TiHo Bibliothek elib - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung des Einflusses von Interleukin-10 auf
den Verlauf der experimentellen
Theilervirusinfektion in SJL-Mäusen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Ann-Kathrin Uhde
Seesen
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Andreas Beineke
Institut für Pathologie
1. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Beineke
2. Gutachter: Prof. Dr. Ludwig Haas
Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2015
meinen Eltern
&
meinem Freund Christian
in Liebe und Dankbarkeit
♥
The process of scientific discovery is, in effect,
a continual flight from wonder.
(Albert Einstein)
Teilergebnisse
der
vorliegenden
Arbeit
wurden
bereits
vorab
zur
Veröffentlichung eingereicht:
A.-K. Uhde, V. Herder, M. Akram Khan, M. Ciurkiewicz, D. Schaudien, R. Teich, S.
Floess, W. Baumgärtner, J. Huehn and A. Beineke (2015):
Viral infection of the central nervous system exacerbates interleukin-10 receptor
deficiency-mediated colitis in SJL mice.
eingereicht
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits als Kongressbeiträge
präsentiert:
A.-K. Uhde, V. Herder, J. Hühn, R. Teich, W. Baumgärtner und A. Beineke (2014):
Interleukin-10 receptor blockade in Theiler´s murine encephalomyelitis.
2nd Joint European Congress of the ESVP, ESTP and ECVP
27. bis 30. August 2014 in Berlin
A.-K. Uhde, V. Herder, J. Hühn, W. Baumgärtner und A. Beineke (2014):
Interleukin-10-Rezeptorblockade bei der Theiler‘schen murinen Enzephalomyelitis,
einem Tiermodell für Entmarkungskrankheiten.
57. Jahrestagung der DVG-Fachruppe „Pathologie“
8. bis 9. März 2014 in Fulda
A.-K. Uhde, V. Herder, R. Teich, S. Flöß, W. Baumgärtner, J. Hühn und A. Beineke
(2015):
Interleukin-10 receptor blockade enhances hippocampal damage of Theiler´s virusinfected SJL mice.
Joint European Congress of the ESVP and ECVP
2. bis 5. September 2015 in Helsinki
A.-K. Uhde, V. Herder, R. Teich, S. Flöß, W. Baumgärtner, J. Hühn und A. Beineke
(2015):
Interleukin-10 receptor blockade enhances neuroinflammation in Theiler´s murine
encephalomyelitis.
60th Annual Meeting of the German Society for Neuropathology and Neuroanatomy
26. bis 28. August 2015 in Berlin
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung............................................................................................................ 1
2
Literaturübersicht .............................................................................................. 3
2.1 Die Multiple Sklerose............................................................................................ 3
2.2 Tiermodelle der Multiplen Sklerose ...................................................................... 5
2.3 Das Theiler´sche murine Enzephalomyelitisvirus ................................................. 7
2.4 Die Immunantwort bei der Theiler´schen murinen Enzephalomyelitis .................. 9
2.4.1
CD4+-T-Helferzellen ................................................................................ 9
2.4.2
CD8+-zytotoxische T-Zellen .................................................................. 14
2.4.3
Regulatorische T-Zellen ........................................................................ 16
2.4.4
B-Zellen / Plasmazellen ........................................................................ 17
2.4.5
Antigenpräsentierende Zellen ............................................................... 18
2.5 Zytokine bei der Theiler´schen murinen Enzephalomyelitis ............................... 20
2.6 Interleukin-10 ..................................................................................................... 24
2.7 Interleukin-10 und virale Infektionskrankheiten .................................................. 30
3
Hypothesen und Ziele ...................................................................................... 33
4
Material und Methoden .................................................................................... 35
4.1 Verwendete Mäuse und Versuchsdurchführung ................................................ 35
4.1.1
Nicht infizierte Tiere (erster Versuchsteil) ............................................. 35
4.1.2
Tiere, die mit dem Theiler´schen murinen Enzephalomyelitisvirus infiziert
wurden und anti-Interleukin-10-Rezeptor-Antikörper in der akuten Phase
der Infektion erhielten (zweiter Versuchsteil) ........................................ 36
4.1.3
Tiere, die mit dem Theiler´schen murinen Enzephalomyelitisvirus infiziert
wurden und anti-Interleukin-10-Rezeptor-Antikörper in der chronischen
Phase der Infektion erhielten (dritter Versuchsteil) ............................... 38
4.1.4
Klinische Untersuchung ........................................................................ 40
Inhaltsverzeichnis
4.1.5
II
Sektion und Gewinnung von Probenmaterial ........................................ 43
4.2 Histologie ........................................................................................................... 44
4.2.1
Semiquantitative Auswertung der Läsionen des Dünndarms, Zäkums
und Kolons ............................................................................................ 45
4.2.2
Semiquantitative Auswertung der Läsionen im Rückenmark ................ 45
4.3 Immunhistologie ................................................................................................. 47
4.3.1
Durchführung ........................................................................................ 47
4.3.2
Protokoll für die Immunhistologie an Paraffinschnitten.......................... 49
4.3.3
Auswertung ........................................................................................... 52
4.4 Isolation von Ribonukleinsäure .......................................................................... 53
4.5 Reverse Transkription ........................................................................................ 54
4.6 Konventionelle Polymerase-Kettenreaktion........................................................ 55
4.7 Gelelektrophorese .............................................................................................. 57
4.8 Reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion........................ 57
4.9 Durchflusszytometrie .......................................................................................... 60
4.9.1
Durchführung ........................................................................................ 60
4.9.2
Protokoll für die Durchflusszytometrie ................................................... 61
4.10 Statistik ............................................................................................................. 64
5
Viral infection of the central nervous system exacerbates interleukin-10
receptor deficiency-mediated colitis in SJL mice ......................................... 66
5.1 Nonstandard abbreviations ................................................................................ 67
5.2 Abstract .............................................................................................................. 68
5.3 Introduction ........................................................................................................ 69
5.4 Results ............................................................................................................... 72
5.5 Discussion .......................................................................................................... 90
5.6 Materials and Methods ....................................................................................... 96
Inhaltsverzeichnis
III
5.6.1
Experimental design ............................................................................. 96
5.6.2
Histology ............................................................................................... 98
5.6.3
Immunohistochemistry .......................................................................... 99
5.6.4
RNA isolation and reverse transcription .............................................. 101
5.6.5
Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction ............ 102
5.6.6
Flow cytometry .................................................................................... 103
5.6.7
Statistical analysis............................................................................... 104
5.7 Acknowledgements .......................................................................................... 105
5.8 References ....................................................................................................... 106
5.9 Supplemental material ...................................................................................... 115
6
Diskussion ...................................................................................................... 126
6.1. Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen und ihre Pathogenese ................ 126
6.2 Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen des Menschen ............................ 128
6.3 Exazerbation von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen durch virale
Infektionen........................................................................................................ 130
6.4 Wechselwirkungen zwischen Darm und Zentralem Nervensystem .................. 132
6.4.1
Der Einfluss von psychischem Stress ................................................. 132
6.4.2
Die Bedeutung der Darmflora für die Etablierung von
Autoimmunkrankheiten ....................................................................... 134
6.5 Komorbidität von Multiple Sklerose und chronisch-entzündlichen
Darmerkrankungen .......................................................................................... 136
6.6 Mögliche Ursachen für die begrenzte Modulation der Entzündungsreaktion im
Rückenmark nach Blockade des Interleukin-10-Rezeptors .............................. 137
6.6.1
Kompartimentalisierung der Entzündung im Zentralen
Nervensystem………. ......................................................................... 138
6.6.2
Die Blut-Hirn-Schranke ....................................................................... 139
Inhaltsverzeichnis
6.6.3
IV
Immunologischer Erschöpfungszustand und Sequestration der
Entzündung im Darm .......................................................................... 141
6.7 Interleukin-10 und andere Autoimmunkrankheiten ........................................... 143
6.8 Schlussfolgerungen .......................................................................................... 145
7
Zusammenfassung ........................................................................................ 147
8
Summary......................................................................................................... 150
9
Literaturverzeichnis ....................................................................................... 153
10 Anhang ............................................................................................................ 201
10.1 Bezugsquellen für Chemikalien, Reagenzien und Antikörper ......................... 201
10.2 Bezugsquellen für Geräte, Software und Einmalartikel................................... 209
10.3 Bezugsquelle für die Tiere .............................................................................. 215
10.4 Lösungen und Puffer ...................................................................................... 216
10.5 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................... 218
11 Danksagung ..................................................................................................... 223
Abbildungsverzeichnis
I
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 2-1:
Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten
10
Abbildung 2-2:
Kreuzregulation der Th1/Th2-Immunität
12
Abbildung 2-3:
Interaktion von IL-10 mit dem IL-10R-Komplex
26
Abbildung 4-1:
Versuchsdesign von Experiment 2
38
Abbildung 4-2:
Versuchsdesign von Experiment 3
40
Figure 5-1:
Motor coordination in Theiler’s murine encephalomyelitis
virus-infected SJL mice
73
Figure 5-2:
Clinical effects of Theiler`s murine encephalomyelitis virusinfection in SJL mice following IL-10R blockade
74
Figure 5-3:
Neuropathological findings in Theiler’s murine
encephalomyelitis virus-infected SJL mice
75
Figure 5-4:
Effects of IL-10R blockade upon the spinal cord in Theiler’s
murine encephalomyelitis virus-infected SJL mice
77
Figure 5-5:
Enteric disease following IL-10R blockade in non-infected
SJL mice
80
Figure 5-6:
Effects of IL-10R blockade upon the spleen in non-infected
SJL mice
82
Figure 5-7:
Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infection
exacerbates enteric disease following IL-10R blockade
84
Figure 5-8:
Effects of acute Theiler’s murine encephalomyelitis
virus-infection (experiment I) upon cytokine expression and
phenotypical changes in the spleen of IL-10R blocked SJL
mice
86
Figure 5-9:
Effects of chronic Theiler’s murine encephalomyelitis virusinfection (experiment II) on cytokine expression and
phenotypical changes in the spleen of IL-10R neutralized
SJL mice
88
Abbildungsverzeichnis
II
Leukomyelitis in Theiler’s murine encephalomyelitis
virus-infected SJL mice
115
Figure 5-11:
Study design
116
Abbildung 6-1:
Übersicht über mögliche Auswirkungen der Hypothalamusautonomes Nervensystem-Achse und der HypothalamusHypophysen-Nebennierenrinden-Achse auf den Darm
bei Morbus Crohn
134
Abbildung 6-2:
Aufbau der Blut-Hirn-Schranke
Figure 5-10:
139
Tabellenverzeichnis
I
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2-1:
Übersicht über die Wirkungen von IL-10
29
Tabelle 4-1:
Übersicht über die verwendeten Tiere aus Versuch 1
36
Tabelle 4-2:
Übersicht über die verwendeten Tiere aus Versuch 2
37
Tabelle 4-3:
Übersicht über die verwendeten Tiere aus Versuch 3
39
Tabelle 4-4:
Bewertungskriterien der klinischen Untersuchung
42
Tabelle 4-5:
Semiquantitative Auswertung des Darms
46
Tabelle 4-6:
Semiquantitative Auswertung des Rückenmarks
47
Tabelle 4-7:
Übersicht über die durchgeführten immunhistologischen
Untersuchungen
51
Probenansatz für die konventionelle PolymeraseKettenreaktion
55
Spezifische Primerpaare für den mRNS-Nachweis von
Zytokinen, Foxp3, TMEV, MBP und den drei
Referenzgenen GAPDH, HPRT und β-Aktin
56
Tabelle 4-8:
Tabelle 4-9:
Tabelle 4-10:
Temperaturprofil und Zyklusdauer für die Amplifikation der
cDNS
59
Tabelle 4-11:
Zusammenfassung der Antikörper für die
Durchflusszytometrie
64
Table 5-1:
Summary of antibodies used for immunohistochemistry
101
Table 5-2:
Summary of statistical analyses (p-values): effects of
IL-10R blockade during acute Theiler’s murine
encephalomyelitis (experiment I)
117
Table 5-3:
Summary of statistical analyses (p-values): effect of IL-10R
blockade during chronic Theiler’s murine encephalomyelitis
(experiment II)
119
Table 5-4:
Statistical analyses of obtained data: effects of IL-10R
blockade in non-infected SJL mice
121
Tabellenverzeichnis
II
Table 5-5:
Summary of statistical analyses (p-values): effects of acute
Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infection upon
IL-10R blockade (experiment I)
122
Table 5-6:
Summary of statistical analyses (p-values): effects of
chronic Theiler’s murine encephalomyelitis virus infection
upon IL-10R blockade (experiment II)
124
Übersicht über inflammatorische Erkrankungen, die mit
Polymorphismen des Interleukin-10-Gens assoziiert sind
144
Tabelle 6-1:
Einleitung
1
1
Einleitung
Bei dem Theiler´schen murinen Enzephalomyelitisvirus (TMEV, Theilervirus,
Theiler´s murine encephalomyelitis virus) handelt es sich um ein einzelsträngiges
RNS-Virus aus dem Genus Cardiovirus und der Familie der Picornaviridae (PEVEAR
et al., 1987). Natürlich infizierte Mäuse (Mus musculus) entwickeln nach fäkal/oraler
Übertragung eine asymptomatische, enterale Infektion mit Serokonversion. TMEV
persistiert dabei überwiegend in Enterozyten und den mesenterialen Lymphknoten.
Nur in seltenen Fällen tritt auch eine Infektion des Zentralen Nervensystems (ZNS) in
Form einer Poliomyelitis und -enzephalitis auf (LIPTON et al., 2001). Die mehr als 20
bekannten TMEV-Stämme können anhand ihrer Neurovirulenz nach experimenteller,
intrazerebraler Infektion in zwei Gruppen unterteilt werden. Die Gruppe der
hochvirulenten Stämme beinhaltet den GDVII- und den FA-Stamm. Diese
verursachen eine in der Regel fatal verlaufende Polioenzephalitis. Überleben die
Mäuse die Infektion, wird das Virus vollständig eliminiert. Im Gegensatz hierzu,
verursachen die weniger neurovirulenten Stämme der zweiten Gruppe, wie
beispielsweise
der
BeAn-Stamm,
einen
biphasischen
Krankheitsverlauf
in
empfänglichen Mausstämmen. Dabei ist der Krankheitsverlauf nicht nur abhängig
vom verwendeten Virusstamm, sondern vor allem vom Genotyp der Maus. Während
SJL-Mäuse nach intrazerebraler Injektion eine biphasische Erkrankung mit akuter
Polioenzephalitis
und
chronisch-demyelinisierender
Leukoenzephalomyelitis
entwickeln, eliminieren C57BL/6-Mäuse und einige BALB/c-Substämme das Virus
nach der akuten Phase und entwickeln keine Demyelinisierung (LIPTON, 1975;
LIPTON und DAL CANTO, 1979; FU et al., 1990; OLESZAK et al., 2004).
Auf Grund des chronisch-progressiven Charakters und dem histologischen Bild dient
die chronische Phase der TMEV-Infektion als ein wichtiges Tiermodell für die Multiple
Sklerose (MS) des Menschen (DAL CANTO und RABINOWITZ, 1982; DENIC et al.,
2011). Trotz intensiver Forschungsbemühungen zur Pathogenese und Therapie der
MS sind die Therapieerfolge, insbesondere in der chronisch-progressiven Phase der
Erkrankung noch immer unzureichend (FITZNER und SIMONS, 2010). In den letzten
Jahren rückten besonders immunmodulatorische Therapeutika in den Mittelpunkt der
Einleitung
2
Forschung (AMEDEI et al., 2012). Vorangegangene Arbeiten mit der Theiler´schen
murinen Enzephalomyelitis (Theiler´s murine encephalomyelitis, TME) zeigten eine
erhöhte Expression von Interleukin (IL)-10 im Gehirn von SJL-Mäusen im Vergleich
zu resistenten C57BL/6-Mäusen. Die erhöhten IL-10-mRNS-Konzentrationen gingen
mit einer verzögerten Viruselimination einher und unterstrichen die Hypothese, dass
ein Ungleichgewicht im Zytokin-Milieu in der Frühphase der Infektion zu einer
unzureichenden Viruselimination in der chronischen Phase der Erkrankung beitragen
könnte (HERDER et al., 2012). Eine verminderte erregerspezifische Immunantwort
durch IL-10 konnte auch bereits bei der experimentellen Infektion mit dem
Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) festgestellt werden. Eine in vivo
Blockade des IL-10-Rezeptors (IL-10R) durch einen neutralisierenden Antikörper
resultierte hierbei in einem therapeutischen Effekt durch Etablierung einer protektiven
Immunantwort mit konsekutiver Elimination des Virus (BROOKS et al., 2006;
EJRNAES
et al., 2006).
Ähnliche
Effekte
wurden
auch bereits
bei der
experimentellen Infektion mit dem West-Nil-Virus (WNV) sowie bei der Humanen
Immundefizienz-Virus (HIV)- und Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektion des Menschen
festgestellt (RIGOPOULOU et al., 2005; BAI et al., 2009; BROCKMAN et al., 2013).
Allerdings ist die Bedeutung von IL-10 für die chronische Phase der TME bisher nur
unzureichend untersucht worden. Auch im Hinblick auf die MS des Menschen kam
damit die Frage auf, ob eine Unterbrechung der IL-10-Signalkaskade einen
therapeutischen Effekt bei der TME zur Folge hat oder die Entwicklung von
immunpathologischen Prozessen in nicht-infizierten und infizierten SJL-Mäusen
fördert.
Literaturübersicht
3
2
Literaturübersicht
2.1
Die Multiple Sklerose
Bei der Multiplen Sklerose (MS) handelt es sich um die häufigste chronischentzündliche Erkrankung des ZNS bei jungen Erwachsenen (HIRTZ et al., 2007). Sie
betrifft
etwa
0,1%
der Weltbevölkerung,
wobei
Nordamerika
und
Europa
topographisch deutlich überrepräsentiert sind (HAUSER und OKSENBERG, 2006).
MS führt zu sensorischen, motorischen und kognitiven Beeinträchtigungen, die mit
Depressionen, Migräne, Vertigo (Schwindel), Diplopie (Doppelsehen), Parästhesie,
Paraplegie, Trigeminusneuralgie, Müdigkeit, Harnabsatzstörungen und sexueller
Dysfunktion einhergehen können (PIKSTON et al., 2007; GOLDENBERG, 2012).
Die Ätiologie dieser Erkrankung ist unklar. Vermutlich liegt eine multifaktorielle
Genese mit einer Kombination aus genetischer Prädisposition und nicht-genetischen
Faktoren zu Grunde (CREE, 2007). Neben Umweltfaktoren werden auch zahlreiche
virale Erreger, wie das Masern-, das Epstein-Barr-, das Herpes-simplex-, das
Varizella-Zoster- und das humane Herpesvirus-6 als auslösende Agenzien diskutiert
(JACOBSON et al., 1985; BERGSTRÖM et al., 1989; SINDIC et al., 1994;
CHALLONER et al., 1995; RAND et al., 2000). Darüber hinaus wird eine Beteiligung
humaner Coronaviren sowie des kaninen Staupe- und des humanen T-ZellLeukämie-Virus von einigen Autoren in Erwägung gezogen (HAAHR und
HÖLLSBERG, 2001; RIMA et al., 2006). Im Liquor cerebrospinalis von MS-Patienten
wurde außerdem ein MS-assoziiertes Retrovirus nachgewiesen (PERRON et al.,
1997). Neben monoviralen Infektionen könnten auch Koinfektionen verschiedener
viraler Erreger zur Entstehung der MS beitragen. Beispielsweise wurden neurotrope
Herpesvirusinfektionen als Kofaktor, im Sinne eines zusätzlichen Stimulus (triggering
effect) für latente Retrovirusinfektionen bei MS-Patienten beschrieben (PERRON et
Literaturübersicht
4
al., 1993). Allerdings ist bisher keines dieser Viren in einen eindeutigen,
ätiologischen Zusammenhang mit der Entstehung der MS gebracht worden.
Die
klinische
Einteilung
der MS
erfolgt
in
vier
Gruppen
abhängig
vom
Krankheitsverlauf (GOLDENBERG, 2012): Die häufigste Form ist die schubförmigremittierende MS. Diese Verlaufsform ist durch akute Schübe gekennzeichnet, die
von einer temporären Rekonvaleszenz gefolgt werden, in der die Symptome deutlich
milder werden oder ganz abklingen. Im chronischen Verlauf der Erkrankung kann
diese Verlaufsform in die sekundär progrediente MS übergehen. Die Symptome
werden stärker und die Intervalle kürzer, zum Teil entfallen die Phasen der
Rekonvaleszenz vollständig. In selteneren Fällen, bei circa 10% der MS-Patienten,
tritt eine primär progrediente Form auf, bei der die Symptome von Beginn an stark
zunehmen und keine Phasen der Remission auftreten. Bei der vierten Verlaufsform
handelt es sich um die progressiv-schubförmige MS. Sie tritt bei weniger als 5% der
Betroffenen auf und ist durch einen primär progressiven Verlauf mit schubförmig
auftretender Verstärkung der Symptome charakterisiert (HAUSER et al., 2008;
GOLDENBERG, 2012).
Pathologisch-anatomisch treten bei der MS multifokale, rötliche oder graue Areale
von derber, teils gummiähnlicher Konsistenz in der weißen Substanz des Gehirns
und des Rückenmarks auf. Oftmals ist darüber hinaus auch der Sehnerv betroffen
(Optikusneuritis; GOLDENBERG, 2012). Histologisch handelt es sich um einen
plaqueförmigen Verlust von Oligodendrozyten und Myelin, der mit einer Infiltration
von Lymphozyten und Makrophagen vergesellschaftet ist (HAUSER et al., 2008). In
der progressiven Phase der Erkrankung liegt darüber hinaus eine großflächige
Demyelinisierung in der grauen Substanz vor, die besonders den zerebralen und
zerebellären Kortex sowie den Hippocampus betrifft. Außerdem weisen häufig auch
makroskopisch unveränderte Areale der weißen Substanz (normal appearing white
matter, NAWM) eine diffuse, entzündliche Infiltration und Mikrogliaaktivierung auf
(KUTZELNIGGL et al., 2005; GEURTS et al., 2007; LASSMANN et al., 2009).
Die Läsionen in der weißen Substanz werden anhand ihres pathohistologischen
Musters in vier verschiedene Gruppen eingeteilt (LASSMANN et al., 2001): Gruppe I
Literaturübersicht
5
(pattern I) beschreibt eine Makrophagen-assoziierte Demyelinisierung, bei der
überwiegend toxische Metabolite von Makrophagen, wie Tumornekrosefaktor (TNF)
und reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) zu einer Zerstörung
von Myelin führen. Entsprechende Läsionen sind überwiegend perivenös lokalisiert
und bestehen aus T-Zellen, Makrophagen und aktivierten Mikroglia (GRIOT et al.,
1990). Gleichartige Veränderungen finden sich auch bei antikörpervermittelten
Läsionen der Gruppe II (pattern II). Allerdings weisen diese Läsionen zusätzlich eine
Ablagerung von Immunglobulinen und aktivierten Komplementfaktoren auf, sodass
eine komplementvermittelte Lyse des durch Antikörper markierten Myelins stattfindet.
Bei Gruppe III (pattern III) handelt es sich um eine ischämisch-induzierte, distale
Oligodendrogliopathie
in
Folge
einer
T-Zell-vermittelten
Vaskulitis
kleinerer
Blutgefäße der weißen Substanz. Gruppe IV (pattern IV) beschreibt eine seltene
primäre Schädigung von Oligodendrozyten mit sekundärer Demyelinisierung. Dieses
Muster tritt nur bei der primär progressiven Verlaufsform der MS auf und weist
histologisch
eine
massive,
periläsionale,
saumförmige
Degeneration
von
Oligodendrozyten auf. Ursächlich liegt wahrscheinlich eine metabolische Störung
oder ein genetischer Defekt der Oligodendrozyten zu Grunde. Auf die Schädigung
der Myelinscheiden folgt eine Schädigung der Axone. Diese erfolgt einerseits direkt
durch toxische Metabolite von Makrophagen und zytotoxischen T-Zellen und
andererseits indirekt durch eine fehlende trophische Versorgung ausgehend von den
geschädigten Oligodendrozyten (LUCCHINETTI et al., 2000; LASSMANN et al.,
2001).
2.2
Tiermodelle der Multiplen Sklerose
Da die MS nur beim Menschen auftritt und es sich um ein sehr variables und
vielschichtiges Krankheitsgeschehen handelt, werden in der Forschung zahlreiche
Tiermodelle genutzt, um die unterschiedlichen Aspekte der Erkrankung zu
untersuchen. Grundsätzlich werden autoimmun-mediierte, genetische und toxisch
Literaturübersicht
6
bedingte sowie viral-induzierte Modelle unterschieden (RANSOHOFF et al., 2012).
Bei der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) handelt es sich um
das am häufigsten verwendete Tiermodell der MS (CONSTANTINESCU et al.,
2011). Durch Injektion von myelinspezifischen Proteinen, wie beispielsweise
Basischem Myelinprotein (myelin basic protein, MBP), Myelin-Proteolipid-Protein
(PLP)
oder
Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein
(MOG)
wird
eine
Autoimmunreaktion induziert, die gegen körpereigenes Myelin gerichtet ist. Alternativ
kann die EAE auch durch einen adoptiven Transfer von CD4+ oder CD8+
enzephalitogenen T-Zellen ausgelöst werden (CONSTANTINESCU et al., 2011;
HUSEBY et al., 2001). Histologisch ähneln die Läsionen denen der MS (WAKSMAN
und ADAMS, 1962; CONSTANTINESCU et al., 2011). Allerdings entwickeln
C57BL/6-Mäuse nach Injektion des Antigens bei der „klassischen Form“ der EAE
einen akuten Krankheitsverlauf ohne wiederkehrende Schübe und die Erkrankung
betrifft im Gegensatz zur MS vor allem die subpialen Bereiche der weißen Substanz
des Rückenmarks. Darüber hinaus handelt es sich bei der EAE überwiegend um
eine CD4+-T-Zellantwort während in MS-Plaques CD8+-T-Zellen dominieren (BABBE
et al., 2000; RANSOHOFF et al., 2012). Neben der „klassischen Form“ der EAE gibt
es allerdings auch schubförmig (relapsing-remitting EAE) bzw. chronisch verlaufende
Manifestationsformen,
die
den
rezidivierenden
Charakter
der
MS
präziser
wiederspiegeln (BERARD et al., 2010). Warum die Administration desselben
Antigens im gleichen Mausstamm aber z.T. unterschiedliche Formen der EAE
hervorruft, ist weitestgehend unklar. Vermutlich spielen in der Pathogenese der
schwereren, schubförmigen und chronischen Verlaufsformen neben einer Dominanz
von CD8+-T-Zellen auch erhöhte Expressionen von proinflammatorischen Zytokinen
wie z.B. Interferon-γ, (INF-γ), TNF, IL-1α und chemokine (C-X-C motif) ligand
(CXCL)-9 eine Rolle (BERARD et al., 2010).
Bei den genetischen Tiermodellen handelt es sich überwiegend um „knockout“Mutanten, wie beispielsweise MBP-deletierte „shiverer“-Mäuse oder PLP-deletierte
„rumshaker“-Mäuse (EDGAR et al., 2004; ROUSSARIE et al., 2007). Eines der
meistverwendeten Modelle zur Erzeugung toxischer Demyelinisierung nutzt den
Kupfer-Chelator Cuprizon. Cuprizon verursacht nach mehrwöchiger Fütterung bei
Literaturübersicht
7
Mäusen eine Dysfunktion des mitochondrialen Komplex IV, die mit einer selektiven
Toxizität gegenüber Oligodendrozyten einhergeht und Apoptosen im Corpus
callosum und im Hippocampus und Cerebellum auslöst (HOFFMANN et al., 2008;
SKRIPULETZ et al., 2010). Neben der Demyelinisierung weisen toxisch-induzierte
Läsionen bereits kurz nach Wegfall des toxischen Agens eine charakteristische
Remyelinisierung auf (MATSUSHIMA und MORELL, 2001; HERDER et al., 2011;
SKRIPULETZ et al., 2011). Ein gleichartiges Nebeneinander von Schädigung und
Reparatur findet sich auch in den Läsionen der MS. Allerdings löst der toxische Insult
durch Cuprizon im Vergleich zur MS keine andauernde Immunantwort aus
(RANSOHOFF et al., 2012). Die wichtigsten viral-induzierten Modelle der MS sind
die TME und das Maus-Hepatitis-Virus (MHV). Während TMEV nach intrazerebraler
Infektion von SJL-Mäusen im ZNS persistiert, wird MHV in immunkompetenten
Wirten innerhalb von zwei Wochen nach der Infektion eliminiert (MARTEN et al.,
2001; BERGMANN et al., 2006). Dennoch setzt als Spätfolge der MHV-Infektion eine
fortlaufende Demyelinisierung ohne Nachweis des Pathogens ein (BERGMANN et
al., 2006).
2.3
Das Theiler´sche murine Enzephalomyelitisvirus
Das TMEV wurde 1937 von dem gleichnamigen Mikrobiologen Max Theiler entdeckt
(THEILER, 1937). Es gehört zur Familie der Picornaviridae und dem Genus
Cardiovirus (PEVEAR et al., 1987). Nach experimenteller, intrazerebraler Infektion
verursachen die hochvirulenten Stämme, wie beispielsweise der GDVII- und der FAStamm, eine in der Regel fatal verlaufende Polioenzephalitis. Empfängliche SJLMäuse, die mit dem niedrig virulenten BeAn-Stamm infiziert werden, entwickeln
hingegen einen biphasischen Krankheitsverlauf mit akuter Polioenzephalitis und
chronisch-demyelinisierender Leukoenzephalomyelitis, die nach etwa 30-40 Tagen
einsetzt (LIPTON, 1975; FU et al., 1990; OLESZAK et al., 2004).
Literaturübersicht
8
Histologisch liegt in der Frühphase der Erkrankung überwiegend eine transiente
Infiltration
der
Plasmazellen
grauen
Substanz
sowie
CD4+-
Entzündungszellinfiltrate
sind
und
und
der
Meningen
durch
Makrophagen,
vor.
Perivaskuläre
Hippocampus,
Hypothalamus,
CD8+-T-Zellen
hauptsächlich
in
Thalamus, Hirnstamm, Basalganglien und den Vorderhörnern des Rückenmarks
nachweisbar (OLITSKY und SCHLESINGER, 1941; STROOP et al., 1981;
RODRIGUEZ et al., 1987; OLESZAK et al., 1995; ZOECKLEIN et al., 2003;
KUMMERFELD et al., 2012). Das Virus infiziert initial überwiegend Neuronen, breitet
sich später aber auch über Astrozyten, Oligodendrozyten, Gliavorläuferzellen und
Mikroglia/Makrophagen aus (WROBLEWSKA et al., 1979; BRAHIC et al., 1981;
O`SHEA et al., 1997). Nach einmaliger Infektion persistiert das TMEV des BeAnStammes bei SJL-Mäusen lebenslang in Mikroglia/Makrophagen, Oligodendrozyten
und Astrozyten (CLATCH et al., 1990; LIPTON et al., 1995; QI und DAL CANTO,
1996; ZHENG et al., 2001; PRINGPROA et al., 2010; KUMMERFELD et al., 2012).
Resistente Stämme, wie C57BL/6-Mäuse oder einige BALB/c-Substämme entwickeln
hingegen lediglich eine akute Polioenzephalitis und keine Demyelinisierung. Sie
eliminieren das Virus bereits in der Frühphase der Infektion (LIPTON und DAL
CANTO, 1979). Während die Erkrankung bei SJL-Mäusen initial häufig klinisch
inapparent verläuft, zeigen die Tiere in der Spätphase der Erkrankung reduzierte
spontane Aktivität, progressive Ataxie und spastische Paresen (THEILER 1937;
ULRICH et al., 2006; GERHAUSER et al., 2007). Histologisch liegt ab etwa 30 Tagen
nach
der
Infektion
eine
progressive
Demyelinisierung
mit
Nachweis
von
Myelinophagen und Sphäroiden im Rückenmark vor (MCGAVERN et al., 1999).
Diese werden, wie bereits in der Frühphase der Erkrankung, von überwiegend
perivaskulär
lokalisierten
Entzündungszellinfiltraten
begleitet
(LIPTON
und
JELACHICH, 1997). Obwohl das gesamte Rückenmark betroffen ist, etablieren sich
die stärksten Läsionen in den ventralen und lateralen Funiculi der thorakalen
Rückenmarkssegmente. Die dorsalen Segmente sind nur sporadisch und weniger
stark betroffen (RODRIGUEZ et al., 1996; URE und RODRIGUEZ, 2002; ULRICH et
al., 2010).
Literaturübersicht
9
Im Vergleich zu Infektionen mit dem BeAn-Stamm rufen Infektionen mit dem
ebenfalls niedrig virulenten DA-Stamm eine stärkere Demyelinisierung hervor. Im
Rückenmark liegt außerdem mehr virale RNS und virales Antigen vor. Die in der
Spätphase der Erkrankung auftretenden, funktionalen Defizite sind stärker
ausgeprägt, treten jedoch auch später auf als nach Infektion mit dem BeAn-Stamm
(NJENGA et al., 1999; ZOECKLEIN et al., 2003).
Pathogenetisch tragen vermutlich verschiedene Faktoren zur Etablierung der
demyelinisierenden Erkrankung bei. Neben der direkten Phagozytose von Myelin und
der primären Schädigung von Oligodendrozyten spielt auch Exzitotoxizität durch
Glutamat, sowie die Freisetzung zytotoxischer Faktoren eine Rolle (LANGRISH et
al., 2005; DOCAGNE et al., 2007). In erster Linie handelt es sich hierbei um
Proteasen, Zytokine, Komplementfaktoren, Stickstoffmonoxid (NO) und ROS
(LANGRISH et al., 2005). Insgesamt sind die Mechanismen, die zur Entwicklung der
Demyelinisierung beitragen sehr komplex, das Immunsystem spielt aber bei allen
Mechanismen eine zentrale Rolle (MECHA et al., 2013).
2.4
Die Immunantwort bei der Theiler´schen murinen
Enzephalomyelitis
2.4.1
CD4+-T-Helferzellen
CD4+-T-Helferzellen kommt in der Pathogenese der akuten und chronischen TME
eine zentrale Rolle zu (OLESZAK et al., 2004). Für ihre Aktivierung bindet initial ein
Antigen
an
den
T-Zellrezeptor
(T-cell
receptor,
TCR),
welches
über
Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC, Major Histocompatibility Complex) der
Klasse II präsentiert wird. Wenn gleichzeitig eine Kostimulation über CD28-CD80
bzw. CD28-CD86 erfolgt, setzt eine Aktivierung der CD4+-T-Helferzellen ein. Die T-
Literaturübersicht
10
Zell-Aktivierung ist schematisch in Abbildung 2-1 dargestellt (TIZARD, 2013;
MCGAVIN und ZACHARY, 2007).
+
Abbildung 2-1: Aktivierung von CD4 T-Lymphozyten.
Die Aktivierung erfolgt in zwei Schritten: Initial bindet der TCR das Antigen, das über einen MHCKlasse-II-Komplex von der APC präsentiert wird (Signal 1), dann erfolgt eine Kostimulation durch
Bindung von CD80 bzw. CD86 an CD28 (Signal 2).
APC = antigenpräsentierende Zelle (antigen presenting cell), CD = Cluster of Differentiation, MHCKlasse-II-Komplex = Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex) der Klasse
II, TCR = T-Zell-Rezeptor (T cell receptor complex).
Modifiziert nach SNYDER, 2007.
In Abhängigkeit vom Zytokin-Milieu entwickeln sich CD4+-T-Helferzellen zu Th1-,
Th2- oder Th17-Zellen (MOSMANN und COFFMAN, 1989; TIZARD, 2013; SCHMITT
und UENO, 2015). Eine Differenzierung zu Th1-Zellen erfolgt unter Einfluss von
Interleukin (IL)-12, welches überwiegend von Antigen-präsentierenden Zellen (APC,
antigen presenting cells) wie Makrophagen, dendritischen Zellen und B-Zellen
gebildet wird. Nach Aktivierung über den Transkriptionsfaktor T-bet produzieren Th1Zellen
überwiegend
IL-2,
Interferon-γ
(βγ)
und
Lymphotoxin-α
(syn.
Literaturübersicht
11
Tumornekrosefaktor-β). Th1-Zellen führen somit zur Aktivierung von T-Zellen, BZellen, natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und Makrophagen sowie zur Produktion
von Immunglobulin (Ig) G durch Plasmazellen (SCHMITT und UENO, 2015). Sie
lösen eine primär gegen intrazelluläre Organismen gerichtete Immunantwort aus und
verursachen eine Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ (Typ-IV- Allergie,
TIZARD, 2013).
Im Gegensatz hierzu benötigen Th2-Zellen für ihre Aktivierung IL-4 aus
Makrophagen und dendritischen Zellen sowie eine Kostimulation durch CD86. Sie
synthetisieren hauptsächlich IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 und stimulieren die
Proliferation von B-Zellen sowie die Sekretion von Ig G, Ig A und Ig E (SCHMITT und
UENO, 2015). Außerdem wird über die Expression von IL-10 die Funktion von
Makrophagen gehemmt und die Ausbildung einer Th1-Immunantwort unterdrückt.
Die
Th2-Immunantwort ist mit einer verstärkten
Immunreaktion
gegenüber
extrazellulären Pathogenen vergesellschaftet, führt aber zu einer insuffizienten
Immunität bei viralen Infektionen (TIZARD, 2013). Eine Übersicht über die
verschiedenen Zytokine, die an der Aktivierung von Th1- und Th2-Zellen sowie an
der Kreuzregulation der Th1/Th2-Immunität beteiligt sind, ist in Abbildung 2-2
dargestellt.
Literaturübersicht
12
Abbildung 2-2: Kreuzregulation der Th1/Th2-Immunität.
Während Th1-Zellen überwiegend durch IL-12 aktiviert werden und die zellmediierte Immunität
+
stärken indem sie Makrophagen und CD8 zytotoxische T-Zellen aktivieren, werden Th2-Zellen durch
IL-4 aktiviert und fördern die Entwicklung einer humoralen Immunität. Sie sezernieren vor allem
Zytokine, die das Wachstum und die Differenzierung von B-Zellen, Mastzellen und eosinophilen
Granulozyten fördern. Darüber hinaus wird über IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-12 und IL-13 eine
Kreuzregulation der beiden Signalwege vermittelt, sodass eine inverse Beziehung zwischen der
zellmediierten und humoralen Immunantwort besteht.
IL = Interleukin, IFN-γ = Interferon-γ, Th1-Zellen = T-Helfer-Zellen der Subgruppe 1, Th2-Zellen = THelfer-Zellen der Subgruppe 2, Treg = regulatorische T-Zellen, CD = Cluster of Differentiation.
Modifiziert nach SNYDER, 2007.
