Relevanz des signaltransduzierenden Adaptorproteins Paxillin für

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Tierärztlichen Fakultät der
Ludwig-Maximilians-Universität München
Relevanz des signaltransduzierenden
Adaptorproteins Paxillin für den Lebenszyklus
des Hepatitis-B-Virus
von Lisa Patzig
aus Berlin
München 2015
Aus dem Veterinärwissenschaftlichen Department der Tierärztlichen Fakultät der
Ludwig-Maximilians-Universität München
Lehrstuhl für Virologie
Arbeit angefertigt unter der Leitung von Univ.-Prof. Dr. med. vet. Gerd Sutter
Angefertigt am Paul-Ehrlich-Institut, Bundesinstitut für Impfstoffe
und biomedizinische Arzneimittel in Langen
Mentor: Prof. Dr. rer. nat. Eberhard Hildt
Gedruckt mit Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät
der Ludwig-Maximilians-Universität München
Dekan:
Univ.-Prof. Dr. med. vet. Joachim Braun
Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Gerd Sutter
Korreferent/en: Prof. Dr. Herbert Kaltner
Tag der Promotion: 18. Juli 2015
Meiner Familie
“Viren sind die einzigen Rivalen um die Herrschaft über unseren Planeten.
Wir müssen auf Draht sein, um mit ihnen Schritt zu halten.”
Joshua Lederberg (Molekularbiologe und Genetiker)
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I
Abbildungsverzeichnis
III
Tabellenverzeichnis
V
Abkürzungsverzeichnis
VII
1 Zusammenfassung
1
2 Summary
2
3 Einleitung
3
4 Literatur
4.1 Hepatitis B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.1 Historischer Überblick . . . . . . . . . . .
4.1.2 Taxonomie . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.3 Aufbau und Struktur von HBV-Partikeln .
4.1.4 Genomorganisation und Proteinbiosynthese
4.1.5 Lebenszyklus von HBV . . . . . . . . . . .
4.1.6 Epidemiologie . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.7 Transmission . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.8 Klinik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.9 Hepatozelluläres Karzinom (HCC) . . . . .
4.1.10 Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.11 Therapie . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.12 Prävention . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2 Paxillin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.2 Aufbau und Struktur . . . . . . . . . . . .
4.2.3 Interaktion und Funktion . . . . . . . . .
4.2.4 Erkrankungen und Zukunft . . . . . . . .
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11
12
14
15
15
15
17
18
24
I
Inhaltsverzeichnis
5 Ansätze und Ziele der Arbeit
26
6 Material
6.1 Zellen . . . . . . . . . . . . .
6.1.1 Prokaryotische Zellen
6.1.2 Eukaryotische Zellen .
6.2 Mäuse . . . . . . . . . . . .
6.3 Gewebeschnitte . . . . . . . .
6.4 Plasmide . . . . . . . . . . .
6.5 siRNA . . . . . . . . . . . .
6.6 Oligonukleotide . . . . . . .
6.7 Antikörper . . . . . . . . . .
6.8 Größenstandards . . . . . . .
6.9 Chemikalien . . . . . . . . .
6.10 Enzyme . . . . . . . . . . . .
6.11 Kits . . . . . . . . . . . . . .
6.12 Lösungen für die Zellkultur .
6.13 Puffer und Lösungen . . . . .
6.14 Geräte . . . . . . . . . . . .
6.15 Verbrauchsmaterialien . . . .
6.16 Software . . . . . . . . . . .
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7 Methoden
7.1 Zellbiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.1.1 Vorbereiten von Geräten und Lösungen . . . . . . . . . . . .
7.1.2 Prokaryotische Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.1.3 Eukaryotische Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2 Molekularbiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2.1 Agarosegelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren . . . . . . . .
7.2.3 Präparation von Plasmiden (Maxi-Prep) . . . . . . . . . . . .
7.2.4 Phenol-/Chloroform-Extraktion von DNA aus dem Überstand
7.2.5 Isolierung von Gesamt-RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2.6 cDNA-Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2.7 Real-Time PCR (RT-PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2.8 Northern Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.3 Proteinbiochemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.3.1 Bradford Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.3.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) . . . . . .
7.3.3 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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II
Inhaltsverzeichnis
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48
49
49
49
50
50
51
51
51
51
51
52
52
8 Ergebnisse
8.1 In vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.1.1 Expression von HBV führt zu erhöhter Bildung von Paxillin in stabil
HBV-exprimierenden Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.1.2 Knockdown der Paxillinexpression führt zu erhöhter Bildung von LHBs
auf Proteinebene und verringerter HBV-Menge auf mRNA-Ebene in
stabil HBV-exprimierenden Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.1.3 Intrazelluläre Paxillinverteilung: Akkumuliertes Verteilungsmuster in
stabil HBV-exprimierenden Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.1.4 Transiente Expression von HBV führt zu erhöhter Bildung von Paxillin
in transfizierten Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.1.5 Intrazelluläre Paxillinverteilung in transient HBV-exprimierenden Zellen
8.1.6 Replikation von HBV führt zu verringerter PXN-mRNA-Menge in infizierten primären Hepatozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.2 In vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.2.1 Expression von Paxillin in HBV-transgenen Mäusen . . . . . . . . . . .
8.2.2 Expression von Paxillin in HBV-infizierten Patienten . . . . . . . . . .
53
53
9 Diskussion
78
Literaturverzeichnis
85
Danksagung
93
7.4
7.5
7.3.4 Luciferase Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Immunologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4.1 Immunochemische Färbung der Western Blot-Membran . . .
7.4.2 Indirekte Immunfluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4.3 Enzym linked immunosorbent assay (ELISA) . . . . . . . . .
7.4.4 Methoden zur Charakterisierung HBV-transgener Mäuse . . .
7.4.5 Gewinnung von Mäuselebergewebeproben . . . . . . . . . . .
7.4.6 Präparation von Mäuselebergewebelysaten . . . . . . . . . .
7.4.7 Isolierung von RNA aus Mäuselebergewebeproben . . . . . .
7.4.8 Paraffinpräparate und Färbetechniken . . . . . . . . . . . . .
7.4.9 Immunfärbung von Paraffinschnitten aus Lebergewebeproben
Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7.5.1 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) . . . . . . .
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53
57
61
62
65
67
72
72
76
III
Abbildungsverzeichnis
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
Aufbau des infektiösen Dane-Partikels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Struktur der nicht-infektiösen subviralen Partikel des Hepatitis-B-Virus . . . .
Schematische Darstellung des HBV-Genomes . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Schematische Darstellung des HBV-Replikationszyklus . . . . . . . . . . . . .
Globale Hepaptitis-B-Prävalenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Vorkommen der Hepatitis-B-Genotypen auf den Kontinenten . . . . . . . . . .
Klinischer Verlauf und serologisches Profil einer akuten Hepatitis-B-Infektion .
Klinischer Verlauf und serologisches Profil einer chronischen Hepatitis-B-Infektion
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.9 Aufbau von fokalen Adhäsionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.10 Struktur und Aufbau der Paxillinfamilie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.11 Paxillinbindungspartner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.12 Anatomie eines Leberlappens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
6
7
8
9
10
13
14
16
18
19
25
7.1
Schematischer Aufbau des Western Blot-Verfahrens . . . . . . . . . . . . . . 48
8.1
Northern Blot-Analyse: Erhöhte PXN-mRNA-Menge in stabil HBV-exprimierenden
Zelllinien im Vergleich zu HBV-negativen Zellen . . . . . . . . . . . . . . . .
Western Blot-Analyse: Erhöhte Paxillinexpression in stabil HBV-exprimierenden
Zelllinien im Vergleich zu HBV-negativen Zellen . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR-Analyse: Erhöhte Paxillin-cDNA-Menge in stabil HBV-exprimierenden
Zelllinien im Vergleich zu HBV-negativen Zellen . . . . . . . . . . . . . . . .
RT-PCR-Analyse: Erhöhte PXN-mRNA-Menge in stabil HBV-exprimierenden
Zelllinien im Vergleich zu HBV-negativen Zellen (V.1) . . . . . . . . . . . . .
RT-PCR-Analyse: Erhöhte PXN-mRNA-Menge in stabil HBV-exprimierenden
Zelllinien im Vergleich zu HBV-negativen Zellen (V.2) . . . . . . . . . . . . .
RT-PCR-Analyse: Erhöhte PXN-mRNA-Menge in stabil HBV-exprimierenden
Zelllinien im Vergleich zu HBV-negativen Zellen (V.3) . . . . . . . . . . . . .
Western Blot-Analyse: Bei Paxillin-Knockdown verstärkte LHBs-Expression in
stabil HBV-exprimierenden Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Paxillin-Knockdown in stabil HBV-exprimierenden HepG2 2.2.15-Zellen . . . .
Paxillin-Knockdown in stabil HBV-exprimierenden HepG AD38-Zellen . . . . .
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
8.8
8.9
53
54
55
56
56
57
58
59
60
IV
Abbildungsverzeichnis
8.10 Immunfluoreszenzanalyse: Verstärkte PXN-Expression in stabil HBV-exprimierenden
HepG2 2.2.15-Zellen im Vergleich zu HBV-negativen Hep G2-Zellen . . . . . .
8.11 Western Blot-Analyse: Erhöhte Paxillinexpression in transient HBV-exprimierenden
Zellen im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zellen (V.1) . . . . . . . . . . . .
8.12 Western Blot-Analyse: Erhöhte Paxillinexpression in transient HBV-exprimierenden
Zellen im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zellen (V.2) . . . . . . . . . . . .
8.13 Luziferase-Assay: Erhöhte PXN-Promotoraktivität in transient HBV-exprimierenden
Zellen im Vergleich zu HBV-negativen Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.14 RT-PCR-Analyse: Erhöhte PXN-mRNA-Menge in transient HBV-exprimierenden
Zellen im Vergleich zu HBV-negativen Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.15 Immunfluoreszenzanalyse von transient HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich
zu HBV-negativen Zellen (1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.16 Immunfluoreszenzanalyse von transient HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich
zu HBV-negativen Zellen (2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.17 HBsAg-ELISA zeigt erfolgte Infektion im PHH-Modell (V.1) . . . . . . . . . .
8.18 RT-PCR-Analyse: Verringerte PXN-mRNA-Menge in infizierten im Vergleich zu
uninfizierten PHHs (V.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.19 HBsAg-ELISA zeigt erfolgte Infektion im PHH-Modell (V.2) . . . . . . . . . .
8.20 RT-PCR-Analyse: Verringerte PXN-mRNA-Menge in infizierten im Vergleich zu
uninfizierten PHHs (V.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.21 Western Blot- und RT-PCR-Analyse: Verringerte PXN-mRNA-Menge in infizierten im Vergleich zu uninfizierten PHHs (V.3) . . . . . . . . . . . . . . . .
8.22 Western Blot-Analyse von männlichen HBV-transgenen im Vergleich zu HBVnegativen Mäusen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.23 Western Blot-Analyse von weiblichen HBV-transgenen im Vergleich zu HBVnegativen Mäusen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.24 RT-PCR-Analyse: Verringerte PXN-mRNA-Menge in männlichen HBV-transgenen
im Vergleich zu HBV-negativen Mäusen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.25 HE-Färbung männlicher Mäuseleberschnitte . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.26 Immunfluoreszenzanalyse: Verstärkte PXN-Expression in männlichen HBVtransgenen Mäusen im Vergleich zu HBV-negativen Kontrolltieren . . . . . . .
8.27 Immunfluoreszenzanalyse: Verstärkte PXN-Expression in Gewebeproben von
Patienten mit HBV-assoziiertem hepatozellulärem Karzinom im Vergleich zu
Kontrollgewebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
62
63
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
73
74
75
77
V
Tabellenverzeichnis
4.1
4.2
4.3
Übersicht der serologischen und virologischen Marker von HBV . . . . . . . . 12
Übersicht der direkten und indirekten Bindungspartner der Paxillin LD motifs . 20
Variabilität der Paxillinexpression in humanen Krebsarten . . . . . . . . . . . . 24
6.1
6.2
6.3
6.4
6.5
6.7
6.8
Prokaryotische Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Eukaryotische Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Verwendete Mäuse für RNA-Proben, Proteinlysate und Gewebeschnitte
Für Gewebeschnitte verwendete Mäuse- und Patientenlebern . . . . . .
Verwendete Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Verwendete Light-Cycler Primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Antikörper und entsprechende Verdünnungen . . . . . . . . . . . . . .
7.1
7.2
7.3
Real-time PCR Programm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Absorptions- und Emissionsmaxima der Fluorophore . . . . . . . . . . . . . . 52
.
.
.
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.
27
27
28
29
30
31
31
VI
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
HZMV
Humanes-Zytomegalie-Virus
AFP
Alpha-1-Fetoprotein
IgG
Immunglobulin G
AK
Antikörper
IgM
Immunglobulin M
ALT
Alanin-Aminotransferase
ILK
Integrin-linked Kinase
APS
Ammoniumperoxidsulfat
KCl
Kaliumchlorid
AuAg
australisches Antigen
KH2 PO4
Kaliumdihydrogenphosphat
cccDNA
covalently closed circular DNA
kDa
Kilodalton
CLSM
konfokales Laser-Scanning-Mikroskop
Kontr.
Kontrolle
c-Src
cellular and sarcoma
LHBs
large hepatitis B surface protein
BSA
Bovines Serum Albumin
MAPK
mitogen-activated protein kinase
DABCO
Triethylendiamin
MHBs
middle hepatitis B surface antigen
DAPI
4´,6-Diamidin-2-phenylindol
mRNA
messanger RNA
ddH2 O
doppelt deionisiertes Wasser
NaCl
Natriumchlorid
DHBV
Duck-Hepatitis-B-Virus
Na2 HPO4
Dinatriumhydrogenphosphat
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
o.
oder
DMSO
Dimethylsulfoxid
ORF
open reading frame
DNA
deoxyribonucleic acid
PAGE
Polyacrylamidgelelektrophorese
dNTPs
Desoxyribonukleosidtriphosphate
PAK
P21 activated kinase
DR
direct repeats
PBS
Phosphatase Buffered Saline
ECL
Enhanced Chemiluminescence
P-BS
Paxillin-binding Subdomain
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
PCR
Polymerase Chain Reaction
EGF
Epidermal Growth Factor
PEI
Polyethylenimin
EGFP
enhanced Green fluorescent protein
pgRNA
prägenomische RNA
ELISA
Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay
PHH
primäre humane Hepatozyten
EZM
extrazelluläre Matrix
PIX
PAK interacting exchange factor
FAK
Focal Adhesion Kinase
PVDF
Polyvinylidenfluorid
FAs
focal adhesions
PXN
Paxillin
FAT
focal adhesion targeting
rev
revert
FCS
fetal calf serum
RNA
ribonucleic acid
fwd
forward
RT
Reverse-Transkriptase
geb.
geboren
RT-PCR
Real-Time PCR
VII
gest.
gestorben
RTK
Rezeptortyrosinkinase
GoHBV
Gorilla-Hepatitis-B-Virus
SDS
sodium dodecyl sulfate
GSHV
Ground-Squirrel-Hepatitis-Virus
SGHBV
Snow-Goose-Hepatitis-B-Virus
gtA
Genotyp A
SHBs
small hepatitis B surface antigen
gtD
Genotyp D
siRNA
small interfering RNA
gtG
Genotyp G
SVP
subvirale Partikel
HAV
Hepatitis-A-Virus
Tab.
Tabelle
HBc
hepatitis B core antigen
TAE
Tris-Acetat-EDTA
HBe
hepatitis B early antigen
TBS/T
Tris-Buffered Saline/Tween 20
HBs
hepatitis B surface antigen
TRIS
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
HBV
Hepatitis-B-Virus
u.
und
HBVtg
HBV-transgen
Vt
vinculin tail
HCC
hepatozelluläres Karzinom
WB
Western Blot
HHBV
Heron-Hepatitis-B-Virus
WHO
World health organisation
HIV
Humanes Immundefizienz-Virus
WHV
Woodchuck-Hepatitis-Virus
VIII
1 Zusammenfassung
Charakterisierung der Bedeutung von Paxillin für den Lebenszyklus
des Hepatitis-B-Virus
Das Hepatitis-B-Virus hat globale Bedeutung bei viralen Lebererkrankungen (Gerlich, 2013). Mit
seinem ausgeprägten Hepatropismus und der hohen Wirtsspezifität befällt es sowohl Säugetiere
als auch Vögel. Die Krankheitsverläufe sind abhängig vom Alter und der vorliegenden Form.
So reichen die Symptome von leichten Anzeichen wie Unwohlsein und Erschöpfung hin zu
schweren Erkrankungen von Organen und im schlimmsten Verlaufsfall bis zur Entwicklung
einer Leberzirrhose oder eines hepatozellulären Karzinoms (Schaefer, 2007; Dienstag, 1981;
Gitlin, 1997). In bereits veröffentlichen Studien konnte gezeigt werden, dass Paxillin eine
wichtige Rolle bei der Entstehung und Verbreitung von bestimmten Tumorarten einnimmt. Es
übernimmt somit nicht nur physiologische Funktionen als Adaptorprotein in den focal adhesions
zur Vermittlung der Signaltransduktion und Integrität der Zelle, sondern hat auch durch die
Steuerung eines Tumors eine entscheidende Mitwirkung an der bestmöglichen Invasions- und
Wachstumsrate des Tumors (Turner, 2000; Deakin et al., 2012).
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des Hepatitis-B-Virus auf die Menge und intrazelluläre Verteilung von Paxillin bestimmt und umgekehrt der Effekt einer Deregulation der
Paxillinexpression auf den Lebenszyklus von HBV charakterisiert. In Northern Blot-, PCR-,
RT-PCR- und Western Blot-Analysen von stabil HBV-exprimierenden Zellen (HepG2 2.2.15
und HepAD38) sowie transient HBV-exprimierenden Zellen (Huh-7.5_pJo19/gtA/gtG) konnte gezeigt werden, dass die Expression von HBV zu einer erhöhten Menge an Paxillin auf
mRNA- und Proteinebene führt (Kap. 8.1.1 und 8.1.4). Die Immunfluoreszenzuntersuchungen
in HepG2 2.2.15-Zellen (Abb. 8.10) bestätigen diese Hypothese. Bei den IF-Aufnahmen der
transient HBV-exprimierenden Zellen zeigt sich kein Unterschied. Der Knockdown von Paxillin hat in HepG2 2.2.15- und HepAD38-Zellen eine verringerte Menge an HBV-spezifischen
Transkripten bei gleichzeitig gesteigerter intrazellulärer LHBs-Expression sowie eine verringerte
HBsAg-Menge im Zellkulturüberstand zur Folge (Abb. 8.8 und 8.9). Die in vivo-Modelle
zeigen eine verringerte Menge an Paxillin bei Anwesenheit von HBV. Dies könnte durch andere
vorherrschende Regulationsmechnismen im Vergleich zu den in vitro-Modellen bedingt sein.
Die Relevanz von Paxillin für HBV konnte gezeigt werden und zukünftige Experimente werden
klären, wie dies zur Bekämpfung der HBV-Erkrankung genutzt werden kann.
1
2 Summary
Characterization of the role of paxillin for the life cycle of the
hepatitis B virus
The hepatitis B virus has global significance in viral liver diseases (Gerlich, 2013). With a
strong hepatropism and a high specificity of host it affects both mammalian animals and birds.
The course of disease depends on the age and the present form. The symptoms range from
mild symptoms such as malaise and fatigue to severe diseases of organs and in the worst case
to the development of liver cirrhosis or hepatocellular carcinoma (Schaefer, 2007; Dienstag,
1981; Gitlin, 1997). In earlier published studies it has already been shown that paxillin plays an
important role in the emergence and spread of certain types of tumors. It assumes not only
physiological functions as an adapterprotein in the focal adhesions to mediate signaltransduction
and cell integrity, but rather, due to the ability to control the tumor, crucially contributes to
its best possible invasion and growth rate (Turner, 2000; Deakin et al., 2012).
In the present work, the influence of hepatitis B virus was analysed by the amount and intracellular distribution of paxillin and, vice versa, the characterisation of the effect of deregulation of
the expression of paxillin for the life cycle of HBV was researched. The analyses of Northern
Blot-, PCR-, RT-PCR- and Western blot data of stable HBV-expressing cells (HepG2 2.2.15
and HepAD38) and transient HBV-expressing cells (Huh-7.5_pJo19/gtA/gtG) were able to
show that the expression of HBV leads to an increased amount of paxillin on the mRNA- and
protein-level (chap. 8.1.1 and 8.1.4). The immunofluorescence studies in HepG2 2.2.15-cells
(fig. 8.10) confirm this hypothesis. The IF-images of the transient HBV-expressing cells show
no difference. The knockdown of paxillin in HepG2 2.2.15 and HepAD38-cells shows the result
of a reduced amount of HBV-specific transcripts and at the same time an increased intracellular
LHBs-expression, the HBsAg-amount in the supernatant of the cellculture was reduced (fig.
8.8 and 8.9). The in vivo-models show a reduced amount of paxillin in the presence of HBV.
This could be caused by other mechanisims of regulation in comparison to the in vitro-models.
The relevance of paxillin for HBV has been shown and future experiments will clarify how this
can be used for the control of HBV infection.
2
3 Einleitung
Am 28. Juli 2014 rief die Weltgesundheitsorganisation (WHO) erneut zum World Hepatitis
Day auf. Zusammen mit der World Hepatitis Alliance kämpft die WHO für das
aktive Einschreiten der Regierungen gegen Infektionserkrankungen auf der ganzen Welt, für
bessere Präventionsprogramme und den Zugang zu Impfstoffen und Medikamenten auch für
die Menschen in Entwicklungsländern.
Ein Hauptvertreter der Krankheit ist das Hepatitis-B-Virus (HBV). Warum hat HBV eine
solche Relevanz für die gesamte Weltbevölkerung? Die globale Ausbreitung dieses Erregers
ist immens und betrifft zur Zeit etwa zwei Milliarden Menschen. Diese sind an einer akuten
oder chronischen Form erkrankt oder haben eine HBV-Erkrankung überstanden. Über 600.000
Menschen sterben jährlich daran. Schätzungsweise 350 Millionen Menschen weltweit leben mit
einer chronischen HBV-Infektion und tragen ein sehr hohes Risiko, an Leberzirrhose oder dem
hepatozellulärem Karzinom (HCC) zu erkranken (Ott et al., 2012; Teh and Sasadeusz, 2014).
Durch die ubiquitäre Verteilung des Virus weisen Regionen wie Südostasien und SubsaharaAfrika eine hohe Prävalenz auf. Weniger als 1 % der Bevölkerung in Westeuropa, Nordamerika
und Australien sind Träger einer chronischen Hepatitis-B-Virusinfektion (Janahi, 2014). Trotz
der präventiven Impfung und Behandlung von Patienten mit antiviralen Langzeittherapien ist
die Entwicklung von Methoden der Resistenzvermeidung und das Aufstellen neuer Konzepte
zum Schutz von non-respondern in der Zukunft unumgänglich (Zuckerman, 1996).
Nicht nur die Suche nach einem therapeutischen Impfstoff und effizienteren Medikamenten treibt
die Forschung voran, auch sind viele Fragen des Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus nur teilweise
entschlüsselt. Die Wissenschaft kann noch keine Antwort über den genauen Viruseintritt in die
Leberzellen sowie die komplexe Bedeutung der subviralen Partikel geben. Auf diesem Gebiet ist
Grundlagenforschung unerlässlich. Für eine gute Replikation benötigt das Hepatitis-B-Virus
eine sessile Zelle. Es sind fokale Adhäsionen vorhanden, welche eine entscheidene Rolle bei der
Zelladhäsion und Zellwanderung spielen (Gallant et al., 2002). Das Protein Paxillin (PXN) ist
ein wichtiger Baustein bei der Koordination der Signaltransduktion zwischen extrazellulärer
Matrix (EZM), den fokalen Adhäsionen und dem Aktin-Zytoskelett. Paxillin agiert als Vermittler
zwischen vielfältigsten biologischen Makromolekülen (Schaller, 2001; Brown and Turner, 2004).
Diese Erkenntnisse sind Ausgangspunkt für die weitere Forschung nach der Verbindung des
signaltransduzierenden Adapterproteins Paxillin und dem Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus.
3
4 Literatur
4.1 Hepatitis B
4.1.1 Historischer Überblick
Der Mediziner B. S. Blumberg fand im Blut eines australischen Ureinwohners ein unbekanntes
Antigen. Das australische Antigen (AuAg), später identifiziert als das sphärische HepatitisB-Oberflächenprotein (HBsAg), gab Hinweise auf einen möglichen Zusammenhang mit einer
Lebererkrankung (Blumberg, 1977). Er erhielt dafür im Jahre 1976 zusammen mit D. C.
Gajdusek den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin "for their discoveries concerning new
mechanisms for the origin and dissemination of infectious diseases" (“für ihre Entdeckungen
bezüglich neuer Mechanismen bei der Entstehung und Verbreitung von Infektionskrankheiten”)
(Blumberg, 2002).
4.1.2 Taxonomie
Der momentane wissenschaftliche Stand klassifiziert das Hepatitis-B-Virus als einziges humanpathogenes Mitglied der Familie der Hepadnaviridae. Der Name der Familie leitet sich
aus der Abkürzung von Hepatitis-DNA-Viren ab (griech.: hepa = Leber; -itis = Entzündung;
latein.: virus = Gift, Schleim). Die Vertreter dieser Familie sind sehr organspezifisch und
lösen akute und chronische Infektionen aus. Dieser ausgeprägte Hepatropismus und eine hohe
Wirtsspezifität sind Merkmale dieser obligat intrazellulären Parasiten. Sie lassen sich taxonomisch in zwei Genera aufteilen, den Orthohepadnaviren und den Avihepadnaviren. Sie befallen
sowohl große Säugetiere, wie zum Beispiel Affen und Menschen, als auch diverse Nagetiere.
Diese Wirte werden dem Genus Orthohepadnavirus zugeordnet. Typische Vertreter sind: Das
Gorilla-Hepatitis-B-Virus (GoHBV), das Hepatitis-B-Virus und das Woodchuck-Hepatitis-Virus
(WHV) sowie das Ground-Squirrel-Hepatitis-Virus (GSHV). Die Avihepadnaviren sind in zahlreichen Vogelarten vorhanden. Das Duck-Hepatitis-B-Virus (DHBV), das Heron-Hepatitis-B-Virus
(HHBV) und das Snow-Goose-Hepatitis-B-Virus (SGHBV) sind klassische Vertreter dieser
Gruppe (Schaefer, 2007).
