Sprühtest zur Prüfung der Substratspezifität von Phenoloxidasen

Sprühtest zur Prüfung der Substratspezifität
von Phenoloxidasen
FRIEDRICH D R A W E R T u n d H E R B E R T
GEBBING
Bundesforschungsanstalt für Rebenzüchtung Geilweilerhof,
Abteilung Biochemie und Physiologie, Siebeldingen/Pfalz
(Z. Naturforschg. 22 b, 559—560 [ 1 9 6 7 ] ; eingeg. am 18. Februar 1967)
Die unter dem Sammelbegriff Phenol- bzw. Polyphenoloxidasen (PPO) zusammengefaßten kupferhaltigen
Enzyme, deren Wirkung vorwiegend auf o- und p-Diphenole gerichtet ist mit 0 2 als Acceptor, sind von der
Enzym-Kommission der internationalen Union für Biochemie als o-Diphenol : 02-Oxidoreduktase 1.10.3.1 (I)
bzw. p-Diphenol: 0 2 -0xidoreduktase 1.10.3.2 (II) klassifiziert worden
Eine exakte Zuordnung der in zahlreichen Literaturangaben beschriebenen Phenoloxidasen
ganz verschiedener Herkunft (Mikroorganismen, höhere
Pflanzen, Tiere) zum Reaktionstypus I oder II ist nun
insofern schwierig, als den Beschreibungen häufig wenig gereinigtes Enzym zugrunde liegt, erschöpfende
Angaben über die Substratspezifitäten fehlen und die
Charakterisierung überdies noch durch Benennung
nach Herkünften oder Substraten wie Teeoxidase, Kartoffeloxidase bzw. Catechinoxidase und Dopaoxidase erschwert wird. Es ist auch bekannt, daß rohe Enzympräparate beide Reaktionstypen nebeneinander enthalten können und infolge gewisser hydroxylierender
Eigenschaften der Phenoloxidasen z. B. audi Monophenole den spez. Reaktionen gemäß I und II zugänglich gemacht werden.
Zur Kennzeichnung der Substratspezifität von gleichartig durchgeführten PPO-Aufarbeitungen aus verschiedenen Pflanzen und zur Kontrolle der Reinigung
und Konzentrierung des Enzyms arbeiteten wir die
nachfolgend beschriebene Methode aus, die eine rasche
und verläßliche Orientierung erlaubt.
Material und Methoden
Kultur-Champignons, Kartoffelknollen, Löwenzahnwurzeln und Beerenhülsen von Reben wurden mit
0,1-m. Phosphatpuffer (PH 6,5) homogenisiert, letztere
unter Zusatz von Coffein zur Ablösung des Enzyms von
Zellbestandteilen 2 . Weitere Aufarbeitungsschritte: Zentrifugieren, zweimalige Acetonfällung des Uberstandes,
Reinigung über Sephadex G 25 (Fraktion 1), Nachreinigung über DEAE-Sephadex A 25 (Fraktion 2 ) ,
Konzentrierung durch Ultrafiltration 3 .
Zur Orientierung über die Substratspezifität prüften
wir zunächst die Fraktionen 1 auf ihre Reaktion mit
30 phenolischen Verbindungen, die auf Grund ihrer
Substitution als Substrate grundsätzlich in Frage kommen. Dies kann in gepufferter (PH 6,5) wäßriger Lösung
im Reagenzglas geschehen oder besser durch Auftüpfeln
der Lösungen der Substrate auf Dünnschichtplatten und
anschließendes Besprühen mit Enzymlösung. Die Sprüh1
Report of the Commission on Enzymes of the International
Union of Biochemistry, Pergamon Press, Oxford 1961.
