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Aus der Klinischen Forschergruppe für Rheumatologie, Freiburg i. Br. Interaktionen von HLA-DR-Molekülen mit Chaperonen der HSP70-Familie und deren Bedeutung für das Prozessieren und Präsentieren von Autoantigenen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Fakultät für Chemie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt von Sabine Roth geb. in Offenburg Januar 2001 Die Arbeit wurde in der Klinischen Forschergruppe für Rheumatologie des Klinikums der Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg i. Br. sowie in der Neurosciences Group, Institute of Molecular Medicine, John Radcliffe Hospital, Oxford, UK im Zeitraum Dezember 1997 bis Januar 2001 durchgeführt. Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. G. E. Schulz Referent: Prof. Dr. D. Jahn Koreferent: Prof. Dr. H.-H. Peter Tag der Verkündigung des Prüfungsergebnisses: 15. Februar 2001 Inhaltsverzeichnis Abkürzungen Glossar 1 3 1 Einleitung 1.1 Rheumatoide Arthritis 1.2 Struktur, Polymorphismus und Funktion der MHC-Moleküle 1.3 Antigenprozessierung und Antigenpräsentation 1.4 Chaperone der HSP70-Familie 1.5 Ausgangspunkt und Ziel der Arbeit 4 4 6 8 10 12 2 Materialien 2.1 Geräte und Arbeitsmaterialien 2.2 Chemikalien, Kits und Antikörper 2.3 Zellen 2.4 Antigene 2.5 Puffer, Nährmedien und Lösungen 16 16 18 20 20 21 3 Methoden 3.1 Zellbiologische Methoden 26 26 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 3.1.9 Isolierung von mononucleären Zellen aus dem peripheren Blut Bestimmung von Zellzahl und Zellvitalität Waschen von Zellen Magnetische Zellseparation Zellkultivierung Vorbehandlung von Stimulatorzellen mit Peptid p144-163 Stimulation des Acetylcholin-Rezeptor-spezifischen Klons PM-A C3 Messung des 3H-Thymidineinbaus von Zellen Ernten radioaktiv markierter Zellen 3.2 Proteinchemische Methoden 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 Markierung von DnaK-Mutanten mit einem Fluoreszenzfarbstoff Gelpermeationschromatographie Affinitätschromatographie Ultrafiltration 3.3 Proteincharakterisierung 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.3.6 Spektroskopische Bestimmung der Proteinkonzentration Bestimmung der Proteinkonzentration mittels BCA-Methode Bestimmung des Markierungsgrades eines fluoreszenzmarkierten Proteins Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese Elektrophoretischer Transfer von Proteinen Western-Blotting 3.4 Immunpräzipitation 3.4.1 3.4.2 Herstellung einer Antikörper-Sepharose Präzipitation von Antigen bzw. Protein 3.5 Durchführung von Fluoreszenztests 3.5.1 3.5.2 3.5.3 Fluoreszenz-aktivierter Zell-Sorter (FACS) FACS-Analyse von Zellen Fluoreszenztest auf einem Objektträger 3.6 Enzymgebundener Immunoassay (ELISA) 4 Ergebnisse 4.1 DRB1*0401 und DRB1*0408: Unterschiede in der Präsentation eines Autoantigens 4.1.1 Die Beobachtungen von Nicolle et al. (1995) 26 26 26 27 28 28 29 30 30 31 31 31 32 33 34 34 34 35 35 36 37 37 38 38 39 39 40 41 42 44 44 44 II 4.1.2 4.1.3 4.1.4 Vergleichbarkeit der Stimulierbarkeit des Klons PM-A C3 durch humane oder murine Zellen, die das Antigen auf demselben DR-Molekül präsentieren Antigenpräsentation von r1-437 durch TP0401 und TP0408: Deutliche quantitative Unterschiede in der T-Zellantwort Antigenpräsentation von r3-181 durch TP0401 und TP0408 4.2 Kontrollversuche zur unterschiedlichen Prozessierung bzw. Präsentation von Polypeptid r1-437 durch TP-Zellen 4.2.1 4.2.2 4.2.3 Antigenbindungsstudien an TP-Zellen Expression von HLA-DR-Molekülen auf der Oberfläche von TP-Zellen Wachstumskinetik von TP-Zellen 46 48 50 51 52 53 54 4.3 Interaktionspartner der HLA-DR-Moleküle 57 4.4 Zusammenfassung I 61 4.5 Biochemische Untersuchungen zur Prozessierung der AChR-Kette 62 4.5.1 4.5.2 4.5.3 Analyse der rekombinanten Antigenpräparationen Depletion von DnaK aus der Präparation r1-437 Antigenpräsentation von DnaK-freien Polypeptiden r3-181 und r1-437 durch humane oder murine Zellen, die das Antigen auf demselben DR-Molekül präsentieren 4.6 Einfluß von DnaK auf die Prozessierung/Präsentation von r1-437 4.6.1 4.6.2 4.7 65 66 Depletionsversuche Rekonstitutionsversuche durch Zugabe von DnaK 66 67 Zusammenfassung II 69 4.8 Zellbiologische Untersuchungen zu Wechselwirkungen von DnaK mit HLA-DRB1*0401-Molekülen 4.8.1 4.8.2 4.8.3 62 64 Markierung von DnaK-Mutanten mit einem Fluoreszenzfarbstoff Bindung von fluoreszenzmarkiertem DnaK an Oberflächen Bindung von fluoreszenzmarkiertem DnaK an TP-Zellen 71 71 72 74 4.9 Zusammenfassung III 75 4.10 Hinweise auf eine Interaktion von HSC70 mit HLA-DR-Molekülen bei der Antigenprozessierung und –präsentation von humanen Antigenen 76 5 Diskussion 5.1 TP0401 und TP0408: Unterschiedliche Prozessierung von r1-437 beruht auf dem Unterschied einer einzelnen Aminosäure 78 78 5.2 Unterschiede in der Antigenbindung von TP0401 und TP0408 5.3 Die Effizienz des Prozessierens und Präsentierens hängt von der Präsenz eines HSP70-Moleküls ab. Dieser Effekt ist besonders deutlich mit Antigenpräsentierenden Zellen aus dem peripheren Blut des Menschen zu erkennen 80 5.4 Humane T-Zellklone 85 5.5 Assoziation zwischen bestimmten HLA-Haplotypen und Autoimmunkrankheiten 86 84 6 Zusammenfassung 89 7 Literatur 90 Publikationsliste Danksagung 1 Abkürzungen AChR AK AP APS APZ B-Zelle BCA Bio BiP BSA β-ME CIITA CLIP CNBr cpm DMF D. melanogaster E.coli EBV EDTA ER FACS FCS FITC GPC Grp Gy H. sapiens HEPES HLA HRPO HS HSP HSP40 HSP70 5-IAF IFN-γ MIIC Acetylcholin-Rezeptor Antikörper Alkalische Phosphatase Ammoniumperoxodisulfat antigenpräsentierende Zelle bone-marrow derived (vom Knochenmark stammende) Zelle Bicinchoninsäure Biotin Ig heavy chain binding protein (Protein, das an die schwere Kette von Immunglobulin bindet) Rinderserumalbumin 2-Mercaptoethanol MHC-II-Transaktivator class-II-associated invariant-chain peptide (Klasse-II-assoziiertes Peptid der Invarianten Kette) Cyanbromid counts per minute (gemessene Impulse pro Minute) Dimethylformamid Drosophila melanogaster Escherichia coli Epstein-Barr-Virus Ethylendiamintetraacetat Endoplasmatisches Retikulum fluorescence activated cell sorter (Fluoreszenz-aktivierter Zellsorter) fetal calf serum (fötales Kälberserum) Fluoresceinisothiocyanat Gelpermeationschromatographie Glucose-reguliertes Protein Gray (1 Gy = 1 rad) Homo sapiens N-(2-hydroxyethyl)-piperazin-N’-2-ethansulfonsäure humanes Leukozytenantigen (Haupthistokompatibilitätskomplex des Menschen) horse radish peroxidase (Meerrettichperoxidase) Humanserum Hitzeschockprotein Hitzeschockprotein der 40 kDa-Familie Hitzeschockprotein der 70 kDa-Familie 5-Iodacetamidfluorescein Interferon-γ MHC-Klasse-II-Kompartimente 2 MHC MP-H2O MTP MW OD PAGE PBMC PBS PNPP RA RPMI-VM RT SA SD SDS T-Zelle TAP TEMED TNF-α TP-Zelle Tris Vt v/v w/v major histocompatibility complex (Haupthistokompatiblilitätskomplex) MilliQ-Wasser Mikrotiterplatte arithmetischer Mittelwert gemessene optische Dichte Polyacrylamid-Gelelektrophorese peripheral blood mononuclear cells (mononucleäre Zellen des peripheren Blutes) Phosphat-gepufferte Saline para- Nitrophenylphosphat Rheumatoide Arthritis RPMI-Vollmedium Raumtemperatur Streptavidin Standardabweichung Natriumdodecylsulfat thymus-dependent (vom Thymus abhängige) Zelle Transporter, der mit Antigenprozessierung assoziiert ist N,N,N’,N’-Tetramethylendiamin Tumornekrosefaktor-α Transfektante von P388.D1, die mit HLA-DR-Molekülen transfiziert wurde Tris(hydroxymethyl)aminomethan Säulenvolumen volume per volume weight per volume Nicht aufgeführt sind solche Abkürzungen, die im European Journal of Biochemistry ohne Definition verwendet werden dürfen (Information for Authors (2000). Eur. J. Biochem.) 3 Erläuterung der verwendeten englischen Begriffe ATCC American typed culture collection Einrichtung in den USA zur Sammlung und Weitergabe von definierten Zellen und Zellinien) bead Kügelchen, dessen Mantel aus einem Dextrangerüst aufgebaut ist. Magnetische beads enthalten zusätzlich einen Eisenkern blotting Transfer von DNA bzw. Protein aus Gelen auf eine Trägermembran bluecap 50 mL-Röhrchen der Firma Greiner CD Cluster of differentiation die „CD-Nomenklatur“ ist ein international anerkanntes System zur Bezeichnung von Zelloberflächenmolekülen, die von monoklonalen Antikörpern erkannt werden ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Nachweis eines bestimmten Epitops durch ein EnzymAntikörperkonjugat shared epitope gemeinsames Epitop; Aminosäuresequenz QKRAA, die einen krankheitsbestimmenden Faktor bei der Rheumatoiden Arthritis darstellt 4 1 Einleitung Das Immunsystem der Vertebraten ist ein leistungsfähiges Verbundsystem von Zellen und Molekülen. Seine Aufgabe ist es, Wirbeltiere vor Mikroorganismen zu schützen – vor Viren, Bakterien und Parasiten. Es überprüft ständig unzählige molekulare Einheiten, um zu entscheiden, welche davon fremd sind, um dann deren Abbau einzuleiten. Seine Kennzeichen sind Spezifität, Anpassung und Gedächtnis. Das Immunsystem benutzt zwei verschiedene, jedoch miteinander kommunizierende Wege. Das Erkennungssystem der humoralen Immunantwort besteht aus löslichen Proteinen, den Antikörpern, die von Plasmazellen produziert werden. T-Zellen sind die Träger der zellulären Immunantwort. Diese nehmen unterschiedliche Funktionen während einer Immunantwort wahr. Beispielsweise haben sie regulatorische Funktionen bei der Entstehung einer Immunantwort, indem sie helfend oder supprimierend einwirken. Die Hilfe bei der Entstehung einer Immunantwort erstreckt sich auch auf die Antikörperproduktion. (Übersicht bei Janeway & Travers, 1997). Durch ihre Unterstützung der B-Zellen, den Vorläufern der Plasmazellen, stimulieren die T-Zellen zudem die humorale Immunantwort. Alle biologischen Makromoleküle sind antigen wirksam. Damit es nicht zur Selbstzerstörung kommt, muß das Immunsystem eines Tieres sowie das des Menschen also äußerst genau zwischen „Selbst-“ und „Fremd-“Antigen unterscheiden. Ein Bruch der Toleranz, das heißt eine Reaktion des Immunsystems gegen das „Selbst“, führt zur sogenannten Autoimmunität und unter bestimmten Voraussetzungen zur Zerstörung körpereigener Strukturen. 1.1 Rheumatoide Arthritis Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische, entzündliche Multisystemerkrankung des Menschen, die sich hauptsächlich an den Gelenken manifestiert. Ein charakteristisches Merkmal für den ablaufenden, chronischen Entzündungsprozeß ist die Infiltration der Synovialmembran und der Synovialflüssigkeit durch mononucleäre Zellen, begleitet von einer villösen Hyperplasie der synovialen Gelenkauskleidung mit einer verbreiterten synovialen Deckzellschicht, dem sogenannten Pannus. In den betroffenen Gelenken treten unter anderem aktivierte T-Zellen auf, die für diesen Zustand charakteristische Oberflächenantigene wie Interleukin-2Rezeptor (IL-2R), MHC-Klasse-II (s. Kap. 1.2), Very late antigen 1 (VLA-1), Intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) und CD45 exprimieren (Potocnik et al., 1990; Smith und Roberts-Thompson, 1990). Dies wird als Hinweis auf die Beteiligung von T-Zellen bei der 5 Pathogenese der RA gewertet. Allerdings sind die Antigene, welche von diesen T-Zellen erkannt werden und welche zu einer Expansion bestimmter T-Zellpopulationen geführt haben könnten, nicht bekannt. Ein weiteres Argument für die Beteiligung von T-Zellen an der Pathogenese der RA ist die signifikante genetische Assoziation mit bestimmten MHC-Klasse-II-Allelen (Stastny, 1978). Bei Kaukasiern sind die DRB1-Allele *0401, *0404, *0408, *0101 und *1001, mit der RA assoziiert. Die Allele DRB1*0402 und DRB1*0403, die sich nur in nicht-konservativen Substitutionen in der dritten hypervariablen Region von den vorgenannten unterscheiden, sind dagegen nicht mit der RA assoziiert (Tab. 1; Übersicht bei Singal et al., 1999). Die dritte hypervariable Region liegt in der α-Helix, die von der β1-Domäne gebildet wird (s. Kap 1.2 ). Sie begrenzt die antigenbindende Grube der Klasse-II-Moleküle. Die polymorphen Aminosäuren der α-Helix könnten eine wichtige Rolle bei der Peptidbindung spielen (Dessen et al., 1997; Brown et al., 1993). Die RA-prädisponierenden Subtypen, der häufigste ist HLA-DRB1*0401, zeigen in der dritten hypervariablen Region eine auffallende Gemeinsamkeit: An den Positionen 70-74 befinden sich die Aminosäurensequenzen QKRAA, QRRAA oder RRRAA, die sich in ihren Eigenschaften kaum unterscheiden (Albani et al., 1992). Diese Beobachtung hat zu der Hypothese geführt, daß dieses „gemeinsame Epitop“ den eigentlichen krankheitsbestimmenden Faktor darstellt. Man spricht hier von der sogenannten "sharedepitope-Hypothese" (Gregersen et al., 1987). Die DRB1*04-, DRB1*01- und DRB1*10Familien gleichen sich im Bereich des shared epitopes: Sie zeigen aber einige Unterschiede in den Aminosäuresequenzen der konservierten Bereiche ihrer DR-β-Ketten, die den Boden der Peptidbindungsgrube der MHC-Klasse-II-Moleküle bilden (s. Kap. 1.2; Bodmer et al., 1999). HLA-DRB1-Allel Aminosäuresequenz (67-77) Assoziation zur RA *0401 *0404 *0408 *0101 *1001 LLEQKRAAVDT ----R---------R---------R--------RR------ ja ja ja ja ja *0402 *0403 I--DE---------R--E--- nein nein Tabelle 1. Unterschiede in den Aminosäuresequenzen der dritten hypervariablen Region von HLA-DR4-, DR1und -DR10-Genen. Striche stehen für identische Aminosäuren im Vergleich zum Allel DRB1*0401. Das shared epitope-Motiv ist bei HLA-DRB1*0401 fett gedruckt. 6 1.2 Struktur, Polymorphismus und Funktion der MHC-Moleküle MHC-Klasse-I- und Klasse-II-Moleküle sind Produkte von Genen des Haupthistokompatibilitätskomplexes MHC (major histocompatibility complex). Dieser Komplex liegt beim Menschen auf Chromosom 6. Viele Gene, die sich in diesem Komplex befinden, sind an unterschiedlichen Aspekten der Antigenprozessierung und –präsentation beteiligt. Neben den Klasse-I- und Klasse-II-Molekülen werden dort Cytokine, Komponenten des Komplementsystems, Chaperone, Proteasen und Peptidtransportproteine der ATP-Superfamilie codiert (Spies et al., 1991; Trowsdale et al., 1990 & 1991). Im folgenden wird nur auf die MHC-Klasse-II-Moleküle näher eingegangen. MHC-Klasse-II-Moleküle sind heterodimere Transmembran-Glykoproteine, die aus einer α-Kette von 33 kDa und einer β-Kette von 28 kDa zusammengesetzt sind. Jede dieser Ketten besteht aus zwei Domänen (α1 und α2; β1 und β2; Abb. 1 A), einer hydrophoben Domäne und einem kurzen, cytoplasmatischen Segment. A B Abbildung 1. (A) Ribbon-Diagramm der Kristallstruktur von HLA-DRB1*0401 im Komplex mit einem Peptid des Collagen-Typ II in der Bindungsgrube des HLA-Moleküls und dem Superantigen SEB. (B) Blick auf die Peptidbindungsgruppe von HLA-DRB1*0401 mit gebundenem Peptid des Collagen-Typ II (Aminosäuren 1168 – 1180). Peptidatome sind als Kugel-Stab-Modell dargestellt; Wasserstoffbrücken zwischen Peptid und HLA-DRB1*0401 sind gestrichelt eingezeichnet (B). (Dessen et al., 1998) 7 Die distale, äußere Domäne der β-Kette (β1) ist ca. 90 Aminosäuren lang und enthält eine Disulfidbrücke. Die äußere Domäne der α-Kette (α1) ist etwas kürzer und besitzt keine Disulfidbrücke. Der Zellmembran benachbart sind die proximalen Domänen (α2 und β2), die hochkonserviert sind. Der hohe Grad an allelem Polymorphismus findet sich hauptsächlich in den α1- und β1-Domänen (Robinson und Kindt, 1989). Die Bezeichnung Polymorphismus leitet sich ab von den griechischen Wörtern poly für „viele“ und morph für „Gestalt“. Hier bedeutet es die Varianten in einem einzelnen Genlocus und seinen Produkten innerhalb einer Spezies. Die individuellen Genvarianten nennt man Allele. Menschen haben drei Paare von α- und β-Ketten-Genen für die Klasse-II-Moleküle, die HLA-DR, -DP und DQ genannt werden. Innerhalb der HLA-DR-Region wurden zwei nichtpolymorphe DRA-Gene, die für die α-Kette codieren, und mehrere polymorphe DRB-Gene lokalisiert (Spies et al., 1985). Bis jetzt wurden über 321 DRB-Allele identifiziert (Übersicht bei Bodmer et al., 1999). Beim DR-Molekül wird der gesamte Polymorphismus durch die DRB-Gene codiert. Das zweite Exon der DRB-Gene, das für die erste extrazelluläre Domäne codiert, zeigt den höchsten Grad an Diversifikation innerhalb der MHC-Klasse-II-Sequenzen (Übersicht bei Marsh und Bodmer, 1991). Innerhalb der β1-Domäne lassen sich Abschnitte höherer Variabilität, die sogenannten hypervariable Regionen identifizieren. Sie sind im Bereich der Aminosäurepositionen 9-14, 25-38 und 67-74 lokalisiert (Schenning et al., 1984). Die beiden ersten hypervariablen Regionen liegen im Bereich der β-Faltblattstruktur des Bodens der Grube, während die dritte hypervariable Region einen Teil der α-Helix darstellt, die sich von Aminosäureposition 50 bis zum Ende der ersten Domäne (Aminosäureposition 86) erstreckt (Abb. 1). Die Lokalisation der hypervariablen Regionen im MHC-Molekül um die Antigenbindungstelle herum zeigt, daß sich hier die Kontaktbereiche zum antigenen Peptid befinden. MHC-Klasse-II-Moleküle werden hauptsächlich auf den „professionellen“ Anitgen- präsentierenden Zellen des Immunsystems wie B-Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen, epidermalen Langerhans’schen Zellen einschließlich des Thymusepithels. Die Klasse-IIMoleküle zeichnen sich durch eine hochkomplexe Regulation der Expression aus (Benoist und Mathis, 1990). Das Ausmaß der Expression wird bei vielen Zelltypen durch Interferon-γ (IFN-γ) und bei B-Zellen durch Interleukin-4 (IL-4) reguliert. Die Funktion der MHC-Klasse-II-Moleküle besteht darin, Peptide, die in den intrazellulären Vesikeln von B-Zellen, Makrophagen und anderen Antigenpräsentierenden Zellen entstehen, zu binden und an der Zelloberfläche zu präsentieren, wo sie dann von T-Zellen erkannt werden können. 8 Jedes MHC-Molekül kann mit einer großen Anzahl von antigenen Strukturen assoziieren. Allerdings können von einem MHC-Produkt nicht alle Peptide gebunden werden (Babbitt et al., 1985). Der hohe Grad an Diversifikation der MHC-Moleküle gewährleistet, daß eine Population als Ganzes gegen ein breites Spektrum von fremden Antigenen reaktionsfähig bleibt. 