Experimentelle - TiHo Bibliothek elib

Friedrich-Loeffler-Institut
Institut für Nutztiergenetik
Experimentelle Untersuchungen zur epigenetischen Modulation
in präpuberalen und adulten bovinen Oozyten
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
-Doctor rerum naturalium( Dr. rer. nat. )
vorgelegt von
Mike Diederich
Mayen
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung:
Apl.-Prof. Dr. med. vet. H. Niemann,
Institut für Nutztiergenetik, Mariensee
Friedrich-Loeffler-Institut (FLI)
1. Gutachter:
Apl.-Prof. Dr. med. vet. H. Niemann
2. Gutachter:
Prof. Dr. phil. nat. Stephan Steinlechner
Tag der mündlichen Prüfung: 18.05.2011
Die vorliegende Arbeit wurde durch die H.WILHELM SCHAUMANN-Stiftung gefördert
Diese Doktorarbeit wurde am Friedrich-Loeffler-Institut,
Institut für Nutztiergenetik, Mariensee angefertigt
und ist meiner Familie
und den Kühen und Kälbern gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
9
2
Literatur
12
2.1
Oozytenentwicklung
12
2.1.1
Allgemeine Oogenese
12
2.1.2
Bovine Oozytenreifung
13
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.3
2.3.1
2.4
Follikulogenese
Steuerung des Follikelwachstum durch körpereigene Hormone und
Wachstumsfaktoren
Entwicklungsdynamik ovarieller Follikel bei präpuberalen und adulten
Rinder
Entwicklungskapazität der Oozyten von Kälbern und Kühen
Fertilisation
In vitro Fertilisation von präpuberalen und adulten Oozyten
Einsatz von Reproduktionsbiotechnologischen Techniken
15
16
18
19
22
22
23
2.4.1
OPU beim adulten Rind
24
2.4.2
OPU beim Kalb
25
2.5
Hormonelle Behandlung der Tiere
25
2.5.1
Hormoneinsatz zur Steigerung der Entwicklungskapazität von Oozyten bei
präpuberalen Kälbern
25
2.5.2
Somatotropin und IGF (Insulin-like Growth Factors) Insulin-ähnliche
Wachstumsfaktoren
29
2.5.3
IGF-1 Regulation bei präpuberalen Rindern
30
2.5.4
Einfluss von IGF-1 und IGF-1 Rezeptoren auf die Follikel- und Oozytenentwicklung
30
2.6
Molekulare Genetik
33
2.6.1
DNA Transkription und Translation
33
2.6.2
Transkription in Oozyten
36
2.6.3
Transkriptionsfaktoren in Oozyten
36
2.6.4
RNA Interferenz
38
2.7
Expression entwicklungsrelevanter Gene in präpuberalen und adulten
bovinen Oozyten
38
2.7.1
Entwicklungsrelevante Gene
41
2.7.1.1
Growth differentiation factor-9 (GDF9)
42
2.7.1.2
Solute carrier family 2 (SLC2A1)
43
Inhaltsverzeichnis
2.7.1.3
Peroxiredoxin 1 (PRDX1)
44
2.7.1.4
Zygotic arrest 1 (ZAR1)
45
2.8
Epigenetik
46
2.8.1
Epigenetische Genregulation
46
2.8.2
DNA-Methylierung
47
2.8.3
Imprinting
52
2.8.4
Histonmethylierung
54
2.9
Quantitative DNA-Methylierung: DNA-Sequenzierung
57
2.9.1
Pyrosequenzierung
59
3
Material und Methoden
62
3.1
Versuchstiere
62
3.1.1
Untersuchung der Kälber und Kühe
62
3.1.2
Technische Ausstattung der OPU-Methode
63
3.1.3
Vorbereitung der Kälber und Kühe
64
3.1.4
Transvaginale Follikelpunktion (OPU)
65
3.1.5
Beurteilung der Entwicklungsfähigkeit von Kumulus-Oozyten-Komplexen
(KOK)
67
3.2
In vitro Verfahren
68
3.3
Präparation von ungereiften und gereiften Oozyten für die
Methylierungs-bestimmung und Real-time PCR
69
3.4
RT-PCR Analysen
70
3.4.1
Isolierung von mRNA
70
3.4.2
Reverse Transkription (RT)
71
3.4.3
Real-time PCR
72
3.4.4
DNA Isolierung aus bovinem Gewebe
74
3.5
DNA Isolierung und Bisulfitbehandlung aus präpuberalen und adulten
Oozyten
74
3.5.1
Bisulfitkonvertierung
76
3.5.2
DNA-Methylierung von Repeatsequenzen
77
3.5.3
Primer Design, PCR Amplifikation und Gelelektrophorese der DNA von
bisulfitbehandelten Oozyten und bovinem Uterusgewebe
78
3.5.3.1
Gelelektrophorese der PCR Produkte
79
3.6
®
Ligation von PCR-Produkten in das pGEM T-easy Vektor System
80
Inhaltsverzeichnis
3.7
Transformation der PCR-Produkte in chemisch-kompetente E.coliBakterien
80
3.7.1
Präparation von chemisch-kompetenten Bakterien
80
3.7.2
Transformation der PCR-Produkte in kompetente Bakterienzellen
81
3.7.3
PCR Screening der transformierten Bakterienklone
81
3.7.4
Analyse der sequenzierten Bakterienklone
82
3.8
Methylierungsanalyse mittels Direktsequenzierung
82
3.9
Versuchsaufbau
85
3.10
Statistische Analyse
87
4
Ergebnisse
88
4.1
OPU an präpuberalen Kälbern und adulten (laktierenden) Kühen
88
4.1.1
Übersicht zu den OPU-Ergebnissen aus den Kälber- und
Kuhversuchsgruppen
89
4.2
Genexpressionsanalysen
90
4.2.1
Messenger RNA-Expression in ungereiften Oozyten von Kälbern und
Kühen
90
4.2.2
Messenger RNA-Transkriptmenge in in vitro gereiften Oozyten von
Kälbern und Kühen
92
4.2.3
Vergleichende mRNA-Transkriptmenge in Oozyten präpuberaler und
adulter Rinder vor und nach in vitro Maturation
95
4.3
Methylierungsanalysen
97
4.3.1
Bestimmung der Methylierung von Repeatsequenzen in präpuberalen und
adulten bovinen Oozyten
97
4.4
Methylierungsmuster von zwei Repeatsequenzen in unterschiedlichen
Entwicklungsstadien der Oozyte und Versuchstiergruppen nach
morphologischer Klassifizierung
99
4.4.1
Methylierung in ungereiften undgereiften präpuberalen und adulten
bovinen Oozyten
99
4.4.1.1
Bovine testis satellite I DNA, segment 2 (BTS)
100
4.4.1.2
Bos taurus α-Satellite I DNA, clone BtKB5 (BTαS)
103
4.5
DNA-Methylierung ungeprägter Gene in ungereiften und gereiften
präpuberalen und adulten bovinen Oozyten
106
Inhaltsverzeichnis
5
Diskussion
109
5.1
Follikelstimulierung, Oozytengewinnung und Maturation von
präpuberalen und adulten Rindern
110
5.2
Messenger RNA-Expression juveniler und adulter Oozyten vor und
nach in vitro Maturation
112
5.3
Methylierungsanalyse an Repeatsequenzen und ausgewählten Genen
116
5.4
Schlussfolgerungen
122
6
Zusammenfasung
124
7
Summary
128
8
Literaturverzeichnis
131
9
Anhang
185
9.1
Medienzusammensetzung
185
9.1.1
Medien für die in vitro Maturation
185
9.1.2
Lösungen und Reagenzien für die Reverse Transkription und PCR
187
9.1.3
Lösungen und Reagenzien für die Bisulfitbehandlung von Oozyten
188
9.2
Angaben zu den Primersequenzen für die Limiting Dilution
191
10
Verzeichnisse
193
10.1
Abkürzungsverzeichnis
193
10.2
Abbildungsverzeichnis
196
10.3
Tabellenverzeichnis
200
10.4
Auszüge aus der Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit vorgestellt
201
11
Danksagungen
202
Ergebnisse 1
Einleitung
Die vollständige Entwicklungskompetenz boviner Oozyten wird während der Follikulogenese
erlangt und findet ihren Abschluss in der Fertilisation. Das Erreichen der Entwicklungskompetenz ist von zahlreichen Faktoren wie Jahreszeit, Follikelgröße, Stress, Fütterung,
Gesundheit und Alter der Tiere abhängig (ARMSTRONG et al. 1997; BOLAND et al. 2001;
TANEJA et al. 2000; PTAK et al. 2003; LI et al. 2007). Mit Hilfe der transvaginalen
Follikelpunktion (OPU) können ungereifte Oozyten von adulten und präpuberalen Tieren
gewonnen werden (OROPEZA et al. 2006). Der Einsatz dieser Technologie lässt eine
vorzeitige züchterische Verwendung von präpuberalen Rindern zu, da das Generationsintervall verkürzt und die Nutzung des weiblichen Keimzellpotentials effizienter gemacht
wird. Somit können von genetisch wertvollen Tieren schon vor der eigentlichen Zuchtreife
Nachkommen produziert werden.
Eine Vielzahl von Untersuchungen an Oozyten präpuberaler Rinder belegen jedoch, dass sich
ihre Entwicklungsfähigkeit deutlich von den Oozyten adulter Tiere unterscheidet (SEIDEL et
al. 1971; REVEL et al. 1995: GANDOLFI et al. 1998; STEVENS et al. 1999; ARMSTRONG
2001; OROPEZA et al. 2004; KAUFFOLD et al. 2005a). Als mögliche Ursachen werden u.a.
die unvollständige zytoplasmatische Reifung und die veränderte Proteinsynthese in
präpuberalen Oozyten gesehen (MHAWI et al. 1991; KATHIR et al. 1998; DE PAZ et al.
2001; SALAMONE et al. 2001). GANDOLFI et al. (1998) beobachteten in präpuberalen
Oozyten eine signifikant niedrigere Proteinsynthese im Vergleich zu Oozyten adulter Kühe.
Weitere Einflussfaktoren auf die Entwicklungsfähigkeit werden in der Oozytengröße und dem
Stoffwechsel der Eizellen vermutet. (LONERGAN et al. 1994; FAIR et al. 1995; KHATIR et
al. 1997; GANDOLFI et al. 1998; STEVENS et al. 1999; KAUFFOLD et al. 2005).
Um die Entwicklungskapazität präpuberaler boviner Oozyten zu verbessern, wurden in
verschiedenen Studien intramuskuläre und intraovarielle Injektionen durchgeführt. Durch die
intraovarielle Injektion von Insulin-like-growth factor-1 (IGF-1) konnte die Entwicklungsfähigkeit präpuberaler Oozyten weiter verbessert werden (OROPEZA et al. 2004).
9
Einleitung
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Kälber (6-9 Monate) intramuskulär mit FSH und
intraovariell mit IGF-1 oder einer Kontrolllösung behandelt und hinsichtlich der Oozytenzahl
und in vitro Reifungsrate mit unbehandelten Kälbern sowie behandelten und unbehandelten
adulten Kühen verglichen. Anschließend wurde der Einfluss der verschiedenen Behandlungen
auf den mRNA Gehalt und das Methylierungsmuster der Eizellen untersucht.
Die Entwicklung der Oozyte vom Primordialstadium bis zum gereiften und befruchtungsfähigen
Stadium
unterliegt
einer
komplexen
und
spezifischen
Regulation.
Das
Expressionsmuster der Gene wird sowohl von genetischen als auch von epigenetischen
Faktoren beeinflusst. Bei entwicklungsspezifischen Genenist es für die Erlangung der
vollständigen Entwicklungskompetenz von Oozyten von besonderer Bedeutung. Im
Gegensatz zu den meisten anderen Geweben, in denen eine ständige Neusynthese von mRNA
erfolgt, findet die Transkription in der Oozyte nur während der Wachstumsphase statt
(THÈLIE et al 2007). Der Growth-differentiation-factor-9 (GDF9) ist für die Differenzierung
und Proliferation verschiedener Zellen von Bedeutung. Er wird während der frühen
Follikelentwicklung in den Oozyten synthetisiert und ist am Oozytenwachstum beteiligt
(VITT et al. 2002). Die relative Transkriptmenge von GDF9 ist in ungereiften Oozyten am
höchsten und steht im Zusammenhang mit der Entwicklungskompetenz (LONERGAN et al.
2003). Ein wichtiger Nährstoff für Oozyten ist die Glucose. Diese wird unter anderem mit
Hilfe des Glucosetransporters 1 in die Zelle transportiert, welcher von SLC2A1 kodiert wird
(MORITA et al. 1992; AUGUSTIN et al. 2001). SLC2A1-mRNA-Transkripte lassen sich
sowohl in ungereiften, als auch in gereiften Oozyten nachweisen. Die mRNA-Konzentration
nimmt für SLC2A1 im Verlauf der Oozytenreifung ab. Während der in vitro Kultur werden
Oozyten und Embryonen einer Vielzahl von Umwelteinflüssen ausgesetzt. Zum Schutz der
Oozyte vor reaktiven Sauerstoffspezies sind unterschiedliche Antioxidationssysteme aktiv
(GUERIN et al. 2001).
Die Transkripte verschiedener Peroxiredoxine (PRDX) sind in Oozyten nachweisbar, darunter
PRDX1, welches sowohl vor als auch nach der in vitro Reifung in Oozyten zu finden ist
(MOUROT et al. 2006). Eine Vielzahl von Studien zeigt auch die Abhängigkeit der frühen
Embryonalentwicklung von maternalen Genprodukten (DURANTHON und RENARD 2001).
Das Zygotic arrest 1 (ZAR1) Gen stellt einen oozytenspezifischen maternalen Faktor in
Oozyten dar (BREVINI et al. 2004).
10
Einleitung
Beim Rind lassen sich ZAR1-Transkripte in ungereiften Oozyten und in der frühen
Embryonalentwicklung bis zum 5-8-Zellstadium nachweisen (PENNETIER et al. 2004).
Epigenetische Veränderungen beeinflussen die Genexpression während der Oozyten- und
Blastozystenentwicklung und führen zur Modifikation des Chromatin, verursachen aber keine
Änderung der DNA-Sequenz (LUCIFERO et al. 2007; MCGRAW et al. 2007). Ein korrektes
DNA-Methylierungsmuster ist für eine normale Säugetierentwicklung und die Aktivierung
spezifischer Gene eine essentielle Voraussetzung (GELDERMANN 2005). Es wird während
der Gametogenese und der frühen Embryogenese etabliert und im Laufe der
Oozytenentwicklung modifiziert (JAENISCH 1997; KAGEYAMA et al. 2007). Es wurde
insbesondere an Mäusen gezeigt, dass die Erstellung von spezifischen Methylierungsmustern
während der Oogenese für die physiologische Entwicklung von Feten entscheidend ist.
Ein weiterer Teilaspekt dieser Arbeit ist, den Einfluss der DNA-Methylierung auf das
Entwicklungspotential von Kälberoozyten im Vergleich zu adulten Eizellen zu untersuchen.
Die Bestimmung des DNA-Methylierungsmusters erfolgt zum einen mittels klassischer
Bisulfitesequenzierung an zwei Repeatsequenzen. Zum anderen wurde die spezifischen
Metyhlierungsmuster der entwicklungsrelevanten Gene SLC1A2, PRDX1 und ZAR1 unter
Verwendung der „Limiting Dilution Methode“ untersucht.
Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen dazu beitragen, neue Erkenntnisse über das
Entwicklungspotential boviner präpuberaler Oozyten zu erlangen - insbesondere im Hinblick
auf die in vitro Maturation - und die Nutzung präpuberaler Tiere in der Rinderzucht mit
gutem Erfolg zu ermöglichen.
11
Literatur
2
Literatur
2.1
Oozytenentwicklung
2.1.1
Allgemeine Oogenese
Während der Oogenese (Entwicklung der Eizelle) entwickeln sich die Oozyten im Ovarium
aus diploiden Urkeimzellen (Primordialfollikel) bis zu befruchtungsfähigen Gameten mit
einfachem Chromosomensatz. Bei den meisten Säugern ist die Oozytenbildung bereits vor der
Geburt abgeschlossen (ZUCKERMAN und BAKER 1977; ANDERSON und HIRSHFIELD
1992), d.h. es kommt postnatal zu keiner weiteren Zunahme von Oozyten. Neuere Untersuchungen zeigten jedoch, dass weibliche Gonaden in vivo eine regenerative Aktivität sowohl
bei juvenilen als auch bei adulten Mäusen besitzen (JOHNSON et al. 2004). Mesenchymale
Zellen der Tunica albuginea bilden die Vorstufe von bipotenten ovariellen Stammzellen des
Oberflächenepithels in Ovarien. Diese stellen wiederum die Vorstufe von Oozyten und
Granulosazellen dar, die sich während der fetalen Entwicklung zu Follikeln und Oozyten für
die reproduktive Phase ausbilden (BUKOVSKY et al. 2008). Nach der Isolierung von
präpuberalen Keimbahn-Stammzellen und deren Transplantation in infertile Empfängertiere
wurden von ZOU et al. (2009) lebende Nachkommen produziert. Auch BUKOSKY (2006)
gelang es aus ovariellen Epithelstammzellen Oozyten aus Ovarien mit fehlenden primären
Follikeln in vitro zu produzieren.
Die weibliche Fruchtbarkeit wird im großen Maß von der Entwicklungskompetenz der
Oozyte bestimmt (KIDDER und VANDERHYDEN 2010). Die Oogenese vollzieht sich in der
Rindenschicht des Ovars und findet ihren Abschluss mit der Ovulation. Während der fetalen
Entwicklung kommt es in den Ovarien zur Bildung einer großen Anzahl an Oogonien. Diese
aus den Primordialkeimzellen hervorgegangenen Oogonien durchlaufen zahlreiche mitotische
Teilungen und bilden mit den somatischen Zellen der Keimstränge den sogenannten Eiballen.
Die aus Stammzellen abstammenden Oogonien liegen in Gruppen zusammen und sind
untereinander über Interzellularbrücken verbunden. Mit der Differenzierung der Oogonien zu
Oozyten 1. Ordnung (primäre Oozyten) in der nachfolgenden ersten Wachstumsperiode, ist
die Gesamtpopulation an Keimzellen eines Organismus festgelegt. Ihre Anzahl kann sich im
Weiteren nur noch durch Ovulation und Atresie verringern (SCHNORR und KRESSIN 2001;
KRYSKO et al. 2008).
12
Literatur
Mit dem Wachstum der Oozyten erfolgt auch die Differenzierung der umgebenden
Follikelzellen. Zwischen Oozyte und Kumuluszellen werden sogenannte Gap Junctions
ausgebildet.
Diese dienen der Ernährung und Übertragung von Molekülen mit einem Molekulargewicht
von bis zu 1000 Dalton (Da). Zusätzlich kommt es zur Ausbildung einer Zellmembran um die
Oozyte, die aus der Zona pellucida und einer Zellschicht der Corona radiata besteht
(LIEBICH 1999; GOSDEN 2002). Die Zona pellucida besitzt mehrere Funktionen. Sie ist u.
a. für die monosperme Befruchtung verantwortlich. Die Corona radiata liegt außerhalb der
Zona pellucida und dient der Ernährung der Oozyte (LIEBICH 1999). Nach der Ovulation
wird die Oozyte vom Infundibulum der Tuba uterina (Eileiter) aufgenommen. Bei einer
eintretenden Befruchtung wird die Oozyte als Zygote ins Uteruslumen überführt. Kommt es
zu keiner Befruchtung erfolgt ca. 24 Stunden nach der Ovulation die Atresie der Oozyte.
2.1.2 Bovine Oozytenreifung
Die Vermehrung der Oogonien beginnt ab Tag 30 der Trächtigkeit (LAVOIR et al. 1994) und
ist an Tag 160 der bovinen Fetalentwicklung abgeschlossen. Ab einem Alter von 110 Tagen
sind in den beiden Ovarien eines bovinen Fetus ca. 5 x 106 Oozyten vorhanden (KOLB 1989),
die ihre erste meiotische Phase (Prophase I) an Tag 75 der Trächtigkeit erreichen
(ERICKSSON 1966). In dieser Phase der Entwicklung kommt es zum Austausch genetischen
Materials durch „Crossing over“ zwischen den homologen Chromatiden, was zur Neuordnung
der Erbsubstanz führt. Die meiotische Prophase I besteht aus fünf Phasen, die den längsten
und kompliziertesten Abschnitt der Meiose darstellen. Jede Stufe ist durch eine spezifische
Chromosomenkonfiguration charakterisiert (BAKER und FRANCHI 1967). Die Oozyten in
der vierten Entwicklungsstufe unterliegen einer längeren Ruhephase (SCHNORR und
KRESSIN 2001). In diesem arretierten Zustand weisen Oozyten einen Durchmesser von 3050µm auf, der auch als „Germinal Vesicle“ (GV) bezeichnet wird (BAKER und FRANCHI
1967; SCHNORR und KRESSIN 2001). Da beim Rind für die Weiterentwicklung ein
Oozytendurchmesser von mind. 100 µm notwendig ist, müssen diese in der Phase fünf
deutlich an Größe zunehmen (Abb.1).
13
Literatur
Erst ab einem Durchmesser von 110 µm erreichen und vollenden bovine Oozyten die
Metaphase II (MII) (FAIR et al. 1995; OTOI et al. 1997).
Abbildung 1: Schematischer Ablauf der Follikel- und Oozytenentwicklung (FAIR 2003)
Die Entwicklungsfähigkeit einer Oozyte ist nicht nur von der meiotischen, sondern auch von
der zytoplasmatischen Reifung abhängig (FAIR et al. 1995). Mit der vollständigen Reifung
von Zytoplasma und Kern erhält die Säugetieroozyte die Fähigkeit zur Befruchtung und
frühen embryonalen Entwicklung (NIEMANN und MEINECKE 1993). Bevor es zur
Metaphase I kommt, laufen im Ooplasma bedeutende Veränderungen ab. Es kommt zur
Auflösung der Kernmembran (Germinal Vesicle Break Down, GVBD), zur Kondensierung
des Chromatins, Trennung der homologen Chromosomen (Anaphase I) und zur Ausbildung
eines Polkörpers (WASSARMAN und ALBERTINI 1994). Zusätzlich findet eine vermehrte
Einlagerung von Lipiden, eine Umverteilung der Mitochondrien sowie die Auflösung von
einzelnen Bereichen des Golgiapparats und Anlagerung der kortikalen Granula am Oolemma
zur Verhinderung von Polyspermie bei der Befruchtung statt (WASSARMAN und
ALBERTINI 1994; HYTTEL et al. 1997).
14
Literatur
Die Oozytenreifung korreliert mit der Aktivierung der beiden Zellzyklusmoleküle Cdc2- und
MAP- Kinase (HIRAO et al. (1995). Die sekundäre Oozyte verharrt bis zur Befruchtung im
Stadium der Metaphase II (SCHNORR und KRESSIN 2001). In dieser Arretierungsphase
findet in vivo die Ovulation statt (HYTTEL et al. 1997).
Während der Oozytenentwicklung kommt es zur Synthese einer großen Menge von
Ribonukleinsäuren (RNA), die im Verlauf der Reifung bis zu einem Oozytendurchmesser von
ca. 110 µm abnimmt (FAIR et al. 1995). Die synthetisierte RNA wird im Wesentlichen für
das Oozytenwachstum und die frühe embryonale Entwicklung benötigt (SIRARD et al. 1989;
HYTTEL et al. 2001). Einen höheren Anteil an in vitro gereiften Oozyten konnten bereits
DAHLHAUSEN et al. (1981) bei präpuberalen bovinen Oozyten mit kompakten bzw.
geringgradig expandierten Kumuluszellen aus Follikeln mit maximal 6 mm Durchmesser im
Vergleich zu Oozyten aus Follikeln mit einem Durchmesser von >6 mm beobachten.
Unterstützt wird ihre Aussage durch Studien von PAVLOK et al. (1992) und ARLOTTO et
al. (1996) die zeigten, dass Größe und Lage der Follikel einen wichtigen Einfluss auf
Kernreifung
und
nachfolgende
Reifungsprozesse
haben.
Rinderoozyten
aus
Schlachthofovarien mit einem Durchmesser von 110 bis 125 µm zeigten eine signifikant
höhere Teilungs- und Schlupfrate im Vergleich zu kleineren bzw. größeren Oozyten (OTOI et
al. 1997).
2.2
Follikulogenese
Die Follikulogenese stellt einen sehr komplexen und fein abgestimmten Prozess dar, in
welchem endo- und parakrine Signale eine wichtige Rolle spielen (WEBB et al. 2004). Der
Follikel setzt sich aus der Oozyte, den Granulosa- und Thecazellen (SKINNER et al. 2008)
sowie der Follikelflüssigkeit zusammen. Die Entwicklungskapazität der Oozyten ist von
Wachstum und Zustand der sich entwickelnden Follikel abhängig (BILODEAU-GOESEELS
und PANICH 2002; SUTTON et al. 2003; LEQUARRE et al. 2005). Die Follikelbildung
beginnt im bovinen fetalen Ovar ab dem 90. Trächtigkeitstag und endet durch Atresie oder
Ovulation der Oozyte (WANDJI et al. 1992; MEINECKE 2000).
15
Literatur
Ab Tag 100 der Trächtigkeit bilden sich erste Primordialfollikel aus. An Tag 220 sind die
ersten tertiären Follikel erkennbar (KOLB 1989; WANDJI et al. 1992). Die einzelnen Stadien
der Follikelentwicklung sind durch verschiedene histologische Merkmale gekennzeichnet.
Die in der Prophase der Meiose I im Ruhestadium befindlichen Primäroozyten weisen einen
Durchmesser von ca. 30 µm auf und sind von einer Schicht abgeplatteter, undifferenzierter
Follikelzellen umgeben (LIEBICH 1999).
Die
Granulosazellen
der
Primäroozyten
verändern
ihre
Form
im
weiteren
Entwicklungsverlauf durch mitotische Teilungen zum Stratum granulosum (SCHNORR und
KRESSIN 2001) und bilden den Sekundärfollikel mit einem Durchmesser von ca.
80 – 100 µm (FAIR et al. 1997; LIEBICH 1999; SCHNORR und KRESSIN 2001).
Desweiteren kommt es zur Ausbildung von Gap Junctions, die einen Austausch von
Molekülen zwischen Oozyten und den umgebenden Zellen ermöglichen (FAIR et al. 1997). In
der weiteren Entwicklungsphase wird durch die Sekretion des Liquor follicularis aus den
Granulosazellen die Hohlraumbildung zwischen Oozyte und Follikel initiert (SCHNORR und
KRESSIN 2001). Die Oozyten weisen nun eine Größe von 120 – 150 µm auf und sind von
Granulosazellen umgeben (KOLB 1989; LIEBICH 1999; SCHNORR und KRESSIN 2001).
Diese ordnen sich zur Corona radiata und bilden so zusammen mit der Follikelwand den
Cumulus oophorus und synthetisieren zusammen mit der Theca interna Östrogene (LIEBICH
1999; SCHNORR und KRESSIN 2001). Follikel ab einer Größe von 12 - 20 mm werden als
„Graaf`scher Follikel“ bezeichnet und die Oozyte kann ihre erste meiotische Teilung
vollenden (KOLB 1989; LIEBICH 1999).
2.2.1 Steuerung des Follikelwachstum
Wachstumsfaktoren
durch
körpereigene
Hormone
und
Das Follikelwachstum unterliegt einem komplexen hormonellen, extra- und intraovariellen
Steuerungsmechanismus. Ein wesentlicher Mechanismus ist, dass Thecazellen auf das
luteinisierende Hormon (LH) reagieren und Androgene synthetisieren. Granulosazellen
wiederum sind verantwortlich für die Produktion des Follikel stimulierenden Hormons (FSH)
und die Bildung von Östrogenen (WEBB et al. 2004).
16
Literatur
Die
Interaktionen
zwischen
Granulosa-
und
Thecazellen
sind
für
das
antrale
Follikelwachstum und die Reifung der Oozyten erforderlich (TAJIMA et al. 2006; SKINNER
et al. 2008). Eine mögliche endokrine Ursache für eine Unfruchtbarkeit wird in der
übermäßigen Ausbreitung von Thecazellen und der damit verbundenen Hyperandrogenese
gesehen (MAGOFFIN 2005; WICKENHEISSER et al. 2006). Zudem hat die lokale Synthese
von verschiedenen Wachstumsfaktoren wie Bone Morphogenetic Protein (BMP-6, -15),
Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9), Aktivin, Inhibin, Insulin-like Growth Factor (IGF1) und Epidermal Growth Factor (EGF) große Bedeutung für die Zell-, Follikel- und
Oozytenentwicklung (WEBB et al. 2004; SKINNER 2005).
BMP-6 und -15, sowie GDF-9 werden während der gesamten Follikelentwicklung bis über
die Ovulation hinaus synthetisiert und stimulieren Proliferation und Differenzierung der
Granulosazellen (KNIGHT und GLISTER 2003). Aktivin stimuliert die Proliferation von
Granulosazellen der präantralen und frühen antralen Follikel. Über das FSH kommt es zur
Steigerung der Aromatase-Aktivität, was zu einer verzögerten Luteinisierung bzw. Atresie
von großen antralen Follikeln führt. Inhibin seinerseits steigert die LH-induzierte
Androgensynthese in großen Follikeln (KNIGHT und GLISTER 2003). Die endokrine
Regulation des Sexualzyklus erfolgt über die hierarchisch aufgebaute HypothalamusHypophysen-Ovar-Achse, deren Steuerung über eine hemmende Rückkopplungsschleife
(negatives Feedback) erfolgt. Die Steuerung der Follikelreifung erfolgt wesentlich über die
Granulosa- und Thecazellen. Erlangt der Follikel das Gonadotropin reaktive Entwicklungsstadium, so weisen seine Granulosazellen FSH- und Theca-interna-Zellen LH-Rezeptoren auf.
Das aus dem Hypophysen-Vorderlappen (HVL) in basalen Mengen freigesetzte LH bindet an
die Rezeptoren der Thecazellen und stimuliert die Synthese von Androgenen, die
anschließend in die Granulosazellen transportiert werden. Das aus der Hypophyse freigesetzte
FSH wird an die entsprechenden Rezeptoren der Granulosazellen gebunden und stimuliert die
Aromatisierung der Androgene aus den Thecazellen zu Östrogenen. Die Freisetzung von LH
und FSH erfolgt durch die pulsatile Ausschüttung des Neurohormons Gonadotropin Releasing
Hormon (GnRH), dessen Frequenz und Amplitude sich im Verlauf des Zyklus ändern
(CLARKE und CUMMINS 1982). Weitere wichtige Faktoren sind IGF-I und -II. IGF-I lässt
sich in Granulosazellen der präantralen und antralen Follikel nachweisen (SCHAMS et al.
2002) und wird unter Punkt 2.5.4 näher erläutert.
17
Literatur
2.2.2
Entwicklungsdynamik ovarieller Follikel bei präpuberalen und adulten Rindern
Das Follikelwachstum adulter Kühe zeigt einen wellenförmigen Verlauf (PIERSON und
GINTHER 1988; SAVIO et al. 1988; SIRIOS und FORTUNE 1988). Dieser zeigt sich meist
in zwei bis drei follikularen Wachstumswellen pro Zyklus (GINTHER et al. 1989). Jede
Welle initiiert das Wachstum einer Gruppe von FSH abhängigen Follikeln ≥ 3 mm und führt
zu einem Anstieg der FSH Konzentration im Serum (ADAMS et al. 1992). Bis zu einer
Follikelgröße von 3 mm verläuft die Follikelentwicklung parallel. Aus einer Gruppe antraler
Follikel entwickelt sich im weiteren Verlauf ein dominanter Follikel (ADAMS et al. 1992;
DRIANCOURT 2001).
Im Allgemeinen erreicht der dominante Follikel an Tag 6 nach Zyklusbeginn seine max.
Größe und reduziert seine „Dominanz“ zwischen Tag 8 und 10, was eine neue Welle auslösen
kann. Die zweite oder eine mögliche dritte Welle führt dann zum Anstieg von LH und somit
zur Ovulation (GINTHER et al. 1996). Die Selektion des dominanten Follikels wird unter
anderem über die Granulosa- und Thecazellen gesteuert. Granulosazellen binden in basalen
Konzentrationen das vorhandene FSH an die entsprechenden Rezeptoren und stimulieren so
die Aromatisierung der Androgene aus den Thecazellen zu Östrogen. Da das synthetisierte
Östrogen mitogen wirkt, ist die weitere Entwicklung des Follikels davon abhängig, ob
ausreichend Östrogen synthetisieren werden kann, was wiederum die Anzahl der
Granulosazellen und indirekt auch die der FSH-Rezeptoren vermehrt.
Die zunehmende Granulosazellzahl führt zu einer ansteigenden Östrogensynthese und
Sekretion des heranreifenden Follikels. Das sezernierte Östrogen seinerseits besitzt auf
follikulärer und hypophysärer Ebene zwei bedeutende Effekte (RODGERS et al. 1990;
MEINECKE 2000). Zum einen induziert es am Follikel das Einsprossen von Blutgefäßen in
die Theca interna, was zu einer gesteigerten Blutversorgung im Vergleich zu den übrigen
Follikeln führt. Zum anderen bewirkt Östrogen zusammen mit dem Anstieg von Inhibin eine
Reduzierung der FSH Freisetzung über die negative Rückkopplung auf der hypophysären
Ebene (MEINECKE 2000; BLEACH et al. 2001). Aufgrund der erhöhten Durchblutung
kommt es zur gesteigerten Bindung von FSH an die Rezeptoren und einer verbesserten
Entwicklung des betreffenden Follikels in der Kohorte.
18
Literatur
In der Endphase der präovulatorischen Entwicklung induziert FSH die Ausbildung von LHRezeptoren an Granulosazellen. Das freigesetzte LH wiederum bindet an die Granulosa- und
Thecazellen und aktiviert eine Reihe von Enzymsystemen, die wiederum die Luteinisierung
der Zellen und die Ovulation induzieren (BAO und GARVERICK 1998; MEINECKE 2000).
Präpuberale Tiere haben bereits eine aktive Hypothalamus-Hypophysen-Ovar-Achse zur
Regulation des Follikelwachstums. Jedoch kommt es zur negativen Rückkopplung von
Östradiol aufgrund fehlender Bindungsstellen für Östradiol an den GnRH-Neuronen bei
gleichzeitiger Synthese von LH (SHIVERS 1983; DAY et al. 1987). Erst die Reduzierung der
negativen Rückkopplung ab dem 8. Lebensmonat führt zur vermehrten LH-Sekretion mit
einem LH-Anstieg im Serum, was eine vollständige Follikelentwicklung, Östrogensekretion
und schließlich die Ovulation zur Folge hat (RAWLINGS et al. 2003).
An den Ovarien von Kälbern lassen sich bereits ab der 2. Lebenswoche erste antrale Follikel
sonographisch nachweisen (TANEJA et al. 2000; ARMSTRONG 2001; DRIANCOURT et
al. 2001; RAWLINGS et al. 2003). Gleichzeitig weisen präpuberale Kälber ein ähnliches
wellenförmiges Follikelwachstum wie adulte Kühe auf (PIERSON und GINTHER 1988;
ADAMS et al. 1994). DRIANCOURT et al. (2001) beobachteten jedoch eine geringere
Östradiolsynthese bei Kälbern, was auf eine reduzierte Aromataseaktivität zurückgeführt
wurde.
2.2.3 Entwicklungskapazität der Oozyten von Kälbern und Kühen
Die Entwicklungskompetenz der Oozyte findet ihren Abschluss in der Geburt eines
lebensfähigen Nachkommen (TROUNSON et al. 2001; SIRARD et al. 2006). Kennzeichen
der Entwicklungskompetenz sind die Fähigkeit der Oozyte die Meiose wieder aufzunehmen,
die embryonalen Zellteilungen nach erfolgter Befruchtung durchzuführen, sowie die
Entwicklung zur Blastozyste und Etablierung einer Trächtigkeit mit dem Abschluss der
Geburt eines gesunden Nachkommen (SIRARD et al. 2006). Jedoch weisen präpuberale
Oozyten eine niedrigere Teilungs- und Blastozystenrate im Vergleich zu Oozyten von adulten
Rindern (Tab.1) auf (REVEL et al. 1995; DAMIANI et al. 1996; PRESICCE et al. 1997;
ARMSTRONG 2001; KAUFFOLD et al. 2005a).
19
Literatur
Tabelle 1: Entwicklungsraten präpuberaler und adulter bovinen Oozyten
BlastoAlter der Stimu- Teilungsrate zystenSpendertiere lierung
(%)
rate
(%)
Gewinnungsart
Autor
2-3 Mo
+
37-41
9-11
Laparoskopie TANEJA et al. (2000)
2-3 Mo
-
52,4
28,6
Laparotomie KAUFFOLD et al. (2005a)
3 Mo
-
59,9
21,1
3 Mo
+
61,2
34,8
3 Mo
+
67,4
34
4-7 Mo
-
78
23
Schlachthof
CAMARGO et al. (2005)
6-7 Mo
+
42
1
OPU
OROPEZA et al. (2004)
5-8 Mo
+
58
12,2
OPU
KUWER (1997)
7-10 Mo
+
68
11,2
OPU
ZARAZA (2009)
Kühe
+
78
25
Schlachthof
OROPEZA et al. (2004)
Kühe
-
77
41
Schlachthof
CAMARGO et al. (2005)
Kühe
-
66,4
29,7
Kühe
k. A.
76,15
29,1
Kühe
-
67
38
Kühe
+
72,3
23
Ovarektomie MACLELLAN et al. (1997)
NEGLIA et al. (2003)
Schlachthof
SAGIRKARYA et al. (2007)
YANG et al. (2008)
OPU
ZARAZA (2009)
Mo = Monate; k. A. = keine Angabe
Morphologische Unterschiede im Cytoplasma zwischen Kälber- und Kuhoozyten ließen sich
mittels elektronenmikroskopischer Untersuchungen nachweisen (DAMIANI et al. 1996; DE
PAZ et al. 2001). In ungereiften Kälberoozyten wurden zwei ovale elektronendichte
Strukturen mit weniger dichten Fibrillen erkannt, welche in adulten Oozyten nicht erkennbar
waren. Nach abgeschlossener Reifung zeigten Kälberoozyten eine verzögerte Verteilung von
Mitochondrien, Lipiden und membranbindenden Vesikeln, sowie ein signifikant kleineres
Volumen des Zytoplasma.
20
Literatur
MERTON et al. (2003) untersuchten verschiedene Einflussfaktoren bei adulten Oozyten auf
ihre Teilungs- und Blastozystenrate. Dabei wurde eine höhere Blastozystenrate bei Oozyten
der morphologischen Klasse I, sowie eine signifikant höhere Teilungs- und Blastozystenrate
im Kulturmedium Menezo-B2 im Vergleich zu TCM 199 erreicht. Bei den mittels OPU
gewonnenen Oozyten zeigte sich, unter Verwendung beider Kulturmedien, kein Unterschied.
