Designer Host Defense Peptide zur onkolytischen Therapie von
Werbung
Aus der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte, Handchirurgiezentrum des Berufsgenossenschaftlichen Universitätsklinikums Bergmannsheil der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. H.U. Steinau Designer Host Defense Peptide zur onkolytischen Therapie von Liposarkomen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Cornelius Dieter Schubert aus Roth 2012 Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: Prof. Dr. med. L. Steinsträßer Koreferent: Prof. Dr. med. S. Hahn Tag der mündlichen Prüfung: 23. April 2013 ABSTRACT Cornelius Dieter Schubert Designer Host Defense Peptide zur onkolytischen Therapie von Liposarkomen Problem: Weichgewebssarkome stellen eine heterogene Gruppe seltener sowie hochaggressiver maligner Tumoren dar. Aktuelle Therapieoptionen sind limitiert und die Ansprechrate auf Chemotherapeutika ist immer noch unbefriedigend. Host Defense Peptide (HDPs) als Teil des angeborenen Immunsystems könnten in Zukunft eine Schlüsselrolle in der Sarkomtherapie spielen. Ziel meiner in vitro und in vivo Studie war es, ein DesignerHDP auf seine onkolytische Wirkung gegenüber Liposarkomen, den häufigsten Weichgewebssarkomen, hin zu untersuchen sowie den genauen Wirkmechanismus hierbei zu analysieren. Methode: In vitro: Die humane Liposarkomzelllinie SW-872 und primäre humane Fibroblasten als Kontrollzellen wurden mit [D]-K3H3L9 inkubiert, einem 15-mer D,L-Aminosäure Designer-HDP. Die antiproliferative (BrdU-Assay) wie auch die antimetabolische Wirkung (MTT-Assay) wurde im Vergleich zu aktuellen klinischen „Gold-Standard“Chemotherapeutika (Doxorubicin, Vincristin, Methotrexat, Ifosfamid) analysiert. Zudem wurde die DNAFragmentierung (TUNEL-Assay) unter HDP-Inkubation untersucht. Der onkolytische Wirkmechanismus wurde mittels FACS-Analyse und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie erforscht. In vivo: Durch subkutane Injektion von SW-872 Liposarkomzellen wurde in athymischen Nacktmäusen (Foxn1nu/nu) Tumorwachstum induziert. Ab einem Tumorvolumen von 200 mm 3 wurde [D]-K3H3L9 (Einzeldosis: 8,5 mg/kg; n=7) dreimal pro Woche über einen Zeitraum von 3 Wochen intratumoral injiziert. PBS diente als Kontrolle (n=5). Die Proliferationsrate, Mitoserate, Gefäßdichte, das Ausmaß des nekrotischen Areals sowie Zeichen der Apoptose bzw. Nekrose wurden histologisch und immunhistochemisch verglichen. Ergebnis: In vitro: [D]-K3H3L9 reduzierte hochsignifikant (p<0,01) die Zellproliferation und den Zellmetabolismus. Verglichen mit aktuellen klinischen „Gold-Standard“-Chemotherapeutika erwies sich das Peptid als vergleichbar antiproliferativ bzw. als stärker antimetabolisch wirksam. Der TUNEL-Assay zeigte eine dosisabhängige genotoxische Wirkung. FACS-Analyse und konfokale Laser Scanning Mikroskopie bestätigten die Zellnekrose als primären onkolytischen Wirkmechanismus. In vivo: Zum Versuchende war das Tumorvolumen der Behandlungsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe hochsignifikant (p<0,01) reduziert. Es betrug lediglich 13,1 % des Tumorvolumens der Kontrollgruppe. Makroskopisch konnte in 43 % volle Remission und in 43 % Teilremission beobachtet werden. Histologische und immunhistochemische Analysen zeigten in der Behandlungsgruppe eine hochsignifikante Reduktion der Proliferationsrate (-87%), eine Verminderung der Mitoserate (-39 %), eine signifikante Abnahme der Gefäßdichte (-52%) sowie eine Vergrößerung der nekrotischen Fläche (+100 %). Die morphologische Analyse bestätigte die Zellnekrose als wahrscheinlichsten onkolytischen Wirkmechanismus in vivo. Diskussion: Zusammenfassend konnte ich in meiner Forschungsarbeit zeigen, dass das Designer-HDP [D]-K3H3L9 gegenüber den SW-872 Liposarkomzellen in vitro und in vivo hochpotente onkolytische Eigenschaften aufwies und die Zellen via Zellnekrose abtöte. Somit könnten onkolytische Designer-HDPs eine innovative sowie überaus wirkungsvolle Therapieoption in der zukünftigen Behandlung von Weichgewebssarkomen darstellen. Für Meine Familie INHALTSVERZEICHNIS Seite 1. EINLEITUNG ....……………………….…………………………….................10 1.1. Weichgewebssarkome .…………………………………………………….....10 1.1.1. Definition ………………………………………………………………………... 10 1.1.2. Epidemiologie ...………………………………………………………………....11 1.1.3. Ätiologie ……………………………………………………………………........ 13 1.1.4. Klinisches Erscheinungsbild ………………………………………………...... 14 1.1.5. Pathologie und Staging ……………………………………………................. 16 1.1.6. Therapieoptionen ………………………………………………….……............20 1.1.6.1. Chirurgische Therapie …………………………………………..........20 1.1.6.2. Strahlentherapie …………………………………………………........21 1.1.6.3. Chemotherapie …………………………………………………..........22 1.2. Host Defense Peptide ……………………………………………………....... 25 1.2.1. Definition ……………………………………………………………………........25 1.2.2. Wirkungsspektrum …………………………………………………………....... 26 1.2.2.1. Antimikrobielle Aktivität …………………………………………........ 26 1.2.2.2. Immunmodulatorische Aktivität ……………………………….......... 27 1.2.2.3. Wundheilung ……………………………………………………..........28 1.2.2.4. Onkolytische Aktivität ……………………………………………....... 28 1.2.3. Molekularer Aufbau ………………………………………………………......... 29 1.2.4. Wirkmechanismus …………………………………………………………........32 1.2.5. Designer Host Defense Peptid [D]-K3H3L9 ………………………………....... 35 2. ZIELSETZUNG ……………………………………………………………........ 37 1 3. MATERIAL UND METHODIK ……………………………………………....... 38 3.1. Laborbedarf ……………………………………………………………….........38 3.1.1. Reagenzien …………………………………………………………………....... 38 3.1.2. Puffer und Lösungen ………………………………………………………....... 42 3.1.3. Labormaterialien und Geräte ……………………………………………......... 43 3.2. Zellkultur ………………………………………………………………….......... 47 3.2.1. Zellen ………………………………………………………………………......... 47 3.2.2. Isolierung primärer humaner Fibroblasten ………………………………....... 48 3.2.3. Peptide und Chemotherapeutika ………………………………………...........49 3.3. In Vitro Analyse ………………………………………………………............. 50 3.3.1. Proliferations-Analyse: BrdU-Assay ……………………………………..........50 3.3.2. Vitalitäts-Analyse: MTT-Assay ……………………………………………....... 51 3.3.3. DNA-Fragmentierung: TUNEL-Assay ………………………………….......... 52 3.3.4. Zelltod-Differenzierung: FACS-Analyse …………………………………....... 54 3.3.5. Zelluläre Peptidlokalisation: Konfokale Laser Scanning Mikroskopie …......55 3.4. In Vivo Analyse ………………………………………………………….......... 57 3.4.1. Tiere und Haltung …………………………………………………………........ 57 3.4.2. Sarkom Xenograft Model …………………………………………………........ 57 3.5. Histologische Analyse …………………………………………………......... 60 3.5.1. Histologische Färbungen …………………………………………………........ 60 3.5.2. Immunhistochemische Färbungen ………………………………………........ 60 3.5.3. Auswertung …………………………………………………………………....... 61 3.6. Statistische Auswertung ………………………………………………......... 62 2 4. ERGEBNISSE ……………………………………………………………..........63 4.1. In Vitro …………………………………………………………………….......... 63 4.1.1. Proliferations-Analyse: BrdU-Assay ……………………………………..........63 4.1.2. Vitalitäts-Analyse: MTT-Assay ……………………………………………....... 64 4.1.3. DNA-Fragmentierung: TUNEL-Assay …………………………………….......67 4.1.4. Zelltod-Differenzierung: FACS-Analyse …………………………………....... 69 4.1.5. Zelluläre Peptidlokalisation: Konfokale Laser Scanning Mikroskopie …….. 72 4.2. In Vivo ……………………………………………………………………..........73 4.2.1. Sarkom Xenograft Model …………………………………………………........ 73 4.3. Histologie ………………………………………………………………….........76 4.3.1. Proliferation …………………………………………………………………....... 76 4.3.2. Nekrotische Fläche ………………………………………………………..........80 4.3.3. Angiogenese ……………………………………………………………….........81 4.3.4. Morphologie: Semidünnschnitt-Verfahren ………………………………........82 5. DISKUSSION ……………………………………………………......................84 5.1. Onkolytische Wirksamkeit in vitro …………………………………............85 5.2. Onkolytische Wirksamkeit in vivo …………………………………….........92 5.3. Onkolytischer Wirkmechanismus ……………………………………......... 98 6. ZUSAMMENFASSUNG ………………………………………............. ........104 7. LITERATUR ……………………………………………………………….......107 8. ANHANG ……………………………………………………..........................124 3 VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN 7-AAD 7-Amino-Actinomycin 22RV1 Humane Prostatakarzinom-Zelllinie 22RV1 AJCC American Joint Committee on Cancer AS Aminosäure BrdU Bromdesoxyuridin c-erbB2 Cellular avian erythroblastosis homologue B2 – Gen C2H6O Ethanol CHOP C/EBP-homologous protein CL1 Humane Prostatakarzinom-Zelllinie CL1 CoCl2 Cobaltdichlorid DAPI 4′,6-Diamidin-2’-phenylindol-dihydrochlorid D-HDP D-Aminosäuren Host Defense Peptid D-L-HDP D- und L-Aminosäuren Host Defense Peptid DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid dTTP Desoxythymidintriphosphat dUTP 2'-Deoxyuridine 5'-Triphosphate EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FACS Fluorescence-activated cell sorting FBS Fetales Rinderserum (engl.: fetal bovine serum) FITC Fluoresceinisothiocyanat FNCLCC French Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer g Erdbeschleunigung G Grading GIST Gastrointestinaler Stromatumor H Histidin HCHO Methanal HCl Salzsäure HDP Host Defense Peptid H&E Hämatoxylin-Eosin HFB Primäre humane Fibroblasten 4 HIV Humanes Immundefizienz-Virus HPF High Power Field HSV Herpes-simplex-Virus IC50 Mittlere inhibitorische Konzentration IC100 Komplette inhibitorische Konzentration IVC Individuell ventilierter Käfig (engl.: individually ventilated cage) K Lysin L Leucin L-HDP L-Aminosäuren Host Defense Peptide M Fernmetastase (TNM-Klassifikation) M Molar MDM2 Mouse double minute 2 - Gen MG Molekulargewicht mM Milimolar MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid N Regionärer Lympknoten (TNM-Klassifikation) N2 Stickstoff NaCl Natriumchlorid NaOH Natriumhydroxid N-myc V-Myc Myelocytomatosis viral related oncogene, Neuroblastoma derived - Gen N2O Distickstoffmonoxid O2 Sauerstoff OL Humane Vorhaut-Fibroblasten OL p Irrtumswahrscheinlichkeit PBS Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (engl.: phosphate buffered saline) PBS-T PBS-Tween-20 PS Phosphatidylserin ras Rat sarcoma - Gen RP-HPLC Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl.: reverse phase high performance liquid chromatography) SCC Standard saline citrate SEM Standardfehler (engl.: standard error of the mean) STR Short Tandem Repeats 5 SW-872 SW-872 Liposarkomzelllinie T Primärtumor (TNM-Klassifikation) TdT Terminale Deoxynucleotidyl Transferase TLR-2 Toll-like-Rezeptors 2 TLS Translocated in liposarcoma - Gen TNF-α Tumornekrosefaktor-α Tris HCl Tris (hydroxymethyl)-aminomethan-hdyrochlorid TUNEL Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)-mediated 2'Deoxyuridine 5'-Triphosphate (dUTP) Nick-End labeling UICC Union Internationale Contre le Cancer µl Mikroliter µM Mikromolar µm Mikrometer 6 VERZEICHNIS DER TABELLEN Tabelle 1 Tumor-Staging (S. 17) Tabelle 2 Tumor-Grading (S. 18) Tabelle 3 TNM-Klassifikation (S. 19) Tabelle 4 BrdU-Assay - Untersuchte Stoffkonzentrationen (S. 51) Tabelle 5 MTT-Assay - Untersuchte Stoffkonzentrationen (S. 52) Tabelle 6 TUNEL-Assay - Untersuchte Stoffkonzentrationen (S. 54) Tabelle 7 BrdU-Assay - IC50-Werte (S. 66) Tabelle 8 MTT-Assay - IC50-Werte (S. 66) 7 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN Abbildung 1 Weichgewebssarkom - Verteilung (S. 12) Abbildung 2 Liposarkom - Klinisches Erscheinungsbild (S. 14) Abbildung 3 Weichgewebssarkom - Lokalisation (S. 15) Abbildung 4 Aktueller Therapiealgorithmus bei Weichgewebssarkomen (S. 24) Abbildung 5 HDP-Wirkungsspektrum (S. 25) Abbildung 6 HDP-Design (S. 30) Abbildung 7 HDP-Wirkmechanismus (S. 33) Abbildung 8 Sarkom Xenograft Model (S. 59) Abbildung 9 Nekrosenausmessung (S. 62) Abbildung 10 BrdU- bzw. MTT-Assay (S. 65) Abbildung 11 TUNEL-Assay (S. 68) Abbildung 12 FACS-Analyse – Scatterplot (S. 70) Abbildung 13 FACS-Analyse (S. 71) Abbildung 14 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (S. 72) Abbildung 15 Sarkom Xenograft Model (S. 74) Abbildung 16 Tumorgewicht (S. 74) Abbildung 17 Tumorvolumina (S. 75) 8 Abbildung 18 Peptidinjektionsareal (S. 77) Abbildung 19 High Power Field Auszählung – Proliferation (S. 78) Abbildung 20 Proliferationsrate (S. 78) Abbildung 21 High Power Field Auszählung – Mitose (S. 79) Abbildung 22 Mitoserate (S. 79) Abbildung 23 Tumorausmessung (S. 80) Abbildung 24 Nekrotischer Tumoranteil (S. 80) Abbildung 25 High Power Field Auszählung – Angiogenese (S. 81) Abbildung 26 Angiogenese (S. 81) Abbildung 27 Semidünnschnittverfahren – Behandlungsgruppe (S. 82) Abbildung 28 Semidünnschnittverfahren – Kontrollgruppe (S. 83) 9 1. EINLEITUNG 1.1. WEICHGEWEBSSARKOME 1.1.1. Definition Weichgewebssarkome stellen eine heterogene Gruppe seltener, hochaggressiver maligner Tumoren dar. Zusammen mit den malignen Knochensarkomen werden sie der Übergruppe der Sarkome zugeteilt [32]. Der Begriff Sarkom geht ursprünglich auf den griechischen Arzt und Anatom Galenos von Pergamon (129 n.Chr – 216 n.Chr) zurück und leitet sich von der griechischen Bezeichnung für Fleisch, „Sarkos“, ab. Er bezieht sich auf das fleischartige makroskopische Aussehen dieser Tumorart [71, 114]. Die Gemeinsamkeit aller Sarkome ist definitionsgemäß, dass sie vornehmlich aus dem embryonalen Mesoderm entspringen. Für die Gruppe der Weichgewebssarkome bedeutet dies, dass sie alle malignen nicht-epithelialen, extraskelettalen Tumoren mit Ausnahme von Tumoren des retikuloendothelialen Systems, der Glia und des Stützgewebes der Eingeweide oder spezifischer Organe umfasst. Tumoren aus dem Gewebe des autonomen peripheren Nervensystems sind hierbei mit eingeschlossen, obwohl sie nicht mesodermalen, sondern neuroektodermalen Ursprungs sind [76]. Entsprechend der hohen Anzahl unterschiedlicher Gewebearten, aus denen ein Weichgewebssarkom entstehen kann, werden über 50 verschiedene Weichgewebssarkom-Entitäten unterschieden [51]. Von allen Weichgewebssarkomen stellt das in meiner Arbeit untersuchte Liposarkom die weitaus häufigste Entität dar [122]. 10 1.1.2. Epidemiologie Obwohl beim Menschen das Weichgewebe 50 % der Gesamtkörpergewebsmasse ausmacht [203], stellen Weichgewebssarkome weniger als 1 % aller maligner Tumoren dar [76]. Mit Neuerkrankungen / 100.000 einer jährlichen Einwohner sind Inzidenz sie von relativ nur selten. In 2-4 der Bundesrepublik Deutschland werden pro Jahr lediglich ca. 2500 - 3000 Fälle neu diagnostiziert, wobei Männer etwas häufiger betroffen sind als Frauen [51]. Das mediane Diagnosealter beträgt 65 Jahre [51]. Durchschnittlich gehört mit einem Anteil von 15 % an allen Weichgewebssarkomen das Liposarkom zu den häufigsten Vertretern. Innerhalb der Liposarkome wiederum dominierend sind die drei histologischen Haupttypen das gut-differenzierte, das myxoide sowie das pleomorphe Liposarkom [122]. Mit 12 %, sind zudem das Leiomyosarkom, mit 10 % das Synovialsarkom und mit 6% der maligne periphere Nervenscheidentumor relativ häufig [30]. Auch im operativen Referenzzentrum für Gliedmaßentumore des BG Klinikums Bergmannsheil in Bochum stellt sich ein ähnliches Bild dar und so nimmt das Liposarkom mit einem Anteil von 22,9 % auch hier die Mehrheit aller behandelten Weichgewebssarkome ein (Abb. 1). Das Patientenalter hat einen wichtigen Einfluss auf die Epidemiologie der unterschiedlichen Weichgewebssarkom-Entitäten. Entsprechend macht diese Krebsart bei Kindern 7 % aller Malignome aus und ist in dieser Altersgruppe die sechsthäufigste Malignitität [200]. Besonders häufige Weichgewebssarkome im Kindes- und Jugendalter sind das embryonale und das alveoläre Rhabdomyosarkom sowie das Synovialsarkom. Zusammen decken diese drei Entitäten über 70 % der Weichgewebssarkome in jener Altersgruppe ab [32, 76]. Bei Erwachsenen über 55 Jahren dagegen ist der Anteil an Leiomyosarkomen und Liposarkomen proportional erhöht [133]. Mit dem Alter ändert sich nicht nur das Spektrum der auftretenden Weichgewebssarkome, sondern auch die Wahrscheinlichkeit einer Neuerkrankung. So steigt bei Personen über 80 Jahren die Sarkom-Inzidenz schließlich auf 8 Neuerkrankungen / 100.000 Einwohner an [84]. 11 6,5% 6,5% 6,4% 5,6% 10,1% 3,6% 3,0% 2,8% 2,6% 2,3% 2,1% 1,8% 17,5% 1,8% 1,5% 1,1% 22,9% Liposarkom: 22,9% Leiomyosarkom:10,1% Myxofibrosarkom: 6,5% Maligner peripherer Nervenscheidentumor: 5,6% Rhabdomyosarkom: 3,0% Fibrosarkom: 2,6% Hämangio-Tumoren: 2,1% Extraskelettales Ewing-Sarkom: 1,8% Extraskelettales Chondrosarkom: 1,1% Alveoläres Weichgewebssarkom: 0,6% 0,4% 0,6% 0,9% Malignes fibröses Histiozytom: 17,5% Fibromatose: 6,5% Synovialsarkom: 6,4% Spindelzellsarkom: 3,6% Dermatofibrosarcoma protuberans: 2,8% Myofibroblastisches Sarkom: 2,3% Epitheloides Sarkom: 1,8% Klarzellsarkom: 1,5% Seltene Typen: 0,9% Extraskelettales Osteosarkom: 0,4% Abbildung 1: Weichgewebssarkom-Verteilung. Verteilung der einzelnen WeichgewebssarkomEntitäten am operativen Referenzzentrum für Gliedmaßentumore des BG Klinikums Bergmannsheil. (Prozentuale Verteilung, n: 2056 Weichgewebssarkome, Stand: 1.7.2007, Quelle: Institut für Pathologie, BG Klinikum Bergmannsheil, Bochum) 12 1.1.3. Ätiologie Der Ursprung der meisten Weichgewebssarkome ist noch unbekannt. Der Großteil scheint de novo und ohne direkte Ursache zu entstehen [51]. Zu den wenigen gesicherten Risikofaktoren zählt die Bestrahlungstherapie im Rahmen der Tumorbehandlung, welche bei nahezu 1 % der Sarkom-Patienten, insbesondere bei Angiosarkom-Patienten als Einflussfaktor eine Rolle spielt [51]. Nach einer Radiatio maligner Tumoren der Brust, Cervix, Ovarien, Hoden oder des lymphatischen Systems ist die Inzidenz um den Faktor 8 – 50 erhöht [17, 201]. Hierbei nimmt das Risiko, später an einem Weichgewebssarkom zu erkranken, mit ansteigender Strahlendosis zu. Die meisten der betroffenen Patienten haben zuvor eine Strahlendosis von mindestens 50 Gy erhalten [51]. Die mediane Latenzzeit zwischen Bestrahlungstherapie und Sarkom-Diagnose beträgt ca. 10 Jahre [51, 145]. Ein weiterer Risikofaktor ist der Kontakt mit bestimmten Chemikalien. Herbizide wie Phenoxyessigsäure oder Holzschutzmittel, welche Chlorphenol enthalten, sind bezüglich Weichgewebssarkomen besonders kanzerogen [62, 166]. Bei der Entstehung von ca. 1 % aller Weichgewebssarkome spielen außerdem genetische Faktoren eine prädisponierende Rolle. Beim Li-Fraumeni Syndrom scheint die Keimbahnmutation des TP53 Tumor Suppressor Gens entscheidend für die Tumor-Entstehung zu sein. Die Hälfte aller Betroffenen leidet hier bereits im Alter von 30 Jahren unter malignen Tumoren, von denen über 30 % Weichgewebs- und Knochensarkome darstellen [72]. Zudem erhöhen gewisse DNA-Mutationen die Erkrankungswahrscheinlichkeit. Onkogene, deren Mutation die Entstehung eines Weichgewebssarkoms zur Folge haben können, sind das Mouse double minute 2 (MDM2) - Gen, das V-Myc myelocytomatosis viral related oncogene - Neuroblastoma derived (N-myc) - Gen, das Cellular avian erythroblastosis homologue B2 (c-erbB2) - Gen wie auch Mitglieder der Rat sarcoma (ras) – Genfamilie. Eine Amplifikation dieser Onkogene korreliert zudem mit einer schlechteren Prognose [98]. Auch Virusinfektionen können zur Erkrankung führen und so spielt das humane Herpes Virus 8 eine Schlüsselrolle bei der Entstehung des Kaposi Sarkoms [51]. Obgleich das Liposarkom die häufigste Weichgewebssarkom-Entität darstellt, ist diese Untergruppe äußerst selten mit den oben genannten Risikofaktoren assoziiert [145]. 