4
Literatur
Die genetische Variabilität von HBV ist sehr hoch. Bis heute sind 8 verschiedene Genotypen bekannt, diese sind als Genotypen A bis H bezeichnet und es wurden mindestens 35 Subgenotypen
entdeckt (Aspinall et al., 2011).
4.1.3 Aufbau und Struktur von HBV-Partikeln
Im Jahr 1970 entdeckte D. S. Dane im Blut von HBsAg-positiven Spendern intakte HepatitisB-Viruspartikel, sog. Dane-Partikel (Abb. 4.1). Mit Hilfe eines Elektronenmikroskops konnte
erstmals ein vollständiges Hepatitis-B-Virus (ca. 0,2 %) mit einer Größe von etwa 42 nm
beobachtet werden (Abb. 4.1) sowie eine Vielzahl mit etwa 22 nm großen und unterschiedlich
langen filamentösen (ca. 1 - 2 %) und spährischen (ca. 98 - 99 %) Partikeln, welche in Abb.
4.2 dargestellt sind (Dane et al., 1970).
Die äußerste Begrenzung des infektiösen Dane-Partikels bildet eine Lipiddoppelschicht aus dem
endoplasmatischen Retikulum der Wirtszelle zusammen mit den drei verschiedenen Oberflächenproteinen. Diese Hüllproteine, das large hepatitis B surface antigen (LHBs), das middle hepatitis
B surface antigen (MHBs) und das small hepatitis B surface antigen (SHBs) umschließen das
etwa 27 nm große ikosaedrische Nukleokapsid, gebildet vom hepatitis B core antigen (HBc).
Dieses beinhaltet das partiell doppelsträngige virale DNA-Genom mit der kovalent gebundenen
DNA-Polymerase, welche eine reverse Transkriptase-Aktivität besitzt.
Abb. 4.1: Aufbau des infektiösen Dane-Partikels. Die Hülle bildet eine Lipiddoppelschicht zusammen mit den drei Oberflächenproteinen (LHBs, MHBs, SHBs). Das LHBs wird aus der PreS1-, der PreS2- und der S-Domäne gebildet. Das MHBs ist aus
der PreS2- und S-Domäne aufgebaut und das SHBs nur aus der S-Domäne. Alle zusammen umgeben das Nukleokapsid, welches
aus dem Kernprotein (HBc) besteht. Dieses umschließt die partiell doppelsträngige virale DNA mit der kovalent gebundenen
DNA-Polymerase, welche eine reverse Transkriptase-Aktivität (RT) besitzt (modifiziert nach Gerlich, 2013; mit Genehmigung von
BioMed Central).
5
Literatur
In sehr großer Anzahl sind die nicht-infektiösen Partikel in Form von Filamenten oder Sphären
vertreten; sie werden auch als subvirale Partikel (SVP) bezeichnet (Abb. 4.2). Diese bestehen
im Gegensatz zum Dane-Partikel nur aus der Lipidhülle mit eingebundenen Hüllproteinen,
beinhalten aber keine virale DNA. Die zum intakten Virus deutlich kleineren 17 - 25 nm großen
sphärischen Partikel bestehen nur aus dem MHBs und dem SHBs. Die filamentösen Partikel sind
unterschiedlich lang und es sind alle drei Oberflächenproteine am Aufbau beteiligt. Die Funktion
dieser beiden nicht-infektiösen subviralen Partikel ist noch nicht genau erforscht. Wahrscheinlich
dienen sie zur Bindung HBV-spezifischer Antikörper vom Wirt, um den Virus beim Eintritt in
die Zelle zu unterstützen (Bruns et al., 1998; Seeger and Mason, 2000; Robert-Koch-Institut,
2000).
Abb. 4.2: Struktur der nicht-infektiösen subviralen Partikel des Hepatitis-B-Virus. Der Hauptanteil beider Partikel bildet
das SHBs. Die Sphären bestehen zusätzlich noch aus dem MHBs und besitzen einen Durchmesser von 17 - 25 nm. Die Filamente
dagegen weisen neben dem MHBs noch das LHBs im Aufbau auf und sind von unterschiedlicher Länge (modifiziert nach Gerlich,
2013; mit Genehmigung von BioMed Central).
4.1.4 Genomorganisation und Proteinbiosynthese
Das HBV-Genom besteht aus einer partiell doppelsträngigen DNA, einem kompletten Minusstrang mit etwa 3200 Nukleotiden und einem inkompletten Plusstrang von variabler Länge.
Die HBV-Polymerase ist am 5‘-Ende des kodierenden Minusstranges kovalent gebunden (Abb.
4.3). Auf dem Minusstrang sind die vier open reading frames (ORF, offene Leseraster) kodiert.
Der längste open reading frame kodiert für die virale Polymerase; hier überlappen teilweise
der zweite ORF für das Core (Kernprotein) und der dritte ORF für das X (regulatorische
Hepatitis-X-Protein). Das Hepatitis-B-extrazelluläre-Antigen (hepatitis B early antigen, HBe)
ist auf den beiden Leserahmen für das Core und Pre-Core kodiert. Das HBe wird sezerniert und
findet sich nicht im Dane-Partikel. Es bewirkt wahrscheinlich eine verminderte Immunantwort
durch Verringerung der Genexpression von Toll-like Rezeptor 2 auf Hepatozyten und Monozyten.
Die drei Oberflächenproteine (LHBs, MHBs, SHBs) werden durch das vierte Leseraster kodiert.
Die S-Domäne transkribiert für das kleine Oberflächenprotein, die PreS2-Domäne und die
S-Domäne das mittlere Oberflächenprotein und die PreS1-Domäne, die PreS2-Domäne und die
S-Domäne für das große Oberflächenprotein. Die covalently closed circular DNA (cccDNA)
6
Literatur
dient als Matrize für die Transkription der vier viralen messenger RNAs (mRNAs). Die Expression der 3.5-, 2.4-, 2.1- und 0.7-kb großen RNA-Transkripte dienen bei der Translation der
Bildung der entsprechenden Proteine. Aus der 3.5-kb RNA wird das Hepatitis-Core-Antigen
(Nukleokapsidprotein), das Hepatitis-E-Antigen und die virale Polymerase (reverse Transkriptase) synthetisiert. Die viralen Oberflächenproteine entstehen aus der 2.4- und 2.1-kb RNA. Die
kleinste RNA mit 0.7-kb ist notwendig für die Herstellung des HBx-Proteins. Alle viralen RNAs
tragen eine Cap-Struktur und einen Poly-A-Schwanz (Valenzuela, 1990; Kidd-Ljunggren et al.,
2002; Locarnini, 2004).
Abb. 4.3: Schematische Darstellung des HBV-Genomes. Das Hepatitis-B-Virus-Genom ist aus einer zirkulären, partiell
doppelsträngigen DNA aufgebaut, einem kompletten kodierenden Minusstrang und einem unvollständigen Plusstrang (innere
schwarze Linien). Es gibt zwei direkt wiederholte Sequenzen (direct repeats, DR1 und DR2), die bei der Replikation eine Rolle
spielen. Die Polymerase ist am 5‘-Ende des Minusstranges kovalent gebunden. Die vier zum Teil überlappenden Leserahmen
kodieren -> türkis: virale Polymerase, gelb: X-Protein, hellblau + blau: Early-Protein, blau: Core-Protein, rot: Oberflächenproteine
(LHBS, MHBs, SHBs). Die äußeren schwarzen und braunen Kreise zeigen die unterschiedlich großen RNA-Transkripte (modifiziert
nach Kidd-Ljunggren et al., 2002; mit Genehmigung der Society for General Microbiology).
4.1.5 Lebenszyklus von HBV
Der erste Schritt des Hepatitis-B-Virus ist die Anheftung an und Penetration durch die
Zellmembran von Hepatozyten. Das geschieht mit Hilfe der PreS1-Domäne, von Fibronektin
und durch die Bindung an NTCP (Na+ -taurocholate cotransporting polypeptide). Der genaue
Ablauf ist noch ungeklärt (Budkowska et al., 1995; Watashi et al., 2014). Nach der Penetration
wird die Hülle des Virus entfernt und das Nukleokapsid zum Zellkern transportiert. Hier bleibt
es im Bereich des Kernporenkomplexes stecken und das Genom gelangt mit Hilfe des nuclear
localization signal der viralen Polymerase in den Zellkern. Durch die Freisetzung der genomischen
DNA aus dem HBc und der darauffolgenden Vervollständigung des Minusstranges kommt es
zum Ringschluss. Die nun vorliegende Form der DNA wird als cccDNA bezeichnet. Sie dient als
7
Literatur
Vorlage für die Transkription der viralen mRNAs und des RNA-Prägenoms. Die Transkription
der cccDNA in prägenomische RNA wird durch die zelleigene RNA-Polymerase II im Zellkern
vermittelt. Der Zusammenbau des Nukleokapsides wird durch die virale Polymerase, die an das
Verpackungssignal ε der 3.5-kb RNA bindet, initiiert und die prägenomische RNA wird in das
Viruskapsid integriert. Auf der einen Seite können die gebildeten Nukleokapside deassemblieren
und die virale DNA wird wieder in den Zellkern verbracht. Diese ist notwendig, um eine
genügend hohe Kopienanzahl der cccDNA während der akuten Hepatitis-B-Infektionsphase zu
gewährleisten. Auf der anderen Seite werden im Nukleokapsid die prägenomischen RNAs in
das komplette virale DNA-Genom umgewandelt. Zuerst erfolgt durch die reverse Transkriptase
die Transkription der prägenomischen RNA in einen kompletten Minusstrang, dieser wird
danach mit Hilfe der viralen Polymerase auf nur wenige Nukleotide abgebaut. Diese dienen der
viralen Polymerase als Primer, um den Plusstrang der DNA zu synthetisieren. Danach wird das
Nukleokapsid mit den viralen Oberflächenproteinen am endoplasmatischen Retikulum umhüllt
und als Dane-Partikel ins Blut sezerniert. Eine Vielzahl an subviralen Partikeln gelangt nach
der Translation der mRNAs auch ins Blut (Abb. 4.4) (Rehermann and Nascimbeni, 2005; Beck,
2007; Schädler and Hildt, 2009; Lupberger et al., 2013).
Abb. 4.4: Schematische Darstellung des HBV-Replikationszyklus. Der komplexe Replikationszyklus von HBV beginnt mit
der Anheftung, der Penetration und dem uncoating des behüllten Virus in den Hepatozyten. An diesem Punkt besteht die virale
DNA in Form einer relaxed circular DNA und wird in eine covalently closed circular DNA (cccDNA) umgewandelt. Innerhalb
des Zellkernes findet die Transkription der cccDNA zur prägenomischen RNA (pgRNA) und mRNA statt. Zurück im Zytoplasma
erfolgt die Translation und Synthese der mRNAs. Die pgRNA wird zur viralen DNA mit Hilfe der viralen Polymerase umgebaut,
gefolgt von der Bildung der Virushülle. Am Ende wird der komplette Dane-Partikel ins Blut entlassen. Eine Vielzahl von nichtinfektiösen subviralen Partikeln gelangt nach der Translation der mRNAs auch ins Blut. Ein weiterer Weg der pgRNA führt zurück
in den Zellkern, um eine hohe Anzahl von cccDNA während einer akuten HBV-Phase gewährleisten zu können (modifiziert nach
Rehermann and Nascimbeni, 2005; mit Genehmigung der Nature Publishing Group).
8
Literatur
4.1.6 Epidemiologie
Die globale Bedeutung der viralen Lebererkrankung (HBV) ist aufgrund des pandemischen Charakters unumstritten. Das große Gefälle in der Prävalenz wird durch die ethnische Zugehörigkeit
und das unterschiedliche Umweltgefahrenpotenzial stark beeinflusst. Die globale Verteilung
zeigt, dass vor allem Alaska, Subsahara-Afrika und Südostasien zu den Endemiegebieten zählen.
Dort sind schätzungsweise über 60 % der Bevölkerung infiziert, 8 - 15 % von ihnen chronisch.
Russland, Indien und Länder an der Mittelmeerküste weisen eine mittlere Erkrankungsrate von
20 - 60 % der Bevölkerung auf. Dort sind 2 - 7 % chronisch erkrankt. Die Übersicht zeigt eine
sehr geringe Infektionsrate in Ländern Nordamerikas, Westeuropas und Australien. Hier hatten
nur < 20 % der Menschen jemals Kontakt mit dem Erreger und < 2 % sind chronisch mit
dem Hepatitis-B-Virus infiziert (Abb. 4.5) (Kane, 1995).
Abb. 4.5: Globale Hepatitis-B-Prävalenz. Die Weltkarte zeigt eine hohe Prävalenz in Entwicklungsländern und Teilen von
Kanada, Alaska und Grönland. Dort sind über 60 % der Bevölkerung mit HBV infiziert, 8 - 15 % von ihnen chronisch. Eine
mittlere Prävalenz ist in Russland, Brasilien und im Mittelmeerraum zu sehen. Es sind ca. 20 - 60 % der Bevölkerung infiziert,
2 - 7 % chronisch. Die geringste HBV-Prävalenz weisen Industrieländer und Teile Südamerikas auf mit < 20 % Infizierten und
< 2 % chronisch Erkrankten (modifiziert nach Gerlich, 2013; mit Genehmigung von BioMed Central).
Die Abb. 4.6 gibt Aufschluss über die vorherrschenden Genotypen auf den Kontinenten. Es zeigt
sich, dass der Genotyp A in Nordwesteuropa und laut Veröffentlichungen auch in Nordamerika
dominiert. Zudem wurde dieser Genotyp auch in Teilen der Philippinen, in Hong Kong, Afrika
und Asien nachgewiesen. Die Genotypen B und C sind für die meisten Infektionen in Südostasien
und dem pazifischen Raum verantwortlich. Der Genotyp D ist vorwiegend der Auslöser einer
Hepatitis-B-Erkrankung in Südeuropa, Afrika und Südostasien. Der Genotyp D ist weltweit
anzutreffen. Der Genotyp E ist vor allem in Westafrika zu finden, der Genotyp F in Teilen
von Süd- und Mittelamerika. Ursprünglich wurde der Genotyp G als Erstes in Frankreich und
9
Literatur
den USA lokalisiert. Neueste Berichte zeigen auch ein Auftreten in Mexiko und Belgien. Der
Genotyp H wurde in Amerika und Japan beschrieben (Norder et al., 2004; Pourkarim et al.,
2014).
Abb. 4.6:
Vorkommen der Hepatitis-B-Genotypen auf den Kontinenten. Genotyp A: Nordwesteuropa; Genotyp B und
C: Südostasien, pazifischer Raum; Genotyp D: Südeuropa, Afrika und Südostasien (“?” bedeutet wahrscheinlich); Genotyp E:
Westafrika; Genotyp F: Mittel- und Südamerika; Genotyp G: USA (modifiziert nach Gerlich, 2013; mit Genehmigung von BioMed
Central).
4.1.7 Transmission
Viren können sich aufgrund ihrer fehlenden Stoffwechselaktivitäten nur innerhalb eines Wirtes
vermehren. Deshalb ist eine effiziente Virusübertragung notwendig. HBV ist bis zu 100-mal
infektiöser als das Humane Immundefizienz-Virus (HIV). Die Tenazität ist dagegen gering.
Das bedeutet, HBV ist gegenüber Umwelteinflüssen nicht sehr widerstandsfähig und bleibt
im getrockneten Blut in der Umwelt außerhalb seines Wirtes etwa eine Woche infektiös (Lin
and Kirchner, 2004). Als sehr wichtige Infektionskette gilt die vertikale Transmission von
einer infizierten Mutter auf ihr Kind (Umar et al., 2013). Die horizontale Transmission erfolgt
direkt über kontaminiertes Blut oder Körperflüssigkeiten durch Aufnahme des Virus in die
Blutbahn oder über kleinste Schleimhautverletzungen. HBV gelangt über die Blutbahn in die
Leber. Beispielhaft seien hier die Risikogruppen der Drogenabhängigen durch gemeinsamen
Nadelgebrauch und Menschen mit Kontakt zu Blut im Gesundheitssystem zu nennen sowie
Hetero- und Homosexuelle bei der Ausübung von ungeschütztem Geschlechtsverkehr. Bei HBV
besteht jedoch keine ernstzunehmende Gefahr der Infektion durch enterale Aufnahme durch
kontaminiertes Wasser, Essen, Hände oder Oberflächen im Gegensatz zum Hepatitis-A-Virus
(HAV) (Torpy et al., 2011; Kuehn, 2014).
10
Literatur
4.1.8 Klinik
Die Inkubationszeit variiert zwischen 1 - 6 Monaten. Meistens liegt sie etwa bei 60 bis 90
Tagen (Aspinall et al., 2011). Hepatitis B hat eine große klinische Spanne. Unterschieden wird
zwischen einer akuten und einer chronischen Infektion. Die Erkrankung kann sowohl inapparent
als auch fulminant verlaufen. Eine sehr große Rolle spielen Alter, Immunstatus, HCC und
Koinfektionen der Betroffenen. Eine neu erworbene Infektion im Erwachsenenalter hat eine
gute Heilungsprognose. Die Ausheilung bei erworbener Infektion im Kindesalter ist jedoch sehr
gering und nimmt meist einen chronischen Verlauf. Zum Beispiel zeigen nur < 10 % der Kinder
unter fünf Jahren Symptome dieser Krankheit. Dadurch wird trotz des signifikant erhöhten
Risikos, an chronischer HBV zu erkranken, die Infektion erst im Erwachsenenalter diagnostiziert.
Wohingegen sich bei Erwachsenen mit 30 - 50 % ein klinisch apparenter Verlauf zeigt. Das
Risiko, dass sich eine chronische Infektion entwickelt, zeigt sich sehr stark bei Neugeborenen
mit 80 - 90 %, dieses Riskiko nimmt bei Kindern mit 30 - 60 % ab und ist bei Erwachsenen
mit < 5 % am geringsten (Cornberg et al., 2011; Kwon and Lee, 2011; Samal et al., 2012).
Das Hepatitis-B-Virus selbst ist nicht zythopathogen. Die Leberzellschädigung wird durch die
Immunreaktion des Wirtes verursacht (Guidotti et al., 1996; Chang and Lewin, 2007).
Die klinischen Symptome im Prodromalstadium sind von anderen akuten viralen Leberentzündungen nicht zu unterscheiden. Leichte Anzeichen von Unwohlsein, Erschöpfung bis hin zu
grippeähnlichen Erscheinungen wie Anorexie, Übelkeit und Vomitus kennzeichen den beginnenden Krankheitsverlauf in den ersten Wochen. Die Lebermanifestation zeigt sich durch einen
hepatozellulären Ikterus und die oft sehr schmerzhafte Hepatomegalie. Die akute HBV-Infektion
heilt beim Großteil der Erwachsenen wieder vollständig aus. Nur 5 % von ihnen, darunter
hauptsächlich Männer, entwickeln eine chronische Form. Etwa 10 - 20 % dieser Betroffenen
erkranken an einer Leberzirrhose oder an einem hepatozellulärem Karzinom. Der Großteil
der erwachsenen chronisch infizierten Patienten, etwa 80 - 90 %, erfahren eine vollständige
Genesung über einen Zeitraum von 2 - 5 Jahren (Dienstag, 1981; Gitlin, 1997).
4.1.9 Hepatozelluläres Karzinom (HCC)
Die Korrelation zwischen der Erkrankung einer chronischen Hepatitis-B-Infektion und dem
Auftreten des hepatozellulären Karzinomes wurde in vielen Untersuchungen beschrieben. Ursprünglich galten nur Mykotoxine als mögliche Auslöser vom HCC. Jedoch fiel auf, dass sich
das Leberzellkarzinom für gewöhnlich in Lebern mit großknotigen Zirrhosen entwickelte. Global
betrachtet ist HBV in ca. 75 - 90 % die ätiologische Ursache für das Entstehen von Leberzellkarzinomen (Beasley, 1988). HCC ist weltweit die fünfhäufigste Krebsart bei Männern
11
Literatur
und die achthäufigste bei Frauen. Mit rund 90 % ist es die vorherrschende Form aller Leberkrebse. Jährlich sterben über eine halbe Millionen Menschen daran. Das Risiko steigt um ein
Hundertfaches an, wenn eine chronische HBV-Erkrankung zusammen mit einer Leberzirrhose
vorliegt. Die Behandlungsmöglichkeiten sind aufgrund der Komplexität dieses Tumors stark
eingeschränkt und zur Zeit gilt Sorafenib, ein Proteinkinasehemmer, als Mittel der Wahl für die
HCC-Therapie, jedoch hat dieses Medikament viele Nebenwirkungen. Sorafenib verlangsamt das
Wachstum der Krebszellen und unterbindet die Blutversorgung zu ihnen. Auch Leberresektion,
-transplantation, Hochfrequenzablation und eine transarterielle Chemoembolisation werden zur
Behandlung genutzt. Die genaue Therapie muss individuell angepasst werden und hängt vom
jeweiligen Stadium ab (Jelic and Sotiropoulos, 2010; Villanueva et al., 2013; Daoudaki and
Fouzas, 2014). Die Neuerkrankung und die Sterberate durch das hepatozelluläre Karzinom ist
nur übertroffen vom Bauchspeicheldrüsenkrebs (Yeo et al., 2010).
4.1.10 Diagnostik
Wichtigstes Kriterium eines guten Diagnostikverfahrens ist die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Untersuchungsergebnisse. Serologische Testverfahren sind für die diagnostische
Untersuchung essentiell. Sowohl HBV-Antigene als auch Antikörper sind bei Raumtemperatur
über mehrere Tage stabil. Die Lagerung bei +4 °C macht die Probe noch nach Monaten und
im gefrorenen Zustand bei -20 bis -70 °C für mehrere Jahre nutzbar (Krajden et al., 2005).
Eine Übersicht der Marker ist in Tab. 4.1 dargestellt.
Tab. 4.1: Übersicht der serologischen und virologischen Marker von HBV. In Klammern = auch in dieser Form möglich
(modifiziert nach Krajden et al., 2005; Liang, 2009).
diagnostische marker
Auftreten
HBsAg
akute u. chronische Infektion
Anti-HBs
ausgeheilte HBV-Infektion o. Marker für die
HBV-Impfung
HBV-DNA
zeigt Level der HBV-Replikation
Anti-HBc Total
(akute), ausgeheilte o. chronische Infektion
Anti-HBc (IgM)
akute, (chronische) HBV-Infektion
Anti-HBc (IgG)
ausgeheilte o. chronische HBV-Infektion
Anti-HBc (IgG) und HBsAg
chronische HBV-Infektion
12
Literatur
prognostische/
überwachende Marker
HBeAg
hohes HBV-Replikationslevel u. Infektiösität;
akute, (chronische) HBV-Infektion
Anti-HBe
niedriges HBV-Replikationslevel u. Infektiösität;
Marker für Behandlungsantwort
HBV-DNA
akute, (überstandene) u. chronische HBV-Infektion
Das Mittel der Wahl, um eine Hepatitis-B-Infektion zu diagnostizieren, ist in den meisten Fällen
die Blutuntersuchung des Patienten. Mit Hilfe eines Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(ELISA, Kap. 7.4.3) ist die Detektion vom vorhandenen Oberflächenprotein des Viruses mit
einer Sensitivität und Spezifität von über 98 % möglich. Ist der Nachweis vom HBsAg über
einen Zeitraum von sechs Monaten hinaus gegeben, liegt eine chronische Hepatitis-Erkrankung
vor. In diesem Fall kann die virale DNA im Serum durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR,
Kap. 7.2.7) vervielfältigt und ermittelt werden. Bei der chronischen Form sind die Leberwerte
beim Leberfunktionstest erhöht und die Leberbiopsie zeigt pathologische Befunde. Erhöhte
Leberparameter, wie zum Beispiel ein hoher Alanin-Aminotransferase-Wert (ALT) oder ein
gesteigerter Alpha-1-Fetoprotein-Status (AFP), weisen auf eine Zerstörung von Hepatozyten
hin, nicht auf die Ursache der Lebererkrankung (Abb. 4.7 und 4.8). Welche Ausmaße und
Veränderungen im Gegensatz zum physiologischen Zustand vorliegen, kann mit dem Einsatz von
Ultraschall, Computertomographie und Magnetresonanztomographie näher bestimmt werden
(Bialecki and Di Bisceglie, Adrian M, 2005; Mitka, 2014).
Abb. 4.7: Klinischer Verlauf und serologisches Profil einer akuten Hepatitis-B-Infektion. Erklärung siehe Text (modifiziert
nach Liang, 2009; mit Genehmigung von John Wiley and Sons).
13
Literatur
Abb. 4.8: Klinischer Verlauf und serologisches Profil einer chronischen Hepatitis-B-Infektion. Erklärung siehe Text (modifiziert nach Liang, 2009; mit Genehmigung von John Wiley and Sons).
4.1.11 Therapie
Die Art der Behandlung von Hepatitis-B-Infizierten ist individuell unterschiedlich. Bei einer
akuten HBV-Erkrankung wird in der Regel keine Therapie begonnen. Die akute Form ist zu
einem sehr großen Teil selbstlimitierend. Bei einem sehr milden Verlauf einer chronischen
HBV-Erkrankung wird diese meist nur überwacht. Bei Verschlechterung des Patientenzustandes
erfolgt eine Behandlung. Bei einem schweren Verlauf einer chronischen HBV-Infektion spielt
die Funktionseinschränkung der Leber und die Höhe der nachweisbaren HBV-DNA im Blut eine
entscheidende Rolle (Cornberg et al., 2011).
Für die Monotherapie stehen zur Zeit zwei antivirale Medikamentenklassen, die Interferone
und die Nukleosid-/Nukleotidanaloga, zur Verfügung. Ziel der Behandlung ist die Bekämpfung
des HBsAg im Blut des Patienten und der Aufbau eines entsprechenden Anti-HBs-Titers.
Ein HBV-DNA-freies Blut ist als Indikator für eine erfolgreiche Virusreduktion anzusehen.
Das Problem ist die cccDNA im Kern der Hepatozyten sowie die integrierte HBV-DNA im
Genom. Die verwendbaren Medikamente können nur die Virusreplikation verhindern, nicht
aber die HBV-DNA aus dem Kern entfernen. Es besteht mit diesen Medikamenten nur die
Möglichkeit, den Krankheitsverlauf der chronischen Hepatitis B abzuschwächen und das Risiko
von Spätfolgen zu minimieren (Bayliss et al., 2013). Mögliche Koinfektionen zum Beispiel mit
HIV oder dem Hepatitis-C-Virus erschweren zusätzlich die Behandlung (Crockett and Keeffe,
2005; Sun et al., 2014).
