I als ein Markergen für
solche pathologische Veränderungen dienen.
Da die Expression der Kollagenase IV in den Mx-cjosD transgenen Mäusen nicht durch eine
erhöhte cjos Expression beeinflußt wird, erscheint es unwahrscheinlich, daß die hier
beobachtete Expression der MMP im Tumorgewebe durch die konstitutive cjos Expression
direkt verursacht werden. Sie scheint vielmehr eine sekundäre Folge der Tumorbildung zu sein.
63
4.5 Expression der Kollagenase I in Geweben von c1os-negativen Mäusen.
Die im Kapitel 4.4 beschriebenen Daten zeigen, daß eine veränderte c1os Expression im
Organismus (transgene Mäuse) zu einer veränderten Kollagenase I Expression in bestimmten
Geweben, hauptsächlich im Knochen, fiihrt. Auch in transgenen Tieren, in denen die langzeitige
erhöhte c1os Expression zu phänotypischen Gewebeveränderungen führt, ist die Kollagenase I
Expression ausschließlich im pathologisch veränderten Knochengewebe stark erhöht. Dies deutet
auf eine entscheidende Funktion von cFos auf die transkriptioneile Regulation von Kollagenase I
hin. Für die Expression der menschlichen Kollagenase I wurde die absolute Notwendigkeit von
cFos durch transiente Transfektion von c1os antisense
Konstru~en
im Zellkultursystem gezeigt
(Schönthal et al., 1988). Diese Daten fiihren zu der Fragestellung, welche Auswirkungen das
Fehlen des c1os Genprodukts auf die Expression von Kollagenase I und damit auf den davon
betroffenen Organismus hat.
Diese Untersuchung wurde in Mäusen durchgefiihrt, bei denen das c1os Gen durch homologe
Rekombination inaktiviert wurde ("Knockout"). Diese Tiere zeigen ungefahr zehn bis vierzehn
Tage nach Geburt ein verzögertes Wachstum und besitzen eine gestörte Knochen- und
Blutzellentwicklung (Johnson et al., 1992; Wang et al., 1992). Ob diese phänotypischen
Veränderungen mit einer veränderten Kollagenase I Expression einhergehen, sollte im
Nachfolgenden untersucht werden.
4.5.1 Expression der Kollagenase I in Embryonen von c1os-negativen Mäusen.
Mittels "in situ" Hybridisierung wurde die Expression der Kollagenase I in embryonalen
Geweben von c1os-deftzienten Mäusen untersucht. Zu diesem Zeitpunkt können noch keine
phänotypischen Veränderungen in den Tieren beobachtet werden. Paraffin-Schnitte von 16.5
Tage alten Wildtyp- und Mutanten-Embryonen Mäusen wurden mit Kollagenase I antisense
Proben hybridisiert (s. 4.2.2).
Abb.19 zeigt Längsschnitte von 16.5 Tage alten Embryonen von Wildtyp (a) und c1os-negativen
Mäusen (c). Folgende Bereiche des Skeletts sind zu erkennen: das Schlüsselbein (cl), die Rippen
(rb), der Unterkiefer (mn) und der Hüftknochen (hb). Abb.19b zeigt die Dunkelfelddarstellung
zu Abb.19a; Abb.l9d die Dunkelfelddarstellung zu 19b. Eine Expression von Kollagenase I ist
in den oben aufgeführten Bereichen des Skeletts sowohl im Wildtyp-Embryo, als als auch im
Mutanten-Embryo nachweisbar. Im Bereich der Rippen und im Unterkiefer des c1os-deflzienten
Embryos scheint das Signal schwächer zu sein als im vergleichbaren Schnitt des WildtypEmbryos.
Abb.l9: Expression der Kollagenase I in Längsschnitten von 16.5 Tage alten Embryonen aus Wildtyp und c-fosnegativen
Mäusen.
(a) Wildtyp-Embryo.
(c)
Mutanten-Embryo.
(b)
Dunkelfelddarstellung von
(a).
(d)
Dunkelfelddarstellung von (c). (cl) Schlüsselbein; (hb) Hüftknochen; (mn) Unterkiefer; (rb) Rippen. Maßstab: 1 mm.
64
a
r
mn
-
65
Abb.20: Expression der Kollagenase I im Bereich der Rippen von 16.5 Tage alten Embryonen aus Wildtyp und c-fosnegativen Mäusen. (a) Längsschnitt und (b) Querschnitt im Bereich der Rippen eines Wildtyp-Embryos. (c)
Längsschnitt und (d) Querschnitt im Bereich der Rippen eines Mutanten-Embryos. (rb) Rippen. Maßstab: 200 11m.
Betrachtet man den Bereich der Rippen in der Vergrößerung (Abb.20), kann man schwache
Unterschiede in der Expressionsstärke beobachten. Abb. 20a zeigt einen Längsschnitt des
proximalen Bereiches der Rippen im Wildtyp-Embryo; Abb. 20c den entsprechenden Bereich im
cjos-defizienten Embryo. In den Rippen des Mutanten-Embryos scheint die Kollagenase I
Expression schwächer zu sein. Dies könnte jedoch auch durch die etwas unterschiedlichen
Schnittebenen durch beide Embryonen hervorgerufen werden. Ein deutlicherer Unterschied in
der Expressionsstärke der MMP ist beim Vergleich eines Querschnittes im Bereich der Rippen
zu erkennen (Abb.20b,d). In den Rippen des Wildtyp-Embryos (20b) scheint das Signal stärker
zu sein als im entsprechenden Bereich des cjos-negativen Embryos (20d).
Signifikantere Unterschiede im Kollagenase I Expressionsmuster zwischen Wildtyp und
Mutanten Mäusen sind in neugeborenen Tieren zu erkennen. Zu diesem Zeitpunkt scheint das
Signal in den Röhrenknochen der Mutanten schwächer zu sein als im Wildtyp (nicht gezeigt).
66
4.5.2 Kollagenase I Expression zum Zeitpunkt des Auftreten phänotypischer Veränderungen
(2 Wochen alte Tiere)
Zwei Wochen nach Geburt zeigen die cjos-negativen Mäuse massive Veränderungen in ihrer
Knochenentwicklung. Die gravierendsten Unterschiede sind in den Röhrenknochen der Tiere zu
beobachten. Abb. 21a zeigt eine Übersicht des proximalen Bereiches des Schienbeins. Zum
direkten Vergleich ist parallel noch einmal das Ergebnis mit Material aus Wildtyp-Mäusen
gezeigt (Abb.16). Ebenso wie im Wildtyp sind die Epi-, die Meta- und die Diaphyse zu sehen (s.
auch Abb.llf). Die Vergrößerung in Abb.21b zeigt, daß der Bereich der Epi- und Metaphyse im
Vergleich zum Wildtyp verbreitert ist, und daß die Knochenmarkshöhle im Bereich der Diaphyse
von Knochenbälkchen ausgefüllt ist. Auch der kompakte Knochen im Bereich der Diaphyse (co)
ist sehr viel dünner als im Wildtyp. Osteoblasten entlang der äußeren und inneren Knochenhaut
(Periosteum und Endosteum) fehlen (Johnson et al., 1992; Wang et al., 1992). Im Bereich der
Wachstumszone ist der Bereich der proliferierenden Chondrozyten stark reduziert und die
Längssäulen, die typisch für die Proliferationszone sind (s.Abb.12; P), erscheinen sehr
unregelmäßig. Zusätzlich ist ein Anwachsen der hypertrophen Chondrozytenzone zu beobachten
(Abb.21d, H). Weiterhin können die vorhandenen Schneide- und Backenzähne aufgrund
abnormal hoher Knochenmengen nicht durchbrechen (Johnson et al., 1992; Wang et al., 1992).
Ein Vergleich der Kollagenase I Expression in den Röhrenknochen von zwei Wochen alten
Wildtyp und Mutanten Mäusen ist in Abb.21 zu sehen (die Expression in Wildtyp Mäusen ist in
Kapitel 4.3.2 gerrauer beschrieben). Die im Bereich der Wachstumszone mit einem Kreis
markierte Region ist in Abb.21d vergrößert dargestellt. In 21c ist die Dunkelfelddarstellung zu
Abb.21b zu sehen. Das Signal (weiße Bereiche) in der Grenzregion der Metaphyse zur
Wachstumszone ist im Knochen der Mutante sehr viel schwächer als im Knochen des Wildtyps.
Zusätzlich kann man in der Mutante eine Expression durch den gesamten Bereich der Diaphyse
beobachten. Das Signal ist, wie schon erwähnt (Abb.16d, H), ebenfalls im Grenzbereich
zwischen hypertrophem und kalziflziertem Knorpel, im Bereich der Knochenneubildung zu
beobachten. Es ist jedoch sehr viel schwächer als im Wildtyp.