1.3 Antigenprozessierung und Antigenpräsentation Die Hauptkomponenten des spezifischen Immunsystems sind die Zellen und deren Produkte, die fremde Moleküle oder auch körpereigene Strukturen erkennen können. Die Zellen lassen sich in zwei Gruppen einteilen. Die erste Gruppe bilden die B-Zellen. Sie sind die Vorläufer der Antikörper-sezernierendenZellen und Träger der humoralen Immunantwort. Die zweite Gruppe besteht aus den T-Zellen als Träger der zellulären Immunantwort. T- und B-Zellen haben miteinander verwandte, aber auch verschiedene Rezeptoren. T-Zellen unterscheiden sich unter anderem von B-Zellen in der Art und Weise, in der sie ihr Antigen erkennen. Der B-Zellrezeptor, der eine membrangebundene Form der Immunglobuline darstellt, bindet spezifisch antigene Epitope auf löslichen Molekülen oder Oberflächen (Vitetta et al., 1971). Im Gegensatz dazu erkennen T-Zellen ihr Antigen nur, wenn es ihnen auf der Oberfläche anderer Zellen mit Hilfe bestimmter Strukturen präsentiert wird (Zinkernagel et al., 1974). Diese Zellen werden nach dieser Funktion Antigen-präsentierende Zellen (APZ) genannt. Die antigenpräsentierenden Strukturen sind MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Moleküle (s. Kap. 1.2). Die MHC-Moleküle binden allerdings lineare, darunter auch solche, die in der nativen Struktur von Antigenen verborgen sind. Die Antigenprozessierung ist daher der essentielle erste Schritt, welcher Antigene so modifiziert, daß sie an MHC-Moleküle gebunden werden. Das Prozessieren bestimmt daher nicht nur, ob ein Antigen eine T-Zellantwort induzieren kann, sondern auch welche molekularen Strukturen genau erkannt werden können. Zwei intrazelluläre Wege der Antigenprozessierung sind, wie in Abbildung 2 dargestellt, bekannt (Übersicht bei Pieters, 1997; Weenik und Gautam, 1997). Während des endogenen Weges (Abb. 2 (a)) wird ein Antigen in der APZ synthetisiert, beispielsweise ein von einem Virus codiertes Protein, mittels Proteasom prozessiert und nach Transport durch das TAP-Molekül (TAP: Transporter, der mit Antigenprozessierung assoziiert 9 ist) in das Endoplasmatische Retikulum vorwiegend im Kontext mit Klasse-I-Molekülen auf der Oberfläche exprimiert. Peptide, die an MHC-Klasse-I-Moleküle gebunden werden können, sind meist 8 oder 9 Aminosäuren lang (Rötzschke und Falk, 1991). Beim exogenen Weg (Abb. 2 (b)) wird ein Antigen von der APZ durch verschiedene Mechanismen wie Phagozytose, Endozytose oder Internalisierung von zelleigenen Membranen aufgenommen und in lysosomalen oder endosomalen Vesikeln in kleinere Fragmente zerlegt. MHC-Klasse-II-Moleküle bilden im Endoplasmatischen Retikulum mit der Invarianten Kette stabile nonamere Komplexe, die durch den trans-Golgi-Apparat in die MHC-Klasse-IIKompartimente (MIIC) des endozytotischen Prozessierungsweges transportiert werden. Dort wird die mit den Klasse-II-Molekülen assoziierte Invariante Kette durch Proteasen degradiert, so daß nur das resultierende CLIP-Peptid in der Bindungsgrube der MHC-Produkte bestehen bleibt (Abb. 2(c)). CLIP kann dann anschließend durch antigene Peptide ausgetauscht werden. Dieser Austauschprozeß wird durch HLA-DM katalysiert. Antigen-beladene MHC-Klasse-IIKomplexe werden anschließend an die Plasmamembran transportiert, wo sie die Peptidfragmente präsentieren, die von T-Zellen erkannt werden können (Abb. 2(d)). Peptide, die an MHC-Klasse-II-Moleküle binden sind 13 bis 17 Aminosäuren lang (Rudensky et al., 1991). Abbildung 2. Intrazelluläre Wege von MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Molekülen. (aus Pieters, 1997) 10 1.4 Chaperone der HSP70-Familie Chaperone sind hochkonservierte, weitverbreitete Proteine. Den Namen Hitzeschockprotein (HSP) bekamen die Chaperone durch Beobachtungen, die zeigten, daß die Synthese der HSP meist durch Streß in der Umgebung, z.B. Hitze, induziert wird. Mittlerweile ist bekannt, daß auch andere Formen von zellulärem Streß, z.B. Stoffwechselgifte, mechanische Belastung oder Ischämie, ihre Transkription und Translation induzieren können. Gemäß ihrer Funktion als Helfer bei der Proteinfaltung werden sie auch als molekulare Chaperone bezeichnet (Pahl et al., 1997). Diese Streßproteine, die auch in der "ungestressten" Zelle vorhanden sind, haben mehrere Aufgaben: Sie agieren als "Chaperone", d.h. als Wächter verhindern sie die unspezifische Aggregation von Proteinen und unterstützen deren Faltung bzw. Rückfaltung. Sie besitzen die bemerkenswerte Fähigkeit, spezifisch nicht-native Proteinstrukturen zu erkennen und Komplexe mit partiell gefalteten Proteinen zu bilden. Zusätzlich scheinen Chaperone für die konformationelle Regulation einer Anzahl von Schlüsselproteinen in der Zelle wichtig zu sein. Außerdem sind Chaperone an der Translokation von Proteinen über Membranen sowie am Proteinabbau beteiligt, und sie fungieren als Regulatoren der Zellproliferation. Bei eukaryotischen Organismen sind sie im Zytosol und in Zellorganellen wie Endoplasmatisches Retikulum und Mitochondrien lokalisiert (Hartl, 1996). Im folgenden wird nur auf die HSP70- und J-Protein-Familien näher eingegangen. Für diese Arbeit sind HSP70-Proteine des Menschen und der Maus von Bedeutung. HSP70Proteine sind eine ubiquitär vorkommende Klasse von molekularen Chaperonen. Es handelt sich dabei um Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 70 kDa. Obwohl die einzelnen HSP70 Proteine unterschiedliche Funktionen ausüben, kann man sie dennoch alle in drei Domänen einteilen. Die hochkonservierte 44 kDa N-terminale Domäne von HSP70 hat eine schwache intrinsische ATPase-Aktivität im nativen Protein, während die isolierte ATPaseDomäne eine wesentlich höhere ATPase-Aktivität zeigt. Die weniger konservierte C-terminale Region unterteilt sich in eine 18 kDa und eine 10 kDa Domäne. Während die erstere für die Bindung von ungefalteten Proteinen und kurzen Peptiden verantwortlich zu sein scheint, ist über die Funktion der 10 kDa Domäne wenig bekannt. Im Menschen sind derzeit 11 funktionelle Gene für HSP70-Moleküle bekannt, wovon sich drei Gene im HLA-Komplex auf Chromosom 6 befinden. Das Gen für das konstitutive HSP70, welches mit HSP73 oder HSC70 bezeichnet wird, wurde auf Chromosom 11 lokalisiert (Tavaria et al., 1995). 11 HSC70 kommt im Cytoplasma und im Nukleus vor. Chappell et al. (1986) zeigten, daß HSC70 an der Auflösung der Clathrinstrukturen von endozytotischen Vesikeln beteiligt ist. Für diese Arbeit ist ein weiterer Aspekt der Funktionen von HSC70 von Bedeutung. Verschiedene Arbeitsgruppen beschrieben eine Beteiligung von HSC70 sowie auch anderer HSP70Molekülen bei der Antigenprozessierung (Srivastava et al., 1994; DeNagel und Pierce, 1992). Da erste Untersuchungen an DnaK, einem HSP70-Molekül aus E. coli, durchgeführt worden sind, werden die Modelle zur Interaktion der HSP70-Proteine mit anderen Molekülen wie HSP40-Proteine anhand des DnaK/DnaJ-Systems erläutert. Das Bindungsmotiv des DnaK besteht aus vier bis fünf hydrophoben Aminosäuren. Diese werden rechts und links von jeweils vier Aminosäuren mit hohem basischen Anteil flankiert (Rüdiger et. al, 1997a & b); negativ geladene Aminosäuren kommen in dieser Konsensussequenz nicht vor. Entsprechende Sequenzen traten in den untersuchten Proteinen durchschnittlich alle 36 Aminosäuren auf. Das DnaK bindet an die Seitenketten dieser Aminosäuren sowie an das Peptidrückgrat. Da solche Strukturen in nativen Proteinen in der Regel nicht zugänglich sind, ist es offensichtlich, daß DnaK eine Vielzahl denaturierter Proteine erkennen kann. Die Bindungsspezifitäten von HSC70 und BiP (HSP70-Protein im ER) bei Säugern sind ebenfalls gut untersucht. Peptide mit folgenden Eigenschaften werden mit der höchsten Affinität gebunden: Sie enthalten mindestens sieben Aminosäuren mit großen hydrophoben und basischen Seitenketten. Saure Aminosäuren kommen dagegen nicht oder nur selten vor (Hightower & Leung, 1998). Die Gemeinsamkeiten mit DnaK lassen vermuten, daß die Hydrophobizität und die Neigung zu positiver Ladung typische Eigenschaften für Substrate der HSP70-Proteine sind. DnaJ wird als Prototyp der J-Proteine betrachtet. Mitglieder dieser Familie werden durch ihre Homologie zur J-Domäne von DnaJ aus E. coli definiert. DnaJ (40 kDa) bildet zusammen mit DnaK (70 kDa) eine Funktionseinheit, die die Faltung anderer Proteine positiv beeinflußt. Während es in Bakterien nur eine begrenzte Anzahl von Mitgliedern der HSP70- bzw. J-Proteine gibt, steigt die Anzahl von Genen beider Familien in höheren Organismen stark an. Vermutlich spiegelt sich darin eine zunehmende Spezialisierung dieser Proteine wider (Pahl et al., 1997). Über J-Proteine in Säugern ist noch relativ wenig bekannt. 12 Abbildung 3. DnaK/DnaJ-Reaktionszyklus (aus Beissinger & Buchner, 1998). Die Interaktion zwischen HSP70- und J-Proteinen soll am Modell des DnaK/DnaJ-Systems erläutert werden (Abb. 3). Es gibt verschiedene Theorien über den Mechanismus; hier wird die von Hartl (1996) aufgegriffen. Es wird angenommen, daß DnaJ (J) zuerst mit dem ungefalteten Protein (U) interagiert, also eine Art Schlepperfunktion für das DnaK ausübt. Der DnaK-ATPKomplex bindet an den DnaJ-Protein-Komplex. DnaJ stimuliert daraufhin die ATPaseAktivität des DnaK. Durch Hydrolyse von ATP zu ADP wird Energie freigesetzt, die für eine festere Bindung des Proteins an DnaK verwendet wird. Der Nukleotidaustauschfaktor GrpE fördert die Freisetzung von ADP. Daraufhin kann ATP die freigewordene Bindungstasche des DnaK besetzen, was zur Substratfreisetzung und zum Zyklusende führt. Es ist noch unklar, in welcher Phase das DnaJ den Chaperonkomplex verläßt. Das freigesetzte Protein kann jetzt entweder durch Eigenfaltung in die native Form übergehen (N) oder erneut in den Zyklus einsteigen. 1.5 Ausgangspunkt und Ziel der Arbeit Auf Grund der bekannten genetischen Assoziation von RA mit bestimmten Allelen von MHC-DRB1-Genen des HLA-Komplexes (s. Kap. 1.1) kann angenommen werden, daß die Bindung von noch unbekannten (Auto-)Antigenen an diese DR Moleküle, bzw. das 13 Prozessieren und Präsentieren in den entsprechenden Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) eine wichtige Voraussetzung für die nachfolgende T-Zell-Reaktivität darstellen. Um die Funktion einzelner dieser Allele zu vergleichen, wurden in der Arbeitsgruppe von I. Melchers eine Reihe von Transfektanten hergestellt. Eine Maus-Makrophagen-Linie (P388.D1) wurde mit dem humanen DRA1 Gen und verschiedenen, teilweise durch gezielte Mutagenese hergestellten DRB1-Allelen transfiziert (Daubenberger et al., 1996). Diese Zellen (TP0401 etc.) sind in der Lage, Antigen-spezifisch entsprechend restringierte humane T-Zell-Klone zu aktivieren. Die kooperierende Gruppe von A. Vincent und N. Willcox, Oxford, UK hat aus einer Patientin mit Myasthenia gravis den T-Zell-Klon PM-A C3 etabliert, der ein Epitop der α-Kette des humanen Acetylcholin-Rezeptors (AChR) im Kontext mit RA-assoziierten HLA-DR4Subtypen erkennt (Ong et al., 1991). In einer weiteren Arbeit zeigte die Gruppe aus Oxford, daß die komplette AChR α-Kette (r1-437) von antigenpräsentierenden Zellen aus dem peripheren Blut des Menschen mit DRB1*0401 gut präsentiert wird, nicht aber von APZ mit DRB1*0408, obwohl kurze Peptide (p138-167) von beiden Allelen gleich gut präsentiert werden können (Nicolle et al., 1995). Da die Peptidbindungstaschen von DRB1*0401 und -*0408 sich nur in einer Aminosäure unterscheiden (Lys71 bzw. Arg71), kann angenommen werden, daß dieser Unterschied für das Prozessieren des kompletten Antigens wichtig ist. Das Prozessieren eines Antigens ist ein komplexer Vorgang, an dem mehrere Komponenten beteiligt sind. Proteine werden in Lysosomen durch Proteasen abgebaut; hierbei entstandene Peptide gelangen in die Peptidbindungstaschen der MHC-II-Moleküle und mit diesen an die Zelloberfläche. MHC-II-Moleküle bilden Komplexe mit der Invarianten Kette, die an der Translokation der Klasse-II-Moleküle in MHC-Klasse-II-Kompartimente (MIIC) beteiligt ist und die Peptid-Bindungstasche vor vorzeitiger Beladung schützt (Kap. 1.3). Durch Proteasen wird ein Teil der Invarianten Kette in diesem Kompartiment abgespalten, so daß nur noch das sogenannte CLIP-Peptid in der Bindungsgrube der MHC-Moleküle verbleibt, welches erst später durch Antigen-Peptide ersetzt wird. An diesem Austausch sind noch weitere Moleküle wie HLA-DM beteiligt. HLA-DM ist strukturell mit Klasse-II-Molekülen verwandt. Eine Beteiligung von HSP70-Proteinen bei der Antigenprozessierung wird für MHC-Klasse-Iund Klasse-II-Moleküle diskutiert (MHC-I: Srivastava et al., 1994; MHC-II: DeNagel und Pierce, 1992). HSP70-Moleküle sind zum einen mitverantwortlich für den Transport von prozessierten Proteinfragmenten zu den entsprechenden MHC-Molekülen und deren anschlie- 14 ßende Beladung, zum anderen wird angenommen, daß HSP70-Proteine auch beim Transport von MHC-Peptid-Komplexen an die Zelloberfläche eine wichtige Rolle spielen können. HSP70-Moleküle sind in dieser Arbeit von besonderer Bedeutung, da das in E. coli beschriebene DnaK-Molekül an die shared epitope-Sequenz bindet. Von Auger et al. (1996 & 1997) wurde beschrieben, daß Peptide aus DR-Molekülen, die QKRAA oder RRRAA enthalten, an ein humanes HSP70-Protein binden. Sie konnten auch zeigen, daß HSP70-Moleküle mit DRβ-Ketten einer EBV-transformierten B-Zell-Linie des Genotyps DRB1*0401 copräzipitieren. Darüberhinaus postulierte diese Gruppe, daß HSP70-gebundende DRβ-Ketten schneller und effektiver in Lysosomen gelangen können als solche, die nicht mit HSP70-Molekülen assoziiert sind. Neuere Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von I. Melchers zeigten, daß ein humanes Homolog eines J-Proteins, welches als ein Tumorsuppressor-Gen in Drosophila entdeckt wurde, in den Gelenken von RA-Patienten überexprimiert wird (Kurzik-Dumke et al., 1999). Protein Sequenz Aminosäureposition D. melanogaster Tid EAYEVLSDEQKRREYDTYGQTAENI 111 – 135 E. coli DnaJ EAYEVLTDSQKRAAYDQYGHAAFEQ 52 – 76 H. sapiens HSJ1 EAYEVLSDKHKREIYDRYGR..EGL 51 – 73 H. sapiens HSP40 EAYDVLSDPRKREIFDRYLE..EGL 49 – 71 H. sapiens HDJ2 QAYEVLSDAKKRELYDKGGEQAIKE 50 – 74 H. sapiens Auxilin DAWSEFENQGQKPLY Referenz I. J-Protein-Familienmitglieder Kurzik-Dumke et al., 1997 896 – 910 II. DnaJ und HLA-DRB1*0401 β-Kette E.coli DnaJ EAYEVLTDSQKRAAYDQYGHAAFEQ 52 – 74 Albani et al., 1995 H. sapiens WNSQKDLLEQKRAAVDTYCRHNYGV 61 – 85 Salvat et al., 1997, DRB1*0401 Roudier et al., 1989 Tabelle 2. Sequenzvergleich einiger J-Proteine innerhalb eines hochkonservierten Bereichs der J-Domäne und der β-Kette von HLA-DRB1*0401. Identische Aminosäuren sind unterstrichen. Das shared epitope-Motiv QKRAA ist bei E. coli DnaJ sowie der β-Kette des HLA-DRB1*0401 fett gedruckt, ebenso die übereinstimmenden Aminosäuren in den übrigen Proteinsequenzen (aus Kurzik-Dumke et al., 1999). 15 Ausgehend von dem von N. Willcox (Neurosciences Group, Institute of Molecular Medicine, John Radcliffe Hospital, Oxford, U.K.) bereitgestellten T-Zellklon PM-A C3 wird in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe von TP-Zellen anhand von Stimulationsexperimenten untersucht, ob der Unterschied in der Prozessierung von langen Polypeptiden bzw. Proteinen durch HLA-DRB1*0401 bzw. DRB1*0408, deren Peptidbindungstaschen sich nur in einer Aminosäure unterscheiden (Lys71 bzw. Arg71), auf diese Diversifikation der Genotypen zurückzuführen ist. Bei Bestätigung dieser Vermutung soll eine Peptidbindungsstudie zeigen, ob diese DR-Moleküle die zugeführten Polypeptide unterschiedlich stark binden und somit die T-Zellaktivierung beeinflußt wird. Ebenso wird in dieser Arbeit die Fragestellung bearbeitet, ob in den verschiedene Zellen die Enzyme des Prozessierungsapparates divergent arbeiten. Desweiteren wird mit Hilfe von Induktionsversuchen und proteinchemischen Methoden untersucht, ob DRB1*0401 bzw. DRB1*0408 unterschiedlich mit einem zweiten Molekül des Antigenpräsentationsapparates interagieren können. Für diese Interaktionsstudien werden Invariante Kette, das DM-Molekül und HSP70-Proteine als mögliche Kandidaten ausgewählt. 16 2 Materialien 2.1 Geräte und Arbeitsmaterialien a) Zellkultur Gerät Typ Hersteller Brutschrank 137 Cs-Quelle Dampfsterilisator Luftstromgerät Magnethalterung Mikroskop Plastikpipetten Polypropylen-Kulturröhrchen Reinstwassersystem Software für Betaplate Szintillationsmultikanalzähler Trockenschrank Zählkammer Zellernte-Gerät Zellkulturgefäße Zellschaber Zentrifuge B 5060 EC/CO2 Bestrahlungsgerät IBL 137C Tecnomara, Typ FVS Gelaire, BSB 6A Dynal, Hamburg MPC-E-1 CK2 steril Bluecap, 50 mL Milli-Q UF Plus Ip MC-E, Version 1.52 Beta-Plate 1205 TK 4067 Neubauer improved Scatron Micro Cell Harvester 25 cm², 75 cm² 25 mm Omnifuge 2.0 RS Heraeus, Osterode Isotopen Diagnostik CIS, Dreieich Integra Biosciences, Fernwald Flow Laboratories, Meckenheim Dynal, Hamburg, Hamburg Olympus, Hamburg Greiner, Frickenhausen Greiner, Frickenhausen Millipore, Frankfurt LKB Wallac, Turku, Finnland LKB Wallac, Turku, Finnland Ehret, Emmendingen Brand, Wertheim Scatron, Lier, Norwegen Nunc, Wiesbaden, Wiesbaden Greiner, Frickenhausen Heraeus, Osterode b) Proteinpräparation Gerät Typ Dialysekassette Quarzküvetten Slide-A-Lyzer 105.020.02B-QS; Hellma 10 mm Säulenmaterialien Software Ultrafiltrationszellen UV/VIS-Spektrophotometer Zentrifugen Nr. Rotortyp 1 2 3 5 12 2252 2252 2252 2256 2252 Hersteller Pierce, Augustin Multimed, Wicker Labortechnik, Kirchheim/Teck CM-Sepharose CL-6B Pharmacia, Freiburg Sephadex G-50 Pharmacia, Freiburg CNBr-aktivierte Sepharose CL-6B Pharmacia, Freiburg Protein A-Sepharose Pharmacia, Freiburg ATP-Agarose Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen PEPTIDSORT, Programmpaket Husar DKFZ, Heidelberg Centriprep-30 Millipore, Frankfurt Beckman, Palo Alto, CA, USA DU 640 EBA 12 R Hettich, Tuttlingen Omnifuge 2.0 RS Heraeus, Osterode Biofuge pico Heraeus, Osterode Funktion Zellen waschen Zellen waschen Ficollgradient (Blut) FACS-Platten Waschen nach Ficoll Tabelle 3. Programme für Omnifuge 2.0 RS Beschleunigung / Bremsen 9/8 9/8 8/0 8/7 9/8 Geschwindigkeit 301×g 301×g 920×g 284×g 403×g Zeit 7 min 7 min 15 min 7 min 7 min Temperatur 24 °C 4 °C 24 °C 4 °C 20 °C 17 c) SDS-PAGE und Western Blot Gerät Typ Blot-Transfer-Apparatur Elektrophorese-Apparatur Entwicklermaschine Gel-Blotting Papier Hyperfilm MP Mini-Trans-Blot Transfer Cell Mini-Protean II Curix 60 GB002 580 x 600 mm Nitrocellulosemembran Rundschüttler Spannungsquelle Thermomixer Vakuum-Geltrockner Vortexer Wasserbad Hersteller BioRad, München BioRad, München Gevaert, Leverkusen Achleicher & Schüll, Dassel Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg Hybond für ECL-System Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg 3015 Kummer, Freiburg 2301 Macrodrive 1, LKB Bromma Pharmacia, Freiburg 5436 Eppendorf, Hamburg Gel Dryer Modell 583 BioRad, München VF2 Janke & Kunkel. IKA Labortechnik, Staufen Julabo U3 Kummer, Freiburg d) ELISA Gerät Typ 96-Kanal-Waschgerät SLT 96 PW Filterphotometer Easy Reader EAR 400 AT Immuno-Platten Mehrkanalpipette Software MaxiSorb, 96 Vertiefungen Mikronic, 8-Kanal MikroCom Excel 7.0 Hersteller SLT Labinstruments, Gröding/Salzburg, Österreich SLT Labinstruments, Gröding/Salzburg, Österreich Nunc, Wiesbaden Integra Biosciences, Fernwald MikroTek, Overath Microsoft Corporation, Santa Rosa, CA, USA e) Immuncytochemie Gerät Deckgläser Durchflußcytometer Filmmaterial Fluoreszenzmikroskop Kamera Objektträger Software Typ FACSScan 64 T Ektachrome 400x Ektachrome (Fluoreszenz) Axioskop MC 100 unbeschichtet oder beschichtet CellQuest Hersteller Langenbrinck, Emmendingen Becton Dickinson, Heidelberg Kodak, Rochester, NY, USA Kodak, Rochester, NY, USA Zeiss, Jena Zeiss, Jena Langenbrinck, Emmendingen Becton Dickinson, Heidelberg 18 2.2 Chemikalien, Kits und Antikörper a) Chemikalien Acrylamid- und Bisacrylamidstammlösung APS ATP ß-Mercaptoethanol Betaplate Scint Bicoll-Trennlösung Bromphenolblau BSA Coomassie Brilliant Blue G Diethanolamin EDTA, Natrium-Salz Ethanolamin Fluoromont G L-Glutamin Glutaraldehyd Glycerin Glycin HEPES 5-IAF LMW-Längenstandard D/L-Lysin×HCl PAP-Pen Penicillin PNPP Poly-L-Lysin Propidiumiodid SDS Streptomycin TEMED 3 H-Thymidin Triton X-100 Trizma Base Trypanblau Tween-20 Rotiphorese Gel (37.5 : 1) Dichte 1.077 g/mL Fraktion V Roth, Karlsruhe Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen ICN Biomedicals, Eschwege Merck, Darmstadt FSA Laboratory Supplies, Loughborough, England Biochrom seromed, Berlin Merck, Darmstadt Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen Merck, Darmstadt Biochrom seromed, Berlin Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen Dianova, Hamburg Gibco BRL, Eggenstein BDH Chemicals, Poole, England Roth, Karlsruhe Roth, Karlsruhe Gibco BRL, Eggenstein MoBiTec, Göttingen Gibco BRL, Eggenstein BDH Chemicals, Poole, England Science Services, München Gibco BRL, Eggenstein Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen Roth, Karlsruhe Gibco BRL, Eggenstein Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg Merck, Darmstadt Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen Serva, Heidelberg Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen Gängige Laborchemikalien sind nicht aufgeführt. Soweit nicht anders beschrieben, wurden alle Chemikalien vom Reinheitsgrad p.a. verwendet. b) Kits BCA Protein Assay Reagent Kit Dynabeads M-450 (sheep anti mouse IgG) SuperSignal Chemiluminescent Substrate for Western Blotting Pierce, Augustin Dynal, Hamburg Pierce, Augustin Die Zusammensetzung der einzelnen Puffer und Lösungen kann den jeweiligen Produktbeschreibungen entnommen werden. 19 c) Antikörper Name Spezifität Spezies/Isotyp Konz. Western ELISA Blot 1: 1‘000 - Anti-DnaK E. coli DnaK Maus IgG1 1 mg/mL Anti-DnaJ E. coli DnaJ Kaninchenserum - 1:10‘000 Anti-HSC70 HSP73 Ratte IgG2a 1 mg/mL Anti-HSP70 HSP72 Maus IgG1 Anti-Grp75 Grp75 Anti-BiP FACS Hersteller - StressGen, Toronto, Canada - - StressGen, Toronto, Canada 1:1‘000 - 1:400 StressGen, Toronto, Canada 1 mg/mL 1:1‘000 - - StressGen, Toronto, Canada Maus IgG1 1 mg/mL 1:1‘000 - - StressGen, Toronto, Canada BiP Maus IgG2a 1 mg/mL 1:500 - - StressGen, Toronto, Canada Anti-Kaninchen IgHRPO Kaninchen IgG Ziegenserum - 1:8‘000 - - Dako, Hamburg Anti-Maus IgGHRPO Maus IgG Ziege - 1: 30‘000 - - Dako, Hamburg HRPO Anti-Ratte IgG Ratte IgG Ziege - 1:8‘000 IOT2aFITC HLA-DR Maus IgG2κ - - - 1:10 Dianova, Hamburg 0.5 mg/mL - - 1:80 Pharmingen, Heidelberg - - - 1:300 Dianova, Hamburg d (bio) Klasse-II Maus IgG2b, κ Dako, Hamburg Anti-I-A Maus I-Ad SAFITC - OKT 3 CD3 auf huma- Maus IgG2a nen peripheren T-Zellen - - - - Neurosciences Group, Oxford, UK Anti-TNFα Humanes TNF-α Maus IgG1 1 mg/mL - 1:1‘000 - Pharmingen, Heidelberg Anti-TNFαbio Humanes TNF-α Maus IgG1 1 mg/mL - 1:1‘000 - Pharmingen, Heidelberg Anti-IFN-γ Humanes IFN-γ Maus IgG1, κ 1 mg/mL - 1:1‘000 - Pharmingen, Heidelberg Anti- IFN-γbio Humanes IFN-γ Maus IgG1, κ 1 mg/mL - 1:1‘000 - Pharmingen, Heidelberg - Tabelle 4. Antikörperliste. Für die einzelnen Anwendungen sind die verwendeten Verdünnungen angegeben. 20 2.3 Zellen a) Stimulatorzellen, Antigenpräsentierende Zellen P388.D1 ATCC (TIB 63), Rockville, Maryland, USA Murine, makrophagen-ähnliche Zellinie Wurde aus einer durch Methylcholanthren induzierten, lymphoiden Neoplasie einer DBA/2-Maus isoliert (Koren et al., 1998) TP0401 P388.D1 transfiziert mit HLA-DRA*0101 und HLADRB1*0401 (Daubenberger et al., 1996) TP0408 P388.D1 transfiziert mit HLA-DRA*0101 und HLADRB1*0408 (Daubenberger et al., 1996) TP0408.B5, TP0408.H2 selektionierte Klone oder Subklone von TP0408 b) Humane T-Zellen PM-A T-Zellinie, die spezifisch für die α-Untereinheit des humanen Acetylcholinrezeptors ist. Aus dieser Linie entstand der Klon C3. Linie PM-A und Klon C3 wurden von N. Willcox, Oxford, UK, aus dem hyperplastischen Thymus einer Patientin, die an Myasthenia gravis leidet, etabliert und zur Verfügung gestellt. Die Patientin ist DRB1*0408/DRB1*0301. 