Jedoch wurde bei einem 3-tägigen Punktionsintervall eine signifikant höhere Anzahl
übertragbarer Embryonen produziert im Vergleich zum 2, 4, 5, 7-tägigen Intervall.
Desweiteren wurde ein signifikanter Rückgang der Methionin- und Cysteinaufnahme bei
präpuberalen Oozyten nach 9 Stunden, bei adulten Oozyten nach 24-stündiger IVM gemessen
(GANDOLFI et al. 1998). Als weiteren Einflussfaktor auf das Entwicklungspotential von
Oozyten wird dem Stoffwechselmetabolismus (Abb.2) bedingt durch die Kumulus-Oozyten
Kommunikation während der IVM beigemessen (SUTTON et al. 2003; THOMPSON et al.
2007).
Abbildung 2: Stoffwechselmetabolismus der Kumuluszellen und Oozyte
(HUANG und WELLS 2010)
Der Metabolismus der Oozyten wird im Wesentlichen über die Substratverfügbarkeit, dem
Transportsystem der Plasmamembran, sowie der Enzymaktivität reguliert (GARDNER et al.
2000). Während der Reifungsphase erfolgt die Energiegewinnung über den oxidativen
Stoffwechsel (LEQUARRE et al. 1997; STEEVES et al. 1999; STEEVES und GARDNER
1999). STEEVES et al. (1999) untersuchten den Glucose- und Pyruvatstoffwechsel von
Embryonen aus präpuberalen und adulten bovinen Oozyten.
21
Literatur
Sie beobachteten eine signifikant geringere Aufnahme von Glucose und Pyruvat im 1-Zell
bzw. 2-4-Zell Stadium von präpuberalen Embryonen gegenüber adulten Embryonen.
Hinsichtlich des weiteren Entwicklungsverlaufs konnten keine Unterschiede mehr
nachgewiesen werden. GANDOLFI et al. (1998) verglichen Oozytendurchmesser,
Oozytenmetabolismus und Proteinsynthese von Oozyten präpuberaler und adulter Tiere.
Oozyten präpuberaler Tiere wiesen einen signifikant niedrigeren Durchmesser von ~118 µm
gegenüber adulten Tieren ~123 µm auf und zeigten innerhalb der ersten drei Stunden der IVM
eine geringere Stoffwechselrate für Glutamin und Pyruvat. Nach 24-stündiger IVM wurden
keine Unterschiede mehr festgestellt. Folglich benötigten Oozyten für die Wiederaufnahme
der Meiose einen Durchmesser von 95-100 µm. Um die in vitro Fertilisation (IVF) und
weitere Entwicklung bis zur Morula zu erlangen, ist eine Oozytengröße von 95-104µm
erforderlich. FÜHRER et al. (1989) berichteten über eine verbesserte Maturation boviner
Oozyten mit zunehmender Größe der Follikel. LEVÈSQUE und SIRAD (1994) fanden bei
Kälberoozyten ein ähnliches Proteinmuster wie bei adulten Oozyten mit schlechter
Entwicklungskapazität.
2.3
Fertilisation
2.3.1 In vitro Fertilisation von präpuberalen und adulten Oozyten
Während der Fertilisation erfolgt die Vereinigung von väterlichem und mütterlichem
Erbmaterial durch Verschmelzung der Vorkerne beider Geschlechtszellen. Bei der in vitro
Fertilisation
erfolgt
die
Verschmelzung
außerhalb
des
weiblichen
Genitaltraktes.
Voraussetzung ist, dass ein kapazitiertes, befruchtungsfähiges Spermatozoon auf eine reife
Eizelle trifft (SCHNORR und KRESSIN 2001).
CAMARGO et al. (2005) verglichen die Teilungs- und Blastozystenrate von fertilisierten
Oozyten aus 4-7 Monaten alten Tieren mit der von adulten Kühen. Innerhalb der ersten 72 h
nach Befruchtung war zwischen beiden Untersuchungs-gruppen eine ähnliche Teilungsrate
festzustellen. In der weiteren Entwicklung ergab sich eine signifikant niedrigere Blastozystenund Schlupfrate in der Kälbergruppe. Bestätigt werden diese Ergebnisse von PATEL et al.
(2007) sowie BETTEGOWDA et al. (2008).
22
Literatur
Von ähnlichen Ergebnissen berichteten PTAK et al. (2006) nach Untersuchungen an ovinen
Oozyten. Es wurde eine signifikant höhere Blastozystenrate sowie eine erhöhte Anzahl
geborener Lämmer aus adulten Schafoozyten im Vergleich zu denen aus Lämmeroozyten
gefunden. Als möglichen Grund wurde eine mangelhafte Ausbildung des Zytoplasmas und
des Zellkerns bei präpuberalen Oozyten vermutet. Demnach stellt das Alter der Spendertiere
ein wichtiges Kriterium für die erfolgreiche Blastozystenentwicklung dar.
KAUFFOLD et al. (2005 a, b) fanden keine signifikanten Unterschiede in der
Oozytenreifungsrate und Blastozystenentwicklung bei präpuberalen Kälbern in Abhängigkeit
vom Alter der Tiere. Jedoch bestand eine Abhängigkeit von der Follikelgröße. Oozyten von
präpuberalen Kälbern, die aus Follikeln > 8mm gewonnen wurden, zeigten einen signifikant
höheren Anteil an 4-Zell Embryonen und Blastozysten an Tag 9 nach der Befruchtung. Einen
Einfluss
der
Jahreszeit
auf
die
Oozytenentwicklung
bei
Wasserbüffeln
konnten
MANJUNATHA et al. (2009) beobachten. In der Hauptzuchtsaison von Oktober bis April
war ein signifikanter Anstieg der Blastozystenrate im Vergleich zum übrigen Jahresverlauf zu
erkennen.
2.4
Einsatz von Reproduktionsbiotechnologischen Techniken
Mit Hilfe biotechnologischer Verfahren kann gezielt Einfluss auf die Fortpflanzung von
Säugern genommen werden (RATH 1992; NIEMANN 1996). Zu den klassischen
biotechnologischen Verfahren der Reproduktion zählen Gefrierkonservierung von Sperma
und Embryonen, Methoden der Steuerung des Sexualzyklus, sowie die IVF von Embryonen
(SCHNORR und KRESSIN 2001). Für die Produktion von IVF Embryonen müssen
ungereifte und/oder gereifte Oozyten mittels einer geeigneten und für den Säuger schonenden
Methode
gewonnen
werden.
Eine
einfache
und
effiziente
Technik
stellt
die
ultraschallgeleitete transvaginale Follikelpunktion (OPU) dar (OROPEZA et al. 2006).
SANTL et al. (1998) verglichen die transvaginale Ovarpunktion mit der laparoskopischen
Ovarpunktion und konnten mittels OPU-Verfahren eine signifikant höhere Anzahl an Oozyten
der morphologischen Klasse 1 mit gutem Entwicklungspotential gewinnen. Desweiteren
konnten sie eine höhere Teilungs- und Blastozystenrate bei durch OPU gewonnenen Oozyten
im Vergleich zu laparoskopisch gewonnenen Oozyten beobachten.
23
Literatur
2.4.1 OPU beim adulten Rind
Die ultraschallgeleitete transvaginale Follikelpunktion (OPU) stellt ein nicht chirurgisches
Verfahren zur Oozytengewinnung dar (PIETERSE et al. 1991). Das ursprünglich in der
Humangynäkologie eingesetzte, minimalinvasive Verfahren wurde von PIETERSE et al.
(1988) modifiziert und erstmals bei Kühen eingesetzt. Die Grundeinheit für die OPU besteht
aus einem Ultraschallgerät, einer Trägersonde für den Ultraschallkopf, einer Punktionseinheit,
inklusive Vakuumpumpe, Spülsystem, Auffangröhrchen und Warmwasserbad.
Zahlreiche Untersuchungen ergaben keine negativen Auswirkungen der OPU auf die
Entwicklung und Fertilität der Spendertiere (PIETERSE et al. 1991; CHASTANT MAILLARD et al. 2003). KRUIP et al. (1993), RICK (1996), GALLI et al. (2001) und LI et
al. (2007) fanden bei zweimaliger wöchentlicher Punktion der Tiere über einen Zeitraum von
8 Wochen keinen negativen Einfluss auf die Histologie der Ovarien und der übrigen
Gentitalorgane. Ebenso wurden Milchleistung, Blut- und somatische Milchzellen nicht
beeinflusst (CHASTANT-MAILLARD et al. 2003). Allerdings wurde von PETYIM et al.
(2007) ein signifikant erhöhter Cortisolgehalt im Blut und eine erhöhte Herzschlagfrequenz
bei einigen Tieren während der OPU Durchführung festgestellt.
Die Effizienz dieser Methode hängt jedoch stark von folgenden Faktoren ab:
Punktionsnadellänge, Lumen der Nadel, Intensität des Vakuums, Punktionstechnik und -dauer
sowie Erfahrung der durchführenden Person (PIETERSE et al. 1988; GARCIA und
SALAHEDDINE 1998; LIANG et al. 2008). Eine höhere Anzahl an Oozyten, sowie eine
signifikant
höhere
Reifungsrate
und
Anzahl
übertragbarer
Embryonen
fanden
BRÜGGERHOFF et al. (2002) nach zweimaliger Ovarpunktion im Vergleich zur einmaligen
Punktion je Woche bei adulten Tiere. GARCIA und SALAHEDDINE (1998) erhielten bei
zweimaliger Punktionsfrequenz eine signifikant höhere Anzahl an aspirierten Follikeln und
mehr Oozyten der morphologischen Klasse 1 und 2 im Vergleich zur einmal wöchentlichen
Punktion. Neben den technischen Faktoren können tierindividuelle Faktoren wie Rasse und
Ernährungszustand sowie klimatische Bedingungen (BOLAND et al. 2001; LI et al. 2007)
aber auch medikamentelle Behandlungen, Gesundheits- und Reproduktionsstatus das
Ergebnis beeinflussen (BROGLIATTI et al 1997; GALLI et al. 2000; DE ROOVER et al.
2008).
24
Literatur
2.4.2 OPU beim Kalb
Zur Gewinnung von Oozyten kann bei präpuberalen Rindern die OPU Technik eingesetzt
werden. Diese erlaubt eine frühere Nutzung wertvoller Spendertiere, verbunden mit einer
Verkürzung des Generationsintervalls und somit der Gewinnung zusätzlicher Embryonen
(FRY et al. 1998). Das OPU-Verfahren kann bei Rindern ab einem Lebensalter von
5-6 Monaten eingesetzt werden, ohne dass die allgemeine und organspezifische Entwicklung
negativ beeinflusst bzw. die Zuchteigenschaft der Tiere eingeschränkt werden (MAJERUS et
al. 1999; HENDRIKSEN et al. 2000; MERTON et al. 2003; OROPEZA et al. 2006).
Im Institut für Nutztiergenetik in Mariensee wurde eine Punktionseinheit für Kälber
schrittweise optimiert (KUWER 1997; WIEKING 2001; OROPEZA et al. 2004).
Ovarpunktionen bei Holstein-Friesian Kälbern zeigten im Alter von ~8 Monaten die höchste
Anzahl
an
gewonnenen
Kumulus-Oozyten-Komplexen
(KOK)
und
eine
höhere
Blastozystenrate im Vergleich zu jüngeren bzw. älteren Kälbern (MAJERUS et al. 1998).
Höhere Teilungs- und Blastozystenraten konnten bei 12 Monate alten Rindern im Vergleich
zu älteren Tieren (7-8 Jahre) beobachtet werden (LU et al. 2009). Um Quantität und Qualität
der KOK, insbesondere bei präpuberalen Rindern zu erhöhen, wird von verschiedenen
Untersuchungsgruppen eine vorherige Stimulation der Ovarien durch Gonadotropin
empfohlen (KUWER et al. 1997; TANEJA et al. 2000; WIEKING 2001; PRESICCE et al.
2002; TECHAKUMPHU et al. 2004).
2.5
Hormonelle Behandlung der Tiere
2.5.1 Hormoneinsatz zur Steigerung der Entwicklungskapazität von Oozyten bei
präpuberalen Kälbern
Hormone, sind inter- oder intrazellulär wirksame Botenstoffe unterschiedlicher Struktur, die
in endokrinen Drüsen gebildet und in kleinsten Mengen über den Blutstrom in verschiedene
Körperregionen transportiert werden. An den Zielzellen entfalten sie ihre Wirkung und
regulieren dadurch den Körperstoffwechsel. Sie binden an spezifische zelleigene Rezeptoren
und entfalten über die Aktivierung von Genen und die Induktion intrazellulärer
Signalmoleküle ihre Wirkung.
25
Literatur
Die
Hormone
des
Hypothalamus
wirken
entweder
stimulierend
auf
den
Hypophysenvorderlappen (HVL) oder hemmen die Ausscheidung von Hypophysenhormonen. LONERGAN et al. (1994) untersuchten den Einfluss der Häufigkeit einer FSH
Stimulierung auf die Follikelgröße adulter Rinder. Dabei beobachteten sie eine signifikante
Zunahme der Follikelgröße auf 6-10 mm bzw. einen signifikanten Rückgang der Anzahl von
Follikeln mit einem Durchmesser 2-6 mm nach 6-maliger Stimulierung im Vergleich zur 4maligen
Stimulierung
bzw.
zur
Kontrollgruppe
ohne
Stimulierung.
Die
höchste
Blastozystenrate wurde jedoch in der Kontrollgruppe ohne Stimulierung gefunden.
Zur Steigerung der Oozytenzahl bei Kälbern wurden diese auch einer hormonellen
Behandlung unterzogen. Sie wurden mittels intramuskulärer (i.m.) Applikation von FSH, LH
und Gonadotropin und/oder durch eine intraovarielle (i.o) Applikation von FSH oder IGF-1
hormonell stimuliert (FRY et al. 1998; WIEKING 2001; OROPEZA 2004; ZARAZA 2009).
Die Superovulationsbehandlung mit FSH, Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) und
Gonadotropin-Releasing Hormon (GnRH) von präpuberaler Kälber zeigte eine Zunahme der
Follikelzahl, jedoch keine Unterschiede in der Gesamtmenge an gewonnenen Oozyten.
Signifikante Unterschiede ließen sich nur in der Anzahl der Follikel mit 5-9 mm Durchmesser
und der entwicklungskompetenten Oozyten zwischen unbehandelten und behandelten Tieren
feststellen (FRY et al. 1998). TANEJA et al. (2000) induzierten bei Kälbern durch i.m Gabe
von Gonadotropin eine größere Anzahl an Follikeln im Vergleich zu nicht stimulierten
Kälbern. Nach der i.m. Applikation von hCG (humanes Chorion Gonadotropin) und FSH
erhielt KUWER (1997) nach der OPU eine signifikant größere Anzahl entwicklungsfähiger
Oozyten bei 5 – 8 Monate alten Kälbern im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren. Die
Gabe von eCG (Equines Chorion Gonadotropin), hCG und FSH in Kombination mit LH 12 h
vor der OPU führte zu einer signifikant höheren Anzahl von Oozyten der morphologischen
Klasse I und II und einer höheren Anzahl Oozyten in der M II Phase bei präpuberalen
Kälbern, sowohl in vivo als auch in vitro (PRESICCE et al. 2002).
HENDRIKSEN et al. (2000) untersuchten den Einfluss von eCG in Kombination mit dem
Zeitpunkt der Gewinnung auf die weitere Entwicklung adulter Oozyten. Oozyten, die 60 h
nach der eCG Gabe aus >8 mm großen Follikeln gewonnen wurden, wiesen eine signifikant
höhere Blastozystenrate auf, als jene aus 5–8 mm großen Follikeln.
26
Literatur
Oozyten, die 104 h nach der eCG Behandlung gewonnen wurden, zeigten eine nochmals
gesteigerte Entwicklungskapazität. Der Einfluss eines GnRH Agonisten mit und ohne
anschließende FSH Stimulation bei präpuberalen Kälbern hinsichtlich der Anzahl der
Oozyten und ihrer Entwicklungsrate wurde von MACLELLAN et al. (1998) untersucht.
Dabei wies die Gruppe der FSH behandelten Kälbern eine signifikant höhere Anzahl an
Oozyten gegenüber allen Untersuchungsgruppen auf. Hinsichtlich der Blastozystenrate
konnten keine Unterschiede festgestellt werden.
WIEKING (2001) konnte mittels i.o. FSH-Injektion sowohl Oozytenanzahl, als auch den
Anteil an Oozyten der morphologischen Klasse I-III je Tier und Punktion gegenüber nicht
stimulierten Kälbern signifikant steigern. PRESICCE et al. (1997) untersuchten den Einfluss
der hormonellen Stimulierung auf die Entwicklungsfähigkeit der Oozyten bei präpuberalen
Kälbern unterschiedlichen Alters (5, 7 und 9 Monate) sowie bei Färsen. Beim Vergleich der
Blastozystenrate zeigte sich in der Gruppe der 7 und 9 Monate alten stimulierten Kälbern eine
signifikant höhere Anzahl an Blastozysten im Vergleich zur nicht stimulierten Altersgruppe.
In der Gruppe der 5 Monate alten Kälber konnten keine Blastozysten produziert werden. In
den beiden Vergleichsgruppen der Färsen konnte kein signifikanter Unterschied in der
Blastozystenrate nachgewiesen werden (Tab.2).
Tabelle 2:
Einfluss der hormonellen Stimulierung auf die Entwicklungsfähigkeit der
Oozyten und Blastozystenrate bei präpuberalen Kälbern und Färsen
(PRESICCE et al. 1997)
Alter
(Monate)
Behandlung: 250 IU eCG
+ 24 mg pFSH
5
11
+
+
+
+
Kontrolle Adult
-
5
7
7
9
9
11
+ mit Stimulierung; - ohne Stimulierung; a,b p<0,05
27
2-16
Zeller
(%)
28
Blastozystenrate (%)
0
24
0
30b
1b
49a
17a
82
11b
88
31a
80
24
88
23
75
28
Literatur
BROGLIATTI und ADAMS (1996) fanden nach Stimulation von 6 bzw. 16 Wochen alten
Kälbern eine signifikante Steigerung der Follikel- und Oozytenzahl. Über einen signifikanten
Einfluss der hormonellen Stimulierung präpuberaler und adulter Schafe auf die Anzahl der in
vitro kultivierten Oozyten und die Produktion von Blastozysten berichten PTAK et al. (1999).
Dabei konnte für die Lämmergruppen eine signifikant höhere Anzahl an Oozyten kultiviert
werden als im Vergleich zu adulten Schafen. Die höchste Blastozystenrate wurde in beiden
FSH-behandelten Untersuchungsgruppen gefunden (Tab. 3).
Tabelle 3: Einfluss der hormonellen Stimulierung auf die Blastozystenrate bei
präpuberalen und adulten Schafen (PTAK et al. 1999)
Spendertier
Behandlung
Kultivierte Oozyten
Blastozystenrate
Lamm
FSH
214a
49a
Lamm
FSH+LH
178a
9b
Lamm
FSH+LH+GnRH
174a
23c
Schaf
FSH
123b
44d
Signifikante Differenz p≤ 0,001 (a vs. b, b vs. c, c vs. d, b vs. d); p≤ 0,05 (a vs. c, a vs. d)
DOMINKO und FIRST (1997) untersuchten die Effekte von LH und FSH im
Maturationsmedium auf adulte Rinderoozyten. Nach der Zugabe von LH fand sich eine
höhere Anzahl von Oozyten mit Polkörpern nach 16 h im Vergleich zu FSH gereiften
Oozyten. Desweiteren zeigte sich eine signifikant höhere Anzahl an Blastozysten aus 2-ZellEmbryonen im LH angereicherten Medium im Vergleich zum FSH angereicherten Medium.
Eine signifikante Steigerung der Blastozystenrate von präpuberalen Oozyten erreichten
PALMA et al. (2001) nach Zugabe von 20 µg/ml FSH + 2 µg/ml Östradiol 17β (E-17β) im
Reifungsmedium gegenüber 10 µg/ml pFSH + 4 µg/ml E-17β. Nach Zugabe von EGF zum
Maturationsmedium für Kälberoozyten beobachteten KATHIR et al. (1996) eine verbesserte
Kumulusexpansion, sowie eine signifikant höhere Teilungsrate 72 h nach Befruchtung und
eine höhere Blastozystenrate an den Tagen 6 bzw. 8. Eine Vorreifung präpuberaler
Kälberoozyten mit dem Meiose-Inhibitor Roscovitine, auch in Kombination mit
Butyrolactone-I, hatte im Gegensatz zur Vorreifung adulter Rinderoozyten einen negativen
Einfluss auf den Reifungsverlauf.
28
Literatur
Die Zugabe von Follicular Fluid-Meiosis Activating Sterol (FF-MAS) im Reifungsmedium
führte zu einer signifikant verbesserten Kernreifung der Kälberoozyten, hatte aber keinen
Einfluss auf die weitere Entwicklungsfähigkeit der Oozyten. Eine Verbesserung der
zytoplasmatischen Entwicklung, sowie eine signifikante Steigerung der Blastozystenrate von
präpuberalen Rinderoozyten konnte nach Zugabe einer Vorstufe von Glutathion bzw.
Antioxidantien und Stimulatoren in Form von Hormonen, Wachstums-faktoren und
Energiesubstraten zum Reifungsmedium erreicht werden (DONNAY et al. 2004).
2.5.2 Somatotropin und
Wachstumsfaktoren
IGF
(Insulin-like
Growth
Factors)
Insulin-ähnliche
Um die Entwicklungskapazität und Anzahl boviner Oozyten insbesondere bei präpuberalen
Tieren zu verbessern, wurden in der Vergangenheit Behandlungen mit verschiedenen
Wachstumsfaktoren, wie dem rekombinanten bovinen Somatotropin (rbST) und IGF-1
(Insulin-like Growth Factors) durchgeführt (GONG et al. 1997; YANG et al. 1998;
OROPEZA et al. 2006; ZARAZA 2009). Das in der Hypophyse gebildete Somatotropin wirkt
nur eingeschränkt auf das Wachstum der Zellen in den Reproduktionsorganen. Stattdessen
bewirkt es indirekt die Bildung von IGF, welches größtenteils in der Leber synthetisiert wird
(Abb. 3) und aus den Liganden IGF-1 und IGF-2 besteht. Nach der Sekretion aus der Leber
ins Blut erfolgt der Transport an einem der 6 IGF-Bindungsproteine zum jeweiligen Rezeptor
1 bzw. 2. (JONES und CLEMMONS 1995; IZADYAR et al. 1997; VELAZQUEZ et al.
2005). IGF-1 besitzt eine Halbwertszeit von ~8 h, was durch das im Blut vorkommende
IGFBP bedingt ist (MEINECKE 2000).
Abbildung 3: Somatotropin-induzierte IGF-1 Synthese in der Leber und
Wirkmechanismen beider Wachstumshormone im Ovar (LUCY 2000)
29
Literatur
2.5.3 IGF-1 Regulation bei präpuberalen Rindern
Die IGF-1 Konzentration im Blut wird bei Kühen mit einer Heritabilität von 0.23 bis 0.52
vererbt (GROCHOWSKA et al. 2001, DAVIS und SIMMEN 2006). Einige Autoren
beschreiben einen Anstieg der IGF-1 Konzentration im Verlauf der präpuberalen Entwicklung
bis zum Beginn der Pubertät (YELICH et al. 1996; GARCIA et al. 2002). GARCIA et al.
(2002) beobachteten, dass die IGF-1 Konzentration 9 Wochen vor Beginn der Pubertät
gegenüber jüngeren Tieren deutlich ansteigt. Die IGF-1 Konzentration bei präpuberalen
Rindern wird unter anderem durch das Futtermanagement und die Lebendmasse der Tiere
beeinflusst (YAMBAYAMBA et al. 1996; LAMMERS et al. 1999; AMSTALDEN et al.
2000; TAYLOR et al. 2004). Präpuberale Rinder zeigten bei ad libitum Fütterung eine früher
einsetzende Pubertät, sowie eine höhere IGF-1 Blutkonzentration (YAMBAYAMBA et al.
1996; MACDONALD et al. 2005) als nach restriktiver Fütterung (YELICH et al. 1996).
Einen rassespezifischen Effekt bezüglich der IGF-1 Konzentration beobachteten JONES et al.
(1991). Präpuberale Angusrinder zeigten einen signifikanten höheren Anstieg der IGF-1
Konzentration bis zur Pubertät sowie den höchsten Mittelwert im Vergleich zu anderen
Rassen wie Charolais, Simmentaler. Eine Immunisierung gegenüber dem Growth Hormon
Releasing Factor (GHRF) bei präpuberalen Rindern führte zu einer Reduzierung der IGF-1
Konzentration im Blut und verzögerte das Einsetzen der Pubertät (SIMPSON et al. 1991;
ARMSTRONG et al. 1992; SCHOPPEE et al. 1996). Als mögliche Ursache dafür wird eine
Reduzierung der Synthese von Östradiol-17β vermutet, bedingt durch eine verzögerte LHAbgabe (SCHOPPEE et al. 1996).
2.5.4
Einfluss von IGF-1 und IGF-1 Rezeptoren auf die Follikel- und Oozytenentwicklung
Am Ovar bindet IGF-1 an seinen entsprechenden Rezeptor und beeinflusst die Proliferation
und Mitogenese unterschiedlicher Zelltypen. Es besitzt für das Follikelwachstum, sowie für
die Oozyten- und Embryonalentwicklung beim Rind eine bedeutende Rolle. Desweiteren
wurde eine Korrelation zwischen der Anzahl gewonnener Blastozysten und der IGF-1
Konzentration im Plasma von Kühen beobachtet (VELAZQUEZ et al. 2005; VELAZQUEZ
et al. 2009).
30
Literatur
IGF-1 mRNA wurde bei Ratten in verschiedenen Geweben und im Oviduct von Büffeln und
Rindern nachgewiesen (MURPHY et al. 1987a; DALIRI et al. 1998; YASEEN et al. 2001).
Eine mRNA Expression von IGF-1 konnte von YOSHIDA et al. (1998) bereits in ungereiften
Oozyten gefunden werden, was auf eine frühe Funktion bereits während des
Follikelwachstums hinweist (YASEEN et al. 2001). Mit Zunahme des Follikeldurchmessers
lässt sich ein Anstieg der IGF-1 Konzentration im Follikel, die mit der IGF-1
Plasmakonzentration korreliert, ausmachen (SPICER und ECHTENKAMP 1995). Das im
antralen Follikel gefundene IGF-1 stammt größtenteils aus der peripheren Zirkulation (SUDO
et al. 2007). Durch die hormonelle rbST Behandlung von Rindern konnten GONG et al.
(1997) einen Anstieg der intrafollikulären IGF-1 Konzentration induzieren. Bei Brahman
Rindern wurde aufgrund eines entsprechenden Rezeptormangels ein Rückgang der
Follikelgröße um das 2 – 4-fache, sowie ein Rückgang des IGF-1 Spiegels im Blutplasma um
das 7 – 8-fache beobachtet (CHASE et al. 1998).
Der Effekt von IGF-1 auf das ovarielle Follikelwachstum ist von verschiedenen Faktoren wie
Follikelphase, Zellzyklus und Behandlungsdosis abhängig. Eine kontinuierliche i.o. Gabe von
150 ng/ml/h rhIGF-1 über einen Zeitraum von 7 Tagen mittels einer osmotischen Minipumpe,
führte zu einem Anstieg von IGF-1 und Östradiol in der Follikelflüssigkeit kleiner Follikel (25 mm). Auch wurde eine Größenzunahme bei Follikeln > 10 mm festgestellt, jedoch ohne
Einfluss auf die IGF-1 Konzentration (SPICER et al. 2000). OROPEZA (2004) beobachtete
nach der i.o. Injektion von 6 µg IGF-1 und der i.m. Injektion von FSH bei 6-7 Monate alten
Tieren eine signifikant höhere Anzahl an Blastozysten im Vergleich zur Kontrollgruppe.
Dieses Ergebnis konnte von ZARAZA (2009) bei Oozyten von 7-10 Monate alten Rindern
nicht erzielt werden. Auch beim Vergleich von 6-7 Monate alten Kälbern mit adulten Rindern
konnte OROPEZA (2004) eine ähnliche hohe Blastozystenrate nachweisen. Der Einsatz von
bST bei Färsen über zwei Östruszyklen führte zum Konzentrationsanstieg von IGF-1 im
Serum, sowie einer Verdopplung der Anzahl von Follikeln < 5 mm, ohne die LH bzw. FSH
Serumkonzentrationen und Anzahl mittlerer und großer Follikel zu beeinflussen (GONG et al.
1991). Verschiedene Untersuchungen zeigten, dass die Behandlung des KOK mit IGF-1 im
Reifungsmedium zu einer verbesserten Reifungsrate führt.
31
Literatur
WALTERS et al. (2006) beobachtete eine signifikante Größenzunahme kleiner antraler
Follikel (165-215 µm) an Tag 6 der Entwicklung nach der Zugabe von 1000 ng/ml
rekombinantem humanem IGF-1 (rhIGF-1) zum Maturationsmedium.
Für mittlere (216-280 µm) und große (281-380 µm) antralen Follikel wurden keine
Veränderungen nachgewiesen. In Kombination mit EGF oder Angiotensin II (Ang II)
steigerte IGF-1 die Kumulusexpansion und Zellkernreifung, den oxidativen Metabolismus
und die Teilungsrate nach IVF (HERRLER et al. 1992, LORENZO et al. 1994; RIEGER et al.
1998; SAKAGUCHI et al. 2002; STEFANELLO et al. 2006). Die Zugabe von 100ng/ml IGF1, 50 ng/ml FSH und 5ng/ml LH in ein serumfreies Kultursystem stimulierte die Proliferation
von Granulosazellen aus Follikeln < 5 mm Durchmesser (GONG et al. 1993). Eine
Behandlung mit 20 ng/ml rekombinanten humanen IGF-1 und 1 ng/ml rh Long R3 IGF
reduzierte die Affinität zum bovinen IGFBP (FRANCIS et al. 1992), förderte jedoch die
Antrumentwicklung und Zunahme des Oozytendurchmessers in präantralen Follikeln
(GUTIERREZ et al. 2000; ITOH et al. 2002). Verschiedene Gruppen konnten nach Zugabe
von IGF-1 in unterschiedlicher Konzentration (1 bis 100 ng/ml) zum Kulturmedium in vitro
eine Verbesserung der Blastozystenrate beobachten (MOREIRA et al. 2002; SIRISATHIEN
et al. 2003; LIMA et al. 2006).
Die Zugabe von bST zum Maturationsmedium führte zu einer signifikant höheren Anzahl an
gereiften Oozyten sowie zu höheren Teilungs- bzw. Blastozystenraten an den Tagen 4 bzw. 9
im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (IZADYAR et al. 1996). Eine signifikante
Steigerung der Blastozystenrate wurde von STEFANELLO et al. (2006) nach Zugabe von
Ang II und IGF-1 im Maturations-medium gefunden. Die Expression des Rezeptors für bST
konnte in Oozyten, Granulosa- und Kumuluszellen nachgewiesen werden, während die
Expression für die bST-Liganden nur in ungereiften und gereiften Oozyten sowie in
Granulosazellen festzustellen war (BEVERS und IZADYAR 2002).
Neben verschiedenen zell- und entwicklungsfördernden Eigenschaften, scheint IGF-1 auch
Hitzeschock schützende Eigenschaft zu besitzen. Höhere Trächtigkeits- und Kalberaten,
sowie eine geringere Abortrate während einer Hitzeperiode führte BLOCK (2007) auf das
Vorhandensein von IGF-1 im Kulturmedium zurück.
32
Literatur
ZHANDI et al. (2009), beobachteten in ihren Untersuchungen, das es in vitro im IGF-1
angereicherten Maturationsmedium bei einer Temperatur von 38,5°C zu einer signifikant
höhere Reifungs- und Blastozystenrate gegenüber einer Temperatur von 41°C kommt.
Des Weiteren wurde im IGF-1 angereicherten Medium bei 38,5°C eine höhere Reifungsrate
gegenüber dem mit Essigsäure angereichertem Medium gefunden. Wogegen das mit
Essigsäure angereicherte Medium im weiteren Versuchsablauf eine höhere Teilungs- und
Blastozystenrate zeigte.
Eine Vielzahl von Untersuchungen beobachtete den Einfluss des Fütterungsmanagements auf
die IGF-1 Konzentration im Blut, die Ovarfunktion sowie das Follikelwachstum (GONG et al.
2002; ADAMIK et al. 2005; FRERET et al. 2006). BAKER et al. (1996) untersuchten die
Wirkung von hCG bei IGF-1-/- und Wildtypmäusen. Durch Injektion von PMSG und hCG in
IGF-1-/- Mäuse konnte keine Ovulation induziert werden, während von Wildtypmäusen 33
Oozyten je Tier gewonnen werden konnten. Nach 10-facher Erhöhung der hCG Dosis
konnten bei IGF-1-/- Mäusen nur wenige Oozyten gewonnen werden, die jedoch
Abnormalitäten in der Morphologie aufwiesen und für die weitere Entwicklung ungeeignet
waren. In der weiterführenden Untersuchung wurden die Oozytendurchmesser aus
verschiedenen Follikelstadien gemessen. Dabei zeigten Oozyten aus Primordialfollikel bei
Wildtypmäusen einen signifikant größeren Oozytendurchmesser im Vergleich zu IGF-1-/Mäusen. In den weiteren Follikelstadien konnten keine signifikanten Differenzen nachgewiesen werden. Bei Stuten führte die i.o. Injektion von rh-IGF-1 nach 3 – 12 h zu einem
Anstieg der Östradiol und Androstendionkonzentration und zu einer Zunahme der
Follikelgröße im Vergleich zur Kontrollgruppe (SPICER et al. 2000; GINTHER et al. 2004).
2.6
Molekulare Genetik
2.6.1 DNA Transkription und Translation
Bei Eukaryoten erfolgt die Transkription im Zellkern (Karyoplasma) (LEHNINGER et al.
1998). Während der Transkription wird die Nucleotid-Folge in einem Gen abgelesen und in
die Form der Einzelstrang-RNA-Nucleotide vervielfältigt, das heißt ein spezifischer DNAAbschnitt dient als Vorlage zur Synthese eines neuen RNA-Strangs (KNIPPERS 2006). Dabei
wird die Desoxyribose durch die Ribose und die Base Thymin durch die Base Uracil ersetzt.
33
Literatur
Die Nukleinbasen der DNA (A; T; G; C) werden in die Nukleinbasen der RNA (A; U; G; C)
umgeschrieben (STRYER 1985). Die nachfolgende Translation führt zur Bildung spezifischer
Proteine mit ihren biologischen Wirkungen. Die Regulation erfolgt bei Eukaryoten meist über
einen Promotor bzw. Enhancer, der jeweils dem Promotor vorgeschaltet bzw. nachgeschaltet
ist (Abb.4).
Abbildung 4: Aufbau eukaryotischer Gene mit Transkriptionseinheit
(DOERFLER 1984)
Die unterschiedlichen RNAs werden nach ihrer Synthese noch prozessiert, bevor sie aus dem
Zellkern in das Cytoplasma transportiert werden. Anschließend erfolgt im Cytoplasma am
Ribosom die Translation der Messenger-RNA (mRNA) in ein Protein (LÖFFLER und
MONTENARH 2003a).
Die für die Transkription verantwortlichen Enzyme sind DNA-abhängige RNA-Polymerasen
(I, II, III). Diese werden an eine als Promotor bezeichnende DNA-Region angelagert. Für den
Transkriptionsstart benötigen Eukaryoten einen Initiationskomplex, der an den Promotor
bindet. Der Initiationskomplex setzt sich aus einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren (TF
(A, B, D, E, F, K)) zusammen, die für die Synthese der komplementären RNA von Bedeutung
sind. Die Synthese der RNA erfolgt vom 3´ zum 5` Ende (LEHNINGER et al. 1998;
LÖFFLER und MONTENARH 2003a; KORNBERG 2007). Bei der Bildung des Komplexes
wird die DNA-Vorlage an das katalytische Zentrum der RNA-Polymerase herangeführt. Dies
erleichtert die Bildung der ersten Phosphodiester-Bindung, womit die Transkription beginnt.
Anschließend trennt sich die TFIIB-Untereinheit vom Präinitiationskomplex.
34
Literatur
Zu diesem Zeitpunkt kann die geöffnete Konfiguration in die geschlossene übergehen, wenn
beispielsweise die ATP-Versorgung des TFIIH ausbleibt oder inhibierende Faktoren
vorhanden sind (KNIPPERS 2006). Sie werden auch als „Upstream Regulatory Factors“
bezeichnet (LÖFFLER und MONTENARH 2003a).
Die nach dem genetischen Code eines Abschnitts der DNA gebildete mRNA enthält
Informationen zum Aufbau eines Proteins. Diese Information wird nun im Verlauf der
Translation genutzt, um das entsprechende Polypeptid zu synthetisieren. Es kodieren jeweils
drei aufeinander folgende Nukleotide der mRNA.
Diese Basentripletts werden auch als Codons bezeichnet und definieren den Anfang, die
einzelnen Aminosäuren und das Ende der Polypeptidkette. Ausgehend von der
Konsenssequenz und dem darin enthaltenen Startcodon AUG (Adenin, Uracil, Guanin) wird
aus hintereinander kodierten Aminosäuren das Protein aufgebaut. Für die Übersetzung
werden Adaptermoleküle benötigt, wofür u.a. sogenannte Aminosäuren-„Transporter“, d.h.
die Transfer-RNA (tRNA) dienen (LEHNINGER 1998; HASILIK 2003). Der Transporter
kann mit seinem Ende, dem Anticodon, am passenden Codon der mRNA andocken und ist am
gegenüberliegenden Ende durch die Aminoacyl-tRNA Synthetasen mit der passenden
Aminosäure beladen. Das Ribosom bringt die mRNA und die Aminosäure tragende tRNA so
zusammen, dass sich an ein bestimmtes Codon der mRNA ein komplementäres Anti-Codon
der tRNA anlagert. Es entsteht eine Codon-Anticodon-Wechselwirkung. (HASILIK 2003;
KNIPPERS 2006).
Eine weitere Aminosäure tragende tRNA setzt sich neben der ersten tRNA an die mRNA. Die
an den tRNAs hängenden Aminosäuren werden mit einer Esterbindung verknüpft und die
erste tRNA verlässt ohne Aminosäure das Ribosom. Die auf das nächste Codon passende
tRNA lagert sich nun an die mRNA an. Dieser Prozess setzt sich fort, so dass sich eine immer
länger werdende Kette aus Aminosäuren bildet. Das Ribosom, das diesen Prozess katalysiert,
wandert dabei immer um ein Codon auf der mRNA weiter, bis die Information der mRNA
vollständig abgearbeitet ist bzw. bis es auf ein Stop-Codon trifft und keine der vorhandenen
tRNA-Molekülarten mehr binden kann. Sobald eines der drei Stop-Codons (z.B.UGA)
gegenüber der A-Stelle positioniert wird, kommt es zur Freisetzung des Polypeptid und damit
zum Ablösen der mRNA.