13 1.1.4. Klinisches Erscheinungsbild Weichgewebssarkome zeichnen sich durch ihr vorerst lokal verdrängendes Wachstum aus (Abb. 2). Das umgebende Gewebe wird hierbei zu einer Art Pseudokapsel mit reaktiven Gewebsveränderungen komprimiert und umgestaltet. Es besteht hier die Gefahr, dass der Tumor Kapsel aufgrund als benigne seiner vermeintlichen fehlinterpretiert wird. Tatsächlich ist die Pseudokapsel jedoch stets mit Tumorzellen infiltriert und der Tumor wächst mikroskopisch über den Kapselrand hinaus. Bevorzugt folgt das Tumorwachstum von Weichgewebssarkomen vorangelegten Faszienund Gefäß-Nerven-Strukturen als Leitschienen. Auch diskontinuierliches Wachstum in Form von Skip-Läsionen ist möglich. Diese erhöhen je nach Ausmaß der chirurgischen Resektion die Häufigkeit von Lokalrezidiven [76]. Die klinische Symptomatik von Weichgewebssarkomen ist relativ unspezifisch. Schwellungen, die vom Patienten selbst entdeckt werden, stellen das häufigste Primärsymptom dar. Diese Schwellungen führen aber nur in 20 % - 30 % zu einer lokalen oder symptomatik [76]. fortgeleiteten Oftmals werden SchmerzWeich- gewebssarkome als Zufallsbefunde erfasst, die trotz des häufig großen Tumorvolumens, nicht die Funktion oder das Allgemeinbefinden des Patienten einschränken. Nur in ca. 20 % der Abbildung 2: Liposarkom – Klinisches Erscheinungsbild. Tumor in situ, MRT-Aufnahme, Tumorpräparat, Histologischer Befund (von oben nach unten, Färbung: H&E, Vergrößerung: 100 x) [141] Fälle stehen bereits zum Diagnosezeitpunkt Anzeichen einer malignen Erkrankung wie z.B. Gewichtsverlust, Leistungsknick oder Metastasen im Vordergrund [51]. 14 Aufgrund ihrer Seltenheit und des vergleichsweise harmlosen klinischen Erscheinungsbildes werden maligne Weichgewebssarkome oftmals als benigne Tumoren fehldiagnostiziert. Die Tatsache, dass benigne Weichgewebstumoren wie z.B. Lipome um den Faktor 100 häufiger sind als maligne Sarkome, macht diese Problematik umso verständlicher [51]. Somit beträgt die durchschnittliche Anamnesedauer ca. ein Jahr [76]. Prinzipiell können Weichgewebssarkome am gesamten Körper lokalisiert sein, jedoch findet sich eine gewisse Häufigkeitsverteilung für bestimmte Körperpartien (Abb. 3) [26]. Die Lokalisation korreliert oft mit der Größe des Tumors. Im Gegensatz zu Tumoren der Extremität oder Rumpfwand sind retroperitoneale Tumoren zum Diagnosezeitpunkt meist deutlich größer, da sie aufgrund ihrer anatomischen Lage erst sehr spät symptomatisch werden [51]. Das Liposarkom ist das häufigste retroperitoneal gelegene Weichgewebssarkom. Es wird daher oft erst in einem fortgeschrittenen Tumorstadium mit entsprechend schlechter Prognose diagnostiziert, so dass aktuelle Therapieansätze (siehe 1.1.6.) meist ungenügend sind [26]. Im Allgemeinen sind zum Zeitpunkt der Diagnose des Primärtumors bereits in 10 % - 20 % der Patienten Metastasen nachweisbar [51, 76], welche zu 70 % 80 % in der Lunge lokalisiert sind [9, 76]. Bei retroperitonealen und viszeralen Tumoren kommen häufiger auch Leber- und Peritonealmetastasen vor [41]. Weichgewebssarkome metastasieren vorwiegend hämatogen. Lymphogene Metastasen sind selten und am ehesten beim Synovial- oder Rhabdomyosarkom zu finden [76]. Kopf & Hals: 3,0% Oberarm: 12,0% Stamm: 19,9% Unterarm: 8,5% Hand: 2,2% Oberschenkel: 37,3% Unterschenkel: 12,1% Fuß: 5,0% Abbildung 3: Weichgewebssarkom-Lokalisation. Verteilungsmuster von Weichgewebssarkomen am operativen Referenzzentrum für Gliedmaßentumore des BG Klinikums Bergmannsheil (Prozentuale Verteilung, Zeitraum: 1990 – 2008, Quelle: Klinik für Plastische Chirurgie, BG Klinikum Bergmannsheil, Bochum) 15 1.1.5. Pathologie und Staging Der exakte Weichgewebssarkom-Pathomechanismus ist bislang noch nicht geklärt [133]. Im Gegensatz zu vielen epithelialen Karzinomen, stammen Weichgewebssarkome oft nicht von den entsprechend ausgereiften Gewebetypen ab [187, 196]. So ist bisher nicht bewiesen worden, dass beispielsweise Liposarkome dem ausgereiften Fettgewebe entspringen bzw. durch maligne Transformation aus Lipomen hervorgehen [187]. Die heute bekannten, über 50 verschiedenen histologischen Weichgewebssarkom-Subtypen werden daher vornehmlich nach dem Gewebe benannt, dem sie hinsichtlich Morphologie am ehesten ähneln [26]. Um die exakte Entität zu bestimmen wird der Tumor anhand folgender pathologischer Kriterien untersucht: Makroskopisches Erscheinungsbild, Histopathologie, Immunophänotyp, Ultrastruktur sowie individuelle genetische Merkmale [26, 116]. Hinsichtlich der genetischen Merkmale können Weichgewebssarkome generell in zwei Hauptgruppen unterteilt werden [67]: Die erste Hauptgruppe umfasst Tumoren mit einem nahezu diploiden Karyotyp mit nur wenigen spezifischen genetischen Veränderungen [67]. Insbesondere chromosomale Translokationen, die zu Fusionsgenen führen können, sind hier von zentraler Bedeutung. Im Falle des myxoiden Liposarkoms beispielsweise führt die chromosomale Translokation der Chromosomen 12 und 16 t(12;16)(q13;p11) zu einer charakteristischen Fusion des Gens für C/EBP-homologous protein (CHOP) und des Translocated in liposarcoma (TLS)-Gens [32, 149]. Ein weiteres typisches Merkmal dieser ersten Gruppe sind zudem onkogene Mutationen wie z.B. des c-Kit Gens, welches für die Rezeptor-Tyrosinkinase KIT kodiert und in über 50 % aller gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) zu finden ist [38]. Diese Mutation führt zu einer ligandenunabhängigen, kontinuierlichen Aktivierung der Tyrosinkinase, was eine anti-apoptotische wie auch proliferationsfördernde Wirkung zur Folge hat [71]. Die zweite Hauptgruppe, in die Weichgewebssarkome aus zytogenetischer Sicht unterteilt werden können, umfasst Tumoren mit unspezifischen genetischen Veränderungen und einem komplexen Karyotyp, der eine schwere Störung der genomischen Stabilität widerspiegelt [67, 187]. Typische genetische Aberrationen sind hier beispielsweise unbalancierte Chromosomen-Translokationen, 16 Veränderungen in der Chromosomenzahl sowie Gendeletionen bzw. Genamplifikationen [187]. Zu den Tumoren dieser zweiten Hauptgruppe gehören z.B. alle Liposarkom-Subtypen außer dem myxoiden Liposarkom, das, wie oben dargestellt, zur ersten Hauptgruppe gehört [67]. Die genannten genetischen Aberrationen können erblich oder erworben sein und sind bereits in vielen Weichgewebssarkomen beschrieben und systematisiert worden [83, 88, 182]. Dadurch wird die Klassifizierung von ehemals schwierig zu identifizierenden Sarkom-Entitäten, insbesondere von pleomorphen Weichgewebssarkomen, erleichtert bzw. überhaupt erst möglich gemacht [26, 163]. Dennoch reicht eine pathologische Klassifizierung der Weichgewebssarkome in ihre jeweiligen Subtypen allein nicht aus, um den klinischen Verlauf vorherzusagen und eine entsprechend aggressive Therapie zu planen [51]. Durch das Staging wird versucht, eine genauere Aussage über den Ausbreitungsgrad des Tumors und somit die individuelle Prognose des Patienten zu machen. Das Staging beeinflusst somit zentral die Radikalität und den Umfang der folgenden Therapie. Das führende Staging System für Weichgewebssarkome ist vom American Joint Committee on Cancer (AJCC) und der Union Internationale Contre le Cancer (UICC) entwickelt worden (Tab. 1) [26, 32, 51]. Es beinhaltet die vier wichtigsten Kriterien, die das Überleben des Patienten beeinflussen: Tumor-Grading (G) (Tab. 2), Größe und Lage des Tumors (T), Befall regionärer Lympknoten (N) sowie das Vorhandensein von Fernmetastasen (M) (Tab. 3). Tabelle 1: Tumor-Staging. Staging-System für Weichgewebssarkome gemäß AJCC und UICC. (Erläuterungen der Abkürzungen in Tab. 2 + 3) Stadium Grading T N M IA G1 G1 T1a T1b N0, Nx N0, Nx M0 M0 IB G1 G1 T2a T2b N0, Nx N0, Nx M0 M0 IIA G2-3 G2-3 T1a T1b N0, Nx N0, Nx M0 M0 G2-3 T2a N0, Nx M0 G2-3 T2b N0, Nx M0 Jedes G Jedes G Jedes T Jedes T N1 Jedes N M0 M1 IIB III IV 17 Das Tumor-Grading ist innerhalb des Stagings der wichtigste prognostische Faktor. In der Vergangenheit sind diverse Grading-Systeme für Weichgewebssarkome entwickelt worden [33, 111, 120, 188, 193]. Zu den gängigsten GradingSystemen zählt das System der French Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer (FNCLCC) (Tab. 2) [29-31, 188]. Hierbei wird das TumorGrading über entsprechende Scores anhand von Tumorzelldifferenzierung, Mitoserate und Tumornekroseanteil errechnet [188]. Daraus ergibt sich eine dreistufige Einteilung der Sarkome in gut differenzierte G1-Tumoren, mäßig differenzierte G2-Tumoren sowie schlecht differenzierte G3-Tumoren. Innerhalb der Weichgewebssarkome liegt die Grading-Verteilung bei 5 % - 10 % für G1Tumoren, 25 % - 30 % für G2-Tumoren und die Mehrheit mit 50 % - 60 % für G3Tumoren [29], was die Aggressivität dieser Tumoren deutlich unterstreicht. Das Grading ist zudem der Haupteinflussfaktor auf die 5-Jahres-Überlebensrate des Patienten. Für G1-Sarkome liegt diese bei 72 % - 83 %, für G2-Sarkome bei 53 % - 59 % und für die mehrheitlich vorkommenden hochaggressiven G3Sarkome bei lediglich 26 % - 42 % [82]. Bei Weichgewebssarkomen ist es entscheidend, dass das Tumor-Grading von einem erfahrenen und auf diese Tumorart spezialisierten Pathologen durchgeführt wird, da sie von allgemeinen Pathologen in 25 % - 40 % der Fälle fehldiagnostiziert werden [151, 165]. Tabelle 2: Tumor-Grading. Grading-System für Weichgewebssarkome gemäß FNCLCC 2 (* HPF= High Power Field, definierte Fläche: 0,1734 mm ) Tumorzelldifferenzierung Score: 1 Ausgeprägte Ähnlichkeit mit normalem, adultem, mesenchymalem Gewebe Score: 2 Sicherer histologischer Typ Score: 3 Embryonales und undifferenziertes Gewebe oder unsicherer histologischer Typ Mitoserate Score: 1 0-9 Mitosen / 10 HPF* Score: 2 10-19 Mitosen / 10 HPF* Score: 3 ≥ 20 Mitosen / 10 HPF* Tumornekroseanteil Score: 0 Keine Nekrose Score: 1 < 50 % Tumornekrose Score: 2 ≥ 50 % Tumornekrose Histologisches Tumor-Grading Grade 1: Gesamtscore: 2-3 Grade 2: Gesamtscore: 4-5 Grade 3: Gesamtscore: 6-8 18 Die weiteren das Staging beeinflussenden Faktoren sind in der TNM-Klassifikation für Weichgewebssarkome zusammengefasst (Tab. 3). Hierzu zählt die Größe und Lage des Primärtumors (T). Weichgewebssarkome werden in Tumoren > 5 cm und Tumoren ≤ 5 cm eingeteilt. Des Weiteren wird zwischen oberflächlich und tief gelegenen Tumoren unterschieden. Regionale Lymphknoten (N) sind bei Weichgewebssarkomen mit 5 % relativ selten befallen [32]. Fernmetastasen (M) hingegen beeinträchtigen stark das Gesamtüberleben der Patienten. Die meisten Patienten sterben aufgrund weitläufiger Tumormetastasierung, welche in 80 % der Patienten innerhalb der ersten 2 - 3 Jahre nach Erstdiagnose auftreten [32]. Tabelle 3: TNM-Klassifikation. Klassifikationssystem für Weichgewebssarkome gemäß AJCC und UICC T Primärtumor T1 Tumordurchmesser ≤ 5cm - T1a - Oberflächlich - T1b - Tief T2 Tumordurchmesser > 5cm - T2a - Oberflächlich - T2b - Tief N Regionäre Lymphknoten N0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen N1 Regionäre Lymphknotenmetastasen vorhanden M Fernmetastasen M0 Keine Fernmetastasen M1 Fernmetastasen vorhanden 19 1.1.6. Therapieoptionen 1.1.6.1. Chirurgische Therapie Im Zentrum der Weichgewebssarkom-Behandlung steht die chirurgische Therapie (Abb. 4) [36, 51, 76, 91, 161, 172]. Angestrebtes Ziel ist es, den Tumor gemäß allgemeinen Radikalitätsprinzipien zu resezieren, um ein lokoregionäres Rezidiv zu verhindern [91, 161, 172]. Als oberstes Prinzip gilt, dass der Tumor während der Operation nicht eröffnet wird, tumoradhärente Strukturen en-bloc entfernt werden und die Resektionsränder histologisch tumorfrei sind [36, 172]. Die Resektion muss weit im Gesunden angelegt sein, da infiltrierende Zellverbände entlang Faszien, Muskelsepten und epineuralem Bindegewebe diskontinuierlich vorwachsen können [76, 91]. Zur Sicherung der Radikalität sollten intraoperativ Schnellschnitte von den Resektionsrändern entnommen werden. Die Radikalität der Operation wird gemäß der Einteilung nach Enneking differenziert [161]. Hierbei wird unterschieden zwischen i) radikaler Resektion, ii) weiter Resektion, iii) marginaler Resektion, iv) intraläsionaler bzw. subtotaler Resektion sowie v) palliativer Resektion. Die Resektion gilt als radikal, wenn es tumorfreie Resektionsgrenzen von 3 cm und mehr gibt. Das tumortragende Kompartment wird hierbei en-bloc entfernt. Bei der weiten Resektion finden sich histologisch tumorfreie Resektionsgrenzen von 1 – 3 cm. Bei der marginalen Resektion reicht der Resektionsrand bis an den Tumor heran. Der Resektionsrand ist dabei histologisch auf einer Breite von einigen mm bis 1 cm tumorfrei. Bei der intraläsionalen bzw. subtotalen Resektion wird der Tumor eröffnet oder aus der oft tumorinfitrierten Pseudokapsel ausgeschält. Adhärente Strukturen wie Nerven, Gefäße oder Knochen sind histologisch nicht tumorfrei. Es verbleiben histologisch positive Resektionsränder. Die palliative Resektion umfasst lediglich eine Tumorverkleinerung mit makroskopisch deutlichen Tumorresten. Die operative Radikalität hängt vom Grading, der Nähe zu vitalen Strukturen, dem Patientenalter und der rechtfertigbaren funktionellen Beeinträchtigung ab. Eine generelle Dissektion des lokoregionären Lymphabstromgebietes wird nicht empfohlen, da Lymphknotenmetastasen mit unter 5% relativ selten auftreten [161]. Bei vereinzelten Sarkomen mit erhöhter Gefahr von Lymphknotenmetastasen wie z.B. dem Synovialsarkom [161], ist eine präoperative Wächterlymphknotenbiopsie jedoch sinnvoll. Während früher die Amputation bei vielen Weichgewebssarkomen 20 die einzig kurative Option darstellte, kann heute oftmals bei befriedigendem funktionellem Outcome extremitätenerhaltend operiert werden [46, 202]. Dennoch schränken diverse Faktoren den Erfolg der chirurgischen Therapie stark ein [3536, 81, 170]. So ist eine kurative chirurgische Resektion bei bereits metastasierten Tumoren schwierig. Gerade bei den lange asymptomatischen und dadurch eventuell großen Sarkomen stellt eine ausgedehnte Resektion insbesondere für multimorbide Patienten eine große Belastung mit erhöhter Morbidität und Mortalität dar [35-36, 81, 170]. Auch eine chirurgische Resektion in der Nähe vitaler Strukturen wie z.B. Aorta oder Rückenmark birgt enorme Risiken mit eventuell fatalen funktionellen Einschränkungen. Postoperative Komplikationen reichen von Wundheilungsstörungen über Lähmungserscheinungen bis hin zur fulminanten Sepsis mit Multiorganversagen [35, 170-171]. 1.1.6.2. Strahlentherapie Die Radiatio hat im interdisziplinären Therapieansatz einen hohen Stellenwert und erlaubt, die lokale Tumorkontrolle deutlich zu verbessern (Abb. 4) [161]. Es werden i) präoperative bzw. neoadjuvante, ii) intraoperative sowie iii) postoperative bzw. adjuvante Strahlentherapien unterschieden. Ziel der neoadjuvanten Radiatio ist es, das Tumorvolumen vor der Operation zu reduzieren, um möglichst eine R0-Resektion zu ermöglichen bzw. eine Amputation zu vermeiden [157]. Nach einer anschließenden Operation ist hierbei allerdings eine signifikant erhöhte postoperative Morbidität besonders durch Bestrahlungsinduzierte Wundheilungsstörung wie z.B. chronische Ulzera oder Hautnekrosen zu berücksichtigen [17, 129, 144, 161]. Meist wird präoperativ eine relativ hohe Dosis von ca. 50 Gy verabreicht [32]. Die intraoperative Strahlentherapie ist besonders bei problematischen Tumorlokalisationen wie z.B. im retroperitonealen Raum indiziert. Hier kann eine perkutane Bestrahlung problematisch sein. Die intraoperative Radiatio mit Einzeldosen von 5-20 Gy kann im Rahmen einer Dosisaufsättigung zur prä- bzw. postoperativen Strahlentherapie erfolgen. Alternativ können im Rahmen einer Brachytherapie intraoperativ Applikationskatheter für das radioaktive Isotop Iridium192 in das Resektionsbett eingelegt werden [32]. Strahlenquellen auch Somit an können schwierig gezielter zugängliche und folglich schonender Resektionsorte gebracht 21 werden [32, 161]. Bei der adjuvanten Bestrahlungstherapie beinhaltet das bestrahlte Areal neben dem Operationsbett zusätzlich die Operationsnarbe und die Drainageausgangsorte. Die verabreichte Dosis beträgt hier meist 60 70 Gy [32]. Es können je nach Sarkomentität lokale Tumorkontrollraten von 78 % 91 % erzielt [32, 102] und die Lokalrezidivraten auch für nicht R0-resezierte Weichgewebssarkome deutlich gesenkt werden [4-5, 27]. Generell bergen alle Arten der Strahlentherapie jedoch die Gefahr schwerer Nebenwirkungen, die direkt nach der Radiatio oder auch Jahrzehnte später auftreten können [2, 32]. Zu den wichtigsten Nebenwirkungen Wundheilungsstörungen zählen Strahlendermatitis, neben den oben Lymphödeme, genannten Fibrosen oder pathologische Frakturen [2, 32]. Überdies fördert die Strahlentherapie selbst die Entstehung von Weichgewebssarkomen oder von malignen Hauttumoren wie Plattenepithelkarzinomen (siehe 1.1.3.) [51, 152]. 