2.4 Antigen α-Untereinheit des humanen Acetylcholin-Rezeptors Folgende Peptide aus der α-Untereinheit des humanen Acetylcholin-Rezeptors wurden in den Experimenten verwendet: synthetisches Peptid rekombinantes Polypeptid rekombinantes Polypeptid p144-163 r3-181 r1-437 Diese wurden freundlicherweise von N. Willcox, Oxford, UK, zur Verfügung gestellt. Die Peptide außer p144-163 verblieben während des gesamten Tests im Kulturgefäß. Die Peptide sind bei Ong et al. (1991) beschrieben. Die Polypeptide r3-181 und r1-437 wurden rekombinant in E. coli hergestellt (Beeson et al., 1989). 21 2.5 Puffer, Nährmedien und Lösungen a) Puffer Na/K-Phosphatpuffer Na2HPO4 KH2PO4 MP-H2O pH 7.2 (RT, eingestellt mit 0.5 M KH2PO4) PBS Na/K-Phosphatpuffer NaCl MP-H2O PBS/Tween-20 Tween-20 PBS 0.5 M 0.5 M 2 % (v/v) 0.9 % (w/v) 0.1% (v/v) b) Nährmedien RPMI-VM Kulturmedium für P388.D1 Kulturmedium für TP-Zellen Kulturmedium für PM-A C3 RPMI-1640 L-Glutamin HEPES Penicillin Streptomycin FCS Kultivierung bei 37 °C, 5% CO2-Begasung 2 mM 10 mM 100 U/mL 100 µg/mL 10% (v/v) RPMI-VM β-Mercaptoethanol 0.05 mM RPMI-VM β-Mercaptoethanol Geneticin 418 0.05 mM 1 mg/mL RPMI-VM HS 5% (v/v) c) Proteinpräparation Affinitätschromatographie Puffer A Puffer B HEPES, (pH 7.6, eingestellt mit 1M KOH) KCl MgCl2 β-Mercaptoethanol EDTA Aufbewahrung bei 4 °C Puffer A KCl Aufbewahrung bei 4 °C 25 mM 50 mM 5 mM 10 mM 1 mM 1M 22 Fluoresceinmarkierung von DnaK Markierungspuffer HEPES (pH 7.0) KCl MgCl2 5-IAF-Lösung 5-IAF DMF 25 mM 200 mM 5 mM 10 mM c) Magnetische Zellseparation Separationspuffer HS PBS 1% (v/v) d) ELISA Coating Puffer NaHCO3 MP-H2O pH 8.2 (RT, eingestellt mit 1M HCl) 0.1 M Blockierungslösung Gelatine PBS Standardpuffer FCS PBS TBS NaCl KCl Tris MP-H2O pH 7.4 (RT, eingestellt mit rauchender HCl) Diethanolaminpuffer MgCl2 × 6 H2O 0.8 g/L NaN3 0.2 g/L Diethanolamin 0.097% (v/v) MP-H2O pH 9.8 (RT, eingestellt mit rauchender HCl) Waschpuffer Tween-20 NaN3 PBS 0.1% (w/v) 10% (v/v) 8.0 g/L 0.2 g/L 25 mM 0.5% (v/v) 0.02% (w/v) 23 e) Immunpräzipitation Herstellung einer Antikörpersepharose CNBr-Sepharose Cl-4B (gequollen in 1mM HCl) 100 µL Antikörperlösung (1 mg/mL) 2% (v/v) NaHCO3 0.1 M NaCl 0.5 M Endvolumen 1mL Stoplösung Ethanolamin pH 8.0 (eingestellt mit 1 M HCl) TSA-Lösung Tris/HCl, pH 8.0 NaCl NaN3 Verdünnungspuffer Triton X-100 BSA TSA-Lösung Probenpuffer Tris/HCl, pH 6.8 0.05 M 0.01 M 0.14 M 0.025% (v/v) 0.1% (v/v) 0.1% (w/v) 0.05 M f) Lösungen für Immuncytochemie Poly-L-Lysin-Lösung Poly-L-Lysin PBS FACS-Puffer PBS FCS NaN3 Lösung 1 PBS Paraformaldehyd Trypanblaulösung Trypanblau PBS Propidiumiodidlösung Propidiumiodid MP-H2O 10 µg/mL 3% (v/v) 0.1% (v/v) 1% (w/v) 0.16% (w/v) 1% (w/v) 24 g) SDS-PAGE Acrylamid-Stammlösung Acrylamid Bisacrylamid 37.5 % (w/v) 1 % (w/v) Elektrophoresepuffer Tris Glycin SDS pH 8.3 (RT, eingestellt mit rauchender HCl) 50 mM 380 mM 0.1 % (w/v) Sammelgelpuffer Tris pH 6.8 (RT, eingestellt mit rauchender HCl) 0.5 M Sammelgel 6 % (w/v) Acrylamid-Stammlösung Sammelgelpuffer MP-H2O SDS 10% (w/v) APS 10 % (w/v) TEMED Trenngelpuffer Tris pH 8.8 (RT, eingestellt mit 6 M HCl) Trenngel 10 % (w/v) Acrylamid-Stammlösung Trenngelpuffer MP-H2O SDS 10% (w/v) APS 10 % (w/v) TEMED SDS-Probenpuffer Sammelgelpuffer SDS 16 % (w/v) Glycerin Bromphenolblau 0.2 % (w/v) β-Mercaptoethanol pH 6.8 (RT, eingestellt mit rauchender HCl) LMW-Längenstandard Mr [kDa] 104 81 47.7 34.6 28.3 19.2 Coomassielösung Coomassie R-250 Ethanol Essigsäure Entfärbelösung Ethanol Essigsäure 670 µL 500 µL 2.7 mL 40 µL 40 µL 4 µL 1.5 M 3.3 mL 2.5 mL 4.0 mL 100 µL 100 µL 10 µL 2 mL 2 mL 4 mL 1 mL 1 mL 0.25 % (w/v) 25 % (v/v) 10 % (v/v) 30 % (v/v) 10 % (v/v) 25 h) Western-Blotting Transferpuffer Tris Glycin Methanol SDS 10% (w/v) MP-H2O 3.15 g 14.26 g 20% (v/v) 1 mL Blockierungspuffer 1 BSA PBS/Tween-20 1% (w/v) Blockierungspuffer 2 Milchpulver PBS/Tween-20 5% (w/v) Antikörperverdünnungspuffer ist der entsprechende Blockierungspuffer Strip-Puffer LMW-Längenstandard Tris/HCl, pH 6.8 SDS β-Mercaptoethanol MP-H2O Mr [kDa] 104 81 47.7 34.6 28.3 62.5 mM 2% (w/v) 100 mM Mr [kDa] 194 120 87 64* 52 39 26 21 15 9 Mr [kDa] 184 145 99 70* 57 43 29 23 18 10 Mit * gekennzeichnete Bande ist zur Orientierung farblich abgehoben i) Zellfixierung Glutaraldehydlösung Glutaraldehyd PBS Stoplösung D/L-Lysin MP-H2O Waschmedium RPMI-VM HS 0.05% (w/v) 0.4 M 2.5% (v/v) 26 3 Methoden 3.1 Zellbiologische Methoden 3.1.1 Isolierung von mononucleären Zellen aus dem peripheren Blut Blut wurde mit PBS in einem Verhältnis von 1 : 2 gemischt. 15 mL Bicoll-Trennlösung wurden in einem 50 mL-Bluecap vorgelegt, vorsichtig mit 30 mL verdünntem Blut überschichtet und 15 min bei 920×g (Omnifuge 2.0 RS, Programm 3) zentrifugiert. Bei dieser diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation durchqueren die Erythrocyten und die Granulocyten aufgrund ihrer hohen Dichte die Bicoll-Schicht, wohingegen die mononucleären Zellen in der Phase zwischen Bicoll und verdünntem Blut verbleiben. Die peripheren mononucleären Zellen des Blutes (PBMC) wurden vorsichtig aus dieser Interphase entfernt und zweimal in PBS gewaschen (Omnifuge 2.0 RS, Programm 12). 3.1.2 Bestimmung von Zellzahl und Zellvitalität Trypanblau ist ein saurer Farbstoff, der als Anion sehr leicht an Proteine binden kann. Die Plasmamembran von lebenden Zellen erlaubt es nicht, daß dieser Farbstoff passiv in das Cytoplasma hineindiffundiert. Tote Zellen dagegen können diesen Farbstoff aufnehmen und erscheinen dadurch im mikroskopischen Bild gefärbt. Eine Lösung von Trypanblau wurde mit einem bestimmten Volumen einer Zellsuspension gemischt und in eine NeubauerZählkammer transferiert. Die Zellen konnten auf diese Weise unter dem Mikroskop sowohl auf ihre Vitalität hin geprüft als auch gezählt werden. 3.1.3 Waschen von Zellen Die Zellen wurden bei 300×g für 7 Minuten zentrifugiert (Programm 1, Omnifuge 2.0 RS). Danach wurde der Überstand mit Hilfe einer Pasteurpipette und einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Das Röhrchen wurde erneut mit RPMI-VM aufgefüllt und die Zellen darin 27 resuspendiert. Danach erfolgte ein weiterer Zentrifugationsschritt, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde wiederum abgesaugt und die Zellen im gewünschten Medium aufgenommen. 3.1.4 Magnetische Zellseparation Für die spezifische Stimulierung des humanen T-Zellklons PM-A C3 wurden in dieser Arbeit sowohl TP-Zellen als auch PBMC von verschiedenen Spendern eingesetzt. Um bei der Verwendung von PBMC durch Spender-T-Zellen hervorgerufene Nebenreaktionen auszuschließen, wurden diese T-Zellen mittels biomagnetischer Depletion aus den PBMC entfernt. Für die biomagnetische Separation wurden DynabeadsM-450 eingesetzt. Dynabeads sind supermagnetische, monodisperse Polymerpartikel mit einem Durchmesser von 4.5 µm. Der magnetische Kern besteht aus δFe2O3 und Fe3O4. Die umgebende dünne Polymerhülle erlaubt es, die verschiedensten Moleküle zu adsorbieren oder zu koppeln. Herstellung spezifischer immunomagnetischer Partikel Zur spezifischen Depletion von T-Zellen wurden zuerst entsprechende Immunomagnetische Partikel hergestellt. Dazu wurden 6×107 Dynabeads-M450, die schon vom Hersteller mit Schafsantikörpern spezifisch für Maus-IgG gekoppelt waren, dreimal in PBS gewaschen. Anschließend wurden diese unter Zusatz von Mausantikörpern OKT3 (5 µg/mL in Separationspuffer), die spezifisch an humane periphere T-Zellen binden, 1 h bei 4°C auf dem Rad inkubiert. Es erfolgten drei Waschschritte in Separationspuffer. Depletion von humanen T-Zellen Zu den für humane T-Zellen spezifischen Magnetpartikeln wurden nun mit 30 Gy in einer 137 Cs-Quelle bestrahlte PBMC in einem Verhältnis von 3 : 1 gegeben und 1 h bei 4 °C auf dem Rad inkubiert. Durch die spezifische Bindung der immunomagnetischen Partikel an humane T-Zellen konnten diese gezielt mit Hilfe eines Magneten von der Gesamtpopulation der PBMC getrennt werden. Dazu wurde ein Reaktionsgefäß in einen Ständer gestellt, dessen Rückwand ein magnetisches Element enthält. Alle Zellen, die nun immunomagnetische 28 Partikel gebunden hatten, wanderten innerhalb von 2 min zur magnetgerichteten Gefäßrückwand. Im Anschluß wurde der T-Zell-freie Überstand mit einer Pipette abgenommen, bei 300×g ca. 3 min zentrifugiert und zweimal mit Separationspuffer gewaschen. 3.1.5 Zellkultivierung Alle Zellen wurden in einem Brutschrank bei 37 °C und 5%- CO2-Begasung kultiviert. Sie erhielten Zellkulturmedium und die Zellsuspension wurde nach Bedarf verdünnt. Adhärent wachsende Zellen wurden mit einem Zellschaber abgelöst. Die Zellzahl und Vitalität wurde wie in Kap. 3.1.2 beschrieben bestimmt. 3.1.6 Vorbehandlung von Stimulatorzellen mit Peptid p144-163 Zellfixierung mit Glutaraldehyd (nach Current Protocols in Immunology, 1997) Um eine ausreichende Antigenpräsentation von kurzen Peptiden wie dem in dieser Arbeit verwandten Peptid p144-163 zu gewährleisten, wurden die eingesetzten APZ mit Glutaraldehyd fixiert. Glutaraldehyd ist in der Lage, über seine Aldehydgruppen mit Oberflächenmolekülen der Zellen zu reagieren. Durch das so entstandene Polymernetz werden die Bewegungsabläufe der Zellmembran blockiert und es ist nur noch ein Austausch von nicht vernetzten Molekülen auf der Zelloberfläche mit ihrer äußeren Umgebung möglich. Daher sind APZ nicht mehr in der Lage zugeführte Peptide oder Proteine aufzunehmen und dem Antigenprozessierungsapparat zu zuführen. Somit wird auch die Präsentation von später zugesetztem Antigen allein auf solche Antigene beschränkt, die unmittelbar an MHCMoleküle auf der Zelloberfläche binden können. 5×106 PBMC wurden zweimal in PBS gewaschen. Das nach Zentrifugation (Biofuge pico, 300×g, 3 min, RT) erhaltene Pellet wurde in 400 µL PBS aufgenommen, 400 µL einer 0.05 %igen Glutaraldehydlösung zugegeben und für 30 s bei RT inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 800 µL Stopplösung beendet. Der Ansatz wurde in 4 mL Waschmedium aufgenommen, zentrifugiert (Omnifuge 2.0 RS, Programm 1) und nochmals mit Waschmedium gewaschen. 29 Bindung von Peptid p144-163 an fixierte APZ Das Peptid p144-163 wurde in Konzentrationen von 0.08 – 10 µg/mL in einem Endvolumen von 2 mL zu 1×106 APZ gegeben. Die Zellen wurden 2 h im Brutschrank inkubiert, mit Waschmedium gewaschen und dann wie in Kap. 3.1.7 beschrieben in die MTP ausgesät. 3.1.7 Stimulation des Acetylcholin-Rezeptor-spezifischen Klons PM-A C3 Die Stimulationsexperimente wurden im Labor von N. Willcox durchgeführt (Neurosciences Group, Institute of Molecular Medicine, John Radcliffe Hospital, Oxford, UK). Die Experimente wurden in Rundboden-MTP (für PBMC) bzw. Flachboden-MTP (für TP-Zellen) und im Kulturmedium für PM-A C3 durchgeführt. Als APZ dienten PBMC von DRB1*0401- oder DRB1*0408-positiven Spendern bzw. TP-Zellen mit den entsprechenden transfizierten HLA-Genen. Die APZ wurden in einer Konzentration von 5×104 Zellen/Kultur eingesetzt, wobei die PBMC zuvor mit 30 Gy in einer 137 Cs-Quelle bestrahlt wurden. Zunächst wurden die Stimulatorzellen und verschiedene Antigene in die MTP pipettiert. Hinzugefügt wurden die Peptide r3-181 oder r1-437. Die mit Peptid p144-163 beladenen APZ (Kap 3.1.6) wurden nach dem Waschen in die MTP pipettiert (s. Kap. 3.1.3). Danach folgte die Zugabe des Klons PM-A C3 in einer Konzentration von 2×104 Zellen/Kultur. Das Endvolumen in den Mikrokulturen war 200 µL. 48 Stunden (PBMC) bzw. 96 Stunden (TP-Zellen) nach Beginn des Experiments wurden pro Kultur 150 µL Überstand abgenommen und später auf ihren Gehalt an humanem IFN-γ/TNF-α getestet (Kap. 3.6). Induktion von TP-Zellen mit Maus-IFN-γ Zur Untersuchung der Interaktion von DR-Molekülen mit Invarianter Kette wurden TP-Zellen vier Tage vor Versuchsbeginn mit 100 U/mL rekombinantem Maus-IFN-γ stimuliert. Danach wurden die so induzierten TP-Zellen in der obengenannten Konzentration eingesetzt und der T-Zellklon zugegeben. 100 U/mL Maus-IFN-γ wurden zur Mikrokultur zugesetzt. Das Endvolumen in den Mikrokulturen war 200 µL. 96 Stunden nach Beginn des Experiments wurden pro Kultur 150 µL Überstand abgenommen und später auf ihren Gehalt an humanem IFN-γ/TNF-α getestet (Kap. 3.6). 30 Zusatz von HSP70-Molekülen Bei Zusatz von HSP70-Molekülen zur Kultur wurden diese mit Antigen 30 min vor Zugabe gemischt. Die weiteren Arbeitsschritte erfolgten wie bei den anderen Stimulationsversuchen. 3.1.8 Messung des 3H-Thymidineinbaus von Zellen Für die kurzfristige Beobachtung der Stoffwechselaktivität von Zellen wird der Einbau von niedermolekularen Vorläufersubstanzen in die Makromoleküle der Zelle verwendet. Üblicherweise wird dabei eine Nucleotidbase zum Einbau in die DNA bzw. RNA verwendet. Die weitaus häufigste Methode ist der Einbau von radioaktivem Thymidin in die DNA. Kurzfristige Inkubation mit dem radioaktiven Precursor gibt einen guten Hinweis auf unidirektionalen Flux, während eine längere Inkubationszeit einen Einbau in Polymere (DNA, RNA) erbringt. TP-Zellen wurden 16 Stunden mit 1.85×104 Bq/Kulturansatz 3H-Thymidin bei 37 °C / 5 % CO2 inkubiert und anschließend geerntet. Der humane T-Zellklon PM-A C3 wurde wie in Kap. 3.1.7 beschrieben mit PBMC von DRB1*0401- und DRB1*0408-positiven Spendern stimuliert. Nach 96 Stunden wurden die Kulturen mit 1.85×104 Bq/Kulturansatz 3H-Thymidin gepulst und nach weiteren 16 Stunden geerntet. 3.1.9 Ernten radioaktiv markierter Zellen Das Ernten der radioaktiv markierter DNA erfolgte mit Hilfe des Skatron „Micro Cell Harvesters“ nach Anleitung des Herstellers. Die Zellen wurden dabei mit Hilfe von H2O lysiert. Die so freiwerdende DNA wurde auf Filtermatten gebunden. Nach Trocknung der Filter wurden diese mit Szintillations-Flüssigkeit überschichtet, in den Beta-Counter überführt und die Menge des in die DNA eingebauten 3H-Thymidins in cpm gemessen. 31 3.2 Proteinchemische Methoden 3.2.1 Markierung von DnaK-Mutanten mit einem Fluoreszenzfarbstoff Es sollten Bindungsstudien des DnaK-Moleküls an Zelloberflächen durchgeführt bzw. dessen Aufnahme durch Zellen mit optischen Methoden verfolgt werden. Dazu wurde dieses mit einem Fluoresceinmolekül gekoppelt. Um eine effiziente Kopplung zu erreichen, wurde ein Iodacetamid-Fluoresceinderivat ausgewählt, das in einer nucleophilen Substituiton (SN2-Reaktion) mit Thiolgruppen reagieren kann. Bei physiologischem pH-Wert besitzen Thiolgruppen die zur Reaktion notwendige Nucleophilie, so daß die Umsetzung sehr schnell und selektiv abläuft. Nebenprodukte durch Kopplung des Farbstoffes an freie Aminogruppen können bei diesem pH-Wert nahezu ausgeschlossen werden, da Aminogruppen hier vollständig protoniert vorliegen. Von M. P. Mayer (Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg) wurden die DnaK-Mutanten Q44C und Q424C zur Verfügung gestellt. Aufgrund eines einzelnen, schwer zugänglichen Cysteinbausteins innerhalb der ATPase-Domäne des DnaK-Moleküls, wurden durch gezielte Punktmutationen an den von außen gut zugänglichen Positionen 44 bzw. 424 Glutaminsäuren durch Cysteine ersetzt. Für die Fluoreszenzmarkierung wurde das entsprechende Protein in Markierungspuffer aufgenommen und die Proteinkonzentration wie in Kap. 3.3.2 beschrieben bestimmt. Der Fluoreszenzfarbstoff wurde in DMF gelöst und im 10 - 20fachen molaren Überschuß zur Proteinlösung gegeben. Der Reaktionsansatz wurde 2 h bei 30 °C mit Hilfe eines Thermomixers (Schüttelstufe 8) lichtgeschützt inkubiert. Anschließend wurde überschüssiges Substrat mittels GPC (Kap. 3.2.2) vom Produkt getrennt. 3.2.2 Gelpermeationschromatographie (GPC) Die GPC trennt Moleküle nach Größe und Form, wobei die Elution für große Moleküle schneller erfolgt als für kleine, da diese in die Gelmatrix eindringen können und somit retardiert werden. In dieser Arbeit wurde für die GPC eine Sephadex G-50-Säule verwendet, deren Trennbereich für Proteine zwischen 1 kDa und 30 kDa angegeben ist. Das Säulen- 32 material besteht aus porösen Kügelchen aus hochvernetztem Agarosegel mit kovalent gebundenem Dextran. Das nach der Farbstoffmarkierungsreaktion erhaltene Produkt wurde auf die Gelfiltrationssäule aufgetragen, die zuvor mit 4 Vt Markierungspuffer äquilibriert wurde. Das Eluat wurde fraktioniert. Der HEPES-Puffer wurde als Elutionspuffer eingesetzt. Säulenmaterial Sephadex G-50 Säulenhöhe 16 cm Säulendurchmesser 2.25 cm Gelvolumen 14 mL Temperatur 25 °C Äquilibrierung Markierungspuffer Flußrate 1.2 mL/min Fraktionsgröße 1 mL Proteinhaltige Fraktionen wurden mit Hilfe der Absorptionspektroskopie (s. Kap. 3.3.1) identifiziert. 3.2.3 Affinitätschromatographie Die Affinitätschromatographie ermöglicht die Trennung und Reinigung aufgrund spezifischer Wechselwirkungen zwischen Protein und Affinitätsgelmaterial. Hiermit unterscheidet sie sich von allen anderen Chromatographiemethoden, die Unterschiede in den physikalischen Eigenschaften der zu trennenden Moleküle ausnutzen. Voraussetzung für eine erfolgreiche Affinitätschromatographie ist, daß das gewünschte Protein reversibel und spezifisch an den Liganden binden kann, der irreversibel an einen Träger gekoppelt ist: M + L k 1→ + ← -1 k ML M = Makromolekül (Protein) L = Ligand am Träger ML = Protein-Ligand-Komplex Wird ein Gemisch, das die gewünschte spezifische Komponente enthält, mit dem schwerlöslichen Liganden in Berührung gebracht, so wird unter geeigneten Bedingungen nur diese 33 Komponente den Liganden binden. Andere Verbindungen können deshalb leicht ausgewaschen und entfernt werden. Die gewünschte Komponente erhält man danach durch Verdrängen vom Liganden. In dieser Arbeit wurde eine ATP-Affinitätschromatographie zur Entfernung von ATPbindenden Proteinen aus rekombinanten Antigenlösungen des AChR durchgeführt. Als Säulenmaterial wurde eine ATP-gekoppelte Agarose verwendet. Da ATP schon bei RT zu ADP hydrolysieren kann, werden alle Arbeitsschritte auf Eis bzw. bei 4 °C durchgeführt. Bei der Präparation der Antigenlösungen wurde im Batch-Verfahren gearbeitet. Das verwendete Säulenmaterial wurde 2 h auf Eis in Puffer A gequollen. Danach wurde die ATPAgarose dreimal in Puffer B gewaschen. Die Äquilibrierung erfolgte durch wiederholtes Aufschlämmen des Materials in Puffer A und Abdekantieren des Überstandes. 200 µL des so äquilibrierten Säulenmaterials wurden zu 1 mL der HSP70-haltigen Antigenlösung gegeben und ca. 30 min bei 4 °C auf dem Rad inkubiert. Anschließend wurde die Suspension 2 min bei 140×g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgehoben und das Gelmaterial für analytische Zwecke bei –20 °C aufbewahrt. Vom abdekantierten Überstand, der nun HSP70-frei sein sollte, wurden Proben entnommen, von denen später eine SDS-PAGE mit anschließendem Western-Blotting durchgeführt wurde, um die Depletion von HSP70-Proteinen des Antigens zu überprüfen. Säulenmaterial ATP-Agarose Gelvolumen 200 µL Temperatur 4 °C Äquilibrierung Puffer A 3.2.4 Ultrafiltration Proteinlösungen wurden durch Ultrafiltration eingeengt. Hierzu wurden Konzentratoren mit Membranen einer Ausschlußgrenze von 10 kDa verwendet. Amicon- 34 3.3 Proteincharakterisierung 3.3.1 Spektroskopische Bestimmung der Proteinkonzentration Bei bekannter Zusammensetzung der Aminosäuren kann die Proteinkonzentration einer Lösung nach der Methode von Gill und von Hippel (1989) bestimmt werden. Durch im Protein vorhandene Tryptophan-, Tyrosin- und Cysteinreste kommt es zu einer Absorption des Proteins im UV bei einer Wellenlänge von 280 nm. ε280 = (nTrp⋅5690 + nTyr⋅1280 + nCys⋅120) ⋅ M-1cm-1 (1) nx = Anzahl der entsprechenden Aminosäuren im Protein ε280 = molarer dekadischer Extinktionskoeffizient bei 280 nm Der molare dekadische Extinktionskoeffizient bei 280 nm kann nach Gleichung 1 berechnet werden. Der Absorptionskoeffizient ε280 des DnaK mit 1 Tryptophan-, 7 Tyrosin- und 1 Cysteinresten beträgt 14'650 M-1cm-1. Aus dem Lambert-Beerschen Gesetz und der Molmasse des Proteins kann die Proteinkonzentration nach Gleichung 2 berechnet werden. Für das DnaK mit einer relativen Molekülmasse von 70'000 (PEPTIDSORT, Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg) ergibt sich zur Konzentrationsbestimmung Gleichung 2. ⋅ c [mg/mL] = M r A 280 ε280 ⋅ d (2) d = Schichtdicke der Küvette c[mg/mL] = 4.778 ⋅ A280 (3) 3.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration mittels BCA-Methode Das BCA-Reagenz (Fa. Pierce) besteht aus einer Bicinchoninsäure-Lösung (BCA, Lösung A) und einer alkalischen Kupfersulfat-Lösung (Lösung B), die mit Natriumtartrat stabilisiert wird. Die Grundlage der Bestimmung bildet die Reduktion eines Kupferions bei pH 11 auf 35 die einwertige Stufe. Danach bildet das so entstandene Kupfer(I)-Ion einen Koordinationskomplex mit zwei BCA-Molekülen, der bei 562 nm ein Absorptionsmaximum besitzt. Die Proteinbestimmung wurde gemäß Herstellerprotokoll durchgeführt. 