35
Literatur
Die neu gebildete Polypeptidkette löst sich vom Ribosom und faltet sich dann meistens so,
dass eine komplexe räumliche Struktur entsteht. Eine mRNA wird in der Regel mehrfach
abgelesen, bis sie durch Nucleaseaktivität in ihre Bausteine, die Ribonucleotide, zerlegt wird.
Bei Eukaryoten ist die Haltbarkeit durch posttranskriptionelle Modifikationen im Kern erhöht
(LEHNINGER 1998; HASILIK 2003; KNIPPERS 2006).
2.6.2 Transkription in Oozyten
Die Entwicklung von der Oogonie bis zur präovulatorischen Oozyte beinhaltet auch eine
konstante Zunahme der transkriptionalen Aktivität, was zu einer Anhäufung von mRNA und
Proteinen führt, die für Fertilisation und Embryogenese zur Verfügung stehen (BREVINI et
al. 2007). Viele Transkriptionseinheiten entfalten ihre Wirkung nicht über Proteine, sondern
über ihre RNA. In bovinen Oozyten wird bereits in der frühen sekundären Follikelphase von
einer transkriptionalen Aktivität berichtet, wenn sowohl heterogene nukleäre RNA (hnRNA)
als auch ribosomale RNA (rRNA) synthetisiert vorliegen (FAIR et al. 1997).
Diese Entwicklung zeigt sich bis zu einer Oozytengröße von 110 µm, einschließlich der
Follikel von 2-3 mm Durchmesser. Auch zeigte sich eine lokale Begrenzung der Transkripte
auf bestimmte Regionen in der Zelle. Dies ist für die Genexpression hinsichtlich ihrer
Gesamtheit, des zeitlichen Ablaufs sowie der lokalen Translation von großer Bedeutung.
LODDE et al. (2008) untersuchten die transkriptionale Aktivität in ungereiften bovinen
Oozyten aus den frühen und mittleren antralen Follikeln mit unterschiedlicher
Zellkernstruktur (GV-0, -1,-2,-3). Eine hohe RNA Aktivität wurde im GV-0 Stadium
beobachtet, während in den Stadien GV-2 und GV-3 die Transkription reduziert war.
2.6.3 Transkriptionsfaktoren in Oozyten
Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die die Genexpression durch Bindung an spezifische
DNA-Sequenzen kontrollieren und die Gentranskription via Auf- und Abregulation der RNA
Polymerase kontrollieren. Des Weiteren enthalten Transkriptionsfaktoren eine oder mehrere
Bindungsstellen, die benachbarte spezifische DNA-Sequenzen miteinander verbinden.
36
Literatur
Nach Anheftung an die DNA führt ein zweiter Aktivitätsbereich des Transkriptionsfaktors zur
Stabilisierung oder Hemmung der Bindung der RNA-Polymerase an die DNA. Der Vergleich
von kleinen und großen Follikeln zeigt eine Assoziation von Follikelgröße und Expression der
TATA-und CAAT Bindungsproteine (SHARMA et al. 2009). Transkriptionsfaktoren spielen
hinsichtlich der ovariellen Entwicklung, der Follikulogenese, sowie der Kontrolle der
Oozytenentwicklung als auch der somatischen Zellfunktion eine wichtige Rolle.
Oozytenspezifische Transkriptionsfaktoren haben Einfluss auf die reproduktive Lebensdauer,
den Fertilisationserfolg, die frühe Embryonalentwicklung und Bildung von ovarialen
Tumoren. Zwei oozytenspezifische Transkriptionsfaktoren, Figla (Faktor in der Keimbahn)
und Nobox (newborn ovary homebox gene) haben eine wichtige Funktion während der frühen
Follikulogenese (LIANG et al. 1997; RAJKOVIC et al. 2004). Figla ist ein grundlegender
Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktor, der ausschließlich in Keimzellen exprimiert wird und
die Transkriptionsgene der Zona pellucida reguliert (LIANG et al. 1997). Mäuse mit einem
Figla Knockout zeigten eine normale Keimbahnentwicklung, jedoch wurden p.p. keine
Primordialfollikel ausgebildet. Des Weiteren wurde eine reduzierte Ovarfunktion mit
deutlicher Depletion der Oozyten, verbunden mit einer Sterilität der Tiere festgestellt
(SOYAL et al. 2000).
Für die Nobox Transkripte konnte eine hohe Expression in den Ovarien von neugeborenen
Tiere beobachtet werden (RAJKOVIC et al. 2001; SUZUMORI et al. 2001), welche
wiederum Einfluss auf die Follikulogenese und die regulatorische Expression von GDF9 und
Oct4 hatte (CHOI und RAJKOVIC 2006). RAJKOVIC et al. (2004) beobachteten nach einem
Knockout
der
Nobox-Expression
bei
Mäusen
eine
eingeschränkte
Primordialfollikelentwicklung, was im weiteren Verlauf selten zu einer Oozytengröße von
mehr als 20 µm Durchmesser führte. Außerdem zeigte sich ein rapider Verlust an Oozyten,
bzw. waren nach der Geburt nur noch wenige degenerierte Oozyten vorhanden.
37
Literatur
2.6.4 RNA Interferenz
Die RNA Interferenz (RNAi), ist ein von FIRE und MELLO (1998) entdeckter Mechanismus,
der an doppelsträngigen RNAs mittels small RNAs (sRNA) die Expression von Zielgenen
kontrolliert bzw. herunter reguliert. Dieser Prozess induziert die Resistenz von Zellen
gegenüber
exogenen
Nukleinsäuren
und
reguliert
die
Expression
von
eigenen
proteinkodierten Genen (LELE 2009; SIROTKIN 2010).
Während der Trennung der langen doppelsträngigen RNA in kurze Fragmente von ~20 Bp
(via Dicer, Argonaute 2 und TRBP), kommt es zum Einbau des RNA-induzierten Silencing
Complex (RISC). Dieser dient der Erkennung der Ziel mRNA (MATRANGA et al. 2005).
Mehrere Formen von sRNA Molekülen, u.a. Mikro-RNA (miRNA), sind für die RNA
Interferenz verantwortlich (FARAZI et al. 2008). Allerdings ist wenig über die Identität und
Funktionalität von miRNA während der frühen Säugerentwicklung bekannt ist (TANG et al.
2010). Mi-RNAs zählen zur Familie der kurzen nicht kodierenden RNAs (17-25 Nukleotide)
(HE und HANNON 2004). MiRNAs hemmen die Expression von Zielgenen durch
Sequenzkomplementation, was zur Inhibierung der Translation führt (BARTEL 2004;
BAGGA et al. 2005). Ein wichtiger Bestandteil der RNAi kommt dem Dicer aufgrund seiner
Funktion in der Gensteuerung und Genomorganisation zugute.
Der Dicer gehört zur Gruppe der Ribonukleasen und weist eine wesentliche Bedeutung für die
Funktion der sRNAs in der Biogenese auf. Ein Fehlen des Dicers hat somit erhebliche Folgen
für die wachsende Oozyte. So konnte z.B. eine ungenügende Spindelorganisation während der
Meiose sowie das Fehlen der Chromosomenkondensation beobachtet werden, was zur
Infertilität der Tiere führte (MURCHISON et al. 2007; TANG et al. 2007).
2.7
Expression entwicklungsrelevanter Gene in präpuberalen und adulten bovinen
Oozyten
Die für die frühembryonale Entwicklung benötigten mRNA Moleküle und Proteine werden
während der Wachstumsphase von Oozyten im Zytoplasma akkumuliert. Die Synthese der
mRNA und rRNA beginnt im sekundären Follikelstadium und wird bis zum Tertiärfollikel
aufrechterhalten, um die meiotische Reifung der Oozyte zu gewährleisten (FAIR et al. 1995;
HYTTEL et al. 1997).
38
Literatur
Dies macht Oozyten zu einer sehr spezifischen Zelle im Vergleich zur somatischen Zelle, in
der RNA und Proteine einem schnellen Turnover unterliegen (FAIR et al. 1997). Die
verfügbaren Daten zeigen, dass spezifische Sequenzen für die Regulation der mRNAStabilität sowie für die Kontrolle der Translationsaktivierung und –hemmung verantwortlich
sind. Diese Sequenzen sind am 3´ Ende der mRNA-Moleküle (3’UTR) lokalisiert (AOKI et
al. 1997; GANDOLFI und GANDOLFI 2001; HUANG und RICHTER 2004). Eine
quantitativ und qualitativ korrekte maternale RNA Synthese ist sowohl für das normale
Oozytenwachstum als auch für die Embryonalentwicklung wesentlich. Eine fehler-hafte
RNA-Synthese bzw. Akkumulation spiegelt sich in einer frühen Degeneration von Oozyten
und Embryonen wider und wirkt somit negativ auf die Fortpflanzung (OLSZAŃSKA und
BORGUL 1993). Die RNA lässt sich in verschiedene Strukturen mit unterschiedlichen
Funktionen einteilen. Die proteinkodierenden Gene machen etwa 5% der genomischen DNA
aus. Etwa 80% der zytoplasmatischen RNA befinden sich in den ribosomalen (rRNA). Die
von der RNA Polymerase II synthetisierte Messenger RNA (mRNA) wird aus dem Nukleus
in das Zytoplasma exportiert und stellt eine chemische Zwischenform der genetischen
Information auf dem Weg zum Protein dar (LÖFFLER 2003b; GELDERMANN 2005).
Zwischen Synthese und Nutzung von RNA und Proteinmolekülen können in Oozyten
mehrere Wochen liegen (GANDOLFI und GANDOLFI 2001). Diese werden durch Enzyme,
welche in der 5´ Region lokalisiert sind, geschützt (SHATKIN und MANLEY 2000) und
interagieren mit dem 3´ Ende der Adenosinreste (PROUDFOOT 2000). Die Halbwertszeit der
individuellen mRNA scheint von spezifischen Exonukleasen abhängig zu sein (BREVINI et
al. 2007).
Es konnte gezeigt werden, dass die Regulation der maternalen RNA auf einer Verlängerung
des Poly(A)-Schwanzes basiert. So wurde bei inaktiver Translation in Oozyten ein verkürzter
Poly(A)-Schwanz der mRNA beobachtet (AOKI et al. 1997). BREVINI et al. (2007) sahen
eine mögliche Beziehung zwischen der Polyadenylation, mRNA Stabilität und Entwicklungskompetenz während der Oozytenreifung. Offenbar ist eine gewisse Mindestlänge des Poly
(A)-Schwanzes am 3`Ende für eine reguläre Meiose und frühembryonale Entwicklung
notwendig. Nach der IVF konnte eine signifikante Abnahme der Poly (A) mRNA Transkripte
gefunden werden (BAISE et al. 2008).
39
Literatur
BREVINI et al. (2002) vermuteten einen Zusammenhang zwischen Entwicklungskapazität
und Grad der Polyadenylierung für SLC1A. Die frühembryonale Entwicklung wird vor der
embryonalen Genomaktivierung durch die mütterlichen mRNAs und Proteine gesteuert
(TELFORD et al. 1990; FAIR et al. 1995; FAIR et al. 2007). Dabei ließen sich deutliche
Unterschiede in der mRNA Transkriptmenge von spezifischen Genen der wachsenden Oozyte
feststellen (ASSOU et al. 2006; CUI et al. 2007). Ferner wurde ein kürzerer Poly (A)Schwanz an mRNA Transkripten von Oozyten mit schlechter Entwicklungskompetenz
gefunden (BREVINI-GANDOLFI et al. 1999; BAISE et al. 2008). Die höchsten mRNA
Transkriptionsraten ließen sich während der Metaphase I und II ausmachen (ASSOU et al.
2006).
LEQUARRE et al. (2004) untersuchten u.a. die Veränderung der RNA-Menge in bovinen
Oozyten vor und nach der in vitro Reifung, konnten jedoch keine Unterschiede feststellen.
Die Messung der Poly (A) mRNA-Menge in präpuberalen Kälberoozyten wies eine
signifikante Abnahme während der Reifung im Vergleich zu adulten Oozyten auf. Translation
und Speicherung von maternaler mRNA finden während des follikulären Wachstums statt und
enden im GVBD-Stadium (BREVINI-GANDOLFI et al. 1999; BREVINI-GANDOLFI und
GANDOLFI 2001). Der Embryo ist in seiner weiteren Entwicklung von der maternal
gespeicherten mRNA und den Proteinen der Oozyten bis zum maternal-zygotischen Wechsel
von der genomischen Aktivität abhängig. Mit dem einsetzen der embryonalen Transkription
erlischt diese Abhängigkeit (TELFORD et al. 1990; MEMELI et al. 1998; MEMILI und
FIRST 2000; BREVINI-GANDOLFI und GANDOLFI 2001; GOSDEN 2002).
Ein erheblicher Verlust maternal vorhandener mRNA und eine Zunahme der mRNA
Deadenylation wurde während der Oozytenreifung und der frühen Teilungsphase beobachtet
(BREVINI-GANDOLFI und GANDOLFI 2001). Es wird davon ausgegangen, dass die
Polyadenylation mit der translatorischen Aktivität verbunden ist, während die Deadenylation
ein herunterregulieren der Translation kennzeichnet (PICCIONI et al. 2005).
Als wichtigen Anhaltspunkt für die Intensität der mRNA Transkription sehen DONNISON
und PFEFFER (2004) die Follikelgröße. Oozyten aus Follikeln von < 3 mm Durchmesser
besitzen nicht das volle RNA Komplement, das für die spätere Oozyten- und Embryonalentwicklung von Bedeutung ist.
40
Literatur
Auch fand sich im wachsenden Follikel ein verändertes Expressionsmuster der mRNA für
FSH- und LH-Rezeptoren (BAO und GARVERICK 1998). LEONI et al. (2007) untersuchten
die relative Menge von mRNA in Relation zur Entwicklungsfähigkeit von adulten und
präpuberalen Schafoozyten. Für die geringere Entwicklungskompetenz der präpuberalen
Oozyten wird ein Defizit an mRNA während des Oozytenwachstums als ursächlich
angesehen.
2.7.1 Entwicklungsrelevante Gene
Zur Identifizierung von Kandidatengenen für die Entwicklungskompetenz von Oozyten und
Embryonen wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt (WRENZYCKI et al. 2007).
Eine umfassende Genanalyse zeigte, dass es während der Oozytenentwicklung bei einer
Vielzahl von Genen zu einer Abnahme der Transkripte kommt. Die geringsten Mengen
fanden sich in der M II-Phase (ASSOU et al. 2006).
Der Nachweis der Genexpression ist essentiell für das Verständnis zellulärer Grundlagen und
molekularer Mechanismen in der Kontrolle der embryonalen Genexpression (NIEMANN und
WRENZYCKI 2000). Die Genexpressionsmuster werden von genetischen und epigenetischen
Mechanismen beeinflusst. Mögliche frühembryonale Verluste werden oft auf eine schlechte
Oozytenqualität und die prädominante Rolle der mütterlichen Faktoren zurückgeführt,
zumindest bis zur vollständigen Aktivierung des eigenen embryonalen Genoms (ROMAR et
al. 2010).
Im Gegensatz zu den meisten anderen Geweben, in denen eine ständige Neusynthese von
mRNA erfolgt, findet in der Oozyte die Transkription nur während der Wachstumsphase statt.
Die nachfolgende Regulation erfolgt auf der posttranskriptionalen Ebene (THÈLIE et al.
2007). Für die eigenen Untersuchungen wurden die Gene GDF9, SLC2A1, ZAR1 und PRDX1
ausgewählt, die eine Aussage zur Entwicklungsfähigkeit von Oozyten und Embryonen
erlauben.
41
Literatur
2.7.1.1
Growth differentiation factor-9 (GDF9)
Oozyten beeinflussen die Follikelentwicklung und Differenzierung der Follikelzellen durch
das parakrin wirkende Peptid Growth differentiation factor-9 (GDF9). GDF9 gehört zur
Familie der TGF-β Wachstumsfaktoren, wird von Oozyten während der Follikulogenese
kontinuierlich exprimiert und ist für die Differenzierung und Proliferation verschiedener
Zellen von Bedeutung (ELVIN et al. 2000; VITT et al. 2002). Die Regulation der GDF9
Expression erfolgt speziesspezifisch, und zeigt einen positiven Einfluss auf die
Kumulusexpansion während der präovulatorischen Periode (YAN et al. 2001).
Die früheste GDF9 Expression in bovinen Oozyten konnte in Primordialfollikeln ermittelt
werden, was mit den Ergebnissen von murinen und ovinen Oozyten vergleichbar ist
(BODENSTEINER et al. 1999; SENDAI et al. 2001). Des Weiteren zeigt sich ein signifikant
höherer Transkriptgehalt von GDF9 in ungereiften bovinen Oozyten im Vergleich zu in vivo
und in vitro gereiften Oozyten. Beim Vergleich von in vitro und in vivo Maturation fand sich
eine signifikant größere Menge an GDF9 Genprodukten in in vitro gereiften Oozyten.
(LONERGAN et al. 2003). Einen reduzierten Transkriptgehalt von GDF9 in präpuberalen
und adulten bovinen Oozyten konnte PONEBŠEK (2005) nach der Reifung beobachten,
wobei sich eine signifikant geringere GDF9 Expression in gereiften präpuberal Oozyten im
Vergleich zu adulten Oozyten darstellte. PENNETIER et al. (2004) wiesen eine GDF9
Expression vom Stadium der ungereiften bovinen Oozyte bis zum 5-8 Zeller nach.
LI et al. (2008) untersuchten die mRNA Expression von GDF9 in ungereiften und gereiften
porcinen Oozyten und beobachteten eine höhere Expression in ungereiften Oozyten und eine
langsame Abnahme der Expression während der Reifung. Keinen Einfluss auf die GDF9
mRNA Expression hatten Follikelgröße und Zeitpunkt der Teilung (MOUROT et al. 2006).
Die höchste mRNA Expression wurde in Oozyten aus 3-5 mm großen Follikeln von
präpuberalen Schweinen beobachtet (LEE et al. 2008).
MONTI und REDI (2009) untersuchten u.a. den Einfluss von Hormonen auf die relative
Transkriptmenge von GDF9 in murinen Oozyten. Dabei ließ sich nur in der mit PMSG
stimulierten Gruppe antraler Oozyten eine signifikant höhere Transkriptionsmenge im
Vergleich zur PMSG und hCG stimulierten Gruppe feststellen.
42
Literatur
Antrale Oozyten besaßen ohne Stimulierung in der Östrusphase eine signifikant geringere
Transkriptionsmenge im Vergleich zur PMSG und hCG stimulierten Gruppe. Eine Abnahme
der Expression von GDF9 konnte in gereiften Oozyten nachgewiesen werden, wobei sich
keine Unterschiede zwischen Oozyten in der Östrusphase und PMSG/ hCG stimulierten
Tieren ergaben (MONTI und REDI 2009).
FITZPATRICK et al. (1998) konnten mittels Northern Blot und RT-PCR GDF9 mRNA im
Ovar, Hoden und Hypothalamus von Mäusen und Ratten nachweisen. Homozygote GDF9-/Mäuse sind aufgrund der fehlenden Follikulogenese steril. Ein gezieltes Ausschalten der
GDF9-Expression führte bei Mäusen zur Atresie der primären Follikel und dem Verlust der
Oozyten (DONG et al. 1996).
2.7.1.2
Solute carrier family 2 (SLC2A1)
Ein wichtiger Nährstoff für Oozyten und Embryonen stellt u.a. Glucose dar. Diese kann
jedoch in der Oozyte bis zum 2-4 Zellstadium aufgrund der geringen Hexokinaseaktivität
nicht genutzt werden (BRINSTER 1965). Mit dem Übergang in das 8-Zellstadium gewinnt
die Glucoseaufnahme signifikant an Bedeutung für die weitere Embryonalentwicklung
(MORITA et al 1992). Der Transport von Glucose in die Oozyte erfolgt über den Glucose
Transporter1 (GLUT1), welcher von SLC2A1 kodiert wird. Die ausreichende Glucoseaufnahme für die Embryogenese ab dem 8-Zellstadium ist daher von SLC2A1 und dessen
Expression von GLUT1 abhängig (MORITA et al. 1992; AUGUSTIN et al. 2001). SLC2A1mRNA-Transkripte konnten in ungereiften und gereiften bovinen und ovinen Oozyten
nachgewiesen werden (AGHAYAN et al. 1992; LEQUARRE et al. 1997; PANTALEON et
al. 2001; RAJHANS et al. 2010). Jedoch nimmt die mRNA-Konzentration für SLC2A1 im
Verlauf der Oozytenreifung ab. Keine Unterschiede in der Transkriptionsmenge konnten
zwischen in vivo und in vitro gereiften Oozyten nachgewiesen werden (LONERGAN et al.
2003). Eine Zunahme der Genexpression von der ungereiften bovinen Oozyte bis zur
Blastozyste konnten WRENZYCKI et al. (1999) nachweisen. Zu demselben Ergebnis kamen
MORITA et al. (1992) bei murinen und DAN-GOOR et al. (1997) bei humanen Oozyten.
43
Literatur
Einen Einfluss der Follikelgröße auf die Genexpression konnten CROZET et al. (1986) und
FAIR et al. (1995) nachweisen. So zeigten Oozyten aus Follikeln < 1-2 mm eine höhere
SLC2A1 mRNA Synthese im Vergleich zu 2–8 mm großen Follikeln. ZHOU et al. (2000)
untersuchten die SLC2A1-Genexpression in Oozyten von präpuberalen IGF-1-/- Knockoutund Wildtypmäusen. Dabei war die SLC2A1-Expression in IGF-1-/- Mäusen signifikant
niedriger im Vergleich zu Wildtyptieren.
Die Behandlung von IGF-1-/- Mäusen mit IGF-1 führte zu einem signifikanten Anstieg der
SLC2A1 Expression gegenüber der nichtbehandelten Gruppe. Im Weiteren wurde nach einer
Östrogenbehandlung ein signifikanter Anstieg der Transkriptmenge in Oozyten von
Wildtypmäusen gegenüber IGF-1-/- Mäusen beobachtet. Als ein weiterer externer
Einflussfaktor auf die SLC2A1 Expression kann die O2-Sättigung während der Maturation von
bovinen Oozyten in betracht gezogen werden. Demnach kommt es zu einem Anstieg der
Transkriptmenge bei einer 5%igen Sauerstoff-versorgung im Vergleich zur 20% O2-Sättigung
(BERMEJO-ALVAREZ et al. 2010).
2.7.1.3
Peroxiredoxin 1 (PRDX1)
PRDX ist eine Familie von 22-27 kDa großen Peroxidasen. Gegenwärtig sind 6 Isoformen
beim Säuger bekannt. Diese sind u. a. an der Antioxidanzabwehr, der intrazellulären
Kommunikation, Zellproliferation, Differenzierung, Immunantwort und Kontrolle der
Apoptosis beteiligt (RHEE et al. 2001; MOUROT et al. 2006; NEUMANN et al. 2009). Der
Verlust an PRDX1 führt zu einem Anstieg von schädlichen Sauerstoffradikalen, verbunden
mit einer Schädigung der DNA. Desweiteren interagiert PRDX1 mit einem transkriptional
regulierenden Bereich der DNA, der für die Transformation wesentlich ist. Dies führt
wiederum zu einer Hemmung oder Steigerung der c-Myc Funktion, was zu einer veränderten
Genexpression führen kann (LI et al. 1994; MU et al. 2002).
LEYENS et al. (2004) wiesen für ungereifte und in in vitro gereifte bovine Oozyten, sowie
für alle bovinen Zellteilungsstadien die PRDX1 Expression nach. Die geringste
Expressionsrate wurde in 9-16-Zellern gefunden. Nach unterschiedlichen Maturationsverfahren der Oozyten wurde eine signifikante Abnahme der Genexpression von in in vivo
gereiften im Vergleich zu in vitro gereiften Oozyten nachgewiesen (THÉLIE et al. 2007).
44
Literatur
In Abhängigkeit von der Follikelgröße fanden MOUROT et al. (2006) eine signifikant höhere
Expression in Oozyten aus Follikel > 8 mm. Dies konnte von ROMAR et al. (2010) nicht
bestätigt werden. Sie fanden stattdessen eine signifikant höhere Expression in gereiften
adulten Oozyten im Vergleich zu präpuberalen Oozyten.
2.7.1.4
Zygotic arrest 1 (ZAR1)
Das ZAR1-Gen ist ein oozytenspezifischer maternaler Faktor, welcher eine wichtige Rolle in
der Fertilität, insbesondere während der Oozytenentwicklung und der ersten Phase nach der
Fertilisation einnimmt (WU et al. 2003a,b; ELIS et al. 2008). Die mRNA Expression von
ZAR1 wurde bei Mäusen ausschließlich in Oozyten und im 1-Zell Stadium nachgewiesen. Mit
Beginn des 2-Zell Stadiums wurde ein Rückgang der Expression beobachtet. Neben der
Expression in Oozyten und Embryonen, konnte die ZAR1-mRNA in Hodengewebe,
Muskulatur und Myokard nachgewiesen werden (BREVINI et al. 2004). ZAR1-Transkripte
lassen sich beim Rind in Oozyten der Primordialfollikel bis zum 5-8-Zeller nachweisen
(PENNETIER et al. 2004).
Einen signifikanten Rückgang der mRNA-Expression konnten NOWAK-IMIALEK (2005)
und UZBEKOVA et al. (2006) während der bovinen Oozytenreifung und nach IVF
feststellen, was auf ein maternales Expressionsmuster deutet. Im bovinen 1- bzw. 2Zellstadium wurden Transkriptions- und Translationsaktivitäten gefunden, die offenbar für
die weitere Embryonalentwicklung von Bedeutung sind (MEMILI und FIRST 2000).
Weibliche ZAR1-/--Mäuse waren fertil und wiesen keine Abnormalitäten in der
Follikelentwicklung,
Ovulation
und
Fertilisation
auf.
Jedoch
gelangte
die
Embryonalentwicklung nicht über das 2-Zell-Stadium hinaus (WU et al. 2003b).
BEBBERE et al. (2008) untersuchten die Expression von ZAR1 in ungereiften und gereiften
ovinen Oozyten sowie in ovinen IVF-Embryonen. Dabei nahm die relative RNA-Menge im
Verlauf der Oozytenentwicklung bis zur Blastozyste ab. Dies könnte als Hinweis auf die
besondere Bedeutung der ZAR1-Expression in der Reifungsphase angesehen werden. Beim
Geflügel wurde die ZAR1-Expression ausschließlich in der Keimscheibe gefunden (ELIS et
al. 2008).………………………………………………………………………………………...
45
Literatur
2.8
Epigenetik
2.8.1 Epigenetische Genregulation
Der Begriff „Epigenetik“ wird für die Beschreibung dauerhafter Veränderungen in der
Genexpression verwendet, die sich während der Entwicklung und Zellproliferation ergeben.
Alle Entwicklungsprozesse in Organismen gehen immer mit einer spezifischen, zeitlichen und
örtlichen Genexpression einher. Dabei wird die Genaktivität über eine Vielzahl von
epigenetischen Prozessen, wie DNA-Methylierung, Imprinting, X-Chromosom-Inaktivierung, Regulation der Telomerlänge sowie Histonmodifikationen reguliert (JAENISCH und
BIRD 2003; SHI et al. 2003; JIRTLE und SKINNER 2007).
Bei einzelnen Differenzierungs- und Entwicklungsvorgängen müssen die „Zugriffsrechte“ auf
genetische Informationen jedoch geändert werden. Dies bedeutet, dass durch Demethylierung
Gene wieder lesbar gemacht und durch Methylierung die nicht mehr benötigten Gene
abgeschaltet werden. Diese Informationsebene oberhalb der eigentlichen Gene bezeichnet
man als „Epigenetik“ (HAAF 2006).
Epigenetische Prozesse sind für Entwicklung und Differenzierung wesentlich und konnten bei
Menschen und Säugetieren nachgewiesen werden (JAENISCH und BIRD 2003).
Veränderungen der Genexpression können in Abhängigkeit von endogenen und exogenen
Faktoren auftreten. So nehmen Alter, Ernährung und Umweltreize im erheblichen Maße
Einfluss auf epigenetische Mechanismen und die daraus resultierende Genaktivität
(SCHNEIDER 2001). Bei Wirbeltieren tritt die DNA-Methylierung im Genom fast
ausschließlich im Kontext von Cytosin-phosphatidyl-Guanosin (CpG) Dinukleotiden auf
(BIRD 2002; GOLL und BESTOR 2005).
Der wohl wichtigste funktionelle Aspekt epigenetischer Modifikationen von CpGDinukleotiden liegt in der Steuerung von Expressionsbereichen (CROSS und BIRD 1995).
Zwar ist jede Zelle mit demselben Genom ausgestattet, aber in einem bestimmten Zelltyp ist
zu einem bestimmten Zeitpunkt der Entwicklung nur eine spezifische Gruppe von Genen
aktiv. Die Anzahl der Gene, die in einer Zelle an- bzw. abgeschaltet sind, wird wesentlich
durch die Methylierung der DNA und Modifikationen des Chromatins gesteuert (WOLFFE
und MATZKE 1999; JAENISCH und BIRD 2003).
46
Literatur
Auch wird angenommen, dass eine funktionelle Selektion, die auf dem Genexpressionsmuster
basiert, einen Schutzmechanismus darstellt, da auf diese Weise genetische Eindringlinge wie
Viren
oder
mobile
DNA-Elemente
abgeschaltet
werden
können
(STRICHMAN-
ALMASHANU et al. 2002).
2.8.2 DNA-Methylierung
DNA-Methylierungsmuster sind vererbbare Veränderungen des Genoms, die ihre Grundlage
in reversiblen Modifikationen der Erbinformation haben, aber keine strukturellen
Veränderungen der Basenabfolge in der DNA-Sequenz darstellen (HAAF 2006). Die DNAMethylierung wird hauptsächlich mit Änderungen der Chromatinstruktur, Inhibierung der
Promotoraktivität und Abschalten der Genexpression assoziiert (BIRD und WOLFFE 1999).
Sie lässt sich sowohl im Genom von Eukaryoten, wie auch in Prokaryoten nachweisen. In
Prokaryoten ist die DNA-Methylierung sowohl am Cytosin, als auch an der Adenosinbase
aufzufinden (WILSON und MURRAY 1991). Bei Eukaryoten ist die Methylierung auf die
CpGs begrenzt und stellt eine erbliche, gewebe- und speziesspezifische Modifikation der
Säuger-DNA dar (REIK et al. 2001; JONES und BAYLIN 2002; SANTOS und DEAN 2004).
Eine Methylierung wird nicht in allen Eukaryoten beobachtet. Beispiele dafür sind
Nematoden oder Saccharomyces cerevisiae (WANG et al. 2006). Die DNA-Methylierung
wird in erster Linie als Schutzmechanismus des Genoms angesehen. Sie ist aber auch
entscheidend für die Säugerentwicklung, wie die Letalität von Mäusen mit einem Knockout
für die verschiedenen DNA-Methyltransferasen (DNMT) zeigt (LI et al. 1992; OKANO et al.
1999).
Im Genom finden sich zwei typische Verteilungsmuster für die DNA-Methylierung wieder.
Zum einen liegen die CpG-Dinukleotide, die in 70-80 % der Fälle methyliert sind, verstreut
vor (EHRLICH et al. 1982; ALLSHIRE 2002), darunter vor allem im Bereich der SatellitenDNA und der repetitiven Elemente. So ist die Methylierung der repetitiven Sequenzen
wichtig
für
die
genomische
Stabilität,
vermutlich
weil
sie
zur
korrekten
Chromosomensegregation beiträgt und eine irreguläre Verteilung der Schwester-Chromatiden
verhindert (BOURC'HIS und BESTOR 2004).
47
Literatur
Im zweiten Fall findet man die Methylierung an den CpG-Inseln mit 0,3-3 kB Länge in den
Promotorregionen vieler Gene organisiert. Dort liegen die CpGs üblicherweise unmethyliert
vor. Kommt es zur Methylierung wird die Genexpression beeinflusst (Abb. 5).
Abbildung 5: Genaktivität 1
Weiterhin ist die Methylierung für das Silencing maternaler Elemente von Bedeutung (LI et
al. 1992; JONES und BAYLIN 2002; LAIRD 2005; KLOSE und BIRD 2006). Eine aberrante
Hypermethylierung der Promotor-assoziierten CpGs, die die Transkription herunterregulieren
und damit Störungen der Genfunktion hervorrufen, werden mit verschiedenen Krankheiten in
Zusammenhang gebracht (JIANG et al. 2007).
Zur Identifizierung von CGIs (CpG Islands) in der Genomsequenz werden verschiedene
Algorithmen genutzt. Der ursprüngliche Algorithmus wurde von GARDINER-GARDEN und
FROMMER (1987) erstellt und basiert auf den Sequenzparametern der Sequenzlänge > 200
Bp, CG-Anteil > 50 % und dem Verhältnis von beobachteten zu erwarteten CpGs
(ObsCpG/ExpCpG) > 0,60. TAKAI und JONES (2002) evaluierten den Originalalgorithmus
mittels humaner Gendaten und optimierten die einzelnen Parameter, wodurch falsch-positive
CGI Ergebnisse von Repeats ausgeschlossen werden konnten. HACKENBERG et al. (2006)
entwickelten einen neuen Algorithmus, welcher auf der physikalischen Entfernung zwischen
zwei CpGs auf dem Chromosom basiert.
1
Quelle: www.epigenomics.de/.../DNA-Methylierung [Abrufdatum 23.09.2010]
48
Literatur
Dieser Algorithmus erlaubt eine Vorhersage über die CpGs in einem abgegrenzten Abschnitt.
Unabhängig von der Sequenzmindestlänge konnte so eine höhere Anzahl an CGIs als bei den
übrigen Algorithmen identifiziert werden.
Für die normale Säugerentwicklung ist eine korrekte DNA-Methylierung erforderlich (LI und
JAENISCH 1993). Besonders intensiv erforscht sind die DNA-Methylierung und Histonmodifikation (JIRTLE und SKINNER 2007). Fehler oder unvollständige epigenetische
Umprogrammierungen in Keimzellen bzw. in Embryonen können zu weitreichenden Entwicklungsproblemen bzw. einer erhöhten Sterblichkeit führen. Einige epigenetische
Störungen werden während der Entwicklung toleriert, können aber mit einer Phänotypenänderung verbunden sein. Ein wichtiges Merkmal, das die epigenetischen Änderungen
von genetischen Änderungen oder Mutationen unterscheidet, ist ihre Reversibilität. Eine
grundlegende Funktion von Keimzellen ist die Änderung vorhandener epigenetischer
Modifikationen. Nach der Fertilisation kommt es zu Veränderungen in der Chromatinstruktur
und der DNA- Methylierung, die für die Entwicklung des Embryos von Bedeutung sind. Eine
nicht vollständige Löschung kann eine transgenerationale epigenetische Vererbung (z. B.
Prader-Willi Syndrom) zur Folge haben (JOHN und SURANI 1999).
Nach Befruchtung der Eizelle kommt es im weiteren Entwicklungsverlauf zur
Reprogrammierung des paternalen und maternalen Genoms. Ein nützlicher Marker für die
epigenetische Modifikation ist das allelspezifische Muster der DNA-Methylierung. Einige der
allelspezifischen Methylierungsmuster werden bereits während der Oogenese etabliert
(CHAILLET et al. 1991; BRANDEIS et al. 1993). Während der frühen embryonalen
Entwicklung gibt es eine Welle von De- und Remethylierung. Sie beginnt mit einer
Demethylierung während der Zellteilung, gefolgt von einer De novo Methylierung über das
gesamte Genom nach der Implantation (YANG et al. 2007). Die Demethylierung des
maternalen Genoms stellt einen verzögerten und passiven Vorgang dar, der möglicherweise
aus dem Fehlen der Methylierung während der frühen embryonalen Zellteilung resultiert
(PARK und PFEIFER 2003); siehe Abbildung 6 auf der folgenden Seite. Die Methylierung
steigt während der Oozytenentwicklung an, bis sie zum Zeitpunkt der M II Phase und
Fertilisation ein gewisses Plateau erreicht. Im Anschluss daran erfolgt eine zeitlich versetzte
Demethylierung des elterlichen Genoms (YANG et al. 2007).
49
Literatur
Abbildung 6: Methylierungsmuster während der Oozyten- und Embryonalentwicklung bei a) Maus und b) Rind (YANG et al. 2007)
Die DNA-Methylierung erfolgt durch die Addition einer Methylgruppe vom s-AdenosylMethionin an die C5 Position des Cytosins, gefolgt von einem Guanin und bildet die in
Abbildung 7 dargestellte 5-Methylcytosinstruktur (m5C).
Abbildung 7: DNA-Methylierung von Cytosin
Die Modifikationen zum m5C werden mit Hilfe von zwei wichtigen Klassen der DNMTs
katalysiert (HERMANN et al. 2003). DNMT1 ist spezifisch für die hemimethylierten (nur an
einem Strang methylierten) CpG-Dinukleotide und somit verantwortlich für die Methylierung
des neuen Tochterstranges nach der DNA-Replikation.
50
Literatur
Ein Verlust von DNMT1 führt zu einer Unterbrechung der monoallelischen Expression von
einigen dem Imprinting unterliegenden Genen (LI et al. 1993). Die Enzyme DNMT3a und
DNMT3b werden für die De novo-Methylierung und den Aufbau des neuen DNAMethylierungsmusters während der Zellentwicklung benötigt (BESTOR 2000; CHEN und LI
2004). Ein weiteres Enzym ist die DNMT 1o. Diese Oozyten-spezifische Isoform ist für die
Aufrechterhaltung, jedoch nicht für die Etablierung des maternalen Imprinting verantwortlich
(BESTOR 2000; HOWELL 2001). Eine hohe Expression von DNMT 1o in Oozyten konnte
in der GV-Phase beobachtet werden, während in der MII-Phase die Expression signifikant
erniedrigt war (OLIVERI et al. 2007). Für DNMT3a und 3b wurde keine Veränderung der
Expression während der Oozytenentwicklung festgestellt. MISIRLIOGLU et al. (2006)
fanden eine 4 bzw. 8 fach höhere Transkription von DNMT 1 bzw. 2 in bovinen MII Oozyten
im Vergleich zu 8-Zell-Embryonen. Störungen des Methylierungsmusters können
unterschiedlich starke Folgen auf den Phänotyp haben bzw. letal wirken (LI et al. 1992;
BESTOR 2000). Fehler in der Methylierung können nicht nur durch genetische Mutationen,
sondern auch durch epigenetische Änderungen an den Zielgenen auftreten (DE RYCKE et al.
2002). LUCIFERO et al. (2004) stellten in murinen Oozyten mit zunehmendem Alter einen
Anstieg der Expression von DNMT 3a und 3b, sowie für die geprägten Gene fest. Des
Weiteren fand sich eine höhere Expression der DNMT 3L in Oozyten mit einer Größe von
60-80µm Durchmesser im Vergleich zu Oozyten mit einem Durchmesser von 20-50µm.
Beim Menschen können Fehler in der Etablierung oder in der Aufrechterhaltung der
Keimzellmethylierung zu verschiedenen Krankheiten führen. Erkrankungen wie das
Beckwith-Wiedemann-Syndrom (BWS), Angelman-Syndrom (AS), Retinoblastom (RB),
Rett-Syndrom und verschiedene Arten von malignen Tumoren werden damit in
Zusammenhang gebracht (DEAN et al. 2005; ROBERTSON 2005).