1.1.6.3. Chemotherapie Innerhalb des Behandlungskonzeptes von Weichgewebssarkomen spielt die systemische Chemotherapie aktuell eine eher untergeordnete, experimentelle Rolle und ist klinischen Studien vorbehalten (Abb. 4) [32, 92, 161]. Auch hier wird eine neoadjuvante von einer adjuvanten Therapie unterschieden. Die neoadjuvante Chemotherapie verfolgt mehrere Ziele. Einerseits die lokale Tumorkontrolle durch präoperative Verkleinerung des Tumorvolumens sowie die Reduktion der Rezidivneigung durch Elimination von Intransitmetastasen [32, 77], andererseits die Verbesserung des Gesamtüberlebens durch eine frühzeitige Therapie von subklinischen Mikrometastasen [32, 77]. Die Datenlage für einen Überlebensvorteil durch eine neoadjuvante Chemotherapie ist jedoch dünn und die Ergebnisse teils ernüchternd [32, 57, 92, 161]. In kleineren Studien wurde eine komplette Tumornekrose durch eine Doxorubicin-Monotherapie in nur 5 % - 9 % der Patienten erzielt [69, 134]. Meric et al. untersuchten zudem einen potentiellen Operationsvorteil nach neoadjuvanter Chemotherapie bei 65 Patienten mit Stage II und III Sarkomen [117]. Nur bei 12 % aller Patienten wurde der Therapieerfolg als ausreichend beurteilt, um das Operationsausmaß zu reduzieren. Zugleich nahm während der Therapiedauer in 9 % der Fälle das Tumorvolumen dermaßen zu, dass das Ausmaß der folgenden Operation noch zusätzlich ausgeweitet werden 22 musste. Bei keinem der Patienten, bei denen vor der Chemotherapie eine Amputation indiziert war, konnte diese durch eine systemische neoadjuvante Chemotherapie verhindert werden [117]. Eine Sonderstellung unter den neoadjuvanten Chemotherapien nimmt die isolierte Extremitätenperfusion ein. Hierbei wird die tumortragende Extremität über einen getrennten Blutkreislauf mit dem Chemotherapeutikum Melphalan und dem Zytokin Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) perfundiert [96, 100, 128]. Dabei kann die Maximaldosis der Substanzen bis auf das 10 bis 20-fache der systemischen Dosis gesteigert werden, so dass bei eventueller Remission eine extremitätenerhaltende Operation teils möglich gemacht wird [20, 95, 201]. Jedoch ist ein kurativer Ansatz auf nicht-metastasierte Tumoren der Extremität beschränkt, wobei hier Remissionsraten von 50 % erzielt werden [96, 128]. Bei fortgeschrittenem Tumorwachstum konnte durch diese Technik bislang noch kein Fortschritt hinsichtlich eines Überlebensvorteiles erzielt werden [92, 95, 128]. Der Nutzen einer adjuvanten Chemotherapie ist bei Weichgewebssarkomen bisher nicht ausreichend gesichert und bislang abgeschlossene Phase-II-Studien bieten diesbezüglich ein recht uneinheitliches Bild [32, 77, 161]. Die Ansprechrate auf Chemotherapeutika variiert je nach Sarkom-Entität, Tumor-Grade, Patientenalter, Allgemeinzustand und Metastasenstatus [32, 192]. Überdies wurde in diversen Studien gezeigt, dass eine adjuvante Chemotherapie weder das Gesamtüberleben noch das krankheitsfreie Überleben verbessert [32, 89, 159]. Wegen der oft nur insuffizienten Therapieerfolge der Chemotherapie, müssen vor jeder Behandlung daher ausführlich der individuelle Nutzen für den Patienten und die teils schwerwiegenden Nebenwirkungen abgewogen werden. Diese variieren je nach eingesetzter Substanz von Übelkeit, paralytischem Illeus über schwerste Blutbildveränderungen bis hin zur Kardio- und Hepatotoxizität [91, 156, 169]. Angesichts der deutlich limitierten Effektivität und der teils drastischen Nebenwirkungen ist die aktuelle Weichgewebssarkom-Therapie stark eingeschränkt (Abb. 4). Die mehrheitlich vorkommenden hochaggressiven G3Weichgewebssarkome stellen hier eine besondere Schwierigkeit dar, besonders wenn sie am Körperstamm auftreten [29]. Gerade bei diesen Tumoren sind große Tumorvolumina, ausgedehnte Metastasierungen, hohe Rezidivraten und die Nähe zu vitalen Strukturen ernsthafte und praxisrelevante Probleme [91]. In Anbetracht dieser Herausforderungen ist ein wirksamerer und zugleich schonenderer Therapieansatz in der Weichgewebssarkom-Therapie dringend nötig. 23 Weichgewebssarkom I. Chirurgische Therapie II. Strahlentherapie III. Chemotherapie • Zentrale Bedeutung • Zentrale Bedeutung • Experimentell • Wirkungsvoll • Wirkungsvoll • Insuffizient • Ziel: Lokale • Ziel: Lokale • Ziel: Systemische Tumorkontrolle Tumorkontrolle • Probleme: • Probleme: Tumorkontrolle • Probleme: - Metastasierung - Metastasierung - Starke Nebenwirkungen - Nähe zu vitalen Strukturen - Nähe zu vitalen Strukturen - Mangelnde Ansprechrate - Multimorbide Patienten - Starke Nebenwirkungen - Keine Verbesserung des - Funktionelle - Massive Spätfolgen Beeinträchtigung - Hohe Strahlendosen nötig Gesamtüberlebens - Keine Verbesserung des krankheitsfreien Überlebens Abbildung 4: Aktueller Therapiealgorithmus bei Weichgewebssarkomen 24 1.2. HOST DEFENSE PEPTIDE 1.2.1. Definition Host Defense Peptide (HDPs) sind Peptid-Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems [19, 59, 177]. Sie gehören zu den entwicklungsgeschichtlich ältesten Formen der Immunabwehr von eukaryotischen Zellen [73, 180]. Viele Tiere wie z.B. Insekten, Oktopus oder Seesterne besitzen weder Lymphozyten, noch Thymus oder Antikörper. Das Immunsystem dieser Tiere stützt sich zentral auf diese hochaktiven Host Defense Peptide, um sich gegen die feindliche Umwelt zu wehren [208]. HDPs sind in der Natur äußerst verbreitet und konnten bisher in fast jeder darauf untersuchten Spezies von Bakterien über Pilze, Pflanzen, Tiere bis hin zum Menschen nachgewiesen werden [73, 93]. Bisher wurden 1954 natürliche HDPs beschrieben [1]. Typische Merkmale und entscheidend für Wirkungsspektrum und Wirkmechanismus sind eine amphipatische Konformation, ein meist kationischer Charakter bei zugleich sehr geringer Länge von nur 540 Aminosäureresten [73]. HDPs zeichnen sich durch ihr vielseitiges Wirkungsspektrum aus (Abb. 5). So besitzen sie eine breite antimikrobielle Aktivität [53, 59, 73, 110, 177], spielen eine wichtige Rolle bei der Wundheilung [176] und besitzen teils immunmodulatorische Aktivität [39, 86, 173, 177-178, 208]. In jüngster Zeit wurde das Wirkungsspektrum durch eine onkolytische Aktivität einzelner HDPs erweitert [3, 73, 140, 174]. Host Defense Peptid Antimirobielle Aktivität Immunmodulation Wundheilung Onkolytische Aktivität Abbildung 5: HDP-Wirkungsspektrum 25 Je nach Ursprung werden natürlich vorkommende HDPs von künstlich erschaffenen, so genannten Designer-HDPs mit optimierter Wirksamkeit unterschieden [73, 140]. Die Familien der Cathelizidine z.B. hCAP18/LL-37 und der Defensine z.B. α-Defensine gehören zu den am besten untersuchten natürlichen HDPs [125-126, 162]. Sie kommen in den verschiedensten Zell- und Gewebetypen des menschlichen Körpers wie z.B. Leukozyten oder Epithelzellen der Haut vor und werden entweder kontinuierlich oder auf spezifische immunologische Reize hin exprimiert [25, 65, 70, 86]. 1.2.2. Wirkungsspektrum 1.2.2.1. Antimikrobielle Aktivität Bekannt wurde die Gruppe der HDPs durch die ersten Beschreibungen ihrer direkten antimikrobiellen Aktivität [59]. Daher wurden sie anfangs und werden sie auch heute noch synonym als antimikrobielle Peptide bezeichnet. Abhängig vom individuellen HDP richtet sich die Aktivität sowohl gegen Gram-positive Bakterien wie z.B. das HDP Cathelicidin hCAP18/LL-37 gegen Staphylococcus aureus als auch gegen Gram-negative Bakterien wie z.B. das Designer-HDP Novispirin G10 gegen Pseudomonas aeruginosa [53, 59-60, 73, 181, 208]. Darüber hinaus sind einige HDPs auch wirksam gegenüber Pilzen, Protozoen und Viren wie z.B. das HDP Brevinin-1 gegenüber dem Herpes-simplex-Virus (HSV) oder Abkömmlinge des HDP Protegrin-1 gegenüber dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) [5960, 73, 185, 205, 208]. Zielproteine bei der antimikrobiellen Aktivität stellen beispielsweise Lipid A oder auch Lipopolysaccacharide der äußeren bakteriellen Zellwand dar [59, 61]. Aber auch innerhalb der Mikroben sind HDPs aktiv und können mittels Interaktion mit der bakteriellen DNA und anderen intrazellulären Zielen die Zielzellen zerstören [15, 44, 55, 59, 176]. Neben dem direkten Angriff auf Mikroben sind einige HDPs überdies in der Lage, entsprechend sezernierte pathogene Substanzen wie bakterielle Toxine z.B. Lipopolysaccharid oder Lipoteichonsäure direkt oder indirekt zu binden bzw. deren Wirkmechanismus zu hemmen [39, 86, 173, 178, 208]. 26 1.2.2.2. Immunmodulatorische Aktivität Neben der antimikrobiellen Aktivität besitzen Host Defense Peptide auch immunmodulatorische Eigenschaften. Sie greifen an verschiedenen Stellen in die hochkomplexe Immunreaktion sowohl des adaptiven als auch des angeborenen Immunsystems ein. So sind HDPs sowohl pro- als auch antiinflammatorisch wirksam. Sie fördern die Apoptose, induzieren die Zytokin- und Chemokinausschüttung, beeinflussen die Zelldifferenzierung, stimulieren die Mastzelldegranulation und haben chemotaktische Eigenschaften [7, 13, 37, 50, 123-124, 158, 204]. Eine wichtige Rolle des angeboren Immunsystems bei der Erkennung bakterieller Erreger spielen die Toll-like-Rezeptoren. Sie stellen ein Brücke zwischen angeborenen und adaptivem Immunsystem dar [184]. In einer kürzlich publizierten Studie konnte bei der Untersuchung von verletzter humaner Haut eine erhöhte Expression des CD14-Rezeptors wie auch des Toll-likeRezeptors 2 (TLR-2) in Keratinozyten der Wundumgebung nachgewiesen werden. Ferner konnte beschrieben werden, dass eine erhöhte TLR-2 und CD14 Expression eine vermehrte Bildung des humanen Cathelizidin HDP hCAP18/LL-37 induziert [160]. Cathelizidine gehören neben den Defensinen zu den am besten erforschten HDPs des Menschen und sind in der Lage, T-Lymphozyten, dendritische Zellen und Monozyten anzulocken. Darüber hinaus stimulieren sie TLymphozyten zur Freisetzung von pro- und antiinflammatorischen Substanzen wie z.B. Interferonen und Interleukinen. Diese Ergebnisse weißen darauf hin, dass HDPs nicht nur als Effektoren des angeborenen Immunabwehr fungieren, sondern auch eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung des adaptiven Immunsystems einnehmen [10, 16, 114-115, 118]. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass HDPs ihre antimikrobielle Aktivität auch über ihre immunmodulatorischen Funktionen ausüben [11]. 27 1.2.2.3. Wundheilung Ein weiterer Wirkbereich von Host Defense Peptiden ist die Wundheilung. Jedoch spielen HDPs nicht nur bei verletzter Haut eine zentrale Rolle, sondern sorgen auch bei intakter Haut dafür, dass der schützende Hautmantel unversehrt bleibt. So leisten z.B. die HDPs RNase 7 und Psoriasin S100A7 einen wichtigen Beitrag zur Aufrechterhaltung eines bakteriologischen Gleichgewichtes der Hautflora [12, 162]. Kommt es schließlich zu einer Verletzung oder sogar einer Infektion der Haut, werden bestimmte HDPs durch Neutrophile Granulozyten und Keratinozyten vermehrt synthetisiert und ausgeschüttet. So ist eine kontinuierliche und induzierbare Expression des humanen Cathelizidins hCAP18/LL-37 sowie der humanen beta-Defensine-2 und -3 in epidermalen Keratinozyten beschrieben worden [44, 52, 63]. Heilborn et al. zeigten eine hohe Konzentration von hCAP18/LL-37 in Wunden, wohingegen in chronischen Wunden nur stark erniedrigte hCAP18/LL-37-Konzentrationen nachgewiesen wurden [66]. Diverse andere Arbeitsgruppen konnten einen protektiven Effekt von hCAP18/LL-37 gegenüber Hautinfektionen mit bakteriellen Erregern insbesondere Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Streptokokken der Gruppe A nachweisen [14, 44, 127, 131]. Die Arbeitsgruppe um Niyonsaba beschrieb überdies, dass beta-Defensine die Migration wie auch die Proliferation von epidermalen Keratinozyten stimulieren würden und somit entscheidend für einen kutanten Wundheilungsprozess sein könnten [126]. 1.2.2.4. Onkolytische Aktivität In jüngster Zeit hat sich herausgestellt, dass einige Host Defense Peptide auch onkolytische Eigenschaften besitzen [3, 60, 105, 174, 208]. So konnte beispielweise gezeigt werden, dass das vom glatten Krallenfrosch (Xenopus laevis) isolierte Sekret Magainin II in Studien zur Bekämpfung von Blasen-Krebs vielversprechende zytotoxische wie auch antiproliferative Aktivität ausübt. Dabei konnte eine Selektivität des Peptids gegenüber malignen Zellen festgestellt werden [90]. Weitere Studien durch Papo et al. an Prostatakarzinomen zeigten eindrücklich, dass auch synthetisch hergestellte modifizierte Designer-HDPs antitumorale Aktivität aufweisen. Bei diesen in vivo-Xenograft Versuchen konnte 28 bei allen behandelten Mäusen ein partieller Rückgang des Tumors und in 40 % der Fälle eine vollkommene Remission des Tumors nach Therapie mit dem synthetischen HDP erzielt werden [136]. Die Gruppe der onkolytischen HDPs werden in zwei Kategorien unterteilt [73]: Erstens, HDPs, die hochpotent gegenüber Bakterien und Krebszellen sind jedoch nicht gegenüber normalen, gutartigen Zellen. Zweitens, HDPs, die zytotoxisch gegenüber Bakterien, Krebszellen und zugleich zytotoxisch gegenüber normalen, gutartigen Zellen sind. Diese letzte Gruppe umfasst also hochaktive zytotoxische HDPs, die aber nicht selektiv zwischen gutartigen und bösartigen Zellen unterscheiden können. Entscheidend für die Selektivität sind zum einen Struktur und molekularer Aufbau potentieller Zielzellen und wie sehr sich diese von physiologischen, gutartigen Zellen unterscheiden, und zum anderen der individuelle HDP-Aufbau aus den verschiedenen Aminosäuren. Details hierzu werden unten genau erläutert (siehe 5.1.). 1.2.3. Molekularer Aufbau In der großen Familie der Host Defense Peptide können natürlich vorkommende HDPs, wie z.B. das oben erwähnte Magainin II [90] von so genannten Designer Host Defense Peptiden, wie dem in dieser Studie untersuchtem [D]-K3H3L9 unterschieden werden [108]. Die Aminosäuresequenz letzterer Designer-HDPs kann hier völlig frei festgelegt werden und bietet dem Wissenschaftler ein fast unerschöpfliches Arsenal an HDPs, welche für den jeweiligen Einsatz hochspezifisch zusammengestellt werden können. All entscheidend für die Wirksamkeit sowohl der synthetischen Designer-HDPs als auch der natürlich vorkommenden HDPs ist der jeweilige molekulare Aufbau. Mehrere Hauptcharakteristika haben hierbei Einfluss auf die Aktivität der einzelnen Host Defense Peptide (Abb. 6). Allen HDPs gemeinsam ist eine relativ kurze Aminosäuresequenz von nur 5 – 40 Aminosäureresten [73]. Dabei bestimmt das Zusammenspiel der einzelnen Aminosäuren (AS) letztendlich den Charakter und die Wirkungsweise des gesamten HDPs: Die meisten HDPs besitzen eine charakteristische positive Nettoladung, welche bei neutralen pH-Werten zwischen +2 bis +9 variiert [73]. Diese positive Nettoladung spielt eine entscheidende Rolle für den unten genauer erläuterten Wirkmechanismus. Die Zellmembran von 29 Bakterien wie auch vieler maligner entarteten Zellen ist negativ geladen [18, 34, 43, 73, 190, 206]. Die kationische Ladung der HDPs auf der einen Seite und die anionische Ladung der Zielmembran auf der anderen Seite erlaubt somit über elektrostatische Wechselwirkungen eine gezielte Bindung. Darüber hinaus ist darauf zu achten, dass die Wahl der AS zu einem möglichst amphipathischen Charakter des gesamten HDP-Moleküls führt [73], d.h. dass das HDP sowohl hydrophile als auch hydrophobe Abschnitte besitzt. Dies kann erzielt werden, indem man sowohl hydrophile also geladene Aminosäuren wie z.B. Lysin oder Histidin als auch hydrophobe also ungeladene bzw. neutrale Aminosäuren wie z.B. Leucin in einem HDP-Molekül verbindet. Ein amphipathischer Charakter erleichtert die Interaktion der HDPs mit der ebenfalls amphipathischen Phospholipidmembran der Zielzelle. Das HDP kann dadurch die Zielmembran leichter durchdringen und schließlich zerstören. Ferner kann sich die Chiralität der einzelnen Aminosäuren auf die Halbwertszeit der HDPs im lebenden Organismus auswirken. Unterschieden werden die physiologisch in körpereigenen Proteinen vorkommenden L-Aminosäuren von ihren entsprechenden Enantiomeren, den D-Aminosäuren. In mehreren Studien stellte sich heraus, dass insbesondere onkolytische HDPs, die nur aus L-Aminosäuren bestehen, nur in vitro aktiv sind, wohingegen sie in vivo ihre Aktivität einbüßen [6, 108, 136-138, 140]. Der Grund hierfür liegt sowohl im proteolytischem Abbau der HDPs als auch in der Bindung der HDPs an Serumkomponenten [6, 136]. Dieses Hindernis kann durch den Einsatz von HDPs ausgeglichen werden, die entweder nur aus D-Aminosäuren bestehen oder aus einem Mix von D- und L-Aminosäuren, wie geschehen im Falle des in dieser Studie untersuchten Designer-HDPs [D]-K3H3L9 [108]. - Kationisch - Elektrostatische Bindung - Amphipathisch - Membranaktivität - D-L-Enantiomere - Stabilität in vivo - pKs ↓ - Aktivität im sauren Milieu HDP 5 - 40 AS Abbildung 6: HDP-Design. Molekulare Charakteristika und deren Bedeutung. 30 Insbesondere für die onkolytische Wirksamkeit der HDPs sind überdies die pKsWerte der einzelnen Aminosäuren wichtig. Gerade in hochproliferativen und somit hochmalignen Tumoren übersteigt die Sauerstoff- und Nährstoffnachfrage des wachsenden Tumorgewebes oft das jeweilige Angebot. Da die Angiogenese nur unzureichend mit dem Tumorwachstum mithalten kann, kommt es zu Sauerstoffund Nährstoffmangel. Im Rahmen dieser anaeroben Stoffwechsellage entsteht dementsprechend vermehrt Laktatsäure. Diese erhöhte Laktatsäureproduktion der Tumorzellen führt dazu, dass der pH-Wert des Tumorgewebes häufig im sauren Bereich liegt. Weiter verstärkt wird dieses saure Milieu durch einen unzureichenden Abtransport dieser sauren Stoffwechselprodukte aufgrund der oftmals chaotischen und mangelnden Vaskularisierung innerhalb des Tumorgewebes [135, 186]. Durch ein entsprechend abgestimmtes HDP-Design kann dieser pH-Wert-Unterschied zwischen soliden, malignen Tumoren und dem normalen, umgebenden Gewebe ausgenutzt werden und somit die gezielte Aktivität onkolytischer HDPs verbessert werden. Eine pH-abhängige Wirkung des onkolytischen HDPs kann dadurch erzeugt werden, dass vermehrt saure Aminosäuren mit niedrigen pKs-Werten in das HDP eingebaut werden. Diese sauren AS liegen bei einem physiologischen pH-Wert in ihrer basischen also deprotonierten Form vor. Liegt der pH-Wert jedoch im sauren Bereich, so verändert sich die Ladung der AS und sie liegen in ihrer sauren also protonierten bzw. kationischen Form vor. Der pH-Wert des umliegenden Gewebes bestimmt also die Ladung des HDPs. Somit sind onkolytische HDPs mit niedrigen pKsWerten erst im sauren Umfeld kationisch geladen und können folglich nur in diesem Umfeld als positiv geladene Moleküle an die negativ geladenen Zielmembranen binden [108, 136-137]. Gemäß dieser Theorie konnte die Gruppe um Makovitzki et al. bereits ein pH-abhängiges onkolytisches HDP generieren und damit im in vivo Xenograft Model erfolgreich das Volumen von Prostatakarzinomen reduzieren [108]. 