Abb.21: Expression der Kollagenase I im Schienbein einer zwei Wochen alten cfos-negativen Maus. Zum direkten
Vergleich ist auf der gegenüberliegenden Seite noch einmal das Ergebnis der Hybridisierung mit Kollagenase I aus
Wildtyp-Mäusen (Abb. 16) gezeigt. (a) Übersicht des Knochens. (b) Vergrößerung der Epiphyse, Wachstumszone,
Meta- und Diaphyse. Der Kreis markiert den in (d) vergrößerten Bereich. (c) Dunkelfelddarstellung von (b). (d)
Vergrößerung im Bereich der Wachstumszone. (cc) Zone der Kn01pelverkalkung; (H) hypertropher Knorpel; (M)
Zone der Chondrozytenreifung. Maßstab: (a) 1 mm; (b,c) 200 pm; (d) 100 pm.
67
a
.. .
d
M
68
(
I
69
Diese Daten zeigen, daß in den c:fos-defizienten Tieren die Kollagenase I Expression beeinflußt
ist. Eine veränderte Expression der MMP kann dabei schon vor dem Auftreten der
phänotypischen Veränderungen nachgewiesen werden. Ob die veränderte Expression der
Kollagenase I für die beobachteten phänotypischen Veränderungen mitverantwortlich ist, muß
jedoch noch gezeigt werden.
70
5. DISKUSSION
Eine intakte Extrazelluläre Matrix
(ECM)
ist
sowohl
für
Vorgänge
während
der
Embryonalentwicklung (z. B. Zellwanderungen, Wachstum), als auch für die Aufrechterhaltung
der
Gewebemorphologie
und
-funktion
des
adulten
Organismus
erforderlich
(als
Übersichtsartikel: Alexander und Werb, 1989; Matrisian und Hogan, 1990). Die ECM ist jedoch
kein starres Gebilde, sondern unterliegt einem regelmäßigen Auf- und Abbau ihrer
Komponenten, um die Dynamik zu erhalten, die für viele Wachstumsprozesse notwendig ist.
Dies erfordert ein kontrolliertes Gleichgewicht dieser beiden gegenläufigen Prozesse.
Das Ausmaß dieser Gewebeumbauprozesse unterliegt der Kontrolle von extrazellulären
Faktoren, z. B. Wachstumsfaktoren und Cytokine, die diese Vorgänge steuern. Zum einen haben
diese Substanzen Einfluß auf die Synthese der Matrixkomponenten, zum anderen beeinflussen sie
die Expression der Matrix-abbauenden Enzyme und deren Inhibitoren (Edwards et al., 1987;
Kerr et al., 1988; Brenner et al., 1989b; Nomura et al., 1989; Matrisian und Hogan, 1990; Lee
et al., 1994). Zum Beispiel konnte nachgewiesen werden, daß Wachstumsfaktoren, wie PDGFA, TGF-a und TGF-ß während dem Blastozystenstadium erhöht exprimiert sind, und daß
gleichzeitig die Menge an MMP- (Kollagenase, Stromelysin) und Inhibitor- (fiMP) Transkripten
ansteigt (Rappolee et al., 1988). Für den Wachstumsfaktor TGF-ß konnte in Zellkultur eine
entgegengesetzte Wirkung auf die Synthese der ECM-Komponenten und die Expression der
spezifisch die ECM-abbauenden Matrixmetalloproteinasen gezeigt werden (Frisch und Ruley,
1987). Auch die sehr weitgestreute Substratspezifität für die Komponenten der ECM und die
mögliche hohe Expression von Metalloproteinasen im Zellkultursystem, im Gegensatz zu den
niedrigen oder nicht nachweisbaren Kollagenumbauraten, die im normalen Organismus
beobachtet werden, weisen auf eine komplexe Kontrolle der MMP-Expression und MMPAktivität hin (als Übersichtsartikel: Werb et al., 1989). Die Folgen einer unkoutrollierten MMPAktivität sind Gewebezerstörung und die Ausbreitung von Tumoren (als Übersichtsartikel:
Woessner et al., 1991). Unter physiologischen Bedingungen finden sich hohe MMP-Aktivitäten
nur während der Embryonalentwicklung. Dies ist plausibel, da man aufgrund des schnellen
Wachstums und der Gewebemorphogenese einen schnellen Umbau der Komponenten der ECM
erwarten muß.
Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der transkriptioneilen Regulation der MMPs im
Gesamtorganismus. Dabei sollte die transkriptioneile Regulation der Maus MMPs im
Zellkultursystem mit derjenigen im
Gesamtorganismus
verglichen werden.
Um
den
Regulationsmechanismus im Gesamtorganismus zu studieren, wurden solche Tiere ausgewählt,
bei denen gezielt die Synthese von wichtigen Regulatorproteinen der MMP-Transkription
manipuliert wurde. Weiterhin sollte überprüft werden, ob Unterschiede im Expressionsmuster
71
der MMPs im Embryo und im adulten Tier auftreten, und ob die Expression der MMPs im
Organismus zelltypspezifisch ist. Zur Durchführung dieser Experimente war die K.lonierung von
mausspezifischen MMP-cDNA Proben notwendig.
Bei diesen Unteruchungen konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: Stromelysin 1,
Stromelysin 2, Kollagenase I und Kollagenase IV (72 kD) der Maus werden gewebespezifisch
exprimiert, wobei deutliche Unterschiede zwischen der Expression im Embryo und im adulten
Organismus auftreten. Eine AP-1 abhängige Expression von Kollagenase I, Stromelysin 1 und
Stromelysin 2 konnte im Zellkultursystem nachgewiesen werden. Im Organismus trifft dies
jedoch nur für Kollagenase I zu. Sie wird im Embryo, als auch im adulten Tier im Knochen
höchstwahrscheinlich in Osteoblasten exprimiert. Aufgrund einer erhöhten Expression von
Kollagenase I in den c-jos transgenen Mäusen, die spezifisch im pathologisch veränderten
Knochengewebe
zu
beobachten
war,
könnte
diese
MMP
als
Markergen
für
die
Knochentumorgenese und anderer Veränderungen in der Knochenhomöostase dienen.
Neben der Aufklärung zum Regulationsmechanismus brachte die cDNA Isolierung auch
Erkenntnisse über die phylogenetische Verwandschaft von Säuger-MMPs. Dieser Aspekt wird
vorweg diskutiert.
5.1 Die Matrix-abbauenden Enzyme der Maus lassen sich in die Familie der Metalloproteinasen einordnen
Anhand des Sequenzvergleiches, der in dieser Arbeit klonierten Maus MMP-cDNA Proben von
Stromelysin 1, Stromelysin 2, Kollagenase I und der 72 kD Kollagenase IV mit MMPs anderer
Spezies, können die Metalloproteinasen der Maus in den phylogenetischen Stammbaum der
Matrixmetalloproteinasen
(Murphy
et
al.,
1991)
eingeordnet
werden.
Die
klonierte
Nukleotidsequenz der 72 kD Kollagenase IV erwies sich als 100% identisch zur kürzlich
isolierten cDNA aus NIH3T3 Zellen (Reponen et al., 1992), und hat 97% Homologie zur
menschlichen Kollagenase IV (72 kD). Auch die Stromelysine weisen einen hohen Prozentsatz
an Homologie zu den entsprechenden menschlichen Sequenzen und denen der Ratte auf. Für
Stromelysin 1 der Maus konnte eine 93 %-ige Sequenzhomologie zur entsprechenden Sequenz
aus Ratte (Matrisian et al., 1985) gefunden werden; zur menschlichen Stromelysin 1 Sequenz
zeigte es eine 83%-ige Homologie (Whitham et al., 1986). Auch Stromelysin 2 wies eine über
90%-ige Sequenzübereinstimmung (91 %) zum Stromelysin 2 der Ratte auf (Breathnach et al.,
1987). Für die entsprechende menschliche Sequenz konnte 77% Homologie gefunden werden
(Muller et al., 1988). Eine Ausnahme bilden die Kollagenasen I der Maus und der Ratte, bei
denen die Homologie zu den entsprechenden Sequenzen von Mensch und auch Kaninchen nur bei
52 bis 55% liegt. Die Unterschiede der Kollagenasen von Maus und Ratte, gegenüber denen der
anderen Säuger, beruhen jedoch nicht nur in ihrer Primärsequenz, sondern es konnten auch
72
Differenzen im 3 '-nichttranslatierten Bereich, in der Anzahl der Glykosylierungsstellen, und in
ihrer Substratspezifität gefunden werden (Henriet et al., 1992). Eine Ausnahme bildet der
Bereich des aktiven Zentrums, dessen Sequenz hoch konserviert ist. Die Charakterisierung des
kürzlich in unserem Labor isolierten genomischen Klons der Maus Kollagenase I (Schorpp et al.,
1994) zeigt ebenfalls, daß sowohl im Promoterbereich (mit Ausnahme der AP-1 und PEA3
Bindungsstellen) als auch im Bereich der Irrtransequenzen (mit Ausnahme der Exon/Intron
Übergänge) eine starke Abweichung zu den entsprechenden Sequenzen der interstitiellen
Kollagenasen von Mensch und Kaninchen (Fini et al., 1987a) besteht.
