Untersuchungen zum intrazellulären Überleben von Mycobacterium
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Aus dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover ___________________________________________________________________ Untersuchungen zum intrazellulären Überleben von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in primären bovinen Makrophagen INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Beatrice Schümann aus Heidelberg Hannover 2001 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand 2. Gutachter: Apl. Prof. Dieter Steinhagen Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2001 Die Arbeit wurde gefördert durch ein Stipendium der Graduiertenförderung. meinen Eltern Inhaltsverzeichnis A Einleitung........................................................................................................ 11 B Schrifttum ....................................................................................................... 12 B.1 Die Paratuberkulose des Rindes.......................................................................12 B.1.1 Geschichte der Erkrankung ..................................................................12 B.1.2 Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis ............................12 B.1.3 Wirtsspektrum und Verbreitung ............................................................13 B.1.4 Pathogenese und Krankheitsbild..........................................................15 B.1.5 Immunologie der Erkrankung ...............................................................17 B.2 Makrophagen ....................................................................................................18 B.2.1 Makrophagenaktivierung und -deaktivierung........................................18 B.2.2 Allgemeine Probleme in der primären Makrophagenkultur...................20 B.3 Intrazelluläres Überleben von Bakterien der Gattung Mycobacterium in Makrophagen ....................................................................................................21 B.4 Intrazelluläres Überleben von M. ptb in Makrophagen ......................................23 C Material und Methoden .................................................................................. 26 C.1 Material .............................................................................................................26 C.2 Methoden ..........................................................................................................26 C.2.1 Zellkultur...............................................................................................26 C.2.1.1 Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis .................26 C.2.1.2 Primäre bovine Makrophagen (PBMs) .......................................28 C.2.1.2.1 Gewinnung und Kultivierung................................................28 C.2.1.2.2 Bestimmung der Zellzahl .....................................................31 C.2.2 Infektionsversuche ...............................................................................32 C.2.2.1 Standardinfektionsversuch.........................................................32 C.2.2.2 Bestimmung der Infektionsraten ................................................32 C.2.2.3 Bestimmung der Überlebensraten von M. ptb in PBMs .............34 C.2.3 Mikroskopie ..........................................................................................34 C.2.3.1 Elektronenmikroskopie...............................................................34 C.2.3.2 Konfokale Laserscanning Mikroskopie.......................................35 C.2.4 FACS-Analyse ......................................................................................37 C.2.5 Molekulargenetische Methoden............................................................39 C.2.5.1 RT-PCR .....................................................................................39 C.2.5.1.1 Gewinnung von RNA nach CHOMCZYNSKI u. SACCHI (1987) ..................................................................................39 C.2.5.1.2 Bestimmung der RNA-Konzentration im Photometer ..........40 C.2.5.1.3 DNase-Behandlung von RNA ..............................................41 C.2.5.1.4 Reverse Transkription .........................................................42 C.2.5.1.5 PCR .....................................................................................42 C.2.5.2 Agarosegel-Elektrophorese der PCR-Produkte .........................45 C.2.5.3 Quantifizierung der Genexpression............................................45 D Ergebnisse...................................................................................................... 47 D.1 Eignung und Standardisierung des Teflon-Modells...........................................48 D.1.1 Makrophagenausbeute.........................................................................49 D.1.2 Infektion von PBMs aus der Teflonkultur mit M. ptb .............................49 D.1.3 Adhärenzraten nicht-infizierter sowie infizierter PBMs aus der Teflonkultur...........................................................................................50 D.1.4 Stimulierbarkeit der PBMs aus der Teflonkultur ...................................52 D.1.5 Überleben von M. ptb in PBMs aus der Teflonkultur ............................53 D.2 Funktionelle Untersuchungen in PBMs aus der Teflonkultur.............................56 D.2.1 Elektronenmikroskopie .........................................................................56 D.2.2 Vitale M. ptb alkalisieren das endosomale Netzwerk............................57 D.2.3 Genexpression ausgewählter Gene bei M. ptb-Infektion ......................61 D.2.3.1 Infektion mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb .....................61 D.2.3.2 Vergleich der Genexpression nach verschiedenen Stimulationen .............................................................................64 D.2.4 Bafilomycin verhindert die Ansäuerung in der Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb, verursacht jedoch keine entsprechenden Genexpressionsmuster.........................................................................67 D.2.5 E deaktivierende Effekte ..........................................................................70 Diskussion ...................................................................................................... 73 E.1 Eignung und Standardisierung des Teflon-Modells...........................................73 E.2 Funktionelle Untersuchungen in PBMs aus der Teflonkultur.............................78 E.2.1 Vitale M. ptb alkalisieren das endosomale Netzwerk............................79 E.2.2 Modulation der Genexpression bei M. ptb-Infektion .............................81 E.2.2.1 Infektion mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb .....................81 E.2.2.2 Vergleich der Genexpression nach verschiedenen Stimulationen .............................................................................85 E.2.3 deaktivierende Effekte ..........................................................................86 F Zusammenfassung ........................................................................................ 89 G Summary......................................................................................................... 91 H Literaturverzeichnis ....................................................................................... 93 I Anhang.......................................................................................................... 117 I.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien.........................................................117 I.2 weitere Reagenzien ........................................................................................120 I.3 Geräteverzeichnis ...........................................................................................121 Abkürzungsverzeichnis â engl.: registered trademark (eingetragenes Warenzeichen) [v/v] engl.: volume per volume (Volumen pro Volumen) [w/v] engl.: weight per volume (Gewicht pro Volumen) ACD Acetat-Citrat-Dextrose A. bidest. lat.: Aqua bidestillata A. dest. lat.: Aqua destillata Abb. Abbildung BCG Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin bzw. beziehungsweise ca. zirka cDNA cm 2 engl.: copy DNA (komplementäre DNA) Quadratzentimeter dATP 2‘-Desoxy-Adenosin-5‘-Triphosphat dCTP 2‘-Desoxy-Cytosin-5‘-Triphosphat dGTP 2‘-Desoxy-Guanosin-5‘-Triphosphat DNA engl.: desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP 2‘-Desoxy-Nukleotid-5‘-Triphosphat EDTA Ethanoldiamintetraacetat et al. et alii FCS engl.: fetal calf serum (fötales Kälberserum) FITC Fluorescein Isothiocyanat gRNA gesamte RNA GM-CSF engl.: granulocyte macrophage colony stimulating factor (Granulozyten-Makrophagen Kolonie-Stimulations-Faktor) IFN-g Interferon gamma iNOS induzierbare NO-Synthase IL Interleukin KBE Kolonie-bildende Einheiten LAM Lipoarabinomannan LPS Lipopolysaccharid M Molarität (mol/l) M. avium Mycobacterium avium Subspezies avium min Minute(n) mM millimolar (mmol/l) M. ptb Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis mRNA engl.: messenger RNA (Boten-RNA) M. tbc Mycobacterium tuberculosis NO Nitritoxid OD Optische Dichte RG Reaktionsgefäß PBM primärer boviner Makrophage PBMs primäre bovine Makrophagen PBS engl.: phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Saline) PCR engl.: polymerase chain reaction (Polymerase-Ketten-Reaktion) Pen/Strep Penicillin/Streptomycin RNA engl.: ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rRNA ribosomale RNA RT Reverse Transkription RTase Reverse Transkriptase sek Sekunde(n) SDS Sodiumdodecylsulfat SSTE Sodium-SDS-Tris-EDTA-Puffer Taq Thermus aquaticus TNF-a Tumornekrosefaktor alpha Tris Trihydroxymethylaminomethan u. und upm Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett V Volt z. B. zum Beispiel ZK Zellkultur Einleitung A Einleitung Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis (M. ptb) verursacht eine chronische, granulomatöse und nicht therapierbare Enteritis bei Wiederkäuern, die Paratuberkulose. Die Tiere infizieren sich in der Regel in den ersten Lebensmonaten und haben danach oft über Jahre keinerlei klinische Symptome. Mit Ausbruch der Krankheit zeigen vor allem Rinder starken intermittierenden Durchfall. Allgemein ist eine fortschreitende Abmagerung bei erhaltenem Appetit bis hin zur Kachexie zu beobachten. Die Krankheit endet für gewöhnlich tödlich. Die Pathogenese der Erkrankung ist bislang ungeklärt. Als fakultativ intrazellulärer Erreger ist M. ptb in der Lage, in professionellen Phagozyten zu überleben und sich zu vermehren. Es gilt als gesichert, daß M. ptb durch die M-Zellen im Epithel der Peyer‘schen Platten die intestinale Mukosa überwindet und anschließend von Gewebemakrophagen aufgenommen wird. Unbekannt sind jedoch die Strategie und die Mechanismen, die M. ptb das intrazelluläre Überleben in diesen Zellen ermöglichen. Von anderen intrazellulär überlebenden Mykobakterien ist bekannt, daß sie durch Modulation der Makrophagen deren Effektorfunktionen so beeinflussen, daß die phagozytierten Erreger nicht abgetötet werden. Eine solche Modulation wird auch für M. ptb angenommen. Daher sollten in diesem Projekt die Auswirkungen des intrazellulären Überlebens von M. ptb auf die Genexpression primärer boviner Makrophagen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde das Modell der Teflonkultivierung primärer Makrophagen verwendet, welches das größte Problem, die Inhomogenität in der Zellpopulation, minimiert. Ziel war es, eine Modulation der Effektorfunktionen des Makrophagen durch den Erreger als Folge des Einwirkens sezernierter oder struktureller Bestandteile, also als aktiv oder passiv, zu diskriminieren. Durch den auf diesem Gebiet bisher nicht eingesetzten experimentellen Ansatz sollte ein Beitrag zur Aufklärung der Pathogenese der Paratuberkulose beim Rind geleistet werden. 11 Schrifttum B Schrifttum B.1 Die Paratuberkulose des Rindes B.1.1 Geschichte der Erkrankung Die klinischen Symptome und das pathologisch-anatomische Erscheinungsbild einer Infektion mit M. ptb bei einem Rind wurden zuerst im 19. Jahrhundert beschrieben. Im Jahre 1895 stellten JOHNE und FROTHINGHAM erstmalig eine Verbindung zwischen der Anwesenheit säurefester Mikroorganismen und chronischer Enteritis bei Rindern fest. Elf Jahre später unterschied BANG (1906) diese Form der Enteritis von der tuberkulösen und nannte sie pseudotuberkulöse Enteritis. Die Identifizierung und Anzucht des Erregers gelang schließlich TWORT u. INGRAM (1912), und nach eingehender Charakterisierung wurde der Erreger Mycobacterium enteritidis chronicae pseudotuberculosis bovis johnei genannt. Seit dieser Zeit wurde er mehrfach umbenannt. Aufgrund seiner hohen genetischen Verwandtschaft von 98 % zu M. avium heißt er heute Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis (THOREL et al. 1990). B.1.2 Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis (M. ptb) ist ein Gram-positives, unbewegliches, obligat aerobes Stäbchen mit einer Größe von 0,3-0,5 x 0,3-2 µm (BISPING u. AMTSBERG 1988). Die Zellwand besteht aus zwei quervernetzten Polymeren, dem Arabinogalactanmycolat-Komplex und Peptidoglycan. Zusätzlich enthält sie einen großen Teil langkettiger Mykolsäuren, wodurch das Bakterium eine außerordentliche Resistenz gegenüber Säuren und Laugen besitzt. Diese Eigenschaft wird in der Ziehl-Neelsen-Färbung ausgenutzt, eine Methode zur selektiven Färbung von säurefesten Bakterien. Weitere Möglichkeiten der Darstellung sind Färbungen mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Auramin O-Rhodamin (TRUANT et al. 1962) und Phenol-Acridinorange (SMITHWICK et al. 1995). 12 Schrifttum Im mikroskopischen Bild zeigen sich die Mykobakterien in nesterartigen Gruppierungen, die vermutlich durch die Ausbildung interzellulärer Filamente zustande kommen (MERKAL et al. 1973). M. ptb besitzt aufgrund seiner Zellwandstruktur eine hohe Tenazität. Der Erreger überlebt im Weidekot infizierter Tiere mehrere Monate (ROSENBERGER 1978) und ist noch nach 270 Tagen aus stehenden Gewässern zu isolieren (LARSEN et al. 1956). Durch direkte Sonneneinstrahlung wird das Bakterium innerhalb von 100 Stunden abgetötet. Selbst aus Milch, die mit M. ptb inokuliert und anschließend entweder pasteurisiert (63,5°C für 30 min) oder für 15 sek auf 71,7°C erhitzt wurde, konnten in 85-96 % aller Fälle noch lebende Bakterien isoliert und kultiviert werden (GRANT et al. 1996). In Milch aus England und Wales, die sich bereits im Verkauf befand, war es sogar möglich, mittels PCR das M. ptb-spezifische Insertionselement IS900 in 7-25 % aller untersuchten Proben nachzuweisen (MILLAR et al. 1996). Charakteristisch für M. ptb ist ein extrem langsames Wachstumsverhalten. Die Generationszeit liegt bei 1,3 - 4,4 Tagen, wodurch bei der Kultivierung erst nach 8-12 Wochen mit dem Auftreten von sichtbaren Kolonien zu rechnen ist (LAMPRECHT et al. 1988). Ein weiteres Charakteristikum ist das Mycobactin-abhängige Wachstum. Mycobactin ist ein Zellwand-assoziiertes Siderophor, welches von vielen Mykobakterien, jedoch nicht M. ptb, synthetisiert wird (FRANCIS et al. 1953; BARCLAY et al. 1985). Unter bestimmten Wachstumsbedingungen kann M. ptb seine Mycobactin-Abhängigkeit verlieren (LAMBRECHT u. COLLINS 1992; AADURIZ et al. 1995); deshalb müssen für die Abgrenzung gegen andere Subspezies entweder weitere biochemische Verfahren herangezogen oder das M. ptb-spezifische Insertionselement IS900 detektiert werden, welches selbst in der nahe verwandten Subspezies M. avium nicht vorkommt (VARY et al. 1990). B.1.3 Wirtsspektrum und Verbreitung Die Paratuberkulose ist eine spezifisch bei Wiederkäuern auftretende Krankheit. Sie kommt nicht nur bei den Hauswiederkäuern vor, sondern ist ebenso bei Wildwiederkäuern wie Bisons, Antilopen, Kamelen und vielen anderen zu finden. Sie 13 Schrifttum stellt daher auch ein Problem bei der Zootierhaltung dar (THOEN et al. 1977; Weber et al. 1991). Monogastrische Tiere erkranken nicht an Paratuberkulose, obwohl sie sich mit M. ptb infizieren können. Geographisch gesehen ist die Paratuberkulose in den gemäßigten und subtropischen Zonen weltweit verbreitet (MERKAL 1984a; THOEN u. BAUM 1988; KREEGER 1991; COCITO et al. 1994; BEHYMER et al. 1991). Die wirtschaftliche Bedeutung dieser Erkrankung ist vor allem in der milchproduzierenden, aber auch in der fleischproduzierenden Industrie zu sehen. Milchleistung und Gewichtszunahme der betroffenen Tiere sinken schon in der subklinischen Phase. Neben der deutlich geringeren Lebenserwartung zeigen die Tiere eine verminderte Fertilität sowie eine hohe Anfälligkeit gegenüber anderen Erkrankungen. Allein in den USA betrugen die jährlichen Verluste nach den letzten Schätzungen ca. 1,5 Milliarden US-Dollar (BUERGELT u. DUNCAN 1978; CHIODINI u. VAN KRUININGEN 1986; BENEDICTUS et al. 1987; KREEGER 1991). Am Beispiel von Schweden wird deutlich, welche Bedeutung der Paratuberkulose beigemessen wird. Hier wurden unter behördlicher Kontrolle alle M. ptb-infizierten Herden getötet (VISKE et al. 1996). In anderen Ländern werden Programme zur Verhinderung der Ausbreitung bzw. zur Erlangung eines Paratuberkulose-freien Status diskutiert (KENNEDY 1996; ROSSITER u. BURHANS 1996). Bislang ist die Paratuberkulose eine meldepflichtige Erkrankung. Es ist zu diskutieren, ob sie, wie in Österreich zur Zeit geplant, in den Status einer anzeigepflichtigen Erkrankung erhoben werden sollte, da dann eine bessere Eradikation möglich wäre (HOMUTH 2001). Ob M. ptb eine Gefahr für den Menschen darstellt, ist noch sehr umstritten. Es existieren Hinweise, die M. ptb mit der Enteritis Regionalis Crohn (Morbus Crohn) des Menschen in Verbindung bringen. Schon 1913 beschrieb DALZIEL Ähnlichkeiten zwischen beiden Erkrankungen. Außerdem konnte aus dem Darmbereich von an Morbus Crohn erkrankten Menschen M. ptb entweder direkt isoliert oder durch Nachweis des IS900 identifiziert werden (CHIODINI 1989; LISBY et al. 1994; SUANEGA et al. 1995). 14 Schrifttum B.1.4 Pathogenese und Krankheitsbild Die Pathogenese der Paratuberkulose ist noch weitgehend ungeklärt. Es herrscht Einvernehmen darüber, daß die orale Infektion durch Haltung von Tieren auf M. ptbkontaminierten Weiden und das Saugen von Jungkälbern an kotverschmierten Zitzen die häufigsten Infektionswege darstellen. Vitale Erreger konnten auch aus den Reproduktionsorganen infizierter Tiere und Föten isoliert werden; die Möglichkeit eines intrauterinen Infektionsweges ist jedoch noch nicht geklärt (CLARKE 1997; COCITO et al. 1994; GERLACH u. VALENTIN-WEIGAND 1998; KREEGER 1991). Symptomatisch unterscheidet man drei unterschiedliche klinische Stadien: Das erste, subklinische Stadium ist ohne Symptome und geprägt von einer starken zellulären Immunantwort; die humorale Immunantwort ist kaum entwickelt. Ein Nachweis von Mykobakterien im Kot ist selten möglich. Die darauf folgende zweite Phase wird als subklinische Exkretionsphase bezeichnet. Es ist ein Anstieg in der humoralen Immunantwort erkennbar, Mykobakterien können im Kot nachweisbar sein. Klinische Symptome sind nur bei einer sehr kleinen Anzahl von Tieren zu beobachten (LEPPER et al. 1989). In der Mukosa kommt es zur kontinuierlichen Vermehrung und Ausbreitung von M. ptb. Die dritte Phase ist die klinische oder exkretorische Phase. Leitsymptom sind nicht therapierbare wässrige Durchfälle, die zur Abmagerung bis hin zur völligen Auszehrung führen können, sowie zu einer Reduktion der Milchleistung, diffusen Ödemen, Anämien und auch Infertilität. Die Tiere sterben schließlich in einem katarrhalischen Stadium (COCITO et al. 1994). Die Infektion erfolgt meist in den ersten sechs Lebensmonaten. Spätere Infektionen sind möglich, jedoch selten (LARSEN et al. 1975). Über die orale Aufnahme gelangen die Bakterien in den Darm, wo sie durch die M-Zellen im Epithel der Peyer‘schen Platten die intestinale Mukosa überwinden (CHIODINI et al. 1984; MOMOTANI et al. 1988). Bei adulten Tieren ist die Zahl der M-Zellen stark verringert, wodurch vermutlich weniger Mykobakterien ins Epithel gelangen. Dies könnte die Ursache für die geringere Infektionsanfälligkeit von adulten Tieren sein (CHIODINI 1991). Nach Aufnahme in die M-Zellen werden die Mykobakterien von sub- und intraepithelialen Makrophagen, in denen sie lange Zeit überleben und sich vermehren können, internalisiert. Bedingt durch das intrazelluläre Wachstum von 15 Schrifttum M. ptb kommt es immer wieder zum Absterben einiger Makrophagen. Die frei gewordenen Mykobakterien werden entweder mit dem Kot ausgeschieden, wodurch es zur intermittierenden Erregerausscheidung bereits in der subklinischen Phase kommt, oder von weiteren, zum Ort des Geschehens angelockten Phagozyten aufgenommen. Dies führt zur Bildung von Granulomen in der Darmmukosa sowie in den nahe gelegenen Lymphknoten (MOMOTANI et al. 1988; ZURBRICK u. CZUPRYNSKI 1987). Die Reaktion im Tier ist eine chronische, katarrhalische Entzündung, begleitet von Hyperplasie und einer intensiven Histiozyten-Infiltration der Lamina propria (MERKAL et al. 1970). Histologisch sind in der Darmwand große Mengen an epitheloiden Zellen und Makrophagen sowie einzelne Riesenzellen vom Langerhanstyp und eine mäßige Lymphoplasmainfiltration zu beobachten. Die Zellinfiltrate können die Krypten verdrängen und sich in Mukosa und Submukosa ausdehnen. Im Innern von Makrophagen und Riesenzellen sind mittels ZiehlNeelsen-Färbung massenhaft säurefeste Stäbchen nachweisbar. Der Erreger persistiert über Monate in den Makrophagen der Darmmukosa; der Ausbruch der Erkrankung erfolgt selten vor dem zweiten Lebensjahr (POHLENZ 1991a). Die Infektion breitet sich schließlich durch Aufnahme von M. ptb an unterschiedlichen Stellen der Peyer‘schen Platten sowie durch graduelle Vermehrung von bereits aufgenommenen Mykobakterien im Dünndarm aus. Im Verlaufe der Erkrankung können großflächigere Darmregionen und angrenzende Körperbereiche wie Leber, Niere, Milz, Lunge und Uterus befallen werden (TRAUTWEIN 1991). Neben der diffusen granulomatösen Reaktion kommt es zu einer Enteropathie mit Proteinverlust und schließlich zur Hypoproteinämie, verbunden mit Ödemen, die durch eine Abnahme des osmotischen Drucks bei gleichzeitiger kontinuierlicher Verdickung des Darmgewebes hervorgerufen werden (PATTERSON et al. 1967, 1968 und 1969). Später werden die überfüllten epitheloiden Zellen ins Darmlumen abgestreift und es kommt zur massiven Ausscheidung von Mykobakterien mit dem Kot. Die gefundenen Zellzahlen liegen bei etwa 108 Zellen/g Kot bzw. 1012 Zellen/Tag (CHIODINI et al. 1984). 