HPLC-MS

HPLC‐MS Ein LC/MS System besteht im Wesentlichen aus zwei analytisch relevanten Bestandteilen: 1) HPLC (high performance liquid chromatography) 2) MS (mass spectrometry): viele unterschiedliche Typen 1
High‐performance liquid chromatography (HPLC): Ist eine Art der Flüssigchromatographie um Komponenten zu trennen, die in Lösung sind (Voraussetzung: Komponente muss gelöst sein). HPLC besteht aus folgenden Bestandteilen: •
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Injektor Pumpe Säule Mobile Phase Detektor Die jeweiligen Komponenten werden durch Injektion eines bestimmten Proben‐ volumens auf die Säule aufgebracht. Sie passieren die Säule mit unterschiedlicher Geschwindigkeit, jeweils abhängig von der Wechselwirkung zwischen der mobilen Phase und der stationären Phase. Aufbau einer HPLC Anlage + 0.3197
+ 0.3197
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Laufmittel Pumpe Injektions‐ Säule ventil Detektor Auswertung 2
Man unterscheidet 2 unterschiedliche HPLC Varianten: 1. Normal Phase (NP)‐HPLC NP‐HPLC: polare stationäre Phase, sowie apolare mobile Phase (z.B.:n‐hexan). Je polarer die mobile Phase ist, desto schneller wird eine Substanz eluiert. Polare Moleküle werden auf der Säule länger retardiert als unpolare Moleküle und verlassen deshalb die Säule später. Normalphasen sind Kieselgele oder Aluminium‐ oxide, an denen reine Adsorptionsvorgänge an den polaren OH‐Gruppen zur Trennung ausgenutzt werden. Man unterscheidet 2 unterschiedliche HPLC Varianten: 2. Reversed Phase (RP)‐HPLC RP‐HPLC: unpolare stationäre Phase, sowie polare mobile Phase (ACN, MeOH, etc. ) D.h. bei der RP‐HPLC wird durch Anlagerung einer apolaren Verbindung an die Säulenmatrix, die Polarität der stationären Phase umgekehrt. Unpolare Seitenketten sind an ein Kieselgelgerüst oder an ein Polymer gebunden. Dadurch verhalten sie sich hydrophob. Mit zunehmender Kettenlänge werden die Phasen unpolarer. Der Trennmechanismus basiert auf Van‐der‐Waals‐Kräften. Je ähnlicher der Analyt der Kohlenwasserstoffkette der Phase ist, umso größer sind seine Wechselwirkungen mit der Säule. 3
Säulenauswahlparameter Normal Phase Si
Umkehr Phase Si
OH
O
O
Si
Si
OH
O
O
Si
Si
OH
O
O
Si
H
OH
Si
OH
Kieselgel ( ‐OH) Hexan Kieselgel‐ C8 H
OH
H
OH
H
OH
H
OH
H
OH
Wasser Säulenauswahlparameter Chemie des Säulenmaterials: Die Wechselwirkung der Probenmoleküle mit dem Packungsmaterial bestimmt, ob eine Trennung überhaupt möglich ist (z.B.: C8, C18, CN, NO2, Phenyl, etc….) Physikalische Säulenparameter: (z.B.: Partikeldurchmesser, Porengröße, Säulenlänge, Säulendurchmesser,..) Diese Parameter beeinflussen die Geschwindigkeit, die Auflösung, den Säulendruck, die Detektierbarkeit und den Lösungsmittelverbauch. Packungsmaterial: Art des Grundkörpers (z.B.: C18, C8, CN, NH2, Diol, polar‐embedded) Größe und Form (Partikeldurchmesser,…) Porös/nicht porös Porenweite, Porenvolumen Dichte der gebundenen Phase 4
Säulenauswahlparameter Kieselgel Octylphase C8 Octadecylphase C18 Der chromatographische Prozeß Analyt
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Bei einem chromatographischen Prozeß werden die zu analysierenden Analyten auf Grund ihrer unterschiedlichen Wechselwirkungen mit der stationären und der mobilen Phase getrennt und als diskrete Banden der Detektion zugeführt. 5
Welche Informationen enthält ein Chromatogramm? Bruttoretentionszeit (tms) 25
Bruttoretentionszeit: tms Totzeit: tm Nettoretentionzeit: ts tms= tm + ts 20
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0
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tm 4 Minuten 6
