Pasteurisierung von Spendermilch (Dr. Lukas Christen)
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30.09.2015 FACULTY OF SCIENCE Pasteurisierung von Spendermilch Lukas Christen, PhD Bioaktivität versus Mikroorganismen Perth, die isolierteste Metropole der Welt 2‘104km bis Adelaide 3‘291km bis Sydney The University of Western Australia 1 30.09.2015 The University of Western Australia The University of Western Australia 2 30.09.2015 Forschungsort „Australien“ Ursäuger (Eierlegende Säugetiere) Beuteltier „Frühgeborene“ als Standard The University of Western Australia Beuteltier The University of Western Australia 3 30.09.2015 Spendermilch Donor milk The University of Western Australia WHO Empfehlung 1. Stillen 2. Abgepumpe Muttermilch 3. Spendermilch 4. Muttermilchersatz-Nahrung The University of Western Australia 4 30.09.2015 Milchbank Sicherheit für den Empfänger von Spendermilch hat die höchste Priorität in Milchbanken Pasteurisierung ist einer der wichtigsten Schritte um die Sicherheit zu gewährleisten Landers & Hartmann, 2013 The University of Western Australia Milchbanken-Richtlinien in Australien Spender Screening HIV, HTLV, Hepatitis B und C, Syphilis Bakteriologische Analyse vor der Pasteurisierung Gesamtzahl der Bakterien <100'000 KBE/ml (koloniebildende Einheit / ml) Keine hitzebeständige Enterotoxin bildende Pathogene Pasteurisierung (Holder Methode) Bakteriologische Analyse nach der Pasteurisierung Gesamtzahl der Bakterien <5 CFU/ml Dokumentation Nachverfolgbarkeit vom Spender bis Empfänger Dokumentation von allen Lagerung- und Behandlungsparametern Hartmann et al. 2007 The University of Western Australia 5 30.09.2015 Erfindung der Pasteurisierung The University of Western Australia Pasteurisation von Milch 1117 Wärmebehandlung von Wein (China) 1568 Erhitzen von Milchprodukten (Japan) 1864 Luis Pasteur erfindet den modernen Pasteurisierungs-Prozess 1886 Franz von Soxhlet schlägt die Pasteurisierung von Kuhmilch vor 1909 Deutsche Physiker behandeln Menschenmilch mit Wasserstoffperoxid 1920s Erfolgreiche Gefriertrocknung von Kuhmilch in grossen Mengen 1922 Walzentrockner für Menschenmilch am Boston Floating Hospital 1924 Erste Beschreibung der Holder-Methode (142°F / 61.1°C für 30 Minuten) 1938 Wilmers beschreibt “Eine einfache Methode um Menschenmilch haltbar zu machen” (Behandlung bei 79°C für 30min, wiederholen nach 24 und 48 Stunden) The University of Western Australia 6 30.09.2015 Aktuelle Pasteurisierungs Methode Holder Pasteurisierung wird in den meisten Milchbanken angewendet Wärmebehandlung im Wasserbad (62.5°C für 30 min) The University of Western Australia Holder Pasteurisierung The University of Western Australia 7 30.09.2015 BAL in Menschenmilch Pankreaslipase Hydrolysiert das Triglyceride in ein Monoglyceride und 2 freie Fettsäuren Gallensalz-aktivierte Lipase (BAL) Hydrolysiert das Triglyceride in ein Glycerin und 3 freie Fettsäuren Hernell & Blackberg, 1982 The University of Western Australia Fett Absorption Frühgebohrene Babies ernährt mit pasteurisierter Menschenmilch haben eine reduzierte Wachstumsrate verglichen mit denen ernährt mit unbehandelter Menschenmilch. Andersson et al. 2007 The University of Western Australia 8 30.09.2015 BAL nach der Holder Pasteurisierung Gallensalz-aktivierte Lipase inaktiviert Es ist wahrscheinlich dass die Inaktivation von BAL durch die Wärmebehandlung verantwortlich für die unterschiedlichen Wachstumsraten in Andersson’s Studie ist. Czank et al. (2009), Tully et al. (2001), Henderson et al. (1998) The University of Western Australia Inaktivation von BAL Wardell (1984) The University of Western Australia 9 30.09.2015 Lactoferrin Eisenbindendes Protein (verlangsamt Vermehrung von Eisenabhängigen Bakterien und Pilzen) Hemmt das Anhaften und Eindringen von