16 Schrifttum Bei der Paratuberkulose des Rindes sind äußerlich eine Kachexie, sowie starke, durch Hypoproteinämie bedingte Ödeme, besonders an Triel und Unterkiefer, auffällig. Bei der Sektion stellen sich das Mesenterium und die intestinalen Lymphknoten stark ödematisiert dar. In der Darmwand sind typischerweise hirnwindungsartige Schleimhautfalten und eine Verdickung auffallend. Submukös zeigt sich ebenfalls ein starkes Ödem mit hochgradiger Stauung der Lymphgefäße (POHLENZ 1991b; ROSENBERGER 1978). Die mesenterialen Lymphknoten erscheinen leicht vergrößert und zeigen eine granulomatöse Lymphadenitis (TRAUTWEIN 1991). B.1.5 Immunologie der Erkrankung Der Krankheitsverlauf der Paratuberkulose ähnelt aus immunologischer Sicht dem Krankheitsverlauf der Lepra des Menschen. Bei beiden Erkrankungen können eine hyperreaktive und eine anergische Phase festgestellt werden (BENDIXEN 1978; MERKAL et al. 1970). Am Anfang der Erkrankung steht die hyperreaktive Phase im Vordergrund. Sie ist geprägt von starker, zellvermittelter Immunreaktion, die einer Ausbreitung der Erreger entgegen wirkt. Diese Phase der Paratuberkulose entspricht möglicherweise der tuberkulösen Form der Lepra. Gegen Ende der Erkrankung wandelt sich das immunologische Bild hin zur Anergie. Diese Phase entspricht wahrscheinlich der lepromatösen Form der menschlichen Lepra. Sie ist geprägt vom Versagen der Immunabwehr und steht kurz vor dem Tod des erkrankten Tieres. Die beiden Stadien werden verbunden durch eine Phase, die vom Erscheinungsbild der „Borderline“ Form der menschlichen Lepra entspricht. Sie ist charakterisiert durch eine kontinuierliche Schwächung der zellvermittelten Immunität und ansteigende Antikörper-Titer gegen M. ptb (BENDIXEN 1978; CHIODINI et al. 1984; DAVIES et al. 1974; DE LISLE u. DUNCAN 1981; LEPPER et al. 1989; PALIWAL et al. 1985). Erklärbar wäre dies dadurch, daß die Bakterien nach oraler Infektion im Darm von MZellen aufgenommen werden und weiter ins Innere des Gewebes gelangen. Hier werden sie von Gewebemakrophagen phagozytiert, und es kommt zur zellulären Immunantwort. 17 Schrifttum Nach dem Absterben des Makrophagen werden die Bakterien freigesetzt, so daß es im folgenden auch zu einer humoralen Immunreaktion kommt (CHIODINI et al. 1984; BLOOD u. RADOSTITS 1989). Diese nimmt mit Fortschreiten der Krankheit zu und bestimmt im Endstadium das immunologische Bild. KOETS et al. (2001) stellten fest, daß die Höhe von humoraler bzw. zellvermittelter Antwort in Abhängigkeit zu den verwendeten Antigenen und Isotypen steht. Die zelluläre Immunantwort ist essentiell für einen umfassenden Schutz und wird primär durch CD4+ Th1-Zellen vermittelt (BASSEY u. COLLINS 1997); nach der Infektion mit M. ptb tritt zunächst eine starke CD4-Expression ein (CHIODINI u. DAVIS 1992). Der protektive Effekt der T-Zellen wird möglicherweise durch IFN-g vermittelt, ein Zytokin, welches eine herausragende Rolle in der antimykobakteriellen Abwehr des Makrophagen spielt (CHAN u. KAUFMANN 1994). Es wird vermutet, daß T-Zellen, die durch mykobakterielle Bestandteile aktiviert werden, für die eintretende Anergie mit verantwortlich sind (BASSEY u. COLLINS 1997; HEIN u. MACKAY 1991). B.2 Makrophagen B.2.1 Makrophagenaktivierung und -deaktivierung Hämatopoetische Stammzellen reifen im Blut über Monoblasten, Promonozyten und Monozyten zu Promakrophagen heran (ZEMBALA u. ASHERSON 1989). Diese verlassen das Blutgefäßsystem, wandern in verschiedene Gewebe ein und differenzieren dort zu Gewebemakrophagen aus. Besonders große Mengen an Makrophagen finden sich im Bindegewebe, im Bereich bestimmter Blutgefäße, sowie in Leber und Milz (LEONHARDT 1990). Der Begriff Makrophage bedeutet frei übersetzt „der große Fresser“ und macht bereits deutlich, daß diesen Zellen eine Schlüsselrolle in der Immunabwehr zukommt. Sie sind zu Phagozytose und Pinozytose "großer" Partikel, wie Bakterien und anderer Mikroorganismen, Fremdkörper, Zelltrümmer oder polymerisierter löslicher Moleküle und deren 18 Schrifttum Elimination (durch enzymatischen Abbau bzw. Abtötung) oder deren Speicherung befähigt. Makrophagen sind amöboid bewegliche, mononukleäre Zellen und besitzen reichlich Zytoplasma, das zahlreiche endozytotische Vesikel und Lysosomen enthält. Ihre mikrobizide Potenz und antitumoröse Zytotoxizität ist nach Aktivierung z. B. durch bakterielle Stoffwechselprodukte oder Zytokine besonders ausgeprägt. Makrophagen synthetisieren eine Vielzahl von Substanzen, die sie zum Teil kontinuierlich, nach Phagozytose oder im aktivierten Zustand sezernieren (WECKER 1990). Dazu gehören Enzyme (z. B. Kollagenase, Hyaluronidase, Lysozym) und andere an Entzündung und unspezifischen Abwehrmechanismen beteiligte Proteine (z. B. Prostaglandine, Interleukin 1), Faktoren, die die Funktion anderer Zellen bzw. Zellsysteme modulieren (z. B. mitogenes Protein, TNF-a), sowie Gerinnungsfaktoren. Hauptfunktionen der Makrophagen sind: Induktion und Regulation von Entzündung; Gewebeorganisation und Organheilung; Immuninduktion und Stimulation von Lymphozyten als antigenverarbeitende und antigenpräsentierende Zelle; mikrobizide, zytotoxische und Entzündungszelle von zentraler Bedeutung für die zellvermittelte Immunität (LEONHARDT 1990). Makrophagen sind die Zielzellen verschiedener Mikroorganismen, welche intrazellulär überleben können. Die Makrophagenaktivierung ist essentiell für eine verstärkte antimikrobielle Aktivität während dieser Infektionen. Allgemein wird die antimikrobielle Aktivtät in zwei Kategorien unterteilt: Sauerstoff-abhängige und Sauerstoff-unabhängige Systeme. Zu den Sauerstoff-abhängigen Systemen gehören die reaktiven Sauerstoff-Intermediate, vermittelt durch den „oxidativen burst“, und die reaktiven Nitrogen-Intermediate, Nitrid-Oxide, welche durch Oxidation von Arginin entstehen. Die Sauerstoff-unabhängigen Mechanismen sind ebenfalls multifaktoriell und können beinhalten: 1) Ansäuerung der phagolysosomalen Vakuole, 2) Wirkung hydrolytischer lysosomaler Enzyme, 3) Nährstoffentzug (z. B. Eisen) und 4) antimikrobielle Proteine (REINER 1994). 19 Schrifttum Um intrazelluläre Erreger zu eliminieren, muß der Makrophage zur Aktivierung seiner Sauerstoff-abhängigen und -unabhängigen antimikrobiellen Mechanismen angeregt werden. Deshalb kann eine Makrophagendeaktivierung als Prozeß definiert werden, in dem die Zelle teilweise oder vollständig unempfänglich wird für aktivierende Stimuli, die normalerweise antimikrobielle Aktivität wie auch Zytokinausschüttung und Antigenpräsentation ausgelöst hätten. Hinweise für die Dysfunktion des Makrophagen durch eine Infektion mit intrazellulären Erregern gibt es bei verschiedenen Infektionen, wie z. B. mit Leishmania (REINER et al. 1990), Mycobacterium (SIBLEY et al. 1990, CHAN et al. 1991), Yersinia (BLISKA et al. 1993) oder dem humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) (BALDWIN et al. 1990). Die Mechanismen, welche zur Dysfunktion des Makrophagen während der intrazellulären Infektion beitragen können, sind entweder gegen die Sauerstoff-abhängigen oder gegen die Sauerstoff-unabhängigen antimikrobiellen Systeme des Makrophagen gerichtet. Negativ beeinflußt werden: 1) Transkription der „major histocompatibility complex“ (MHC) Klasse II-Gene, 2) Antigenprozessierung und -präsentation, 3) Zytokinproduktion, 4) Expression transkriptioneller Regulatorproteine, 5) „oxidativer burst“, 6) Phagozytose. Verstärkt wird die Produktion immunsuppressiver Moleküle, wie z. B. Prostaglandin E2 oder IL-10 (REINER 1994). B.2.2 Allgemeine Probleme in der primären Makrophagenkultur Hauptproblem primärer Makrophagen in der Zellkultur ist die Inhomogenität der Zellen und daraus folgende Schwankungen der Untersuchungsergebnisse (GOFF et al. 1998). Dieses Problem kann durch das Verwenden der Methode nach JUNGI et al. (1996) überwunden werden. Dabei wird ein Reifungsschritt im Teflonbeutel, an den die Zellen nicht adhärieren können, vorgenommen: nach der Isolierung reifen die monozytären Zellen unterschiedlicher Stadien im Teflonbeutel zu Promakrophagen aus. Damit soll die Ausbeute erhöht und die Zellpopulation synchronisiert werden. 20 Schrifttum B.3 Intrazelluläres Überleben von Bakterien der Gattung Mycobacterium in Makrophagen Das intrazelluläre Überleben von Bakterien der Gattung Mycobacterium ist zentrales Problem bei Erkrankungen mit diesen Erregern. Ist das Bakterium in der Lage, im Makrophagen zu überleben, ist es vor der humoralen Abwehr geschützt. Schon bei der Internalisierung kann das Umgehen der Abwehr beginnen: Bei M. avium und M. tbc ist die Erkennungsstruktur Lipoarabinomannan (LAM), zur welches von Internalisierung des nicht-opsonierenden Erregers das Makrophagen- rezeptoren, wie z. B. CD14 oder dem Mannoserezeptor, erkannt wird. Dadurch entkommt der Erreger der Opsonierung und somit dem Auslösen des „oxidativen burst“ in der Zelle (CHAN u. KAUFMANN 1994). Die genauen Mechanismen, die zur Umgehung der nach der Internalisierung folgenden phagozytischen Abwehr führen, sind weitgehend unbekannt. Es gibt aber Hinweise auf eine Reihe von Mechanismen, die M. avium ein intrazelluläres Überleben ermöglichen. BERMUDEZ et al. (1991) fanden heraus, daß M. avium nicht über Fc-Rezeptoren aufgenommen wird und damit keine Aktivierung des Makrophagen in Form von reaktiven Sauerstoff-Intermediaten auslöst. Die Hemmung der Ansäuerung ist ein weiterer Mechanismus, der es pathogenen Mykobakterien ermöglicht, die Effektorfunktionen des Makrophagen in ihrem Sinne zu verändern. STURGILL-KOSZYCKI et al. (1994) stellten fest, daß M. avium-haltige Phagosomen keine Protonen-ATPase in ihrer Membran besitzen bzw. diese kurz nach der Phagozytose aus der Membran entfernt wird. Diese Protonen-ATPase ist ein Enzymkomplex, der für die Ansäuerung von intrazellulären Kompartimenten zuständig ist und im besonderen den pH-Wert in Phagosomen absenkt, was einen wichtigen Schritt in der Reifung des Phagosoms darstellt (NELSON 1987; STURGILL-KOSZYCKI et al. 1994). Das Fehlen der ATPase ist eine mögliche Erklärung für den fehlenden pH-Abfall in M. avium-haltigen Phagosomen. Die bisherigen Erkenntnisse legen nahe, daß Mykobakterien aktiv an der Umgehung der phagozytischen Abwehr beteiligt sind. 21 Schrifttum In Infektionsversuchen mit verschiedenen Mykobakterien konnte außerdem die Rolle einiger Zytokine in der Makrophagenabwehr teilweise charakterisiert werden. So führte z. B. eine starke Interleukin-6- (IL-6-) Expression in Infektionen mit M. avium zu einem immunosuppressorischen Effekt auf umliegende Makrophagen und die TZell-Aktivierung (VAN HEYNINGEN et al. 1997). Alleine gegeben, änderte IL-6 jedoch nichts an der Abtötungsrate von M. bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) in humanen Makrophagen (BONAY et al. 1999) bzw. von Mycobacterium bovis in murinen Knochenmarksmakrophagen (FLESCH u. KAUFMANN 1991). In denselben Versuchen hatten sowohl Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-a) als auch IL-10 alleine ebenfalls keinen Effekt auf das intrazelluläre Überleben des Erregers. Mit M. avium infizierte Makrophagen konnten jedoch nach Behandlung mit rekombinantem IL-6 das Abtöten der intrazellulären Erreger um 68 % erhöhen. Gleichzeitig wurde die Expression von aktivierenden TNF-Rezeptoren um 78 % vermindert (BERMUDEZ et al. 1992). In Lipopolysaccharid- (LPS-) oder LPS- und Interferon-gamma- (IFN-g-) stimulierten humanen Makrophagen war IL-10, ein deaktivierendes Zytokin, in der Lage, die Expression von IL-1, IL-6 und TNF-a zu inhibieren (FIORENTINO et al. 1991). In Versuchen mit M. avium in humanen Makrophagen führte IL-10 zu einer verminderten Expression von TNF-a bei gleichzeitig vermehrter Ausschüttung des TNF-Rezeptors Typ 2, welcher eine Inaktivierung von TNF-a zur Folge hat (BALCEWICZ-SABLINSKA et al. 1999). Außerdem waren IL-10-defiziente Mäuse wesentlich schneller in der Lage, eine BCG-Infektion zu eliminieren. In den Makrophagen der Lungengranulome dieser Mäuse waren ungewöhnlich hohe Level von TNF-a und der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) zu detektieren (JACOBS et al. 2000a). TNF-defiziente Mäuse starben nach 8 bis 12 Wochen mit atypischen Granulomen in der Lunge (JACOBS et al. 2000b). Eine Vorinkubation mit „granulocyte macrophage colony stimulating factor“ (Granulozyten-Makrophagen Kolonie-Stimulations-Faktor; GM-CSF) führte in der Infektion humaner Makrophagen mit BCG zu einem schnelleren Abtöten des Erregers. Spätere Gaben von GM-CSF hatten keinen Einfluß mehr (BONAY er al. 1998). Sowohl TNF-a als auch GM-CSF hatten in der Infektion humaner Makrophagen mit BCG hemmenden wie auch verstärkenden Effekt, unterschiedlich in den jeweiligen Makrophagenchargen (HOAL- 22 Schrifttum VAN HELDEN et al. 2001). Stimulation mit TNF-a, IFN-g oder GM-CSF führten in der Infektion muriner Intestinalmakrophagen mit M. avium-Komplex zu einer erhöhten mykobakteriostatischen und/oder mykobakterioziden Aktivität (HSU et al. 1995). Murine Knochenmarksmakrophagen waren nach Stimulation mit IFN-g in der Lage, das intrazelluläre Wachstum von Mycobacterium bovis zu unterbinden. Dies konnte durch Zugabe eines spezifischen Inhibitors der Nitrit- und Nitrat-Synthese aus L-Arginin, dessen erster Schritt die iNOS-Expression darstellt, wieder aufgehoben werden (FLESCH u. KAUFMANN 1991). NO spielt eine herausragende Rolle in der Abwehr intrazellulärer Parasiten und ist notwendig für die Aktivierung des Makrophagen (JAMES 1995; GARCIA et al. 2000). Die NO-Produktion von Makrophagen wird durch IFN-g in Kombination mit TNF-a oder anderen sekundären Aktivierungssignalen stimuliert und durch eine Reihe von Zytokinen (vor allem IL-4, IL-10 und „transforming growth factor beta“), anderen Mediatoren und autoinhibitorischen Mechanismen reguliert (JAMES 1995). INOSdefiziente Mäuse waren nicht in der Lage, BCG zu eliminieren und starben innerhalb von 8 bis 12 Wochen, wohingegen die Kontrollgruppe überlebte (GARCIA et al. 2000). Ein experimentelles Medikament, CRL-1072, löste in humanen Makrophagen eine verstärkte iNOS-Produktion und folgend ein höheres NO-Level aus und führte so zum Abtöten von M. avium (JAGANNATH et al. 2000). B.4 Intrazelluläres Überleben von M. ptb in Makrophagen M. ptb ist nicht in der Lage, der Phagozytose durch den Makrophagen zu entgehen. Wie die Internalisierung des Erregers ausgelöst wird, ist noch weitgehend ungeklärt. Andere Mykobakterien werden von nicht-opsonierenden Rezeptoren erkannt und entgehen so dem „oxidativen burst“ in der Zelle (CHAN u. KAUFMANN 1994). Dieser Mechanismus kann für M. ptb jedoch nur spekuliert werden. Es wurde beobachtet, daß die Zugabe von Serum frühe Aufnahmeraten von M. ptb in bovine Makrophagen erhöht, ein Hinweis auf Rezeptoren, die einer Opsonierung des Erregers bedürfen (ZURBRICK u. CZUPRYNSKI 1987). Außerdem konnte gezeigt werden, daß M. ptb 23 Schrifttum Fibronektin bindet, welches möglicherweise als Ligand bei der Internalisierung dient (VALENTIN-WEIGAND u. MORIARTY 1992). Zur effektiven Eliminierung von Mykobakterien benötigt der Makrophage das koordinierte Zusammenspiel des IFN-g der Th1-Zellen (eine Subpopulation der Helfer-T-Lymphozyten) sowie von IL-1, IL-6, TNF-a und GM-CSF des Makrophagen selbst (VALENTIN-WEIGAND u. GOETHE 1999). Aus diesem Grunde wurden in letzter Zeit verschiedene Studien durchgeführt, welche die Rolle dieser Zytokine in der Pathogenese boviner und oviner Paratuberkulose aufklären sollten (ADAMS u. CZUPRYNSKI 1994; ADAMS et al. 1996; BEGARA-MCGORUM et al. 1998; STABEL 1995; ZHAO et al. 1997; ZURBRICK et al. 1988). Die Untersuchungen wurden mit Gewebematerial experimentell infizierter Tiere bzw. Vollblut sowie als in vitroInfektionen mit Blutmonozyten, primären Makrophagen und Zellinien durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Studien geben Hinweise darauf, daß M. ptb in der Lage ist, eine verstärkte Expression der proinflammatorischen bzw. aktivierende Zytokine IL-1b, IL-6, TNF-a und GM-CSF hervorzurufen. Diese Effekte wurden sowohl mit lebenden, als auch mit hitzeinaktivierten Bakterien und mit gereinigtem LAM beobachtet. Eine Vorinkubation von J774-Mausmakrophagen mit TNF-a beeinflußte das intrazelluläre Überleben von M. ptb: nach niedriger Dosis war das Überleben verbessert, nach hoher Dosis jedoch war das Abtöten schneller und effizienter (BALCEWICZ-SABLINSKA et al. 1999). Wie sich die oben genannten Zytokine sowie die iNOS in der Infektion mit M. ptb verhalten und welchen Einfluß sie auf das intrazelluläre Überleben von M. ptb in primären bovinen Makrophagen haben, ist bislang nicht vollständig geklärt. Es wird über M. ptb-spezifische Mechanismen spekuliert, da im Gewebe experimentell infizierter Lämmer eine signifikant geringere Menge IFN-g mRNA gefunden wurde (BEGARA-MCGORUM et al. 1998) und IFN-g nur geringe Effekte auf das intrazelluläre Überleben von M. ptb in bovinen Monozyten hatte (ZHAO et al. 1997). Dieser geringe antibakterielle Effekt von IFN-g in vitro steht im Gegensatz zu Untersuchungen anderer Mykobakterien und wurde durch ungenügende Produktion von NO erklärt, welches im zellfreien System zum Abtöten der Bakterien führen kann (ZHAO et al. 1991). 24 Schrifttum Die Hemmung der Ansäuerung (siehe auch B.3) ist ein weiterer möglicher Mechanismus, die Abwehr des Makrophagen zu umgehen. KUEHNEL et al. (2001) konnten zeigen, daß M. ptb in murinen Mausmakrophagen in der Lage ist, die Ansäuerung des endosomalen Netzwerkes fast vollständig zu verhindern. Ob dieses Phänomen auch in bovinen Makrophagen stattfindet, wurde bislang nicht untersucht. 25 Material und Methoden C Material und Methoden C.1 Material Die verwendeten Chemikalien, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien sind im Anhang aufgeführt (siehe I.1 und I.2). Alle verwendeten Geräte sind im Geräteverzeichnis unter der entsprechenden Hochzahl zu finden (siehe I.3). C.2 Methoden C.2.1 Zellkultur C.2.1.1 Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis Benötigte Lösungen: Watson-Reid-Medium: L-Asparagin 5 g Glucose 10 g Diammoniumcitrat 2 g Eisenammoniumcitrat 75 mg NaCl 2 g Kaliumdihydrogenphosphat 2 g MgSO4 x 7 H2O 1 g ZnSO4 x 7 H2O 10 mg CaCl2 x 2 H2O 2 mg Glycerin 63 ml A. dest ad. 1 l pH-Wert mit NaOH auf 5,6 einstellen; nach dem Autoklavieren 2 mg Mycobactin und 4 g Natriumpyruvat dazugeben In sämtlichen Versuchen wurde der M. ptb-Stamm 6783 verwendet. Dabei handelt es sich um einen Feldstamm, der 1996 von SCHEIBL erstmalig beschrieben wurde. Zur langen Aufbewahrung wurden die Mykobakterien in Watson-Reid-Medium als Glycerinstocks in 50 % Glycerin bei -80°C eingefroren. Die Kultivierung erfolgte in 20 ml Watson-Reid-Medium in ZK-Flaschen bei 37°C im Brutschrank Monate. 26 4) über mehrere Material und Methoden Zur Infektion von Makrophagen wurden nur solche Kulturflaschen verwendet, die ein dichtes Bakterienwachstum in Kolonien mit einem Durchmesser von 3-15 mm an der Oberfläche des Mediums aufwiesen. Mit einer sterilen Einmalpipette wurden die Kolonien vorsichtig von der Oberfläche des Mediums abgehoben und in ein 50-ml-RG mit 10 ml Iscove’s Medium ohne Pen/Strep und 30 sterilen Glasperlen überführt. Dieses Gemisch wurde für 15 min augerüttelt 28) , wodurch die Mykobakterien vereinzelt wurden (SILVA et al. 1987). Um noch verbliebene große Bakterienklumpen zu entfernen, erfolgte eine Zentrifugation bei 1000 Upm in der Hermle Zentrifuge 10) für 5 min. Der Überstand mit den vereinzelten Bakterien wurde weiterverwendet, das Pellet mit den größeren Bakterienklumpen wurde verworfen. Die Vitalität der so gewonnenen Bakterien wurde mit der BacLightâ-Färbung überprüft. Vitale Mykobakterien stellen sich in dieser Färbung grün dar, da nur der membrangängige grüne Farbstoff Syto 9â in der Lage ist, in die Zelle einzudringen und die DNA zu färben. Tote Mykobakterien stellen sich zusätzlich rot dar, da bei diesen die Membranen teilweise zerstört sind und somit auch der nicht membrangängige rote Farbstoff Propidiumjodid in den Zellkern eindringt und die DNA färbt. Hierzu wurden 100 µl Bakteriensuspension in einer Tischzentrifuge 26) bei 12.000 Upm für 5 min zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und das Pellet in 100 µl BacLightâ-Lösung (nach Angaben des Herstellers gemischt) resuspendiert. Nach einer Inkubation von 15 min bei Raumtemperatur erfolgte eine Zentrifugation wie oben. Der Überstand wurde abgesaugt, das Pellet in 100 µl A. bidest. resuspendiert und erneut wie oben zentrifugiert. Dies wurde wiederholt und das Pellet schließlich in 10 µl A. bidest. aufgenommen. 