14
Literatur
4.1.12 Prävention
Die Aufklärung ist der Schlüssel für erfolgreiche Strategien zur Bekämpfung von HBVErkrankungen. Das Einhalten von Hygienerichtlinien und Impfungen ist von größter Bedeutung,
um flächendeckend das Risiko, an einer Hepatitis-B-Infektion zu erkranken, zu minimieren.
Das beste Mittel zum Schutz der Menschen ist eine Unterbrechung der Übertragung des
Virus. Nicht nur der Schutz von Nichtinfizierten steht im Fokus, auch eine gute Überwachung
der HBV-Patienten muss gegeben sein. Es sollte alle sechs Monate eine Kontrolle beim Arzt
erfolgen, um frühzeitig Leberveränderungen zu erkennen und nächste Behandlungsschritte
einzuleiten (Hwang, 1999).
Der momentan verwendete Impfstoff besteht nur aus den nicht-infektiösen Oberflächenproteinen
des Hepatitis-B-Virus. Die Impfung erfolgt nach null, eins und sechs Monaten (WHO, 2009;
Komatsu, 2014). Laut Empfehlung der WHO sollen alle Neugeborenen ihre erste HBV-Impfung
so schnell wie möglich bekommen. Innerhalb der ersten 24 h nach Geburt sollte die Injektion
erfolgen. Der ersten Impfdosis folgen zwei oder drei weitere, um eine Grundimmunisierung
aufzubauen. Die Anti-HBs-Prävalenz ist der wichtigste Baustein, um den Erfolg der Immunisierung messen zu können (WHO, 2010). In Deutschland besteht keine Impfpflicht. Es gibt aber
Empfehlungen von der Ständigen Impfkommission am Robert-Koch Institut zu Schutzimpfungen.
Diese sehen eine Impfung gegen Hepatitis B vor (Robert-Koch-Institut, 2013). Rund 90 - 95 %
der Bevölkerung zeigen eine gute Immunantwort auf den verfügbaren Impfstoff.
Die Gruppe der non-responder sind Patienten, die nach einer mehrmaligen Impfung einen
Anti-HBs-Titer < 10 mIU/ml zeigen. Diese Personen haben keine ausreichende Immunität
gegen HBV entwickelt. Neueste Forschungen versuchen einen Weg über die intradermale
Route im Gegensatz zur konventionellen intramuskulären Verabreichung zu finden, um die
Immunantwort in non-respondern zu steigern sowie das LHBsAg als Impfstoffkomponente
einzubeziehen (van Herck et al., 2007; Filippelli et al., 2014).
4.2 Paxillin
4.2.1 Einleitung
Die komplexen Interaktionen zwischen Zellen und der umgebenden extrazellulären Matrix
sind von großer Bedeutung hinsichtlich der aktivierenden und regulierenden Prozesse bei der
Zellhaftung, -wanderung, -morphogenese, Wundheilung sowie der Tumorentstehung. Sie werden
durch chemische und mechanische Stimulation mediiert. Die extrazelluläre Matrix setzt sich
aus einer Vielzahl von Matrixmolekülen zusammen, hier unterscheidet man die Glykoproteine
wie Fibronektin, Kollagen, Laminin und Proteoglykane. Zu den Nicht-Matrixproteinen gehören
15
Literatur
zum Beispiel die Wachstumsfaktoren (Berrier and Yamada, 2007). Liegen funktionelle Defekte
oder Störungen in diesem komplexen System der Zellerhaltung und -umgebung vor, droht eine
negative Entwicklung in Form von Dysplasie, Gewebedegeneration und Hypertrophie bis hin
zur Metastasierung.
Ein wichtiger Baustein bei der Zellintegrität und Signaltransduktion ist Paxillin, es ist dem
Zytoskelett der Zelle zugeordnet und an den focal adhesions (FAs oder Zell-Matrix-Adhäsionen)
lokalisiert (Abb. 4.9). Dort dient es als signaltransduzierendes Adapterprotein. An den FAs
werden sowohl mechanische als auch regulatorische Signale zwischen dem extrazellulären Raum
und der Zelle vermittelt und eine Antwort der Zelle auf die äußeren sich ändernen Umstände
mediiert. Bedingt durch den ständigen Signalaustausch verknüpfen und trennen sich beteiligte
Proteine von den focal adhesions. Dies zeigt den enormen funktionellen Aufgabenbereich wie
die Zellverankerung und Signalübermittlung, die das Verhalten der Zelle steuern. Die fokalen
Adhäsionsproteine werden in zwei Gruppen geteilt. Zu den strukturellen Proteinen zählen z. B.
Tensin, Vinculin und α-Actinin und zu den regulatorischen Proteinen die Focal Adhesion Kinase
(FAK) und Paxillin (Burridge and Chrzanowska-Wodnicka, 1996). In ruhenden Zellen weisen
FAs eine stabile Struktur auf. In beweglichen Zellen jedoch ist ein ständiger Auf- und Abbau
notwendig, um die Bewegung der Zelle zu ermöglichen (Webb et al., 2002).
Abb. 4.9: Aufbau von fokalen Adhäsionen. Fokale Adhäsionen verbinden das Zytoskelett der Zelle mit dem extrazellulären
Raum. Durch sie finden eine Zellverankerung und ein ständiger Signalaustausch mit der Umwelt statt, welcher das Verhalten der
Zelle steuert. Die fokalen Adhäsionsproteine werden in zwei Gruppen geteilt. Zu den strukturellen Proteinen zählen Tensin, Vinculin
und α-Actinin und zu den regulatorischen Proteinen die Focal Adhesion Kinase (FAK) und Paxillin. Die Integrine verbinden die
EZM mit dem Zellinneren durch ihre transmembrale Lage (modifiziert nach University of Reading, 2015).
16
Literatur
4.2.2 Aufbau und Struktur
Paxillin wurde 1990 von Keith Burridge entdeckt. Es ist an den focal adhesions lokalisiert und
dient durch seine Vielzahl an Bindungsstellen als Adaptor für strukturelle und regulatorische
Proteine. Das Protein besteht aus 559 Aminosäuren und ist 68 kDa groß. Es weist eine bis zu
90%ige Sequenzübereinstimmung zwischen Hühnern und Menschen auf. Neben der ubiquitären
α-Form gibt es zwei zusätzliche Spleißvarianten, die β- und γ-Isoform. Sie konnten bis jetzt
in Mäusen und Menschen nachgewiesen werden. Wie in Abb. 4.10 zu sehen ist, besitzen
sie zusätzliche Sequenzen im Amino-Terminus (N-Terminus). Diese Proteinfamilie umfasst
auch Hic-5, Leupaxin und PaxB, welche eine Vielzahl von strukturellen Eigenschaften und
Bindungspartner von Paxillin teilen. Es wird vermutet, dass diese Proteine durch Antagonisierung
von Paxillin dessen Funktion erst vollständig ermöglichen (Turner, 2000).
Der Amino-Terminus besitzt fünf leucinreiche Regionen, sogenannte LD motifs, welche bei
der Proteinidentifizierung helfen. Hier binden Partner wie Vinculin, FAK und Actopaxin. Im Nterminalen Abschnitt befindet sich auch eine prolinreiche Domäne, welche als SH3-Bindungsstelle
(Src-homology 3 ) dient. Daneben gibt es einige SH2-Bindungsdomänen (Src-homology 2 ),
welche durch Phosphorylierung von Tyrosinresten (PY) gebildet werden. Sie sind notwendig für
die Verknüpfung mit den zytoplastischen Kinasen, Src und Csk sowie dem Adaptorprotein Crk.
Der Carboxyl-Terminus (C-Terminus) besteht aus vier cysteinreichen Regionen, jede mit zwei
Zinkfingern, sie werden als LIM domains bezeichnet. Sie sind wichtig für die Protein-ProteinInteraktionen und verbinden Paxillin mit unterschiedlichen Signaltransduktionskaskaden. Die
FA-Zielsequenz ist auf der C-Terminushälfte lokalisiert. Durch die Phosphorylierung von Serinund Threoninresten in diesem Bereich wird die Bindungsbereitschaft mit den focal adhesions
verstärkt. Die LIM domain 3 spielt eine große Rolle, um Paxillin in die FAs einzubauen (Schaller,
2001; Brown and Turner, 2004; Webb et al., 2005).
17
Literatur
Abb. 4.10: Struktur und Aufbau der Paxillinfamilie. Paxillin besteht aus 559 Aminosäuren und ist 68 kDa groß. Es gibt
die α-, β- und γ-Isoform. Paxillin besitzt im N-terminalen Teil fünf leucinreiche Regionen (LD motifs), eine prolinreiche Domäne
und einige SH2-Bindungsdomänen. Der C-terminale Teil ist aus vier cysteinreichen Regionen, jede mit zwei Zinkfingern (LIM
domains), aufgebaut. Die FA-Zielsequenz ist auf der C-Terminushälfte lokalisiert. Die Proteine Hic-5, Leupaxin und PaxB weisen
ähnliche Strukturen auf, wobei in der Abb. zu sehen ist, dass die SH3-Domäne und die entscheidenden Phosphorylierungsstellen
fehlen (modifiziert nach Turner, 2000; mit Genehmigung der Nature Publishing Group).
4.2.3 Interaktion und Funktion
PXN ist ein Mitglied der fokalen Adhäsionsproteine und wurde durch die erhöhte Tyrosinphosphorylierung durch die v-Src-Expression entdeckt. Es wurde zuerst im glatten Muskelgewebe
isoliert. Die Abb. 4.11 zeigt eine kleine Übersicht der für die Arbeit relevanten Bindungspartner
von Paxillin. Die Regulation und Lokalisation der Proteine in den focal adhesions kann nur
schemenhaft dargestellt werden und ist bei weitem komplexer. Die Anzahl der Proteine, ihre
Funktion und Bindungspartner hängen vom Zustand der Zelle ab (Brown and Turner, 2004).
18
Literatur
Abb. 4.11: Paxillinbindungspartner. (A) Paxillin ist ein Adaptor für eine Vielzahl von Proteinen, die an der Intergrin- und
Wachstumsfaktorsignaltransduktion beteiligt sind. Die Proteine Focal Adhesion Kinase (FAK), Src und die Tyrosinkinase ABL
(Abelson murine leukemia, nicht dargestellt) werden durch die Verbindung der EZM mit Integrin oder durch die Stimulation des
Wachstumsfaktors durch die Rezeptortyrosinkinase (RTK) aktiviert. Adaptorproteine wie Crk können durch die Phosphorylierung
von Paxillin, welche durch FAK und Src erfolgt, Bindungsstellen an den focal adhesions besetzen. Zudem phosphoryliert Src das
Adaptorprotein Cas und der Komplex aus Crk und FAK binden es. Dieser nun entstandene Proteinkomplex aktiviert den MAPKinase-Weg (mitogen-activated protein kinase). Eine Inaktivierung von Cas erfolgt durch die paxillinabhängige Tyrosinkinase Csk
an die FAs und die Tyrosinphosphatase PTP-PEST. Es wird vermutet, dass die Wachstumsfaktor- und Integrinsignalübertragung
verstärkt werden kann, wenn Paxillin den PKL–PIX–PAK–Nck-Komplex an sich bindet. PAK aktiviert den MAPK-Weg und
ist für die Rac-vermittelte Reorganisation des Zytoskelettes verantwortlich. (B) Vinculin und Actopaxin sind an Paxillin und
Aktinfilamente gebunden. Die Integrine werden durch Talin und α-Actinin an Aktin gebunden. Die Zellbewegung ist durch die
phosphorylierungsabhängige Verbindung von Crk an Paxillin bedingt. Der Umbau der focal adhesions wird durch Paxillin, den
PKL–PIX–PAK–Nck-Komplex und die PTP–PEST ermöglicht. Die Dephosphorylierung von Cas lässt die Cas–Crk-Verbindung
abreißen. Auch die Bindung von Mikrotubuli an Paxillin kann die Destabilisierung der FAs hervorrufen und die Zellbewegung
steuern (modifiziert nach Turner, 2000; mit Genehmigung der Nature Publishing Group).
Paxillin LD motifs
Der N-terminale Teil von Paxillin beinhaltet fünf leucinreiche Sequenzabschnitte (Tab. 4.2),
sie sind als Bindungsstellen für Struktur- und Regulationsproteine wichtig. Diese steuern
Änderungen des Aktinzytoskeletts und somit auch die Zellbewegung und -adhäsion sowie die
Expression von Genen. Es wird vermutet, dass die Interaktion mit Paxillin der Schlüssel zu einer
normalen subzellulären Lokalisation der Adhäsionsproteine (Vinculin, Actopaxin, Integrin-linked
Kinase und Paxillin-Kinase Linker) ist (Tumbarello et al., 2002).
19
Literatur
Tab. 4.2: Übersicht der direkten und indirekten Bindungspartner der Paxillin LD motifs. FAK = Focal Adhesion Kinase,
PIX = PAK interacting exchange factor , PKL = Paxillin-Kinase Linker, PAK = P21 activated kinase, Nck = non-catalytic region
of tyrosine kinase adaptor protein (modifiziert nach Turner, 2000).
Paxillin
LD motifs
direkte Bindungspartner
indirekte Bindungspartner
LD1
Actopaxin, Vinculin,
Aktin (über Actopaxin + Vinculin)
Papillomavirus E6 Protein
LD2
Vinculin, FAK
—
LD3
—
—
LD4
Vinculin (schwach), FAK, PKL
PIX (über PKL), PAK (über PIX),
Nck (über PAK)
LD5
—
—
Paxillin LIM domains
Die Serinreste 188 und 190 im N-terminalen Teil von Paxillin gelten als Hauptphosphorylierungsstellen bei der Adhäsion an Fibronektin. Erst nach Bindung an Fibronektin wird über die
Phosphorylierungstellen der LIM domains im C-terminalen Teil von Paxillin die Lokalisation an
den focal adhesions bestimmt. Der C-terminale Teil von Paxillin besteht aus vier cysteinreichen
Regionen, jede mit zwei Zinkfingerdomänen. Die LIM3-Domäne ist unerlässlich für die Bindung
von Paxillin an die focal adhesions. Die Phosphorylierung der LIM2- und der LIM3-Region
erfolgt durch Serin-(PS)/Threoninkinasen (Brown et al., 1998; Turner, 1998).
Paxillin-binding Subdomain (P-BS)
Die Paxillin-binding Subdomain dient den Proteinen als Verbindungsmodul mit den Paxillin
LD motifs. Sie wurde zuerst bei Vinculin und FAK entdeckt. P-BS ähnliche Sequenzen konnten
auch bei anderen LD motif -bindenen Proteinen wie Actopaxin, ILK und PKL nachgewiesen
werden. Bis heute ist jedoch der genaue Verbindungsmechnismus zwischen der Paxillin-binding
Subdomain und den LD motifs von Paxillin ungeklärt. Es wird vermutet, dass die Heterogenität
zwischen den einzelnen P-BSs der Proteine die Grundlage für die selektive Bindung an bestimmte
LD motifs von Paxillin bildet (Tumbarello et al., 2002).
Integrin
Integrine sitzen fest verankert in der Zellmembran und setzen sich aus einer α- und einer βUntereinheit zusammen. Diese wiederum besitzen eine große extrazelluläre Domäne für die
Verbindung mit Matrix-Proteinen (z. B. Laminin oder Fibronektin) und eine kleine intrazelluläre
20
Literatur
Domäne für die Verknüpfung mit den Signalproteinen und dieser mit dem Aktinzytoskelett.
Sie werden den Transmembranproteinen zugeordnet und verbinden Zellen untereinander sowie
mit der EZM. Integrine können so durch die Umwandlung von äußeren mechanischen Reizen in innere chemische Signale die Signaltransduktion ermöglichen, sie sind ein essentieller
Bestandteil der focal adhesions. An den FAs erfolgt die An- und Abkopplung der Proteine
an der zytoplasmatischen Seite durch posttranslationale Modifikationen der Integrine, insbesondere durch Phosphorylierung. Wichtig in diesem Zusammenhang der Regulierung der
Integrin-assoziierten Proteine sind die Fokal Adhesion Kinase und die Integrin-linked Kinase.
Eine direkte Bindung von Paxillin an die intrazelluläre Domäne von β1- und β3-Integrin mit
α4-Untereinheit konnte gezeigt werden. Hier agiert Paxillin in der Funktion der Regulation der
Zellvermehrung und -bewegung (Schaller, 2001; Brown and Turner, 2004). Die Bindung von
Integrinen an extrazelluläre Matrixliganden (z. B. Fibronektin) wird durch den Anstieg von
Tyrosin-phosphorylierten Formen der beteiligten fokalen Adhäsionsproteine vermittelt. Besonders hoch ist die Tyrosinphosphorylierungsrate bei der Fokal Adhesion Kinase und Paxillin bei
entsprechender Integrinaktivität (Bellis et al., 1995).
Focal Adhesion Kinase (FAK)
Die Phosphorylierung von Paxillin ist eng gekoppelt mit der FAK-Aktivität. Die Aktivität
von FAK wird durch das Zusammenlagern von Integrinen (clustering) hervorgerufen. Diese
Aktivierung kann die Bindung von der Tyrosin-Protein Kinase Src zur Folge haben. Im Nterminalen Teil von Paxillin wurden die Phosphorylierungsstellen (PY31 und PY118 ) für
FAK nachgewiesen. Die Bindung an die LD2- und LD4-Domäne von Paxillin geschieht mit
Hilfe der focal adhesion targeting (FAT) domain im N-terminalen Teil der Focal Adhesion
Kinase. FAT stellt über Paxillin und Talin die Verknüpfung zur β-Untereinheit der Integrine
her. Die Phosphorylierungsstellen im LD4 motif von Paxillin fördern neben der GIT1-Bindung
auch die Reduzierung der Anziehung, FAK an dieses Motiv zu binden. Das deutet darauf hin,
dass Paxillin so den GIT1-mediierten Signalweg unterstützt und gleichzeitig die Aktivität und
Lokalisation von FAK bestimmen kann, welches selbst eine Schlüsselrolle in der Aktivierung der
RhoA-Aktivität einnimmt. FAK selbst benötigt nur eine LD motif -Bindungsstelle, um einen
Platz in den focal adhesions einzunehmen. Jedoch ist eine Verknüpfung von FAK mit beiden
LD motifs für seine vollständige Beteiligung am Signal- und Downstream-Weg notwendig. Es
scheint so, als besitze Paxillin, die Möglichkeit durch seine Phosphorylierung am LD4 motif, die
Lokalisation von FAK und Rac1 fein regulieren zu können und damit die Interaktionen bezüglich
des GIT1-PIX-PAK-Nck-Komplexes zu steuern. Das zeigt, dass die Tyrosinphosphorylierung
durch FAK und Paxillin sowohl eine Änderung in der Formationsanordnung der focal adhesions
als auch bei der Assemblierung an die Aktinfilamente bedingt (Bellis et al., 1995; Deakin and
Turner, 2008).
21
Literatur
Integrin-linked Kinase (ILK)
Die Integrin-linked Kinase ist eine Serin-/Threoninkinase. Der N-terminale Teil mit seinen
vier Ankyrin-Repeats interagiert mit dem LIM-only adaptor PINCH (particularly interesting
cysteine- and histidine-rich protein) und Parvin (Legate et al., 2006). Die Carboxyl-Domäne
beinhaltet die Kinaseaktivität und zudem die Bindungsstelle für die β1-Integrinuntereinheit.
In vitro konnte nachgewiesen werden, dass die Integrin-linked Kinase direkt an das LD1 motif
von Paxillin gebunden ist, dies geschieht über eine paxillin-bindene Subdomäne im C-terminalen
Teil. Zudem zeigte die Co-Immunpräzipitation von Lysaten aus Fibroblasten, dass die Verbindung
von IKL und PXN in vivo sowohl in adhärenten Zellen als auch in Zellsuspension besteht. Die
Immunfluoreszenzmikroskopie untermauerte die Kolokalisation der beiden Proteine. ILK wird
mit Funktionen im Integrin-, Wachstumsfaktor- und Wnt-Signaltransduktionsweg assoziiert.
Auch bei Integrin-mediierten Zellvorgängen wie die Zelladhäsion, die Assemblierung an die
Fibronektinmatrix und die zelladhäsionsabhängige Zellzyklusentwicklungen spielt es eine Rolle.
Für den gezielten Einsatz an den focal adhesions muss die Integrin-linked Kinase an Paxillin
gebunden sein (Nikolopoulos and Turner, 2001).
Vinculin
Vinculin zählt zu den strukturellen Adhäsionsproteinen. Es erfüllt hauptsächlich Aufgaben im
Aufbau und in der Verknüpfung von Proteinen und Zellen. Vinculin wird durch die vinculin tailDomäne (Vt) an Paxillin gebunden und bindet auch an die Aktinfilamente (HOELLERER et al.,
2003).
Parvin
Parvin liegt in der α- und β- Form vor. Dieses Protein bindet an die zytoplasmatischen Domänen
der β1- und β3-Integrinuntereinheiten und kann auch direkt an Aktinfilamente gebunden sein.
Es mediiert zudem die Verknüpfung von anderen aktinbindenen-Proteinen sowie α-Actinin oder
Vinculin, welches wiederum mit Paxillin interagiert (Widmaier et al., 2012).
Actopaxin
Dieses Protein ist mit Aktin verknüpft. Actopaxin weist eine fehlerhafte Paxillinbindung bei einer
Überexpression der Paxillin-binding Subdomain auf. Die Folge ist eine gestörte Zelladhäsion
und -vermehrung von Kollagen. Die Vermutung liegt nahe, dass dies durch die defekte aktopaxinabhängige Kernbildung und Assemblierung der Aktinfilamente geschieht (Tumbarello et al.,
2002). Actopaxin wird durch seine zweite CH-Domäne an Paxillin gebunden (HOELLERER
et al., 2003).
22
Literatur
CRK
Die Tyrosinreste im N-terminalen Teil von Paxillin dienen als SH2-Bindungsdomänen für das
Adapterprotein Crk an Paxillin, welche durch die Anbindung von FAK phosphoryliert wurden.
Crk spielt bei der Modulation der Ras-Familie in der Signaltransduktion eine Rolle (Brown
et al., 1998).
F-Aktin
Aktin ist ein Strukturprotein, das in allen eukaryotischen Zellen vorhanden ist. Es ist Bestandteil
des Zytoskeletts. F-Aktin steht für aneinander gereihte dynamische Aktinfilamente, welche die
Zellform, die Ausbildung der Zellfortsätzen, intrazelluläre Verlagerungen und gerichtete zelluläre
Bewegungen stabilisieren.
Paxillin-Kinase Linker (PKL)
Der Paxillin-Kinase Linker bindet nur an die LD4-Domäne von Paxillin. So entsteht eine
Interaktion von Paxillin mit einem Proteinkomplex bestehend aus dem Rac-Faktor, PAK und
dem SH2-SH3 Adaptorprotein Nck sowie dem PIX/COOL. Die sogenannten PIX/COOLProteine binden an die kleinen Rho-GTPasen und Kinasen der Pak-Familie (Tumbarello et al.,
2002).
Tyrosinkinase c-Src (cellular and sarcoma)
Die Tyrosinkinase liegt im Zytosol der Zelle vor und ist mit der Zellmembran assoziiert. C-Src
wird durch das gleichnamige Protoonkogens SRC kodiert. Es ist aus vier Src-Homologiedomänen
(SH1-4) aufgebaut. Die SH1-Domäne beinhaltet die Kinaseaktivität und steuert die Phosphorylierung von Tyrosin. Die SH2- und SH3-Region dienen als Bindungsstellen und bedingen
so die Regulation von c-Src. Um die Verankerung in der Zellmembran sicherzustellen, ist die
SH4-Domäne verantwortlich. Mit Hilfe der Phosphorylierung und Dephosphorylierung eines
Tyrosinrestes im C-terminalen Teil wird die Tyrosinkinase aktiviert oder inaktiviert. C-Src hat
viele Bindungspartner, wie zum Beispiel FAK und Cas und kann durch diese, unabhängig
von der eigenen Phosphorylierung, kompetitiv gebunden und aktiviert werden. Mit Hilfe der
Phosphorylierungsstellen im N-terminalen Teil von Paxillin kann Src gebunden werden. Csk ist
ein negativer Regulator von c-Src (Turner, 1998; Roskoski, 2004).
Andere Bindungspartner
Tubulin nutzt die LIM2- und LIM3-Domäne als Bindungspartner von Paxillin, PTP-PEST
ist über LIM3 und LIM4 verknüpft (Brown and Turner, 2004). Paxillin hat die Fähigkeit,
23
Literatur
GIT-Proteine an die focal adhesions zu binden und dient somit bei der Disassemblierung und
der Verhinderung der Zellmobilität. Das G-protein-coupled receptor kinase-interacting protein
(GIT1) bindet an das LD4 motif von Paxillin (Deakin and Turner, 2008).
Die Zelladhäsion an die extrazelluläre Matrix ist eine essentielle Grundlage für die Regulierung
des Zellverhaltens. Dazu gehören zum Beispiel Zellbewegung, -proliferation und -differenzierung.
Somit stellt Paxillin einen entscheidenden Faktor in diesem Komplex dar.
4.2.4 Erkrankungen und Zukunft
Die physiologischen Funktionen von Paxillin sind überlebenswichtig für die Zelle. In der embryonalen Phase hilft das Protein bei der Steuerung der normalen Entwicklung des Individuums.
Fehlt Paxillin im frühen Embryonalstadium, ist eine hohe Letalität die Folge (Hagel et al., 2002).
Durch seine Position in den focal adhesions ist es auch wichtig für den Eintritt bestimmter Viren
in die Zelle, dies konnte am Beispiel des humanen Zytomegalievirus (HZMV) nachgewiesen
werden. Durch fehlerhafte Paxillinexpression oder Defizite im Intergin-Src-Paxillin-Signalweg ist
ein verringerter Eintritt von HZMV in die Monozyten die Folge (Nogalski et al., 2011). Schon
lange ist bekannt, dass die Zelladhäsion eine ganz entscheidende Rolle bei der Tumorentstehung
einnimmt. Paxillin ist in fast allen Zellen vorhanden, nur im Nervensystem findet man es in sehr
geringer Konzentration. Viele der Phosphorylierungsstellen im N-terminalen Teil von Paxillin
konnten in Tumoren und Krebszelllinien detektiert werden. Der Tumor muss eine genaue Steuerung der Paxillinexpression regulieren, um eine bestmögliche Invasions- und Wachstumsrate zu
erlangen. Somit konnte bewiesen werden, dass die Expression von Paxillin und Änderungen des
Phosphorylierungszustandes eng mit einer Vielzahl von malignen humanen Krebserkrankungen
verknüpft sind (Tab. 4.3) (Turner, 1991; Deakin et al., 2012). Forschungsergebnisse zeigen,
dass Paxillin unter anderem Einfluss auf den Verlauf von Brust-, Lungen- und Magenkrebs hat
(Salgia et al., 1999; Vadlamudi et al., 1999; Xiao et al., 2014).