Eine Vielzahl von Säugerchromosomen weist eine α-Satelliten Sequenz (auch bekannt als
Satellite I) auf, die in der Nähe oder im Centromer lokalisiert ist und für die Centromeraktivität eine Rolle spielt (LEE et al. 1997; TYLER-SMITH et al. 1998). KANG et al. (2001)
bestimmten
den
Methylierungsstatus
von
unterschiedlichen
Satellitensequenzen
in
unterschiedlich produzierten Blastozysten (IVF bzw. Kerntransfer (NT) sowie in gereiften
bovinen Oozyten. Nach der IVF wurde eine Hypomethylierung (10%), nach NT eine
Hypermethylierung (63%) in den Blastozysten beobachtet.
51
Literatur
In Oozyten der MII Phase wurde eine moderate Methylierung der Satellitensequenz von 35%
im Vergleich zu einer Hypomethylierung im 4-8 Zellstadium, bzw. bei Morulae aus IVF und
NT festgestellt. Beim Vergleich von adulten und neonatalen Oozyten wurde eine graduelle
Methylierung beobachtet (SATO et al. 2007). BAO et al. (2000) sahen eine erfolgreiche
Embryoproduktion von adulten Mäuseoozyten bereits bei einem Durchmesser von 50-59 µm,
bei juvenilen Oozyten jedoch erst bei einen Durchmesser von mindestens 60–69 µm. Eine
mögliche Erklärung sahen sie in der früheren epigenetischen Änderung des maternalen
Chromatins während der Entwicklung adulter Oozyten. Als Schwelle für die vollständige
epigenetische Modifikation mit nachfolgender normaler Embryonalentwicklung kann ein
Alter von 16 Lebenstagen angesehen werden.
Eine signifikant geringere DNA-Methylierung bei präpuberalen im Vergleich zu adulten
Schafoozyten bei gleichem Oozytendurchmesser wurde von PTAK et al. (2006)
nachgewiesen. SATO et al. (2007) beobachteten in humanen und murinen Oozyten eine
Reduzierung der PEG1-Methylierung und führten dies auf eine längere Superovulation der
Spender zurück. Die Beziehung zwischen epigenetischen Prozessen und Umweltfaktoren ist
bei Säugetieren bisher noch wenig erforscht. Einen signifikanten Einfluss auf die DNAMethylierung von Schafoozyten konnten SINCLAIR et al. (2007) nach einer spezifischen
Vitamin B Fütterung feststellen. In 88% von 57 untersuchten CpGs wurde eine
Hypomethylierung im Vergleich zur Kontrollgruppe gefunden. Ähnliche Beobachtungen
wurden von WATERLAND und JIRTLE (2003) an Mäusen gemacht.
2.8.3 Imprinting
Genomisches Imprinting (Prägung) bezeichnet das Phänomen, das die Expression spezifischer
entwicklungsrelevanter Gene davon abhängt, von welchem Elternteil das Allel stammt. Das
genomische Imprinting ist ein epigenetischer Zustand, bei dem es aufgrund einer
gametenspezifischen Methylierung bestimmter Chromosomenbereiche zur Aktivierung oder
Stilllegung eines Allels kommt (BARLOW 1997; KANEDA et al. 2004). Somit stellt das
Imprinting einen wichtigen Mechanismus dar, der die Expression von Genen kontrolliert, so
dass entweder das mütterliche oder das väterliche Allel exprimiert wird (SOLTER 1998).
52
Literatur
Bevor die primordialen Keimzellen in die Urgonaden einwandern und die männliche bzw.
weibliche fetale Keimzelldifferenzierung beginnt, wird das elterliche Methylierungsmuster in
der genomischen DNA-Sequenz gelöscht. Dies ist wahrscheinlich der einzige Zeitpunkt in der
Entwicklung, zu dem beide Allele eines geprägten Gens vollkommen äquivalent sind (HAIG
und GRAHAM 1991). Verfahren wie die in vitro Reifung von Oozyten und in vitro
Produktion von Embryonen, können zu einer veränderten Methylierung und somit zu einer
veränderten Expression von geprägten Genen führen (YOUNG et al. 2001).
Imprinting beruht auf einer zusätzlichen epigenetischen Prägung, zum einen durch die DNAMethylierung am Cytosin als auch durch Modifikation der Histone H3 und H4. Dabei zeigt
sich eines der beiden Allele heterochromatinisiert und transkriptionell inaktiv, das andere in
einer euchromatischen, transkriptionell aktiven Konfiguration (WALTER und PAULSEN
2005). Des Weiteren konnten Faktoren bestimmt werden, deren elternspezifische
Methylierung die Expression und Repression von geprägten Genen reguliert (LOPES et al.
2003). Dem Imprinting unterliegende Gene sind nicht zufällig im Genom verteilt, sondern
zeigen eine Clusterbildung und somit CpG-reiche DNA-Sequenzen (sogenannte CpGIslands). Dies deutet darauf hin, dass die Kontrolle des Imprints nicht primär auf Genebene
stattfindet, sondern durch ein Imprinting Center erfolgt, welches Chromatinstruktur, DNAMethylierung und Genaktivität reguliert (BUITING et al. 1995).
Die Beeinflussung der Methylierung von geprägten Genen lässt sich am Verlust von
methylierten Sequenzen erkennen. Ein Knockout der DNMT1o in Oozyten führt zur
embryonalen Mortalität (REIK und DEAN 2001). Eine Veränderung während der Präimplantationsphase kann zu einer verfrühten Deregulierung von Imprinting-Genen,
biallelischen Expression oder zum Abschalten der Genexpression führen. Auch konnte in
Primordialzellen von Mäusen ab Tag 11,5 der Entwicklung eine fehlerhafte Reprogrammierung der Imprints beobachtet werden (DE RYCKE et al. 2002).
Der
gesamte
Vorgang
der
epigenetischen
Reprogrammierungen
wird
durch
die
Demethylierung von Imprinting Loci deutlich und findet zwischen Tag 10,5 und 12,5 statt
(LEE et al. 2002; HAJKOVA et al. 2002a). Das primäre Imprinting während der
Gametogenese reguliert die monoallelische Expression und Repression von Imprinting Genen
in der Embryogenese.
53
Literatur
OBATA
und
KONO
(2002)
untersuchten
in
Mäuseoozyten
unterschiedlicher
Entwicklungsstadien und Größe u.a. die Expression der maternal geprägten Gene Igf2r und
p57KIP2. Diese werden in der frühen Wachstumsphase der Oozyte bzw. in Oozyten mit einem
Durchmesser von 45-55 µm exprimiert. Eine Störung dieser Prägung führte zu einem
veränderten Expressionsmuster dieser Gene während der späteren Embryogenese (OBATA et
al. 1998). Mäuseexperimente haben auch gezeigt, dass die hormonelle Stimulation zur
Eizellgewinnung zum Verlust der Methylierung bei einigen dem Imprinting unterliegenden
Genen führen kann (ALEXANDRIDIS et al. 2005).
Eine Änderung im Methylierungsmuster fanden MARKET-VELLER et al. (2010) in
Mäuseblastozysten nach der Verabreichung hoher Hormondosen zur Superovulation. Daraus
folgerten sie, dass es zu fehlerhaften Imprints während der Oozytenentwicklung kommt und
im weiteren Verlauf zu einer fehlerhaften Präimplantations-entwicklung aufgrund nicht
vorhandener Imprints. Auch wurde eine fehlerhafte Methylierung von H19 sowohl im
maternalen, als auch im paternalen Genom beobachtet.
2.8.4 Histonmethylierung
KAGEYAMA et al. (2007) untersuchten mögliche epigenetische Veränderungen im Genom
von Oozyten von 5 bis 15 Tage alten Mäusen. Dabei ließ sich eine deutliche Zunahme der
Histonmethylierung im Verlauf des Oozytenwachstums feststellen. Auch konnte eine höhere
Chromatindichte im Bereich des Zellkerns und ein damit verbundenes Abschalten von Genen
beobachtet werden. Oozyten mit geringer Chromatindichte hingegen wiesen eine aktive
Genexpression auf. Daher wird vermutet, dass die Histonmodifikation, welche mit der
Veränderung der Chromatinkonfiguration eng verbunden ist, eine wichtige Rolle für die
meiotische Kompetenz in wachsenden Oozyten besitzt.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen von DNA-Molekülen zeigen, dass die chromosomale
DNA perlartige Verdickungen, sogenannte Nucleosomen, aufweist. Diese sind Grundbestandteil der DNA-Organisation aller Eukaryoten. Nucleosome bestehen im Kern aus den
basischen Proteinen, den Histonen (H) H2A, H2B, H3, H4, welche jeweils doppelt vertreten
sind, sowie H1 für die Komprimierung bzw. Aufspiralisierung der DNA (GELDERMANN
2005).
54
Literatur
Strukturelle Studien über Nucleosomen zeigen, dass sowohl N- wie auch C-Termini von
Histonen nicht an der Kernpartikelstruktur beteiligt sind (BERGER 2002; SHIIO und
EISENMANN 2003). Stattdessen bilden sie vom Inneren des Nucleosoms aus die
sogenannten „Histon-tails“ (Histon-Schwänze), die in einem Ein-Buchstaben Code mit einer
Länge von 102 – 135 Aminosäuren (AS) dargestellt werden (LACHNER et al. 2003; JIANG
und PUGH 2009). Die N- und C-terminalen Histon-Schwänze können durch eine Vielzahl
von posttranslationalen Modifikationen an den einzelnen AS u.a. durch die Phosphorylierung,
Acetylierung, Methylierung (Abb. 8), Ubiquitierung und ADP-Ribosylierung verändert
werden (BERGER 2002; SHIO und EISENMANN 2003).
Abbildung 8: Schematischer Aufbau eines Nucleosoms. Bestehend aus den 4 Histonen
und Histon-Schwänzen sowie deren Modifikationen 2
Histonmethylierungen wurden erstmalig 1964 von ALLFREY et al. (1964) und MURRAY
(1964) beschrieben. Sie unterscheiden sich von den übrigen Histon-Änderungen darin, dass
sie sowohl an den Seitenketten von Arginin und Lysin als auch an deren Enden an den
Stickstoffatomen sowohl einzeln (Mono) als auch mehrfach (Di-; Tri) methyliert auftreten.
Am Arginin kann die Seitenkette mit dem Guanidinrest sowohl einfach, als auch zweifach
methyliert sein und als symmetrisches bzw. asymmetrisches Bindungsmuster erscheinen. Am
Lysin kann die ε-Aminogruppe ein- bis dreifach methyliert vorliegen (KLOSE und ZHANG
2007).
2
http://www.sabiosciences.com/pathwaymagazine/pathways8/ebook/index.html [Abrufdatum: 18.03.2011] 55
Literatur
Beim Säuger lässt sich die Argininmethylierung am Histon-Schwanz 3 an Position 2, 8, 17
und 26 sowie bei H4 an Position 3 finden (ZHANG und REINBERG 2001; WYSOCKA et al.
2006).
Die Enzyme, welche die Methylierungen katalysieren, werden kollektiv als Protein-ArgininMethyltransferasen (PRMT) zusammengefasst. Zu dieser Gruppe gehören PRMT1 und
CARM1 (Coactivator-associated Arginine Methyltransferase 1), die Histone als Substrate
nutzen. Die Histon-Arginin-Methylierung erfolgt mittels der Katalyse von CARM1, einem
sekundären Coaktivator. Dieser ist für die Bildung der inneren Zellmasse während der
Blastozystenentwicklung und die transkriptionale Aktivierung mitverantwortlich (CHEN et
al. 1999; TORRES-PADILLA et al. 2007). PMRT1 hingegen besitzt sowohl eine aktive als
auch repressive Wirkung auf die Chromatinfunktion von Säugern (WANG et al. 2001;
STRAHL et al. 2001; YU et al. 2006). Die Untersuchung ungereifter Mäuseoozyten
(SARMENTO et al. 2004) zeigte einen hohen Anteil an methyliertem Arginin an Position
H3Arg17 der Kernregion.
Die Histon-Lysin-Methylierung wird von Proteinen katalysiert, welche eine SET-Domäne aus
40–400 Aminosäuren umfassende Region tragen (LEHNINGER et al. 1998; MARTIN und
ZHANG 2005).Die SET-Domäne kommt sowohl in Hefen wie auch in Säugern nachgewiesen
werden, und steht für eine erste Gruppe von Drosophila-Genen, die Proteine mit einem
gemeinsamen Sequenzmotiv kodieren (KNIPPERS 2006). Diese tritt innerhalb des NTerminus von H3 an den Positionen K4, K9, K27, K36 und K79 auf (FENG et al. 2002). Die
Methylierung von H3-K4, -K36 und K79 wird mit der aktiven Region des Chromatins in
Verbindung gebracht, während bei der Methylierung von K9 und K27 der jeweilige DNAAbschnitt abgeschaltet ist (BANNISTER et al. 2001; LACHNER et al. 2001).
Desweiteren steht die Lysin-Methylierung in Assoziation mit der transkriptionalen
Aktivierung und Elongation der RNA-Polymerase II, dem transkriptionalen Abschalten im
Euchromatin und der Ausbildung der repressiven Heterochromatin-Domaine (SIMS et al.
2003). Die Methylierung von H3K9 ist sowohl für die Erstellung und Erhaltung vom
perizentrischen und telomerischen Heterochromatin (PETERS et al. 2002), als auch für die
Inaktivierung des X-Chromosoms weiblicher Säugetiere von Bedeutung (HEARD et al.
2001).
56
Literatur
Beim Vergleich der Lysin-Methylierung von präpuberalen murinen Oozyten in der GV-Phase
konnte eine signifikant höhere Methylierung für H3K9me3, H3K36me2, H3K79me2 und
H4K20me2 gegenüber adulten Mäuseoozyten beobachtet werden (MANOSALVA und
GONZALEZ 2010).
Als mögliche Ursache für die geringere Methylierung in adulten Mäuseooyzten wurden
enzymatische, chromosomale und physikalische Ursachen angesehen (LI et al. 2002;
JACQUET 2004; GONZALO und BLASCO 2005). Signifikante Unterschiede wurden im
Genom gereifter Oozyten präpuberaler Mäuse für H3K4me2, H3K9me2, H3K9me3,
H3K36me2, H3K79me2 und H4K20me2 gegenüber adulten Oozyten gefunden. Eine
Veränderung der Lysin-Methylierung während der Entwicklung boviner Oozyten konnten
RACEDO et al. (2009) nicht beobachten. Die Verbindung von Histon- und DNAMethylierung hat möglicherweise einen Effekt auf die abgeschaltete Chromatin-Domäne
sowie die Genexpression und bewahrt die genomische Integrität (FUKS et al. 2003).
2.9
Quantitative DNA-Methylierung: DNA-Sequenzierung
Seit der Entdeckung des 5-Methyl-Cytosins durch HOTCHKISS (1948) wurden verschiedene
Methoden zur Untersuchung und Sequenzierung dieser modifizierten Base entwickelt.
Ursprüngliche Methoden wie die basenspezifische Spaltung nach MAXAM und GILBERT
(1977) werden heute nicht mehr verwendet und wurden durch die klassische DidesoxyMethode (Kettenabbruch-Synthese) nach SANGER (1975) ersetzt.
Das Methyl-Cytosin, die sogenannte „fünfte Base“, ist für viele Standardmethoden der DNAAnalyse, wie die Sanger-Didesoxy-Sequenzierung oder die konventionelle PCR, nicht
sichtbar. Methyl-Cytosin kann durch die Behandlung genomischer DNA mit Sodiumbisulfit
nachgewiesen werden (LEHMANN 2008). Dabei wird unmethyliertes Cytosin (C) in der
späteren Analyse als Thymidin (T) sequenziert, während die methylierten Cytosine als solche
sequenziert werden.
57
Literatur
Die Bisulfit-Genomsequenzierung ist eine weitverbreitete Technik zur Analyse der CytosinMethylierung der DNA (SHIRAISHI und HAYATSU 2004). Bei der Sodiumbisulfit-Methode
werden zunächst alle nicht methylierten Cytosine in Uracil desaminiert (Abb. 9) und bei der
anschließenden PCR in T amplifiziert (HAYATSU et al. 1970; SHAPIRO et al. 1973;
WANG et al. 1980).
Abbildung 9: Bisulftinduzierte hydrolytische Desaminierung von Cytosin in Uracil
(GRIGG und CLARK 1994)
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Desaminierung von m5C zu Thymin im
Vergleich von Cytosin zu Uracil geringer ist. Diese Methode bietet somit eine gute
Möglichkeit einen Überblick über den Methylierungsgrad der Untersuchungs-sequenz zu
erhalten (FROMMER et al. 1992). Die vollständige Konvertierung aller unmethylierten
Cytosine zu Uracil stellt allerdings einen kritischen Schritt für die Methylierungsanalyse dar
(GRUNAU et al. 2001). SHIRAISHI und HAYATSU (2004) untersuchten den Einfluss der
Temperatur bei unterschiedlicher Inkubationsdauer auf die Konvertierung von Cytosin zu
Uracil. Eine 5 minütige Inkubation bei 90 °C führte zu einer 90 % -igen Konvertierung, nach
20 min. lag eine vollständige Konvertierung vor. Bei einer Inkubationstemperatur von 70°C
waren erst nach 40 min. alle Cytosine konvertiert.
Für die Analyse des Amplifikationsproduktes wird eine Primergröße von ca. 30 Bp
empfohlen (TOST und GUT 2007). Das zu amplifizierende Produkt sollte eine Größe von ca.
200 Bp besitzen. Eine Analyse von größeren Produkten (> 300 bp) reduziert die Erfassung der
biotinmarkierten Amplifikationsprodukte. Dagegen ist die Pyrosequenzierung eine noch
relativ neue Methode. Sie bietet die Möglichkeit der beschleunigten Analyse durch
hochparallelen Einsatz.
58
Literatur
Ein
weiteres
Verfahren
nutzt
nicht
mehr
die
Auftrennung
der
DNA
über
Kapillarelektrophorese, sondern eine Kopplung von Molekülen an Oberflächen mit der
Aufnahme von hochauflösenden Bildern wie bei der „Sequencing by Oligonucleotide
Ligation and Detection“.
KANG et al. (2005) untersuchten die veränderten Methylierungsmuster von Satellitenregionen mittels Bisulfitbehandlung und Sequenzierung u. a. in bovinen Oozyten und konnten
deutliche Unterschiede im Methylierungsgrad zwischen den einzelnen Regionen (27,9 % und
5,5 %) nachweisen. KANEDA et al. (2004) zeigten mittels Bisulfitsequenzierung, dass der
intracisternale A Partikel (IAP) Repeat in Knockout-Mäuseembryonen etwa 50% geringer
methyliert war im Vergleich zum Wildtyp. Eine unterschiedlich starke Methylierung des
Small nuclear ribonucleoprotein N (Snrpn) Gen lies sich in Oozyten von Neugeborenen, 10
Tage alten Embryonen und Oozyten der M II-Phase beobachten. In Oozyten von Neugeborenen wurde zudem die geringste Methylierung beobachtet, die aber mit fortschreitendem
Alter zunahm und in der M II-Phase der Oozyte die höchste Konzentration zeigte (KANEDA
et al. 2004).
2.9.1 Pyrosequenzierung
Eine neue vielversprechende Methode zur Methylierungsanalyse stellt die Pyrosequenzierung
dar. Sie wurde als erstes von RONAGHI et al. (1996) und RONAGHI et al. (1998)
beschrieben. Diese Sequenziertechnik der DNA basiert auf der Erkennung von freiem
Pyrophosphat (PPi) während der DNA-Synthese. In einer Kaskade von enzymatischen
Reaktionen (DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase) wird sichtbares
Licht generiert, das proportional zur Anzahl von integrierten Nukleotiden ist. Die Kaskade
beginnt mit einer DNA-Polymerisation, in der anorganisches PPi als Folge der
Nukleotidintegration durch die Polymerase freigegeben wird. Das freie PPi wird durch die
ATP-Sulfurylase in ATP umgewandelt und liefert die nötige Energie für die Luciferasereaktion. Dabei wird Luciferin in Oxyluziferin umgewandelt und detektierbares Licht
entsteht. Da das hinzugefügte RNA-/DNA-Nukleotid bekannt ist, kann die Sequenz der
Matrize bestimmt werden.
59
Literatur
Jedoch weisen DNA-Polymerasen eine höhere katalytische Aktivität als RNA-Polymerasen
auf. Daher wurden Bemühungen unternommen, bereits präparierte Matrizen für die
Pyrosequenzierung zu nutzen (RONAGHI 2001). Für die Standardpyrosequenzierung wird
das Klenow-Fragment von Escherichia coli DNA Polymerase I genutzt. (BENKOVIC und
CAMERON 1995).
Die bei der Pyrosequenzierung verwendete ATP-Sulfurylase ist eine rekombinante Form aus
Saccharomyces cerevisiae (KARAMOHAMED et al. 1999). Die Luciferase entstammt dem
amerikanischen Leuchtkäfer Photinus pyralid. Die Gesamtreaktion von der Polymerisation
eines Nukleotids bis zur Erkennung des Lichtes findet innerhalb von 3-4 Sekunden bei
Raumtemperatur statt. Die Menge an Licht wird mithilfe einer Photodiode oder einer Chargecouple Kamera (CCD) wahrgenommen (RONAGHI 2001). Das Lichtsignal wird im
Anschluss daran mittels einer Software in ein Pyrogramm umgewandelt, welches die
eingebauten Nukleotide erkennt (Abb. 10).
Abbildung 10: Prinzip der Pyrosequenzierung (LEHMANN 2008)
Erstmals wurde von UHLMANN et al. (2002) exemplarisch der Methylierungsgrad eines
einzelnen CG-Dinukleotides mithilfe der Pyrosequenzierung gezeigt. Der Grad der
Methylierung wird mittels der Allelhäufigkeit berechnet (TOST und GUT 2007).
Höchster Lichtwert (LMax)
Methylierung% = Höchster Lichtwert + Höchster Nichtmethylierter Lichtwert *100
60
Literatur
Zwei weitere Pyrosequenzierungsstrategien stellen die Festphasen (RONAGHI et al. 1996)
und Flüssigphasepyrosequenzierung (RONAGHI et al. 1998) dar. Für die Festphasenpyrosequenzierung wird die fixierte DNA sowie die Enzyme Polymerase, ATP-Sulfurylase
und Luciferase genutzt. Für die Flüssigphasensequenzierung wird ein weiteres Enzym
„Apyrase“ benötigt. Durch die Zugabe dieses Enzyms wird das nicht genutzte ATP und dNTP
(Desoxynukleotid-Triphosphat) kontinuierlich abgebaut (RONAGHI 2001).
61
Material und Methoden
3
Material und Methoden
Die Zusammensetzung der verwendeten Medien, Chemikalien, Materialien sowie die
verwendeten Geräte sind, sofern nicht im Text angegeben, im Anhang beschrieben.
3.1
Versuchstiere
Die im Rahmen dieser Arbeit genutzten Kälber und Kühe stammen aus der Versuchsherde
des Instituts für Nutztiergenetik des Friedrich-Loeffler-Institutes in Mariensee. Insgesamt
wurden 105 Kälber und 43 Kühe der Rassen Holstein-Friesian, Deutsche Schwarzbunte und
Fleckvieh verwendet. Das Alter der Kälber lag zwischen sechs und neun Lebensmonaten.
Diese wurden im Offenstall gehalten und erhielten Heu, Grassilage und Wasser ad libitum
sowie entwicklungsabhängig, Mineral- und Kraftfutter. Die Kühe befanden sich in der ≥ 2.
Laktationsperiode. Sie wurden in der Zeit von November bis April in Anbindehaltung, in der
Zeit von Mai bis Oktober bei ganztägigem Weidegang gehalten und erhielten eine der
Laktationsleistung entsprechende Futtermischration.
Nach Erreichen der Altersgrenze von neun Monaten wurden die Kälber in die institutseigene
Jungtierherde integriert. Die Kühe wurden nach Beendigung der Versuche und einer
entsprechenden Ruhephase wieder besamt.
3.1.1 Untersuchung der Kälber und Kühe
Die Kälber und Kühe wurden vor der Einstellung in den Versuch sowohl einer
Allgemeinuntersuchung (Temperatur, Augen- und Mundschleimhaut, Kapillarfüllungszeit,
Herz- und Lungenfunktion, Ernährungszustand und Körpergewicht zu Beginn der Nutzung)
als auch einer gynäkologischen Untersuchung unterzogen. Tiere, die Auffälligkeiten im
Allgemeinbefinden bzw. in der gynäkologischen Untersuchung aufwiesen, wurden nicht für
den Versuch verwendet.
62
Material und Methoden
3.1.2 Technische Ausstattung der OPU-Methode
Zur visuellen Darstellung des Ovars für die Follikelpunktion zur Oozytengewinnung und der
Ovarinjektion wurden das Ultraschallgerät Picker Modell CS 9000 (Picker, München) und
eine 6,5 MHz Fingertipultraschallsonde (Picker Modell EUP-F-331, München) genutzt (Abb.
11 A). Der Ultraschallkopf wird am Ende eines 60cm langem PVC-Rohres an einem Tragegestell instaliert. Im Inneren des PVC-Rohres befindet sich ein PVC-Stab mit 2 Führungskanälen zum einen für die Stromversorgung der Ultraschallsonde, der weitere für die
Punktions- und Injektionseinheit (Abb. 11 B).
A
B
Punktions- und
Injektionskanal
Ultraschallsonde
Stromversorgung
Abbildung 11: A: OPU-Ausstattung
(OROPEZA 2004)
B: Ultraschallkopf mit Trägereinheit
Der Sondenträger wurde für die Durchführung mit einer Hygiene Schutzhülle versehen
(Servoprax®, Wesel), in einem schleimhautverträglichen Desinfektionsbad geschwenkt und
mit einer geringen Menge Gleitgel (Bovi-Vet Gel, Krusse) versehen.
63
Material und Methoden
Mit der linken Hand wurde das Rektum entleert und das jeweilige Ovar fixiert. Nach
Reinigung mit körperwarmem Wasser und Desinfektion (Octenisept®, Schülke & Mayr
GmbH, Norderstedt) der Vulva wurde der Sondenträger eingeführt.
3.1.3 Vorbereitung der Kälber und Kühe
Alle Untersuchungen und Behandlungen fanden im Biotechnologiezentrum des Instituts für
Nutztiergenetik in Mariensee statt. Für Voruntersuchungen, Oozytengewinnug und i.o.
Injektionen wurden die Kälber und Kühe in einem Behandlungsstand fixiert und erhielten zur
Minderung der Darmmotorik eine Epiduralanästhesie mit 5mg/kg Procasel® (Selectavet,
Weyarn-Holzolling). Kälber erhielten bei Bedarf 0,01mg/kg Xylazin (cp-pharma, Burgdorf)
zur Sedation. Vier Tage vor der ersten Oozytengewinnung wurden alle dominierenden
Follikel entfernt. Desweiteren erhielten Kälber aus vorbestimmten Versuchsgruppen 48h vor
jeder OPU-Sitzung 65µg porcines FSH und LH (Stimufol®, Ulg FMV PhR, Sart-Tilman,
Belgien) zur Stimulierung des follikulären Wachstums. Eine Kuhgruppe erhielt ebenfalls 48h
vor der Ovarpunktion 100µg FSH. Die Injektion erfolgte jeweils i.m. in die lange
Sitzbeinmuskulatur.
Für zwei Kälbergruppen erfolgte neben der FSH Injektion eine i.o. Injektion von 6 µg
rekombinantem humanem IGF-1 ((rhIGF-1)(R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt) bzw.
einer Kontrollsubstanz je Ovar (Tab. 4).
Tabelle 4:
Versuchsgruppen (Gonadotropin und IGF-1 Behandlungen)
Gruppe
Kontrolle
FSH
FSH + IGF-1
FSH + IGF K*
Kuh
+
+
-
-
Kalb
+
+
+
+
*IGF K = 0,01 M Essigsäure
Das für diesen Versuch genutzte rhIGF-1 entspricht dem Aminosäuremuster des bovinen
IGF-1 (FOTSIS et al. 1990). Dazu wurden 250µg lyophilisiertes rhIGF-1 in 25ml (10mM)
Essigsäure (CH3COOH) (Trägersubstanz) gelöst, welches eine Stammlösung von 10µg/ml
ergab.
64
Material und Methoden
Diese wurde zu je 1,2ml in ein Eppendorf Tube (Bioenzym Diagnostic GmbH, Hess
Ollendorf) verbracht und bei -80°C bis zum Gebrauch gelagert. Die Injektion von je 0,6ml
IGF-1
(6µg)
beziehungsweise
der
Kontrollsubstanz
(CH3COOH)
erfolgte
an
2
unterschiedlichen Stellen des Ovars. Für die Injektion wurde eine 1-ml Spritze und eine 20G
2¾ Nadel (0,9 x 70mm, Terumo Europa N.V.-3001 Leuven Belgien) verwendet (Abb. 12).
Die Punktionsdauer belief sich für jeden Versuchsdurchgang und Gruppe auf 3 Wochen.
A
B
Schematische Darstellung der Fixation von
Ovar und Lage der Ultraschallsonde
Ultraschallkopf und Injektionseinheit
Abbildung 12: Darstellung der intraovariellen Injektion (OROPEZA 2004)
3.1.4 Transvaginale Follikelpunktion (OPU)
Für die Punktion wurde eine auswechselbare Punktionsnadel 20G 2¾ Nadel (0,9 x 70mm,
Terumo Europa N.V.-3001 Leuven Belgien) mit einem Schlauchsystem (Ø 2mm x 1m)
genutzt, welches mit einem 50ml Sammelröhrchen verbunden war (Abb. 13). Das NadelSchlauchsystem war mit einer Vakuumpumpe (IVF Ultra Quiet, COOK Veterinary Products,
Mönchengladbach) verbunden, die bei 8,3-8,5 kPa eingestellt wurde.
65
Material und Methoden
Ultraschall mit Arbeitskanal
Punktionseinheit mit Schlauchsystem
Sammelgefäß
Abbildung 13: Punktionseinheit (OROPEZA 2004)
Zwei Tage nach der i.m. bzw. i.o. Injektion erfolgte die ovarielle Punktion zur
Oozytengewinnung.
Für die Punktion wurden die Kälber und adulten Kühe im Behandlungsstand fixiert und
entsprechend anästhesiert. Es wurden alle Follikel mit einer Größe von ø 5 bis 17mm
punktiert (Abb. 14).
Follikel
Abbildung 14: Schematische Darstellung der Ovarpunktion (PONEBŠEK, 2005)
66
Material und Methoden
Nach jeweils 4-5 Follikelpunktionen wurden die Punktionsnadel und das Schlauchsystem mit
frisch angesetztem Spülmedium, bestehend aus
•
1000 ml Dulbecco`s Phosphat Buffered Saline (PBS) Medium
•
10ml/l hitzeinaktiviertes New Born Calf Serum (NBCS, PAA Laboratories GmbH
Austria)
•
und 0,05g/l Heparin-Na
gespült. Spülmedium und Punktionsflüssigkeit wurden in einem 50ml Tube gesammelt und
während der gesamten Punktionssitzung in einem Wasserbad bei 38°C eingestellt. Nach
Beendigung der Punktion wurde das Sammelröhrchen mit Ohrmarkennummer des Tieres und
der Anzahl punktierter Follikel versehen und umgehend ins IVF Labor verbracht.
Die gewonnenen Oozyten wurden mittels Sieb (Porengröße 50µm) filtriert und nach
2-3-maligem Spülen mit PBS-NBCS-Heparin-Lösung in einer Petrischale gesammelt. Im
Anschluss daran wurden die gewonnenen Oozyten mit Hilfe eines Stereomikroskops (Hund
Wetzlar, Wetzlar) bei 50-facher Vergrößerung gesucht. Die gefundenen Oozyten wurden in
einer weiteren Petrischale in Tropfen aus TCM-air Medium für die jeweilige Versuchsgruppe
gesammelt. Im Anschluss daran erfolgte die Qualitätsbeurteilung der KOK und Aufteilung in
die verschiedenen Versuchsansätze. Es wurde darauf geachtet, dass der Zeitraum zwischen
Punktion und Suchen der Oozyten nicht mehr als 25–30min betrug.
3.1.5 Beurteilung der Entwicklungsfähigkeit von Kumulus-Oozyten-Komplexen
(KOK)
Die gewonnenen Oozyten aus dem OPU-Punktat wurden im nächsten Schritt unter einem
Stereomikroskop bei 45 bis 50x Vergrößerung beurteilt. Diese Beurteilung erfolgte anhand
der Morphologie des Zytoplasmas und der Kompaktheit der Kumuluszelllagen in 5 Klassen
(I-V) (LOONEY et al. 1994, GOODHAND et al. 1999). Für die Versuche wurden nur
Oozyten der Klassen I bis III verwendet.
67
Material und Methoden
Klasse I
Oozyten mit homogenem, gleichmäßig granuliertem Zytoplasma
und mindestens 3 Lagen Kumuluszellen
Klasse II
Oozyten mit homogenem, gleichmäßig granuliertem Zytoplasma
und weniger als 3 Lagen Kumuluszellen
Klasse III
Oozyten mit unregelmäßig granuliertem Zytoplasma, dunklen Flecken
und einer einschichtigen Kumuluszelllage
Klasse IV
Oozyten ohne Kumuluszellen
Klasse V
Oozyten mit bereits expandiertem Kumulus
3.2
In vitro Verfahren
PBS –Phosphate-buffered saline (Spülmedium)
Als Spülmedium wurde Dulbecco´s phosphate buffered saline (PBS-Pulver) (AppliChem)
unter Zugabe der PBS-Stammlösung und Aqua bidest. verwendet. Am Tag der Nutzung
wurden 25mg Heparin/0,5l Medium zugefügt und im Wasserbad bei 38°C inkubiert.
TCM-air
Für das Sammeln und Beurteilen der ungereiften und gereiften Oozyten wurde als
Grundmedium Tissue Culture Medium 199 (TCM 199) verwendet. Dieses wurde im
Kühlschrank gelagert und vor der Nutzung auf 38°C erwärmt.
TCM culture (Reifungsmedium)
Als Grundmedium wurde TCM 199 verwendet. Hierfür wurde TCM 199, Gentamycinsulfat,
Na-Pyruvat, NaHCO3 in MilliQ gelöst und für ca. 1h im offenen Glas bis pH 7,4 gerührt.
Anschließend wurde BSA zugefügt und anschließend bei einem osmotischen Druck von 268
mOs sterilfiltriert (CA-Membran 0,20µm, Minisart, Sartorius Stedium Biotech). Die
Haltbarkeit beträgt 1-2 Wochen bei 4°C Lagerungstemperatur.
68
Material und Methoden
In vitro Reifung (IVM)
Für die in vitro Reifung wurden 975µl TCM-199 + BSA und 25µl eCG (10 I.E. PMSG; 5 I. E.
hCG Suigonan, Intervet GmbH, Tönisvorst) in einem sterilen 1,5ml Tube gemischt und 9
Tropfen à 100µl in eine Ø 60mm Petrischale pipettiert, mit Siliconöl überschichtet und für
min. 1 h bei 39°C und 5% CO2 äquilibriert. Nach Klassifikation der Oozyten wurden diese
dreimal in TCM-199 + BSA gewaschen und in die Reifungsstropfen überführt. Für die
Reifung wurden die Oozyten in einem Inkubator bei 38°C, 5% CO2 und gesättigter
Luftfeuchtigkeit für 22 – 24h in vitro gereift.
3.3
Präparation von ungereiften und gereiften Oozyten für die
Methylierungs-bestimmung und Real-time PCR
Um anhaftende Kumuluszellen von ungereiften Oozyten der Qualitätsklassen 1-3 zu
entfernen, wurde eine 0,1% Hyaluronidase Lsg. verwendet. Diese wurde in Aliquots bei
-20°C gelagert, mindestens 20min vor Gebrauch im Wärmeschrank aufgetaut und inkubiert.
Oozyten für die RT-PCR Analyse wurden nach Gewinnung und Beurteilung in Hyaluronidase
Lsg. überführt, je nach Kumulusanheftung für 7 – 10min inkubiert und für weitere 5min geschüttelt. Zur Inaktivierung der Hyaluronidase erfolgte die Zugabe von 1,5ml TCM-air. Die
restlichen anhaftenden Kumuluszellen wurden mittels einer angefertigten Glaspipette entfernt.
Die entkumulierten Oozyten wurden 3x in PBS/PVA 0,1% gewaschen und in einem 600µl
silikonbeschichteten Eppendorfgefäß, in 10er Pools für die Methylierungsanalyse und einzeln
für die RT-PCR Analyse, bei -80°C gelagert.
Gereifte Oozyten wurden 22 – 24h nach Beginn der Reifung entkumuliert und mikroskopisch
auf einen vorhandenen Polkörper untersucht. Oozyten mit Polkörper wurden anschließend
nach dem gleichen Protokoll wie ungereifte Oozyten gelagert. Zusätzlich erfolgte für einige
Oozyten die Reifungskontrolle mittels Resorcinfärbung. Für diese Färbung wurden auf einem
Objektträger zunächst zwei Streifen Vaseline für die spätere Fixierung des Deckgläschens
parallel aufgetragen. Anschließend wurden 3 einzelne und entkumulierte Oozyten in einer
geringen Menge TCM-air Medium platziert. Das Deckgläschen wurde auf die
Vaselinestreifen aufgelegt und vorsichtig soweit heruntergedrückt, dass die Oozyten fixiert
jedoch nicht geplatzt sind.
69
Material und Methoden
Zur Kontrolle wurde etwas Fixiermedium (Essigsäure-Alkohollösung, 1:3) zwischen
Objektträger und Deckgläschen gegeben und am Mikroskop verfolgt, ob alle Oozyten fest
fixiert sind. Der Objektträger wurde anschließend für mindestens 24h in einer Färbekürvette
mit Fixiermedium belassen. Am Tag der Färbung wurden einige Tropfen der LacmoidGebrauchslösung an den unteren Rand des Deckgläschens gegeben, welche unter
Zuhilfenahme eines saugfähigen Filterpapiers durch Adhäsion das Präparat durchfärbten.
Nach einigen Minuten Einwirkzeit wird nach demselben Schema mit Hilfe von 45%iger
Essigsäure der Hintergrund wieder entfärbt. Anschließend wurden die angefärbten Oozyten
am Phasenkontrastmikroskop auf das Vorhandensein des Polkörpers und der Metaphase II
Anordnung der Chromosomen beurteilt (Abb. 15).
Oozyte
Metaphase II
Polkörper
Abbildung 15: Gereifte Oozyte in der Metaphase II mit Polkörper
3.4
RT-PCR Analysen
3.4.1 Isolierung von mRNA
In dieser Arbeit wurde der relative Transkriptgehalt von 4 Genen (GDF9, SLC2A1, PRDX1
und ZAR1), die für die Oozytenentwicklung von Bedeutung sind, analysiert. Dazu wurde die
mRNA aus ungereiften und gereiften Oozyten der verschiedenen Versuchsgruppen mit Hilfe
eines Analysekits (Dynabeads®, Dynal, Oslo, Norwegen) isoliert.