3 µl dieser Suspension wurden auf einen Objektträger aufgetragen. Ein Deckgläschen wurde aufgelegt und mit Nagellack versiegelt, um ein Austrocknen zu verhindern. 27 Material und Methoden Die mikroskopische Beurteilung des prozentualen Verhältnisses vitaler bzw. toter Mykobakterien erfolgte durch Fluoreszenzmikroskopie 8) bei 1000facher Ver- größerung. Die Mykobakterien wurden nur verwendet, wenn mehr als 70 % der 200 gezählten Zellen grün, also vital waren. C.2.1.2 Primäre bovine Makrophagen (PBMs) C.2.1.2.1 Gewinnung und Kultivierung Hämatopoetische Stammzellen reifen im Blut über Monoblasten, Promonozyten und Monozyten zu Promakrophagen, die in Körpergeweben schließlich zu unterschiedlichen Makrophagen ausdifferenzieren. Im Blut befinden sich also monozytäre Zellen verschiedener Reifungsstadien, von denen nur die späteren Stadien zur Adhärenz befähigt sind. Die Methode der Teflonkultivierung beruht auf dem Prinzip, sämtliche Reifungsstadien zu Promakrophagen ausdifferenzieren zu lassen, damit die Ausbeute möglichst hoch und die Zellpopulation möglichst synchron ist. Am Teflonbeutel können die Zellen nicht adhärieren, so daß ihnen zur endgültigen Ausdifferenzierung dieses essentielle Signal fehlt. Dem Medium im Teflonbeutel wird jedoch fötales Kälberserum (FCS) zugegeben, welches zur Reifung bis zum Promakrophagen führt. Aus dem „buffy coat“, dieser entsteht durch starke Zentrifugation von Blut zwischen dem Pellet aus Erythrozyten und dem Überstand mit Thrombozyten und besteht aus der Fraktion der Leukozyten, werden durch Waschen bzw. Lyse Thrombozyten und Erythrozyten möglichst vollständig entfernt. Durch Dichtezentrifugation werden die Leukozyten isoliert und nach weiterem Waschen ausgezählt. Mit einer Zellkonzentration von 6 Mio. Leukozyten pro ml Medium wird die Suspension für 8 Tage bei 37°C und 8 % CO2 in Teflonbeuteln inkubiert. Anschließend werden die ausgereiften Promakrophagen gewaschen und gezählt. Sie sind leicht anhand ihrer Göße und Granularität von den verbliebenen Lymphozyten und Zelltrümmern zu unterscheiden. 28 Material und Methoden Benötigte Lösungen: ACD-Puffer (pH 7,3-7,35) Citratpuffer (pH 7,3-7,35) Lysepuffer (pH 7,3-7,35) PBS (pH 7,3-7,35) PBS-EDTA Iscove’s Medium 140 mM C6H8O7 x H2O, 200 mM C6H5Na3O7x 2H2O, 220 mM C6H12O6 (wasserfrei) 30,0 mM C6H8O7 x H2O, 4,5 mM C6H12O6, 3,0 mM KCl, 100,0 mM NaCl 155,0 mM NH4Cl, 10,0 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA (pH 8,0) 137,0 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 7,4 mM Na2HPO4 x 2H2O, 1,5 mM KH2PO4 150,00 µl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 250,00 ml PBS pH 7,3 – 7,35 ergänzt mit 10 % FCS, 100 µM Glutamin, mit bzw. ohne je 250 U/ml Penicillin und Streptomycin Durchführung: Vor der Blutentnahme wurde der Boden des Raumes gründlich mit Wasser abgespritzt, um den Staubgehalt in der Luft zu senken. Die Einstichstelle am Hals des Tieres wurde großzügig mit 70%igem Alkohol desinfiziert; die Blutentnahme erfolgte mit einer Braunüle (G12, 8 cm). Das Blut wurde unter Schwenken bis zu einer Gesamtmenge von 500 ml in eine sterile 1000-ml-Schottflasche mit 50 ml ACDPuffer aufgefangen. Alle von hier an durchgeführten Arbeiten fanden unter sterilen Bedingungen unter einer Lamina 14) statt. Nach einer Stunde Ruhephase bei Raumtemperatur wurden 400 ml des Blutgemisches auf acht 50-ml-Reaktionsgefäße (RG) verteilt und bei 2800 Upm und 10°C in der Hermle Zentrifuge 10) 25 min zentrifugiert. Deren Bremse wurde bei sämtlichen Schritten ausgestellt, da sonst Verwirbelungen der „buffy coats“ bzw. der Pellets auftreten. Nach der Zentrifugation wurde ein Teil des Überstandes abgesaugt und die „buffy coats“ mit einer sterilen Transferpipette entnommen und in eine 1000-ml-Schottflasche mit 500 ml Citratpuffer überführt. Die Reste des zentrifugierten Blutes wurden mit den übrig gebliebenen 100 ml Blut vermischt, erneut auf acht 50-ml-RG verteilt und wie oben zentrifugiert. Die hier entstandenen „buffy coats“ wurden den ersten hinzugefügt, das Gemisch mit Citratpuffer auf 800 ml aufgefüllt und auf 16 50-ml-RG verteilt. Diese Röhrchen wurden in der Hermle Zentrifuge 10) bei 1350 Upm und 10°C für 12 min zentrifugiert. Anschließend wurden die Überstände, welche ein Gemisch aus Citratpuffer und Thrombozyten darstellten, abgesaugt, die Röhrchen erneut mit Citratpuffer gefüllt und die Zellpellets suspendiert. Dieser Waschvorgang wurde vier- bis fünfmal wiederholt, bis die abgesaugten Überstände klar waren, also nur noch wenige Thrombozyten enthielten. 29 Material und Methoden Jetzt wurden die Zellpellets jeweils in 20 ml Citratpuffer suspendiert, und es erfolgte die Zugabe von 30 ml Lysepuffer. Nach 10 min Inkubation waren die Erythrozyten lysiert, was an einer Farbänderung nach klarem Rot-Schwarz zu erkennen war. Nach einer Zentrifugation für 10 min bei 4°C und 1350 Upm wurden die Überstände abgesaugt. Die verbliebenen Zellpellets waren wenige Millimeter dick und, je nach Effektivität der Lyse, beige bis dunkelrot gefärbt. Die Pellets aller RG wurden in insgesamt 40 ml eiskaltem PBS-EDTA aufgenommen und je 10 ml dieses Gemisches auf 4 ml Ficoll 400 in 15-ml-RG überschichtet. Nun erfolgte eine Zentrifugation in der Hermle Zentrifuge 10) bei 2100 Upm und 4°C für 25 min. Danach wurden alle Arbeiten auf Eis durchgeführt. Die bei der Zentrifugation entstandene intermediäre Phase enthielt sowohl Monozyten als auch Lymphozyten. Sie wurde mit einer sterilen Transferpipette in ein 50-ml-RG überführt, das Gemisch mit eiskaltem PBS in 50 ml suspendiert und in der Hermle Zentrifuge 10) bei 4°C und 1350 Upm für 10 min zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstandes wurde das Pellet in eiskaltem Iscove’s Medium mit Pen/Strep resuspendiert und die Monozyten gezählt. Anschließend wurden je 25 ml des Gemisches bei einer Zellkonzentration von 6 Mio. Leukozyten pro ml Medium in Teflonbeutel gefüllt und dieser mit einem Schweißgerät 23) verschweißt. Die Teflonbeutel wurden nun für 8 Tage bei 8 % CO2 und 37°C im Brutschrank 3) inkubiert. Zum Ernten wurden die nur locker adhärierten Zellen durch Schwenken von der Beutelwand gelöst und vermischt, die Suspension steril aus den Beuteln entnommen und in 50-ml-RG überführt. Nach einer Zentrifugation in der Hermle Zentrifuge 10) bei 4°C und 1200 Upm für 8 min wurden die Überstände entfernt, die Pellets mit eiskaltem PBS suspendiert und in vier 50-ml-RG gepoolt, die anschließend mit eiskaltem PBS auf 50 ml aufgefüllt wurden. Nach erneuter Zentrifugation wie oben wurden die Überstände abgesaugt, die Pellets mit Iscove’s Medium ohne Pen/Strep suspendiert, in einem 50-ml-RG gepoolt und auf 10 ml mit Iscove’s Medium ohne Pen/Strep aufgefüllt. In dieser Zellsuspension wurden nun die Promakrophagen gezählt. Diese waren morphologisch anhand ihrer Größe und Granularität leicht von den übrigen Zellen zu unterscheiden. Anschließend wurden die Zellen in einer Konzentration von 2,5 Mio. Promakrophagen pro ml Medium ausgesät, so daß sich 30 Material und Methoden folgende Zellzahlen pro Well bzw. Schale ergaben: 1,25 Mio. in 24 Well Platte (1,9 cm2), 3,75 Mio. in 6 Well Platte (9,6 cm2), 5 Mio. in kleiner ZK-Schale (21 cm2). Nach einer Adhärenz von drei bis vier Stunden bei 8 % CO2 und 37°C wurden die ZK-Schalen viermal gründlich mit 37°C warmem PBS gewaschen, um die nichtadhärenten Zellen zu entfernen. Nach erneuter Inkubation von zwei Tagen in Pen/Strep-freiem Iscove’s Medium wurden die PBMs wiederum mit warmem PBS gewaschen, einen Tag in frischem Medium weiter inkubiert und schließlich für die Infektion verwendet. Die Stimulation sowie die Sekundärstimulation mit LPS bzw. IFN-g (freundlicherweise überlassen von Prof. T. W. Jungi, Institut für Veterinärvirologie, Unviersität Bern, Schweiz) erfolgte wie in D.1.4 und D.2.5 beschrieben. C.2.1.2.2 Bestimmung der Zellzahl Das Verwenden der PBMs für Infektionsversuche setzt eine Stabilität der Zellkultur zumindest für den Zeitraum der Versuche, also für 72 Stunden, voraus. Aus diesem Grunde wurde die Zahl adhärenter Zellen nicht-infizierter sowie infizierter PBMs in Kultur gemessen. Hierzu wurden die PBMs enzymatisch durch das Enzymgemisch Akutase (Enzymgemisch; nach Angaben des Herstellers PAA eingesetzt) wie folgt abgelöst. Durchführung: Die Zellen wurden zweimal gründlich mit 37°C warmem PBS gewaschen und das PBS möglichst restlos entfernt. Anschließend wurden 750 µl ebenfalls auf 37°C temperierter Akutase pro Well aufpipettiert. Nach einer Inkubation von 10 min bei 37°C und 8 % CO2 war der größte Teil der PBMs bereits vom Boden gelöst. Die restlichen, noch adhärenten PBMs ließen sich durch leichtes Tippen des Fingers gegen den Boden der ZK-Schale lösen. Mit Zugabe von 750 µl Iscove’s Medium ohne Pen/Strep pro Well wurde die Akutase durch das enthaltene FCS inaktiviert. Die Zellen wurden mit Hilfe der Neubauerkammer ausgezählt (LINDL 1987). 31 Material und Methoden C.2.2 Infektionsversuche C.2.2.1 Standardinfektionsversuch Durchführung: Für die Versuche mit hitzeinaktivierten Mykobakterien erfolgte ein Erhitzen der Bakterien für 15 min bei 85°C im Wasserbad 29) . Die jeweilige Bakteriensuspension wurde in Iscove’s Medium auf eine OD660 von 0.1 eingestellt und im Wasserbad 29) auf 37°C temperiert. Das Medium wurde von den PBMs entfernt und durch die Infektionssuspension ersetzt. Verwendet wurden folgende Mengen: 500 µl für 24 Well-, 1500 µl für 6 Well-, 2000 µl für kleine ZK-Schale. Nach einer Inkubation von zwei Stunden bei 37°C und 8 % CO2 wurde die Infektionssuspension entfernt und die Schalen dreimal mit warmem PBS gründlich gewaschen, um nicht-phagozytierte Mykobakterien zu entfernen. Anschließend erfolgte die weitere Inkubation der Zellen in Iscove’s Medium bei 37°C und 8 % CO2. Nicht infizierte und als Kontrolle behandelte PBMs wurden bezüglich der Medienwechsel sowie der Waschschritte identisch behandelt. Die Verwendung von Bafilomycin, einem ATPase-Blocker, erfolgte wie in D.2.4 beschrieben. Das Durchführen der Reinfektionsversuche mit vitalen sowie hitzeinaktivierten M. ptb erfolgte wie in D.2.5 beschrieben. C.2.2.2 Bestimmung der Infektionsraten Nun sollte überprüft werden, wieviele Makrophagen die Mykobakterien der Infektionssuspension phagozytierten, also wie hoch die Infektionsrate war. Durchführung: Zur Bestimmung der Infektionsraten der PBMs wurde die Infektion in 24 Well Platten durchgeführt, in denen Glasdeckgläschen lagen, so daß ein Teil der PBMs am Glas adhärierte. Die Infektionen wurden ansonsten wie in C.2.2.1 beschrieben 32 Material und Methoden durchgeführt. Zu den jeweiligen Zeitpunkten wurden die Deckgläschen entnommen, luftgetrocknet, hitzefixiert und anschließend nach Ziehl-Neelsen gefärbt (WAGENER 1966). Hierfür wurde das Deckgläschen auf einen Objektträger gelegt, dieser mit Karbolfuchsin überschichtet und über dem Bunsenbrenner erhitzt, bis das Karbolfuchsin Blasen schlug. Nach 2 - 3 min Kochen wurde die Färbelösung abgegossen. Anschließend wurde der Objektträger in 3%igem salzsaurem Alkohol geschwenkt, bis er farblos war (ca. 30 sek). Hierbei entfärben sich alle nicht säurefesten Zellbestandteile, die säuerefesten Mykobakterien behalten den roten Farbstoff. Nach Abspülen mit Wasser erfolgte die Gegenfärbung mit Methylenblau für 15 sek. Schließlich wurde der Objektträger mit Wasser abgespült und abgetrocknet. Die Zellen stellen sich unter dem Mikroskop 16) bei 800facher Vergrößerung in dieser Färbung blau dar, Mykobakterien sind rot gefärbt (siehe Abb. 1). Es wurden 80 bis 110 Zellen nach drei Kriterien ausgezählt: a) Zellen ohne Mykobakterien, b) Zellen mit 1-50 Mykobakterien und c) Zellen mit über 50 Mykobakterien. 10 µm Abbildung 1: vitale Mykobakterien in PBMs, 8 h p. i., gefärbt nach Ziehl Neelsen Mykobakterien stellen sich rot, Zellen blau dar 33 Material und Methoden C.2.2.3 Bestimmung der Überlebensraten von M. ptb in PBMs Für die Tauglichkeit des Modells war neben dem Überleben der PBMs das Überleben der Mykobakterien unerläßlich. Deshalb wurden auch die Überlebensraten phagozytierter M. ptb, also die Zahl Kolonie-bildender Einheiten (KBE) pro Makrophage, gemessen. Durchführung: Hierfür wurden PBMs wie in C.2.1.2.1 bzw. C.2.2.1 beschrieben in kleinen ZKSchalen kultiviert und infiziert. Zu den jeweiligen Zeitpunkten wurden die Zellen in eiskaltem SSTE-Puffer (100,0 mM NaCl, 2,0 mM Tris pH 7,5, 10,0 mM EDTA pH 7,5, 0,5 % SDS mit einem Zellschaber von der Unterlage gekratzt und die PBMs durch Scheren mit Kanüle (G19) und 1-ml-Spritze zerstört. Durch das Zerstören der Zellen lagen die phagozytierten Mykobakterien nun wieder frei in der Suspension vor. Die Suspension wurde in vier Schritten jeweils 1:10 verdünnt, und je 100 µl der Verdünnungen 10-3, 10-4 und 10-5 wurden auf Watson-Reid-Agarplatten aufgebracht. Die Petrischalen wurden sorgfältig mit mehreren Lagen Parafilm sowie Kreppband verschlossen und bei 37°C mindestens vier Monate oder aber, bis eine zählbare Anzahl sichtbarer Kolonien gewachsen waren, im Brutschrank 4) inkubiert. Die KBE wurden durch Auszählen der Kolonien ermittelt. C.2.3 Mikroskopie C.2.3.1 Elektronenmikroskopie Um zu bestätigen, daß sich M. ptb in primären bovinen Makrophagen aus der Teflonkultur in phaogosomalen Vakuolen und nicht etwa frei im Zytoplasma befindet, wurden elektronenmikroskopische Bilder angefertigt. Benötigte Lösungen: Cacodylatpuffer (pH 6,9) 100 mM Cacodylat, 90 mM Saccharose, 10mM MgCl2, 10 mM CaCl2 34 Material und Methoden Durchführung: Für die Transmissions-Elektronenmikroskopie, kurz Elektronenmikroskopie, wurden Zellen wie beschrieben in kleinen ZK-Schalen kultiviert und nach dem Standardinfektionsversuch infiziert. Zu den jeweiligen Zeitpunkten wurden die Zellen in 1 ml eiskaltem Cacodylatpuffer mit 3 % [w/v] Glutaraldehyd und 5 % [w/v] Formaldehyd fixiert und anschließend dreimal mit Cacodylatpuffer gewaschen. Schließlich wurden die Zellen mit 1 % [w/v] Osmiumtetroxid in Cacodylatpuffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend erneut mit Cacodylatpuffer gewaschen und schließlich in 1 ml Cacodylatpuffer mit einem Zellschaber abgekratzt. Diese Suspension wurde in ein 1,5-ml-RG überführt und bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank gelagert. Nach einer Zentrifugation für 3 min bei 2.000 Upm wurden die Zellen in 1,5%igem Agar eingebettet. Kleine Agarstücke wurden mit einer Reihe Acetongradienten dehydriert und schließlich in Spurr resin eingebettet. Ultradünnschnitte wurden mit Glasmessern 9) durchgeführt. Die Schnitte wurden 30 min bei 40°C in 0,5%igem Uranylacetet (pH 4,5) und 30 min bei 20°C in 1%igem Bleicitrat im Ultrostainer kontrastiert. Die Schnitte wurden im Elektronenmikroskop 5) bei 80 27) kV durchgemustert. C.2.3.2 Konfokale Laserscanning Mikroskopie Zur Bestimmung des intraendosomalen pH-Wertes mit FITC-Dextran mußten die FITC-Dextran-Partikel und die Mykobakterien in den Makrophagen größtenteils kolokalisiert sein. Aufgrund der Dicke der Makrophagen und der damit verbundenen Streulichtproblematik wurde diese Kolokalisierung in der konfokalen Laserscanning Mikroskopie, kurz Konfokalmikroskopie, untersucht. Die Optik des Konfokalmikroskops erlaubt es, optische Schnitte mittels Laser in relativ dicken Präparaten zu erstellen. Somit kann die Lokalisierung des Farbstoffes in Relation zu den Bakterien eindeutig bestimmt werden. 35 Material und Methoden Durchführung: Hierfür wurden die Zellen in 24 Well Platten kultiviert, in denen sich Glasdeckgläschen befanden, so daß ein Teil der Zellen am Glas adhärierte (siehe C.2.2.2). Die zu verwendenden Mykobakterien wurden in der Nacht zuvor mit 1 µg/ml Sulpho-NHS-Biotin in PBS bei Raumtemperatur inkubiert. Sulpho-NHS-Biotin markiert Proteine an der Bakterienoberfläche durch die Bildung einer Succinyldiesterbindung. Um überschüssiges Sulpho-NHS-Biotin zu binden und zu entfernen, wurden die Bakterien 30 min. in 1 mol Glycin-PBS inkubiert und anschließend zweimal darin gewaschen. Dann wurden sie in der jeweilig benötigten Menge Medium aufgenommen. Die Infektion erfolgte für zwei Stunden als Koinkubation der markierten Mykobakterien mit 1 mg/ml FITC-Dextran. Dann wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und für 15 min mit 2%igem Paraformaldehyd bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend erfolgte ein dreimaliges Waschen mit PBS mit 5 % FCS. Schließlich wurde das FCS-haltige PBS durch PBS mit 1 µg/ml TexasRed-Streptavidin ersetzt, welches an Biotin bindet und bei 546 nm Anregungs Wellenlänge eine Rotfluoreszenz zeigt. Nach weiteren 20 min wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit der Zellseite nach unten auf einen Objektträger in 10 µl Mowiolâ mit 10 mg/ml DABCOâ gelegt, um ein Austrocken und Ausbleichen zu verhindern. Die Deckgläschen wurden mit Nagellack versiegelt und bis zur Untersuchung bei 4°C gelagert. Die Konfokalmikroskopie wurde mit einem Leica DM-IRBE konfokalen Laserscanning Mikroskop durchgeführt, ausgestattet mit einem Plan-Apo 100x/1.4 n.a. Ölimmersions-Objektiv und einem Argon/Krypton-Laser (Leica, Bensheim). Die Auswertung der Bilder Konfokalmikroskopie und erfolgte Adobe mit der Standardsoftware Photoshop (Adobe von Systems Leica für Incorporated, Amsterdam, Holland). Eine Kolokalisation der Grünfluoreszenz des FITC mit der Rotfluoreszenz des TexasRed resultierte in einer Gelbfluoreszenz und bedeutete eine Kolokalisierung des FITC-Dextran mit den Mykobakterien. Es wurden 200 Mykobakterien in Form von roten und gelben Fluoreszenzen ausgezählt. 36 Material und Methoden C.2.4 FACS-Analyse Nach der Phagozytose befinden sich Bakterien in Phagosomen, welche Marker früher Endosomen tragen. Sie reifen innerhalb Minuten bis weniger Stunden heran und tragen dann Marker später Endosomen. Hauptunterschiede dieser ineinander übergehender Endosomentypen sind zum einen die Oberflächenmarker, die erst eine Zuordnung in frühe und späte Typen erlauben, zum anderen der intraendosomale pH-Wert. Dieser liegt nach der Phagozytose zwischen 6,3 und 6,5, in reifen Phagosomen mit Markern später Endosomen jedoch etwa bei pH 4,5-5,5. In diesem sauren pH-Wert haben Enzyme das optimale Mileu zum Verdau des phagozytierten Materials. Somit stellt die Ansäuerung des Phagosoms einen wichtigen Schritt in der Phagosomenreifung dar. Als Mittel der Wahl wurde die FACS-("fluorescence activated cell sorting"-)Analyse verwendet. FACS besitzt den Vorteil, daß eine sehr große Zellzahl (ca. 300 - 500 Zellen pro Sekunde) anhand von physikalisch-morphologischen und Fluoreszenzeigenschaften qualitativ und quantitativ charakterisiert werden kann. Im Verlauf der Messung im FACS-Gerät werden die Makrophagen einzeln durch einen Laserstrahl geführt und dabei das Durchlicht, zur Messung der Zellgröße, das 90°-Streulicht zur Bestimmung der Granularität sowie bis zu drei unterschiedliche Fluoreszenzen (hier: 490 nm sowie 540 nm) detektiert. FITC ist ein Fluorochrom, welches bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm pHabhängig Fluoreszenz emmitiert (SCHLESINGER 1994), je niedriger der pH-Wert, desto schwächer die Fluoreszenz. Die internalisierte Menge an FITC-Dextran kann zwischen den Proben anhand der nicht-pH-abhängigen Fluoreszenz bei 546 nm abgeglichen werden. Dextran wird von der Zelle aufgenommen, wo es anfänglich in frühe Endosomen, in der weiteren Endosomenreifung in späte Endosomen und Lysosomen gelangt. Eine eventuelle Änderung des pH-Wertes durch Mykobakterien wird als Änderung der Fluoreszenzintensität angezeigt. 37 die Material und Methoden Benötigte Lösungen: pH-Eichpuffer 10 mM Nigericin, 1 mM MgCl2, 105 mM KCl pH-Werte wurden mit unterschiedlichen Mengen an KH2PO4 sowie NaHPO4 auf 5,0 bis 8,0 in 0,5-Schritten eingestellt Durchführung: Die Zellen wurden wie oben beschrieben in kleinen ZK-Schalen kultiviert und anschließend mit M. ptb OD660 0,1 und 5 mg/ml FITC-Dextran inkubiert. Nach zwei Stunden wurden die PBMs durch dreimaliges Waschen mit warmem PBS von nicht internalisierten Mykobakterien bzw. FITC-Dextran befreit und wie in C.2.1.2.2 beschrieben durch Akutase (Enzymgemisch; wurde nach Angaben des Herstellers PAA eingesetzt) abgelöst. Die Zellsuspension wurde zu Portionen à 300 µl auf acht 1,5-ml-RG verteilt, in einer Tischzentrifuge 26) bei 2.000 Upm für 1 min zentrifugiert und die Überstände entfernt. Sieben Pellets wurden verwendet, um eine pHEichkurve zu erstellen, das achte wurde in 300 µl eiskaltem PBS aufgenommen. Zum Erstellen der Eichkurve wurden sieben Eichpuffer mit unterschiedlichen pHWerten (5,0 bis 8,0) verwendet. Je ein Zellpellet wurde in je 300 µl eines der eiskalten pH-Eichpuffer aufgenommen. Die Proben wurden sofort per FACS-Analyse im FACS-Scan-Gerät 7) gemessen. Insgesamt 10.000 Ereignisse wurden gezählt. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der Zellen in den Eichpuffern nach Intensitätsabgleich anhand der Fluoreszenz bei 546 nm wurde verwendet, um die Eichkurve des jeweiligen Experimentes zu erstellen. Die Fluoreszenzemission der Zellen in den Puffern der pH-Werte 5,0-7,5 wurden als prozentuale Fluoreszenzintensität der Zellen im Eichpuffer pH 8,0 dargestellt. Der pH-Wert des Testers wurde anhand dessen Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Eichkurve errechnet. Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Softwareprogramm WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, USA). 38 Material und Methoden C.2.5 Molekulargenetische Methoden C.2.5.1 RT-PCR Die RT-PCR bietet eine Möglichkeit, die exprimierte mRNA eines Gens und somit dessen Aktivität zu quantifizieren. C.2.5.1.1 Gewinnung von RNA nach CHOMCZYNSKI u. SACCHI (1987) Bei dieser Methode werden die Zellen in Guanidinthiozyanat homogenisiert und anschließend einer saueren Phenolextraktion unterzogen. Nach Zugabe von Natriumacetat, Phenol sowie Chloroform/Isoamyalkohol und der anschließenden Zentrifugation ist die DNA in der organischen Phase gelöst, die Proteine befinden sich in der Interphase, die RNA in der wässrigen, oberen Phase. Nach Isopropanolpräzipitation wird das RNA-Pellet erneut in Guanidinthiozyanat gelöst, in Isopropanol präzipitiert und mit Ethanol gewaschen. Benötigte Lösungen: Denaturierungspuffer 4,0 M Guanidinthiocyanat, 25,0 mM Natriumcitrat, 0,5 % Sarkosyl, 100,0 mM Mercaptoethanol Durchführung: Die PBMs wurden je nach Versuchsaufbau wie in Abschnitt C.2.1 und C.2.2 beschrieben kultiviert und infiziert. Die Gewinnung der mRNA erfolgte bei allen Versuchen in kleinen ZK-Schalen wie folgt: Das Medium wurde restlos abgesaugt, die ZK-Schalen auf Eis inkubiert und die Zellen einmal mit eiskaltem PBS gewaschen. Ab hier erfolgten sämtliche Arbeiten auf Eis, um die RNA vor dem Abdauen durch RNasen zu schützen. Es wurde 1 ml eiskaltes PBS aufpipettiert, die Zellen mit einem Zellschaber vom Boden gekratzt und die Zellsuspension in ein 2-ml-RG überführt. Nun erfolgte eine Zentrifugation in der Tischzentrifuge 26) bei 13.000 Upm für 3 min. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt und das Zellpellet für mindestens 2 Stunden, höchstens aber 3 Tage bei -70°C eingefroren. Zur RNA-Präparation wurden die Zellen auf Eis aufgetaut und 750 µl Denaturierungspuffer aufpipettiert. Mit Kanüle (G19) und 1-ml-Spritze wurden 39 Material und Methoden die Zellen durch zehnmaliges Aufziehen geschert, somit Zellen, Zellkerne und DNA zerstört und die RNA freigesetzt. Zu den zerstörten Zellen wurden 75 µl 2 M Natriumacetatlösung (pH 4,0) gegeben, als Ansäuerung zur sauren Phenolextraktion. Nach kurzem Aufrütteln wurden 750 µl Phenol zur Proteinextraktion hinzugefügt und erneut aufgerüttelt. Nach Zugabe von 150 µl Chloroform:Isoamylalkohol (49:1) und Aufrütteln wurde das Gemisch milchig. Nun erfolgte eine Inkubation auf Eis für 15 min. Die anschließende Zentrifugation bei 4°C und 11.000 Upm in der Kühlzentrifuge 13) für 20 min trennte die phenolische Phase mit Proteinen und DNA von der wässrigen Phase mit RNA. Die wässrige obere Phase wurde vorsichtig aufgenommen, in ein neues 2-ml-RG überführt, mit derselben Menge Isopropanol (ca. 750 µl) versetzt und aufgerüttelt. Bei der anschließenden Inkubation bei -20°C für eine Stunde fiel die RNA aus. Durch eine Zentrifugation bei 4°C und 11.000 Upm für 20 min wurde die RNA pelettiert, der Überstand abgesaugt. Das Pelett wurde erneut in 300 µl Denaturierungspuffer aufgenommen und in ein 1,5-ml-RG überführt. Nach Zugabe von 300 µl Isopropanol wurden die Gefäße erneut für 30 min bei -20°C inkubiert und anschließend bei 4°C und 12.000 Upm für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und nach kurzem Anzentrifugieren vollständig entfernt. Das Pellet wurde in 400 µl 80%igem Ethanol aufgenommen und für 15 min auf Eis inkubiert. Durch mehrmaliges Aufrütteln wurden die Salze gelöst. Nach Zentrifugation bei 4°C und 12.000 Upm für 10 min wurde der Überstand abgesaugt und das Pellet getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde in 22 µl eiskaltem A. bidest. (SIGMA) aufgenommen und 2 µl zur Konzentrationsmessung der RNA im Photometer 20) verwendet. Die gewonnene RNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -70°C aufbewahrt. C.2.5.1.2 Bestimmung der RNA-Konzentration im Photometer Um annähernd gleiche RNA-Mengen in die Reverse Transkription und damit später cDNA in die PCR einsetzen zu können, muß die Konzentration der RNA festgestellt werden. Dies erfolgt anhand der Lichttransmission bei definierten Wellenlängen im Photometer. Hier kann gleichzeitig die Reinheit der RNA errechnet werden. Gemessen wird die Transmission bei 260 sowie 280 nm. Anhand der Werte bei 40 Material und Methoden 260 nm wird abhängig vom eingesetzten Verdünnungsgrad die RNA-Konzentration festgestellt (z. B. Wert bei 260 nm mal 2 bei einer Verdünnung von 1:50). Die Werte bei 280 nm dividiert durch jene bei 260 nm ergeben die Reinheit der Probe. Dieser Wert sollte zwischen 1,7 und 2,2 liegen. C.2.5.1.3 DNase-Behandlung von RNA Um auch die letzten eventuell vorhandenen DNA-Verunreinigungen zu entfernen, wurden die Proben mit DNase (verdaut DNA) behandelt. Benötigte Lösungen: DNase-Mastermix Präzipitationsmix 12,5 mM Tris, 62,5 mM KCl, 7,5 mM MgCl2, 2,0 U/µl RNase Inhibitor, 2,5 U/µl DNase I 7 µg/µl Glykogen, 840 mM Natriumacetat pH 5,2, 86 % [v/v] Ethanol Durchführung: Zu den je 20 µl gRNA wurden je 80 µl DNase-Mastermix pipettiert und für 30 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Die folgenden Schritte fanden wiederum auf Eis statt. Zur Phenolextraktion der Ansätze wurden 100 µl equilibriertes Phenol zugegeben, anschließend aufgerüttelt und bei 4°C und 12.000 Upm in der Kühlzentrifuge 13) für 5 min zentrifugiert. Die obere, wässrige Phase wurde vorsichtig abpipettiert und in ein neues 1,5-ml-RG überführt. Zum Phenol wurden 100 µl A. bidest. (SIGMA) pipettiert und erneut aufgerüttelt sowie zentrifugiert. Die obere, wässrige Phase wurde wiederum vorsichtig abgenommen und der ersten hinzugefügt. Zu diesen 200 µl wurden für die Ethanolpräzipitation der RNA mit Natriumacetat je 675 µl Präzipitationsmix gegeben, aufgerüttelt und für 2 Stunden bei -70°C oder über Nacht bei -20°C inkubiert. An diesen Inkubationsschritt schloß sich eine Zentrifugation bei 4°C und 12.000 Upm für 15 min an. Der Überstand wurde verworfen, das Pelett in 400 µl eiskaltem 80%igem Ethanol aufgenommen und erneut bei 4°C und 12.000 für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum verworfen, das Pelett getrocknet und anschließend in einer Konzentration von 0,5 µg gRNA/µl in A. bidest. (SIGMA) aufgenommen. Bis zur weiteren Verwendung wurde die RNA bei -70°C aufbewahrt. 41 Material und Methoden C.2.5.1.4 Reverse Transkription Bei der Reversen Transkription wird die vorhandene RNA durch das Enzym Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Durch das Verwenden eines oligo-dTPrimers wird fast ausschließlich mRNA transkribiert, da sich diese durch eine poly(A)-Sequenz auszeichnet. Benötigte Lösungen: RT-Mastermix 1 x RT-Puffer (GIBCO), 15 mM Dithiothreitol (DTT), 0,04 µM oligo dT Primer, 0,03 mM dNTP each Durchführung: Je Ansatz wurden 2 µg der DNase-verdauten RNA mit 14 µl RT-Mastermix auf Eis vermischt und im Thermocycler 25) erst 5 min bei 65°C, dann 10 min bei 37°C inkubiert. Das RG wurde sofort auf Eis gestellt, 50 U RTase zupipettiert und gemischt. Anschließend erfolgte eine weitere Inkubation bei 37°C für 50 min zur Durchführung der eigentlichen Reversen Transkription. Das folgende Erhitzen für 5 min auf 75°C diente der Inaktivierung der RTase. Zur Vorbereitung für die PCR wurde zu jedem Ansatz von 20 µl cDNA-Mix 80 µl A. bidest zupipettiert und vermischt. Bis zur weiteren Verwendung wurde die hergestellte cDNA bei -70°C gelagert. C.2.5.1.5 PCR Die PCR dient der Amplifikation der hergestellten cDNA zur anschließenden Auftrennung und Quantifizierung in der Gelelektrophorese. Bei der PCR synthetisiert Taq, eine spezielle DNA-Polymerase, einen neuen DNAStrang an einer einzelsträngigen Nukleinsäurematritze (in diesem Fall die cDNA). Dazu werden Startermoleküle ("Primer") benötigt, die an die dentaurierte MatrizenDNA binden (hybridisieren). Von deren 3'-Ende aus synthetisiert die Polymerase den neuen DNA-Strang. 42 Material und Methoden 1. Denaturierung des zu amplifizierenden DNA-Doppelstranges: Bei etwa 90-94°C wird die Matrizen-DNA aufgeschmolzen. Es entstehen einzelsträngige DNAMoleküle. 2. Primer-Hybridisierung an die einzelsträngige DNA (sog. "Annealing"): Die synthetischen Oligonukleotide binden bei Temperaturen von etwa 50-60°C an die komplementären Sequenzen der Matrizen-DNA und leiten auf diesem Weg die Amplifikation des dazwischen liegenden Sequenzabschnittes ein. 3. Synthese des Gegenstranges (sog. "Extension"): Vom 3'-Ende der Primer ausgehend wird der Gegenstrang der Matrizen-DNA durch eine DNA-Polymerase synthetisiert. Die hier gewählte Temperatur entspricht in der Regel dem Temperaturoptimum der verwendeten Polymerase. Durch die Wahl eines gegenläufig orientierten Primerpaares kann die DNA-Sequenz zwischen den Primern geziehlt vervielfältig werden. Das entscheidende Prinzip der PCR ist die zyklische Wiederholung der einzelnen Reaktionsschritte, wodurch die Ausgangsmenge an DNA bis zu einem Faktor von etwa 107 amplifiziert werden kann. Die Sequenzen der verwendeten Primer sowie die aus der RT-PCR resultierenden Fragmentgrößen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Benötigte Lösungen: PCR-Mastermix: 1 x PCR-Puffer, 1,88 mM MgCl2, 0,25 mM dNTP each, 0,25 µM Primer, 0,05 U/µl Taq-Polymerase Durchführung: Je 10 µl der verdünnten cDNA wurden mit je 40 µl PCR-Mastermix in einem 200-µlRG gemischt und im Thermocycler 25) amplifiziert. Nach der initialen Denaturierung für 3 min bei 91°C erfolgte die Amplifikation je nach Produkt in 30-40 Amplifikationsschritten, bestehend aus Denaturierung (1 min bei 94°C), „Annealing“ und Synthese (2 min bei 72°C). Die „Annealing“-Temperaturen sowie die Anzahl der Amplifikationszyklen sind ebenfalls Tabelle 1 zu entnehmen. Abschließend folgten als terminale Synthese 7 min bei 72°C. Danach wurden die PCR-Produkte bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert. 43 5‘ GTTGCCTGGTCTTCCTGGCTG 5‘ TATGTAGTTGATGAAGATGTC 5‘ TAGAGGAACATCTGGCCAGG 5‘ TGGCAGGGTCCCCTCTGATG 60 °C Annealing 40 Zyklen 60 °C Annealing 37 Zyklen 5‘ AGCTGGCGGAGGAGGTGCTC 60 °C Annealing 5‘ CTTCTGGGCTGGTTCCCAGCAGTCA 5‘ ACCCACTCGTTTGAAGACTGCATCTT 30 Zyklen 32 Zyklen 5‘ GACGGATGCTTCCAATCTG 60 °C Annealing 5‘ ATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTCC 5‘ CAAAGCTCATGCAGAACACCACTT 33 Zyklen 44 IL-10 372 bp ADLER et al. 1995 GM-CSF 471 bp KEEFE et al. 1997 429 bp TNF-a ITO u. KODAMA 1996 309 bp ADLER et al. 1995 251 bp ITO u. KODAMA 1996 394 bp ITO u. KODAMA 1996 IL-6 60 °C Annealing 5‘ AAACAGATGAAGAGCTGCATCCAA 60 °C Annealing 405 bp IL-1b 5‘ CCATGAGGGCATTGGCATAC 5‘ GCTGGAAGGTGGACAGGGAGGCCAGGA 31 Zyklen ITO u. KODAMA 1996 b-Actin 37 Zyklen 5‘ ACGTCGCCTTGGACTTCGAGCAGG 55 °C Annealing Material und Methoden Tabelle 1: verwendete Primer, Quellen und Produktgrößen der ausgewählten Gene, verwendete Annealingtemperatur und Zyklenzahl iNOS Material und Methoden C.2.5.2 Agarosegel-Elektrophorese der PCR-Produkte In der Gelelektrophorese wird die amplifzierte DNA elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht. Benötigte Lösungen: 10x Tris-Borsäure-EDTA-Puffer (TBE) 6x Gel-Ladepuffer 900,0 mM Tris, 890,0 mM Borsäure, 5,8 mM EDTA 15,0 mg Bromphenolblau, 1,5g Ficoll 400, 9,5 ml A. bidest Durchführung: In einer Elektrophoresekammer 6) wurden 95 ml 1,5%iges Agarosegel in TBE mit 1,4 µg/µl Ethidiumbromid gegossen und das ausgehärtete Gel mit 1xTBE übergossen. Je 20 µl des PCR-Ansatzes wurden mit je 5 µl des 6x Gel-Ladepuffers gemischt und auf das Gel aufgetragen. Als Größenmarker diente ein 100-BasenpaarLeiter, von dem 1 µl mit 5 µl 6x Gel-Ladepuffer und 19 µl A. dest. gemischt aufgetragen wurde. Die elektrophoretische Auftrennung der Proben erfolgte bei 80 V (Stromversorgungsgerät 24) ) und wurde gestoppt, wenn die Bromphenolblau-Bande das letzte Drittel des Abschnitts erreicht hatte. Anschließend wurde das Gel unter UV-Licht fotografiert (Kamera digital 11) ) und das Bild im Computer gespeichert. Durch Ethidiumbromid wird DNA im UV-Licht sichtbar gemacht. C.2.5.3 Quantifizierung der Genexpression Das mit UV-Licht bestrahlte Gel, und somit die sichtbaren Banden, wurde photographiert. Die Auswertung der PCR erfolgte anhand der Intensität der einzelnen Banden. Um diese miteinander vergleichen zu können, muß bekannt sein, welche RNA-Mengen im Vergleich aufgetragen wurden. Dies ist durch sogenannte Haushaltsgene möglich. Diese Gene sind dadurch charakterisiert, daß die Regulation ihrer Expression in der jeweiligen Zelle unabhängig von einem Stimulus erfolgt, sie sind konstitutiv exprimiert. Außerdem sind sie für das Überleben der Zelle essentiell. Die Bandenintensität der Haushaltsgene ist also genau dann gleich stark, wenn exakt die gleichen RNA-Mengen eingesetzt wurden. 45 Material und Methoden Dies ist technisch nicht möglich, daher ist es notwendig, die Bandenintensität der untersuchten Gene anhand der Bandenintensität der Haushaltsgene abzugleichen: IC – IH wobei IC = Intensität der Bande des zu untersuchenden Zytokins, Ihg – IH IH = Hintergrundintensität, Ihg = Intensität der Bande des housekeeping genes Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, wurden die Untersuchungen in drei bzw. vier PCR-Ansätzen durchgeführt. In einem zweiten Schritt ist es notwendig, die Intensität der Gele untereinander anzugleichen, zu normalisieren. Hierzu wurde die Summe der Bandenflächen der einzelnen PCRAnsätze untereinander gleichgesetzt. Danach wurden die Werte als Durchschnitt des X-fachen des jeweiligen Kontrollwertes mit Standardabweichung im Diagramm dargestellt. Die Auswertung der Daten erfolgte mit Microsoftâ Excel 97, Microsoft Corporation, USA, und Sigma Plot for Windows 5.00, SPSS, Incorporation, USA. 46 Ergebnisse D Ergebnisse M. ptb verursacht eine chronisch-progressive, nicht therapierbare Enteritis bei Wiederkäuern. Die Pathogenese der Erkrankung ist weitgehend unbekannt. Es gilt als gesichert, daß die Persistenz des Erregers in den Makrophagen der Darmwand eine Schlüsselrolle spielt (COCITO et al. 1994). Von anderen pathogenen Mykobakterien, die ebenfalls in Makrophagen überleben, ist bekannt, daß sie die Effektorfunktionen der Makrophagen modulieren, um nicht abgetötet zu werden (siehe B.3). Im Blut vorkommende Monozyten sind keine einheitliche Zellfraktion, sie befinden sich in unterschiedlichen Reifungsstadien von Promonozyten über Monozyten bis hin zu Promakrophagen (OPPENHEIM u. LEONARD 1989). Wird diese Zellmischung in die Zellkultur verbracht, erhält sie zwei wichtige Differenzierungssignale: zum einen die Adhärenz an das feste Substrat (das Plastik der ZK-Schale), zum anderen das im Medium befindliche Serum (DOUGHERTY u. MCBRIDE 1989). Aufgrund dieser Signale differenzieren die Zellen zu Makrophagen aus. Bisherige Arbeiten mit M. ptb wurden mit Gewebematerial experimentell infizierter Tiere bzw. Vollblut sowie als in vitro-Infektionen mit Blutmonozyten, primären Makrophagen und Zellinien durchgeführt. Zellinien werden im Umgang mit anderen Erregern häufig verwendet, da sie deutlich einfacher in der Handhabung sind, nahezu beliebig viele Zellen zur Verfügung stehen und die einzelnen Zellen annähernd identische Eigenschaften besitzen. In Ermangelung einer bovinen Makrophagenzellinie wurden Arbeiten in bovinen Makrophagen bislang mit frisch isolierten, also primären Makrophagen durchgeführt, wobei hier das Problem der hohen Diversität der Zellpopulation entsteht (siehe auch C.2.1). In dieser Arbeit wird die Eignung des Teflon-Modells primärer boviner Makrophagen (PBMs) nach JUNGI et al. (1996) getestet. Zudem werden die Auswirkungen des intrazellulären Überlebens von M. ptb auf PBMs aus der Teflonkultur untersucht. 47 Ergebnisse D.1 Eignung und Standardisierung des Teflon-Modells Hauptproblem bisher verwendeter primärer boviner Makrophagen war die geringe Infektionsrate (ca. 40 %), die als Ausdruck der Inhomogenität der Zellpopulation gewertet wurde. Daneben war der Anteil verunreinigender Lymphozyten so hoch, daß eine wesentliche Beeinflussung der Makrophagen durch die Lymphozyten und damit eine Verfälschung der Ergebnisse nicht ausgeschlossen werden konnte. Bei dem hier verwendeten Teflon-Modell nach JUNGI et al. (1996) werden die Makrophagen 7-10 Tage in Teflonbeuteln in FCS-haltigem Medium kultiviert. FCS dient als erstes Differenzierungssignal für die Makrophagenvorläuferzellen und führt zur Differenzierung bis zum Promakrophagen (ZEMBALA u. ASHERSON 1989). An der Teflonoberfläche kann keine Adhärenz stattfinden, die Promonozyten und Monozyten differenzieren zu Promakrophagen aus und bleiben in diesem Stadium stehen. Durch das Verbringen auf ZK-Schalen erhalten die Promakrophagen das zweite Signal, die Adhärenz, und differenzieren innerhalb weniger Stunden zu Makrophagen aus (JUNGI et al. 1996). Zur Kultivierung von PBMs im Teflonbeutel wurde das Blut semisteril entnommen. In mehreren Waschschritten wurden die Thrombozyten entfernt, die Erythrozyten anschließend osmotisch zerstört. Durch die nun folgende Dichtezentrifugation wurden die restlichen Erythrozyten und anderen Zellen von den Lymphozyten und Monozyten in verschiedenen Reifungsstadien getrennt. Diese leukozytären Zellen wurden für 8 Tage in Teflonbeuteln kultiviert und anschließend auf ZK-Schalen gegeben. Hier adhärierten die gereiften Promakrophagen, die übrigen Zellen wurden durch Waschen entfernt. Nach weiteren drei Tagen Inkubation wurden die nun reifen Makrophagen in die Versuche eingesetzt. 48 Ergebnisse D.1.1 Makrophagenausbeute Aus einem halben Liter Blut wurden zwischen 800 Mio. und 1,4 Mrd. leukozytäre Zellen isoliert. Nach 8 Tagen im Teflonbeutel wurden die Promakrophagen gezählt; sie waren aufgrund ihrer Größe und Granularität leicht von Lymphozyten und anderen Zellen zu unterscheiden. 40-80 Mio. Promakrophagen wurden gezählt, also etwa 5 % der ursprünglich isolierten monozytären Zellen. Da im Blut etwa 10 % der monozytären Zellen Monozyten sind (LEONHARDT 1990), betrug die Ausbeute bei der hier gewählten Teflon-Methode rund 50 %. D.1.2 Infektion von PBMs aus der Teflonkultur mit M. ptb In Infektionsversuchen ist es wichtig, daß möglichst jede Zelle mindestens ein Bakterium phagozytiert hat, da ansonsten die Ergebnisse eine Mischung aus infizierten und nicht-infizierten Zellen darstellen. Um eine mögliche Auswirkung der Bakterien auf die Makrophagen als Folge sezernierter oder struktureller Bestandteile identifizieren zu können, wurden in sämtlichen Versuchen neben vitalen M. ptb auch hitzeinaktivierte Erreger eingesetzt. Zur Bestimmung der Infektionsrate, d. h. der Anzahl phagozytierter Mykobakterien pro PBM, wurden die Makrophagen mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb infiziert und nach zwei Stunden nicht phagozytierte Bakterien durch Waschen entfernt. Zu drei Zeitpunkten (2, 8 und 24 Stunden p. i.) wurden die Zellen hitzefixiert, nach ZiehlNeelsen gefärbt und infizierte sowie nicht-infizierte Zellen gezählt (siehe C.1.6). In Abb. 2 sind die Infektionsraten von PBMs aus der Teflonkultivierung mit vitalen und hitzeinaktivierten M. ptb im Verlauf von 24 Stunden prozentual als Balkendiagramm mit Standardabweichung dargestellt. Zum Zwecke der Übersichlichkeit sind auf der Y-Achse nur die Werte zwischen 92,5 und 100 % aufgetragen. Es wurden Infektionsraten zwischen 94 und 98 % erreicht. 49 Ergebnisse Infektionsrate [%] 100,0 97,5 95,0 92,5 hT 24 hL 24 T 8h L 8h T 2h 2h L 0,0 Abbildung 2: Infektionsrate, PBMs aus der Teflonkultur mit M. ptb über die Zeit Die PBMs wurden mit vitalen (L) bzw. hitzeinaktivierten (T) M. ptb infiziert, zu den jeweiligen Zeitpunkten hitzefixiert, nach ZiehlNeelsen gefärbt und die infizierten Makrophagen ausgezählt. Dargestellt ist die durchschnittliche Infektionsrate aus drei unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. D.1.3 Adhärenzraten nicht-infizierter sowie infizierter PBMs aus der Teflonkultur Um die Überlebensraten der Mykobakterien (siehe D.1.5) in Relation zur Infektionsrate setzen zu können, sowie um die Stabilität der Kultur zu bestimmen, wurden die Adhärenzraten infizierter sowie nicht-infizierter PBMs aus der Teflonkultur über 72 Stunden bestimmt. Zu diesem Zweck wurden die Makrophagen zu den jeweiligen Zeitpunkten durch Akutase enzymatisch von der Unterfläche abgelöst und gezählt (siehe C.2.1.2.2). In Abb. 3 ist der prozentuale Anteil adhärenter Makrophagen als Balkendiagramm mit Standardabweichung über die Zeit dargestellt. Die Zellzahl vor der Infektion (T0) wurde 100 % gesetzt. 50 Ergebnisse Nach 72 Stunden waren noch 98 % der nicht infizierten PBMs adhärent; bei infizierten Makrophagen lag diese Rate zwischen 60 und 90 %. Offensichtlich ist hier ein deutlicher Unterschied zwischen der Infektion mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb: in der Infektion mit vitalen M. ptb lag die Adhärenzrate zu den Zeitpunkten 48 bzw. 72 Stunden um 24 bzw. 18 % höher als in der Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb. Sowohl infizierte als auch nicht-infizierte PBMs zeichnen sich in diesem System durch eine Adhärenzrate zwischen 60 und 98 % über einen Zeitraum von 72 Stunden aus. Die Kultur ist also über den Untersuchungszeitraum stabil und damit für die Versuche geeignet. adhärente PBMs [%] 100 80 60 40 20 n ic h t in fizie rt v ita le M . p tb h itz e in a k tivie rte M . p tb 0 0 2 8 24 48 72 Z e it [h ] Abbildung 3: Adhärenzraten nicht-infizierter bzw. infizierter PBMs aus der Teflonkultur Die PBMs wurden mit Akutase enzymatisch abgelöst und gezählt. 