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ts Kenngrößen der Chromatographie Totzeit: kleinste mögliche Retentionszeit für Substanzen, die keine Wechselwirkung mit der stationären Phase eingehen Bruttoretentionszeit: Zeit zwischen Aufbringen der Komponenten auf die Säule (Injektion) und der Detektion (Peakmaximum) Nettoretentionszeit: Differenz aus Bruttoretentionszeit und Totzeit Retentionsfaktor (auch Kapazitätsfaktor): andere Größe zur Beschreibung der Retention : Maß um wie viel länger sich eine Substanz in der stationären Phase aufhält als in der mobilen Phase (ist dimensionslos) . 6
Kenngrößen der HPLC Trennstufenzahl (N): auch Bodenzahl genannt; sie beschreibt die Anzahl der Gleichgewichtseinstellungen der zu trennenden Substanz zwischen stationärer und mobiler Phase in der Säule. Ein großes N bedeutet, dass mehr Gleichgewichtseinstellungen erfolgen und dadurch die Trennleistung der Säule besser wird. Der chromatographische Trennvorgang lässt sich in nacheinander ablaufende Trennschritte zerlegen. In jedem dieser theoretischen Böden kommt es zur Gleichgewichtseinstellung zwischen den beiden Phasen. Kenngrößen der HPLC Trennfaktor (α): Trennstufenhöhe (H): gibt die Qualität der Trennung zweier Substanzen an; er beruht auf der Retentionszeit der Komponenten in der Säule. Definitionsgemäß ist α immer >1; bei α=1 eluieren beide Substanzen gleichzeitig (Coelution) und es findet keine Trennung statt ist ein Maß für die Trennleistung der Säule 7
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Van Deemter Gleichung Sie beschreibt den Einfluss der mobilen Phase auf Peak verbreiternde Prozesse. Die Effizienz der Trennung ist in erster Linie von der Verteilung abhängig. Die Trennung wird außerdem von anderen Prozessen überlagert, die die Peakform und die Effizienz der Trennung beeinflussen. Diese Prozesse hängen von der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase ab; dieser Zusammenhang wird in der sogenannten Van‐Deemter Gleichung ausgedrückt HETP = A + B/u +C*u u = Linargeschwindigkeit der mobilen Phase (cm*s‐1) A = Eddy Diffusion B = Longitudinaldiffusion C = Massentransfer •
Eddy Diffusion (= Mehrweg‐Effekt) (A)  Unterschiedliche Wegstrecken, die die Probenmoleküle durch die gepackte Säule nehmen. Hieraus resultiert eine Gauss‐Verteilung der Retentionszeiten. Proportional zur Güte der Säulenpackung und des Teilchendurchmessers. 9
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Längsdiffusion (B)  In der mobilen Phase diffundieren die Moleküle sowohl in, als auch entgegen der Fließrichtung, und verbreitern so das chromatographische Signal. Indirekt proportional zur Flussrate. Direkt proprotional zum Diffusionskoeffizienten und der Störung der Diffusionsbewegung durch Säulenpartikel. • Massentransport (C) Damit ist die Verbreiterung der chromatographischen Signale durch unterschiedliche Wechselwirkungen der Analyte mit der stationären Phase gemeint. Gleichgewichtseinstellung an der Phasengrenze stationäre/mobile Phase benötigt Zeit ⇒ da die mobile Phase aber in Bewegung ist, kann sich der Gleichgewichtszustand nicht vollständig einstellen ⇒ Zunahme der Höhe eines theoretischen Bodens (HETP) 10
Van Deemter Gleichung Van Deemter Gleichung  Je kleiner H, umso größer die Anzahl der Stufen pro Säule  Je mehr Trennstufen die Säule hat, umso „besser“ ist die Trennleistung der Säule (= die Peaks werden schärfer !)  Je flacher die Kurve ansteigt, um so größere Flussraten der mobilen Phase können eingesetzt werden, ohne dass die Trennleistung (Effizienz) nachlässt. 11
Van Deemter Gleichung: Schlussfolgerungen  Die Packungsteilchen müssen klein sein.  Die Teilchen sollen möglichst gleichmäßig geformt.  Die Teilchenverteilung sollte so schmal wie möglich sein.  Die Säulenfüllung muss so gleichförmig gepackt sein.  Die effektive Schichtdicke der stationären Phase bzw. die Diffusionswege innerhalb der Packungsteilchen müssen so klein wie möglich ein.  Die mobile Phase soll einen großen Diffusionskoeffizienten haben, also niedrig viskos sein. LC/MS System Ion Source RF‐lens Q‐Analyzer Transfer Lens Collision Cell Pusher Detector Probe Dionex Ultimate 3000 (HPLC) Refelctron DCMS link Auftrennung der Substanzen auf der analytischen Säule Detektion der Substanzen mittels Massenspektrometrie 12