31 1.2.4. Wirkmechanismus Host Defense Peptide Wirkungsspektrum. bieten Ebenso ein zahlreich äußerst wie umfassendes die vielen und breites unterschiedlichen Einsatzmöglichkeiten sind die einzelnen Wirkmechanismen, die den jeweiligen Wirkungsspektren zugrunde liegen. Dabei ist der genaue Wirkmechanismus oft noch nicht vollständig verstanden [73, 140, 208]. Dieser Abschnitt soll sich auf die zentralen Hypothesen der onkolytischen Wirksamkeit beschränken. Um möglichst gezielt nur maligne Zellen zu zerstören und physiologisch normale Zellen auszusparen, ist es wichtig die Unterschiede zwischen den beiden Zellen zu identifizieren. Von entscheidender Bedeutung ist hierbei die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem kationischen also positiv geladenen HDP und der anionischen also negativ geladenen, entarteten Zielzelle. Im Gegensatz zu dieser zeichnen sich die normalen Zellen des menschlichen Körpers physiologischerweise durch eine neutrale Nettoladung aus [73]. So besteht die Phospholipiddoppelmembran von Säugetieren zum Großteil aus zwitterionischen Phospholipiden wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin oder Sphingomyelin und ist daher weniger attraktiv für die kationischen HDPs [73]. Dieser Unterschied in der Zellmembranzusammensetzung ist entscheidend für die gezielte Aktivität der HDPs [73, 140, 208]. Im Vergleich hierzu sind Tumorzellen eher negativ geladen. Dies hat mehrere Gründe: Zum einen besteht die Zellmembran von Tumorzellen zu 3-9 % aus negativ geladenem Phosphatidylserin (PS) [23, 195]. Des Weiteren beinhaltet die Zellmembran vieler Tumorzellen O-glykosilierte Mucine [21]. Diese Glykoproteine generieren eine weitere negative Aufladung der Tumorzelloberfläche. Überdies scheint das im Vergleich zu normalen Zellen verstärkt negative Membranpotential innerhalb von Krebszellen einen Einfluss auf die gezielte Aktivität von HDPs zu haben [34]. Ein weiteres Merkmal von Tumorzellen, welches eine plausible Erklärung für die unterschiedliche Empfänglichkeit gegenüber HDPs darstellt, ist die erhöhte Anzahl an Microvilli auf der Oberfläche von Tumorzellen [210]. Folglich wird hierdurch die Oberfläche der Tumorzellen erhöht. Somit kann eine größere Anzahl an HDPs an die Zielzelle binden [22]. 32 Bindet das HDP an die Zielzelle, so gibt es daraufhin mehrere Mechanismen, die zum Tod der Zelle via Nekrose oder Apoptose führen. Die meisten Host Defense Peptide sind membranaktiv, das heißt, dass sie spezifisch an die Zellmembran der negativ geladenen Tumorzellen binden und diese zerstören, was zum Zelltod durch Nekrose führt [138]. Hierfür werden mehrere rezeptorunabhängige Mechanismen diskutiert (Abb. 7) [140]: Das „Carpet-Model“ [132, 150], das „Toroidal-Pores-Model“ [103, 113] sowie das „Barrel-Stave-Model“ [48]. Beim „Carpet-Model“ ordnen sich die kationischen HDPs in einem ersten Schritt über elektrostatische Wechselwirkungen parallel an die anionische, äußere Membran der Tumorzell-Zytoplasmadoppelmembran an und bedecken diese schließlich wie eine Art HDP-Teppich (engl.: carpet = Teppich). Sobald eine Schwellenkonzentration an HDPs erreicht ist, werden in einem zweiten Schritt die HDPs in die Membran integriert und durchdringen diese wie Detergentien. Diese kontinuierliche Durchdringung der Membran durch HDPs führt dann zur Zerstörung der Membranintegrität und zur Micellenbildung der Membran und dadurch zu deren Vernichtung. Zellzerstörung nach dem „Carpet-Model“ findet sich vornehmlich bei HDPs, die hochselektiv gegenüber Tumorzellen sind [140]. HDPs in Lösung HDPs in Lösung Membranbindung „Carpet-Model“ „Toroidal-Pores-Model“ Micellenbildung „Barrel-Stave-Model“ Membrandepolarisierung Abbildung 7: HDP-Wirkmechanismus. Wirkmechanismus von onkolytischen Host Defense Peptiden an der Membran von Tumorzellen [140]. 33 Beim „Toroidal-Pores-Model“ erfolgt der erste Schritt wie beim „Carpet-Model“. Nachdem auch hier eine Schwellenkonzentration an HDPs erreicht wird, wölbt sich die Membran nach innen und formt ein aus HDPs und Plasmamembranbausteinen bestehende kreisrunde Pore. Zwischen den jeweils positiven und sich folglich abstoßenden HDPs wirken die negativ geladenen Phospolipidmembrananteile als Stabilisatoren der Porenwand [73]. Schließlich kommt es durch die Poren zur Membranzersetzung und zum Zelltod durch Micellenbildung nach dem „Carpet-Model“. Alternativ kommt es beim „ToroidalPores-Model“ zum Zelltod, indem durch die Poren eine Depolarisierung der Membran ausgelöst wird. Das führt dazu, dass das Ionengleichgewicht innerhalb der Zelle nicht mehr aufrecht erhalten werden kann. Zudem laufen durch die Poren Zellinhalte in den extrazellulären Raum. Das „Barrel-Stave-Model“ findet sich primär bei HDPs, die nicht selektiv gegenüber Tumorzellen sind und die an alle Arten von Zellmembranen binden. Hierbei bilden HDPs eine transmembrane Pore, welche nur aus HDPs besteht und die gesamte Dicke der Plasmamembran überspannt. Dabei formt der hydrophile Teil der amphiphilen HDPs die Innenwand der Pore und der hydrophobe Teil der HDPs die Außenwand. Bedingung für das „Barrel-Stave-Model“ ist jedoch, dass ein HDP in der Lage ist, die ganze Dicke der Membran zu überspannen. Daher sind je nach Peptid-Sekundärstruktur im Falle von α-Helices mindestens 20 Aminosäurereste nötig und im Falle von β-Faltblättern mindestens 8 Aminosäurereste [73]. Schließlich kommt es hier zum Zelltod durch Nekrose, weil auch hier eine Depolarisierung der Membran ausgelöst wird. Neben der Nekrose-Induktion können HDPs auch die Zielzelle via Apoptose töten. Der Mechanismus hierbei beinhaltet die Internalisierung der HDPs in das Zytoplasma der eukaryotischen Zelle. Dort angelangt können HDPs die stark negativ geladene Membran der Mitochondrien angreifen und zersetzen. Dies führt wiederum zur Freisetzung von Cytochrom C aus dem Mitochondrium, was über eine Kaskade an Caspasen-Aktivierungen schließlich die Apoptose der Zielzelle auslöst [99, 106, 142]. Auch von einer Death-Receptor-abhängigen Induktion der Apoptose durch das HDP Tachyplesin wurde bereits berichtet [24, 143]. Weitere Arbeitsgruppen zeigten überdies auch HDP-Wirkmechanismen, die unabhängig von membranolytischen Mechanismen Krebszellen töten. So konnte gezeigt werden, dass das HDP Melittin selektiv aktiv gegenüber Zellen ist, welche hohe Mengen des ras-Onkogens exprimieren [164]. Darüber hinaus wirkte das HDP 34 Alloferon über eine immunmodulatorischen Effekt indirekt onkolytisch, indem es die antitumoralen Resistenzen in der Maus förderte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass HDPs nicht nur über ihre membranolytischen Aktivitäten alleine Tumorzellen zerstören, sondern auch über viele weitere, teils bisher noch nicht verstandene Mechanismen onkolytisch wirksam sind. 1.2.5. Designer Host Defense Peptid [D]-K3H3L9 In meiner Arbeit habe ich das synthetische Designer Host Defense Peptid [D]-K3H3L9 auf sein onkolytisches Potential gegenüber Liposarkomzellen untersucht. Das Peptid besteht aus einem Mix von 15 D- und L-Aminosäuren. Die exakte Peptid-Sequenz lautet: LHLLHKLLKHLLKLL-NH2 (L = Leucin, pKs = 5,98; H = Histidin, pKs = 6,1; K = Lysin, pKs = 10,5; D-Aminosäuren sind unterstrichen hervorgehoben). Die mit unserem Labor kooperierende Arbeitsgruppe um Yechiel Shai des Weizmann Institute of Science in Israel stellte aus der Erfahrung mehrerer Studien dieses Peptid-Design als vorerst beste Entwicklung vor [108, 136-138, 140]. Beim HDP-Design wurde besonders auf einen möglichst geringen Gesamt-pKsWert geachtet. So wurden bei diesem Peptid im Vergleich zu einem Vorgängerpeptid [D]-K6L9 (LKLLKKLLKKLLKLL-NH2) drei Lysin-AS mit hohem pKs-Wert durch 3 Histidin-AS mit niedrigerem pKs-Wert ersetzt [108]. Dies hatte zur Folge, dass der Gesamt-pKs-Wert des Peptides reduziert wurde (siehe 1.2.3.). Dennoch konnte noch keine pH-Abhängigkeit des Peptides erreicht werden. Erst der vollständige Ersatz der Lysin-AS durch Histidin-AS in einem weiteren Vorgänger-HDP, [D]-H6L9 (LHLLHHLLHHLLKLL-NH2), konnte den Gesamt-pKsWert ausreichend senken, um die gewünschte pH-Abhängigkeit im sauren Bereich zu erreichen. Jedoch war dieses [D]-H6L9 bereits ab einer einzelnen i.v. Dosis von 20 mg/kg toxisch, wohingegen beim in dieser Studie eingesetzten Peptid [D]-K3H3L9 nach einer einmaligen systemischen Gabe von bis zu 30 mg/kg auch nach 6 Tagen keine Anzeichen akuter Toxizität nachgewiesen werden 35 konnten [108]. Das Peptid [D]-K6L9 war bereits knapp über der therapeutischen Dosis ab einer einzelnen i.v. Gabe von 8 mg/kg toxisch [108]. Es konnte folglich durch die Senkung des gesamten pKs-Wertes die Tumor-gerichtete Aktivität verbessert und zugleich die systemische Toxizität reduziert werden. Für eine erfolgreiche in vivo Applikation wurde zudem die Chiralität der einzelnen Aminosäuren bedacht (siehe 1.2.3.). So verglichen Papo et al. verschiedene Designer-HDPs bezüglich ihrer Aktivität in vivo miteinander [136]. Dabei wurden Peptide untersucht, die nur aus L-Aminosäuren (L-HDP) bestanden, und baugleichen HDPs gegenübergestellt, die aus einem Mix aus D- und LAminosäuren (D-L-HDP) bestanden, wie es bei dem in dieser Studie eingesetzten Peptid der Fall ist. Dabei zeigte sich, dass das L-HDP nur in vitro hochwirksam war, jedoch nicht zwischen Tumorzellen und normalen Zellen unterscheiden konnte. In vivo war es überhaupt nicht aktiv, da es im Serum und der extrazellulären Matrix sowohl an Serumkomponenten gebunden wurde als auch proteolytisch inaktiviert wurde. Im Gegensatz dazu behielt das D-L-HDP seine volle Aktivität im Serum und wurde nur zu 50 % durch die extrazelluläre Matrix inaktiviert. Darüber hinaus konnte das D-L-HDP 15-fach besser an negativ geladene Membranen binden und zeigte überdies bei einer Konzentration von 100 µM keinerlei hämolytische Aktivität [136, 139]. Bei derselben Konzentration wurden beim L-HDP 100 % der Erythrozyten lysiert [139]. Benkirane et al. demonstrierten darüber hinaus, dass die gemischten D-L-HDPs gegenüber baugleichen L-HDPs bzw. HDPs, die nur aus D-Aminosäuren (D-HDPs) bestanden merklich weniger immunogen sind [8]. Deshalb wurde bei dem in meiner Studie untersuchtem Peptid [D]-K3H3L9 bewusst eine AS-Anordnung nach dem D-L-HDP-Prinzip gewählt. Die Arbeitsgruppe um Yechiel Shai testeten [D]-K3H3L9 bereits auf seine onkolytische Fähigkeiten gegenüber 22RV1 Prostatakarzinomzellen in vitro und in vivo [108]. In vitro war das Designer-HDP [D]-K3H3L9 gezielt aktiv gegenüber CL1 Prostatakarzinomzellen, 22RV1 Prostatakarzinomzellen sowie gegenüber LLC Lungenkarzinomzellen. In vivo wurde nach intratumoraler Gabe von 1 mg/kg bzw. nach systemischer Gabe von 9 mg/kg eine signifikante Reduzierung des Tumorgewichtes des 22RV1 Prostatakarzinom-Xenografts um 81 % bzw. 75 % im Vergleich zur Kontrollgruppe erreicht [108]. 36 2. ZIELSETZUNG Weichgewebssarkome umfassen eine große Vielfalt an seltenen und zugleich hochaggressiven malignen Tumoren. Jedoch sind die heutigen Therapieoptionen bisweilen ungenügend und mit teils schwersten Nebenwirkungen und Komplikationen behaftet. Daher werden effektivere und zugleich schonendere Therapieansätze dringend benötigt. In der molekularen Onkologie ist aktuell die onkolytische Wirksamkeit von Host Defense Peptiden Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen. Dabei handelt es sich um kleine, kationische Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems. Ziel meiner Forschungsarbeit war es, die onkolytische Wirkung von Designer-Host Defense Peptiden gegenüber der häufigsten Weichgewebssarkom-Entität, dem Liposarkom, zu untersuchen sowie den onkolytischen Wirkmechanismus hierbei zu analysieren. 37 3. MATERIAL UND METHODIK Sämtliche Zellkulturarbeiten sowie die in vitro und in vivo Versuche mit entsprechender histologischer und statistischer Aufarbeitung und Auswertung wurden von mir persönlich durchgeführt. 3.1. LABORBEDARF 3.1.1. Reagenzien 7-Amino-Actinomycin (7-AAD) BD Biosciences, San Jose, CA, USA 25 mM Cobaltdichlorid (CoCl2) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland 1 mM dATP PJK Krauser GmbH, Kleinblittersdorf, Deutschland 4′,6-Diamidin-2’-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) Invitrogen, Eugene, OR, USA 0,9 % Natriumchlorid-Lösung(NaCl) DeltaSelect GmbH, Dreieich, Deutschland 1 M Natriumhydroxid (NaOH) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland 1 M Salzsäure (HCl) Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland 1 % Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA Anti-[D]-K3H3L9-Antikörper aus dem Kaninchen NeoMPS SA, Straßburg, Frankreich Antigen Unmasking Solution Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA,USA Anti-human-Ki67-Antikörper Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen, Deutschland 38 BD Matrigel Matrix BD Biosciences, San Jose, CA, USA Biotinylierter Anti-KaninchenAntikörper aus der Ziege Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA,USA BrdU cell proliferation enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Kit Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland Chroma Tide ® Alexa Fluor ® 488-5-dUTP Invitrogen, Eugene,OR, USA Citronensäure Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Dako Fluorescent Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA, USA Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Distickstoffmonoxid (N2O) Air Products GmbH, Hattingen, Deutschland [D]-K3H3L9 PolyPeptide Laboratories, Straßburg, Frankreich DNAse I, RNAse-frei Qiagen Inc., Valencia, CA, USA Doxorubicin-Hydrochlorid Ribosepharm, Gräfelfing, Deutschland Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) high Glucose (4,5g/l) with L-Glutamine PAA Laboratories, Pasching, Österreich Dulbecco’s Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (engl.:Dulbecco’s phosphate buffered saline, PBS) PAA Laboratories, Pasching, Österreich Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Sigma, Aldrich Chemie GmbH, München,Deutschland 39 Ethanol (C2H6O) Sigma, Aldrich Chemie GmbH, München,Deutschland Fetales Rinderserum (engl.: fetal bovine serum, FBS) Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences, San Jose, CA, USA Forene® Isofluran Abbott GmbH & Co.KG, Wiesbaden, Deutschland Formafix 5 % Methanal (HCHO), neutral gepuffert PathoMed Logistik GmbH, Viersen, Deutschland Glycin Sigma, Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland Ifosfamid Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Deutschland Kollagenase Typ II Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ, USA Methotrexat-Dinatrium Gry Pharma GmbH, Kirchzarten, Deutschland Narcoren (Pentobarbital-Natrium) Merial GmbH, Hallbergmoos, Deutschland Natriumchlorid (NaCl) AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland Natriumcitrat Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA PBS-Tween-20 Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Penicillin/Streptomycin 100x Konzentrat Laboratories, Pasching, Österreich Sauerstoff (O2) Air Products GmbH, Hattingen, Deutschland 40 Streptavidin Alexa Fluor ® 488 conjugate 2 mg/ml Invitrogen, Eugene, OR, USA Stickstoff (N2) Air Products GmbH, Hattingen, Deutschland Temgesic (Buprenorphin) MSD Sharp & Dohme GmbH, Haar, Deutschland Terminale Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland TdT-Puffer Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA Tris (hydroxymethyl)-aminomethan -hdyrochlorid (Tris HCl) Merck KG, Darmstadt, Deutschland Trypsin-EDTA PAA Laboratories, Pasching, Österreich Vincristinsulfat Gry Pharma GmbH, Kirchzarten, Deutschland Xylol Sigma, Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland Ziegenserum Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA 41 3.1.2. Puffer und Lösungen Citratpuffer - 0,01 M Citronensäure - 0,01 M Natriumcitrat - pH-Wert: 3 Glycinpuffer - 0,1 M Natriumchlorid (NaCl) - 0,1 M Glycin - pH-Wert: 10,5 > eingestellt mit 1 M Natriumhydroxid (NaOH) Standard Saline Citrate (SSC) - 3 M Natriumchlorid (NaCl) - 0,3 M Natriumcitrat - pH-Wert: 7,0 > eingestellt mit 1 M Salzsäure (HCl) TE-Puffer - 10 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan-hdyrochlorid (Tris HCl), pH-Wert: 7,4 > eingestellt mit 1 M Salzsäure (HCl) - 1mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH-Wert: 8,0 > eingestellt mit 1 M Natriumhydroxid (NaOH) Reaktions-Mix - Terminale Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) bzw. TE-Puffer - TE-Puffer - TdT-Puffer - 25 mM Cobaltdichlorid (CoCl2) - 1 mM Chroma Tide ® Alexa Fluor ® 488-5 dUTP - 1 mM dATP 42 3.1.3. Labormaterialien und Geräte 6-Well Zellkulturtestplatte TPP, Trasadingen, Schweiz 96-Well Zellkulturtestplatte schwarz, transparenter, flacher Boden, mit Deckel Corning GmbH, Kaiserslautern Deutschland Athymische männlicheNacktmaus Typ Foxn 1nu/nu Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Deutschland Bachofer Ofen 400 HY Bachofer GmbH, Reutlingen, Deutschland BD CellQuestTM Pro Version 5.2.1. BD Biosciences, San Jose, CA, USA BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Biosciences, San Jose, CA, USA Canon Power Shot S21S Digitalkamera Canon Inc., Tokyo, Japan CASY-1 Model TT Cellcounter und Analyse System Schärfe System, Reutlingen, Deutschland Dampfsterilisator Varioklav Typ 400 HP Medizintechnik GmbH, Garching-Hochbrück, Deutschland Digitaler Messschieber Lux-Tools, Wermelskirchen, Deutschland Diskus 32 – Mikroskopische Bilddarstellung Technisches Büro Hilgers, Königswinter, Deutschland Electrolux UF601Ultra Cold Freezer Electrolux, Stockholm, Schweden Elx808 Ultra Microplate Reader Bio-Tek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Deutschland Eppendorf Centrifuge 5415C Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland 43 Einmal-Pinzetten Servoprax GmbH, Wesel, Deutschland Einmal-Skalpell Aesculap Ag&Co.KG, Tuttlingen, Deutschland FACS Röhrchen, 5 ml polysterene, Rundboden BD Biosciences, San Jose, CA, USA Feinwaage Typ 1712 Sartorius GmbH, Göttingen, Deutschland Exsikkator W. Feddeler, Laboratoriumsbedarf, Essen, Deutschland Glaskapillare Poulten&Graf GmbH, Wertheim, Deutschland Heidolph Inkubator 1000 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland Heidolph Unimax 1010 Schüttler Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland Heraeus Hera Safe Sterilwerkbank Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland Heraeus Function Line Inkubator Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland ImmEdge Pen Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA Individuell ventilierter Käfig (engl.: individually ventilated cage, IVC), Typ II Uno Roestvaststaal B.V., Zevenaar, Niederlande Kammerobjektträger, Lab-Tek II, 8 Kammern Nalge Nunc International, Naperville, IL, USA KC4 3.01 Analyseprogramm Bio-Tek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Deutschland 