3.3.3 Bestimmung des Markierungsgrades eines fluoreszenzmarkierten Proteins Um fluoreszenzmarkiertes Protein von unmarkiertem Protein unterscheiden zu können, wurde jede erhaltene Fraktion aus Kap. 3.2.1 zusätzlich noch bei einer Wellenlänge von 492 nm untersucht. Dabei entspricht die Wellenlänge λ = 492 nm derjenigen Wellenlänge, bei der ein Fluoresceinmolekül sein Absorptionsmaximum besitzt. Der Absorptionskoeffizient εFarbstoff des Fluoresceins beträgt 75'000 M-1cm-1. Der Grad der Fluoreszenzmarkierung mit kann Formel 4 berechnet werden: A492 Mr Protein molFarbstoff × = εFarbstoff cProtein[mg / mL] molProtein (4) 3.3.4 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese Proteingemische lassen sich in einem Polyacrylamidgel in denaturierter Form auftrennen (Laemmli, 1970). Polyacrylamidgele entstehen durch Copolymerisation von Acrylamid und einem geeigneten Vernetzer, meist N,N'-Methylenbisacrylamid. Die Größe der Poren im Gel läßt sich durch Variation der Totalacrylamidkonzentration und des Vernetzungsgrades einstellen (Westermeyer, 1990). Vor dem Auftragen auf das Gel werden die Proteine mit Natriumdodecylsulfat (SDS) denaturiert. SDS bindet an Proteine in einem Massenverhältnis von 1.4 : 1. Dies hat zur Folge, daß die elektrophoretische Mobilität der Proteine ausschließlich durch Molekularsiebeffekte bestimmt wird und in einem annähernd linearen Zusammenhang mit dem Logarithmus der Molmasse steht. Werden die Proteine zunächst in einem großporigen Sammelgel fokussiert und anschließend in einem kleinporigen Trenngel getrennt (diskontinuierliche SDS-PAGE), so lassen sich Bandenschärfe und Trenneffekt verbessern (Righetti et al., 1990). Die SDS-PAGE wurde zum Nachweis verschiedener Proteine und deren Reinheitsbestimmung verwendet. Die diskontinuierliche SDS-PAGE wurde mit Gelen der Dimension 8 36 cm × 7 cm × 0.75 cm und einem Vernetzungsgrad von 2.5 % durchgeführt. Die TotalAcrylamidkonzentration betrug im Sammelgel 6 % und im Trenngel 10 %. Pro Probentasche wurde 0.05 - 30 µg Protein in 40 µl Probenpuffer verdünnt aufgetragen. Vor dem Auftrag wurden die Proben für 3 min bei 95 °C erhitzt, um eine vollständige Denaturierung der Proteine zu erreichen. Um eine irreversible Spaltung der Disulfidbrücken durch Denaturierung zu erreichen, wurde dem Probenpuffer β-Mercaptoethanol zugesetzt. Die Elektrophorese wurde bei einer konstanten Stromstärke von 25-30 mA pro Gel und Spannungen von 35-200 V durchgeführt. Die Gele wurden etwa 40 min in Coomassie-Lösung unter leichtem Schütteln gefärbt, 40 min mit Entfärber behandelt und über Nacht in 10 %ige Essigsäure gelegt. Nach dem Wässern (mindestens 10 min) wurden die Gele zwischen Cellophanfolien bei 80°C im Vakuum-Geltrockner getrocknet. 3.3.5 Elektrophoretischer Transfer von Proteinen Das Transfer-Blotting-Verfahren ermöglicht die Überführung von Proteinbanden nach einer SDS-PAGE auf eine dafür geeignete Nitrocellulose-Membran. Die an der Membranoberfläche immobilisierten Proteine werden dadurch weiteren Untersuchungsmethoden wie Aminosäuresequenzanalyse oder Antikörperreaktionen (Western-Blotting) zugänglich gemacht (Towbin et al., 1979). Nach Durchführung der SDS-PAGE wurde das Sammelgel vom Trenngel entfernt. Das ungefärbte Trenngel wurde kurz in Transferpuffer äquilibriert. Vier mit Transferpuffer getränkte Gel-Blotting-Papiere wurden nacheinander luftblasenfrei, gefolgt vom Trenngel auf die anodische Seite des Blotting-Gestells gelegt. Dabei überragten die Filterpapiere das Trenngel auf jeder Seite um wenige mm. Eine auf die Größe des Trenngels zugeschnittene Nitrocellulose-Membran wurde zur Aktivierung 2 min in Transferpuffer äquilibriert und anschließend luftblasenfrei auf das Trenngel gelegt. Vier Filterpapiere in der Größe des Trenngels wurden mit Transferpuffer getränkt und nacheinander luftblasenfrei auf die Membran gelegt. Die kathodische Seite des Blotting-Gestells wurde aufgesetzt, befestigt und in die Blotting-Apparatur überführt. Unter Eiskühlung wurde 1 h bei konstanter Stromstärke von 300 mA geblottet. 37 3.3.6 Western-Blotting Bereits geringste Mengen eines Proteins können durch Western-Blotting nachgewiesen werden. Bei dieser immunologischen Technik wird eine Proteinprobe zunächst in mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine werden anschließend durch Transfer-Blotting auf eine Nitrocellulose-Membran überführt. Hier sind sie für die Behandlung mit spezifischen Antikörpern zugänglich. Antikörper-Antigen-Komplexe werden dann z.B. mit Hilfe eines zweiten Antikörpers oder eines Proteins, das für den ersten Antikörper spezifisch ist, nachgewiesen. Dabei ist der Antikörper bzw. das Protein kovalent mit einem Enzym verknüpft, das eine Farbreaktion katalysiert. Nach Durchführung von SDS-PAGE und Transfer-Blotting wurde die NitrocelluloseMembran 10 min mit PBS-Puffer gewaschen und über Nacht in Blockierungspuffer gelegt. Für die anschließende Verwendung von Antiköper anti-Grp75 wurde Blockierungspuffer 1, für alle anderen Antikörper Blockierungspuffer 2 eingesetzt. Anschließend wurde die Membran 1 h in Antikörperlösung inkubiert und zweimal je 5 min mit PBS/Tween-20 und einmal 5 min mit PBS gewaschen. Dann wurde die Membran 1 h in DetektionsantikörperLösung (mit Meerrettichperoxidase markiert) inkubiert und zweimal je 5 min mit PBS/Tween-20 sowie 5 min mit PBS gewaschen. Zur Entwicklung wurde die Membran 10 min im Dunkeln in SuperSignal (Fa. Pierce, Anwendung gemäß Herstellerprotokoll) inkubiert. Der Blot wurde schließlich zwischen Folien drapiert und in eine Fotokassette gelegt. In der Dunkelkammer konnte die Chemilumineszenzreaktion des SuperSignals mit einem speziellen Film (Hyperfilm) dokumentiert werden. Der Blot wurde in Frischhaltefolie verpackt und bei –20 °C aufbewahrt. 3.4 Immunpräzipitation Bei den meisten immunochemischen Techniken wird das Prinzip ausgenutzt, daß ein Antigen mit einem spezifischen Antikörper zu einem Antigen-Antikörper-Komplex reagiert. Bei der Immunpräzipitation wird das Antigen bei bekannter Antikörper-Konzentration durch Diffusion so weit verdünnt, bis eine Präzipitation zustande kommt, die bei einem AntigenAntikörper-Verhältnis im Äquivalenzbereich erfolgt. 38 3.4.1 Herstellung einer Antikörper-Sepharose Um einen kontrollierten Präzipitationseffekt zu erzielen, wurden Antikörper an eine feste Phase chemisch gebunden. Dazu wurde eine CNBr-aktivierte Sepharose Cl-4B zuerst in eiskalter 1mM HCl gequollen und gewaschen. Die Waschlösung wurde mittels einer G3-Fritte über eine Waschflache soweit abgezogen bis der entstandene Sepharose-Kuchen eine glanzlose Oberfläche aufwies. Nach Herstellerangaben kann an 1 mL dieser Gelmatrix 5 - 10 mg Protein gekoppelt werden. Die aktiven Gruppen der CNBr-aktivierten Sepharose sind Cyanatestergruppen. Diese Gruppen reagieren mit primären Aminogruppen des zu koppelnden Proteins (hier Antikörper) und bilden so über eine nucleophile Substitutionsreaktion (SN2) Isoharnstoffbrücken/-bindungen. In dieser Arbeit wurden für jeden Ansatz 100 µL Gelsuspension mit 50 µg Antikörper versetzt und mit 0.1 M NaHCO3/0.5 M NaCl auf ein Endvolumen von 1 mL aufgefüllt. Die anschließende Inkubation erfolgte über Nacht bei 4 °C auf dem Rad. Durch Zugabe von Stoplösung wurden dann freie Cyanatestergruppen blockiert. Nach ca. 45-minütigem Absitzen der Gelpartikel auf Eis wurden diese bei 120×g und 4 °C für 4 min zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in 250 µL TSA-Lösung resuspendiert. 3.4.2 Präzipitation von Antigen bzw. Protein Eine Proteinlösung wurde mit Verdünnungspuffer zu einem Volumen von 200 µL gemischt. Dazu wurden 10 µL einer entsprechenden Antikörpersepharose, die zuvor in einem Verhältnis von 1 : 2 in Verdünnungspuffer aufgenommen wurde, zugegeben und für 1.5 h bei 4 °C auf dem Rad inkubiert. Im Anschluß erfolgten ein zweimaliges Waschen mit Verdünnungspuffer und einmal mit TSA-Lösung. Jeder Waschschritt wurde durch Zentrifugieren bei 120×g für 5 - 10 s beendet und der Überstand mit Hilfe einer Pasteurpipette und einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Das resultierende Pellet wurde in 50 µL Probenpuffer aufgenommen. Zur Charakterisierung des Präzipitats wurde eine SDS-PAGE mit anschließendem WesternBlotting durchgeführt. 39 3.5 Durchführung von Fluoreszenztests 3.5.1 Fluoreszenz-aktivierter Zell-Sorter (FACS) Die Fluoreszenz ist definiert als das durch Strahlung angeregte Leuchten eines Stoffes. Hier dient das von einem Argon-Laser erzeugte Licht der Anregung des Farbstoffs Fluorescein. Fluoreszierende Verbindungen absorbieren Lichtenergie nach einem für sie charakteristischen Absorptionsspektrum (z.B. liegt für Fluorescein das Absorptionsmaximum bei λ = 488 nm). Mit dieser Energie werden Elektronen in ein höheres Energieniveau angehoben. Bei Rückfall zum ehemaligen Grundniveau emittiert das Elektron ein Photon. Dieser Strahlungsübergang wird als Fluoreszenz bezeichnet. Da bei der Absorption mehr Energie aufgenommen als später emittiert wird, ist das emittierte Licht langwelliger als das Anregungslicht und bildet das Emissionsspektrum. Die meisten Zellen zeigen bei der Anregung mit λ = 488 nm auch ohne Anfärbung eine gewisse Fluoreszenz. Diese Autofluoreszenz resultiert in Fluoreszenzlicht, das ungefärbte Zellen aufgrund ihrer eigenen chemischen Zusammensetzungen emittieren. Die zu analysierenden Zellen werden in einer Konzentration von 1 – 5 × 105 Zellen/mL aus dem Probengefäß angesaugt. Die Zellen passieren in einem Hüllstrom aus Flüssigkeit den Analysepunkt. Der Hüllstrom dient dazu, den Probenstrom im Zentrum der Meßküvette zu stabilisieren und so zu verengen, daß die Zellen einzeln und hintereinander zum Analysepunkt gelangen. Dieses Prinzip wird auch hydrodynamische Fokussierung genannt. Der Analysepunkt ist die wichtigste Stelle im gesamten System. Er ist definiert als der Ort, an dem der Laserstrahl (hier: Argon-Laser) den Flüssigkeitsstrahl kreuzt. Bei der Analyse der Zellen werden neben der Fluoreszenz auch Eigenschaften der Zellen wie die Zellgröße sowie deren Zellmembran, Zellkern, intrazelluläre granuläre Bestandteile und Struktur der Membranoberfläche erfaßt. Dabei ist das Vorwärtsstreulicht (FSC) hauptsächlich ein Maß für die Zellgröße, während das Rechtwinkelstreulicht (SSC) von der Dichte und der Granularität der Zellen abhängig ist. 40 3.5.2 FACS-Analyse von Zellen Direkte und indirekte Immunfluoreszenz Die Zellen wurden aus den Zellkulturflaschen geerntet und in FACS-Puffer gewaschen (Omnifuge 2.0 RS, Programm 2). Die Zelldichte wurde auf 25 × 105 Zellen/mL eingestellt. 200 µL dieser Zellsuspension wurden in Rundboden-MTP pipettiert und bei 284×g und 4 °C für 7 min zentrifugiert (Omnifuge 2.0 RS, Programm 5). Der Überstand wurde entfernt, und es erfolgte die Zugabe von 20 µL einer Primär-Antikörperlösung. Danach wurde der Ansatz für 30 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und zentrifugiert (Omnifuge 2.0 RS, Programm 5). Falls der PrimärAntikörper nicht fluoreszenzmarkiert eingesetzt wurde, ist ein weiterer Inkubationsschritt mit einem Sekundär-Antikörper notwendig, der mit Fluoreszenzmarkern (FITC, PE) versehen wurde. Dazu wurden 20 µL des Sekundär-Antikörpers zu den Zellen gegeben und 30 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal in FACS-Puffer gewaschen und mit Programm 5 der Omnifuge 2.0 RS zentrifugiert. Die Zellen wurden dann in 300 µL FACS-Puffer aufgenommen und mit Hilfe des FACSScan analysiert. Für jede zu färbende Probe wurden folgende Ansätze gemacht: 1. Zellen ohne Antikörper 2. Zellen mit Primär- und Sekundär-Antikörper 3. Zellen mit Sekundär-Antikörper (nicht erforderlich bei direktmarkierten PrimärAntikörpern) Um tote Zellpopulationen erkennen zu können, wurden die Proben vor der Analyse mit einer 1:10'000-Verdünnung einer Propidiumiodidlösung versetzt. Propidiumiodid ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der mit DNA interkaliert. Im Fall von TP-Zellen diente als Negativkontrolle immer eine Immunfluoreszenzfärbung der nicht transfizierten P388.D1, um eine eventuell stattfindende unspezifische Bindung des mAb IOT2aFITC auszuschließen. Die Auswertung erfolgte über die CellQuest-Software zur FACS-Datenauswertung. 41 Bindung von fluoresceinmarkiertem Protein an Zellen Für Bindungsstudien wurde fluoresceinmarkiertes DnaK [0.5 µg/mL] mit TP-Zellen für 15 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit FACSPuffer gewaschen und zentrifugiert (Omnifuge 2.0 RS, Programm 5). Danach erfolgte eine Fixierung der Zellen mit einer 1 %igen Paraformaldehyd/PBS-Lösung für 15 min im Dunkeln auf Eis, die der Fixierungsmethode mit Glutaraldehyd vergleichbar ist (s. Kap. 3.1.6). Nach zwei weiteren Waschschritten mit FACS-Puffer wurden die Zellen dann in 300 µL FACSPuffer aufgenommen und mit Hilfe des FACSScan analysiert. Die Auswertung erfolgte über die CellQuest-Software zur FACS-Datenauswertung. 3.5.3 Fluoreszenztest auf einem Objektträger Vorbereitung der Objektträger Für adhärent wachsende P388.D1- und TP-Zellen wurden Objektträger 1 h in einer Glasküvette mit Poly-L-Lysin-Lösung inkubiert und anschließend mit einem Papiertuch abgewischt. Zellfelder waren bereits vom Hersteller durch eine Kunststoffbeschichtung bzw. wurden durch Auftragen einer dünnen Silikonschicht mittels PAP-Pen festgelegt. Vor dem Auftragen der Zellsuspension wurden die Objektträger zur Sterilisation 10 min mit UV-Licht bestrahlt. Pro Feld wurden ca. 2×104 der zu färbenden Zellen in 50 µL Medium aufgetragen und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2-Begasung inkubiert. Färbung Der Überstand über dem Zellrasen wurde mit Hilfe einer Pasteurpipette und einer Wasserstrahlpumpe vorsichtig abgesaugt. Anschließend wurde eine Lösung von fluoreszenzmarkiertem DnaK ([DnaK]= 1- 80 µg/mL) auf die einzelnen Zellfelder aufgetropft, für 5 - 8 min bei 37 °C sedimentieren lassen und abgesaugt. Die Zellenfelder wurden mit je 20 µL Lösung 1 15 min bei RT fixiert. Die überstehende Lösung wurde abgesaugt. Danach wurde Eindeckelmedium Flouromont G auf die Zellfelder getropft und ein Deckglas luftblasenfrei aufgelegt, um ein Austrocknen der Präparate zu verhindern. Die Zellen wurden anschließend sofort mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops analysiert. 42 3.6 Enzymgebundener Immunoassay (ELISA) Die Enzymimmunoassay-Methoden, deren Abkürzung ELISA aus der Bezeichnungen Enzyme-linked immunosorbent assay herrührt, vereinen die hohe Spezifität der Antikörper mit der Empfindlichkeit einfacher spektrophotometrisch auszuwertender Enzymtests. Man benutzt Antikörper oder Antigene, an die einfach zu bestimmende Enzyme mit hoher Wechselzahl kovalent gebunden sind. In dieser Arbeit wurde die Cytokinproduktion des T-Zellklons PM-A C3 nach Stimulation (s. Kap. 3.1.7) gemessen. Dazu wurde der als „Sandwich-ELISA“ bezeichnete nichtkompetitive ELISA eingesetzt. Cytokine sind lösliche Proteine bzw. Glykoproteine, die von Leukozyten produziert werden und als chemische Vermittler zwischen den einzelnen Zellen fungieren. Viele Mitglieder dieser Familie werden sekretiert, andere werden auf der Zelloberfläche exprimiert und ein weiterer Teil dieser Familie wird in Reservoirs der extrazellulären Matrix gespeichert. Cytokine binden an spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche ihrer Zielzellen, die mit intrazellulären Signaltransduktionswegen gekoppelt sind. Die meisten Cytokine sind Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktoren und wirken in der Regel auf Zellen des hämatopoetischen Systems ein. Interferon-γ (IFN-γ) ist ein pleiotropes Cytokin, das an der Regulation von fast allen Phasen der Immunantworten beteiligt ist. Dazu zählen die Aktivierung, Wachstum und Differenzierung von T- und B-Zellen, Makrophagen, NK-Zellen und anderen Zelltypen wie Endothelzellen und Fibroblasten. IFN-γ hat selbst schwache antivirale und antiproliferative Aktivität. Der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) ist ein potenter parakriner und endokriner Mediator entzündlicher und immunologischer Prozesse. Ebenso ist bekannt, daß er bei der Regulation von Wachstum und Differenzierung verschiedener Zellen eine Rolle spielt. TNF-α wird als ein Typ-II-Membranprotein expremiert, das aufgrund einer Signaltransmembrandomäne seines Propeptides von einer Matrix-Metalloproteinase prozessiert wird und so in eine lösliche Form übergeht. TNF-α wirkt für viele transformierte Zellen (z.B. Tumorzellen) selektiv zytotoxisch, besonders in der Kombination mit IFN-γ. Alle Arbeitssschritte wurden in einer feuchten Kammer durchgeführt. Dabei wurden je 50 µL des Antikörpers (1 µg/mL in Coatingpuffer) für das gesuchte Cytokin in eine MaxiSorbMTP pipettiert und für 6 h bei RT inkubiert. Darauf folgten drei Waschschritte mit Waschpuffer unter Verwendung eines 96-Kanal-Waschgerätes. Um unspezifische Bindungen 43 der Folgeschritte zu unterbinden, wurden die Vertiefungen der MTP mit je 150 µL Blockierungslösung für 2 h bei RT inkubiert. Es folgten drei Waschschritte mit Waschpuffer. Danach wurden die erhaltenen Zellkulturüberstande aus Kap. 3.1.6 in ver-schiedenen Verdünnungen in Standardpuffer mit einem Volumen von je 50 µL auf die MTP aufgebracht. Als Positivkontrolle und zur Standardisierung der gebundenen Cytokinmengen aus den Überständen dienten rekombinant hergestellte Cytokine, die in Konzentrationen von 2 ng/mL – 15 pg/mL in Standardpuffer eingesetzt wurden. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4 °C. Anschließend wurden wiederum drei Waschschritte durchgeführt. Dann wurde durch Zugabe eines biotinylierten Antikörpers (1 µg/mL in Standardpuffer) das Cytokin unter Bildung eines „Sandwichs“ gebunden (1.5 h, RT). Es erfolgten wiederum drei Waschschritte. Durch Inkubation des Sandwich-Komplexes mit je 50 µL Alkalischer Phosphatase-markiertem Streptavidin (in TBS; 45 min, RT), dreimaligem Waschen und anschließender Zugabe von je 100 µL des Substrats PNPP (1 mg/mL in Diethanolaminpuffer) wurde die Menge an gebundenem Cytokin spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm ermittelt. Die statistische Auswertung der erhaltenen Messwerte erfolgte über die Excelsoftware. 44 4 Ergebnisse 4.1 DRB1*0401 und DRB1*0408: Unterschiede in der Präsentation eines Autoantigens 4.1.1 Die Beobachtungen von Nicolle et al. (1995) Nicolle et al. konnten zeigen, daß die komplette AChR α-Kette (r1-437) von Antigenpräsentierenden Zellen (APZ) aus dem peripheren Blut mit dem Genotyp HLA-DRB1*0401 besser präsentiert wird als von entsprechenden APZ mit dem Genotyp DRB1*0408. Dabei bestimmte die Gruppe in Oxford um A. Vincent und N. Willcox die T-Zell-Antwort des T-Zellklons PM-A C3 mittels 3H-Thymidin-Einbau (s. Kap. 3.1.6 - 9). Dies wurde für verschiedene Antigenkonzentrationen sowie für unterschiedliche APZ-Zahlen durchgeführt. Dieser T-Zellklon erkennt ein Peptid aus der Region 144 – 156 der α-Kette des AChR (Matsuo et al., 1998), sowie ein kürzeres synthetisches Peptid mit der Sequenz 138-167, das von beiden Genotypen gleich gut präsentiert wurde. I II Abbildung 4. Präsentation von Peptid p138-167 (A) und rekombinanter AChR α-Kette r1-437 (B) durch DRB1*0401- bzw. DRB1*0408-positive APZ. I zeigt die Ergebnisse für verschiedene Antigenkonzentrationen, in II sind die Daten für unterschiedliche APZ-Zahlen aufgezeichnet. In dieser Arbeit wurde eine ältere Nomenklatur für HLA-DRB1 verwendet: w4.2 entspricht DRB1*0401, w14.2 entspricht DRB1*0408. HC = Kontrollprobe eines gesunden Menschen, MG = Myasthenia gravis Patient (aus Nicolle et al., 1995). 45 In diesem System blieben einige Fragen unbeantwortet: 1. Werden Zellen aus dem peripheren Blut als APZ verwendet, so unterscheiden sie sich durch die unterschiedlichen Spender. Dabei liegen die Unterschiede nicht nur in den DRB1-Molekülen, die jeder einzelne Spender exprimiert, sondern auch in anderen Genen, die für die Antigenpräsentation wichtig sind (z.B. solche, die für Enzyme codieren) und dadurch diesen Prozeß beeinflussen können. 2. Ein Mensch produziert im Durchschnitt aus den potentiellen MHC-II-Genen verschiedene MHC-Klasse-II-Moleküle auf seinen Zellen. APZ aus dem peripheren Blut exprimieren somit nicht nur MHC-II-Komplexe, die dem HLA-DR-Locus entstammen, sondern auch solche, die HLA-DQ bzw. HLA-DP zugeordnet werden können. 3. Bei manchen Loci der MHC-Klasse-I- und die MHC-Klasse-II-Gene findet man über 100 Allele. Jedes Allel ist in der Bevölkerung unterschiedlich häufig vorhanden. Die Wahrscheinlichkeit, daß der entsprechende MHC-Locus auf beiden Chromosomen einer Person das gleiche Allel codiert, ist gering. Das heißt, die meisten Menschen sind an diesen HLA-Loci heterozygot. Somit ist die Wahrscheinlichkeit, homozygote Spender für einen bestimmten Genotyp zu finden, sehr gering. Etwa 10 % der nordeuropäischen Bevölkerung besitzen den Genotyp HLA-DRB1*0401. Dagegen findet man in weniger als 1 % der Nordeuropäer den Genotyp DRB1*0408 (Balsa et al., 2000). Die für diese Arbeit verfügbaren DRB1*0401- sowie auch die DRB1*0408positiven Spender wurden alle als heterozygot identifiziert. 4. Um genotypisch definierte APZ für weitere Versuche einsetzen zu können, versuchte die Gruppe um N. Willcox den T-Zellklon PM-A C3 mit EBV-transformierten B-Zellinien zu stimulieren. Diese Versuche schlugen für die Verwendung von langen Polypeptiden fehl, was auf eine effiziente Antigenprozessierung bzw. –präsentation durch andere „professionelle APZ“, wie Monocyten, Makrophagen oder dendritische Zellen schließen läßt (N. Willcox, persönliche Mitteilung). 5. Man kennt bis heute nur einen Teil der Aminosäuresequenz des HLA-DRB1*0408 in der konstanten Region der β-Kette (Aminosäuren 6 – 94; Robinson et al., 2001; IMGT/HLA Datenbank). Es kann daher nicht sicher gesagt werden, daß sich DRB1*0401 und DRB1*0408 nur in einer Aminosäure in Position 71 (Lys bzw. Arg) unterscheiden. Nicolle et al. (1995) schlossen aus den erhaltenen Daten, daß ein direkter Zusammenhang zwischen der Größe der eingesetzten Antigene und deren Prozessierung besteht. 