0 = vor der Infektion; 2, 8, 24, 48 und 72 sind die Zeitpunkte post infectionem. Dargestellt ist der Durchschnitt aus drei unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. 51 Ergebnisse D.1.4 Stimulierbarkeit der PBMs aus der Teflonkultur Als Kriterium für die Homogenität der Zellpopulation sollten Reproduzierbarkeit und Gleichmäßigkeit der Stimulierbarkeit der PBMs getestet werden. Dies sollte auf Basis der Expression ausgewählter, proinflammatorischer Zytokine durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wurden die Zellen mit LPS bzw. IFN-g behandelt. LPS ist Bestandteil der Zellhülle gramnegativer Bakterien und ein potenter Makrophagenstimulator; IFN-g wird von T-Zellen sezerniert und trägt wesentlich zur endogenen Makrophagenaktivierung bei. Überprüft wurden drei proinflammatorische Zytokine (IL-1b, IL-6 und TNF-a), GMCSF als Makrophagenaktivator, IL-10 als deaktivierendes Zytokin sowie die iNOS. Die Makrophagen wurden wie in C.2.1 beschrieben isoliert und kultiviert. Nach drei Tagen Adhärenz wurde frischem Medium 5 µg/ml LPS bzw. 10 U/ml IFN-g zugesetzt. Nach weiterer Inkubation bei 37°C und 8 % CO2 wurden die PBMs zu den jeweiligen Zeitpunkten abgekratzt und die RNA gewonnen. Nach Aufreinigung der RNA wurden RT-PCRs mit ausgewählten Primern durchgeführt (siehe C.2.5.1) Der zeitliche Verlauf der Expression ausgewählter Gene sowie die Höhe der Expression innerhalb 24 Stunden unterscheiden sich wesentlich bei Stimulation mit LPS oder mit IFN-g. In den Abb. 4 und 5 ist die relative Extinktion der Genexpression als Balkendiagramm mit Standardabweichung als Vielfaches der Kontrolle (K) über die Zeit dargestellt. Die Genexpression der proinflammatorischen Zytokine ist bei LPS-Stimulation durch einen Verlauf mit einem „Peak“ nach 2 bzw. 8 Stunden gekennzeichnet. Bei Stimulation mit IFN-g ist neben der geringeren Höhe der Genexpression ein früherer „Peak“ (IL-1b), ein schnelleres Abfallen (IL-6) bzw. ein langsames Ansteigen ohne „Peak“ (TNF-a) zu erkennen. Auch die Expression der übrigen Gene zeichnet sich bei Stimulation mit LPS durch einen Verlauf mit einem „Peak“ bei 2 bzw. 8 Stunden aus. Bei Stimulation mit IFN-g ist wiederum die Höhe der Genexpression wesentlich geringer. Der zeitliche Verlauf der IL-10-Genexpression ähnelt der nach LPS-Stimulation. Die Expression von GM- 52 Ergebnisse CSF sowie der iNOS erreicht jedoch bei IFN-g-Stimulation nach 30 min einen leicht erhöhten Wert, der als Plateau bestehen bleibt. Die hier verwendeten PBMs aus der Teflonkultur sind also sowohl durch LPS, als auch durch IFN-g stimulierbar. Die Expression der ausgewählten Gene unterscheidet sich nach diesen beiden Stimulationen in der Höhe sowie im zeitlichen Verlauf. D.1.5 Überleben von M. ptb in PBMs aus der Teflonkultur Aus den vorherigen Versuchen leitet sich ab, daß PBMs aus der Teflonkultur unter den beschrieben Bedingungen eine relativ homogene Zellpopulation darstellen. Im Folgenden wurden die KBE (Kolonie-bildende Einheiten) pro Makrophage nach Infektion von PBMs aus der Teflonkultivierung mit vitalen M. ptb ermittelt. Hierzu wurden PBMs wie oben beschrieben mit M. ptb infiziert. Die Makrophagenzahl wurde durch Auszählen festgehalten und in einem Paralellansatz die PBMs zerstört, so daß die phagozytierten Bakterien frei wurden. Diese wurden anschließend in drei Verdünnungsstufen ausplattiert und die KBE nach 8-10 Wochen gezählt. Durch Verrechnen dieser beiden Werte ergab sich die Anzahl kolonie-bildender Einheiten pro Makrophage. In Abb. 6 ist das Verhältnis KBE/PBM als Balkendiagramm mit Standardabweichung über die Zeit dargestellt. Die KBE/PBM liegt durchschnittlich zwischen 0,3 und 0,4; pro 10 Makrophagen entstanden also 3 bzw. 4 kolonie-bildende Einheiten. Während des hier untersuchten Zeitraumes von 72 Stunden ändert sich dieses Verhältnis nicht. Die Mykobakterien können in den PBMs aus der Teflonkultur überleben. 53 Ergebnisse IFN-gamma: IL-1 beta 3,0 100 2,5 rel. Genexpression rel. Genexpression LPS: IL-1 beta 120 80 60 40 20 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 K 0,5 h 2h 8h K 24 h LPS: IL-6 8h 24 h IFN-gamma: IL-6 14 50 rel. Genexpression rel. Genexpression 2h 16 60 40 30 20 10 12 10 8 6 4 2 0 0 K 0,5 h 2h 8h 24 h K LPS: TNF-alpha 0,5 h 2h 8h 24 h IFN-gamma: TNF-alpha 3,5 2,5 3,0 rel. Genexpression rel. Genexpression 0,5 h 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 K 0,5 h 2h 8h 24 h K 0,5 h 2h 8h 24 h Abbildung 4: Expression der proinflammatorischen Gene IL-1b (oben), IL-6 (Mitte) und TNF-a (unten) Die PBMs wurden wie in C.1.1 beschrieben isoliert und kultiviert. Nach drei Tagen Adhärenz wurde frischem Medium 5 µg/ml LPS (jeweils links) bzw. 10 U/ml IFN-g (jeweils rechts) zugesetzt. Nach weiterer Inkubation bei 37°C und 8 % CO2 wurden die PBMs zu den jeweiligen Zeitpunkten abgekratzt und die RNA gewonnen. Nach Aufreinigung der RNA wurden RT-PCRs mit ausgewählten Primern durchgeführt. K ist die nicht stimulierte Kontrolle. Dargestellt ist der Durchschnitt aus vier Reversen Transkriptionen zweier unabhängiger Versuche als Vielfaches von K über die Zeit. 54 Ergebnisse LPS: GM-CSF IFN-gamma: GM-CSF 18 2,5 rel. Genexpression rel. Genexpression 16 14 12 10 8 6 4 2,0 1,5 1,0 0,5 2 0 0,0 K 0,5 h 2h 8h 24 h K LPS: IL-10 8h 24 h 5 25 rel. Genexpression rel. Genexpression 2h IFN-gamma: IL-10 30 20 15 10 5 0 4 3 2 1 0 K 0,5 h 2h 8h 24 h K LPS: iNOS 0,5 h 2h 8h 24 h IFN-gamma: iNOS 12 2,5 10 rel. Genexpression rel. Genexpression 0,5 h 8 6 4 2 0 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 K 0,5 h 2h 8h 24 h K 0,5 h 2h 8h 24 h Abbildung 5: Expression von GM-CSF (oben), IL-10 (Mitte) und iNOS (unten) Die PBMs wurden wie in C.1.1 beschrieben isoliert und kultiviert. Nach drei Tagen Adhärenz wurde frischem Medium 5 µg/ml LPS (jeweils links) bzw. 10 U/ml IFN-g (jeweils rechts) zugesetzt. Nach weiterer Inkubation bei 37°C und 8 % CO2 wurden die PBMs zu den jeweiligen Zeitpunkten abgekratzt und die RNA gewonnen. Nach Aufreinigung der RNA wurden RT-PCRs mit ausgewählten Primern durchgeführt. K ist die nicht stimulierte Kontrolle. Dargestellt ist der Durchschnitt aus vier Reversen Transkriptionen zweier unabhängiger Versuche als Vielfaches von K über die Zeit. 55 Ergebnisse 0 ,7 0 ,6 KBE/PBM 0 ,5 0 ,4 0 ,3 0 ,2 0 ,1 0 ,0 0 2 8 24 48 72 Z e it [h ] Abbildung 6: Anzahl kolonie-bildender Einheiten pro PBM Die PBMs aus der Teflonkultur wurden nach dem Standardinfektionsmodell infiziert. Die Anzahl PBMs wurde gezählt, die PBMs zerstört und die so frei gewordenen Bakterien in drei Verdünnungsstufen ausgesät. Nach sechs bis acht Wochen wurde die Zahl kolonie-bildender Einheiten festgehalten. Dargestellt ist das Verhältnis KBE pro PBM über die Zeit als Durchschnitt aus drei unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. D.2 Funktionelle Untersuchungen in PBMs aus der Teflonkultur D.2.1 Elektronenmikroskopie Anhand der elektronenmikroskopischen Aufnahmen sollte bestätigt werden, daß M. ptb in primären bovinen Makrophagen aus der Teflonkultur in phagosomalen Vakuolen liegt. Zu diesem Zweck wurden die PBMs wie beschrieben kultiviert und infiziert (siehe C.2.1 und C.2.2). Die infizierten Makrophagen wurden mit Formaldehyd und Osmiumtetroxid fixiert, in Aceton dehydriert und schließlich in Spurr resin eingebettet. Mit Glasmessern wurden Ultradünnschnitte der Makrophagen angefertigt und im Elektronenmikroskop durchgemustert (siehe C.2.3.1). 56 Ergebnisse In Abb. 7 ist beispielhaft eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines infizierten Makrophagen abgebildet. Wie deutlich zu erkennen (Pfeil) ist der Erreger von einer Membran umschlossen. Dies konnte bei sämtlichen Aufnahmen bestätigt werden. M. ptb liegt in primären bovinen Makrophagen also in Phagosomen. 0,1 µm Abb 7: Elektronenmikroskopische Aufnahme von M. ptb in PBMs aus der Teflonkultur; der Pfeil weist auf die deutlich zu erkennende vakuoläre Membran; Ausschnitt eines Makrophagen D.2.2 Vitale M. ptb alkalisieren das endosomale Netzwerk Nach der Phagozytose befinden sich Bakterien in Phagosomen mit leicht saurem pHWert (pH 6,3-6,5), welche Marker früher Endosomen tragen. Sie reifen innerhalb von Minuten bis wenigen Stunden heran und tragen dann Marker später Endosomen. Hier liegt der pH-Wert bei 4,5-5,5 (CLEMENS 1996). In diesem sauren pH-Wert 57 Ergebnisse haben Enzyme das optimale Mileu zum Verdau des phagozytierten Materials. Somit stellt die Ansäuerung des Phagosoms einen wichtigen Schritt in der Phagosomenreifung dar (siehe auch C.2.3). SIBLEY et al. stellten 1985 ein Verhinderung der Ansäuerung in Toxoplasma gondiihaltigen Phagosomen fest. STURGILL-KOSZYCKI et al. konnten dies 1994 für M. avium-haltige Phagosomen zeigen; auch andere Bakterien und Pilze sind dazu in der Lage (MALIK et al. 2000, KAPOSZTA et al. 1999, BLACK et al. 1996). Eine mögliche Erklärung ist das Fehlen der Protonen-ATPase in der Phagosomenmembran. Diese ist ein Enzymkomplex, der für die Ansäuerung von intrazellulären Kompartimenten zuständig ist und im besonderen den pH-Wert in Phagosomen absenkt. Bisher ist nicht bekannt, ob M. ptb in bovinen Makrophagen ebenfalls, wie in murinen Mausmarkophagen bereits von KUEHENEL et al. (2001) beschrieben, die Ansäuerung verhindert. Um dies zu untersuchen wurde eine von KUEHNEL et al. (2001) etablierte und für diese Arbeit modifizierte Methode der intraphagosomalen pH-Wert-Messung mit FITC-Dextran verwendet. FITC ist ein Fluorochrom, welches bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm pH-abhängig fluoresziert (SCHLESINGER 1994), je niedriger der pH-Wert, desto geringer die Fluoreszenz. Die internalisierte Menge an FITC-Dextran wurde zwischen den Proben anhand der nicht-pH-abhängigen Fluoreszenz bei 546 nm normalisiert. FITC-Dextran wird von der Zelle aufgenommen, wo es anfänglich in frühe Endosomen, in der weiteren Endosomenreifung in späte Endosomen und Lysosomen gelangt (SCHLESINGER 1994). Eine Änderung des pH-Wertes wird als Änderung der relativen Fluoreszenzintensität angezeigt. Anhand der konfokalen Laserscanning Mikroskopie, kurz Konfokalmikroskopie, wurde geklärt, ob FITC-Dextran mit den Mykobakterien in Phagosomen kolokalisiert ist, Voraussetzung für eine korrekte Erfassung des intraendosomalen pH-Wertes. Um dies zu zeigen, wurden die Mykobakterien mit Sulfo-NHS-Biotin markiert. Die PBMs wurden mit diesen Mykobakterien sowie FITC-Dextran für zwei Stunden koinkubiert. Anschließend wurde TexasRed-Streptavidin zugegeben, welches an 58 Ergebnisse Biotin bindet und bei 546 nm Anregungswellenlänge eine Rotfluoreszenz zeigt. Nach dreimaligem Waschen wurden die Präparate fixiert und unter dem Konfokalmikroskop mikroskopiert. Die Mykobakterien stellten sich rot dar, FITCDextran grün. Eine Kolokalisierung der Mykobakterien mit dem FITC-Dextran wurde durch Gelbfluoreszenz angezeigt. Wie in Abb. 8 beispielhaft zu erkennen, war sowohl in den Infektionen mit vitalen, als auch in den Infektionen mit hitzeinaktivierten M. ptb ca. 70-80 % der FITC-DextranPartikel mit den Mykobakterien kolokalisiert. Das System zur intraendosomalen pHMessung konnte dementsprechend verwendet werden. 10 µm 10 µm Abbildung 10 µm 8: Kolokalisierung von FITC-Dextran mit Mykobakterien in PBMs. Die PBMs aus der Teflonkultur wurden mit TexasRed-markierten vitalen (links) bzw. hitzeinaktivierten M. ptb (rechts) infiziert, bei gleichzeitiger Koinkubation mit FITC-Dextran. Die Mykobakterien fluoreszieren rot, FITC-Dextran grün; Kolokalisierung wird durch Gelbfluoreszenz angezeigt. Zur Bestimmung des intraendosomalen pH-Wertes nach einer Infektion wurde in der FACS-Analyse die Messung anhand der bereits erwähnten Fluoreszenz von FITC durchgeführt. Die PBMs wurden mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb und FITC-Dextran koinkubiert, nach zwei Stunden gewaschen, mit Akutase enzymatisch vom 59 Ergebnisse Untergrund abgelöst und auf acht Reaktionsgefäße verteilt. In sieben dieser Gefäße wurden zur Erstellung der Eichkurve mit Nigericin, einem Ionophor, pH-Werte von 5,5 bis 8,0 angelegt. Im achten Gefäß wurde der intrazelluläre pH-Wert in PBS gemessen. Die ermittelten pH-abhängigen Fluoreszenzen bei 480 nm wurden anhand der pH-unabhängigen Fluoreszenz bei 546 nm normalisiert. Abb. 9 zeigt die Eichkurve als pH-Wert in Abhängigkeit zur relativen Fluoreszenz. Dargestellt ist der Durchschnitt aus sechs Versuchen als Kurvendiagramm mit Standardabweichung. Die relative Fluoreszenz kommt zustande, indem der jeweils höchste Wert 100 % gesetzt und die übrigen Werte entsprechend verrechnet wurden. Die ermittelten relativen Fluoreszenzen der Proben konnten nun anhand der Eichkurve als pH-Werte abgelesen werden und sind in Tab. 2 aufgeführt. In der Infektion mit vitalen M. ptb lag der durchschnittliche pH-Wert aus sechs Versuchen bei 6,97, in der Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb bei pH 5,19. Das heißt, vitale M. ptb sind nicht nur in der Lage, die intraphagosomale Ansäuerung in PBMs vollständig zu verhindern, sie führen sogar zu einer leichten Alkalisierung, da der normale pH-Wert früher Endosomen bei 6,3-6,5 liegt (FUCHS et al. 1989). Hitzeinaktivierte M. ptb können die Ansäuerung nicht verhindern. Tab. 2: relative Fluoreszenz und sich daraus ergebende pH-Werte bei Infektion mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten PBMs aus der Teflonkultur rel. Fluoreszenz [%] errechneter pH-Wert vitale M. ptb 90,22 6,97 hitzeinaktivierte M. ptb 61,36 5,19 60 Ergebnisse rel. Fluoreszenzintensität [%] 100 90 80 70 60 50 10 0 5 ,0 5 ,5 6 ,0 6 ,5 7 ,0 7 ,5 8 ,0 p H -W e rt Abbildung 9: Eichkurve zur FACS-Analyse intraphagosomaler pHWerte Die PBMs aus der Teflonkultur wurden mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb und FITC-Dextran koinkubiert, nach zwei Stunden gewaschen, mit Akutase enzymatisch vom Untergrund abgelöst und auf acht Reaktionsgefäße verteilt. In sieben dieser Gefäße wurden zur Erstellung der Eichkurve mit Nigericin, einem Ionophor, pH-Werte von 5,5 bis 8,0 angelegt. Die Normalisierung der Werte erfolgte anhand der pH-unabhängigen Fluoreszenz bei 546 nm. Dargestellt ist der Durchschnitt aus sechs unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. D.2.3 Genexpression ausgewählter Gene bei M. ptb-Infektion D.2.3.1 Infektion mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb In Infektionsversuchen mit anderen Mykobakterien, v.a. im humanen und murinen System, konnte die Rolle einiger Zytokine in der Makrophagenabwehr teilweise charakterisiert werden (VAN HEYNINGEN et al. 1997; BONAY et al. 1999; FLESCH u. KAUFMANN 1991; FIORENTINO et al. 1991; BALCEWICZ-SABLINSKA et al. 1999; JACOBS et al. 2000a; JACOBS et al. 2000b; HOAL-VAN HELDEN et al. 2001; JAMES 1995; GARCIA et al. 2000; JAGANNATH et al. 2000). Nachdem in dieser Arbeit die allgemeine Stimulierbarkeit der PBMs aus der Teflonkultur mit LPS bzw. 61 Ergebnisse IFN-g bereits anhand ausgewählter Gene untersucht wurde, wurde nun die Genexpression derselben Gene nach Infektion mit M. ptb untersucht. Um Folgen sezernierter bzw. struktureller Bestandteile voneinander unterscheiden zu können, wurden auch hier hitzeinaktivierte M. ptb neben vitalen eingesetzt. Die Mykobakterien und Makrophagen wurden wie in C.2.1 beschrieben kultiviert. Die Infektion erfolgte als Standardinfektion wie in C.2.2.1 beschrieben. Zu den jeweiligen Zeitpunkten wurden die Makrophagen abgekratzt, die RNA isoliert und eine RT-PCR mit verschiedenen spezifischen Primern durchgeführt. Mit Ethidiumbromid wurden die PCR-Produkte sichtbar gemacht und die Bandenintensität im Biorad-System festgehalten. Dann erfolgte eine Normalisierung anhand des Haushaltsgenes b-Actin. Zur weiteren Berechnung siehe C.2.5.3. In Abb. 10 ist die relative Genexpression ausgewählter Gene als Vielfaches der nicht stimulierten Kontrolle (K) über die Zeit als Balkendiagramm mit Standardabweichung dargestellt. Der auffallendste Unterschied ist die höhere Expression aller untersuchter Gene in der Infektion mit vitalen M. ptb im Vergleich zur Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb. Die Unterschiede liegen zwischen 25 und 700 %. Außerdem unterscheidet sich bei zwei Zytokinen der zeitliche Verlauf der Expression: Die GM-CSF-Genexpression erreicht in der Infektion mit vitalen M. ptb bereits nach 2 Stunden den höchsten Wert („Peak“) und fällt dann langsam ab. In der Infektion mit hitzeinaktierten M. ptb ist der „Peak“ erst nach 8 Stunden erreicht. Noch deutlicher ist der Unterschied in der IL-6-Genexpression: in der Infektion mit vitalen M. ptb ist ein biphasischer Verlauf mit dem ersten „Peak“ nach 2, dem zweiten nach 24 Stunden zu erkennen. In der Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb handelt es sich um einen monophasischen Verlauf mit gleichhohen Werten nach 2 sowie 8 Stunden. Es gibt also deutliche Unterschiede in der Genexpression der ausgewählten Gene bei Infektionen mit vitalen im Vergleich zu hitzeinaktivierten M. ptb. Dies spricht dafür, daß zumindest ein Teil der Effekte auf von vitalen Bakterien sezernierten Bestandteilen beruht. 62 Ergebnisse IL-1 beta rel. Genexpression 35 GM-CSF 25 lebend tot rel. Genexpression 40 30 25 20 15 10 5 0 K 2h 8h lebend tot 20 15 10 5 0 24 h K 2h IL-6 rel. Genexpression 7 lebend tot 6 5 4 3 2 1 0 2h 8h 1,5 1,0 0,5 24 h K 2h iNOS 5 lebend tot rel. Genexpression rel. Genexpression 24 h 2,0 TNF-alpha 14 8h lebend tot 2,5 0,0 K 16 24 h IL-10 3,0 rel. Genexpression 8 8h 12 10 8 6 4 lebend tot 4 3 2 1 2 0 0 K 2h 8h 24 h K 2h 8h 24 h Abb. 10: Expression ausgewählter Gene der nicht stimulierten Kontrolle (K) sowie bei Stimulation mit vitalen (schwarz) und hitzeinaktivierten (grau) M. ptb als Vielfaches der Kontrolle über die Zeit. Die PBMs wurden wie in C.1.1 beschrieben isoliert und kultiviert. Nach drei Tagen Adhärenz erfolgte die Infektion mit den Mykobakterien für zwei Stunden. Nach Waschen und weiterer Inkubation bei 37°C und 8 % CO2 wurden die PBMs zu den jeweiligen Zeitpunkten abgekratzt und die RNA gewonnen. Nach Aufreinigung der RNA wurden RTPCRs mit ausgewählten Primern durchgeführt. Dargestellt ist der Durchschnitt aus vier Reversen Transkriptionen zweier unabhängiger Versuche als Vielfaches von K über die Zeit. 63 Ergebnisse D.2.3.2 Vergleich der Genexpression nach verschiedenen Stimulationen Es stellte sich die Frage, ob die ermittelten Zytokinmuster Hinweise auf die Signaltransduktion im Makrophagen liefern. LPS ist ein potenter Makrophagenaktivator mit bekannten Signalwegen. Nach Bindung von LPS an CD14, TLR („toll like receptor“) oder andere LPS-Rezeptoren ist eine Tyrosin-Phosphorylierung an der weiteren Signaltransduktion beteiligt (KOVARIK et al. 1998; MEANS et al. 1999). Es ist jedoch noch unklar, welche Tyrosinkinasen diese Phosphorylierung durchführen. Bekannt ist außerdem, daß LAM, also das LPS der Mykobakterien, ebenfalls an CD14, aber auch an andere Rezeptoren als LPS bindet (MEANS et al. 1999). LPS kann TLR nur in Anwesenheit von CD14 aktivieren, LAM aktviert TLR auch unabhängig von CD14. M. tuberculosis aktiviert TLR2 und TLR4, M. avium nur TLR2. Um Hinweise auf die Aktivierung von Signalwegen durch M. ptb zu finden, wurden die zeitlichen Verläufe der Expression der ausgewählten Gene nach Stimulation mit LPS und Infektion mit Mykobakterien miteinander verglichen. In Abb. 11 sind die Verläufe der Expression der ausgewählten Gene infolge aller vier Stimulationen im Vergleich aufgetragen. Benutzt wurden die Durchschnittswerte der Abb. 4, 5 und 10. Die Höhe der Expression nach LPS- und IFN-g-Stimulation hängt von der verwendeten Konzentration der beiden Stoffe ab. Um die Werte unabhängig von der Höhe nur im zeitlichen Verlauf miteinander vergleichen zu können, wurde daher der jeweils höchste Wert 100 % gesetzt und die übrigen entsprechend dem Dreisatz berechnet. Die zeitlichen Verläufe der Genexpression von IL-10 bzw. der iNOS ist nach allen vier Stimulation ähnlich, mit einem „Peak“ nach 2 bzw. 8 Stunden. Die Genexpression der vier übrigen Zytokine weist jedoch Unterschiede zwischen den verschiedenen Stimulationen auf: Nach Stimulation mit LPS bzw. Infektion mit Mykobakterien steigt die IL-1bGenexpression von unter 10 % auf 100 % nach 8 Stunden an und fällt dann auf rund 50 % (LPS und vitale M. ptb) bzw. 12 % (hitzeinaktivierte M. ptb) ab. Nach Stimulation mit IFN-g erfolgt ein rascher Anstieg von 74 % auf 100 % nach 2 Stunden und ein schnelles Abfallen auf 19 % nach 8 Stunden. Nach 24 Stunden war keine Genexpression mehr detektierbar. 