Diese Daten machen deutlich, daß die Kollagenasen vom Typ I der Ordnung Rodentia sich in
vielen Merkmalen klar von den entsprechenden Sequenzen der anderen Säugerordnungen
unterscheiden und unterstützen somit die von Li et al. (1990) aufgestellte Hypothese (basierend
auf einer phylogenetischen Analyse), daß sich die Ordnung Rodentia als eine Seitengruppe zu
den anderen Säugetieren abzweigt. Die anderen Metalloproteinasen, z. B. Stromelysin 1
(Ostrowski et al., 1988) und Stromelysin 2 (diese Arbeit), könnten diesem Evolutionsdrift durch
eine Koevolution entkommen sein (Henriet et al., 1992). Ein weiterer Hinweis auf die
Abzweigung der interstitiellen Kollagenasen von Maus und Ratte könnte die vor kurzem in
unserem
Labor
(in
Zusammenarbeit
mit
M.
G.
Mattei,
Marseille)
durchgeführte
Chromosomenlokalisierung liefern, wobei das Gen für Kollagenase I in einem Bereich auf
Chromosom 9 (A1-A2 Region) der Maus lokalisiert wurde, welcher synthenisch mit dem kurzen
Arm von Chromosom 19 im Menschen ist (M. G. Mattei, pers. Mitteilung; Schorpp et al.,
1994). Das menschliche Gen für Kollagenase I, und auch das des Stromelysin 1, liegt jedoch
nicht auf Chromosom 19, sondern auf dem langen Arm von Chromosom 11 (Birkedal-Hansen et
al., 1993). Ein weiteres MMP-Gen, das auf Chromosom 9 der Maus gefunden wurde, ist das der
Metalloelastase (Shapiro et al., 1992). Auch diese Metalloproteinase zeigt nur eine sehr geringe
Homologie zu den anderen MMPs der Säuger (33-48%). Die unterschiedliche chromosomale
Lokalisierung der Kollagenase I Gene der Ordnung Rodentia zu den entsprechenden Genen der
anderen Säuger könnten daher ein weiteres Indiz für die Hypothese sein, daß sich die heutigen
Kollagenasen der Nager als eine neue Enzymgruppe aus einem Gen entwickelt haben, das sich
vom Vorläufergen der Kollagenase I vor der Entstehung der Ordnung Rodentia abgetrennt hat
(Henriet et al., 1992). Das ursprüngliche Kollagenase I Vorläufergen muß jedoch bei diesem
Prozeß verloren gegangen sein, da keine Kreuzreaktion zwischen genorniseher DNA der Maus
und der cDNA Probe aus Mensch oder Kaninchen festgestellt werden konnte (Angel et al.,
unveröffentlichte Daten).
73
5.2 Fos/Jun als die limitierenden Kontrollfaktoren der M:MPs in Kulturzellen
Die Expression der MMP-Gene wird in Zellkultur durch eine Reihe von extrazellulären Stimuli,
darunter Wachstumsfaktoren, Hormone, Cytokine oder Phorbolester reguliert (Angel et al.,
1987; Kerr et al., 1988; Brenner et al., 1989b; Quinn et al., 1990). Die Behandlung von SV40
transformierten Lungenfibroblasten der Maus mit dem Phorbolester TPA führt zu einer
Induktion der Stromelysin 1, der Stromelysin 2 und der Kollagenase I Expression. Diese
Ergebnisse stimmen weitgehend mit den Expressionsdaten von Metalloproteinasen anderer
Spezies überein (Angel et al., 1987a; Breathnach et al., 1987). Im menschlichen und auch im
Rattensystem induziert der Phorbolester TPA und auch Wachstumsfaktoren (z. B. EGF) sowohl
die Transkriptionsrate,
als
auch posttranslationale Modifikationen der Mitglieder der
Transkriptionsfaktorfamilien Jun und Fos, die als AP-1 Komplex an die AP-1 Bindungsstelle in
der Promoterregion von Stromelysin 1, Stromelysin 2 und Kollagenase I binden (als
Übersichtsartikel: Angel und Karin, 1991). Der Signalweg, der zu dieser Induktion der MMPExpression führt, verläuft über die durch TPA und Wachstumsfaktoren aktivierbare
Proteinkinase C (Nishizuka, 1984; 1986) und weiterer, nachgeschalteter Proteinkinasen (z. B.
Raf und Mitglieder der MAP-Kinase Familie; Radler-Pohl et al., 1993; Nishida und Gotoh,
1993; Derijard et al., 1994). Dagegen scheint die durch den sekundären Botenstoff cAMP
aktivierbare Proteinkinase A in der Regulation der drei MMPs Stromelysin 1, Stromelysin 2 und
Kollagenase I der Maus keine Rolle zu spielen. In einigen menschlichen Zellinien konnte nach
einer Behandlung von Zellen mit cAMP oder cAMP-imitierenden Substanzen sogar eine
Hemmung der basalen MMP-Expression beobachtet werden (Brenner et al., 1989b; Angel und
Karin, 1992).
UV-Strahlung, die in den Zellen DNA-Schäden erzeugt und damit zur Auslösung einer StreßAntwort im Organismus führt, induziert ebenfalls die Expression von Kollagenase I und
Stromelysin 2 der Maus. Im Gegensatz zu der nach 6 bis 8 Stunden nach TPA-Behandlung
beobachteten MMP-Induktion ist eine Expression der beiden MMPs erst nach 36 bis 48 Stunden
zu beobachten. Diese Kinetik stimmt mit der im menschlichen System beobachteten Kinetik der
Kollagenase I Expression durch UV-Strahlung überein und ist wahrscheinlich, analog zum
menschlichen System, auf die vermehrte Synthese und Sekretion von Il-1a und bFGF
zurückzuführen (Schorpp et al., 1984; Krämer et al., 1993). Dies muß jedoch für das
Maussystem noch gezeigt werden. Obwohl die Behandlung der Lungenfibroblasten mit TPA
auch zu einer Induktion der Stromelysin 1 Genexpression führt, induziert die Bestrahlung der
Zellen mit UV die Expression des Stromelysin 1 Gens nicht. Der Grund hierfür könnte sein, daß
trotz der gemeinsamen AP-1-Stelle, die im Promoter von Kollagenase I (Schorpp et al., 1994)
und Stromelysin 1 (J. Mudgett, pers. Mitteilung) der Maus gefunden wurde, Unterschiede in
anderen Sequenzen innerhalb des Promoterbereichs dieser beiden Gene existieren, die für die
74
beobachteten Unterschiede in Antwort auf verschiedene extrazelluläre Stimuli verantwortlich
sind. So könnten Faktoren, die infolge einer UV-Behandlung sezerniert werden, über andere
Promotorelemente wirken, indem sie mit Fos/Jun funktionell zusammenarbeiten. Sie könnten so
für die erhöhte Expression von Stromelysin 2 und Kollagenase I verantwortlich sein, aber nicht
die
Induktion
der
Stromelysin
1
Genexpression
bewirken.
Aufgrund
der
hohen
Sequenzhomologie der kodierenden Regionen von Stromelysin 1 und Stromelysin 2 könnte man
annehmen, daß diese beiden Gene ähnlich reguliert werden. Ein Vergleich der Sequenzen im
Promoterbereich der Rattengene zeigte jedoch nur eine geringe Homologie (Breathnach et al.,
1987).
Vor kurzem wurde eine weitere MMP der Maus, die 92 kD Typ IV Kollagenase, isoliert
(Reponen et al., 1994). Das Gen besitzt ebenfalls eine AP-1-Stelle in der Promoter Region (C.