46 Um die Assoziation der RA mit bestimmten DR4-Subtypen überprüfen zu können, etablierten Daubenberger et al. (1995) APZ, die einzelnen HLA-DR-Moleküle und davon abgeleitete, mutierte HLA-DR-Moleküle (Mutanten) exprimieren. Zu diesem Zweck wurde die Mausmakrophagen-ähnliche Zelline P388.D1 mit Genen transfiziert, die zum einen die α-Domäne des HLA-DRA*0101 codieren, zum anderen die Informationen für die β-Domänen für HLA-DRB1*0401 bzw. HLA-DRB1*0408 tragen. Da das zur Transfektion verwendete DRB1*0408-Gen durch gezielte Mutagenese aus einem DRB1*0401-Gen hergestellt wurde, sind beide über die gesamte β-Kette identisch und unterscheiden sich nur in einer einzigen Aminosäure. P388.D1-Zellen exprimieren im ruhenden Zustand keine MHC-Klasse-II-Moleküle der Maus auf der Zelloberfläche. Durch Induktion der Zellen mit Interferon-γ kann die Synthese von Klasse-II-Produkten sowie die für deren intrazellulären Transport wichtige Invariante Kette induziert werden. Transfizierte P388-Zellen (TP-Zellen) sind in der Lage, Proteine und Partikel aufzunehmen, diese anschließend zu prozessieren und antigenspezifische, humane T-Zellen über die Präsentation ihres Antigens durch HLA-DR-Moleküle zu stimulieren (Daubenberger et al., 1996). Diese werden in Übereinstimmung mit anderen Autoren (Bikoff et al., 1993; Viville, et al., 1994; Busch et al., 1995; Schaiff et al., 1992; Lightstone et al., 1997) in ausreichender Menge auch ohne die Invariante Kette an die Zelloberfläche gebracht. Mit diesen TP-Zellen sollte in dieser Arbeit gezeigt werden, ob der Unterschied in Position 71 der β-Kette dieser DRB1-Moleküle ausreicht, um die AChR-Kette unterschiedlich zu prozessieren und/oder zu präsentieren. 4.1.2 Vergleich der Stimulierbarkeit des Klons PM-A C3 durch humane oder murine Zellen, die das Antigen auf demselben DR-Molekül präsentieren Als Parameter für die T-Zell-Funktion wurde von Nicolle et al. (1995) die Proliferationsfähigkeit des humanen T-Zellklons PM-A C3 untersucht. Dabei machte man sich den indirekten Nachweis zu Nutze, daß T-Zellen nach Kontakt mit spezifischem Antigen zur Proliferation angeregt werden. Die Zellteilung ist mit einer Verdoppelung des DNA-Gehalts verbunden, so daß der Einbau von zugesetztem 3H-Thymidin in neusynthetisierte DNA verfolgt werden kann (s. Kap. 3.1.8). Die Vermehrung der T-Zellen beweist eine Stimulation, sagt aber nichts über die T-Zell-Funktionen aus. 47 Im Verlauf der Interaktion mit APZ und Antigen können T-Zellen verschiedene Cytokine sekretieren. Erkennt eine T-Zelle spezifisch ein (ihr) Antigen, so wird schnell die Transkription der Cytokingene induziert, und die Proteinneusynthese beginnt innerhalb einer Stunde nach der T-Zellstimulierung. Die neuentstandenen Cytokine werden dann direkt durch die Mikrovesikel des konstitutiven sekretorischen Wegs zur Stelle des Kontakts zwischen T-Zellmembran und APZ gebracht. Auf diese Weise können z.B. Pathogen-tragende Makrophagen stimuliert werden (s. Kap. 3.6). In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die Stimulation des T-Zellklons PM-A C3 anhand der Cytokinsekretion per ELISA (s. Kap. 3.6) gemessen. Es wurden die Titer für humanes IFN-γ bestimmt. 60 IFNγ [pg/mL] 50 40 TP0401 30 PBLx0401 Medium 20 10 0 0 50 100 150 200 Stunden Abbildung 5. IFN-γ-Sekretion von PM-A-Zellen nach Stimulation mit rekombinanter AChR α-Kette (r1-437) und humane DRB1*0401-positive APZ bzw. murine TP0401-Zellen. Stimulationskinetik über sechs Tage. PBLx = bestrahlte PBMC. (n = 3, MW ± 1 SD). Dieses Schaubild ist repräsentativ für zwei Experimente. Abbildung 5 zeigt, daß der T-Zellklon bei Aktivierung durch TP-Zellen nach zwei Tagen eine meßbare IFN-γ-Antwort zeigt, wohingegen im humanen System schon nach elf Stunden ein schwacher Titer detektierbar ist. Nach sieben Tagen (148 h) erreichte die Stimulation durch TP-Zellen einen Cytokintiter, der vergleichbar mit der Cytokinmenge ist, die bereits nach 96 Stunden für humane APZ gemessen wurde. Aufgrund der vorliegenden Daten wurden die Cytokintiter bei Stimulation durch humane APZ nach 48 Stunden, bei Stimulation durch TP-Zellen nach 96 Stunden bestimmt. Die nach Stimulation mit TP-Zellen erst später meßbare Cytokinantwort der PM-A-Zellen läßt sich erklären. TP-Zellen exprimieren im Gegensatz zu APZ aus dem peripheren Blut weniger HLA-DR-Moleküle auf ihrer Zelloberfläche. Somit bieten sie den PM-A-Zellen weniger 48 Möglichkeiten, mit ihren HLA-Molekülen und dem präsentierten Antigen im gleichen Maße zu interagieren wie dies für humane APZ der Fall ist. Für eine optimale Antwort benötigen T-Zellen neben MHC-Molekülen mit gebundenem Antigen noch weitere Costimulatoren. Murine Costimulatoren, die sich auf TP-Zellen befinden, können nicht unbedingt mit dem humanen T-Zellklon PM-A C3 interagieren. Daubenberger et al. (1995) konnten bereits zeigen, daß TP-Zellen nicht in der Lage sind humane T-Zellen zur Expression des hochaffinen IL-2Rezeptors zu bringen oder die Sekretion von IL-2 zu induzieren. IL-3 bzw. GM-CSF waren durch TP-Zellen induzierbar. In Folgeexperimenten wurden auch die Cytokintiter für humanes TNF-α bestimmt, um so einen weiteren Parameter für die T-Zellaktivierung zu erhalten (s. Kap. 3.6). 4.1.3 Antigenpräsentation von r1-437 durch TP0401 und TP0408: Deutliche quantitative Unterschiede in der T-Zell-Antwort Die Unterschiede in der Prozessierung bzw. Präsentation von langen Polypeptiden des AChR durch HLA-DRB1*0401- bzw. -*0408-positive APZ sollte durch den Einsatz von TP-Zellen der entsprechenden Genotypen überprüft werden. Da sich diese TP-Zellen allein in Position 71 der β-Kette ihrer DRB1-Moleküle unterscheiden, sollten die folgenden Experimente klären, ob dieser Unterschied ausreicht, um die AChR-Kette unterschiedlich zu prozessieren und/oder zu präsentieren. Die Stimulation des T-Zellklons PM-A C3 erfolgte bei verschiedenen Antigenkonzentrationen bzw. APZ-Zahlen (s. Kap. 3.1.7). Dafür wurden TP0401 bzw. TP0408-Zellen (APZ) mit der rekombinanten α-Kette r1-437 gefüttert und mit dem C3-Klon versetzt. Nach vier Tagen Inkubation wurden jeweils 150 µL Kulturüberstand abgenommen und die Cytokinsekretion des T-Zellklons per ELISA (s. Kap. 3.6) gemessen. 49 A B 600 1000 900 500 800 700 IFN- γ [p g/m L] TP0401 300 IF N- [p g/m L] 400 600 TP0408.B 5 TP0408.H2 500 P388.D1 400 200 300 200 100 100 0 0 0 500 1000 1500 2000 0 20000 40000 r1-437 [n g/m L] 60000 80000 100000 APZ-Zah len Abbildung 6. IFN-γ-Sekretion des Klons PM-A C3 nach Stimulation durch die rekombinante AChR α-Kette (r1-437) und TP0401- bzw. TP0408-Zellen. In A sind die Ergebnisse für verschiedene Antigenkonzentrationen bei einer APZ-Zahl von 30‘000, in B die Daten für unterschiedliche APZ-Zahlen bei einer Antigen-Konzentration von 1.7 µg/mL aufgezeichnet. Als Negativkontrolle dienten nicht-transfizierte P388.D1-Zellen. (n = 3, MW± 1 SD). Diese Schaubilder sind repräsentativ für drei Experimente. 2500 2300 2100 1900 TNF-α [pg/mL] 1700 1500 1300 TP0401 1100 TP0408.B5 900 P388.D1 700 500 300 100 -100 0 20000 40000 60000 80000 100000 APZ-Zahlen Abbildung 7. TNF-α-Sekretion des Klons PM-A C3 nach Stimulation durch die rekombinante AChR α-Kette (r1-437) und TP0401- bzw. TP0408-Zellen. Es sind Daten für unterschiedliche APZ-Zahlen bei einer AntigenKonzentration von 1.7 µg/mL aufgezeichnet. Als Negativkontrolle dienten nicht-transfizierte P388.D1-Zellen. (n = 3, MW ± 1 SD). Dieses Schaubild ist repräsentativ für zwei Experimente. Abbildung 6 zeigt die IFN-γ-Produktion des humanen T-Zellklons PM-A C3 als Antwort auf die rekombinante α-Kette des AChR, die von TP-Zellen prozessiert und präsentiert wurde. Der in Abbildung 6 gezeigte Trend konnte in zwei weiteren Experimenten bestätigt werden. Ergänzend wurde die Sekretion von TNF-α bei Verwendung des Antigens r1-437 gemessen. Das Schaubild in Abbildung 7 steht repräsentativ für zwei dieser Experimente. Auch hier zeigte sich, daß der Klon PM-A C3 durch TP0401-Zellen wesentlich besser stimuliert wurde als durch TP0408. 50 Murine TP0401-Zellen sind also in der Lage, durch Prozessierung bzw. Präsentation des langen, rekombinanten Polypeptids r1-437 den humanen T-Zellklon PM-A C3 besser zu stimulieren als TP0408-Zellen. Während humane DRB1*0401-positive APZ die rekombinante α-Kette des AChR (r1-437) bis zu hundertfach besser prozessieren und/oder präsentieren konnten als DRB1*0408-positive, waren im Vergleich dazu TP0401-Zellen im IFN-γ-Profil (Abb. 6 A, B) um einen Faktor von acht bis zehn bessere Präsentatoren gegenüber TP0408. Für das gezeigte TNF-α-Profil für unterschiedliche APZ-Zahlen konnte sogar eine 1700fach bessere Präsentation durch TP0401 dargestellt werden (Abb. 7). Um auszuschließen, daß der zunächst verwendete TP0408-Klon einen zusätzlichen Defekt trägt, wurden weitere Klone aus dieser Linie hergestellt und getestet. Die Abbildungen 6 A und B zeigen, daß mit verschiedenen Klonen dasselbe Ergebnis erhalten wurde. 4.1.4 Antigenpräsentation von r3-181 durch TP0401 und TP0408 Um zu prüfen, ob auch Unterschiede in der Prozessierung und Präsentation von kürzeren Polypeptiden des AChR bestehen, wurde der T-Zellklon PM-A C3 mit dem rekombinanten r3-181 und mit TP0401- bzw. TP0408-Zellen versetzt. Die Stimulation erfolgte bei verschiedenen Antigenkonzentrationen bzw. APZ-Zahlen (s. Kap. 3.1.7). Nach vier Tagen Inkubation wurden jeweils 150 µL Kulturüberstand abgenommen und die Cytokinsekretion des T-Zellklons per ELISA (s. Kap. 3.6) gemessen. B A 2400 1800 2200 1600 2000 1400 1800 [pg/ mL] 1600 1000 800 IF N- IFN- [pg/m L] 1200 TP0401 1400 TP0408.B5 1200 TP0408.H2 1000 600 800 400 600 P 388.D1 400 200 200 0 0 0 2000 4000 6000 8000 r3-181 [ng /mL] 10000 12000 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 APZ-Zahle n Abbildung 8. IFN-γ-Sekretion des Klons PM-A C3 nach Stimulation durch Peptid r3-181 und TP0401- bzw. TP0408-Zellen. In A sind die Ergebnisse für verschiedene Antigenkonzentrationen bei einer APZ-Zahl von 10‘000, in B die Daten für unterschiedliche APZ-Zahlen bei einer Antigen-Konzentration von 10 µg/mL aufgezeichnet. Als Negativkontrolle dienten nicht-transfizierte P388.D1-Zellen. (n = 3, MW ± 1 SD). Diese Schaubilder sind repräsentativ für drei Experimente. 51 A B 700 1600 1400 600 1200 [pg/mL] 400 300 T NF- T NF - [pg/ mL] 500 1000 TP0401 800 TP0408.B5 TP0408.H2 600 P388.D1 200 400 100 200 0 0 0 2000 4000 6000 8000 r3-18 1 [n g/m L] 10000 12000 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 APZ-Zahlen Abbildung 9. TNF-α-Sekretion des Klons PM-A C3 nach Stimulation durch Peptid r3-181 und TP0401- bzw. TP0408-Zellen. In A sind die Ergebnisse für verschiedene Antigenkonzentrationen bei einer APZ-Zahl von 10‘000, in B die Daten für unterschiedliche APZ-Zahlen bei einer Antigen-Konzentration von 10 µg/mL aufgezeichnet. Als Negativkontrolle dienten nicht-transfizierte P388.D1-Zellen. (n = 3, MW ± 1 SD). Diese Schaubilder sind repräsentativ für drei Experimente. Abbildungen 8 und 9 zeigen die Cytokinproduktionen des Klons PM-A C3 als Antwort auf das kürzere rekombinante Polypeptid r3-181, das von TP-Zellen prozessiert und präsentiert wurde. Die Schaubilder repräsentieren die Tendenzen von drei Experimenten. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit r1-437 als Antigen, wurde r3-181 von TP0401 und TP0408 nicht unterschiedlich behandelt, was zu T-Zell-Antworten meist vergleichbarer Größe führte. Ein Unterschied in der Präsentation von r3-181 war nur für niedrige Antigenkonzentrationen [≤ 2‘000 ng/mL] zu beobachten. Dabei zeigten sich TP0401-Zellen sowohl für die IFN-γ- sowie TNF-α-Produktion im Vergleich zu TP0408 als bessere Präsentatoren (Faktor zwei; Abb. 8 A, 9 A). Für größere Antigendosen wurde allerdings kein Unterschied zwischen TP0401- und TP0408-Zellen beobachtet. Dies ließ sich auch für gleichbleibende Antigenkonzentration und verschiedene APZ-Zahlen zeigen (Abb. 8 B, 9 B). 4.2 Kontrollversuche zur unterschiedlichen Prozessierung bzw. Präsentation von Polypeptid r1-437 durch TP-Zellen Da sich TP-Zellen nur durch ihre HLA-DR-Moleküle unterscheiden, sollte im folgenden gezeigt werden, wie das Phänomen der unterschiedlichen Prozessierung von langen Polypeptiden zu erklären ist. 52 4.2.1 Antigenbindungsstudien an TP-Zellen Um untersuchen zu können, ob kleinere Peptide, die das eigentliche T-Zell-Epitop darstellen, unterschiedlich stark in den Peptidbindungsgruben der HLA-Moleküle DRB1*0401 bzw. DRB1*0408 binden, wurde die Bindung der Antigene indirekt über die T-Zell-Aktivierung bestimmt. Dafür wurden die TP-Zellen zuvor mit Glutaraldehyd-Lösung fixiert und mit dem synthetischen Peptid p144-163 [10 µg/mL] vorinkubiert (s. Kap. 3.1.6). Nach zwei Tagen erfolgte die Bestimmung der Cytokintiter. 90 80 IFN-γ [pg/mL] 70 60 TP0401 TP0408.B5 Medium 50 40 30 20 10 0 unbehandelt Glutaraldehyd-fixiert Abbildung 10. IFN-γ-Sekretion des humanen T-Zellklons PM-A C3 auf p144-163. Antigen-präsentierende TP-Zellen wurden zuvor mit Glutaraldehyd fixiert (rechts); links zum Vergleich die Ergebnisse von unbehandelten TP-Zellen. (n = 3, MW ± 1 SD). Dieses Schaubild ist repräsentativ für zwei Experimente. Abbildung 10 zeigt, daß unbehandelte TP0408-Zellen annähernd gleich starke Cytokinausschüttungen des C3-Klons hervorriefen wie TP0401-Zellen. Die Glutaraldehyd-Fixierung von Zellen (s. Kap. 3.1.6) bietet den Vorteil, daß eine Aufnahme von Antigen und dessen intrazelluläre Prozessierung unterbunden wird. Dadurch wird die Präsentation von später zugegebenen Peptiden auf diejenigen Peptide begrenzt, die tatsächlich über einen Austausch von Peptiden an MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche binden können. Somit können Experimente mit fixierten Bindungsaffinität herangezogen werden. Zellen zur quantitativen Analyse der 53 Für fixierte Zellen konnte eine um den Faktor zwei bessere Präsentation des synthetischen Peptids p144-163 durch TP0408 beobachtet werden (Abb. 10). Dies läßt den Schluß zu, daß sich HLA-DRB1*0401 und DRB1*0408 in ihren Bindungsaffinitäten für Peptide des AChR nicht grundsätzlich unterscheiden. Der zuvor beobachtete Unterschied in der Prozessierung bzw. Präsentation von langen Polypeptiden oder Proteinen (s. Kap. 4.1.1 und 4.1.2) läßt sich somit nicht auf unterschiedliche Bindungseigenschaften der hier betrachteten HLA-DR4Subtypen zurückführen. Vergleicht man in Abbildung 10 die Cytokintiter unbehandelter APZ mit denen Glutaraldehydfixierter Zellen, so konnte für unbehandelte TP-Zellen eine schwächere T-Zellaktivierung demonstriert werden. Dies ist darauf zurückzuführen, daß unbehandelte TP-Zellen in der Lage sind, Peptide zu verdauen, so daß nach Prozessierung nur ein Teil der eingesetzten Antigenmenge im Komplex mit HLA-DR-Molekülen auf der Zelloberfläche von TP-Zellen präsentiert wird. Versuche mit unbehandelten Zellen können deshalb nicht zur Bestimmung von Bindungsaffinitäten zwischen Peptid und MHC-Molekül herangezogen werden. 4.2.2 Expression von HLA-DR-Molekülen auf der Oberfläche von TP-Zellen TP-Zellen unterscheiden sich nur durch die HLA-DR-Gene, mit denen sie transfiziert wurden. Daubenberger et al. (1996) zeigten mittels FACS-Analyse und mRNA-Studien bereits, daß die Expression von HLA-DR-Molekülen und deren Vorkommen auf den Zelloberflächen der etablierten TP-Zellinien untereinander vergleichbar sind. In der vorliegenden Arbeit wurde vor und teilweise auch nach jedem funktionellen Experiment (s. Kap. 4.1.2) die Oberflächenexpression von HLA-DR-Molekülen, wie in Kap. 3.5.2 beschrieben, mittels FACS-Analyse überprüft. Dabei konnten HLA-DR-Moleküle auf der Zelloberfläche spezifisch mit dem monoklonalen Mausantikörper IOT2aFITC nachgewiesen werden. 54 Abbildung 11. HLA-DR-Expression von verschiedenen TP-Zellen. FL1-Height zeigt die Fluoreszenzintensität des durch Laserbeschuß angeregten FITC-Moleküls; counts steht für die im Zeitraum der Messung erhaltenen Fluoreszenzereignisse. Die gestrichelten Linien zeigen die getesteten TP-Zellen (⋅−⋅ TP0401, Geometrisches Mittel: 54.73; −−− TP0408.B5, Geom. Mittel: 50.82; --- TP0408.H2, Geom. Mittel: 41.66). Als Negativkontrolle diente die nicht-transfizierte P388.D1-Linie ( P388.D1, Geom. Mittel: 5.00). Die Daten wurden mit dem Programm CellQuest ausgewertet. Vergleicht man die verschiedenen FACS-Analysen von TP0401- und TP0408-Zellen (Abb. 11), so wird deutlich, daß die HLA-DR-Expressionen ähnlich sind. 4.2.3 Wachstumskinetik von TP-Zellen Um Unterschiede in der Zellproliferation der einzelnen TP-Zelltypen ausschließen zu können, wurden diese in unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen ausgesät und wie in Kap. 3.1.8 beschrieben mit 3H-Thymidin gepulst. Das Wachstum der Zellen wurde über einen Zeitraum von vier Tagen verfolgt. 55 3 H-Thymidin-Inkorporation (in 103 cpm) Wachstumszeitraum 24 h 48 h 72 h 96 h 26 ± 4 81 ± 23 96 ± 63 164 ± 23 TP0408.B5 8±2 20 ± 4 74 ± 4 170 ± 25 TP0408.H2 11 ± 4 21 ± 18 59 ± 45 192 ± 11 TP0401 62 ± 14 140 ± 18 113 ± 28 259 ± 7 TP0408.B5 30 ± 3 103 ± 6 125 ± 23 120 ± 19 TP0408.H2 28 ± 11 106 ± 12 117 ± 5 132 ± 45 0.07 ± 0.03 0.06 ± 0.02 A. 10‘000 Zellen TP0401 B. 30‘000 Zellen Medium 0.09 ± 0.04 0.08 ± 0.02 Tabelle 5. DNA-Synthese von TP0401- und TP0408-Zellen über einen Zeitraum von vier Tagen. Gezeigt wird der 3H-Thymidin-Einbau ausgehend von verschiedenen Ausgangszellzahlen (A 10'000 Zellen, B 30'000 Zellen). Als Negativkontrolle diente Kulturmedium alleine. (n = 4, MW ± 1 SD) Tabelle 5 zeigt die DNA-Synthese von TP-Zellen über einen Zeitraum von vier Tagen. Die TP-Zellen wurden in Zellzahlen ausgesät, die mit den Experimenten in Kap. 4.1.3 vergleichbar sind. Für TP0401 konnte innerhalb der ersten 48 h sowohl für eine Ausgangszellzahl von 10'000 als auch für 30'000 ein 3H-Thymidineinbau in neusynthetisierte DNA beobachtet werden. Dieser stagnierte am dritten Tag der Kultivierung (72 h). Nach 96 h schließlich konnte wiederum eine Verdoppelung der 3H-Thymidin-haltigen DNA von TP0401-Zellen gezeigt werden. Für die untersuchten Klone TP0408.B5 und H2 wurde ähnliches Wachstumsverhalten beobachtet. Da der Einbau von 3H-Thymidin lediglich einen Einblick in die DNA-Synthese gibt, wurden zusätzlich TP-Zellen wie in Kap. 3.1.5 beschrieben in Zellkulturgefäßen mit einer Kulturoberfläche von 25 cm² ausgesät und über einen Zeitraum von vier Tagen kultiviert. Die Zellen wurden im Abstand von 24 h aus dem jeweiligen Kulturgefäß geerntet und die Zellzahl wie in Kap. 3.1.2 bestimmt. 56 10000000 Zellzahl 1000000 TP0401 TP0408.B5 100000 10000 0 25 50 75 100 Stunden Abbildung 12. Wachstumszahlen von TP-Zellen über den Zeitraum von vier Tagen. Die Kultivierung einer Ausgangszellzahl von 150'000 für TP0401 und 120'000 für TP0408.B5 erfolgte in Zellkulturgefäßen mit einer Kul-turoberfläche von 25 cm². Bestimmung der Zellzahlen nach Trypanblaufärbung (s. Kap. 3.1.2). (n = 4, MW ± 1 SD) Abbildung 12 zeigt die Wachstumskurven von TP-Zellen. Obwohl TP0401-Zellen in einer höheren Ausgangskonzentration eingesetzt wurden, demonstrieren die erhaltenen Zellzahlen, daß es keinen signifikanten Unterschied im Wachstum der TP-Zellen gab. Anhand der erhaltenen Daten zur Wachstumskinetik von TP-Zellen kann gefolgert werden, daß die Unterschiede in der Präsentation von Polypeptid r1-437 des humanen AChR nicht auf ein unterschiedliches Wachstum der eingesetzten TP-Zellen zurückzuführen ist. TP-Zellen wurden zu Beginn eines jeden Experimentes in gleichen Zellzahlen ausgesät. Wie in Kap. 4.2.2 gezeigt, sind sie darüberhinaus auch in der Lage, vergleichbare Mengen der entsprechenden HLA-DR-Moleküle zu exprimieren. Deshalb liegt die Schlußfolgerung nahe, daß die unterschiedliche Stimulation des humanen T-Zellklons PM-A C3 durch das Antigen r1-437 im Kontext mit HLA-DRB1*0401 bzw. -*0408 innerhalb der betrachteten Zeiträume von der Antigenprozessierung und/oder Antigenpräsentation abhängig ist. Um TP0401- und TP0408-Zellen in ihren Eigenschaften als Antigen-präsentierende Zellen ganz allgemein zu vergleichen, wurden bereits von Daubenberger et al. (1996) Experimente mit anderen Antigenen durchgeführt. Dazu wurden z. B. Pepsin-spezifische T-Zellklone mit TP-Zellen im Vergleich zu EBV-transformierten lymphoblastoiden Zellinien der entsprechenden HLA-DR4-Subtypen und Pepsin als Antigen aktiviert. Dabei konnte kein Unterschied zwischen den verwendeten APZ beobachtet werden. Bezogen auf die in dieser Arbeit verwendeten TP-Zellen, kann für TP0408 nicht davon ausgegangen werden, daß im Vergleich zu TP0401 generell immer Unterschiede in der T-Zell-Aktivierung auftreten. 