Kultur tierischer Zellen
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© 2008 AGI-Information Management Consultants May be used for personal purporses only or by libraries associated to dandelon.com network. S. J. Morgan und D. C. Darling Kultur tierischer Zellen Aus dem Englischen übersetzt von Christof Hauck Spektrum Akademischer Verlag Inhalt Vorwort Danksagung Abkürzungen 11 13 14 1. Grundlegende Methoden 1. Einleitung 19 1.1 1.2 1.3 1.4 19 20 22 1.5 Wozu braucht man die Zellkultur? Die verschiedenen Aspekte der Zellkultur Sicherheitsratschläge Grundlegende Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeit mit Zellkulturen Literatur 2. Ausrüstung und normaler Laborbetrieb 25 2.1 2.2 Das Zellkulturlabor Autoklaven und Heißluftsterilisatoren 2.2.1 Arbeitsweise und Sicherheitsüberlegungen 2.2.2 Was läßt sich in einem Heißluftsterilisator/Autoklaven sterilisieren? 2.2.3 Wie stellt man fest, ob der Autoklav ordnungsgemäß gearbeitet hat? Sterile Arbeitsbänke 2.3.1 Die verschiedenen Bautypen und ihr Arbeitsprinzip 2.3.2 Inbetriebnahme und Reinigung steriler Arbeitsbänke 2.3.3 Sicherheitsaspekte, Wartung und technische Überprüfung 25 26 26 2.3 23 24 28 28 29 29 32 32 6 Kultur tierischer Zellen 2.6 2.7 Brutschränke 2.4.1 Inkubationsbedingungen 2.4.2 Inbetriebnahme eines Gasbrutschranks 2.4.3 Tägliche Wartung und Kontrolle Zentrifugen 2.5.1 Tips zum Gebrauch der Zentrifuge Mikroskope Literatur 33 33 35 37 38 38 39 40 3. Sterile Arbeitstechniken 41 3.1 3.2 3.3 3.4 Der sterile Bereich der Arbeitsbank Umgang mit Pipetten und Plastikpipettenspitzen Entnehmen von Medium aus einem sterilen Vorratsbehälter Sterilfilter für Einmalspritzen 41 44 45 47 4. Ansetzen von Medien 49 4.1 49 49 52 4.5 4.6 Anforderungen an Medien für die Zellkultur 4.1.1 Medienarten und Zusammensetzung 4.1.2 Serumfreie Medien 4.1.3 In welcher Form sollte man das Medium beziehen: als Pulver, Konzentrat oder gebrauchsfertige Lösung? Was benötigt man für das Ansetzen von Medien? Ansetzen von Medien aus Flüssigkonzentraten Ansetzen von Medien aus Pulver 4.4.1 Filtereinrichtungen 4.4.2 Filtermethode Autoklavierbare Medien Mediumzusätze 5. Die Kultur permanenter Zellinien 63 5.1 5.2 5.3 5.4 Verschiedene Arten etablierter Zellinien Vorbereitungen Beurteilung der Zellkulturen Zellzahlbestimmung 5.4.1 Vorbereitungen bei Suspensionskulturen 5.4.2 Vorbereiten von adhärenten Zellen 5.4.3 Einsatz des Haemocytometers Die Subkultivierung von Zellen Ermitteln einer Wachstumskurve 63 65 67 69 69 69 70 73 75 2.4 2.5 4.2 4.3 4.4 5.5 5.6 52 54 55 56 56 56 58 59 Inhalt 7 5.8 Produktion größerer Zellmengen 5.7.1 Rollerkulturflaschen 5.7.2 Spinnerkulturen 5.7.3 Mikrohäger Literatur 77 78 78 79 80 6. Primärkulturen 81 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 Warum eigentlich Primärzellen? Methoden der Zellisolierung Isolierung von Fibroblasten aus Hühnerembryonen Isolierung von Rattenhepatocyten Menschliche Primärzellen 6.5.1 Isolierung von Thyrocyten 6.5.2 Isolierung von Endothelzellen aus der Nabelschnur Besondere Voraussetzungen für die Kultur von Primärzellen Immortalisierung von Primärzellen Literatur 81 82 83 86 89 89 92 94 95 98 7. Kontaminationen 101 7.1 7.2 