Die Lagerung der Oozyten erfolgte bei -80°C in einem Eppendorfreaktionsgefäß. Am Tag der
Nutzung wurden diese, bis zur Zugabe von 40µl Lysispuffer A, auf Eis transportiert. Nach der
Zugabe des Lysispuffers A wurden 2µl (1pg) Kaninchen Globin mRNA hinzugefügt und für
10min bei Raumtemperatur inkubiert.
70
Material und Methoden
Währenddessen wurden 5µl Dynabeads oligo (dt)25 mit 5 µl Lysispuffer A, unter Verwendung
eines Magnetständers, gewaschen. Nach Inkubation der Oozyten erfolgte die Zugabe von 5µl
Dynabeads, die im Anschluss für 15min bei 25°C im Thermoschüttler geschüttelt wurden.
Dabei kam es zur Verbindung der Dynabeads und dem Poly(A)-Schwanz der Oozyten
mRNA. Im nächsten Schritt wurden die Reaktionsgefäße in einen Magnetständer gestellt,
wodurch sich freie Dynabeads, wie auch Dynabeads-mRNA-Komplexe, an der Rückwand der
Gefäße sammelten. Nach Absaugen des Überstandes wurden die Proben im ersten Schritt mit
40µl Waschpuffer A und anschließend zweimal mit Waschpuffer B gewaschen. Dem letzten
Waschschritt folgte die Resuspension der Proben in 11µl Aqua bidest. und die Inkubation für
2,5min bei 68°C, was zur Trennung der mRNA von den Dynabeads führte. Nach der
Inkubation wurden die Reaktionsgemische umgehend in den eisgekühlten Magnetständer
gestellt. Dies führte zur Anhaftung der Dynabeads, sodass die im Überstand enthaltene
mRNA abgenommen werden konnte und umgehend mit Hilfe der Reversen Transkription in
cDNA umgeschrieben wurde.
3.4.2 Reverse Transkription (RT)
Für das Umschreiben der mRNA in cDNA wurde zunächst ein Mastermix (MM) mit einem
Volumen von 9µl angesetzt. Nach Zugabe von 11µl isolierter mRNA (1 Oozyte) wurde das
Reaktionsgemisch mit einem Endvolumen von 20µl in einem MJ Research PTC 200 Peltier
Thermal Cycler inkubiert. Um mögliche Kontaminationen der Proben zu erkennen, wurden
Negativkontrollen mit Aqua bidest. ohne mRNA in die Analyse mit einbezogen. Zusätzlich
wurde, um die Effizienz der mRNA Wiederfindung zu bestimmen, eine Globin Kontrolle mit
1pg Kaninchen mRNA hinzugefügt (Tab. 5).
Die einzelnen Schritte der RT waren wie folgt:
1. 10min bei 25°C
2. 60min bei 42°C (RT der mRNA in cDNA)
3. 5min. bei 99°C (Denaturierung der Enzyme)
4.
Herunterkühlen auf 4°C Endtemperatur.
71
Material und Methoden
Tabelle 5:
Reverse Transkription
Komponenten
MM
RNA
MgCl2 (50mM)
Negativkontrolle
11µl RNA aus 1Oozyte 2 µl Kaninchen RNA
0
2µl
2µl
2µl
2µl
2µl
2µl
2µl
2µl
2µl
Probe
Kontrolle
10x PCR Puffer
dNTP`s (10mM)
2µl
2µl
2µl
Hexamer Primer (50µM)
1µl
1µl
1µl
1µl
RNase Inhibitor (20U/µl)
1µl
1µl
1µl
1µl
Rev. Transkriptase (50U/µl)
H2O
1µl
-
1µl
0
1µl
9µl
1µl
11µl
Total
9µl
20µl
20µl
20µl
3.4.3 Real-time PCR
Die Real-time PCR wurde in einer 96-Well optischen Reaktionsplatte (Applied Biosystems,
Foster City, USA) durchgeführt. Zunächst wurde ein MM vorbereitet, dessen Bestandteile in
Tabelle 6 und 7 aufgeführt sind. Jedes Well wurde mit 18µl MM und 2µl cDNA für die
Analyse befüllt. Gleichzeitig mit den zu untersuchenden Genen wurde Kaninchenglobin für
die Normalisierung amplifiziert. Die Analyse erfolgte mittels ABI 7500 Fast Real-time
System (Applied Biosystems).
Zunächst erfolgte die Aktivierung der Taq-Polymerase für 10 Min. bei 95°C. Im Anschluss
die Denaturierung bei 95°C für 15sek über 40 Zyklen mit anschließender Anlagerung der
Primer bzw. Extension der DNA für 1min bei 60°C und gleichzeitiger Power SYBR® Green
Fluoreszenzdetektion. Die Ergebnisse wurden anschließend für die Microsoft Exelanalyse
mittels Sequence Detection Software 1.4 transformiert. Die Expression der einzelnen Gene
wurde mittels der relativen Standardkurve dargestellt. Die Verifikation der spezifischen
Genprodukte erfolgte mittels Schmelzkurvenanalyse.
72
Material und Methoden
Tabelle 6:
Tabelle 7:
Mastermix Real-time PCR
Komponente
MM
Endkonzentration
cDNA
Primer Upper/Lower (5µM)
Power SYBR Green 2x
H2O
2µl
0,8µl
10µl
6,4µl
1 Oozyte
0,2µM
-
Total
20µl
-
Primerpaare
Annealing
Gene
Primersequenzen
temp./
FragOA
Zyklenzahl
GDF9
SLC2A1
PRDX1
ZAR1
Globin
5`CGGTATGGCTCTCCAGTTCAC
60°C
3`TGGCACTGAGGAGTCAAGTTTC
40
5`CAGGAGATGAAGGAGGAGC
60°C
3`CACAAATAGCGACACGACAG
40
5`TCAAGCCTGATGTCCAGAAGAGC
60°C
3´CCGTCCTGTCCCTACACCAC
40
5`AGACTAGATGCTCCTGCCCAGT
60°C
3`TCTTGACGGTGGGGCCGTTTAG
40
5´GCAGCCACGGTGGCGAGTAT
60°C
3`GTGGGACAGGAGCTTGAAAT
40
OA = Oozytenanteil, bp = Basenpaare
73
mentgröße
0,05
69bp
0,05 258bp
0,05 173bp
0,05
82bp
0,05 257bp
Material und Methoden
Zur Bestimmung der Endpunktquantifizierung zwischen den einzelnen Untersuchungsgruppen wurden bei jeder Analyse zwei Standardkurven bestimmt. Standardkurve eins wurde
aus 1pg Kaninchenglobin cDNA, die zweite aus einem Pool Oozyten adulter Kühe hergestellt.
Die Standardkurven bestanden aus vier 1:5 Verdünnungen aus dem jeweiligen Original
cDNA-Pool. Die Ergebnisse wurden durch Kalkulation des Verhältnisses zum Globin mRNA
Gehalt normalisiert und als Mittelwerte mit Standardabweichungen dargestellt.
3.4.4 DNA Isolierung aus bovinem Gewebe
Für die DNA-Präparation aus bovinem Gewebe wurde gefrorenes Uterusgewebe von 1 x 1cm
Größe benutzt. Das Gewebestück wurde mit 500µl Lysispuffer B und 70µl (100µg/ml)
Proteinase K versetzt und über Nacht bei 55°C in einem Thermoschüttler inkubiert. Am
darauffolgenden Tag wurde 250µl 6 M NaCl (gesättigt) zugegeben. Anschließend wurde die
Probe für 5min gemischt und bei 14000 U/min für 15min zentrifugiert. Der Überstand von ca.
700µl wurde in ein steriles Eppendorfgefäß überführt und mit 500µl Isopropanol 100%
versetzt. Im Anschluss wurden die Proben für 2min gemischt und 10min zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen und das gefällte DNA-Pellet in 70% Ethanol gewaschen, für 5
Min. zentrifugiert und anschließend getrocknet. Je nach Menge des Pellets wurde dieses in
50–200µl MilliQ® bidest. H2O resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C
gelagert.
3.5
DNA Isolierung und Bisulfitbehandlung aus präpuberalen und adulten Oozyten
Zur Bestimmung des Methylierungsmusters der Repeatsequenzen wurde die DNA aus jeweils
5 ungereiften bzw. 5 gereiften Oozyten der verschiedenen Untersuchungsgruppen isoliert.
Isolierung und Bisulfitbehandlung erfolgten mittels EZ DNA Methylation DirectTM Kit
(ZYMO RESEARCH, USA). Zunächst wurden die Oozyten mit 13µl M-Digestion Buffer
(2x), 1µl Proteinase K und 12µl Aqua dest. versetzt. Der Ansatz wurde für 20min bei 50°C
inkubiert und im Anschluss für 5min bei 10 000 U/min zentrifugiert. Darauffolgend wurden
20 µl des Überstandes und 130µl CT Conversion Reagent in ein weiteres PCR-Gefäß
pipettiert, kurzzeitig abzentrifugiert und im MJ Research PTC Peltier Thermal Cycler
inkubiert.
74
Material und Methoden
Die einzelnen Schritte der PCR waren wie folgt:
1. 98°C für 8min
2. 64°C für 3,5h
3. 4°C zur Lagerung für 20h.
Im weiteren Verlauf der Probenbearbeitung wurden zunächst 600µl M-Bindung Buffer auf
eine Zymo-SpinTM® IC Säule gegeben, welche in ein Auffanggefäß gestellt wurde.
Anschließend wurde das Reaktionsvolumen von 150µl auf die Säule pipettiert, gemischt und
bei 10 000 x U/min für 30sek zentrifugiert. Im Anschluss wurden 100µl M-Wash Buffer auf
die Säule gegeben und wiederum zentrifugiert. Für die anschließende Inkubation für 15min
bei 30°C wurden 200µl M-Desulphonation Buffer hinzugegeben und nach Ablauf der
Inkubationszeit zentrifugiert. Diesem Schritt folgte eine 2-malige Waschung mit je 200µl MWash Buffer und Zentrifugation. Im weiteren Verlauf wurde die Säule in ein Mikrozentrifugengefäß umgesetzt, 10µl M-Elution Buffer direkt auf die Säulenmatrix pipettiert und,
zur Eluierung der DNA, 30sek zentrifugiert. Die DNA wurde danach bis zum weiteren
Gebrauch bei -20°C gelagert.
75
Material und Methoden
3.5.1 Bisulfitkonvertierung
Bei der Bisulfitbehandlung konvertiert nichtmethyliertes Zytosin in Uracil, während das
methylierte Zytosin der genomischen DNA unverändert bleibt (Abb. 16).
1. Isolierung genomischer DNA
CH3
CH3
CH3
|
|
|
5`CCCTGCTCGTCTCGCCCCAGGCG
:::::::::::::::::::::::
3`GGGAGCAGCAGAGCGGGGTCCGC
|
|
|
CH3
2.
CH3
Wasserstoffbrückenbindung
CH3
Bisulfitbehandlung
methyliertes (CH3) Cytosin
nichtmethyliertes Cytosin
URACIL
CYTOSIN
CH3
CH3
CH3
|
|
|
5`UUUTGUTCGTUTCGUUUUAGGCG
:::::::::::::::::::::::
3`GGGAGCAGUAGAGCGGGGTUUGC
|
|
|
CH3
CH3
CH3
Abbildung 16: Konvertierung von Cytosinmolekülen mittels Bisulfit
76
Material und Methoden
3.5.2 DNA-Methylierung von Repeatsequenzen
Die Bestimmung der DNA-Methylierung von Repeatsequenzen erfolgte an zwei Sequenzen,
welche der Publikation von KANG et al. (2005) entnommen wurden. Repeatsequenz 1
markiert die Bovine testis satellite I DNA, segment 2, BOVRS71T2, GenBank: J00032.1 auf
Chromosom 3 und 16. (Abb. 17). Repeatsequenz 2 kennzeichnet die Bos taurus α-Satellite I
DNA, clone pBtKB5, GenBank: AJ293510.1 auf Chromosom 7, 11, 27 und dem
x-Chromosom des bovinen Genoms (Abb. 18). Die Methylierungsanalyse der Bovine testis
satellite I Sequenz erfolgte an einem 211 bp (gelb), die Analyse der Bos taurus α-Satellite I
Sequenz an einem 154 bp (gelb) großen Segment.
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
ccctcatctc
cggtttctca
cgggtctcca
atctggcctc
agccctgggt
aagccaggga
gaagagggcc
gatcgcaggg
tggaactccg
ttggaacctg
attcacaggg
gggaaatcgg
gtgagaccgg
g
ccgatgacgg
cgaggtacga
tgcgagtaac
gagacgtgtt
ccctcgactt
aactggaggt
tcatctccag
tccctgcaga
cttgcctctc
gggttttttc
gtggagttcg
ggtcccacgg
cctcatcctg
gggagtctag
cggcgaggtc
gagggggagc
gaagagggtc
gtgcaggtga
gggaggggcc
ttgaggcagg
ctggggacag
gagatgtccc
cgaacggtgc
gagaggtgtc
aacgtggaac
aggtgcgacc
gggttgttct
agtgagcctc
gcgccattgc
tctcgaggtc
cctcaggggg
tctcgggact
aaccgcaggg
gagagtcagg
cggggagaga
acggagaagc
cgggcatcgg
cacccacgag
ggaaggcaac
cgagcggcgg
tcgtggggcg
tcccgagcca
ttccccgggt
cttctcgtgg
ccactgggct
tacctctgat
cctcgtcttg
ggccgcttgt
tgccccttcg
gttcttatca
gccacgtctg
cccttccaga
ccccagtgtg
ccagggaagt
tgggaggaga
gcaggcaggc
tggctctgag
tggtgcattg
ttcagactcc
ggttgaggca
cgagctgtat
tgttgactgc
agaggggacc
gaatgtcttc
caaagcaggg
Abbildung 17: Bovine testis satellite I Repeatsequenz einschließlich der Analysesequenz
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
tggtggtcac
gctatatgat
gtcgaaaggg
cctcgagagg
gatctggaca
cgcacctcag
ccacattccg
acctctcgaa
gatcggaaaa
tctcgagagg
tcgagaatcc
ccctttcccg
cccttggcac
aacactgagg
ggagggtcga
gatgaggccg
taggaccccg
ctccagcctg
acccctggtt
caagcg
cgccgtaact
ctacagcgcc
cctggatgcg
ttttccggca
ctcccctgct
gtctcacgaa
atttcccggt
tgaatgaagt
tcaaatacag
cgagaaaaac
tcaggagaag
acccacaaag
ccccctcctc
ttgtctggaa
gacattccag
cccctcttga
caacacgaag
ctcgacaagc
cacgtggctc
tcccacgtta
ttccccgaaa
tgagcccttt
ggggttcccg
acgtggcctc
taagaacccg
gggcagtttt
ggcctctctc
ccccgtcacc
ggaattggag
tcccggtctc
ctcccctcct
accttccggt
gtgggtggtt
atgcccggac
tccgtgcatc
cccggggaca
Abbildung 18: Bos taurus α-Satellite I Repeatsequenz einschließlich der Analysesequenz
77
Material und Methoden
3.5.3 Primer Design, PCR Amplifikation und Gelelektrophorese der DNA von
bisulfitbehandelten Oozyten und bovinem Uterusgewebe
Die Primer für die PCR-Reaktion der bisulfitbehandelten Oozyten DNA wurden der Arbeit
KANG et al. (2005) entnommen, der diese erfolgreich an bovinen Embryonen verwendete.
Nach Modifizierung der Annealing Temperatur und Zyklenzahl wurden die Primer für die
eigene Analyse eingesetzt (Tab. 8).
Tabelle 8: Verwendete Primerpaare
Gene
Primersequenzen
Primerpaar 1
Bovine testis
satellite I
Sequenz
F:5`-AATACCTCTAATTTCAAACT-3`
R: 5`-TTTGTGAATGTAGTTAATA-3`
Primerpaar 2
F: 5`-GATGTTTTYGGGGAGAGAGG
Bos taurus αR: 5`-CCRATCCCCTCTTAATAAAAACC
Satellite I
Sequenz
Annealing
temp./
Zyklenzahl
49°C
35
61°C
35
O FragmentA
größe
5
211bp
5
154bp
OA = Oozytenanteile; bp = Basenpaare
Für eine PCR Reaktion wurde ein MM mit einem Volumen von 47µl und zusätzlich 3µl der
behandelten DNA in ein 0,6ml Mikroeppendorfgefäß pipettiert. Die einzelnen PCRReaktionen sind in Tabelle 9 aufgeführt.
Tabelle 9: PCR Zyklus für die Amplifikation der genspezifischen Transkripte
Gentranskript
Primerpaar 1
Primerpaar 2
Denaturation
95°C 2min
95 C 2min
Denaturation
Primer Annealing
DNA Extension
Zyklenzahl
Denaturation
Letzte Extension
Endtemperatur
95°C 15sek
49°C 20sek
72°C 15sek
35
98°C 15sek
72°C 10min
4°C
95oC 15sek
61°C 20sek
78
o
72oC 15sek
35
98°C 15sek
72°C 10min
4°C
Material und Methoden
Im Anschluss daran erfolgte eine Gelelektrophorese zur Bestimmung der Bandengröße der
PCR-Produkte. Desweiteren wurden die amplifizierten PCR-Produkte für die nachfolgende
Ligation mittels Wizard® SV Gel und PCR Clean-Up System Kit (Promega, USA) aufgereinigt. Dazu wurden die einzelnen Proben in ein 1,5ml Eppendorfgefäß überführt, mit
300µl Binding Buffer versehen und für 20min bei 65°C inkubiert. Im nächsten Schritt wurden
die Proben auf eine Säule gegeben, für 1min. bei Raumtemperatur inkubiert und bei 14 000
U/Min zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und anschließend zweimal mit 700
bzw. 500µl Wash-Solution gewaschen und für 1 bzw. 6min. bei 14 000 U/min zentrifugiert.
Die Säule wurde für den nächsten Schritt in ein neues 1,5 ml Eppendorfgefäß gestellt und mit
50µl nucleasefreiem Wasser versehen, für 1min inkubiert und wiederum bei 14 000 U/Min
zentrifugiert. Im Anschluss daran erfolgte die Bestimmung der DNA-Konzentration des
DNA-Eluat mittels NanoDrop® Spektrophotometer (NanoDrop® ND-1000).
3.5.3.1 Gelelektrophorese der PCR Produkte
Für die Analyse der PCR Produkte mittels Gelelektrophorese wurde ein 2% Agarosegel
gegossen. Hierzu wurden 2g Agarose in 100 ml TBE-Puffer gegeben und zum Lösen in einer
Mikrowelle kurz aufgekocht. Anschließend wurde die Lösung auf ca. 65°C abgekühlt, 2µl
Ethidiumbromid unter einer Dampfabzugshaube hinzupipettiert und in eine Gelkammer mit
einem Probenkamm gegossen. Nach ca. 30min bei Raumtemperatur war das Gel erstarrt.
Nach Entfernung des Probenkamms wurde das Gel mit 1x Tris Puffer übergossen. Zur
Analyse der einzelnen PCR Produkte wurden 10µl der Probe entnommen, mit 5µl Ladepuffer
gemischt und in die einzelnen Probentaschen des Agarosegels pipettiert.
In der ersten Probentasche befand sich ein 100 bp-DNA-Marker (100bp DNA-Ladder,
Invitrogen) zur Bestimmung der Fragmentgrößen, in der letzten Tasche Aqua bidest. als
Negativkontrolle. Im Anschluss daran wurde das Gel mit einer Spannung von 100 V für
30min an eine Spannungsquelle (PP 279, VHN Elektroforese, Daela Aps Dänemark)
angeschlossen. Die einzelnen Gelfragmente wurden mit Hilfe eines UV-Transilluminators
sichtbar gemacht, mit einer CCD Kamera (Fusion -SL, 3500 WL, Vilber Lourmat,
Eberhardzell) aufgenommen und mit dem IPLab Spectrum Programm ausgewertet.
79
Material und Methoden
Ligation von PCR-Produkten in das pGEM®T-easy Vektor System
3.6
Die PCR Produkte der Bisulfit behandelten Oozyten-DNA wurden für die Ligation über
Nacht bei 4°C inkubiert. Für die Ligation wurde 1µl (10ng/µl) des gereinigten PCR-Produktes
in 9µl Ligationsansatz aufgenommen und in einen 1,5ml Tube pipettiert. Der Ligationsansatz
setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen:
3.7
•
5µl 2 x Ligation Buffer
•
1µl pGEM®T-easy Vektor (50ng/µl)
•
1µl T4 Ligase (3Weiss Units/µl)
•
1µl gereinigtes PCR-Produkt
•
2µl Aqua bidest.
Transformation der PCR-Produkte in chemisch-kompetente E.coli-Bakterien
3.7.1 Präparation von chemisch-kompetenten Bakterien
Eine geringe Anzahl von tiefgefrorenen E.coli XL 10-Gold® Ultracompetent Cells
(Stratagene, CA, USA) wurde auf einer antibiotikafreien Luria-Bertani (LB)-Platte verteilt,
die bei 37°C über Nacht inkubiert wurde. Am darauffolgenden Tag wurde von einer einzelnen
Bakterienkolonie eine Vorkultur in 3ml LB-Medium angeimpft und über Nacht bei 37°C
inkubiert. Am 3. Tag wurde 1ml der über Nacht gewachsenen Bakterienkultur in einen
sterilen Kolben mit 100ml LB-Medium überführt und für 1,5–2h unter kontinuierlicher
Bewegung bei 37°C inkubiert. Im Anschluss daran wurde der Kolben vorsichtig in eine mit
Eis gefüllte Box gestellt und für 10min geschüttelt, um das Bakterienwachstum zu beenden.
Die Kultur wurde dann in zwei 50ml eisgekühlte Greinertubes überführt und für 10min bei
4000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das im Tube verbliebene
Pellet in 25ml eisgekühlter TfB1 Lösung resuspendiert. Das in der TfB1 Lösung enthaltene
CaCl2 arrangiert die nötige Transformationseffizienz. Im nachfolgenden Schritt wurde die
Lösung erneut für 10min bei 4000 U/min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das
Pellet in 10ml gekühlter TfB2 Lösung resuspendiert. Die kompetenten Bakterien wurden in
Aliquots zu je 100µl in Stickstoff schockgefroren und bis zum Gebrauch bei -80°C gelagert.
80
Material und Methoden
3.7.2 Transformation der PCR-Produkte in kompetente Bakterienzellen
Für die Ligation mittels des pGEM®T-easy Plasmid Kit wurden die E.coli Zellen auf Eis
aufgetaut. Der gesamte Ligationsansatz wurde auf die aufgetauten Bakterienzellen pipettiert
und vorsichtig für 30min auf Eis inkubiert. Nachfolgend wurden die Proben für 10min
gemischt, sodass eine gleichmäßige Verteilung der Plasmide und Bakterienzellen gewährleistet war. Die Plasmide wurden für 45sek bei 42°C im Thermoschüttler inkubiert. Dieser
Prozess wurde durch eine zweiminütige Inkubation auf Eis gestoppt. Anschließend erfolgte
die Überführung in einen 15ml Tube mit 900µl vorgewärmtem LB-Medium und eine einstündigen Inkubation bei 37°C im Schüttler. Danach erfolgte die Ausplattierung der Zellen
auf einer vorgewärmten LB-Platte mit Ampicilin (50µg/ml) und eine weitere Inkubation für
16h bei 37°C.
3.7.3 PCR Screening der transformierten Bakterienklone
Um den Transformationserfolg darzulegen, wurde ein PCR Screening der Bakterienklone
durchgeführt. Das Screening erfolgte mittels Microtiterplatte unter Verwendung der Universal
T7 und SP6 Primer. Die Amplifizierung der DNA Plasmide erfolgte sowohl vom 5`Ende als
auch vom 3`Ende. Für jede Microtiterplatte mit 96 Proben wurde ein Standard PCR
Mastermix vorbereitet. Tabelle 10 zeigt den MM für einen Bakterienklon.
Tabelle 10:
Mastermix für die PCR der Bakterienklone
Komponente
MM
Konzentration
Primer T7/SP6
1µl
20µM
MgCl2 (50mM)
1,5µl
1,5mM
10x PCR Puffer - MgCl2
dNTP`s (10mM)
Taq-Polymerase: (5U/µl)
H2O
5µl
1µl
0,5µl
39,5µl
1x
0,2µM
1U
-
Total
50µl
-
81
Material und Methoden
Primersequenzen, Annealingtemperatur, Zykluszahl und Größe der erwarteten PCR Produkte
sind in Tabelle 11 aufgeführt. Die isolierten Bakterienklone wurden mittels einer dünnen
Pipettenspitze von der LB-Platte aufgenommen und einzeln auf eine Microtiterplatte
übertragen. Dabei wurde die Pipettenspitze vorsichtig hin und her bewegt, sodass die an der
Pipettenspitze haftenden Bakterienzellen in den PCR Mix übergehen konnten.
Tabelle 11: Universal T7 und SP6 Primer
Annealing PCR
Primer
Temperatur Produkt
Primer
Primersequenz
Position
/Zyklenzahl Größe
211bp T7 Promotor
T7
ACT CAC TAT AGG GCG AAT TG
55°C
35
154bp SP6 Promotor
SP6 ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACT C
3.7.4 Analyse der sequenzierten Bakterienklone
Für die Sequenzierung wurden von 24 PCR-Produkten der Bakterienklone jeweils 40µl auf
eine Microtiterplatte gebracht und an das Max-Planck-Institut für Molekulargenetik, Dr.
Reinhardt, Frau A. Kühn und D.Kühn (Berlin-Dahlem/Köln) gesand. Die Sequenzierung
erfolgte vom 5` und 3` Ende der Plasmide, bei Verwendung der beiden Universalprimer T7
und SP6. Von jedem Bakterienklon wurden beide Sequenzpaare analysiert. Klonsequenzen
des 3`Ende wurden mittels des Computerprogrammes BiQ Analyser (Max-Planck-Institut für
Informatik, Saarland) in die komplementäre Reverse Form geschrieben. Beide Sequenzen
wurden anschließend mit der Originalsequenz verglichen. Die ausgerichteten Sequenzen
wurden dann ebenfalls mittels des BiQ Analyser Programms analysiert. Jede Konvertierung
der Cytosinmoleküle innerhalb der Sequenz wurde markiert.
3.8
Methylierungsanalyse mittels Direktsequenzierung
Die Methylierungsanalyse für die Gene SLC2A1, PRDX1 und ZAR1 erfolgte nach der
Bisulfitkonvertierung mittels der „Limiting Dilution“ Methode. Die Versuchsdurchführung
und Entwicklung der benötigten Assays für die Limiting Dilution erfolgte an der JuliusMaximilians-Universität Würzburg, Lehrstuhl für Humangenetik, Prof. Dr. T. Haaf durch
Frau Dipl. Biol. T. Hansmann.
82
Material und Methoden
Das Methylierungsmuster von SLC2A1, PRDX1 und ZAR1 wurde in ungereiften Oozyten
nach OPU von tertiären Follikeln und in in vitro gereiften Oozyten analysiert. Die
Bisulfitbehandlung der Oozyten-DNA und die anschließende Verdünnung „Limiting
Dilution“ (LD), gefolgt von einzelnen PCR-Schritten, ermöglichte die Darstellung und
Beurteilung des Methylierungsmusters von einzelnen DNA-Sequenzen in einer geringen
Menge von DNA (HEINZMANN et al., 2011).
Für diese Studie wurden jeweils 9x10 Oozyten aus den verschiedenen Untersuchungsgruppen
gepoolt. In der Untersuchung zeigten sowohl ungereifte als auch gereifte Oozyten eine
identische Menge an DNA. Ungereifte Oozyten verbleiben in der Diktyotänphase, gereifte
Oozyten in der Metaphase II mit einem sichtbaren ersten Polkörper. Somit enthält jede
untersuchte ungereifte Oozyte bzw. jeder reife Oozyte-Polkörper-Komplex vier Allele des
entsprechenden Gens, wovon zwei Allele identisch sind. Nach der LD von 10 Oozyten auf 20
Tubes enthält theoretisch jedes Reaktionsgefäß die Hälfte der DNA einer Oozyte bzw. zwei
Allele des zu untersuchenden Gens, das als DNA-Template für die PCR dient. In den meisten
Tubes fanden sich jedoch keine, in einigen nur ein und in sehr wenigen zwei Allele wieder.
Eine Ursache ist die starke Degeneration und Fragmentierung der DNA durch die chemische
Behandlung mit Natriumbisulfit, weshalb die Größe des PCR-Amplikons 300 bp nicht
überschreiten sollte. Des Weiteren kommt es durch die an die Behandlung anschließenden
Aufreinigungsschritte
zu
weiteren
DNA-Verlusten,
in
Folge
dessen
weniger
Ausgangsmaterial für die PCR zur Verfügung steht. Die auf das LD Material angewandte
sogenannte „digitale PCR“ führte zu einer binären Antwort. Entweder lag ein Produkt in dem
spezifischen Tube vor oder nicht (VOGELSTEIN und KINZLER 1999). Die Amplifikation
von einzelnen DNA-Molekülen vermeidet eine bevorzugte Vervielfachung einzelner Allele.
Im Gegensatz zur konventionellen Methode können somit auch einzelne aberrante
Methylierungsmuster erkannt werden, welche in einem großen DNA-Gemisch untergehen
und durch die normalen Allele maskiert werden würden.
Die Bisulfitkonvertierung des Oozytenpools erfolgte mittels EZ DNA Methylation-Direct Kit
(Zymo Research). Die bisulfitbehandelte DNA wurde mit dem PCR-Mastermix (Tab. 12) auf
ein Volumen von 520µl verdünnt, durch gründliches Pipettieren gemischt und auf 20 Tubes
mit je 26µl verteilt. Anschließend erfolgte eine Multiplex-PCR mit Primern für alle drei Gene,
auf die wiederum eine Singleplex-PCR der einzelnen Gene folgte.
83
Material und Methoden
Tabelle 12:
Mastermix für Multiplexreaktion
Komponente
Primer Forward/Reverse
PCR-Puffer
Platinum-Taq
MM
7µl/7µl
644µl
5,6µl
Konzentration
40µM
5 U/µl
Die Primer der Singleplex-PCR wurden so konstruiert, dass sie innerhalb des ersten
Amplikons aus der Multiplex-PCR binden (innere Primer). Zusätzlich wurden sechs
Negativkontrollen (15µl Mastermix + 10µl H2O) zur Vermeidung von Falsch-PositivenErgebnissen aufgrund von eventuellen Kontaminationen mitgeführt. Die genspezifischen
inneren Primer wurden mit der Füllsequenz markiert, welche von HAN et al. (2006) publiziert
wurde, um eine direkte Sequenzierung der CG armen DNA zu ermöglichen. Zur
Verbesserung der Sequenzqualität wurde die Füllsequenz mit einem zusätzlichen M13-tag
versetzt und als Zielbereich für die Sequenzierprimer genutzt (Heinzmann et al., 2011). Die
einzelnen PCR-Bedingungen und eingesetzten Primer für beide PCR-Durchgänge sind in
Tabelle 13 dargestellt. Tabelle 14 zeigt die Reaktionsansätze für die Singleplex-PCRs. Die
Sequenzierung der PCR-Produkte erfolgte durch einen automatischen Sequenzer ABI 3130xl
(Applied Biosystems TM).
Tabelle 13:
PCR-Bedingungen und eingesetzte Primer
Gentranskript
MultiplexPCR
Singleplex-PCR
SLC2A1
35
31
31
54°C 30sek
58oC 30sek
54oC 30sek
58oC 30sek
DNA Extension
72oC 45sek
Letzte Extension
72oC 5min
Endtemperatur
32
95oC 30sek
Denaturierung
Primer Annealing
ZAR1
95oC 5min
Anfangsdenaturation
Zyklenzahl
PRDX1
8oC
8°C
84
8oC
8oC
Material und Methoden
Tabelle 14:
Pipettierschema für die Singleplex-PCRs der Limiting Dilution
Komponente
MM
Konzentration
Primer Forward/Reverse
1µl/1µl
10µM
10x PCR Puffer - MgCl2
2,5µl
1x
dNTPs
0,5µl
10mM
Taq-Polymerase: (1U/µl)
0,2µl
1U
H2O
18,8µl
-
DNA (aus Multiplex-PCR)
1µl
-
Total
25µl
Reaktionsansatz berechnet für ein Sample
3.9
Versuchsaufbau
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, potentielle epigenetische Einflüsse in Form der DNAMethylierung entwicklungsrelevanter, nichtgeprägter Gene zu ermitteln und deren Einfluss
auf das Entwicklungspotential ungereifter und gereifter Oozyten bei präpuberalen Tieren zu
klären. Die für diese Untersuchung verwendeten Oozyten wurden mit Hilfe der OPUMethode von 6 - 9 Monate alten Kälbern gewonnen. Zur Kontrolle wurden Oozyten von
laktierenden Kühen (≥ 2. Laktation) mit der gleichen Methode gewonnen. Die gewonnenen
Oozyten wurden nach Beurteilung ihrer Entwicklungsfähigkeit entweder umgehend
entkumuliert und bei -80°C gelagert oder in TCM 199 + BSA gereift und bei vorhandenem
Polkörper ebenfalls bis zur Analyse tiefgefroren. Für den Vergleich der Oozyten von Kälbern
und adulten Kühen wurden verschiedene Analysemethoden angewandt. Mit Hilfe der Real
time PCR sollten Unterschiede im relativen Transkriptgehalt entwicklungsrelevanter Gene
(GDF9, SLC2A1, PRDX1 und ZAR1) zwischen den verschiedenen Untersuchungsgruppen aus
ungereiften und gereiften Oozyten dargestellt werden. Für die Darstellung des DNAMethylierungsstatus
der
einzelnen
Gene
und
Untersuchungsgruppen
wurde
die
Direktsequenzierung, für die Darstellung von Mikrosatelliten die Repeatanalyse verwendet.
85
Material und Methoden
Für die Bestimmung der relativen Transkriptmenge wurden mindestens 15 Einzeloozyten je
Gruppe genutzt. Zur Direktsequenzierung wurden 9 x 10 Oozyten, für die Repeatanalyse
24 Bakterienklone je Untersuchungsgruppe analysiert. Der gesamte Versuchsablauf ist in
Abbildung 19 dargestellt.
OPU an präpuberalen
Kälbern nach unterschiedlicher hormoneller
Stimulierung
OPU an adulten Kühen
nach unterschiedlicher
hormoneller Stimulierung
ungereifte und in vitro
gereifte Oozyten
ungereifte und in vitro
gereifte Oozyten
Bestimmung der relativen mRNA
Menge entwicklungsrelevanter Gene
GDF9, SLC2A1, PRDX1 und ZAR1 in
Oozyten
DNA-Methylierung der Oozyten
mittels Repeatanalyse von Bovine
testis satellite I (Genbank J00032) und
Bos tarus alpha satellite I (Genbank
AJ293510)
DNA-Methylierung mittels Limiting
Dilution von entwicklungsrelevanten
Genen
Abbildung 19: Ablauf des Versuchsvorhabens zur Analyse epigenetischer Effekte in
den Oozyten von präpuberalen und adulten Rindern
Die Ergebnisse des Projekts sollen zu einem verbesserten Verständnis des Entwicklungspotentials präpuberaler Oozyten führen. Dies könnte eine züchterische Verwendung von
präpuberalen Tieren möglich machen, was das Generationsintervall verkürzen und ein
verstärktes Nutzen des weiblichen Keimzellpotentials erlauben würde. Somit könnten von
genetisch wertvollen Tieren schon vor Erreichen der eigentlichen Zuchtreife Nachkommen
produziert werden.
86
Material und Methoden
3.10
Statistische Analyse
Die statistische Auswertung der Daten wurde mit den Programmpaketen R 2.11.1
(www.r-project.org) und JMP® 7.0.1 (www.jmp.com) durchgeführt.
Die Untersuchung des Effektes der Behandlungsgruppe auf die Follikel- und Oozytendaten
erfolgte mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse. Bei Vorliegen eines signifikanten Einflusses
wurde der Tukey-HSD-Test angewendet um Gruppenmittelwerte zu vergleichen.
Der Effekt der Behandlungsgruppen auf die nicht normalverteilten Genexpressionsdaten
wurde getrennt nach ungereiften und gereiften Oozyten mit dem nicht parametrischen
Kruskal-Wallis-Test untersucht. Bei Signifikanz wurden multiple Vergleiche zwischen den
Behandlungsgruppen mit der im R-Zusatzpaket (pgirmess) verfügbaren Funktion „kruskalmc“
durchgeführt (SIEGEL et al. 1988).
Die Auswertung der Methylierung der Repeatsequenzen sowie der Einzelgene wurden über
Kontingenzanalysen (Chi2-Test) vorgenommen. Um bei signifikantem Einfluss der Behandlungsgruppe den Vergleich einzelner Gruppen zu ermöglichen, wurde der im R-Paket {stats}
vorhandene „pairwise.prop.test“ eingesetzt. Unterschiede, die p ≤ 0,05 waren, wurden als
signifikant bewertet.
87
Ergebnisse
4
Ergebnisse
4.1
OPU an präpuberalen Kälbern und adulten (laktierenden) Kühen
Die Gewinnung von ungereiften Oozyten mittels OPU erfolgte zweimal wöchentlich über
jeweils 3 Wochen. Es wurden 4 Kälbergruppen im Alter von 6-9 Monaten und adulte Kühe (≥
2. Laktation) untersucht. Die Kälber wurden in 4 Gruppen (Kalb = keine Behandlung; FSH =
FSH-Behandlung; FSH+IGF-1 = FSH Behandlung + intraovarielle (i.o.) IGF-1 Injektion und
FSH + IGF K = FSH Gabe + i.o. 0,01 M Essigsäureinjektion) unterteilt. Um mögliche Effekte
des IGF-1 Lösungsmittels (Trägersubstanz), hier 0,01M Essigsäure (K), erfassen zu können,
wurde in der vierten Behandlungsgruppe „FSH + IGF K“ injiziert. Bei den Kühen wurden 2
Gruppen (Kuh = keine Behandlung und Kuh FSH) unterschieden.
Für den gesamten Versuch wurden im Untersuchungszeitraum zwischen Oktober 2008 und
Februar 2011 insgesamt 105 Kälber und 43 Kühe genutzt. Die Ergebnisse der Punktionen sind
in den Tabellen 15 und 16 dargestellt. Die für diese Untersuchungen gewonnenen Oozyten
wurden in die Klassen I-V (LOONEY et al. 1994, GOODHAND et al. 1999) eingeteilt, wobei
nur diejenigen der Klassen I-III für die weiteren Versuche verwendet wurden. Ungereifte und
gereifte Oozyten wurden bis zur Verwendung in den verschiedenen Versuchen bei -80°C
einzeln (Genexpressionsanalyse) oder in Pools (5-10/ Methylierungsanalyse) eingefroren.