Tab. 4.3: Variabilität der Paxillinexpression in humanen Krebsarten. Die Zahlen geben Auskunft über die vorhandenen Studien
mit signifikanter Paxillinexpressionsänderung in Tumorgewebe im Vergleich zu Normalgewebe. Rot = erhöhte Paxillinexpression,
blau = verringerte Paxillinexpression (modifiziert nach Deakin et al., 2012).
Krebsarten
Paxillin
up↑
Bauspeicheldrüsenkrebs
1
Brust
1
Eierstock
6
Gebärmutterhals
2
Gehirn u. ZNS
5
Leukämie
down↓
6
1
10
24
Literatur
Eine Überexpression der FAK konnte in einer Vielzahl von humanen Krebsarten nachgewiesen werden, dazu zählt auch HCC. Interessanterweise konnte auch die signifikant erhöhte
Expression von Paxillin in HCV-bedingten HCCs bestätigt werden (Alisi et al., 2012). Eine
chronische Hepatitis-B-Erkrankung ist in den meisten Fällen die ätiologische Ursache eines
HCCs (Kap. 4.1.9). Da sowohl der genaue Eintritt des Virus in die Leberzelle als auch das
Wachstum eines hepatozellulären Karzinoms noch nicht vollständig geklärt werden konnte, kann
die Untersuchung von Paxillin in diesem Zusammenhang neue Hinweise geben. Es ist bekannt,
dass Fibronektin zu einer direkten Interaktion mit vielen Viren wie zum Beispiel mit HIV, dem
Rous-Sarkom-Virus, Myxoviren, Paramyxoviren und HAV fähig ist. Forschungsergebnisse zeigen,
dass HBV an das extrazellulär gelagerte Fibronektin in den humanen Lebersinusoiden über
die PreS2-Domäne bindet. Die Lebersinusoide werden mit Blut durchströmt und ermöglichen
dadurch eine Kontaktfläche von den im Blut zirkulierenden Hepatitis-B-Viren mit Fibronektin
und Heparansulfat-Proteoglykanen (Abb. 4.12). Diese Andockstellen sind äußerst wichtig und
man vermutet, dass hierdurch eine direkte Verbindung vom HBV im Blut mit den unzähligen
Rezeptoren in der Leberzellmembran geschaffen wird. Hier sind auch die äußerst funktionsreichen focal adhesions eingelagert. Fibronektin hilft dadurch zusammen mit spezifischen
Leberzellrezeptoren bei dem Viruseintritt in die Hepatozyten. Dieses unlösliche Fibronektin wird
durch Chondrozyten, Makrophagen oder Endothelzellen gebildet und kann sowohl Zellen an die
EZM binden als auch eine Verbindung zu Paxillin in den focal adhesions schaffen (Kap. 4.2.3).
Das bedeutet, ein Weg der Fibronektin-Paxillin-Interaktion ist über eine noch unbekannte
Kinase möglich, der zweite Weg führt über die Fibronektin-Integrin-Verknüpfung zu einem so
mediierten Einfluss auf Paxillin (Kap. 4.2.3 und 4.2.3) (Budkowska et al., 1995; Schulze et al.,
2007).
Abb. 4.12: Anatomie eines Leberlappens. Erklärung siehe Text (Seeger and Mason, 2000; mit Genehmigung der American
Society for Microbiology).
Paxillin reguliert sowohl das normale Überleben der Zelle als auch die Invasionsfähigkeit von
unterschiedlichsten Tumoren und wurde damit für die Forschung interessant. Es dient als
prognostischer Marker für eine Vielzahl von Krebsarten und wird in der Zukunft als potentieller
therapeutischer Baustein angesehen (Deakin et al., 2012).
25
5 Ansätze und Ziele der Arbeit
Die bisher veröffentlichten Ergebnisse zur Paxillinexpression in humanen malignen Krebserkrankungen sind nicht eindeutig und zeigen starke Schwankungen. Paxillin wird eine wichtige
Funktion bei der Invasions- und Wachstumsrate beim Tumorgeschehen zugeschrieben. Weltweit
gilt HBV in ca. 75 - 90 % als ätiologische Ursache für das Entstehen von Leberzellkarzinomen.
Ausgehend von dieser Beobachtung stellt sich die Frage, welchen Einfluss Paxillin auf eine
HBV-Infektion ausübt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss des Hepatitis-B-Virus auf
die Menge und intrazelluläre Verteilung von Paxillin bestimmt und umgekehrt der Effekt einer
Deregulation der Paxillinexpression auf den Lebenszyklus von HBV charakterisiert.
Da HBV vornehmlich in sich nicht-teilenden sessilen Zellen repliziert, sind eine stabile ZellmatrixInteraktion und somit auch stabile focal adhesions vorhanden. Zuerst wurde die Paxillinexpression in stabil HBV-exprimierenden und HBV-transienten Zellkultursystemen im Vergleich zu
Kontrolllinien sowohl auf Proteinebene als auch auf mRNA-Ebene untersucht. Durch Knockdown-Experimente wurde die Relevanz von PXN für die HBV-Expression überprüft. Nach den
veränderten Bedingungen erfolgte eine quantitative Analyse der Paxillinmenge und der Viruslast
sowohl innerhalb der Zellen als auch von den Überständen der sekretierenden HBV-Zellen. Um
auf subzellulärer Ebene die genaue Paxillinlokalisation innerhalb einer Zelle sowie mögliche
Kolokalisationen untersuchen zu können, wurde eine Immunfluoreszenzmikroskopie durchgeführt. Die nächste Ebene stellte das Infektionsmodell in primären humanen Hepatozyten dar. In
diesen Versuchen konnte die Paxillinmenge direkt während eines Infektionsverlaufes auf Proteinund mRNA-Ebene überprüft werden. Abschließend wurde anhand von Gewebeschnitten von
männlichen HBV-negativen und -positiven Mäusen sowie von HBV-negativen und an HBVassoziiertem hepatozellulärem Karzinomgewebe die Paxillinexpression beurteilt. Dies erfolgte
mit Hilfe der Hämatoxylin-Eosin-Färbung und einer Immunfluoreszenz.
Es ist möglich, dass HBV-spezifische Proteine eine Verbindung zu den focal adhesions über
eine Paxillinbindung erhalten. Diese Verknüpfung könnte Einfluss auf den Lebenszyklus des
Hepatitis-B-Virus haben und in Hinblick auf neue therapeutische Ansätze von Bedeutung sein.
26
6 Material
6.1 Zellen
6.1.1 Prokaryotische Zellen
Tab. 6.1: Prokaryotische Zellen.
Stamm
Beschreibung
Quelle
One Shot® TOP
10 E. coli
F- mcrA Δ(mrr- hsdRMS- mcrBC) φ80lacZΔM15
ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697
galE15 galK16 rpsL(StrR ) endA1λ
Invitrogen,
Karlsruhe
6.1.2 Eukaryotische Zellen
Tab. 6.2: Eukaryotische Zellen.
Stamm
Beschreibung
Quelle
Huh-7.5
Immortalisierte humane Hepatomzelllinie,
abstammend von Huh-7-Zellen (Blight et al., 2002).
AG Hildt
Hep G2
Immortalisierte humane Hepatomzelllinie (Knowles
et al., 1980).
AG Hildt
HepG2 2.2.15
Immortalisierte stabil HBV-exprimierende humane
Hepatomzelllinie, welche das 2,15-fache HBV-Genom
(Genotyp D) chromosomal beinhaltet. Entstammt der
Hep G2 Zelllinie (Sells et al., 1987).
AG Hildt
HepAD38
Immortalisierte stabil HBV-exprimierende humane
Hepatomzelllinie, welche das 1,2-fache HBV-Genom
(Genotyp D) beinhaltet. Entstammt der
Hep G2-Zelllinie (Ladner et al., 1997).
AG Hildt
PHH
Primäre humane Hepatozyten, welche aus
Gewebeproben nach einer partiellen Hepatektomie
isoliert wurden.
Universitätsklinikum
Frankfurt am Main
27
Material
6.2 Mäuse
Für die folgenden Versuche wurden männliche HBV-transgene und HBV-negative Mäuse
verwendet, da sie eine höhere HBsAg-Expression aufweisen als die weiblichen Tiere (Almog
et al., 1992; Guidotti et al., 1995).
Tab. 6.3:
Verwendete Mäuse für RNA-Proben, Proteinlysate und Gewebeschnitte. Kontr. = Kontrolltiere, HBVtg =
HBV-transgene Tiere, geb. = geboren, gest. = gestorben
Stamm
C57BL/6 („Black6“)
(Mekada et al., 2009)
Maus ♂
geb. / gest.
Quelle
# 901/1
(17.08./10.12.2012)
AG Hildt Tierbestand
# 901/2
(17.08./10.12.2012)
AG Hildt Tierbestand
# 901/3
(17.08./10.12.2012)
AG Hildt Tierbestand
# 910
(17.08./10.12.2012)
AG Hildt Tierbestand
Kontr.
C57BL/6-HBV1.3tg
HBVtg
(Guidotti et al., 1995)
# 69
(06.03./08.07.2013)
AG Hildt Tierbestand
# 123
(24.04./15.08.2013)
AG Hildt Tierbestand
# 124
(24.04./15.08.2013)
AG Hildt Tierbestand
# 125
(24.04./15.08.2013)
AG Hildt Tierbestand
28
Material
6.3 Gewebeschnitte
Tab. 6.4: Für Gewebeschnitte verwendete Mäuse- und Patientenlebern.
Maus ♂
Beschreibung
Quelle
# 910
E5775
AG Hildt Tierbestand
# 901/1
E5983
AG Hildt Tierbestand
# 901/2
E5984
AG Hildt Tierbestand
# 69
E5776
AG Hildt Tierbestand
# 123
E5987
AG Hildt Tierbestand
# 124
E5988
AG Hildt Tierbestand
HBV-negativ
K17211/07
Universitätsklinikum Tübingen
Institut für Pathologie und Neuropathologie
Abt. Molekulare Pathologie
chronisch HBV-infiziert
K2170/06
UniversitätsklinikumTübingen
Institut für Pathologie und Neuropathologie
Abt. Molekulare Pathologie
K12270/06
UniversitätsklinikumTübingen
Institut für Pathologie und Neuropathologie
Abt. Molekulare Pathologie
Kontrolltiere
HBV-transgene Tiere
Patienten
29
Material
6.4 Plasmide
Tab. 6.5: Verwendete Plasmide.
Plasmid
Beschreibung
Herkunft
pUC18
Kontrollvektor, Ampicillin-Resistenz
Invitrogen, Karlsruhe
pHBV1.2 (pJo19)
Beinhaltet das 1,2-fache HBV-Genom
(Genotyp D), Ampicillin-Resistenz.
Dr. Joachim Lupberger
pCEP-gtA-1.5
Kodiert für das 1,5-fache HBV-Genom
(Genotyp A), Ampicillin-Resistenz.
Prof. Dr. Glebe,
Universität Gießen
pCEP-gtD-1.5
Kodiert für das 1,5-fache HBV-Genom
(Genotyp D) (Melegari et al., 1998).
Dr. Kiyoshi Himmelsbach
pCEP-gtG-1.5
Kodiert für das 1,5-fache HBV-Genom
(Genotyp G), Ampicillin-Resistenz.
Prof. Dr. Glebe,
Universität Gießen
pEGFPN1
Kodiert für das enhanced Green fluorescent
protein, Kanamycin-Resistenz.
Clontech, SaintGermain-en-Laye
(Melegari)
6.5 siRNA
siRNA und benötigte Substanzen
Hersteller
paxillin siRNA (h)
Santa Cruz, Heidelberg
Control siRNA-A
Santa Cruz, Heidelberg
siRNA Dilution Buffer
Santa Cruz, Heidelberg
N-TER Nanoparticle siRNA Transfection System
Sigma-Aldrich, USA
30
Material
6.6 Oligonukleotide
Hersteller der verwendeten Oligonukleotide ist Biomers.net in Ulm.
Tab. 6.7: Verwendete Light-Cycler Primer. Fwd = forward, rev = revert.
Primer Nr.
Name
Sequenz (5’ → 3’)
#42
#43
GAPDH_fwd
GAPDH_rev
gac ccc ttc att gac ctc aac
tgg act gtg gtc atg agt cc
#185
#186
HBV_S_fwd
HBV_S_rev
aac atg gag aac atc aca tca g
tat acc caa aga caa aag aaa att gg
#260
#261
Maus_GAPDH_sense
Maus_GAPDH_antisense
cac caa ctg ctt agc ccc
tct tct ggg tgg cag tga tg
#393
#480
Paxillin_fwd
Paxillin_rev
atg gac gac ctc gac gcc
agg gtt gga gac act gga ag
#405
#406
HBV3.5kb_fwd
HBV3.5kb_rev
ctc caa gct gtg cct tgg g
ccc acc cag gta gct aga g
6.7 Antikörper
Die Primärantikörper und Sekundärantikörper für Western Blots (WB) wurden in 10 % Milchpulver und 1x TBS/T ggf. 5 % BSA in 1x TBS/T oder in 1x RotiBlock, für die Analyse im
Odyssey (LI-COR), oder für die Immunfluoreszenz (IF) in 10 % BSA und 1x TBS/T verdünnt.
Tab. 6.8: Antikörper und entsprechende Verdünnungen.
Antikörper
Spezies/
Klonalität
primäre
Antikörper
Verdünnung
Hersteller
(WB/LI-COR/IF)
Anti-β-actin
Maus, monoklonal
1:10000/1:6000/-
Sigma-Aldrich, USA
Anti-Paxillin
Maus, monoklonal
-/-/1:100
Merck, Darmstadt
Anti-Paxillin
(N-term)
Kaninchen, monoklonal
1:2000/1:3000/1:100
Merck, Darmstadt
Anti-HBcAg
(B0586)
Kaninchen, polyklonal
1:1000/-/1:100
Dako, Glostrup,
Dänemark
Anti-HBsAg
Ziege, polyklonal
-/-/1:100
Abcam, Cambridge
31
Material
Anti-HBsAg (HB01)
Maus, monoklonal
1:200/-/1:100
Prof. Dr. Glebe,
Universität Gießen
Anti-LHBsAg
(MA 18/7)
Maus, monoklonal
1:800/-/1:150
Prof. Dr. Glebe,
Universität Gießen
(Heermann et al.,
1984)
sekundäre
Antikörper
Anti-mouse
IgG-HRP
Esel, polyklonal
1:2000/-/-
GE Healthcare, Freiburg
Anti-rabbit IgG-HRP
Esel, polyklonal
1:2000/-/-
GE Healthcare, Freiburg
Anti-mouse IgG-680
Esel
-/1:10000/-
LI-COR Biosciences,
Lincoln, USA
Anti-mouse IgG-800
Esel
-/1:10000/-
LI-COR Biosciences,
Lincoln, USA
Anti-rabbit IgG-680
Esel
-/1:10000/-
LI-COR Biosciences,
Lincoln, USA
Anti-rabbit IgG-800
Esel
-/1:10000/-
LI-COR Biosciences,
Lincoln, USA
Anti-mouse
IgG-Alexa488
Esel, polyklonal
-/-/1:1000
Invitrogen, Karlsruhe
Anti-rabbit
IgG-Alexa488
Esel, polyklonal
-/-/1:1000
Invitrogen, Karlsruhe
Anti-mouse
IgG-Alexa546
Esel, polyklonal
-/-/1:1000
Invitrogen, Karlsruhe
Anti-goat IgG-Cy3
Esel, polyklonal
-/-/1:400
Jackson
ImmunoResearch Europe,
UK
Anti-rabbit IgG-Cy3
Esel, polyklonal
-/-/1:400
Jackson
ImmunoResearch Europe,
UK
-/-/1:800
Carl Roth, Karlsruhe
DAPI
32
Material
6.8 Größenstandards
Protein-Marker
Hersteller
PageRuler Prestained Protein Ladder
Fermentas, St.-Leon Rot
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder
Fermentas, St.-Leon Rot
DNA-Marker
GeneRuler 1 kb DNA Ladder
Fermentas, St.-Leon Rot
6.9 Chemikalien
Chemikalien
Hersteller
Agarose LE
Genaxxon, Biberbach
6-Aminohexansäure
Carl Roth, Karlsruhe
Ammoniumperoxidsulfat (APS)
Carl Roth, Karlsruhe
Ampicillin
Carl Roth, Karlsruhe
β-Mercaptoethanol
Sigma-Aldrich, Sleeze
Bovines Serumalbumin (BSA)
PAA, Österreich
Bradford Reagenz
Sigma-Aldrich, Sleeze
Bromphenolblau
Merck, Darmstadt
1-Butanol
Merck, Darmstadt
Chloroform
Carl-Roth, Karlsruhe
Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) (100 mM)
Genaxxon, Biberach
Ethanol 96 %
Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid
AppliChem, Darmstadt
Ethylendiamintetraacetat (EDTA)
Serva, Heidelberg
Formaldehyd 37 %
Carl Roth, Karlsruhe
Glycerin 99,5 %
GERBU, Heidelberg
Glycin
AppliChem, Karlsruhe
Immobilon Western HRP Substrat
Merck, Darmstadt
Isopropanol
Merck, Darmstadt
Kanamycin
Carl Roth, Karlsruhe
Luminata Forte Western HRP Substrat
Merck, Darmstadt
Magermilchpulver
Carl Roth, Karlsruhe
Methanol
Carl Roth, Karlsruhe
Mowiol
Sigma-Aldrich, Sleeze
Natriumacetat
Carl Roth, Karlsruhe
Natriumchlorid
Carl Roth, Karlsruhe
33
Material
Natriumdesoxycholat
AppliChem, Darmstadt
peqGold Trifast
PeqLab, Erlangen
Phenol
AppliChem, Darmstadt
Polyethylenimin (PEI)
Thermo Scientific, Karlsruhe
Random Hexamer Primer (200 ng/μl)
Fermentas, St. Leon-Rot
5x Reaktionspuffer für M-MuLV RT
Fermentas, St. Leon-Rot
RotiBlock (10x)
Carl Roth, Karlsruhe
Rotiphorese 40 Acrylamid/Bisacrylamid (29:1)
Carl Roth, Karlsruhe
10x RQ1 DNase I Puffer
Promega, Madison, USA
RQ1 Stop Solution
Promega, Madison, USA
Salzsäure
Carl Roth, Karlsruhe
Sodiumdodecylsulfat (SDS, 10 %)
Carl Roth, Karlsruhe
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate
Thermo Scientific, Karlsruhe
SYBR Green PCR Master Mix (2x)
Invitrogen, Karlsruhe
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Merck, Darmstadt
Triethylendiamin (DABCO)
Merck, Darmstadt
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)
Carl Roth, Karlsruhe
Triton X-100
Fluka, Deisenhofen
TWEEN 20 (Polysorbat 20)
Serva, Heidelberg
Xylol
Carl Roth, Karlsruhe
6.10 Enzyme
Enzyme
Hersteller
Revert AidTM H Minus M-MulV Reverse Transkriptase
Fermentas, St. Leon-Rot
RQ1 DNase I
Promega, Madison, USA
6.11 Kits
Kit
Hersteller
High Pure Viral Nucleic Acid Purification Kit
Roche, Mannheim
Enzynost HBeAg monoclonal
Dade Behring, Marburg
Enzynost HBsAg 5.0
Siemens Healthcare, USA
Quiagen Plasmid Maxi Kit
Quiagen, Hilden
34
Material
6.12 Lösungen für die Zellkultur
Produkt
Hersteller
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Genaxxon, Biberach
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
Lonza, Basel
(4,5 g/l Glukose, L-Glutamin)
fetales Kälberserum (fetal calf serum, FCS)
Biochrom, Berlin
Geneticin (G-418)
Calbiochem, Darmstadt
L-Glutamin
PBS ohne
Ca2+
PAA, Linz
und
Mg2+
PEI Medienküche
Penicillin/Streptomycin
PAA, Linz
Trypsin/EDTA
PAA, Linz
6.13 Puffer und Lösungen
Alle hier aufgeführten Puffer und Lösungen wurden mit doppelt deionisiertem Wasser (ddH2 O)
hergestellt.
Puffer und Lösungen
Zusammensetzung
SDS-Ladepuffer (4x)
4 % SDS (w/v)
125 mM TRIS-HCl pH 6,8
10 % Glycerin (v/v)
10 % ß-Mercaptoethanol (v/v)
0,02 % Bromphenolblau (w/v)
Sammelgelpuffer
0,5 M TRIS
0,4 % SDS (w/v)
pH 6,8
Trenngelpuffer
1,5 M TRIS
0,4 % SDS (w/v)
pH 8,8
SDS-Laufpuffer (10x)
25 mM TRIS
0,2 M Glycin
1 % SDS (w/v)
pH 8,3
Anodenpuffer I
20 % Ethanol (v/v)
300 mM TRIS
35
Material
Anodenpuffer II
20 % Ethanol (v/v)
25 mM TRIS
Kathodenpuffer
20 % Ethanol (v/v)
40 mM 6-Aminohexansäure
RIPA-Puffer
50 mM TRIS-HCl pH 7,2
150 mM NaCl
0,1 % SDS (w/v)
1 % Natriumdesoxycholat (w/v)
1 % Triton X-100
Eindeckelmedium (Mowiol)
10 % Mowiol (w/v)
25 % Glycerin (w/v)
2,5 % DABCO
100 mM TRIS-HCl pH 8,5
TAE-Puffer (50x)
0,2 M TRIS
1 M Natriumacetat
0,05 mM EDTA
pH 8,0
6x DNA Loading Dye
10 mM TRIS-HCl pH 7,6
0,03 % Bromphenolblau
0,03 % Xylencyanol
60 % Glycerin
60 mM EDTA
Phosphatase Buffered Saline (PBS)
137 nM NaCl
2,7 mM KCl
10 nM Na2 HPO4
1,8 nM KH2 PO4
pH 7,4
Tris Buffered Saline Tween 20 (TBS/T)
20 mM TRIS pH 8,8
150 nM NaCl
0,05 % Tween 20
Lysogeny broth medium (LB-Medium)
10 g Trypton
5 g Hefeextrakt
5 g NaCl
12 g Agar
ad 1 l H2 O /pH 7,2
36
Material
6.14 Geräte
Elektrophorese
Hersteller
Elektrophorese Power-Supply-EPS 301
GE Healthcare, Freiburg
Horizontale Elektrophoresekammer HE 33
GE Healthcare, Freiburg
Mighty Small II Vertical Electrophoresis System SE 250
GE Healthcare, Freiburg
Mighty Small Multiple Gel Caster SE 200
GE Healthcare, Freiburg
Semidry Blotting Kammer TE77 PWD
GE Healthcare, Freiburg
Standard Power Pack P25
Biometra, Göttingen
Mikroskopie
Durchlicht-Mikroskop Axiovert 40C
Carl Zeiss, Jena
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 510 META)
Carl Zeiss, Jena
Mikroskop Leica, Leitz DM RBE
Leica, Wetzlar
Imaging
AGFA Curix 60
AGFA, Köln
Amersham Hyperfilm ECL
GE Healthcare, Freiburg
HypercassetteTM
GE Healthcare, Freiburg
INTAS Imaging System
Intas, Göttingen
Odyssey Imaging System
LI-COR Biosciences, USA
PCR-Cycler
LightCycler®1.5 Instrument
Roche, Mannheim
LightCycler®480
Roche, Mannheim
Zentrifugen
Heraeus Fresco 17
Thermo Scientific, Karlsruhe
Mikrozentrifuge 5415D
Eppendorf, Hamburg
Multifuge 1S-R
Thermo Scientific, Karlsruhe
Sorvall Evolution RC mit SLA 1500 Rotor
Sorvall, Bad Homburg
Sonstige
Eppendorf® Thermomixer® R
Sigma-Aldrich, Sleeze
Dako Pen
Dako, Dänemark
IkaMAG Ret Magnetrührer
IKA, Staufen
Inkubator BBD 6220
Heraeus, Osterode
NanoPhotometer P 300
Implen, München
pH-Meter 766 Calimatic
Knick, Berlin
37
Material
Photometer DU 730
Beckman Coulter, Krefeld
Potter-Homogenisator für Zellaufschluss
Braun, Melsungen
Rocking Plattform
Biometra, Göttingen
Satorius Analytical balance
Satorius, Göttingen
Satorius balance LP 6000 200S
Satorius, Göttingen
Schüttelinkubator Innova 44
Eppendorf, Hamburg
Sonifizierer W-220F
Misonix, USA
Sonopuls HD 2200
Bandelin GmbH, Berlin
SterilGARD III Advance
The Baker Company, USA
Stuart Rollerinkubator SRT9
Bibby Scientific, UK
Thermomixer compact
Eppendorf, Hamburg
UV/VIS–Spectrometer Ultrospec 500 Pro
GE Healthcare, Freiburg
Vortex®Genie 2
Scientific Industries, USA
Wasserbad TW12
Julabo, Seelbach
Zellzählkammer nach Neubauer
Carl Roth, Karlsruhe
6.15 Verbrauchsmaterialien
Produkt
Hersteller
Blottingmembran Immobilon-P (PVDF)
Millipore, Schwalbach
Deckgläschen
Carl Roth, Karlsruhe
Einwegspritzen (1, 5, 10, 20 ml)
B. Braun, Melsungen
Falcontubes (15 ml, 50 ml)
Greiner, Frickenhausen
Hyperfilm ECL Chemiluminescence
GE Healthcare, Freiburg
LightCycler Kapillaren (Polycarbonat)
Genaxxon, Biberbach/Riss
Messpipetten (1, 5, 10, 25 ml)
Greiner, Frickenhausen
Objektträger
Carl Roth, Karlsruhe
Pipettenspitzen (1 μl, 100 μl, 1ml)
Sarstedt, Nümbrecht
Pipettenspitzen gestopft (1 μl, 100 μl, 1ml)
4titude, Berlin
Reaktionsgefäße (1.5, 2 ml)
Eppendorf, Hamburg
Sterilfilter 0,22 μm
Carl Roth, Karlsruhe
Whatmanpapier
GE Healthcare, Freiburg
Zellkulturflaschen (T25, T75, T175)
Greiner, Frickenhausen
Zellkulturplatten (6-, 12- und 24-Loch-Platten)
Greiner, Frickenhausen
Zellkulturschaber
TPP, Schweiz
38
Material
6.16 Software
Produkt
Hersteller
ImageJ
Wayne Rassband
Image Studio Lite
LI-COR Biosciences, USA
INTAS GDS
Intas, Göttingen
LightCycler®1.5 Instrument Software, Version 3.5
Roche, Mannheim
LightCycler®480 Software, Version 1.5
Roche, Mannheim
LSM Image Browser
Zeiss, Jena
Photoshop CS2
Adobe, USA
ZEN 2012
Carl Zeiss, Jena
39
7 Methoden
7.1 Zellbiologie
7.1.1 Vorbereiten von Geräten und Lösungen
Um sterile Arbeiten gewährleisten zu können, wurden alle hitzestabilen Geräte und Lösungen
für 20 min bei 121 °C und einem Druck von 2 bar autoklaviert. Die hitzelabilen Lösungen
wurden mit Hilfe eines Membranfilters (Porengröße 0,2 μm) sterilfiltriert.