44 Kryoröhrchen Nalge Nunc International, Naperville, IL, USA Narkosegerät Sulla 19 Drägerwerk AG, Lübeck, Deutschland Magnetrührer RH Basic IKA Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland Microsoft Office Excel 2003 Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA Mikrowelle Sharp 700w Sharp, Hamburg, Deutschland Multifuge 3SR+Zentrifuge Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland Objektträger Superfrost Utra Plus Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Orion Microplate Luminometer Berthold Detection Systems, Pforzheim, Deutschland Probenlagerbehälter für Stickstoff Messer Chronos Messer Griesheim GmbH, Krefeld, Deutschland Schüttelwasserbad GFL 1092 GFL - Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel, Deutschland Simplicity 2.1. Analyseprogramm Berthold Detection Systems, Pforzheim, Deutschland Softasept®N B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland SW-872 humane Liposarkomzelllinie CLS, Eppelheim, Deutschland Tecniplast Interactive Safe Change Station Tecniplast Deutschland GmbH, Hohenpeißenberg, Deutschland Tierfutter Ssniff R/M-H, 10 mm Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland 45 U-40 BD Micro Fine+ 0,5 ml Injektionsspritzen BD Biosciences, San Jose, CA, USA Vakuumpumpstand Vacuubrand Vacuubrand, Wertheim, Deutschland Versorgunsbehälter für Stickstoff Messer Apollo Messer Griesheim GmbH, Krefeld, Deutschland Zeiss AxioCam HRc Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland Zeiss Axioskop 2 Plus Fluoreszenzmikroskopes Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland Zeiss Axiovert 25 inverses Mikroskop Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland Zeiss Axio Vision 3.1 Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland Zellkulturflaschen 150 cm2 TPP, Trasadingen, Schweiz Zellschaber 24 cm TPP, Trasadingen, Schweiz Zellsieb, Nylon, 100 µM BD Biosciences, San Jose, CA, USA Zentrifugenröhrchen TPP, Trasadingen, Schweiz 46 3.2. ZELLKULTUR 3.2.1. Zellen In meiner Arbeit habe ich die humane SW-872 Liposarkomzelllinie (SW-872) im Vergleich zu primären humanen Fibroblasten (HFB) als Kontrollzellen untersucht. Beide Zellarten sind mesenchymalen Ursprungs, jeweils in maligne entarteter bzw. in physiologischer Form. SW-872 Zellen entstammen einem undifferenzierten Liposarkom eines 36-jährigen, männlichen Kaukasiers und wurden im Jahre 1974 isoliert. Primäre humane Fibroblasten wurden gemäß Protokoll (siehe 3.2.2.) im Jahre 2008 aus der Dermis eines 47-jährigen männlichen Kaukasiers gewonnen. Um bei der SW-872 Zelllinie eine eventuelle Krosskontamination auszuschließen, wurden die in meiner Studie eingesetzten Zellen auf ihre Authentizität hin geprüft. Hierfür wurde durch die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ GmbH, Braunschweig, Deutschland) aus den Zellproben genomische DNA isoliert und mit Hilfe einer nonaplex PCR ein DNA Profil von acht hoch polymorphen Orten von Short Tandem Repeats (STRs) erstellt. Die DSMZ GmbH bestätigte die Reinheit und Authentizität der in dieser Arbeit verwendeten Liposarkomzelllinie SW-872 (siehe 8.). Beide adhärente Zellarten wurden in Zellkulturflaschen von 150 cm2 Wachstumsfläche zu 3000 Zellen/cm2 (SW-872) bzw. 5000 Zellen/cm2 (HFB) ausgesät und in einer 5 % CO2 Atmosphäre bei 37°C im Inkubator kultiviert. Mediumwechsel erfolgte alle 3 Tage unter Verwendung von Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM), high Glucose (4,5 g/l), mit L-Glutamin, welches zu 10 vol% mit fetalem Rinderserum (engl.: fetal bovine serum, FBS) und zu 1 vol% mit 100 x Konzentrat Penicillin/Streptomycin (Penicillin: 10.000 Units/ml, Streptomycin: 10 mg/ml) versetzt wurde. Bei annähernder Konfluenz wurden die Zellen mit Hilfe von Trypsin/EDTA abgelöst, mittels eines CASY-CellcounterSystems gezählt und entsprechend neu ausgesät. Um die Kontaminationsgefahr der Zellkulturen zu minimieren, wurden alle Arbeiten unter sterilen Bedingungen und mit sterilen Einmalmaterialien unter einer Sterilwerkbank mit Laminar-FlowAbzug-System durchgeführt. 47 3.2.2. Isolierung primärer humaner Fibroblasten Um Fibroblasten aus der Dermis zu isolieren, wurde diese unter sterilen Bedingungen in Einzelstücke von ca. 5 mm Durchmesser geteilt. Anschließend wurden die Stückchen in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 2,5 ml Medium und 7,5 ml steril filtrierter 1 % Kollagenase-II-Lösung überführt. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37°C auf einem Schüttler bei 200-250 rpm wurden die Fibroblasten mittels eines 100 µM Zellsiebes von unverdauten Gewebeanteilen getrennt. Um die isolierten Zellen von der Kollagenase-II-Lösung zu trennen, wurde das Filtrat bei 400 x g zentrifugiert, der Überstand mit Kollagenase-II-Lösung verworfen und das dadurch gewonnene Fibroblasten Pellet mit 10 ml Medium resuspendiert. Nachdem die Zellkonzentration mittels eines CASY-Cellcounter-Systems ermittelt wurde, erfolgte die Zellaussaat der Fibroblasten zu 5000 Zellen/cm2 in 150 cm2 Kulturflaschen. Zellen wurden fortan wie oben beschrieben (siehe 3.2.1.) kultiviert. Um zu gewährleisten, dass stets ein Vorrat dieser Fibroblasten in niedriger Passage vorhanden war, wurden Fibroblasten in Passage 2 und 3 zu 10 vol% mit Dimethylsulfoxid (DMSO) versetzt, bei -80°C eingefr oren und nach 24 Stunden in flüssigem Stickstoff bei -196°C eingelagert. 48 3.2.3. Peptide und Chemotherapeutika Das in dieser Arbeit untersuchte Peptid [D]-K3H3L9 ist aus 15 D- und LAminosäuren aufgebaut. Die Primärstruktur lautet LHLLHKLLKHLLKLL-NH2 (unterstrichene Buchstaben stehen für D-Aminosäuren). Das Peptid wurde extern durch Festphasenpeptidsynthese hergestellt und mit Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl.: reverse phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC) auf eine Konzentration von 99,4 % aufgereinigt. Das Molekulargewicht (MG) beträgt 1831,4 g/mol. Die Lagerung erfolgte bei -80°C als gelöste Suspension in Phosphat-gepufferte r Kochsalzlösung (engl.: phosphate buffered saline, PBS) zu 1 ml-Einheiten der Konzentrationen 1 mg/ml bzw. 10 mg/ml. Die Peptidsequenz wurde freundlicherweise von Herrn Professor Yechiel Shai, Department of Biological Chemistry, The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel zur Verfügung gestellt. Die Auswahl der spezifischen Chemotherapeutika wurde in Kooperation mit dem erfahrenen Onkologen Herrn Doktor Christian Mölleken, Medizinische Klinik I, BG Kliniken Bergmannsheil, Ruhr-Universität Bochum, Bochum nach aktuellen klinischen Standards der Weichgewebssarkom-Therapie festgelegt. Als „GoldStandard“-Chemotherapeutika Doxorubicin-Hydrochlorid (MG = 498,5 g/mol) sowie wurden Vincristinsulfat (MG = 579,99 g/mol), (MG = 923 g/mol), Methotrexat-Dinatrium Ifosfamid (MG = 261,09 g/mol) eingesetzt. Alle Chemotherapeutika wurden jeweils zu 2 mg/ml in 0,9 vol% Natriumchlorid gelöst und im Dunkeln bei 2-8°C gelagert. 49 3.3. IN VITRO ANALYSE 3.3.1. Proliferations-Analyse: BrdU-Assay Die Zellproliferation wurde mit einem Bromdesoxyuridin-(BrdU)-Cell-ProliferationEnzyme-linked-immunosorbent-Assay-(ELISA)-Kit ermittelt. Hierfür wurden SW-872 Zellen bzw. primäre humane Fibroblasten wie oben beschrieben (siehe 3.2.1.) passagiert, zu 3x104 Zellen/Well in 96-Well Platten ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO 2 inkubiert. Nach einem anschließenden Mediumwechsel wurden 90 µl/Well frisches Medium ohne FBS und 10 µl/Well der Peptid- bzw. Chemotherapeutikumverdünnung hinzugefügt (Tab. 4) und für weitere 24 Stunden bei 37°C inkubi ert. 1 % Triton-X-100 diente als Positivkontrolle. Diese Substanz tötete alle Zellen ab und führte dazu, dass folglich keine Zellproliferation mehr detektierbar war. Als Negativkontrolle diente die jeweilige Trägersubstanz PBS bzw. 0,9 vol% Natriumchlorid. Die Negativkontrolle stellt die Proliferation der Zellen ohne Beeinflussung durch antiproliferative Substanzen dar. Nach der Inkubation mit den Testsubstanzen wurden 10 µl/Well BrdU-Labeling-Solution zugefügt. Die Zellen wurden für 22 Stunden in der somit erreichten BrdU-Konzentration von 10 µM/Well bei 37°C inkubiert. BrdU ist ein chemisches Pyrimidinanalogon des Nukleosids Desoxyuridin und wurde während der Inkubation in phosphorylierter Form anstelle des Nukleotids Desoxythymidintriphosphat (dTTP) in die neu synthetisierte DNA proliferierender Zellen eingebaut. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen am Boden der Wells mittels 200 µl/Well Fix-Denat-Solution innerhalb von 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 ± 2°C) fixiert und zugleich die Zell-DNA denaturiert. Die DNA wurde dabei für die im Folgeschritt eingebrachten spezifischen Anti-BrdU-Antikörper zugänglich. Die Antikörper wurden in einer AntiBrdU-Peroxidase-Lösung gelöst. 100 µl/Well dieser Antikörperlösung wurden daraufhin auf die Zellen gegeben und für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Anti-BrdU-Antikörper banden an das BrdU, welches in die DNA proliferierender Zellen eingebaut wurde. Somit konnten proliferierende Zellen zuverlässig markiert werden. Danach wurden die Zellen jeweils dreimal zu 200 µl/Well mit Waschpuffer gespült, mit 100 µl/Well einer Luminol enthaltenden Substrate-Solution versetzt und 3 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Die an den Anti-BrdU-Antikörper gekoppelte Peroxidase 50 oxidierte das Luminol, was zur Photonenfreisetzung und folglich zu Lumineszenz führte. Das Ausmaß dieser Chemilumineszenz stand in direkter Korrelation zur Menge an proliferierenden Zellen. Sie wurde mit Hilfe eines Orion Microplate Luminometer in Kombination mit dem Simplicity 2.1. Analyseprogramm ermittelt. Die mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) in Bezug auf die Zellproliferation wurde jeweils für jede Zellart und Substanz durch graphische Extrapolation ermittelt. Dabei handelt es sich um die Stoffkonzentration, bei der die untersuchte Zellproliferation um 50 % reduziert ist. Alle Assays wurden in einem Dreifachansatz durchgeführt. Die Ergebnisse wurden auf die unbehandelte Negativkontrolle normalisiert. Tabelle 4: BrdU-Assay - Untersuchte Stoffkonzentrationen Testsubstanz Konzentration [µM] [D]-K3H3L9 0 3,125 6,25 12,5 25 37,5 50 62,5 75 87,5 100 Vincristin 0 3,125 6,25 12,5 25 37,5 50 62,5 75 87,5 100 Doxorubicin 0 0,04 0,08 0,16 0,3 0,65 1,3 2,5 3,6 4,6 5 Methotrexat 0 3,125 6,25 12,5 25 37,5 50 62,5 75 87,5 100 Ifosfamid 0 7,8 15,6 31,3 62,5 125 204,5 250 359 458,8 500 3.3.2. Vitalitäts-Analyse: MTT-Assay Die Zellvitalität wurde durch einen 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT) - Assay ermittelt. Hierfür wurden SW-872 Zellen bzw. primäre humane Fibroblasten wie oben beschrieben passagiert (siehe 3.2.1.), zu 1x104 Zellen/Well in 96-Well Platten ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO 2 inkubiert. Nach einem anschließenden Mediumwechsel wurden 90 µl/Well frisches Medium ohne FBS und 10 µl/Well der Peptid- bzw. Chemotherapeutikumverdünnung hinzugefügt (Tab. 5) und für weitere 24 Stunden bei 37°C im Inkubator kultiviert. Es wurden die gle ichen Kontrollsubstanzen wie beim BrdU-Assay verwendet (siehe 3.3.1.). Nach der Inkubation mit den Testsubstanzen wurde das Medium mit einer Glaskapillare abgesaugt und 200 µl/Well frisches Medium mit FBS hinzugefügt. Hierzu wurden 50 µl/Well MTT der Konzentration 5 mg/ml in PBS gelöst zugefügt. MTT wurde für weitere 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Dieser gelbe, wasserl ösliche Farbstoff wurde von 51 vitalen Zellen zu violettem, wasserunlöslichem Formazan reduziert und diente somit als Maßstab für die oxidative Stoffwechselaktivität der Zellen. Die Menge an integriertem Formazan stand dabei in direkter Korrelation mit der Stoffwechselaktivität der einzelnen Zelle. Zuletzt wurde das Medium abgesaugt und die Zellen in 200 µl/Well Dimethylsulfoxid (DMSO) sowie 25 µl/Well GlycinPuffer resuspendiert. Die Menge an reduziertem Formazan wurde bei 562 nm in einem Elx808 Ultra Microplate Reader in Kombination mit dem KC4 3.01 Analyseprogramm quantifiziert. Die mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) in Bezug auf den oxidativen Stoffwechsel wurde jeweils für jede Zellart und Testsubstanz durch graphische Extrapolation ermittelt. Alle Assays wurden in einem Dreifachansatz durchgeführt. Die Ergebnisse wurden auf die unbehandelte Negativkontrolle normalisiert. Tabelle 5: MTT-Assay - Untersuchte Stoffkonzentrationen Testsubstanz Konzentration [µM] [D]-K3H3L9 0 3,125 6,25 12,5 25 50 62,5 75 100 Vincristin 0 3,125 6,25 12,5 25 50 62,5 75 100 Doxorubicin 0 3,125 6,25 12,5 25 50 62,5 75 100 Methotrexat 0 25 50 100 150 200 300 350 400 Ifosfamid 0 7,8125 15,625 31,25 35,9 62,5 125 250 500 3.3.3. DNA-Fragmentierung: TUNEL-Assay Brüche in den DNA-Einzelsträngen wurden durch einen Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)-mediated 2'-Deoxyuridine 5'-Triphosphate (dUTP) Nick-End labeling (TUNEL)-Assay nachgewiesen. Hierfür wurden SW-872 Zellen bzw. primäre humane Fibroblasten wie oben beschrieben passagiert und entsprechend einer Zelldichte von 5000 Zellen/cm2 in Kammerobjektträger (0,7 cm2/Kammer) ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO 2 inkubiert. Nach einem anschließenden Mediumwechsel wurden 225 µl/Kammer frisches Medium ohne FBS sowie 25 µl/Kammer der Peptidverdünnung hinzugefügt (Tab. 6) und für weitere 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die eingeset zte Maximaldosis des Peptids entsprach der zuvor im MTT-Assay ermittelten Letaldosis von 52 62,5 µM (siehe 4.1.2.). Anschließend wurde das Medium vorsichtig mit einer Pipette abgezogen und die Zellen durch 30-minütige Inkubation bei 4°C mit Formafix 5 vol% Lösung auf den Objektträgern fixiert. Die Kammern wurden danach von den Objektträgern abgelöst, wobei die Zellen auf den Objektträgern verblieben. Antigene wurden durch High-Temperature-Antigen-Retrieval in Citratpuffer freigelegt. Hierfür wurden die Objektträger mit den darauf fixierten Zellen in Citratpuffer überführt und in der Mikrowelle für 10 Minuten bei 700 Watt erhitzt. Dabei wurde ein Aufkochen des Citratpuffers vermieden, welches die Zellen von den Objektträgern gelöst hätte. Nach einem 30-minütigen Abkühlintervall bei 4°C wurden die Objektträger zwe ifach in PBS gewaschen. In der Positivkontrolle und einer der beiden Negativkontrollen wurde die DNAFragmentierung durch DNAse I erzeugt. Hierfür wurden die Zellen eines Kammerobjektträgers erst für 10 Minuten mit je 25 µl DNAse I Puffer je Kammer inkubiert. Nachdem der Puffer verworfen wurde, folgte eine 10-minütige Inkubation mit DNAse I der Konzentration 0,5 µg/ml bei Raumtemperatur. Die enzymatische Reaktion wurde schließlich durch 15-minütige Inkubation mit standard saline citrate (SSC) bei Raumtemperatur abgestoppt. Zum Waschen wurden die Objektträger schließlich fünfmal für zwei Minuten unter leichtem Schwenken in PBS inkubiert. Anschließend wurden DNAse I behandelte und unbehandelte Objektträger bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit 25 µl/Kammer Equilibrierungspuffer geblockt. Danach wurden jeder Kammer 25 µl eines Reaktions-Mixes zugeführt und bei 37°C für 75 Minut en inkubiert. Im Falle des Test-Objektträgers und der Positivkontrolle enthielt dieser Reaktions-Mix das Enzym TdT. Die Negativkontrolle enthielt statt des Enzymes die entsprechende Menge TE-Puffer. Außerdem enthielt der Reaktions-Mix das mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff markierte Chroma Tide katalysierte die Bindung von Chroma Tide ® ® Alexa Fluor Alexa Fluor ® ® 488-5-dUTP. TdT 488-5-dUTP an DNA- Bruchenden, welche durch DNAse I und evtl. die entsprechende Testsubstanz entstanden. Die enzymatische Markierungsreaktion wurde durch 15-minütige Inkubation mit SSC bei Raumtemperatur abgestoppt. Nach weiteren fünfmaligen 5-minütigen Waschschritten mit PBS erfolgte die 30-minütige Gegenfärbung der Zellkerne mit dem DNA-Farbstoff 4′,6-Diamidin-2’-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI) der Konzentration 100 ng/ml in PBS bei Raumtemperatur. Nach zwei letzten 5-minütigen Waschschritten mit PBS wurde Fluorescent Mounting Medium aufgetragen, die Objektträger mit einem Deckglas versehen und im Dunkeln bei 53 2-8°C gelagert. Die dUTP-markierten Zellen wurden s chließlich mittels eines Zeiss Axioskop 2 Plus Mikroskops analysiert. Bilder wurden mit der Digitalkamera Zeiss AxioCam HRc in Kombination mit dem Programm Zeiss Axio Vision 3.1 erstellt. Tabelle 6: TUNEL-Assay - Untersuchte Stoffkonzentrationen Testsubstanz Konzentration [µM] [D]-K3H3L9 0 12,5 25 50 62,5 3.3.4. Zelltod-Differenzierung: FACS-Analyse Um das genaue Verhältnis von apoptotischen zu nekrotischen Zellen zu bestimmen, wurde eine Fluorescence-activated cell sorting (FACS)-Analyse unter Verwendung des FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I und 7-AminoActinomycin (7-AAD) durchgeführt. Bei FITC Annexin V handelt es sich um ein Calcium-Ionen abhängiges Zellprotein, welches mit hoher Affinität an das Phospholipid Phosphatidylserin (PS) bindet und welches zudem an den Fluoreszenzfarbstoff Fluoresceinisothiocyanat (FITC) gekoppelt ist. Ein Zeichen der frühen Phase der Apoptose ist die Translokation von PS von der inneren auf die äußere Plasmamembran der Zelle. Mittels FITC Annexin V konnten somit Zellen in der frühen Apoptose detektiert werden. 7-AAD ist ein Peptid, welches in der FACS-Analyse als Avitalfarbstoff Verwendung findet. Es kann in der DNA der Zellen interkalieren und diese somit markieren. Dies ist jedoch nur bei abgestorbenen Zellen ohne intakte Zellmembran möglich. 