Bakterien in Säugetier Zellen Anti-Virus Aktivitäten (wird noch nicht komplett verstanden) Hemmt Eisenabhängige Lipidperoxidation Anti-Tumor Aktivitäten Freisetzung von Lactoferricin (Peptid) - antimikrobielle, antivirale und antifungale Aktivitäten - Stimuliert das Immunsystem - Neutralisiert Endotoxine Schützender Effekt gegen mehrere Arten von Infektionen The University of Western Australia Lysozym Konzentration 3000mal höher als in Kuhmilch Lysis der meisten gram-positiven Bakterien Bakterizid gegen gram-negative Bakterien in Synergie mit Lactoferrin Aktivitäten gegen HIV (in vitro) - agiert gegen den freien Virus und am zellgebunden Virus Aktivitäten gegen Amöben The University of Western Australia 10 30.09.2015 sIgA Antikörper Resistent gegen Proteolyse im Magen-Darm-Trakt Neutralisiert Gifte Fördert die Immunabwehr des Kindes The University of Western Australia Spätsepsis und invasive Pilzinfektion Spätsepsis (LOS) Sepsis nach den ersten 48 Stunden nach der Geburt Erworben um den Geburtszeitpunk oder während dem Krankenhausaufenthalt (Bakterien, Viren oder Pilze) Risikofaktoren - langer Krankenhausaufenthalt - intravenöser Katheter, Endotrachealschlauch etc. - Infektionen durch Personal und Eltern Invasive Pilzinfektion (IFI) Hauptsächlich verursacht durch Candida spp Kolonisierung findet bei über 46% von VLBW 10–30% der Kolonisierung entwickeln sich zu einer systemischen Infektion The University of Western Australia 11 30.09.2015 NEC Nekrotisierende Enterokolitis Vorkommen bei VLBW: ~10% Mortalitätsrate: 30% Ursache: nicht zweifellos geklärt Prävention: wird nicht komplett verstanden - Probiotische Bakterien - sIgA - Epidermale Wachstumsfaktoren - Interleukine und Cytokine - Mikrobiom - Menschenmilch The University of Western Australia Spätsepsis Vorkommnis bei sehr kleinen Frühgeborenen (VLBW) wenn ernährt mit: Muttermilch Pasteurisierte Menschenmilch Muttermilchersatz 23% 29% 30% (16/70) (23/78) (26/88) Schanler et al. 2005 The University of Western Australia 12 30.09.2015 Lactoferrin in vivo Studie Muttermilch (MM) MM + 100mg/d bovine Lactoferrin Gesamt Spätsepsis 17.3% (29/168) 5.9% (9/153) gram-positive bakterielle LOS 7.7% (13/168) 1.3% (2/153) gram-negative bakterielle LOS 10.1% (17/168) 4.6% (7/153) Pilz Kolonialisierung 18.5% (31/168) 17.6% (27/153) Invasive Pilzinfektion 7.7% (13/168) 0.7% (1/153) NEC – 2nd Stage 5.4% (14/258) 2% (5/247) Manzoni et al. 2009; Manzoni et al. 2012; Manzoni et al. 2014 The University of Western Australia Konzentration nach der Holder Pasteurisierung Gallensalz-aktivierte Lipase (BAL) 0% Alkalische Phosphatase (ALP) 0% Lactoferrin ~ 22% Lysozym ~ 39% Sekretorische IgA ~ 72% Czank et al. (2009), Tully et al. (2001), Henderson et al. (1998) The University of Western Australia 13 30.09.2015 Immunologische Proteine in Menschenmilch Zusätzliche 700 Proteine entdeckt (Total 976) Ein Viertel hat eine immunologische Funktion Synergetische Effekte von zahlreichen Komponenten sind noch nicht untersucht Molinari et al. (2012), Gao (2012) The University of Western Australia Wirkung von Menschenmilch auf Frühgeborene Tiefere Mortalität Kürzere Krankenhausaufenthalte Tiefere Infektionsraten Besseres Neuroentwicklung Assoziiert mit besserer Gesundheit im Erwachsenenalter The American Academy of Pediatrics (2012), Schanler & Atkinson (2005), Wight (2001) The University of Western Australia 14 30.09.2015 Nahrungsmittelindustrie - Pasteurisierung The University of Western Australia Milchindustrie vs. Milchbanken Milchprodukte Spendermilch reduzieren reduzieren Nutritional proteins schützen schützen Sensorische Qualität schützen --- Enzymatische Aktivität reduzieren schützen Immunologische- und entwicklungs Proteine --- schützen Mikrobiologische Last The University of Western Australia 15 30.09.2015 