7.3 7.4 Verschiedene Kontaminanten in Zellkulturen Beseitigung von Kontaminationen Antimikrobielle Wirkstoffe Desinfektion mit Formaldehyd 101 103 104 105 8. Kryokonservierung 107 8.1 8.2 8.3 8.4 Gefrierschutzmittel Das Einfriermedium Das Einfrieren von Zellen Auftauen der Zellen 107 108 108 111 9. Zellkionierung 113 9.1 Klonierung durch Verdünnung 9.1.1 Mathematische Überlegungen 9.1.2 feeder-Zellschicht 9.1.3 Ansetzen einer Klonierung durch Verd ünnung 9.1.4 Klonierungseffizienz 9.1 .5 Expandieren des Klons Klonierung in Weichagar 9.2.1 Hintergrund 9.2.2 Vorgehensweise 113 115 115 116 118 119 119 119 120 5.7 9.2 8 Kultur tierischer Zellen 9.4 9.2.3 Expandieren des Klons 9.2.4 Alternativstrategien Ringklonierung - direktes Klonieren von Kolonien aus einer einzelnen Petrischale Literatur 11. Weiterführende Techniken und Anwendungen 10. Isolierung von Lymphocyten und Richtlinien zur Etablierung von Lymphzellinien 133 10.4 Isolierung von Lymphocyten 10.1.1 Isolierung aus menschlichem Blut 10.1.2 Lymphocyten aus Tonsillen des Menschen 10.1.3 Mauslymphocyten aus der Milz 10.1.4 Mauslymphocyten aus Thymus und Lymphknoten Anreicherung von T- und B-Zellen 10.2.1 Anreicherung von B-Zellen des Menschen 10.2.2 Anreicherung von T-Zellen 10.2.3 Andere Selektionsmethoden Kultivierung von Lymphzellinien 10.3.1 T-Zellinien 10.3.2 Test auf Spezifität 10.3.3 Klonierung der Lymphzellinien Literatur 134 134 137 137 138 138 139 140 143 143 144 147 149 151 11. Zellfusion 153 11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 Ziele und Anwendungen Zellen, die sich als Fusionspartner eignen Fusion der Zellen 11.3.1 Vorbereiten der Fusion 11.3.2 Die Fusion 11.3.3 Kultur der Fusionsansätze Untersuchung des Wachstums der Hybride Expansion und Klonierung der Hybride Literatur 153 156 157 157 159 161 162 163 164 12. Cytotoxizitätstests 167 12.1 12.2 Killerzellen Voraussetzungen für Cytotoxizitätstests 167 168 9.3 10.1 10.2 10.3 125 126 127 129 Inhalt 9 12.3 12.4 12.5 12.6 12.7 Vorbereitung der Effektorzellen Vorbereitung der Zielzellinien Der Cytotoxizitätstest Interpretation der Ergebnisse Literatur 169 172 174 175 176 13. Immortalisierungmit dem Epstein-Barr-Virus 177 13.1 13.2 13.3 13.4 13.5 Vorbereitung des Virus Bestimmung des Virentiters Immortalisierung menschlicher Lymphocyten Klonierung Literatur 178 1ao iai 182 184 14. Transfektion 185 14.1 Grundlagen und Ziele 14.1.1 Die Herkunft der DNA 14.1.2 Wie kann sich Fremd-DNA in einer kultivierten Zelle replizieren? 14.1.3 Identifizierung transfizierter Zellen 14.1.4 Einsatz transfizierter Zellen Transfektion adhärenter Zellen 14.2.1 Auswahl der Methoden und Materialien 14.2.2 Calciumphosphat-Copräzipitation Transfektion von nichtadhärenten Zellen mit Retrovirusvektoren 14.3.1 Eigenschaften von Retroviren 14.3.2 Konstruktion von Vektoren 14.3.3 Auswahl der Methoden und Materialien 14.3.4 Abnehmen von Kulturüberstand der Produzentenzellen 14.3.5 Infektion der Zielzellen Alternative Transfektionsmethoden Literatur 185 185 14.2 14.3 14.4 14.5 Anhang A: Glossar Anhang B: Nützliche Adressen Anhang C: Empfehlenswerte Literatur Index 189 190 191 192 192 193 197 197 198 199 20 1 20 1 203 205 207 211 213 215