64 Ergebnisse Die Expression des IL-6-Gens verläuft in den ersten beiden Stunden nach allen Stimulationen ähnlich, mit einem Anstieg von 2-30 % auf 100 %. Nach IFN-gStimulation erfolgt dann ein schnelles Abfallen zum Zeitpunkt 8 h auf 6 %; nach 24 Stunden ist keine Genexpression mehr detektierbar. Nach LPS-Stimulation fällt die Expression von IL-6 auf 42 % nach 8 Stunden und 30 % nach 24 Stunden. Bei Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb bleibt die Expression über 8 Stunden annähernd konstant und fällt dann nach 24 Stunden auf 77 % ab. Bei Infektion mit vitalen M. ptb sinkt die Genexpression von IL-6 nach 8 Stunden auf 57 % und steigt nach 24 Stunden wieder auf 91 % an, so daß sich ein biphasischer Verlauf mit zwei „Peaks“ ergibt. Nach LPS-Stimulation steigt die TNF-a-Genexpression schnell von 32 % auf 100 % nach 2 Stunden an und sinkt anschließend langsam nach 8 Stunden auf 81 %, nach 24 Stunden auf 62 %. Nach Infektion mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb erfolgt ebenfalls ein schnelles Ansteigen: von 7 bzw. 14 % auf 100 %. Anschließend sinkt die Genexpression jedoch rasch auf 28 bzw. 9 % und ist nach 24 Stunden nur noch gering mit 1 % bzw. nicht mehr zu detektieren. Nach Stimulation mit IFN-g steigt die Expression des TNF-a-Gens langsam von 56 % auf 66 % nach 2 Stunden, 76 % nach 8 Stunden und erreicht nach 24 Stunden schließlich 100 %. Nach Stimulation mit IFN-g steigt die Expression des GM-CSF-Gens von 60 % auf 96 % nach 2 Stunden an und bleibt bis 24 Stunden annähernd gleich (100 % bzw. 99 %). Bei Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb erfolgt ein Ansteigen von 8 % auf 68 % nach 2 Stunden und 100 % nach 8 Stunden. Anschließend fällt die Expression auf 71 % nach 24 Stunden. Bei Stimulation mit LPS bzw. Infektion mit vitalen M. ptb steigt die Genexpression von 6 bzw. 5 % auf 100 % nach 2 Stunden. Nach LPSStimulation fällt sie dann nach 8 Stunden auf 60 %, nach 24 Stunden auf 36 %. Nach Infektion mit vitalen M. ptb erfolgt das Absinken langsamer auf 94 % nach 8 Stunden und 88 % nach 24 Stunden. Die zeitlichen Verläufe der Genexpression von IL-10 und der iNOS sind also nach Stimulation mit LPS oder IFN-g bzw. nach Infektion mit vitalen oder hitzeinaktivierten M. ptb ähnlich. Die Expression der übrigen untersuchten Gene unterscheidet sich mehr oder weniger stark (siehe oben). Besonders auffällig ist hier der biphasische Verlauf der IL-6-Expression nach Infektion mit vitalen M. ptb. 65 Ergebnisse IL-1b b GM-CSF 80 100 80 rel. Genexpression rel. Genexpression 100 60 40 20 60 40 20 0 0 K 2h 8h 24 h IL-10 100 80 60 40 20 K 2h 8h 24 h iNOS 100 24 h K 2h 8h 24 h 2h 8h 24 h 80 60 40 20 80 100 rel. Genexpression rel. Genexpression 8h 0 0 TNF-a a 2h 100 rel. Genexpression rel. Genexpression IL-6 K 60 40 20 0 80 60 40 20 0 K 2h 8h 24 h K Abb. 11: Expression ausgewählter Gene der nicht stimulierten Kontrolle (K) sowie bei Stimulation mit LPS (durchgezogene Linie), IFN-g (gepunktet), vitalen (gestrichelt) und hitzeinaktivierten (Striche und Punkte) M. ptb als Vielfaches der Kontrolle über die Zeit. Benutzt wurden die Durchschnittswerte der Abb. 4, 5 und 10. Die Höhe der Expression nach LPS- und IFN-g-Stimulation hängt von der verwendeten Konzentrationen der beiden Stoffe ab. Um die Werte unabhängig von der Höhe nur im zeitlichen Verlauf miteinander vergleichen zu können, wurde daher der jeweils höchste Wert 100 % gesetzt und die übrigen entsprechend dem Dreisatz berechnet. 66 Ergebnisse D.2.4 Bafilomycin verhindert die Ansäuerung in der Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb, verursacht jedoch keine entsprechenden Genexpressionsmuster Wie in D.2.2 gezeigt sind vitale M. ptb in der Lage, die Ansäuerung des Phagosoms fast vollständig zu verhindern, wohingegen hitzeinaktivierte M. ptb dies nicht können. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, daß der zeitliche Verlauf der Expression ausgewählter Gene sich nach Infektion mit vitalen M. ptb bzw. mit hitzeinaktivierten M. ptb unterschied (IL-6 und GM-CSF). Außerdem lag die Expression sämtlicher untersuchter Gene nach Infektion mit vitalen M. ptb zwischen 25 und 700 % über der nach Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb. Nun wurde untersucht, ob diese beiden durch vitale M. ptb verursachten Phänomene im Zusammenhang stehen. Die Ansäuerung des Phagosoms erfolgt durch in der Membran befindliche ATPasen, also ATP-betriebene Protonenpumpen, die einen Wasserstoff-Gradienten aufbauen und so den intraphagosomalen pH-Wert verändern (FUCHS et al. 1989). ProtonenATPasen können durch den Wirkstoff Bafilomycin blockiert werden (BOWMAN et al. 1988). Es stellte sich die Frage, ob bei einer Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb und gleichzeitiger Gabe von Bafilomycin der Effekt vitaler M. ptb, also die Verhinderung der Ansäuerung sowie die erhöhte bzw. im zeitlichen Verlauf veränderte Genexpression imitiert werden kann. Dies sollte wie in D.2.2 beschrieben durch FACS-Analyse der mit FITC-Dextran koinkubierten, infizierten PBMS (siehe unten) untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden die PBMs aus der Teflonkultur 15 min vor der Infektion mit 100 µM Bafilomycin inkubiert. Auch während der Infektion mit den hitzeinaktivierten M. ptb wurde neben dem FITC-Dextran 100 µM Bafilomycin zugesetzt. Nach zwei Stunden Infektion wurden die PBMs gewaschen, mit Akutase enzymatisch abgelöst und in der FACS-Analyse (siehe auch D.2.2.2) eingesetzt. Wie in D.2.2 beschrieben, wurde der intraphagosomale pH-Wert durch Unterschiede der Fluoreszenzintensität anhand einer Eichkurve (Abb. 9) abgelesen. 67 Ergebnisse Bei Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb und gleichzeitiger Gabe von Bafilomycin wurde eine relative Fluoreszenintensität von 96,58 % gemessen, was anhand der Eichkurve als pH 7,41 abgelesen werden konnte. Bafilomycin ist somit in der Lage, die Ansäuerung des Phagosoms bei Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb zu verhindern und somit den Effekt vitaler M. ptb zu imitieren. Bezüglich des intraphagosomalen pH-Wertes konnte mit Bafilomycin also der Effekt vitaler M. ptb in der Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb imitiert werden. Ob dies auch bezüglich der Expression ausgewählter Gene möglich ist, sollte anhand der RTPCR überprüft werden. Der prinzipielle Versuchsaufbau folgt dem in D.2.3.1 beschriebenen Prinzip. Die Zugabe von Bafilomycin erfolgte auch hier zum einen 15 min vor der Infektion mit den hitzeinaktivierten M. ptb, zum anderen während der Infektion in einer Konzentration von 100 µM. Zur Kontrolle wurden nicht infizierte PBMs in derselben Konzentration mit Bafilomycin behandelt. Die PBMs wurden wie in D.2.3.1 beschrieben abgkratzt, die RNA aufgereinigt und RT-PCRs mit spezifischen Primern für IL-6, TNF-a und iNOS durchgeführt. In Abb. 12 ist die relative Expression der drei genannten Gene als Balkendiagramm mit Standardabweichung dargestellt. Bafilomycin alleine hat nur einen sehr geringen Effekt auf die Expression der drei Gene. Die Unterschiede zwischen der Infektion mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb wurden reproduziert: in der Infektion mit vitalen M. ptb lag die Expression um ca. 40-50 % über der bei Infektion mit hitzeinaktivierten Bakterien. Bei gleichzeitiger Gabe von Bafilomycin zur Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb lag die Expression der drei Gene jedoch unter den Werten bei Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb ohne die Gabe von Bafilomycin. Die Gabe von Bafilomycin zur Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb konnte die Expressionsmuster der Infektion mit vitalen M. ptb also nicht imitieren. Die verhinderte Ansäuerung des Phagosoms und die veränderten Zytokinexpressionsmuster scheinen also zwei voneinander unabhängige Beeinflussungen des Makrophagen durch vitale M. ptb zu sein. 68 Ergebnisse 10 rel. Genexpression 8 6 4 2 0 K KB L T TB 1 7 ,5 1 5 ,0 rel. Genexpression 1 2 ,5 1 0 ,0 7 ,5 5 ,0 2 ,5 0 ,0 K KB L T TB 10 rel. Genexpression 8 6 4 2 0 K KB L T TB Abbildung 12: Expression des Il-6- (oben), TNF-a- (Mitte) und iNOS-Gens (unten) nach 2 Stunden als Vielfaches der Kontrolle. K = nicht-stimulierte Kontrolle; KB = PBMs, die nur mit Bafilomycin stimuliert wurden; L = Infektion mit vitalen M. ptb; T = Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb; TB = Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb bei gleichzeitiger Stimulation mit Bafilomycin. Die Zugabe von Bafilomycin erfolgte zum einen 15 min. vor dem Infektionszeitpunkt, zum anderen während der Infektionsphase in einer Konzentration von 100 µM (siehe auch D.2.3.1). Nach 2 Stunden wurde die PBMs gewaschen und abgekratzt, die RNA aufgereinigt und RT-PCRs mit spezifischen Primern durchgeführt. Dargestellt ist der Durchschnitt aus vier Reversen Transkriptionen zweier unabhängiger Versuche. 69 Ergebnisse D.2.5 deaktivierende Effekte LPS führt zur Aktivierung von Makrophagen und im Folgenden u. a. zur Ausschüttung von TNF-a, IL-6 und IL-12. Eine Vorinkubation mit LPS führte jedoch zu einer reduzierten Sensitivtiät auf weitere LPS-Gaben. Dieses Phänomen wird LPS-Toleranz, „LPS-hyporesponsiveness“ oder Refraktärität genannt. In vivo wurden hierbei eine verminderte Fieberantwort und geringere Letalität vermerkt. In vitro ging mit dem Phänomen eine verminderte Produktion proinflammatorischer Zytokine nach Sekundärstimulation mit LPS einher (NOMURA et al. 2000). Ob eine solche Refraktärität auch in bovinen Makrophagen nach Infektion mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb auftritt, wurde in dieser Arbeit untersucht. Hierzu wurden Makrophagen mit vitalen bzw. mit hitzeinaktivierten M. ptb für zwei Stunden infiziert (t=0). Nach weiteren 20 Stunden (t=22) wurden die Makrophagen einem zweiten Stimulus in Form von a) LPS, b) vitalen M. ptb, c) hitzeinaktivierten M. ptb oder d) IFN-g ausgesetzt. Nachdem dieser zweite Stimulus 2 Stunden einwirkte, wurden die Makrophagen wie in D.2.3.1 beschreiben abgekratzt, die RNA gewonnen und RT-PCRs mit spezifischen Primern durchgeführt. Als Kontrollen dienten nicht infizierte PBMs sowie PBMs, die nur mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb infiziert, jedoch keinem Sekundärstimulus ausgesetzt wurden. In Abb. 13 ist die relative Expression der Gene IL-6, TNF-a, GM-CSF und iNOS als Balkendiagramm mit Standardabweichung dargestellt. In der integrierten Tabelle ist aufgeführt, zu welchem Zeitpunkt welcher Stimulus gesetzt wurde. Im linken Teil jedes Diagrammes ist die Genexpression der Kontrollen sowie nach Zweitstimulation mit LPS bzw. Infektion mit vitalen und hitzeinaktivierten M. ptb aufgetragen; im rechten Teil wiederum die Expression der Kontrollen sowie nach Zweitstimulation mit IFN-g. Ist der Balken nach Sekundärstimulus höher als der Vergleichsbalken der nicht-zweit-stimulierten Makrophagen, so konnten die Zellen auf den zweiten Stimulus reagieren, waren also nicht deaktivert. Ist der Balken in etwa gleich hoch, konnten die Makrophagen mit keiner weiteren Genexpression reagieren, sie waren also bezüglich der Expression dieses Gens refraktär. 70 Ergebnisse Ist der Balken wesentlich niedriger, so führte der Sekundärstimulus sogar zum Abschalten des jeweiligen Gens. Nach Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb führten die bakteriellen Sekundärstimuli zu einer verstärkten Genexpression aller vier untersuchten Gene. Nach Infektion mit vitalen M. ptb waren die Makrophagen jedoch bei den bakteriellen Sekundärstimuli bezüglich der Genexpression von TNF-a sowie der iNOS refraktär: die Balken sind genauso hoch wie die Vergleichsbalken. Bezüglich der Genexpression von IL-6 sowie GM-CSF besteht keine Refraktärität. Nach Infektion mit vitalen M. ptb und IFN-g als Sekundärstimulus geht die Genexpression von IL-6, GM-CSF und der iNOS auf unter 5 %, die von TNF-a auf 50 % zurück. Nach Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb und IFN-g als Sekundärstimulus geht die Genexpression von IL-6, GM-CSF und der iNOS auf 20 %, 37 % bzw. 30 % zurück, die von TNF-a jedoch steigt um 25 %. Die Infektion mit M. ptb führt also tatsächlich zu einer graduellen Deaktivierung des Makrophagen, wobei vitale Mykobakterien eine wesentlich stärkere Deaktivierung verursachen, als hitzeinaktivierte. Tatsächlich führt der körpereigene Makrophagenaktivator IFN-g sogar zu einer Deaktivierung anstelle einer Aktivierung der Makrophagen. 71 Ergebnisse 2 5 IL-6 2 0 1 5 1 0 5 0 G e n e x p r e s s i o n 3 , 5 TNF-a a 3 , 0 2 , 5 2 , 0 1 , 5 1 , 0 0 , 5 0 , 0 3 0 GM-CSF 2 5 2 0 r e l . 1 5 1 0 5 0 1 5 , 0 iNOS 1 2 , 5 1 0 , 0 7 , 5 5 , 0 2 , 5 0 , 0 t=0 Lebend Tot t=22 LPS Lebend Tot IFN-g - + - + + - + + - + + - + - + + - + + - + + - - + - + + + - + + Abbildung 13: Expression der Gene (von oben nach unten) IL-6, TNF-a, GM-CSF und iNOS als Vielfaches der Kontrolle; in der Tabelle ist angegeben, welchen Stimulus die PBMs aus der Teflonkultur zu den Zeitpunkten t=0 (Beginn des Versuches) und t=22 (22 Stunden nach Beginn des Versuches und 2 Stunden vor dem Ernten der Zellen) erhielten. Nach insgesamt 24 Stunden wurden die PBMs wie in D.2.3.1 beschreiben abgekratzt, die RNA gewonnen und RT-PCRs mit spezifischen Primern durchgeführt. Dargestellt ist der Durchschnitt aus drei unabhängigen Versuchen. 72 Diskussion E Diskussion Die Pathogenese der Paratuberkulose ist bislang ungeklärt. Als fakultativ intrazellulärer Erreger ist M. ptb in der Lage, in professionellen Phagozyten zu überleben und sich zu vermehren. Es gilt als gesichert, daß M. ptb durch die M-Zellen im Epithel der Peyer‘schen Platten die intestinale Mukosa überwindet und anschließend von Gewebemakrophagen aufgenommen wird. Unbekannt sind jedoch die Strategie und die Mechanismen, die M. ptb das intrazelluläre Überleben in diesen Zellen ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell entwickelt und standardisiert, um das Überleben der Bakterien in den Makrophagen des Darmes in vitro zu imitieren. In dem etablierten Modell wurden die Auswirkungen des intrazellulären Überlebens von M. ptb auf die Genexpression der Makrophagen untersucht. Verwendet wurde die Teflonkultivierung primärer Makrophagen. Durch den Einsatz sowohl vitaler als auch hitzeinaktivierter M. ptb sollten Ergebnisse als Folge des Einwirkens sezernierter oder struktureller Bestandteile, also als aktiv oder passiv, eingeordnet werden. Erster Schritt der Arbeit waren die Etablierung und Standardisierung des Modells der Teflonkultivierung primärer boviner Makrophagen. E.1 Eignung und Standardisierung des Teflon-Modells Es wird häufig angenommen, periphäre Blutmonozyten seien im Gegensatz zu Gewebemakrophagen eine relativ homogene Zellpopulation (COHN 1968). Tatsächlich besitzen zwar alle Monozyten gewisse einheitliche morphologische, biochemische und funktionelle Charakteristika (MORAHAN 1980), es muß jedoch betont werden, daß sie in keiner Hinsicht völlig uniform sind. In den vergangen Jahren wurden verschieden Untersuchungen durchgeführt, um die Art und das Ausmaß der Heterogenität zu charakterisieren und mögliche Ursprünge für diese Unterschiede herauszustellen (TREVES 1984; DOUGHERTY u. MCBRIDE 1984). 73 Diskussion Frisch isolierte Monozyten unterschieden sich u. a. bezüglich Größe, Dichte, Expression von Oberflächenproteinen und funktionellen Kapazitäten (TREVES 1984). Hauptproblem bei Arbeiten mit primären Makrophagen in der Zellkultur ist daher die Inhomogenität der Zellen aufgrund der Diversität im Blut befindlicher monozytärer Zellen und daraus folgende Schwankungen der Untersuchungsergebnisse (GOFF et al. 1998). Das Verwenden einer bovinen Makrophagenzellinie wäre vorteilhaft, kann jedoch in Ermangelung einer solchen Zellinie nicht durchgeführt werden. Hämatopoetische Stammzellen reifen im Blut über Monoblasten, Promonozyten und Monozyten zu Promakrophagen, die in Körpergeweben schließlich zu unterschiedlichen Makrophagen ausdifferenzieren (OPPENHEIM u. LEONARD 1989). Im Blut befinden sich also monozytäre Zellen verschiedener Reifungsstadien, von denen nur die späteren Stadien zur Adhärenz befähigt sind. Wird diese Zellmischung in die Zellkultur verbracht, erhält sie zwei wichtige Differenzierungssignale: zum einen die Adhärenz an das feste Substrat (das Plastik der ZK-Schale), zum anderen das im Medium befindliche Serum (DOUGHERTY u. MCBRIDE 1989). Aufgrund dieser Signale differenzieren die Zellen in vitro zu Makrophagen aus. In Vorarbeiten von KUEHNEL (nicht veröffentlicht) wurden die Probleme der Kultivierung primärer boviner Makrophagen deutlich. Die durch Dichtezentrifugation gewonnenen Blutmonozyten wurden hier direkt auf ZK-Schalen gegeben, nach drei Stunden Adhärenz wurden nicht-adhärente Zellen durch Waschen mit PBS entfernt und die Makrophagen in die Versuche eingesetzt. Zum einen war die Ausbeute bei dieser Methode mit nur 10 % der im Blut befindlichen Makrophagenvorläuferzellen sehr gering, da ein Teil der Monozyten noch nicht reif genug war, um adhärieren zu können und somit beim Waschen entfernt wurde. Zum anderen betrug die Infektionsrate der Zellen nur etwa 40 %, da wiederum ein Teil der adhärenten Zellen noch nicht vollständig zu Makrophagen ausdifferenziert und somit nicht in der Lage war, Bakterien zu phagozytieren. Die Zellpopulation war inhomogen. 74 Diskussion Eine möglichst homogene Zellpopulation ist jedoch Voraussetzung für eine geringe Standardabweichung zwischen den einzelnen Versuchen und somit für reproduzierbare und aussagekräftige Ergebnisse. Ziel der Etablierung des Teflonmodells war das Überwinden des Problems der Inhomogenität. Ursprünglich wurde die Kultivierung von Makrophagen und anderen Zellen in Teflonbeuteln verwendet, um Untersuchungen durchzuführen, nach denen die Zellen möglichst vollständig wiedergewonnen werden sollten. Dies war in der Teflonkultur möglich, da die Zellen nicht an der Teflonoberfläche adhärieren (VAN DER MEER et al. 1978). Bereits CAMPBELL u. ADAMS (1992) verwendeten primäre bovine Makrophagen und Teflon-Beutel. In ihren Arbeiten mit Brucella abortus wurden die Makrophagen jedoch über den gesamten Untersuchungszeitraum in der Teflonkultur gehalten, um Adhärenz zu verhindern und um die Makrophagen in einem relativ unstimulierten Zustand zu belassen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode von JUNGI et al. (1996) leicht modifiziert, um sie an die Gegebenheiten des Labors anzupassen. Hierbei diente die Kultivierung im Teflonbeutel über mehrere Tage der Synchronisation der Zellen; sie wurden anschließend auf Plastik verbracht, um sie als synchronisierte und ausdifferenzierte, adhärente Makrophagen in die Versuche einzusetzen. In der Differenzierung humaner Monozyten zu Makrophagen wurden zwei Differenzierungssignale erkannt (ZEMBALA u. ASHERSON 1989). Die Inkubation mit Serum führte zur Differenzierung bis zum Promakrophagen; die endgültige Differenzierung zum Makrophagen wurde durch Adhärenz erreicht. Diesen Erkenntnissen folgend, wurden die isolierten Leukozyten für 8 Tage in FCS-haltigem Medium in Teflonbeuteln kultiviert (siehe C.2.1.2.1). Durch das FCS erhielten sie das erste Differenzierungssignal und entwickelten sich zu Promakrophagen. Die Zellpopulation war jetzt synchronisiert und wurde auf ZK-Schalen gegeben. Hier adhärierten die vitalen Promakrophagen und differenzierten innerhalb weniger Stunden zu Makrophagen aus (JUNGI et al. 1996). Die Makrophagenausbeute erhöhte sich bei dieser Methode auf Makrophagenvorläuferzellen (siehe D.1.1). 75 50 % der im Blut befindlichen Diskussion Für die Infektionsversuche wurden die Makrophagen für 2 Stunden mit einer definierten Zahl Mykobakterien inkubiert, anschließend gewaschen und bis zum Erntezeitpunkt weiterinkubiert (siehe C.2.2.1). Die Infektionsrate wurde durch Auszählen der infizierten Makrophagen unter dem Mikroskop festgestellt (siehe D.1.2); sie lag über 72 Stunden zwischen 94 und 98 %. In anderen Untersuchungen lag die Infektionsrate zwischen 40 und 80 % (BERMUDEZ et al. 1997; BONAY et al. 1999). Die hier erreichte hohe Infektionsrate spricht für eine homogene und vitale Zellkulur. Ein Problem der Kultivierung primärer Zellen ist die geringe Stabilität in der Zellkultur. Geringe Stabilität ist hier definiert als abnehmende Vitalität verbunden mit dem Verlust der Adhärenz. Zur Bestimmung der Stabilität der Kultur wurden die Adhärenzraten der Makrophagen durch Auszählen adhärenter Zellen in der Neubauerkammer untersucht (siehe C.2.1.2.2). Die Adhärenzraten über 72 Stunden unterschieden sich deutlich zwischen den Versuchsansätzen: nicht-infizierte Makrophagen waren nach 72 Stunden noch zu 98,6 % adhärent. Mit vitalen M. ptb infizierte Makrophagen waren nach 72 Stunden noch zu 79,7 % adhärent, mit hitzeinaktivierten M. ptb infizierte noch zu 65,8 %. Bemerkenswert ist hier vor allem der Unterschied zwischen der Infektion mit vitalen und hitzeinaktivierten Bakterien. Ursache hierfür könnte die Zahl der phagozytierten Erreger sein: In der Mikroskopie wurde deutlich, daß Makrophagen, die mit hitzeinaktivierten M. ptb infiziert wurden, zu einem höheren Prozentsatz über 50 Bakterien pro Zelle phagozytierten (durchschnittlich 14 % gegenüber 6 %). Dieses „Überfressen“ könnte Ursache für den schnelleren Verlust der Adhärenz sein. Eine weitere mögliche Erklärung für die Abnahme adhärenter Zellen, ist die Apoptose. Die Infektion humaner Makrophagen mit M. avium führte zu 20 % (BALCEWICZ-SABLINSKA et el. 1999), in anderen Untersuchungen zu bis zu 31 % apoptotischen Zellen (BERMUDEZ et al. 1997). Es ist allgemein akzeptiert, daß intrazelluläre Mykobakterien Apoptose auslösen können. Vermutlich ist die Apoptose ein Verteidigungsmechanismus der Makrophagen gegen die Mykobakterien, der durch pathogene Mykobakterien zum Teil ausgeschaltet werden kann (FRATAZZI et al. 1999). Da es im Interesse intrazellulärer Erreger liegt, die Wirtszelle am Leben zu 76 Diskussion erhalten, ist ein Mechanismus möglich, der Makrophagen daran hindert, vitale Erreger in letaler Zahl zu phagozytieren oder aber apoptotisch zu werden. Das Entdecken eines solchen Mechanismus war nicht Ziel der vorliegenden Arbeit, könnte jedoch in Zukunft ein interessanter Untersuchungsgegenstand sein. Um die Stimulierbarkeit der Makrophagen sowie die geringe Standardabweichung im Sinne einer homogenen Zellpopulation zu überprüfen, wurden die Zellen mit LPS bzw. IFN-g behandelt und anschließend die Expression ausgewählter Gene durch RT-PCR überprüft (siehe D.1.4). LPS ist Bestandteil der Zellhülle gramnegativer Bakterien und ein potenter Makrophagenaktivator; IFN-g wird von T-Zellen sezerniert und trägt wesentlich zur endogenen Makrophagenaktivierung bei. Überprüft wurden drei proinflammatorische Zytokine (IL-1b, IL-6 und TNF-a), GM-CSF als Makrophagenaktivator, IL-10 als deaktivierendes Zytokin sowie die iNOS. In nichtstimulierten primären bovinen Makrophagen war eine Genexpression von IL-1 und der iNOS nicht zu detektieren (GOFF et al. 1998). IL-6, GM-CSF sowie TNF-a waren in nicht-stimulierten Zellen nur gering exprimiert (ADLER et al. 1995; KEEFE et al. 1997). Wie erwartet waren die primären bovinen Makrophagen aus der Teflonkultur stimulierbar. Die durchschnittliche Standardabweichung sämtlicher Versuche lag bei 0,97 (siehe D.1.4), was ein weiterer Beleg für die Homogenität der Zellpopulation und damit für die Aussagekraft der Versuche ist. Die vorliegende Arbeit sollte ein in vitro-Modell für das Überleben der Mykobakterien im Darm infizierter Tiere etablieren und verwenden. Dafür war es notwendig, daß die Bakterien in den Makrophagen aus der Teflonkultur überleben. Um dies zu überprüfen wurde die Zahl Kolonie-bildender Einheiten (KBE) pro Makrophagen über einen Zeitraum von 72 Stunden gemessen (siehe C.2.2.3). Diese änderte sich im Untersuchungszeitraum nicht. Die Mykobakterien konnten also in den primären bovinen Makrophagen überleben. 