Im Vergleich zu stimulierten Kühen (36±16) konnte für unbehandelte Kühe (38±19) eine
signifikant höhere Zahl an Follikeln punktiert werden. Weitere Signifikanzen konnten
aufgrund der Standardabweichungen in den Kälbergruppen nicht beobachtet werden.
Dennoch kann für intraovariell behandelte Kälber eine höhere Gesamtzahl an punktierten
Follikeln im Vergleich zu FSH behandelten und unbehandelten Kälbern gefunden werden. Im
Weiteren konnte für die Gruppen „Kuh“ (8±2) und „Kalb“ FSH + IGF K“ (8±2) im Vergleich
zu den Kälbergruppen „Kalb“ (5±2) und „Kalb FSH“ (6±2) eine signifikant größere Anzahl
an Follikeln je Sitzung punktiert werden. Eine signifikant höhere Anzahl an gesamten
Oozyten je Tier wurde zwischen den Gruppen „Kalb FSH + IGF K“ (33±28) vs. „Kalb FSH“
(20±17) und „Kalb FSH + IGF K“ vs. „Kuh FSH“ (19±11) gefunden. Für die Gesamtzahl an
genutzten Oozyten konnten signifikante Unter-schiede zwischen den Gruppen „Kalb FSH +
IGF K“ (26±24) und „Kalb FSH“ (15±13) beobachtet werden. Für die IVM wurden keine
signifikanten Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen festgestellt.
88
Ergebnisse
4.1.1 Übersicht zu den OPU-Ergebnissen aus den Kälber- und Kuhversuchsgruppen
Tabelle 15: Punktion präpuberaler Tiere
Punktierte
Gesamt
Gesamte
Alter
Tage
Follikel/Tier/
punktierte
Tiere
Oozyten/Tier
Gruppe
( ± SD) Follikel/Tier OPU-Sitzung
n=
( ± SD)
( ± SD)
( ± SD)
31
200 ± 27
Kalb
29±21ab
5±2c
23 ± 18abc
35
205 ± 23
Kalb FSH
6±3bc
20 ± 17bc
28±20ab
Kalb FSH
30
200 ± 26
7±2abcd
28 ± 24abc
38±27ab
+ IGF-1
Kalb FSH
27
194 ± 18
44±29ab
8±2ad
33 ± 28a
+ IGF K
(a:b:c:d p≤ 0,05); (4 Gruppen á 4-6 Tieren); jeweils über 3 Wochen
Gesamt genutzte
Genutzte Oozyten für
Oozyten/Tier Klasse
IVM Klasse 1-3/Tier
1-3 ( ± SD)
gereifte
Oozyten/Tier
16 ± 14ab
9
4
15 ± 13b
9
4
23 ± 19ab
14
5
26 ± 24a
13
5
Tabelle 16: Punktion adulter Tiere
Gruppe
Tiere
n=
Kuh
26
Gesamt
Anzahl
Gesamte
Punktierte
punktierte
Laktation
Follikel/Tier/ Oozyten/Tier
Follikel/Tier
Sitzung
()
( ± SD)
( ± SD)
3
38±19a
8±2a
b
ab
Kuh FSH
17
3
36±16
7±2
(a:b:c p≤ 0,05); (2 Gruppen á 2-3 Tieren); jeweils über 3 Wochen
28 ± 16abc
c
19 ± 11
89
Gesamt genutzte
Genutzte Oozyten für
Oozyten/Tier Klasse
IVM Klasse 1-3/Tier
1-3 ( ± SD)
gereifte
Oozyten/Tier
23 ± 13ab
12
4
ab
11
5
19 ± 11
Ergebnisse
4.2
Genexpressionsanalysen
4.2.1
Messenger RNA-Expression in ungereiften Oozyten von Kälbern und Kühen
Zur Bestimmung der relativen Transkripthäufigkeit wurden die Gene GDF9, SLC2A1,
PRDX1 und ZAR1 untersucht. Für jede Untersuchungsgruppe wurden mindestens 15
ungereifte und gereifte Oozyten analysiert. Die absolute Quantifizierung wird anhand einer
gegebenen Kalibrierkurve angegeben (PFAFFL und HAGELEIT 2001). Diese basiert in der
eigenen Untersuchung auf einer Verdünnungsreihe der RNA aus ungereiften adulten bovinen
Oozyten. Die Ergebnisse der Real-time Analyse werden in Form von Ct oder CP (=Crossing
Point) dargestellt. Sie entsprechen der Anzahl an PCR Zyklen die nötig sind, um ein
definiertes Power SYBR® Green Fluoreszenzniveau zu erreichen (PFAFFL 2004). Die
relative Transkriptmenge wird nun mittels der Ergebnisse der Ct und der Kalibrierkurve
berechnet. Alle Werte wurden auf die Transkriptmenge von Globin normalisiert. Die mRNATranskripte der unterschiedlichen Gene konnten in Oozyten aller Untersuchungsgruppen
nachgewiesen werden. In der anschließenden statistischen Analyse wurden die Ergebnisse aus
den Untersuchungsgruppen „Kuh FSH, Kalb, Kalb FSH, Kalb FSH + IGF-1 und Kalb FSH +
IGF K“ mit denen von unbehandelten Kühen verglichen.
Abbildung 20: Relativer Transkriptgehalt der GDF9-mRNA in ungereiften
Oozyten von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
90
Ergebnisse
Für das GDF9-Gen (Abb.20) konnte nach der Stimulierung eine max. Veränderung der
relativen Transkriptmenge (0,23) zwischen der Gruppe „Kalb FSH + IGF-1“ gegenüber den
unbehandelten Kälbern beobachtet werden.
Abbildung 21: Relativer Transkriptgehalt der SLC2A1-mRNA in ungereiften Oozyten
von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
Für SLC2A1 (Abb.21) wurde die höchste Differenz mit 0,19 zwischen der Gruppe „Kalb
FSH+IGF-1“ und „Kalb FSH+IGF K“ gefunden. Signifikante Unterschiede konnten für beide
Gene zwischen den einzelnen Unter-suchungsgruppen nicht dargestellt werden.
Abbildung 22: Relativer Transkriptgehalt der PRDX1-mRNA in ungereiften Oozyten
von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
91
Ergebnisse
Bei PRDX1 wurde nach der FSH Behandlung in der Gruppe „Kuh FSH“ ein Anstieg der
Transkriptmenge im Vergleich zur Gruppe „Kuh“ beobachtet (Abb. 22). Für die FSH und
i.o. behandelten Kälber zeigte sich eine Reduzierung der Transkriptmenge im Vergleich zu
unbehandelten und FSH stimulierten Kälbern. Signifikante Unterschiede zwischen den
Gruppen waren aber nicht festzustellen.
Abbildung 23: Relativer Transkriptgehalt der ZAR1-mRNA in ungereiften Oozyten
von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
Abbildung 23 zeigt den relativen Gehalt von ZAR1 in ungereiften Oozyten der verschiedenen
Versuchsgruppen. Dabei kann sowohl bei adulten wie auch bei präpuberalen Oozyten nach
der hormonellen Behandlung ein Rückgang der Transkriptmenge beobachtet werden.
Signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen wurden aber nicht gefunden.
4.2.2
Messenger RNA-Transkriptmenge in in vitro gereiften Oozyten von Kälbern
und Kühen
Für GDF9 zeigte sich nach der in vitro Reifung bei präpuberalen Oozyten der Kälbergruppen
„FSH“ und „FSH+IGF K“ eine deutliche Abnahme der mRNA-Transkriptmenge im
Vergleich zu den übrigen Kälbergruppen und den FSH-behandelten Kühen. Signifikante
Unterschiede konnten nicht nachgewiesen werden (Abb.24).
92
Ergebnisse
Abbildung 24:
Relativer Transkriptgehalt der GDF9-mRNA in in vitro gereiften
Oozyten von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
Ein deutlicher Unterschied für den relativen Transkriptgehalt von SLC2A1 in in vitro gereiften
Oozyten wurde nur für die Gruppe Kalb „FSH+IGF-1“ gegenüber den übrigen
Untersuchungsgruppen dargestellt. Im Gesamtergebnis wurden aber keine signifikanten
Unterschiede festgestellt (Abb. 25).
Abbildung 25: Relativer Transkriptgehalt von SLC2A1 in in vitro gereiften Oozyten
von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
93
Ergebnisse
Im Vergleich zur jeweiligen Kontrollgruppe wurde in den Oozyten von behandelten
Versuchstieren in gereiften Oozyten eine zum Teil deutlich höhere PRDX1 Transkriptmenge
beobachtet. Zwischen den Vergleichsgruppen wiesen Oozyten aus der Gruppe „Kalb“ eine
geringere Transkriptmenge im Vergleich zur Gruppe „Kuh“ auf. Signifikante Unterschiede
wurden aber nicht gefunden (Abb. 26).
Abbildung 26: Relativer Transkriptgehalt von PRDX1 in in vitro gereiften Oozyten
von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
Abbildung 27 stellt den relativen Transkriptgehalt von ZAR1 in in vitro gereiften Oozyten dar.
Abbildung 27: Relativer Transkriptgehalt von ZAR1 in in vitro gereiften Oozyten
von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
94
Ergebnisse
Für alle behandelten Gruppen wurde ein Rückgang der Transkriptmenge im Vergleich zur
unbehandelten Gruppe gefunden. Die Abnahme der Transkriptmenge war jedoch nicht
signifikant.
4.2.3
Vergleichende mRNA-Transkriptmenge in Oozyten präpuberaler und adulter
Rinder vor und nach in vitro Maturation
Die relative Menge spezifischer Gentranskripte in Oozyten vor und nach in vitro Reifung
wurde innerhalb der jeweiligen Versuchsgruppen miteinander verglichen. Für GDF9 wurde in
allen Untersuchungsgruppen nach Reifung der Oozyten eine signifikante Abnahme der
relativen Transkriptmenge beobachtet (Abb. 28).
a
a
a
a
b
a
a
b
b
b
b
b
Abbildung 28: Relative Transkriptmenge von GDF9 vor und nach in vitro Reifung
innerhalb der Versuchsgruppen (n = 15;  ± SD; a:b p≤ 0,05)
Ein Vergleich der relativen SLC2A1-Transkripte in Oozyten der verschiedenen Untersuchungsgruppen nach der in vitro Maturation ergab, mit Ausnahme der beiden intraovariell
behandelten Versuchsgruppen, eine signifikante Abnahme (Abb.29).
95
Ergebnisse
a
a
a
a
b
b
b
b
Abbildung 29: Relative Transkriptmenge von SLC2A1 vor und nach in vitro Reifung
innerhalb der Versuchsgruppen (n = 15;  ± SD; a:b p≤ 0,05)
Für PRDX1 wurde nach Reifung der Oozyten eine signifikante Abnahme der relativen
Transkriptmenge innerhalb der verschiedenen Untersuchungsgruppen, mit Ausnahme der
Gruppe „Kalb FSH+IGF K“, beobachtet (Abb. 30).
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
Abbildung 30: Relative Transkriptmenge von PRDX1 vor und nach in vitro Reifung
innerhalb der verschiedenen Versuchsgruppen
(n = 15;  ± SD; a:b p≤ 0,05)
96
Ergebnisse
Der Einfluss der in vitro Reifung auf die Transkriptmenge von ZAR1 ist in Abbildung 31
dargestellt. Für alle Versuchsgruppen wurde ein signifikanter Rückgang nach der in vitro
Reifung beobachtet.
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
b
Abbildung 31: Relative Transkriptmenge von ZAR1 vor und nach in vitro Maturation
in den verschiedenen Versuchsgruppen (n = 15;  ± SD; a:b p≤ 0,05)
4.3
Methylierungsanalysen
4.3.1 Bestimmung der Methylierung von Repeatsequenzen in präpuberalen und
adulten bovinen Oozyten
Die Methylierung der Oozyten-DNA wurde u.a. an zwei DNA-Repeatsequenzen untersucht,
die der Publikation von KANG et al. (2005) entnommen wurden. Zur Analyse wurden
ungereifte und gereifte Oozyten von präpuberalen und adulten Rindern der morphologischen
Qualitätsklassen 1-3 verwendet. Die Methylierungsanalyse der Bovine testis Satellit I DNA,
segment 2, BOVRS71T2 Genbank: J00032.1 erfolgte an einem 211 bp großen Segment
(Abb. 32). Die Analyse der Bos taurus α-Satellite I DNA, clone pBtKB5, Genbank: AJ
293510.1 an einem 154 bp großen Segment (Abb. 33). CpGs sind in beiden
Untersuchungssequenzen grün markiert. Für die statistische Analyse wurde die Summe der
Methylierung der CpGs in den Versuchsgruppen miteinander verglichen.
97
Ergebnisse
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
ccctcatctc
cggtttctca
cgggtctcca
atctggcctc
agccctgggt
aagccaggga
gaagagggcc
gatcgcaggg
tggaactccg
ttggaacctg
attcacaggg
gggaaatcgg
gtgagaccgg
g
ccgatgacgg
cgaggtacga
tgcgagtaac
gagacgtgtt
ccctcgactt
aactggaggt
tcatctccag
tccctgcaga
cttgcctctc
gggttttttc
gtggagttcg
ggtcccacgg
cctcatcctg
gggagtctag
cggcgaggtc
gagggggagc
gaagagggtc
gtgcaggtga
gggaggggcc
ttgaggcagg
ctggggacag
gagatgtccc
cgaacggtgc
gagaggtgtc
aacgtggaac
aggtgcgacc
gggttgttct
agtgagcctc
gcgccattgc
tctcgaggtc
cctcaggggg
tctcgggact
aaccgcaggg
gagagtcagg
cggggagaga
acggagaagc
cgggcatcgg
cacccacgag
ggaaggcaac
cgagcggcgg
tcgtggggcg
tcccgagcca
ttccccgggt
cttctcgtgg
ccactgggct
tacctctgat
cctcgtcttg
ggccgcttgt
tgccccttcg
gttcttatca
gccacgtctg
cccttccaga
ccccagtgtg
ccagggaagt
tgggaggaga
gcaggcaggc
tggctctgag
tggtgcattg
ttcagactcc
ggttgaggca
cgagctgtat
tgttgactgc
agaggggacc
gaatgtcttc
caaagcaggg
Abbildung 32: Genomische Region einschließlich der Bovine testis satellite I Sequenz
(gelb) und der CpGs (grün)
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
tggtggtcac
gctatatgat
gtcgaaaggg
cctcgagagg
gatctggaca
cgcacctcag
ccacattccg
acctctcgaa
gatcggaaaa
tctcgagagg
tcgagaatcc
ccctttcccg
cccttggcac
aacactgagg
ggagggtcga
gatgaggccg
taggaccccg
ctccagcctg
acccctggtt
caagcg
cgccgtaact
ctacagcgcc
cctggatgcg
ttttccggca
ctcccctgct
gtctcacgaa
atttcccggt
tgaatgaagt
tcaaatacag
cgagaaaaac
tcaggagaag
acccacaaag
ccccctcctc
ttgtctggaa
gacattccag
cccctcttga
caacacgaag
ctcgacaagc
cacgtggctc
tcccacgtta
ttccccgaaa
tgagcccttt
ggggttcccg
acgtggcctc
taagaacccg
gggcagtttt
ggcctctctc
ccccgtcacc
ggaattggag
tcccggtctc
ctcccctcct
accttccggt
gtgggtggtt
atgcccggac
tccgtgcatc
cccggggaca
Abbildung 33: Genomische Region einschließlich der Bos taurus α-Satellite I Sequenz
(gelb) und der CpGs (grün)
Für die Amplifizierung mittels PCR wurde für beide Sequenzen jeweils ein Primerpaar nach
der Vorlage von KANG et al. (2005) eingesetzt. Die Primersequenzen sind unter Kapitel 3.6.3
angegeben. Die PCR der bisulfitbehandelten DNA wurde mit genomischer DNA aus Blut
etabliert. Abbildung 34 zeigt exemplarisch beide Fragmente mit ihrer entsprechenden
Fragmentgröße.
DNALadder BTS
211 Bp
200 Bp
BTαS
154 Bp
100 Bp
Abbildung 34: Repräsentatives Fragment der Bovine testis satellite I (BTS) und der
Bos taurus α-Satellite I (BTαS) Sequenz
98
Ergebnisse
4.4
Methylierungsmuster von zwei Repeatsequenzen in unterschiedlichen
Entwicklungsstadien
der
Oozyte
und
Versuchstiergruppen
nach
morphologischer Klassifizierung
4.4.1
Methylierung in ungereiften und gereiften präpuberalen und adulten bovinen
Oozyten
Die Analyse der DNA-Methylierung beider Repeatsequenzen erfolgte an insgesamt
420 präpuberalen und adulten bovinen Oozyten nach Bisulfitbehandlung, PCR Amplifikation,
Subklonierung in ein Plasmid und Einzelklonsequenzierung von 24 DNA-Klonen. Als interne
Kontrolle diente die Bestimmung des Methylierungsmusters in Blastozysten und Plazentagewebe.
Für die Analyse wurden 2100 DNA-Klone aufgenommen. Davon wurden 1536 der
Einzelsequenzierung zugeführt und in die statistische Auswertung einbezogen. Abbildung 35
zeigt beispielhaft die BiQ-Auswertung der sequenzierten DNA-Klone einer Versuchsgruppe,
von denen 2 Klone nicht bestimmt werden konnten. Dabei stellen die schwarzen Punkte den
methylierten Zustand der CpGs an der jeweiligen Position der Sequenz dar, während offene
Punkte die demethylierte Situation anzeigen.
Abbildung 35: Methylierungssituation an CpGs von DNA-Klonen nach der BiQ-Auswertung der Bovine testis satellite I Sequenz (n=22 Klone)
99
Ergebnisse
4.4.1.1
Bovine testis satellite I DNA, segment 2 (BTS)
Abbildung 36 zeigt die DNA-Methylierung der BTS-Sequenz in ungereiften Oozyten der
morphologischen Klassen 1-3. Die Gruppe “Kalb” (75,6%) wies eine signifikant höhere
Methylierung im Vergleich zu den Gruppen “Kuh” (53,8%) und “Kalb FSH+IGF-1” (56,1%)
auf. Ein signifikanter Unterschied wurde auch zwischen den Gruppen “Kalb FSH + IGF-1”
(56,1%) und “Kalb FSH+IGF K” (74,1%) gefunden.
abcd
a
b
ab
c
cd
Abbildung 36: DNA-Methylierung der BTS-Sequenz ungereifter Oozyten (n=5)
der morphologischen Klasse 1 – 3 in den Untersuchungsgruppen
(p≤ 0,05; n=24 Klone)
Um den Einfluss der DNA-Methylierung in den Oozyten für die Bovine testis satellite
Sequenz im Verhältnis zur morphologischen Klassifizierung zu untersuchen, wurden diese in
zwei Gruppen aufgeteilt: Oozyten der Klasse 1–2 weisen eine gute, Oozyten der Klasse 3 eine
reduzierte Entwicklungskapazität in der IVF auf.
Die Ergebnisse der Methylierungsanalyse von ungereiften Oozyten der Klassen 1-2 zeigten in
der Gruppe „Kuh“ ein fast ausgeglichenes Verhältnis der Methylierung von 49,6%
methylierter und 51,4% demethylierter CpGs. Ein signifikanter Unterschied der Methylierung
wurde zwischen den Oozyten der Gruppe „Kalb“ (74,8%) und „Kuh“ (49,6%) sowie
zwischen FSH stimulierten Kühen (69,8%) und nichtstimulierten Kühen (49,6%) beobachtet
(Abb. 37).
100
Ergebnisse
ab
a
abc
abc
abc
c
Abbildung 37: DNA-Methylierungsgrad der BTS-Sequenz in ungereiften Oozyten
(n=5) mit gutem Entwicklungspotential der verschiedenen Versuchsgruppen (a,b,c p≤ 0,05; n=24 Klone)
Bei ungereiften Oozyten der morphologischen Klasse 3 wurde ein statistisch signifikanter
Unterschied zwischen den Untersuchungsgruppen beobachtet. Oozyten der Gruppe „Kalb“
wiesen mit 77% gegenüber den Gruppen „Kalb FSH+IGF-1“ mit 52,9% und „Kuh“ mit
56,6% eine signifikant höhere Methylierung auf. Oozyten aus der Gruppe „Kalb FSH“ wiesen
mit 66,4% gegenüber der Gruppe „Kalb FSH+IGF-1“ (52,9%) eine signifikant höhere,
gegenüber der Gruppe „Kalb FSH+IGF K“ mit 81,9% eine signifikant niedrigere
Methylierung auf. Ein signifikanter Unterschied wurde auch zwischen der Gruppe „Kalb
FSH+IGF K“ (81,9%) und „Kalb FSH+IGF-1“ (52,9%) nachgewiesen (Abb. 38).
a
ab
abcd
b
c
cd
Abbildung 38: DNA-Methylierungsmuster der BTS-Sequenz in ungereiften Oozyten
(n=5) mit eingeschränktem Entwicklungspotential (Klasse 3) der
verschiedenen Versuchsgruppen (a:b:c:d p≤ 0,05; n=24 Klone)
101
Ergebnisse
Beim
Vergleich
des
Methylierungsmusters
zwischen
ungereiften
Oozyten
der
morphologischen Klassen 1-2 und 3 ergaben sich nur geringe Unterschiede. Die Gruppe
„Kalb FSH+IGF-1“ zeigte eine um 7,7% reduzierte, die Gruppen „Kuh“ und „Kalb FSH+IGF
K eine um 7% bzw. 12,3% erhöhte Methylierung. Jedoch wurden keine signifikanten
Unterschiede gefunden (Abb. 39).
Abbildung 39: Vergleichende Darstellung DNA-Methylierung der BTS- Sequenz in
ungereiften Oozyten (n=5) mit unterschiedlichem Entwicklungspotential in den verschiedenen Versuchsgruppen (n=24 Klone)
Innerhalb der Versuchsgruppen wurde für die DNA-Methylierung der BTS-Sequenz aus
Oozyten Klasse 1-2 eine signifikante Zunahme in der Gruppe „Kuh“ (49,6% vs. 64,9%) und
eine signifikante Abnahme in den Gruppen „Kalb FSH+IGF-1“ (60,6% vs. 71,7%) und
„Kalb“ (74,6% vs. 53,3) nach der in vitro Reifung beobachtet (Abb. 40).
a
b
b
a
a
b
Abbildung 40: DNA-Methylierung der BTS-Sequenz zwischen ungereiften und
gereiften Oozyten (n=5) der Klasse 1 - 2 der verschiedenen
Untersuchungs-Gruppen (a:b p≤ 0,05; n = 24)
102
Ergebnisse
Für in vitro gereifte Oozyten der Klasse 1-2 der verschiedenen Untersuchungsgruppen konnte
zwischen der Gruppe „Kalb“ (53,3%) und „Kalb FSH+IGF-1“ (71,7%) ein signifikanter
Unterschied in der Methylierung nachgewiesen werden (Abb.41).
a
ab
ab
ab
ab
b
Abbildung 41: DNA-Methylierungsgrad des BTS-Sequenz in gereiften Oozyten (n=5)
mit gutem Entwicklungspotential in den verschiedenen Versuchsgruppen (a,b p≤ 0,05; n=24)
4.4.1.2
Bos taurus α-Satellite I DNA, clone BtKB5 (BTαS)
Das Methylierungsmuster der Bos taurus α-Satellite I Sequenz in ungereiften Oozyten der
Klasse 1-3 ist in Abbildung 42 dargestellt. Beim Vergleich der Gruppen wurden keine
signifikanten Unterschiede beobachtet. Eine Tendenz wurde für die Gruppen „Kuh FSH“
(76,6%) vs. „Kalb FSH“ (61,5%) bei einem p=0,06 festgestellt.
Abbildung 42: DNA-Methylierung der BTαS-Sequenz in ungereiften Oozyten(n=5) der
morphol. Klassen 1 – 3 in den Untersuchungsgruppen (n=24 Klone)
103
Ergebnisse
Für die weitere Analyse wurden die Oozyten nach ihrer morphologischen Klassifizierung in
die Klasse 1–2 und 3 eingeteilt, um etwaige Einflüsse hinsichtlich der Methylierung zu bestimmen. Für die Bos taurus α-Satellite I Sequenz wurde bei ungereiften Oozyten mit gutem
Entwicklungspotential (Klasse 1-2) ein Unterschied der Methylierung von 10,3% zwischen
den Gruppen „Kuh“ und „Kuh FSH“ beobachtet. Innerhalb der Kälbergruppen „Kalb“ und
„Kalb FSH+IGF-1“ betrug die größte Differenz 7% (Abb. 43). Signifikante Unterschiede
zwischen den Gruppen wurden aber nicht gefunden.
Abbildung 43: DNA-Methylierung der BTαS-Sequenz in ungereiften Oozyten (n=5)
der morphol. Klasse 1-2 der verschiedenen Versuchsgruppen
(n=24 Klone)
Für ungereifte Oozyten mit reduziertem Entwicklungspotential (Klasse 3) wurde für alle
Gruppen, ausschließlich der Gruppe „Kalb FSH“ (61,4%), eine Methylierung von > 70,1%
gefunden (Abb. 44). Statistische Signifikanzen konnten nicht berechnet werden.
Abbildung 44:
DNA-Methylierung der BTαS-Sequenz in ungereiften Oozyten (n=5)
der morphol. Klasse 3 der verschiedenen Versuchsgruppen
(n=24 Klone)
104
Ergebnisse
Abbildung 45 zeigt das vergleichende Methylierungsmuster bei ungereiften Oozyten mit
unterschiedlichem Entwicklungspotential. Dabei wiesen Oozyten der Klasse 3 ein gleichbleibendes bzw. geringgradig höheres Methylierungsmuster im Vergleich zu Oozyten der
Klasse 1-2 auf. Eine Abnahme der Methylierung zeigte sich bei Oozyten der Gruppe „Kalb
FSH“ (72,8% vs. 61,4%), welche aber nicht signifikant war.
Abbildung 45: Vergleichende Darstellung der Methylierung in ungereiften Oozyten
(n=5) der morphol. Klasse 1-2 und der Klasse 3 der verschiedenen
Versuchsgruppen (n = 24 Klone)
Für die Bos taurus α-satellite I Sequenz wurde in allen Untersuchungsgruppen bei Oozyten
mit guter Entwicklungskompetenz nach in vitro Reifung eine Reduzierung der Methylierung
beobachtet.
a
a
b
b
b
Abbildung 46: Methylierungsverhältnis der BTαS-Sequenz von ungereiften und
gereiften Oozyten (n=5) mit gutem Entwicklungspotential der
verschiedenen Untersuchungsgruppen (a:b p≤ 0,05; n=24 Klone)
105
Ergebnisse
Ein signifikanter Unterschied der Methylierung wurde bei Oozyten der FSH behandelten
Gruppe „Kuh FSH“ (76,7% vs. 52,5) und „Kalb FSH“ (72,8% vs. 57,8%) nachgewiesen
(Abb. 46).
Für gereifte Oozyten mit gutem Entwicklungspotential wurde zwischen den Gruppen „Kuh“
und „Kuh FSH“ ein Unterschied in der Methylierung von 10,3% beobachtet. Innerhalb der
Kälbergruppen betrug die größte Differenz zwischen „Kalb“ und „Kalb FSH+IGF-1“ 13,2%.
Signifikante Unterschiede konnten aber nicht festgestellt werden (Abb. 47).
Abbildung 47: DNA-Methylierung der BTαS-Sequenz in gereiften Oozyten (n=5) der
morphol. Klasse 1 - 2 der verschiedenen Versuchsgruppen (n = 24)
4.5
DNA-Methylierung ungeprägter Gene
präpuberalen und adulten bovinen Oozyten
in
ungereiften
und
gereiften
Erstmalig wurde das Methylierungsmuster von individuellen Allelen von drei nichtgeprägten
Genen (SLC2A1, PRDX1 und ZAR1) analysiert. Dies erfolgte an der Julius-MaximiliansUniversität Würzburg, am Lehrstuhl für Humangenetik. Die verwendeten Primer sind im
Anhang 8.2 angegeben. Bei der Bestimmung des Methylierungsmusters wurden ungereifte
und gereifte Oozyten der morphologischen Klasse 1-2 von präpuberalen und adulten Rindern
genutzt. Für die Analyse wurde ein Pool von zehn Oozyten je Untersuchungsgruppe für die
Limiting Dilution Methode eingesetzt. Jede diploide Oozyte besitzt 4 Kopien für jedes Gen.
Für die drei untersuchten Gene liegen in den zehn Oozyten insgesamt 120 mögliche DNAMoleküle vor.
106
Ergebnisse
Die Direktsequenzierung der amplifizierten Allele offenbarte den Methylierungsstatus von 14
CpGs innerhalb von SCL2A1, 17 CpGs innerhalb von PRDX1, und 18 CpGs innerhalb von
ZAR1 (Abb. 48).
Abbildung 48: Repräsentatives Methylierungsmuster von ungereiften und gereiften
adulten bovinen Oozyten. Jede Linie zeigt ein Allel nach der Limiting
Dilution für das entsprechende Gen
Für die Auswertung wurde die Summe der analysierten CpGs mit der Anzahl einzelner CpGFehler verglichen. Zusätzlich wurde die Anzahl von Allelen mit abnormaler Methylierung
betrachtet. Hierbei wurden Allele als abnormal und damit als Epimutation definiert, wenn
mehr als 50% ihrer CpG-Dinukleotide methyliert waren. Für ungereifte Oozyten wurden
durchschnittlich 43 Allele je Gruppe bestimmt, für gereifte 49 Allele pro Gruppe. Für alle drei
Gene wurden in ungereiften und gereiften Oozyten keine abnormalen Allele beobachtet.
Somit kann für alle drei Gene von einer Hypomethylierung ausgegangen werden. Für die
Gesamtzahl an einzelnen CpG-Fehlern lässt die Gruppe „Kalb FSH+IGF K“ für gereifte
Oozyten eine mögliche Tendenz für eine geringere Anzahl an einzelnen CpG-Fehlern (0,3%)
erkennen (Tab. 17: DNA-Methylierung von ungeprägten Genen in ungereiften und gereiften
Oozyten von präpuberalen und adulten Rindern). Signifikanten Unterschiede konnten nicht
beobachtet werden.
107
Ergebnisse
Tabelle 17: DNA-Methylierung von ungeprägten Genen in ungereiften und gereiften Oozyten
Anzahl der
untersuchten Pools
Gruppe
Anzahl der
analysierten
CpGs
Anzahl
einzelner
CpG-Fehler/
methylierter
CpGs (%)
Anzahl der
analysierten
Allele
Anzahl der
abnormalen
Allele (>50%
Methylierung)
SLC2A1
14 CpGs
(%)
PRDX1
17 CpGs
(%)
Ungereifte
Oozyten
Gereift
Oozyten
Ungereifte
Gereifte
Kalb
5
4
84
196
119
170
Kalb FSH
5
4
364
98
272
Kalb
FSH+IGF-1
3
5
252
238
Kalb
FSH+IGF K
4
3
168
Kuh
5
5
Kuh FSH
5
4
Ungereifte
Total
(%)
Ge- Unge
reifte -reifte
Gereifte
54
450
257
816
85
234
198
870
381
85
102
198
324
535
664
182
17
170
198
270
383
622
462
462
306
306
504
504
1272
1272
280
392
170
170
360
432
810
994
Kalb
1 (1,2)
0 (0)
0 (0)
3
(1,8)
0 (0)
4
(0,9)
(0,4)
Kalb FSH
2 (0,5)
2(2)
2
(0,7)
1
(1,2)
0 (0)
2
(1,0)
(0,5)
Kalb
FSH+IGF-1
6 (2,4)
4
(1,7)
0 (0)
2
(2,0)
0 (0)
2
(0,6)
(1,1)
Kalb
FSH+IGF K
1 (0,6)
1
(0,5)
0 (0)
0 (0)
3 (1,5)
1
(0,4)
(1,0)
Kuh
5 (1,1)
9
(1,9)
0 (0)
0 (0)
6 (1,2)
5
(1,0)
11
(0,9)
14
(1,1)
Kuh FSH
4 (1,4)
6
(1,5)
1
(0,6)
0 (0)
5 (1,4)
5
(1,2)
10
(1,2)
11
(1,1)
Kalb
6
18
7
10
3
25
16
53
Kalb FSH
26
7
16
5
13
11
55
23
Kalb
FSH+IGF-1
18
17
5
6
11
18
34
41
Kalb
FSH+IGF K
12
13
1
10
11
15
24
38
Kuh
33
33
18
18
28
28
79
79
Kuh FSH
20
28
10
10
20
24
50
62
Kalb
0
0
0
0
0
0
0
0
Kalb FSH
0
0
0
0
0
0
0
0
Kalb
FSH+IGF-1
0
0
0
0
0
0
0
0
Kalb
FSH+IGF K
0
0
0
0
0
0
0
0
Kuh
0
0
0
0
0
0
0
0
Kuh FSH
0
0
0
0
0
0
0
0
108
Unge- Gereifte reifte
ZAR1
18 CpGs
(%)
1
4
6
4
7 (0,9)
5 (1,3)
8 (1,2)
2 (0,3)
Diskussion
5
Durch
Diskussion
die
Nutzung
präpuberaler
Kälberoozyten
in
der
Rinderzucht
kann
das
Generationsintervall von 25-28 Monaten auf ~9 Monate verkürzt werden. Dafür ist aber eine
erhebliche Verbesserung der Entwicklungskapazität von Oozyten aus präpuberalen
Spendertieren erforderlich. Präpuberale Oozyten vom Rind stellen zudem ein gutes Modell
für grundlegende Studien zur Erlangung der Entwicklungskompetenz präpuberaler
Säugeroozyten dar, da sie relativ einfach gewonnen werden können und die in vitro
Produktionssysteme für Rinderembryonen gut entwickelt sind.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Versuche unternommen, um Zahl und Qualität
präpuberaler Oozyten zu verbessern und die daraus resultierende Anzahl in vitro produzierter,
transfertauglicher Blastozysten zu erhöhen. Durch i.m Applikation von follikelstimulierenden
Hormonen (ARMSTRONG et al. 1997; FRY et al. 1998; KUWER et al. 1999) und
intraovarieller (i.o.) Injektion von IGF-1 (OROPEZA 2004) können die Zahl der Follikel und
die Qualität der daraus gewonnenen Oozyten gesteigert und dadurch mehr entwicklungsfähige
Embryonen produziert werden. Die Zugabe von FSH, Cystein und EGF zu den Kulturmedien
in der in vitro Produktion führte zu einer verbesserten Entwicklungsfähigkeit der von Kälbern
gewonnenen Oozyten (REVEL et al. 1995; KHATIR et al. 1996; PALMA et al. 2001;
DONNAY
et
al.
2004).
Ähnliches
wurde
durch
Kokultur
mit
einem
Granulosazellenmonolayer im Kulturmedium erreicht (PONEBŠEK 2005).
Jedoch wurde auch in vielen Untersuchungen eine geringere Blastozystenrate aus
präpuberalen Oozyten (~10%) im Vergleich zu adulten (~30%) erzielt (TANEJA et al. 2000;
OROPEZA et al. 2004; ZARAZA 2009). Als mögliche Ursache für die niedrigere
Entwicklungsrate juveniler Oozyten können epigenetische Veränderungen, insbesondere im
DNA-Methylierungsmuster,
DNA-Methylierung
Genexpression
und
sind
Entwicklungsstörungen
in
die
von
und
Betracht
daraus
zentraler
gezogen
resultierenden
Bedeutung
notwendig
Entwicklungsvorgängen.
werden.
109
zur
für
Verständnis
der
Regulationsmechanismen
der
das
gezielten
Das
Erkennen
möglicher
Beeinflussung
von
Diskussion
Die entwicklungsabhängige Methylierung an Position 5 des Cytosins von CpG-Dinukleotiden
spezifischer Gene ist für eine ungestörte Säugerentwicklung von wesentlicher Bedeutung; sie
unterliegt einer strengen Regulation (LI et al. 1992; OKANO et al. 1999; KLOSE und BIRD
2004).
In der vorliegenden Arbeit wurde mittels der „Limiting Dilution Methode“ das
DNA-Methylierungsmuster der entwicklungsrelevanten, nichtgeprägten Gene SLC2A1,
PRDX1 und ZAR1 untersucht. Zusätzlich wurde mittels klassischer Methylierungsanalyse
über Bisulfitsequenzierung zweier Repeatsequenzen des bovinen Genoms ein Einblick in das
globale Methylierungsmuster des präpuberalen Oozytengenoms erhalten. Für die Untersuchungen wurden Oozyten präpuberaler und adulter Tiere, mit oder ohne hormonelle
Behandlung sowie vor und nach in vitro Reifung miteinander verglichen. Es sollte geklärt
werden, ob sich das Methylierungsmuster in Oozyten präpuberaler Tiere von dem adulter
Tiere unterscheidet und möglicherweise in der Erlangung der vollen Entwicklungskompetenz
präpuberaler Oozyten eine wesentliche Rolle spielt. Über diesen Aspekt wurde bisher in der
internationalen Literatur noch nicht berichtet.
Weiterhin wurden mittels Real-time PCR (RT-PCR) die relativen mRNA Transkriptmengen
der vier genannten Gene in den unterschiedlichen Behandlungsgruppen untersucht. Die
ermittelten
mRNA-Expressionsmuster
aus
den
Oozyten
der
verschiedenen
Untersuchungsgruppen und Entwicklungsstadien wurden miteinander verglichen. Die
erzielten Daten erlauben Rückschlüsse auf den transkriptionellen Status der Gene in Oozyten
unter verschiedenen hormonellen Einflüssen in Abhängigkeit vom Alter.
5.1
Follikelstimulierung, Oozytengewinnung und Maturation von präpuberalen und
adulten Rindern
Die Anzahl der Embryonen, die von einem individuellen Spendertier produziert werden kann,
steht in direktem Zusammenhang mit der Anzahl der gefundenen Oozyten. (MOTRON et al.
2005). In der Literatur wird über eine Vielzahl von Versuchen berichtet, um die Anzahl
entwicklungskompetenter Kälber- und Kuhoozyten für die in vitro Fertilisation zu steigern.
Obwohl die jeweiligen Raten für IVM und IVF bei ca. 80% liegen, erreichen auch bei adulten
Tieren nur ~30 % der eingesetzten Oozyten das Blastozytenstadium (RIZOS et al. 2002).
110
Diskussion
Verschiedene Hormonbehandlungen unter anderem mit FSH, hCG und PMSG sind zur
Steigerung der Follikelzahl und somit der Oozytenrate durchgeführt worden (BUNGARTZ et
al. 1995; MORTON et al. 2005; OROPEZA et al. 2006). Eine signifikante Zunahme der
punktierten Follikel nach FSH Stimulierung bei adulten Tieren, wie von BUNGARTZ et al.
(1995) beobachtet, konnte in den eigenen Untersuchungen nicht nachgewiesen werden.