7-AAD markierte daher tote Zellen. Entsprechend der unterschiedlichen Markierungsmöglichkeiten mit diesen zwei Farbstoffen konnte in der FACS-Analyse auf den Zustand der einzelnen Zellen bzgl. Nekrose oder Apoptose geschlossen werden. FITC Annexin V – und zugleich 7-AAD-negative Zellen waren vital bzw. es konnte keine Apoptose gemessen werden. FITC Annexin V-positive und gleichzeitig 7-AAD-negative Zellen befanden sich in der frühen Phase der Apoptose bei intakter Zellmembran. FITC Annexin V – und zugleich 7-AAD-positive Zellen befanden sich in der Spätphase der Apoptose oder waren bereits abgetötet. Für die FACS-Analyse wurden SW-872 Zellen wie oben beschrieben (siehe 3.2.1.) passagiert und entsprechend einer Zelldichte von 1,5x105 Zellen/Well in einer 54 6-Well Zellkulturtestplatte (10 cm2/Well) ausgesät und für 24 Stunden im Inkubator kultiviert. Nach einem Waschschritt mit PBS wurde 1 ml/Well frisches Medium hinzugefügt. Die adhärenten Zellen wurden nun vorsichtig mittels eines Zellschabers vom Boden der Wells abgelöst, in ein Zentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten bei 400 x g zentrifugiert. Anschließend wurde das Zellpellet mit Medium ohne FBS resuspendiert und für 2, 15 bzw. 30 Minuten mit dem Peptid bei 37°C auf einem Schüttler bei ca. 250 rpm inkubi ert. Die hierbei eingesetzte Peptiddosis entsprach der im MTT-Assay ermittelten Letaldosis von 62,5 µM (siehe 4.1.2.). PBS diente als Negativkontrolle. Die Zellsuspension wurde dreimal in frischem Medium mit FBS gewaschen. Anschließend wurde die Zellsuspension in ein FACS-Röhrchen überführt und nochmals zweimal mit PBS resuspendiert, jeweils für 5 Minuten bei 400 x g abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Schließlich wurden die Zellen mit 100 µl/Ansatz eines Bindungspuffers, mit 5 µl/Ansatz von FITC Annexin V sowie 5 µl/Ansatz von 7-AAD resuspendiert und für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach einer letzten Zugabe von 400 µl/Ansatz des Binding Puffer wurden die Zellen mit Hilfe eines BD FACSCalibur Flow Cytometer und des Programms BD CellQuestTM Pro Version 5.2.1. gemessen und ausgewertet. 3.3.5. Zelluläre Peptidlokalisation: Konfokale Laser Scanning Mikroskopie Die zeitlich abgestufte Verteilung des Peptides in Relation zum Zellkörper erlaubt Rückschlüsse auf dessen potentiellen Wirkmechanismus. Hierfür wurden SW-872 Zellen wie oben beschrieben (siehe 3.2.1.) passagiert und entsprechend einer Zelldichte von 5000 Zellen/cm2 in Kammerobjektträgern (0,7 cm2/Kammer) ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO 2 inkubiert. Nach einem anschließenden Mediumwechsel wurden 225 µl/Kammer frisches Medium ohne FBS und 25 µl/Kammer der Peptidverdünnung hinzugefügt und für 0 bzw. 1 Minute und 1 bzw. 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die eingesetzte Peptidkonzentration entsprach der zuvor im MTT- und TUNEL-Assay ermittelten Letaldosis von 62,5 µM (siehe 4.1.2). PBS diente als Negativkontrolle. Anschließend wurde das Medium vorsichtig mit einer Pipette abgezogen und die Zellen mit Formafix 5 vol% Lösung auf den Objektträgern bei 4°C für 30 Minuten fixiert. Für die Antigen Demaskierung wurden 2 ml Citratpuffer mit 200 ml 55 destilliertem Wasser vermengt. Die Zellen wurden in den verdünnten Citratpuffer überführt und in der Mikrowelle für 10 Minuten bei 700 Watt erhitzt ohne den Puffer zum Aufkochen zu bringen. Nach einem 30-minütigen Abkühlintervall bei 4°C wurden die Zellen zweifach in PBS gewaschen. Da raufhin folgte eine 30minütige Inkubation bei Raumtemperatur in Blockerserum, in diesem Falle in Ziegenserum. Hierfür wurden 7,5 µl Ziegenserum in 500 µl PBS-Tween-20 (PBS-T) verdünnt. Die Zellen wurden dabei vollständig mit Blockerserum bedeckt. Um ein unspezifisches Binden der Antikörper zu vermeiden, muss die Tierart des Blockerserums und die Tierart, in welcher der Zweitantikörper exprimiert wurde, übereinstimmen. Nachdem die Schnitte dann erneut zweimal in PBS gewaschen wurden, folgte die Inkubation mit dem primären Antikörper, einem Anti-[D]-K3H3L9Antikörper aus dem Kaninchen, spezifisch gegen das zugefügte Peptid. Im Verhältnis 1:50 in PBS-T verdünnt, wurde der Antikörper für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit den Zellen inkubiert. Nach zusätzlichen zweimaligen Waschschritten in PBS wurden die Zellen mit 70 µl/Kammer des Zweitantikörpers für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dabei handelte es sich um einen biotinylierten Anti-Kaninchen-Antikörper aus der Ziege. 10 µl von diesem Antikörper wurden in 15 µl Ziegenserum und 1000 µl PBS-T gelöst, was einer Verdünnung von 1:100 entsprach. Nach wiederholten zweifachen Waschschritten in PBS wurden die Zellen mit 70 µl pro Kammer Streptavidin Alexa Fluor ® 488 conjugate der Konzentration 2,5 µg/ml versetzt. Das Protein Streptavidin band kovalent an Biotin und markierte so über Erst- und Zweitantikörper das Peptid. Streptavidin wiederum war mit dem Fluoreszenzfarbstoff Alexa Fluor ® 488 gekoppelt und war somit fluoreszenz-mikroskopisch detektierbar. Nach weiteren zweimaligen Waschschritten in PBS erfolgte eine 30-minütige Gegenfärbung der Zellkerne mit 70 µl/Kammer des DNA-Farbstoffes 4′,6-Diamidin-2’-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) der Konzentration 100 ng/ml in PBS bei Raumtemperatur. Nach zwei letzten Waschschritten in PBS wurde Fluorescent Mounting Medium aufgetragen, die Objektträger mit einem Deckglas versehen und im Dunkeln bei 2-8°C gelagert. Die räumliche Verteilung des Peptid es in und um die SW-872 Zellen wurde schließlich mittels eines Zeiss Axioskop 2 Plus Mikroskops sowie in einem Zeiss Axioskop 2 FS-mot in Kombination mit einem Zeiss LSM 510 Meta Confocal Laser Scanning System untersucht. 56 3.4. IN VIVO ANALYSE 3.4.1. Tiere und Haltung In meiner Studie wurden männliche athymische Nacktmäuse des Typs Foxn 1nu/nu verwendet. Diese waren zu Versuchsbeginn 5-6 Wochen alt und wogen zwischen 20 und 25 g. Die Tiere wurden separat in individuell ventilierten Käfigen (engl.: individually ventilated cages, IVCs) Typ II bei kontinuierlichem 12 Stunden Tag-Nacht-Rhythmus, geregelter Luftfeuchtigkeit von 65 %, einer Raumtemperatur von 20 ± 2°C und freiem Zugang zu Wasser und Futter gehalten. Zwischen Anlieferung und Versuchsbeginn wurde eine Frist von mindestens einer Woche eingehalten, so dass sich die Tiere stressfrei an die neue Umgebung gewöhnen konnten. Käfige, Bodenstreu, Futter und Trinkwasser wurden autoklaviert und wöchentlich gewechselt, um eine möglichst keimarme Umgebung zu gewährleisten. Alle Versuche wie auch die Pflege der Tiere wurden bis zur Finalisierung unter keimarmen Bedingungen unter einer Tecniplast Interactive Safe Change Station vorgenommen. Alle Tierversuche wurden gemäß der Genehmigung der Tierschutzkommission der Bezirksregierung Arnsberg mit dem Aktenzeichen: 9.93.2.10.32.07.026 und dem Titel "Untersuchung zur onkolytischen Wirkung von Effektormolekülen des angeboren Immunsystems auf Weichteilsarkome" ausgeführt. 3.4.2. Sarkom Xenograft Model Um die Wirkung des Peptides [D]-K3H3L9 in vivo ausführlich zu studieren, wurde in der athymischen Nacktmaus Sarkomwachstum induziert. Hierfür wurden vorerst 5x106 SW-872 Zellen gelöst in 50 µl PBS bei 2-8°C mit 50 µl BD Matrigel Matrix gemischt und in 0,5 ml Insulinspritzen aufgezogen (Abb. 8A). BD Matrigel Matrix ist in kühlem Zustand flüssig und liegt bei 38-39°C , der Körpertemperatur einer Maus, in fester Form vor. Dadurch konnte sichergestellt werden, dass die in der Matrigel Gel Matrix eingebrachten Liposarkomzellen und somit später der solide Tumor an der gewünschten Injektionsstelle verbleiben würde. Überdies sind in BD Matrigel Matrix standardmäßig Wachstumsfaktoren enthalten, welche unterstützend auf das Sarkomwachstum wirkten. Die wichtigsten enthaltenen 57 Wachstumsfaktoren sind TGF-beta, epidermal growth factor, insulin-like growth factor und tissue plasminogen activator. Um im Zuge der Narkotisierung eine ausreichende Sedierung und Analgesie der Tiere bei Zellinjektion sicherzustellen, wurden die Mäuse mit 5 vol% Isofluran in 4 l/min Sauerstoff (O2) sowie 0,5 l/min Distickstoffmonoxid (N2O) eingeleitet. Die Narkose wurde dann bei konstanter Isofluran-Konzentration und 0,4 l/min O2 sowie 0,5 l/min N2O aufrecht erhalten. Die Injektionsstelle wurde 1 Minute vor Injektion mit Softasept®N desinfiziert. Schließlich wurde die Zellsuspension subkutan in den Bereich der linken Flanke injiziert. Zur Narkoseausleitung wurde nacheinander die Gabe von Isofluran, dann von N2O und schließlich von O2 beendet. Die Tiere wurden anschließend überwacht, bis sie ihr volles Bewusstsein zurückerlangten. Im Zeitraum ab der Tumorinjektion, über das Therapieintervall bis einschließlich hin zur Finalisierung wurden die Tiere dreimal pro Woche vermessen. Die Ausmaße des Tumors wurden mittels eines Messschiebers gemessen. Mit folgender Formel wurde das Tumorvolumen berechnet: Tumorvolumen [mm3] = 1/2 x Tumorlänge [mm] x (Tumorbreite [mm]) 2 Überdies wurde das Gewicht der Maus und des Futters gewogen, und ebenso das Tumorwachstum fotographisch dokumentiert. Sobald das Tumorvolumen eines einzelnen Tieres 200 mm3 überschritt, wurde individuell mit der Therapie begonnen (Abb. 8B). Dieser Zeitpunkt markierte den Tag 0 der jeweiligen Versuchsreihe. Die Mäuse wurden für die in vivo Studie in 2 Gruppen unterteilt: I. Therapiegruppe: 7 Tiere II. Kontrollgruppe: 5 Tiere Die Gruppenzuteilung der Tiere erfolgte nach den Prinzipien einer randomisierten, kontrollierten Studie. Die Therapie beinhaltete 9 intratumorale Einzelinjektionen, welche über einen Zeitraum von 3 Wochen 3 Mal wöchentlich verabreicht wurden (Abb. 8B). In der Therapiegruppe wurde pro Injektion eine Peptiddosis von 8,5 mg ([D]-K3H3L9) / kg (Körpergewicht) gewählt. In PBS gelöst wurde die Peptidlösung mit einem Gesamtvolumen von 50 µl mit einer Insulinspritze intratumoral injiziert. Kontrolltiere erhielten anstelle des Peptides eine intratumorale Injektion von 50 µl der Trägersubstanz PBS. Die Applikationen erfolgten in jeweils unterschiedliche 58 Bereiche des soliden Tumors. Bei jeder Applikation wurden die Tiere, wie bereits beschrieben, narkotisiert, vermessen und fotografiert. Sobald Mäuse Anzeichen von Schmerz zeigten, wurden sie alle 12 Stunden mit Temgesic (Buprenorphin) in einer subkutanen Dosis von 0,05 mg/kg (Körpergewicht) analgetisch behandelt. War das Leiden eines Tieres trotz schmerzlindernder Medikation deutlich sichtbar (apathisches Auftreten, Gewichtsreduktion > 20 %) bzw. überschritt der Tumordurchmesser 20 mm, wurden die Mäuse aus der Studie genommen und euthanasiert. Tiere, welche aufgrund des starken Tumorwachstum einen kachektischen Allgemeinzustand aufwiesen, wurden zusätzlich mit autoklavierten Sonnenblumenkernen gefüttert. Dadurch konnte der erhöhte Energiebedarf teils ausgeglichen werden. Auf die letzte Applikation folgte ein Beobachtungszeitraum von einer Woche. Anschließend wurden die Tiere finalisiert. Hierzu wurden die Mäuse, wie oben beschrieben, narkotisiert und dann mit einer intraperitonealen Übderdosis Narcoren (Pentobarbital-Natrium) eingeschläfert. Der Tumor wurde unter keimarmen Bedingungen herauspräpariert, vermessen, auf einer Feinwaage gewogen und halbiert (Abb. 8C). Eine Tumorhälfte sowie Lunge, Leber und Milz wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt, in Formafix 5 vol% Lösung fixiert und bei 2-8°C gelagert, die andere Tumorhälfte wurde in ein Kryoröhrchen überführt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C g elagert. Die entnommenen Organe sowie Thorax und Abdomen wurden makroskopisch auf Metastasen und auf Anzeichen deutlicher Peptid-Nebenwirkungen hin untersucht. A B C Abbildung 8: Sarkom Xenograft Model. A) SW-872-Liposarkomzellen in Zellkultur B) Peptidbehandlung des SW-872-Liposarkom-Xenografts C) Entnahme des SW-872-Liposarkom-Xenografts 59 3.5. HISTOLOGISCHE ANALYSE 3.5.1. Histologische Färbungen Die Hämatoxylin-Eosin (H&E) Färbung wurde in Kooperation mit dem Institut für Pathologie, BG Universitätsklinikum Bergmannsheil, Ruhr-Universität Bochum, durchgeführt. Hierfür wurden Paraffinschnitte der Schnittdicke 2 µM verwendet. Die Toluidinblau-Färbung wurde in Kooperation mit dem Zentrum für Anatomie, Ruhr Universität Bochum durchgeführt. Hierfür wurden Schnitte der Schnittdicke 0,75 µM verwendet. 3.5.2. Immunhistochemische Färbungen Die auf Superfrost Plus Objektträger aufgebrachten und paraffinfixierten histologischen Schnitte der Schnittdicke 2 µM wurden in einem 70°C heißen Ofen in horizontaler Position für 60 Minuten erhitzt. Anschließend wurden sie auf Raumtemperatur abgekühlt und schließlich deparaffinisiert. Hierfür wurden die Objektträger zweimal für 5 Minuten in Xylol getaucht und anschließend in einer absteigenden Alkoholreihe hydriert. Dabei wurden die Objektträger für jeweils 2 Minuten bei Raumtemperatur in 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol, 50 % Ethanol und schließlich in destilliertem Wasser inkubiert. Bei allen Schritten wurde darauf geachtet, dass die Schnitte zwischen den Einzelschritten nicht austrockneten. Mussten die Schnitte zwischengelagert werden, so wurden sie bei 4°C in PBS belassen. Die Antigen Demaskierung sowie das Blocken mit Ziegenserum wurde wie oben beschrieben (siehe 3.3.5.) durchgeführt. Nachdem die Schnitte erneut zweimal in PBS gewaschen wurden, folgte die Inkubation mit dem primären Antikörper. Die Kontrollschnitte wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS-T inkubiert, die anderen Schnitte im jeweiligen in PBS-T gelösten primären Antikörper. Verwendet wurden in der Verdünnung 1:100 ein monoklonaler Anti-human-Ki67-Antikörper, welcher spezifisch proliferierende Zellen markierte. Um sicherzustellen, dass nur humane Sarkomzellen markiert wurden und um auszuschließen, dass der Antikörper auch proliferierende murine Zellen markierte, wurde ein Antikörper gewählt, welcher keine Kreuzreaktivität mit murinen Zellen besaß und spezifisch für humane Zellen war. Daneben fand ein 60 polyklonaler Anti-[D]-K3H3L9-Antikörper in einer Konzentration von 1:50 Anwendung, welcher spezifisch das in dieser Studie untersuchte Peptid [D]-K3H3L9 markierte. Beide Antikörper wurden in Kaninchen exprimiert. Nach der Inkubation wurden die Schnitte in PBS zweimal gereinigt und dann mit dem sekundären Antikörper für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Hierfür wurde ein biotinylierter Anti-Kaninchen-Antikörper aus der Ziege verwendet. 10 µl von diesem Antikörper wurden in 15 µl Ziegenserum und 1000 µl PBS-T verdünnt, was zu einer Verdünnung von 1:100 führte. Nach erneuter zweifacher Reinigung in PBS wurden alle Schnitte für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Streptavidin Alexa Fluor ® 488 conjugate inkubiert. Das Protein Streptavidin bindet kovalent an Biotin und markiert so über Erst- und Zweitantikörper das jeweilige Antigen. Streptavidin wiederum ist mit dem Fluoreszenzfarbstoff Alexa Fluor ® 488 gekoppelt und somit fluoreszenz-mikroskopisch detektierbar. Nach weiteren zwei Waschschritten mit PBS erfolgte eine 30-minütige Gegenfärbung der Zellkerne mit dem DNA-Farbstoff DAPI in der Konzentration 100 ng/ml in PBS bei Raumtemperatur. Nach zwei letzten Waschschritten mit PBS wurde Fluorescent Mounting Medium aufgetragen, die Objektträger mit einem Deckglas versehen und im Dunkeln bei 2-8°C gelagert. 3.5.3. Auswertung Für die Quantifizierung der proliferierenden Ki67-positiven, der mitotischen Zellen und der Zahl der einzelnen Blutgefäße wurden High Power Fields (HPFs) ausgezählt. Ein HPF wurde als das Blickfeld unter dem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung definiert. Die Auszählung der mitotischen Zellen sowie der Blutgefäßanschnitte wurde an H&E-Schnitten ausgeführt. Die Auswertung der proliferierenden Ki67-positiven Zellen wurde an entsprechend immun- histochemisch gefärbten Präparaten vorgenommen. Es wurden jeweils im nichtnekrotischen Tumorgewebe die Anzahl der positiv gefärbten, mitotischen Zellen bzw. die Anzahl der Gefäßanschnitte in 10 HPFs von 4 Peptid-behandelten und von 4 Kontrolltumoren ausgezählt. Jede HPF-Auszählung wurde unabhängig von drei Personen ausgeführt. 61 Um das Ausmaß der Peptid-induzierten Nekrose zu ermitteln, wurde überdies an 5 Peptid-behandelten und 5 Kontrolltumoren die Fläche des nekrotischen Areals mittels des Programms Diskus 32 – Mikroskopische Bilddarstellung gemessen (Abb. 9). Hierfür wurden ausschließlich H&E gefärbte Schnitte analysiert. Sämtliche Auswertungen erfolgten anhand eines Zeiss Axioskop 2 Plus Mikroskops. Bilder wurden mit der Digitalkamera Zeiss AxioCam HRc in Kombination mit dem Programm Zeiss Axio Vision 3.1 erstellt. Abbildung 9: Nekrosenausmessung. SW-872-Liposarkom-Xenograft. Abmessung der gesamten Tumorfläche (schwarze Umrandung) mit anschließender mikroskopischer Beurteilung und Abgrenzung der nekrotischen Abschnitte (rote Umrandung). (H&E-Färbung, schwarzer Maßstab = 1 mm) 3.6. Statistische Auswertung Die Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen und Zelltypen wurden mittels eines einseitigen T-Tests und unter Annahme gleicher Varianz auf ihre Signifikanz hin analysiert. Eine Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner 5 % (p<0,05) galt als signifikant, ein Wert kleiner 1 % (p<0,01) als hochsignifikant. Um die Varianz abzubilden, wurde der Standardfehler (engl.: standard error of the mean, SEM) ermittelt. Alle Rechnungen wurden mit der Software Microsoft Office Excel 2003 erstellt. 62 4. ERGEBNISSE 4.1. IN VITRO 4.1.1. Proliferations-Analyse: BrdU-Assay Mit dem BrdU-Assay wurde die antiproliferative Wirkung des synthetischen Designer Host Defense Peptides [D]-K3H3L9 im Vergleich zu aktuellen „Gold-Standard“-Chemotherapeutika untersucht. Hierfür wurden die Substanzen in unterschiedlichen Dosierungen für 24 Stunden mit den SW-872 Liposarkomzellen bzw. primären humanen Fibroblasten als Kontrollzellen inkubiert und anschließend die Zellproliferation chemi- luminometrisch analysiert. Dabei stellte sich das Peptid als hochsignifikant (p<0,01) antiproliferativ wirksam gegenüber den SW-872 Zellen heraus (Abb. 10A). Die IC50 betrug dabei 41 µM (Tab. 7). Dieser Wert lag über den IC50-Werten von Doxorubicin und Vincristin mit 0,53 µM bzw. 9 µM jedoch unter denen von Ifosfamid und Methotrexat mit IC50-Werten von jeweils über 100 µM. Die Sarkomzellproliferation wurde durch das Peptid bei einer IC100 von 50 µM vollständig unterbunden. Bei dieser Stoffkonzentration wurde auch durch Doxorubicin die Sarkomzellproliferation gänzlich gehemmt, durch Vincristin um 94,5 %, durch Methotrexat um 11,5 % und durch Ifosfamid um 1,4 % reduziert. Bezüglich der Reduktion der Zellproliferation erwies sich das Peptid als nicht selektiv gegenüber den Sarkomzellen. Die IC50 gegenüber den Kontrollzellen lag mit 20 µM um 51 % unter dem IC50-Wert gegenüber den Sarkomzellen. Bei der IC100 der Sarkomzellen wurde zugleich die Proliferation der Kontrollzellen um 93,5 % reduziert. Unter den Chemotherapeutika zeigte Vincristin zwischen 3,125 µM und 25 µM eine hochsignifikante (p<0,01) selektive Inhibierung der Zellproliferation. Auch bei den anderen Chemotherapeutika war der Unterschied der antiproliferativen Wirkung teils hochsignifikant. Jedoch wurde weder bei Methotrexat noch bei Ifosfamid die IC50 erreicht. Der Kurvenverlauf vierlief hier, trotz teils erhöhter Dosierung eher horizontal im Sinne einer mangelnden Inhibierung der Zellproliferation. Doxorubicin reduzierte im Bereich von 0,04 µM und 1,25 µM sogar zuerst selektiv die Proliferation der Kontrollzellen während der antiproliferative Effekt auf die Sarkomzellen erst verzögert auftrat. 