Th17-Zellen
werden
durch
IL-23,
IL-6,
IL-21
und
den
transformierenden
Wachstumsfaktor-β (TGF-β) initiiert und haben zwei Hauptfunktionen: Einerseits
unterstützen sie die Funktion von B-Zellen und wirken anderseits proinflammatorisch
indem sie die Proliferation von Granulozyten fördern, Makrophagen rekrutieren und
deren Überlebenszeit verlängern. Sie sezernieren IL-22 sowie IL-17A und -F und
fördern somit eine gegen extrazelluläre Erreger gerichtete Immunantwort (GAFFEN,
2009; TIZARD, 2013). Im Gegensatz zu Th1-Zellen begünstigen Th17-Zellen die
Entstehung einer viralen Persistenz bei der TME, da sie das Überleben
virusinfizierter Zellen begünstigen (HOU et al., 2009).
Literaturübersicht
13
In der Frühphase der TMEV-Infektion wird virales Antigen durch APC prozessiert und
CD4+-T-Zellen
präsentiert.
Nach
Freisetzung
proinflammatorischer
Zytokine
migrieren Makrophagen und Monozyten in das ZNS. Ihre Infiltration geht mit einer
Schädigung und dem Abbau von Myelin einher und resultiert schließlich in der
Freisetzung von Myelinbestandteilen und der Etablierung einer anti-Myelinspezifischen CD4+-T-Zellpopulation (Th1-vermittelte Immunantwort; OLSON und
MILLER, 2004). Entsprechend resultiert eine intravenöse Applikation von anti-CD4Antikörpern während der chronischen Phase der Infektion in einer verminderten
Demyelinisierung und einer geringeren Anzahl an schweren Krankheitsverläufen
(WELSH et al., 1987; MURRAY et al., 1998). Die Infektion CD4-deletierter SJLMäuse führt hingegen zu einer Steigerung der Demyelinisierung, da virales Antigen
in der Frühphase der Infektion nur unzureichend eliminiert wird (MURRAY et al.,
1998). In gleicher Weise entwickeln C57BL/6-Mäuse mit einer Deletion des Aβ-Gens
des
MHC-Klasse-II-Komplexes
eine
Viruspersistenz
mit
konsekutiver
Demyelinisierung. Gleichzeitig weisen sie auch niedrigere anti-TMEV-Immunglobulin
(Ig)G-Spiegel als immunkompetente C57BL/6-Mäuse auf. Eine schwache CD4Antwort mit einem Mangel an neutralisierenden Antikörpern führt bei diesen Tieren
zu einer verringerten Viruselimination und Etablierung einer persistenten Infektion
(NJENGA et al., 1996).
Wenngleich also in der Frühphase der TME eine Spezifität infiltrierender T-Zellen
gegen das TMEV-Epitop VP270-86 besteht und die Viruslast effektiv vermindert wird,
entwickelt sich in der chronischen Phase der Infektion eine gegen autologe
Myelinepitope gerichtete Autoimmunität mit konsekutiver Demyelinisierung (GERETY
et al., 1994; KATZ-LEVY et al., 2000; KANG et al., 2002; MCMAHON et al., 2005).
Überwiegend besteht hierbei vermutlich eine Autoreaktivität gegen MBP139-151,
hervorgerufen durch eine de novo Aktivierung (priming) autoreaktiver T-Zellen
gegenüber Myelinautoepitopen, die im Zuge der T-Zell-mediierten Demyelinisierung
freigesetzt wurden (epitope spreading; Th2-vermittelte Immunantwort; OLSON und
MILLER, 2004; CHASTAIN und MILLER, 2012). Da keine Kreuzreaktivität zwischen
den immundominanten TMEV-Epitopen und denen der Myelinproteine PLP, MBP
Literaturübersicht
14
und MOG besteht, scheint Molekulares Mimikry bei der TME lediglich eine
untergeordnete Rolle zu spielen (MILLER et al., 1997).
2.4.2
CD8+-zytotoxische T-Zellen
Neben CD4+-T-Zellen spielen auch CD8+-T-Zellen eine Rolle in der Früh- und
Spätphase der TME (OLESZAK et al., 2004). Für eine vollständige Aktivierung von
CD8+-zytotoxischen
T-Zellen
ist
neben
einem
an
MHC-Klasse-I-Komplexe
gebundenem Antigen eine Kostimulation durch CD4+-Th1-Zellen erforderlich. Die
aktivierten, zytotoxischen T-Zellen führen dann durch die Freisetzung zytotoxischer
Proteine zur Apoptose von virusinfizierten Zellen (JANEWAY et al., 2001; TIZARD,
2013).
Allerdings ist diese Immunantwort bei SJL-Mäusen im Gegensatz zu C57BL/6Mäusen nicht ausreichend um das TMEV vollständig zu eliminieren (LIPTON und
DAL CANTO, 1979). Entsprechend führt eine experimentelle Infektion von CD8+-TZell-Knock-out (KO)-Mäusen auf einem C57BL/6-Hintergrund zu einer TMEVPersistenz und Etablierung einer demyelinisierenden Erkrankung (MURRAY et al.,
1998; OLESZAK et al., 2004). Während sich eine starke T-Zellantwort mit
konsekutiver, antiviraler Immunität positiv auf den frühen Krankheitsverlauf auswirkt,
führt eine intraperitoneale Applikation von anti-CD8-Antikörpern zum Zeitpunkt der
beginnenden Demyelinisierung nach Infektion mit dem BeAn-Stamm zu einem
reduzierten Myelinabbau und einem günstigeren Krankheitsverlauf (RODRIGUEZ
und SRIRAM, 1988). Entsprechend wiesen TSUNODA et al. (2006) das Vorliegen
autoreaktiver TMEV-spezifischer CD8+-T-Zellen bei SJL-Mäusen nach. Nach
Übertragung (adoptiver Transfer) dieser Zellen in nicht-infizierte Tiere, entwickelten
diese ebenfalls eine Meningitis und perivaskuläre Infiltrate im ZNS (LIBBEY et al.,
2012). Allerdings ergab ein Vergleich der CD8+-T-Zellantwort von SJL- und C57BL/6Mäusen nach TMEV-Infektion zwar einige quantitative, jedoch keine qualitativen
Unterschiede:
Während
+
C57BL/6-Mäuse
initial
größere
Mengen
an
virus-
spezifischen CD8 -T-Zellen aufweisen, reduziert sich ihre Anzahl im Verlauf der
Literaturübersicht
15
Infektion derart stark, dass SJL-Mäuse im späteren Krankheitsverlauf höhere CD8+T-Zell-Spiegel als C57BL/6-Mäuse zeigen (LYMAN et al., 2004). Da beide Stämme
im Verlauf der Infektion aber gleiche Mengen proinflammatorischer Zytokine (TNF,
IFN-γ) exprimieren und sich die zytolytische Funktion der CD8 +-T-Zellen zwischen
C57BL/6- und SJL-Mäusen nicht unterscheidet, sind
die unterschiedlichen
Krankheitsverläufe bei diesen beiden Stämmen vermutlich nicht ausschließlich auf
die CD8+-T-Zellpopulation zurückzuführen (LYMAN et al., 2004; MECHA et al.,
2013).
CD8+-T-Zellen spielen außerdem eine Rolle für den sogenannten, immunologischen
Erschöpfungszustand (T cell exhaustion). Bei vielen viralen Erkrankungen mit einem
chronischen Verlauf, wie beispielsweise LCMV-, HIV- oder murinen CoronavirusInfektionen,
etabliert
sich
im
Krankheitsverlauf
eine
Erschöpfung
der
virusspezifischen CD8-T-Zellantwort (MOSKOPHIDIS et al., 1993; BERGMANN et
al., 1999; OXENIUS et al., 2002; FREBEL et al., 2010). Dieser Zustand manifestiert
sich
durch
eine
nachlassende
oder
fehlende
Expression
bestimmter,
proinflammatorischer Zytokine (z.B. IL-2 > TNF > IFN-γ) sowie einen Verlust des
proliferativen Potentials und einen deutlichen oder vollständigen Rückgang der
virusspezifischen CD8+-T-Zellpopulation. Zusätzlich scheinen aber auch CD4+-TZellen in ihrer Funktion beeinträchtigt zu werden (MOSKOPHIDIS et al., 1993;
FULLER et al., 2004; WHERRY et al., 2004; FREBEL et al., 2010).
Die vorherrschenden Mechanismen dieser immunologischen Erschöpfung sind
bisher nur teilweise bekannt, wahrscheinlich liegt ihnen aber eine multifaktorielle
Genese zu Grunde. Neben der Expression von IL-10 und TGF-β sowie hohen
Antigenspiegeln, spielt auch die Expression inhibitorischer Moleküle, wie PD-1
(programmed cell death 1), LAG-3 (lymphocyte-activation gene 3) und TIM-3 (T cell
immunoglobulin and mucin protein 3) auf T-Zellen eine Rolle für die Reduktion der
Immunantwort (MATTER et al., 2006; JONES et al., 2008; BLACKBURN et al., 2009;
FREBEL et al., 2010). Beispielsweise führt die Bindung von PD-1 an seine Liganden
PDL (programmed cell death ligand)-1 und PDL-2 zu einer verminderten T-ZellAktivierung. Einerseits fördert PD-1 auf diesem Wege die Selbsttoleranz und beugt
Literaturübersicht
16
Autoimmunkrankheiten vor, vermindert andererseits aber gleichzeitig die Etablierung
einer effektiven, antiviralen Immunität (NISHIMURA et al., 2001; IWAI et al., 2003;
KEIR et al., 2008). Inwieweit im Verlauf der TME eine Funktionsstörung von
zytotoxischen
T-Zellen
auftritt,
bzw.
welchen
Einfluß
ein
immunologischer
Erschöpfungszustand auf den Krankheitsverlauf hat, ist bislang noch überwiegend
unklar (KANEYAMA et al., 2014; TAKIZAWA et al., 2014). Allerdings wiesen
TAKIZAWA et al. (2014) eine erhöhte Expression von PD-1- und PDL-1-spezifischer
mRNS im Rückenmark von TMEV infizierten Mäusen nach. Die Gabe von anti-PD-1spezifischen
Antikörpern
resultiert
in
einer
klinischen
und
histologischen
Exazerbation der demyelinisierenden Erkrankung, sodass diesen inhibitorischen
Molekülen vermutlich eine wichtige Rolle in der TME zukommt.
2.4.3
Regulatorische T-Zellen
Auch regulatorische T-Zellen (Treg) spielen vermutlich eine wichtige Rolle in der
Pathogenese der TME, da sie die Etablierung und Aufrechterhaltung von Toleranz
und Immunität steuern (RICHARDS et al., 2011). Die Aktivierung von TregVorläuferzellen durch Antigene und ihre Kostimulation über IL-2 und TGF-β induziert
die Expression des Transkriptionsfaktors forkhead box protein P3 (FoxP3; LI und
ZHENG, 2015). Sie erfolgt überwiegend im Darm, sowie zu einem kleineren Anteil in
sekundären lymphatischen Organen. Treg sezernieren IL-10, IL-35 und TGF-β und
hemmen die Funktion von T-Zellen und Makrophagen (TIZZARD, 2013). Nach
TMEV-Infektion entwickeln SJL-, aber nicht C57BL/6-Mäuse eine schnelle TregExpansion mit erhöhter Expression von IL-10 im Gehirn. Durch die Expansion ergibt
sich ein ungünstiges Verhältnis von Treg zu Effektor-T-Zellen, welches einen
nachteiligen Effekt auf die antivirale Immunität zu haben scheint (RICHARDS et al.,
2011; HERDER et al., 2012). Dementsprechend resultiert die funktionelle
Inaktivierung von Treg mittels anti-CD25-Antikörpern in einer gesteigerten CD4- und
CD8-dominierten, antiviralen Immunität sowie einem milderen Krankheitsverlauf und
einer geringeren Virusmenge im ZNS (RICHARDS et al., 2011). Ein adoptiver
Transfer von ex vivo generierten, induzierten Treg (iTreg) in der Frühphase der
Literaturübersicht
17
Infektion resultiert hingegen folglich in einer Exazerbation der Erkrankung mit
Nachweis erhöhter Virustiter (MARTINEZ et al., 2014). Interessanterweise führt eine
Übertragung der gleichen iTreg in der chronischen Phase der TME nach Beginn der
Demyelinisierung aber zu einer Verringerung des Schweregrades der chronischdemyelinisierenden Erkrankung (MARTINEZ et al., 2014).
Während Treg also vermutlich eine zentrale Funktion in der TME von SJL-Mäusen
erfüllen, scheinen sie hingegen im Krankheitsverlauf von C57BL/6-Mäusen nur eine
untergeordnete Rolle zu spielen. Eine Treg-Depletion verursacht zwar einen
transienten Anstieg von Th1- und CD8+-Zellen, reduziert aber nicht die Virusmenge
im ZNS von TMEV-infizierten C57BL/6-Mäusen (PRAJEETH et al., 2014).
2.4.4
B-Zellen / Plasmazellen
Eine Aktivierung von B-Zellen erfolgt überwiegend durch IL-4, IL-5, IL-6 und IL-13,
welche von Th2-Zellen sezerniert werden. Während IL-4 und IL-13 das Wachstum
und
die
Differenzierung
von
B-Zellen
stimulieren,
den
Wechsel
der
Immunglobulinklasse fördern und die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen und
Fc-Rezeptoren induzieren, initiiert IL-5 hauptsächlich die Differenzierung aktivierter
B-Zellen zu Plasmazellen und stimuliert die Produktion von Immunglobulinen
(TIZARD, 2013). Für ihre vollständige Aktivierung ist außerdem eine Kostimulation
durch T-Helferzellen (CD40-CD154) und Komplement (CD21-CD19) erforderlich
(BANCHEREAU, 2015). Während T-Zellen lediglich bereits prozessiertes Antigen
erkennen, sind B-Zellen auch fähig, natives Antigen zu binden und einer T-Zelle zu
präsentieren, um anschließend eine Kostimulation zu erhalten (OBINO und
LENNON-DUMÉNIL,
produzierenden
2014).
Plasmazellen
Es
erfolgt
und
eine
Differenzierung
Gedächtniszellen.
Um
zu
Antikörper-
Autoimmunität
zu
vermeiden, erfahren B-Zellen einen zweistufigen Selektionsprozess, der jene Zellen
die Autoantigene binden in die Apoptose leitet (TIZZARD, 2013).
Literaturübersicht
18
Obwohl autoimmunen B-Zellen in der Pathogenese der MS inzwischen eine
Schlüsselrolle zugesprochen wird, ist über die Bedeutung von B-Zellen und
Plasmazellen bei der TME bisher nur wenig bekannt (DISANTO et al., 2012). Mittels
Genexpressionsanalysen wurde allerdings bereits gezeigt, dass viele der Gene, die
im Verlauf der TME aufreguliert werden, mit der humoralen Immunantwort im
Zusammenhang stehen (NAVARETTE-TALLONI et al., 2010; ULRICH et al., 2010).
Außerdem weisen SJL-Mäuse in der chronischen Phase der TME, drei bis vier
Monate nach Infektion, eine Infiltration CD138+ Plasmazellen/Plasmablasten und
hohe IgG-Spiegel im Liquor cerebrospinalis bei intakter Blut-Hirn-Schranke (bloodbrain barrier, BBB) auf. Dies deutet darauf hin, dass sich im Verlauf der Erkrankung
eine ortsständige Plasmazellpopulation etabliert, deren Bedeutung für den
Krankheitsverlauf der TME noch weitestgehend unklar ist (PACHNER et al., 2011).
Auch bei der MS entwickeln sich im chronischen Stadium der Erkrankung ektopische
Lymphfollikel mit B-Zellreifung und Plasmazelldifferenzierung in den Meningen
(MEINL et al., 2006).
2.4.5
Antigenpräsentierende Zellen
Zu den antigenpräsentierenden Zellen (APC) im ZNS gehören vor allem Mikroglia
und Makrophagen. Ob und inwieweit Astrozyten an der Präsentation von Antigenen
beteiligt sind, wird in der Literatur kontrovers diskutiert (WEBER et al., 1994; DONG
und BENVENISTE, 2001; CONSTANTINESCU et al., 2005). APC erfüllen im ZNS
vielfältige Aufgaben: Neben der Präsentation von Antigen zur Aktivierung von T- und
B-Zellen determinieren sie durch Zytokinsekretion die Differenzierung von CD4+-TZellen
zu
Th1-,
Th2-
und
Th17-Zellen
und
modulieren
die
Etablierung,
Aufrechterhaltung und den Verlauf von Entzündungen (ZHU und PAUL, 2010).
Aktivierte Mikroglia spielen auch eine große Rolle in der Pathogenese der MS und
der TME. Bei der MS sind Mikroglia überwiegend in den Läsionen der weißen
Substanz lokalisiert, phagozytieren Myelinfragmente, aktivieren CD4+-T-Zellen und
exprimieren MHC-Klasse-II-Moleküle und deren Kostimulatoren (ALOISI et al., 2000).
Literaturübersicht
19
Bei der TME entwickeln infizierte SJL-Mäuse eine lebenslange Persistenz des Virus
in Mikroglia/Makrophagen (LIPTON et al., 1995) und Astrozyten (ZHENG et al.,
2001), wodurch diesen Zellpopulationen eine besondere Bedeutung in der
Pathogenese der Erkrankung zukommt. Eine Aktivierung durch TMEV-Antigen führt
zu einer erhöhten Expression von myelinotoxischen Faktoren, wie z.B. TNF, IL-6, IL1β, IL-12β und induzierbarer Stickstoffmonoxid-Synthase (inducible nitric oxide
synthase, iNOS; DALPKE et al., 2002; OLSON und MILLER, 2004, MECHA et al.,
2013), wodurch ein Milieu entsteht, das die Schädigung des ZNS begünstigt
(bystander demyelination; CHASTAIN et al., 2011). Neben Zytokinen exprimieren
Mikroglia/Makrophagen nach Stimulation durch TMEV-Antigen auch Chemokine, wie
zum Beispiel chemokine (C-C motif) ligands (CCL)-2, CCL-3, CCL-4 und CXCL-3
(EBERT et al., 2005) sowie CCL-5 und CXCL-10 (HERDER et al., 2015). Für die
TME wurde bereits gezeigt, dass CCL-5 und CXCL-10 die Infiltration von Leukozyten
in das ZNS regulieren und die antivirale Immunität beeinflussen (RANSOHOFF et al.,
2002; MI et al., 2004; HERDER et al., 2015; RUBIO et al., 2014). Im Gegensatz zum
Serum von Balb/C-Mäusen enthielt jenes von TMEV-infizierten SJL-Mäusen
beispielsweise hohe Mengen an biologisch aktivem CXCL-10 zum Zeitpunkt des
Einsetzens der klinischen Erkrankung (RUBIO et al., 2014). Eine Aufregulation von
CCL-5 und CXCL-10 liegt außerdem auch bei der EAE und der MS vor (SORENSEN
et al., 1999; ELHOFY et al., 2002). Die Depletion von CCL-2 bei C57BL/6-Mäusen
mit EAE resultiert in einem milderen Krankheitsverlauf mit weniger Demyelinisierung
und einer geringeren Anzahl an iNOS- und TNF-produzierenden dendritischen Zellen
und Makrophagen (DOGAN et al., 2008). Ob CCL-2 eine ähnliche Funktion im
Verlauf der TME erfüllt ist weitestgehend unklar.
Jedoch
hat
die
Aktivierung
von
Mikroglia/Makrophagen
im
Verlauf
der
Demyelinisierung nicht nur nachteilige Effekte. Nach lokaler Applikation von
Ethidiumbromid
begünstigt
Mikroglia/Makrophagen
das
die
Phagozytose
Einsetzen
der
von
Myelinfragmenten
nachfolgenden
durch
Remyelinisierung
(KOTTER et al., 2006). Pathogenetisch liegt wahrscheinlich eine Hemmung der
Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch Myelin zu Grunde
(KOTTER et al., 2006). Allerdings führt auch die Applikation von nichtspezifischen
Literaturübersicht
20
Membranbestandteilen zu einer geringeren, aber signifikanten Hemmung der
Remyelinisierung,
weshalb
möglicherweise
neben
Myelin
auch
andere
Zellbestandteile inhibitorisch auf die Remyelinisierung im ZNS wirken könnten
(ROBINSON et al., 1999; KOTTER et al., 2006). Analog zu ihrer dualen Funktion in
der
Pathogenese
der
Demyelinisierung
kann
eine
Einteilung
der
Mikroglia/Makrophagen-Population in zwei Gruppen erfolgen (CHASTAIN et al.,
2011): Während klassisch-aktivierte, proinflammatorische M1-Makrophagen die
Entzündung verstärken und die protektive Immunität fördern, terminieren alternativaktivierte M2-Makrophagen die Entzündung, phagozytieren zellulären Debris und
unterstützten die Gewebsheilung (PINTEAUX-JONES et al., 2008; LASKIN, 2009;
CHASTAIN et al., 2011; MARTINEZ und GORDON, 2014; PRAJEETH et al., 2014).
Zu Beginn der chronisch-demyelinisierenden Erkrankung zeigen TMEV-infizierte
SJL-Mäuse eine erhöhte Expression von CD16+ CD32+ M1-Makrophagen und eine
Aufregulation der korrespondierenden Gene im Rückenmark. In der chronischen
Phase der TME entwickelt sich eine zunehmende M2-Prägung bei erhaltener M1Polarisation.
Möglicherweise
begünstigt
eine
Imbalance
der
Makrophagenpolarisierung mit Dominanz von M1-Zellen die Entwicklung chronischer
Rückenmarksläsionen in TMEV-infizierten SJL-Mäusen (HERDER et al., 2015).
2.5
Zytokine bei der Theiler´schen murinen
Enzephalomyelitis
Ähnlich wie bei anderen viralen Infektionen mit chronischem Verlauf scheint die
Orchestrierung der frühen Immunantwort auch bei der TME einen entscheidenden
Einfluss auf die Elimination oder Persistenz des Virus zu haben. In der Frühphase
der Infektion weisen sowohl SJL- als auch C57BL/6-Mäuse eine starke Expression
proinflammatorischer Zytokine auf. Überwiegend handelt es sich hierbei um IFN-γ,
IL-1, IL-6, IL-12p40 und TNF (CHANG et al., 2000). Allerdings exprimieren nur SJLMäuse gleichzeitig hohe Mengen an IL-10 mRNS. Diese werden vor allem von T-
Literaturübersicht
21
Zellen und Makrophagen/Mikroglia gebildet und gehen mit einer vermehrten
Infiltration von Foxp3+-Treg und CD45R+-B-Zellen einher (HERDER et al., 2012).
Folglich etabliert sich eine schwächere Entzündungsreaktion mit ungenügender
antiviraler Immunantwort (HIMEDA et al., 2010; HERDER et al., 2012).
In der subakuten Phase, acht Tage nach der Infektion, exprimieren SJL-Mäuse
hingegen bereits höhere Mengen an TGF-β und TNF als resistente B57BL/6-Mäuse
(CHANG et al., 2000). In der Spätphase der Infektion weisen dann nur noch SJLMäuse eine proinflammatorische Th1-Zytokinantwort im ZNS auf. Darüber hinaus
liegen bei SJL-Mäusen auch gleichzeitig hohe Mengen der antiinflammatorischen
Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10 vor (CHANG et al., 2000). Da IL-10 auch in vitro zu
einer verminderten Expression von IL-12 und IL-23 durch TMEV-infizierte Mikroglia
führt, scheint es wie bei der LCMV-, HIV- oder HCV-Infektion auch bei der TME an
der Etablierung einer insuffizienten, antiviralen Immunantwort beteiligt zu sein
(RIGOPOULOU et al., 2005; BROCKMAN et al., 2009; CORREA et al., 2011;
HERDER et al., 2012; RICHTER et al., 2013).
Jedoch spielen neben IL-10 auch diverse andere Zytokine eine wichtige Rolle in der
Pathogenese der TME. Im Gegensatz zu IL-10 ist TNF ein stark proinflammatorisch
wirkendes Zytokin. Es gilt als einer der wichtigsten Entzündungsmediatoren und ist in
entzündeten Geweben maßgeblich an der Rekrutierung von Lymphozyten beteiligt
(PROBERT, 2015). TNF vermittelt die Aufregulation von Adhäsionsmolekülen (z.B.
E-Selektin, Intercellular Adhesion Molecule 1, ICAM-1 und Vascular Cell Adhesion
Molecule 1, VCAM-1) und führt zur Vasodilatation durch eine vermehrte Expression
des Vasodilators Prostaglandin I2 (PGI2; BRADLEY, 2008). Welche Rolle TNF bei
viralen Infektionen im Allgemeinen und der TME im Besonderen zukommt, ist
fraglich, da für verschiedene, infektiöse Erkrankungen sowohl neuroprotektive als
auch neurodestruktive Effekte beschrieben wurden (SERGERIE et al., 2007;
KIRKMAN et al., 2010). Auf Grund seiner proinflammatorischen Eigenschaften
verstärkt TNF die antivirale Immunität in resistenten C57BL/6-Mäusen und
vermindert die Gewebsschädigung im Gehirn nach der Infektion mit dem DA-Stamm
des TMEV (SERGERIE et al., 2007; EJRNAES et al., 2006). Gleichzeitig wurde in
Literaturübersicht
22
anderen Arbeiten gezeigt, dass TNF die Freisetzung exzitatorischer Neurotransmitter
fördert und die Schädigung von Neuronen begünstigt (LIBBEY et al., 2008;
KIRKMAN et al., 2010). Ein Vergleich von SJL- und C57BL/6-Mäusen nach Infektion
mit dem DA-Stamm zeigte, dass SJL-Mäuse in der akuten bis subakuten Phase der
Infektion erhöhte Mengen an TNF exprimieren (CHANG et al., 2000). TNF spielt
somit möglicherweise ebenfalls eine Rolle in der stammspezifischen Pathogenese
der TME.
Andere proinflammatorische Zytokine wie IL-6, IFN-α und evtl. auch IFN-γ
verursachen bei SJL-Mäusen hingegen eine erhöhte Expression von PD-1 auf
infiltrierenden Makrophagen. Diese Aufregulation inhibitorischer Moleküle mindert die
Zytolyse durch CD8+-T-Zellen und begünstigt die Etablierung einer viralen
Persistenz. Da IL-6 außerdem die Differenzierung zu Th17-Zellen fördert, trägt es
vermutlich direkt zur Demyelinisierung bei (JIN et al., 2013). Transgene C57BL/6Mäuse, die das humane IL-6 exprimieren, entwickeln nach TMEV-Infektion eine
chronisch-demyelinisierende Leukoenzephalomyelitis. Diese geht mit einer erhöhten
viralen Persistenz und einer vermehrten Differenzierung zu Th17-Zellen einher.
Synergistisch unterstützen IL-6 und IL-17 die Expression von B-cell lymphoma
protein 2 (Bcl-2) und B-cell lymphoma-extra large protein (Bcl-xl), die beide den
Übergang von virusinfizierten Zellen in die Apoptose verhindern. IL-6 und IL-17
wirken sich somit direkt negativ auf die Elimination virusinfizierter Zellen im ZNS aus
(HOU et al., 2014).
Ähnlich wie IL-6 begünstigen auch hohe IL-1-Spiegel die Differenzierung von CD4+
T-Helferzellen zu Th17-Zellen. Eine Depletion von IL-1 führt jedoch ebenfalls zu einer
vermehrten Viruspersistenz, da diese eine ungenügende T-Zell-Aktivierung mit
verstärkter Expression antiinflammatorischer Zytokine und inhibitorischer Moleküle
(PDL-1, TIM-3) zur Folge hat. Eine angemessene Aktivierung der IL-1-Signalkaskade
scheint daher für die Protektion vor einer persistenten Infektion mit TMEV
unerlässlich zu sein (KIM et al., 2012).
Während bei IL-1 sowohl die Applikation als auch die Depletion mit einer
Exazerbation der demyelinisierenden Leukoenzephalomyelitis einhergeht, scheinen
Literaturübersicht
23
sich erhöhte Mengen an IL-2 günstig auf den Krankheitsverlauf auszuwirken. Die
Applikation von IL-2 sezernierenden Tumorzellen verhindert in TMEV-infizierten
Dilute Brown Non-Agouti/2 (DBA/2)-Mäusen die Entwicklung einer persistenten
Infektion. Diese Beeinflussung des Krankheitsverlaufs geht mit einem drei- bis
vierfachen Anstieg zytotoxischer T-Zell-Vorläuferzellen einher. LARSSON-SCIARD
et al. (1997) postulieren deshalb, dass zumindest bei DBA/2-Mäusen eine
ungenügende Anzahl und Aktivierung von zytotoxischen T-Zell-Vorläuferzellen für die
Etablierung der viralen Persistenz von Bedeutung sein könnte. Inwieweit IL-2 eine
Rolle für die Viruspersistenz in SJL-Mäusen spielt, ist hingegen weitestgehend
unklar.
Zusätzlich scheinen IFN-γ und TGF-β eine wichtige Rolle in der Pathogenese der
TME zu spielen (CHANG et al., 2000; MURRAY et al., 2002; RODRIGUEZ et al.,
2003). Die Hauptfunktion von IFN-γ besteht in der Aktivierung von Makrophagen und
der Initiation der Migration von Leukozyten in das ZNS. Darüber hinaus erfüllt IFN-γ
auch direkte antivirale und antiproliferative Effekte und fördert die Expression von
TNF und IL-1 (RODRIGUEZ et al., 2003). IFN-γ-defiziente C57BL/6-Mäuse
entwickeln
nach
Infektion
mit
TMEV
eine
chronisch-demyelinisierende
Leukoenzephalomyelitis mit Persistenz des Virus im ZNS (MURRAY et al., 2002).
Eine Infektion von Mäusen mit gleichartiger Defizienz und einem empfänglichen
genetischen Hintergrund führt darüber hinaus zu einer erhöhten Mortalitätsrate und
schweren neurologischen Ausfällen, die innerhalb von 16 Tagen nach der Infektion
auftreten. Diese sind überwiegend auf eine schwere neuronale Schädigung in der
Frühphase der Infektion zurückzuführen. Die Tiere weisen erhöhte Virustiter und eine
geringere Expression von CD4+- und CD8+-T-Zellen sowie MHC-Klasse-I- und MHCKlasse-II-Molekülen auf (RODRIGUEZ et al., 2003). Die Ergebnisse dieser Arbeiten
lassen darauf schließen, dass sich IFN-γ positiv auf den Verlauf der TME auswirkt.
Es wird postuliert, dass IFN-γ dem virus-induzierten Untergang von Neuronen
entgegenwirkt und somit die neuronalen Schäden bei der TME begrenzt. Diese
Hypothese wurde auch dadurch untermauert, dass IFN-γ in vitro das Überleben von
Neuronen unterstützt (RODRIGUEZ et al., 2003).
Literaturübersicht
24
Hingegen wurde mittels Genexpressionsanalyse gezeigt, dass Gene, die mit der
Signalkaskade von IFN-γ korrespondieren während der demyelinisierenden Phase
der Erkrankung aufreguliert sind (HERDER et al., 2015). Da IFN-γ eine große Rolle
in der M1-Polarisation von Makrophagen spielt, führt die vermehrte Expression zu
einer Steigerung der Infiltration und Aktivierung von Makrophagen, wodurch sich eine
verstärkte Demyelinisierung in der Spätphase der TME etabliert (MILLER et al.,
2001; TSUNODA et al., 2002; ULRICH et al., 2006; KIGERL et al., 2009). Somit
scheint sowohl ein Mangel an IFN-γ in der Frühphase der Erkrankung, als auch ein
hoher
Spiegel
während
der
Demyelinisierung
eine
Exazerbation
des
Krankheitsverlaufs zu begünstigen (MILLER et al., 2001; MURRAY et al., 2002;
TSUNODA et al., 2002; ULRICH et al., 2006; KIGERL et al., 2009).
2.6
Interleukin-10
IL-10 wurde erstmals 1989 von MOSMANN et al. beschrieben und ist neben TGF-β
und IL-35 eines der stärksten antiinflammatorischen Zytokine mit diversen,
pleiotropen Eigenschaften (FIORENTINO et al., 1989; SABAT et al., 2010). Es wird
in der Peripherie überwiegend von Monozyten, Makrophagen und T-Helferzellen
synthetisiert, kann jedoch in Abhängigkeit von Stimulus, Zeitpunkt und Art des
betroffenen Gewebes auch von dendritischen Zellen, B-Zellen, zytotoxischen TZellen, Treg, NK-Zellen und Mastzellen sowie von neutrophilen und eosinophilen
Granulozyten gebildet werden (MAYNARD et al., 2007; COUPER et al., 2008;
SABAT et al., 2010). Während initial die Auffassung vertreten wurde, dass IL-10
lediglich von Th2-Zellen produziert wird, ist heute bekannt, dass Th1-Zellen ähnlich
hohe Mengen an IL-10 bilden (FIORENTINO et al., 1989; DEL PRETE et al., 1993;
JANKOVIV et al., 2007; SARAIVA et al., 2009). Im ZNS wird IL-10 überwiegend von
Mikroglia, Astrozyten und Neuronen exprimiert (HULSHOF et al., 2002; LEDEBOER
et al., 2002).
Literaturübersicht
25
Zur Aktivierung der Signalkaskade muss IL-10 in zwei Schritten an den zweiteiligen
IL-10-Rezeptor (IL-10R) binden (YOON et al., 2006). Während der IL-10R1
überwiegend von Immunzellen, vor allem von Monozyten und Makrophagen
exprimiert wird, ist der IL-10R2 auch ein Anteil anderer Rezeptorkomplexe (z.B. von
IL-22, IL-26, IL-28a, IL-28b und IL-29) und wird daher großflächig auf der Membran
der meisten körpereigenen Zellen ausgebildet (WOLK et al., 2002; KUNZ et al.,
2006; SABAT et al., 2010; ZDANOV, 2010). Zur Aktivierung der IL-10RSignalkaskade erfolgt initial eine Bindung von IL-10 an die Untereinheit IL-10R1. Eine
darauffolgende Konformationsänderung erlaubt im zweiten Schritt die Assoziation
des IL-10/IL-10R1-Komplexes mit dem IL-10R2 (YOON et al., 2006). Diese Bindung
resultiert in einer Aktivierung der IL-10R1-assoziierten Januskinase Jak1 und der IL10R2-assoziierten Januskinase Tyk2, gefolgt von einer Phosphorylierung des IL10R1. Nun bindet der Transkriptionsfaktor signal transducer and activator of
transcription (STAT) 3 an den phosphorylierten IL-10R1 und wird dadurch selbst
phosphoryliert. In Abhängigkeit vom Zelltyp erfolgt in der IL-10-Signalkaskade zum
Teil auch eine Phosphorylierung von STAT1- und STAT5-Molekülen. Die
phosphorylierten STAT-Moleküle bilden Homo- und Heterodimere, migrieren in den
Zellkern, binden an STAT-Bindungselemente und induzieren die Transkription
korrespondierender Gene (FINBLOOM et al., 1995; SABAT et al., 2010). Die
Interaktion von IL-10 mit seinem Rezeptor ist in Abbildung 2-3 schematisch
dargestellt.
Die Aktivierung der IL-10-Signalkaskade hat weitreichende Effekte. Allein in
Monozyten werden etwa 1600 Gene aufreguliert und gleichzeitig circa 1300 Gene
herunterreguliert (JUNG et al., 2004). IL-10 hemmt beispielsweise die Freisetzung
von proinflammatorischen Mediatoren durch Monozyten/Makrophagen. Hierzu zählen
unter anderem TNF, IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-12, IL-23 sowie der Granulozytenkolonienstimulierende Faktor (granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) und der
Granulozyten-Monozyten-kolonienstimulierende Faktor (granulocyte macrophage
colony stimulating factor, GM-CSF). Gleichzeitig verstärkt es die Expression
antiinflammatorischer Mediatoren, wie die des IL-1-Rezeptor-Antagonisten (IL-1RA)
und löslicher TNF-Rezeptoren (FIORENTINO et al., 1994; HART et al., 1996).
Literaturübersicht
26
Außerdem hemmt IL-10 die Antigenpräsentation durch eine verminderte Expression
von MHC-Klasse-II-Komplexen und ihren Kostimulatoren (z.B. CD86) und verhindert
die Etablierung einer Th1- und Th17-Immunantwort durch Hemmung der IL-12- und
IL-23-Synthese (DE WAAL MALEFYT et al., 1991; D`ANDREA et al., 1993; CREERY
et al., 1996; SCHÜTZE et al., 2005). Darüber hinaus verstärkt IL-10 die Phagozytose
durch eine Steigerung der Expression von Oberflächenrezeptoren und hemmt
gleichzeitig die Abtötung phagozytierter Mikroorganismen (ROILIDES et al., 1998;
BUCHWALD et al., 1999; SABAT et al., 2010).
Abbildung 2-3: Interaktion von IL-10 mit dem IL-10R-Komplex.
IL-10 bindet an die Untereinheit IL-10R1 und verändert dessen Konformation, sodass eine
Bindungsstelle für den IL-10R2 entsteht, der daraufhin über IL-10 an den IL-10R1 bindet. Durch eine
Aktivierung und Phosphorylierung von Jak1 und Tyk2 und der konsekutiven Phosphorylierung des IL10R1 und der STAT3-Transkriptionsfaktoren bilden sich Homo- und Heterodimere, die im Nukleus an
STAT binding elements binden und die Transkription korrespondierender Gene induzieren. Je nach
Zelltyp werden zum Teil auch STAT1- und STAT5-Moleküle aktiviert.
Jak1= Janus Kinase 1; Tyk2= Tyrosin Kinase 2; STAT= signal transducer and activator of
transcription, P = Phosphorylierung.
Modifiziert nach SABAT et al., 2010.
Literaturübersicht
27
IL-10 hat jedoch nicht nur Einfluss auf die Funktion von Monozyten/Makrophagen,
sondern auch auf die von T-Zellen, B-Zellen, Mastzellen und NK-Zellen sowie von
neutrophilen und eosinophilen Granulozyten. Einerseits hemmt IL-10 die Proliferation
von CD4+-T-Zellen und unterdrückt andererseits die Synthese von IL-2 und IFN-γ
durch Th1- und IL-4 und IL-5 durch Th2-Zellen (DEL PRETE et al., 1993). Eine
direkte Hemmung der IL-17-Synthese durch Th17-Zellen erfolgt hingegen nicht und
es liegt auch kein direkter Einfluss auf CD8+-T-Zellen vor (GROUX et al., 1998;
NAUNDORF et al., 2009). In vitro bewirkt IL-10 außerdem die Differenzierung CD4+T-Zellen zu Treg vom Typ I (Tr1-Zellen). Diese sezernieren IL-10 und hemmen
antigenspezifische Effektor-T-Zellen (GROUX et al., 1997). Die Funktion neutrophiler
Granulozyten beeinträchtigt IL-10 indem es die Produktion und Sekretion von TNF,
IL-1β, diversen Chemokinen und Zyklooxygenase-2 hemmt und somit die Infiltration
neutrophiler Granulozyten in entzündetes Gewebe unterbindet und die Synthese von
Prostaglandin E2 unterdrückt (KASAMA et al., 1994; NIIRO et al., 1997). Eine
ähnliche Wirkung übt es auch auf eosinophile Granulozyten und Mastzellen aus,
indem
es
die
Synthese
proinflammatorischer
Mediatoren
hemmt
und
die
Differenzierung von Vorläuferzellen zu Mastzellen zusammen mit IL-4 unterdrückt
(TAKANASKI et al., 1994; SPEIRAN et al., 2009). Allerdings erfüllt IL-10 nicht nur
inhibitorische Funktionen, da es der Apoptose von B-Zellen entgegenwirkt, ihre
Differenzierung und Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen fördert und einen
Isotypen-Klassenwechsel induziert (MALISAN et al., 1996; BURDIN et al., 1997).