Murnaut, I. Thesleff, persönliche Mitteilung) und man könnte deshalb erwarten, daß diese MMP
ähnlich reguliert wird, wie Kollagenase I, Stromelysin 1 und Stromelysin 2. Diese
Untersuchungen stehen jedoch noch aus. Demgegenüber wird die Expression der 72 kD Typ IV
Kollagenase weder durch eine Behandlung der Zellen mit TPA, noch durch eine cAMP- bzw.
eine UV-Behandlung beeinflußt. Die fehlende Antwort auf TP A in den Mauszellen ist in
Übereinstimmung mit der fehlenden TPA-Antwort dieser MMP in menschlichen Zellen. Für die
menschliche 72 kD Typ IV Kollagenase konnte gezeigt werden, daß die ausbleibende TPAAntwort mit dem Fehlen einer AP-1-Stelle im Promoter des Gens korreliert (Collier et al., 1988;
Huhtala et al., 1991). Aufgrun4 des hohen Grades an Homologie (97%) zwischen der
menschlichen und der Maus Kollagenase IV Sequenz (Reponen et al., 1992) könnte das
Ausbleiben der TPA-Antwort im Maussystem ebenfalls auf einem Fehlen der AP-1-Stelle im
Promoter beruhen.
Die hohe Übereinstimmung in der Regulation der Maus MMP-Gene mit der Regulation der
MMP-Gene anderer Spezies läßt vermuten, daß die für den Transkriptionsmechanismus
verantwortlichen Komponenten streng konserviert sind. Die in der Zwischenzeit in unserem
Labor erfolgte Isolierung des genorniseben Klons der Maus Kollagenase I ermöglichte eine
Charakterisierung der für die Regulation verantwortlichen Sequenzen (Schorpp et al., 1994). So
zeigte die Analyse der Promoterregion nur zwei konservierte Elemente; eine AP-1- und eine
PEA3-Stelle, die auch im Promoter der menschlichen oder der Kaninchen Kollagenase I zu
finden sind (Angel et al., 1987a,b; Fini et al., 1987a). Die AP-1-Stelle des Maus Kollagenase
Gens erwies sich dabei als perfektes Palindrom und die durchgeführten "in vitro"
Bindungsstudien bestätigten, daß diese AP-1-Stelle eine hochaffine Jun!Fos-Bindungsstelle
darstellt (Schorpp et al.,
1994). Es ist daher anzunehmen, daß die Bindung des
Transkriptionsfaktors AP-1, zusammen mit den Ets-Proteinen, für die transkriptionelle
Regulation als Antwort auf Wachstumsfaktoren, Cytokine und Tumorpromotoren verantwortlich
75
ist. Auch in der Promoterregion des Stromelysin 1 Gens der Maus ist eine AP-1-Stelle zu finden
(J. Mudgett, persönl. Mitteilung). Ob diese Bindungsstelle für die Antwort auf extrazelluläre
Signale essentiell ist, bleibt noch zu zeigen. Für Stromelysin 2 der Maus müssen solche
Promoterelemente und die daran bindenden Faktoren noch identifiziert werden. Eine AP-1
Bindungsstelle, die eine TPA-Antwort vermitteln könnte, konnte jedoch im Promoter des
Stromelysin 2 Gens der Ratte identifiziert werden (Breathnach et al., 1987).
5.3 Die Expression der MMPs während der Embryogenese ist gewebespezifisch und nicht
überlappend
Die im Zellkultursystem gefundene Induzierbarkeit von Kollagenase I, Stromelysin 1 und
Stromelysin 2 deutet auf eine koordinierte Regulation dieser MMPs hin. Ob dies jedoch auch für
den Gesamtorganismus zutrifft, oder ob die verschiedenen Metalloproteinasen in den Geweben
unterschiedlich exprimiert werden, sollte in dieser Arbeit untersucht werden. Daß Zell- bzw.
Gewebekulturdaten nicht unbedingt auf die Situation des Gesamtorganismus zu übertragen sind,
konnte bereits für die 92 kD Typ IV Kollagenase der Maus bestätigt werden. "In situ"
Hybridisierungsdaten zeigten, daß diese MMP in Zellen der Osteoklastenlinie exprimiert wird
und nicht, wie aufgrund der existierenden Zellkulturdaten angenommen, in Makrophagen und
Geweben, die Makrophagen enthalten (Reponen et al., 1994). Die hier beschriebene Klonierung
von mausspezifischen MMP-cDNA Proben liefert somit einen wichtigen Beitrag zur Erforschung
der Regulation und
Funktion dieser
für
den
Gewebeumbau
wichtigen Enzyme im
Gesamtorganismus.
Zu den verschiedenen Zeitpunkten der Embryonalentwicklung der Maus konnte in den Geweben
des Embryos nur die Expression von Kollagenase IV und Kollagenase I nachgewiesen werden.
Die für die 72 kD Typ IV Kollagenase beobachtete Expression, die in vielen Geweben
mesenchymalen Ursprungs gefunden wird, stimmte mit den von Reponen et al. (1992)
beschriebenen Ergebnissen überein. Die Metalloproteinasen Stromelysin 1 und Stromelysin 2
konnten in diesem Zeitraum nicht nachgewiesen werden (Tab.2). Dies ist erstaunlich, da
während der Embryonalentwicklung cJun und cFos Proteine in verschiedenen Geweben
exprimiert werden (Caubet, 1989; Wilkinson et al., 1989). Diese Beobachtung könnte jedoch
eine Erklärung dafür sein, daß Mäuse, bei denen das Stromelysin 1 Gen durch homologe
Rekombination inaktiviert wurde ("Knock out"), keinen auffaltigen Phänotyp aufweisen (J.
Mudgett, persönliche Mitteilung). Während eine Expression der 72 kD Kollagenase IV in vielen
mesenchymalen Geweben schon sehr früh (Tag 10.5; Tab.2) beobachtet werden kann (hier
gezeigte Daten; Reponen et al., 1992), findet man eine schwache Kollagenase I Expression zum
ersten Mal am Tag 14.5 (Tab.2) in eng begrenzten Bereichen einiger weniger Gewebe des sich
entwickelnden Skeletts (z. B. in den Schaftregionen von Oberarm und -schenke!, bestimmte
76
Bereiche in Ober- und Unterkiefer und des Schädels). Am Tag 15.5 der Entwicklung läßt sich
dann eine drastische Zunahme der Kollagenase I Expression beobachten. Nun findet man eine
Expression in den Schaftregionen fast aller Röhrenknochen, in den proximalen Bereichen der
Rippen, im Zentrum des Wirbelkörpers und in den Wirbelbögen, im Schulterblatt und in
Bereichen des Unter- und Oberkiefers. Am Tag 16.5 wird die Expression geringfügig gesteigert.
Das Erscheinen und die Lokalisation des Signals stimmt dabei mit den beschriebenen Bereichen
der Umwandlung des Knorpel-Vorläuferskeletts in den primären Knochen überein. Auch der
Zeitpunkt zu dem eine Kollagenase I Expression zum ersten Mal auftritt, korreliert mit dem
Auftreten der ersten Ossifizierungszentren (Kaufnlan, 1992). Eine spezifische Färbung
(Alizarinrot-Färbung), die die Ossifikationszentren im Gesamt-Embryo lokalisiert, stimmt mit
der Kollagenase I Lokalisation überein und bestätigt diese Annahme. Die gerrauere Untersuchung
zeigt, daß die Kollagenase I wahrscheinlich von Osteoblasten exprimiert wird, denn man findet
das Signal in Bereichen, in denen aktive Osteoblasten lokalisiert sind, z. B. in der
Übergangszone zwischen Knorpel und sich neubildendem Knochen (Eröffnungszone), entlang
der Knochenbälkchen, und entlang der Kompakta.
Zeitpunkt der Embryonalentwicklung (in Tage)
Kollagenase IV
10.5
11.5
12.5
13.5
14.5
15.5
16.5
18.5
Geburt
Adult
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
n.b.
n.b.
+
(72 kD)
Kollagenase I
Stromelysine
(1 und 2)
c-jun
n.b
n.b.
n.b.
n.b.
c-fos
TIMP-1
+
+
+
+
+
+
+
n.b.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
n.b.
n.b
Tab.2: Expression der MMPs, des Transkriptionsfaktors AP-1 (Jun/Fos) und des MMP-Inhibitors TIMP-1 während
der Embryogenese und im adulten Organismus der Maus. Die Expression wurde mittels "in situ" Hybridisierung und
durch Northem Blot Analysen bestimmt (+:nachgewiesene Expression;-: keine Expression; n.b.: nicht bestimmt).
77
Die gefundene Expression von Kollagenase I wirft natürlich die Frage nach der möglichen
Funktion während dieser Prozesse auf. Bei der Umwandlung des im Embryo angelegten
Knorpelmodells in die verknöcherte Form des Skeletts findet ein "Switch" von Kollagen II nach
Kollagen I statt (v. d. Mark, 1980; Martin et al., 1985). Um der neugebildeten Knochenmatrix
Platz zu verschaffen, ist ein Abbau der Knorpelkomponenten, d.h. von Kollagen II, notwendig.