7.1.2 Prokaryotische Zellkultur
Kultivierung von E. coli
Es wurden E. coli TOP10-Zellen verwendet. Die aerobe Kultivierung erfolgte schüttelnd in
einem Erlenmeyerkolben bei 37 °C und 150 rpm für 16 h, hierfür wurde LB-Medium verwendet.
Zur Resistenzselektion wurden dem Medium 100 μg/ml Ampicillin oder 30 μg/ml Kanamycin
zugesetzt. Die Plasmid-Maxipräparationskulturen wurden mit Glycerolstocks angeimpft und
damit eine Übernachtkultur angelegt. Zur dauerhaften Lagerung wurden 2 ml der Übernachtkultur zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 600 μl der Übernachtkultur
resupendiert und mit 400 μl 87%igem Glycerin versetzt. Die Aufbewahrung erfolgt bei -80 °C.
Ampicillin-Stammlösung
100 mg/ml
Kanamycin-Stammlösung
30 mg/ml
7.1.3 Eukaryotische Zellkultur
Kultivieren und Passagieren
Die Zelllinien Huh-7.5, Hep G2, HepG2 2.2.15 und HepAD38 wurden in einer T125-Zellkulturflasche bei 37 °C, 5 % CO2 und ≥ 90 % Luftfeuchtigkeit dauerhaft kultiviert. Bei etwa
70 - 80 % Konfluenz, welche mit Hilfe eines Durchlichtmikroskops bestimmt wurde, erfolgte
ein Waschschritt der adhärent-wachsenden Zellen mit PBS. Durch die anschließende Zugabe
40
Methoden
von Trypsin/EDTA für 2 - 5 min bei 37 °C lösten sich die Zellen vom Boden der Kulturflasche.
Die Trypsinaktivität wurde durch Zugabe von FCS-haltigem Medium abgestoppt und diente
gleichzeitig als Resuspendierungslösung für die Zellen. Eine Verdünnung, durch Zugabe von
neuem Medium, wurde der Zelllinie entsprechend angepasst, um ein optimales Wachstum
gewährleisten zu können.
Medium für Huh-7.5/Hep G2/HepG2 2.2.15
500 ml DMEM
10 % FCS
5 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung
2 mM L-Glutamin
500 ml DMEM
Medium für HepAD38
10 % FCS
5 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung
2 mM L-Glutamin
25 μg Hydrokortison
5 μg Insulin
Transfektion von Huh-7.5-Zellen
Um die Auswirkung in transient HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich zu HBV-negativen
Zellen und die Paxillinmenge in den unterschiedlichen HBV-Genotypen untersuchen zu können,
wurden Transfektionsexperimente durchgeführt. Für die Transfektion der Zellen wurde lineares
Polyethylenimin (PEI) verwendet. Hierfür wurden bei einer 6-Loch-Platte 0,5 - 1 μg PlasmidDNA/Kavität und 6 μl PEI/μg in 200 μl PBS resuspendiert und für 10 sec durchmischt. Nach
einer Inkubationszeit von 15 min bei Raumtemperatur wurde 200 μl vom Transfektionsansatz
tropfenweise zu 2 ml Medium/Kavität gegeben. Bei einer 24-Loch-Platte setzte sich der Ansatz
aus 0,25 μg Plasmid-DNA/Kavität und 6 μl PEI/μg in 100 μl PBS zusammen. Nach 10 sec
guter Durchmischung und einer Inkubation von 15 min bei Raumtemperatur wurden je 100 μl
vom Transfektionsansatz tropfenweise zu 1 ml Medium/Kavität gegeben. Als Negativkontrolle
wurde das pUC-Plasmid im transienten Zellkultursystem verwendet. Nach 16 h der Transfektion
erfolgte ein Mediumwechsel.
Polyethylenimin-Stammlösung
1 mg/ml
Transfektion mit siRNA
Neben der Transfektion von Plasmiden wurde auch eine Transfektion mit siRNA (small interfering
RNA) durchgeführt, welche die Paxillinexpression auf mRNA-Ebene ausschaltet. Diese Methode
eignet sich gut für die Grundlagenforschung zur Aufklärung der noch unbekannten Funktion
von Paxillin im HBV-Lebenszyklus. Die siRNA sind kurze Ribonukleinsäure-Moleküle, welche
41
Methoden
sich mit komplementären einzelsträngigen Ribonukleinsäure-Molekülen verbinden und dadurch
die Translation der speziellen mRNA verhindern (Knockdown). Die Knockdown-Versuche
wurden in 24-Loch-Platten durchgeführt. Dazu wurden zwei verschiedene Ansätze gemacht:
Ansatz A enthielt 6,5 μl der 10μM paxillin-siRNA (oder der 10μM Control-siRNA) und 43,5 μl
Dilution Buffer, der Ansatz B enthielt 8 μl des Transfektionsreagenz N-TER und 42 μl ddH2 O.
Beide Ansätze wurden vereinigt und gut vermischt und für 10 sec bei 4°C und 13.000 rpm
zentrifugiert. Nach erneuter Zentrifugation des Ansatzes erfolgte eine Inkubationszeit von
15 min bei Raumtemperatur. Für eine Konzentration von 10 nM wurden 2954 μl Medium
mit 46 μl des kombinierten Ansatzes zusammengefügt, für 20 nM waren 2905 μl Medium
und 92 μl des kombinierten Transfektionsansatzes notwendig, für eine Konzentration von
40 nM wurden 1408 μl Medium und 92 μl kombinierter Transfektionsansatz verwendet. Von
diesem Endvolumen wurden jeweils 500 μl/Kavität entnommen und damit für 24/48/72 h die
stabil HBV-exprimierenden Zellen inkubiert. Nach Inkubationsende wurde mit den gewonnenen
Proben, wie in Kap. 7.2.5 und 7.1.3 beschrieben, weiterverfahren.
Infektion von primären humanen Hepatozyten
Um die Paxillinmenge im Infektionsmodell untersuchen zu können, wurden zur Infektion von
primären humanen Hepatozyten infektiöse Überstände von HepG2 2.2.15- sowie HepAD38Zellen verwendet. Dazu wurden PHHs genutzt, welche aus Gewebeproben nach einer partiellen
Hepatektomie isoliert werden konnten. Nach dem Auslegen in 6-Loch-Platten erfolgte bei
Ankunft der Zellplatten aus dem Universitätsklinikum Frankfurt am Main eine dreimalige
Waschung mit PBS der Platten, um nicht angewachsene Zellen vollständig zu entfernen. Für
die Infektion wurden 2 ml infektiöser Überstand/Kavität zugegeben und über Nacht inkubiert.
Danach erfolgte ein Mediumwechsel. Vor jedem Mediumwechsel wurden die Zellen einmal
mit PBS gewaschen. Abhängig vom Experiment erfolgte ein Mediumwechsel und die Zellen
wurden entsprechend Kap. 7.1.3 und 7.2.5 für die Analysen geerntet. Als Negativkontrolle
wurden nicht infizierte primäre humane Hepatozyten verwendet. Für die Sicherstellung einer
erfolgreichen Infektion der PHHs wurde ein HBsAg-ELISA durchgeführt und der Virustiter
bestimmt (Kap. 7.4.3).
Medium für PHH
500 ml DMEM
10 % FCS
5 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung
2 mM L-Glutamin
25 μg Hydrokortison
5 μg Insulin
100 μl EGF (0,1 μg/ml)
42
Methoden
Ernte und Lyse von Hepatomzellen
Die Zellen wurden in Abhängigkeit der erfolgten Experimente durch Verwendung verschiedener
Puffer und unterschiedlicher Bedingungen geerntet und lysiert. Alle genannten Schritte wurden
auf Eis durchgeführt.
Protein-Lysate
Für die Analyse im Western Blot wurden Gesamtzelllysate von den jeweiligen Zelllinien verwendet
und in 6-Loch-Platten mit einer Konzentration von 3x105 biszu 1x106 Zellen/Kavität ausgelegt.
Nach den jeweiligen Experimenten wurden die Zellkulturüberstände für einen HBsAg-ELISA
(Kap. 7.4.3) bei 4 °C aufbewahrt, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und durch Zugabe
von RIPA-Puffer, je nach Lochgröße, lysiert. Nach einer Inkubationszeit von 10 min auf Eis
wurden die Zellen mit Hilfe eines Zellschabers gelöst und in entsprechende Eppendorf-Gefäße
überführt. Mittels Ultraschall für 10 sec bei einer Leistung von 10 - 20 % erfolgte der Aufschluss
der Zellen. Nach 5 min Zentrifugation bei 13.000 rpm und 4 °C konnten die Zelltrümmer
sedimentiert werden, dann erfolgte die Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Bradford
Assay (Kap. 7.3.1) und die Lysate wurden anschließend mit Hilfe des Western Blot-Verfahrens
(Kap. 7.3.3) analysiert.
7.2 Molekularbiologie
7.2.1 Agarosegelelektrophorese
Die Reinheit und Größe der verwendeten Plasmid-DNA und isolierten RNA wurden mit Hilfe
der Agarosegelelektrophorese analysiert. Zuerst erfolgte die Auftrennung der DNA- bzw. RNAMoleküle durch größenabhängig gewählte 1 - 2%ige (w/v) Agarose, welche in 1x TAE-Puffer
durch Erhitzen gelöst und mittels Magnetrührer zu einer homogenen Masse vermengt wurde.
Nach dem Abkühlen der flüssigen Agaroselösung wurde diese mit 0,1 μg/ml Ethidiumbromid
versetzt und in eine horizontale Gelkammer mit zugehörigem Kamm für die Taschen zur späteren
Probenbeladung gegossen. Nach dem vollständigen Aushärten des Agarosegels wurde es in
eine horizontale Elektrophoresekammer überführt und mit 1x TAE als Laufpuffer vollständig
bedeckt. Nun konnten die zu analysierenden Proben, welche mit 6x DNA-Ladepuffer versetzt
wurden, in die Geltaschen geladen und bei 80 - 100 Volt elektrophoretisch aufgetrennt werden.
Die Visualisierung der Banden erfolgte mittels UV-Licht und wurde durch das INTAS-ImagingSystem dokumentiert. Ethidiumbromid ist ein Fluoreszenzfarbstoff und interkaliert mit der
DNA-Doppelhelix, dadurch werden die Banden im Gel unter UV-Licht sichtbar. Für die eindeutige
Basenanzahlbestimmung wurde ein entsprechender Größenstandard zusätzlich zu den Proben
aufgetragen.
43
Methoden
7.2.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Nach DNA-Aufreinigung aus den Zellkulturüberständen oder RNA-Isolierung aus Zellen sowie Lebergewebeproben wurde eine Konzentrationsbestimmung für die weitere Verarbeitung
notwendig. Die Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren wurde mittels Nanophotometer
(P 300) bei einer Wellenlänge von 260 nm quantifiziert. Ein Extinktionswert von 1 bei dieser
Wellenlänge entspricht einer Konzentration von 50 μg/ml doppelsträngiger DNA oder 35 μg/ml
einzelsträngiger DNA/RNA. Das Absorptionsmaximum für Proteine liegt bei einer Wellenlänge von 280 nm. Somit lassen sich Hinweise auf Verunreinigungen der Nukleinsäurelösung
durch Bestimmung des Verhältnisses der Absorption bei 260/280 nm ablesen. Liegt dieser
Wert < 1,8 - 2,0, kann es sich um eine Kontamination mit Proteinen oder Phenol handeln.
7.2.3 Präparation von Plasmiden (Maxi-Prep)
Für die Präparation von Plasmid-DNA, welche für die Transfektionsexperimente notwendig
war, wurde das Qiagen Plasmid Maxi Kit entsprechend den Herstellerangaben genutzt. Das
Prinzip beruht auf einem Verfahren, bei dem Bakterien einer alkalischen Lyse ausgesetzt
und die Proteine denaturiert werden (Birnboim and Doly, 1979). Die Isolierung der PlasmidDNA erfolgte aus 300 ml Übernachtkultur. Die anschließende DNA-Reinigung umfasst eine
Präzipitation mittels Isopropanol und zwei Waschschritten mittels 70%igem Ethanol. Das
Präzipitat wurde luftgetrocknet und in ddH2 O wieder gelöst. Alle Plasmide wurden bei -20 °C
gelagert.
7.2.4 Phenol-/Chloroform-Extraktion von DNA aus dem Überstand
Für die Isolierung von DNA aus dem Zellkulturüberstand von HBV-positiven Zellen wurde die
Phenol-/Chloroform-Extraktion genutzt. Bei den durchgeführten Versuchen wurden 400 μl Zellkulturüberstand, 320 μl ddH2 O, 80 μl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 800 μl Phenolchloroform
in ein Reaktionsgefäß pipettiert und gut durchmischt. Nach 5 min Zentrifugation wurde die
obere Phase in ein neues steriles Reaktionsgefäß überführt und die enthaltenden Nukleinsäuren
durch Zugabe des 2,5-fachen Volumens von 96%igem Ethanol bei 13.000rpm/30 min präzipitiert. Der Überstand wurde verworfen und es wurden 500 μl 70%iges Ethanol hinzugegeben. Der
Waschschritt erfolgte bei 5 min Zentrifugation. Das entstandene Pellet wurde luftgetrocknet
und anschließend in einer entsprechenden Menge ddH2 O resuspendiert. Alle hier genannten
Zentrifugationsschritte erfolgten bei 13.000 rpm und 4 °C in einer Eppendorf-Tischzentrifuge.
44
Methoden
7.2.5 Isolierung von Gesamt-RNA
Um die Menge an PXN-spezifischen Transkripten beurteilen zu können, wurde die Isolierung
gesamtzellulärer RNA durch die Verwendung von peqGOLD TriFast (Trizol) durchgeführt. Dies
ist eine Ein-Schritt-Flüssigphasenseparationsmethode (Chomczynski and Sacchi, 1987). 48 h
nach der Transfektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit 400 μl
Trizol/Kavität lysiert. Nach einer Inkubationszeit von 2 min auf Eis wurden die Zellen abgelöst
und von jeweils zwei Kavitäten vereinigt. Die Lösung wurde in ein Reaktionsgefäß überführt.
Nun erfolgte eine Zentrifugation von 5 min und der Probenüberstand wurde in ein neues
steriles Reaktionsgefäß gegeben und mit 160 μl Chloroform kräftig durchmischt. Nach weiteren
5 min Zentrifugation erfolgte eine erneute Überführung des oberen wässrigen Überstandes
in ein steriles Reaktionsgefäß. Die nun RNA-enthaltende wässrige Phase wurde mit 400 μl
Isopropanol versetzt, invertiert und für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen
und das RNA-Pellet mit 500 μl 75%igem Ethanol durch 5 min Zentrifugation gewaschen.
Der Überstand wurde erneut verworfen und das RNA-Pellet luftgetrocknet. Abhängig von der
Größe des Pellets wurde die RNA in 15 - 25 μl DEPC-H2 O resuspendiert. Alle hier genannten
Zentrifugationsschritte erfolgten bei 13300 rpm und 4 °C (Kap. 7.2.1 und 7.2.2).
7.2.6 cDNA-Synthese
Im Anschluss an die RNA-Isolierung wurde ein DNAse-Verdau durchgeführt, um eventuell
noch vorhandene DNA-Reste zu entfernen. Dafür wurden jeweils 3 - 5 μg der RNA-Probe,
1,2 μl 10x RQ 1 DNase Puffer und 1 μl DNase zusammen pipettiert und mit DEPC-H2 O
auf ein Endvolumen von 12 μl aufgefüllt. Nach einer Inkubationzeit von 1 h bei 37 °C wurde
anschließend die DNase I durch 5 min Inkubation bei 90 °C inaktiviert und der gesamte
Ansatz zentrifugiert. Die cDNA wird aus RNA mittels reverser Transkriptase synthetisiert.
Die cDNA-Synthese erfolgte im Anschluss an den DNase-Verdau durch die Zugabe von 1 μl
Random Hexamer Primer, 2 μl dNTPs (10mM), 4 μl 5xRT Puffer und 1 μl M-MulV Reverse
Transcriptase (RT). Die Erststrangsynthese erfolgte nach Inkubation von 1 h bei 42 °C, die
Inaktivierung der RT durch 10 min bei 72 °C. Die fertigen cDNA-Proben wurden bei -20 °C
gelagert. Es wurde eine Verdünnung von 1:10 für die PCR-Amplifikation (Kap. 7.2.7) der
cDNA-Proben verwendet.
7.2.7 Real-Time PCR (RT-PCR)
Für die quantitative Analyse von DNA-Sequenzen von Paxillin wurde das LightCycler 1.5-System
und 480-System (Roche) genutzt. Der Reaktionsansatz setzt sich aus 5 μl 2x MaximaTM SYBR
Green qPCR Master-Mix sowie 0,25 μl Primer (10 μM) zusammen und wird mit Ultrareinstwasser
auf ein Gesamtvolumen von 10 μl aufgefüllt. Die Amplifikation wurde in Polycarbonat-Kapillaren
45
Methoden
oder speziellen 96-Loch-Platten durchgeführt. Die Quantifizierung wird durch die Einlagerung
des DNA-bindenden Farbstoffes MaximaTM SYBR Green qPCR in die doppelsträngige DNA
während der PCR-Reaktion ermöglicht. Nach jedem Zyklus wird die Intensität der Fluoreszenz
gemessen, die Zunahme der SYBR Green-Fluoreszenz ist zu der Menge der amplifizierten
DNA direkt proportional. Mit Hilfe bekannter Konzentrationen von Standardverdünnungen
kann die Menge der DNA danach quantifiziert werden. Das Programm für den Ablauf einer
Real-time PCR ist in Tab. 7.2.7 dargestellt.
Tab. 7.1: Real-time PCR-Programm.
Programm
Einleitende Denaturierung
Temperatur
(°C)
95
Haltezeit
(sec)
600
Temperaturabnahme
(°C/sec)
20
1
Denaturierung
95
15
20
45
Annealing
56
30
20
Elongation
72
30
5
Schmelzkurve
95
60
20
60
30
20
95
0
0,1
40
30
30
”Cooling”
Zyklen
1
7.2.8 Northern Blot
Für die Übertragung der in der Gelelektrophorese aufgetrennten RNA von stabil HBV-exprimierenden Zellinien und der Kontrollprobe auf eine Hybond-N-Membran (Amersham) wurde das
Northern Blot-Verfahren verwendet. Dazu wurden je Probe 5 - 10 μg RNA mittels eines 1,2%igen
Agarose-Gels, welches zusätzlich 1,5 % Formaldehyd enthielt, der Größe nach aufgetrennt und
mit Hilfe eines Kappilarblot-Systems (Schleicher und Schuell‘s Turboblotter) auf die Membran
übertragen. Die Radiomarkierung der verwendeten DNA-Sonden wurde mit [α32 P] dCTP (3000
Ci/mmol) unter Benutzung eines Klenow-Fragments (5 U/μl) (Bioline) durchgeführt. Bei 95 °C
erfolgte die Denaturierung von 30 - 80 ng DNA je Probe und anschließender Inkubation auf Eis.
Danach wurde der Ansatz für die radioaktive Markierung wie folgt zusammenpipettiert: DNA,
5 μl Klenow-Fragment Puffer (10x), 2 μl dATP/dTTP/dGTP (0,5 mM), 1 μl Random Primer
(500 ng/μl), 1 μl Klenow-Fragment, 5 μl radiomarkiertes [α32 P] dCTP und mit ddH2 O auf 50 μl
aufgefüllt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 1 h. Für die Aufreinigung der radiomarkierten
DNA-Sonden wurde das QIAquik PCR Purification Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben genutzt.
Über Nacht erfolgte die Hybridisierung durch Verwendung von Roti-Hybrid-Quick (Roth). Am
nächsten Tag konnten die Membranen gewaschen werden. Dies wurde mittels 10 min Inkubation
mit dem erhitzten Waschpuffer I und zwei weiterer Male, auch für jeweils 10 min, mit dem
erhitztem Waschpuffer II bei 65 °C durchgeführt. Anschließend wurden die Membranen in eine
46
Methoden
Folie eingeschweißt und bei -80 °C auf einem Röntgenfilm (Amersham) exponiert. Der Northern
Blot wurde mit freundlicher Unterstützung von Herrn Dr. K. Himmelsbach durchgeführt.
7.3 Proteinbiochemie
7.3.1 Bradford Assay
Der Bradford Assay dient zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen in wässrigen Lösungen,
wie zum Beispiel Zelllysaten, um gleiche Proteinmengen in den Experimenten einsetzen zu
können (Bradford, 1976). Die Methode basiert auf der Verschiebung des Absorptionsmaximums
des Farbstoffes Coomassie-Brillant-Blau G-250 von 465 zu 595 nm in Anwesenheit von Proteinen
in der Lösung. Es wurden 100 μl Bradfordreagenz in eine 96-Loch-Platte vorgelegt, mit 1 μl
Zelllysat vermischt und am Tecan Reader in Konzentrationsbestimmung bei einer Extinktion
von 595 nm gemessen. Alternativ wurden 995 μl Bradfordreagenz in eine spezielle Küvette
vorgelegt und mit 5 μl Zelllysat vermischt. Die Auswertung erfolgte mit dem Photometer (DU
730) bei gleicher Wellenlänge.
7.3.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese ist eine analytische Methode zur
Trennung von Stoffgemischen nach ihrer unterschiedlichen Molekülmasse in einer Gelmatrix in
einem elektrischen Feld. Entwickelt wurde diese Methode von Ulrich K. Laemmli (Laemmli,
1970). Durch dieses diskontinuierliche elektrophoretische System ist eine gute Auftrennung der
Proteine mit Molekülmassen zwischen 5 und 250 kDa möglich. Dies ist auch der Grund für die
unterschiedliche Polyacrylamidkonzentration des Trenngels (untere Phase) von 10 - 14 %, welche
abhängig vom Molekulargewicht der zu untersuchenden Proteine gewählt wurde. Die obere
Phase, das Sammelgel, wurde immer mit einer 4%igen Polyacrylamidkonzentration verwendet.
Aufgrund der netzartigen Struktur des Gels kommt es zu einer Auftrennung der Proteine nach
ihrem Molekulargewicht, da die größeren Moleküle langsamer als kleinere Moleküle durch das
Gel wandern. Die zu untersuchenden Proben wurden mit etwa 75 μg Protein in 1x SDS-PAGE
Probenpuffer für 5 min bei 95 °C aufgekocht und bei 90 - 120 Volt in einer vertikalen Kammer
elektrophoretisch aufgetrennt. Die genaue Zusammensetzung der Gele kann der Tab. 7.2
entnommen werden.
47
Methoden
Tab. 7.2: Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels.
Sammelgel
4%
Rotiphorese 40 (29:1)
Trenngel
10 %
12 %
14 %
6 ml
20 ml
24 ml
28 ml
Sammelgelpuffer (4x)
15 ml
20 ml
20 ml
20 ml
H2 O
45 ml
40 ml
36 ml
32ml
TEMED
60 μl
80 μl
80 μl
80 μl
APS (10 %)
600 μl
800 μl
800 μl
800 μl
7.3.3 Western Blot
Nach erfolgreicher SDS-PAGE folgte der Proteintransfer von den im Gel aufgetrennten Proteinen
durch Western Blotting auf eine PVDF-Membran. Dafür wurde das Semidry -ElektroblottingVerfahren (0,95 mA/cm2 für 1 h) und in einem speziellen Puffersystem genutzt (Towbin et al.,
1979; Kyhse-Andersen, 1984). Dazu wurde zuerst das Trenngel nach der Elektrophorese vom
Sammelgel getrennt. Die auf Trenngelgröße zugeschnittene Whatmanfilterpapiere wurden mit
Kathoden- oder Anodenpuffer getränkt und die PVDF-Membran wurde in Methanol aktiviert.
Der genaue Aufbau ist in Abb. 7.1 dargestellt.
Abb. 7.1: Schematischer Aufbau des Western Blot-Verfahrens.
Durch den im SDS-PAGE verwendeten gefärbten Marker konnte ein erfolgter Transfer beurteilt
werden und es erfolgte eine immunochemischen Färbung der Membran.
7.3.4 Luciferase Assay
Das Luciferase Assay dient der Untersuchung der PXN-Promotoraktivität in transient HBVexprimierenden Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen. Dazu wurde der pGL3-Enhancer für den
PXN-Promotor verwendet. Die Huh-7.5-Zellen wurden 48 h nach der Transfektion (0,5 μg
pLucpromPXN und 0,25 μg pUC/pJo19/gtA/gtG) analysiert. Die Zellen wurden mit dem
Luciferase-Lyse-Puffer geerntet und die Proteinkonzentration mittels Bradford Assay bestimmt.
48
Methoden
Die Normalisierung der Proteinkonzentration erfolgte und es wurden 50 μl von jedem Lysat mit
50 μl Substrat gemischt. Die Messung erfolgte im Luminometer mit einer Dauer von 10 sec.
Die Anzahl der emittierten Lichtquanten ist proportional zur Anzahl der Luciferasemoleküle
und diese sind wiederum an die Paxillinexpression gekoppelt.