63 4.1.2. Vitalitäts-Analyse: MTT-Assay Im MTT-Assay konnte die potente antimetabolische Wirkung des HDP [D]-K3H3L9 im Vergleich zu den oben genannten Chemotherapeutika dargestellt werden. Hierfür wurden das Peptid bzw. die Chemotherapeutika in unterschiedlichen Dosierungen für 24 Stunden mit den SW-872 Zellen bzw. Fibroblasten als Kontrollzellen inkubiert und anschließend der oxidative Zellstoffwechsel photometrisch untersucht. Die Versuchsergebnisse (Abb. 10B, Tab. 8) zeigten, dass das Peptid im Vergleich zu den Chemotherapeutika den Zellstoffwechsel deutlich stärker reduzierte. Bezüglich der SW-872 Zellen konnte eine hochsignifikant (p<0,01) antimetabolische Aktivität nachgewiesen werden. Die mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) betrug hier 52 µM (Tab. 8). Im Gegensatz dazu lag die IC50 des stärksten Chemotherapeutikums Doxorubicin mit 89 µM um 71 % höher. Die IC50-Werte der übrigen Chemotherapeutika lagen jenseits von 100 µM (Tab. 8). Bei einer Peptiddosierung von 62,5 µm war kein oxidativer Stoffwechsel mehr messbar (IC100). Bei derselben Stoffkonzentration reduzierte Vincristin den Zellstoffwechsel um 41 %, Doxorubicin um 31,1 % und Methotrexat um 9 %. Ifosfamid dagegen führte bei einer Konzentration von 62,5 µM zu einer Erhöhung des Zellstoffwechsels um 20,8 %. Insgesamt zeigte das Peptid jedoch kein selektives Stoffwechsel inhibierendes Verhalten gegenüber den SW-872 Zellen. So lag die IC50 im Falle der primären humanen Fibroblasten mit 34 µM noch unter dem Wert der Liposarkomzellen. Bei der IC100 der Sarkomzellen war auch Stoffwechsel mehr zugleich messbar. Im bei den Kontrollzellen Gegensatz dazu kein erwiesen oxidativer sich die Chemotherapeutika Vincristin sowie Doxorubicin bei Konzentrationen zwischen 25 µM und 100 µM als hochsignifikant (p<0,01) selektiv gegenüber den malignen Zellen (Abb. 10B). Obgleich auch bei Methotrexat und Ifosfamid der Unterschied der antimetabolischen Wirkung teils hochsignifikant war, wurde trotz erhöhter Stoffkonzentration die IC50 nicht erreicht. Der Graph verlief hier jeweils horizontal bis aszendierend, was einem antimetabolischem Effekt widersprach. 64 A B Abbildung 10: BrdU- bzw. MTT-Assay. Wirkung des Peptides [D]-K3H3L9 sowie aktueller „GoldStandard“-Chemotherapeutika auf die Liposarkom Zelllinie SW-872 (gestrichelte Linie) und auf primäre humane Fibroblasten als Kontrollzellen (durchgezogene Linie). A) Veränderung der Zellproliferation (BrdU-Assay) in Relation zur jew. Negativkontrolle B) Veränderung der Zellstoffwechselaktivität (MTT-Assay) in Relation zur jew. Negativkontrolle Das Peptid erwies sich als hochsignifikant antiproliferativ (BrdU-Assay) bzw. hochsignifikant antimetabolisch (MTT-Assay) wirksam. Die Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler abgebildet. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant betrachtet, p-Werte < 0,01 als hochsignifikant (* = p<0,05 ; ** = p<0,01). 65 Tabelle 7: BrdU-Assay - IC50-Werte. Wirkung des Peptides [D]-K3H3L9 und aktueller „GoldStandard“-Chemotherapeutika auf die Zellproliferation der Liposarkom Zelllinie SW-872 sowie der primären humanen Fibroblasten als Kontrollzellen. Mit einem IC50-Wert von 41 µM ist das Peptid hinsichtlich der antiproliferativen Wirkung auf die SW-872 Zellen vergleichbar mit aktuellen Chemotherapeutika. IC50-Werte in Bezug auf Zellproliferation. Zellproliferation IC50 [µM] [D]-K3H3L9 Vincristin Doxorubicin Methotrexat Ifosfamid SW-872 41 9 0,53 >100 >100 Fibroblasten 20 28 0,04< >100 >100 Tabelle 8: MTT-Assay - IC50-Werte. Wirkung des Peptides [D]-K3H3L9 und aktueller „GoldStandard“-Chemotherapeutika auf den oxidativen Zellstoffwechsel der Liposarkom Zelllinie SW872 und der primären humanen Fibroblasten als Kontrollzellen. Im Gegensatz zu den aktuellen Chemotherapeutika war der IC50-Wert für das Peptid mit 52 µM am niedrigsten und hatte somit die stärkste antimetabolische Wirkung auf die SW-872 Zellen. IC50-Werte in Bezug auf Zellstoffwechsel bzw. Zytotoxizität. Zytotoxizität IC50 [µM] [D]-K3H3L9 Vincristin Doxorubicin Methotrexat Ifosfamid SW-872 52 >100 89 >100 >100 Fibroblasten 34 >100 >100 >100 >100 66 4.1.3. DNA-Fragmentierung: TUNEL-Assay Um die im MTT-Assay beschriebene antimetabolische Wirkung genauer zu verstehen, wurde das Peptid [D]-K3H3L9 im TUNEL-Assay weiter untersucht. Somit konnte gezeigt werden, inwieweit es sich dabei lediglich um eine Reduzierung bzw. ein Sistieren des zellulären Stoffwechsels handelte oder ob das Peptid auch einen genotoxischen Effekt im Sinne von DNA-Einzelstrangbrüchen bewirkte. Dabei wurde das Peptid in unterschiedlichen Dosierungen für 24 Stunden mit den SW-872 Liposarkomzellen (Abb. 11A) bzw. primären humanen Fibroblasten als Kontrollzellen (Abb. 11B) inkubiert. Anschließend wurden potentielle DNAEinzelstrangbrüche fluoreszenz-mikroskopisch analysiert. Gemäß der dosisabhängigen antimetabolischen Wirkung, welche im MTT-Assay bestimmt wurde, zeigte sich im TUNEL-Assay eine entsprechende dosisabhängige genotoxische Wirkung. Bei einer Peptidkonzentration von 50 µM konnte gemäß der IC50 von 52 µM in ungefähr 50 % der Zellen DNA-Einzelstrangbrüche nachgewiesen werden (Abb. 11A). Bei einer Konzentration entsprechend der IC100 von 62,5 µM stieg der Anteil an Zellen mit DNA-Einzelstrangbrüchen entsprechend auf 100 % an. Gemäß der Ergebnisse des MTT-Assay wurden DNAEinzelstrangbrüche bei den Fibroblasten bereits früher ab Konzentrationen von 12,5 µM detektiert (Abb. 11B). Dieses Ergebnis belegte auf der einen Seite erneut die mangelnde Selektivität des Peptides gegenüber malignen Liposarkomzellen, auf der anderen Seite bewies es, dass die im MTT-Assay ermittelte antimetabolische Wirkung von einer parallelen DNA-Fragmentierung und somit von einer schweren genotoxischen Schädigung der Tumorzellen begleitet wurde. 67 A B [D]-K3H3L9 Positivkontrolle Negativkontrolle I Negativkontrolle II [D]-K3H3L9 Positivkontrolle Negativkontrolle I Negativkontrolle II (+TdT / -DNAse I) (+TdT / +DNAse I) (-TdT / - DNAse I) (-TdT / + DNAse I) (+TdT / -DNAse I) (+TdT / +DNAse I) (-TdT / - DNAse I) (-TdT / + DNAse I) PBS 12,5 25 50 62,5 Peptidkonzentration [µM] Peptidkonzentration [µM] PBS 12,5 25 50 62,5 Abbildung 11: TUNEL-Assay. Genotoxische Wirkung des Peptides [D]-K3H3L9 A) SW-872 Liposarkomzelllinie B) Primäre humane Fibroblasten Mit zunehmender Peptidkonzentration kam es zum Anstieg der Zellzahl mit nachweisbaren DNA-Einzelstrangbrüchen (grün). (Weißer Maßstab = 100 µm) 68 4.1.4. Zelltod-Differenzierung: FACS-Analyse Mit Hilfe der FACS-Analyse konnte nach Peptideinwirkung das Verhältnis von abgetöteten zu apoptotischen Zellen quantifiziert werden. In ansteigenden Zeitintervallen wurden hierfür SW-872 Zellen dem Peptid [D]-K3H3L9 in der letalen Dosis von 62,5 µM ausgesetzt und anschließend durchflußzytometrisch auf Apoptosemarker hin untersucht (Abb. 12 + 13). Die Analyseergebnisse verdeutlichten, dass der Anteil der toten Zellen hochsignifikant (p<0,01) sowie proportional zur Inkubationszeit zunahm (Abb. 13A). Im Vergleich zur jeweiligen Negativkontrolle war der Anteil toter Zellen in der Behandlungsgruppe jeweils hochsignifikant erhöht. In der Negativkontrolle betrug der Anteil toter Zellen an der Gesamtzellzahl nach 2, 15 bzw. 30 Minuten durchschnittlich 24 %, 31 % bzw. 55 %. Im Gegensatz dazu war in der Behandlungsgruppe der Anteil toter Zellen hochsignifikant erhöht und betrug nach 2, 15 bzw. 30 Minuten Inkubation durchschnittlich jeweils 54 %, 70 % bzw. 92 %. Somit war der Anteil toter Zellen in der Behandlungsgruppe nach 2, 15 bzw. 30 Minuten um jeweils 30, 39 bzw. 37 Prozentpunke erhöht. Dies belegte vorerst lediglich, dass Zellen im ansteigenden Zeitintervall zwischen 2 Minuten und 30 Minuten sicher abgetötet wurden. Durch diese Messung konnte jedoch noch keine Aussage darüber gemacht werden, welche Art des Zelltodes hier die zentrale Rolle spielte. In denselben Proben wurde dafür zeitgleich der Anteil an Zellen gemessen, die sich in der frühen Phase der Apoptose befanden (Abb. 13B). In der Negativkontrolle betrug der Anteil apoptotischer Zellen an der Gesamtzellzahl nach 2, 15 bzw. 30 Minuten durchschnittlich 9 %, 5 % bzw. 7 %. Im Gegensatz dazu war in der Behandlungsgruppe aber der Anteil apoptotischer Zellen teils sogar hochsignifikant (p<0,01) reduziert und betrug nach 2, 15 bzw. 30 Minuten Inkubation durchschnittlich jeweils 5 %, 2 % bzw. 5 %. In der Behandlungsgruppe war somit der Anteil apoptotischer Zellen nach 2, 15 bzw. 30 Minuten um jeweils 4, 3 bzw. 2 Prozentpunke erniedrigt. Zusammenfassend kam es während der Inkubation mit dem Designer Host Defense Peptid [D]-K3H3L9 zu einem hochsignifikant erhöhten Absterben der SW-872 Liposarkomzellen. Zeitgleich jedoch wurde eine teils hochsignifikante Reduzierung apoptotischer Zellen in der Behandlungsgruppe registriert. Dieser Befund zeigte, dass [D]-K3H3L9 die SW-872 Liposarkomzellen weniger mittels Apoptose tötete, sondern vielmehr durch die Induktion der Nekrose. 69 Negativkontrolle 76 Negativkontrolle 24 67 9 2 Minuten 2 Minuten 46 54 15 Minuten 30 15 Minuten 70 30 Minuten 8 40,5 5,5 28 2 30 Minuten 92 Anteil vitaler Anteil und toter apoptotischer Zellen [%] Zellen [%] 3 Anteil vitaler Zellen [%] 5 Anteil apoptotischer Zellen [%] Abbildung 12: FACS-Analyse - Scatterplot. Reaktion der SW-872 Liposarkomzelllinie nach Inkubation mit dem Peptid [D]-K3H3L9 in der letalen Dosis von 62,5 µM nach ansteigenden Zeitintervallen (2, 15, 30 min.). Mit zunehmender Inkubationszeit kam es in der Behandlungsgruppe zu einem hochsignifikanten Anstieg des Anteils toter Zellen (linke Graphen, rechtes Fenster). Zugleich verblieb der Anteil apoptotischer Zellen (rechte Graphen, rechtes Fenster) auf vergleichsweise niedrigem Niveau. (Ein Punkt = eine Zelle, Angaben in % der Gesamtzellzahl) 70 100 A ** Tote Zellen [%] 90 80 ** 70 60 ** 50 40 30 20 10 0 2 15 30 Inkubationszeit [min] 100 B Apoptotische Zellen [%] 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ** 0 2 15 30 Inkubationszeit [min] Abbildung 13: FACS-Analyse. A) Messung toter Zellen: Anteil toter Zellen an der Gesamtzellzahl nach Inkubation mit dem Peptid [D]-K3H3L9 in der letalen Dosis von 62,5 µM B) Messung apoptotischer Zellen: Anteil apoptotischer Zellen an der Gesamtzellzahl nach Inkubation mit dem Peptid [D]-K3H3L9 in der letalen Dosis von 62,5 µM Während es in der Behandlungsgruppe mit zunehmender Inkubationszeit zu einem hochsignifikantem Anstieg der toten Zellen kam (Graph A, weiße Säulen), sank der Anteil apoptotischer Zellen (Graph B, weiße Säulen) teils hochsignifikant. Die Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler abgebildet. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant betrachtet, p-Werte < 0,01 als hochsignifikant (* = p<0,05 ; ** = p<0,01), (Schwarze Säulen = Negativkontrolle, weiße Säulen = Behandlungsgruppe). 71 4.1.5. Zelluläre Peptidlokalisation: Konfokale Laser Scanning Mikroskopie Die zeitlich abgestufte Verteilung des Peptides [D]-K3H3L9 in Relation zum Zellkörper erlaubte Rückschlüsse auf dessen Wirkmechanismus. Eigens für diesen Zweck habe ich einen neuen Versuchsaufbau mit einem Anti-[D]-K3H3L9-Antikörper entwickelt. Dazu wurden SW-872 Zellen in ansteigenden Zeitintervallen mit der im MTT-Assay ermittelten letalen Peptiddosis von 62,5 µM versetzt. Das Peptid wurde anschließend mit Hilfe eines konfokalen Laser Scanning Mikroskopes detektiert (Abb. 14). Initial war zu erkennen, dass sich die markierten [D]-K3H3L9-Moleküle an die Oberfläche der Tumorzellmembran anlegten (Abb. 14, 0 min). Bereits nach einer Minute Peptidinkubation zeigte sich ein deutliches Anschwellen der Zelle und des Zellkernes, ein typisches Zeichen der Zellnekrose (Abb. 14, 1 min). Nach einer Stunde war die Plasmamembran aufgelöst und nur noch adhärente Zellkerne erkennbar (Abb. 14, 1 h). Das Peptid war nun direkt an der Kernmembran lokalisiert. Nach insgesamt 24 Stunden Peptidinkubation ließen sich nur noch komplett zerstörte, adhärente Zellfragmente nachweisen (Abb. 14, 24 h). Apoptotische Zellen mit ihren typischen apoptotischen Körperchen wurden kaum nachgewiesen. Auch dieses Ergebnis sprach somit für eine Abtötung der SW-872 Liposarkomzellen durch das Designer Host Defense Peptides [D]-K3H3L9 mittels Zellnekrose. 0 min 1 min 1h 24 h Inkubationszeit Abbildung 14: Konfokale Laser Scanning Mikroskopie. Morphologische Analyse der Abtötungsmechanismen von SW-872 Liposarkomzellen nach Inkubation mit dem Peptid [D]-K3H3L9 in der letalen Dosis von 62,5 µM. Verteilung des Peptides (grün) um den Zellkern (blau). Mit zunehmender Inkubationszeit konnten die typischen morphologischen Charakteristika der Zellnekrose beobachtet werden. Nach initialer Anlagerung an der Zellmembran (0 min) kam es zur Zellschwellung (1 min) mit Auflösung der Plasmamembran und Anlagerung der Peptide um die adhärenten Zellkerne (1 h). Nach 24 h waren die Zielzellen komplett zerstört. (Weißer Maßstab = 20 µm) 72 4.2. IN VIVO 4.2.1. Sarkom Xenograft Model In einem SW-872-Liposarkom-Xenograft-Modell wurde die onkolytische Aktivität des synthetischen Designer Host Defense Peptides [D]-K3H3L9 nach intratumoraler Applikation (Einzeldosis: 8,5 mg ([D]-K3H3L9) / kg (Körpergewicht) ) in vivo untersucht. Die Therapie wurde ab einem durchschnittlichem Tumorvolumen von 216 mm3 (196 mm3 – 250 mm3) gestartet. In der Kontrollgruppe war unter Behandlung mit PBS exponentielles Tumorwachstum zu verzeichnen (Abb. 15 + 17). Über den Behandlungszeitraum von 3 Wochen mit anschließender einwöchiger Beobachtungszeit nahm das Tumorvolumen in der Kontrollgruppe um das 7,5-fache auf durchschnittlich 1612 mm3 (611 mm3 – 3424 mm3) zu (Abb. 17A). Im Gegensatz dazu war in der Behandlungsgruppe ein leichter Abfall des mittleren Tumorvolumens um 2,31 % auf 211 mm3 (0 mm3 – 1004 mm3) messbar (Abb. 17A). Am Tag der Finalisierung stellte sich heraus, dass das mittlere Tumorvolumen der Kontrollgruppe um das 8-fache das mittlere Tumorvolumen der Behandlungsgruppe übertraf. In der Behandlungsgruppe konnten makroskopisch in 43 % der Mäuse eine partielle Remission mit Tumorvolumenrückgang von durchschnittlich 32,1 % (7,6 % 50,2 %) gemessen werden (Abb. 17B). In weiteren 43 % der Tiere konnte makroskopisch eine volle Tumorremission erzielt werden. Bei 14 % der Tiere war die Therapie erfolglos. Bereits 2 Tage nach der ersten Peptidinjektion konnte zwischen Behandlungs- und Kontrollgruppe ein hochsignifikanter (p=0,00312) Unterschied im durchschnittlichen Tumorwachstum festgestellt werden (Abb. 17A). Der Unterschied der mittleren Tumorvolumina der entsprechenden Versuchsgruppen verblieb auch über den letzten Tag des Therapieintervalls (p=0,00312) bis hin zum Tag der Finalisierung (p=0,00506) hochsignifikant (Abb. 17A). Am Tag der Finalisierung wurde überdies das Tumorgewicht der einzelnen Tiere ermittelt (Abb. 16). Dabei stellte sich heraus, dass das durchschnittliche Tumorgewicht in der Behandlungsgruppe mit 0,108 g (0 g – 0,503 g) um 88 % signifikant (p=0,0238) niedriger lag als in der Kontrollgruppe mit 0,902 g (0,288 g – 2,521 g). 73 Finalisierung [D]-K3H3L9 Kontrolle Therapiebeginn Abbildung 15: Sarkom-Xenograft-Model. Vergleich des Tumorvolumens von Behandlungs- und Kontrollgruppe nach intratumoraler Applikation des Peptides [D]-K3H3L9 bzw. von PBS. Bei vergleichbaren Tumorvolumina zur Therapiebeginn kam es in der Kontrollgruppe (oben) zur Ausbildung exponentiell wachsender, solider Tumoren. Im Vergleich dazu waren in der Behandlungsgruppe (unten) in 43 % makroskopisch volle Remissionen und in weiteren 43 % partielle Remissionen zu verzeichnen. 1,4 Tumorgewicht [g] 1,2 1 0,8 0,6 0,4 * 0,2 0 Kontrolle [D]-K3H3L9 p = 0,0238 Abbildung 16: Tumorgewicht. Mittleres Gewicht nach Entnahme am Tag der Finalisierung. Im Rahmen der Peptidtherapie war in der Behandlungsgruppe das mittlere Tumorgewicht im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant um 88 % reduziert. Die Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler abgebildet. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant betrachtet, p-Werte < 0,01 als hochsignifikant (* = p<0,05 ; ** = p<0,01). 74 Tumorvolumen [mm3] Durchschnittliches A 2200 2200 2000 2000 1800 1800 1600 1600 1400 1400 1200 1200 1000 1000 800 800 600 600 400 400 200 200 0 ** 0 0 ** ** 5 5 ** ** 10 10 ** ** ** ** ** ** 15 15 20 20 25 25 20 20 25 25 Zeit [Tag] 3500 3500 B Tumorvolumen [mm3] Einzelnes 3000 3000 2500 2500 2000 2000 1500 1500 1000 1000 500 500 00 0 0 5 5 10 10 15 15 Zeit [Tag] Abbildung 17: Tumorvolumina. A) Entwicklung der durchschnittlichen Tumorvolumina B) Entwicklung der einzelnen Tumorvolumina Während das durchschnittliche Tumorvolumen in der Behandlungsgruppe um 2,31 % abnahm, wuchs das Tumorvolumen in der Kontrollgruppe exponentiell auf das 7,5-fache des Ausgangswertes an. Die Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler abgebildet. PWerte < 0,05 wurden als signifikant betrachtet, p-Werte < 0,01 als hochsignifikant (* = p<0,05 ; ** = p<0,01). (Gestrichelte Linie = Behandlungsgruppe, durchgezogene Linie = Kontrollgruppe, 3 orangene Linie = durchschnittliches Tumorvolumen von 216 mm bei Therapiestart) 75 4.3. HISTOLOGIE 4.3.1. Proliferation Histolologische Untersuchungen der entnommenen Tumorproben bestätigten die bereits in vitro beschriebene zytotoxische und antiproliferative Wirkung von [D]-K3H3L9. In der H&E-Färbung waren nekrotische Areale im Tumorgewebe deutlich erkennbar (Abb. 18, untere Reihe). Weiterführende immun- histochemische Untersuchungen zeigten, dass diese sichtbaren nekrotischen Areale mit dem Wirkungsbereich des Peptides exakt übereinstimmten (Abb. 18A + B, obere Reihe, grün). Dadurch konnte gezeigt werden, dass dieser zytotoxische Effekt durch das Peptid selbst hervorgerufen wurde. Im Bereich der Peptidinjektionsstelle selbst fanden sich daher kaum intakte Zellkerne oder mitotische Zellen. Im Gewebe neben dem Injektionsbereich des Peptides (Abb. 18A + B, obere Reihe, grün) wurden intakte, DAPI-gefärbte Zellkerne (Abb. 18A + B, obere Reihe, blau) sowie Ki67-positive proliferierende Zellen gefunden (Abb. 18A + B, obere Reihe, rot). Jedoch war auch in diesem scheinbar vitalen Tumorgewebe eine deutlich Beeinträchtigung der Proliferation nachweisbar. Durch High Power Field (HPF) Auszählungen der nicht-nekrotischen TumorAreale konnte diese antiproliferative Wirkung genauer quantifiziert werden (Abb. 19 - 22). In der Behandlungsgruppe lag die Anzahl proliferierender, Ki-67positiver Zellen mit durchschnittlich 2,96 Zellen/HPF (0,6 Zellen/HPF – 4,5 Zellen/HPF) um 87 % und somit hochsignifikant (p=0,0006) unter der Kontrollgruppe mit durchschnittlich 23,64 Zellen/HPF (12,3 Zellen/HPF – 34,7 Zellen/HPF) (Abb. 19 + 20). Darüber hinaus wurde die Anzahl mitotischer Zellen in den nicht-nekrotischen Arealen der H&E-gefärbten Tumorschnitten untersucht. Hier war die Zahl mitotischer Zellen in der Behandlungsgruppe mit durchschnittlich 1,56 Zellen/HPF (0 Zellen/HPF – 5,2 Zellen/HPF) um 39 % geringer als in der Kontrollgruppe mit 2,54 Zellen/HPF (2 Zellen/HPF – 3,5 Zellen/HPF) (Abb. 21 + 22). 