Die Funktion der Kollagenase I könnte dabei im Abbau des Kollagen vom Typ II liegen, da sie
spezifisch in der Eröffnungszone vom Knorpelgewebe zum neugebildetem Knochen hin und in
Zellen entlang der Knochenbälkchen lokalisiert werden kann. Dabei scheint hauptsächlich
Kollagenase I während der Embryonalentwicklung für diesen Prozeß verantwortlich zu sein.
Obwohl eine Kollagenase I Funktion für viele andere embryonale Prozesse (z. B. Angiogenese)
postuliert wurde, konnte keine Expression dieser MMP in anderen Geweben gefunden werden.
Eine andere Möglichkeit wäre allerdings auch, daß die Transkriptmenge unterhalb der
Nachweisgrenze der verwendeten Methode liegt.
Die Transfektion von c-jun und c-jos spezifischen antisense Konstrukten bzw. transdominantnegativ Mutanten von Fos und Jun Proteinen in menschlichen Zellinien und die durchgeführten
"in vitro" Bindungsstudien im Maussystem zeigten, daß für die Induktion der Kollagenase I
Expression der Transkriptionsfaktor AP-1
verantwortlich
ist,
der
sich
aus Jun/Fos
Heterodimeren zusammensetzt (Peter Angel, pers. Mitteilung; Schönthai et al., 1988; Schorpp et
al., 1994). Tatsächlich wurde eine c-jun Expression im sich entwickelnden Skelett gefunden
(Wilkinson et al., 1989). Transkripte konnten mittels "in situ" Hybridisierung am Tag 14.5
(Tab.2) in den schnell proliferierenden Zellen des Perichondriums der sich entwickelnden
Gliedmaßen und in den Rippen nachgewiesen werden. Später am Tag 17.5 findet man c-jun
Transkripte hauptsächlich in den Wachstumszonen des Knorpels (Wilkinson et al., 1989). Das
Gen scheint jedoch schon früher während anderer Prozesse der Embryonalentwicklung eine
wichtige Rolle zu spielen, da Mäuse, bei denen das c-jun Gen durch homologe Rekombination
inaktiviert wurde, ungefähr am Tag 12.5 der Entwicklung sterben (Hilberg et al., 1993; Johnson
et al., 1993). Auch eine c-jos Expression konnte in den perichondralen Regionen des hyalinen
Knorpels, in den wachsenden Regionen der flachen Knochen (parietaler und frontaler Knochen),
in den Wirbelkörpern, und in den langen Röhrenknochen nachgewiesen werden (Dony und
Gruss, 1987; Caubet und Bernaudin, 1988). Die c-jos exprimierenden Zellen sind dabei
hauptsächlich Chondrozyten und Osteoblasten in den ossifizierenden Regionen. Eine c-jos
Expression ist ebenfalls nicht vor Tag 13 der Entwicklung zu beobachten. "In vitro" konnte
bestätigt werden, daß die c-jos Expression der Differenzierung der osteogenen Zellen vorausgeht
(Closs et al., 1990). Diese Daten machen deutlich, daß c-jun und c-jos im sich entwickelnden
Skelettsystem koexprimiert werden und somit für die Kollagenase I Expression verantwortlich
sein könnten.
78
Die beiden Transkriptionsfaktoren sind dabei in Chondrozyten und in Zellen der osteogenen
Linien kurz vor und zum Zeitpunkt der Ossifizierung nachweisbar.
Eine wichtige Frage kann bisher noch nicht beantwortet werden: Geht die Transkription in den
Geweben mit dem Erscheinen von Enzymaktivität einher?
Mit kürzlich hergestellten spezifischen Antikörpern gegen Kollagenase I (Rüdiger Vallon,
unveröffentlichte Daten) der Maus konnte zwar die Kolokalisation des Proteins mit der mRNA,
und auch die Koexpression mit dem.cFos Protein im Skelettgewebe mittels Immunhistochemie
nachgewiesen werden (Rüdiger Vallon, unveröffentlichte Daten). Die Aktivität der Enzyme wird
jedoch von posttranslationalen Ereignissen bestimmt. Einerseits muß die inaktive Proform des
Enzyms durch einen spezifischen Aktivator im entsprechenden Gewebe aktiviert werden. An der
Aktivierung der Prokollagenase ist "in vivo" wahrscheinlich die Serinproteinase Plasmin
beteiligt. Ob Plasmin, das durch die Spaltung von Plasminogen durch den Plasminogenaktivator
entsteht, in den Geweben bzw. Zellen in denen Kollagenase I exprimiert ist, ebenfalls zu finden
ist, wurde bisher noch nicht untersucht. Es konnte jedoch nachgewiesen werden, daß das
Parathormon (PTH) die Akkumulation des Plasminogen-spaltenden Plasminogenaktivators in
kultivierten Osteoblasten stimuliert (als Übersichtsartikel: Matrisian und Hogan, 1990; und
Referenzen darin). Die postulierte Funktion der Stromelysine bei der Aktivierung der
Kollagenase ist zum Zeitpunkt der Embryonalentwicklung ausgeschlossen, da in der
vorliegenden Arbeit eine Expression dieser beiden MMPs nicht nachgewiesen werden konnte.
Eine "Netto"-Enzymaktivität resultiert nur dann, wenn die Expression des MMP-Gens die
Expression des gewebespezifischen Inhibitors TIMP übersteigt. Im Gegensatz zur Kollagenase I
Expression kann eine TIMP Expression schon etwas früher am Tag 13.5 (Tab.2) der
Entwicklung mittels "in situ" Hybridisierung nachgewiesen werden (Flenniken und Williams,
1990). Transkripte werden ebenfalls in den Geweben, die eine Osteogenese durchlaufen, z. B. in
der Mandibel, den Rippen und im Schädelknochen gefunden. Das Signal wird dabei in einem
Ring von Zellen und extrazellulärer Matrix beobachtet, der den Knorpelkern umgibt und ähnelt
damit sehr dem Expressionsmuster der 72 kD Kollagenase IV. Zu einem späteren Zeitpunkt (Tag
15.5 und 17.5) findet man eine TIMP Expression sowohl in der Knochenmanschette, die das
Knorpelgewebe umgibt, als auch in den Regionen der zentralen Markhöhle (Nomura et al.,
1989; Flenniken und Williams, 1990), wo auch die Kollagenase I Expression beobachtet wird.
Die Expression von TIMP in der Schaftregion scheint jedoch weitaus geringer zu sein, als die
für Kollagenase beobachtete Expression, sodaß trotz Vorhandensein des Inhibitors in den
knochenbildenden Regionen eine "Netto"-Enzymaktivität resultieren könnte. Obwohl TIMP-1
effektiver in der Hemmung der Kollagenase I zu sein scheint (Birkedal-Hansen et al., 1993 und
Referenzen darin), deutet die korrelierende Lokalisation von TIMP-1 und der 72 kD Kollagenase
IV darauf hin, daß der Inhibitor vorwiegend eine Rolle bei der Hemmung dieser MMP zu
79
spielen scheint. Die Expression von TIMP-2, dem effektiveren Inhibitor gegenüber Gelatinasen,
wurde bisher noch nicht untersucht.
Um zum richtigen Zeitpunkt der Entwicklung einenMatrixauf-oder Abbau zu erhalten, müssen
diese Vorgänge einem strengen Kontrollmechanismus unterliegen, der durch eine Reihe
physiologischer Regulatoren gesteuert wird.
Eine wichtige Rolle in Bezug auf die
Knochenmatrixsynthese scheinen hier die Wachstumsfaktoren der TGF-ß-Familie zu spielen. Im
Zellkultursystem konnte für TGF-ß eine hemmende Wirkung auf die Expression der
Metalloproteinasen Stromelysin 1 und Kollagenase I nachgewiesen werden, dagegen wird die
Expression von TIMP und auch die Ablagerung von ECM-Komponenten und ihre Einlagerung
in die Extrazelluläre Matrix stimuliert (Matrisian et al., 1986; Edwards et al., 1987). "In situ"
Hybridisierungsdaten zeigen, daß sich die räumliche Verteilung von TGF-ß und TIMP sehr
ähneln. Man findet beide im Periosteum und in den Osteoblasten des sich entwickelnden
Knochens (Sandberg et al., 1988; Nomura et al., 1989). TGF-ß scheint so auch unter "in vivo"
Bedingungen für eine Induktion der TIMP Expression verantwortlich zu sein. Die Bestimmung
der Lokalisierung anderer Wachstumsfaktoren, die die Kollagenase Expression stimulieren
könnten, z. B. das Parathormon (PTH) oder Vitamin D3 , muß noch durchgeführt werden, um
diesen komplexen Regulationsmechanismus aufzuklären. In Zellkultur induzieren PTH und
Vitamin D3 in Osteoblasten die Expression von Kollagenase I (Heath et al., 1984; Delaisse et
al., 1988; Quinn et al., 1990). Es konnte nachgewiesen werden, daß PTH in Osteoblasten auch
die Expression der Protoonkogene c-jun und c-jos induziert (Clohisy et al., 1992). Mittels "in
situ" Hybridisierung wurde gezeigt, daß PTH "in vivo" eine schnelle und transiente c-jos
Expression in Osteoblasten entlang der Knochenbälkchen und in Chondrozyten im Bereich der
Wachsturnsplatte induziert. Die Expression von c-jos stimmt dabei mit den Zellen überein, die
auch den Rezeptor für PTH exprimieren (Lee et al., 1994).