Weiterhin stimuliert es die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen und fördert ihre durch
IL-2 induzierte Expression von IFN-γ, GM-CSF und TNF (CARSON et al., 1995). Die
vielfältigen,
pleiotropen
Wirkungen
von
IL-10
werden
in
Tabelle
2-1
zusammengefasst dargestellt.
IL-10 wirkt jedoch nicht nur auf das Immunsystem sondern erfüllt auch
neuroprotektive
Funktionen
im
ZNS.
Durch
eine
Hemmung
mikroglialer,
proinflammatorischer Mediatoren bewirkt IL-10 eine reduzierte Aktivierung von
Astrozyten und eine reduzierte Aktivität des Transkriptionsfaktors nuclear factor
'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells (NF-κB), wodurch die neurotoxische,
intrasynaptische Akkumulation von Glutamat verhindert wird (BALASINGAM und
Literaturübersicht
28
YONG, 1996; KIM et al., 2011). Weiterhin exprimieren einige neuronale
Subpopulationen
IL-10-Rezeptoren,
deren
Aktivierung
über
die
STAT3-
Signalkaskade dem Zelltod entgegenwirkt (BOYD et al., 2003). Erst kürzlich konnte
außerdem gezeigt werden, dass IL-10 die Schädigung des ZNS nach temporärer
Hypoxie in vivo reduziert und Neuronen und Astrozyten vor einem Ischämieinduzierten Zelltod in vitro bewahrt. Ursächlich liegt vermutlich eine Modulation des
Ischämie-induzierten, intrazellulären Ca2+-Einstroms zu Grunde (TUKHOVSKAYA et
al., 2014).
Literaturübersicht
Tabelle 2-1:
29
Übersicht über die Wirkungen von IL-10
Zielzelltyp:
Monozyten/ Makrophagen
T-Zellen
B-Zellen
Neutrophile Granulozyten
Eosinophile Granulozyten
Mastzellen
NK-Zellen
vermittelte Wirkung:
Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren ↓
(z.B. TNF, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-23, G-CSF, GMCSF)
Freisetzung antiinflammatorischer Mediatoren ↑
(z.B. IL-1RA, sTNFR)
Antigenpräsentation ↓
Th1- und Th17-Immunantwort ↓
Phagozytose ↑
Proliferation von CD4+ -T-Zellen ↓
Synthese von IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-5 ↓
Differenzierung von CD4+-T-Zellen zu Tr1 ↑
Apoptose ↓
Expression von MHC-II-Molekülen ↑
Isotypen-Klassenwechsel ↑
Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren↓
(z.B. TNF, IL-1β, COX-2)
Synthese von Prostaglandin E2 ↓
Infiltration in entzündetes Gewebe ↓
Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren↓
(z.B. Eikosanoide, IL-1α, IL-12)
Differenzierung von Vorläuferzellen zu Mastzellen ↓
zytotoxische Aktivität ↑
Expression proinflammatorischer Zytokine ↑
(z.B. IFN-γ, GM-CSF, TNF)
↑ = Erhöhung, ↓ = Reduktion, TNF = Tumornekrosefaktor, IL = Interleukin, G-CSF = granulocyte
colony stimulating factor, GM-CSF = granulocyte macrophage colony stimulating factor, RA =
Rezeptorantagonist; sTNFR = soluble TNF receptors, IFN-γ = Interferon-γ, Tr1 = regulatorische TZellen vom Typ I, MHC-II = major histocompatibility complex class II, COX-2 = Cyclooxygenase-2, NKZellen = Natürliche Killerzellen.
Literatur zu Tabelle 2-1: DE WAAL MALEFYT et al., 1991; D´ANDREA et al., 1993; FIORENTINO et
al., 1994; KASAMA et al., 1994; TAKANASKI et al., 1994; CARSON et al., 1995; CREERY et al.,
1996; HART et al., 1996; MALISAN et al., 1996; BURDIN et al., 1997; GROUX et al., 1997; NIIRO et
al., 1997; GROUX et al., 1998; ROILIDES et al., 1998; BUCHWALD et al., 1999; SCHÜTZE et al.,
2005; HOGAN et al., 2008; NAUNDORF et al., 2009; SPEIRAN et al., 2009; SABAT et al., 2010.
Literaturübersicht
2.7
30
Interleukin-10 und virale Infektionskrankheiten
Auf Grund seiner immunsuppressiven Eigenschaften spielt IL-10 eine bedeutende
Rolle für die Etablierung und Aufrechterhaltung von chronisch verlaufenden, viralen
Infektionskrankheiten. Eine Infektion von C57BL/6-Mäusen mit LCMV führt zu einer
gesteigerten Expression von IL-10, welche mit einer Inaktivierung und Erschöpfung
von T-Zellen (T cell exhaustion) einhergeht. Folglich resultiert die Applikation von
anti-IL-10R-Antikörpern in einer höheren Anzahl virusspezifischer CD8+-T-Zellen und
niedrigeren Virustitern (BROOKS et al., 2006; EJRNAES et al., 2006). Hierbei
scheint
besonders
Makrophagen/Monozyten
die
die
IL-10-Produktion
Etablierung
durch
einer
CD4+-T-Zellen
persistenten
Infektion
und
zu
begünstigen. Von Mastzellen, B-Zellen, NK-Zellen und dendritischen Zellen
produziertes IL-10 trägt hingegen, wenn überhaupt, nur marginal zur Suppression
der antiviralen Immunantwort bei (RICHTER et al., 2013).
Auch im Plasma von HIV-infizierten Menschen mit Virämie und in chronischen Fällen
von HCV-Infektionen liegt eine erhöhte IL-10-Konzentration vor (TSAI et al., 1997;
REISER et al., 1997; STYLIANOU et al., 1999; BROCKMAN et al., 2009). In vitro
resultiert eine IL-10R-Blockade bei peripheren mononukleären Blutzellen chronisch
HIV-infizierter Probanden in einer Verstärkung der antigenspezifischen CD4+- und
CD8+-T-Zell-Proliferation (BROCKMAN et al., 2009). In gleichartiger Weise führt die
Blockade des IL-10R bei der HCV-Infektion zu einer gesteigerten Th1-Immunantwort
mit einer höheren Anzahl an HCV-spezifischen, IFN-γ-produzierenden T-Zellen
(RIGOPOULOU et al., 2005). Daher wird postuliert, dass IL-10 zu einer reversiblen
T-Zell-Dysfunktion beiträgt. Hingegen ist unklar, ob IL-10 direkt durch das Virus
aufreguliert wird oder ob eine systemische Hyperaktivierung des Immunsystems
vorliegt (BROCKMAN et al., 2009). Der klinischen Besserung in Abwesenheit von IL10 liegt vermutlich eine Aufregulation von IFN-γ zu Grunde, die die Ausbildung einer
protektiven Immunität fördert (DAI et al., 1997; COUPER et al., 2008).
Eine vermehrte Expression von IL-10 wurde jedoch nicht nur für chronisch
verlaufende, virale Infektionen von Menschen und Nagern beschrieben, sondern
Literaturübersicht
31
beispielsweise auch für die Staupeinfektion des Hundes. Nach Infektion mit dem
Kaninen Staupevirus (CDV, Canine Distemper Virus) zeigen dendritische Zellen in
vitro eine erhöhte Expression von IL-10. Möglicherweise unterbindet CDV durch
diesen und andere Mechanismen die Etablierung einer effektiven, antiviralen
Immunität (QESKA et al., 2014).
Zusätzlich spielt IL-10 auch eine Rolle bei akuten, viralen Infektionen. Nach
experimenteller Infektion mit dem WNV entwickeln C57BL/6-Mäuse eine oftmals
tödlich verlaufende Erkrankung mit erhöhter IL-10-Expression. Die intraperitoneale
Applikation eines anti-IL-10R-Antikörpers sowie die Infektion von IL-10-defizientenKO (IL-10-/-)-Mäusen verringert die Mortalität und die Virusmenge in peripheren
Organen und im Blut. Dieser Effekt tritt allerdings nicht auf, wenn die IL-10-/--Mäuse
nicht intraperitoneal sondern intrazerebral mit WNV infiziert werden (BAI et al., 2009).
Jedoch gehen nicht alle viralen Infektionen mit einer gesteigerten IL-10-Produktion
einher und nicht immer wirkt sich eine Blockade der IL-10-Signalkaskade günstig auf
den Krankheitsverlauf aus. Beispielsweise zeigen IL-10-/--Mäuse im Vergleich zum
Wildtyp-Stamm oder zu IL-4-/--Mäusen auf C57BL/6-Hintergrund eine schwerere
Erkrankung nach Infektion mit dem neurotropen John Howard Mueller (JHM)-Stamm
des MHV (LIN et al., 1998). Während die Mortalität deutlich erhöht ist, entspricht die
Virusmenge im ZNS der des Wildtyps. Zwar besteht somit keine Korrelation
zwischen der Viruslast und der klinischen Symptomatik, die IL-10-Depletion führt
jedoch zu einer verstärkten, mononukleären Entzündungszellinfiltration in das ZNS
und zu einer vermehrten Expression von TNF, IFN-γ und iNOS. Demnach scheint IL10 bei der MHV-Infektion nicht entscheidend für die Viruselimination zu sein, hat
jedoch Einfluss auf das Ausmaß des akuten Entzündungsgeschehens im ZNS (LIN
et al., 1998). Entsprechend führt eine Infektion von IL-10−/−-Mäusen auf C57BL/6Hintergrund mit einem rekombinanten IL-10-exprimierendem MHV-Virus (rJ2.2-IL-10)
zu einer Verringerung der Mortalitätsrate. Das rekombinante MHV-Virus verursacht
weniger Demyelinisierung und geht mit einer geringeren Entzündungszellinfiltration
und niedrigeren, proinflammatorischen Zytokin- und Chemokinspiegeln im ZNS
einher (TRANDEM et al., 2011). Eine Beeinflussung der IL-10-Signalkaskade kann
Literaturübersicht
32
sich also in Abhängigkeit von Erreger und Zeitpunkt sowohl positiv als auch negativ
auf den Krankheitsverlauf auswirken, weshalb die Effektivität neutralisierender
Antikörper für jedes Virus individuell ermittelt werden sollte (BROOKS et al., 2006).
Hypothesen und Ziele
3
33
Hypothesen und Ziele
In vorausgegangenen Arbeiten zur Pathogenese der TME konnte bereits gezeigt
werden, dass SJL- im Vergleich zu C57BL/6-Mäusen in der Frühphase der TMEVInfektion eine erhöhte Expression von IL-10 mRNS im Gehirn aufweisen (HERDER
et al., 2012). Darüber hinaus konnte in anderen Studien durch eine IL-10R-Blockade
eine Steigerung der antiviralen Immunität bei chronisch-viralen Infektionen erzielt
werden (BROOKS et al., 2006; BAI et al., 2009). Beispielsweise bewirkt die Blockade
der IL-10-Signalkaskade eine Prävention viraler Persistenz nach experimenteller
Infektion mit dem LCMV und erhöht die Überlebensrate nach WNV-Infektion von
C57BL/6-Mäusen (BROOKS et al., 2006; BAI et al., 2009). Diese Ergebnisse warfen
die Frage auf, ob IL-10 eine zentrale Rolle für die Pathogenese und die virale
Persistenz der TME spielt und ob die Blockade des IL-10R einen potentiellen
Therapieansatz für chronische Entmarkungskrankheiten darstellt.
Neben den zahlreichen Funktionen die IL-10 bei Infektionserkrankungen erfüllt, spielt
es jedoch auch gleichzeitig eine zentrale Rolle für die Immunhomöostase, weshalb
eine
Dysregulation
oder
Manipulation
der
IL-10-Signalkaskade
das
Risiko
immunpathologischer Prozesse erhöht (IYER und CHENG, 2012). Das Ziel des
ersten Teils der Arbeit bestand deshalb in der Charakterisierung des Einflusses einer
IL-10R-Blockade auf die peripheren Organe. Hierbei lag ein besonderes Augenmerk
auf dem Gastrointestinaltrakt, da IL-10-Defizienz in C57BL/6-Mäusen mit der
Entwicklung
einer
chronischen,
lymphoplasmazellulären,
teils
histiozytären
Enterokolitis einhergeht (KÜHN et al., 1993). Der Einfluss einer IL-10R-Blockade auf
den Darm und andere periphere Organe von SJL-Mäusen ist hingegen in der
Literatur bisher nicht beschrieben.
Im zweiten und dritten Teil der vorliegenden Arbeit wurde anschließend der Einfluss
einer IL-10R-Blockade auf den Verlauf der akuten bzw. chronischen TME untersucht
und die Viruslast sowie pro- und antiinflammatorische Zytokinspiegel im ZNS
bestimmt. Ein Schwerpunkt war hierbei die Beantwortung der Frage, ob
Hypothesen und Ziele
34
phasenspezifische Unterschiede einer IL-10-Rezeptorblockade vorliegen, oder ob
sich die Auswirkungen der Antikörperapplikation unabhängig von der akuten und
chronischen Phase der TME gleich darstellen. Weiterhin wurde die Hypothese
untersucht,
dass
neuroinflammatorische
Prozesse
eine
systemische
Immunpathologie verstärken. Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen Aufschluss über IL10-vermittelte Immunreaktionen und Persistenzmechanismen bei der Entmarkung im
Verlauf der TME geben. Im Hinblick auf eine potentielle infektiöse Ursache der MS
haben die Untersuchungen außerdem eine Relevanz für die Erforschung dieser
bedeutenden Erkrankung des Menschen.
Material und Methoden
35
4
Material und Methoden
4.1
Verwendete Mäuse und Versuchsdurchführung
4.1.1
Nicht infizierte Tiere (erster Versuchsteil)
Um den Einfluss einer IL-10R-Blockade auf die peripheren Organe und das nicht
entzündete ZNS zu charakterisieren wurden 30 weibliche, fünf Wochen alte
SJL/JHanHsd-Mäuse (Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland) aus einer
spezifisch-pathogenfreien (SPF) Zucht verwendet. 15 Tieren wurde einmal
wöchentlich am nullten, siebten und 14. Tag nach Versuchsbeginn 250 µg Ratte antiMaus IL-10R-Antikörper intraperitoneal verabreicht (IL-10R↓; JONES et al., 2010;
WILSON et al., 2011). Die andere Hälfte der Tiere erhielt an den gleichen
Zeitpunkten
die
gleiche
Menge
einer
Immunglobin
G1
(IgG1)-spezifischen
Isotypenkontrolle (Isotyp) aus der Ratte und fungierte als Negativkontrolle.
Außerdem wurden die Tiere einmal wöchentlich klinisch untersucht. Jeweils eine
Gruppe, die aus fünf Tieren mit anti-IL-10R-Antikörper-Behandlung und fünf Tieren,
die lediglich Isotypenkontrolle erhalten hatten, bestand, wurde anschließend an Tag
sieben, 14 und 21 des Versuchs getötet und wie in Kapitel 4.1.4 beschrieben seziert.
In Tabelle 4-1 sind die Anzahl der Tiere und die entsprechenden Tötungszeitpunkte
des ersten Versuchsteils zusammengefasst.
Alle
tierexperimentellen
Studien
wurden
von
der
zuständigen
Behörde
(Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
(LAVES),
genehmigt.
Oldenburg,
Deutschland,
Aktenzeichen:
33.12-42502-04-13/1138)
Material und Methoden
Tabelle 4-1:
36
Übersicht über die verwendeten Tiere aus dem
ersten Versuchsteil
Alter der Tiere
(in Wochen)
Tötungszeitpunkt
(Tage nach Versuchsbeginn)
6
7
8
7
14
21
Anzahl der untersuchten
Tiere
IL-10R↓
Isotyp
5
5
5
5
5
5
Die Tiere erhielten Interleukin-10-Rezeptor-Antikörper (IL-10R↓) oder Immunglobin G1-spezifische
Isotypenkontrolle (Isotyp) intraperitoneal an Tag 0, 7 und 14 nach Versuchsbeginn. In diesem
Versuchsteil
erfolgte
keine
zusätzliche
Infektion
mit
dem
Theiler´schen
murinen
Enzephalomyelitisvirus.
4.1.2
Tiere,
die
mit
dem
Theiler´schen
murinen
Enzephalomyelitisvirus infiziert wurden und Interleukin10-Rezeptor-Antikörper in der akuten Phase der Infektion
erhielten (zweiter Versuchsteil)
Um die Effekte einer Unterbrechung der IL-10-Signalkaskade auf den akuten Verlauf
der TME zu untersuchen, wurden im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit 50
weibliche, 5 Wochen alte SJL/JHanHsd-Mäuse aus der gleichen Zucht verwendet.
Die Administration des Antikörpers erfolgte analog zum vorher beschriebenen ersten
Teil der Arbeit. Wieder erhielt die eine Hälfte der Tiere 250 µg Ratte anti-Maus IL10R-Antikörper (IL-10R↓akut/TMEV) und die andere Hälfte eine Immunglobin G1spezifische Isotypenkontrolle (Isotypakut/TMEV). Zusätzlich wurden die Tiere am
nullten Versuchstag mit 1,63 x 106 plaquebildenden Einheiten (plaque forming units,
PFU) einer Virussuspension des TMEV-BeAn-Stammes in 20 µl Dulbecco´s Modified
Eagle Medium (DMEM) mit 2% fetalem Kälberserum und 50 µg/kg Gentamycin
intrazerebral in die rechte Großhirnhemisphäre infiziert (ULRICH et al., 2008). Die
Infektion erfolgte in Allgemeinanästhesie. Als sedativ und analgetisch wirkende
Prämedikation erhielten die Mäuse hierfür subkutan Medetomidin in einer Dosierung
von
0,5 mg/kg
Körpergewicht.
Nach
15 Minuten
wurde
anschließend
als
Material und Methoden
37
Anästhetikum Ketamin in einer Dosierung von 100 mg/kg intraperitoneal, paramedian
im kaudalen Abdominalbereich appliziert. Auch diese Tiere wurden einmal
wöchentlich klinisch untersucht und an Tag sieben, 14, 22 und 42 nach Infektion
wurden anschließend jeweils fünf Tiere aus beiden Gruppen euthanasiert und wie in
Kapitel 4.1.4 beschrieben seziert. Als zweite Kontrollgruppe wurden zusätzlich zehn
weitere Tiere nach dem gleichen Schema mit anti-IL-10R-Antikörper behandelt und
an Tag Null des Experiments Mock-infiziert (IL-10R↓akut/Mock). Diesen Tieren wurden
lediglich 20 µl des Trägermediums ohne TMEV intrazerebral appliziert. Tabelle 4-2
und Abbildung 4-1 zeigen Ablauf, Anzahl der Tiere und die entsprechenden
Tötungszeitpunkte des zweiten Versuchsteils.
Tabelle 4-2:
Übersicht über die verwendeten Tiere aus dem
zweiten Versuchsteil
Alter der Tiere
(in Wochen)
Tötungszeitpunkt
(Tage nach
Versuchsbeginn)
6
7
8
11
7
14
22
42
Anzahl der untersuchten Tiere
IL-10R↓akut/
Isotypakut/
IL-10R↓akut/
TMEV
TMEV
Mock
5
4
5
4
5
5
5
5
5
5
Den Tieren wurde an Tag 0 des Versuchs eine Suspension mit Theiler´schem murinen
Enzephalomyelitisvirus (TMEV) (IL-10R↓akut/TMEV, Isotypakut/TMEV) oder virusfreies Trägermedium
(IL-10R↓akut/Mock) intrazerebral verabreicht. Zusätzlich wurde anti-Interleukin-10-Rezeptor-Antikörper
(IL-10R↓) oder Immunglobin G1-spezifische Isotypenkontrolle (Isotyp) intraperitoneal in der akuten
Phase der Theiler´schen murinen Enzephalomyelitis an Tag 0, 7, 14 und 21 nach Infektion
verabreicht.
Material und Methoden
38
Abbildung 4-1: Versuchsdesign von Experiment 2.
Versuchsablauf der TMEV-infizierten Tiere, die zusätzlich in der akuten Phase der TMEV-Infektion
anti-IL-10R-Antikörper oder Immunglobin G1-spezifische Isotypenkontrolle intraperitoneal an Tag 0, 7,
14 und 21 erhielten. * Eine durchflusszytometrische Untersuchung des Milzgewebes erfolgte von den
Tieren, die an Tag 14 nach Versuchsbeginn getötet wurden. # Eine Quantifizierung der Viruslast im
Rückenmark und Bestimmung der Interleukin-Spiegel in Milz und Rückenmark wurde von den
Experimenten an Tag 14 und 22 nach Versuchsbeginn durchgeführt.
TMEV = Theiler´sches murines Enzephalomyelitisvirus, IL-10R = Interleukin-10-Rezeptor, RT-qPCR =
Reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion, PFU = plaquebildende Einheiten
(plaque forming units).
4.1.3
Tiere,
die
mit
dem
Theiler´schen
murinen
Enzephalomyelitisvirus infiziert wurden und Interleukin10-Rezeptor-Antikörper in der chronischen Phase der
Infektion erhielten (dritter Versuchsteil)
Im dritten Teil der Arbeit wurde der Einfluss einer IL-10R-Blockade auf die
chronische Phase der TME untersucht. Hierfür wurden 20 Tiere an Tag null des
Versuchs mit TMEV infiziert und wöchentlich klinisch untersucht. Die Tiere erhielten
zusätzlich Ratte anti-Maus IL-10R-Antikörper (IL-10R↓chron/TMEV) bzw. IgG1-
Material und Methoden
39
spezifische Isotypenkontrolle (Isotypchron/TMEV) an Tag 35 und 42 nach der Infektion.
Die Sektion dieser Tiere erfolgte an Tag 42 und 49. Analog zu den Versuchen in der
akuten Infektionsphase der TME wurde auch im dritten Versuchsteil eine Mockinfizierte Versuchsgruppe aus fünf Tieren mitgeführt (IL-10R↓chron/Mock), die an Tag
35 und 42 des Versuchs anti-IL-10R-Antikörper erhielt und an Tag 49 getötet wurde.
In Tabelle 4-3 und Abbildung 4-2 sind Ablauf, Anzahl der Tiere und die
entsprechenden Tötungszeitpunkte des dritten Versuchsteils dargestellt.
Tabelle 4-3:
Alter der Tiere
(in Wochen)
11
12
Übersicht über die verwendeten Tiere aus dem
dritten Versuchsteil
Tötungszeitpunkt
(Tage nach
Versuchsbeginn)
42
49
Anzahl der untersuchten Tiere
IL-10R↓chron/
Isotypchron/
IL-10R↓chron/
TMEV
TMEV
Mock
5
5
5
5
5
Den Tieren wurde an Tag 0 des Versuchs eine Suspension mit Theiler´schem murinen
Enzephalomyelitisvirus (IL-10R↓/TMEV, Isotyp/TMEV) oder virusfreies Trägermedium (IL-10R↓/Mock)
intrazerebral appliziert. Zusätzlich wurde anti-Interleukin-10-Rezeptor-Antikörper (IL-10R↓) oder
Immunglobin G1-spezifische Isotypenkontrolle (Isotyp) intraperitoneal in der chronischen Phase der
Theiler´schen murinen Enzephalomyelitis an Tag 35 und 42 nach Infektion verabreicht.
Material und Methoden
40
Abbildung 4-2: Versuchsdesign von Experiment 3.
Versuchsablauf der TMEV-infizierten Tiere, die zusätzlich in der chronischen TMEV-Infektion anti-IL10R-Antikörper oder Immunglobin G1-spezifische Isotypenkontrolle intraperitoneal an Tag 35 und 42
erhielten. *Eine durchflusszytometrische Untersuchung des Milzgewebes sowie eine Quantifizierung
der Viruslast im Rückenmark und Bestimmung der Interleukin-Spiegel in Milz und Rückenmark wurde
von dem Experiment 49 Tage nach Versuchsbeginn durchgeführt.
TMEV = Theiler´sches murines Enzephalomyelitisvirus, IL-10R = Interleukin-10-Rezeptor, RT-qPCR =
Reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion, PFU = plaquebildende Einheiten
(plaque forming units)
4.1.4
Klinische Untersuchung
Alle Tiere im Versuch wurden einmal wöchentlich klinisch untersucht. Hierbei wurden
nach einem etablierten Schema Körperhaltung und äußere Erscheinung (Kategorie
1), Verhalten und Aktivität (Kategorie 2) sowie der Gang (Kategorie 3) der Tiere
beurteilt (ULRICH et al., 2006). In jeder Kategorie wurden zwischen Null und drei
bzw. vier Punkten vergeben, sodass theoretisch eine maximale Punktzahl von 10
Punkten vergeben werden konnte. Die Bewertungskriterien sind in Tabelle 4-4
dargestellt. Erhielt ein Tier in einer der drei Kategorien die höchstmögliche Punktzahl
(Kategorie 1: 3 Punkte, Kategorie 2: 3 Punkte, Kategorie 4: 4 Punkte) wurde das
betroffene Tier vorzeitig aus dem Versuch genommen.
Material und Methoden
41
Bei den TMEV-infizierten Tieren wurde zusätzlich
einmal wöchentlich die
Motorkoordination mittels RotaRod®-Messung untersucht. Vor Beginn des Versuchs
wurden die Tiere an das RotaRod® adaptiert. Hierfür wurde jeweils eine
zehnminütige Trainingseinheit an Tag minus drei und Tag minus eins vor
Versuchsbeginn durchgeführt. Die Mäuse wurden auf eine rotierende Walze mit
einem Durchmesser von 30 mm gesetzt, die sich am ersten Trainingstag mit einer
konstanten Geschwindigkeit von fünf Umdrehungen/Minute drehte. Am zweiten
Trainingstag wurde die Geschwindigkeit auf 10 Umdrehungen/Minute erhöht. Ab dem
Tag des Versuchsbeginns (Tag Null) wurde die Walze linear von fünf auf 55
Umdrehungen/Minute beschleunigt. Die Umdrehungszahl, bei der die Tiere von der
Walze hinunterfielen, wurde über eine Lichtschranke gemessen und automatisch
aufgezeichnet. Pro Tier und Versuchstag wurden drei aufeinanderfolgende
Messungen durchgeführt und der Mittelwert der drei Messwerte bestimmt. Anhand
der Messwerte kann ermittelt werden, ob sich die Motorkoordination der Tiere
während der Versuchsdauer verändert (ULRICH, 2006).
Material und Methoden
Tabelle 4-4:
42
Bewertungskriterien der klinischen Untersuchung
Kategorie:
Veränderung:
Haltung und äußere normale Haltung
Haare glatt, glänzend und dem Körper dicht
Erscheinung
Punktzahl
0
anliegend
Verhalten und
Aktivität
Gang
normale Haltung
struppige, stumpfe Haare
1
leicht aufgekrümmter Rücken
struppige, stumpfe Haare
2
stark aufgekrümmter Rücken
struppige, stumpfe, verunreinigte Haare; Inkontinenz
3
aufmerksam und neugierig
0
sehr ruhig
geringgradig reduzierte spontane Bewegung, nicht
reduzierte induzierte Bewegung
1
Apathie
mittelgradig reduzierte spontane Bewegung,
geringgradig reduzierte induzierte Bewegung
2
Stupor
keine spontane Bewegung, kaum induzierte
Bewegung
normaler Bewegungsablauf
geringgradige, spinale Ataxie: gelegentlich zu
beobachtende geringgradige Gangunsicherheit
(Schwanken, Stolpern, geringgradig verkürzte
Schritte); teilweise nur beim Klettern am Laufrad
oder am Käfig sichtbar
mittelgradige spinale Ataxie: regelmäßig zu
beobachtende, gering- bis mittelgradige
Gangunsicherheit (Schwanken, Stolpern, verkürzte
Schritte, Rudern mit dem Schwanz)
hochgradige spinale Ataxie: regelmäßig zu
beobachtende, mittel- bis hochgradige
Gangunsicherheit (Schwanken, Stolpern, Umfallen,
verkürzte Schritte, Rudern mit dem Schwanz);
verzögertes Aufstehen aus Rückenlage
höchstgradige spinale Ataxie: spastische Parese
mehrerer Gliedmaßen; deutlich verzögertes
Aufstehen aus Rückenlage
3
0
1
2
3
4
Die Haltung und die äußere Erscheinung sowie das Verhalten, die Aktivität und der Gang aller Tiere
im Versuch wurden einmal wöchentlich mittels dieses Bewertungsschemas beurteilt. Die jeweiligen
Punktzahlen der drei Einzelkategorien wurden zu einer Gesamtpunktzahl von null Punkten bis
maximal zehn Punkten addiert. Wenn ein Tier in einer der drei Kategorien mit der Höchstpunktzahl
bewertet wurde, wurde das betroffene Tier vorzeitig aus dem Versuch genommen. ULRICH 2006.
Material und Methoden
4.1.5
43
Sektion und Gewinnung von Probenmaterial
An den jeweiligen Tötungszeitpunkten wurden die Mäuse erneut wie zuvor
beschrieben mit Medetomidin und Ketamin in Narkose gelegt. Zur Tötung wurden
ihnen anschließend in tiefer Narkose 1,0 mg/kg Medetomidin und 200 mg/kg Ketamin
intraperitoneal verabreicht. In tiefer terminaler Narkose wurde den Mäusen
unmittelbar vor Beginn der Perfusion mittels einer Einmal-Feindosierungsspritze Blut
aus dem Herzen entnommen. Als Gerinnungshemmer wurden 0,05 ml Heparin
verwendet, das zuvor 1:1000 mit 0,9%iger Kochsalzlösung vorverdünnt wurde. Das
heparinisierte Blut wurde bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert.
Anschließend wurden die Mäuse mit 3,75 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(PBS, phosphate buffered saline) pro Minute über den linken Ventrikel perfundiert,
bis die großen parenchymatösen Organe weitestgehend blutleer erschienen. Direkt
im Anschluss wurde die Milz in toto entfernt, gewogen und in der Mitte zerteilt. Eine
Hälfte der Milz wurde in PBS mit 0,5% fetalem Kälberserum (fetal calf serum, FCS)
überführt und für die Durchflusszytometrie aufbereitet. Dünndarm, Zäkum und
Dickdarm wurden getrennt voneinander vollständig entnommen und longitudinal
eröffnet. Um die enthaltene Ingesta zu entfernen, wurde der Darm in 4%igem
Formalin geschwenkt und ggf. vorsichtig gespült. Der Dünndarm wurde in der Mitte
geteilt. Die Dünndarmanteile und der Dickdarm wurden für 24 Stunden in gerollter
Form in 4%igem Formalin fixiert. Das Gehirn wurde entnommen und auf Höhe des
Chiasma opticums sowie auf Mitte des Cerebellums transversal geteilt. Die
Wirbelsäule wurde in sechs Abschnitte unterteilt (C1-2, C3-Th2, Th3-6, Th7-13, L1-2
und L3-6) und an C3-Th2, Th7-13 und L3-6 wurde jeweils eine vollständige
Laminektomie durchgeführt um das Rückenmark zu entnehmen und anschließend zu
Gefrierblöcken weiterzuverarbeiten. Neben den drei Rückenmarkssegmenten wurde
auch jeweils ein Viertel der Milz zur Herstellung von Gefrierblöcken verwendet. Die
Gewebe wurden in Aluhütchen, die aus Rotilabo®-Aluminium-Rundlingen erstellt
wurden
gesetzt
und
mit
Tissue-Tec®
O.C.T.TM
Compound
überschichtet.
Anschließend wurden sie in einer Blechdose mit Hilfe von flüssigem Stickstoff und
Material und Methoden
44
Isopentan als Kälteleiter gefroren. Die Lagerung des Gefriermaterials bis zur
Weiterverarbeitung erfolgte bei -80°C.
Die Rückenmarksegmente C1-2, Th3-6, und L1-2, sowie Thymus, mesenteriale
Lymphknoten, ein Viertel der Milz, Leber, Magen, Pankreas, Trachea, Ösophagus,
Schilddrüse, Herz, Lunge, Niere, Nebenniere, Ovarien, Uterus, Blase, Zunge,
Speicheldrüse, Haut, Augen, Skelettmuskulatur, Oberschenkelknochen und Sternum
wurden für mindestens 24 Stunden in 4%igem Formalin fixiert. Anschließend wurde
pro Tier ein Oberschenkelknochen und das Sternum für 48 Stunden in 10%iger
Disodium-Ethylendiamintetraacetat (EDTA) entkalkt. Nach Entnahme des fixierten
Rückenmarks aus dem Wirbelkanal wurden alle Gewebe nach maschineller
Entwässerung in einer aufsteigenden Alkoholreihe in ein Paraffin-Paraplast-Gemisch
routinemäßig eingebettet. Vom Darm wurden jeweils zwei circa 0,5 cm lange Stücke
Dünndarm, ein 0,5 cm langes Stück Zäkum und sechs 0,5 cm lange, repräsentative
Proben
Kolon
entnommen
und
als
Querschnitte
analog
zu
den
übrigen
Gewebeproben in Paraffin-Paraplast-Gemisch eingebettet.
4.2
Histologie
Für die histologische Untersuchung der formalinfixierten Gewebe wurde jeweils eine
Serie von 2-3 μm dicken Schnitten hergestellt und auf SuperFrost®Plus-Objektträger
aufgezogen. Von jeweils einem Schnitt wurde anschließend routinemäßig eine
Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung in einem Färbeautomaten (Leica ST 4040, Leica
Instruments GmbH) durchgeführt (MULISCH u. WELSCH 2010). Die HE-gefärbten
Schnitte wurden lichtmikroskopisch untersucht und Darm und Rückenmark wurden
mittels semiquantitativer Auswertungsschemata bewertet.
Material und Methoden
4.2.1
45
Semiquantitative Auswertung
Dünndarms, Zäkums und Kolons
der
Läsionen
des
Die Schnitte von Dünndarm, Zäkum und Kolon aller Versuchsteile wurden anhand
eines semiquantitativen, modifizierten Auswertungsschemas nach TAMAKI et al.
(2006) evaluiert. Pro Darmabschnitt (2 x Dünndarm, 1 x Zäkum, 6 x Kolon) wurden
vier Kriterien beurteilt, die in Tabelle 4-5 zusammengefasst dargestellt sind. In den
Kategorien Grad der Entzündung, Ausdehnung der Entzündung und Schädigung des
Kryptepithels wurde jeweils die am stärksten betroffene Stelle des jeweiligen
Darmsegments beurteilt. Über die Kategorie Prozent wurde zusätzlich erhoben,
welcher Anteil des Gewebes entzündlich verändert war. Der Parameter Entzündung
beschrieb
eine
vermehrte
Infiltration
von
Makrophagen,
Lymphozyten
und
neutrophilen Granulozyten in das Darmepithel oder die darunter gelegenen
Schichten. Pro Querschnitt wurden die vier Parameter summiert, sodass sich eine
Gesamtpunktzahl zwischen 0 und 14 für den jeweiligen Querschnitt ergab.
Anschließend wurde pro Tier und Darmabschnitt (Dünndarm, Zäkum, Kolon) der
arithmetische Mittelwert berechnet, in dem die Summen der einzelnen Querschnitte
der jeweiligen Darmabschnitte gemittelt wurden.
4.2.2
Semiquantitative
Rückenmark
Auswertung
der
Läsionen
im
Vom Rückenmark wurde pro Tier ein HE-gefärbter Querschnitt des Zervikal-,
Thorakal- und Lumbalmarks untersucht. Die Auswertung erfolgte nach einem
zweiteiligen,
semiquantitativen
Auswertungsschema,
welches
bereits
in
vorausgegangenen Arbeiten zur TME angewendet wurde (ULRICH et al., 2006;
GERHAUSER et al., 2007; HERDER et al., 2012). Hierfür wurde jeder der drei
Rückenmarktransversalschnitte in vier Quadranten unterteilt, wobei die vertikale
Grenze der Quadranten durch den Sulcus medianus dorsalis und die Fissura
mediana ventralis verlief. Die horizontale Grenze bildete eine senkrecht verlaufende
Linie, die durch die Mitte des Zentralkanals verlief. Pro Quadrant wurde einerseits die
Material und Methoden
46
Anzahl der Lagen perivaskulär gelegener Entzündungszellinfiltrate (PVI) und
andererseits die Anzahl der Entzündungszellinfiltrate in der weißen Substanz
(Hyperzellularität) erhoben. Tabelle 4-6 zeigt die Kriterien für die Punktevergabe
beider Kategorien. Im Anschluss wurde der arithmetische Mittelwert für alle drei
Segmente und beide Parameter getrennt bestimmt, indem die Punktzahlen der vier
Quadranten jedes Segments gemittelt wurden. Für jedes Tier wurde dann ein
arithmetischer Gesamtmittelwert pro Rückenmark und Tier berechnet, indem die
Punktzahlen der drei Segmente beider Kategorien gemittelt und die Werte für PVI
und Hyperzellularität addiert wurden.
Tabelle 4-5:
Semiquantitative Auswertung des Darms
Kategorie:
Grad der Entzündung
Veränderung:
keine
geringgradig
mittelgradig
hochgradig
Ausdehnung der
keine
Entzündung
auf die Tunica mucosa beschränkt
Tunica mucosa und submucosa betroffen
transmurale Entzündung bis in die tiefen
Schichten der Tunica muscularis
Schädigung des
keine
Kryptepithels
basales 1/3 geschädigt
basale 2/3 geschädigt
fokaler Verlust des Kryptepithels, intaktes
Oberflächenepithel
Verlust des Epithels (Ulzeration)
betroffener Darmanteil
0%
1 bis ≤ 25%
26 bis ≤ 50%
51 bis ≤ 75%
76 bis ≤ 100%
Punktzahl:
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
Nach HE-Färbung wurden pro Tier jeweils zwei HE-gefärbte Anschnitte Dünndarm, ein Anschnitt
Zäkum und sechs Anschnitte Kolon semiquantitativ evaluiert. In jedem Anschnitt wurde für die
Kategorien Grad und Ausdehnung der Entzündung sowie Schädigung des Kryptepithels jeweils die
am stärksten betroffene Stelle des Darmsegments beurteilt. Zusätzlich wurde erhoben wie viele
Prozent des Darms in dem jeweligen Segment betroffen waren. Aus den Einzelpunktzahlen der vier
Kategorien ergab sich die Summe für jeden der drei Darmabschnitte. Modifiziert nach TAMAKI et al.,
2006.