methode ist sehr vorteilhaft: Die Reaktionen laufen
unter Luftsauerstoff (Acceptor) bei ausreichender
Enzymaktivität rasch ab; bei gleicher Reaktionszeit
können Unterschiede in der Reaktionsgeschwindigkeit
verschiedener Substratphenole gut beobachtet werden;
die Schichten lassen sich in bekannter Weise dokumentieren. Dünnschichtplatten (20-20 cm) werden normal
(0,25 mm) z. B. mit Polyamidpulver beschichtet. Dann
tüpfelt man die Phenole in einer Konzentrationsreihe
punktförmig auf (0,5 —10 ^g/Fleck) und besprüht mit
der zu prüfenden Enzymlösung gleichmäßig. Bei Lufttrocknung entwickeln sich die Farben der schnell reagierenden Substrate innerhalb weniger Min., die der langsam reagierenden innerhalb ca. 30 Minuten. Da die
Reaktionsgeschwindigkeit pH-abhängig ist, entwickelt
man zweckmäßig bei einem pH von 6,5. Dieser wird
entweder durch leichtes Vorbesprühen mit dem entsprechenden Puffer eingestellt oder man verwendet
Enzym in pufferhaltiger Lösung.
Ergebnisse
Mit Hilfe der genannten Methoden lassen sich rasch
und einfach
1. die Reaktionstypen I und II ermitteln,
2. Unterschiede in der Substratspezifität bei Enzympräparaten des gleichen Reaktionstypus aber verschiedener Herkunft feststellen.
Zu 1. bei der Ermittlung des Reaktionstypus z.B.
von Fraktion 1 aus Traubenhülsen unter den angegebenen Bedingungen (pn 6,5) gegenüber 30 phenolischen Verbindungen zeigte sich, daß charakteristische
Farbreaktionen mit einer Ausnahme nur bei o-Diphenolen auftraten. Als einziges Monophenol reagierte p-Cumarsäure (p-Hydroxy-zimtsäure). Andere MonohydroxyVerbindungen wie Phenol, Tyrosin, Salicylsäure, pund m-Hydroxy-benzoesäure, Vanillinsäure (p-Hydroxym-methoxy-benzoesäure), Syringasäure (p-Hydroxy-mdimethoxy-benzoesäure), o-Cumarsäure
(o-Hydroxyzimtsäure) oder Verbindungen mit Hydroxylgruppen in
p-(Gentisinsäure = 2.5-Dihydroxy-benzoesäure) bzw. m(Resorcin, Phloroglucin), ferner Verbindungen mit oHydroxylgruppen an hydrierten Ringen (Chinasäure,
Shikiminsäure) reagieren unter diesen Bedingungen
nicht. Da die Farbreaktionen zwischen den Phenoloxidasen und ihren Substrat-Phenolen sehr empfindlich
sind, war damit der Nachweis erbracht, daß es sich bei
der Enzymfraktion 1 aus Traubenhülsen ausschließlich
oder überwiegend um das Enzym des Reaktionstypus I
handelte.
Zu 2. Zur Feststellung von Unterschieden in der
Substratspezifität von Enzympräparaten des gleichen
Reaktionstypus aber verschiedener Herkunft wurden
die Fraktionen 1 bzw. 2 aus Traubenhülsen und Kartoffeln mit Hilfe des Sprühtests miteinander verglichen.
Naturwissenschaften, im Druck.
in Vorbereitung.