Pasteurization Methods The University of Western Australia Pasteurization Methods The University of Western Australia 16 30.09.2015 Pasteurization Methods The University of Western Australia Milk cells (20 - 4µm) Human milk components Filtration Milk fat globule (15 – 0.1µm) Casein micelle (300 - 100nm) Proteins (10 - 3nm) Micro-organism Lactose (1nm) Protozoa and fungi (100 – 10µm) Bacteria (5 – 0.2µm) Chlamydia (500 - 200nm) Viruses (300 - 10nm) Macro-Molecules (10 - 1nm) Molecules Atoms 1mm 1000µm 0.1mm 100µm 0.01mm 0.001mm 10µm 1µm 1000nm 0.1µm 100nm 0.01µm 0.001µm 10nm 1nm 0.1nm 0.01nm The University of Western Australia 17 30.09.2015 Baktofugation Hohe Zentrifugalkräfte Sporen Reduktion 95 bis 98% Vegetative Bakterien Reduktion ~89% (Anhaftung von Bakterien an Milchfett-Globulus) Meistens verwendet in Kombination mit thermaler Pasteurisierung Anwendung in Käseproduktion => Reduktion von Sporen Stack & Sillen, 1998; Aae 1980; Torres-Anjel & Hedrick, 1971 The University of Western Australia Pasteurization Methods The University of Western Australia 18 30.09.2015 Thermale Pasteurisierung Mechanismus der Innaktivierung Beschädigung der Zellmembrane Verlust von Nährstoffen und Ionen Ribosom Aggregation DNA-Faden Bruch Innaktivierung von essenziellen Enzymen Protein Koagulierung The University of Western Australia Holder Pasteurisierung 62.5°C für 30 Minuten Vegetative Bakterien Reduktion von log10 5 Eliminiert CMV, HIV und HTLV (1 von 100’000 KBE/ml überlebt) Wills et al. 1982 62.5°C für 5 Minuten 56°C für 15 Minuten (Immunologische Proteine >90%, Bakterien log10 2) Czank et al. 2009 57°C für 30 Minuten (Immunologische Proteine >90%, Bakterien log10 3) BAL ist komplett Innaktiverit bei all diesen vorgeschlagenen Methoden The University of Western Australia 19 30.09.2015 Flash Pasteurisierung High temperature short time (HTST) (Hohe Temperatur, kurze Zeit) 72°C für 15 Sekunden Grosse Vielfalt von widersprüchlichen Daten! Mangel an Methodik Kein Aufzeichnen der Behandlungstemperatur der Milch Keine Verifikation (Bakterielle Last oder ALP-Aktivität) The University of Western Australia Pasteurization Methods The University of Western Australia 20 30.09.2015 Hochdruck Flüssigkeit wird unter Hochdruck versetzt Kompression zerreisst Zellmembrane Vegetative Bakterien >100 MPa (1000 bar) E. coli ist Druckresistent (log10 2 Reduktion bei 800 MPa) Sporen >1200 MPa Druck denaturierte Proteine unterscheiden sich von Wärme denaturierten Proteinen => möglicherweise mit ernährungstechnischen Konsequenzen Nieder Temperatur Prozess (23°C Erhöhung bei 800 MPa) Phasenwechsel bei den Lipiden Hite, 1899; Larson, 1918; Heremens, 1995; Patterson, 1995 The University of Western Australia Pasteurization Methods The University of Western Australia 21 30.09.2015 Pulsed Electric Field The University of Western Australia Pulsierendes-Elektrisches-Feld Pulse mit Hochspannung (20 – 80 kV/cm) Elektroporation der Zellmembrane führt zur Lysis Effektiv bei vegetativen Bakterien, Hefen und Schimmel Enzym Reduktion in Protein-Lösungen • Lipase Reduktion 70-85% • Peroxidase Reduktion 30-40% • Alkalische Phosphatase Reduktion ~5% Gould, 2001; Wouters & Smelt, 1997; Ho et al. 1997 The University of Western Australia 22 30.09.2015 Oszillierendes Magnetisches Feld Starkes magnetisches Feld (2 – 100 T) für 25µs bis 2ms Frequenzen zwischen 5 und 500kHz Inaktivierungsmechanismus unbekannt (möglicherweise wird der Ionenfluss über der Zellmembrane verändert) Log10 2 Reduktion von S. aureus in Milch Pothakamury et al. 1993; Hofmann, 1995 The University of Western Australia Pasteurization Methods The University of Western Australia 23 30.09.2015 Ultrasonication Ultraschall Reinigung 20 – 40 kHz Therapeutischer Ultraschall 250 kHz – 2 MHz Dispensieren, Suspendieren, Emulsifieren, etc. 