Material und Methoden
Tabelle 4-6:
47
Semiquantitative Auswertung des Rückenmarks
Kategorie:
PVI
Hyperzellularität
weiße Substanz
Veränderung:
Punktzahl:
keine
nur vereinzelte PVI
2 bis 3 Lagen PVI
≥ 3 Lagen PVI
keine
1 bis ≤ 25 Zellen
26 bis ≤ 50 Zellen
> 50 Zellen
0
1
2
2
0
1
2
3
Nach HE-Färbung wurde pro Tier jeweils ein Querschnitt des zervikalen, thorakalen und lumbalen
Rückenmarks beurteilt. Die Angabe der Zellzahl für die Hyperzellularität in der weißen Substanz
bezieht sich jeweils auf das am stärksten betroffene Gesichtsfeld bei hoher Vergrößerung (400x). Die
Punktzahl für die perivaskulären Infiltrate (PVI) beschreibt jeweils den am stärksten veränderten
perivaskulären Bereich des Querschnitts. ULRICH et al., 2006; GERHAUSER et al., 2007; HERDER
et al., 2012.
4.3
Immunhistologie
4.3.1
Durchführung
Die immunhistologischen Untersuchungen des zervikalen, thorakalen und lumbalen
Rückenmarks wurden mittels Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)-Methode
durchgeführt und für die Visualisierung der Reaktion wurde das Chromogen 3,3’Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
(DAB,
siehe
Anhang)
verwendet.
Für
die
Charakterisierung der Entzündungszellpopulation wurde ein polyklonaler anti-CD3Antikörper aus dem Kaninchen zur Detektion von T-Zellen verwendet und B-Zellen
wurden mittels eines spezifischen, monoklonalen anti-CD45R/B220-Antikörpers aus
der Ratte nachgewiesen (GERHAUSER et al., 2007a,b; HERDER et al., 2012b;
HERDER et al., 2015). Außerdem wurden regulatorische T-Zellen durch die
Verwendung eines monoklonalen Foxp3-spezifischen Antikörpers aus der Ratte
detektiert und zum Nachweis von Makrophagen/Mikroglia wurde einerseits ein
Material und Methoden
48
monoklonaler
aus
anti-CD107b-Antikörper
der
Ratte
und
andererseits
ein
polyklonaler anti-Arginase-1-Antikörper aus der Ziege verwendet (GERHAUSER et
al., 2007a,b; HERDER et al., 2012b; HERDER et al., 2015). Axonaler Schaden
wurde durch einen monoklonalen Antikörper gegen Nicht-phosphorylierendesNeurofilament-Protein (Np-NF) aus der Ziege detektiert und zum Nachweis von
Entmarkung wurde die Menge von MBP mittels eines polyklonalen anti-MBPAntikörpers aus dem Kaninchen quantifiziert (GERHAUSER et al., 2007a,b;
SEEHUSEN und BAUMGÄRTNER, 2010; HERDER et al., 2012b; KREUTZER et al.,
2012). Darüberhinaus wurde TMEV-spezifisches Antigen durch die Verwendung
eines polyklonalen anti-TMEV-Antikörpers aus dem Kaninchen nachgewiesen (siehe
Tabelle 4-7; KUMMERFELD et al., 2009; NAVARETTE-TALLONI, 2010).
Zur Demaskierung des Antigens wurden die Schnitte zum Nachweis von CD3,
CD45R/B220, Foxp3, CD107b, Arginase-1 und Np-NF für 20 Minuten in 10 mM
Natrium-Zitrat-Puffer (pH-Wert 6,0; Raumtemperatur; siehe Anhang) bei 800 Watt
(W) in der Mikrowelle erhitzt. Für den Nachweis von MBP- und TMEV-Antigen wurde
keine Vorbehandlung durchgeführt. Um eine unspezifische Hintergrundsreaktion zu
vermeiden, wurden die Schnitte vor Applikation des Primärantikörpers für 30 Minuten
mit verdünnten Normalseren (1:5 in PBS) der Tierart inkubiert, aus welcher der
jeweils
verwendete
Sekundärantikörper
stammte
(Kaninchen-
oder
Ziegennormalserum; siehe Tabelle 4-7). Anschließend wurden die Schnitte für
75 Minuten mit dem jeweiligen Primärantikörper inkubiert. Die verwendeten
Verdünnungen wurden mit PBS unter Zusatz von 1% Bovinem Serumalbumin (BSA)
hergestellt und sind in Tabelle 4-7 aufgelistet. Die biotinylierten Sekundärantikörper
wurden vor der Verwendung 1:200 mit PBS verdünnt. Je nach Herkunftsspezies des
jeweiligen Primärantikörpers handelte es sich um biotinilierte Ziege-anti-Kaninchen
IgG-Antikörper zum Nachweis von T-Zellen, TMEV- und MBP-Antigen, um
biotinilierte Kaninchen-anti-Ratte IgG-Antikörper für die Detektion von Foxp3+ Treg
und um biotinilierte Kaninchen-anti-Ziege IgG-Antikörper zur Darstellung von
Arginase-1+-Makrophagen/Mikroglia und np-NF+-Axonen. Für die Reaktionen zum
Nachweis von CD107b+-Makrophagen/Mikroglia und CD45R+-B-Zellen wurden keine
Material und Methoden
49
Sekundärantikörper und Blockseren verwendet, da es sich um biotinylierte
Primärantikörper handelte. Pro Färbung wurde jeweils eine adäquate Negativ- und
Positivkontrolle mitgeführt. Als Negativkontrolle wurde anstelle des Primärantiköpers
jeweils ein Normalserum der Tierart aufgetragen, in der der Primärantikörper
hergestellt
wurde.
Die
verwendeten
Konzentrationen
entsprechen
der
des
Primärantikörpers und sind in Tabelle 4-7 aufgeführt. Für die Positiv- und
Negativkontrollen wurden zum Nachweis von CD3-, CD45R/B220-, Foxp3- und
CD107b-Antigen jeweils Schnitte mit murinem Milz- und Lymphknotengewebe
mitgeführt. Für die Reaktionen zum Nachweis von Arginase-1 wurde murines
Lebergewebe und für MBP- und np-NF-Antigen Rückenmark einer nicht-infizierten
Kontrollmaus genutzt. Als Kontrollschnitte für den Antigennachweis von TMEV wurde
ein Pellet infizierter BHK21-Zellen aus der Zellkultur verwendet.
Um eine enterale TMEV-Infektion auszuschließen wurde zusätzlich eine TMEVAntigen-spezifische
Immunhistologie
aller
histologisch
untersuchten
Darmquerschnitte nach dem zuvor beschriebenen Protokoll durchgeführt.
Die jeweiligen Primärantikörper zum Nachweis der verschiedenen Antigene sowie
Seren,
Sekundärantikörper
und
Vorbehandlungen
sind
in
Tabelle
4-7
zusammengefasst dargestellt. Die Produktinformationen zu den verwendeten
Chemikalien, Reagenzien, Antikörpern, Geräten und Einmalartikeln finden sich im
Anhang in Kapitel 10.1 (Bezugsquellen für Chemikalien, Reagenzien und Antikörper),
10.2 (Bezugsquellen für Geräte, Software und Einmalartikel) und 10.4 (Lösungen
und Puffer).
4.3.2
Protokoll für die Immunhistologie an Paraffinschnitten
1. Deparaffinieren und Rehydratisieren der Schnitte für zweimal zwei Minuten in
Roticlear®, zwei Minuten in Isopropanol und zwei Minuten in 96%igem
Ethanol
2. Hemmung der endogenen Peroxidase in 85%igem Ethanol nach Zusatz von
0,5% Wasserstoffperoxid über 30 Minuten
Material und Methoden
50
3. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS
4. Gegebenenfalls Demaskierung des Antigens: 20 Minuten bei 800 Watt in der
Mikrowelle in Natrium-Zitrat-Puffer (pH 6,0; siehe Tabelle 4-7; siehe Anhang)
5. Zweimaliges Spülen der Schnitte mit PBS, Verbringen der Schnitte in
Shandon Coverplates® und Shandon Sequenza® Slide Racks
6. Spülen der Shandon Coverplates® mit PBS
7. Überschichten mit 120 µl eines inaktivierten Normalserums, Inkubation für
20 Minuten bei Raumtemperatur (Vorverdünnung 1:5 mit PBS; siehe Tabelle
4-7)
8. Auftragung von 120 µl Primärantikörper (Vorverdünnung mit PBS und einem
Prozent
BSA;
siehe
Tabelle
4-7),
Inkubation
für
75 Minuten
bei
Raumtemperatur
9. Zweimaliges Spülen der Shandon Coverplates® mit PBS
10. Überschichten der Shandon Coverplates® mit 120 µl des biotinylierten
Sekundärantikörpers (Vorverdünnung 1:200 mit PBS; siehe Tabelle 4-7),
Inkubation für 45 Minuten bei Raumtemperatur
11. Zweimaliges Spülen der Shandon Coverplates® mit PBS
12. Auftragung von 120 µl des vorinkubierten ABC-Reagenz, einmaliges Spülen
der Shandon Coverplates® mit PBS, Entnahme der Schnitte
13. Inkubation
der
Schnitte
in
0,05%igem
DAB
mit
PBS
und
0,3%
Wasserstoffperoxid für fünf Minuten bei Raumtemperatur
14. Dreimaliges Spülen der Schnitte mit PBS, zweimaliges Spülen der Schnitte mit
Aqua dest.
15. Gegenfärbung der Schnitte für 30 Sekunden mit Hämalaun nach Mayer
16. Bläuen der Schnitte durch dreimaliges Spülen mit Aqua dest.
17. Dehydratisieren der Schnitte in aufsteigender Alkoholreihe für jeweils eine
Minute in 70%igem und 96%igem Ethanol, zwei Minuten in Isopropanol und
zweimal eine Minute in Essigsäure-n-butylester (EBE).
18. Eindecken der Schnitte mit Roti®-HistoKit ll
Material und Methoden
Tabelle 4-7:
51
Übersicht über die durchgeführten
immunhistologischen Untersuchungen
Primärantikörper
Antigen
Klon
CD3
Verdünnung,
Vorbehandlung
pk
1:1000
Kaninchen
Zitratpuffer/MW
Negativkontrolle:
SekundärSerum,
antikörper
Verdünnung
Spezifität
KNS, 1:1000
GAR-b
T-Lymphozyten
1:1000
Zitratpuffer/MW
RNS, 1:1000
RAR-b
B-Lymphozyten
1:50
Zitratpuffer/MW
RNS, 1:50
RAR-b
Treg
1:200
Zitratpuffer/MW
RNS, 1:200
RAR-b
aktivierte
Makrophagen/
Mikroglia (M2)
1:50
Zitratpuffer/MW
ZNS, 1:50
RAG-b
aktivierte
Makrophagen/
Mikroglia
1:8000
Zitratpuffer/MW
ZNS, 1:8000
RAG-b
Störung der
axonalen
Phosphorylierung
RA3-6B2
CD45R
mk
Ratte
FJK-16s
Foxp3
mk
Ratte
M3/84
CD107b
mk
Ratte
N-20
Arginase-1
pk
Ziege
SMI 311
np-NF
mk
Ziege
pk
1:2000
basisches
KNS, 1:2000
GAR-b
keine
Myelinprotein
Kaninchen
Vorbehandlung
pk
1:2000
TMEV
KNS, 1:2000
GAR-b
TMEV
keine
Kaninchen
Vorbehandlung
Übersicht über den antigenspezifischen Nachweis von Entzündungszellen (CD3, CD45R, Foxp3,
CD107b, Arginase-1), nicht-phosphorylierendem Neurofilament (np-NF, non-phosphorylated
neurofilament protein), murinem basischen Myelinprotein (MBP) und Theiler´schem murinen
Enzephalomyelitisvirus (TMEV) im Rückenmark von TMEV-infizierten SJL-Mäusen.
RNS = Rattenneutralserum, ZNS = Ziegenneutralserum, KNS = Kaninchenneutralserum; Treg =
regulatorische T-Zellen, pk = polyklonal, mk = monoklonal, MW = Mikrowelle, GAR-b = biotinilierter
Ziege-anti-Kaninchen (goat-anti-rabbit) IgG-Antikörper, RAR-b = biotinilierter Kaninchen-anti-Ratte
(rabbit-anti-rat) IgG-Antikörper, RAG-b = biotinilierter Kaninchen-anti-Ziege (rabbit-anti-goat) IgGAntikörper.
GERHAUSER et al., 2007a,b; KUMMERFELD et al., 2009; NAVARETTE-TALLONI, 2010;
SEEHUSEN und BAUMGÄRTNER, 2010; KREUTZER et al., 2012; HERDER et al., 2012b; HERDER
et al., 2015.
MBP
Material und Methoden
4.3.3
52
Auswertung
Für die Ermittlung der Menge von TMEV-, CD3-, CD45R-, Foxp3-, CD107b- und
Arginase-1-Antigen wurde für jedes der drei Rückenmarksegmente die absolute
Anzahl positiver Zellen in der grauen und weißen Substanz bestimmt. Es wurden nur
deutliche zellgebundene, intrazytoplasmatische (TMEV, Arginase-1) bzw. membran(CD3, CD45R, CD107b) und kernständige (Foxp3) Signale gezählt. Die Zählung
erfolgte lichtmikroskopisch bei 200-facher Vergrößerung unter Verwendung einer in
das Okular des Mikroskops eingelassenen Netzmikrometerplatte (U-OCMSQ10/10).
Anschließend wurden die drei Werte addiert, sodass sich eine Gesamtsumme
positiver Zellen pro Tier und Rückenmark ergab. Für die Auswertung von np-NFpositiven Axonen wurde pro Tier ebenfalls jeweils ein Querschnitt zervikales,
thorakales und lumbales Rücken untersucht und die Anzahl der positiven Axone in
der weißen Substanz ermittelt, die einen Durchmesser ≥ 3 µm aufwiesen. Die Werte
der zervikalen, thorakalen und lumbalen Rückenmarkssegmente wurden für jedes
Tier addiert und erneut zu einer Gesamtsumme zusammengezogen.
Die Auswertung der MBP-Expression erfolgte morphometrisch mit dem Keyence BZ9000 Hellfeld-Phasenkontrast-Fluoreszenz-Mikroskop. Hierfür wurde in einem ersten
Schritt die Größe jedes Rückenmarkssegments in µm2 bei 40-facher Vergrößerung
mit der area measurement-Funktion der Keyence Messmodul-Software ermittelt.
Anschließend erfolgte bei 100-facher Vergrößerung eine manuelle Abgrenzung der
Herde in der weißen Substanz, in denen keine MBP-Expression mehr erfolgte. Die
Größe dieser Herde wurde mittels eines gerätespezifischen Kalibrierungsfaktors in
µm2 umgerechnet. Abschließend wurde die Fläche mit fehlender MBP-Expression in
Relation zur Gesamtfläche ermittelt und in Prozent angegeben.
Material und Methoden
4.4
53
Isolation von Ribonukleinsäure
Für eine Quantifizierung der Virusmenge und der Zytokin- und MBP-messenger
Ribonukleinsäure (mRNS) wurde aus dem Rückenmark und der Milz der TMEVinfizierten Tiere von Tag 14 und 22 aus dem zweiten Versuchsteil (akute Phase der
TMEV-Infektion) sowie der Tiere von Tag 49 des dritten Versuchsteils (chronische
Phase der TMEV-Infektion) Ribonukleinsäure (RNS) aus Gefriermaterial isoliert.
Hierfür wurden ein RNeasy® MiniKit, QIAzol® Lysis Reagent und ein Omni´s PCR
Tissue Homogenizing Kit sowie jeweils 10-40 mg Gewebe der Rückenmarks- und
Milzgefrierblöcke verwendet. Es wurde pro Tier und Organ 1 ml QIAzol® Lysis
Reagent in ein 2 ml Eppendorfgefäß auf Eis vorgelegt und das Probenmaterial
hinzugefügt. Anschließend wurde das Gewebe homogenisiert und für 5 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Die weitere RNS-Isolation aus Milz und Rückenmark
erfolgte analog zu den Angaben des Herstellers nach dem folgenden Protokoll:
1. Zugabe von 200 µl Chloroform, mischen durch kräftiges schütteln (vortexen)
2. Inkubation für drei Minuten bei Raumtemperatur
3. Zentrifugation der Proben für 15 Minuten bei 12000 x g und 4°C
4. Überführung der oberen, wässrigen Phase in ein neues 2 ml Eppendorfgefäß
5. Zugabe von 0,5 ml Isopropanol, mischen durch kräftiges schütteln (vortexen)
6. Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur
7. Zentrifugation der Proben für 10 Minuten bei 12000 x g und 4°C
8. Aspiration und Verwurf des Überstands
9. Zugabe von 600 µl 70%igem Ethanol, mischen durch kräftiges schütteln
(vortexen)
10. Überführung von 600 µl der Lösung in ein RNeasy® mini column
11. Zentrifugation des RNeasy® mini column für 15 Sekunden bei 8000 x g
12. Verwurf des Durchflusses, Überführung der restlichen Lösung
13. Zentrifugation des RNeasy® mini column für 15 Sekunden bei 8000 x g
14. Verwurf des Durchflusses und des Sammelröhrchens, Überführung des
RNeasy® mini column in ein neues Sammelröhrchen
Material und Methoden
54
15. Zugabe von 350 µl RW1-Puffer, Zentrifugation des RNeasy® mini column für
15 Sekunden bei 8000 x g
16. Verwurf des Durchflusses
17. Mischen von 10 µl DNase I stock solution und 70 µl RDD-Buffer pro Probe,
Überführung von 80 µl des Ansatzes auf jede Silica-Gel-Membran
18. Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur
19. Hinzugabe von 350 µl RW1-Buffer
20. Zentrifugation des RNeasy® mini column für 15 Sekunden bei 8000 x g,
Verwurf des Durchflusses
21. Hinzugabe von 500 µl RPE-Buffer, erneute Zentrifugation für 15 Sekunden bei
8000 x g, Verwurf des Durchflusses
22. Hinzugabe von 500 µl RPE-Buffer, Zentrifugation für 2 Minuten bei 8000 x g,
Verwurf des Durchflusses, erneute Zentrifugation für 1 Minute bei 8000 x g
23. Verwurf des Durchflusses, Überführung des RNeasy® mini column in ein
1,5 ml Eppendorfgefäß
24. Zugabe von 50 µl RNAse-freiem Wasser, Zentrifugation für 1 Minute bei
8000 x g, Verwurf des RNeasy® mini column
25. Lagerung der Proben bis zur weiteren Verwendung bei -80°C
4.5
Reverse Transkription
Die isolierte RNS wurde mit dem Omniscript® Reverse Transcriptase Kit, 10 μM
Random Hexamers und 0,5 U/μl RNase Inhibitor wie vom Hersteller empfohlen in
komplementäre DNS (cDNS, complementary DNA) umgeschrieben. Von der
isolierten RNS des Rückenmarks wurden jeweils 110 ng und von der Milz 500 ng
RNS eingesetzt. Die Reaktionsansätze wurden in einem Thermocycler für zehn
Minuten bei 25°C und anschließend für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Danach
erfolgte eine Hitzeinaktivierung der reversen Transkriptase bei 93°C für fünf Minuten.
Material und Methoden
4.6
55
Konventionelle Polymerase-Kettenreaktion
Für die Erstellung der Standartreihen wurden aus cDNS des Milzgewebes von
Kontrolltieren mittels spezifischer Primer die PCR-Produkte von IL-1α, IL-2, IL-4
(HERDER et al., 2012a), IL-5, IL-6 (SCHAUDIEN, 2007), IL-10 (HERDER et al.,
2012a), Foxp3 (HANSENNE et al., 2009), TNF, IFN-γ und TGF-β1 (HERDER et al.,
2012a) erstellt. Aus der cDNS des Gehirns einer TMEV-infizierten Maus wurde
TMEV amplifiziert und für MBP wurde Rückenmark eines Kontrolltieres verwendet
(ULRICH et al., 2006). Außerdem wurden die drei Referenzgene Glycerinaldehyd-3phosphat-Dehydrogenase
(GAPDH),
Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase
(HPRT) und β-Aktin amplifiziert (ULRICH et al., 2005).
Alle Reaktionen wurden unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase PCR Buffer,
Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTP) und AmpliTaq® DNA Polymerase nach
den
Angaben
des
Herstellers
durchgeführt
und
es
wurde
jeweils
eine
Negativkontrolle mitgeführt, bei der die zu untersuchende cDNS durch eine
entsprechende Menge Diethyldicarbonat (DEPC)-Wasser (siehe Anhang) ersetzt
wurde. Der Probenansatz wurde für alle Reaktionen wie in Tabelle 4-8 angegeben
hergestellt. Die verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 4-9 aufgeführt.
Tabelle 4-8:
Probenansatz für die konventionelle Polymerase
Kettenreaktion
DEPC Wasser
10-fach Puffer [ohne MgCl2]
18,93 µl
2,5 µl
MgCl2 [50 mM]
0,75 µl
dNTP [10mM]
0,5 µl
Taq-Polymerase
0,13 µl
Vorwärtsprimer [15pmol]
0,6 µl
Rückwärtsprimer [15pmol]
0,6 µl
24 µl
cDNS
Gesamt
1 µl
25 µl
Material und Methoden
Tabelle 4-9:
Gen:
IL-1α
IL-2
IL-4
IL-5
IL-6
IL-10
Foxp3
TNF
INF-γ
TGF-β1
TMEV
MBP
GAPDH
HPRT
β-Aktin
56
Spezifische Primerpaare für den mRNS-Nachweis
von Zytokinen, Foxp3, TMEV, MBP und den drei
Referenzgenen GAPDH, HPRT und β-Aktin
Primer:
Richtung:
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
Sequenz (5´ → 3´):
AAG CAA CGG GAA GAT TCT GA
TGA CAA ACT TCT GCC TGA CG
GCA GGA TGG AGA ATT ACA GGA
TGA AAT TCT CAG CAT CTT CCA A
CCT CAC AGC AAC GAA GAA CAC C
CAT CGA AAA GCC CGA AAG AGT C
ATG GAG ATT CCC ATG AGC AC
CCC ACG GAC AGT TTG ATT CT
GTT CTC TGG GAA ATC GTG GA
CCA GAG GAA ATT TTC AAT AGG C
CCA AGC CTT ATC GGA AAT GA
TTT TCA CAG GGG AGA AAT CG
TTC-TCA-CAA-CCA-GGC-CAC-TTG
CCC-AGG-AAA-GAC-AGC-AAC-CTT
GCC TCT TCT CAT TCC TGC TT
CAC TTG GTG GTT TGC TAC GA
CAC GGC ACA GTC ATT GAA AG
AAT CTG GCT CTG CAG GAT TT
TTG CTT CAG CTC CAC AGA GA
TGG TTG TAG AGG GCA AGG AC
GAC TAA TCA GAG GAA CGT CAG C
GTG AAG AGC GGC AAG TGA GA
GAC TCA CAC ACG AGA ACT AC
GTG TTC GAG GTG TCA CAA
GAG GCC GGT GCT GAG TAT GT
GGT GGC AGT GAT GGC ATG GA
GGA CCT CTC GAA GTG TTG GA
TTG CGC TCA TCT TAG GCT TT
GGC TAC AGC TTC ACC ACC AC
ATG CCA CAG GAT TCC ATA CC
Länge des
Amplifikats:
179 bp
183 bp
133 bp
180 bp
176 bp
162 bp
88 bp
203 bp
144 bp
183 bp
129 bp
117 bp
288 bp
169 bp
233 bp
Die Tabelle zeigt die verwendeten Primerpaare und die Basenpaarlänge der jeweiligen PCRProdukte. GAPDH, HPRT und β-Aktin wurden als Referenzgene verwendet.
IL = Interleukin, Foxp3 = Forkhead Box Protein P3, TNF = Tumornekrosefaktor, IFN-γ = Interferon-γ,
TGF-β1 = Transforming growth factor-β1, TMEV = Theiler´sches murines Enzephalomyelitisvirus,
GAPDH = Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, HPRT = Hypoxanthin-PhosphoribosylTransferase, MBP = basisches Myelinprotein (myelin basic protein), bp = Basenpaare (base pairs).
Material und Methoden
57
ULRICH et al., 2005; ULRICH et al., 2006; SCHAUDIEN, 2007; HANSENNE et al., 2009; HERDER et
al., 2012a; HERDER et al., 2012b.
4.7 Gelelektrophorese
Die Produkte aus der konventionellen PCR wurden in einem horizontalen 2%igen
ethidiumbromidhaltigen Agarosegel (siehe Anhang) in einer Laufkammer mit 1%igem
Trisaminomethan-Borat-Ethylendiamintetraessigsäure (TBE)- Puffer (siehe Anhang)
elektrophoretisch aufgetrennt um die Spezifität der Reakionen zu überprüfen. Von
jeder Probe wurden 7 μl des PCR-Produktes bzw. die gleiche Menge der
Negativkontrolle mit 2 μl Laufpuffer (Gel Loading Buffer) gemischt und in die GelTaschen pipettiert. Als Längenstandard wurde eine DNS-Leiter (0.1-10.000 kb, siehe
Anhang) mitgeführt. Die Auftrennung erfolgte mit einer Elektrophoresis Power Supply
E425-Spannungsquelle bei 120 V (6 V/cm) und 250 mA für 60 Minuten. Zur
Visualisierung der Reaktion wurde das BioDoc Analyse System verwendet, das die
verstärkte Fluoreszenz bei der Wechselwirkung von doppelsträngiger DNS mit
Ethidiumbromid unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 312 nm detektiert. Alle
Reaktionen erzeugten jeweils ein visualisierbares PCR-Produkt mit der spezifischen
Länge. Diese sind in Tabelle 4-9 für alle Primerpaare angegeben.
4.8
Reverse Transkriptase-quantitative PolymeraseKettenreaktion
Zur Erstellung der externen Standartreihen für die Reverse Transkriptasequantitative
Polymerase-Kettenreaktion
(RT-qPCR,
Reverse
Transcriptase-
quantitative PCR) wurden die PCR-Produkte mit DEPC-Wasser verdünnt und auf
eine 10-fache Verdünnungsreihe von 108 bis 102 Kopien/µl eingestellt. Hierfür wurde
die
enthaltene
Menge
des
PCR-Produktes
mit
dem
NanoDrop
1000
Material und Methoden
58
spektralphotometrisch bei 260 nm gemessen und die Anzahl an doppelsträngigen
DNS Kopien pro μl nach folgender Formel berechnet:
Kopien dsDNS  Konzentration [ng / µl ] x 10 9 x 6,02 x 10 23Teilchen / mol

µl
660 g / mol x Länge des Fragments [bp]
Die RT-qPCR wurde mit dem Brilliant III Ultra-Fast SYBR® QPCR Master Mix auf
einem Stratagene MX3005P QPCR System durchgeführt. Für jede Probe wurden
19 µl Mastermix nach den Angaben des Herstellers angesetzt und anschließend 1 µl
cDNS hinzugefügt. Der Mastermix für die Amplifizierung von IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL6, IL-10, Foxp3, TNF, INF-γ, TGF-β1, MBP, GAPDH und β-Aktin enthielt pro Probe
jeweils 8,33 µl DEPC-Wasser, 9,90 µl Brilliant III Ultra-Fast SYBR® QPCR Master
Mix, 0,3 µl des 1:500 mit DEPC-Wassers vorverdünnten reference dye sowie 0,24 µl
des Vorwärts- und Rückwärtsprimers in einer Konzentration von 15 pmol/µl. Für die
Reaktionen von HPRT und TMEV wurde jeweils lediglich die halbe Menge an Primer
eingesetzt
und
der
fehlende
Anteil
durch
DEPC-Wasser
ersetzt.
Das
Temperaturprofil wurde wie in Tabelle 4-10 dargestellt verwendet. Die AnnealingTemperatur betrug für die Amplifikation von IL-5 63°C und für TMEV 65°C (ULRICH
et al., 2006, SCHAUDIEN, 2007). In allen anderen Reaktionen erfolge die
Anlagerung bei 60°C (ULRICH et al., 2005; HANSENNE et al., 2009; HERDER et al.,
2012a). Jede Reaktion erfolgte über 40 Zyklen. Für die Berechnung des
Normalisierungsfaktors aus den drei Referenzgenen GAPDH, HPRT und β-Aktin
wurde die geNorm Software Version 3.4 genutzt und wie bei VANDESOMPELE et al.
(2002) beschrieben angewendet.
Die
Produktinformationen
zu
den
verwendeten
Chemikalien,
Reagenzien,
Antikörpern, Geräten, Einmalartikeln und der Software finden sich im Anhang in
Kapitel 10.1 (Bezugsquellen für Chemikalien, Reagenzien und Antikörper) und 10.2
(Bezugsquellen für Geräte, Software und Einmalartikel).
Material und Methoden
Tabelle 4-10:
Anzahl
der Zyklen:
1
40
1
59
Temperaturprofil und Zyklusdauer für die
Amplifikation der cDNS
Dauer:
Temperatur:
10 Min
30 Sek
11 Sek
9 Sek
1 Min
30 Sek
30 Sek
95 °C
95 °C
Annealing-Temperatur
72 °C
95 °C
55 °C
95°C
Denaturierung
Primeranlagerung
Elongation
Die Annealing-Temperatur betrug für die Amplifikation von IL-5 63°C und für TMEV 65°C (ULRICH et
al., 2006, SCHAUDIEN, 2007). Alle anderen Reaktionen wurden mit einer Annealing-Temperatur von
60°C durchgeführt. Jede Reaktion verlief über 40 Zyklen.
ULRICH et al., 2005; HANSENNE et al., 2009; HERDER et al., 2012a.
Material und Methoden
60
4.9
Durchflusszytometrie
4.9.1
Durchführung
Die Milzhälften der nicht-infizierten SJL-Mäuse aus dem ersten Teil des Versuchs
sowie die Milzhälften der TMEV-infizierten Tiere von Tag 14, 22 und 49 der
Infektionsversuche (Versuchsteil 2 und 3) wurden für eine durchflusszytometrische
Untersuchung aufbereitet.
Für den Nachweis und die Quantifizierung von T- und B-Zellen wurden anti-CD3εbzw. anti-CD19-spezifische Antikörper verwendet. Anschließend erfolgte eine
Differenzierung der T-Zellpopulation in CD4+-T-Helferzellen und CD8+-zytotoxische
T-Zellen mittels anti-CD4- und anti-CD8-spezifischer Antikörper. Mittels eines antiCD69-Antikörpers
wurde
anschließend
die
Expression
von
sehr
frühem
Aktivierungsantigen (very early activation antigen) auf CD4+-T-Helferzellen und
CD8+-zytotoxischen
T-Zellen
quantifiziert.
Analog
hierzu
erfolgte
auch
die
Quantifizierung der T-Gedächtniszellen und T-Effektorgedächtniszellen mittels eines
anti-CD44-Antikörpers in den CD4+- und CD8+-T-Zellsubpopulationen. Weiterhin
wurde der Anteil an Treg aus der T-Helferzellpopulation durch die Expression von
Foxp3 mittels eines spezifischen anti-Foxp3-Antikörpers ermittelt. Da Foxp3 lediglich
im Zellkern exprimiert wird, erfolgte zum Nachweis dieses Antigens eine
Intrazellulärfärbung.
Oberflächenantigene.
Bei
allen
Konjugat,
anderen
Klon,
Antigenen
Isotyp
und
handelte
Verdünnung
es
sich
der
um
jeweils
verwendeten Antikörper sind in Tabelle 4-11 dargestellt.
Die Aufbereitung der Zellen sowie die eigentliche Durchflusszytometrie und die
Auswertung der Messergebnisse wurden am Institut für Experimentelle Immunologie
des
Helmholtz-Zentrums
für
Infektionsforschung
in
Braunschweig
in
der
Material und Methoden
61
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Jochen Hühn nach dem nachfolgenden Protokoll
durchgeführt.
Die Messung der Fluoreszenz erfolgte mit dem BD LSR-II SORP Zytometer und für
die Auswertung und das Gating wurde die Software FlowJo Version 9.6.4 verwendet.
Die
Produktinformationen
zu
den
verwendeten
Chemikalien,
Reagenzien,
Antikörpern, Geräten, Einmalartikeln und der Software finden sich im Anhang in
Kapitel 10.1 (Bezugsquellen für Chemikalien, Reagenzien und Antikörper) und 10.2
(Bezugsquellen für Geräte, Software und Einmalartikel).
4.9.2
Protokoll für die Durchflusszytometrie
1. Präparation der Zellen:
a) Erstellung einer Einzelzellsuspension mittels eines 100 µm Siebs und PBS
mit 0,2% BSA (PBS/BSA) bei Raumtemperatur
b) Zentrifugation der Zellsuspension für 10 Minuten bei 20°C und 337 x g
c) Zugabe von 1 ml Erythrozyten-Lysepuffer (ACK-Lyse-Puffer)
d) Inkubation bei Raumtemperatur für 3 Minuten und 30 Sekunden
e) Abstoppung der Reaktion durch Zugabe von PBS/BSA
f) Zentrifugation der Zellsuspension für 10 Minuten bei 20°C und 337 x g
g) Resuspension des Zellpellets in PBS/BSA, Filtration durch ein 30 µm Sieb
h) Lagerung auf Eis bis zur Weiterverwendung
2. Zellzahlbestimmung:
a) Bestimmung der Zellzahl mittels Trypanblau-Lösung (Vorverdünnung 1:2
mit PBS) und einer Neubauer Improved Zählkammer
b) Überführung von 2 x 106 Zellen pro Tier und Reaktionsgefäß
c) Zugabe von 600 µl PBS
d) Zentrifugation der Zellsuspension für 4 Minuten bei 4°C und 337 x g
Material und Methoden
62
3. Fcy-Block:
a) Zugabe
von
100 µl
anti-CD16/32
Antikörper
pro
Reaktionsgefäß
(Vorverdünnung 1:100 mit PBS)
b) Inkubation für 5 Minuten bei 4°C
c) Zugabe von 600 µl PBS
d) Zentrifugation der Zellsuspension für 4 Minuten bei 4°C und 337 x g
4. Lebend/Tot-Färbung (live/dead staining):
a) Durchführung nach Angaben des Herstellers mittels LIVE/DEAD® Fixable
Dead Cell Stain Kit
b) Verdünnung 1:500 mit PBS
c) Inkubation für 30 Minuten bei 4°C
d) Zugabe von 600 µl PBS
e) Zentrifugation der Zellsuspension für 4 Minuten bei 4°C und 337 x g
5. Fluorochrom-konjugierte Oberflächenfärbung:
a) Zugabe der Antikörper in 100 µl PBS/BSA zu Einzelfärbungen, FMOKontrollen (Fluorescence minus one control) und Proben
b) Inkubation für 15 Minuten bei 4°C
c) Zugabe von 600 µl PBS
d) Zentrifugation der Zellsuspension für 4 Minuten bei 4°C und 337 x g
6. Fixierung:
a) Überführung der Zellen in 200 µl fixation/permeabilization concentrate und
fixation/permeabilization diluent (Verhältnis 1:3)
b) Inkubation für 30 Minuten bei 4°C
c) Zugabe von 600 µl PBS/BSA
d) Zentrifugation der Zellsuspension für 4 Minuten bei 4°C und 337 x g
e) Aufnahme des Zellpellets in 600 µl PBS/BSA
f) Lagerung bis zur Messung im Dunkeln bei 4°C
Material und Methoden
63
7. Intrazelluläre Färbung:
a) Durchführung nach Angaben des Herstellers mittels Foxp3 Transcription
Factor Staining Buffer Set
b) Zentrifugation der Zellsuspension für 4 Minuten bei 4°C und 337 x g
c) Zugabe von 200 ml einfach konzentrierten permeabilization buffer
d) Zentrifugation der Zellsuspension für 4 Minuten bei 4°C und 337 x g
e) Zugabe von 50 µl einfach konzentrierten permeabilization buffer und
Ratten IgG-Isotypenkontrolle
f) Inkubation für 15 Minuten bei 4°C
g) Zugabe von 50 µl doppelt konzentrierten permeabilization buffer und
Foxp3-Antikörper, Einstellung auf ein Färbevolumen von 100 µl
h) Inkubation für 30 Minuten bei 4°C im Dunklen
i) Zugabe von 100 µl einfach konzentrierten permeabilization buffer
j) Zentrifugation für 4 Minuten bei 4°C und 337 x g
k) Zugabe von 100 µl einfach konzentrierten permeabilization buffer
l) Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunklen
m) Zentrifugation für 4 Minuten bei 4°C und 337 x g
n) Aufnahme des Zellpellets in 600 µl PBS/BSA
o) Lagerung bis zur Messung bei 4°C im Dunklen
Material und Methoden
Tabelle 4-11:
64
Zusammenfassung der Antikörper für die
Durchflusszytometrie
Spezifität
Konjugat
Klon
Isotyp
Verdünnung:
CD 3ε
PE-Cy7
145-2C11
ArmHam IgG
1:200
CD 4
Pacific Blue*
HV 450#
GK1.5*
RM4-5#
Rat IgG2b,κ*
Rat IgG2a,κ#
1:2000
CD 8α
HV 500*
APC#
53-6.7
Rat IgG2a,κ
1:200
CD 19
PE-eFluor 610*
FITC#
1D3*
6D5#
Rat IgG2a,κ
1:800
CD 44
APC*
PerCp-Cy 5.5#
IM7*
RM4-5#
Rat IgG2b,κ*
Rat IgG2a,κ#
1:800
CD 69
FITC*
PE-Cy 7#
H1.2F3
ArmHam IgG
1:500
Foxp3
PE
FJK-16S
Rat IgG2a,κ
1:200
2.4G2
Rat IgG2b,κ
1:100
CD 16/
CD 32
*
Tabelle 4-11: Die mit einem gekennzeichneten Antikörper wurden für den ersten Versuchsteil ohne
TMEV-Infektion verwendet. Antikörper, die mit einer # gekennzeichnet sind fanden Anwendung im
zweiten und dritten Versuchsteil mit zusätzlicher TMEV-Infektion. Bei PE-Cy7, PE-eFluor 610 und
PerCp-Cy 5.5 handelt es sich jeweils um Tandemkonjugate.
ArmHam = Armenian Hamster, IgG = Immunglobulin G, TMEV = Theiler´sches murines
Enzephalomyelitisvirus, Foxp3 = Forkhead-Box-Protein P3, PE = Phycoerythrin, Cy = Cyanin, APC =
Allophycocyanin, FITC = Fluorescein-Isothiocyanat, APC = Allophycocyanin, PerCp = Peridinin
Chlorophyll Protein.