77 Diskussion Die KBE pro Makrophagen lag hier durchschnittlich zwischen 0,3 und 0,4. Dies stimmt mit Untersuchungen in anderen Arbeitsgruppen überein, in denen Werte zwischen 0,1 und 0,4 (BONAY et al. 1997; KEMPER at al. 1998) festgestellt wurden. Die Abweichungen zwischen der KBE (0,3-0,4) und der im Mikroskop festgestellten Infektionsrate (zwischen 1 und mehr Bakterien pro Zelle) ist durch die Methode der KBE-Ermittlung selbst zu erklären. Es ist allgemein akzeptiert, daß beim Ermitteln der KBE nur etwa 10 % der tatsächlich vorhandenen Zahl vitaler Bakterien erfaßt wird (BISPING u. AMTSBERG 1988). Mögliche Gründe hierfür sind das Verklumpen der Bakterien, deren Absterben durch die Reisolierung aus den Makrophagen oder die Kultivierung auf den Platten selbst. M. ptb wächst innerhalb 6-8 Wochen zu sichtbaren Kolonien heran; ein Verlust eines Teils der vitalen Erreger in dieser Zeit ist nicht überraschend. Der entstehende Fehler ist jedoch in allen Versuchen gleich und daher zu vernachlässigen. Wichtig war hier der Vergleich zwischen den einzelnen Versuchen und nicht die absoluten Zahlen, da diese durch Mikroskopie ermittelt wurden (siehe C.2.2.2). Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die hier verwendete Methode der Teflonkultivierung das Hauptproblem der Inhomogenität der Zellpopulation überwunden hat. Die Kultur war außerdem stabil, die Makrophagen aktivierbar und die Mykobakterien in den Makrophagen überlebensfähig. Das Modell der Teflonkultivierung war somit geeignet für die durchzuführenden Versuche. In der vorliegenden Arbeit wurde also ein standardisiertes Infektionsmodell mit charakterisierten Zytokinmustern etabliert, welches für zukünftige Arbeiten im bovinen Modell weiter Verwendung finden kann. E.2 Funktionelle Untersuchungen in PBMs aus der Teflonkultur Makrophagen sind die Zielzellen verschiedener intrazellulärer Mikroorganismen. Die Aktivierung des Makrophagen ist essentiell für eine verstärkte antimikrobielle Aktivität während dieser Infektionen. Allgemein wird die antimikrobielle Aktivtät in Sauerstoffabhängige (z. B. reaktive Stickstoff-Intermediate, Nitrid-Oxide) und Sauerstoff- 78 Diskussion unabhängige (z. B. Ansäuerung der phagolysosomalen Vakuole) Systeme unterteilt (REINER 1994). Um intrazelluläre Erreger zu eliminieren, muß der Makrophage zur Aktivierung dieser Mechanismen angeregt werden. Deshalb kann eine Makrophagendeaktivierung als Prozeß definiert werden, in dem die Zelle teilweise oder vollständig unempfänglich wird für aktivierende Stimuli. Hinweise für die Dysfunktion des Makrophagen aufgrund intrazellulärer Erreger gibt es bei verschiedenen Infektionen, wie z. B. mit Leishmania (REINER et al. 1990), Mycobacterium (SIBLEY et al. 1990, CHAN et al. 1991), Yersinia (BLISKA et al. 1993) oder dem humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) (BALDWIN et al. 1990). E.2.1 Vitale M. ptb alkalisieren das endosomale Netzwerk Phagozytierte Partikel liegen in Makrophagen meist in Vakuolen, den Phagosomen, die Teil des endosomalen Netzwerkes sind. In der vorliegenden Arbeit wurde anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen bestätigt, daß M. ptb in primären bovinen Makrophagen aus der Teflonkultur ebenfalls in Vakuolen liegt (siehe Abb. 7). Diese Bestätigung war essentiell für die folgenden Untersuchungen am endosomalen Netzwerk der Makrophagen. Ein Weg, die Sauerstoff-unabhängige Abwehr zu umgehen, ist das Verhindern der Ansäuerung des Phagosoms (REINER 1994). Nach der Phagozytose befinden sich Bakterien in Phagosomen mit leicht saurem pH-Wert (pH 6,3-6,5), welche Marker früher Endosomen tragen. Sie reifen innerhalb von Minuten bis wenigen Stunden heran und akkumulieren dann Marker später Endosomen. Hier liegt der pH-Wert bei 4,5-5,5 (CLEMENS 1996). In diesem sauren pH-Wert haben proteolytische Enzyme des späten endosomalen Netzwerkes, die an Abbauvorgängen beteiligt sind, das optimale Mileu zum Verdau des phagozytierten Materials. Somit stellt die Ansäuerung des Phagosoms einen wichtigen Schritt in der Phagosomenreifung dar (siehe auch C.2.3). SIBLEY et al. stellten 1985 ein Verhinderung der Ansäuerung in Toxoplasma gondiihaltigen Phagosomen fest. STURGILL-KOSZYCKI et al. konnten dies 1994 für M. avium-haltige Phagosomen zeigen; auch andere Bakterien und Pilze sind dazu in 79 Diskussion der Lage (MALIK et al. 2000, KAPOSZTA et al. 1999, BLACK et al. 1996). In J774Mausmakrophagen waren vitale M. ptb in der Lage, die Ansäuerung des Phagosoms fast vollständig zu verhindern (KUEHNEL et a. 2001). Eine mögliche Erklärung ist das Fehlen der Protonen-ATPase in der Phagosomenmembran. Diese ist ein Enzymkomplex, der für die Ansäuerung von intrazellulären Kompartimenten zuständig ist und im besonderen den pH-Wert in Phagosomen absenkt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob vitale oder auch hitzeinaktivierte M. ptb in primären bovinen Makrophagen ebenfalls die Ansäuerung des Phagosoms verhindern. Zu diesem Zweck wurde eine von KUEHNEL et al. (2001) etablierte und für diese Arbeit modifizierte Methode der intraendosomalen pH-Wert-Messung mit FITCDextran verwendet (siehe C.2.4). Eine Änderung des pH-Wertes wurde hier als Änderung der relativen Fluoreszenzintensität angezeigt (siehe D.2.2). KUEHNEL et al. (2001) führten Untersuchungen zum intraendosomalen pH-Wert in M. ptbinfizierten J774 Mausmakrophagen durch. Hier waren vitale M. ptb in der Lage, die Ansäuerung des Phagosoms zu verhindern, führten jedoch nicht zu einer Alkalisierung. Der pH-Wert lag nach 2 Stunden bei pH 6,3. Vitale M. ptb waren in primären bovinen Makrophagen aus der Teflonkultur in der Lage, die Ansäuerung des Phagosoms und endosomalen Netzwerkes nicht nur zu verhindern, sondern leiteten eine leichte Alkalisierung ein: der intraendosomale pHWert lag 2 Stunden post infectionem bei 6,97. Der endosomale pH-Wert von Makrophagen, die mit hitzeinaktivierten M. ptb infiziert waren, lag bei 5,19. Das Verhindern der Ansäuerung ist also ein Prozeß, der nur von vitalen M. ptb durchgeführt wird. Durch das Blockieren der Protonen-ATPasen mit dem Wirkstoff Bafilomycin (siehe D.2.2) wurde die Ansäuerung auch in der Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb verhindert. Möglicherweise handelt es sich also auch bei dem Effekt durch vitale M. ptb um eine Beeinflussung der Protonen-ATPasen. 80 Diskussion E.2.2 Modulation der Genexpression bei M. ptb-Infektion E.2.2.1 Infektion mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb Zur effektiven Eliminierung von Mykobakterien benötigt der Makrophage das koordinierte Zusammenspiel des IFN-g der Th1-Zellen (eine Subpopulation der Helfer-T-Lymphozyten) sowie der eigenen proinflammatorischen Zytokine IL-1, IL-6 und TNF-a wie auch des Makrophagenaktivators GM-CSF (VALENTIN-WEIGAND u. GOETHE 1999). Auch NO spielt eine herausragende Rolle in der Abwehr intrazellulärer Parasiten und ist Bestandteil der Aktivierung des Makrophagen (JAMES 1995; GARCIA et al. 2000). Die NO-Produktion wird durch IFN-g in Kombination mit TNF-a oder anderen sekundären Aktivierungssignalen über die iNOS (induzierbare NO-Synthase) stimuliert und durch eine Reihe von Zytokinen (vor allem IL-4, IL-10 und transforming growth factor beta), anderen Mediatoren und autoinhibitorischen Mechanismen reguliert (JAMES 1995). In Infektionsversuchen mit verschiedenen Mykobakterien konnte die Rolle einiger Zytokine in der Makrophagenabwehr teilweise charakterisiert werden (FLESCH u. KAUFMANN 1991; FIORENTINO et al. 1991; JAMES 1995; VAN HEYNINGEN et al. 1997; BONAY et al. 1999; BALCEWICZ-SABLINSKA et al. 1999; JACOBS et al. 2000a; JACOBS et al. 2000b; GARCIA et al. 2000; JAGANNATH et al. 2000; HOALVAN HELDEN et al. 2001). Auch mit M. ptb wurden Arbeiten, v. a. im murinen, aber auch im bovinen System durchgeführt (ZURBRICK et al. 1988; ADAMS u. CZUPRYNSKI 1994; STABEL 1995; ADAMS et al. 1996; ZHAO et al. 1997; BEGARA-MCGORUM et al. 1998; VALENTIN-WEIGAND u. GOETHE 1999). Bisherige Arbeiten geben Hinweise darauf, daß eine Infektion mit vitalen oder hitzeinaktivierten M. ptb sowie eine Inkubation mit gereinigtem LAM zu einer verstärkten Expression von IL-1b, IL-6, TNF-a und GM-CSF führen. Wie sich die genannten Zytokine sowie IL-10 als deaktivierendes Zytokin und die iNOS in der Infektion mit M. ptb exakt verhalten und welchen Einfluß sie auf das intrazelluläre Überleben von M. ptb in primären bovinen Makrophagen haben, ist jedoch nicht vollständig geklärt. Es wird über M. ptb-spezifische Mechanismen spekuliert (siehe unten). 81 Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß von vitalen sowie hitzeinaktivierten M. ptb auf die Expression ausgewählter Gene in primären bovinen Makrophagen aus der Teflonkultur untersucht. Überprüft wurde die Expression von IL-1b, IL-6, TNF-a, GM-CSF, IL-10 und der iNOS durch RT-PCR im zeitlichen Verlauf von 24 Stunden (siehe C.2.5). Es bestanden deutliche Unterschiede in der Genexpression von Makrophagen, die mit vitalen M. ptb und solchen, die mit hitzeinaktivierten M. ptb infiziert wurden (siehe D.2.3.1). Der auffallendste Unterschied war die höhere Expression aller untersuchter Gene in der Infektion mit vitalen M. ptb im Vergleich zur Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb. Die Unterschiede lagen zwischen 25 und 700 %. Außerdem unterschied sich bei zwei Zytokinen der zeitliche Verlauf der Expression: die GMCSF-Genexpression stieg in der Infektion mit vitalen M. ptb schneller an, die IL-6Genexpression nahm einen biphasischen Verlauf. Diese Unterschiede sprechen dafür, daß zumindest ein Teil der Effekte auf von vitalen Bakterien sezernierten Bestandteilen beruht. Es wäre auch möglich, daß die Hitzeinaktivierung der Mykobakterien eine Denaturierung der strukturellen Bestandteile bewirkt und somit die beobachteten Effekte nicht durch sezernierte, sondern duch strukturelle Bestandteil zu erklären wären. Dagegen sprechen Vorversuche mit hitzeinaktivierten sowie strahleninaktivierten Mykobakterien, die keine Unterschiede in den Ergebnissen zeigten. Bei einer Inaktivierung mit Strahlen bleiben strukturelle Bestandteile intakt. Alle untersuchten Zytokine und die iNOS wurden nach Infektion mit vitalen M. ptb stärker exprimiert als nach Infektion mit hitzeinaktivierten Bakterien. Dies spricht auf den ersten Blick für eine stärkere Aktivierung des Makrophagen. Trotzdem ist der Makrophage nicht in der Lage, die intrazellulären Erreger abzutöten (siehe D.1.5). Eine erhöhte Expression des proinflammatorischen IL-6 muß nicht zwingend einen inaktivierenden Einfluß auf die Mykobakterien nehmen. Sie kann sogar zu einem immunsuppressiven Effekt auf die Makrophagen führen und damit einen inaktivierenden Einfluß auf die Mykobakterien verhindern. Die Zugabe von IL-6 änderte nichts an der Abtötungsrate von M. bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) in humanen Makrophagen (BONAY et al. 1999) bzw. von Mycobacterium bovis in 82 Diskussion murinen Knochenmarksmakrophagen (FLESCH u. KAUFMANN 1991). Bei M. aviuminfizierten Makrophagen wurde eine verminderte Expression von aktivierenden TNFRezeptoren um 78 % verzeichnet (BERMUDEZ et al. 1992). In einer anderen Arbeit führte die starke IL-6-Expression in Infektionen mit M. avium zu einem immunosuppressorischen Effekt auf umliegende Makrophagen und die T-ZellAktivierung (VAN HEYNINGEN et al. 1997). Auch eine erhöhte Expression von TNF-a muß nicht zwingend einen mykobakteriziden Effekt nach sich ziehen. Eine Vorinkubation von Mausmakrophagen mit geringen Dosen TNF-a verbesserte sogar das intrazelluläre Überleben von M. ptb (BALCEWICZ-SABLINSKA et al. 1999). Die in dieser Arbeit detektierte starke Erhöhung der TNF-a-Expression kann zwar nicht als geringe Dosis bezeichnet werden. Doch die mRNA-Menge korreliert nicht zwingend mit der wirksamen Menge an TNF-a. So führte IL-10 in M. avium-infizierten humanen Makrophagen zu einer vermehrten Ausschüttung des TNF-Rezeptors Typ 2. Dieser hat eine Inaktivierung von TNF-a zur Folge (BALCEWICZ-SABLINSKA et al. 1999). Wie bereits erwähnt wurde bei M. avium-infizierten Makrophagen eine verminderte Expression von aktivierenden TNF-Rezeptoren um 78 % verzeichnet (BERMUDEZ et al. 1992). Alleine gegeben hatte TNF-a außerdem keinen Einfluß auf das Überleben von M. bovis in murinen Knochenmarksmakrophagen (FLESCH u. KAUFMANN 1991; BONAY et al. 1999). In humanen Makrophagen, die mit BCG infiziert waren, hatte TNF-a hemmenden wie auch verstärkenden Effekt, unterschiedlich in den jeweiligen Makrophagenchargen (HOAL-VAN HELDEN et al. 2001). Der fehlende mykobakterizide Effekt trotz hoher mRNA-Menge könnte also durch verminderte Mengen aktivierender TNF-Rezeptoren oder erhöhte Mengen inaktivierender TNFRezeptoren zu erklären sein. Auch GM-CSF hatte nicht in allen bisherigen Arbeiten einen mykobakteriziden Effekt. Eine Vorinkubation mit GM-CSF führte in der Infektion humaner Makrophagen mit BCG zwar zu einem schnelleren Abtöten des Erregers. Spätere Gaben von GM-CSF hatten jedoch keinen Einfluß mehr (BONAY er al. 1998). In humanen Makrophagen, die mit BCG infiziert waren, hatte GM-CSF hemmenden wie auch verstärkenden Effekt, unterschiedlich in den jeweiligen Makrophagenchargen (HOAL-VAN HELDEN 83 Diskussion et al. 2001). Außerdem könnte die Aufregulation der GM-CSF-Genexpression zur Rekrutierung weiterer Makrophagen dienen (RIEDEL u. KAUFMANN 2000). Diese können dann im folgenden ebenfalls infiziert und deaktiviert werden. Da es sich bei IL-10 um ein deaktivierendes Zytokin handelt, ist eine verstärke Expression hier nicht überraschend. Wie bereits erwähnt führte IL-10 in M. aviuminfizierten humanen Makrophagen zu einer vermehrten Ausschüttung des inaktivierenden TNF-Rezeptors Typ 2 (BALCEWICZ-SABLINSKA et al. 1999). Außerdem waren IL-10-defiziente Mäuse wesentlich schneller in der Lage, eine BCG-Infektion zu eliminieren. In den Makrophagen der Granulome waren ungewöhnlich hohe Spiegel von TNF-a und der iNOS zu detektieren (JACOBS et al. 2000a). INOS-defiziente Mäuse waren nicht in der Lage, BCG zu eliminieren und starben innerhalb von 8 bis 12 Wochen, wohingegen die Kontrollgruppe überlebte (GARCIA et al. 2000). Ein experimentelles Medikament, CRL-1072, löste in humanen Makrophagen eine verstärkte iNOS-Produktion und folgend einen höheren NO-Level aus und führte so zum Abtöten von M. avium (JAGANNATH et al. 2000). Die erhöhte iNOS-Expression korreliert ebenso wie bei TNF-a nicht zwingend mit den tatsächlich freigesetzten Mengen an NO. Inwiefern dies durch veränderte Rezeptormengen oder eine schnellere Inaktvierung bzw. Zersetzung von NO zu erklären ist, bleibt in Zukunft zu untersuchen. Bezüglich der erhöhten Expression von IL-1b kann nur über ähnliche Mechanismen oder Gründe spekuliert werden. Es gibt in bisherigen Arbeiten keine Hinweise auf eine besondere Rolle von IL-1b in der Eliminierung von intrazellulären Mykobakterien. Die hier detektierten Veränderungen in der Genexpression v. a. durch vitale, aber auch durch hitzeinaktivierte M. ptb sind möglicherweise Teil des Pathogenitätsmechanismus. Die oben erwähnten weiterführenden Untersuchungen könnten Aufschluß über die Bedeutung eines solchen Mechanismus geben. 84 Diskussion Die Zugabe von Bafilomycin verhinderte die Ansäuerung des Phagosoms in der Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb und imitierte damit den Effekt vitaler Mykobakterien. Bei der Untersuchung der Genexpression von IL-6, TNF-a und der iNOS ließ sich ein solcher Effekt auf die Genexpression nicht nachweisen: die Expression der Gene lag sogar unter der nach Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb und nicht um 25 bis 700 % höher wie nach Infektion mit vitalen M. ptb. Dies legt nahe, daß es sich bei der Verhinderung der Ansäuerung und der Veränderung der Genexpression durch vitale M. ptb um zwei voneinander unabhängige Pathogenitätsmechanismen handelt. E.2.2.2 Vergleich der Genexpression nach verschiedenen Stimulationen Es stellte sich die Frage, ob die ermittelten Zytokinmuster Hinweise auf die Signaltransduktion im Makrophagen liefern. LPS ist ein potenter Makrophagenaktivator mit bekannten Signalwegen. Nach Bindung von LPS an CD14, TLR („toll like receptor“) oder andere LPS-Rezeptoren ist eine Tyrosin-Phosphorylierung an der weiteren Signaltransduktion beteiligt (KOVARIK et al. 1998; MEANS et al. 1999). Es ist jedoch noch unklar, welche Tyrosinkinasen diese Phosphorylierung durchführen. Bekannt ist außerdem, daß LAM, also das LPS der Mykobakterien, ebenfalls an CD14, aber auch an andere Rezeptoren als LPS bindet (MEANS et al. 1999). LPS kann TLR nur in Anwesenheit von CD14 aktivieren, LAM aktviert TLR auch unabhängig von CD14. Um Hinweise auf die Aktivierung von Signalwegen durch M. ptb zu finden, wurden die zeitlichen Verläufe der Expression der ausgewählten Gene nach Stimulation mit LPS und Infektion mit Mykobakterien miteinander verglichen (siehe D.2.3.2). Die zeitlichen Verläufe der Genexpression von IL-1b, IL-10, GM-CSF und der iNOS unterschieden sich nach Stimulation mit LPS bzw. nach Infektion mit vitalen oder hitzeinaktivierten M. ptb nur wenig. 