Bestandteile der Ultimate 3000 im Detail: Pumpe, Probengeber 1) Hochdruck Gradientenpumpe (HPG) HPG (meist in Kombination mit einem Degasser) 3) Säulenofen: sowohl kühl‐als auch heizbar 5‐ 85°C 2) Probengeber (Autosampler) Kühlbar (teurer, aber wichtig für thermolabile Substanzen) 13
Inline‐Split‐Loop‐Injektionsprinzip (I) Das Probengläschen wird unter der Nadel platziert Inline‐Split‐Loop‐Injektionsprinzip (II) Die Nadel sticht durch das Septum in das Probengläschen 14
Inline‐Split‐Loop‐Injektionsprinzip (III) Die Spritze zieht das zu injizierende Volumen auf Inline‐Split‐Loop‐Injektionsprinzip (IV) Die Nadel fährt aus dem Probengläschen… 15
Inline‐Split‐Loop‐Injektionsprinzip (V) …in den Needle Port und führt die Injektion durch Detektoren in der HPLC • UV/Vis‐Absorption: variable λ oder PDA (Photodiodenarray) • Brechungsindex • Fluoreszenz (Analyten fluoreszieren oder können derivatisiert werden) • Elektrochemisch (elektroaktive Substanzen) • elektrische Leitfähigkeit (für Ionen) • Lichtstreuung • Kernmagnetische Resonanz (NMR): molekulare Information • Massenspektrometrie (MS): molekulare Information • Atomspektrometrie (AAS, AES): Elementinformation • Induktiv gekoppelte Plasma‐MS (ICP‐MS): Elementinformation 16
Eigenschaften der Detektoren Detektor Nachweisgrenze Linearer Bereich UV/VIS 10‐11 g 104 Fluoreszenz 10‐14 g 105 Leitfähigkeit 10‐8g*mL‐1 105 MS 10‐7 – 10‐9 g 105 AAS 10‐9 – 10‐12 103 ICP‐MS 10‐12‐10‐15 105 Elutionsverfahren 
Isokratisch [griech.]: gleichgemischt Gradient [latein.]: Gefälle Bezeichnung für den Grad der Veränderung einer physikalisch‐ mathematischen Größe (z. B. Dichte, Temperatur, Druck, Höhe, Konzentration, elektrisches Feld etc.) mit z. B. dem Volumen, der Längeneinheit etc. 
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Elutionsverfahren Die Parameter, die während der Trennung geändert werden können, sind: Fluss Temperatur pH‐Wert Elutionsmittelzusammensetzung Elutionsverfahren  Isokratische Elution: Die Zusammensetzung der mobilen Phase bleibt konstant. Gradienten Elution: Die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich. Bei den meisten Anwendungen bei der RP‐LC arbeitet man zu Beginn mit polareren Lösemittelgemischen, und steigert dann die Konzentration des unpolaren Lösemittel‐Anteils.  Fluss‐ oder Temperaturgradienten spielen bei der RP‐LC eher eine untergeordnete Rolle. 18
Selektivität der Detektoren Selektivität universal spezifisch Ein selektiver Detektor zeigt nur die gewünschten Komponenten an, obwohl sie mit anderen coeluieren Sensitivität des Detektors Limit of detection (LOD): Lowest concentration that can be detected Signal‐to‐noise ratio of 2:1 or 3:1 Limit of quantitation (LOQ): Lowest concentration that can be determined with acceptable precision Signal‐to‐noise ratio of 10:1 19
Stabilität der Basislinie Noise, Drift und der kleinste, noch detektierbare Peak LC/MS Kopplung  Hat inzwischen immer weitere Verbreitung gefunden  hohe qualitative Aussagekraft  sehr hohe Empfindlichkeit mit Techniken wie SIM (Selected Ion Monitoring)  heute sind Eluatflussraten bis 2 ml/min möglich  technisch schwierig ist das Interface zur Kopplung (wegen den hohen Massenströmen der mobilen Phase) 20
Massenspektrometrie Die Massenspektrometrie ist eine Analysetechnik zur Bestimmung der Molekülmasse freier Ionen im Hochvakuum. Ein Massenspektrometer besteht aus: Massenspektrometrie Atmosphärendruck 21