4.10
Statistik
Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit der Statistical analysis
software SAS 9.3 und dem Enterprise Guide 5.1 für Windows in Zusammenarbeit mit
dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Stiftung
Material und Methoden
65
Tierärztliche Hochschule Hannover. Die erhobenen Daten der drei Gruppen „IL10R↓/TMEV“, „Isotyp/TMEV“ und „IL-10R↓/Mock“ aus dem zweiten (akute Phase der
TMEV-Infektion) und dritten (chronische Phase der TMEV-Infektion) Versuchsteil
wurden mittels multipler Kruskal-Wallis-Tests untersucht. Wenn sich ein pWert < 0,05 ergab, wurde ein paarweiser Vergleich der Gruppen mittels MannWhitney U-test angeschlossen. Für den Vergleich von Parametern, die lediglich in
zwei der drei Gruppen erhoben wurden und zum Vergleich der Daten aus dem ersten
Versuchsteil (keine TMEV-Infektion, „IL-10R↓“ und „isotype“) wurden multiple MannWhitney U-tests durchgeführt. In allen Tests wurden p-Werte < 0,05 als statistisch
signifikant erachtet und in den jeweiligen graphischen Darstellungen mit einem
Sternchen (*) gekennzeichnet.
Der geometrische Mittelwert der Fluoreszenz-Intensität (geometric mean of
fluorescence intensity, gMFI) für CD69 und CD44 auf CD4+- und CD8+-T-Zellen
wurde mittels der FloJo Software 9.6.4 ermittelt.
Die graphische Darstellung der Daten erfolgte überwiegend durch box-and-whiskerplots, die mittels der GraphPad Prism software Version 6.0 erstellt wurden. Die boxand-whisker-plots zeigen jeweils den Median sowie die Minimal- und Maximalwerte
und das obere und untere Quartil. Lediglich die Darstellung der erreichten
Punktzahlen (scores) aus der klinischen Untersuchung erfolgte der Übersicht halber
in Form von Liniendiagrammen, die jeweils den Mittelwert der erreichten Punktzahl
pro Gruppe am jeweiligen Versuchstag zeigen.
IL-10 in TME
5
66
Viral infection of the central nervous system
exacerbates interleukin-10 receptor
deficiency-mediated colitis in SJL mice
Ann-Kathrin Uhde 1, Vanessa Herder 1,2, Muhammad Akram Khan 1,2,
Malgorzata Ciurkiewicz 1,2, Dirk Schaudien 3, René Teich 4, Stefan Floess 4,
Wolfgang Baumgärtner 1,2, Jochen Huehn 4 and Andreas Beineke 1,2,5
1
Department of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover,
Germany
2
Center for Systems Neuroscience, Hannover, Germany
3
Fraunhofer - Institute for Toxikology and Experimental Medicine ITEM, Hannover,
Germany
4
Experimental Immunology, Helmholtz Centre for Infection Research, Braunschweig,
Germany
5
Corresponding author:
Prof. Dr. Andreas Beineke
Department of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover
Buenteweg 17
30559 Hannover
Germany
Phone number: 00495119538640
Fax number:
00495119538675
Email address:
[email protected]
Submitted 2015
IL-10 in TME
67
5.1
Nonstandard abbreviations
Ab
CNS
dpi
EAE
gMFI
H&E
IHC
LCMV
MS
MBP
np-NF
PVI
qPCR
TME
TMEV
Treg
WNV
antibody
central nervous system
days post infection
experimental autoimmune encephalomyelitis
geometric mean of fluorescence intensity
hematoxylin and eosin
immunohistochemistry
lymphocytic choriomeningitis virus
multiple sclerosis
myelin basic protein
non-phosphorylated neurofilament protein
perivascular infiltrates
real-time quantitative PCR
Theiler’s murine encephalomyelitis
Theiler´s murine encephalomyelitis virus
regulatory T cells
West Nile Virus
IL-10 in TME
5.2
68
Abstract
Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV)-infection is a widely used animal
model to study demyelinating disorders, including multiple sclerosis (MS). The
immunosuppressive cytokine IL-10 counteracts hyperactive immune responses and
critically controls immune homeostasis in infectious and autoimmune disorders. In
order to investigate the effect of signaling via IL-10R in infectious neurological
diseases, TMEV-infected SJL mice were treated with IL-10R blocking antibody (Ab).
Results demonstrate that (i) Ab-mediated IL-10 neutralization leads to progressive
colitis with reduction of Foxp3+ regulatory T cells (Treg) and increased numbers of
CD8+CD44+ memory T cells as well as activated CD4+CD69+ and CD8+CD69+ T cells
in uninfected mice. (ii) Concurrent acute TMEV-infection worsened enteric diseasemediated by IL-10R neutralization. Virus-triggered effects were associated with an
enhanced activation of CD4+ Th cell and CD8+ CTL population and augmented
cytokine expression. By contrast, (iii) IL-10R neutralization during chronic TMEVinfection was not associated with enhanced peripheral immunopathology but an
increased CD3+ T cell influx in the spinal cord. In conclusion, IL-10R neutralization
causes a breakdown of peripheral immune tolerance in genetically predisposed mice,
which leads to immune-mediated colitis, resembling inflammatory bowel disease
(IBD). Hyperactive immune state following IL-10R blockade is enhanced by central
nervous system (CNS)-restricted viral infection in a disease phase-dependent
manner.
IL-10 in TME
5.3
69
Introduction
Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV)-infection is a widely used animal
model to study demyelinating disorders, including human multiple sclerosis (MS).
Following intracerebral infection, genetically susceptible mouse strains, such as SJL
mice develop viral persistence with delayed-type hypersensitivity and myelin-specific
autoimmunity with spinal cord myelin loss, resembling chronic progressive MS
lesions (Chastain and Miller, 2012; Hou et al., 2009; Lipton, 1975; McMahon et al.,
2005; Tsunoda, 2008; Tsunoda and Fujinami, 1996). In contrast, resistant C57BL/6
mice eliminate the virus from the central nervous system (CNS) by specific cellular
immunity, including effective CD8+ CTL responses during the acute infection phase
(Monteyne et al., 1997).
IL-10 is an anti-inflammatory cytokine secreted by a variety of cell types. The main
functions of IL-10 include down-regulation of pro-inflammatory cytokine expression,
reduction of antigen presentation and reduced T cell activation (Creery et al., 1996;
de Waal Malefyt et al., 1991; Del Prete et al., 1993; Fiorentino et al., 1991; Groux et
al., 1996; Moore et al., 2001; Sabat et al., 2010). Ligation of the IL-10R leads to
phosphorylation and translocation of STAT3 molecules, promoting the transcription of
suppressor of cytokine signaling 3 leading to profound immune inhibitory effects (Ito
et al., 1999; Yoon et al., 2006). Thus, IL-10 counteracts hyperactive immune
responses and critically controls immune homeostasis (Kaser et al., 2010; Shouval et
IL-10 in TME
70
al., 2014). In autoimmune CNS disorders, such as experimental autoimmune
encephalomyelitis (EAE), IL-10 exerts protective effects by reducing T cell-mediated
tissue damage (Zhang et al., 2004). The critical role of IL-10 in immune-mediated
disorders is also demonstrated in human inflammatory bowel disease (IBD), a
chronic, relapsing, idiopathic inflammation of the intestinal tract. Here, IL-10 signaling
defects cause a particularly early onset of IBD and loss-of-function mutations
affecting IL-10R contribute to the development of very early-onset-IBD, a serious
enteric disease in children (Begue et al., 2011; Glocker et al., 2009; Marlow et al.,
2013; Moran et al., 2013; Shim and Seo, 2014; Uhlig et al., 2014). Moreover, genetic
deficiency of either IL-10 or IL-10R in transgenic mice leads to breakdown of immune
tolerance and immune mediated colitis, representing a well-established murine model
for IBD (Kuhn et al., 1993; Rakoff-Nahoum et al., 2006; Spencer et al., 1998).
IL-10 also influences the disease outcome in several persistent viral infections (Bai et
al., 2009; Brooks et al., 2006; Ejrnaes et al., 2006; Lin et al., 1998; Richter et al.,
2013). For instance, the cytokine contributes to T cell exhaustion and persistence of
lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV)-infection in C57BL/6 mice, which can be
circumvented by treatment with IL-10R blocking Ab (Brooks et al., 2006; Ejrnaes et
al., 2006). Similarly, genetic and Ab-mediated blockade of IL-10 signaling decreases
mortality rate and brain virus load in murine West Nile Virus (WNV)-infection (Bai et
al., 2009). By contrast, IL-10 knockout mice infected with a neurotropic strain of
mouse hepatitis virus exhibited overwhelming morbidity and increased mortality
without affecting virus clearance (Lin et al., 1998). In addition, IL-10 produced by
CD8+ regulatory T cells (Treg) alleviates acute encephalitis in mouse hepatitis virus-
IL-10 in TME
71
infected mice, suggestive of IL-10-dependent mechanisms to reduce CNS
immunopathology (Trandem et al., 2011). Thus, in contrast to primary beneficial
effects of IL-10 in autoimmune disorders, an ambivalent function of IL-10 has to be
considered in infectious CNS diseases, contributing to insufficient protective (e.g.
antiviral) immunity on the one hand, but limiting immunopathology on the other (Belz,
2009). Referring to this, in Theiler’s murine encephalomyelitis (TME) an enhanced
expression of IL-10 has been measured in the brain of SJL mice, however the
functional relevance of inhibitory cytokines and effects of pharmacological modulation
of the IL-10 pathway remains largely undetermined in this MS model (Herder et al.,
2012a).
The aim of the present study was to get insights into IL-10-mediated immune
regulation in mouse strains susceptible to develop a variety of immune-mediated
disorders, including TMEV-induced demyelination (Charles et al., 1999; De Souza et
al., 1974; James and Harley, 1998; Lindsey, 1996; Lipton and Canto, 1976;
Peltoniemi et al., 2002; Rose et al., 1973). Results illustrate the ability of Abmediated IL-10R neutralization to cause an immune enhancement and progressive
colitis in SJL mice, which are aggravated by concurrent TMEV-infection in a disease
phase-dependent manner.
IL-10 in TME
5.4
72
Results
Interleukin-10 receptor blockade causes clinical deterioration without influencing
motor coordination in Theiler’s murine encephalomyelitis virus infected SJL mice
Intracerebral TMEV-infection induces progressive ataxia and motor coordination
deficits determined by RotaRod® performance test starting at 42 days post infection
(dpi, figure 5-1). IL-10R Ab treatment (groups “IL-10R↓early/TMEV” and “IL10R↓early/mock”) during the early infection phase (experiment I) caused increased
clinical scores at 22 dpi compared to animals, that received only isotype control Ab
(group “isotypeearly/TMEV”; figure 5-2). Affected animals displayed reduced activity,
hunched backs and ruffled hair. Strikingly, the clinical score at 22 dpi was
significantly increased in TMEV-infected mice (group “IL-10R↓early/TMEV”) compared
to mock-infected animals (group “IL-10R↓early/mock”) following anti-IL-10R Ab
treatment during acute TME (experiment I), suggestive of a triggering or additive
effect of acute virus infection upon IL-10R deficiency mediated systemic signs (figure
5-2). At 42 dpi increased clinical scores were observed in IL-10R-blocked infected
mice (group “IL-10R↓early/TMEV”) and infected mice that received isotype control Ab
(group “isotypeearly/TMEV”), showing that systemic clinical signs are primarily a
consequence of virus-infection at later time points. Similarly, during the late TME
phase (experiment II) significantly increased clinical scores were observed in infected
mice at 42 and 49 dpi, which were similar in animals with (group “10R↓late/TMEV”)
and without concurrent Ab treatment (group “isotypelate/TMEV”, figure 5-2).
IL-10 in TME
73
In summary, results show that IL-10R neutralization causes systemic clinical signs in
SJL mice which are temporary (22 dpi) enhanced by acute TMEV infection.
Conversely, antibody mediated IL-10R blockade is insufficient to alter neurological
deficits (motor coordination) associated with TMEV-induced demyelinating disease.
Figure 5-1: Motor coordination in Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infected SJL mice.
RotaRod® performance test revealed motor coordination deficits starting at 42 dpi. Box and whisker
plots display median, minimum and maximum values as well as upper and lower quartiles, n = 5 at all
investigated time points, Wilcoxon rank-sum tests, * = p < 0.05.
IL-10 in TME
74
Figure 5-2: Clinical effects of Theiler`s murine encephalomyelitis virus-infection in SJL mice
following IL-10R blockade.
(A) TMEV-infection causes worsening of systemic clinical signs (increased clinical scores) at 22 dpi in
SJL mice with early anti-IL-10R Ab treatment (experiment I) compared to non-infected mice following
anti-IL-10R Ab treatment (*) and TMEV-infected mice without anti-IL-10R Ab treatment (*), suggestive
of a triggering effect of virus infection upon IL-10R deficiency mediated systemic signs. (B) By
contrast, Ab treatment during the late infection phase (experiment II) leads to similar clinical scores
between TMEV-infected mice with and without IL-10R blockade. n = 5 in all three groups and at all
investigated time points, Wilcoxon rank-sum tests, arrows = administration of IL-10R Ab or isotype
control, respectively. *significant differences (p < 0.05) between TMEV-infected mice with and without
IL-10R blockade. *significant differences (p < 0.05) between IL-10R blocked mice with and without
TMEV-infection. *significant differences (p < 0.05) between TMEV-infected mice and IL-10R blocked
mice.
Interleukin-10 receptor blockade leads to an enhanced recruitment of T cells to the
spinal cord during the demyelinating phase of Theiler’s murine encephalomyelitis but
does not influence the virus load
In order to determine the effect of IL-10R blockade upon CNS inflammation, spinal
cord sections were evaluated by histology. TMEV-infection induces progressive
leukomyelitis (figure 5-3) with infiltration of CD3+ T cells, CD45R/B220+ B cells,
Foxp3+
Treg,
CD107b+
microglia/macrophages
and
arginase-1+
M2-type
microglia/macrophages starting a 22 dpi (supplemental figure 5-10). Increased
numbers of non-phosphorylated neurofilament (np-NF)+ axons in the white matter,
characteristic of axonal damage (axonopathy), were detected at 49 dpi in both
IL-10 in TME
75
groups (supplemental figure 5-10). Demyelination defined by loss of myelin basic
protein (MBP, supplemental figure 5-10) started at 42 dpi. However, no differences in
the severity of myelitis, axonopathy and demyelination were found between TMEVinfected
mice
with
(group
“IL-10R↓early/TMEV”)
and
without
(group
“isotypeearly/TMEV”) anti-IL-10R Ab treatment during the early infection phase
(experiment I). The lack of group differences was confirmed by real-time quantitative
PCR (qPCR) showing similar mRNA expression levels of Foxp3 and all selected
cytokines (IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ, TGF-β) within the spinal cord
of infected animals with and without Ab treatment at 14 and 22 dpi (supplemental
table 5-2). Results show that early systemic IL-10R blockade is unable to directly
influence CNS inflammation during the acute phase or to cause long-term effects
upon the chronic demyelinating phase of TME.
Figure 5-3: Neuropathological findings in Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infected
SJL mice.
H&E staining of spinal cord cross sections detected progressive leukomyelitis starting at 22 dpi
determined by histological scoring. Box and whisker plots display median, minimum and maximum
values as well as upper and lower quartiles, n = 5 at all investigated time points, Wilcoxon rank-sum
tests, * = p < 0.05.
IL-10 in TME
76
Since TME represents a biphasic disease with directly virus-induced tissue damage
during the acute stage and immunopathology due to virus persistence during the
chronic stage, additional TMEV-infected mice were treated with anti-IL-10R Ab at 35
and 42 dpi (experiment II). Although no differences were observed regarding the
severity of leukomyelitis determined by histology, and demyelination determined by
immunohistochemistry (IHC, MBP) and qPCR (MBP mRNA), IHC for CD3 revealed
significantly increased numbers of T cells within the spinal cord at 49 dpi (14 d after
onset of IL-10R neutralization) in infected mice (group “IL-10R↓late/TMEV”, figure 5-4).
Additionally, IL-6 mRNA transcription was significantly decreased in IL-10R blocked
mice (group “IL-10R↓late/TMEV”) compared to isotype-treated mice following TMEVinfection (group “isotypelate/TMEV”, figure 5-4). However, numbers of CD45R+ B cells,
Foxp3+
Treg,
arginase-1+
M2-type
macrophages/microglia,
CD107b+
macrophages/microglia and np-NF+ axons as well as mRNA expression of IL-1, IL-2,
IL-4, IL-5, IL-10, TNF, TGF-β, IFN-γ and Foxp3 remained unchanged between both
groups (supplemental table 5-2), indicating a rather mild effect of IL-10R
neutralization upon spinal cord inflammation and pathology.
IL-10 in TME
77
Figure 5-4: Effect of IL-10R blockade upon the spinal cord in Theiler’s murine
encephalomyelitis virus-infected SJL mice.
+
(A) TMEV infection leads to moderate infiltration of CD3 T cells in the spinal cord at 49 dpi. (B) Note
+
increased numbers of CD3 T cells following IL-10R Ab treatment during the late infection phase
(group “IL10R↓late/TMEV”) at 49 dpi, A,B: IHC, bar = 20 µm. (C) Statistical analyses revealed a
+
significant increase of CD3 T cells in IL-10R blocked and TMEV-infected mice at 49 dpi. (D)
Simultaneously IL-6 mRNA expression significantly decreased in TMEV-infected animals following IL10R blockade.
TMEV-infected mice without IL-10R Ab treatment (group “isotypelate/TMEV”),
TMEV-infected mice with IL-10R treatment (group “IL10R↓late/TMEV”). Box and whisker plots display
median, minimum and maximum values as well as upper and lower quartiles, n = 5 in both groups,
Wilcoxon rank-sum tests, * = p < 0.05.
To determine the impact of IL-10R blockade on antiviral immunity, the amount of
TMEV antigen and RNA in the spinal cord was measured by IHC and qPCR,
respectively. Again, no differences of virus load between group “IL-10R↓early/TMEV”
and group “isotypeearly/TMEV” were observed (experiment I, supplemental table 5-2).
IL-10 in TME
78
Similarly, IL-10R neutralization during the late TME phase (experiment II) did not
influence virus concentration in the spinal cord (supplemental table 5-3).
Conclusively, data indicate that systemic anti-IL-10R blockade is unable to alter
antiviral immunity during acute and chronic TME. However, although being
insufficient to influence the severity of neurological signs (motor coordination) and
demyelination, increased CD3+ T cell influx together with reduced IL-6 transcription in
the spinal cord during chronic TME clearly demonstrates a limited but general ability
of systemic IL-10R neutralization to alter the inflammatory environment within the
CNS.
Interleukin-10 receptor blockade leads to the development of severe immune
mediated colitis in SJL mice
To characterize the effect upon peripheral organs of IL-10R blockade in SJL mice
under non-infectious (steady-state) conditions, animals received anti-IL-10R Ab i.p.
weekly without additional TMEV-infection (group “IL-10R↓”). Treatment successfully
induced severe lymphohistiocytic to granulocytic colitis with loss of goblet cells, crypt
hyperplasia and crypt necrosis starting at 14 dpi (figure 5-5). Histological changes in
the intestine are similar to IBD lesions in IL-10 KO mouse models (Tamaki et al.,
2006). Significant differences were present among different time points, showing a
progressive disease course (figure 5-5). Interestingly, intestinal lesions were not only
restricted to the colon, since significant differences were observed between treated
animals (group “IL-10R↓”) and controls (group “isotype”) also in the caecum at 21 dpi
(supplemental table 5-4). No histological changes of the small intestine were found at
IL-10 in TME
79
any time point. As expected, animals that received IgG1 isotype Ab (group “isotype”)
did not develop typhlocolitis.
Intestinal inflammation was associated with significantly increased spleen weights of
IL-10R blocked mice (group “IL-10R↓”) compared to control animals (group “isotype”)
at 21 dpi (data not shown). By histology extramedullary hematopoiesis and lymphoid
hyperplasia were detected in spleens and mesenteric LN following IL-10R blockade.
Extramedullary hematopoiesis was also found in the liver of IL-10R-neutralized mice,
while other tissues (see materials and methods), including the CNS, remained
unaffected.
Results confirm the capability of IL-10R neutralization to breakdown gut immune
homeostasis and induce immune-mediated enteritis, primarily of the colon, in SJL
mice, resembling IBD.
Intestinal inflammation was associated with significantly increased spleen weights of
IL-10R blocked mice (group “IL-10R↓”) compared to control animals (group “isotype”)
at 21 dpi (data not shown). By histology extramedullary hematopoiesis and lymphoid
hyperplasia were detected in spleens and mesenteric LN following IL-10R blockade.
Extramedullary hematopoiesis was also found in the liver of IL-10R-neutralized mice,
while other tissues (see materials and methods), including the CNS, remained
unaffected.
Results confirm the capability of IL-10R neutralization to breakdown gut immune
homeostasis and induce immune-mediated enteritis, primarily of the colon, in SJL
mice, resembling IBD.
IL-10 in TME
80
IL-10 in TME
81
Figure 5-5: Enteric disease following IL-10R blockade in non-infected SJL mice.
(A) Unformed feces and mucosal edema in an animal 14 d after onset of Ab treatment. (B) Colon of a
control animal (group “isotype”) at d 21. (C) Colon of an animal receiving IL-10R Ab (group “IL-10R↓”)
at the same time point. Note infiltration of neutrophils (arrows) and loss of goblet cells (#). B, C: H&E
staining, bar = 20 µm. (D) IL-10R blockade causes progressive colitis. Box and whisker plot display
median, minimum and maximum values as well as upper and lower quartiles, n = 5 at all investigated
time points, Wilcoxon rank-sum tests, * = p < 0.05.
Interleukin-10 receptor blockade in SJL mice is accompanied by decreased levels of
CD4+ Foxp3+ regulatory T cells together with enhanced CD44 and CD69 expression
on T cells in the spleen
In order to determine effects upon peripheral immune responses accompanied with
IL-10R blockade, phenotypical changes in the spleen were analyzed by flow
cytometry. Splenocytes from SJL mice with IL-10R blockade (group “IL-10R↓”)
revealed significantly decreased percentages of CD4+Foxp3+ Treg compared to
control mice (group “isotype”) at 21 d after first Ab application (figure 5-6). Notable,
relative numbers of CD3+ T cells, CD4+ Th cells and CD8+ CTL remained unchanged,
indicative of specific downregulation of Treg in Ab treated animals. Simultaneously,
the geometric mean of fluorescence intensity (gMFI) for the activation marker CD69
was significantly higher in CD4+ and CD8+ T cell subsets in IL-10R blocked mice
(group “IL-10R↓”) compared to untreated mice (group “isotype”). Moreover, the gMFI
for CD44, indicative of memory T cell differentiation, was elevated in CD8+ CTL of IL10R-neutralized animals (group “IL-10R↓”) compared to control animals (group
“isotype”, figure 5-6).
The finding of diminished CD4+Foxp3+ Treg responses together with an enhanced
activation and differentiation of T cells within the spleen supports the assumption,
IL-10 in TME
82
that IL-10R blockade disturbs peripheral immune tolerance, fostering systemic
immunopathology.
Figure 5-6: Effects of IL-10R blockade upon the spleen in non-infected SJL mice.
(A) Histograms from splenocytes of control animals (group “isotype”) showed higher relative numbers
+
+
of CD4 Foxp3 Treg than those of animals receiving IL-10R Ab (group “IL-10R↓”, (B)). (C) Relative
+
+
decrease of splenic CD4 Foxp3 Treg in animals receiving IL-10R Ab at d 21 of the experiment.
+
+
Simultaneously, gMFI of CD69 gated on CD4 cells (D) and CD8 cells (E) were increased at d 21. (F)
+
Similarly, gMFI of CD44 gated on CD8 cells was enhanced at d 21.
“isotype”),
control animals (group
IL-10R blocked animals (group “IL-10R↓”). Box and whisker plot display median,
minimum and maximum values as well as upper and lower quartiles, n = 5 in both groups, Wilcoxon
rank-sum tests, * = p < 0.05.
IL-10 in TME
83
Immune-mediated colitis in interleukin-10 receptor blocked mice is aggravated by
concurrent Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infection
To test the hypothesis that CNS infection exhibit triggering effects upon systemic
immunopathology, IL-10R blocked SJL mice were additionally infected with TMEV.
IL-10R blockade leads to colitis at all investigated time points (14, 22, 49 dpi) in
infected and non-infected mice. Notably, simultaneous infection of mice treated
during the early TME phase (experiment I, group “IL-10R↓early/TMEV”) resulted in
transient worsening of colonic disease compared to mock-infected mice (group “IL10R↓early/mock”) at 14 dpi (figure 5-7). Histological scoring revealed more extensive
colitis with hyperplasia of crypt epithelium, increased crypt damage and multifocal
transmural inflammation. By contrast, IL-10R blockade at later time points (35 and 42
dpi, experiment II) did not induce group differences at 14 d after treatment onset (49
dpi). As expected, animals that received only isotype control Ab (groups “isotype”,
“isotypeearly/TMEV”, “isotypelate/TMEV”) did not develop any signs of colitis. TMEVspecific IHC was performed to exclude direct viral effects on the intestinal tract and
was negative for all animals (data not shown).
Results show that acute TMEV-induced neuroinflammation has the ability to
deteriorate immune-mediated colitis in IL-10R neutralized SJL mice, probably
attributed to peripheral immune enhancement.
IL-10 in TME
84
Figure 5-7: Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infection exacerbates enteric disease
following IL-10R blockade.
(A) Note thickening of colon mucosa with severe lymphohistiocytic to neutrophilic inflammation (arrow
heads), crypt abscesses (#), and loss of crypt epithelium (arrow). H&E staining, bar = 60 µm (B)
Significantly increased severity of colitis at 14 dpi in TMEV-infected mice with IL10R Ab treatment
(group “IL10R↓early/TMEV”) compared to Ab treated animals without infection (group
“IL10R↓early/mock”).
IL-10R Ab treated SJL mice without TMEV-infection (group “IL10R↓early/mock”)
IL-10R Ab treated SJL mice with TMEV-infection (group “IL10R↓early/TMEV”). Box and whisker plots
display median, minimum and maximum values as well as upper and lower quartiles, n = 5 in both
groups, Wilcoxon rank-sum tests, * = p < 0.05.
Theiler’s murine encephalomyelitis enhances peripheral cytokine expression and
phenotypical changes in interleukin-10 receptor blocked SJL mice
To further analyze the mechanisms involved in peripheral immune derailment
triggered by CNS-restricted infection, cytokine expression analyses of spleen tissue
have been performed. Early administration of IL-10R blocking Ab (experiment I) led to
an increased transcription of all investigated pro-inflammatory cytokines (IL-1α, IL-2,
IL-5, IL-6, TNF, IFN-γ) and - probably in a compensatory manner - also of antiinflammatory cytokines (IL-4, IL-10, TGF-β1) in TMEV-infected mice (group “IL10R↓early/TMEV”) compared to non-infected animals (group “IL-10R↓early/mock”) at 14
and 22 dpi (figure 5-8, supplemental table 5-5). Worth mentioning, highest cytokine
IL-10 in TME
85
transcription levels were measured in group “IL-10R↓early/TMEV” animals primarily at
14 dpi. At this, significantly higher levels of IFN-γ (p = 0.020) and statistical
tendencies of increased levels of IL-2 (p = 0.066) and TNF (p = 0.066) at 14 dpi
compared to 22 dpi were observed (data not shown). With the exception of IL-5, IL10R neutralization at later time points (35 and 42 dpi, experiment II) also significantly
increased the mRNA-expression of all investigated pro- and anti-inflammatory
cytokines at 49 dpi (figure 5-9, supplemental table 5-6) in infected mice.
Flow cytometry was performed to determine phenotypical changes associated with
IL-10R blockade-mediated peripheral cytokine enhancement. Results revealed an
increased percentage of CD19+ B cells (figure 5-8) and a decreased percentage of
CD4+ T cells (figure 5-8) within spleens at 14 dpi following Ab treatment during the
early TME phase (experiment I, group “IL-10R↓early/TMEV”). Additionally, relative
numbers of Foxp3+ Treg were upregulated in animals receiving IL-10R Ab and TMEV
(group “IL-10R↓early/TMEV”) compared to control animals (group “IL-10R↓early/mock”,
figure 5-8). CD69 and CD44 expression on both CD4+ Th cells and CD8+ CTL were
significantly enhanced in TMEV-infected animals (group “IL-10R↓early/TMEV”)
compared to non-infected animals following receptor blockade (group “IL10R↓early/mock”, figure 5-8).
IL-10 in TME
86
Figure 5-8: Effects of acute Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infection (experiment I)
upon cytokine expression and phenotypical changes in the spleen of IL-10R blocked SJL mice.
IL-10 in TME
87
(A-I) Significantly elevated mRNA levels of IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF, IFN-γ, TGF-β and IL-10 in
spleens of infected mice (group “IL-10R↓early/TMEV”) compared to non-infected mice following IL-10R
+
Ab treatment (group “IL10R↓early/mock”). (J) Flow cytometry revealed a relative increase of CD19 B
+
cells and a simultaneous decrease of CD4 T cells (K) in the spleen of infected mice following IL-10R
+
+
blockade at 14 dpi. (L) Additionally, the relative numbers of CD4 Foxp3 Treg in the spleen were
increased following TMEV-infection and IL-10R blockade. Moreover, gMFI of CD69 (M) and CD44 (N)
+
+
gated on CD4 cells and gMFI of CD69 (O) and CD44 (P) gated on CD8 cells were increased at 14
dpi in infected mice following IL-10R Ab treatment (group “IL-10R↓early/TMEV”).
IL-10R Ab treated
mice without TMEV-infection (group “IL10R↓early/mock”)
IL-10R Ab treated mice with additional
TMEV-infection (group “IL-10R↓early/TMEV”). Box and whisker plots display median, minimum and
maximum values as well as upper and lower quartiles, n = 5 in both groups and at all investigated time
points, Wilcoxon rank-sum tests, * = p < 0.05.
Indicative of disease phase-specific differences, IL-10R blockade during the late TME
phase (experiment II) led to an elevated percentage of CD8 + CTL (figure 5-9) but
induced no differences in the activation status (CD44,CD69) of CD4+ and CD8+ cells
in infected mice (group “IL-10R↓late/TMEV”) compared to non-infect mice (group “IL10R↓late/mock”, supplemental table 5-6).
IL-10 in TME
88
Figure 5-9: Effects of chronic Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infection (experiment II)
on cytokine expression and phenotypical changes in the spleen of IL-10R neutralized SJL
mice.
(A-H) Significantly elevated mRNA levels of IL-1α, IL-2, IL-4, IL-6, TNF, IFN-γ, TGF-β and IL-10 in
spleens of infected mice (group “IL-10R↓late/TMEV”) compared to non-infected mice following IL-10R
+
Ab treatment (group “IL-10R↓late/mock”). (I) Flow cytometry revealed a relative increase of CD8 CTL
in the spleens of TMEV-infected mice with IL-10R Ab treatment at 49 dpi. IL-10R Ab treated mice
without TMEV-infection (group “IL-10R↓late/mock”) IL-10R Ab treated mice with TMEV infection
(group “IL-10R↓late/TMEV”). Box and whisker plots display median, minimum and maximum values as
well as upper and lower quartiles, n = 5 in both groups, Wilcoxon rank-sum tests, * = p < 0.05.
IL-10 in TME
89
In summary, results confirm the ability of acute CNS infection to cause prominent
cytokine enhancement in IL-10R neutralized SJL mice, characteristic of a hyperactive
immune state, which worsened immune mediated colitis. The functional relevance is
further shown by associated CD4+ Th cell and CD8+ CTL activation (CD69
expression) together with an increased number of CD44 + memory T cells in acutely
infected mice with anti-IL-10R Ab treatment.
IL-10 in TME
5.5
90
Discussion
IL-10 exhibits profound suppressive properties and thus critically controls the
physiological balance of host immune responses (Hadis et al., 2011; Sabat et al.,
2010; Saraiva and O'Garra, 2010; Zigmond et al., 2014). Besides immune-mediated
colitis induced by dysregulated IL-10R signaling the study illustrates the complex
interplay between neuroinflammation and peripheral immune responses in infectious
disorders. The capability of CNS-restricted virus infection to aggravate systemic
immunopathology via a hyperactive immune state is shown, representing an as yet
undescribed phenomenon.
IL-10 is a pleiotropic cytokine which suppresses Th1 and Th17 responses and
reduces APC function, while enhancing Th2 responses, Treg expansion, B cell
maturation and Ab production (Mosser and Zhang, 2008). Genetic ablation of IL-10
or IL-10R leads to spontaneous colitis in mice, representing a reliable model for
human IBD (Glocker et al., 2011; Kuhn et al., 1993). Likewise, the present survey
shows, that IL-10R neutralization induces early onset and severe enteric disease in
SJL mice. Similar findings can be observed in very early-onset-IBD, a pediatric
disorder caused by genetic defects affecting the IL-10R (Begue et al., 2011; Glocker
et al., 2009; Moran et al., 2013; Uhlig et al., 2014). Genome-wide association studies
also revealed a central role of the IL-10 axis in adult IBD pathogenesis (Franke et al.,
2010). Furthermore, autoantibodies against IL-10 and IL-10R can be found in a
subset of human IBD patients, however, their pathogenic relevance remains to be
IL-10 in TME
91
determined (Ebert et al., 2009; Frede et al., 2014). Disturbed mucosal homeostasis in
IL-10-deficient mouse models is accompanied by a loss of intestinal regulatory
myeloid cells (CX3CR1highCD11b+CD11c+) and Treg (CD4+Foxp3+) leading to
aberrant Th1/Th17-mediated responses towards commensal gut microbiota and
dietary antigen (Kayama and Takeda, 2012). Noteworthy, genetic IL-10R deficits lead
to a pro-inflammatory phenotype of regulatory CX3CR1high macrophages and
development of colitis in mice (Zigmond et al., 2014). In the present study also
reduced numbers of CD4+Foxp3+ Treg together with increased numbers of CTL in
the spleen indicates unbalanced immune responses, which may contribute to
progressive intestinal inflammation. Susceptibility to develop intestinal inflammation
in most models of experimental colitis differs among inbred mouse strains. In a
previously established inducible IBD model, C57BL/6 mice infected with the
pathobiont Helicobacter hepaticus, but not animals lacking these bacteria, respond to
Ab-mediated IL-10R neutralization by colitis development (Kullberg et al., 2006).
Using SJL mice, which are prone to develop Th1-driven disorders (Charles et al.,
1999; Peltoniemi et al., 2002), we were able to induce similar intestinal lesions
without an additional bacterial trigger. The remarkable response of SJL mice to IL-10
signaling defects is also exemplified by therapeutic effects of Ab-mediated IL-10 or
IL-10R blockade in experimental infection and lack of overt enteric disease in other
mouse strains, as shown in WNV-infected C57BL/6 mice and LCMV-infected BALB/c
mice (Bai et al., 2009; Brooks et al., 2006; Ejrnaes et al., 2006; Richter et al., 2013).
Most strikingly, acute TMEV-infection has the capacity to exacerbate enteric disease
in IL-10R blocked mice. Here, the lack of a detectable influence of chronic TME upon
IL-10 in TME
92
enteritis severity indicates a disease phase-specific effect. Present data show that
CNS infection causes a systemic hyperactive immune state following IL-10R
blockade with up-regulation of pro- and anti-inflammatory cytokines. Although proof
of causality is often missing, infections are supposed to trigger autoimmune
disorders, such as MS, type 1 diabetes, Guillian-Barré syndrome and systemic lupus
erythematosus, by molecular mimicry, epitope spreading, release of cryptic antigens
or bystander activation, respectively (Doria et al., 2008; Ercolini and Miller, 2009).
Similarly, participation of viruses (e.g. measles virus, mumps virus, cytomegalovirus,
Epstein-Barr virus) in the initiation or exacerbation of IBD in human patients is
currently under discussion (Bosca-Watts et al., 2015; Norman et al., 2015). Our data
provide evidence that extraintestinal infection can enhance enteric disease. Recently,
similar effects have been described in experimental respiratory influenza virus
infection, where intestinal injury is caused by lung-derived virus-specific CD4+
effector T cells, which destroy intestinal homeostasis and promote Th17 cell
polarization (Wang et al., 2014). Moreover, during the onset of EAE intestinal barrier
dysfunction together with disturbed peripheral immune homeostasis probably caused
by circulating encephalitogenic T cells have been described (Nouri et al., 2014). In
addition, stress increases intestinal permeability and exacerbates enteritis in rats,
suggestive of brain-gut interaction (Meddings and Swain, 2000; Stasi and Orlandelli,
2008). Although the basic mechanisms remain undetermined, also a correlation
between psychological disorders and the prevalence and course of Crohn’s disease
has been reported (Garcia-Vega and Fernandez-Rodriguez, 2004; Li et al., 2004;
Mardini et al., 2004). Conversely, intestinal barrier damage and gut microbiota are
supposed to trigger systemic and CNS autoimmunity (Berer et al., 2011; Embry,
IL-10 in TME
93
2004; Ochoa-Reparaz et al., 2009), which might have contributed to the observed
mild increased CD3+ T cell infiltration in the spinal cord during chronic TME (see
below). Increased intestinal permeability often referred to as “leaky gut” syndrome
can be observed also in MS and systemic autoimmune diseases, such as type I
diabetes (Visser et al., 2009). Interestingly, concurrent IBD has been observed in a
subset of MS patients (Alkhawajah et al., 2013; Sadovnick et al., 1989). The cause
for this co-morbidity is still unclear, but genetic factors that predispose individuals to
develop immune mediated disorders are assumed (Yacyshyn et al., 1996).
During the acute TME phase, hyperactive immune state with enhanced cytokine
expression following IL-10R neutralization is accompanied by elevation of
CD4+CD69+ and CD8+CD69+ activated T cells and an increase of CD8 +CD44+ and
CD4+CD44+ memory T cells (14 dpi). Enhanced CD8-mediated cytotoxicity can
contribute to intestinal inflammation in murine colitis models (Das et al., 2006; Lutz et
al., 2015). Moreover, comparable with the present findings, an increased activation
and memory differentiation of circulating CD8+ CTL is associated with an aggressive
disease course including frequent clinical relapses in human IBD patients (Lee et al.,
2011) and intestinal tract damage is associated with systemic CD4+ and CD8+ T cell
activation (Funderburg et al., 2013). Using DNA microarray analyses we previously
observed an activation of lymphoid organs (cervical LN, spleen) of SJL mice during
early TME (14 dpi), followed by transcriptional silencing during the chronic
demyelinating phase (Navarrete-Talloni et al., 2010). Thus, the transient nature of
peripheral immune activation in the TME model might explain the observed
temporary worsening of IL-10R blockade-mediated enteritis during the acute infection
IL-10 in TME
94
and disease phase-dependent alterations of peripheral immune responses,
respectively.