85 Diskussion Die Expression von IL-6 fiel nach Stimulation mit LPS relativ schnell wieder ab, blieb nach Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb auf einem höheren Level bestehen und nahm nach Infektion mit vitalen M. ptb einen biphasischen Verlauf. Das hohe Level von IL-6 zu einem späten Zeitpunkt der Infektion wurde auch bei der Infektion von J774 mit M. ptb beobachtet (GOETHE, unveröffentlicht). Möglicherweise handelt es sich hier um einen M. ptb-spezifischen Mechanismus, der einen immunsuppressiven Effekt zur Folge hat. Es kann spekuliert werden, daß vitale M. ptb einen anderen Signaltransduktionsweg als hitzeinaktivierte M. ptb und LPS nehmen. Diese Möglichkeiten werden in Zukunft in der Arbeitsgruppe untersucht werden. Die Expression von TNF-a blieb nach Stimulation mit LPS auf relativ hohem Niveau, fiel jedoch nach Infektion sowohl mit vitalen als auch mit hitzeinaktivierten M. ptb bereits nach 8 Stunden auf unter 30 %, nach 24 Stunden auf Null ab. Dieser schnelle Abfall könnte ein weiterer Grund für die geringe Wirksamkeit von TNF-a gegen M. ptb sein. Auch unterschiedlichen dies steht möglicherweise Signaltransduktionwegen und im wird Zusammenhang ebenfalls mit zukünftiger Untersuchungsgegenstand sein. Inwieweit M. ptb Signaltransduktionswege beschreitet, die IFN-g oder andere Aktivatoren verwenden, bleibt zu klären. E.2.3 deaktivierende Effekte Das Deaktivieren der Wirtszelle ist eine Möglichkeit für das intrazelluläre Überleben von Erregern. Das Phänomen der Refraktärität ist ein Weg einer solchen Deaktivierung: LPS führt zur Aktivierung von Makrophagen und im Folgenden u. a. zur Ausschüttung von TNF-a, IL-6 und IL-12. Eine Vorinkubation mit geringen Mengen LPS führte jedoch zu einer reduzierten Sensitivtiät auf weitere LPS-Gaben (NOMURA et al. 2000). Dieses Phänomen wird LPS-Toleranz, „LPS- hyporesponsiveness“ oder Refraktärität genannt. In vivo wurden hierbei eine verminderte Fieberantwort und geringere Letalität vermerkt. In vitro ging mit dem Phänomen eine verminderte Produktion proinflammatorischer Zytokine nach 86 Diskussion Sekundärstimulation mit LPS einher (NOMURA et al. 2000). Auch LAM ist in der Lage, Refrakterität in Makrophagen auszulösen (RIEDEL u. KAUFMANN 2000). Um zu untersuchen, ob eine solche Refraktärität auch in bovinen Makrophagen nach Infektion mit M. ptb auftritt, wurden Makrophagen aus der Teflonkultur, die mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb infiziert waren, einem Zweitstimulus ausgesetzt. Bei diesem handelte es sich entweder um eine Stimulation mit LPS bzw. IFN-g oder um eine Reinfektion mit vitalen bzw. hitzeinaktivierten M. ptb. (siehe D.2.5). Anschließend wurde die mRNA gewonnen und in der RT-PCR eingesetzt. Untersucht wurde die Genexpression von IL-6, TNF-a, GM-CSF sowie der iNOS. Nach Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb führten die Zweitstimulation mit LPS sowie mit vitalen oder hitzeinaktivierten Mykobakterien zu einer verstärkten Genexpression aller vier untersuchten Gene. Mit vitalen M. ptb infizierte Makrophagen jedoch waren bei Sekundärstimulation mit weiteren vitalen, aber auch mit hitzeinaktivierten M. ptb bezüglich der Genexpression von TNF-a sowie der iNOS refraktär. Eine Zweitstimulation dieser Makrophagen mit LPS zeigte bei der Expression von TNF-a die Refraktärität des Makrophagen. Vitale M. ptb waren also in der Lage, im Gegensatz zu hitzeinaktivierten M. ptb, den Makrophagen in einen refraktären Zustand zu versetzen. Dies könnte einen wichtigen Pathogenitätsmechanismus darstellen. Im Tier kann ebenfalls eine Zweitstimulation mit vitalen M. ptb erfolgen. Zum einen erfolgt durch wiederholte Aufnahme ein ständiger Erregereintrag in die Darmwand. Zum anderen stirbt ein Teil der infizierten Makrophagen ab und gibt dabei die phagozytierten Erreger wieder frei, so daß sie von umliegenden Makrophagen phagozytiert werden. Somit kommt es vermutlich häufig zu Reinfektionen einzelner Makrophagen mit vitalen Erregern. Befindet sich der Makrophage durch die Erstinfektion in einem refraktären Zustand, kann er auf die Reinfektion nicht in gewohnter Weise reagieren; die Überlebenswahrscheinlichkeit des phagozytierten Bakteriums steigt. Die Zweitstimulation mit IFN-g führte zu den weitaus interessantesten Ergebnissen. IFN-g wird hauptsächlich von TH-1-Zellen ausgeschüttet und trägt wesentlich zur Aktivierung des Makrophagen bei. Murine Knochenmarksmakrophagen waren nach Stimulation mit IFN-g in der Lage, das intrazelluläre Wachstum von M. bovis zu 87 Diskussion unterbinden (FLESCH u. KAUFMANN 1991). In der Infektion muriner Intestinalmakrophagen mit M. avium-Komplex führte die Stimulation mit IFN-g zu einer erhöhten mykobakteriostatischen und/oder mykobakteriziden Aktivität (HSU et al. 1995). Es wird jedoch über M. ptb-spezifische Mechanismen spekuliert, da in Gewebe experimentell infizierter Lämmer eine signifikant geringere Menge IFN-g mRNA gefunden wurde (BEGARA-MCGORUM et al. 1998) und IFN-g nur geringe Effekte auf das intrazelluläre Überleben von M. ptb in bovinen Monozyten hatte (ZHAO et al. 1997). Dieser geringe antibakterielle Effekt von IFN-g in vitro steht im Gegensatz zu Untersuchungen anderer Mykobakterien und wurde durch ungenügende Produktion von NO erklärt, welches im zellfreien System zum Abtöten der Bakterien führen kann (ZHAO et al. 1991). In der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression M. ptb-infizierter primärer boviner Makrophagen aus der Teflonkultur nach Sekundärstimulation mit IFN-g gemessen. Nach Infektion mit vitalen M. ptb und IFN-g als Sekundärstimulus ging die Genexpression von IL-6, GM-CSF und der iNOS auf unter 5 %, die von TNF-a auf 50 % zurück. Nach Infektion mit hitzeinaktivierten M. ptb und IFN-g als Sekundärstimulus ging die Genexpression von IL-6, GM-CSF und der iNOS auf 20 %, 37 % bzw. 30 % zurück, die von TNF-a jedoch stieg um 25 %. Die Infektion mit M. ptb führte also nicht nur zu einer graduellen Deaktivierung des Makrophagen. Tatsächlich führte der körpereigene Makrophagenaktivator IFN-g, sogar zu einer Deaktivierung anstelle einer Aktivierung der Makrophagen. Diese Deaktivierung war nach Infektion mit vitalen M. ptb deutlich höher als nach Infektion mit hitzeinaktivierten Bakterien und ist ein Hinweis, daß es sich hier zumindest teilweise um einen durch sezernierte Bestandteile der Mykobakterien hervorgerufenen Effekt handelt. Der intrazelluläre Erreger M. ptb verleitet seine Wirtszelle, den Makrophagen, also scheinbar dazu, auf einen ansonsten aktivierenden Stimulus mit einer Deaktivierung zu reagieren. Da der Makrophage das Ausschütten von IFN-g durch die erhöhte TNF-a-Expression selbst ausgelöst hat, kann man hier von einem suiziden Effekt sprechen. Der Makrophage selbst führt zu seiner eigenen Deaktivierung. 88 Zusammenfassung F Zusammenfassung Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis (M. ptb) verursacht eine chronische, granulomatöse und nicht therapierbare Enteritis bei Wiederkäuern, die Paratuberkulose. Die Tiere infizieren sich in der Regel in den ersten Lebensmonaten und haben danach oft über Jahre keinerlei klinische Symptome. Mit Ausbruch der Krankheit zeigen vor allem Rinder starken intermittierenden Durchfall und fortschreitende Abmagerung bis hin zur Kachexie. Die Krankheit endet für gewöhnlich tödlich, die Pathogenese ist weitgehend unbekannt. Es gilt als gesichert, daß die Persistenz des Erregers in den Makrophagen der Darmwand eine Schlüsselrolle spielt. Ungeklärt sind jedoch die Strategie und die Mechanismen, die M. ptb das intrazelluläre Überleben in diesen Zellen ermöglichen. Von anderen pathogenen Mykobakterien, die ebenfalls in Makrophagen überleben, ist bekannt, daß sie die Effektorfunktionen der Makrophagen modulieren, um nicht abgetötet zu werden. Eine solche Modulation wird auch für M. ptb angenommen. Im Umgang mit anderen Erregern werden häufig Zellinien verwendet, da diese einfach in der Handhabung sind, nahezu beliebig viele Zellen zur Verfügung stehen, und die einzelnen Zellen annähernd identische Eigenschaften besitzen. In Ermangelung einer bovinen Makrophagenzellinie werden Arbeiten in bovinen Makrophagen mit frisch isolierten, also primären Makrophagen durchgeführt, wobei hier das Problem der hohen Diversität der Zellpopulation entsteht. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell der Teflonkultivierung primärer boviner Makrophagen etabliert, charakterisiert und standardisiert. Das Modell ist aufgrund der hohen Reproduzierbarkeit für Arbeiten im bovinen Modell sehr gut geeignet. In dem etablierten Untersuchungen zur und standardisierten Modulation der Modell wurden verschiedene Makrophageneffektorfunktionen durch intrazelluläre M. ptb durchgeführt. Die Ansäuerung des Phagosoms ist Teil der bakteriziden bzw. bakteriostatischen Effektorfunktionen des Makrophagen und damit ein wichtiger Schritt in der Phagosomenreifung. Andere intrazelluläre Erreger, wie z. B. M. avium, verhindern die Ansäuerung des Phagosomes, um im Makrophagen überleben zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß vitale M. ptb, im Gegensatz zu hitzeinaktivierten, die Ansäuerung des Phagosoms nicht nur verhindern, sondern zu 89 Zusammenfassung einer Alkalisierung der Vakuole führen. Dies ist möglicherweise ein wichtiger Pathogenitätsmechanismus vitaler M. ptb. Um intrazelluläre Erreger abtöten zu können, benötigt der Makrophage das koordinierte Zusammenspiel verschiedener Zytokine und anderer Enzyme, wie z. B. der induzierbaren NO-Synthase (iNOS). In Untersuchungen mit anderen Mykobakterien konnte die Rolle einiger Zytokine teilweise charakterisiert werden. Welche Bedeutung diese Zytokine und die iNOS in der Infektion von M. ptb in primären bovinen Makrophagen haben, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Genexpression von Interleukin (IL) -1b, IL-6, Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-a), IL-10, Granulozyten-Makrophagen KolonieStimulationsfaktor (GM-CSF) und der iNOS in der Infektion mit vitalen sowie mit hitzeinaktivierten M. ptb gemessen. Sie lag in der Infektion mit vitalen Erregern deutlich über der mit hitzeinaktivierten Bakterien und unterschied sich im zeitlichen Verlauf. Auch diese Modifikation der Genexpression durch vitale M. ptb ist möglicherweise Teil der Pathogenitätsmechanismen, da eine Koordinierung der Zytokinexpression und damit ein Abtöten der Erreger nicht mehr möglich ist. Ein dritter Weg, den Makrophagen auszuschalten, ist das Auslösen der sogenannten Refraktärität. Sie bedeutet, daß der Makrophagen durch die erste Infektion des Erregers nicht mehr in der Lage ist, auf eine Sekundärinfektion mit den bakteriziden bzw. bakteriostatischen Effektorfunktionen zu antworten. In der vorliegenden Arbeit wurde diese Refraktärität anhand der Expression der genannten Gene untersucht. Vitale M. ptb waren in der Lage, die Zelle in einen teilweise refraktären Zustand zu versetzen: auf eine Reinfektion mit vitalen M. ptb war keine Erhöhung der TNF-aund iNOS-Genexpression zu verzeichnen. Besonders ausgeprägt war die Refraktärität nach Stimulation mit Interferon-gamma (IFN-g). Dieses wird im Körper von T-Zellen ausgeschüttet und dient der Aktivierung des Makrophagen, soll also das Abtöten der intrazellulären Erreger unterstützen. In der vorliegenden Arbeit führte die Stimulation infizierter Makrophagen mit IFN-g jedoch zum genauen Gegenteil: die Expression von IL-6, TNF-a, GM-CSF und der iNOS ging um 50 bis über 95 % zurück. Die zur Aktivierung des Makrophagen gedachte IFN-g-Ausschüttung könnte im Körper also zu einer weiteren Deaktvierung des Makrophagen führen. Dies ist möglicherweise ein weiterer Pathogenitätsmechanismus vitaler M. ptb. 90 Summary G Summary Investigation of intracellular survival of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in primary bovine macrophages Beatrice Schuemann Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis (M. ptb) is the causative agent of a chronic, granulomatous and non-treatable enteritis of ruminants, paratuberculosis. The infection normally occurs within the first few months, and the animals do not show any clinical signs for years. With the outbreak of the disease cattle, above all, show severe intermittant diarrhoea and progressive wasting leading to cachexia. The disease usually ends lethally; the pathogenesis is largely unknown. It is widely accepted that the persistence of the pathogen within the macrophages of the intestinal wall plays a key role. The strategy and the mechanism of the intracellular survival of M. ptb within these cells is yet unknown. From work with other intracellular pathogenic mycobacteria it is known that they modulate the macrophage’s effector functions with the aim not to be killed. Such a modulation is assumed for M. ptb as well. Cell lines, since they are easy to handle and to multiply, are often used working with other intracellular pathogens. In the case of M. ptb the absence of a suitable cell culture system necessitates working with primary bovine macrophages. Such cells are more difficult to standardise than cultured cell lines. In the present study a model of teflon cultivation of primary bovine macrophages was established, characterised and standardised. Because of the high reproducibility the model is well suited for the investigation in bovine cells. With the established and standardised model investigation of the modulation of macrophage’s effector functions by intracellular M. ptb were carried out in the present study. The acidification of the phagosome is part of the bactericidal and bacteriostatic effector functions of the macrophage and therefore an important part of the phagosomal maturation. Other intracellular pathogens, such as M. avium, prevent the acidification of the phagosome in order to survive within the macrophage. 91 Summary In the present study it was shown, that live M. ptb, in contrast to heat-inactivated M. ptb, do not only prevent acidification but lead to partial alcalization of the vacuole. This may be an important mechanism of pathogenicity of live M. ptb. In order to kill intracellular pathogens the macrophage needs the co-ordinated expression of different cytokines and other enzymes, like the inducable NO-synthase (iNOS). In studies with other mycobacteria the role of some cytokines was partially characterised. The role of these cytokines, and of the iNOS, in M. ptb-infected bovine macrophages was investigated in the present study. For this purpose the expression of interleukin (IL-) 1b, IL-6, tumor necrosis factor alpha (TNF-a), IL-10, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and iNOS was measured in macrophages infected with live and heat-inactivated M. ptb. In macrophages infected with live M. ptb the expression of all these genes was much higher and differences in the kinetics of these expression levels between these products were observed. This modulation of gene expression by live M. ptb might well be part of the mechanisms of pathogenicity, since a co-ordinated cytokine expression and, as a consequence, the killing of the pathogen is prevented. A third possibility for the pathogen to deactivate the macrophage is to trigger the so called ‘refractory state’. This means that after a primary stimulus the macrophage is unable to react with its bacteriocidal and bacteriostatic effector functions in response to a secondary stimulus with the same stimulant. In the present study this refractory state was investigated by means of the expression of the mentioned genes. Live M. ptb were able to cause a partial refractory state: after the re-infection with live M. ptb there was no increase in TNF-a nor iNOS gene expression. After stimulation with interferon gamma (IFN-g) this refractory state was especially distinct. IFN-g is released in vivo by T-cells in order to activate the macrophage and thereby to kill intracellular pathogens. In the present study the stimulation of infected macrophages with IFN-g led to the contrary: the gene expression of IL-6, TNF-a, GMCSF and iNOS was decreased to between 50 and 5 percent. Therefore release of IFN-g in vivo, meant to activate the macrophage, might instead lead to the deactivation of the macrophage. This might be another mechanism by which M. ptb leads to pathogenicity. 92 Literaturverzeichnis H Literaturverzeichnis AADURIZ, J. J., R. A. JUSTE u. N. CORTABARRIA (1995): Lack of mycobactin dependence of mycobacteria isolated on Middlebrook 7H11 from clinical cases of ovine paratuberculosis. Vet. Microbiol. 45, 211-217 ADAMS, J. L. u. C. J. CZUPRYNSKI (1994): Mycobacterial cell wall components induce the production of TNF-alpha, IL-1, and IL6 by bovine monocytes and the murine macrophage cell line RAW 264. Microb. Pathog. 16, 401-411 ADAMS, J. L., M. T. 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(SIGMA) SIGMA, Deisenhofen Aceton BIESTERFELD, Harsum Agar Agar MERCK, Darmstadt Agarose GIBCO, Eggenstein Akutase PAA, Cölbe Ammoniumchlorid SIGMA, Deisenhofen Ammoniumpersulfat SIGMA, Deisenhofen Bafilomycin CALBIOCHEM, Bad Soden Bleicitrat SIGMA, Deisenhofen Borsäure MERCK, Darmstadt Braunüle (G12, 8 cm) BRAUN, Melsungen Bromphenolblau MERCK, Darmstadt Butanol MERCK, Darmstadt Cacodylat MERCK, Darmstadt Calciumchlorid MERCK, Darmstadt Calciumchlorid-Dihydrat MERCK, Darmstadt Chloroform MERCK, Darmstadt Citronensäure-Monohydrat MERCK, Darmstadt DABCOâ FLUKA, Neu-Ulm Diammoniumcitrat MERCK, Darmstadt Diethanolamin MERCK, Darmstadt Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat MERCK, Darmstadt Dithiothreitol (DTT) SIGMA, Deisenhofen Eisenammoniumcitrat SIGMA, Deisenhofen Essigsäure (Eisessig) ROTH, Karlsruhe Ethanol absolut ROTH, Karlsruhe Ethanol (96%) BIESTERFELD, Harsum Ethanoldiamintetraacatat (EDTA) SIGMA, Deisenhofen 117 Anhang Ethidiumbromid SIGMA, Deisenhofen Ficoll 400 MERCK, Darmstadt Fluorescein Isothiocyanat (FITC)-Dextran fötales Kälberserum (FCS) SIGMA, Deisenhofen PAA, Cölbe Formaldehyd (37%) ROTH, Karlsruhe Glasperlen MERCK, Darmstadt Glukose (wasserfrei) MERCK, Darmstadt Glutamin GIBCO, Eggenstein Glutaraldehyd FLUKA, Neu-Ulm Glycerin ROTH, Karlsruhe Glykogen BOEHRINGER, Mannheim Guanidinthiocyanat SIGMA, Deisenhofen Harnstoff SIGMA, Deisenhofen Iscove's Medium GIBCO, Eggenstein Isoamylalkohol MERCK, Darmstadt Isopropanol SIGMA, Deisenhofen Kaliumacetat MERCK, Darmstadt Kaliumchlorid MERCK, Darmstadt Kaliumdihydrogenphosphat MERCK, Darmstadt Kaliumhydrogencarbonat MERCK, Darmstadt Kanüle (G19) BRAUN, Melsungen Karbolfuchsin MERCK, Darmstadt Kryoröhrchen SARSTEDT, Nümbrecht L-Asparagin SIGMA, Deisenhofen Lipopolysaccharid (LPS, Salmonella) SIGMA, Deisenhofen Magnesiumchlorid GIBCO, Eggenstein Magnesiumsulfat MERCK, Darmstadt Magnesiumsulfat-Heptahydrat MERCK, Darmstaddt Mercaptoethanol MERCK, Darmstadt Methanol BIESTERFELD, Harsum Methylenblau MERCK, Darmstadt 118 Anhang Middlebrook OADC-Enrichment BECTON DICKINSON, Sparks (USA) Mikroliterküvetten (1 ml) RATIOLAB, Dreieich Mowiol MERCK, Darmstadt Mycobactine J SYNBIOTICS, Lyon (Frankreich) Natriumacetat MERCK, Darmstadt Natriumchlorid ROTH, Karlsruhe Natriumcitrat ROTH, Karlsruhe Natriumhydroxid Plätzchen MERCK, Darmstadt Natriumthiosulfat MERCK, Darmstadt Nigericin SIGMA, Deisenhofen Nukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) GIBCO, Eggenstein Osmiumtetroxid SERVA, Heidelberg Paraformaldehyd SIGMA, Deisenhofen PCR-Zusätze GIBCO, Eggenstein Penicillin GIBCO, Eggenstein Phenol ROTH, Karlsruhe Phosphorsäure (89%) MERCK, Darmstadt Propidiumjodid MOLECULAR PROBES, Eugene (USA) Reaktionsgefäß, 200 µl BIOZYM, Hess. Oldendorf Reaktionsgefäß, 1,5 ml BRAND, Wertheim Reaktionsgefäß, 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht Reaktionsgefäß, 15 ml GREINER, Frickenhausen Reaktionsgefäß, 50 ml SARSTEDT, Nümbrecht Saccharose SERVA, Heidelberg Salzsäure SIGMA, Deisenhofen Sarkosyl (Natrium-N-Laurylsarcosine) SIGMA, Deisenhofen Sodiumdodecylsulfat (SDS) ROTH, Karlsruhe Sterilfilter (0,2 µm und 0,45 µm) MILLIPORE, Bedford (USA) Streptomycin GIBCO, Eggenstein Sulpho-NHS-Biotin PIERCE, Rockford (USA) Syto 9 MOLECULAR PROBES, Eugene (USA) 119 Anhang Teflonfolie ANGST UND PFISTER, Zürich (Schweiz) Tetramethyl-ethylendiain (TEMED) SIGMA, Deisenhofen TexasRed-Streptavidin PIERCE, Rockford (USA) Transferpipette BRAUN, Melsungen Trichloressigsäure (TCA) ROTH, Karlsruhe Tri-Natriumcitrat-Dihydrat ROTH, Karlsruhe Tris (hydroxymethyl) aminomethan MERCK, Darmstadt Triton X 100 SERVA, Heidelberg Uranylacetet MERCK, Darmstadt Zellschaber NUNC GmBH, Wiesbaden Zinksulfat-Heptahydrat MERCK, Darmstadt ZK-Flasche, mittel GREINER, Frickenhausen ZK-Schale, 24-well NUNC GmBH, Wiesbaden ZK-Schale, 6-well NUNC GmBH, Wiesbaden ZK-Schale, klein GREINER, Frickenhausen I.2 weitere Reagenzien 5 x Reverse Transkriptase Puffer GIBCO, Eggenstein 10 x PCR-Puffer GIBCO, Eggenstein 50 mM Magnesiumchlorid GIBCO, Eggenstein 100 Basenpaar Leiter (100 bp ladder) GIBCO, Eggenstein DNase I (RNase frei, 10 U/µl) GIBCO, Eggenstein DTT (0,1 M) GIBCO, Eggenstein RNase Inhibitor (40 U/µl) Super Script TM GIBCO, Eggenstein II-Reverse Transkriptase (200 U/µl) Taq DNA Polymerase GIBCO, Eggenstein GIBCO, Eggenstein 120 Anhang I.3 Geräteverzeichnis 1) Analysenwaage, (80-400 g), SARTORIUS über Landgraf, Hannover 2) Analysenwaage, BA 61 (0-60 g), SARTORIUS über Landgraf, Hannover 3) Brutschrank, CO2-Auto-Zero, HERAEUS-CHRIST, Osterode 4) Brutschrank, MEMMERT GmbH & Co., Schwabach 5) Elektronenmikroskop, Transmissions-EM 910, ZEISS, Göttingen 6) Elektrophoresekammer horizontal für DNA, Easy-Cast Electrophoresis System, OWL SCIENTIFIC, Inc. Woburn, MA USA 7) FACS-Scan-Gerät, BECTON DICKINSON, Heidelberg 8) Fluoreszenzmikroskop, LEICA, Bensheim 9) Glasmesser, FCS Kryomikrotom, LEICA, Bensheim 10) Hermle Zentrifuge, ZK 380, HERMLE, Wehingen 11) Kamera digital, BIO-RAD, MultiAnalyst-Sytem, München 12) Konfokalmikroskop, DM-IRBE, invertiert, LEICA, Bensheim 13) Kühlzentrifuge, Hermle Z 400 K, HERMLE, Wehingen 14) Lamina, HB 2448 S, HERAEUS, Hanau 15) Magnetrührer, LR 12, METTLER über Landgraf, Hannover 16) Mikroskop, Orthoplan, LEITZ, Wetzlar 17) Mikrowelle, PANASONIC, Hannover 18) Multi-Screen-Systems, BIO RAD, München 19) pH-Meter, WTW, Weilheim 20) Photometer und Zubehör, Spektratphotometer Ultrospec III, PHARMACIA, Freiburg 21) Photometer für Mikrotiterplatten, BCA-Reader, DINATEC, Guernsey, Island 22) Pipettboy, TECNOMARA, Fernwald 23) Schweißgerät, polystarâ 100 GE, RISCHE UND HERFURTH, Hamburg 24) Stromversorgungsgerät, PowerPac 300, BIO RAD, München 25) Thermocycler, Primus, MWG-BIOTECH, Ebersberg 26) Tischzentrifuge, EPPENDORF, Tespe 27) Ultrostainer, LEICA, Bensheim 28) Vortex/Aufrüttler, HEIDOLPH über Landgraf, Hannover 29) Wasserbad, GFL, Burgwedel 121 An dieser Stelle möchte ich mich bedanken bei Prof. Peter Valentin-Weigand für die Überlassung des Themas und die Betreuung der Arbeit, bei Dr. Ralph Goethe für sein stetes Interesse, seine Ideen, sein Fachwissen, seine Unterstützung bei der Durchführung der Experimente, aber vor allem bei der Anfertigung der Dissertation - und in den letzten Wochen in Hannover sogar für seinen Humor und das angenehme Arbeitsklima, bei den Arbeitsgruppen von Manfred Rohde, Thomas Jungi, Hans-Joachim Schuberth und Beate Sodeik, und bei den Mitarbeitern und Doktoranden des Institutes für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover für die Hilfsbereitschaft und die stets nette und freundliche Zusammenarbeit. Mein besonderer Dank gilt hier: Mark Kühnel für die Arbeiten am Konfokalmikroskop und viele andere Arbeiten und Hilfestellungen, Jörg Matusch für seine Hilfe bei allen Computerfragen (egal ob am Wochenende oder spät Abends, auf Dich konnte ich immer zählen), Herrn Richter für das Zähmen und liebevolle Pflegen von Felix (ohne Sie wäre ich nie an sein Blut gekommen), Herrn Kipri und Werner Scharnhorst für die Hilfe bei Felix (alleine ist es eben fast unmöglich), Herrn Wernheimer für das Sterilfiltrieren der Unmengen an Citratpuffer (wenn auch noch so kurzfristig, Sie haben’s immer möglich gemacht) und Felix für sein Blut (möge er ewig im Rinder-Himmel herumtollen). Mein allerherzlichster Dank gilt aber meinen Eltern, die mir das Studium und die Doktorarbeit erst ermöglicht haben, und Mark, der mich privat und auch fachlich immer unterstützt und die Zeit im Institut versüßt hat. 122