In der vorliegenden Arbeit zeigte sich eine signifikant höhere Gesamtzahl punktierter Follikel
bei nichtbehandelten Kühen im Vergleich zu Tieren nach FSH-Stimulation. Eine signifikant
höhere Anzahl an punktierten Follikeln, je Sitzung und Tier, konnte in der Kälbergruppe
„FSH+IGF K“ und der Gruppe „Kuh“ gegenüber den Gruppen „Kalb FSH“ und „Kalb“
festgestellt werden (Tabelle 12). Keine Unterschiede wurden zwischen unbehandelten und
FSH stimulierten Kälbern gefunden, welches die Ergebnisse von KUWER (1997),
PRESICCE et al. (1997) und TECHAKUMPHU et al. (2004) bestätigt. Eine mögliche
Erklärung für die signifikanten Unterschiede in der Anzahl punktierter Follikel bei adulten
Tieren kann die individuelle Reaktion der Versuchstiere auf die FSH-Injektionen sein (KAFI
und MCGOWAN 1997). Desweiteren wurden signifikante Unterschiede für die Gesamtzahl
an Oozyten je Tier nach i.m. FSH und i.o. IGF K (0,01 M Essigsäure) Injektion zwischen den
Gruppen „Kalb FSH + IGF K“ bzw. „Kalb FSH“ und „Kuh FSH“ ermittelt.
Mögliche Erklärungen für die Unterschiede sind neben physiologischen und umweltbedingten
Faktoren, wie Östruszyklus, Alter (ARMSTRONG et al. 1997; BOLAND et al. 2001;
TANEJA et al. 2000), Genetik (LI et al. 2007; PTAK et al. 2003), auch die Größe der
Primordial- und Tertiärfollikel (CUSHMAN et al 1999) sowie Klima, Fütterung und
technische Aspekte der OPU Durchführung. Dazu zählen die Häufigkeit der Punktionen
(GARCIA und SALAHEDDINE 1998), Nadellänge bzw. –größe und die rektale
Manipulation. Alle aufgeführten Faktoren scheinen einen Einfluss auf die Ovarfunktion und
damit auf die Anzahl der Follikel und der gewonnenen Oozyten zu haben (VAN
WAGTENDONK 2006). Dies könnte eine mögliche Erklärung für die höhere Anzahl an
punktierten Follikeln und gewonnenen Oozyten je Tier in der intraovariell behandelten
Gruppe, insbesondere bei der Gruppe „Kalb FSH+IGF K“ im Vergleich zu unbehandelten
und FSH behandelten Kälbern sein.
111
Diskussion
Keine signifikanten Unterschiede wurden zwischen den beiden intraovariell behandelten
Gruppen gefunden, wobei die Anzahl entwicklungskompetenter Oozyten in der Gruppe „Kalb
FSH + IGF K“ leicht erhöht war. Dieses wurde auch von OROPEZA et al. (2004) in der
gleichen Versuchstierherde beobachtet.
Unterschiede in den Reifungsraten präpuberaler und adulter Tiere wurden nicht gefunden,
was die Ergebnisse von DAMIANI et al. (1996) bestätigt. Allerdings wurde über
Unterschiede in der Kinetik der Kernreifung bei in vitro Maturation zwischen präpuberalen
und adulten Oozyten berichtet (KATHIR et al. 1998).
5.2
Messenger RNA-Expression juveniler und adulter Oozyten vor und nach
in vitro Maturation
Mit Hilfe der RT-PCR können relative mRNA Transkriptmengen von Genen in
unterschiedlichen Entwicklungsstadien von Oozyten dargestellt werden. In der vorliegenden
Arbeit wurde der relative Transkriptgehalt der vier Gene GDF9, SLC2A1, PRDX1 und ZAR1
in ungereiften und gereiften Oozyten präpuberaler Kälber und adulter Rinder untersucht und
miteinander verglichen. TOMEK et al. (2002) zeigten, dass mRNA-Polyadenylierung und
Translation vom GVBD bis zur MII-Phase zunehmen, wobei in dieser Phase die Transkription
stark zurückgeht und schließlich vollständig zum Erliegen kommt.
Die Expression des Wachstumsfaktors GDF9 kann bereits in primordialen und präantralen
Follikeln bei Schaf und Rind nachgewiesen werden (BODENSTEINER et al. 1999; SENDAI
et al. 2001). Die relative GDF9 mRNA Menge korreliert mit der Follikelgröße in Oozyten
von Rindern und Schweinen (PFEFFER et al. 2007; PARADIS et al. 2009). In der
vorliegenden Arbeit wurde die höchste Transkriptmenge von GDF9 in ungereiften Oozyten
gefunden, welches die Untersuchungen von ITOH et al. (2001) bestätigt.
Desweiteren lassen sich Einflüsse von FSH und IGF-1 erkennen. JAYAWARDANA et al.
(2006) berichteten über einen positiven Einfluss der FSH Applikation auf Follikelselektion
und -entwicklung, der durch IGF-1 weiter gesteigert werden konnte (MIHM et al. 2000;
MONGET et al. 2002; MAO et al. 2004).
112
Diskussion
IGF-1 kann nach i.o. Injektion die Proliferation der Granulosazellen in kleinen Follikeln
unterstützen und somit zu einer verbesserten Entwicklungskapazität der Oozyten beitragen
(MONGET und BONDY 2000; CUSHMAN et al. 2001; ROTH et al. 2002). Dies wurde in
mehreren Studien auch über in vitro Kulturen nachgewiesen (INGMAN et al. 2000; MAO et
al. 2004; PUROHIT et al. 2005; SPICER und AAD 2007; SPICER et al. 2008).
Die hormonelle Phase im Zyklus zum Behandlungszeitpunkt kann sich ebenfalls auf
Follikelgröße und relative GDF9 Transkriptmenge auswirken, wie MONTI und REDI (2009)
bei Mäusen beobachteten. HUMBLOT et al. (2005) fanden 12h nach PGF2α-Gabe eine
erhöhte GDF9 Transkriptmenge in Oozyten. Dieses führten sie auf eine Beeinflussung der
Granulosazellen kurz vor der Ovulation zurück. Nach der Reifung wurde in allen
Untersuchungsgruppen ein signifikanter Rückgang der Transkriptmenge von GDF9
festgestellt. Dies bestätigen die Ergebnisse von LONERGAN et al. (2003) und LI et al.
(2008). Die geringste GDF9 Expression wiesen FSH stimulierte Kälber auf, was
möglicherweise mit dem Verlust der Interaktion von KOK und Granulosazellen im Follikel zu
erklären ist.
In der vorliegenden Arbeit wurde die mRNA-Transkriptmenge von SLC2A1 in ungereiften
und gereiften Oozyten untersucht. SLC2A1 kodiert die Synthese des Glucose-TransporterProtein-Typ 1, das die Aufnahme von Glucose, unabhängig von Insulin, in Zellen ermöglicht.
SLC2A1 wurde vor und nach der Maturation in den verschiedenen Untersuchungsgruppen
gefunden, was die Ergebnisse von AUGUSTIN et al. (2001) bestätigt. Nach Reifung wurde
für die Gruppen „Kuh, Kuh FSH, Kalb, Kalb FSH“ ein signifikanter Rückgang der
Expression im Vergleich zu ungereiften Oozyten dieser Untersuchungsgruppen beobachtet.
Auffallend war, dass sich für beide FSH stimulierten Gruppen eine fast identische
Transkriptmenge für SLC2A1 in ungereiften wie auch in gereiften Oozyten nachweisen ließ.
Ähnlich der eigenen Untersuchung fanden LEQUARRE et al. (1997) und LONERGAN et al.
(2003) einen signifikanten Rückgang der Expression von SLC2A1 in ungereiften gegenüber
gereiften Oozyten. Dies könnte mit der Degradation der maternalen mRNA während der
Reifung erklärt werden (PAYNTON 1988; TELFORD et al. 1990; LEQUARRE et al. 1997).
113
Diskussion
Die hohe SLC2A1 Expression der „FSH+IGF-1“ stimulierten Tiere könnte durch eine
gesteigerte Granulosazellproliferation und Mitogenese bedingt werden (CAMPBELL et al.
1996; GUTIERREZ et al. 1997).
Als eine Ursache für die Reduzierung der SCL2A1 Transkriptmenge in maturierten Oozyten
kann die in vitro Kultur vermutet werden. HEINZMANN et al. (2011) beobachteten
signifikante Unterschiede zwischen in vivo und in vitro gereiften Oozyten. Unterschiede in
der SLC2A1-Expression wurden auch in Oozyten von Wildtyp- und IGF-1 behandelten
IGF-1-/-Mäusen festgestellt (ZHOU et al. 2001). Ein möglicher Grund kann die Beeinflussung
der Expression des IGF-1-Rezeptors und der damit verbundenen SLC2A1 Expression,
insbesondere bei sich entwickelnden Oozyten, sein (CASCIERI et al. 1986; WILSON et al.
1995; ZHOU et al. 2000). OROPEZA et al. (2004) fanden in in vitro produzierten 2-4
Zellembryonen aus IGF-1 behandelten Kälbern eine höhere mRNA Expression von SLC2A1
im Vergleich zu nichtbehandelten Kälbern.
Ein signifikanter Unterschied wurde zwischen präpuberalen und adulten Tieren gefunden.
Hierbei spielt die Zunahme der IGF-1 Konzentration im Blut während der Entwicklung bis
zum Erreichen der Pubertät möglicherweise eine entscheidende Rolle (JONES et al. 1991;
GARCIA et al. 2001). Auch wird die Sauerstoffsättigung als Einflussfaktor gesehen. Bei einer
20%igen Sauerstoffsättigung wurde eine signifikant geringere SCL2A1-Expression im
Vergleich zum 5%igen O2-Gehalt in der in vitro Kultur beobachtet (BALASUBRAMANIAN
et al. 2007). Eine Beeinflussung der SLC2A1 Expression durch die Fütterung ist
auszuschließen, da alle Tiere entsprechend ihrer Entwicklung gefüttert wurden.
Durch die Gewinnung und die nachfolgende in vitro Reifung werden Oozyten
atmosphärischem Sauerstoff, Licht und verschiedenen Schwermetallen in den Kulturmedien
ausgesetzt und können dabei nicht von der mütterlichen Antioxidantienabwehr geschützt
werden. Dies führt zu einem aeroben Stoffwechsel, der mit der Bildung von reaktivem
Sauerstoff wie Hyperoxiden, Hydrogenperoxiden und Hydroxylradikalen verbunden ist.
Daher haben Oozyten und Embryonen verschiedene Antioxidationssysteme, die sie vor
schädlichen Einflussfaktoren schützen können (GUERIN et al. 2001). Eines dieser Systeme
stellt die Familie der Peroxiredoxine (PRDX) dar (LEYENS et al. 2003).
114
Diskussion
Das in dieser Arbeit untersuchte PRDX1 konnte sowohl in ungereiften als auch in in vitro
gereiften Oozyten nachgewiesen werden. Eine signifikante Abnahme der mRNA-Menge
wurde nach der Maturation, mit Ausnahme der Gruppe „Kalb FSH+IGF K“, gefunden.
Ähnliche Ergebnisse wurden von LEYENS et al. (2003) und THÈLIE et al. (2007) berichtet.
Durch Sauerstoffradikale, wie z.B. Wasserstoffperoxid, kann es an der DNA zu oxidativen
Schädigungen bzw. einer Veränderung der Basenabfolge mit daraus resultierenden
Fehlpaarungen und Mutationen kommen (BRANDT 2003). Nach Maturation in
rekombinantem humanem FSH angereichertem Medium beobachteten MOUROT et al.
(2006) einen geringgradigen Rückgang der Transkriptmenge von PRDX1.
Die eigenen Ergebnisse bei gereiften Oozyten zeigen sowohl nach der i. m. FSH-Injektion als
auch nach der i.o. Stimulierung eine deutliche Zunahme der PRDX1-Expression gegenüber
den beiden Kontrollgruppen. Ursache dafür können veränderte Zellproliferationsmuster,
Differenzierungsstörungen, Fehler in der Zellkommunikation und die Reduktion von
Gluthation sein (RHEE et al. 2001; LEYENS et al. 2004; MOUROT et al. 2006). ZHANDI et
al. (2009) berichten nach Zugabe von IGF-1 zum Maturationsmedium über eine verbesserte
Oozytenentwicklung. In ähnlicher Weise könnten die i.o. Injektionen von IGF-1 bzw. IGF-K
die Oozytenreifung verbessert und die spezifische Genexpression erhöht haben.
Als weiteres entwicklungsrelevantes Gen wurde die Expression des maternalen Effekt-Gens
ZAR1 (WU et al. 2003a,b) untersucht. ZAR1 ist vor allem in der Reprogrammierungsphase der
Keimzellen und der Oogenese von Bedeutung (HAMATANI et al. 2008). PENNETIER et al.
(2004) konnten bereits in primären Follikeln die ZAR1 Expression nachweisen und ZAR1 als
eines der keimzellspezifischen maternalen Gene beim Rind identifizieren.
In der eigenen Untersuchung wurde an ungereiften Oozyten, nach FSH Stimulierung sowie in
Kombination mit IGF-1 bzw. IGF K, eine Reduzierung des Transkriptgehalts im Vergleich
zur jeweiligen Kontrollgruppe beobachtet. Als mögliche Ursache für die Reduzierung der
mRNA-Menge kann eine unzureichende Oozytenentwicklung, insbesondere nach der
Stimulierung,
gesehen
werden.
Eine
signifikante
Abnahme
der
relativen
ZAR1
Transkriptmenge wurde nach in vitro Maturation in allen Untersuchungsgruppen festgestellt.
115
Diskussion
Über ähnliche Beobachtungen berichteten PENNETIER et al. (2004); UZBEKOVA et al.
(2006); THÈLIE et al. (2007) und ADONA et al. (2011) für adulte bovine Oozyten von
nichtstimulierten Tieren sowie BEBBERE et al. (2008) für ovine Oozyten. Ein Rückgang der
ZAR1-Expression nach der Maturation wurde von RACEDO et al. (2009) in bovinen Oozyten
in Abhängigkeit von der Follikelgröße gefunden. In Oozyten aus 2-8 mm großen Follikeln,
denen eine höhere Entwicklungskompetenz zugesprochen wird, stieg die ZAR1 Expression
während der Reifung. Dagegen zeigten Oozyten aus Follikeln < 2mm eine konstante
Expression.
Keine signifikanten Unterschiede in der ZAR1-Expression fanden THÈLIE et al. (2007)
zwischen präpuberalen und adulten bovinen Oozyten, während UZBEKOVA et al. (2006) von
signifikanten Unterschieden in ungereiften porcinen Oozyten von präpuberalen und 7 Monate
alten Schweinen berichteten. Als Ursache für die geringere Expression in gereiften Oozyten
von stimulierten Tieren kann auch die unvollständige zytoplasmatische Reifung bzw.
Degradation maternaler Transkripte vermutet werden (MERMILLOD et al. 1998; WU et al.
2003a; MARTINS DA SILVA et al. 2005). Die höchste mRNA-Menge in gereiften Oozyten
wurde bei unbehandelten Tieren gemessen. Folglich kann angenommen werden, dass eine
Stimulierung des Follikelwachstums mit der Hemmung bzw. Reduzierung der ZAR1-mRNA
Expression verbunden ist.
5.3
Methylierungsanalyse an Repeatsequenzen und ausgewählten Genen
Epigenetische Modifikationen in Form spezifischer DNA-Methylierungsmuster werden im
Genom von Prokaryoten und Eukaryoten gefunden (WILSON und MURRAY 1991). Beim
Säuger besitzt die DNA-Methylierung der CpG-Dinukleotide wichtige regulatorische
Funktionen bei der X-Chromosomeninaktivierung, dem Imprinting, dem Kondensationsgrad
des Chromatins und der Genexpression. Alle Methylierungsmuster, sowohl die geprägter als
auch ungeprägter Gene, werden während der Primordialkeimzellentwicklung gelöscht und in
geschlechtsspezifischer Form während der Follikulogenese bis zum Antralfollikel wieder
etabliert. An geprägten Genen boviner Oozyten wurde bereits eine Vielzahl von
Methylierungsuntersuchungen vorgenommen.
116
Diskussion
Die geprägten (Imprinting) Gene haben eine wichtige Funktion während der fetalen und
plazentalen Entwicklung. Aufgrund des monoallelischen Charakters und ihrer komplexen
epigenetischen Regelung sind geprägte Gene im Bezug auf epigenetische Änderungen
besonders empfindlich (DOLINOY et al. 2007). Weibliche Keimzellen erhalten ihr
genspezifisches Methylierungsmuster (mütterliche Prägung) während der Entwicklung vom
Primordial- zum antralen Follikel (HIURA et al. 2006).
Für die Bestimmung des globalen Methylierungsmusters in Oozyten der verschiedenen
Untersuchungsgruppen wurden in dieser Arbeit zwei Repeatsequenzen von KANG et al.
(2005) genutzt. Repeat 1 markiert die Bovine testis satellite I (BTS) Sequenz, Repeat 2 die
Bos taurus α-Satellite I (BTαS) Sequenz. Nach Bisulfitbehandlung der Oozyten aus den
verschiedenen Versuchsgruppen wurden nach der Sequenzierung signifikante Unterschiede
beobachtet.
Für die BTS Sequenz wurden, in ungereiften und gereiften Oozyten mit gutem Entwicklungspotential (Klassen 1-2) sowie ungereiften Oozyten mit reduzierter Entwicklungskapazität
(Klasse 3), signifikante Unterschiede in der Methylierung sowohl zwischen als auch innerhalb
der Versuchsgruppen beobachtet (Abb. 37, 39). In der Literatur sind für die BTS-Sequenz in
bovinen Oozyten nur wenige Angaben zu finden. Die BTS-Sequenz in gereiften bovinen
Oozyten hatte einen Methylierungsgrad von 35% bzw. 27,9%, was als moderate Methylierung
interpretiert wurde (KANG et al. 2001; KANG et al. 2005). In dieser Arbeit wurden
Methylierungsmuster von 52% bis 71% nachgewiesen, die damit in allen Versuchsgruppen
deutlich über den von KANG et al. (2001; 2005) veröffentlichten Werten lagen. Sie können
als stark- bzw. hypermethyliert bewertet werden. Dies könnte auf eine maternale
epigenetische Regulierung der Sequenz hindeuten. WEE et al. (2007) fanden in bovinen
Hautfibroblasten einen Methylierungsgrad von 64%, die mit den eigenen Ergebnissen aus den
verschiedenen Untersuchungsgruppen vergleichbar sind. Über den möglichen Einfluss einer
intraovariellen Behandlung auf das Methylierungsmuster der BTS-Sequenz lagen bisher keine
Daten vor. Als mögliche Ursache der höheren Methylierung in gereiften Oozyten von
„FSH+IGF-1“ (71,7%) behandelten Kälbern im Vergleich zu unbehandelten Kälbern (53,3%)
kann ein veränderter Stoffwechsel durch die verbesserte Differenzierungs- und Proliferationsrate der Zellen vermutet werden, was wiederum mit einer gesteigerten Entwicklungskompetenz der Oozyte einhergehen könnte.
117
Diskussion
In der weiteren Embryonalentwicklung wurde für Blastozysten ein Methylierungsgrad von
24,1% nachgewiesen (KANG et al. 2005). Eine mögliche Ursache für die Abnahme der
Methylierung sehen REIK und DEAN (2001) sowie LI (2002) in dem unterschiedlichen
Verlauf der epigenetischen Reprogrammierung, der aktiven bzw. passiven Demethylierung
des maternalen und paternalen Genoms und der de novo Methylierung während der
Embryonalentwicklung. Für die Bos taurus α-Satellite (BTαS)-Sequenz wurde nach Reifung
der Oozyten für alle Untersuchungsgruppen ein Rückgang in der Methylierung im Vergleich
zu ungereiften Oozyten beobachtet. Für FSH behandelte präpuberale und adulte Tiere zeigte
sich ein signifikanter Rückgang im Methylierungsgrad in gereiften Oozyten, was einen
starken Einfluss von FSH vermuten lässt. KANG et al. (2005) beobachteten in gereiften
bovinen Oozyten eine Methylierung von 5,5%. Damit liegt dieser Wert deutlich unter den
eigenen Ergebnissen. PTAK et al. (2006) beobachteten nach der Progesteron- und FSHStimulations-behandlung von adulten und präpuberalen Schafen bei Lämmeroozyten eine
signifikant niedrigere Methylierung im Vergleich zu adulten Tieren.
Beim Vergleich des Methylierungsgrad spezifischer Gene in Oozyten von superovulierten
infertilen Frauen gegenüber nichtstimulierten fertilen Frauen konnte bei ersteren eine
Hypomethylierung beobachtet werden (WILKINS-HAUG 2009). Nach Superovulation mit
steigenden Hormondosen wurde ein zunehmender Verlust der Methylierung für die geprägten
Gene Peg3, Snrpn und Kcnq1ot1 am maternalen DNA-Strang in Embryonen beobachtet.
Gleichzeitig wurde eine Zunahme der Methylierung im normalerweise unmethylierten
maternalen H19 festgestellt (MARKET-VELKER et al. 2010).
Ein abnormales Methylierungsmuster wurde nach Superovulation von Mäusen in Embryonen
gefunden, die sich nicht zur Blastozyste entwickelt hatten (SHI und HAAF 2002). Der
signifikante Rückgang der BTαS-Methylierung in Oozyten von FSH stimulierten Tieren
könnte möglicherweise die Folge einer unzureichenden Genometablierung während der
Oozytenentwicklung sein. Unabhängig von der Entwicklungsphase der Oozyten konnten
SATO et al. (2007) bei Mäusen keinen Einfluss auf die Methylierung geprägter Gene nach
Superovulation erkennen. Jedoch fanden sie für einzelne geprägte Gene in präpuberalen
Oozyten einen sprunghaften Anstieg in der Methylierung in Abhängigkeit der
Oozytenentwicklung, während adulte Tiere eine kontinuierliche Zunahme zeigten.
118
Diskussion
Auch wiesen die verschiedenen Entwicklungsstadien von Oozyten adulter Mäuse eine
deutlich höhere Methylierung im Vergleich zu präpuberalen Tieren auf. Der höhere
Methylierungsgrad von > 50% bei beiden Repeatsequenzen nach der in vitro Maturation
könnte für Oozyten mit gutem Entwicklungspotential für eine bessere Embryoproduktion von
Bedeutung sein. Ähnliches vermuteten LUCIFERO et al. (2006) für das geprägte Gen Snrpn
in bovinen GV-Oozyten.
Einige genomische Sequenzen, einschließlich der Satellitensequenzen, sind relativ resistent
gegenüber Veränderungen der DNA-Methylierung und besitzen eigene Mechanismen zur
Regulierung. Diese hohe Konservierung lässt auf eine effiziente de novo Methylierung
während ihrer Embryonalentwicklung schließen (KANG et al. 2005). Ein Einfluss der
Follikelgröße und der daraus gewonnenen Oozyten sowie deren Weiterentwicklung auf die
Methylierung wurde von FAGUNDES et al. (2010) bei adulten Rindern beobachtet. Demnach
zeigten ungereifte Oozyten aus Follikeln ≥ 8mm eine signifikant höhere Methylierung
gegenüber gereiften Oozyten. Oozyten aus 1-3mm großen Follikeln wiesen keine
Methylierungsunterschiede im Verlauf der Reifung auf. Damit kann belegt werden, dass die
Oozyten in der eigenen Untersuchung überwiegend aus Follikeln > 3mm stammten und die
Ergebnisse in einer Untersuchungsgruppe gruppenspezifisch sind.
SANFORD et al. (1984) untersuchten das Methylierungsmuster der Minor- und Majorsatellitensequenz in präpuberalen Mäuseoozyten und wiesen für beide eine Hypomethylierung
im Vergleich zur DNA somatischer Zellen nach. Bestätigt wurden diese Ergebnisse von
MONK et al. (1987). Abweichungen vom korrekten Methylierungsmuster bzw. eine
fehlerhafte Entwicklung können auch durch genetische Faktoren (Zuchtlinien) erklärt werden,
wie SHI und HAAF (2002) an Embryonen verschiedener Mäuselinien beobachteten. Dieses
kann für die eigene Arbeit ausgeschlossen werden.
CHEN et al. (2004) analysierten die Rsat IIE, eine centromerische Satellitensequenz in
gereiften Kaninchenoozyten, und fanden eine moderate Methylierung von 47,6% ± 23,2%,
was mit den hier gezeigten Ergebnissen für die BTαS-Methylierung vergleichbar ist. Als
mögliche Ursache für die relativ hohe Methylierung beider Satelliten in der eigenen
Untersuchung könnte der höhere morphologische Differenzierungsgrad und die bessere
Qualität der Oozyten angenommen werden.
119
Diskussion
Beim Vergleich der Methylierung von ungereiften Oozyten der morphologischen Klassen 1-2
mit Oozyten der Klasse 3 wurden für beide Sequenzen nur geringe Unterschiede zwischen
den Untersuchungsgruppen gefunden. Tendenziell zeigen Oozyten der Klasse 3 eine
geringgradig höhere Methylierung. Insgesamt scheinen morphologische Unterschiede
zwischen Oozyten nur einen geringen Einfluss auf den Methylierungsgrad zu besitzen.
Die hier gewonnenen Daten geben erste grundlegende Hinweise auf die Methylierung der
beiden Repeatsequenzen in Abhängigkeit von Alter und Morphologie boviner Oozyten sowie
der hormonellen Stimulation am lebenden Tier. Der Methylierungsstatus ungereifter Oozyten
der unbehandelten Kuh kann dabei als Referenzwert genutzt werden. Ein Vergleich mit
bereits vorliegenden Methylierungsdaten kann nur stark eingeschränkt vorgenommen werden,
da die zur Verfügung stehenden Daten anderer Autoren auf der Basis von Oozyten aus
Labortieren bzw. somatischem Zellgewebe gewonnen wurden.
Ein kürzlich neu entdeckter Mechanismus ist die Oxidation von 5-Methylcytosin (5mC) am
5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) in Purkinje-Neuronen, Gehirnzellen und embryonalen
Stammzellen durch die Oxygenase Tet1 und Tet2 (KRIAUCIONIS und HIENTZ 2009;
TAHILIANI et al. 2009). In Oozyten konnte die Oxygenase Tet3 nachgewiesen werden, die
zur Bildung von 5hmC in der frühen Embryonalphase und zu einer veränderten DNAMethylierung führte (IQBAL et al. 2011; WOSSIDLO et al. 2011). Jedoch kann vermutet
werden, dass der Anteil von 5hmC relativ gering ist, da diese Form der Methylierung wohl
erst kurz nach der Befruchtung auftritt und hauptsächlich das paternale Genom betrifft, wie
neuere Arbeiten von IQBAL et al. (2011) und WOSSIDLO et al. (2011) zeigen. Desweiteren
kann postuliert werden, dass Oozyten durch die hohe Expression von PGC7/Stella vor der
Bildung von 5hmC geschützt werden (NAKAMURA et al. 2007). WOSSIDLO et al. (2011)
beobachteten eine deutliche Zunahme von 5hmC sowohl im paternalen wie auch im
maternalen Genom von Zygoten aus PGC7 Knockoutmäusen. Dies lässt eine eingeschränkte
Weiterentwicklung vermuten. PGC7 stellt somit einen wichtigen Faktor in der
Oozytenentwicklung,
insbesondere
während
der
Maturation,
dar.
In
zukünftigen
Experimenten könnte das Entwicklungspotential der hier beschriebenen Oozytengruppen in
Relation zum Vorhandensein der verschiedenen Methylcytosinformen untersucht werden, um
weitere Einblicke in die epigenetische Regulation der Entwicklung präpuberaler Oozyten zu
erhalten.
120
Diskussion
Viele Studien haben die Beeinflussung des CpG Methylierungsstatus an oder in der
Umgebung der Promotorregion und deren Auswirkungen auf die Genexpression während der
Gameto- und Embryogenese beschrieben (CHEUNG et al. 2009; KATARI et al. 2009).
Jedoch ist die Regulierung von der CpG-Dichte im Promotor bzw. der umliegenden Sequenz
abhängig (KESHET et al. 1986; BIRD 1992; HUG et al. 1996; NAN et al. 1997). In etwa
60% der Gene weisen die Promotoren in diesem Bereich eine hohe CpG-Dichte, sogenannte
CpG Inseln, auf (ANTEQUERA und BIRD 1993). Ein schwacher Promotor kann mit
wenigen methylierten CpGs runterreguliert werden, während für einen starken Promotor eine
höhere Dichte notwendig ist (BOYES und BIRD 1992).
Die DNA-Methylierung ist die Hauptmodifikation im eukaryotischen Genom und hat große
regulative Bedeutung für die Genexpression. Im Säugergenom erfolgt die Methylierung
überwiegend an den CpG Dinukleotiden. Annähernd 60-90% der Dinukleotide sind
entsprechend modifiziert (SIEGFRIED und CEDAR 1997). In somatischen Zellen ist die
Methylierung hauptsächlich an CpG armen Regionen zu finden, während CpG reiche
Bereiche vorwiegend in den regulierenden Regionen von Genen zu finden sind und diese vor
möglichen Änderungen schützen (CROSS and BIRD 1995). Eine verminderte Methylierung
ist wahrscheinlich eine Voraussetzung für die aktive Transkription (NEUMANN und
BARLOW 1996).
In dieser Arbeit wurde die DNA-Methylierung von drei ungeprägten Genen (SLC2A1, PRDX1
und ZAR1) in Abhängigkeit von Alter und unterschiedlichen hormonellen Einflüssen in
ungereiften und gereiften bovinen Oozyten untersucht. Für das Gen GDF9 konnte aufgrund
fehlender CpG Islands im Promotorbereich und im 1. Exon keine Methylierung dargestellt
werden. Die hier gefundenen Ergebnisse liefern erste Hinweise zur Methylierung in den
genannten Genen in ungereiften und gereiften bovinen Oozyten. Die Analyse erfolgte mittels
der bereits an Oozyten etablierten Limiting Dilution Methode (HANSMANN et al. 2011;
HEINZMANN et al. 2011).
Für die Gene SLC2A1, PRDX1 und ZAR1 wurde sowohl in ungereiften wie auch in gereiften
Oozyten in allen Untersuchungsgruppen eine ausgeprägte Hypomethylierung beobachtet.
Altersabhängige Methylierungen von CpG Inseln können tiefgreifende funktionelle Folgen
haben (LAIRD 2005).
121
Diskussion
Gleichwohl kann aufgrund der vorhandenen Daten davon ausgegangen werden, dass die
Methylierungsmuster der untersuchten Gene nur in geringem Maße vom Alter der Tiere und
der hormonellen Stimulierung beeinflusst wurden. Auch geben diese Methylierungsergebnisse
nur eine Teilansicht zur Methylierungsdynamik in ungereiften und gereiften präpuberalen und
adulten bovinen Oozyten wieder. Die spezifische Chromatinstruktur, die u.a. durch die DNAMethylierung hervorgerufen wird, bleibt auch während kritischer Entwicklungsphasen stabil
(KUBICEK und JENUWEIN 2004). Bei der Limiting Dilution Analyse handelt es sich um
ein sicheres und robustes Verfahren, wie neue Studien aus unserem Labor an
unterschiedlichem bovinen und murinen Probenmaterial zeigen (HANSMANN et al. 2011).
5.4
Schlussfolgerungen
In dieser Arbeit wurde erstmalig das Methylierungsmuster nichtgeprägter, entwicklungsrelevanter Gene an ungereiften und gereiften präpuberalen und adulten Oozyten boviner Tiere
unter Berücksichtigung von Alter und hormonellem Einfluss analysiert. Desweiteren wurde
erstmalig das Methylierungsmuster an zwei Repeatsequenzen in Oozyten aller präpuberalen
und stimulierten adulten Tiere untersucht. Zusätzlich erfolgte eine mRNA-Analyse zur
Bestimmung der relativen Transkriptmenge der ausgewählten entwicklungsrelevanten Gene.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die i.m. Injektion von FSH und die intraovarielle
Injektion von IGF-K (0,01 M Essigsäure) bei präpuberalen Kälbern zu einer signifikant
erhöhten Anzahl an punktierten Follikeln und gewonnenen Oozyten führt. Beeinträchtigungen
der Reproduktionsorgane konnten nicht beobachtet werden. Somit sollte eine spätere
züchterische Nutzung der Tiere ohne Einschränkungen möglich sein.
Zwischen den einzelnen Untersuchungsgruppen und Entwicklungsstadien war eine deutliche
Variabilität in der relativen mRNA Expression ausgewählter Gene zu beobachten. Für alle
Gene konnten teilweise signifikante Abnahmen nach der Reifung beobachtet werden. Die
Ergebnisse der Methylierungsanalyse für die Repeatsequenzen Bovine testis satellite I und
Bos taurus α-Satellite I zeigen, sowohl zwischen als auch innerhalb der Versuchsgruppen
bzw. vor und nach der Reifung, signifikante Unterschiede zwischen präpuberalen und adulten
Oozyten.
122
Diskussion
Die genspezifische Methylierungsanalyse der nichtgeprägten entwicklungsrelevanten Gene
SLC2A1, PRDX1 und ZAR1 ergab in ungereiften und gereiften Oozyten eine
Hypomethylierung. Für das Erlangen der vollen Entwicklungskompetenz boviner Oozyten
spielt dies scheinbar eine eher untergeordnete Rolle. Jedoch sind weitere Studien zur
Aufklärung der epigenetischen Regulation in dieser kritischen Phase der Entwicklung
notwendig.
Durch die höhere Anzahl an punktierten Follikeln nach intramuskulärer Injektion von FSH
und intraovarieller Injektion von IGF-K (0,01 M Essigsäure) ist diese Behandlung für eine
Oozytengewinnung von Kälbern zu empfehlen. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, mehr
entwicklungsfähige Embryonen zu produzieren. Die Ergebnisse der Repeatsequenzierung
könnten als Referenzwerte für Untersuchungen an bovinen Oozyten zur Bestimmung des
Hormonstatus
der
Spendertiere
genutzt
werden.
Desweiteren
können
sie
als
Qualitätsparameter zur gezielten Selektion von Oozyten mit gutem Entwicklungspotential
eingesetzt werden. Insgesamt können diese neuen Befunde dazu beitragen, das
Generationsintervall in der Rinderzucht durch Gewinnung und Selektion entwicklungsfähiger
Oozyten von präpuberalen Spendern zu verkürzen und dadurch die Zucht effektiver und
nachhaltiger zu machen.
123
Zusammenfassung
6.
Zusammenfassung
Mike Diederich
Experimentelle Untersuchungen zur epigenetischen Modulation in präpuberalen und
adulten bovinen Oozyten
Oozyten von präpuberalen Rindern weisen eine deutlich geringere Blastozystenrate im
Vergleich zu adulten Rindern auf. Ziel dieser Arbeit war es, weitere Erkenntnisse zur
Entwicklungskompetenz präpuberaler und adulter boviner Oozyten durch Untersuchung der
mRNA-Expression von entwicklungsrelevanten nichtgeprägten Genen (GDF9, SLC2A1,
PRDX1 und ZAR1) sowie deren genspezifischer Methylierung zu erlangen. Die Analyse der
Genexpression erfolgte mittels Real-time PCR. Für die genspezifische Methylierungsanalyse
wurde die „Limiting Dilution Methode“ eingesetzt. Zusätzlich wurde der Methylierungsgrad
von zwei Satellitensequenzen (Repeatsequenzen) untersucht, um einen Einblick in das globale
Methylierungsmuster zu bekommen.
Für die Untersuchungen wurden bovine Oozyten aus vier präpuberalen und zwei adulten
Tiergruppen gewonnen. Diese wurden nach morphologischer Beurteilung in die Klasse 1-2
(mit
gutem
Entwicklungspotential),
und
Klasse
3
(mit
eingeschränktem
Entwicklungspotential) eingeteilt. Für die einzelnen Untersuchungen wurden ungereifte und
in vitro gereifte Oozyten der verschiedenen Untersuchungsgruppen eingesetzt. Drei der vier
Kälberversuchsgruppen erhielten 48h vor jeder OPU-Sitzung eine FSH und zwei dieser
Untersuchungsgruppen eine zusätzliche intraovarielle Injektion mit IGF-1 oder IGF K (0,01
M Essigsäure) (Injektionskontrolle).
Auch ein Teil der Kühe erhielt 48h vor der Punktion eine hormonelle Follikelstimulierung.
Für die Arbeit wurden präpuberale Kälber ab dem 6. Lebensmonat zweimal wöchentlich über
einen Zeitraum von drei Wochen punktiert. Die Punktion wurde nach einer dreiwöchigen
Pause bis zum Erreichen des 9. Lebensmonats wiederholt. Zur Kontrolle wurden adulte Kühe
mit mindestens zwei Laktationen genutzt.
124
Zusammenfassung
Folgende Ergebnisse konnten erzielt werden:
1. Die Gesamtzahl der punktierten Follikel je Tier war in der Gruppe „Kuh“ (38±19)
signifikant höher als in der Gruppe „Kuh FSH“ (36±16). Weitere signifikante
Unterschiede zwischen den übrigen Untersuchungsgruppen konnten nicht beobachtet
werden.
2. Bei Tieren der Gruppe „Kuh“ (8±2) und „Kalb FSH+IGF K“ (8±2) konnte gegenüber
Tieren der Gruppen „Kalb“ (5±2) und „Kalb FSH“ (6±2) eine signifikant höhere
Anzahl Follikel je Tier und OPU-Sitzung festgestellt werden.
3. Eine signifikant höhere Anzahl Oozyten wurde zwischen den Gruppen „Kalb
FSH+IGF K“ (26) und „Kalb FSH“ (15) sowie zwischen „Kalb FSH+IGF K“ (26) und
„Kuh FSH“ (19) beobachtet.
4. Für die Gene GDF9, SLC2A1, PRDX1 und ZAR1 konnten in ungereiften und gereiften
Oozyten
zwischen
den
einzelnen
Untersuchungsgruppen
keine
signifikanten
Unterschiede dargestellt werden. Beim Vergleich innerhalb der Untersuchungsgruppen
wurde nach Maturation für die Gene GDF9 und ZAR1 ein signifikanter Rückgang der
mRNA-Menge in allen Gruppen beobachtet. Für SLC2A1 wurde, mit Ausnahme der
i.m. und i.o stimulierten Kälber, ein signifikanter Rückgang in den Gruppen „Kuh,
Kalb, Kuh FSH und Kalb FSH“ festgestellt. Für das Gen PRDX1 wurde in den
Gruppen „Kuh, Kalb, Kuh FSH, Kalb FSH und Kalb FSH+IGF 1“ ein signifikanter
Rückgang nachgewiesen.
5. Das Methylierungsmuster für die Bovine testis satellite I Sequenz wurde in ungereiften
und gereiften Oozyten der morphologischen Klasse 1-3 bestimmt. Für ungereifte
Oozyten der Klassen 1-3 wurden signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen
„Kalb“ (75,6%), „Kalb FSH+IGF-1“ (56,1%) und „Kuh“ (53,8%) beobachtet. Nach der
morphologischen Differenzierung wurden für ungereifte Oozyten der Klassen 1-2
signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen „Kuh“ (49,6%) und „Kalb“ (74,6%)
sowie zwischen „Kuh“ (49,6%) und „Kuh FSH“ (69,8) festgestellt. Für gereifte
Oozyten der Klassen 1-2 bestand ein signifikanter Unterschied zwischen der Gruppe
„Kalb FSH+IGF-1“ (71,7%) und „Kalb“ (53,3%).