A mild increased CD3+ T cells influx was observed in the infected spinal cord
following IL-10R blockade during the chronic TME phase. Similarly, enhanced TMEVspecific CD4+ and CD8+ T cell responses in the CNS are associated with decreased
IL-10 production in CD11b+Ly6c+ depleted mice (Bowen and Olson, 2009) and in MS
patients a leukocyte disability to produce IL-10 is supposed to foster CNS disease
progression (Niino et al., 2014). The inhibitory effect of IL-10 upon neuroinflammation
is also illustrated by IL-10 or IL-10R blockade in EAE (Lin et al., 2014; Podojil et al.,
2013). However, in contrast to the EAE model no overt changes upon spinal cord
pathology have been observed in TMEV-infected mice following Ab treatment in the
present experiments. In addition, CNS virus load remained unchanged, indicative of
an unaffected antiviral immunity. Possible explanations for the limited effect of antiIL-10R treatment in TME include (i) autonomous immune responses triggered by
virus persistence in the spinal cord, (ii) an inability of the anti-IL-10R Ab to penetrate
the blood spinal cord barrier and reach sufficient CNS levels, and/or (iii) a preferential
recruitment of inflammatory cells to the intestine with peripheral sequestration. At
this, inflammation restricted to the spinal cord with local antigen presentation and
plasma cell differentiation and intact blood spinal cord barrier has been shown in
TMEV-infected SJL mice (Hansmann et al., 2012; Pachner et al., 2011; Ulrich et al.,
2010). Similarly, closure of the blood brain barrier, isolating the CNS from peripheral
lymphoid organs, is supposed to play a pivotal role for therapy failure in chronic MS
patients (Lassmann, 2009; Lassmann et al., 2007; Massacesi, 2002; Meinl et al.,
IL-10 in TME
95
2008; Owens et al., 2009). In general, CNS uptake of therapeutic antibodies is limited
by an intact neurovascular endothelium (Yu et al., 2014). Thus, prominent blood
brain barrier damage and permeability present in experimental WNV- or LCMVinfection explains the restoration of antiviral immunity in the CNS and beneficial
effects of anti-IL-10/IL10-R treatment in these infection models in contrast to TME
(Bai et al., 2009; Matullo et al., 2010; Richter et al., 2013; Roe et al., 2012).
Detrimental effects of IL-10R blockade in TME might be circumvented by adequate
Ab delivery systems across the blood spinal cord barrier to guarantee sufficient CNS
Ab levels and to reduce systemic adverse effects (Löscher and Potschka, 2005; Pan
et al., 2011; Smith, 1993; Yu et al., 2014).
In conclusion, unlike other CNS infectious models pharmacological blockade of IL-10
signaling in TME causes severe systemic immunopathology in mouse strains with a
susceptible genetic background. Since IL-10 is currently discussed as target for novel
therapeutic approaches in chronic viral diseases, the identification of critical factors
that regulate IL-10 in different organ compartments is crucial for the understanding of
how IL-10 restores protective immunity, especially in patients with genetic
predisposition to develop immune mediates disorders (Iyer and Cheng, 2012).
IL-10 in TME
96
5.6
Materials and Methods
5.6.1
Experimental design
Five-week-old female specific-pathogen-free SJL/JCrHsd mice (Harlan Winkelmann,
Borchen, Germany) were inoculated into the right cerebral hemisphere with 1.63x10 6
PFU/mouse of the BeAn-strain of TMEV in 20 µl DMEM (PAA Laboratories, Cölbe,
Germany) with 2 % FCS and 50 µg/kg gentamicin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, Germany). Mock-infected animals received 20 µl of the vehicle only.
Inoculation was carried under general anesthesia with medetomidine (0.5 mg/kg, i.m.,
Domitor, Pfizer, Karlsruhe, Germany) and ketamine (100 mg/kg, i.p., Ketamine 10 %,
WDT eG, Garbsen, Germany). In order to examine the effect of IL-10R blockade
under acute infectious conditions (experiment I, supplemental figure 5-11), 250 µg rat
anti-mouse IL10R Ab (clone: 1B1.3A, BioXCell, West Lebanon, USA) or rat IgG1specific isotype controls (BioXCell, West Lebanon, USA), respectively, were
administered i.p. during the early TME phase at 0, 7 and 14 dpi. Accordingly, mice
were separated into three groups: group “IL-10R↓early/TMEV” animals received antiIL-10R Ab and were infected with TMEV, group “isotypeearly/TMEV” animals received
isotype control and were infected with TMEV, and group “IL-10R↓early/mock” animals
were treated with anti-IL-10R Ab without TMEV-infection (mock injection). To
examine the effect of IL-10R blockade during chronic TMEV-infection, additional SJL
IL-10 in TME
97
mice were TMEV- or mock-infected and treated with anti-IL-10R Ab or isotype
control, respectively, during the late TME phase at 35 and 42 dpi (experiment II,
supplemental figure 5-11). In analogy to experiment I, the following groups have
been
built:
group
“IL-10R↓late/TMEV”,
group
“isotypelate/TMEV”
and
“IL-
10R↓late/mock”. During all experiments, weekly clinical scoring and RotaRod ®
performance tests for the quantification of motor coordination deficits were performed
as described before (Herder et al., 2012b; Ulrich et al., 2006). Animals were
euthanized in groups of four to five mice at 7, 14, 22 and 42 dpi (experiment I) and 42
and 49 dpi (experiment II), respectively.
For investigation of IL-10R signaling effects under non-infectious conditions, noninfected SJL mice were treated with anti-IL-10R Ab (group “IL-10R↓”) or rat IgG1
isotype control (group “isotype”) on d 0, 7 and 14 and necropsied on d 7, 14 and 21,
respectively. Each examined group consisted of five animals.
At necropsy, spleen tissue from each animal was taken and processed for flow
cytometry. In addition, parts of spleen and spinal cord tissue (cervical, thoracic and
lumbar segments) were immediately snap frozen for molecular analyses. Remaining
spinal cord segments and spleen tissue as well as thymus, mesenteric LN, liver,
stomach, pancreas, trachea, esophagus, thyroid gland, heart, lung, kidney, adrenal
gland, ovaries, uterus, urinary bladder, tongue, salivary gland, haired skin, eyes,
skeletal muscle, femur and sternum, small intestine (two cross sections), cecum (one
cross section) and colon (five cross sections) were fixed in formalin for 24 h and
embedded in paraffin wax for histology. Bony tissue (femur, sternum) was decalcified
for 48h with 10 % disodium-ethylenediaminetetraacetate prior to embedding.
IL-10 in TME
98
The studies were conducted in accordance with German law for animal protection
and with the European Communities Council Directive for the protection of animals
used for experimental purposes. Approvement and authorization of the animal
experiment was given by the local authorities (Niedersächsisches Landesamt für
Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), Oldenburg, Germany,
permission number: 33.12-42502-04-13/1138).
5.6.2
Histology
Sections of all organs were stained with hematoxylin and eosin (H&E) and were
examined by routine light microscopy. In addition, inflammatory responses in the
small intestine, cecum and colon were scored by use of a four-part, semiquantitative
scoring system, modified from Tamaki et al. (2006) including the following
parameters: severity (0 = none, 1 = mild, 2 = moderate and 3 = severe infiltration)
and extent of inflammation (0 = none, 1 = inflammation restricted to mucosa, 2 =
inflammation of mucosa and submucosa, 3 = transmural inflammation affecting all
layers), percentage of area affected (0 = 0 %, 1 = 1-25 %, 2 = 26-50 %, 3 = 51-75 %
and 4 = 76-100 %) and extent of crypt damage (0 = none, 1 = ≤ basal ⅓ affected, 2 =
basal ⅔ affected, 3 = crypts lost, surface epithelium present, 4 = crypts and surface
epithelium lost). The scores of the four parameters were summed for each cross
section (score: 0-14) and a final score was calculated by averaging the segments.
Leukomyelitis was graded in cervical, thoracic and lumbar spinal cord cross sections
using a two-part, semiquantitative scoring system (leukomyelitis score) including
IL-10 in TME
99
perivascular infiltrates (PVI, 0 = no changes; 1 = scattered PVI, 2 = two to three
layers, 3 = more than three layers of PVI) and hypercellularity (1 = 1-25 cells, 2 = 2650 cells, 3 = > 50 cells per high power field) as previously described (Gerhauser et
al., 2007a; Gerhauser et al., 2007b; Herder et al., 2012b; Ulrich et al., 2006).
Arithmetic averages were calculated for each segment and each parameter and a
final score was determined by averaging scores of the three segments from each
animal and adding scores of PVI and hypercellularity.
5.6.3
Immunohistochemistry
IHC was performed using a polyclonal rabbit anti-CD3-specific Ab (DakoCytomation,
Hamburg, Germany) for the detection of T cells, a rat anti-CD45R/B220-specific mAb
(BD Biosciences, Heidelberg, Germany) for the detection of B cells, a polyclonal
rabbit anti-TMEV-specific Ab for detection of TMEV-antigen and a rat anti-Foxp3specific Mab (eBioscience, Frankfurt, Germany) for the detection of Treg (Gerhauser
et al., 2007a; Gerhauser et al., 2007b; Herder et al., 2012a; Herder et al., 2012b;
Kummerfeld et al., 2009; Navarrete-Talloni et al., 2010). Additionally, a rat antiCD107b-specific mAb (AbD Serotec, Oxford, UK) and a polyclonal goat antiarginase-1-specific Ab (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Germany) for the
detection of macrophages/microglia were used (Herder et al., 2012a; Herder et al.,
2012b; HERDER et al., 2015). Damaged axons were labeled with a goat anti-np-NFspecific mAb (Biolegend, London, UK) and the amount of MBP was determined by
use of a polyclonal rabbit anti-MBP-specific Ab (Chemicon International, Hofheim am
Taunus, Germany) (Gerhauser et al., 2007a; Gerhauser et al., 2007b; Herder et al.,
IL-10 in TME
100
2012b; Kreutzer et al., 2012; Seehusen and Baumgartner, 2010). All reactions were
conducted as previously described and summarized in Table 5-1.
For evaluation of CD3, CD45R, Foxp3, TMEV, CD107b and arginase-1 the absolute
number of immunoreactive cells was counted in all three spinal cord segments of
each animal. The MBP-negative white matter area was measured by manual
mapping at 100x magnification using the fluorescence microscope BZ-9000E
(Keyence, Mechelen, Belgium), the BZ-II analyzer software (BZ-H2AE, Keyence,
Mechelen, Belgium), and the area measurement function. For determination of npNF-positive axons the total numbers in the white matter of all three spinal cord
segments were enumerated. Additionally, TMEV-specific IHC was performed on all
sections of intestine from infected animals to exclude enteric infection.
IL-10 in TME
101
Table 5-1
Summary of antibodies used for immunohistochemistry
Antibody
CD3
Primary antibody
DakoCytomation
polyclonal Ab
rabbit
CD45R/B220 BD Biosciences
553085
mAb
clone RA3-6B2
rat
Foxp3
eBioscience
14-5773
mAb
clone FJK-16s
rat
CD107b
AbD Serotec
MCA2293B
mAb
clone M3/84
rat
Arginase-1
Santa Cruz
sc-18351
Biotechnology
polyclonal Ab
goat
Np-NF
BioLegend
801703
mAb
clone SMI 311
goat
MBP
Merck Millipore
AB980
polyclonal Ab
rabbit
TMEV
Kummerfeld et al.
2009
polyclonal Ab
rabbit
A0452
5.6.4
Pre-treatment
and dilution
Citrate
buffer/microwave
1:1000
Citrate
buffer/microwave
1:1000
Citrate
buffer/microwave
1:50
Citrate
buffer/microwave
1:200
Citrate
buffer/microwave
1:50
Specifity
Citrate
buffer/microwave
1:8000
No pretreatment
1:2000
Axonal damage
No pretreatment
1:2000
TMEV BeAn
T cells
B cells
Treg
Activated
macrophages/microglia
Activated M2-type
macrophages/microglia
MBP
RNA isolation and reverse transcription
RNA was isolated from 10 to 40 mg of snap frozen spinal cord and spleen from
TMEV- and mock-infected animals euthanized at 14, 22 and 49 dpi using an Omni´s
PCR Tissue Homogenizing Kit (Süd-Laborbedarf GmbH, Gauting, Germany),
IL-10 in TME
102
QIAzolTM Lysis Reagent (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) and a RNeasy® Mini Kit
(Qiagen GmbH, Hilden, Germany) according to the manufacturer´s protocols.
Subsequently, equal amounts of RNA were transcribed into cDNA with the
OmniscriptTM RT Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), RNAseOutTM Recombinant
Ribonuclease Inhibitor (InvitrogenTM GmbH, Karlsruhe, Germany) and Random
Primers (Promega GmbH, Mannheim, Germany) as described previously (Pringproa
et al., 2008; Ulrich et al., 2006).
5.6.5
Reverse
reaction
transcription-quantitative
polymerase
chain
QPCR was performed for TMEV, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, Foxp3, TNF, IFNγ, TGF-β1, MBP and three reference genes (GAPDH, β-actin, hypoxanthin-guaninphosphoribosyltransferase) in spinal cord and spleen tissue by use of the Mx3005P
Multiplex Quantitative PCR System and Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green QPCR
Master Mix (Agilent Technologies Deutschland, Böblingen, Germany). Primer
sequences for IL-5 and IL-6 were determined using the Primer3 input software and
were as follows: IL-5 sense: ATG GAG ATT CCC ATG AGC AC; IL-5 antisense: CCC
ACG GAC AGT TTG ATT CT; IL-6 sense: GTT CTC TGG GAA ATC GTG GA; IL-6
antisense: CCA GAG GAA ATT TTC AAT AGG C. All other sequences were taken
from the literature (Hansenne et al., 2009; Herder et al., 2012a; Herder et al., 2012b;
Ulrich et al., 2006; Ulrich et al., 2005). For quantification ten-fold serial dilution
standards ranging from 108 to 102 copies/µl were prepared. The normalization factor
IL-10 in TME
103
for correction of experimental variations was calculated from the three housekeeping
genes with geNorm software version 3.4 (Vandesompele et al., 2002).
5.6.6
Flow cytometry
For the analysis of splenocytes, samples from all non-infected animals and TMEVand mock-infected mice euthanized at 14 and 49 dpi were dissolved to single cell
suspension in PBS/BSA buffer ([0.2 %] Gibco, Darmstadt, Germany). Erythrocytes
were lysed by addition of Ammonium-Chloride-Potassium Lysing Buffer (Gibco,
Darmstadt, Germany) and the cell number was determined using trypan blue solution
(Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) and a Neubauer Improved
chamber. To avoid unspecific binding to FcR, preincubation with anti-CD16/CD32 Ab
(clone 2.4G2; BioXCell, West Libanon, USA) was performed, and dead cells were
stained using LIVE/DEAD® fixable dead cell stain kit (InvitrogenTM GmbH, Karlsruhe,
Germany) as described by the manufacturer. Subsequently, anti-CD3ε (PE-Cy7;
clone 145-2C11; eBioscience, San Diego, USA), anti-CD4 (PacificBlue; clone GK1.5;
BioLegend, London, UK), anti-CD8α (HV500; clone 53-6.7; BD Biosciences,
Heidelberg, Germany), anti-CD19 (PE-eFluor610; clone 1D3; eBioscience, San
Diego, USA), anti-CD69 (FITC; clone H1.2F3; BioLegend, London, UK) and antiCD44 Ab (APC; clone IM7; BioLegend, London, UK) were added for fluorochromeconjugated surface marker staining. For intracellular staining of Foxp3 the
Foxp3 Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, San Diego, USA) was
used according to the manufacturer´s protocol. Samples were acquired with an LSRII
IL-10 in TME
104
SORP cytometer (BD Biosciences, Heidelberg, Germany) and analyzed using
FlowJo software version 9.6.4 (Tree Star, Ashland, USA).
5.6.7
Statistical analysis
All statistical analyses were conducted using Statistical analysis software SAS 9.3
and the Enterprise Guide 5.1 for Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Data
generated from several mice from each group were analyzed using Kruskal-Wallis
tests when “IL-10R↓/TMEV”, “isotypeearly/TMEV” and “IL-10R↓early/mock” were
compared. Relation of two groups was performed by use of multiple Wilcoxon ranksum tests. Results were considered statistically significant at p-value < 0.05. The
gMFI for CD69 and CD44 in CD4+ and CD8+ T cells was determined using the
FlowJo software version 9.6.4 (Tree Star, Ashland, USA). Box and whisker plots
were generated with GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, USA) and
display median, minimum and maximum values as well as upper and lower quartiles.
IL-10 in TME
5.7
105
Acknowledgements
The authors would like to thank Bettina Buck, Petra Grünig, Kerstin Schöne, Caroline
Schütz, Danuta Waschke, Kirsten Löhr and Beate Pietzsch for the excellent technical
support. The BeAn-strain of TMEV was a generous gift of Prof. Dr. H. L. Lipton
(Department of Microbiology-Immunology, University of Illinois, Chicago, IL, USA).
This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, BE
4200/1-2; HU 1300/5-2).
IL-10 in TME
5.8
106
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IL-10 in TME
115
5.9 Supplemental material
Supplemental figure 5-10: Leukomyelitis in Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infected
SJL mice.
(A) Lymphoplasmacytic leukomyelitis in a TMEV-infected mouse at 49 dpi. Note perivascular and
meningeal (arrow) infiltration of inflammatory cells in the white matter (*) and rarely also in the grey
+
matter (#). H&E staining, bar = 60 µm. (B) Arginase-1 M2-type microglia/macrophages with gitter cell
morphology at 49 dpi, indicative of myelinophagia. IHC, bar = 20 µm. (C) Bilateral loss of MBP
(demyelination) in ventral funiculi (#) of cervical spinal cord segment at 49 dpi. IHC, bar = 200 µm. (D)
Axonal damage characterized by axonal swelling (spheroid formation) with accumulation of np-NF
(arrow) in the spinal cord at 49 dpi. IHC, bar = 20 µm.
IL-10 in TME
116
Supplemental figure 5-11: Study design.
(A) Experiment I: Animals infected with TMEV at d 0 of the experiment received IL-10R Ab or isotype
control respectively at d 0, 7, 14 and 21 of the experiment. Necropsy (†) was performed at d 7, 14, 22
and 42 of the experiment. (B) Experiment II: Animals infected with TMEV at d 0 of the experiment
received IL-10R Ab or isotype control respectively at d 35 and 42 of the experiment. Necropsy (†) was
performed at d 42 and 49 of the experiment. (C) Overview on performed experiments: experiment I
included TMEV-infected animals receiving isotype control (isotypeearly/TMEV) or IL-10R Ab (IL10R↓early/TMEV) and mock-infected animals receiving IL-10R Ab (IL-10R↓early/mock) in the early phase
of the TME (0-21 dpi). Experiment II included TMEV-infected animals receiving isotype control
(isotypelate/TMEV) or IL-10R Ab (IL-10R↓late/TMEV) and mock-infected animals receiving IL-10R Ab
(IL-10R↓late/mock) in the chronic phase of TME (35-42 dpi). n = 5 in both groups and at all investigated
time points.
IL-10 in TME
117
Table 5-2
Summary of statistical analyses (p-values): effects of IL-10R blockade during acute Theiler’s murine encephalomyelitis
(experiment I)
Investigation
Differences between TMEV-infected SJL mice with (“IL-10R↓early/TMEV”) and without
(“isotypeearly/TMEV”) IL-10R blockade (p-values)
RotaRod®
7 dpi
14 dpi
22 dpi
42 dpi
0.187
0.248
0.296
0.525
0.705
clinical score
1.000
1.000
↑0.007*
spleen weight
0.402
0.540
↑0.012*
↑0.006*
0.831
Histology (H&E)
leukomyelitis
1.000
0.662
0.273
semiquantitative
inflammation small intestine
1.000
1.000
1.000
1.000
scoring
inflammation cecum
0.424
0.228
↑0.040*
↑0.001*
inflammation colon
0.239
↑0.031*
↑0.029*
↑0.001*
Immunohistochemistry CD3
0.210
0.178
1.000
0.903
Spinal cord
CD45R
0.199
0.176
0.209
0.623
Foxp3
ND
0.176
0.346
ND
CD107b
ND
1.000
0.833
ND
ND
1.000
0.737
ND
1.000
0.338
1.000
0.710
arginase-1
MBP
np-NF
ND
ND
ND
ND
TMEV
1.000
0.194
0.728
0.461
RT-PCR
IL-1α
ND
↑0.020*
↑0.022*
ND
spleen
IL-2
ND
0.270
0.676
ND
mRNA
IL-4
ND
0.178
0.095
ND
IL-5
ND
↑0.018*
0.139
ND
IL-6
ND
↑0.020*
0.095
ND
TNF
ND
0.111
0.210
ND
TGF-β
ND
↑0.020*
↑0.037*
ND
IFN-γ
ND
0.066
0.835
ND
Foxp3
ND
0.066
1.000
ND
RT-PCR
IL-1α
ND
0.391
0.403
ND
spinal cord
IL-2
ND
0.898
0.389
ND
mRNA
IL-4
ND
1.000
0.656
ND
IL-5
ND
0.540
0.666
ND
IL-6
ND
0.540
0.403
ND
TNF
ND
0.540
0.676
ND
TGF-β
ND
0.540
0.296
ND
IFN-γ
ND
0.806
1.000
ND
Foxp3
ND
0.713
0.531
ND
TMEV
0.209
0.270
1.000
0.525
CD4+ [%]
0.116
0.713
0.095
0.081
+
CD8 [%]
1.000
0.391
1.000
0.079
CD19+ [%]
0.144
0.325
↑0.012*
0.081
CD4+ Foxp3+ [%]
1.000
0.903
↓0.012*
0.081
gMFI CD69 gated on CD4+ cells
ND
0.066
↑0.012*
ND
gMFI CD69 gated on CD8+ cells
ND
0.391
0.531
ND
gMFI CD44 gated on CD4+ cells
ND
↑0.037*
0.210
ND
ND
0.270
0.075
ND
Flow cytometry
spleen
+
gMFI CD44 gated on CD8 cells
IL-10 in TME
118
Table 5-2: arrows = significant up(↑)- or downregulation (↓) in TMEV-infected SJL
mice receiving anti-IL-10R Ab compared with mice receiving IgG1 specific isotype
control in the acute phase of the disease; administration of Ab or isotype control,
respectively, was performed at 0, 7, 14 and 21 dpi; * bold p-values = significant
difference between both groups, p ≤ 0.05, determined by Wilcoxon´s rank sum-tests.
dpi = days post infection, H&E = hematoxylin and eosin, MBP = myelin basic protein,
np-NF = non-phosphorylated neurofilament protein, TMEV = Theiler´s murine
encephalomyelitis virus, gMFI = geometric mean of fluorescence intensity
IL-10 in TME
119
Table 5-3
Summary of statistical analyses (p-values): effect of IL-10R blockade during chronic Theiler’s murine
encephalomyelitis (experiment II)
Investigation
Differences between TMEV-infected SJL mice with (“IL-10R↓late/TMEV”) and
without (“isotypelate/TMEV”) IL-10R blockade (p-values)
42 dpi
49 dpi
RotaRod®
0.403
0.531
clinical score
0.507
1.00
spleen weight
0.346
1.00
0.246
Histology (H&E)
leukomyelitis
0.399
semiquantitative scoring
inflammation small intestine
1.000
1.000
inflammation cecum
0.371
↑0.025*
inflammation colon
0.083
↑0.007*
Immunohistochemistry CD3
0.834
↑0.022*
spinal cord
CD45R
1.000
0.210
Foxp3
ND
↑0.037*
CD107b
ND
0.210
arginase-1
ND
0.834
MBP
ND
0.167
np-NF
ND
1.000
TMEV
0.249
0.531
RT-PCR
IL-1α
ND
0.403
spleen
IL-2
ND
0.531
mRNA
IL-4
ND
0.210
IL-5
ND
0.402
IL-6
ND
0.060
TNF
ND
0.296
TGF-β
ND
0.144
IFN-γ
ND
↑0.037*
Foxp3
ND
0.403
RT-PCR
IL-1α
ND
0.676
spinal cord
IL-2
ND
0.296
mRNA
IL-4
ND
0.676
IL-5
ND
0.144
IL-6
ND
↓0.037*
TNF
ND
0.144
TGF-β
ND
0.531
IFN-γ
ND
0.834
Foxp3
ND
1.000
ND
0.1437
MBP
TMEV
0.713
1.000
Flow cytometry
CD4+ [%]
0.676
↓0.037*
spleen
CD8+ [%]
0.917
0.296
CD19+ [%]
0.531
0.402
+
+
CD4 Foxp3 [%]
0.144
0.095
gMFI CD69 gated on CD4+ cells
ND
1.000
gMFI CD69 gated on CD8+ cells
ND
0.296
gMFI CD44 gated on CD4+ cells
ND
0.095
gMFI CD44 gated on CD8+ cells
ND
1.000
IL-10 in TME
120
Table 5-3: arrow = significant up(↑)- or downregulation (↓) in TMEV-infected SJL mice
receiving anti-IL-10R Ab compared with mice receiving IgG1 specific isotype control
in the chronic phase of the disease; administration of Ab or isotype control
respectively was performed at 35 and 42 dpi; * bold p-values = significant difference
between both groups, p ≤ 0.05, determined by Wilcoxon´s rank sum-tests. dpi = days
post infection, H&E = hematoxylin and eosin, MBP = myelin basic protein, np-NF =
non-phosphorylated
neurofilament
protein,
TMEV
=
Theiler´s
encephalomyelitis virus, gMFI = geometric mean of fluorescence intensity
murine
IL-10 in TME
121
Table 5-4
Statistical analyses of obtained data: effects of IL-10R blockade in non-infected SJL mice
Differences between IL-10R blocked SJL mice (“IL-10R↓”) and
non-treated animals (“isotype”) (p-values)
Investigation
Histology (H&E)
inflammation small intestine
7 dpi
1.000
semiquantitative scoring
inflammation cecum
1.000
0.067
↑0.007*
inflammation colon
0.067
↑0.007*
↑0.006*
CD3+ [%]
1.000
0.402
0.143
+
CD4 [%]
1.000
0.463
0.835
+
1.000
0.403
0.210
+
CD19 [%]
0.403
1.000
0.060
CD4+ Foxp3+
1.000
0.676
↓0.021*
Flow cytometry
spleen
CD8 [%]
14 dpi
1.000
21 dpi
1.000
0.530
1.000
↑0.012*
+
1.000
1.000
↑0.012*
+
0.676
0.531
0.144
+
0.835
0.403
↑0.012*
gMFI CD69 gated on CD4+ cells
gMFI CD69 gated on CD8 cells
gMFI CD44 gated on CD4 cells
gMFI CD44 gated on CD8 cells
Table 5-4: arrow = significant up(↑)- or downregulation (↓) in SJL mice receiving antiIL-10R Ab compared with mice receiving IgG1 specific isotype only; administration of
Ab or isotype control ,respectively, was performed at 0, 7 and 14 dpi; * bold p-values
= significant difference between both groups, p ≤ 0.05, determined by Wilcoxon´s
rank sum-tests. dpi = days post infection, H&E = hematoxylin and eosin, gMFI =
geometric mean of fluorescence intensity
IL-10 in TME
122
Table 5-5
Summary of statistical analyses (p-values): effects of acute Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infection upon
IL-10R blockade (experiment I)
Investigation
Differences between IL-10R blocked SJL mice with (“IL-10R↓early/TMEV”) and
without (“IL-10R↓early/mock”) TMEV-infection (p-values)
14 dpi
22 dpi
RotaRod®
0.307
0.762
clinical score
1.000
↑0.028*
spleen weight
0.140
↑0.008*
Histology (H&E)
leukomyelitis
↑0.015*
↑0.019*
semiquantitative scoring
inflammation small intestine
1.000
1.000
inflammation cecum
0.380
0.749
inflammation colon
↑0.037*
0.752
RT-PCR
IL-1α
↑0.020*
↑0.008*
spleen
IL-2
↑0.020*
↑0.008*
mRNA
IL-4
↑0.020*
↑0.008*
IL-5
↑0.011*
↑0.015*
IL-6
↑0.020*
↑0.008*
TNF
↑0.020*
↑0.008*
TGF-β
↑0.020*
↑0.008*
IFN-γ
↑0.020*
↑0.008*
Foxp3
↑0.020*
↑0.008*
RT-PCR
IL-1α
↑0.020*
↑0.036*
spinal cord
IL-2
0.308
↑0.048*
mRNA
IL-4
0.701
0.400
IL-5
↑0.020*
0.274
IL-6
↑0.020*
0.083
TNF
↑0.020*
↑0.008*
TGF-β
↑0.020*
0.235
IFN-γ
0.125
↑0.006*
Foxp3
↑0.020*
↑0.036*
TMEV
↑0.011*
↑0.004*
Flow cytometry
CD4+ [%]
↓0.020*
ND
spleen
CD8+ [%]
0.540
ND
CD19 [%]
↑0.020*
ND
CD4+ Foxp3+ [%]
↑0.020*
ND
gMFI CD69 gated on CD4+ cells
↑0.020*
ND
gMFI CD69 gated on CD8+ cells
↑0.020*
ND
gMFI CD44 gated on CD4+ cells
↑0.020*
ND
↑0.037*
ND
+
+
gMFI CD44 gated on CD8 cells
IL-10 in TME
123
Table 5-5: arrows = significant up(↑)- or downregulation (↓) in TMEV-infected SJL
mice receiving anti-IL-10R Ab compared to non-infected mice receiving anti-IL-10R
Ab during the acute infection phase (0, 7, 14 and 21 dpi); * bold p-values display
significant difference between both groups (p ≤ 0.05) determined by Wilcoxon´s rank
sum-tests. dpi = days post infection, H&E = hematoxylin and eosin, TMEV = Theiler´s
murine encephalomyelitis virus, gMFI = geometric mean of fluorescence intensity
IL-10 in TME
124
Table 5-6
Summary of statistical analyses (p-values): effects of chronic Theiler’s murine
encephalomyelitis virus infection upon IL-10R blockade (experiment II)
Investigation
Differences between IL-10R blocked SJL mice with (“IL10R↓late/TMEV”) and without (“IL-10R↓late/mock”)
TMEV-infection (p-values)
49 dpi
RotaRod®
↓0.001*
clinical score
↑0.003*
spleen weight
↓0.012*
↑0.007*
Histology (H&E)
leukomyelitis
semiquantitative scoring
inflammation small intestine
1.000
inflammation cecum
0.515
inflammation colon
0.432
RT-PCR
IL-1α
↑0.012*
spleen
IL-2
↑0.012*
mRNA
IL-4
↑0.012*
IL-5
0.389
IL-6
↑0.012*
TNF
↑0.012*
TGF-β
↑0.012*
IFN-γ
↑0.012*
Foxp3
↑0.012*
RT-PCR
IL-1α
↑0.012*
spinal cord
IL-2
↑0.008*
mRNA
IL-4
↑0.008*
IL-5
0.676
IL-6
↑0.012*
TNF
↑0.012*
TGF-β
0.060
IFN-γ
↑0.008*
Foxp3
↑0.012*
TMEV
↑0.008*
Flow cytometry
+
CD4 [%]
0.296
spleen
CD8+ [%]
↑0.037*
CD19+ [%]
+
0.296
+
0.531
CD4 Foxp3 [%]
+
0.403
+
0.144
+
gMFI CD44 gated on CD4 cells
0.210
gMFI CD44 gated on CD8+ cells
0.095
gMFI CD69 gated on CD4 cells
gMFI CD69 gated on CD8 cells
IL-10 in TME
125
Table 5-6: arrows = significant up-regulation (↑) or down-regulation (↓) in infected SJL
mice receiving IL-10R Ab compared to non-infected mice receiving anti-IL-10R Ab
during the chronic infection phase (35 and 42 dpi); * bold p-values display significant
differences between both groups (p ≤ 0.05) determined by Wilcoxon´s rank sumtests. dpi = days post infection, H&E = hematoxylin and eosin, TMEV = Theiler´s
murine encephalomyelitis virus, gMFI = geometric mean of fluorescence intensity
Diskussion
6
126
Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss einer systemischen IL-10R-Blockade
bei der TME auf das periphere Immunsystem und die immunpathologischen
Prozesse im Rückenmark untersucht. Hierfür wurde ein Mausstamm verwendet, der
für Th1-mediierte, immunpathologische Prozesse, anaphylaktische Reaktionen und
Viruspersistenz empfänglich ist (LIPTON, 1975; FU et al., 1990; CHARLES et al.,
1999; PELTONIEMI et al., 2002). Da die systemische Applikation von anti-IL-10RAntikörpern in der Literatur bisher überwiegend für C57BL/6- und BALB/c-Mäuse
beschrieben ist (BELKAID et al., 2001; BROOKS et al., 2006; EJRNAES et al., 2006;
EJRNAES et al., 2007; BAI et al., 2009), erfolgte zuerst eine Untersuchung der
peripheren Organe von nicht infizierten SJL-Mäusen mittels Histologie. Zusätzlich
wurde die Expression der Oberflächenantigene CD3, CD4, CD8, CD19, CD44 und
CD69 und des kernständigen Transkriptionsfaktors Foxp3 in der Milz mittels
Durchflusszytometrie untersucht. Um den Einfluss der IL-10R-Blockade auf den
Verlauf der akuten und demyelinisierenden TME näher zu charakterisieren, wurden
Rückenmark, Darm und Milz mittels Histologie, Immunhistologie, RT-qPCR und
Durchflusszytometrie
analysiert.
Die
Ergebnisse
der
vorliegenden
Studie
verdeutlichen die zentrale Rolle von IL-10 für die Immunhomöostase und die
Komplexität der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Kompartimenten eines
Organismus.
6.1.
Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen und
ihre Pathogenese
In der vorliegenden Arbeit löste die systemische Applikation von anti-IL-10RAntikörpern eine Typhlokolitis aus. Da in keinem anderen Organsystem ein derart
direkter und ständiger Kontakt zu Mikroorganismen besteht, spielt IL-10 besonders
im
Darm
eine
zentrale
Rolle
für
die
Unterdrückung
überschießender,
Diskussion
127
immunpathologischer Prozesse (ARTIS, 2008; BARNES et al., 2009; ZIGMOND et
al. 2014). Studien von KÜHN et al. (1993) zeigen, dass ein Verlust der IL-10Expression (IL-10 knock out, IL-10-/-) in Mäusen mit C57BL/6-Hintergrund einen
Gewichtsverlust und Wachstumsretardierung im Vergleich zu IL-10-kompetenten
Wurfgeschwistern zur Folge hat. Histologisch weisen IL-10-/--Mäuse eine chronische,
lymphoplasmazytäre, teils histiozytäre Enterokolitis mit multifokalen Erosionen im
gesamten Gastrointestinaltrakt auf, wobei Duodenum, proximales Jejunum und
proximales Kolon stärker betroffen sind als die übrigen Darmabschnitte. Besonders
im Duodenum und im proximalen Jejunum ist die Mukosa hyperplastisch und weist
eine abnorme Gestaltung der Krypt- und Zottenarchitektur auf (KÜHN et al., 1993).
Ähnliche Läsionen entwickelten sich auch nach Applikation des anti-IL-10RAntikörpers in der vorliegenden Studie. Allerdings wiesen lediglich Zäkum und Kolon
eine lymphoplasmazelluläre bis histiozytäre, teils erosive und ulzerative Entzündung
mit multifokalen Kryptabszessen und Proliferation des Epithels auf. Der Dünndarm
war hingegen in der vorliegenden Studie nicht betroffen.
Pathogenetisch führt die Unterbrechung der IL-10-Signalkaskade durch einen
Mangel an IL-10 oder eine Blockade des IL-10R zu einer verstärkten Expression von
MHC-Klasse-II-Komplexen und proinflammatorischen Zytokinen (z.B. TNF, IL-1, IL-6
und IFN-γ). Dies resultiert in einem Verlust der peripheren Toleranz und der
Etablierung einer Immunreaktion gegenüber kommensalen Mikroorganismen im
Darm (KÜHN et al., 1993; RAKOFF-NAHOUM et al., 2006). Neuere Studien von
ZIGMOND et al. (2014) zeigen, dass CX3CR1hi-Makrophagen im Kolon von IL-10-/-Mäusen akkumulieren und große Mengen proinflammatorischer Moleküle (z.B.
Triggering receptor expressed on myeloid cells 1, Trem1, Nitric oxide synthase 2,
Nos2 und IL-23α) exprimieren. Diese CX3CR1high-Makrophagen stammen von Ly6C+Makrophagen aus dem Blut ab und verhalten sich im nicht entzündeten Kolon
ortständig (nonmigratory), anerg und antiinflammatorisch (SCHULZ et al., 2009;
ZIGMOND et al., 2012; ZIGMOND und JUNG, 2013). Wenn diese Zellen allerdings
eine Defizienz des IL-10R aufweisen, entwickeln die betroffenen C57BL/6-Mäuse
eine schwere, spontane Kolitis. Interessanterweise ruft jedoch eine alleinige IL-10Defizienz
der
gleichen
Zellpopulation
keine
intestinale
Entzündung
hervor
Diskussion
128
(ZIGMOND et al., 2014). Im Falle einer IL-10R-Defizienz verlieren die CX3CR1highMakrophagen ihre antiinflammatorische Gensignatur und exprimieren CCR7,
wodurch sie potentiell migratorische Fähigkeiten erlangen (SCHULZ et al., 2009;
ZIGMOND et al., 2012; ZIGMOND et al., 2014). ZIGMOND et al. (2014) postulieren,
dass eine Unterbrechung der IL-10R-Signalkaskade durch eine Erhöhung der
Antigenexpression zu einer verstärkten Aktivierung von Effektor-T-Zellen führt, in
deren Folge sich ein immunpathologischer Prozess etabliert. Vermutlich spielen
ähnliche Mechanismen auch in der vorliegenden Studie eine Rolle in der
Pathogenese der intestinalen Entzündung nach systemischer Blockade des IL-10R
bei SJL-Mäusen.
6.2
Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen des
Menschen
Ähnliche Läsionen wie die von IL-10-/-- und SJL-Mäusen, die anti-IL-10R-Antikörper
erhalten haben, sind auch für die chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen
(inflammatory bowel disease, IBD) des Menschen und des Hundes charakteristisch
(IKENOUE et al., 2005; JUNGINGER et al., 2012; JUNGINGER et al., 2014). Auf
Grund ihres Verteilungsmusters und ihres Charakters wird die IBD in Morbus Crohn
(MC) und Colitis Ulcerosa (CU) unterteilt (NAHIDI et al., 2013). Während sich die CU
im Bereich des Rektums entwickelt und dann entlang anatomischer Grenzen nach
oral aufsteigt, betrifft MC diskontinuierlich den gesamten Gastrointestinaltrakt. Ileum
und Kolon sind in etwa 50% der Fälle betroffen. Im Gegensatz zur CU, die sich in der
Regel auf Mukosa und Submukosa beschränkt, betrifft MC alle Wandschichten des
Darms und geht deshalb häufig mit schweren Komplikationen wie Stenosen- und
Fistelbildung einher (FEAKINS, 2014). Beiden Manifestationsformen der IBD ist
gemeinsam, dass sie durch eine chronisch-rezidivierende Entzündung des
Gastrointestinaltrakts unklarer Genese charakterisiert werden und mit einem
erhöhten Risiko für die Entwicklung von Kolonkarzinomen einhergehen (NAHIDI et
Diskussion
129
al., 2013). Insgesamt sind in Europa etwa 2,2 Millionen Menschen betroffen
(CARTER et al., 2004; ENGEL et al., 2010). Ätiologisch liegt vermutlich eine Störung
der
intestinalen
Barrierefunktion
(leaky
gut)
mit
konsekutiver,
dauerhafter
Antigenstimulation des darmassoziierten lymphatischen Gewebes (gut-associated
lymphoid tissue, GALT) in genetisch prädisponierten Individuen zu Grunde
(FIOCCHI, 1998; LAUKOETTER et al., 2008).