7.4 Immunologie
7.4.1 Immunochemische Färbung der Western Blot-Membran
Nach Übertragung der Proteinbanden auf die Membran wurde diese für 1 h bei Raumtemperatur
in 10 % Milchpulver in 1x TBS/T inkubiert, um unspezifische Antikörperbindungsstellen
abzusättigen. Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgte, abhängig vom verwendeten
Antikörper, in 10 % Milchpulver in 1x TBS/T ggf. in 5 % BSA in 1x TBS/T für 1 h bei
Raumtemperatur oder bei 4 °C über Nacht auf einem Rollschüttler. Um die nicht gebundenen
Antikörper zu entfernen, wurde die Membran für eine halbe Stunde in eine mit TBS/T
gefüllte Wanne gelegt und dieses alle 5 - 10 min ausgetauscht. Die Inkubation mit dem
Sekundärantikörper, welcher mit einer Horseradish Peroxidase (HRP) gekoppelt war, erfolgte
ebenfalls in 10%igem Milchpulver in TBS/T für 1 h bei Raumtemperatur. Die ungebundenden
Sekundärantikörper wurden ebenfalls wie durch den zuvor beschriebenen Waschschritt entfernt.
Es kam das Enhanced Chemolumineszenz-System (ECL) zum Einsatz. Die gekoppelte Peroxidase
am sekundären Antikörper setzt das Substrat um und durch Verwendung eines entsprechenden
Entwicklerreagenz kommt es zu einer Emittierung von Lichtquanten. Durch das Auflegen
eines Röntgenfilms wurden die Lichtquanten detektiert und anschließend im automatischen
Filmentwickler (Agfa Curix 60) entwickelt. Die Entwicklung erfolgte nach den Herstellerangaben.
Bei der Verwendung des Odyssey-Systems wurde anstelle von 10 % Milchpulver in 1x TBS/T,
die Lösung 1x RotiBlock (Carl Roth, Karlsruhe) eingesetzt und beim Sekundärantikörper
kamen fluorophorgekoppelte Antikörper zum Einsatz. Deshalb erfolgte diese Inkubation unter
Lichtschutz.
7.4.2 Indirekte Immunfluoreszenz
Für die genaue Untersuchung der intrazellulären Lokalisation und Verteilung von Paxillin und
möglichen Kolokalisationen wurde die indirekte Immunfluoreszenzmethode für die Färbung
angewendet und mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (Kap. 7.5.1) analysiert.
Die Zellen wurden mit einer Konzentration von 3x105 (Huh-7.5) oder 6x105 (Hep G2, HepG2
2.2.15, HepAD38) in eine 6-Loch-Platte ausgelegt und nach entsprechender Behandlung, wie
zum Beispiel einer Transfektion, auf ein Deckgläschen in eine 12-Loch-Platte übertragen.
Dies geschah durch Verwerfen des Überstandes, 1x Waschen mit PBS und Benetzen des
49
Methoden
Plattenbodens mit Trypsin/EDTA für 2 - 5 min bei 37 °C, um ein Lösen der Zellen zu
bewirken. Das Enzym wurde durch Zugabe von 1,5 ml Medium inaktiviert und die Zellen darin
resuspendiert. Nach 24 h wurden die Zellen in der 12-Loch-Platte fixiert, permeabilisiert und mit
Fluorophor-gekoppelten Antikörpern gefärbt. Die Fixierung erfolgte mit 3,7%igem Formaldehyd
in PBS für 10 min bei Raumtemperatur. Um unspezifische Antikörperbindungen abzusättigen,
wurde nach dreimaligem Waschen in PBS eine Inkubation in 10 % BSA in 1x TBS/T für 1 h
bei Raumtemperatur vorgenommen. Für die Permeabilisierung wurde 0,5%iges Triton X-100
verwendet und für 10 min inkubiert. Die feuchte Kammer diente dem Schutz der Zellen vor
Austrocknung bei der Inkubation mit dem Primärantikörper bzw. dem Fluorophor-gekoppelten
Sekundärantikörper. Die Zellkerne wurden mit DAPI (4‘6-Diamidin-2-phenylindol) gefärbt.
Es wurde in 10 % BSA in 1x TBS/T angesetzt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
Zwischen den Antikörperansätzen und danach erfolgte eine dreimalige Waschung mit PBS. Nach
Inkubation mit dem Sekundärantikörper erfolgten alle Schritte nur noch unter Lichtschutz. Die
angefärbten Deckgläschen wurden mit dem Eindeckelmedium (Mowiol) auf den Objektträgern
dauerhaft versiegelt. Dazu wurden je Deckgläschen 15 μl verwendet. Die fertigen Objektträger
wurden lichtgeschützt bei 4 °C bis zur mikroskopischen Analyse aufbewahrt.
DAPI Stammlösung
0,1 mg/ml in PBS
7.4.3 Enzym linked immunosorbent assay (ELISA)
Ein ELISA ist ein antikörperbasiertes Nachweisverfahren, eine spezielle Technik davon stellt der
Sandwich-ELISA oder auch Antigen-ELISA dar. Bei diesem Verfahren werden zwei Antikörper
verwendet, die beide spezifisch an das nachzuweisende Antigen binden. Der erste Antikörper ist
an eine 96-Loch-Platte fest gebunden, an welchem das in der Probe vorhandene HBe- bzw. HBsAntigen binden kann. Danach kann ein zweiter Antikörper, welcher auch an das Antigen bindet,
dazugegeben werden. Der nun entstandene Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex entspricht
dem Sandwichprinzip. Das zugesetzte Enzym verursacht nach Zugabe eines Substrates einen
Farbumschlag bei erfolgreicher Bindung an den Komplex. Die Farbintensität ist proportional
zur vorhandenen Konzentration an HBe- bzw. HBs-Antigen. Mit Hilfe der Messung im Tecan
Reader kann ein quantitativer Nachweis des Antigens erfolgen. Der ELISA wurde entsprechend
den Hersteller-Angaben (Enzygnost HBsAg 5.0, Siemens) durchgeführt.
7.4.4 Methoden zur Charakterisierung HBV-transgener Mäuse
Neben der Genotypbestimmung mittels PCR erfolgte eine zusätzliche Bestimmung von HBVtransgenen und HBV-negativen Mäusen durch einen HBsAg-ELISA vom Blutserum der für die
Experimente verwendeten Mäuse mit freundlicher Unterstützung von Frau Dr. M. Gratz.
50
Methoden
7.4.5 Gewinnung von Mäuselebergewebeproben
Alle Mäuselebergewebeproben wurden freundlicherweise von Sebastian Barthel zur Verfügung
gestellt. Die Lebergewebeproben wurden bis zur Verwendung (Kap. 7.4.6 und 7.4.7 ) bei -80 °C
eingelagert.
7.4.6 Präparation von Mäuselebergewebelysaten
Zur Bestimmung der Paxillin-Proteinmenge in den Mäuseleberproben wurden diese mit Hilfe des
Potter-Homogenisators zusammen mit je 1 ml vorgelegtem RIPA-Puffer lysiert. Die anschließende
Zentrifugation erfolgte für 10 min bei 4 °C bei 13300 rpm. Die Proteinkonzentration im
Überstand wurde, wie in Kap. 4.3.1 beschrieben, bestimmt.
7.4.7 Isolierung von RNA aus Mäuselebergewebeproben
Die zur Isolierung von RNA verwendeten Mäuselebergewebeproben wurden mit Hilfe eines
Potters zusammen mit 1 ml Trizol-Reagenz je Probe homogenisiert und lysiert. Die weiteren
Schritte entsprechen den in Kap. 7.2.5 genannten Verfahren.
7.4.8 Paraffinpräparate und Färbetechniken
Die Paraffinpräparate der Mäuselebergewebeproben wurden freundlicherweise von Frau M.
Wingerter aus der Abteilung 4/0 des Paul-Ehrlich-Instituts angefertigt. Die dazu gehörige
Hämatoxolin-Eosin-Färbung (HE) wurde ebenfalls von ihr nach Standardmethoden durchgeführt. Die Paraffinpräparate der Patientenlebergewebeproben wurden freundlicherweise von
der Abteilung für molekulare Pathologie des Instituts für Pathologie und Neuropathologie des
Universitätsklinikums Tübingen zur Verfügung gestellt.
7.4.9 Immunfärbung von Paraffinschnitten aus Lebergewebeproben
Zur Beurteilung der Paxillin-Expression im Mausmodell wurden Paraffinschnitte von HBVnegativen und HBV-transgenen Mäuselebern angefärbt. Zum Deparaffinieren der Schnitte
wurden diese in Färbeküvetten für Objektträger erst für 15 min in Xylol, anschließend für
10 min in 96%iges Ethanol und 10 min in 75%iges Ethanol verbracht. Anschließend wurden
die Schnitte zweimal für 5 min in ddH2 O gewaschen. Um die Autofluoreszenz der Leberzellen
zu reduzieren wurden sie für 30 min in 3,7%igem Wasserstoffperoxid in Methanol inkubiert.
Zum Abschluss der Deparaffinierung erfolgte nochmals ein Waschschritt von 5 min in ddH2 O.
Das Blockieren von unspezifischen Anitkörperbindungsstellen erfolgte durch die Inkubation in
51
Methoden
10 % BSA in 1x TBS/T für 1 h. Damit die Antikörperlösung auf den Organproben bei der
Inkubation verblieb, wurden diese mit einem Fettstift (Dako Pen) umrandet und mit 75 - 100 μl
Primärantikörper/Objektträger für 1 h in einer feuchten Kammer inkubiert. Der Waschschritt
mit 1x TBS/T erfolgte dreimal, bevor die Inkubation mit dem Fluoreszenz-gekoppelten Sekundärantikörper ebenfalls für 1 h in einer feuchten Kammer folgte. Die Zellkernfärbung erfolgte
mit DAPI. Nach erneutem dreimaligem Waschen in 1x TBS/T wurden die Deckgläschen mit
Hilfe von Eindeckelmedium (Mowiol) dauerhaft auf den Objektträgern versiegelt. Die fertigen
Objektträger wurden lichtgeschützt bei 4 °C bis zur Analyse mit dem CLSM (Kap. 7.5.1)
aufbewahrt.
7.5 Mikroskopie
7.5.1 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)
Bei dieser Mikroskopiemethode wird ein fokussierter Laserstrahl genutzt, um das Präparat
abzuscannen. Die in Kap. 7.4.2 und 7.4.9 erklärten Verfahren dienen der Herstellung von
Fluoreszenz-gekoppelten Proteinpräparaten. Dadurch kann das Fluoreszenz-anregende Laserlicht die unterschiedlichen Intensitäten im Präparat zeigen und durch die ZEN 2009/LSM Image
Browser Software erfolgte die Darstellung sowie Dokumentation. Diese Methode ermöglich
eine exakte Bestimmung der Proteinverteilungen und mögliche Kolokalisationen in einer definierten Schicht, da mit Hilfe der Lochblende, welche konfokal zur Fokusebene liegt, Licht aus
anderen Schichten herausgefiltert werden kann. Die verwendeten Farbstoffe und dazugehörigen
Absorptions- und Emissionsmaxima sind in Tab. 7.3 aufgelistet.
Tab. 7.3: Absorptions- und Emissionsmaxima der Fluorophore
Farbstoff
Absorptionsmaximum (nm)
Emissionsmaximum (nm)
DAPI
358
461
Alexa Fluor 488
496
519
Alexa Fluor 546
556
573
Indocarbocyanin (Cy3)
550
570
Indodicarbocyanin (Cy5)
650
670
52
8 Ergebnisse
8.1 In vitro
8.1.1 Expression von HBV führt zu erhöhter Bildung von Paxillin in
stabil HBV-exprimierenden Zelllinien
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von HBV auf die Menge und intrazelluläre Verteilung
von Paxillin in Leberzellen charakterisiert sowie umgekehrt der Effekt einer Deregulation der
Paxillinexpression auf den Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus bestimmt.
Abb. 8.1: Northern Blot-Analyse: Erhöhte PXN-mRNA-Menge in stabil HBV-exprimierenden Zelllinien im Vergleich zu
HBV-negativen Zellen. (A) Der Northern Blot dient dem Vergleich von HepAD38- und HepG2 2.2.15-Zellen (HBV-positiv)
zu Hep G2-Zellen (HBV-negativ). Die 3.5-, 2.4-, 2.1- und 0.7-kb HBV-Transkripte zeigen die Anwesenheit von HBV; GAPDH
ist die Ladekontrolle. Es wurde eine Paxillin-, HBV- und GAPDH-spezifische, radioaktive-markierte Sonde genutzt. (B) Die
Quantifizierung des Western Blots ist in (B) dargestellt. Die Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung zeigt
eine erhöhte Menge an PXN-spezifischen Transkripten in HepAD38- und HepG2 2.2.15-Zellen im Vergleich zu Hep G2-Zellen.
53
Ergebnisse
Zunächst fand eine Untersuchung der stabil HBV-exprimierenden Zelllinie HepG2 2.2.15 sowie
HepAD38 statt. Die vorhandene Menge an Paxillin wurde durch verschiedene Methoden
analysiert und quantifiziert.
Um Aufschluss über die Menge an PXN-spezifischen Transkripten in HBV-exprimierenden Zellen
zu bekommen, wurden die stabil HBV-exprimierenden Zelllinien HepG2 2.2.15 und HepAD38
untersucht. Der Abb. 8.1 ist eine gesteigerte mRNA-Menge, welche für das Protein Paxillin
kodiert, in HBV-positiven Zellen im Vergleich zu HBV-negativen Zellen zu entnehmen. Es
handelt sich hier um die 3.5-, 2.4-, 2.1- und 0.7-kb mRNAs von HBV, welche als Nachweis
für die positiven HBV-Zellen anzusehen sind. Hierfür wurde die HBx-Sequenz als Sonde und
das Haushaltsgen GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase) als Ladekontrolle
verwendet.
Abb. 8.2: Western Blot-Analyse: Erhöhte Paxillinexpression in stabil HBV-exprimierenden Zelllinien im Vergleich zu HBVnegativen Zellen. (A) Western Blot als Detektionsmöglichkeit der Menge an Paxillin auf Proteinebene in HepAD38- und HepG2
2.2.15-Zellen (HBV-positiv) im Vergleich zu Hep G2-Zellen (HBV-negativ). Die obere Bande im LHBs-Blot ist die spezifische
LHBs-Bande und dient als Nachweis der HBV-Expression, β-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet. Folgende Antikörper wurden
verwendet: Anti-Paxillin Kaninchen (Paxillin), MA 18/7 (LHBs), Anti-β-actin (β-Aktin). (B) Die Quantifizierung des Western
Blots ist in (B) dargestellt und die Daten wurden auf β-Aktin normalisiert. Sie zeigt bei drei unabhängigen Experimenten (n=3)
eine erhöhte Paxillinmenge in HepG2 2.2.15-Zelllysaten und eine tendentiell erhöhte Proteinexpression an PXN in HepAD38 im
Vergleich zu Hep G2-Zellen.
Die Abb. 8.1 gab somit Hinweis darauf, dass eine HBV-Expression zu einer erhöhten Menge an PXN-spezifischen Transkripten führt. Der Western Blot (Abb. 8.2) mit stabil HBVexprimierenden Zellen dient der Beurteilung der Menge an Paxillin auf der Proteinebene. Als
Negativkontrolle wurde ein Hep G2-Zelllysat verwendet. Der Nachweis von HBV-positiven Zellen
konnte mittels LHBs-Detektion erfolgen und β-Aktin wurde als Ladekontrolle genutzt. Die
Quantifizierung zeigt eine erhöhte Paxillinmenge in HepG2 2.2.15-Zellen sowie eine tendentiell
54
Ergebnisse
erhöhte Menge an Paxillin an PXN in HepAD38-Zellen im Vergleich zur HBV-negativen Zelllinie
(Hep G2).
Durch die Begutachtung der cDNA von HBV-positiven und HBV-negativen Zellen mit Hilfe der
PCR-Methode konnte die Annahme, dass die Anwesenheit von HBV zu einer höheren Menge
an Paxillin führt, weiter untersucht und, wie Abb. 8.3 zeigt, gestärkt werden. Dieses Ergebnis
wurde durch RNA-Isolate von HepG2 2.2.15- sowie HepAD38- und Hep G2-Zellen generiert.
Die trotz der vorhandenen GAPDH-Bande nicht sichtbare Paxillinbande bei den Hep G2-Zellen
kann in der zu geringen PCR-Zyklenanzahl begründet sein. Die Negativkontrolle (H2 O) zeigt
keinen Hinweis auf Verunreinigungen.
Abb. 8.3: PCR-Analyse: Erhöhte Paxillin-cDNA-Menge in stabil HBV-exprimierenden Zelllinien im Vergleich zu HBVnegativen Zellen. (A) Die untersuchte cDNA von HepAD38- und HepG2 2.2.15-Zellen (HBV-positiv) im Vergleich zu Hep G2Zellen (HBV-negativ) wurde mit den Paxillin-spezifischen (#393 und #480), den HBV-spezifischen PCR-Primer (#185 und
#186) analysiert und für die Ladekontrolle dienten die GAPDH-spezifischen PCR-Primer (#42 und #43). Die Negativkontrolle
(H2 O) zeigt keine Hinweise auf Verunreinigung. (B) Die Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung zeigt eine
erhöhte cDNA-Menge, welche für Paxillin kodiert, in HepAD38- und HepG2 2.2.15-Zellen im Vergleich zu Hep G2-Zellen.
Für die quantitative Analyse der mRNA-Menge von stabil HBV-exprimierenden Zelllininen
wurde die RT-PCR eingesetzt. Die Quantifizierung ergab in drei unabhängigen Experimenten
(n=3) eine stark erhöhte Menge an Paxillin in stabil HBV-exprimierenden Zellen. Die Abb.
8.4, 8.5 und 8.6 zeigen die einzelnen Experimente mit Nachweis von vorhandener HBVmRNA in HepG2 2.2.15- sowie HepAD38-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen (Hep G2).
Zusammenfassend kann eine stark erhöhte Menge an PXN-spezifischen Transkripten in HBVpositiven Zellen festgestellt werden, jedoch ist keine Beurteilung innerhalb der stabil HBVexprimierenden Zellen möglich, da die Paxillinexpression Schwankungen aufweist.
55
Ergebnisse
Abb. 8.4: RT-PCR-Analyse: Erhöhte PXN-mRNA-Menge in stabil HBV-exprimierenden Zelllinien im Vergleich zu HBVnegativen Zellen (V.1). (A) Die erhaltenen RT-PCR-Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung der relativen
mRNA-Menge, welche für HBs kodiert, ergab eine hohe HBV-Menge für die HepG2 2.2.15-Zellen und eine sehr hohe Menge
für die HepAD38-Zellen, beide sind HBV-positiv. Die Hep G2-Zelllinie dient als Kontrolle. (B) Die erhaltenen RT-PCR-Daten
wurden auf GAPDH normalisiert. Durch die Quantifizierung der RT-PCR-Ergebnisse ist eine erhöhte Menge an PXN-spezifischen
Transkripten in HepG2 2.2.15- und HepAD38- (HBV-positiv) im Vergleich zu den Hep G2-Zellen (HBV-negativ) feststellbar. Es
wurden die HBV-spezifischen (#405 und #406) und die PXN-spezifischen (#639 und #640) sowie die GAPDH-spezifischen
RT-PCR-Primer (#42 und #43) genutzt.
Abb. 8.5: RT-PCR-Analyse: Erhöhte PXN-mRNA-Menge in stabil HBV-exprimierenden Zelllinien im Vergleich zu HBVnegativen Zellen (V.2). (A) Die erhaltenen RT-PCR-Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung der relativen
mRNA-Menge, welche für HBs kodiert, ergab eine sehr hohe HBV-Menge für die HepG2 2.2.15- und die HepAD38-Zellen,
beide sind HBV-positiv. Die Hep G2-Zelllinie dient als Kontrolle. (B) Die Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Durch die
Quantifizierung der RT-PCR-Ergebnisse ist eine stark erhöhte Menge an PXN-spezifischen Transkripten in HepG2 2.2.15- und
HepAD38- (HBV-positiv) im Vergleich zu den Hep G2-Zellen (HBV-negativ) feststellbar. Es wurden die HBV-, PXN- sowie
GAPDH-spezifischen RT-PCR-Primer genutzt.
56
Ergebnisse
Abb. 8.6: RT-PCR-Analyse: Erhöhte PXN-mRNA-Menge in stabil HBV-exprimierenden Zelllinien im Vergleich zu HBVnegativen Zellen (V.3). (A) Die erhaltenen RT-PCR-Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung der relativen
mRNA-Menge, welche für HBs kodiert, ergab eine hohe HBV-Menge für die HepG2 2.2.15- und die HepAD38-Zellen, beide sind
HBV-positiv. Die Hep G2-Zelllinie dient als Kontrolle. (B) Die Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Durch die Quantifizierung
der RT-PCR-Ergebnisse ist eine erhöhte Menge an PXN-spezifischen Transkripten in HepG2 2.2.15- und HepAD38- (HBV-positiv)
im Vergleich zu den Hep G2-Zellen (HBV-negativ) feststellbar. Es wurden die HBV-, PXN- sowie GAPDH-spezifischen RT-PCRPrimer genutzt.
8.1.2 Knockdown der Paxillinexpression führt zu erhöhter Bildung
von LHBs auf Proteinebene und verringerter HBV-Menge auf
mRNA-Ebene in stabil HBV-exprimierenden Zelllinien
Da die Paxillinmenge in stabil HBV-exprimierenden Zellen erhöht ist, was die vorangegangenen
Experimente belegen, stellte sich die Frage, wie sich ein Knockdown der Paxillinexpression
auf die Expression des Hepatitis-B-Virus und die Abgabe von Viruspartikeln in den Überstand
auswirkt. Der Knockdown erfolgte unter Verwendung von siRNA und die Analyse wurde mittels
Western Blot (siehe Abb. 8.7) durchgeführt. Die Zellen wurden am Tag 1 ausgelegt, am Tag 2
erfolgte die Transfektion mit 20 nM ctrl- oder si-RNA. Die Ernte der Zellen wurde 24/48/72 h
nach erfolgter Transfektion durchgeführt. Der erfolgreiche Knockdown von Paxillin zeigt sich
durch die Analyse der PXN-Menge mittels Western Blot. Die Western Blot-Analyse zeigt
sowohl bei den HepG2 2.2.15-, als auch bei den HepAD38-Zellen einen guten Knockdown auf
Proteinebene mit gleichzeitig erhöhter LHBs-Expression.
57
Ergebnisse
Abb. 8.7: Western Blot-Analyse: Bei Paxillin-Knockdown verstärkte LHBs-Expression in stabil HBV-exprimierenden Zelllinien. (A) Der Western Blot zeigt einen durch siRNA erfolgten Paxillin-Knockdown in HepG2 2.2.15-Zellen (HBV-positiv). Die
Paxillinbande ist beim Knockdown nicht zu detektieren, die obere spezifische LHBs-Bande ist in diesem Fall, im Vergleich zu den
Kontrollzellen desselben Zeitpunktes, verstärkt zu sehen. Als Ladekontrolle wurde β-Aktin verwendet. (B) Die gleiche Versuchsanordnung wurde auch in HepAD38-Zellen durchgeführt und wieder ist keine Paxillin-Bande beim Knockdown durch die siRNA
detektierbar, auch in diesem Fall zeigt sich eine verstärkte LHBs-Bande. Folgende Antikörper wurden verwendet: Anti-Paxillin
Kaninchen (Paxillin), MA 18/7 (LHBs), Anti-β-actin (β-Aktin).
Um die Effekte einer Deregulation der Paxillinexpression beurteilen zu können, wurde ein
Paxillin-Knockdown in HepG2 2.2.15-Zellen durchgeführt und, wie in Abb. 8.8 gezeigt, gleichzeitig im Western Blot, HBsAg-ELISA und RT-PCR analysiert. Die Western-Blot-Analyse
zeigt einen durch siRNA erfolgten, adäquaten Paxillin-Knockdown mit gleichzeitig erhöhter
LHBs-Menge auf Proteinebene. Durch den HBsAg-ELISA konnte eine verringerte Menge an
viralen Oberflächenpartikeln im Überstand der Paxillin-deregulierten Zellen gezeigt werden. Die
Quantifizierung der cDNA in der RT-PCR zeigt eine starke Deregulation der HBV-mRNAMenge in den behandelten Zellen im Vergleich zu den kontrolltransfizierten Zellen. Die aus
dem Überstand isolierte virale DNA weist in der RT-PCR die gleiche Menge auf.
58
Ergebnisse
Abb. 8.8: Paxillin-Knockdown in stabil HBV-exprimierenden HepG 2.2.15-Zellen. (A) Der Western Blot zeigt einen durch
siRNA erfolgten adäquaten Paxillin-Knockdown in HepG2 2.2.15-Zellen (HBV-positiv). Folgende Antikörper wurden verwendet:
Anti-Paxillin Kaninchen (Paxillin), MA 18/7 (LHBs), Anti-β-actin (β-Aktin). (B) Die Daten wurden mittels cut-off-Wert berechnet.
Der HBsAg-ELISA zeigt eine verringerte HBsAg-Menge im Überstand der Knockdown-Zellen. (C) Die RT-PCR-Daten wurden auf
GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung der untersuchten cDNA zeigt in den RT-PCR-Ergebnissen bei erfolgter Deregulation
der Paxillinexpression eine starke Deregulation der HBV-mRNA-Menge in den behandelten Zellen im Vergleich zu den kontrolltransfizierten HepG2 2.2.15-Zellen. Verwendete RT-PCR-Primer: HBV-spezifisch (#185 und #186), PXN-spezifisch (#393 und
#480), GAPDH-spezifisch (#42 und #43). (D) Die im Überstand enthaltene virale DNA wurde isoliert und mittels RT-PCR
quantifiziert. In der Abb. ist kein Unterschied feststellbar. Verwendete RT-PCR-Primer: HBV-spezifisch (#185 und #186).
Die Ergebnisse der Auswertung der HepAD38-Zelllinie decken sich mit den vorhandenen
Daten aus den HepG2 2.2.15-Zellen. Die Abb. 8.9 zeigt die Zusammenstellung der einzelnen
Ergebnisse, wobei hier eine nicht so starke Reduktion in den behandelten Zellen im Vergleich
zu den siRNA-transfizierten HepG2 2.2.15-Zellen zu verzeichnen ist.