Grundlagen der Massenspektrometrie Grundprinzip der MS: Das Prinzip der Massenspektrometrie geht auf J.J. Thomson zurück, der zeigte, dass das Element Neon aus einer Mischung aus zwei Isotopen mit der Masse 20 und 22 besteht. Es gelang ihm auch diese Isotope zu trennen. In der "klassischen" Massenspektrometrie werden die Probenmoleküle in der Gasphase ionisiert (und teilweise auch fragmentiert), durch ein elektrisches Feld beschleunigt und in einem Magnetfeld auf Flugbahnen unterschiedlicher Radien (abhängig von der Masse der Teilchen) gezwungen. Dieses ursprüngliche Prinzip wurde in den letzten Jahren vielfach abgewandelt und zum Teil durch völlig andere Konzepte der Massenauftrennung ersetzt oder ergänzt, so dass heute eine größere Zahl von verschiedenen Typen von Massenspektrometern zur Verfügung Stehen (Sektorfeldgeräte, Quadrupol, Ionenfallen, etc.) Welche Erkenntnisse/Informationen gewinnt man aus der Massenspektrometrie? Molekülmasse, bzw. Molekulargewicht: das Verhältnis von Molekülmasse zu Ionenladung (m/z) Auskunft über die Struktur der untersuchten Verbindung mithilfe von Fragmentierungsmechanismen Identifizierung bekannter Verbindungen durch Vergleich der Massenspektren aus der Probe mit jenen in Datenbanken (v.a. in der Drogenanalytik und Umweltanalytik) 22
Quadrupol Ein Prinzip zur Auftrennung von Massen besteht in der Trennung in hochfrequenten elektrischen Feldern. Die Felder regen die Ionen zu oszillierenden Flugbahnen an, die nur für einen bestimmten Massenbereich stabil sind und nur diesen Ionen erlaubt, den Massenfilter zu passieren. Quadrupolmassenspektrometer sind der häufigste Massenspektrometer‐Typ, da die Geräte kompakt und kostengünstig gebaut werden können. Quadrupole sind außerdem schnell genug, um mit der Gaschromatographie gekoppelt zu werden. Ionenfalle (Ion trap) Das Prinzip einer Ionenfalle beruht darauf, Ionen in einem Quadrupolfeld "gefangen" zu halten. Je nach Art der einwirkenden Felder kann man entweder nur Ionen einer bestimmten Masse gefangen halten, oder aber sämtliche Ionen in der Falle vorrätig halten und durch geeignete Veränderung der Felder Ionen mit einer bestimmten Masse dazu zu bringen, den Iontrap zu verlassen. Dadurch ist es möglich, gezielt den Vorrat der Ionen massenaufgetrennt zu scannen. Die Ionenfalle besteht aus drei Elektroden, einer torusförmigen Elektrode und zwei hyperbolischen Deckkappen. Die Deckkappen haben jeweils ein Loch für den Eintritt und den Austritt der Ionen. 23
Flugzeit‐Massenspektrometer (time of flight – TOF) Ein Flugzeitmassenspektrometer (engl. time of flight ‐ TOF) basiert auf der Tatsache, dass Teilchen gleicher kinetischer Energie mit unterschiedlicher Geschwindigkeit fliegen, wenn sie unterschiedliche Masse aufweisen. Beschleunigt man Ionen in einem elektrischen Feld mit der Spannung V so haben die Ionen beim Verlassen des Feldes die kinetische Energie q∙V (q ist die Ladung eines Ions), die gleich ½∙m∙v2 sein muss: und daraus m Masse des Teilchens v Geschwindigkeit des Teilchens V Feldspannung q Ladung des Teilchens t Flugzeit L Länge der Flugbahn 24
Tandem‐Massenspektrometrie (MS/MS) Um die Selektivität zu erhöhen kann man zwei Massenspektrometer hintereinander Schalten (Tandem MS). Zwischen den beiden Analysatoren wird eine sogenannte Kollisionszelle eingebaut. Dadurch bekommen die Ionen durch ein Inertgas zusätzlich Energie und zerfallen zu spezifischen anderen, leichteren Ionen. 25
Tandem‐Massenspektrometrie (MS/MS) Die zu bestimmende Probe wird im ersten Massenspektrometer mit Hilfe von EI oder CI ionisiert. Dabei entsteht eine sehr große Anzahl verschiedener Ionen, von denen jene Masse im ersten Massenspektrometer (manchmal auch Massenfilter genannt) ausgewählt wird, die die substanzspezifischen Ionen enthält. Die ausgewählten Ionen werden dann in eine Stoßkammer geleitet, wo sie mit einem neutralen Gas (in der Regel Argon) zusammenstoßen und weiter zerfallen. Diese Zerfallsprodukte werden im nachgeschalteten zweiten Spektrometer weiter aufgetrennt und registriert. Man erzeugt also ein vollständiges Spektrum der vom ersten