FUNDERBURG et al. (2013) zeigen, dass betroffene Patienten im Blut höhere
Spiegel an aktivierten CD4+- und CD8+-T-Zellen aufweisen. Ähnliche Ergebnisse
liefert auch die vorliegende Studie für die intestinale Entzündung bei der Maus. Die
vermehrte Expression von CD69 und CD44 auf CD4 +- und CD8+-T-Zellen in der
vorliegenden Studie ist Ausdruck einer verstärkten Aktivierung von T-Zellen, die sich
möglicherweise infolge einer Akkumulation von proinflammatorischen CX3CR1hiMakrophagen im Kolon etabliert hat. Im Zuge der Kolitis entwickelten Tiere aus der
Arbeit von GEBOES (2003) wie die Tiere aus der vorliegenden Studie eine
myeloische Hyperplasie in den mesenterialen Lymphknoten.
Neben Makrophagen spielen auch Foxp3+-Treg eine zentrale Rolle für den Erhalt der
Immunhomöostase im Kolon (MAYNARD et al., 2007; RUBTSOV et al., 2008;
BANERJEE et al., 2009). Analog hierzu zeigten RUBTSOV et al. (2008), dass ein
Unvermögen von Foxp3+-T-Zellen IL-10 zu sezernieren ausreicht, um eine auf das
Kolon beschränkte, spontane Entzündung zu erzeugen. Da sich in der vorliegenden
Studie ebenfalls ein relativer Verlust von CD4+ Foxp3+-Treg in der Milz 14 Tage nach
erstmaliger Antikörperapplikation einstellte und sich die Entzündung auf Zäkum und
Kolon beschränkte, liegt wahrscheinlich auch bei SJL-Mäusen nach Blockade des IL10R eine durch Makrophagen- und Foxp3-vermittelte Immunpathologie zu Grunde.
Während beim Menschen die Mehrzahl der Erkrankungen vermutlich auf multiple
Faktoren und Gene (multigenic disorders) zurückzuführen ist, zeigen neuere
Untersuchungen, dass es sich bei einigen, selteneren IBD-Varianten um monogene,
autosomal-rezessive
Defizienzen
des
IL-10R
handelt.
Betroffene
Patienten
entwickeln sehr schwere Verlaufsformen, die sich bereits im ersten Lebensjahr
manifestieren und auch als Very early onset (VEO)-IBD bezeichnet werden
Diskussion
130
(GLOCKER et al., 2011; DENSON et al., 2013). Da das Krankheitsbild bei den
verwendeten SJL-Mäusen ähnlich wie bei der VEO-IBD des Menschen progressiv
verlief und mit multifokalen Ulzerationen und transmuralen Entzündungen einherging,
eignen sich SJL-Mäuse möglicherweise auch zur Untersuchung der Pathogenese
früh einsetzender und akuter Verlaufsformen der IBD.
6.3
Exazerbation von chronisch-entzündlichen
Darmerkrankungen durch virale Infektionen
Neben genetischen Prädispositionen (z.B. Polymorphismen des MHC-II-Komplexes)
und Umweltfaktoren (v.a. nutritive Faktoren) werden auch immer wieder Infektionen
durch Bakterien oder Viren als auslösende und modulierende Faktoren bei der IBD
als Ursache in Erwägung gezogen (MANN und SAEED, 2012; BOSCA-WATTS et
al., 2015).
Besonders die Rolle von bakteriellen Infektionen, wie z.B. adhärenten Escherichia
coli, Mycobacterium avium spp. paratuberculosis, Clostridium difficile, Salmonella
und Campylobacter spp. wird in der Literatur von verschiedenen Autoren kontrovers
diskutiert (BOSCA-WATTS et al., 2015). Die Rolle von Viren für die Entwicklung und
Modulation der IBD ist ebenfalls umstritten, wurde bislang aber nur wenig untersucht
und liefert zum Teil widersprüchliche Ergebnisse (GLASSER et al., 2001;
MASSERET et al., 2001; NASER et al., 2004; BAUMGART et al., 2007; OLSEN et
al., 2009; JESS et al., 2011; NITZAN et al., 2013). Einerseits werden verschiedene
virale Infektionen im Kindesalter mit einer zeitlich verzögerten Entwicklung von IBD in
einen kausalen Zusammenhang gebracht (EKBOM et al., 1990), andererseits spricht
die erhöhte Prävalenz von IBD in Industrienationen mit hohen Hygienestandards für
eine negative Korrelation von IBD und viralen Infektionen („Hygiene-Theorie“,
STRACHAN, 1989; OKADA et al., 2010).
Diskussion
131
Korrespondierend zu der Theorie, dass virale Infektionen IBD auslösen könnten,
werden seit den 1990er Jahren immer wieder erhöhte IBD-Inzidenzen nach Masernund/oder Mumps-Infektionen beschrieben (EKBOM et al., 1994; MONTGOMERY et
al., 1999; NG et al., 2012). Ein eindeutiger kausaler Zusammenhang wurde bisher
jedoch nicht erbracht (GHOSH et al., 2001; IIZUKA et al., 2001). Außerdem sprechen
die sinkenden Fallzahlen von Mumps- und Masern-Infektionen bei gleichzeitig
steigenden
IBD-Prävalenzen
in
Europa
gegen
einen
direkten
kausalen
Zusammenhang (MILLER, 1987; FEENEY, et al., 1997).
Virale Erreger werden jedoch nicht nur als Auslöser der IBD in Erwägung gezogen,
sondern auch als modulierende oder verstärkende Faktoren bei bestehender IBDErkrankung genannt (BOSCA-WATTS et al., 2015). Beispielsweise gehen schwere
Verlaufsformen der CU oftmals mit einer Reaktivierung von Cytomegalovirus (CMV)Infektionen einher. Fraglich ist allerdings, ob CMV zu einer Exazerbation der IBD
führen kann oder ob die Reaktivierung der viralen Infektion lediglich eine Folge der
IBD ist (LAWLOR und MOSS, 2010; GARRIDO et al., 2013). Eine ähnliche,
modulierende
Funktion
wird
teilweise
auch
dem
Epstein-Barr-Virus
(EBV)
zugesprochen. Obwohl die Prävalenz sowohl bei IBD-Patienten als auch bei
Kontrollgruppen annähernd 100% erreicht, liegt bei der IBD eine positive Korrelation
zwischen der Virusreplikation und dem Ausmaß der intestinalen Entzündung vor
(LINTON et al., 2013). Außerdem treten bei hohen Replikationsraten des EBV
häufiger schwere Komplikationen wie z.B. intestinale Lymphome auf (SANKARANWALTERS et al., 2011; SUBRAMANIAM et al., 2013). Obwohl die meisten viralen
Infektionen also vermutlich in der Regel nicht in der Lage sind IBD auszulösen,
können sie möglicherweise den Schweregrad einer bereits bestehenden Erkrankung
beeinflussen (BOSCA-WATTS et al., 2015).
Eine Modulation des Schweregrads der Kolitis durch eine virale Infektion trat auch in
der vorliegenden Studie nach Applikation des anti-IL-10R-Antikörpers bei TMEVinfizierten Mäusen auf. Obwohl mittels spezifischer Immunhistologie im Darm kein
TMEV-Antigen nachgewiesen werden konnte und ein direkter Viruseinfluss
deswegen sehr unwahrscheinlich ist, entwickelten die Tiere, die zusätzlich mit TMEV
Diskussion
132
infiziert wurden an Tag 14 nach der Infektion eine deutlichere Kolitis als jene Tiere,
die
lediglich
anti-IL-10R-Antikörper
erhielten.
Interessanterweise
wird
eine
gleichartige Beobachtung durch WANG et al. (2014) auch für experimentelle murine
Influenza beschrieben. Nach der Infektion mit einem Maus-adaptierten Influenza-AVirus (H1N1) entwickeln die Tiere Gastroenteritis-ähnliche Symptome obwohl im
Darm kein Virus nachweisbar ist. In anderen Organsystemen wie der Leber und der
Niere liegen ebenfalls keine Veränderungen vor (WANG et al., 2014). Auch in der
vorliegenden Arbeit waren die entzündlichen Veränderungen auf den Darm
beschränkt. WANG et al. (2014) beschreiben, dass die intranasale Infektion mit dem
Influenza-Virus zu einer veränderten Zusammensetzung der intestinalen Mikroflora
führt und mit erhöhten Mengen an Th17-Zellen und einer vermehrten Produktion von
IFN-γ durch CCR9+ CD4+-T-Zellen einhergeht. Bei den CCR9+ CD4+-T-Zellen
handelt es sich um primär in der Lunge geprägte, virusspezifische Effektor-T-Zellen
(lung-derived virus-specific effector T cells), die sekundär in den Darm rekrutiert
werden und die Immunhomöostase stören (WANG et al., 2014). Ähnliche
Mechanismen könnten auch bei der TME in der vorliegenden Arbeit eine Rolle
spielen.
6.4
Wechselwirkungen zwischen Darm und Zentralem
Nervensystem
6.4.1
Der Einfluss von psychischem Stress
Neben einer immunvermittelten Aufregulation der Kolitis durch ein aktiviertes
Immunsystem oder eine Rekrutierung von virusspezifischen Effektor-T-Zellen in den
Darm, könnte die Modulation der Entzündung nach TMEV-Infektion auch auf eine
direkte Gehirn-Darm-Interaktion zurückzuführen sein. Für den Menschen wird bereits
in verschiedenen Studien eine Korrelation von psychischem Stress und MC
Diskussion
133
beschrieben (COHN et al., 1970; ANDREWS et al., 1987; LI et al., 2004). Auch im
Tiermodell führt psychischer Stress bei gesunden Ratten zu einer Aktivierung
neurobiologischer Signalwege unter Einbeziehung der Hypothalamus-HypophysenNebennierenrinden-Achse
(HHN-Achse)
und
der
Hypothalamus-autonomes
Nervensystem-Achse (HANS-Achse), die mit einer Erhöhung der intestinalen
Permeabilität (leaky gut) und einer Adhäsion von Bakterien an das Darmepithel
einhergeht (SANTOS et al., 2001; MEDDINGS und SWAIN, 2012). Infolge eines
vermehrten transzellulären (Transzytose) oder parazellulären Transports (über tight
junctions) von Makromolekülen etabliert sich eine ständige Stimulation des GALT
(MEDDINGS und SWAIN, 2012; ALKHAWAJAH et al., 2013).
Ob die Modulation der Kolitis im vorliegenden Fall tatsächlich Ausdruck eines
erhöhten Stresszustandes durch die zusätzliche TMEV-Infektion ist, bleibt offen.
Allerdings konnte eine Verstärkung der Kolitis nur an Tag 14 nach Infektion und nicht
mehr an Tag 22 und 49 beobachtet werden. An Tag 14 zeigten sowohl die Tiere, die
nur anti-IL-10R-Antikörper erhielten, als auch die Tiere, die zusätzlich mit TMEV
infiziert wurden, eine Kolitis. In der klinischen Untersuchung unterschied sich der
Zustand beider Gruppen nicht. Hingegen wiesen die Tiere, die zusätzlich infiziert
waren an Tag 49 nach TMEV-Infektion neben der Kolitis auch bereits eine deutliche
Reduktion der Motorkoordination und einen schlechteren Gesundheitszustand auf.
Im vorliegenden Fall kann deshalb nicht ausgeschlossen werden, dass das
Stressniveau an Tag 49 höher war als an Tag 14 und dass Stress in der
vorliegenden Arbeit möglicherweise eher eine untergeordnete Rolle spielt.
Die Wechselwirkungen zwischen dem Darm und der HHN- und der HANS-Achse am
Beispiel des MC sind in Abbildung 6-1 dargestellt.
Diskussion
134
Abbildung 6-1: Übersicht über mögliche Auswirkungen der Hypothalamus-autonomes
Nervensystem-Achse und der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse auf den
Darm bei Morbus Crohn.
Psychischer Stress führt zu einer Aktivierung der Hypothalamus-autonomes Nervensystem (HANS)Achse und induziert eine periphere Hypersekretion von Corticotropin-releasing Hormone (CRH),
gefolgt von erhöhter intestinaler Permeabilität und vermehrter intraluminaler Antigenpräsentation.
Durch eine zusätzliche Modulation der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden (HHN)-Antwort
etabliert sich eine pathologische Immunantwort mit konsekutiver Entzündung des Darms.
+ = aktivierender Einfluss; - = hemmender Einfluss; ENS = Enterisches Nervensystem; ACTH =
Adrenocorticotropes Hormon; PVN = paraventrikulärer Nukleus; ADH = Antidiuretisches Hormon.
Modifiziert nach STASI et al., 2008.
6.4.2
Die Bedeutung der Darmflora für die Etablierung von
Autoimmunkrankheiten
Interessanterweise wird eine Interaktion von Darm und Gehirn auch bei der EAE
beschrieben. NOURI et al. (2014) zeigen, dass eine intradermale Applikation von
MOG-Antigen oder die Übertragung von enzephalitogenen T-Zellen (adoptiver
Transfer) mit einer Erhöhung der intestinalen Permeabilität und einer verstärkten
Expression von Zonulin in Epithelzellen und Zellen der Lamina propria einhergeht.
Bei Zonulin handelt es sich um ein sekretorisches Protein, dessen Freisetzung ins
Diskussion
135
Darmlumen zu einem reversiblen Anstieg des parazellulären Transports führt
(FASANO, 2011). Gleichzeitig weisen MOG-immunisierte Tiere eine vermehrte
Infiltration von Th1-/Th17-Zellen und eine verminderte Anzahl an Treg in der Lamina
propria, den mesenterialen Lymphknoten und der Milz auf (NOURI et al., 2014). Die
Autoren schlussfolgern daraus, dass eine erhöhte Expression von IL-17 in
Kombination mit IFN-γ und TNF die Expression der tight junction-Proteine
aufreguliert und sich deshalb eine verstärkte, intestinale Permeabilität in Folge der
Autoimmunität etabliert (NOURI et al., 2014). Ähnlich wie bei der EAE liegt auch bei
den Tieren aus der vorliegenden Arbeit, die anti-IL-10R-Antikörper erhielten und mit
TMEV-infiziert wurden, eine Aufregulation von IFN-γ und TNF in der Milz vor, sodass
die Verstärkung der Entzündung möglicherweise durch ähnliche Mechanismen
reguliert wird, wie die Erhöhung der Permeabilität bei der EAE. Allerdings ist für EAE
bisher nicht beschrieben, dass die betroffenen Tiere eine Entzündung des Darms
entwickeln (NOURI et al., 2014).
Korrespondierend zu der Studie von NOURI et al. (2014) zeigen OCHOA-REPÁRAZ
et al. (2009), dass die orale Verabreichung eines Breitspektrum-Antibiotikums vor
Immunisierung mit MOG- oder PLP-Antigen die klinische Manifestation der EAE
deutlich reduziert. In einer ähnlichen Arbeit entwickeln transgene SJL-Mäuse, die
einen MOG-Antigen-bindenden T-Zellrezeptor exprimieren keine EAE, wenn sie
unter keimfreien Bedingungen gehalten werden (BERER et al., 2011). Nachweislich
geht die Reduktion der intestinalen Mikroflora mit einem relativen Anstieg der IL-10
produzierenden CD4+ Foxp3+-Treg in der Milz einher (OCHOA-REPÁRAZ et al.,
2009). Vorausgegangene Arbeiten von COOMBES et al. (2007) zeigen bereits, dass
die Konversion von naiven CD4+-T-Zellen zu CD4+ Foxp3+-Treg durch CD103+
CD11chigh dendritische Zellen von der Zusammensetzung der intestinalen Mikroflora
abhängt. Vermutlich ist die Protektion vor EAE durch orale Antibiotikaadministration
deshalb zumindest zum Teil auf die vermehrte Expression von IL-10 durch im Darm
geprägte Treg zurückzuführen (OCHOA-REPÁRAZ et al., 2009).
Auch bei Tieren aus der vorliegenden Arbeit wurden am 21. Versuchstag nach Gabe
des anti-IL-10R-Antikörpers in der Milz geringere Mengen an CD4+ Foxp3+-Treg
Diskussion
136
nachgewiesen. Dies ist möglicherweise auf die Alteration der intestinalen Mikroflora
im Verlauf der Kolitis zurückzuführen. Diese Ergebnisse unterstreichen die
Bedeutung
der
Darmflora
für
die
Ausbildung
einer
physiologischen
und
pathologischen Immunantwort. Bei Patienten mit Autoimmunkrankheiten wie z.B. MS
wird deshalb eine Modulation der Darmflora als Teil der Therapie in Erwägung
gezogen (BERER et al., 2011).
6.5
Komorbidität von Multiple Sklerose und
chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen
Bereits 1982 beschrieben RANG et al. eine Assoziation von MS und CU. Diese
Komorbidität wird in zahlreichen späteren Studien belegt (SADOVNICK et al., 1989;
KIMURA et al., 2000; BERNSTEIN et al., 2005; GUPTA et al., 2005; MARRIE et al.,
2013). Beispielsweise zeigten MARRIE et al. (2013), dass die IBD-Prävalenz bei MSPatienten etwa 0,78% betrug, während aus der Kontrollpopulation nur etwa 0,65%
der Probanden an IBD erkrankt waren. Im Gegensatz zu diesen relativ niedrigen
Prozentsätzen wies eine andere Arbeit deutlich höhere IBD-Prävalenzen von bis zu
3,5% bei MS-Patienten nach (JACOBS et al., 1999). In einer Studie von BERNSTEIN
et al. (2005) lag die Prävalenz von MC bei MS-Patienten hingegen lediglich bei
0,41% und wies somit keinen signifikanten Zusammenhang zwischen den beiden
Krankheitsbildern nach. In derselben Arbeit wird allerdings eine erhöhte Prävalenz
von CU bei MS-Patienten (0,54%) im Vergleich zur Kontrollpopulation (0,29%)
nachgewiesen. Die Autoren dieser zweiten Studie postulieren deshalb, dass zwar
eine Assoziation zwischen UC und MS, nicht jedoch zwischen MC und MS besteht
(BERNSTEIN et al., 2005). Andere Arbeiten schließen hingegen jede Assoziation
von IBD und MS aus (HENDERSON et al., 2000; RAMAGOPALAN et al., 2007).
Jedoch detektieren genomweite Assoziationsstudien zum Teil identische, genetische
Risikofaktoren für MS und CU, was daraufhin deutet, dass eine Assoziation zwischen
beiden Erkrankungen bestehen könnte (LETTRE und RIOUX, 2008). Außerdem
Diskussion
137
weisen circa 20% der MS-Patienten eine erhöhte intestinale Permeabilität (leaky gut)
auf und etwa 75% zeigen im Blut erhöhte Werte an CD45R0+ B-Zellen. Bei CD45R0
handelt es sich um einen Marker für intestinale Permabilität beim MC (YACYSHYN et
al., 1996).
Obwohl der Zusammenhang zwischen beiden Erkrankungen unklar ist, postuliert
EMBRY
(2004),
dass
Molekulares
Mimikry
von
Nahrungsantigenen,
Infektionserregern und Eigenantigenen die Etablierung einer Autoimmunreaktion und
somit die Entstehung der MS begünstigen könnte. Da es sich auch in dem
vorliegenden Modell um eine Komorbidität von Kolitis und demyelinisierender
Leukomyelitis handelt, sollte in Erwägung gezogen werden, dass die Entzündung
des Darms die direkten Auswirkungen der IL-10R-Blockade auf das Rückenmark
beeinflusst haben könnte. Möglicherweise hätte sich die Applikation des anti-IL-10RAntikörpers anders auf die Leukomyelitis ausgewirkt, wenn die Tiere aus der
vorliegenden Studie, wie C57BL/6-Mäusen aus anderen Studien, nach Applikation
des Antikörpers keine Kolitis entwickelt hätten (BELKAID et al., 2001; BROOKS et
al., 2006; EJRNAES et al., 2006; EJRNAES et al., 2007; BAI et al., 2009).
Wahrscheinlich weisen SJL- im Gegensatz zu C57BL/6-Mäusen eine genetische
Prädisposition für Autoimmunerkrankungen und immunpathologische Prozesse auf,
die sie sowohl für die demyelinisierende Leukomyelitis als auch überschießende
Immunreaktionen im Darm empfänglich werden lässt.
6.6
Mögliche Ursachen für die begrenzte Modulation
der Entzündungsreaktion im Rückenmark nach
Blockade des Interleukin-10-Rezeptors
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie werfen die Frage auf, warum die
systemische Applikation des anti-IL-10R-Antikörpers zwar die periphere Toleranz
reduziert und eine Kolitis induziert, gleichzeitig jedoch die Entzündungsreaktion im
Diskussion
138
Rückenmark nur marginal beeinflusst. Mögliche Erklärungsansätze werden im
Folgenden näher erläutert:
6.6.1
Kompartimentalisierung der Entzündung im Zentralen
Nervensystem
Zahlreiche Studien bei MS-Patienten zeigen, dass antiinflammatorische und
immunmodulatorische Therapeutika (z.B. Interferon-β, Glatirameracetat) vielfach
lediglich in der akuten Phase der Erkrankung wirksam sind. Wenn die Erkrankung in
die progrediente Phase übergeht, lässt die Wirkung oftmals nach oder wird ganz
aufgehoben
(NOSEWORTHY et al.,
2000; GOLDENBERG,
2012).
Dieses
Therapieversagen in der progredienten Phase der MS wird häufig darauf
zurückgeführt, dass sich im Verlauf der Erkrankung durch einen Verschluss der BlutHirn-Schranke (BHS, blood brain barrier) eine Kompartimentalisierung des ZNS
einstellt. Während die Entzündungsschübe in der Frühphase der MS durch das
periphere Immunsystem ausgelöst werden, etabliert sich in der Spätphase der
Erkrankung
eine
autonome
Entzündungsreaktion
mit
intrathekaler
Immunglobulinsynthese und follikelähnlichen B-Zell-Aggregaten in den Meningen
(HOCHMEISTER et al., 2006; LASSMANN et al., 2007; MEINL et al., 2008).
Da auch SJL-Mäuse drei bis vier Monate nach TMEV-Infektion eine geschlossene
BHS sowie eine Infiltration von CD138+-Plasmazellen/Plasmablasten und hohe IgGSpiegel in der Zerebrospinalflüssigkeit aufweisen, werden gleichartige Verhältnisse
wie bei der MS auch für die TME vermutet (PACHNER et al., 2011). Möglicherweise
ist der geringe Effekt der IL-10R-Blockade auf
die Leukomyelitis darauf
zurückzuführen, dass der Antikörper nicht in ausreichenden Mengen die intakte BHS
penetriert.
Diskussion
6.6.2
139
Die Blut-Hirn-Schranke
Bei der BHS handelt es sich um eine physiologische Barriere zwischen dem Blut und
dem ZNS, die erstmals 1885 von PAUL EHRLICH beschrieben wurde und in der
neueren Literatur auch als „neurovaskuläre Einheit“ bezeichnet wird. Sie besteht aus
einem einschichtigen Endothel, dessen Zellen über tight junctions miteinander
verbunden sind und einer Basalmembran aufliegen. Zusätzlich erfolgt eine
Verstärkung durch Astrozytenfortsätze, Perizyten und Mikroglia (ABBOTT und
FRIEDMAN, 2012). Ihr Aufbau ist in Abbildung 6-2 schematisch dargestellt.
Abbildung 6-2: Aufbau der Blut-Hirn-Schranke.
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) besteht aus kontinuierlichem Endothel, dessen Endothelzellen über
tight junctions miteinander verbunden sind und einer Basalmembran aufliegen. Verstärkt wird die
Endothelzellschicht durch die Fortsätze von Perizyten, Astrozyten und Mikroglia. Diese physiologische
Barriere stellt dem ZNS alle notwendigen Nährstoffe zur Verfügung und reguliert gleichzeitig den
Abtransport der entstandenen Stoffwechselendprodukte.
Modifiziert nach ABBOTT und FRIEDMAN, 2012.
Unter physiologischen Bedingungen ermöglicht die BHS nur einen sehr restriktiven
Stoffaustausch (BAUER et al., 2014). Beispielsweise können Aminosäuren, Glukose,
Diskussion
140
Hormone, Insulin, Transferrin, IL-1α, IL-6 und TNF die Barriere passieren, während
TGF-β und IL-10 nicht ins gesunde ZNS gelangen (GUTIERREZ et al., 1993; BANKS
et al., 1994a; BANKS et al., 1994b; KASTIN et al., 2003; DENNIS und WATTS,
2012). Kleine, lipophile Moleküle diffundieren zwar zum Teil passiv durch die BHS,
werden jedoch durch Efflux-Transporter (z.B. Permeability glycoprotein, P-gp,
Multidrug Resistance Protein, MRP und Breast cancer Resistance Protein, BCRP)
zum Großteil wieder aus dem ZNS entfernt (BAUER et al., 2014). Die Penetration
von Antikörpern ist unter physiologischen Bedingungen ebenfalls nur gering
(DENNIS und WATTS, 2012).
Beim Vorliegen von neurologischen Erkrankungen erhöht sich jedoch zum Teil die
Permeabilität der BHS, sodass auch Stoffe, die normalerweise nicht übertreten im
ZNS nachweisbar sind (STANIMIROVIC et al., 2012). Beispielsweise führt die
systemische Applikation von anti-IL-10R-Antikörpern bei WNV- oder LCMVInfektionen zu einer Reduktion der Viruslast, was auf eine erhöhte Permeabilität bzw.
Schädigung der BHS mit konsekutivem Austausch von Antikörpern, Immunzellen
oder Entzündungsmediatoren zwischen dem ZNS und dem peripheren Immunsystem
zurückzuführen sein könnte (BROOKS et al., 2006; EJRNAES et al., 2006; BAI et al.,
2009; MATULLO et al., 2010; ROE et al., 2012).
Im Gegensatz hierzu ist die Permeabilität der BHS in der vorliegenden Studie
möglicherweise nicht ausreichend erhöht, um einen Übertritt des anti-IL-10RAntikörpers in therapeutischen Dosen zu ermöglichen. Korrespondierend hierzu
konnten HANSMANN et al. (2012) mittels eines Markerfarbstoffes (Evans Blue
Essay) und einer IgG-spezifischen Immunhistologie keine Störung der BlutRückenmark-Schranke (blood-spinal cord barrier, BRS) an Tag 0, 1, 28 und 98 nach
TMEV-Infektion nachweisen. Es bleibt deshalb fraglich, warum ausgerechnet an Tag
49 nach Infektion eine verstärkte Infiltration von T-Zellen ins Rückenmark beobachtet
werden konnte, während zu früheren Zeitpunkten kein Effekt detektiert wurde.
Möglicherweise wurde der schwache Effekt der anti-IL-10R-Antikörper-Applikation
aber auch erst an Tag 49 offensichtlich, da sich zu diesem relativ späten Zeitpunkt
bereits eine deutlich stärkere Immunpathologie im Rückenmark etabliert hatte als zu
Diskussion
141
den früheren Zeitpunkten. Weitere Untersuchungen sind daher notwendig, um die
Integrität der BHS/BRS im Verlauf der TME nach Applikation von anti-IL-10RAntikörpern näher zu charakterisieren.
Um den Übertritt von Pharmazeutika in das ZNS zu verbessern und eine
Optimierung intrakranialer und -spinaler Erkrankungen (z.B. intrakraniale Neoplasien
und Morbus Parkinson) zu erzielen, werden in der Humanmedizin bereits
verschiedene Ansätze verfolgt (ZHANG et al., 2015). Neben HyperthermieTechniken
(z.B.
Laserimpulse)
fokussierter
und
Ultraschall,
Rezeptor-vermittelten
elektromagnetische
Transportsystemen
Wellen
spielen
und
auch
Nanopartikel, die intrazerebral appliziert werden und das Therapeutikum nachfolgend
kontinuierlich freisetzen sowie Goldnanopartikel, die die BHS via Endozytose
überwinden,
Zell-penetrierende
Peptide
(Cell-penetrating
peptides,
protein
transduction domains, membrane translocation sequences) und Zell-mediierte
Transportsysteme (z.B. unter Verwendung von mesenchymalen oder neuralen
Stammzellen) eine Rolle (SIRAV et al., 2009; STENEHJEM et al., 2009; BINELLO et
al., 2012; DENNIS und WATTS, 2012; FERNANDEZ et al., 2012; YANG et al., 2012;
BOVENBERG et al., 2013; GROMNICOVA et al., 2013; LEE et al., 2013; ZOU et al.,
2013;
PARRISH
et
al.,
2015).
Außerdem
können
Substanzen
über
Mikroinfusionspumpen in exakter Dosierung und zu determinierten Zeitpunkten direkt
ins ZNS appliziert werden (GROSSI et al., 2003; BRANDT et al., 2007). Eine
Erhöhung der Permabilität der BHS/BRS oder eine direkte Applikation des anti-IL10R-Antikörpers in das ZNS könnte möglicherweise auch in der vorliegenden Arbeit
einerseits die antivirale Immunantwort stärken und die Viruslast im ZNS senken und
andererseits die systemischen Nebenwirkungen der Antikörpergabe reduzieren.
6.6.3
Immunologischer Erschöpfungszustand und
Sequestration der Entzündung im Darm
Es muss in Betracht gezogen werden, dass in der vorliegenden Arbeit auch die
Etablierung eines immunologischen Erschöpfungszustandes (T cell exhaustion) eine
Diskussion
142
Rolle spielen könnte. Hierfür spricht, dass der erhöhte Aktivierungszustand von CD4+
und CD8+ T-Zellen in der Milz von Tieren, die sowohl anti-IL-10R-Antikörper als auch
TMEV erhielten, nur in der Frühphase der TME an Tag 14 nachweisbar war. Dieser
Effekt trat an Tag 49 nicht mehr auf, wenn die Tiere die gleiche Behandlung in der
chronischen Phase der TME erfuhren. Es scheint sich folglich im Verlauf der
Erkrankung auch nach Applikation von anti-IL-10R-Antikörper eine Reduktion der
peripheren, virusspezifischen T-Zell-Antwort einzustellen, die möglicherweise auf
einen immunologischen Erschöpfungszustand zurückzuführen ist (FREBEL et al.,
2010). Dagegen spricht allerdings, dass der relative Anteil an CD8+-T-Zellen an Tag
49
nach
der
Infektion
in
der
vorliegenden
Studie
aufreguliert
war.
Ein
immunologischer Erschöpfungszustand geht in der Regel nicht nur mit einer
funktionellen Störung der T-Zellen sondern auch mit dem Verlust des proliferativen
Potentials und deutlicher oder vollständiger Reduktion der virusspezifischen CD8+-TZellpopulation einher (WHERRY et al., 2004; FREBEL et al., 2010). Außerdem war
die Expression von IL-2, TNF und IFN-y bei Tieren, die sowohl Antikörper als auch
TMEV erhielten an Tag 49 in der Milz und im Rückenmark nicht reduziert. Weitere
Untersuchungen sind notwendig, um zu klären, ob sich in der chronischen Phase der
TME im Rückenmark und/oder im peripheren Immunsystem tatsächlich ein
immunologischer Erschöpfungszustand einstellt und ob dieser durch die Blockade
der IL-10-Signalkaskade beeinflusst wird (KANEYAMA et al., 2014; TAKIZAWA et
al., 2014).
Darüberhinaus spielt ggf. auch die Sequestration von Entzündungszellen im Darm
durch die Kolitis eine Rolle für die schwache Modulation der Neuroinflammation.
Inwieweit die starke intestinale Entzündung durch Sekretion von chemotaktischen
Faktoren (z.B. Leukotrien B4) den Übertritt von Entzündungszellen in den Darm
fördert und gleichzeitig den Übertritt ins ZNS reduziert, bleibt spekulativ (PETERSGOLDEN und HENDERSON, 2007).
Diskussion
6.7
143
Interleukin-10 und andere Autoimmunkrankheiten
Abschließend soll darauf hingewiesen werden, dass IL-10 nicht nur eine bedeutende
Rolle bei der IBD und der TME sowie bei diversen anderen Infektionskrankheiten
spielt, sondern auch für weitere immunpathologische Prozesse in verschiedenen
Organsystemen von zentraler Bedeutung ist.
Auch für MS-Patienten wurde bereits beschrieben, dass mononukleäre Zellen des
peripheren Blutes eine verminderte Expression von IL-10 und erhöhte Spiegel an
proinflammatorischen Zytokinen wie z.B. IL-6 aufweisen (PATANELLA et al., 2010;
IRELAND et al., 2012; ROMME CHRISTENSEN et al., 2012). Entsprechend
bewirken mehrere MS-Therapeutika wie Interferon-β und Glatirameracetat u.a. eine
Verstärkung der IL-10- und z.T. auch IL-10R-Expression und beeinflussen hierdurch
den Verlauf der Erkrankung positiv (PUTHETI et al., 2003; LIU et al., 2012;
KVARNSTROM et al., 2013).
Ähnlich wie bei MS weisen auch Patienten mit Rheumatoider Arthritis und Asthma
eine deutlich verminderte Expression von IL-10 auf (LAPADULA et al., 1995;
BORISH et al., 1996). Meta-Analysen zeigen außerdem beim MC oder der CU einen
kausalen Zusammenhang zwischen Polymorphismen des IL-10-Gens und anderen
Erkrankungen, die in Tabelle 6-1 zusammengefasst dargestellt werden.
Interessanterweise gehen jedoch nicht alle Autoimmunkrankheiten mit einer
Verminderung der IL-10 Expression einher. Beispielsweise ist die Expression von IL10 im Serum von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) deutlich
erhöht und beeinflusst die Produktion von Autoantikörpern im Verlauf der Erkrankung
(LLORENTE et al., 1994; HAGIWARA et al., 1996; HORWITZ et al., 1998; SUN et
al., 2012). LLORENTE et al. (1995) zeigen, dass SCID (Severe combined
Immunodeficiency)-Mäuse
nach
Übertragung
von
peripheren
mononukleären
Blutzellen von SLE-Patienten weniger Autoantikörper bilden, wenn sie zuvor anti-IL10-Antikörper erhalten. Die Autoren schlussfolgern daraus, dass IL-10 eine zentrale
Rolle bei der Induktion von Autoantikörpern beim SLE spielt (LLORENTE et al.,
1995). Auch in klinischen Studien mit SLE-Patienten führt eine Applikation des
Diskussion
144
Antikörpers zu einer Linderung der klinischen Haut- und Gelenkssymptomatik, die mit
einer
verminderten
Hyperaktivität
des
Immunsystems
und
partieller
Wiederherstellung der T-Zellfunktion einhergeht.
Im Gegensatz zum Tiermodell wird beim Menschen die Menge zirkulierender DNSAutoantikörper jedoch nicht reduziert. Die Autoren postulieren deshalb, dass IL-10
beim humanen SLE eine weitaus komplexere Rolle spielt als bei der Maus
(LLORENTE et al., 2000). Vermutlich unterdrückt IL-10 beim SLE des Menschen die
Differenzierung und Funktion von dendritischen Zellen und wirkt aktivierend auf
Endothelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten und B-Zellen, obwohl es unter
physiologischen Bedingungen größtenteils antiinflammatorische Eigenschaften erfüllt
(LLORENTE et al., 2003; SABAT et al., 2010; SUN et al., 2012).
Tabelle 6-1:
Übersicht über inflammatorische Erkrankungen, die
mit Polymorphismen des Interleukin-10-Gens
assoziiert sind
Erkrankung
Asthma
Psoriasis
Systemischer Lupus erythematodes
Rheumatoide Arthritis
Tuberkulose
Referenz
ZHENG et al., 2014
HYUN et al., 2013
LIU et al., 2013
NIE et al., 2012
CHATTERJEE et al., 2005
KINGO et al., 2003
SONG et al., 2013
ZHOU et al., 2013
NATH et al., 2005
YING et al., 2011
DE PAZ et al., 2010
PARADOWSKA-GORYCKA et al., 2010
LIANG et al., 2014
MEENAKSHI et al., 2013
ZHANG et al., 2011
ANSARI et al., 2009
Tabelle 6-1: Bei den Polymorphismen handelt es sich um drei Einzelnukleotid-Polymorphismen
(single nucleotide polymorphisms, SNP) in der Promoterregion des Interleukin-10-Gens, die mit der
Bildung von überwiegend drei verschiedenen Haplotypen (GCC, ACC, ATA) einhergehen.
Modifiziert nach TRIFUNOVIC et al., 2015.
Diskussion
6.8
145
Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie unterstreichen die pleiotropen Eigenschaften
von IL-10 und seine Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase im
gesunden Organismus sowie bei der TME.
Nach systemischer Applikation von anti-IL-10R-Antikörpern entwickeln nicht infizierte
SJL-Mäuse innerhalb von 14 Tagen eine progressiv-verlaufende Typhlokolitis, deren
Schweregrad durch eine zusätzliche intrazerebrale Applikation von TMEV temporär
verstärkt wird, ohne dass Virusantigen im Darm nachweisbar ist. Diese Exazerbation
der immunpathologischen Prozesse ist möglicherweise auf virusspezifische EffektorT-Zellen
und
Mechanismen
eine
erhöhte
wurden
bereits
Zytokinexpression
für
zurückzuführen.
Influenza-A-Virus-Infektionen
bei
Ähnliche
Mäusen
beschrieben (WANG et al., 2014). Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die
zu Grunde liegenden Pathomechanismen näher zu charakterisieren und um zu
ermitteln, warum SJL- im Vergleich zu C57BL/6-Mäusen wesentlich empfänglicher
für die Entwicklung von zentralen und peripheren immunpathologischen Prozessen
sind. Fraglich bleibt, ob proinflammatorische CX3CR1high-Makrophagen eine Rolle in
der Pathogenese der Kolitis bei SJL-Mäusen spielen und ob ihre Anzahl durch eine
zusätzliche TMEV-Infektion beeinflusst wird (ZIGMOND et al., 2014).
Eine direkte Verabreichung des anti-IL-10R-Antikörpers in das ZNS mittels
Mikroinfusionspumpen könnte Aufschluss darüber geben, ob das Ausbleiben eines
protektiven
Verfügbarkeit
Effekts
des
nach
systemischer
Antikörpers
im
ZNS
Applikation
auf
zurückzuführen
eine
ist
mangelhafte
oder
ob
eine
Unterbrechung der IL-10-Signalkaskade die antivirale Immunität bei der TME
tatsächlich nicht erhöht, weil andere Mechanismen vorherrschen und die Elimination
bzw. Reduktion von TMEV im ZNS unterbinden.