57 4.3 Interaktionspartner der HLA-DR-Moleküle MHC-Klasse-II-Moleküle werden im exogenen Antigenprozessierungsweg (s. Kap. 1.3) im Komplex mit Invarianter Kette vom Endoplasmatischen Reticulum (ER) zu den entsprechenden MIIC-Kompartimenten transportiert. Die Invariante Kette stabilisiert so lange das Heterodimer aus MHC-Klasse-II α- und β-Ketten, bis sie durch Proteasen in den Endosomen abgespalten wird und das resultierende CLIP-Peptid durch ein anderes ersetzt wird. Murine P388.D1-Zellen, die Mutterzellinie der TP-Zellen, exprimieren im unstimulierten Zustand weder MHC-Klasse-II-Moleküle der Maus noch die Invariante Kette. Da HLA-DRMoleküle auch auf TP-Zelloberflächen zu detektieren sind, wenn sich die Zellen in einem unstimulierten oder ruhenden Zustand befinden, muß man annehmen, daß die transfizierten HLA-DR-Moleküle auch ohne die Invariante Kette an die Zelloberfläche gelangen. In der Literatur (Bikoff et al., 1993; Viville, et al., 1994; Busch et al., 1995; Schaiff et al., 1992; Lightstone et al., 1997) findet man Hinweise darauf, daß auch normalerweise ein Teil der MHC-Klasse-II-Moleküle ohne Invariante Kette ihren Weg an die Oberflächen von APZ findet. Für die in dieser Arbeit eingesetzten TP-Zellen und deren HLA-Expression bedeutet dies, daß die Invariante Kette keine Rolle spielt, da diese im uninduzierten Zustand nicht vorhanden ist. Weiterhin stellt sich hier die Frage, ob in TP-Zellen humane MHC-Klasse-II-Moleküle im unstimulierten Zustand mit der Invarianten Kette der Maus interagieren können. Sette et al. (1995) zeigten anhand von Inhibitionsexperimenten, daß sowohl humane als auch murine Invariante Kette bzw. die nach Proteaseverdau entstandenen CLIP-Peptide an Klasse-IIMoleküle beider Spezies binden können. Kinetik der Stimulation von TP-Zellen mit rekombinantem Maus-IFN-γ Durch IFN-γ (s. auch Kap. 3.6) wird die Expression der Gene induziert, die für α- und βKetten von MHC-II-Molekülen codieren sowie weiterer an der Antigenprozessierung beteiligter Proteine wie z.B. der Invarianten Kette. Um die Beteiligung der Invarianten Kette der Maus untersuchen zu können, wurden TP-Zellen wie in Kap. 3.1.7 beschrieben mit rekombinantem Maus-IFN-γ über drei Tage stimuliert. 58 A B Abbildung 13. Expression von humanen und endogenen MHC-Klasse-II-Molekülen auf TP0401-Zellen nach Stimulation mit murinem IFN-γ über einen Zeitraum von drei Tagen. Auf der linken Seite sind die Daten für die Stimulation der TP-Zellen mit 100 U/mL rekombinantem Maus-IFN-γ, auf der rechten Seite entsprechend die unstimulierten Zellen dargestellt. In A ist die Expression von HLA-DRB1*0401-Molekülen, in B die Expression von endogenen Maus-MHC-II-Molekülen I-Ad auf der Zelloberfläche dargestellt. (grauunterlegt: Eigenfluoreszenz der TP0401-Zellen; Färbung nach 24 h; --- Färbung nach 48 h; −⋅−⋅ Färbung nach 72 h). FL1-Height zeigt die Intensität der Fluoreszenz des durch Laserbeschuß angeregten FITC-Moleküls; counts steht für die im Zeitraum der Messung erhaltenen Fluoreszenzereignisse. (n = 3) 59 A B Abbildung 14. Expression von humanen und endogenen MHC-Klasse-II-Molekülen auf TP0408.B5-Zellen nach Stimulation mit murinem IFN-γ über einen Zeitraum von drei Tagen. Auf der linken Seite sind die Daten für die Stimulation der TP-Zellen mit 100 U/mL rekombinantem Maus-IFN-γ, auf der rechten Seite entsprechend die unstimulierten Zellen dargestellt. In A ist die Expression von HLA-DRB1*0408-Molekülen, in B die Expression von endogenen Maus-MHC-II-Molekülen I-Ad auf der Zelloberfläche dargestellt. (grauunterlegt: Eigenfluoreszenz der TP0401-Zellen; Färbung nach 24 h; --- Färbung nach 48 h; −⋅−⋅ Färbung nach 72 h). FL1-Height zeigt die Intensität der Fluoreszenz des durch Laserbeschuß angeregten FITC-Moleküls; counts steht für die im Zeitraum der Messung erhaltenen Fluoreszenzereignisse. (n = 3) Abbildung 13 zeigt eine Erhöhung der Fluoreszenzintnsität und somit der Zahl an HLA-DRMolekülen auf der Oberfläche von TP0401-Zellen in Abhängigkeit von der Zeit und nach Stimulation mit 100 U/mL rekombinantem Maus-IFN-γ. Als interne Kontrolle des Systems diente dabei die Expression von endogenen MHC-Molekülen der Maus auf der Zelloberfläche von TP-Zellen, die erst nach Stimulation mit IFN-γ dort exprimiert wurden. Bei TP0408.B5Zellen konnten übereinstimmende Daten für die Stimulation mit rekombinantem Maus-IFN-γ erhalten werden (Abb. 14 A, B). 60 Stimulation des humanen T-Zellklons PM-A C3 mit IFN-γ-induzierten TP-Zellen Unter Maus-IFN-γ-Zusatz im Kulturmedium wurden die so stimulierten TP-Zellen zum PM-A C3-Klon gegeben (s. Kap. 3.1.7). Nach vier Tagen erfolgte die Bestimmung der Cytokintiter. B A 6000 4500 4000 5000 3500 4000 [pg/m L] 2500 TP0401 TP0408.B5 3000 P388. D1 IF N- IFN- [pg/ml] 3000 2000 2000 1500 1000 1000 500 0 0 0 5000 10000 15000 r1-437 [ng/mL] 20000 25000 0 20000 40000 60000 80000 100000 APZ Za hle n Abbildung 15. Präsentation von rekombinanter AChR α-Kette (r1-437) durch IFN-γ-induzierte TP0401- bzw. TP0408-Zellen in Gegenwart von muriner Invarianter Kette. In A sind die Ergebnisse für verschiedene Antigenkonzentrationen und einer Ausgangszellzahl von 20'000 APZ, in B die Daten für unterschiedliche APZZahlen dargestellt. Gemessen wurde die IFN-γ-Produktion des humanen T-Zellklons PM-A C3. Als Negativkontrolle dienten nicht-transfizierte P388.D1-Zellen (in B abgebildet). (n = 3, MW ± 1 SD). Das Schaubild ist repräsentativ für zwei Experimente. Auch hier konnte für TP0401-Zellen im Vergleich zu TP0408-Zellen eine bessere Stimulation des humanen T-Zellklons PM-A C3 nachgewiesen werden. Durch die erhöhte HLA-Expression auf der Zelloberfläche von IFN-γ-induzierten TP-Zellen konnte eine um den Faktor 5 höhere Stimulation des T-Zellklons im Vergleich zu gleichzeitig getesteten uninduzierten TP-Zellen (vgl. Kap. 4.1.3) erzielt werden. Der Unterschied in der Präsentation von der α-Kette des AChR r1-437 durch TP0401- bzw. TP0408-Zellen war in beiden Fällen gleich groß. Da der Cytokin-ELISA (Kap. 3.6) spezifisch für humanes IFN-γ ist, das der T-Zellklon PM-A C3 sekretiert, lassen sich hier störende Antikörperreaktionen mit dem rekombinanten MausIFN-γ aus den Zellkulturüberständen ausschließen. Auch konnte im Experiment keine Stimulation des humanen T-Zellklons durch zugesetztes Maus-IFN-γ detektiert werden (nicht gezeigt). Das humane IFN-γ dagegen induziert nicht die murinen Zellen. 61 Die Ähnlichkeit der Cytokinprofile der T-Zellaktivierung durch IFN-γ-induzierte sowie nichtinduzierte TP-Zellen verdeutlicht, daß der gravierende Unterschied in der Prozessierung/Präsentation durch DRB1*0401- und DRB1*0408-positive APZ auch bei Anwesenheit von Invarianter Kette bestehen blieb. Dies läßt den Schluß zu, daß der beobachtete Unterschied nicht auf die Beteiligung von Invarianter Kette zurückgeführt werden kann. 4.4 Zusammenfassung I In der hier vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß das lange, rekombinant hergestellte Polypeptid r1-437 von TP-Zellen mit DRB1*0401 besser prozessiert bzw. präsentiert wird als von TP-Zellen mit DRB1*0408, die sich in nur einer einzigen Aminosäure von TP0401-Zellen unterscheiden. Dieser Unterschied war bei Verwendung des kurzen Polypeptides r3-181 kaum noch zu beobachten. Das kurze synthetische Peptid p144-163, welches das eigentliche T-ZellEpitop repräsentiert, konnte an DRB1*0408 auf fixierten Zellen sogar besser binden als an DRB1*0401. Für das in dieser Arbeit betrachtete System wurde zunächst folgende Schlußfolgerung gezogen: Je länger die Sequenz der Peptide wird, um so größer werden die Unterschiede in den T-Zell-Antworten, die durch Zellen der Genotypen HLA-DRB1*0401 und DRB1*0408 hervorgerufen werden. Die Aktivierung des T-Zellklons PM-A C3 durch TP-Zellen plus Antigen wurde zum ersten Mal durch Sekretion der Cytokine IFN-γ und TNF-α bestimmt. Kontrollversuche demonstrierten für die TP0401- und TP0408-Zellen: • Stärkere Bindungsaffinitäten des synthetischen Peptides p144-163 des humanen AChR an HLA-DRB1*0408 im Vergleich zu -*0401 (s. Kap. 4.2.1), • gleiche Expression von HLA-DR-Molekülen auf der Zelloberfläche (s. Kap. 4.2.2), • ähnliches Wachstumsverhalten der Zellen über einen längeren Zeitraum (s. Kap. 4.2.3), • Anstieg der Expression von HLA-Molekülen auf der Zelloberfläche nach Stimulation mit rekombinantem Maus-IFN-γ über mehrere Tage (s. Kap. 4.3). Der Einsatz von IFN-γ-induzierten TP-Zellen ergab eine höhere Cytokinproduktion mit ähnlichen Profilen der T-Zell-Antwort wie zuvor für uninduzierte TP-Zellen. Die 62 ausgeschüttete Menge an Cytokinen konnte durch den Einsatz von rekombinantem Maus-IFNγ auf das Fünffache erhöht werden (s. Kap. 4.3). Eine direkte Beteiligung von Invarianter Kette, die am intrazellulären Transport der MHCMoleküle beteiligt ist und deren Produktion mit Maus-IFN-γ in TP-Zellen induziert wird, konnte ausgeschlossen werden, da die T-Zellstimulationen beim Einsatz induzierter sowie nicht-induzierter TP-Zellen einen ähnlichen Verlauf nahmen (s. Kap. 4.3). Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß die Unterschiede der Prozessierung/Präsentation von langen Polypeptiden bzw. Proteinen durch Zellen der Genotypen DRB1*0401 bzw. -*0408 tatsächlich auf den Austausch einer einzigen Aminosäure in der β-Kette dieser HLA-DRMoleküle zurückzuführen sind. 4.5 Biochemische Untersuchungen zur Prozessierung der AChR-Kette 4.5.1 Analyse der rekombinanten Antigenpräparationen Die Polypeptide r3-181 und r1-437, die Teile der α-Untereinheit des AChR darstellen, wurden rekombinant in E. coli hergestellt (s. Kap. 2.4; Beeson et al., 1989). Dabei wurden diese Polypeptide über Einschlußkörper isoliert und präpariert. Einschlußkörper sind Konglomerate aus Hitzeschockproteinen und falsch gefalteten bzw. denaturierten Proteinen. Daher erschien es sinnvoll, diese Polypeptide auf mögliche Verunreinigungen mit E. coli-Hitzeschockproteinen mittels SDS-PAGE und Western Blot-Technik zu untersuchen. Die Analyse mittels diskontinuierlicher SDS-PAGE (s. Kap. 3.3.4) mit anschließender Coomassie Brillant Blue-Färbung ergab, daß r3-181 einen hohen Reinheitsgrad besaß. Dagegen konnte man für das Polypeptid r1-437 mehrere Banden detektieren (Abb. 16). 63 M r [kDa] 1 2 3 4 104 DnaK → r1-437 → 81 47.7 34.6 r3-181 → 28.3 19.2 + Bahn 1: Bahn 2: Bahn 3: Bahn 4: LMW DnaK [0.1 µg/mL], Firma StressGen r1-437 r3-181 Abbildung 16. SDS-PAGE zur Analyse der Reinheit der rekombinanten Polypeptidpräparationen r3-181 und r1-437. Mittels Western Blot-Analyse (s. Kap.3.3.6) wurde auf die E. coli-Hitzeschockproteine DnaK und DnaJ mit entsprechenden Antikörpern (s. Kap. 2.2) getestet. Auch hier konnten wie zuvor in der SDS-PAGE keine Verunreinigungen des r3-181 nachgewiesen werden. Die Analyse der rekombinanten α-Kette des AChR r1-437 zeigte die Präsenz von DnaK (Abb. 16, Bahn 4) und in geringen Mengen auch von DnaJ (Abb. 16, Bahn 9). 64 1 2 3 4 Mr [kDa] 6 7 8 9 104 81 DnaK → DnaJ → 47.7 34.6 28.3 Bahn 1, 3: Bahn 2, 4: Bahn 5: Bahn 6, 8: Bahn 7, 9: DnaK [0.5 µg/mL] r1-437 LMW DnaJ [1.135 µg/mL], Firma StressGen r1-437 Abbildung 17. Western Blot zur Analyse der Reinheit der rekombinanten Polypeptidpräparation r1-437. Die Bahnen 3 und 4 wurden mit anti-DnaK, die Bahnen 7 und 8 mit anti-DnaJ als Primärantikörper inkubiert (s. Kap. 3.3.6). Die Bahnen 1 und 2 bzw. 6 und 7 wurden als Negativkontrolle für die Detektionsantikörperreaktionen verwandt. Durch Auftragen von 4 ng DnaK als Referenz (Abb. 16, Bahn 2; Abb. 17, Bahn 3) konnte der DnaK-Gehalt der Präparation r1-437 mittels optischer Auswertung auf maximal 0.1 µg/mL bestimmt werden (Software NIH Image 1.59). Für die Detektion von E. coli DnaJ wurde ein polyklonales Kaninchenserum verwendet. Wie die meisten Seren dieser Art band es an viele unspezifische Banden, die in der Präparation von r1-437 vorhanden waren (Abb. 17, Bahn 7 und 8). 4.5.2 Depletion von DnaK aus der Präparation r1-437 Zur Depletion von E. coli DnaK wurde die rekombinante Proteinpräparation r1-437 mittels Affinitätschromatographie an einer ATP-Agarose gereinigt (s. Kap. 3.2.3). Hierbei macht man sich wie in Kap.1.4 (siehe auch Abb. 3) beschrieben zu Nutze, daß DnaK bei Zugabe von ATP gebundene Peptide bzw. Proteine aus seiner Peptidbindungstasche entläßt. Abbildung 18 zeigt ein Beispiel einer Depletion von r1-437. 65 Mr [kDa] 2 3 4 194 120 DnaK → 87 64 52 39 26 Bahn 1: Bahn 2: Bahn 3: Bahn 4: + LMW r1-437 r1-437 nach Affinitätschromatographie an ATP-Agarose DnaK [0.5 µg/mL], Firma StressGen Abbildung 18. Western Blot zur Analyse der Reinheit der rekombinanten Polypeptidpräparationen r1-437 vor (Bahn 2) und nach Reinigung (Bahn 3) an ATP-Agarose. Zur spezifischen Detektion von DnaK wurde anti-DnaK und der entsprechende HRPO-markierte Detektionsantikörper eingesetzt (s. Kap. 2.2). 4.5.3 Antigenpräsentation von DnaK-freien Polypeptiden r1-381 und r1-437 durch humane oder murine Zellen, die das Antigen auf demselben DR-Molekül präsentieren Um nachzuweisen, ob nach DnaK-Depletion aus r1-437 der T-Zellklon PM-A C3 stimuliert werden kann, wurde die Präparation aus Kap. 4.5.2 in einer Konzentration von 10 µg/mL unter Verwendung von TP-Zellen und humanen APZ eingesetzt. Als positiver Vergleich der T-Zellantwort dienten verschiedene Konzentrationen an rekombinantem Polypeptid r3-181, das keine Verunreinigungen enthielt (s. Kap. 4.5.1). nach vier Tagen Inkubation wurden jeweils 150 µL Kulturüberstand abgenommen und die Cytokinsekretion des T-Zellklons per ELISA (s. Kap. 3.6) gemessen. Für die Stimulation mit humanen APZ wurde zusätzlich noch die Proliferation von PM-A C3 gemessen (s. Kap 3.1.8) 66 A B r3-181 [21 ng/mL] r3-181 [21 ng/mL] TP0408 r3-181 [42 ng/mL] r3-181 [42 ng/mL] PBLx 0408 TP0401 PBLx 0401 r3-181 [84 ng/mL] r3-181 [84 ng/mL] DnaK-freies r1-437 DnaK-freies r1-437 0 500 1000 1500 IFN-γ [pg/mL] 2000 2500 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 3 H-Thymidin [cpm] Abbildung 19. Präsentation von DnaK-freier AChR α-Kette (r1-437, [10 µg/mL]) und verschiedenen Konzentrationen des kurzen Polypeptides r3-181 durch DRB1*0401- oder DRB1*0408-positive APZ. (A) IFN-γSekretion des humanen T-Zellklons PM-A C3 nach Stimulation durch TP-Zellen. (B) Proliferation des Klons PM-A C3 nach Stimulation durch humane APZ. PBLx = bestrahlte PBMC. (n = 1, MW ± 1 SD). Abbildung 19 zeigt, daß der T-Zellklon durch die DnaK-freie Präparation von r1-437 effizient stimuliert wurde. Auch nach Entfernen von DnaK aus der Antigenlösung wurde das lange Polypeptid r1-437 besser durch DRB1*0401-positive als durch DRB1*0408-positive APZ präsentiert. TP0401 waren im Vergleich zu TP0408 um einen Faktor zwei bessere Präsentatoren. Dagegen reagierte der Klon PM-A C3 empfindlicher auf die Unterschiede der Präsentation durch humane APZ. Hier konnte für DRB1*0401-positive APZ im Vergleich zu DRB1*0408-positiven APZ eine um den Faktor zehn bessere Präsentation des DnaK-freien r1-437 beobachtet werden. Für die unterschiedlichen Konzentration des reinen Polypeptides r3-181 wurde ein ähnliches Stimulationsverhalten für PM-A C3 gezeigt. 4.6 Einfluß von DnaK auf die Prozessierung/Präsentation von r1-437 4.6.1 Depletionsversuche Die Stimulation des T-Zellklons PM-A C3 erfolgte sowohl mit der in Kap. 4.4.2 gereinigten Präparation von r1-437 unter Verwendung von TP-Zellen als auch mit humanen APZ (s. Kap. 3.1.7). Dafür wurden die APZ mit dem gereinigten Peptid r1-437 gefüttert und mit dem C3Klon versetzt. Nach vier Tagen Inkubation wurden jeweils 150 µL Kulturüberstand abgenommen und die Cytokinsekretion des T-Zellklons per ELISA (s. Kap. 3.6) gemessen. Für die Stimulation mit humanen APZ wurde zusätzlich noch die Proliferation von PM-A C3 gemessen (s. Kap. 3.1.8). 67 A B P B Lx 0 40 8 T P 0 4 0 8 .B 5 T -Z e lle n + A P Z D n a K - f r e ie s r 1 - 4 3 7 D na K -f r e ie s r 1 - 4 3 7 r1 -43 7 r1-437 P B Lx 0 40 1 T P040 1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 IF N - γ [ p g /m L ] 1 0000 2 0000 3 3 0000 4 0000 5 0000 6 0000 7 0000 H - T h ym i d i n [ c p m ] Abbildung 20. Präsentation von DnaK-freier AChR α-Kette (r1-437) durch DRB1*0401- oder DRB1*0408positive APZ. (A) IFN-γ-Sekretion des humanen T-Zellklons PM-A C3 nach Stimulation durch TP-Zellen. (B) Proliferation des Klons PM-A C3 nach Stimulation durch humane APZ. PBLx = bestrahlte PBMC. (n = 3, MW ± 1 SD). Diese Schaubilder sind repräsentativ für vier Experimente. Abbildung 20 zeigt einen starken Abfall der T-Zell-Antwort des Klons PM-A C3, wenn dieser sowohl durch APZ des Genotyps HLA-DRB1*0401 als auch durch -*0408 mit DnaK-freiem r1-437 stimuliert wurde. Bei der Untersuchung der Cytokintiter nach Stimulation mit TP-Zellen und DnaK-freiem r1-437 kann sowohl für TP0401 als auch für TP0408 eine geringere Cytokinausschüttung beobachtet werden. Im humanen System nehmen die 3HThymidin-Einbauraten von PM-A C3 nach Stimulation mit gereinigtem r1-437 und *0401positiven APZ ab. Gleiches gilt für *0408-positive APZ im Vergleich zu DnaK-haltigem Polypeptid. Diese Resultate demonstrieren sehr deutlich, daß DnaK für das Prozessieren/Präsentieren von großen Polypeptiden eine essentielle Rolle spielt. Jedoch bleibt der Unterschied zwischen DRB1*0401 und DRB1*0408 bei Verwendung von DnaK-freiem r1-437 und TP-Zellen bestehen. 4.6.2 Rekonstitutionsversuche durch Zugabe von DnaK Im Anschluß an Kap. 4.6.1 sollte nun untersucht werden, ob die Zugabe von DnaK zu einer DnaK-freien Präparation von r1-437 die T-Zell-Antwort in Gegenwart von DRB1*0401 bzw. -*0408 rekonstituieren kann und ob sich für diese beiden Allele Unterschiede beobachten lassen. Dafür wurde HSP70-freies Peptid r1-437 aus Kap. 4.5.2 unter Zugabe von 0.025 – 0.1 µg/mL DnaK gemischt, die APZ mit dieser Antigen-DnaK-Mischung gefüttert und mit dem C3-Klon 68 versetzt. Als APZ wurden TP-Zellen als auch humane APZ eingesetzt (s. Kap. 3.1.7). Nach vier Tagen Inkubation wurden jeweils 150 µL Kulturüberstand abgenommen und die Cytokinsekretion des T-Zellklons per ELISA (s. Kap. 3.6) gemessen. In Experimenten mit humanen APZ wurde zusätzlich noch die DNA-Synthese von PM-A C3 gemessen (s. Kap. 3.1.8). A T P0408 T P0401 0 20 40 60 80 1 00 1 20 IFN - γ [p g/m L ] B r1-437 P B L x D RB 1*0 40 8 DnaK-freies r1-437 0,025 µg/mL DnaK 0,05 µg/mL DnaK 0,075 µg/mL DnaK 0,1 µg/mL DnaK P B L x D RB 1*0 40 1 0 10 00 0 20 00 0 30 00 0 3 40 00 0 50 00 0 60 00 0 70 00 0 H-T h y m id in [c p m ] Abbildung 21. Einfluß verschiedener Konzentrationen von DnaK auf die Präsentation von DnaK-freier AChR α-Kette (r1-437) durch DRB1*0401- und DRB1*0408-positive APZ. (A) IFN-γ-Sekretion des humanen T-Zellklons PM-A C3 nach Stimulation durch TP-Zellen. (B) Proliferation des PM-A C3 nach Stimulation durch humane APZ. PBLx = bestrahlte PBMC. (n = 3, MW ± 1 SD). Diese Schaubilder sind repräsentativ für vier Experimente. 69 Durch die Zugabe verschiedener Dosen von E. coli DnaK zur gereinigten Präparation von r1-437 konnte eine komplette Rekonstitution für HLA-DRB1*0401-positive APZ erzielt werden. Bei der Stimulation mit TP0401 wurde durch Zugabe von 0.075 µg/mL DnaK im Vergleich zur DnaK-haltigen Präparation von r1-437 eine Steigerung der Cytokinproduktion des T-Zellklons auf 107% des Ausgangswertes erzielt. Für TP0408 war auch ein leichter Anstieg der Cytokintiter erkennbar, wodurch allerdings bei weitem nicht das Niveau von verunreinigtem r1-437 erreicht wurde (ca. 50 % Rekonstitution). Für *0401-positive humane APZ konnte bei Zugabe von 0.075 µg/mL DnaK eine auf 40% verringerte T-Zell-Antwort im Vergleich zu DnaK-haltiger r1-437-Präparation gemessen werden. Für *0408-positive humane APZ dagegen konnte keine Rekonstitution durch DnaKZugabe erzielt werden. Dieser Trend konnte in drei weiteren Experimenten bestätigt werden. Abbildung 21 (A, B) zeigt einen annähernd parabelförmigen Verlauf der Rekonstitution in Abhängigkeit der DnaK-Konzentration sowohl für TP0401 als auch für humane DRB1*0401APZ. Das Maximum der Kurven liegt bei 0.075 µg/mL DnaK (für DRB1*0401), einem Wert, der der mittels SDS-PAGE und Western Blot bestimmten Konzentration von DnaK in der ursprünglichen Präparation nahe kommt. Dieser Wert stellt gleichzeitig das Optimum für das Zusammenspiel von DnaK, der α-Kette des AChR und dem Prozessierungsapparat von HLA-DRB1*0401-positiven APZ dar. 4.7 Zusammenfassung II In Präparationen von rekombinant hergestellter α-Kette des humanen AChR (r1-437) konnte zum einen DnaK, ein Mitglied der HSP70-Familie aus E. coli, zum anderen in sehr geringen Mengen dessen Cochaperon DnaJ, ein HSP40-Molekül aus E. coli, mittels SDS-PAGE und Western Blot-Analyse nachgewiesen werden (s. Kap. 4.5.1). Um einen Zusammenhang zwischen DnaK und dem unterschiedlichen Prozessierungsverhalten von HLA-DRB1*0401 und -*0408 positiven APZ gegenüber dem humanen T-Zellklon PM-A C3 herstellen zu können, wurde DnaK mittels ATP-Agarose affinitätschromatographisch aus der Proteinlösung r1-437 entfernt (s. Kap. 4.5.2). Das so gereinigte Antigen r1-437 wurde zur Stimulation des T-Zellklons PM-A C3 durch murine TP-Zellen und humane APZ aus dem peripheren Blut eingesetzt. Dabei konnte ein starkes Absinken der T-Zell-Antwort beobachtet werden (s. Kap. 4.6.1). Dies läßt den Schluß 70 zu, daß DnaK für das in dieser Arbeit untersuchte System essentiell ist, um effektiv Polypeptide oder Proteine zu verarbeiten und Immunantworten auszulösen. Durch Zugabe von unterschiedlichen Konzentrationen an DnaK zur gereinigten Antigenlösung r1-437 konnte eine Rekonstitution der Immunantworten, die durch DRB1*0401-positive APZ induziert wurden, von bis zu 100% erzielt werden (bezogen auf die T-Zellstimulierung durch DnaK-haltiges r1-437). Dabei stellte sich eine Konzentration des DnaK von 0.075 µg/mL als Optimum heraus. Für DRB1*0408-positive APZ konnte dagegen die Zugabe von DnaK die Stimulierung von PM-A C3 durch gereinigtes Polypeptid r1-437 nicht (für humane APZ) oder nur teilweise (50 % Rekonstitution für TP0408) beeinflussen (s. Kap.4.5.2). Durch diese Resultate konnten für die weiteren Arbeitsschritte folgende Hypothesen aufgestellt werden: 1. Unterschiedliche Bindung von DnaK an Zellen, die DRB1*0401 bzw. -*0408 exprimieren. HLA-DR-Moleküle stellen entweder selbst einen Rezeptor für DnaK-Polypeptid-Komplexe dar oder sind an deren Bindung beteiligt. DRB1*0401 kann aufgrund seiner Aminosäuresequenz QKRAA (Position 70 – 74 der β-Kette des MHC-II-Moleküls, s. Kap. 1.1) mit DnaK interagieren und dieses mit dem antigenen Polypeptid binden. Dadurch ist eine DRB1*0401-positive APZ besser in der Lage, Polypeptide aufzunehmen und/oder diese vermutlich sogar ohne Prozessierung, auf ihrer Zelloberfläche zu präsentieren. HLA-DRB1*0408-positive Zellen können aufgrund ihrer Aminosäuresequenz QRRAA in der Position 70 – 74 nicht oder nur schwächer DnaK binden. 