20 – 100 kHz The University of Western Australia Diagnostischer Ultraschall 5 – 10 MHz Effect of Ultrasound Power-Ultraschall (20 – 100 kHz) kreiert Kavitation Kavitation: Formierung, Wachstum und Implosion von Dampfblasen Lokale Hotspots (~5000°C, ~50MPa, wenige Mikrosekunden) Implosion resultiert in einer Schockwelle Schockwelle zerreisst Zellmembrane und führt zur Lysis Suslick, 1990; Cameron et al. 2008; Allison et al. 1996 The University of Western Australia 24 30.09.2015 Effect of Cavitation Kavitation an Schiffsschraube Kavitation an Ultraschall-Horn The University of Western Australia Ultrasonication von Kuhmilch Eliminierung von Bakterien gleich oder besser als bei thermaler Pasteurisierung Eliminierung von gewissen Pilzen und Viren möglich Ultraschall–Thermal Kombinierung erhöht Effizienz Thermosonication von Menschenmilch • Log10 3 Reduktion von Bakterien • Retention Lactoferrin ~77% • Retention BAL ~45% D’Amico et al. 2006; Piyasena et al. 2003; Sherba e al. 1991; Czank et al. 2010 The University of Western Australia 25 30.09.2015 E. Coli Reduction The University of Western Australia Christen et al. 2012 BSSL Retention The University of Western Australia Christen et al. 2012 26 30.09.2015 Schlussfolgerung Kritische Temperatur von BAL zwischen 51 und 58°C Unter diesem Level • BAL Verlust minimal (~10%) • Exponentielle E. coli Reduktion Behandlungszeit erhöht Temperatur und nicht höhere Ultraschall-Leistung Temperatur muss unter dem kritischen Level gehalten werden • Kühlsystem • Hohe Leistung / kurze Zeit The University of Western Australia Nachteile Staphylokokken schwierig zu Eliminieren Unbehüllte Viren schwierig zu Eliminieren Grosse Mengen von Abwärme The University of Western Australia 27 30.09.2015 Pasteurization Methods The University of Western Australia Mikrowellen Nicht ionisierende Strahlung Wärme erzeugende Strahlung => andere thermale Methode Gleichmässige Wärmeverteilung schwierig zu erreichen Gleicher Effekt wie die anderen thermalen Methoden Mudgett, 1986; Villamiel et al. 1996 The University of Western Australia 28 30.09.2015 Ionisierende Strahlung Elektronen, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen • Ionisierende Strahlung • Hochpotent für mikrobielle Reduktion • Kostspielig und braucht anspruchsvolle Schutzausrüstung Schwere Schäden an ernährungstechnischer Qualität von Kuhmilch • Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies • Veränderung in Farbe, Geschmack und Geruch • Reduktion von Vitamin A, C und E Behandlung von gefrorener Milch Starke Regulierung in der EU von Nahrungsmittel Bestrahlung Kung et al. 1953; Wertheim, 1960; Kume et al. 2009 The University of Western Australia Elektromagnetisches Spektrum visible light 400 - 780nm gamma rays X-rays ultraviolet 10-6m 10-8m 10-11m Vacuum-UV 10 infrared UV-C 200 UV-B 280 254nm Mercury low-pressure lamp 320 microwaves 10-3m UV-A 400 Wavelength [nm] Germicidal effectiveness curve The University of Western Australia 29 30.09.2015 Germizidaler Effekt von UV-C UV-C ➔ germizidale Wellenlänge ~260nm Absorption von Photonen durchschmilzt DNA Bildung von Thymin-Dimer unterbricht DNA-Kette The University of Western Australia Ultraviolet Bestrahlung Konstante UV-C Licht oder pulsierendes Licht für wenige Zehntelsekunden Sterilisierung von transparenten Flüssigkeiten und NahrungsmittelOberflächen ist ein übliches Verfahren UV-C kann Gifte neutralisieren (z.B. Patulin in Apfelsaft) Absorptions-Koeffizient bei 254nm Milch 300 cm-1 Bier 20 cm-1 Wasser 0.1 cm-1 The University of Western Australia 30 30.09.2015 UV-C und Milch Energy used to reduce S. epidermidis load from 100'000 to 50'000 CFU/ml / n=3 100000 Log10 Energy [J/cm2] 10000 0.4mm Layer 1000 0.6mm Layer 0.8mm Layer 100 1.2mm Layer 10 1 0 10 20 30 40 50 60 70 Fat [g/l] The University of Western Australia Photon zum Bakterium The University of Western Australia 31 30.09.2015 UV-C Bestrahlung im Labor UV-C lamp UV-Lampe: UV-C Leistung 1.1W Glasbecher: 400ml Rühren: 500min-1 Glass beaker Magnetic stirrer bar Stirring platform The University of Western Australia UV-C Dosis und Bakterien in Menschenmilch Christen et al. 2013a The University of Western Australia 32 30.09.2015 Bakterielle Reduktion und Feststoffe in Milch Vegetative bakterielle Reduktion von 5-log10 möglich (E. coli, S. aureus, S. epidermidis, E. cloacae, B. cereus) Erforderliche Dosis hängt von der Feststoff Konzentration der Milch ab 125 g/L 135 g/L 145 g/L 1200 Decimal reduction dosage [J/l] 1100 2574 3443.96 4607.95 14.82 19.83 26.53 0 0 0 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 Total solids [g/l] Christen et al. 2013a The University of Western Australia UV-C Bestrahlung vs. Holder Pasteurisierung UV-C Bestrahlung: 4863 J/l (Dosis für 5-log10 Reduktion bei 146g/l Feststoffen) Holder Pasteurisierung: 62.5ºC für 30 Minuten Bestandteil UV-Bestrahlung Holder Lipase ~100% 0% Alkalische Phosphatase ~100% 0% Lysozym ~75% ~31% sIgA ~89% ~73% Lactoferrin ~87% ~22% Konzentraion nach Behandlung Christen et al. 2013a; Christen et al. 2013b The University of Western Australia 33 30.09.2015 65 70 75 80 p<0.001 60 Lysozyme retention [%] 85 Lysozym Retention 110 120 130 140 Total solids concentration [g/l] Christen et al. 2013b The University of Western Australia Fettsäuren Christen et al. 2013a The University of Western Australia 34 30.09.2015 Bakterielles Wachstum 7.5 5.0 2.5 untreated UV Holder NB Christen et al. 2013b The University of Western Australia Geschwindigkeit des Rührens ist wichtig Tiefe Rührgeschwindigkeit verhindert Beschädigung von Milchfett aber erhöht die Bestrahlungszeit welches die Proteine beschädigt. Mild damage (creates butter oil) Severe damage (creates butter) Christen et al. 2013a The University of Western Australia 35 30.09.2015 Schlussfolgerung UV-C Bestrahlung Menschenmilch muss um UV-C Quelle fliessen wegen der hohen Photonenabsorption der Menschenmilch Mikroorganismen können erfolgreich Reduziert werden in Menschenmilch - Vegetative Bakterien (Christen et al. 2013a) - Cytomegalovirus (CMV) (Marchant, Christen et al. 2011; Jayaraman, Christen et al. 2012) Retention von Proteinen ist besser als mit Holder Pasteurisierung (Christen et al. 2013b) Retention der bakteriostatischen Eigenschaften besser als mit Holder Pasteurisierung. (Christen et al. 2013b) The University of Western Australia Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Reaktives Moleküle mit Sauerstoff (z.B. Sauerstoffionen, Peroxide) Hochreaktiv Wichtige Rolle bei Zellroll-Signalfunktion Stress (UV, Temperatur) kann ROS erhöhen Oxidativer Stress kann Zellstrukturen zerstören Kann Proteine und Lipide beschädigen Oxidiert Vitamin A, C und E The University of Western Australia 36 30.09.2015 H2O2 in Menschenmilch 40000 35000 Fluorescence 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 The University of Western Australia H2O2 in UV-C Bestrahlter Menschenmilch 25000 Fluorescence 20000 15000 10000 5000 0 -10 0 The University of Western Australia 10 20 30 40 50 Time in [min] 37 30.09.2015 ROS Schlussfolgerung Unbehandelte Menschenmilch reguliert Peroxid Level Temperatur pasteurisierte Menschenmilch verliert Regulierungs-Mechanismus UV-C bestrahlte Menschenmilch behält Regulierungs-Mechanismus Offene Frage Was reguliert den Peroxid Level The University of Western Australia Pasteurization Methods The University of Western Australia 38 30.09.2015 ~ 100 Jahre The University of Western Australia School of Chemistry and Biochemistry Acknowledgements Hartmann Human Lactation Research Group 2013 The University of Western Australia 39