125
Zusammenfassung
Bei ungereiften Oozyten der Klasse 3 wurde eine signifikant höhere Methylierung der
Gruppe „Kalb“ (77%) gegenüber „Kuh“ (56,6%) und „Kalb FSH+IGF-1“ (52,9%)
ermittelt. Oozyten aus der Gruppe „Kalb FSH“ (68,2%) wiesen eine signifikant höhere
Methylierung gegenüber „Kalb FSH+IGF-1“ auf, aber eine niedrigere gegenüber „Kalb
FSH+IGF K“ (81,9%). Die Oozyten der Gruppe „FSH+IGF K“ wiesen eine signifikant
höhere Methylierung gegenüber „Kalb FSH+IGF-1“ auf. Beim Vergleich der
Methylierung
nach
in
vitro
Reifung
der
Klassen
1-2
innerhalb
jeder
Untersuchungsgruppe wiesen Oozyten der Gruppen „Kuh“ (49,6% vs. 64,9) und „Kalb
FSH+IGF-1“ (60,6%vs.71,7%) eine signifikante höhere, die Gruppe „Kalb“ (74,6% vs.
53,3%) eine signifikant niedrigere Methylierung auf.
6. Für die Methylierung der Bos taurus α-Satellite I Sequenz konnten zwischen den
einzelnen Versuchsgruppen und morphologischen Klassen keine signifikanten
Unterschiede beobachtet werden.
Für die Gruppen „Kuh FSH“ und „Kalb FSH“ wurde nach der Reifung der Oozyten mit
guten
Entwicklungspotential
eine
signifikante
Abnahme
der
Methylierung
(76,5 vs. 52,5% und 72,8 vs. 57,8%) ermittelt.
7. Für die entwicklungsrelevanten, nichtgeprägten Gene SLC2A1, PRDX1 und ZAR1
wurde in ungereiften und gereiften Oozyten aller Untersuchungsgruppen eine
genspezifische Hypomethylierung beobachtet. Für GDF9 konnte aufgrund fehlender
CpGs keine Aussage zur Methylierung getroffen werden.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass in der vorliegenden Arbeit erstmals an ungereiften
und gereiften bovinen Oozyten aus präpuberalen und adulten Tieren die genspezifische
Methylierung von entwicklungsrelevanten, nicht geprägten Genen untersucht wurde. Hierbei
wurden Alter und hormonelle Behandlung der Tiere berücksichtigt. Innerhalb des
Forschungsprojektes wurde das Methylierungsmuster von zwei Repeatsequenzen zwischen
verschiedenen Versuchsgruppen und Entwicklungsstadien der Oozyten bestimmt. Die
Resultate der Repeatsequenzierung von einzelnen Untersuchungsgruppen können als
Referenzwert für zukünftige Untersuchungen eingesetzt werden.
126
Zusammenfassung
Die hier gewonnenen Ergebnisse geben erste Hinweise auf das genspezifische
Methylierungsgeschehen in ungereiften und gereiften Oozyten bei präpuberalen und adulten
Rindern. Dieses sollte durch weitere Studien und Analyseverfahren bestätigt bzw. überprüft
werden.
127
Summary
7.
Summary
Mike Diederich
Experimental analysis of epigenetic modulation in prepuberal and adult bovine oocytes
Oocytes derived form prepuberal cattle develop to the blastocyst stage at a significantly
reduced rate compared to oocytes from adult cattle. The aim of this thesis was to gain new
insights into the developmental competence of prepuberal and adult bovine oocytes. To
achieve this, we investigated the mRNA expression profiles of developmentally important
non-imprinted genes (GDF9, SLC2A1, PRDX1 and ZAR1) as well as their gene specific
methylation status. The gene expression profiles were analyzed by Real Time PCR. For the
gene specific methylation analysis the “Limiting Dilution” method was employed.
Additionally, we investigated the methylation level of two satellite sequences (repeat
sequences), in order to gain insight into the global methylation pattern. The bovine oocytes
for these assays were retrieved from four prepuberal and two adult animal groups. The
oocytes were classified regarding their morphological properties into class 1-2 (good
developmental potential) and class 3 (limited developmental potential). Immature and in vitro
matured oocytes of the different groups were used. Three groups of prepuberal animals were
administered FSH 48h prior to each OPU session. Additionally, two of the FSH treated
groups also received intraovarian injections of IGF-1 and IGF K (0.01 M acetic acid/ injection
control), respectively. A subgroup of adult animals also received hormonal follicle stimulation
48h before puncture. For this thesis, we used prepuberal calves with an age of 6 months.
These calves were subjected to OPU twice weekly over a period of three weeks. Puncture was
repeated every three weeks until the animals were 9 months old. As control, adult cows with
at least two lactations were used, with a mean of three lactations
The following findings resulted from this work:
1. The total number of punctured follicles per animal was significantly higher in the
group “Cow” (38±19) than in the group “Cow FSH” (36±16). No other significant
differences were observed between the remaining groups.
128
Summary
2. Animals from the group “Cow” (8±2) and group “Calf FSH+IGF K” (8±2) showed a
significantly higher number of follicles per animal and OPU session compared to the
groups “Calf” (5±2) and “Calf FSH” (6±2).
3. A significantly higher number of oocytes was observed between the groups “Calf
FSH+IGF K” (26) and “Calf FSH” (15) as well as between “Calf FSH+IGF K” (26)
and “Cow FSH” (19).
4. For the transcripts of the genes GDF9, SLC2A1, PRDX1 and ZAR1 no differences
could be shown between the respective groups for immature and matured oocytes.
However, within the same group, a significant reduction in mRNA levels was
observed for GDF9 and ZAR1 for all groups. For SLC2A1 a significant reduction, with
the exception of the intramuscular and intraovarian stimulated calves, could be shown
for the groups “Cow”, “Calf”, “Cow FSH” and “Calf FSH”. The transcript for PRDX1
was significantly reduced in the groups “Cow”, “Calf”, “Cow FSH”, “Calf FSH”,
“Calf FSH+IGF 1”.
5. The methylation pattern for the Bovine testis satellite I sequence was examined in
immature and matured oocytes of the morphological classes 1-3. For immature
oocytes of the quality 1-3 significant differences were found between the groups
“Calf” (75.6%), “Calf FSH+IGF-1” (56.1%) and “Cow” (53.8%). After morphological
differentiation significant differences were observed between the groups “Cow”
(49.6%) and “Calf” (74.6%) as well as for the groups “Cow” (49.6%) and “Cow FSH”
(69.8%) for immature oocytes of the quality 1-2. For matured oocytes of high quality
(class1-2) a significant difference was shown between “Calf FSH+IGF-1” (71.7%)
and “Calf” (53.3%). For immature oocytes of reduced quality (class 3) a significantly
enhanced methylation was observed for the group “Calf” (77%) when compared to
“Cow” (56.6%) and “Calf FSH+IGF-1” (52.9%). Oocytes from the group “Calf FSH”
(68.2%) showed a significantly higher methylation compared to “Calf FSH+IGF-1”,
although a reduced methylation level compared to “Calf FSH+IGF K” (81.9%).
129
Summary
When the methylation levels before and after in vitro maturation of oocytes class 1-2
within each group are compared, oocytes of the groups “Cow” (49.6% vs. 64.9 %) and
“Calf FSH+IGF-1” (60.6% vs. 71.7%) showed a significantly higher methylation
level, the group “Calf” (74.6% vs. 53.3%) a significantly lower methylation level after
maturation.
6. For the methylation status of the Bos Taurus α-Satellite I sequence were no significant
differences were found between the individual groups and morphological qualities.For
the groups “Cow FSH” and “Calf FSH” a significant reduction of methylation was
observed for oocytes with good developmental potential after maturation (76.5 vs.
52.5% and 72.8 vs. 57.8%).
7. A gene specific hypomethylation was shown for the developmentally important nonimprinted genes SLC2A1, PRDX1 and ZAR1 in immature and matured oocytes of all
groups. For GDF9 no information regarding methylation could be gathered due to the
lack of CpGs.
In conclusion, this is to our knowledge the first report on gene specific methylation of
developmentally important non-imprinted genes in immature and in vitro matured bovine
oocytes from prepuberal and adult animals. For these experiments age and hormonal status of
the animals were taken into consideration. In this project the methylation patterns of two
repeated sequences of oocytes from different treatments and age groups and developmental
status were determined. The results from the analysis of the repeat sequencing for the
different groups have the potential to be used as a point of reference in advanced studies.
The results from this investigation give first cognitions regarding gene specific methylation
processes in immature and matured oocytes from prepuberal and adult cattle that need to be
validated in further studies.
130
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Anhang 9
Anhang
9.1
Medienzusammensetzung
9.1.1 Medien für die in vitro Maturation
PBS (Dulbecco´s phoshate buffered saline)
PBS Gebrauchslösung
Produkt
1L
Produkt Nr.
Dulbeccos phoshate buffered saline*
(PBS-Pulver)
9,65 g
AppliChem A 0964
Stocklösung*
10 ml
Destilliertes H2O
1000 ml
MilliQ®
* getrennt lösen
PBS- Stocklösung
Produkt
g/500 ml
g/L
Produkt Nr.
Na-Pyruvat
1,80 g
3,6 g
AppliChem A 3912
Streptomycinsulfat
2,50 g
5,0 g
AppliChem A 1852
D-Glukose
50,00 g
100,0 g
Roth 6780
CaCl2 x 2H2O*
6,65 g
13,3 g
Fluka 21098
Penicillin G*
(Sodium)100000 IU/L
3.00 g
6,00 g
AppliChem A 1837
H2O
500 ml
1000 ml
MilliQ®
* getrennt lösen
185
Anhang Wasch- und Reifungsmedium
TCM-air
*
**
Produkt
50 ml
Produkt Nr.
TCM 199
0,7550 g
Sigma M 2520
Gentamycin-Sulfat
0,0025 g
Roth 0233
Na-Pyruvat
0,0011 g
AppliChem A 3923
NaHCO3*
0,0175 g
Roth HN 01.2
ad . H2O
50ml
MilliQ®
BAS (FAF)**
0,05 g
Sigma A 7030
getrennt lösen;
BSA nach pH-Messung dazu auf pH 7,2 mit 1M NaOH einstellen
Kulturmedium TCM-Culture
Produkt
50 ml
TCM 199
Gentamycin-Sulfat
Gentamycin-Sulfat
Produkt Nr.
0,755 g
0,0025 g
Sigma M 2520
Roth 0233
0,025 g
* NaHCO3
0,11 g
MilliQ®
ad . H2O
50 ml
Sigma A 7030
BSA (FAF)∗∗
0,05 g
Sigma M 2520
*
getrennt lösen;
**
BSA nach pH-Messung dazu ca. 1h im offenen Glas rühren bis pH 7,4 erreicht ist;
0,1% Hyaluronidase, Sigma Aldrich, Steimheim
186
Anhang Resorcin-Färbung
Resorcin
Resorcin Stocklösung:
Merck KGaA, Darmstadt
2,2%ig in 100% Essigsäure gelöst (Eisessig)
1mg Resorcin in 45ml heißer Essigsäure lösen, abkühlen und filtrieren
Gebrauchslösung:
1% Resorcin Stocklösung in 45% Essigsäure
5 ml Stocklösung
5,5 ml MilliQ® bidest.
9.1.2 Lösungen und Reagenzien für die Reverse Transkription und PCR
Analysekits
Dynabeads®
Dynal, Oslo, Norwegen
Wizards®SV Gel and PCR Clean Up System
Promega, Mannheim
Lysispuffer A:
100mM Tris-HCL, pH 8,0
500mM LiCL
10mM EDTA
1% LiDS
5mM DTT
Waschpuffer A:
10mM Tris-HCL, pH 8,0
0,15mM LiCl
1mM EDTA
0,1% LiDS
Waschpuffer B:
10mM Tris-HCL, pH 8,0
0,15mM LiCl
1mM EDTA
Reverse Transkription (RT)
187
Anhang 10x RT Puffer Mg-
Invitrogen, Darmstadt
50mM MgCl2
Invitrogen, Darmstadt
10mM dNTPs
Amersham, Biosciences Europa, Freiburg
Random Hexamers (50µM)
Applied Biosystems, CA, USA
RNase-Inhibitor (20U/µl)
Applied Biosystems, CA, USA
Reverse Transkriptase (50U/µl)
Applied Biosystems, CA, USA
Kaninchen Globin mRNA
BRL, Gaithersburg, MD
Polymerase Kettenreaktion (PCR)
10x PCR Puffer
Invitrogen, Darmstadt
50mM MgCl2 (50 mM)
Invitrogen, Darmstadt
10 mM dNTPs
Amersham, Biosciences Europa, Freiburg
Taq DNA Polymerase
Invitrogen, Darmstadt
Genspezifische Primerpaare
MWG-Biotech, Ebersberg
Kaninchen Globin Primer
MWG-Biotech, Ebersberg
Power SYBR® Green 2x
Applied Biosystems
ABI 7500 Fast Real-Time System
Applied Biosystems
9.1.3 Lösungen und Reagenzien für die Bisulfitbehandlung von Oozyten
Lysis Puffer B
10mM EDTA, pH 8,0
10mM Tris-HCl, pH 8,0
400µg/ml Proteinase K
1% (w/v) SDS
188
Anhang Bisulfitsequenzierung
EcoRI, Xbal Restriktionsenzyme
Sigma Aldrich, Steimheim
pGEM®T-easy Vektor System
Promega, Mannheim
XL-10Gold®Ultrakompetente Zellen
Stratagene, CA, USA
Ampicillin
Abbildung 49: T-Klonierungsvektor pGEM®-T Easy Vector Systems http://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/
TBE-Puffer
90 mM Tris
90 mM Borsäure
2 mM EDTA
Biozym LE Agarose
Biozym Hess. Oldendorf
Ethidiumbromid
Fluka Biochemika
Quick-Load®DNA-Ladders
New England Biolabs
189
Anhang LB Medium (Luria-Bertani)
10 g Bactotrypton
5 g Hefeextrakt
10 g NaCl
auf 1000ml mit Aqua bidest. auffüllen
LB Platten:
LB Medium + 15g Bacto-Agar
Autoklavieren und bis zum Gießen auf 50°C abkühlen lassen
TfB1 Puffer
30mM KOAc, pH 6,5
50mM MnCl2
100mM KCl2
10mM CaCl2
15% Glycerin
TfB 2 Puffer
Na-MOPS, pH 7,0
75mM CaCl2
10mM KCl2
15% Glycerin
190
Anhang
9.2
Angaben zu den Primersequenzen für die Limiting Dilution
Gen
Primer
Anzahl
Sequenz (5´-3´)
Amplikon
Chromosomale
Länge (bp)
Lokalisation (bp)
der CpGs
───
──────────
──────────────────────────────────────────
GLUT1
GLUT1 OF
GLUT1 OR
110,221,002
GLUT1 IF M13/stuffer
GLUT1 IR M13/stuffer
110,221,002
14
PRDX1
PRDX1 OF
───── ──────────
────
GTTTTTATAGGATTTTAGTTATTGGTTAG
AAAAATCACACAACCAAAAAATTCTC
239
BTA 3, (-)-strand
110,220,764-
TGTAAAACGACGGCCAGTCCACTCACTCACCCACCCGTTTTTATAGGATTTTAGTTATTGGTTAG
CAGGAAACAGCTATGACCGGGTGGGAGGTGGGAGGGAAAACTCAAAAAAAAATAAAAATCC
213 (285)
110,220,790-
TTGTTTTTATATTTATTAGTTTTATTGAAATAG
BTA 3, (-)-strand
PRDX1 OR
107,467,638
PRDX1 IF M13/stuffer
PRDX1 IR M13/stuffer
107,467,634
17
AAAAAATTAAAAAAACCCCTCAAACT
TGTAAAACGACGGCCAGTCCACTCACTCACCCACCCTTTTATATTTATTAGTTTTATTGAAATAGGAT
CAGGAAACAGCTATGACCGGGTGGGAGGTGGGAGGGCCCCCAACAAAAAAAAAC
220 (292)
107,467,415-
ZAR1
AAAGTTTTTTTTGTAGATTATTTTAAGAAT
AAAACAACCATCAATATACCCCTA
276
BTA 6, (+)-strand
69,751,593-
TGTAAAACGACGGCCAGTCCACTCACTCACCCACCCGGGTGTGGAATATTTTTATATTAAGGT
CAGGAAACAGCTATGACCGGGTGGGAGGTGGGAGGG AAAACAACCATCAATATACCCCTAC
230 (302)
69,751,639-
ZAR1 OF
ZAR1 OR
69,751,868
ZAR1 IF M13/stuffer
ZAR1 IR M13/stuffer
69,751,868
18
Sequenzierprimer M13/stuffer R
Sequenzierprimer M13/stuffer F
307
107,467,332-
TGTAAAACGACGGCCAGTCCACTCACTCACCCACCC
CAGGAAACAGCTATGACCGGGTGGGAGGTGGGAGGG
───────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────
Primersequenzen zur direkten Bisulfitsequenzierung der untersuchten Gene sowie die Längen und chromosomale Lokalisation der
amplifizierten Segmente (entsprechend des NCBI Veröffentlichung der Bos taurus Genoms Btau_4.0, Aug 2010), und die Anzahl der
CpGDinukleotide in den Amplikons. Legende: O = äußerer Primer, I = innerer Primer, F = Vorwärts-Primer, R = Rückwärts-Primer;
die spezifischen inneren Primer sind mit einer M13-Sequenz (kursiv) und einer Stuffer-Sequenz (Fett) verlängert. Amplikonlängen
ohne Klammern: bovine spezifische Amplikonlänge; Amplikonlänge in Klammern: eigentliche/volle Amplikonlänge inklusive des
M13/stuffer-tags.
191
Anhang
Limiting Dilution
PCR-Puffer:
Ammoniumsulfat (24mM),
Tris-HCl (90mM),
dNTPs (24µM),
Magnesiumsulfat (24mM),
Enhancer (2,4x)
192
Verzeichnisse
10
Verzeichnisse
10.1
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
=
Abbildung
ANOVA
=
Analysis of Varianz
BMP
=
Bone Morphogenetic Protein
BSA
=
Bovines Serumalbumin
C
=
Cytosin
CpG
=
Cytosin-phosphatidyl-Guanosin
CL
=
Corpus Luteum
CO2
=
Kohlendioxid
d
=
Tag
dNTP
=
Desoxyribonukleosidtriphosphate
DNA
=
Desoxyribonucleinsäure
DNMT
=
DNA-Methyltransferasen
eCG
=
equines Choriogonadotropin
E-17β
=
Östradiol 17β
EGF
=
Epidermal growth factor
Et al.
=
et alii
FCS
=
Fetales calf serum
FF-MAS
=
Follicular Fluid-Meiosis Activating Sterol
FSH
=
Follikelstimulierendes Hormon
°C
=
Grad Celsius
G
=
Guanin
g
=
Gramm
GDF9
=
Growth Differentiation Factor-9
GH
=
Growth Hormon
GLUT1
=
Glucose Transporter 1
GnRH
=
Gonadotropin-Releasing Hormon
GSH
=
Gluthation-Synthese
GV
=
Germinal vesicle
GVBD
=
Germinal vesicle break down
193
Verzeichnisse
h
=
Stunden
hCG
=
humanes Choriogonadotropin
HVL
=
Hypophysenvorderlappen
i.m.
=
intra musculär
I.E.
=
Internationale Einheiten
IGF-1
=
Insulin-like growth factor 1
IVM
=
In vitro Maturation
IVF
=
In vitro Fertilisation
IVP
=
In vitro Embryoproduktion
kg
=
Kilogramm
kPa
=
Kilopascal
KG
=
Körpergewicht
KOK
=
Kumulus-Oozyten-Komplex
l
=
Liter
LH
=
luteinisierende Hormon
M II
=
Metaphase II
5
mC
=
5-Methylcytosin
mg
=
Milligramm
min
=
Minute
ml
=
Milliliter
mm
=
Millimeter
mM
=
Millimol
mRNA
=
Messenger Ribonucleinsäure
M
=
Mol
nM
=
Nanomol
NBCS
=
New Born Calf Serum
O2
=
Sauerstoff
OPU
=
Ovum-Pick-up
p
=
Irrtumswahrscheinlichkeit
PBS
=
Dulbecco`s phosphat saline
PCR
=
Polymerasekettenreaktion
194
Verzeichnisse
pFSH
=
porcines Follikelstimulierendes Hormon
PMSG
=
Pregnant Mare Serum
PRDX1
=
Peroxiredoxin 1
(rh)FSH
=
rekombinant human Fpllikelstimulierendes Hormon
(rh)IGF1
=
rekombinant human insulin-like growth factor 1
RNA
=
Ribonucleinsäure
SD
=
Standardabweichung
Sek
=
Sekunde
SLC2A1
=
Solute carrier family 2
T
=
Thymin
Tab.
=
Tabelle
Taq
=
Termophilus aquaticus
TCM air
=
Tissue culture medium air
TCM
=
Tissue culture medium
u.a.
=
unter anderem
U
=
Uracil
U/min
=
Umdrehung pro Minute
vs.
=
Versus
µg = Mikrogramm µM
=
Mikromol

=
Mittelwert
ZAR1
=
Zygotic arrest 1
195
Verzeichnisse
10.2
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:
Schematischer Ablauf der Follikel- und Oozytenentwicklung
(FAIR 2003)
14
Abbildung 2:
Stoffwechselmetabolismus und Aktivitäten von Kumuluszellen
und der Oozyte (HUANG und WELLS 2010)
21
Abbildung 3:
Somatotropin-induzierte IGF-1 Synthese in der Leber und
Wirkmechanismen beider Wachstumshormone im Ovar (LUCY
2000)
29
Abbildung 4:
Aufbau eukaryotischer Gene mit Transkriptionseinheit
(DOERFLER 1984)
34
Abbildung 5:
Genaktivität
48
Abbildung 6:
Methylierungsmuster während der Oozyten- und
Embryonenentwicklung bei a) Maus und b) Rind
(YANG et al. 2007)
50
Abbildung 7:
DNA-Methylierung von Cytosin
50
Abbildung 8:
Schematischer Aufbau eines Nucleosoms. Bestehend aus den 4
Histonenund Histon-Schwänzen sowie deren Modifikationen
55
Abbildung 9:
Bisuliftinduzierte hydrolytische Desaminierung von Cytosin in
Uracil (GRIGG und CLARK 1994)
58
Abbildung 10: Prinzip der Pyrosequenzierung (LEHMANN 2008)
60
Abbildung 11: A: OPU-Ausstattung
63
B: Ultraschallkopf mit Trägereinheit (OROPEZA 2004)
Abbildung 12: Darstellung der intraovariellen Injektion (OROPEZA 2004)
65
Abbildung 13: Punktionseinheit (OROPEZA 2004)
66
Abbildung 14: Schematische Darstellung der Ovarpunktion (PONEBŠEK, 2005)
66
Abbildung 15: Gereifte Oozyte in der Metaphase II mit Polkörper
70
Abbildung 16: Konvertierung von Cytosinmolekülen mittels Bisulfit
76
Abbildung 17: Bovine testis satellite I Repeatsequenz einschließlich der
Analysesequenz
77
196
Verzeichnisse
Abbildung 18: Bos taurus α-Satellite I Repeatsequenz einschließlich der
Analysesequenz
77
Abbildung 19: Ablauf des Versuchsvorhabens zur Analyse epigenetischer Effekte
in den Oozyten von präpuberalen und adulten Rindern
86
Abbildung 20: Relativer Transkriptgehalt der GDF9-mRNA in ungereiften
Oozyten von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
90
Abbildung 21: Relativer Transkriptgehalt der SLC2A1-mRNA in ungereiften
Oozyten von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
91
Abbildung 22: Relativer Transkriptgehalt der PRDX1-mRNA in ungereiften
Oozyten von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
91
Abbildung 23: Relativer Transkriptgehalt der ZAR1-mRNA in ungereiften
Oozyten von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
92
Abbildung 24: Relativer Transkriptgehalt der GDF9-mRNA in in vitro
gereiftenOozyten von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
93
Abbildung 25: Relativer Transkriptgehalt von SLC2A1 in in vitro gereiften
Oozyten von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
93
Abbildung 26: Relativer Transkriptgehalt von PRDX1 in in vitro gereiften
Oozyten von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
94
Abbildung 27: Relativer Transkriptgehalt von ZAR1 in in vitro gereiften Oozyten
von Kühen und Kälbern (n = 15;  ± SD)
94
Abbildung 28: Relative Transkriptmenge von GDF9 vor und nach in vitro
Reifung innerhalb der Versuchsgruppen
(n = 15;  ± SD; a:b p≤ 0,05)
95
Abbildung 29: Relative Transkriptmenge von SLC2A1 vor und nach in vitro
Reifung innerhalb der Versuchsgruppen
(n = 15;  ± SD; a:b p≤ 0,05)
96
Abbildung 30: Relative Transkriptmenge von PRDX1 vor und nach in vitro
Reifung innerhalb der verschiedenen Versuchsgruppen
(n = 15;  ± SD; a:b p≤ 0,05)
96
197
Verzeichnisse
Abbildung 31: Relative Transkriptmenge von ZAR1 vor und nach in vitro
Maturation in den verschiedenen Versuchsgruppen
(n = 15;  ± SD; a:b p≤ 0,05)
97
Abbildung 32: Genomische Region einschließlich der Bovine testis satellite I
Sequenz (gelb) und der CpGs (grün)
98
Abbildung 33: Genomische Region einschließlich der Bos taurus α-Satellite I
Sequenz (gelb) und der CpGs (grün)
98
Abbildung 34: Repräsentatives Fragment der Bovine testis satellite I (BTS) und
der Bos taurus α-Satellite I (BTαS) Sequenz
98
Abbildung 35: Methylierungssituation an CpGs von DNA-Klonen nach der BiQAuswertung der Bovine testis satellite I Sequenz (n=22 Klone)
99
Abbildung 36: DNA-Methylierung der BTS-Sequenz ungereifter Oozyten (n=5)
der morphologischen Klasse 1 – 3 in den Untersuchungsgruppen
(p≤ 0,05; n=24 Klone)
100
Abbildung 37: DNA-Methylierungsgrad der BTS-Sequenz in ungereiften
Oozyten (n=5) mit gutem Entwicklungspotential der
verschiedenen Versuchsgruppen (a,b,c p≤ 0,05; n=24 Klone)
101
Abbildung 38: DNA-Methylierungsmuster der BTS-Sequenz in ungereiften
Oozyten (n=5) mit eingeschränktem Entwicklungspotential
(Klasse 3) der verschiedenen Versuchsgruppen
(a:b:c:d p≤ 0,05; n=24 Klone)
101
Abbildung 39: Vergleichende Darstellung DNA-Methylierung der BTS- Sequenz
in ungereiften Oozyten (n=5) mit unterschiedlichem
Entwicklungspotential in den verschiedenen Versuchsgruppen
(n=24 Klone)
102
Abbildung 40: DNA-Methylierung der BTS- Sequenz zwischen ungereiften und
gereiften Oozyten (n=5) der Klasse 1 – 2 der verschiedenen
Untersuchungs-Gruppen (a:b p≤ 0,05; n = 24)
102
Abbildung 41: DNA-Methylierungsgrad des BTS-Sequenz in gereiften Oozyten
(n=5) mit gutem Entwicklungspotential in den verschiedenen
Versuchs-gruppen (a,b p≤ 0,05; n=24)
103
198
Verzeichnisse
Abbildung 42: DNA-Methylierungsgrad des BTS-Sequenz in gereiften Oozyten
(n=5) mit gutem Entwicklungspotential in den verschiedenen
Versuchsgruppen (a,b p≤ 0,05; n=24)
103
Abbildung 43: DNA-Methylierung der BTαS-Sequenz in ungereiften Oozyten
(n=5) der morphol. Klasse 1-2 der verschiedenen
Versuchsgruppen (n=24 Klone)
104
Abbildung 44: DNA-Methylierung der BTαS-Sequenz in ungereiften Oozyten
(n=5) der morphol. Klasse 3 der verschiedenen Versuchsgruppen
(n=24 Klone)
104
Abbildung 45: Vergleichende Darstellung der Methylierung in ungereiften
Oozyten (n=5) der morphol. Klasse 1-2 und der Klasse 3 der
verschiedenen Versuchsgruppen (n = 24 Klone)
105
Abbildung 46: Methylierungsverhältnis der BTαS-Sequenz von ungereiften und
gereiften Oozyten (n=5) mit gutem Entwicklungspotential der
verschiedenen Untersuchungsgruppen (a:b p≤ 0,05; n=24 Klone)
105
Abbildung 47: DNA-Methylierung der BTαS-Sequenz in gereiften Oozyten (n=5)
der morphol. Klasse 1 - 2 der verschiedenen Versuchsgruppen
(n = 24)
106
Abbildung 48: Repräsentatives Methylierungsmuster von ungereiften und
gereiften adulten bovinen Oozyten. Jede Linie zeigt ein Allel nach
der Limiting Dilution für das entsprechende Gen
107
Abbildung 49: T-Klonierungsvektor pGEM®-T Easy Vector Systems
189
199
Verzeichnisse
10.3
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:
Entwicklungsraten präpuberaler und adulter bovinen Oozyten
20
Tabelle 2:
Einfluss der hormonellen Stimulierung auf die Entwicklungsfähigkeit
derOozyten und Blastozystenrate bei präpuberalen Kälbern und Färsen
(PRESICCE et al. 1997)
27
Tabelle 3
Einfluss der hormonellen Stimulierung auf die Blastozystenrate bei
präpuberalen und adulten Schafen (PTAK et al. 1999)
28
Tabelle 4:
Versuchsgruppen (Gonadotropin und IGF-1 Behandlungen)
64
Tabelle 5:
Reverse Transkription
72
Tabelle 6:
Mastermix Real-time PCR
73
Tabelle 7:
Primerpaare
73
Tabelle 8:
Verwendete Primerpaare
78
Tabelle 9:
PCR Zyklus für die Amplifikation der genspezifischen Transkripte
78
Tabelle 10:
Mastermix für die PCR der Bakterienklone
81
Tabelle 11:
Universal T7 und SP6 Primer
82
Tabelle 12:
Mastermix für Multiplexreaktion
84
Tabelle 13:
PCR-Bedingungen und eingesetzte Primer
84
Tabelle 14:
Pipettierschema für die Singleplex-PCRs der Limiting Dilution
85
Tabelle 15:
Punktion präpuberaler Tiere
89
Tabelle 16:
Punktion adulter Tiere
89
Tabelle 17:
DNA-Methylierung von ungeprägten Genen in ungereiften und gereiften 108
Oozyten von präpuberalen und adulten Rindern
200
Verzeichnisse
10.4
Auszüge aus der Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit vorgestellt
37. Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Embryotransfer deutschsprachiger Länder (AET-d)
am 08.-09.07.2010 in Bonn:
„Untersuchungen epigenetischer Modulation unterschiedlicher Gene in präpuberalen und
adulten bovinen Oozyten“
Vortragstagung der Deutschen Gesellschaft für Züchtungskunde e.V. (DGfZ) und der
Gesellschaft für Tierzuchtwissenschaften e.V. (GfT) am 15.-16. 09.2010 in Kiel:
„Untersuchungen zur epigenetischen Modulation entwicklungsrelevanter
präpuberalen und adulten bovinen Oozyten“
Posterpräsentation:
37th Annual Conference of the IETS, Orlando, Florida, 08.-12.01.2011:
„Epigenetic analysis of genomic DNA in prepuberal and adult bovine oocytes“
201
Gene in
Danksagungen
DANKSAGUNGEN
Diese Seite gehört all denen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
• An dieser Stelle möchte ich mich zuallererst ganz besonders bei meinen Doktorvater
Herrn Prof. Dr. H. Niemann für die Überlassung des Themas und somit der Möglichkeit
diese interessante Arbeit anzufertigen bedanken. Ebenso danke ich Ihm für die jederzeit
hilfsbereite sowie unverzügliche Unterstützung in allen Phasen dieser Arbeit und die
Geduld bei der Verfassung des schriftlichen Teils, sowie die Bereitstellung des Arbeitsplatzes.
•
Ein großes Dankeschön an PD Dr. W. Kues für die hervorragenden Ideen und die
jederzeit gewährte Hilfe, Beratung und Aufmunterung. Desweiteren für den Kontakt zur
Möglichkeit unserer Repeatanalyse.
•
Für die finanzielle Unterstützung möchte ich mich sehr herzlich bei der H. WILHELM
SCHAUMANN-Stiftung bedanken. Ohne die Hilfe hätte dieses Projekt nicht so
durchgeführt werden können.
•
Darüber hinaus gilt ein großer Dank Julia für die vielen hilfreichen Anregungen, beim
Korrekturlesen, der Übersetzung und die Geduld, insbesondere beim Tanzen.
•
Ein riesiges „DANKE“ geht an Grit Möller (Es lebe der F.C.), Hans-Georg Sander,
Gunnar Scharnhorst, Volker Lindwedel und Rolf Poppenga für die tolle Zeit im Stall, euer
Vertrauen und Erfahrungen die ich mitnehmen darf.
•
Ein großes „Danke“ an Doris Herrmann für Deine Hilfe, Zeit und Geduld in der
Molekularbiologie und die stetige Diskussionsbereitschaft. Wünsche Dir das Du
irgendwann einen kleinen Klasse S „Kasper“ in Deiner Boxe stehen hast.
•
Ein ebenfalls großes „Danke“ an Brigitte Barg-Kues für die große Unterstützung und
Geduld bei der Erstellung unserer Klone. Das Du stets den „Durch- und Überblick“
behalten hast, zur Not auch mit zwei Brillen und Tesafilm. Ebenso Dir und Wilfried für
die lustigen und netten Abende.
•
Ganz herzlichen danken möchte ich Karin Korsawe für die Einführung in die IVP, sowie
die wertvollen Ratschläge und Hinweise.
•
Ebenso möchte ich mich ganz besonders bei Patrick Aldag für seine Mühe, seinen die
Ergebnisse noch so ernüchternd gewesen bedanken. Was nur wenig Wissen, seine
Favoriten unter den Rindern ist sein über alles geschätztes „FLECKVIEH“.
•
Ein großer Dank gilt Richard Reinhardt von MPI in Berlin bzw. Köln und seinen sehr
netten und geduldigen Mitarbeiterinnen für die unzähligen Klonanalysen.
202
Danksagungen
•
Ebenso möchte ich mich bei Herrn Prof. Haaf, Tamara Hansmann und ihren Praktikanten
für die spezifische Gensequenzierung und die sehr netten Aufenthalte in Würzburg
danken.
•
Danke Klaus-Gerd für das herführen und die Geduld beim OPU.
•
Erika Lemme und Frau Dr. Lucas-Hahn danke ich für die wertvollen Hinweise in der
IVM.
•
Ein außerordentlicher Dank gilt meinen tollen und überaus netten Mitbewohnerinnen und
Besuchern in der „Oase der Ruhe“ Steph (Mario), Anke (Benjamin) und Sonja für die
vielen guten Gespräche und lustige Zeit.
•
Besonderer Dank gilt Frau Heide für so manches Paper und die exzellente Formatierung.
Ohne Sie hätte diese Arbeit nicht dieses Format. Wünsche Ihnen und ihren beiden Jungs
noch viele tolle und erholsame Ausflüge.
•
Ein großes Dankeschön an meine Büro-Mitbewohner Matthias, Antje, Andres und Jasmin
mit Erna. Es war einfach nur toll!!! Man kann nur noch sagen: Alles wird gut.
•
Mein Dank gilt ebenfalls Peter Köhler, Erich Kahle, Willi Hasselbring, PD Dr. Bernhard,
PD Dr. Lamade, Prof. Fritsche-Ravens, Dr. Fabian Rieber und Prof. Hochberger für euer
riesiges Vertrauen, dass ich viele neue Wege einschlagen und eine Teil von D-NOTES
sein durfte.
•
Christine Ehling eine Dankeschön für die pharmakologische Unterstützung.
•
Herrn Prof. Dr. Rath für die kleinen Behälter aus Neustadt-Aisch. Vielen Dank.
•
Christine und Hans-Hermann ein herzliches Dankeschön für die kleinen und großen
Bestellungen.
•
Ausdrücklich bedanken möchte ich mich bei Dr. U. Baulain für die hervorragende
statistische Unterstützung und so manch nettes Gespräch.
•
Ebenso möchte ich mich bei Edward, Johann und Toni für die nette Zeit und guten
Gespräche bedanken.
•
Meinen lieben Kollegen allen voran Julia, Wiebke, Steph, Gerd, Thomas, Christina,
Maren, Rudi, Ulrike, Andres danke ich für die lustige Zeit im Labor, die stete
Hilfsbereitschaft, die guten Ratschläge und nicht zuletzt so manch schönen Grill-, Tanzund Spielerabend.
•
Der Wandertruppe: Brigitte, Steph, Wilfried, Miriam, Hellen, Natalie, Rudi, Maren,
Karsten, Julia, Wiebke, Christiane, Linda und Fly. Irgendwann werden wir alle
gemeinsam auf einem 3-Tausender stehen und den Ausblick geniessen. Weiß im Moment
nur noch nicht wie.
203
Danksagungen
•
Desweiteren möchte ich unser Stalltierärztin Anke Janssen ganz besonders für ihr
Vertrauen und Offenheit für neue Techniken und Ideen danken.
•
Gabi und Bärbel den beiden Putzfeen gilt ein eben so großes Dankeschön, auch wenn es
montagmorgens hin und wieder ein wenig wild aussah.
•
Die Amerikaner haben die Gebrüder Wright, die Franzosen haben die Gebrüder
Montgolfier, wir aber haben die Gebrüder Streil. Vielen Dank für eure riesige Mühe und
Geduld!!! Für die Umsetzung so manch innovativer Idee. Manche bleiben einzigartig,
andere erobern die Welt! Ebenso Danke ich den übrigen Mitarbeiter des TD.
•
Ein besonderer DANK gilt der Pferdeklinik „Burg Müggenhausen“ insbesondere Thomas,
Bettina und Coco ohne die dieser Weg nicht möglich gewesen wäre.
•
Ein unendlich großer DANK und eine tiefe Verbundenheit gilt Edith, Jörn, Christian,
Marion und Shy. Vielen Dank für die vielen schönen und unvergesslichen Jahre. Ihre
werdet immer einen ganz besonderen Platz in mir haben.
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Ein herzliches Dankeschön gilt Waltraud, Detlef, Alexandra und der „Wiesentalherde“,
sowie Hans-Peter, Norbert, Petra, Veronika und dem „Rosenhof“. Danke für euer riesiges
Vertrauen und tollen sowie lehrreichen Jahre.
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Von Herzen möchte ich mich bei allen Freunden insbesondere (Ute, Michel, Sandra, Susi,
Berthold und Edith) bedanken, die mir treu, geduldig und aufmuntert zur Seite standen.
Mein schönster Dank gilt Maren. Jetzt werden wir hoffentlich die Zeit für unsere Touren
haben!!! Ich freu mich drauf.
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Zuletzt gilt mein allergrößter Dank meiner Familie für die große Unterstützung und ihren
steten Rückhalt.
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