Massenfilter ausgewählten Ionen. Dieses Spektrum wird auch CID‐Spektrum (engl. collision induced dissociation) genannt und ist für die betreffenden Ionen genauso charakteristisch wie ein normales Massenspektrum für neutrale Moleküle. MS/MS lässt sich kostengünstig in so genannten "Triple‐stage Quadrupolgeräten" verwirklichen. Dabei sind drei Quadrupol‐Massenfilter unmittelbar hintereinander geschaltet. Das mittlere wird als Stoßzelle benützt. Man kann nun die beiden Massenspektrometer in unterschiedlicher Weise koppeln, so dass man verschiedene Scans bekommt: Daughter Scan (oder product‐ion scan): Hier werden alle Tochterionen eines Mutterions registriert. Dieser Scan ist der am meisten bekannte Scan, bei dem das erste MS fix auf eine Masse eingestellt ist und das zweite MS den Bereich bis zur Muttermasse abscannt. Parent Scan (oder precursor‐ion scan): Dabei wird das erste MS gescannt während das zweite auf einer fixen Masse steht. Dadurch werden alle für ein bestimmtes Tochterion in Frage kommenden Mutterionen registriert. Die Darstellung des Spektrums erfolgt so, dass man auf der x‐Achse die Masse des Mutterions aufträgt. Neutral Loss Scan: Bei dieser Betriebsart werden bei Massenspektrometer gleichzeitig mit einem bestimmten Versatz der Masse gescannt so dass nur jene Tochterionen, die durch Abspaltung eines bestimmten Neutralteilchens entstehen, registriert werden. Im Spektrum wird wieder die Masse des Vorläuferions angezeigt 26
Die häufigsten Interfaces in der LC‐MS  Elektrospray (ESI)  Mix von positiven und negative geladenen Ionen, Neutralteilen und Lösungsmittel  Lösungsmittelverdampfung erhöht das elektrische Feld, Ionen wandern zur Tropfenoberfläche  Ionenaustoss geschieht wenn der Tropfen kleiner wird und das Feld grösser  APCI (Atmospheric Pressure Chemical ionization)  Das Lösungsmiitel wird erhitzt und mit Stickstoff vernebelt.  Bildung der Ionen (Spitzenentladung) an der Nadel.  Ionen, welche vom Lösungsmittel herrühren, dienen als chemisches Ionisierungsgas und bewirken die Ionisierung des Analyten (Probenmoleküle) 27
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Im MS Mode findet keine, bzw. nur eine sehr geringe Fragmentierung statt; vergleichbar mit ESI‐TOF Unselektives Fragmentieren 29
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Was wird nun tatsächlich gemessen: Ein Massenspektrum ist eine zweidimensionale Darstellung von Ionenhäufigkeit vs. Ionenmasse zu Ladungs‐Verhältnis (m/z). Die bei der Ionisierung einer Substanz erzeugten Ionen werden entweder gleichzeitig oder zeitlich nacheinander registriert. Die jeweilige Intensität wird aus der Fläche oder der Höhe der Signale, der sog. Peaks, ermittelt und normalerweise auf den Signalstärksten Peak im Spektrum, den sog. Basispeak (base peak) normiert (rel. Int. %). Massenspektren werden sowohl als Strichspektren, oder als Profilspektren (Peakform) dargestellt. Zusätzlich können beliebige Spuren einer Masse mitgemessen werden, z.B.: m/z 440, m/z 444, etc. Achtung: gemessen wird entweder im positiven, oder im negativen Mode, d.h. die Masse erhöht sich (M+H), oder verringert sich (M‐H) um eine Ladungseinheit. 32
Fragmentierung Unter Fragmentierung versteht man einen Prozess, bei dem in der Kollisionszelle eine relativ hohe Energie angelegt wird, bei der die Moleküle (Mutterionen) spezifisch zerfallen (Tochterionen). Das Muster der Fragmentierung ist für jedes Molekül charakteristisch und kann als Fingerprint einer Verbindung angesehen werden. 33
Fragmentierung: 
Fragmentierung Fragmentierung am Beispiel Koffein: m/z 194 (M+) 34
Fragmentierung Fragmentierung am Beispiel Folsäure: m/z 444 (M‐) Fragmentierung Fragmentierungsmuster der Tetrahydrofolsäure m/z 444 Mutterion: Tochterionen: 5‐MTHF (m/z): 444 (M‐) m/z 315.1167 m/z 400.1707 35
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