Wie schon erwähnt unterscheidet sich die Expression der 72 kD Typ IV Kollagenase
vollkommen von der beobachteten Kollagenase I Expression. Kollagenase IV wird zu einem sehr
viel früheren Zeitpunkt exprimiert (Tab.2) und wird nicht nur im Knochen, sondern auch in
vielen anderen Geweben mesenchymalen Ursprungs gefunden (Reponen et al., 1992; hier
gezeigte Daten). Die Lokalisation der beiden Enzyme auf Zellebene unterscheidet sich auch im
Knochengewebe selbst. Während Kollagenase I direkt in den Ossifizierungszentren zu finden ist,
wird
Kollagenase
IV
(Osteoprogenitorzellen)
von
Zellen
exprimiert,
des
die das
Perichondriums
Knorpel-
bzw.
bzw.
des
Periosteums
Knochengewebe umgeben.
Kollagenase IV könnte somit am Abbau der Basalmembranen und der Matrix des mesenchymalen
Stromas beteiligt sein, um dem sich entwickelnden Skelett ein Wachstum und eine Ausdehnung
zu ermöglichen. Sahiberg et al. (1992) konnten mittels Immunhistochemie nachweisen, daß
während der Zahnentwicklung die erhöhte Expression der 72 kD Kollagenase IV in
80
Präodontoblasten dem Abbau der Basalmembran vorausgeht. Da auch Osteoblasten, die den
Odontoblasten ähneln, die 72 kD Typ IV Kollagenase exprimieren, könnte das Enzym am
selektiven Abbau von Knochenmatrixproteinen, zusammen mit der Kollagenase I, beteiligt sein
und somit zur Einwanderung von Blutgefäßen durch das Periost und der Mineralisierung des
Knochens beitragen (Sahlberg et al., 1992). Die 92 kD Typ IV Kollagenase scheint ebenso eine
wichtige Funktion während der Knochenentwicklung zu besitzen. Im Gegensatz zu Kollagenase I
wird diese MMP spezifisch von Osteoklasten exprimiert und könnte als Gelatinase wirken, die
an der Entfernung der denaturierten Kollagenfragmente (Gelatin) beteiligt ist, die von der
interstitiellen Kollagenase produziert werden (Reponen et al., 1994).
5.4 Unterschiede in der MMP Expression im Embryo und im adulten Organismus
Die Untersuchung der MMP-Expression in Geweben des adulten Organismus zeigte, daß sich
das Expressionsmuster der einzelnen MMPs zu dem im Embryo deutlich unterscheidet.
So konnten im Embryo keine Stromelysin 1 und 2 Transkripte nachgewiesen werden. Im adulten
Tier sind die beiden MMPs aber in einigen Geweben exprimiert (Tab.2). Für Stromelysin 2 kann
in den meisten der untersuchten Geweben eine geringe Transkriptmenge gefunden werden. Eine
höhere Expression findet man in Herz und Niere. Eine Stromelysin 1 Expression findet man nur
im Herz und in der Lunge. Dabei stimmt die Expression mit dem Expressionsmuster der 72 kD
Kollagenase IV überein. Die Funktion der Stromelysine in diesen Geweben ist nicht bekannt. Sie
könnten jedoch einerseits am Abbau von degradiertem Kollagen (Gelatin) beteiligt sein, das
entweder durch die Aktivität von Kollagenase IV oder Kollagenase I entsteht. Zum anderen
könnte ihnen auch eine Funktion bei der Aktivierung dieser beiden Enzyme zukommen, da die
Expression von Stromelysin 1 mit der 72 kD Kollagenase IV korreliert, und Stromelysin 2 in
den Geweben zu finden ist, in denen auch eine Expression der Kollagenase I nachweisbar ist.
Inwieweit die MMPs in den verschiedenen Geweben eine Aktivität ausüben ist von der lokalen
Präsenz der Inhibitoren der TIMP-Familie abhängig. Eine genaue Studie der TIMP-Expression
in adulten Geweben auf Einzelzellebene wurde bisher jedoch noch nicht durchgeführt (Tab.2).
Während die 72 kD Kollagenase IV im Embryo in vielen mesenchymalen Geweben exprimiert
wird, ist eine Expression im adulten Organismus nur noch im Herz und in der Lunge zu finden.
Dies sind Gewebe, die reich an Basalmembranen sind, welc;he sich hauptsächlich aus Kollagen
vom Typ IV zusammensetzen (Reponen et al., 1992). Im Gegensatz zum Embryo wird im
adulten Tier, außer im Knochen, eine hohe Kollagenase I Expression auch im Muskel und in der
Niere gefunden. Geringere Transkriptmengen konnten auch im Herz, der Milz und in der Lunge
nachgewiesen werden. Ihre Funktion in diesen Geweben ist noch unklar. Sie könnte jedoch am
Abbau von Typ 111 Kollagen beteiligt sein, das Bestandteil des Retikulinfasernetzes ist, das viele
81
innere Organe, wie z. B. die Milz oder die Blutgefaßwände umgibt und stützt (von der Mark,
1980, Martin et al., 1985). Auch im adulten Tier wird die Kollagenase I jedoch hauptsächlich im
Knochen exprimiert. Durch "in situ" Hybridisierung konnte ein starkes Signal in der
kalzifizierten Knorpelzone, die an den hypertrophen Knorpel angrenzt, gezeigt werden. In den
Osteoblasten, die entlang der Knochenoberfläche im Bereich des kompakten Knochens der
Diaphyse und auch im Grenzbereich Zur Wachstumszone hin liegen, findet man ebenfalls ein
starkes
Signal.
Die
Expression
der
Kollagenase
I
lokalisiert
dabei
mit
der
ß-
Galaktosidaseaktivität in c-jos-lacZ transgenen Mäusen, die ebenfalls im mineralisierten Knorpel
im Bereich der Wachstumsplatte und im Bereich der Knochenbälkchen beobachtet werden kann
(Smeyne et al., 1992). Da die Kollagenase I Expression sowohl im embryonalen, als auch im
adulten Knochengewebe in Osteoblasten beobachtet wird, die im Bereich des neugebildeten
Knochens entlang der Knochenbälkchen lokalisiert sind, könnte das Signal, neben dem direkten
Effekt von Cytokinen (PTH, Vitamin D 3 ), auch durch den Kontakt mit spezifischen
Komponenten der ECM induziert werden. Weiterhin findet man im adulten Knochen eine starke
Expression im Grenzbereich zwischen dem hypertrophen Knorpel und der Eröffnungszone zum
Knochen hin. Auch der vollständig ausdifferenzierte hypertrophe Knorpel könnte eine Rolle bei
der Signalgebung spielen. So konnte gezeigt werden, daß hypertrophe Chondrozyten hoch
differenzierte Zellen sind, die verschiedene Makromoleküle synthetisieren und sezernieren, die
direkt am Prozeß der Matrixmineralisierung, der Kapillareninvasion und der Bildung von
Knochen am kalzifizierten Knorpel involviert sein könnten (Cowell et al., 1987).
Auch im adulten Tier korreliert die Expression von Kollagenase I mit der Expression von
Komponenten des Transkriptionsfaktors AP-1. So ist die Kollagenase I in Geweben exprimiert,
in denen auch eine c-jun Expression nachgewiesen werden konnte (Lunge, Herz, Niere).
Dagegen findet man in Geweben, in denen c-jun nicht exprimiert ist, auch keine Expression der
MMP (Leber, Gehirn, Hoden; Ryder und Nathans, 1985; Hirai et al., 1989; Ryder et al., 1989).
Eine Expression der Komponente c-jos in adulten Geweben von Wildtyp Mäusen wurde bisher
noch nicht gezeigt; eine ß-Galaktosidase-Aktivität in c-jos-lacZ transgenen Mäusen findet man
jedoch in der Haut, im Knochen und in bestimmten Bereichen des Gehirns (Smeyne et al.,
1992). Weiterhin wurde eine Expression des endogenen c-jos in der Lunge, der Niere, im
Muskel, im Herz und im Knochen von H2-c-josL TR transgenen Mäusen nachgewiesen (Rüther
et al., 1989).