59
Ergebnisse
Abb. 8.9: Paxillin-Knockdown in stabil HBV-exprimierenden HepAD38-Zellen. (A) Der Western Blot zeigt einen durch siRNA
erfolgten guten Paxillin-Knockdown in HepAD38-Zellen (HBV-positiv). Folgende Antikörper wurden verwendet: Anti-Paxillin
Kaninchen (Paxillin), MA 18/7 (LHBs), Anti-β-actin (β-Aktin). (B) Die Daten wurden mittels cut-off-Wert berechnet. Der HBsAgELISA zeigt eine verringerte HBsAg-Menge im Überstand der Knockdown-Zellen. (C) Die RT-PCR-Daten wurden auf GAPDH
normalisiert. Die Quantifizierung der untersuchten cDNA zeigt in den RT-PCR-Ergebnissen bei erfolgter Deregulation der Paxillinexpression eine starke Deregulation der HBV-mRNA-Menge in den behandelten Zellen im Vergleich zu den kontrolltransfizierten
HepAD38-Zellen. Verwendete RT-PCR-Primer: HBV-spezifisch (#185 und #186), PXN-spezifisch (#393 und #480), GAPDHspezifisch (#42 und #43). (D) Die im Überstand enthaltene virale DNA wurde isoliert und mittels RT-PCR quantifiziert. Die
Quantifizierung zeigt keinen Unterschied. Verwendete RT-PCR-Primer: HBV-spezifisch (#185 und #186).
Zusammenfassend konnte im stabil HBV-exprimierenden Zellkultursystem sowohl eine erhöhte
Menge an PXN-spezifischen Transkripten als auch eine erhöhte Menge an Paxillin auf Proteinebene nachgewiesen werden. Der Knockdown der Paxillinexpression zeigt auf Proteinebene
eine erhöhte LHBs-Expression mit gleichzeitig verringerter Menge der HBV-Expression auf
mRNA-Ebene sowie an viralen Oberflächenpartikeln im Überstand.
60
Ergebnisse
8.1.3 Intrazelluläre Paxillinverteilung: Akkumuliertes
Verteilungsmuster in stabil HBV-exprimierenden Zellen
Für die Beurteilung der intrazellulären Paxillinmenge und -verteilung in stabil HBV-exprimierenden
Zellen wurden HepG2 2.2.15- (HBV-positiv) zusammen mit Hep G2-Zellen (HBV-negativ)
gemischt und auf ein Deckgläschen ausgelegt, nach der Färbung der Zellen erfolgte die Analyse
mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie.
Abb. 8.10: Immunfluoreszenzanalyse: Verstärkte PXN-Expression in stabil HBV-exprimierenden HepG2 2.2.15-Zellen im
Vergleich zu HBV-negativen Hep G2-Zellen. Die Zellkerne wurden mit DAPI angefärbt und sind in Blau dargestellt. Für die
Paxillinfärbung wurde der Anti-Paxillin-Antikörper (Maus) benutzt und ist im grünen Kanal zu sehen, als zweiter Antikörper wurde
der Anti-mouse IgG-Alexa488 verwendet. Zum Nachweis von HBV-positiven Zellen wurde der Anti-HBcAg (B0586)-Antikörper
verwendet (zweiter Antikörper: Anti-rabbit IgG-Cy3) und ist im roten Kanal sichtbar. Die Menge an vorhandenem Paxillin ist
stark erhöht in den HepG2 2.2.15- im Vergleich zu den Hep G2-Zellen. Zudem zeigen die Aufnahmen eine akkumulierte Form
von Paxillin, welche um den Zellkern lokalisiert ist. Die gelben Bereiche bei der Überlagerung geben Hinweis auf eine mögliche
partielle Kolokalisation von Paxillin und dem Core-Protein von HBV.
61
Ergebnisse
Die Abb. 8.10 zeigt die gemischten HepG2 2.2.15- und Hep G2-Zellen. Die Färbung des CoreProteins vom Hepatitis-B-Virus, welches im roten Kanal sichtbar ist, ermöglicht eine genaue
Unterscheidung von HBV-positiven (HepG2 2.2.15-) und -negativen (Hep G2-) Zellen. Im grünen
Kanal ist die Paxillinverteilung innerhalb der einzelnen Zellen zu erkennen. Es zeigt sich eine
stark erhöhte Menge an Paxillin in den stabil HBV-exprimierenden HepG2 2.2.15-Zellen, welche
in akkumulierter Form um den Zellkern liegt. Die gelben Bereiche in den Überlagerungsbildern
geben Hinweis auf eine mögliche partielle Kolokalisation von Paxillin und dem Core-Protein des
HBV.
8.1.4 Transiente Expression von HBV führt zu erhöhter Bildung von
Paxillin in transfizierten Zellen
Die folgenden Experimente wurden mit transient HBV-exprimierenden Zelllinien durchgeführt.
Um die Auswirkung der HBV-Expression auf die PXN-Menge zu untersuchen, wurden Huh-7.5Zellen mit verschiedenen HBV-Expressionskonstrukten transfiziert.
Abb. 8.11: Western Blot-Analyse: Erhöhte Paxillinexpression in transient HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich zu
kontrolltransfizierten Zellen (V.1). (A) Der Western Blot zeigt HBV-positive Zellen (Huh-7.5_pJo19/gtA/gtG) im Vergleich
zu den kontrolltransfizierten Zellen (Huh-7.5_pUC). Die obere Bande im LHBs-Blot ist die spezifische LHBs-Bande und dient
als Nachweis der HBV-Expression, β-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet. Verwendete Antikörper: Anti-Paxillin Kaninchen
(Paxillin), MA 18/7 (LHBs), Anti-β-actin (β-Aktin). (B) Die Daten wurden auf β-Aktin normalisiert. Die Quantifizierung zeigt
eine erhöhte Paxillinmenge in HBV-positiven Zellen.
Zuerst erfolgte die Untersuchung der Paxillinmenge auf Proteinebene, die Western Blots sind
in Abb. 8.11 und 8.12 dargestellt. Als Negativkontrolle wurde der Leervektor pUC verwendet,
β-Aktin dient als Ladekontrolle und mit Hilfe der Detektion von LHBs ist eine genaue Unterscheidung von HBV-positiven und -negativen Zellen möglich. Die Quantifizierungen zeigen eine
62
Ergebnisse
erhöhte Paxillinmenge in den untersuchten Genotypen (Huh-7.5_pJo19/gtA/gtG) im Vergleich
zu den kontrolltransfizierten Zellen (Huh-7.5_pUC).
Abb. 8.12: Western Blot-Analyse: Erhöhte Paxillinexpression in transient HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich zu
kontrolltransfizierten Zellen (V.2). (A) Der Western Blot zeigt HBV-positive Zellen (Huh-7.5_pJo19/gtA/gtG) im Vergleich
zu HBV-negativen Zellen (Huh-7.5_pUC). Die obere Bande im LHBs-Blot ist die spezifische LHBs-Bande und dient als Nachweis der HBV-Expression, β-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet. Verwendete Antikörper: Anti-Paxillin Kaninchen (Paxillin),
MA 18/7 (LHBs), Anti-β-actin (β-Aktin). (B) Die Daten wurden auf β-Aktin normalisiert. Die Quantifizierung zeigt eine erhöhte
Paxillinmenge in HBV-positiven Zellen.
Als nächstes wurde der Einfluss der verschiedenen HBV-Genotypen auf die PXN-Promotoraktivität
bestimmt, dies erfolgte mit Hilfe eines Luziferase Assays. Die Luziferaseaktivität der Zelllysate
wurde 48 h nach erfolgter Transfektion gemessen. Die Auswertung in Abb. 8.13 weist eine
erhöhte PXN-Promotoraktivität in transient HBV-exprimierenden Zellen auf.
Abb. 8.13: Luziferase-Assay: Erhöhte PXN-Promotoraktivität in transient HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich zu
HBV-negativen Zellen. Die Auswertung zeigt eine höhere Promotoraktivität von Paxillin in Genotypen-transfizierten Zellen. Als
Negativkontrolle dient der Leervektor pUC (HBV-negative Zellen).
63
Ergebnisse
Um auch im transienten HBV-exprimierenden Zellkultursystem die mRNA quantifizieren zu
könnnen, wurde die Gesamt-RNA von Huh-7.5 Zellen, welche mit den verschiedenen HBVGenotypen transfiziert wurden, isoliert. Anschließend erfolgte die reverse Transkription und die
Analyse der cDNA mittels RT-PCR.
Abb. 8.14: RT-PCR-Analyse: Erhöhte PXN-mRNA-Menge in transient HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich zu HBVnegativen Zellen. (A) Die erhaltenen RT-PCR-Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung der relativen mRNAMenge, welche für HBs kodiert, zeigt eine erfolgreiche Expression in den HBV-positiven Zellen (Huh-7.5_pJo19/gtA/gtG) im
Vergleich zu den kontrolltransfizierten Huh7.5_pUC-Zellen. (B) Die erhaltenen RT-PCR-Daten wurden auf GAPDH normalisiert.
Durch die Quantifizierung der RT-PCR-Ergebnisse ist eine erhöhte Menge an PXN-spezifischen Transkripten in HBV-positiven im
Verhältnis zu den HBV-negativen Zellen feststellbar. Es wurden die HBV-spezifischen (#185 und #186) und die PXN-spezifischen
(#393 und #480) sowie die GAPDH-spezifischen RT-PCR-Primer (#42 und #43) genutzt.
Die Daten belegen eine höhere Menge an PXN-spezifischen Transkripten in den HBV-positiven
Zellen (Huh-7.5_pJo19/gtA/gtG) im Vergleich zu den HBV-negativen Kontrollzellen (Huh7.5_pUC) (Abb. 8.14). Zusammenfassend konnten damit die bisherigen Beobachtungen im
stabil HBV-exprimierendem Zellkultursystem belegt werden. Die Menge an Paxillin ist sowohl
auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene in HBV-positiven Zellen erhöht.
64
Ergebnisse
8.1.5 Intrazelluläre Paxillinverteilung in transient
HBV-exprimierenden Zellen
Abb. 8.15: Immunfluoreszenzanalyse von transient HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich zu HBV-negativen Zellen
(1). Die Zellkerne sind in Blau dargestellt und wurden mit DAPI angefärbt. Für die Paxillinfärbung wurde der Anti-PaxillinAntikörper (Kaninchen) genutzt, als zweiter Antikörper diente der Anti-rabbit IgG-Alexa488 und ist im grünen Kanal zu sehen.
Zum Nachweis von HBV-positiven Zellen wurde der MA 18/7 (Anti-LHBsAg)-Antikörper verwendet (zweiter Antikörper: Antimouse IgG-Alexa546) und ist im roten Kanal sichtbar. Sowohl die Menge als auch die Verteilung von Paxillin in der Zelle weisen
keine Veränderung zwischen HBV-positiven und -negativen Zellen auf.
65
Ergebnisse
Für die Begutachtung der intrazellulären Verteilung von Paxillin wurde eine Immunfärbung
durchgeführt und mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie analysiert. Die Abb. 8.15 zeigt
untransfizierte (Huh-7.5) und kontrolltransfizierte (Huh-7.5_pUC) HBV-negative Zellen im
Vergleich zu den HBV-positiven Zellen, welche mit den unterschiedlichen Genotypen transfiziert
wurden. Durch das LHBsAg des Hepatitis-B-Virus ist eine Unterscheidung möglich, dargestellt im
roten Kanal. Die Paxillinverteilung ist im grünen Kanal sichtbar. Die Betrachtung der einzelnen
Zellen zeigt kein unterschiediches Verteilungsmuster oder eine erhöhte Paxillinexpression in
HBV-positiven im Vergleich zu HBV-negativen Zellen. Für die Aufnahmen in Abb. 8.16 wurden
statt des zuvor verwendeten Anti-LHBsAg- der Anti-HBsAg-Antikörper verwendet.
Abb. 8.16: Immunfluoreszenzanalyse von transient HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich zu HBV-negativen Zellen (2).
Die Zellkerne sind in Blau dargestellt und wurden mit DAPI angefärbt. Für die Paxillinfärbung wurde der Anti-Paxillin-Antikörper
(Kaninchen) genutzt, als zweiter Antikörper diente der Anti-rabbit IgG-Alexa488 und und ist im grünen Kanal zu sehen. Zum
Nachweis von HBV-positiven Zellen wurde der HB01 (Anti-HBsAg)-Antikörper verwendet (zweiter Antikörper: Anti-mouse IgGAlexa546) und ist im roten Kanal sichtbar. Sowohl die Menge als auch die Verteilung von Paxillin in der Zelle weisen keine
Veränderung zwischen HBV-positiven und -negativen Zellen auf.
66
Ergebnisse
8.1.6 Replikation von HBV führt zu verringerter PXN-mRNA-Menge
in infizierten primären Hepatozyten
In den in vitro-Experimenten konnte eine erhöhte Paxillinexpression in HBV-exprimierenden
Zellen verzeichnet werden. Um zu untersuchen, ob diese Beobachtung auch im Infektionsmodell
festzustellen ist, wurde mit primären humanen Hepatozyten gearbeitet. Die PHHs wurden mit
infektiösem Überstand von stabil HBV-exprimierenden Zelllinien (HepG2 2.2.15 oder HepAD38)
über Nacht inkubiert und nach verschiedenen Zeitpunkten geerntet und analysiert. Der HBsAgELISA des ersten Infektionsversuches zeigt in Abb. 8.17 einen deutlichen Anstieg des HBsAgTiters, daraus lässt sich eine erfolgreiche Infektion ableiten. Dazu wurden die verschiedenen
Überstände der Erntezeitpunkte und der für die Infektion benutzte HepG2 2.2.15-Überstand
gemessen. Als weiterer Nachweis einer erfolgten Infektion dient die erhöhte Menge der HBVspezifischenTranskripten in infizierten PHHs im Vergleich zu den nicht infizierten Kontrollzellen.
Die Ergebnisse des ersten Infektionsexperiments (Abb. 8.18) zeigen eine verringerte mRNAMenge, welche für Paxillin kodiert, bei erfolgreicher Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus.
Abb. 8.17: HBsAg-ELISA zeigt erfolgte Infektion im PHH-Modell (V.1). Die Daten wurden mittels cut-off-Wert berechnet.
Der HBsAg-ELISA zeigt eine erhöhte HBsAg-Menge im Überstand der infizierten PHHs, woraus sich die erfolgreiche Infektion
ablesen lässt.
67
Ergebnisse
Abb. 8.18: RT-PCR-Analyse: verringerte PXN-mRNA-Menge in infizierten im Vergleich zu uninfizierten PHHs (V.1). (A)
Die Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung der untersuchten cDNA zeigt eine stark erhöhte mRNA-Menge,
welche für HBV kodiert, in den HBV-infizierten Zellen im Vergleich zu den nicht infizierten Kontrollzellen. (B) Die Daten wurden
auf GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung der cDNA weist bei erfolgter Infektion mit HBV eine verringerte Menge an PXNspezifischen Transkripten im Vergleich zu den nicht-infizierten Kontrollzellen auf. Verwendete RT-PCR-Primer: HBV-spezifisch
(#185 und #186), PXN-spezifisch (#588 und #589), GAPDH-spezifisch (#42 und #43).
68
Ergebnisse
Auch die Daten des zweiten Infektionsversuches (Abb. 8.19 und 8.20), bei dem statt des
HepG2 2.2.15-Überstandes für die Infektion der infektiöse Überstand von HepAD38-Zellen
verwendet wurde, zeigen eine deutliche Abnahme der Menge an PXN-spezifischen Transkripten
bei infizierten PHHs im Vergleich zu den nicht infizierten Kontrollzellen.
Abb. 8.19: HBsAg-ELISA zeigt erfolgte Infektion im PHH-Modell (V.2). Die Daten wurden mittels cut-off-Wert berechnet.
Der HBsAg-ELISA zeigt eine erhöhte HBsAg-Menge im Überstand der infizierten PHHs, daraus lässt sich die erfolgreiche Infektion
ableiten.
69
Ergebnisse
Abb. 8.20: RT-PCR-Analyse: Verringerte PXN-mRNA-Menge in infizierten im Vergleich zu uninfizierten PHHs (V.2).
(A) Die Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung der untersuchten cDNA zeigt bei erfolgter Infektion mit
HBV eine stark erhöhte mRNA-Menge, welche für HBV kodiert, im Vergleich zu den nicht-infizierten Kontrollzellen. (B) Die
Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung der cDNA weist bei erfolgter Infektion mit HBV eine verringerte
Menge an PXN-spezifischen Transkripten im Vergleich zu den nicht-infizierten Kontrollzellen auf. Verwendete RT-PCR-Primer:
HBV-spezifisch (#405 und #406), PXN-spezifisch (#639 und #640), GAPDH-spezifisch (#42 und #43).
Bei einer sehr hohen Infektion im PHH-Modell ist es möglich, LHBs mittels Western Blot
zu detektieren (Abb. 8.21 (A)). Die Quantifizierung zeigt keine (V.3.1) oder eine verringerte
(V.3.2) Änderung im Paxillinexpressionslevel auf Proteinebene, jedoch konnte eine verringerte
Menge an PXN-spezifischen Transkripten mittels RT-PCR beobachtet werden (Abb. 8.21
(B-D)).
70
Ergebnisse
Abb. 8.21: Western Blot- und RT-PCR-Analyse: Verringerte PXN-mRNA-Menge in infizierten im Vergleich zu uninfizierten
PHHs (V.3). (A) Der Western Blot zeigt eine erfolgte Infektion, welche durch die obere spezifische LHBs-Bande nachgewiesen
wurde. Verwendete Antikörper: Anti-Paxillin Kaninchen (Paxillin), MA 18/7 (LHBs), Anti-β-actin (β-Aktin). (B) Die Daten wurden
auf β-Aktin normalisiert. Die Quantifizierung zeigt keine Unterschiede der Paxillinmenge auf Proteinebene der infizierten PHHs
im Vergleich zu den nicht-infizierten Kontrollzellen. (C) Die Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Die Quantifizierung der
untersuchten cDNA zeigt in den RT-PCR-Ergebnissen bei erfolgter Infektion mit HBV zeigt eine stark erhöhte Menge an HBVspezifischen Transkripten im Vergleich zu den nicht-infizierten Kontrollzellen. (D) Die Daten wurden auf GAPDH normalisiert.
Die Quantifizierung der cDNA weist bei erfolgter Infektion mit HBV eine verringerte Menge an PXN-spezifischen Transkripten
im Vergleich zu den nicht infizierten Kontrollzellen auf. Verwendete RT-PCR-Primer: HBV-spezifisch (#405 und #406), PXNspezifisch (#639 und #640), GAPDH-spezifisch (#42 und #43).
71
Ergebnisse
Zusammenfassend konnten die drei unabhängigen Untersuchungen (n=3) im Infektionsmodell
von primären humanen Hepatozyten die vorherigen Beobachtungen nicht bestätigen. Jedoch
ist in allen PHH-Versuchen bei erfolgter Infektion eine verringerte Menge an PXN-spezifischen
Transkripten im Vergleich zu den nicht-infizierten Kontrollzellen zu verzeichnen.
8.2 In vivo
8.2.1 Expression von Paxillin in HBV-transgenen Mäusen
Um die Paxillinmenge und -verteilung im in vivo-System analysieren zu können, wurde das
Mausmodell gewählt. Zur Beurteilung der Paxillinexpression in HBV-transgenen Mäusen wurden
Leberzelllysate sowohl von männlichen als auch von weiblichen Tieren im Western Blot analysiert.
Die Abb. 8.22 zeigt die Auswertung der Leberproben aus vier männlichen HBV-negativen und
HBV-transgenen Mäusen. Der Nachweis von HBsAg im Blut der HBV-transgenen Tiere erfolgte
mittels HBsAg-ELISA. Die Quantifizierung zeigt auf Grund der Standardabweichung keine
Unterschiede in der Paxillinmenge. Eine mögliche Erklärung für die hohe Standardabweichung
könnte das unterschiedlich Alter sowie der HBsAg-Titer der einzelnen Tiere sein.
Abb. 8.22: Western Blot-Analyse von männlichen HBV-transgenen im Vergleich zu HBV-negativen Mäusen. (A) Der Western Blot aus Leberzelllysaten zeigt links die männl. HBV-negativ Mäuse und rechts die HBV-transgenen Tiere. Als Ladekontrolle
wurde β-Aktin genutzt. Verwendete Antikörper: Anti-Paxillin Kaninchen (Paxillin), Anti-β-actin (β-Aktin). (B) Die Daten wurden
auf β-Aktin normalisiert. Die Quantifizierung (n=4) zeigt, dass es auf Grund der Standardabweichung keine Unterschiede in der
Paxillinmenge auf Proteinebene zwischen männl. HBV-negativen und HBV-transgenen Mäusen gibt.
Die Analyse der weiblichen Mäuseleberzelllysate ergab auch keine Unterschiede der PXNExpression in den HBV-transgenen im Vergleich zu den HBV-negativen Tieren (Abb. 8.23).
72
Ergebnisse
Abb. 8.23:
Western Blot-Analyse von weiblichen HBV-transgenen im Vergleich zu HBV-negativen Mäusen. (A) Der
Western Blot aus Leberzelllysaten zeigt links die weibl. HBV-negativ Mäuse und rechts die HBV-transgenen Tiere. Als Ladekontrolle
wurde β-Aktin genutzt. Verwendete Antikörper: Anti-Paxillin Kaninchen (Paxillin), Anti-β-actin (β-Aktin). (B) Die Daten wurden
auf β-Aktin normalisiert. Die Quantifizierung (n=4) zeigt, dass es keine Unterschiede in der Paxillinmenge auf Proteinebene
zwischen weibl. HBV-negativen und HBV-transgenen Mäusen gibt.
Als weitere Untersuchung wurde eine RT-PCR von cDNA-Proben, welche aus zuvor isolierter
RNA transkribiert wurden, durchgeführt. Die Abb. 8.24 weist in männlichen HBV-transgenen
im Vergleich zu HBV-negativ Mäusen eine niedrigere Menge an PXN-spezifischen Transkripten
auf.
Abb. 8.24:
RT-PCR-Analyse: Verringerte PXN-mRNA-Menge in männlichen HBV-transgenen im Vergleich zu HBV-
negativen Mäusen. (A) Die Quantifizierung (n=4) zeigt einen sehr hohen mRNA-Anteil, welchen für HBV kodiert; dies dient
als Nachweis für HBV-transgene Tiere. (B) Die Daten wurden auf GAPDH normalisiert. Zu sehen ist eine verringerte Menge
an PXN-spezifischen Transkripten in den männl. HBV-transgenen im Vergleich zu den HBV-negativen Mäusen. Verwendete
RT-PCR-Primer: HBV-spezifisch (#405 und #406), PXN-spezifisch (#639 und #640), GAPDH-spezifisch (#260 und #261).
73
Ergebnisse
Zur Beurteilung der Lebermorphologie wurden Leberschnitte von männlichen Mäusen mit
HE gefärbt. Die Abb. 8.25 weist keine Veränderungen der Leberstruktur von männlichen
HBV-transgenen Mäusen im Vergleich zu den Kontrolltieren auf.
Abb. 8.25: HE-Färbung männlicher Mäuseleberschnitte. (A) HBV-negatives Tier. (B) HBV-transgenes Tier. Zwischen den
Präparaten sind keine Unterschiede erkennbar.
Zur Begutachtung der intrazellulären Paxillinmenge und -verteilung im Mäusemodell wurden
Leberschnitte männlicher Tiere angefärbt und mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie
beurteilt. Wie in Abb. 8.26 zu sehen ist, ist ein verstärktes Paxillinsignal in HBV-positiven
Bereichen der HBV-transgenen Mäuse detektierbar. Die Färbung der viralen Oberflächenproteine,
welche im roten Kanal sichtbar ist, ermöglicht eine genaue Unterscheidung von HBV-positiven
und -negativen Zellen. Im grünen Kanal ist die Paxillinverteilung innerhalb der einzelnen Zellen
zu erkennen, blau sind die Zellkerne. Die gelben Bereiche in den Überlagerungsbildern geben
Hinweis auf eine mögliche partielle Kolokalisation von Paxillin und den Oberflächenproteinen
(LHBs, MHBs, SHBs) des Hepatitis-B-Virus.
74
Ergebnisse
Abb. 8.26: Immunfluoreszenzanalyse: Verstärkte PXN-Expression in männlichen HBV-transgenen Mäusen im Vergleich
zu HBV-negativen Kontrolltieren. Die Zellkerne wurden mit DAPI angefärbt und sind in Blau dargestellt. Für die Paxillinfärbung
wurde der Anti-Paxillin-Antikörper (Kaninchen) benutzt (zweiter Antikörper: Anti-rabbit IgG-Alexa488) und ist im grünen Kanal
zu sehen. Zum Nachweis von HBV-positiven Zellen wurde der Anti-HBsAg-Antikörper (Ziege) verwendet (zweiter Antikörper:
Anti-goat IgG-Cy3) und ist im roten Kanal sichtbar. Die Aufnahmen zeigen eine verstärkte Paxillinanreicherung in HBV-positiven
Bereichen der HBV-transgenen Mäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren. Die gelben Bereiche bei der Überlagerung geben Hinweis
auf eine mögliche partielle Kolokalisation von Paxillin und den Oberflächenproteinen des Hepatitis-B-Virus.
Abschließend konnten durch die Experimente im Mausmodell nur die vorherigen Beobachtungen
auf intrazellulärer Ebene in den in vitro-Modell-Untersuchungen, welche ein verstärktes Paxillinsignal in HBV-positiven Zellen zeigten, bestätigt werden. Die Daten der RT-PCR decken
75
Ergebnisse
sich mit denen des Infektionsmodells und weisen eine verringerte Menge an PXN-spezifischen
Transkripten in HBV-transgenen Tieren auf.
8.2.2 Expression von Paxillin in HBV-infizierten Patienten
Da sowohl die in vitro- als auch die Aufnahmen der Mäuseleberschnitte eine verstärkte Paxillinanreicherung im HBV-positiven Zell- und Gewebebereichen zeigten, wurden zudem Gewebeproben
von Patienten mit HBV-assoziiertem hepatozellulärem Karzinom angefärbt und analysiert.
Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie diente auch in diesem Fall der intrazellulären Beurteilung. In der Abb. 8.27 sind die Aufnahmen dargestellt und es ist erneut ein verstärktes
Paxillinsignal in HBV-positiven Bereichen detektierbar. Die Färbung der viralen Oberflächenproteine, welche im roten Kanal sichtbar ist, ermöglicht eine genaue Unterscheidung von
HBV-positiven und -negativen Zellen. Im grünen Kanal ist die Paxillinverteilung innerhalb
der einzelnen Zellen zu erkennen, die Zellkerne sind blau. Die gelben Bereiche in den Überlagerungsbildern geben Hinweis auf eine mögliche partielle Kolokalisation von Paxillin und
den Oberflächenproteinen des Hepatitis-B-Virus. Somit bestätigt dieser Versuch die zuvor
schon im stabilen Zellkultursystem und Mäusemodell gezeigte erhöhte Paxillinexpression in
HBV-exprimierenden Zellen.
76
Ergebnisse
Abb. 8.27: Immunfluoreszenzanalyse: Verstärkte PXN-Expression in Gewebeproben von Patienten mit HBV-assoziiertem
hepatozellulärem Karzinom im Vergleich zu Kontrollgewebe. Die Zellkerne wurden mit DAPI angefärbt und sind in Blau dargestellt. Für die Paxillinfärbung wurde der Anti-Paxillin-Antikörper (Kaninchen) benutzt (zweiter Antikörper: Anti-rabbit IgGAlexa488) und ist im grünen Kanal zu sehen. Zum Nachweis von HBV-positiven Zellen wurde der Anti-HBsAg-Antikörper (Ziege)
verwendet (zweiter Antikörper: Anti-goat IgG-Cy3) und ist im roten Kanal sichtbar. Die Aufnahmen zeigen eine verstärkte Paxillinanreicherung in HBV-positiven Bereichen des Lebergewebes von Patienten. Die gelben Bereiche bei der Überlagerung geben
Hinweis auf eine mögliche partielle Kolokalisation von Paxillin und den Oberflächenproteinen des Hepatitis-B-Virus.
77
9 Diskussion
Das Hepatitis-B-Virus hat weltweit eine sehr große Bedeutung, momentan sind ca. 350 Millionen
Menschen chronisch erkrankt. Global betrachtet leben etwa zwei Milliarden Menschen mit einer
bestehenden oder ausgeheilten HBV-Infektion. Der Schutz vor einer Infektion kann nur durch
eine Impfung gewährleistet werden, wobei eine erfolgte Infektion mit HBV je nach Schwere der
Infektion individuell behandelt wird. Liegt die chronische Form vor, ist mit schweren Folgen
für den Körper zu rechnen. Als eine der schlimmsten Verlaufsformen gilt die Entwicklung
einer Leberzirrhose, Leberinsuffizienz oder eines hepatozellulären Karzinoms. Die derzeitigen
Behandlungen können nur dazu beitragen, die Virusverbreitung einzudämmen, es kann aber
keine vollständige Heilung erzielt werden. Eine große Hürde für die weitere Entwicklung neuer
Therapiekonzepte ist die Vielzahl ungeklärter Fragen bezüglich des Viruseintritts und seines
Lebenszyklus.
Ziel dieser Arbeit war es, die Relevanz des signaltransduzierenden Adaptorproteins Paxillin
für den Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus zu untersuchen. Dieses Protein ist physiologisch
gesehen ein wichtiger Baustein in den focal adhesions, welche Bedeutung sowohl für die Signalweiterleitung in sowie aus der Zelle haben als auch die Integrität dieser sicherstellen. Durch
verschiedene Publikationen aus den Bereichen der Krebsforschung wurde gezeigt, dass Paxillin
eine pathologisch wichtige Funktion im Tumorgeschehen einnimmt (Kap. 4.2.4). Somit ist
auch eine HBV-vermittelte pathologische Veränderung der Paxillinexpression denkbar, wie dies
bei anderen Tumorarten wie zum Beispiel bei Gebärmutter-, Eierstock- und Bauchspeicheldrüsenkrebs der Fall ist (Deakin et al., 2012). Das Hepatitis-B-Virus repliziert vorwiegend in sich
nicht-teilenden sessilen Zellen und bevorzugt somit stabile focal adhesion-Komplexe, welche
als reversible dynamische Strukturen anzusehen sind. Auf Grund dieses Wissens in Verbindung
mit den schon gewonnenen Erkenntnissen der PXN-Funktion in speziellen Krebsarten wurde
der Zusammenhang von HBV und PXN auf die mögliche Entwicklung neuer therapeutischer
Strategien untersucht.
78
Diskussion
Expression von HBV führt zu erhöhter Bildung von Paxillin in stabil
HBV-exprimierenden Zelllinien
Zu Beginn dieser Arbeit wurde die Expressionsmenge von Paxillin auf Proteinebene in stabil
HBV-exprimierenden Zelllinien (HepG2 2.2.15 und HepAD38) im Vergleich zu HBV-negativen
Kontrollzellen (Hep G2) mittels Northern Blot-Analyse untersucht. Es konnte eine erhöhte
Menge an PXN-spezifischen Transkripten in den HBV-positiven Zellen festgestellt werden
(Abb. 8.1). Durch die Überprüfung der Menge an Paxillin auf Proteinebene konnte ebenfalls
eine Erhöhung dieser verzeichnet werden (Abb. 8.2). Somit ist die erhöhte PXN-Expression
auf Proteinebene in den stabil HBV-exprimierenden Zellen in Bezug auf die Kontrollzellen sehr
wahrscheinlich auf eine erhöhte Transkription und nicht auf einen verminderten Proteinabbau
zurückzuführen. Das PCR-Ergebnis in Abb. 8.3 zeigt eine deutlich gesteigerte Menge an
PXN-spezifischen Transkripten in den stabil HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich zu den
Hep G2-Zellen. Dass keine Paxillinbande trotz gut sichtbarer Ladekontrolle (GAPDH-Bande)
bei den HBV-negativen Zellen zu detektieren ist, kann in der zu geringen PCR-Zyklenanzahl
begründet sein. Da die Negativkontrolle keine Hinweise auf Verunreinigung zeigt, ist es möglich,
dass die benötigte PCR-Zyklenanzahl eine zu große Differenz aufweist, um sowohl bei den
HBV-positiven als auch bei den HBV-negativen Zellen ein gutes PXN-Signal zu bekommen.
Mittels quantitativer PCR (RT-PCR) konnte in allen Versuchen eine gesteigerte Menge an
PXN-spezifischen Transkripten in den HBV-positiven Zelllinien (HepG2 2.2.15 und HepAD38)
im Vergleich zu den Kontrollzelllinie (Hep G2) gezeigt werden. Betrachtet man die Unterschiede
innerhalb der stabil HBV-exprimierenden Zelllinien einzeln, so ist beim ersten Experiment
(Abb. 8.4) die PXN-mRNA-Menge in den HepAD38- höher als in den HepG2 2.2.15-Zellen;
dies gilt auch für die HBV-spezifischen Transkripte. Im zweiten Experiment (Abb. 8.5) ist
die gesteigerte Menge an PXN-spezifischen Transkripten in den HepG2 2.2.15- vergleichend
mit den HepAD38-Zellen zu sehen. Die höhere HBV-mRNA-Menge ist bei den HepAD38Zellen zu verzeichnen. Das letzte der drei Experimente (Abb. 8.6) ähnelt den Ergebnissen
der Quantifizierung des zweiten Versuchs. Auch hier liegt eine gesteigerte Menge an PXNTranskripten in den HepG2 2.2.15- im Vergleich zu den HepAD38-Zellen vor. Zusammenfassend
konnte gezeigt werden, dass immer eine gesteigerte Menge an PXN-spezifischen Transkripten
in stabil HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich zu HBV-negativen Zellen zu detektieren
ist. Dass es beim Vergleich der Menge an Paxillin auf mRNA-Ebene der stabilen Zelllinien
untereinander starke Schwankungen gibt, ist wahrscheinlich der unterschiedlichen Passagenzahl
der bei den Versuchen verwendeten Zellen geschuldet.
Durch die gewonnenen Ergebnisse wurde eine erhöhte Menge an Paxillin in HBV-positiven
Zellen nachgewiesen, damit konnte eine Relevanz dieses Proteins für den Lebenszyklus des
Hepatitis-B-Virus gezeigt werden. Die Bedeutung von Paxillin könnte möglicherweise in der
Rolle als Helfer bei der Virusaufnahme bestehen. Bekannt ist, dass das extrazelluläre Fibronektin
in den Lebersinusoiden über die PreS2-Domäne des Hepatitis-B-Virus gebunden wird und somit
79
Diskussion
eine Kontaktfläche mit diesem und Heparansulfat-Proteoglykanen entsteht (Budkowska et al.,
1995; Schulze et al., 2007). So kann eine Verbindung zu den funktionsreichen focal adhesions
geschaffen und eine Fibronektin-Paxillin-Interaktion sowie ein über die Fibronektin-IntegrinVerknüpfung mediierter Einfluss auf Paxillin ausgeübt werden (Kap. 4.2.3 und 4.2.3). Somit
könnte eine Abhängigkeit des Lebenszyklus von HBV von der umgebenden Matrix durch die
veränderte Paxillinexpression widerspiegelt werden.
Knockdown der Paxillinexpression führt zu erhöhter Bildung von
LHBs auf Proteinebene und verringerter HBV-Menge auf
mRNA-Ebene in stabil HBV-exprimierenden Zelllinien
Zur weiteren Untersuchung wurde der Knockdown von Paxillin in stabil HBV-exprimierenden
Zellen (HepG2 2.2.15 und HepAD38) durchgeführt und mittels Western Blot analysiert. Die
Abb. 8.7 zeigt, dass durch die erfolgreiche Deregulation der PXN-spezifischen Transkripte eine
erhöhte LHBs-Menge im Vergleich zu den kontrolltransfizierten Zellen (Hep G2) detektierbar ist.
Dies ist sowohl in den HepG2 2.2.15- als auch in den HepAD38-Zellen der Fall. Betrachtet man
den Knockdown des Proteins und dessen Folgen auf intra- und extrazellulärer Ebene, so konnte
gezeigt werden, dass nicht nur die gesteigerte intrazelluläre LHBs-Menge auf Proteinebene,
sondern auch eine verringerte extrazelluläre HBsAg-Menge im Überstand der Zellen in beiden
stabil HBV-exprimierenden Zelllinien vorliegt (Abb. 8.8 und 8.9). Auf mRNA-Ebene ist mittels
quantitativer RT-PCR eine verringerte intrazelluläre Menge an HBV- sowie PXN-spezifischer
Transkripte messbar. Die Menge an extrazellulärer viraler DNA im Überstand der Zellen weist
keine Veränderung auf. Der Effekt eines Knockdowns von Paxillin ist in beiden HBV-positiven
Zelllinien gleich.
Ein Reduktion der Paxillinexpression hat eine gesteigerte LHBs-Menge auf Proteinebene in
stabil HBV-exprimierenden Zellen zur Folge. Zudem ist eine verminderten Menge an HBVTranskripten detektierbar. Somit ist es wahrscheinlich, dass die Erhöhung der Viruslast durch
einen verzögerten Proteinabbau bedingt ist. Eine weitere Erklärung könnte sein, dass die 2.4und 2.1-kb HBV-Transkripte stärker betroffen sind als das 3.5-kb HBV-Transkript. Dies würde
zu einer geringeren Menge an SHBs führen und hätte eine unveränderte Menge an Virus im
Überstand sowie von intrazellulärem LHBs zur Folge. Bedingt ist, da die gesunkene Menge
an HBV-Transkripten in den behandelten Zellen im Vergleich zu den kontrolltransfizierten
Zellen eigentlich eine verringerte Transkription von HBV bewirken müsste. Somit ist eine
positiv-regulatorische Funktion von Paxillin möglich.
80
Diskussion
Intrazelluläre Paxillinverteilung: Akkumuliertes Verteilungsmuster in
stabil HBV-exprimierenden Zelllinien
Die Aufnahmen mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (Abb. 8.10) zeigen eine wesentlich
höhere Paxillinmenge auf intrazellulärer Ebene der HBV-positiven Zellen im Vergleich zu den
Kontrollzellen (Hep G2, HBV-negativ). Die Verteilung von Paxillin ist in akkumulierter Form
rings um den Zellkern zu sehen. Das Verteilungsmuster in den HBV-negativen Zellen ist
diffus und es stellt sich eine geringere Menge an Paxillin innerhalb der Zelle dar. Die gelben
Bereiche, welche in den Überlagerungsbildern zu sehen sind, zeigen sich in den HBV-positiven
HepG2 2.2.15-Zellen. Das bedeutet, dass es möglicherweise eine partielle Kolokalisation, was eine
Verbindung zu den focal adhesions nachweisen würde. Diese Verknüpfung könnte mediierenden
Einfluss auf Paxillin haben und damit dem HBV-Lebenszyklus dienen.
Transiente Expression von HBV führt zu erhöhter Bildung von
Paxillin in transfizierten Zellen
Um weitere Hinweise auf die Paxillinmenge und -verteilung in HBV-positiven Zellen zu erlangen, wurde diese Fragestellung im transient HBV-exprimierenden Zellkultursystem untersucht. Die Quantifizierung der Western Blot-Analyse (Abb. 8.11 und 8.12) zeigt eine höhere
Paxillinmenge auf Proteinebene in den mit verschiedenen Genotypen transfizierten Zellen
(Huh-7.5_pJo19/gtA/gtD/gtG) im Vergleich zu den kontrolltransfizierten Huh-7.5_pUC-Zellen
(HBV-negativ). Der höchste Anstieg ist bei den Genotypen A und G zu verzeichnen, gefolgt von
den mit pJo19 transfizierten Zellen. Bei der Analyse der Zellen mittels Western Blot und RT-PCR
ist zu beachten, dass sowohl transfizierte als auch untransfizierte Zellen einbezogen werden. Das
bedeutet, es wird die Gesamtheit aller vorhandenen Zellen untersucht. Somit ist der Effekt an
die Transfektionseffizienz gekoppelt. Die RT-PCR-Auswertung (Abb. 8.14) zeigt eine verstärkte
Bildung der Menge an PXN-spezifischen Transkripten in den transient HBV-exprimierenden
Zellen im Vergleich zu den HBV-negativen Zellen (Huh-7.5_pUC). Die Durchführung des
Luziferase Assay (Abb. 8.13) zeigt zudem eine gesteigerte PXN-Promotoraktivität in HBVpositiven Zellen (Huh7.5_pJo19/gtA/gtG). Die IF-Aufnahmen (Abb. 8.15 und 8.16) zeigen
keinen Unterschied in der Paxillinmenge sowie -verteilung in transient HBV-exprimierenden
Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen.
Zusammenfassend konnte der zuvor beobachtete Effekt der erhöhten Paxillinexpression in
stabil HBV-exprimierenden Zellen im Vergleich zu HBV-negativen Kontrollzellen auch im
transient HBV-exprimierenden Zellkultursystem nachgewiesen werden. Auch in diesem Fall
ist die gesteigerte Menge an Paxillin auf Proteinebene durch die erhöhte Transkription und
nicht durch verminderten Proteinabbau sehr wahrscheinlich. Dies wurde durch die gesteigerte
Menge an PXN-spezifischen Transkripten in den Genotypen-transfizierten Zellen deutlich. Die
81
Diskussion
Tatsache, dass in die humane Hepatomzelllinie Huh-7.5 die Einbringung des HBV-Genoms durch
Transfektion möglich ist, diese Zellen jedoch gegenüber einer HBV-Infektion nicht suszeptibel
sind, könnte eine mögliche Erklärung für den nicht vorhandenen Unterschied der Paxillinmenge
sowie -verteilung in den LSM-Aufnahmen im transient HBV-exprimierenden Zellkultursystem
im Vergleich zu den Aufnahmen der stabil HBV-exprimierenden HepG2 2.2.15 sein (Gripon
et al., 2002).
Replikation von HBV führt zu verringerter PXN-mRNA-Menge in
infizierten primären Hepatozyten
Die Verwendung von Zellen, welche gegenüber einer HBV-Infektion suszeptibel sind, ist auf
Grund der stark beschränkten Verfügbarkeit, der unterschiedlichen Qualität und des rapiden
Verlustes der Suszeptibilität starken Schwankungen und Beschränkungen unterlegen (Gripon
et al., 2002). Die hier verwendeten primären humanen Hepatozyten wurden nach erfolgter
Isolation umgehend in das Institut verbracht und mit Hilfe von infektiösem HBV-enthaltenden
Überstandes infiziert. Die Ergebnisse zeigen eine Reduzierung der Menge an PXN-spezifischen
Transkripten bei erfolgreicher Infektion mit HBV (Abb. 8.18, 8.20 und 8.21). Als denkbare
Ursache kann der zu kurze Beobachtungszeitraum von 12 Tagen angeführt werden. Es ist
abzuklären, ob bei einer länger bestehenden HBV-Infektion die PXN-Expressionsmenge steigt
und dann derselbe Effekt wie im stabil HBV-exprimierenden Zellkultursystem zu beobachten
ist. Zudem ist ein unter Umständen starker Einfluss auf die Paxillinexpression durch das
Herauslösen der PHHs aus der intakten Leberzellmatrix und die nur kurze Adaptionszeit
an die neue Kollagen-Matrix ohne Fibronektin auf den Platten bei der Interpretation der
Ergebnisse mit einzubeziehen. Denn wie bereits angesprochen, könnte so eine Verbindung zu
den funktionsreichen focal adhesions geschaffen werden und eine Fibronektin-Paxillin-Interaktion
sowie ein über die Fibronektin-Integrin-Verknüpfung mediierter Einfluss auf Paxillin ausgeübt
werden (Kap. 4.2.3 und 4.2.3). Damit wäre der beobachtete HBV-abhängige Effekt eher als
sekundär zu betrachten.
Expression von HBV in in vivo-Modellen
Weiterhin wurde der Einfluss von HBV auf die Paxillinexpression in einem HBV-transgenen
Mausmodell untersucht. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen auf der Proteinebene (Abb. 8.22
und 8.23) keine Veränderung der Paxillinmenge. Auf mRNA-Ebene (Abb. 8.24) ist in den
männlichen HBV-transgenen Mäusen im Vergleich zu den Kontrolltieren (HBV-negativ) eine
verringerte Menge der PXN-mRNA detektierbar. Da nun Lebergewebeproben von einem
lebenden Organismus verwendet und nicht im Zellkultursystem behandelt wurden, müssen
Schwankungen zum Beispiel durch Alter und unterschiedlichen HBsAg-Titer berücksichtigt
82
Diskussion
werden. Das bedeutet, dass möglicherweise kein Unterschied im Western Blot nachweisbar ist,
da die Leber durch Blutperfusion versorgt wird und bei der Isolation des Lebergewebes mit
anschließender Analyse auf Protein- und mRNA-Ebene die Bestandteile des Blutes ebenfalls in die
Messungen miteinbezogen werden. So könnten vorhandene Serumreste bei der Normalisierung
interferieren. Die verringerte Menge an PXN-spezifischen Transkripten war auch zuvor in den
HBV-positiven Zellen im PHH-Versuch der Fall. Die Mäuse sind jedoch nicht empfänglich für
eine HBV-Infektion, deshalb wurden gentechnisch veränderte Tiere auf Basis der C57BL/6Linie verwendet, welche das HBV-Genom besitzen (Guidotti et al., 1995). Die Aufnahmen
der Immunfluoreszenzfärbung mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie zeigen jedoch wie
in den zuvor beschriebenen HepG2 2.2.15-Zellversuchen eine gesteigerte Paxillinexpression
in HBV-positiven Bereichen des untersuchten Lebergewebes. Auch hier zeigen die gelben
Bereiche eine möglicherweise partielle Kolokalisation von Paxillin und den HBV-spezifischen
Oberflächenproteinen an (Abb. 8.26). Es ist möglich, dass HBV-spezifische Proteine eine
Verbindung zu den focal adhesions über eine Paxillinbindung erhalten.
Bei der Untersuchung, ob die Paxillinexpression nach einer HBV-Infektion auch im humanen
System regulatorische Veränderungen aufweist (Abb. 8.27), wurde ähnlich wie bei den Aufnahmen der Lebergewebeschnitte der Mäuse verfahren. Es ist, ebenso wie bei den Gewebeschnitten
der Mäuse, eine erhöhte Paxillinmenge in den HBV-positiven Bereichen in den mit einem
HBV-assozierten HCC-Gewebeproben von Patienten im Vergleich zu den Kontrollschnitten zu
sehen. Zu beachten ist, dass es wahrscheinlich andere Regulationsmechanismen im murinen
System bezüglich der Paxillinsteuerung gibt. Sowohl die Gewebeschnitte der Mäuse als auch
die der Patienten zeigen eine möglich partielle Kolokalisation von Paxillin und den Oberflächenproteinen des Hepatitis-B-Virus. Durch zukünftige Experimente muss genauer charakterisiert
werden, welche der drei Oberflächenproteine des HBV daran beteiligt sind und über welche
Mechanismen sie Einfluss auf Paxillin nehmen. Offensichtlich ist jedoch, dass es einen Zusammenhang zwischen der PXN-Expression und dem Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus gibt und
somit auch des Virus-induzierten HCCs.
Ausblick
Durch die gezeigte Relevanz des signaltransduzierenden Adaptorproteins Paxillin auf den Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus müssen zukünftige Untersuchungen klären, inwieweit diese
Erkenntnis, dass die Expression von HBV zu einer erhöhten Menge an Paxillin in stabil HBVexprimierenden Zellen führt, für die Bekämpfung der HBV-Erkrankung genutzt werden kann. Die
umfangreichen Daten aus den stabil HBV-exprimierenden HepG2 2.2.15- und HepAD38-Zellen
zeigen, dass dieser Effekt eindeutig in stabil HBV-exprimierenden Zelllinien beobachtet werden
kann. In den transient HBV-exprimierenden Zellen ist durch die Steigerung der Transfektionseffizienz und eventuell eine längere Zeit nach der Transfektion und vor der Analyse der
intrazellulären Verteilung ein stärkerer Effekt auf die Veränderung der Paxillinexpression zu
83
Diskussion
erzielen. Es muss weiter an der Verbesserung der Konditionen in den in vivo-Modellen gearbeitet werden, um die Veränderung der Paxillinexpression durch äußere Schwankungen auf ein
äußerst geringes Maß zu reduzieren. Mit Hilfe der Analyse von Paxillinüberexpressionsversuchen
kann die andere Seite in HBV-exprimierenden Zellen untersucht werden. Zudem ist zu klären,
welche direkten oder indirekten Strategien HBV nutzt, um Einfluss auf Paxillin zu nehmen.
Ein nächster denkbarer Schritt wäre die genaue Bestimmung des Einflusses von Fibronektin
auf Paxillin im HBV-Lebenszyklus und die Betrachung weiterer Proteine der focal adhesions
bezüglich ihrer Bedeutung für die von HBV benötigte Zellstabilität und -integrität. Die hier
erfolgten ersten Schritte der HBV-PXN-Grundlagenforschung sollen den Anstoß geben für die
weitere gezielte Suche nach neuen Ansätzen für therapeutische Strategien im Kampf gegen die
Hepatitis-B-Erkrankung.
84
Literaturverzeichnis
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Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei all den Menschen bedanken, die zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen haben.
Prof. Dr. Sutter übernahm freundlicherweise meine Betreuung an der LMU München und
hatte jederzeit ein offenes Ohr für mein Anliegen. Durch die Präsentation der Ergebnisse in
seiner Abteilung konnte ich wichtige Anregungen und Hinweise bekommen und so meine Arbeit
weiter voranbringen. Ich danke sehr für die Unterstützung einer tiermedizinischen Doktorarbeit
auf humanmedizinischem Gebiet.
Prof. Dr. Hildt gab mir die großartige Möglichkeit, ein Teil seines Teams zu werden und
begleitete mich durch die Zeit der Doktorarbeit. Durch seine hervorragende wissenschaftliche
Hilfestellung gelang es mir, mich in einen neuen Themenkomplex einzuarbeiten. Die ständige
Diskussionen der Daten ermöglichte eine zielgerichtete und erfolgreiche Arbeit.
Dagmar und Jasminka danke ich für die tolle Unterstützung! Ohne euch wären wir doch alle
verloren ,. Ihr seid immer da, wenn‘s brennt und helft, wo ihr nur könnt. Einen großen Dank
an Dagmar für das Korrekturlesen der Arbeit.
Klaus habe ich jederzeit um Rat und Tat fragen können, wenn es um das LSM ging. Durch
seine große Hilfsbereitschaft und die fantastische Art, Technik zu erklären, gelang es mir, die
IF-Aufnahmen für meine Arbeit anzufertigen.
Kiyoshi war vom ersten Moment an ein super Betreuer ,!! Ich wüsste nicht, was ich ohne
seine immer geduldige, hilfsbereite und kompetente Art gemacht hätte. Er half mir nicht
nur über die ersten Verluste meiner Versuchszellen, sondern auch bei allen nur erdenklichen
Aufgaben im täglichen Laborgeschehen. Zum Glück kam der Spaß nie zu kurz und ich werde
die Zusammenarbeit mit dir vermissen.
Das Laborteam war in all der Zeit immer an meiner Seite und ich danke euch sehr, dass ich
ein Teil des Teams werden konnte! Es braucht nicht mehr Worte, ihr wisst, was ich sagen will.
Es wird mir fehlen, euch nicht mehr jeden Tag zu sehen. Deshalb herzlichen Dank an Gert,
Andrea, Bingfu, Mei, Ramon, Regina, Wiebke, Matthias, Tanjo, Sami, Meli, Stef, Dani, Fabi,
Christian und natürlich Meike! Euer Buch werde ich in Ehren halten.
Martina und Malin möchte ich von ganzem Herzen danken, dass sie mich durchs Leben
begleiten. Es ist unglaublich toll, solche Freunde zu haben, die immer da sind, egal wo man
gerade auf der Welt ist! Durch euch habe ich immer wieder Kraft geschöpft, um die nächsten
Aufgaben bewältigen zu können. Die Auszeit in den Bergen war großartig.
Meiner Familie möchte ich diese Arbeit widmen, denn ihr seid wundervoll!!! Vielen Dank für
alles, durch euch konnte ich diesen Weg gehen und ihr stärkt mir jederzeit den Rücken.
Matze hat wohl die schwerste Aufgabe übernommen, als er mir während der gesamten Zeit
der Arbeit bedingungslos das Seil zum Klettern hielt ,. Ich danke dir von Herzen für dein
Verständnis, die Geduld und die Motivation. Ich bin froh, dass es durch dich auch immer jede
Menge Abwechslung gab und ich trotz des anstrengenden Weges all die schönen Dinge mit dir
erleben durfte!