2. Unterschiedliche Wirkungen von DnaK innerhalb von Zellen. Würde sich allerdings im weiteren Verlauf der Arbeit herausstellen, daß Hypothese 1 nicht zutrifft, so spielen ausschließlich intrazelluläre Ereignisse wie Endozytose und Antigenprozessierung eine Rolle. Hier kommen eine direkte Interaktion zwischen DnaK und DR-Molekül während der Peptidbeladung oder indirekte Mechanismen (z. B. Peptidaustausch von DnaK mit anderen Chaperonen) in Frage, bei denen möglicherweise zelleigene HSP70und/oder J-Proteine eine Rolle spielen. 71 4.8 Zellbiologische Untersuchungen zu Wechselwirkungen von DnaK mit HLA-DRB1*0401-Molekülen 4.8.1 Markierung von DnaK-Mutanten mit einem Fluoreszenzfarbstoff Mit dem Ziel, Bindungsstudien des DnaK-Moleküls an Zelloberflächen durchzuführen bzw. dessen Aufnahme durch phagozytierende Zellen mit optischen Methoden verfolgen zu können, wurde die DnaK-Mutante Q44C mit einem Fluoresceinmolekül gekoppelt (s. Kap.3.2.1). Die Mutation des DnaK an Position 44 gewährleistet, daß die Konformation des Moleküls bei Fluoresceinmarkierung erhalten bleibt. Gelpermeationschromatographie (GPC) Zur Trennung von überschüssigem Fluoreszenzfarbstoff von markiertem DnaK wurde eine Reinigung mittels GPC vorgenommen. Dazu wurde eine Sephadex G-50-Säule (Vt = 14 mL) mit einem Trennbereich von 1 – 30 kDa eingesetzt. Nach Auftrag des Reaktionsproduktes aus Kap. 3.2.1 wurde die Säule mit HEPES-Puffer eluiert. Die Fraktionsgröße betrug 1 mL. Jede Fraktion wurde mit Hilfe der Absorptionspektroskopie (s. Kap. 3.3.1) bei drei verschiedenen Wellenlängen auf ihren Proteingehalt untersucht. 0,4 OD 0,3 280 nm 492 nm 515 nm 0,2 0,1 0 0 10 20 Fraktion Abbildung 22. Elutionsprofil nach GPC. 30 40 72 Die in Abbildung 22 als proteinhaltige Proben identifizierten Fraktionen 19 – 34 wurden einer Konzentrationsbestimmung mittels der BCA-Methode (s. Kap. 3.3.2) unterzogen und vereint. Ultrafiltration Die nach der GPC erhaltene Proteinlösung konnte durch Ultrafiltration (s. Kap. 3.2.4) bis auf eine Konzentration von 0.43 mg/mL eingeengt werden. Bestimmung des Markierungsgrades eines fluoresceinmarkierten Proteins Wie in Kap. 3.3.3 beschrieben wurde der Markierungsgrad des fluoresceinmarkierten Proteins zu 0.54 bestimmt. Jedes zweite DnaK-Molekül trug somit ein Fluoresceinmolekül. Da die Mutante Q44C nur ein leicht zugängliches Cystein besitzt, entspricht dies der Erwartung. 4.8.2 Bindung von fluoresceinmarkiertem DnaK an Oberflächen Bindung an Protein A-Sepharose DnaK ist in der Lage, Protein A zu binden (Rüdiger et al., 1997). Aus diesem Grund wurden Protein A-Sepharose 6 MB-beads ausgewählt, da diese zum einen eine entsprechend große Oberfläche bieten, zum anderen eine spezifische Bindung des DnaK an Protein A gegeben ist. Wie in Kap 3.5.3 beschrieben wurden Protein A-Sepharose-beads mit Konzentrationen von 0 – 80 µg/mL fluoreszenzmarkiertem DnaK inkubiert. Anschließend wurden diese unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Für Protein-A-Sepharose-beads, die mit 40 – 80 µg/mL fluoreszenzmarkiertem DnaK inkubiert wurden, konnte eine sehr schwache Fluoreszenz beobachtet werden, die aber innerhalb von wenigen Minuten verblaßte. Um eine schwächere Substratbindung von DnaK, die aus der Mutation resultieren könnte, auszuschließen, wurde diese Mutante Q44C nach Fluoresceinmarkierung auf ihre ATPase-Aktivität getestet. Dabei zeigte die Mutante gleiche ATPaseAktivität im Vergleich zu nativem DnaK (durchgeführt von M. P. Mayer, Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg). 73 Bindung an Antikörpersepharose Es wurde der für DnaK spezifische, monoklonale Antikörper anti-DnaK an CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelt (s. Kap.3.4.1). Von diesem Antikörper ist die genaue Erkennungssequenz im DnaK nicht bekannt. Durch Zugabe von 10 µg des fluoresceinmarkierten DnaK wurde dieses wie in Kap. 3.4.2 beschrieben an die Antikörpersepharose gekoppelt. Das so entstandene Präzipitat wurde unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Zur quantitativen sowie qualitativen Analyse der Bindung von fluoresceinmarkiertem DnaK an die spezifische Antikörpersepharose wurde eine SDS-PAGE mit anschließendem Western Blotting durchgeführt. Abbildung 23. Antikörpersepharose mit gebundenem, fluoresceinmarkiertem DnaK. Als Negativkontrolle wurde die Eigenfluoreszenz der Antikörpersepharose getestet (nicht gezeigt). Abbildung 23 zeigt Antikörpersepharose-beads mit spezifisch gebundenem, fluoresceinmarkiertem DnaK. Die Bindung von fluoresceinmarkiertem DnaK sowohl an Protein A-Sepharose-beads (Bindung an Oberflächen durch Interaktion zwischen DnaK und seinem Substrat) wie auch an spezifische Antikörpersepharose (Bindung von DnaK an Oberflächen über die rezeptorartige Struktur von Antikörpern) stellte einen Untersuchungen an anderen Oberflächen dar. Positivnachweis für die anschließenden 74 4.8.3 Bindung von fluoreszenzmarkiertem DnaK an TP-Zellen Fluoreszenzfärbung auf Objektträgern Um die Bindung und eine eventuelle Aufnahme von DnaK in TP-Zellen optisch verfolgen zu können, wurden diese auf Objektträger gegeben (s. Kap. 3.5.3). Bei Inkubation von DnaK mit TP-Zellen wurde festgestellt, daß vitale Zellen bei 37 °C innerhalb von 10 min DnaK aufnehmen. In einem weiteren Experiment wurden TP-Zellen nach 5 – 8 minütiger Inkubation bei 37 °C mit unterschiedlichen Konzentrationen (1 – 80 µg/mL) an fluoreszenzmarkiertem DnaK mit 1% Paraformaldehydlösung fixiert, um so ein Endozytieren der Zellen zu unterbinden. Bei Analyse der fertigen Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop wurden für TP0401, TP0408.B5 sowie für die nicht-transfizierten P388.D1 ähnliche Fluoreszenzintensitäten beobachtet (Abb. 24). A B C Abbildung 24. TP-Zellen (A TP0401, B TP0408) nach Inkubation (8 min, 37 °C) mit fluoresceinmarkiertem DnaK [80 µg/mL]. Als Kontrolle dienten nicht-transfizierte P388.D1-Zellen (C). FACS-Analyse Eine empfindliche Testmethode zur Analyse von Zelloberflächen bzw. darauf gebundenen Proteinen oder Komplexen ist die FACS-Analyse (s. Kap. 3.5.2). Hierzu wurden TP0401, TP0408.B5-Zellen sowie P388.D1-Zellen zuerst 15 min auf Eis mit 0.5 µg/mL 75 fluoresceinmarkiertem DnaK inkubiert, anschließend mit 1% Paraformaldehydlösung für 15 min auf Eis fixiert, in FACS-Puffer gewaschen und mittels FACSScan analysiert. A B C Abbildung 25. Bindung von fluoresceinmarkiertem DnaK an TP-Zellen (A TP0401, B TP0408.B5). Als Kontrolle wurden nicht-transfizierte P388.D1-Zellen eingesetzt (C). Als Positivkontrolle der Färbung wurde auf die Expression von HLA-DR-Molekülen getestet. (grauunterlegt: Eigenfluoreszenz der Zellen; Reaktion mit fluoresceinmarkiertem DnaK, ⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅ Färbung mit IOT2aFITC, Nachweis von HLA-DR). FL1-Height zeigt die Fluoreszenzintensität des durch Laserbeschuß angeregten FITC-Moleküls; counts steht für die im Zeitraum der Messung erhaltenen Fluoreszenzereignisse. (n = 1) Intensität (geom. Mittel, willkürliche Einheiten) TP0401 TP0408.B5 P388.D1 Eigenfluoreszenz 10.5 8.7 6.2 Färbung mit fluoresceinmarkiertem DnaK 29.4 18.4 8.7 Expression von HLA-DR 69.8 54.3 10.5 Tabelle 6. Mittels CellQuest-Software berechnete geometrische Mittel der Intensitäten (s. Abb. 25). Die Datenauswertung mittels CellQuest-Software ist in Tabelle 6 dargestellt. Für TP0401 ist eine etwas bessere Bindung von DnaK gegenüber TP0408- bzw. P388.D1-Zellen gezeigt, die aber nicht auf einen signifikanten Unterschied in der Bindung von fluoreszenzmarkiertem DnaK an die verschiedenen Zelltypen schließen läßt. 4.9 Zusammenfassung III Durch direkte Fluoreszenzmarkierung von DnaK-Mutanten sollte die Möglichkeit geschaffen werden, Bindungsstudien an Zelloberflächen bzw. Vorgänge innerhalb von Zellen mittels optischer Methoden durchführen zu können (s. Kap. 4.8.1). 76 Um nachzuweisen, daß fluoreszenzmarkiertes DnaK in der Lage ist, an Oberflächenstrukturen bzw. an geeignete Substrate zu binden, wurde dieses mit Protein A-Sepharose-beads oder mit DnaK-spezifischer Antikörpersepharose inkubiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Die Bindung von DnaK an Protein A- bzw. Antikörpersepharose konnte gezeigt werden (s. Kap. 4.8.2). Da DnaK mit MHC-Molekülen und speziell mit HLA-DRB1*0401 über das shared epitopeMotiv QKRAA interagieren können soll (Auger et al., 1996), wurde untersucht, ob eine Interaktion von diesen Molekülen an der Zelloberfläche stattfindet. Dazu wurden TP-Zellen mit fluoreszenzmarkiertem DnaK auf Objektträgern kultiviert oder mittels FACS-Analyse in cytometrisch untersucht. Hier wurde kein deutlicher Unterschied zwischen den verschiedenen Zelltypen beobachtet. 4.10 Hinweise auf eine Interaktion von HSC70 mit HLA-DR-Molekülen bei der Antigenprozessierung und –präsentation von humanen Antigenen Nicolle et al. (1995) beschrieben für AChR-Präparationen aus menschlichem Muskelgewebe ebenfalls einen Unterschied in der Präsentation des Antigens. Auch hier waren HLA-DRB1*0401-positive APZ um den Faktor 100 bessere Präsentatoren als HLADRB1*0408-positive Stimulatorzellen. Als Antigen diente mittels Immunpräzipitation (s. Kap. 3.4) an Dynabeads-M450 gekoppelter humaner AChR. Eine Präparation des kompletten AChR aus Wadenmuskel (von N. Willcox zur Verfügung gestellt) wurde mittels Western Blot auf verschiedene Proteine der HSP70-Familie untersucht. 77 1 2 Mr [kDa]4 5 6 7 104 81 HSC73 → 47.7 34.6 28.3 19.2 + Bahn 1, 2, 4 - 7: humaner Muskelextrakt Bahn 3: LMW Abbildung 26. Western Blot zur Analyse von humanem Muskelextrakt. In Bahn 1 wurde auf HSC73, in Bahn 4 auf HSP72, in Bahn 5 auf Grp75 und in Bahn 6 auf BiP getestet. Die Bahnen 2 bzw. 7 wurden als Negativkontrolle für die Detektionsantikörperreaktionen verwandt. In Abbildung 26 konnte mit den für diese Arbeit zur Verfügung stehenden Antikörpern das konstitutiv exprimierte humane HSC73 detektiert werden. Da die Erkennungssequenz dieses Antikörpers nicht bekannt ist, jedoch eine zweite Bande im Bereich von 40 kDa detektiert wurde, könnte man postulieren, daß der anti-HSC70-Antikörper ein Epitop in der ATPaseDomäne des HSC73 erkennt (die ATPase-Domäne von HSC73 hat ein Molekulargewicht von 40 kDa). Ebenso wurde auf das induzierbare HSP72, sowie Grp75 und BiP getestet. Im Western Blot wurden keine Banden für diese Mitglieder der HSP70-Familie detektiert. Obwohl TP-Zellen sehr gut in der Lage sind, Partikel zu phagozytieren (Daubenberger et al., 1992), ergaben erste Kontrollexperimente, daß Dynabeads von diesen Zellen nicht aufgenommen werden. Experimente mit an beads gekoppeltem humanem AChR konnten daher nicht durchgeführt werden. Analog zu den Depletionsversuchen der rekombinanten Präparation von r1-437 (s. Kap 4.5.2) wurde der Muskelextrakt zur affinitätschromatographischen Reinigung auf eine ATP-Agarose gegeben (s. Kap. 3.2.3). Hier konnte kein HSC73-freies Produkt erhalten werden. Zur Zeit kann jedoch keine Aussage über unterschiedliche Aktivitäten der ATPase-Domänen von E. coli DnaK und humanem HSC73 gemacht werden. Auch in der Literatur sind keine Aussagen über unterschiedliche ATPase-Aktivitäten dieser HSP70-Familien-Mitgliedern zu finden. 78 5 Diskussion In dieser Arbeit werden unterschiedliche Aspekte der Antigenpräsentation von Polypeptiden durch die mit der RA assoziierten HLA-DRB1*0401- bzw. -*0408-Moleküle beleuchtet. Die gewonnen Daten sollen nun im Hinblick auf die Fragestellungen der Doktorarbeit mit den aus der Literatur verfügbaren Daten verglichen und diskutiert werden. 5.1 TP0401 und TP0408: Unterschiedliche Prozessierung von r1-437 beruht auf dem Unterschied einer einzelnen Aminosäure Alle TP-Zellen haben den gleichen Ursprung, denn sie stammen von der Maus-MakrophagenLinie P388.D1 ab. Dabei wurde die Mutterzellinie P388.D1 mit dem humanen DRA1-Gen und Genen von verschiedenen, teilweise durch gezielte in vitro Mutagenese hergestellten DRB1-Allelen transfiziert (Daubenberger et al., 1996). Der Unterschied zwischen den in dieser Arbeit benutzten TP0401- und TP0408-Zellen besteht darin, daß TP0408-Zellen mit einem DRB1*0408-Gen transfiziert wurden, das durch gezielte Mutation eines DRB1*0401-Gens hergestellt wurde. Deswegen enthält die DR-β-Kette der TP0408-Zellen ein Arginin an Position 71, wohingegen TP0401 an dieser Position ein Lysin besitzt. Die Effizienz der Transfektion dieser TP-Zellen konnte mit FACS-Analysen der Zelloberflächen gezeigt werden. Diese Zellen expremieren die gleiche Anzahl HLA-DRMolekülen. Als interne Kontrolle diente die Expression von murinen endogenen MHC-KlasseII-Molekülen, die nach Induktion mit IFN-γ eingeleitet wurde. Auch hier wurden keine Unterschiede für TP0401 im Vergleich zu den verschiedenen Klonen von TP0408 beobachtet. Die Stimulation mit Maus-IFN-γ über mehrere Tage führte auch zu einer gleich großen Erhöhung der Anzahl an humanen DR-Molekülen, bedingt durch einen besseren Transport an die Zelloberfläche durch die IFN-γ induzierte murine Invariante Kette. Beim Vergleich der Wachstumskinetiken der TP-Zellen konnte ein unterschiedliches Verhalten beim 3H-Thymidin-Einbau in neusynthetisierte DNA beobachtet werden. Es zeigte sich, daß TP0408-Zellen zu Beginn der einzelnen Experimente im Vergleich zu TP0401 weniger 3 H-Thymidin einbauten. Dies könnte durch ein langsameres Zellwachstum erklärt werden. Zum anderen sind Makrophagen aber in der Lage, selbst Thymidin zu synthetisieren, das den Einbau von radioaktiv-markiertem Thymidin hemmen kann. 79 Eine Bestimmung der Zellzahlen nach Ernten der TP-Zellen aus großen Kulturgefäßen ergab vergleichbare Ergebnisse für die untersuchten Zellen. Nach anfänglichem Abfall nahmen die Zellzahlen im weiteren Verlauf der Experimente gleichmäßig zu. Die Zellteilungsrate lag bei etwa einer Teilung innerhalb von 24 Stunden. In der Literatur wurden keine Anhaltspunkte gefunden, die einen Zusammenhang zwischen HLA-DR-Molekülen und der 3H-Thymidin-Einbaurate belegen. Da das Experiment nur ein einziges Mal durchgeführt wurde, und die Zellzahlen in den anderen Experimenten keine Unterschiede zeigten, sollte diesem Unterschied keine zu große Bedeutung zugerechnet werden, es sei denn, das Phänomen ließe sich in weiteren Experimenten sichern. Bei Betrachtung der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente muß auch berücksichtigt werden, ob der Unterschied in der 3H-Thymidin-Einbaurate der TP-Zellen einen Einfluß auf die Stimulation des humanen T-Zellklons PM-A C3 hat. Da der Klon durch die Präsentation von Antigen durch HLA-DR-Moleküle stimuliert wird, ist es vor allem wichtig, daß auf TP-Zellen genügend HLA-DR-Moleküle zu Beginn der Experimente vorhanden sind. Dies wurde durch den Einsatz von gleichen Ausgangskonzentrationen an TP0401 und TP0408 gewährleistet. Weiterhin mußte berücksichtigt werden, daß aufgrund der Strahlenresistenz der TP-Zellen die 3H-Thymidin-Einbaurate in die DNA des T-Zellklons nicht zur spezifischen Bestimmung der T-Zell-Aktivierung herangezogen wurde. Eine besondere Bedeutung für die durchgeführten Stimulationsexperimente hat die Funktion der TP-Zellen als Antigen-präsentierende Zellen. In zuvor von R. Rzepka (Klinische Forschergruppe für Rheumatologie, Freiburg) durchgeführten Stimulationsexperimenten mit TP-Zellen und Antigenen (wie z. B. Ovalbumin, einem Superantigen oder einem Mitogen) und T-Zellen entsprechender Sprzifität und Restriktion konnte kein Unterschied in der Aktivierung dieser Zellen festgestellt werden. Dies läßt darauf schließen, daß TP0401 und TP0408 in ihren Antigenprozessierungsschritten gleiches Verhalten zeigen. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß sich TP0401- und TP0408-Zellen lediglich in den transfizierten HLA-DR-Molekülen in nur einer einzelnen Aminosäure unterscheiden. 80 5.2 Unterschiede in der Antigenbindung von TP0401 und TP0408 In dieser Arbeit wurden unterschiedliche Peptide des AChR zur Stimulation des T-Zellklons PM-A C3 eingesetzt. Dabei konnte für das synthetische Peptid p144-163 für den Klon eine bessere Aktivierung durch TP0408 im Vergleich zu TP0401 gezeigt werden. Durch das Polypeptid r3-181 wurde PM-A C3 in verschiedenen Experimenten durch beide TP-Zelltypen entweder gleich gut stimuliert, oder TP0401 war etwas effizienter als TP0408. Die rekombinante α-Kette des humanen AChR r1-437 wurde dagegen von TP0401-Zellen im Vergleich zu TP0408-Zellen um ein Vielfaches besser präsentiert. Diese Aussagen gelten für Präparationen, in denen entweder nie nachgewiesen wurde (p144-163, r3-181) oder für Präparationen mit und ohne Kontamination mit DnaK (r1-437) (s. hierzu auch Kap. 4.5.3). Hier stellt sich die Frage, ob die Länge der eingesetzten Peptide und/oder die Konformation, in der das eigentlöiche Epitop vorliegt, einen kritischen Faktor für die Prozessierung und die anschließende Präsentation darstellen kann. Es besteht die Möglichkeit, daß im Prozessierungsschritt langer Polypeptide andere Peptidfragmente entstehen als das Peptid, das das eigentliche T-Zellepitop darstellt. Diese sind dann in der Lage mit dem „richtigen“ Peptid um die Bindungsstelle am HLA-DR-Molekül zu konkurrieren. Peptidbindungsstudien von Matsuo et al. (1999) führten zu dem in Abbildung 27 gezeigten Modell für die Bindung des Peptides α147-159 des AChR an DR-Moleküle. Für die Berechnung der Strukturdaten des MHC-Klasse-II-Moleküls lag die DR1/Influenza-PeptidKristallstruktur vor (Stern et al., 1994). 81 Abbildung 27. Potentielle Lage des Peptides α147-159 des humanem AChR in der Peptidbindungsgrube von HLA-DRB1-Molekülen. Das AChR-Peptid ist durch schwarze Striche dargestellt; die einzelnen Aminosäuren sind mit dem Einbuchstabencode gekennzeichnet. Variable Aminosäurereste der DR-β-Kette, deren Seitenketten mit dem Peptid interagieren können, sind durch schwarze Punkte und Zahlen gekennzeichnet. (aus Matsuo et al.,1999) Die in Abbildung 27 dargestellte Struktur von DRB1-Molekülen mit gebundenem Peptid des AChR demonstriert, daß an Position 71 sowohl Lysin (DRB1*0401) als auch Arginin (DRB1*0408) in der Lage sind, Wasserstoffbrücken zur benachbarten Asparaginsäure des Peptids auszubilden. Da im Verlauf dieser Arbeit auch die Kristallstruktur von HLA-DRB1*0401 publiziert wurde (Dessen et al., 1998) und neue Algorithmen des Programms SYFPEITHI (Rammensee et al., 1999) zur Bestimmung von möglichen Bindungspartnern und Bindungsmotiven für HLA-Moleküle vorlagen, konnte in dieser Arbeit die Lage des Antigens aus dem humanen AChR neu berechnet werden. Die Algorithmen wurden auf die komplette Sequenz der α-Kette des AChR angewandt. Es wurden nur in der Region von 144 – 163 der α-Kette Peptide gefunden, die mit einer Wahrscheinlichkeit von mindestens 6 % an DRB1*0401 binden. Für DRB1*0408 wurden anhand der erhaltenen Daten von DRB1*0401 entsprechende Modelle erstellt, da derzeit noch keine Algorithmen bzw. die Struktur für DRB1*0408 bekannt sind. 82 Aminosäureposition im humanen AChR Sequenz Wahrscheinlichkeit der Bindung an DRB1*0401 28 148 - 162 LGTWTYDGSVVAINP TWTYDGSVVAINPES 149 - 163 WTYDGSVVAINPESD 6 * 147 - 160 6 145 - 159 GTWTYDGSVVAINPE KLGTWTYDGSVVAIN 144 - 158 MKLGTWTYDGSVVAI 6 146 - 160 16 6 Tabelle 7. Durch das Programm SYFPEITHI bestimmte mögliche Peptide des AChR, die an HLA-DRB1*0401 binden können. Diejenige Aminosäure, die mit der Aminosäurenseitenkette der Position 71 des DRB1*0401 interagiert, ist fett gedruckt. Mit * gekennzeichnetes Peptid 147 – 160 wurde von Matsuo et al. (1998) als möglicher Bindungspartner vorgeschlagen. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 28 % erfolgt die Bindung an DRB1*0401 durch die Sequenz 146-160 des humanen AChR. Das von Matsuo et al. (1998) publizierte T-Zell-Epitop α147159 bindet dagegen nur mit einer Wahrscheinlichkeit von 6 % an HLA-DRB1*0401. Durch die Bindung der Peptidsequenz 146-160 an DRB1-Moleküle werden die in Abbildung 27 dargestellten Aminosäuren um eine Position nach rechts verschoben. Somit können nun sowohl Lysin (DRB1*0401) als auch Arginin (DRB1*0408) in Position 71 mit der Hydoxylgruppe des Wechselwirkungen Guanidinogruppe Tyrosins des des (Y) Wasserstoffbrücken delokalisierten Arginins ausbilden. π-Elektronensystem (DRB1*0408) eine des Jedoch Tyrosins elektrostatische können mit der Abstoßung der Argininseitenkette hervorrufen. Dadurch wird die Bindungsaffinität des AChR-Peptides 146160 an DRB1*0408 geschwächt. Ähnliche Effekte könnte auch Peptid 144 – 158 mit einem Tryptophan (W) an der diskutierten Position des Peptides hervorrufen. Die Peptide 148 – 162, 149 – 163 und 145 – 159 sind in ihren Interaktionen an dieser betrachteten Stelle dem von Matsuo et al. (1998) berechneten Peptid α147 – 160 ähnlich. Diese Berechnungen postulieren, daß auf molekularer Ebene DRB1*0401 besser mit dem Peptid 146 - 160 interagiert als DRB1*0408. Es bleibt die Frage, welche(s) Peptid(e) der T-Zellklon in DRB1*0401 bzw. DRB1*0408 erkennt. Für Bindungsstudien wurde in dieser Arbeit das synthetische Peptid p144 - 163 eingesetzt. Die Bindung wurde als T-Zell-Reaktion gemessen. Seine Sequenz ist um fünf Aminosäuren länger als die der in Tabelle 7 aufgeführten Peptide. Es besteht damit die Möglichkeit, daß sich dieses 83 Peptid in jeder der oben berechneten Positionen in der DR-Peptidbindungstasche wiederfinden kann. In Korrelation zu den aus den Stimulationsexperimenten erhaltenen Daten ist es prinzipiell in der Lage, eine den Peptiden 148 – 162, 149 – 163, 145 – 159 oder 147 – 160 entsprechende Position einzunehmen. Die gemessene T-Zell-Antwort spricht dafür, daß in diesem Fall das p146-160 nicht die dominante Rolle spielt. Ebenso kann es sich für Stimulationen mit dem Polypeptid r3-181 verhalten, da hier häufig ähnliche T-Zell-Stimulierungen durch TP0401 und TP0408 erzielt wurden. Für die komplette rekombinante α-Kette des AChR muß nach den oben angeführten Berechnungen auch ein Peptid aus dem Bereich 144 – 163 angenommen werden, da kein konkurrierendes Peptid im restlichen Molekül gefunden werden konnte. Versuche mit TP-Zellen zeigten, daß bei der Stimulation des T-Zellklons mit einer hohen Konzentration der Präparationen von r1-437, die keine detektierbaren Verunreinigungen beinhalteten, TP0401 bzw. TP0408 vergleichbar waren. Die erhaltenen Cytokintiter des TZellklons hingegen waren niedriger im Vergleich zu denen, die nach Stimulation mit verunreinigten Präparationen von r1-437 erhalten wurden. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, daß auch das Peptidfragment aus dem langen rekombinanten Polypeptid r1-437 eine der für das kurze synthetische Peptid p144-163 diskutierte Sequenz besitzt. Leider wurden mit TP-Zellen und gereinigtem r1-437 keine kompletten Titrationen von APZ und Antigen durchgeführt. Diese Experimente wurden jedoch mit humanen PBMC und dem DnaK-freien r3-181 durchgeführt. Hier zeigte sich weiterhin ein deutlicher Unterschied zwischen DRB1*0401 und DRB1*0408, ebenso bei Verwendung von DnaK-freiem r1-437, auch in hohen Antigenkonzentrationen. Es ist daher anzunehmen, daß in den humanen APZ bevorzugt das Peptid p146-160 in die DR-Moleküle gelangt und dort von PM-A C3 auch erkannt wird. Zukünftige Studien an diesem Modell sollten auf die Isolierung der gebundenen Peptide in den DR-Molekülen abzielen. 84 5.3 Die Effizienz des Prozessierens und Präsentierens hängt von der Präsenz eines HSP70-Moleküls ab. Dieser Effekt ist besonders deutlich mit Antigen-präsentierenden Zellen aus dem peripheren Blut des Menschen zu erkennen. Um festzustellen, ob das in der Präparation r1-437 gefundene DnaK einen erheblichen Einfluß auf die Prozessierung bzw. Präsentation durch HLA-DRB1*0401 ausübt, wurde DnaK affinitätschromatographisch an ATP-Agarose aus der r1-437-Lösung depletiert. Die so erhaltene DnaK-freie Präparation von r1-437 wurde zur Stimulation von PM-A C3 durch DR4positive APZ eingesetzt. Dafür wurden sowohl TP-Zellen wie auch humane APZ von heterozygoten Spendern verwandt. Es zeigte sich, daß die Aktivierung des T-Zellklons sowohl bei DRB1*0401- als auch bei DRB1*0408-positiven APZ stark abnahm. Bei Depletion von DnaK aus Präparationen von r1-437 konnte für TP0408 im Vergleich zu TP0401 ein relativ größerer Effekt beobachtet werden. Durch anschließende Zugabe von DnaK konnte für beide TP-Zelltypen eine Rekonstitution erzielt werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß der Effekt der unterschiedlichen T-Zellstimulation durch TP-Zellen auf eine bessere Peptidbindung des „richtigen“ Peptides von HLA-DRB1*0401 im Vergleich zu -*0408 schließen läßt. DnaK zeigt für dieses System einen katalytischen Effekt. Im humanen System wurde nach Depletion allerdings nur ein gravierender Unterschied für DRB1*0401-positive APZ beobachtet. Ebenso konnte die Rekonstitution der T-Zell-Antwort nur für DRB1*0401-positive Zellen erzielt werden. Für dieses System kann im Vergleich zu TP-Zellen zusätzlich zur Peptidbindung auch noch ein genotyp-spezifischer Effekt für DnaK gezeigt werden, indem DnaK nur die Reaktion von DRB1*0401 positiv beeinflußt. Um den Einfluß von DnaK auf die Antigenpräsentation eingehender zu untersuchen, sollten zukünftige Versuche die Bindung von DnaK an humane APZ näher charakterisieren. In dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, daß ein Mitglied der HSP70-Familie bei der Antigenprozessierung/-präsentation der MHC-Klasse-II-Moleküle eine essentielle Rolle spielt. Geprägt werden diese Ergebnisse dadurch, daß gerade in diesem System das E. coli DnaK mit den betrachteten HLA-DRB1*0401- bzw. DRB1*0408-Molekülen, die sich in nur einer einzigen Aminosäure unterscheiden, unterschiedlich reagiert und dabei DRB1*0401 über sein QKRAA-Motiv Vorteile gegenüber anderen MHC-Molekülen besitzt. In der neueren Literatur (Binder et al., 2000; Asea et al., 2000; Arnold-Schild et al., 1999) wird diskutiert, daß Mitglieder der HSP70-Familie (wie z.B. gp96, HSP70) mit gebundenen 85 Peptiden oder Proteinen über den Rezeptor CD91 (α2-Makroglobulin-Rezeptor) von APZ aufgenommen werden können und somit den Prozessierungsapparaten von MHC-Klasse-I- wie auch MHC-Klasse-II-Molekülen zur Verfügung stehen. Während für den endogenen Prozessierungsweg von MHC-Klasse-I-Molekülen dieses Phänomen für Mauszellen bereits gut untersucht ist, sind für MHC-Klasse-II-Moleküle derzeit nur wenige Arbeiten bekannt (Panjwani et al., 1999). Die Aufnahme von DnaK-Komplexen war bei TP0401- und TP0408-Zellen gleich. Die DR-Moleküle dienen also wohl nicht als (Co-)Rezeptor. Was innerhalb der APZ, speziell der humanen, mit dem aufgenommenen Komplex geschieht, konnte in der hier vorliegenden Arbeit nicht weiter untersucht werden Daß endogene HSC70-Moleküle bei der Antigenprozessierung eine wichtige und quantitative Rolle spielen, zeigen die Arbeiten der Gruppe G. Stockinger. DRB1*0401 könnte über sein QKRAA-Motiv Vorteile in der Peptidbeladung gegenüber anderen DR-Molekülen besitzen (survival of the fittest). Auger et al. (1996) konnten mittels Coimmunpräzipitation zeigen, daß auch humane HSC70-Moleküle in der Lage sind, mit der β-Kette von HLA-DR-Molekülen und auch hier speziell mit dem shared-epitope-Motiv zu interagieren. Darüberhinaus demonstrierten diese Autoren, daß die HSC73-bindenden DR-β-Ketten schneller und effektiver in Lysosomen gelangen als die, die nicht an HSC73 binden. Die von Auger et al. (1996) beschriebenen Phänomene für die Interaktion von DnaK mit dem shared epitope-Motiv der HLA-DRB1*0401 β-Kette konnten in dieser Arbeit durch die Betrachtung der Immunantworten eines Antigen-spezifischen T-Zellklons erstmals bestätigt werden. 5.4 Humane T-Zellklone Die Arbeit mit humanen T-Zellklonen bringt einige Schwierigkeiten mit sich. Um eine ausreichende Menge an Zellen zu erhalten, müssen diese durch autologe APZ und einem reaktiven Peptid unter IL-2-Zugabe zur Proliferation stimuliert werden. Für anschließende Experimente muß der genaue Zeitpunkt des Abklingens dieser Stimulation unter IL-2-Zusatz erfaßt werden, um die T-Zellen in einem Zustand zu gewinnen, der es erlaubt, sie erneut mit neuem Antigen zu aktivieren. Außerdem haben humane T-Zellklone im allgemeinen eine begrenzte Lebensdauer und sind nicht immer stimulierbar. Daher wird für zukünftige Arbeiten 86 bereits die Etablierung von T-Zellhybridomen geplant, die man aber nur aus der Maus gewinnen kann bzw. durch Transfektion der T-Zellrezeptor-Gene in ein Maus-Hybridom. Für T-Zell-Aktivierungsexperimente mit verschiedenen HLA-DR4-Subtypen sollten zur Überprüfung der in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse auch T-Zellen mit anderer Spezifität, wie z. B. Tetanus Toxoid, untersucht werden. 5.5 Assoziation zwischen bestimmten HLA-Haplotypen und Autoimmunkrankheiten Bei fast allen Autoimmunkrankheiten des Menschen hat man eine Assoziation mit dem HLAKomplex festgestellt. Oft ist noch ungeklärt, welcher Locus des Komplexes wichtig ist. Mit der molekularen Technik der HLA-Typisierung werden diese Assoziationen zunehmend eingegrenzt. Wie schon in Kap. 1.1 erwähnt, spielt für die rheumatoide Arthritis die Assoziation mit Subtypen des HLA-DR, die das sogenannte shared epitope-Motiv tragen, eine wichtige Rolle (Gregersen et al., 1987). Die Assoziation zwischen den Allelen DR3 und DR4 mit dem insulinabhängigen Diabetes mellitus ist hingegen durch das Kopplungsungleichgewicht zwischen DR3, DR4 und bestimmten DQβ-Allelen bedingt. Die assoziierten DQβ-Sequenzen der Patienten unterscheiden sich von den nicht-assoziierten ebenfalls durch den Austausch nur einer einzelnen Aminosäure in Position 57 (Asp57 gegen Val, Ser oder Ala) (Übersicht bei Janeway & Travers, 1997). Ein Zusammenhang zwischen dem MHC-Genotyp und einer Autoimmunkrankheit ist verständlich, da an allen Autoimmunreaktionen T-Zellen beteiligt sind, die nicht nur antigenspezifisch sondern meist auch restringiert auf die eigenen MHC-Moleküle sind. Dabei spielen MHC-Klasse-II-Moleküle bei der Induktion und Regulation von Immunantworten eine zentrale Rolle. Somit wird vermutet, daß diese selbst an dem Krankheitsgeschehen beteiligt sind. In den letzten Jahren wurden innerhalb des MHC-Komplexes der Maus und des Menschen auch andere Gene entdeckt, deren Genprodukte wichtige Funktionen beim intrazellulären Antigentransport und dem Prozessieren von Antigenen ausüben (Übersicht u. a. bei Singal et al., 1999). Da es auch hier allele Varianten gibt, die sich in einem Ungleichgewicht mit bestimmten HLA-Haplotypen befinden, kommen auch diese Gene als Kandidaten für Autoimmunerkrankungen in Frage. 87 In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Antigenpräsentation durch die RA-assoziierten MHC-Klasse-II-Moleküle DRB1*0401 und DRB1*0408 anhand der Stimulation des T-Zellklons PM-A C3 näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß diese für lange Polypeptide Unterschiede in der T-Zell-Aktivierung zeigen. Ebenso wurde demonstriert, daß das E. coli HSP70-Protein DnaK die Antigenprozessierung und - präsentation von Polypeptiden oder Proteinen durch HLA-DRB1*0401 (QKRAA) und somit die resultierende Immunantwort positiv beeinflussen kann. Auf die Präsentation von langen Polypeptiden durch HLA-DRB1*0408, das sich in nur einer einzigen Aminosäure (QRRAA) von DRB1*0401 unterscheidet, hatte DnaK keinen maßgeblichen Einfluß. Außerdem konnten Hinweise gefunden werden, daß auch das humane HSC73 in der Lage ist, die Präsentation von Proteinen durch HLA-DRB1*0401 stark zu beeinflussen. Folgende Hypothese kann aus den in dieser Arbeit gewonnenen Resultaten aufgestellt werden: Bei Anwesenheit von DRB1*0401 nimmt die RA einen schlimmeren Verlauf, da die Autoantigen-Epitope über die Interaktion mit HSC70 oder anderen HSP70-Molekülen besser, schneller und effizienter in die Peptidbindungstasche dieser DR-Moleküle gelangen können. Auf der anderen Seite kann dies für Menschen, die zwar Träger des HLA-DRB1*0401-Gens sind aber keine RA entwickeln, auch einen Selektionsvorteil gegenüber der Gesamtpopulation darstellen. Hierbei führt die effizientere Interaktion der DRB1*0401-Moleküle mit HSP70Proteinen und Antigen zu einer schnelleren Immunantwort, möglicherweise speziell bei bakteriellen Infektionen. Dies kann an dem folgenden Modell verdeutlicht werden: Bei der RA wird vermutet, daß ein oder mehrere Antigene im Gelenk vorhanden sind. Ebenfalls wurde im Gelenk eine Überexpression von HSC70 (Schick et. al., Klinische Forschergruppe für Rheumatologie, Freiburg; persönliche Mitteilung), HLA-DR-Molekülen und aktivierten APZ (wie synoviale Fibroblasten und Makrophagen) gefunden. Es wird nun eine Bindung zwischen diesen HSC70-Proteinen und den entsprechenden Antigenen vermutet (wie es in ähnlicher Form in dieser Arbeit für HSC70 und Polypeptide aus dem humanen AChR gezeigt wurde). Diese Bindung kann zum einen in den APZ stattfinden, zum anderen besteht auch die Möglichkeit, daß die APZ diese HSC70/Antigen-Komplexe aufnehmen. Nach erfolgter Aufnahme der HSC70/Antigen-Komplexe kann ein präferentielles Beladen der DRB1*0401-Moleküle in den entsprechenden Kompartimenten stattfinden. Die Antigene können so mit den DRB1*0401-Molekülen wieder an die Zelloberfläche gelangen und werden 88 dort den T-Zellen präsentiert. Für die RA konnte bereits gezeigt werden, daß autoreaktive T-Zellklone aus synovialen T-Zellen bevorzugt DRB1*0401-restringiert sind (I. Melchers, Klinische Forschergruppe für Rheumatologie, Freiburg; persönliche Mitteilung). Das Zusammenspiel all dieser Ereignisse in der Antigenpräsentation kann eine verstärkte Reaktion in der Immunantwort bei DRB1*0401-positiven Menschen hervorrufen. 89 6 Zusammenfassung Das Immunsystem erkennt Antigene mit Hilfe antigenspezifischer Rezeptoren auf B- und T-Zellen. Während B-Zell-Rezeptoren ein Antigen direkt binden, erkennen T-Zell-Rezeptoren ein Antigen erst, nachdem es prozessiert wurde: Eine spezialisierte Antigenpräsentierende Zelle (APZ) nimmt das Antigen auf, verdaut es teilweise und präsentiert schließlich auf ihrer Oberfläche Peptide daraus, gebunden an Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (engl.: MHC). Neben fremden Antigenen können auch zelleigene präsentiert werden. Während das gesunde Immunsystem diese übersieht, reagiert das kranke – bei Autoimmunerkrankungen – auch mit Autoantigenen. Die Rheumatoide Arthritis ist eine Autoimmunerkrankung mit ungeklärter Pathogenese. Sie tritt familiär gehäuft auf und ist mit bestimmten Allelen der HLA-DRB1-Gene des MHC-Komplexes gekoppelt. Die betroffenen β-Ketten dieser HLA-DR4-Subtypen tragen in der Peptidbindungstasche eine gemeinsame Aminosäuresequenz, das sog. shared epitope (meist QKRAA, auch QRRAA oder RRRAA). Um die Funktion einzelner dieser Allele vergleichen zu können, wurden murine makrophagenartige Zellen zur Verfügung gestellt, die Gene für HLA-DRB1*0401 (TP0401) bzw. DRB1*0408 (TP0408) exprimieren. Diese Zellen unterscheiden sich nur in einer einzelnen Aminosäure in Position 71 (Lys – Arg) der DR-β-Kette. Diese TP-Zellen können den humanen T-Zellklon PM-A C3, der ein Epitop der α-Kette des humanen Acetylcholin-Rezeptors (AChR) im Kontext von HLA-DR4 erkennt, aktivieren. Von diesem Antigen ist bekannt, daß es von Zellen, deren HLA-DR-β-Ketten sich nur in einer einzigen Aminosäure unterscheiden, (DRB1*0401 und DRB1*0408, innerhalb des shared epitops) verschieden prozessiert wird. Dieses Phänomen wurde mit TP-Zellen eingehender untersucht werden. Durch Studien der Bindungsaffinitäten von Peptid an die entsprechenden MHC-Klasse-II-Moleküle, der Expression von HLA-Molekülen auf der Zelloberfläche und Induktion von invarianter Kette konnte bestätigt werden, daß der Unterschied in den DR-β-Ketten dieser TP-Zellen allein für das Prozessieren der α-Kette des AChR wichtig ist. Durch proteinchemische Analysen mittels SDS-PAGE und Western-Blot wurde demonstriert, daß die rekombinant hergestellte Präparation der α-Kette des AChR Hitzeschockproteine aus E. coli, nämlich DnaK (HSP70) und in geringen Mengen DnaJ (HSP40), enthielt. Durch affinitätschromatographische Depletion an ATP-Agarose konnte DnaK aus der Proteinlösung entfernt werden. Die so gewonnene DnaK-freie Antigenpräparation von r1-437 wurde zur Stimulation des humanen TZell-Klons PM-A C3 eingesetzt. Dabei wurden sowohl TP-Zellen als auch humane APZ aus dem peripheren Blut der Genotypen DRB1*0401 und -*0408 als Präsentatoren verwendet. Im Gegensatz zu den vorangegangenen Experimenten konnte nun kein Unterschied in der Präsentation der α-Kette durch *0401 im Vergleich zu *0408 festgestellt werden. Durch Zugabe von DnaK zur gereinigten Proteinlösung von r1-437 gelang bei Präsentation durch DRB1*0401-positive APZ die Rekonstitution T-Zell-Antwort von PM-A C3. Dabei zeigte sich, daß eine maximale Stimulation durch Zugabe von 0.075 µg/mL DnaK erreicht wird. Dies läßt den Schluß zu, daß DnaK für das in dieser Arbeit verwendete System einen essentiellen Bestandteil bei der Prozessierung und Präsentation von Polypeptiden und Proteinen darstellt. Mit Hilfe der Fluoresceinmarkierung von verschiedenen DnaK-Cystein-Mutanten konnte die Interaktion von DnaK mit Oberflächenstrukturen von Zellen optisch untersucht werden. Fluoreszenzexperimente auf Objektträgern und FACS-Analysen ließen sich allerdings keine signifikanten Unterschiede zwischen den in dieser Arbeit untersuchten Genotypen nachweisen. Untersuchungen von einer Präparation des AChR aus humanem Muskelgewebe zeigten, daß auch humanes HSC73, ein Mitglied der HSP-Familie, in sehr großen Mengen vorhanden war. Arbeiten von Nicolle et al. (1995) demonstrierten für dieses Antigen ebenfalls große Unterschiede in der Prozessierung bzw. Präsentation. Mit TP-Zellen konnten in dieser Arbeit diese Resultate nicht bestätigt werden. Ebenso wurde keine Depletion von humanem HSC73 aus der humanen AChR-Präparation beobachtet. 90 7. Literatur Albani, S., Carson, D. A., Roudier J. (1992). Genetic and environmental factors in the immune pathogenesis of rheumatoid arthritis. Rheum. Dis. Clin. North. Am. 18, 729 – 40. Arnold-Schild, D., Hanau, D., Spehner, D., Schmid, c., Rammensee, H.-G., de la Salle, H. & Schild, H. (1999). Receptor-mediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presenting cells. J. Immunol. 162, 3757 – 3760. Asea, A., Kraeft, S.-K., Kurt-Jones, E. A., Stevenson, M. A., Chen, L. B., Finberg, R. 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Roth, S., Willcox, N., Melchers, I. (1999). Significant differences in antigen processing and presentation of a human autoantigen depend on the exchange of one amiono acid at position 71 of the DR4 β chain. (Frühjahrstagung der DGfI, Stuttgart, 03. – 06.03.1999) Roth, S., Willcox, N., Melchers, I. (1999). Significant differences in antigen processing and presentation of a human autoantigen depend on the exchange of one amiono acid at position 71 of the DR4 β chain. (Workshop für Experimentelle Rheumatologie, Berlin, 26. – 27.03.1999) Roth, S., Willcox, N., Mayer, M. P., Melchers, I. (1999). Effects of a chaperone of the HSP70 family on antigen presentation to a specific T cell clone. (Workshop des Jungchemikerforums, Paderborn, 03. – 05.10.1999) Roth, S., Willcox, N., Mayer, M. P., Melchers, I. (2000). The exchange of one single amino acid at position 71 of the DR4 β-chain leads to significant differences in antigen processing and presentation of a human autoantigen chaperoned by a memeber of the HSP70-family. Cell Stress & Chaperones 5, 393 (II. International Congress on „Heat Shock Protein in Immune Response“, Farmington, CT, USA, 08. – 12.10.2000) Posterbeiträge Roth, S., Willcox, N., Melchers, I. (1998). The exchange of one single amino acid at position 71 of the DR β chain leads ro significant differences in antigen processing and presentation. Immunobiology 199, 427. Roth, S., Kurzik-Dumke, U., Schick, C., Rzepka, R., Melchers, I. (1998). Overexpression of homologues of the bacterial DnaJ chaperone in synovial tissue of arthritis patients and in various cell lines. Cell Stress & Chaperones 3, 22. Roth, S., Willcox, N., Mayer, M. P., Melchers, I. (1999). Effects of a chaperone of the HSP70 family on antigen presentation to a specific T cell clone. Immunobiology 200, 350. Benoit, S., Rzepka, R., Sato, N., Torigoe, T., Roth, S., Melchers, I. (2000). Cell surface expression of a HSC73-like molecule by CD14+ monocytes. Immunobiology 203, 29. Mein besonderer Dank gilt: Frau Dr. Inga Melchers für die Bereitstellung des interessanten und vielseitigen Themas, ihre Unterstützung und den Freiraum bei der Durchführung der Arbeit. Prof. Dr. Dieter Jahn für die bereitwillige Übernahme der Betreuung der Arbeit vor der Fakultät für Chemie der Universität Freiburg. Prof. Dr. Hans Hartmut Peter für sein Interesse an der Arbeit und die gewährte Hilfe. Prof. Dr. Nicholas Willcox für die Unterstützung des Projektes mit Rat und Tat und die Bereitstellung von Zellen und des Laborplatzes in der Neurosciences Group, Oxford, UK. Rita Rzepka für ihre Hilfsbereitschaft und die herzliche Arbeitsatmosphäre im Labor. Sandrine Benoit, Marko Stein, Dr. Andrea Zgaga-Griesz und allen Mitgliedern der KFR und der Neurosciences Group für sämtliche Diskussionen und das angenehme Arbeitsklima. Dr. Christoph Grote für die ernsten und nicht so ernsten Diskussionen bei der Erstellung des Manuskripts. dem Deutschen Akademischen Austauschdienst für die Finanzierung des Projektes.