Die unterschiedliche Zusammensetzung der Extrazellulären Matrix verschiedener Gewebe und
die in dieser Arbeit gezeigte gewebespezifische Expression der vier MMPs deutet darauf hin,
daß jedes dieser Enzyme eine bestimmte Funktion beim Abbau der ECM erfüllt und somit diese
Enzyme "in vivo" unterschiedlich reguliert werden. Ein Grund für diese unterschiedliche
Regulation der MMPs könnte die unterschiedliche Expression der verschiedenen Mitglieder der
82
Transkriptionsfaktorfamilien Jun und Fos sein, die unabhängig voneinander in verschiedenen
Geweben reguliert werden (Hirai et al., 1989). Die Vielfalt derjun undjos Gene, und die damit
mögliche Bildung verschiedener Homo- und Heterodimere mit verschiedenen Bindungsaffinitäten
kreiert eine große Anzahl von AP-1 Isoformen, die auf die verschiedenen extrazellulären Signale
antworten können (Hirai et al., 1989). Der Grund für die fehlende Expression der Stromelysine
während der Embryonalentwicklung und auch in Geweben des adulten Tieres, in denen eine
Expression von AP-1 (Jun/Fos) nachgewiesen werden konnte, könnte auf gewebespezifische
Unterschiede in der Modifikation von AP-1 oder auf das Fehlen von zusätzlichen,
zelltypspezifischen Faktoren, die für die Expression der Stromelysin Expression notwendig sind,
zurückzuführen sein.
5.5 Expression von Kollagenase I in c-jos transgenenund c-jos 11 Null 11 Mäusen: Ist
Kollagenase I ein Markergen für cFos-abhängige pathologische Veränderungen im
Knochenmetabolismus?
Da die MMPs Kollagenase I, Stromelysin 1 und Stromelysin 2 in Zellkultur nach einer TPABehandlung koordiniert exprimiert werden, und auch im Gesamtorganismus in einigen Geweben
koexprimiert sind, war es natürlich interessant zu untersuchen, ob auch unter physiologischen
Bedingungen die Expression dieser MMPs vom Transkriptionsfaktor AP-1 reguliert wird, da in
allen drei Genen auch ein AP-1 Sequenzmotiv im Promoter gefunden wird (bei Stromelysin 2
nur
für
Ratte bekannt).
Mäuse bei denen die Expression von Komponenten des
Transkriptionsfaktors AP-1 verändert ist, bieten ein einmaliges System, um den Einfluß dieser
Veränderung auf die Expression der MMPs unter "in vivo" Bedingungen zu untersuchen.
Um die Auswirkung einer transient erhöhten c-jos Expression auf die Expression der
Kollagenase I zu untersuchen, wurden transgene Mäuse ausgewählt, bei denen eine exogene c-jos
Expression durch das Anschalten der endogenen Interferonsynthese induziert wird (Mx-c-josD
Transgene; Bachiller und Rüther, 1990). Trotz des hohen exogenen c-jos Levels in allen
untersuchten Geweben war eine erhöhte Kollagenase I Expression nur in der Milz, der Leber,
dem Thymus und hauptsächlich im Knochen zu beobachten. Die fehlende Kollagenase I
Expression in den anderen Geweben könnte mehrere Ursachen haben. Zum einen könnten in
diesen Geweben angemessene Mengen an Jun Proteinen fehlen, die für die Aktivierung von
Genen durch cFos notwendig sind. Die Messungen der jun Expression in Geweben von adulten
Mäusen sprechen jedoch dagegen (Ryder und Nathans, 1985; Hirai et al., 1989; Ryder et al.,
1989). Zum anderen könnten Komponenten, die für eine posttranslationale Modifikation der AP1 Komponenten notwendig sind, in den Zellen dieser Gewebe fehlen. Durch die Induktion des c-
jos Transgens wird zwar eine cFos Neusynthese induziert, die posttranslationale Modifikation
des Transkriptionsfaktors ist jedoch von der Umgebung der c-jos exprimierenden Zellen
83
abhängig, d. h. von der Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren, die zum Beispiel eine basale
Aktivierung der Proteinkinase C bewirken. Eine weitere Möglichkeit wäre, daß für die
Expression von Kollagenase I zusätzliche, gewebespezifische bzw. zelltypspezifische Proteine
(Aktivatoren oder Repressoren) notwendig sind, die an zusätzliche Bindungsstellen im Promoter
des
Gens
binden
und
somit
für
die
variable
Induzierbarkeit
durch
verschiedene
Wachstumsfaktoren verantwortlich sind.
Im Gegensatz zu Kollagenase I war kein Unterschied der Kollagenase IV Expression in den
Geweben von unbehandelten und behandelten Mx-cjosD transgenen Mäusen festzustellen. Dies
ist in Übereinstimmung mit der unter Zellkulturbedingungen beobachteten Expression von
Kollagenase IV, wo eine Behandlung mit TPA keinen Einfluß auf deren Expression hat. Die
dabei erhaltenen Ergebnisse stimmen mit den für die menschliche MMP beobachteten
Expressionsdaten überein und könnten, wie auch bei der menschlichen MMP, mit dem Fehlen
der AP-1 Stelle im Promoter des Gens erklärbar sein (Collier et al., 1988; Huthala et al., 1991).
Obwohl die Stromelysin 1 und Stromelysin 2 Expression in Zellkultur durch eine TPABehandlung induziert wird, und auch eine AP-1 Stelle im Promoter des Stromelysin 1 Gens
(Maus und Ratte) und des Stromelysin 2 Gens (Ratte) gefunden werden kann (J. Mudgett, pers.
Mitteilung; Breathnach et al., 1987), kann weder eine basale noch eine induzierte Expression
dieser beiden MMPs in den Geweben der cjos transgenen Mäuse nachgewiesen werden. Dies
könnte zum einen auf der Tatsache beruhen, daß eine Aktivierung der Proteinkinase C durch
TPA alleine nicht ausreichend ist für eine Stromelysin Expression, sondern noch zusätzliche
Faktoren dafür benötigt werden (Matrisian et al., 1986). Andererseits wurde beobachtet, daß die
Expression von Stromelysin 1 der Ratte über einen cjos abhängigen, als auch einen cjos
unabhängigen Signalweg induziert werden kann (Kerr et al., 1988). Weiterhin konnte gezeigt
werden, daß die AP-1 Stelle im Stromelysin 1 Promoter zwar für die basale Expression des
Gens, nicht aber für den Mechanismus der TPA-Antwort verantwortlich ist (Buttice et al.,
1991).
Interessanterweise zeigen transgene Mäuse, bei denen die exogene cjos Expression konstitutiv
erhöht ist, infolge dieser erhöhten cjos Expression phänotypische Veränderungen in der Milz,
dem Thymus und im Knochen, die je nach verwendetem Promoter 3 Wochen bis 9 Monate nach
Geburt auftreten (Rüther et al., 1987; 1988; 1989). Die phänotypischen Veränderungen dieser
Tiere stimmen dabei mit der Lokalisation einer erhöhten Kollagenase I Expression überein, die
infolge der transient erhöhten cjos Expression in den transgenen Mx-cjosD Mäusen auftritt
(Bachiller und Rüther, 1990). Da Knochen das primäre Gewebe der Kollagenase I Expression
darstellt, wurden Tiere ausgewählt, die infolge der erhöhten cjos Expression Knochenrumore
entwickeln. Interessanterweise findet man im veränderten Knochengewebe eine mehrere
hundertfach erhöhte Kollagenase I Expression (im Gegensatz zum normalen Knochengewebe in
84
Wildtyp Mäusen), während die Expression in nicht betroffenen Geweben, z. B. Niere und
Gehirn im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert ist. Auch die Expression der Kollagenase IV
ist im Tumorgewebe etwas erhöht; im Gegesatz zu Kollagenase I ist der Induktionslevel jedoch
weitaus geringer. Da eine TPA Behandlung die Kollagenase IV Expression in Zellkultur nicht
beeinflußt und auch in den Mx-cjosD transgenen Mäusen nach Induktion keine veränderte
Expression der MMP zu beobachten ist, scheint dies ein sekundärer Effekt der Tumorbildung zu
sein.
Durch transiente Transfektion von cjos antisense Konstrukten konnte gezeigt werden, daß cFos
absolut notwendig für die Expression der menschlichen Kollagenase I ist (Schönthal, et al.,
1988). Auch die in dieser Arbeit nachgewiesene veränderte Expression der Kollagenase I infolge
einer
veränderten
cjos
Expression
machen
deutlich,
daß
diese
Komponente
des
Transkriptionsfaktors AP-1 eine wichtige Rolle für die Expression dieser MMP spielt. Obwohl
mittlerweile eine ganze Reihe von Genen identifiziert wurden, die in Zellkultur durch cFos
reguliert werden, konnte das Kollagenase I Gen als erstes Beispiel identifiziert werden, für das
eine cjos abhängige Regulation auch unter physiologischen Bedingungen im Gesamtorganismus
zutrifft.