Nicht zuletzt untermauern die Ergebnisse dieser Arbeit, dass eine Modulation der
Entzündung durch Zytokin- oder -Rezeptor-blockierende Antikörper immer das Risiko
überschießender Immunreaktionen und nicht zu erwartender Nebenwirkungen in
genetisch prädisponierten Individuen birgt. Trotz des großen Potentials für die
Diskussion
Therapie
146
von
Autoimmunkrankheiten
und
chronischen
Infektionen
sollten
Zytokintherapien deshalb nur mit Vorsicht und nach Kenntnis der zu Grunde
liegenden Signalwege durchgeführt werden.
Zusammenfassung
7
147
Zusammenfassung
Untersuchung des Einflusses von Interleukin-10 auf den Verlauf der
experimentellen Theilervirusinfektion in SJL-Mäusen
Ann-Kathrin Uhde
Bei
der
Theiler´schen
murinen
Enzephalomyelitis
(Theiler´s
murine
encephalomyelitis, experimentelle Theilervirusinfektion, TME) handelt es sich um ein
anerkanntes Tiermodell für die Multiple Sklerose (MS). Nach intrazerebraler Infektion
mit
dem
Theiler´schen
murinen
Enzephalomyelitisvirus
(Theiler´s
murine
encephalomyelitisvirus, TMEV) entwickeln SJL-Mäuse in der Frühphase der
Erkrankung
eine
akute
Polioenzephalitis
gefolgt
von
einer
chronisch-
demyelinisierenden Leukoenzephalomyelitis mit Persistenz des Virus im Zentralen
Nervensystem (ZNS). Im Gegensatz zu anderen Mausstämmen wie C57BL/6 und
einigen BALB/c-Substämmen sind SJL-Mäuse nicht in der Lage, TMEV vollständig
aus dem ZNS zu eliminieren. Die Ursache ihrer insuffizienten, antiviralen
Immunantwort ist weitestgehend unklar, vorausgegangene Studien zeigen jedoch,
dass SJL- im Vergleich zu C57BL/6-Mäusen deutlich höhere Mengen an Interleukin
(IL)-10 exprimieren. Da IL-10 durch seine überwiegend antiinflammatorischen
Eigenschaften einerseits hemmend auf die antivirale Immunität wirken könnte,
andererseits aber immunpathologische Prozesse potentiell verhindert, war es das
Ziel der vorliegenden Arbeit, den Einfluss von IL-10 auf die Immunhomöostase nichtinfizierter SJL-Mäuse (1. Versuchsteil) sowie den Verlauf der akuten (2. Versuchsteil)
und chronischen Phase (3. Versuchsteil) der TME näher zu charakterisieren.
Hierzu erhielten SJL-Mäuse an Tag 0, 7, 14 und 21 (1. und 2. Versuchsteil) bzw. an
Tag 35 und 42 (3. Versuchsteil) nach Versuchsbeginn systemisch anti-IL-10Rezeptor (IL-10R)-Antikörper. Tiere aus den Infektionsversuchen wurden zusätzlich
an Tag 0 intrazerebral mit TMEV oder virusfreiem Trägermedium infiziert (2. und 3.
Versuchsteil). Mittels klinischer Untersuchung, Histologie, Immunhistologie zum
Nachweis von TMEV-, CD3-, CD45R-, Foxp3-, CD107b-, Arginase-1-, basischem
Myelinprotein
(myelin
basic
protein,
MBP)-
und
nicht-phosphorylierendem
Neurofilament (np-NF)-Antigen sowie quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (IL-1α,
Zusammenfassung
148
IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, Foxp3, TNF, IFN-γ, TGF-β1 und TMEV) und
Durchflusszytometrie (CD3, CD19, CD4, CD8, CD44, CD69 und Foxp3) wurde
ermittelt,
wie
sich
die
anti-IL-10R-Antikörperapplikation
auf
das
periphere
Immunsystem und den Verlauf der TME auswirkt.
Nach Applikation des anti-IL-10R-Antikörpers entwickelten nicht-infizierte SJL-Mäuse
(1. Versuchsteil) eine progressive, lymphoplasmazelluläre, teils granulozytäre Kolitis
mit konsekutiver Reduktion der CD4+ Foxp3+ regulatorischen T-Zellen (Treg) und
Erhöhung
des
geometrischen
Mittelwerts
der
Fluoreszenz-Intensität
(gMFI,
geometric mean of fluorescence intensity) von CD69 auf CD4+- und CD8+-T-Zellen
und CD44 auf CD8+-T-Zellen in der Milz. Diese phänotypischen Veränderungen
lassen darauf schließen, dass eine Blockade des IL-10R die Aktivierung von EffektorT-Zellen verstärkt, die periphere Immuntoleranz stört und die Entwicklung von
immunpathologischen Prozessen fördert.
Die
Entwicklung
der
Kolitis
nach
Applikation
des
IL-10R-Antikörpers
ist
pathogenetisch vermutlich auf eine Aufregulation der MHC-Klasse-II-Komplexe und
erhöhte Zytokinspiegel mit konsekutivem Verlust der peripheren Toleranz und
Etablierung
einer
Immunreaktion
gegenüber
kommensalen
Mikroorganismen
zurückzuführen. Zusätzlich spielen möglicherweise auch proinflammatorische
Makrophagen eine Rolle in der Pathogenese. Interessanterweise führte eine
zusätzliche, intrazerebrale TMEV-Infektion zu einer Verstärkung der Kolitis in der
Frühphase der TME an Tag 14, ohne dass TMEV-Antigen im Darm nachweisbar war
(2. Versuchsteil). Diese Exazerbation der intestinalen Erkrankung ging mit einer
Aufregulation von IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF, IFN-γ und TGF-β1 sowie einer
zusätzlichen Erhöhung des gMFI von CD69 und CD44 auf CD8+- und CD4+-T-Zellen
in der Milz einher. Da die genauen Mechanismen der Interaktion von ZNS und Darm
bisher unklar sind, sind weitere Untersuchungen notwendig, um zu bestimmen, ob
möglicherweise virusspezifische Effektor-T-Zellen in den Darm migrieren und dort die
Immunhomöostase stören.
Obwohl SJL-Mäuse hinsichtlich der gastrointestinalen Manifestation sehr sensibel
auf eine Immunmodulation durch anti-IL-10R-Antikörper reagierten, beeinflusste eine
Zusammenfassung
149
Applikation des anti-IL-10R-Antikörpers bei gleichzeitiger TMEV-Infektion den Verlauf
der TME im Rückenmark nicht, wenn der Antikörper in der Frühphase der
Erkrankung (0 bis 21 Tage nach Infektion, 2. Versuchsteil) verabreicht wurde.
Allerdings führte die Verabreichung des anti-IL-10R-Antikörpers in der chronischen
Phase der TME (Tag 35 bis 42, 3. Versuchsteil) bei gleichbleibender Viruslast zu
einer vermehrten Infiltration von CD3+ T-Zellen in das Rückenmark, was die
Annahme unterstützt, dass eine Blockade der antiinflammatorischen IL-10Signalkaskade die zentrale Immunantwort nach TMEV-Infektion tendenziell verstärkt.
Die relativ schwache und phasenspezifische Modulation der antiviralen Immunität im
ZNS ist möglicherweise auf i) eine Kompartimentalisierung der Entzündung bei
geschlossener Blut-Hirn-Schranke (BHS), ii) die Entwicklung eines immunologischen
Erschöpfungszustandes im Verlauf der TME oder iii) die Sequestration von
Entzündungszellen
im
entzündeten
Dickdarm
zurückzuführen.
Weitere
Untersuchungen zur Integrität der BHS bei der TME unter dem Einfluss einer IL-10R
Blockade und eine direkte Applikation des anti-IL-10R-Antikörpers in das ZNS in
Folgestudien könnten Aufschluss darüber geben, ob ursächlich eine mangelnde
Verfügbarkeit des Antikörpers im ZNS zu Grunde liegt oder ob zusätzliche
Mechanismen die Etablierung einer effektiven Immunantwort in SJL-Mäusen
unterdrücken.
Abschließend unterstreichen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die Bedeutung
von IL-10 für die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase sowohl in gesunden,
genetisch empfänglichen Individuen als auch bei der TME. Darüber hinaus
untermauern sie die Relevanz autonomer immunpathologischer Prozesse im ZNS
(Kompartimentalisierung) bei chronisch-infektiösen Erkrankungen, da ausgeprägte
Imbalanzen der peripheren Immunantwort die Immunpathologie im ZNS nur marginal
und phasenspezifisch beeinflussen.
Summary
8
150
Summary
Investigation of Interleukin-10 in Theiler´s murine encephalomyelitis
Ann-Kathrin Uhde
Theiler´s murine encephalomyelitis (TME) is a well-recognized animal model for
multiple sclerosis (MS). After intracerebral infection with Theiler´s murine
encephalomyelitis virus (TMEV) SJL mice develop an early acute polioencephalitis
followed by chronic demyelinating leucoencephalomyelitis with persistence of the
virus within the central nervous system (CNS). In contrast to other mouse strains, like
C57BL/6 and some BALB/c substrains, SJL mice are unable to eliminate the virus
from the CNS. The reasons for the insufficient antiviral immunity in SJL mice are still
uncertain, but former studies indicate a higher expression of Interleukin-10 (IL-10) in
the brain of SJL mice compared to C57BL/6 mice following TMEV-infection. In
consequence of its anti-inflammatory functions, IL-10 has the potential to inhibit the
antiviral immunity on the one hand, but reduces immunopathology on the other.
Therefore it was the aim of the present study to determine the influence of IL-10
receptor (IL-10R) blockade on the immune homeostasis of non-infected SJL mice
(experiment 1) and the course of acute (experiment 2) and chronic (experiment 3)
TME.
SJL mice received systemic rat anti-mouse-IL-10R antibodies at day 0, 7, 14 and 21
(experiment 1 and 2) or at 35 and 42 (experiment 3), respectively. Animals from
infection experiments (experiment 2 and 3) were additionally intracerebrally infected
with
TMEV
or
vehicle
only
at
day
0.
Clinical
examination,
histology,
immunohistochemistry for TMEV-, CD3-, CD45R-, Foxp3-, CD107b-, arginase 1-,
myelin basic protein (MBP)- and non-phosphorylated neurofilament (np-NF)-antigen
as well as quantitative polymerase chain reaction (IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10,
Foxp3, TNF, IFN-γ, TGF-β1 and TMEV) of spleen and spinal cord and flow cytometry
(CD3, CD19, CD4, CD8, CD44, CD69 and Foxp3) of spleen samples were used to
determine the impact of systemic IL-10R blockade on the spinal cord and peripheral
organs of non-infected and infected animals.
Summary
151
Weekly application of anti-IL-10R antibodies led to the development of a progressive,
lymphoplasmacytic to granulocytic colitis with consecutive reduction of CD4+ Foxp3+
regulatory T cells (Treg) in the spleen of non-infected SJL mice (experiment 1).
Simultaneously, an increase of the geometric mean of fluorescence intensity (gMFI)
for CD44 gated on CD8+ T cells and CD69 gated on CD4+ and CD8+ T cells was
observed in spleen samples. These phenotypical changes in the periphery indicate
an activation of effector T cells and subsequent disturbances of the immune
homeostasis with development of immunopathological processes.
The colitis was probably caused by an upregulation of MHC class II molecules and
increased levels of proinflammatory cytokines with consecutive loss of peripheral
tolerance and establishment of an immune response against commensal microbiota
of the gut. Additionally, proinflammatory macrophages might also play a role in the
pathogenesis of colitis. Most interestingly, additional intracerebral TMEV-infection
was associated with a significantly increased severity of the intestinal inflammation at
14 days post infection (dpi, experiment 2). TMEV antigen was not detected in the
intestine by immunohistochemistry, indicating a peripheral immune enhancement by
CNS-restricted infection. The exacerbation of enteric disease was accompanied by
an upregulation of IL-1α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF, IFN-γ and TGF-β1 in the spleen
as well as an increase of the gMFI of CD69 and CD44 gated on CD8+ and CD4+ T
cells. Further studies are needed to determine whether virus-specific effector T cells
might play a role for disturbances of the enteric immune homeostasis after TMEV
infection and to determine the underlying mechanisms of brain-gut interaction.
Although SJL mice seemed to be highly susceptible for IL10R-deficiency mediated
systemic immunopathology, early application of anti-IL-10R-antibodies (0 to 21 dpi;
experiment 2) was unable to alter the disease course of acute TME. Nevertheless,
administration of anti-IL-10R antibody in the chronic TME phase (35 to 42 dpi,
experiment 3) led to an enhanced infiltration of CD3 + T cells into the spinal cord at 49
dpi without affecting antiviral immunity. Thus, it can be concluded that blocking of
anti-inflammatory IL-10R signaling is able to enhance CNS immune responses in
TME in a disease phase-specific manner. The comparatively weak and phase-
Summary
152
specific modulation of the immune reaction in the CNS might be caused by i) a
compartmentalization of inflammation within the CNS supported by an intact blood
brain barrier, ii) establishment of T cell exhaustion or iii) sequestration of immune
cells in the inflamed intestine. Further studies on the blood brain barrier integrity in
TME and antibody delivery systems are necessary to determine whether the limited
effect of antibody treatment is caused by low availability in the CNS or by additional
mechanisms which prevent an effective antiviral immune response in SJL mice after
TMEV infection.
In conclusion, IL-10R neutralization causes a breakdown of peripheral immune
tolerance in genetically predisposed mice, which leads to immune-mediated colitis,
resembling inflammatory bowel disease. The hyperactive immune state following IL10R blockade is enhanced by CNS-restricted viral infection in a disease phasedependent
manner.
Moreover,
findings
emphasize
the
importance
of
compartimentalized CNS inflammation for TME pathogenesis, as currently discussed
for MS patients.
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Causes Severe Spontaneous Colitis.
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strain of Theiler´s murine encephalomyelitis virus.
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Cell-penetrating peptide-mediated therapeutic molecule delivery into the central
nervous system.
Curr. Neuropharmacol. 11, 197-208
Anhang
201
10
Anhang
10.1
Bezugsquellen für Chemikalien, Reagenzien und
Antikörper
Bio-Rad AbD Serotec GmbH, Puchheim, Deutschland
Rat anti Mouse CD107b, clone: M3/84, # MCA2293B
Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland
Brilliant III Ultra-Fast SYBR® QPCR Master Mix, # 600882
Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Deutschland
Bepanthen® Augen- und Nasensalbe
BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland
Purified Rat Anti-Mouse CD45R BD PharmingenTM, clone: RA3-6B2, # 553086
V500 Rat anti-Mouse CD8a, clone: 53-6.7, # 560776
BioLegend, London, UK
Non phosphorylated Neurofilament Antibody, clone: SMI 311, # 837801
Pacific Blue™ anti-mouse CD4 Antibody, clone: GK 1.5, # 100427
APC anti-mouse/human CD44 Antibody, clone: IM7, # 103011
FITC anti-mouse CD69 Antibody, clone: H1.2F3, # 104505
Anhang
202
BioXCell, West Libanon, USA
anti m CD16/32, clone: 2.4G2, # CUS-HB-197
InVivoMAb anti m IL-10R, clone: 1B1.3A, # BE0050
InVivoMAb Rat IgG1 Isotype control; anti Horseradish Peroxidase, clone: HRPN, #
BE0088
Biozym, Hessisch Oldendorf, Deutschland
Biozym LE Agarose, # 840004
B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland
NaCl 0,9% B. Braun, Ecotainer® PP Flasche 500 ml
Camon Labor-Service GmbH, Wiesbaden, Deutschland
Biotinylated Rabbit Anti-Goat IgG Antibody, Vecor laboratories, # BA-5000
Biotinylated Rabbit Anti-Rat IgG Antibody, Vector laboratories, # BA-4000
Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG Antibody, Vector laboratories, # BA-9200
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, Vector laboratories, # BA-1000
Vectastain® ABC Kit Standard, Vector laboratories, # PK-6100
Chemicon International, Hofheim am Taunus, Deutschland
Mouse Anti-Alzheimer Precursor Protein A4 monoclonal antibody, clone: 22C11, #
MAB348
Chroma GmbH + Co. KG, Münster
Kresylechtviolett, # 1A 396
Luxolechtblau MBS, # 1B 389
Anhang
203
DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland
Anti-Human CD3, Polyclonal Rabbit, # A 0452
Dianova GmbH, Hamburg, Deutschland
IgG from Rat (polyclonal)-unconj., # 012000003
eBioscience, Frankfurt, Deutschland
Anti-Mouse CD3e PE-Cyanine7, clone: 145-2C11, # 25-0031-81
Anti-Mouse CD19 PE-eFluor® 610, clone: eBio1D3, # 61-0193-80
Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5, clone: BM8, # 45-4801-80
Anti-Mouse/Rat Foxp3 Purified, clone: FJK-16s, # 14-5773-80
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE, clone: FJK-16s, # 12-5773-82
Fixation/Permeabilization Concentrate, # 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent, # 00-5223-56
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set, # 00-5523-00
Invitrogen GmbH, Darmstadt, Deutschland
dATP solution, 100mM, # 10216-018
dCTP solution, 100mM, # R0151
dGTP solution, 100mM, # 18332-015
dTTP solution, 100mM, # 10219012
LIVE/DEAD® Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation, # L-23105
RNaseOUTTM Recombinant Ribonuclease Inhibitor, # 10777-019
Taq DNA Polymerase PCR Buffer, 10x, # 18067-017
Anhang
204
Jackson Immuno Research, Suffolk, UK
Chrom Pure Rat IgG, whole molecule, 40 µg/ml, # 012-000-003
Life Technologies, Darmstadt, Deutschland
ACK Lysing Buffer GibcoTM, # A10492-01
CellTraceTM Violet Cell Proliferation Kit, # C34557
Phosphate-Buffered Salines (10x) GibcoTM, pH 7.4, # 70011-036
Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Norderstedt, Deutschland
Venno® Vet 1 super
Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland
Natriumchlorid (NaCl); # 6404
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4); # 6346
Natronlauge (NaOH, 1M); # 9137
Rabbit Anti-Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody, # AB5864
MWG-Biotech AG, Ebersberg, Deutschland
Primersynthese für die PCR
New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland
2-lod-DNA ladder, 0.1 – 10.000 kb, # N0469 S
Anhang
205
https://www.neb.com/products/n3200-2-log-dna-ladder-01-100-kb
07.07.2015
PAA Laboratories, Cölbe, Deutschland
Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM), low glucose, # E15-080
Pfizer, Karlsruhe, Deutschland
Domitor®, Medetomidin Hydrochlorid, 1,0 mg/mL, # 140-999
Promega, Madison WI, USA
Random Primers, # C118A
Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland
Omniscript® Reverse Transcriptase Kit, # 205111
QIAGEN RNase Inhibitor, # 129916
QIAzolTM Lysis Reagent, # 79306
RNeasy® Mini Kit, # 74106
Anhang
206
RNase-Free DNase Set, # 79254
Ratiopharm, Ulm, Deutschland
Heparin-Natrium, 5000 I.E./0,2ml
Roche, Mannheim, Deutschland
AmpliTaq® DNA-Polymerase, 5U/µl, # 58002040-01
Roth C. GmbH und Co KG, Karlsruhe, Deutschland
Ethanol, 96%, # P075.1
Hämalaunlösung sauer nach Mayer, # T865.1
ROTICLEAR®, # A538.1
ROTI®-HistoKit ll, # T160.1
ROTI®-Histol, # A6640
ROTILABO®-Aluminium-Rundlinge R80, # E723.1
ROTIPURAN® Essigsäure-N-Butylester (EBE), # P036.1
ROTIPURAN®, Ethanol, 70%, # T868.1
ROTIPURAN®, 2-Methylbutan/ Isopentan, # 3926.1
ROTISOLV®, 2-Propanol/ Isopropanol, # 7343.2
ROTISOLV® Trichlormethan/ Chloroform, # 4432.1
Zitronensäure-Monohydrat, p.a., # 3958.1
R & D Systems; Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland
Paraformaldehyd; # 76240
Anhang
207
Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, Niederlande
Tissue-Tec® O.C.T.TM Compound, # 4583
Santa Cruz Biotechnology® Inc., Heidelberg, Deutschland
Arginase I Antibody, clone: N-20, # sc-18351
SERVA Electrophoresis GmbH, Hamburg
Ethylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) p.a., # 11280
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
3,3`-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB)-Dihydrat purum, p.a., # 32750
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, # A2058-1G
Diethylpyrocarbonat (DEPC), # 32490
DNase/RNase freies Wasser, # W4502-1L
Ethidiumbromid, # 46067-50ML-F
Fetal Bovine Serum, USA origin, sterile-filtered, # F2442
Gentamycin, 10 ml, # 613974
Mouse Serum, # M5905
Rabbit Serum, # R9133
Rat Serum, # R9759
Tris (hydroxymethyl-)aminomethane, # 93352
Trypan Blue solution, 0,4%, for microscopy, # 93595
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Klinik für kleine Klauentiere,
Hannover, Deutschland
Ziegennormalserum
Anhang
208
Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland
DNA Gel loading dye (6x), # R0611
VWRTM International GmbH, Darmstadt, Deutschland
Borsäure krist. reinst, # 1.00160
Eosin (gelblich), # 1.15935.0100
Hämatoxylin krist., # 1.15938.0100
Natriumhydroxid-Plätzchen p.a., # 1.06498.1000
Natriumhypochlorid-Lösung, # 1.05614
Perhydrol® Hydrogen Peroxide, H2O2, 30%, # EM.1.07210.1000
WDT Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG, Garbsen,
Deutschland
Ketamin, 10%, 100mg/ml
Anhang
209
10.2 Bezugsquellen für Geräte, Software und Einmalartikel
Adobe Systems, Inc., San Jose, CA
Adobe Photoshop 7.0
Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Deutschland
Baby-Metzenbaumschere gebogen, # BC603-R
Irisschere gebogen, # BC111
Pinzette anatomisch, # BD 320-R
Pinzette anatomisch gebogen, # BD035-R
Pinzette nach Graeffe, # OC100-R
Skalpellhalter, # BB084-R
Skalpellklingen, # BB522
Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland
Stratagene MX3005P QPCR System
Optical strip caps (8x Strip), # 401427
Optical tube strips (8x Strip), # 401428
Biometra biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen
Biodoc Analyse System
Biometra, biomedizinische Analytik Jena, Jena, Deutschland
Thermomocycler T3 Gradient
Anhang
210
Bio-Rad Laboratories, Inc.; München
Elektrophoresekammer Wide Mini-Sub Cell GT Cell (10 x 15 cm)
BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland
BD LSR-II SORP Zytometer
B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland
Omnican® Einmal-Feindosierungsspritzen, 1ml
Consort N.V., Turnhout, Belgien
Mikrocomputer "Elektrophoresis Power Supply", E 425
Data weighing systems Inc., Elk Grove, USA
Feinwaage PT210
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
50-1000 µl ep Dualfilter T.I.P.S.®, # 0030073304
20-200 µl ep Dualfilter T.I.P.S.®, # 0030073266
0,1-2 µl ep Dualfilter T.I.P.S.®, # 0030073002
Eppendorf Zentrifuge 5417R
Pipette Reference 10μl
Pipette Reference 100μl
Pipette Reference 1000μl
Pipette Research 20μl
Anhang
211
Pipette Research 200μl
GFL - Gesellschaft für Labortechnik mbH; Burgwedel
Wasserbad; # 1092
GraphPad Software, La Jolla, USA
GraphPad Prism Software 6.0
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland
Cellstar® Polypropylene Tubes, 50 ml, # 227 261
Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz
Hamilton Mikroliter Syringe, Model 705N SYR, # 80565
Jürgens, Bremen, Germany
Magnetrührer Ika-Combimag RTC
Kendro Laboratory Products GmbH (formerly Heraeus), Langenselbold,
Deutschland
Heraeus LaminAir® Sterilwerkbank, HLB 2472 GS
Heraeus Wärmeschrank UT 6
Keutz Laborgeräte, Reiskirchen, Deutschland
Flachgel-Elektrophoresekammer Midi, horizontal, # 0030191-00
Gießvorrichtung, # 0030191-03
Anhang
212
Keyence, Mechelen, Belgien
Keyence BZ-9000 Hellfeld-Phasenkontrast- Fluoreszenz-Mikroskop
Keyence Messmodul-Software
Knittel W. Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig, Deutschland
Deckgläser (24 x 50 mm)
Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Deutschland
Färbeautomat, Leica ST 4040
Mikrotom, Leica RM2035
Medite Medizintechnik, Burgdorf, Deutschland
Eindeckautomat, Promounter RCM 2000
Menzel Gläser, Glasbearbeitungswerke GmbH & Co KG, Braunschweig,
Deutschland
SuperFrost® Plus-Objektträger, # J1800AMNZ
Peqlab Biotechnologie, VWR International GmbH, Erlangen, Deutschland
NanoDrop ND-1000 Spektralphotometer
Roth C. GmbH und Co KG, Karlsruhe, Deutschland
Deckgläser (für Neubauer Zählkammer), # L189.1
Neubauer Improved Zählkammer, # T729.1
Parafilm, 50 mm breit; # H951.1
Anhang
213
ROTILABO®, Aluminium foil disks, # E723.1
Rotiprotect® Nitril-Handschuhe, # P777.1
Sarstedt AG und Co, Nümbrecht, Deutschland
Mikrovette CB 300 Z, # 16440
Multiply® PCR-Einzelgefäße, 0,5ml; # 72.735.002
Reaktionsgefäße 1,5 ml, # 72.690
Reaktionsgefäße 2,0 ml, # 72.695
Vernichtungsbeutel 200 x 300 mm, # 86.1197
SAS, Cary, USA
Statistical analysis software SAS 9.3
Enterprise Guide 5.1 für Windows
Süd-Laborbedarf GmbH, Gauting, Deutschland
Omni TipTM Tissue Homogenizing Kit, Modell TH220
Omni Tip®-Dispengierwerkzeug, # 0934750
Systec GmbH, Wettenberg, Deutschland
Autoklav 3850 ELC
Terumo Europe, N.V., Leuven, Belgien
1cc Terumo® Tuberculin Syringe without needle, 0.01cc, # SS-01T
Terumo Neolus® Einwegkanülen (Luer-Lock), 26-G x 1/2“ (0,45 x 12 mm), # NN2613R
Terumo Neolus® Einwegkanülen (Luer-Lock), 23-G x 1“ (0,6 x 25 mm), # NN-2325R
Anhang
214
Tecniplast Deutschland GmbH, Hohenpeißenberg, Deutschland
Edelstahl Gitterdeckel, # 1284L189
Edelstahl-Kartenhalter, # ACPC10575VS
H-Temp (Polysulfon) Käfig Eurostandard: Typ II L, # 1284L00SUV
H-Temp SealSafe Haube, # 1284L452SU
SealSafe-IVC-Systemgestell, # 2L96MAC20CA
SlimLine-Gebläseeinheit, # BOXUNCP04
Tränkeflasche 260 ml, # ACBT0262
Tränkekappe, # ACCP6521
Thermo Electron GmbH, Karlsruhe, Deutschland
ShandonTM Coverplates®, # 72-110-017
ShandonTM Sequenza® Slide Racks, # 7331017
Thermo Fischer Scientific, Langenselbold, Deutschland
Heraeus Zentrifuge Biofuge 13
NanoDrop 1000 Spectrophotometer V3.7
Tree Star, Ashland, USA
FlowJo software, version 9.6.4
TSE Systems GmbH, Bad Homburg v. d. Höhe, Deutschland
PC-Anschluß-Set für Drehstab (Rotarod Treadmill), # 337500-C-E
RotaRod Treadmill für 5 Mäuse, # 337500-M/E-A
Ziegra-Eismaschinen GmbH, Isernhagen
Eismaschine ZBE 70-35
Anhang
215
10.3 Bezugsquelle für die Tiere
Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland
Weibliche, SPF-freie SJL/J HanHsd-Mäuse, 4 Wochen alt
Anhang
216
10.4 Lösungen und Puffer
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB)-Lösung
0,1 g DAB
200 ml PBS
200 μl Wasserstoffperoxid (H2O2) 30%
Diethyldicarbonat (DEPC)-Wasser
1 ml Diethylpyrocarbonat (DEPC)
ad 1000 ml Aqua bidest.
über Nacht rühren bis zur vollständigen Lösung
Kresylechtviolett (KEV)-Lösung
Stammlösung:
0,1 g Kresylechtviolett
100 ml Aqua dest.
Gebrauchslösung:
5 Tropfen 10%ige Essigsäure
ad 30 ml Stammlösung
Luxol Fast Blue (LFB)-Lösung
0,1 g Luxolechtblau
100 ml Ethanol, absolute
0,5 ml Essigsäure 10%
Natronlauge-Maßlösung (1 mol/l)
40 g Natriumhydroxid (NaOH)
ad 1 l Aqua dest.
Anhang
217
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline; PBS)
40,00 g Natriumchlorid (NaCl)
8,97 g Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 · H2O)
ad 5 l Aqua dest.
mit Natronlauge-Maßlösung (1 mol/l) auf pH 7,1 einstellen
Trisaminomethan-Borat-Ethylendiamin-tetraessigsäure (TBE)-Puffer (1%)
Stammlösung:
108,8 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
55,0 g Borsäure
40 ml 0,5 M Na2-EDTA-Lösung
ad 1 l Aqua dest.
autoklavieren (0,3 atü, 120°C, 20 Minuten)
Gebrauchslösung (1%ig):
100 ml Stammlösung
ad 900 ml Aqua dest.
Trisaminomethan-Borat-Ethylendiamin-tetraessigsäure (TBE)-Agarosegel (1%)
1 g Agarose
ad 100 ml 1x TBE-Puffer
3 min in der Mikrowelle aufkochen
abkühlen lassen
2,5 μl Ethidiumbromid hinzufügen
in Gießstation gießen, ca. eine Stunde bei Raumtemperatur trocknen
Natrium-Zitrat-Puffer
2,1 g Zitronensäure-Monohydrat (C6H8O7 · H2O)
ad 1 l Aqua dest.
mit Natronlauge-Maßlösung (1 mol/l) auf pH 6,0 einstellen
Anhang
218
10.5 Abkürzungsverzeichnis
ABC-Methode
Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode
ACTH
Adrenocorticotropes Hormon
ADH
Antidiuretisches Hormon
APC
Antigenpräsentierende Zellen (antigen presenting cell)
A. bidest.
Aqua bidestillata
A. dest.
Aqua destillata
BHS
Blut-Hirn-Schranke, blood brain barrier
Bcl-2
B-cell lymphoma protein 2
Bcl-xl
B-cell lymphoma-extra large protein
BCRP
Breast cancer Resistance Protein
BRS
Blut-Rückenmark-Schranke, blood spinal cord barrier
BSA
Bovines Serumalbumin
bzw.
beziehungsweise
°C
Grad Celsius
C57BL/6-Mäuse
C57 black-6-Mäuse
ca.
circa
CCL
chemokine (C-C motif) ligand
CCR
C-C chemokine receptor
CD
cluster of differentiation
cDNS
komplementäre DNS (complementary DNA, cDNA)
CDV
Kanines Staupevirus, Canine Distemper Virus
cm
Zentimeter
CMV
Cytomegalievirus
CRH
Corticotropin-releasing Hormone
CU
Colitis Ulcerosa
Anhang
219
CXCL
chemokine (C-X-C motif) ligand
DAB
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
DBA/2-Mäuse
Dilute Brown Non-Agouti/2-Mäuse
DEPC
Diethylpyrokarbonat
DMEM
Dulbecco´s Modified Eagle Medium
dNTP
Desoxyribonukleosidtriphosphate
DSS
Dextran-Sodium-Sulfat
EAE
Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis
EBE
Essigsäure-n-butylester
EBV
Epstein-Barr-Virus
EDTA
Disodium-Ethylendiamintetraacetat
ENS
Enterisches Nervensystem
evtl.
eventuell
FCS
Fetales Kälberserum (fetal calf serum)
FMO
Fluorescence minus one control
FoxP3
Forkhead-Box-Protein P3
g
Gramm
GALT
darmassoziiertes lymphatisches Gewebe
(gut-associated lymphoid tissue)
GAPDH
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
G-CSF
Granulozyten-kolonienstimulierender Faktor
(granulocyte colony stimulating factor)
ggf.
gegebenfalls
GM-CSF
Granulozyten-Monozyten-kolonienstimulierender Faktor
(granulocyte macrophage colony stimulating factor)
HANS-Achse
Hypothalamus-autonomes Nervensystem-Achse
HHN-Achse
Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse
Anhang
220
HIV
Humanes Immundefizienzvirus
HPRT
Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase
IBD
inflammatory bowel disease
ICAM
Intercellular Adhesion Molecule 1
IFN-α
Interferon-α
IFN-у
Interferon-у
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
iNOS
induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (inducible nitric oxide
synthase)
iTreg
induzierte regulatorische T-Zellen
Jak1
Januskinase 1
kb
Kilobasen
KO
Knock out
l
Liter
LAG-3
lymphocyte-activation gene 3
LCMV
Lymphozytäres Choriomeningitis Virus
LFB
Luxol Fast Blue
mA
Milliampere
MBP
basisches Myelinprotein (myelin basic protein)
MC
Morbus Crohn
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex
(major histocompatibility complex)
MHV
Maus-Hepatitis-Virus
ml
Milliliter
mM
Millimol
mm
Millimeter
µl
Mikroliter
Anhang
221
µm
Mikrometer
MOG
Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein
mRNS
messenger RNS
MRP
Multidrug Resistance Protein
MS
Multiple Sklerose
N.
Nervus
NaCl
Natriumchlorid
NaOH
Natriumhydroxid
NAWM
makroskopisch unveränderte Areale der weißen Substanz
(normal appearing white matter)
NF-κB
nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells
ng
Nanogramm
NK-Zellen
natürliche Killerzellen
NO
Stickstoffmonoxid
Nos2
Nitric oxide synthase 2
np-NF
Nicht-phosphorylierendes-Neurofilament
(non-phosphorylated neurofilament)
PBS
phosphate buffered saline
PBS/BSA
PBS mit Zusatz von 0,2% BSA
PCR
Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
PD-1
programmed cell death 1
PDL-1
programmed cell death ligand-1
PGI2
Prostaglandin I2
P-gp
Permeability glycoprotein
PLP
Proteolipid-Protein
PVN
paraventrikulärer Nukleus
RNS
Ribonukleinsäure
ROS
Reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species)
RT-qPCR
Reverse Transcriptase-quantitative PCR
Anhang
222
SCID-Mäuse
Severe combined Immunodeficiency-Mäuse
(Mangel an funktionsfähigen T- und B-Zellen)
SJL-Mäuse
Swiss Jim Lambert-Mäuse
SLE
Systemischer Lupus Erythematodes
STAT
Signal Transducer and Activator of Transcription
sTNFRs
lösliche TNF-Rezeptoren (soluble TNF receptors)
TCR
T-Zellrezeptor (T cell receptor)
TGF-ß
Transformierender Wachstumsfaktor ß
(Transforming growth factor-β)
Tim-3
T cell immunoglobulin and mucin protein 3
TME
Theiler`sche murine Enzephalomyelitis
(Theiler´s murine encephalomyelitis)
TMEV
Theiler´sches murines Enzephalomyelitisvirus
(Theiler´s murine encephalomyelitisvirus)
TNF
Tumornekrosefaktor (syn. Tumornekrosefaktor alpha, TNF-α)
Tr1-Zellen
Regulatorische T-Zellen vom Typ I
Treg
regulatorische T-Zellen
Trem1
Triggering receptor expressed on myeloid cells 1
Tyk2
Tyrosinkinase 2
U/µl
Units pro Mikroliter
UV
Ultraviolettstrahlung (100-380 nm)
V
Volt
VCAM
Vascular Cell Adhesion Molecule 1
VEO-IBD
Very early onset-Inflammatory Bowel Disease
W
Watt
WNV
West-Nil-Virus
z.B.
zum Beispiel
ZNS
z.T.
Zentrales Nervensystem
zum Teil
Danksagung
223
11 Danksagung
Abschließend möchte ich mich herzlichst bei zahlreichen Menschen bedanken, ohne
die diese Arbeit sicherlich nicht möglich gewesen wäre.
Prof. Dr. Andreas Beineke
gilt mein besonderer Dank für die Bereitstellung des interessanten Themas, seine
ausgezeichnete Betreuung und die stets freundliche Zusammenarbeit.
Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner
danke ich für die Möglichkeit meine Dissertation an seinem Institut anzufertigen und
an der Fachtierarztausbildung teilzunehmen.
Dr. Vanessa Herder
gilt großer Dank für die vielfältige, fachliche und technische Unterstützung bei der
Durchführung des Tierversuchs und diverser Methoden. Ohne deine Hilfe hätte diese
Arbeit sicherlich deutlich länger gedauert…
Prof. Dr. Jochen Huehn, Dr. Stefan Flöß und Dr. René Teich
vom Helmholtz Institut Braunschweig danke ich für die gute Zusammenarbeit und die
hervorragende Durchführung und Auswertung der Durchflusszytometrie sowie die
Überarbeitung des Manuskripts.
Bettina Buck, Kerstin Schöne, Caroline Schütz, Petra Grünig, Danuta Waschke,
Kirsten Löhr und Beate Pietzsch
danke ich herzlich für zahllose Paraffinschnitte, Färbungen, Immunhistologien, die
Durchführung der Durchflusszytometrie und große Unterstützung bei der Sektion und
Haltung der Mäuse.
Danksagung
224
Dr. Karl Rohn
vom Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung gilt ein
herzlicher Dank für die Unterstützung bei der statistischen Auswertung dieser Arbeit.
Malgorzata Ciurkiewicz und Muhammad Akram Khan
danke ich für Hilfe bei der Durchführung des Tierversuchs, gute Ideen und viele
aufbauende Worte.
Meinen Kolleginnen Anna mit Barn(ab)y, Charlotte, Kathrin mit Nela, Nicki mit
Lotta und meinem Kollegen Andrè
danke ich sehr für „kiloweise“ Kuchen, Schokolade, Tee und Kaffee sowie
„tonnenweise“ aufmunternde Worte, Hilfe bei meinem Projekt und in (fast) allen
Lebenslagen sowie für zahllose gute Stunden inner- und außerhalb des Instituts.
Ohne euch wäre es nicht das Gleiche gewesen….
Allen nicht namentlich erwähnten Kollegen und besonders der gesamten
„Theiler-Arbeitsgruppe“ des Instituts für Pathologie
gilt großer Dank für die gute Zusammenarbeit und „offene Ohren“ im Labor, in der
Sektionshalle, beim Schreibdienst, im „Mäusekeller“ und bei der Planung und
Durchführung des Tierversuchs.
Meinem Freund Christian
danke ich für die Hilfe bei der Anfertigung dieser Arbeit und dafür, dass er mir hilft
meine Ziele & Pläne zu verwirklichen. Ich danke dir, dass du immer für mich da bist.
Danke für deine Liebe und dafür, dass es dich gibt….
Meinen Eltern Regina und Karl-Wilhelm
danke ich von ganzem Herzen für die finanzielle Unterstützung während des
Studiums und der Promotion sowie für den fortwährenden Rückhalt. Danke für eure
Liebe, danke für „Wurzeln“ und „Flügel“….