2
F . DRAWERT U. H . GEBBING,
3
F . DRAWERT U. H . GEBBING,
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in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der
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Substratphenole
Brenzcatechin
Dihydrokaffeesäure
Kaffeesäure
Chlorogensäure
Rutin
Protocatechusäure
Pyrogallol
L-Epica techin
D-Catechin
Dopa
p-Cumarsäure
Gallussäure
3.4-Dihydroxy--phenylessigsäure
Adrenalin
Farben im U V (350 nm)
Besprühen mit
Trauben-PPO
vor
nach
Farben im Sichtbaren
nach Besprühen mit
Trauben- Trauben-PPO KartoffelPPO
+ Prolin *
PPO
braun
gelb
hellblau
hellblau
dunkelbraun
blau
graubraun
graubraun
graubraun
grau
dunkelblau
blau
dunkelbraun
graubraun
hellbraun
hellbraun
dunkelbraun
graubraun
graubraun
ocker
gelb
grau
hellbraun
grau
rotbraun
rotbraun
braun
hellbraun
dunkelbraun
rotbraun
graubraun
ocker
ocker
blauschwarz
braun
hellbraun
graubraun
gelb
hellbraun
gelbgrün
(leuchtend)
braun
rotbraun
violett
violett
oliv
violett
gelb
braun
braun
ocker
ocker
blauschwarz
violett
grau
rotbraun
rotbraun
braun
hellbraun
dunkelbraun
rotbraun
graubraun
ocker
ocker
blauschwarz
Farbstärke
TraubenPPO
—|—j—}—
hellbraun
+ +
++ +
++ +
+ +
+ +
+ +
++ +
+ +
+
++ +
+
braun
rotbraun
++ +
++ +
—
KartoffelPPO
++ +
+ +
++ +
++ +
+ +
+
++ +
++ +
++ +
+ +
—
+ +
++ +
++ +
Tab. 1. Ergebnisse des Sprühtests beim Vergleich von Polyphenoloxidase (PPO) des gleichen Reaktionstypus (o-Diphenyl :0 2 Oxidoreduktase; I) aber verschiedener Herkunft (Trauben —Kartoffeln). * Durch unmittelbares Nachbesprühen mit 1-proz.
Prolinlösung in Puffer (vgl. F . D R A W E R T U. H. G E B B I N G , Naturwissenschaften 5 0 , 5 2 2 [ 1 9 6 3 ] ) .
T a b . 1 enthält die Vergleiche der Fraktionen 2. A u s
ihr ist zu ersehen, daß die weitgehend gereinigten, in
farbloser L ö s u n g vorliegenden Enzympräparate verschiedener Herkunft gegenüber den angegebenen Substrat-Phenolen etwa dieselbe Spezifität aufweisen. Ein
grundsätzlicher Unterschied zeigte sich nur in der Reaktion mit d e m M o n o p h e n o l p-Cumarsäure. T r a u b e n - P P O
reagierte deutlich, K a r t o f f e l - P P O nicht. Weitere Unterschiede traten in der Reaktionsgeschwindigkeit beider
Enzympräparate mit einigen Substrat-Phenolen auf.
P P O aus Traubenhülsen reagierte z. B. schnell mit
4
F . D R A W E R T U. H .
GEBBING, J .
Protocatechusäure, P P O aus Kartoffel vergleichsweise
langsamer und schwächer.
Beim Vergleich der P P O verschiedener Herkunft mit
Hilfe des Sprühtests reagierte das Enzym aus Champignon wie das aus Traubenhülsen positiv mit p-Cumarsäure, während die aus Löwenzahn und Kartoffeln
gewonnenen Präparate keine F ä r b u n g zeigten.
Die unterschiedlichen Farbreaktionen ( T a b . 1) können zur spezifischen Identifizierung von dünnschichtchromatographischen T r e n n u n g e n entsprechender Phenole genutzt werden 4 .
Chromatogr., im Druck.
Fig. 1. A big round food vacuole (FV), containing many
partly digested (Bj and B 2 ) and completely digested bacteria
(B 4 ), except the cell wall. Arrows show the origin of the
pinocytic vesicles (V). In some places the vesicles (V) detached from the wall of the main vacuole (VF). X 20,000.
Fig. 2. The food vacuole becomes amoeboid in shape. Most of
the bacteria have been digested. The row of pinocytic vesicle
(V) is visible outside the food vacuole (FV). X 20,000.
Fig. 3. The shape of the food vacuole (FV) has become more
amoeboid. The pinocytic vesicles (V) have been considerably
increased in number. These vesicles (V") are also observed
in the cytoplasmic stream. X 20,000.
Fig. 4. The pinocytic vesicles (V") travel throughout the
entire body of the organism which are also visible even very
close to the macronucleus ( M C ) , situated in the middle of the
body. X 20.000.
Fig. 5. Two trichocysts (TT) are visible. Near the trichocysts
three laminated bodies (LB) are found. These bodies are
surrounded by a well defined membrane ( M ) . Sometimes
these bodies (LB') are seen in a very close association with
the trichocysts (TT). The pinocytic vesicles (V") are visible
in this region too. X 20,000.