Um die Auswirkung einer Elimination des cjos Gens auf die Expression der Kollagenase I zu
untersuchen, standen Mäuse zur Verfügung, bei denen das cjos Gen durch homologe
Rekombination eliminiert wurde. Diese Tiere zeigen interessanterweise 2 bis 3 Wochen nach
Geburt in den gleichen Geweben phänotypische Veränderungen (Johnson et al., 1992; Wang et
al., 1992), wie die konstitutiv exprimierenden cjos transgenen Mäuse. Auch in diesen Tieren
scheint hauptsächlich das Knochengewebe betroffen zu sein. Dies zeigt, daß das cjos Gen und
damit auch ePos-abhängige Gene für die korrekte Ausbildung und Funktion dieser Gewebe
wichtig sind.
Da der Knochen in diesen Tieren das hauptsächlich betroffene Gewebe ist, wurde mittels "in
situ" Hybridisierung ·die Kollagenase I Expression in Embryonen (16.5), als auch im
Knochengewebe von neugeborenen und zwei Wochen alten Mäusen untersucht.
Die
Untersuchung zeigte, daß Kollagenase I exprimiert ist, dilß aber die Menge an Transkripten
vermindert zu sein scheint. Im Gegensatz zu den beobachteten phänotypischen Veränderungen ist
eine veränderte Kollagenase I Expression gegenüber dem Wildtyp schon am Tag 16.5 der
Entwicklung nachzuweisen. In diesen Embryonen kann man schon eine gering reduzierte
Expression von Kollagenase I gegenüber Wildtyp Embryonen beobachten. Im neugeborenen Tier
treten dann erstmals gut erkennbare Unterschiede in der Stärke und auch in der Verteilung des
Signals auf, die im weiteren Verlauf der Entwicklung massiv zunehmen. Die Unterschiede in der
Lokalisierung des Signals ist auf die unterschiedliche Verteilung der osteogenen Zellen in den c-
85
jos-defizienten Tieren gegenüber Wildtyp Mäusen zurückzuführen.· Den Mutanten fehlt im
Gegensatz zu den Wildtyp Mäusen eine Knochenmarkshöhle im Bereich der Diaphyse der
Röhrenknochen. Stattdessen ist dieser Bereich mit Knochen- und Knorpelbälkchen ausgefüllt und
ist kalzifiziert. Auch im Bereich der Wachstumsplatte findet man starke Veränderungen. Die
Zone der proliferierenden Chondrozyten ist stark reduziert, die Längssäulen sind sehr
unregelmäßig und die Zone der hypertrophen Chondrozyten ist verbreitert (Johnson et al., 1992;
Wang et al., 1992; Abb.21).
Die in der vorliegenden Arbeit aufgezeigten Evidenzen für eine Funktion von Kollagenase I in
der Entstehung des Knochenskeletts (durch den Abbau der Knorpelkomponente Kollagen II) und
ihre eventuelle Funktion bei der Entstehung der Knochenmarkshöhle im Bereich der Diaphyse
(durch den Abbau von Kollagen I) läßt vermuten, daß eine Reduktion ihrer Expression, schon
vor dem Auftreten der phänotypischen Veränderungen, bei der Entstehung des Phänotyps in den
cjos-negativen Mäusen eine Rolle spielen könnte.
Auch in kultivierten primären Fibroblasten, die aus den cjos-defizienten Mäusen isoliert
wurden, ist die Kollagenase I Expression signifikant reduziert. Durch Behandlung mit TPA kann
eine Kollagenase Induktion beobachtet werden, aber die Transkriptmenge liegt selbst nach
Induktion der Expression noch unter dem basalen Level von primären Fibroblasten aus Wildtyp
Mäusen. Die Expression der MMPs Stromelysin 1, Stromelysin 2 und der 72 kD Kollagenase IV
dagegen wird durch das Fehlen von cFos nicht beinflußt (Bernd Baumann, persönliche
Mitteilung).
Für die noch vorhandene, wenn auch reduzierte Expression von Kollagenase I in den isolierten
cjos-negativen Fibroblasten, als auch im Organismus könnte eine Substitution des cFos Proteins
durch ein verwandtes Protein, z. B. Fra-1, Fra-2 oder FosB, verantwortlich sein. Die Expression
dieser Gene wird in ähnlicher Weise reguliert wie das cjos Gen und ihre Genprodukte können
genauso wie das cFos Protein mit den verschiedenen Proteinen der Jun-Familie Komplexe bilden
(Cohen et al., 1989; Matsui et al., 1990). Der Grund für die geringere Expression von
Kollagenase I in den cjos-negativen Zellen und in den Geweben der c:fos-defizienten Tiere
könnte jedoch sein, daß die gebildeten Jun/FosB oder Jun/Fra-1 Heterodimere, im Vergleich zu
cJun/cFos, geringere Bindungsaffinitäten an die AP-1 Bindungsstelle des Kollagenase Promoters
oder eine geringere Transaktivierungsaktivität besitzen. "In vitro" gibt es, aufgrund der
unterschiedlichen Stabilität der verschiedenen Komplexe, klare Unterschiede in der Affinität
verschiedener Jun/Jun Homo- und Jun/Fos Heterodimere an die AP-1 Stelle (Ryseck und Bravo,
1991). Somit könnte auch "in vivo" eine andere Kombination des AP-1 Komplexes die
Kollagenase I Expression zwar induzieren, aber dies in einem weit geringeren Maße, als das
normalerweise verantwortliche Heterodimer aus Jun und cFos Proteinen.
86
Mitt~erweile
konnte das Gen, das für das Oberflächenprotein CD44 kodiert, in Zellkultur als
weiteres AP-1 abhängiges Gen identifiziert werden (Hofmann et al., 1993). Dieses Gen scheint
ebenfalls eine wichtige Funktion beim Prozeß der Knochenbildung auszuüben. CD44 wird an der
Oberfläche von Osteoprogenitorzellen exprimiert, die spezifisch die Hyaluronsäure im
hypertrophen Knorpel im Bereich der Eröffnungszone entfernen. Der Abbau der Hyaluronsäure
kann mit Antikörpern gegen CD44 gehemmt werden (Pavasant et al., 1994). Eine Funktion der
von Chondrozyten synthetisierten und sezernierten Makromoleküle beim Prozeß
der
Knochenentwicklung wurde postuliert (Cowell et al., 1987). So könnte das Vorhandensein und
die Entfernung der Hyaluronsäure in der Eröffnungszone eine wichtige biologische Funktion
haben. Zum Beispiel könnte Hyaluronsäure als Substrat dienen, das die Wanderung von
Osteoprogenitorzellen in diese Region dirigiert. Eine weitere Möglichkeit wäre, daß Fragmente
der Hyaluronsäure, die durch den Abbauprozeß produziert werden, die Einwanderung von
Blutgefäßen stimuliert (Pavasant et al., 1994).
Die in dieser Arbeit gefundene Pos-abhängige, gewebespezifische Expression von Kollagenase I
deutet auf eine wichtige Funktion dieser MMP in der Knochenhomöostase hin. Die kausale
Funktion der Kollagenase I in der Entstehung und der Aufrechterhaltung des veränderten
Phänotyps in den cjos transgenen Mäusen und in den cjos negativen Mutanten muß noch
demonstriert werden. Durch Inaktivierung des Kollagenase I Gens kann überprüft werden, ob
diese "Knock out" Tiere den gleichen Phänotyp, wie die cjos-defizienten Mäuse zeigen. Die
Klonierung der mausspezifischen Probe ermöglichte die Isolierung des genemischen Klons, was
jetzt als Ausgangspunkt zur Herstellung dieser Tiere ("Knock out") dient. Die Kreuzung der cjos-negativen Mäuse mit Tieren, die Kollagenase ektopisch · exprimieren ("Transgene") könnte
Aufschluß darüber geben, ob der pathologische Phänotyp dadurch aufgehoben werden kann
("Rescue").
Kollagenase I könnte dennoch, unabhängig von der Funktion anderer Gene, als Markergen für
pathologische Veränderungen des Knochengewebes dienen.
Die Ergebnisse dieser experimentellen Ansätze, als auch weitergehende Untersuchungen zur
Funktion und Regulation der anderen MMPs, werden zusätzliche Erkenntnisse zur Aufklärung
des komplizierten Netzwerkes des ECM Metabolismus unter physiologischen Bedingungen, und
auch bei pathologischen Prozessen liefern.
87
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