76 A B Abbildung 18: Peptidinjektionsareal. Immunhistochemisch (obere Reihe) bzw. H&E gefärbter (untere Reihe) Anschnitt eines SW-872-Liposarkom-Xenografts. Verteilung des Peptides [D]-K3H3L9 (grün) sowie angrenzender intakter Zellkerne (blau) und proliferierende Zellen (rot) im Bereich der Peptidinjektionsstelle der Behandlungsgruppe (links) bzw. in der Kontrollgruppe (rechts). A) Vergrößerung: 5 x; weißer Maßstab = 500 µm B) Vergrößerung: 20 x; weißer Maßstab = 200 µm Die immunhistochemischen Färbung zeigte, dass im Peptidinjektionsareal (grün) kaum intakte DAPI-gefärbte Zellkerne (blau) bzw. proliferierende Ki67-positive Zellen (rot) vorkamen. Die Fläche des immunhistochemisch gefärbten Peptidinjektionsareales deckte sich mit der aufgehellten nekrotischen Fläche in den H&E gefärbten Schnitten und unterstrich somit den zytotoxischen Effekt des Peptides auf die Tumorzellen in vivo. 77 Kontrolle [D]-K3H3L9 Abbildung 19: High Power Field Auszählung – Proliferation. Immunhistochemisch gefärbter Anschnitt eines SW-872-Liposarkom-Xenografts. Die antiproliferative Wirkung des Peptides [D]-K3H3L9 führte zu einer hochsignifikanten Reduktion der proliferierenden Zellen / HPF in der Behandlungsgruppe (rechts). (Vergrößerung: 40 x, weißer Maßstab = 100 µm, grün/Kreis = proliferierende Ki67-positive Zelle, blau = DAPI-gefärbter Zellkern) Proliferierende Zellen / HPF 30 25 20 15 10 5 0 ** Kontrolle [D]-K3H3L9 p = 0,0006 Abbildung 20: Proliferationsrate. Vergleich der Zellproliferation durch HPF-Auszählungen Ki67-positiver Zellen. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe war die Proliferationsrate in der Behandlungsruppe hochsignifikant um 87 % reduziert. Die Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler abgebildet. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant betrachtet, p-Werte < 0,01 als hochsignifikant (* = p<0,05 ; ** = p<0,01). 78 [D]-K3H3L9 Kontrolle Abbildung 21: High Power Field Auszählung – Mitose. H&E gefärbter Anschnitt eines SW872-Liposarkom-Xenografts. Die antiproliferative Wirkung des Peptides [D]-K3H3L9 resultierte in einer signifikanten Reduktion der mitotischen Zellen / HPF in der Behandlungsgruppe (rechts). (Vergrößerung: 40 x, schwarzer Maßstab = 100µm, Kreis = Mitotische Zelle) 3 Mitosen / HPF 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrolle [D]-K3H3L9 p = 0,1708 Abbildung 22: Mitoserate. Vergleich der Zellproliferation durch HPF-Auszählungen mitotischer Zellen an H&E-Schnitten. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe war die Mitoserate in der Behandlungsgruppe um 39 % reduziert. Die Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler abgebildet. 79 4.3.2. Nekrotische Fläche Die in vitro bereits gezeigte zytotoxische Wirkung wurde überdies durch Ausmessen der nekrotischen Fläche der einzelnen Tumorschnitte in der H&EFärbung quantifiziert (Abb. 23). Der Anteil der nekrotischen Fläche an der Gesamttumorfläche betrug in der Kontrollgruppe 14,5 % (0 % - 39,3 %). In der Behandlungsgruppe lag der Anteil bei 29,2 % (0 % - 49 %) und somit um das zweifache höher (Abb. 24). Nekrotischer Anteil: 0 % Nekrotischer Anteil: 42,1 % Kontrolle [D]-K3H3L9 Abbildung 23: Tumorausmessung. H&E gefärbter Anschnitt eines SW-872-LiposarkomXenografts. Die onkolytische Wirkung des Peptides [D]-K3H3L9 führte in der Behandlungsgruppe (rechts) zu einer Erhöhung des nekrotischen Tumoranteils (rote Umrandung) an der Gesamttumorfläche (schwarze Umrandung). (Vergrößerung: 40 x, schwarzer Maßstab = 1 mm) Nekrotischer Tumoranteil [%] 40 40 35 30 25 25 20 20 15 15 10 10 5 0 Kontrolle [D]-K3H3L9 p = 0,11906 Abbildung 24: Nekrotischer Tumoranteil. Gegenüberstellung der nekrotischen Tumorschnittfläche als Anteil an der Gesamttumorschnittfläche. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe war der nekrotische Anteil in der Behandlungsgruppe um 100 % erhöht. Die Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler abgebildet. 80 4.3.3. Angiogenese Die Gefäßdichte wurde mittels HPF-Auszählungen an H&E-Schnitten quantifiziert (Abb. 25). Dabei stellte sich in der Behandlungsgruppe eine signifikante (p=0,0356) anti-angiogenetische Wirkung heraus. Im Vergleich zur Kontrollgruppe mit einer mittleren Gefäßdichte von 4,98 Blutgefäßen/HPF (2,1 Blutgefäße/HPF – 7,4 Blutgefäße/HPF) war der Wert in der Behandlungsgruppe mit 2,41 Blutgefäßen/HPF (1,5 Blutgefäße/HPF – 3,1 Blutgefäße/HPF) um 52 % reduziert (Abb. 26). [D]-K3H3L9 Kontrolle Abbildung 25: High Power Field Auszählung – Angiogenese. H&E gefärbter Anschnitt eines SW-872-Liposarkom-Xenografts. Die antiangiogenetische Wirkung des Peptides [D]-K3H3L9 verursachte eine signifikante Reduktion der Gefäßanschnitte / HPF in der Behandlungsgruppe (rechts). (Vergrößerung: 40 x, Schwarzer Maßstab = 100 µm, Pfeil = Gefäßanschnitt) 66 Blutgefäße / HPF 55 44 33 D * 22 11 0 Kontrolle [D]-K3H3L9 p = 0,0356 Abbildung 26: Angiogenese. Vergleich der Blutgefäßdichte von SW-872-LiposarkomXenografts. Die Blutgefäßdichte in der Behandlungsgruppe war im Gegensatz zur Kontrollgruppe signifikant um 52 % verringert. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant betrachtet (* = p<0,05). Die Werte wurden als Mittelwerte ± Standardfehler abgebildet. 81 4.3.4. Morphologie: Semidünnschnitt-Verfahren Mittels des Semidünnschnitt-Verfahrens konnte eine detaillierte Analyse der Zellmorphologie Aufschluss über den onkolytischen Wirkmechanismus des Peptides [D]-K3H3L9 gegenüber den SW-872 Liposarkomzellen in vivo geben. Hierfür wurden die Tumorzellen an der Grenzschicht zur Peptidinjektionsstelle untersucht. In den behandelten Tumoren zeigten die Zellen typische Zeichen eines nekrotischen Wirkmechanismus (Abb. 27). So waren schaumige Nekrosen mit Vakuolen im Zytoplasma der Tumorzellen zu erkennen (Abb. 27, schwarze Pfeile). Überdies waren diese sich im Stadium der Nekrose befindlichen Zellen deutlich angeschwollen. Direkt angrenzend an das Injektionsareal fanden sich zudem aufgeplatzte Zellen mit zerstörter Zellmembran (Abb. 27, graue Pfeile). Diese in vivo Befunde korrelierten somit eng mit den bereits in vitro postulierten Annahmen einer Zellnekrose als primären onkolytischen Wirkmechanismus. Abbildung 27: Semidünnschnittverfahren – Behandlungsgruppe. Toluidinblau-gefärbtes SW872-Liposarkom-Xenograft der Behandlungsgruppe mit Peptidinjektionsstelle (schwarzes Quadrat). Direkt angrenzend an die Injektionsstelle (rechtes Bild, oben) fanden sich geplatzte Zellen (graue Pfeile). Daran angrenzend waren nekrotische Zellen mit schaumigen Vakuolen (schwarze Pfeile) und vereinzelte intakte Liposarkomzellen (weißer Pfeil) sichtbar. Apoptotische Zellen waren im Bereich des Peptidinjektionsareals kaum zu finden. (Schwarzer Maßstab: links = 2 mm; rechts = 20 µm) 82 In den Kontrolltumoren hingegen war ein solcher Befund nicht zu finden (Abb. 28). Hier fanden sich jedoch Gruppen apoptotischer Zellen (Abb. 28, schwarze Pfeile) mit typischer randständiger Chromatinansammlung als Inseln im vitalen Tumorgewebe (Abb. 28, weiße Pfeile). Diese Ansammlung apoptotischer Zellen war jedoch eher in der dort lokalen vaskulären Minderversorgung des rapide wachsenden Tumors begründet. Im Gegensatz dazu waren im helleren, vitalen Tumorbereich viele Gefäßanschnitte sichtbar (Abb. 28, graue Pfeile). Abbildung 28: Semidünnschnittverfahren – Kontrollgruppe. Toluidinblau-gefärbtes SW-872Liposarkom-Xenograft der Kontrollgruppe. Intaktes helles Tumorgewebe mit vitalen Sarkomzellen (weißer Pfeil) und zahlreichen Gefäßanschnitten (grauer Pfeil). An Stellen mit reduzierter Gefäßdichte fanden sich Inseln dunkler, apoptotischer Zellen (schwarzer Pfeil). (Schwarzes Rechteck = Übergang zwischen vitalen und apoptotischen Zellverbänden, Schwarzer Maßstab: oben = 500 µm, unten = 100 µM) 83 5. DISKUSSION Weichgewebssarkome stellen eine heterogene Gruppe seltener und hochaggressiver maligner Tumoren mit meist mesodermalem Ursprung dar [32, 51, 76]. Aufgrund ihres anfangs asymptomatischen Wachstums bleiben sie lange Zeit unentdeckt, bevor sie oft erst im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert werden [29]. Häufig ist aufgrund des bereits ausgedehnten Tumorwachstums die Prognose des Patienten dann entsprechend schlecht [32, 51, 76, 82, 159]. Die Ansprechrate dieser Tumoren auf aktuelle Chemotherapeutika ist immer noch ungenügend und mit teils gravierenden Nebenwirkungen behaftet [32, 64, 77, 117, 159]. Deshalb besteht ein dringender Bedarf nach effektiveren und schonenderen Therapieoptionen. Als Teil des angeborenen Immunsystems könnten Host Defense Peptide eine Lösung für diese schwerwiegende Problematik darstellen. Dabei handelt es sich um kleine, kationische, amphipathische Polypeptide, welche zu den entwicklungsgeschichtlich ältesten Formen der Immunabwehr von eukaryotischen Zellen gehören [59, 73, 180, 208]. Die einzelnen Vertreter der Familie der HDPs besitzen jeweils vielseitige Wirkspektren und sind beispielsweise an der antimikrobiellen Abwehr [53, 59, 73], der Wundheilung [12, 44, 63, 126, 176] oder der Immunmodulation beteiligt [39, 86, 173, 178, 208]. Einige HDPs sind auch onkolytisch wirksam [73, 108, 140, 174-175]. In meiner Studie habe ich das onkolytische Potential des synthetischen Designer Host Defense Peptids [D]-K3H3L9 gegenüber dem häufigsten der Weichgewebssarkome, dem Liposarkom untersucht. Neben der onkolytischen Wirksamkeit in vitro habe ich diese auch in vivo an einem Liposarkom-Xenograft-Model in der athymischen Nacktmaus erforscht. Zusätzlich habe ich den genauen Wirkmechanismus dieses onkolytischen Agens analysiert, da dieser insbesondere gegenüber Sarkomzellen bisher kaum verstanden ist. Meine Arbeit zeigt in ihren zentralen Ergebnissen, dass das synthetische Designer Host Defense Peptid [D]-K3H3L9 (a) potente antiproliferative sowie zytotoxische Aktivitäten in vitro besaß, welche sich (b) auch in vivo nachweisen ließen und zusammen mit zusätzlichen anti-angiogenetischen Wirkungen zu einer Remission des Tumors in vivo führten. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit demonstriert werden, dass (c) der wahrscheinlichste onkolytische Wirkmechanismus von [D]-K3H3L9 gegenüber Liposarkomzellen die Induktion der Zellnekrose über einen membranolytischen Vorgang war. 84 5.1. ONKOLYTISCHE WIRKSAMKEIT IN VITRO Im Vergleich zu den aktuell in der Sarkomtherapie eingesetzten „Gold-Standard“Chemotherapeutika Vincristin, Doxorubicin, Methotrexat und Ifosfamid zeigte sich im BrdU-Assay, dass das Peptid [D]-K3H3L9 bezüglich seiner antiproliferativen Wirkung mit den aktuellen Chemotherapeutika vergleichbar war. So lag im BrdUAssay der IC50 Wert von [D]-K3H3L9 mit 41 µM zwischen den IC50 Werten von Vincristin und Doxorubicin auf der einen Seite und Methotrexat und Ifosfamid auf der anderen Seite (Abb. 10A, Tab. 7). Hinsichtlich der antimetabolischen Wirkung war [D]-K3H3L9 sogar wirksamer als die vergleichbaren Chemotherapeutika. So wurde im MTT-Assay der IC50 Wert des Peptides von 52 µM von keinem der alternativen Chemotherapeutika unterboten (Abb. 10B, Tab. 8). Der TUNEL-Assay bestätigte schließlich, dass es sich bei der im MTT-Assay ermittelten antimetabolischen Aktivität nicht lediglich um eine Ruhigstellung des oxidativen Stoffwechsels im Sinne einer metabolischen Ruhephase der Zelle handelte, sondern dass es bei den entsprechenden Peptidkonzentrationen zu einer gleichzeitigen DNA-Fragmentierung und somit zur schweren genotoxischen Schädigung der Tumorzellen kam (Abb. 11A). Die durchgeführten in vitro Versuche offenbarten daher das potente onkolytische Potential des Designer Host Defense Peptides [D]-K3H3L9 gegenüber der SW-872 Liposarkomzelllinie. Beim BrdU-Assay, dem MTT-Assay und dem TUNEL-Assay war das Peptid [D]-K3H3L9 jedoch nicht selektiv wirksam gegenüber den SW-872 Liposarkomzellen. So wurden durch das Peptid im gleichen oder teils sogar größeren Umfang auch die primären humanen Fibroblasten als Kontrollzellen angegriffen (Abb. 10 + 11, Tab. 7 + 8). Der IC50 Wert der Fibroblasten lag beim BrdU-Assay mit einer Peptidkonzentration von 20 µM um 21 µM unter dem IC50 Wert der SW-872 Zellen (Tab. 7). Dies bedeutete, dass die Zellproliferation der Fibroblasten schon bei einer Peptidkonzentration von 21 µM um die Hälfte des Ausgangswertes reduziert war (Abb. 10A, Tab. 7). Bei dieser Peptidkonzentration war aber die Proliferation der Liposarkomzellen sogar um 12 % erhöht. Der MTTAssay ergab einen vergleichbaren Befund. Der IC50 Wert der Fibroblasten lag hier bei einer Peptidkonzentration von 34 µM und somit um 18 µM unterhalb der IC50 der SW-872 Liposarkomzellen (Tab. 8). Der TUNEL-Assay bot ein ähnliches Bild dar und so wurden bei den Fibroblasten bereits bei einer Peptidkonzentration von 12,5 µM DNA-Einzelstrangbrüche nachgewiesen (Abb. 11B). Erst später ab einer 85 Peptidkonzentration von 25 µM war auch bei den SW-872 Zellen eine genotoxische Wirkung ersichtlich (Abb. 11A). Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den in vitro Ergebnissen von Makovitzki et. al. [108]. Hier wurde das gleiche synthetische Designer-HDP [D]-K3H3L9 in einer Studie bzgl. der onkolytischen Aktivität gegenüber den humanen Prostatakarzinom-Zelllinien CL1 und 22RV1 eingesetzt. Als Kontrollzellen dienten hier humane Vorhaut-Fibroblasten OL. In dieser Studie erwies sich das Peptid jedoch als selektiv onkolytisch gegenüber den Prostatakarzinomzellen. Mittels eines XTT-Assays wurde hier die Zellvitalität untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die IC50 Werte der malignen Zellen mit 9,3 µM (CL1) bzw. 12,5 µM (22RV1) um mehr als die Hälfte niedriger waren als der IC50 Wert der Kontrollzellen mit 25 µM (OL). Dies spricht nicht nur für eine gezieltere Wirkung von [D]-K3H3L9 gegenüber den Prostatakarzinomzellen, sondern es zeigt auch, dass die SW-872 Liposarkomzellen deutlich robuster gegenüber dem Peptid-Angriff waren. So lag der IC50 Wert der Sarkomzellen beim MTT-Assay mit 52 µM um das ca. 4-fache (22RV1) bzw. das 5,5-fache (CL1) über dem IC50 Wertes der Prostatakarzinomzellen. Bei dieser Studie muss jedoch betont werden, dass es sich nicht um Liposarkomzellen, sondern um Prostatakarzinomzellen handelte, die mit HDP behandelt und mit Fibroblasten als Kontrollzellen verglichen wurden. Daher sind grundsätzlich Makovitzkis Ergebnisse nur bedingt mit den Ergebnissen dieser Arbeit vergleichbar. Es muss hier nämlich beachtet werden, dass die in Makovitzkis Studie verglichenen Zellen jeweils unterschiedlichen embryologischen Ursprunges waren. Während Fibroblasten sowie Liposarkomzellen beide aus dem Mesenchym hervorgehen [32, 189] ist beispielsweise die Prostata- karzinomzelllinie 22RV1 epithelialen Ursprunges [168]. Das Drüsenepithel der Prostata wiederum entstammt dem Endoderm [119]. Insofern stellt sich vorerst die grundsätzliche Frage, ob die in Makovitzkis Studie eingesetzten Fibroblasten wirklich die best geeigneten Kontrollzellen für seine Versuche darstellten. Eventuell wäre der Vergleich von Prostatakarzinomzellen mit entsprechenden Prostata-Drüsenepithelzellen geeigneter, um eine deutliche Selektivität des HDPs gegenüber malignen Zellen darzustellen. Im Gegensatz dazu wurde in dieser Arbeit bewusst darauf geachtet, dass maligne und benigne Zellen denselben embryonalen, in diesem Falle mesenchymalen, Ursprung haben. Jedoch soll an dieser Stelle betont werden, dass nicht zwingend 86 Adipozyten die passenden benignen Kontrollzellen zu den Liposarkomzellen darstellten. Denn wie oben bereits beschrieben (siehe 1.1.5.) konnte im Gegensatz zur Onkogenese einiger Karzinome bei den Weichgewebssarkomen kein Zusammenhang zwischen benignen Adipozyten und malignen Liposarkomzellen im Sinne einer malignen Entartung nachgewiesen werden [133, 187, 196]. Die Namensgebung richtet sich bei den Weichgewebssarkomen eher nach morphologischen Kriterien [26]. Dennoch stellt die mangelnde Selektivität des Peptides im in vitro Teil dieser Studie eine Herausforderung dar, die es zu verstehen gilt, um sie im Weiteren zu beheben. Mit entscheidend für das Verständnis der unterschiedlichen Selektivitäten ist sicherlich die Kenntnis über die Grundprinzipien des HDPWirkmechanismus. Wie oben beschrieben (siehe 1.2.4.) binden die kationischen HDPs über elektrostatische Wechselwirkungen bevorzugt an die, im Vergleich zur physiologischen Zelle, negativer geladene Zellmembran der Tumorzelle [21, 23, 34, 73, 140, 195, 208]. Aufgrund des unterschiedlichen phylogenetischen Ursprunges ist es jedoch wahrscheinlich, dass auch der Unterschied in der Zellmembranzusammensetzung zwischen Prostatakarzinomzelle und Fibroblasten größer ist als zwischen Liposarkomzelle und Fibroblasten. Die individuelle Zusammensetzung der Zellmembran bestimmt wiederum maßgeblich deren elektrische Ladung. Ändert sich nun diese Zusammensetzung der Zelllmembranbausteine, so ist es folglich möglich, dass sich auch die Nettoladung der Zellmembran ändert [73, 140, 208]. Aktuell wird angenommen, dass eine unterschiedliche Nettoladung für die HDPs das zentrale Unterscheidungskriterium zwischen maligner und benigner Zelle ist [73, 140, 208]. Daher könnte es aufgrund des zu geringen Unterschiedes in der Nettoladung umso schwieriger für die HDPs sein, gezielt zwischen Fibroblasten und den phylogenetisch nahe verwandten Liposarkomzellen zu unterscheiden. Aufgrund dieser mangelnden Zielgenauigkeit ist es daher wahrscheinlich, dass nicht alle Peptidmoleküle an die Liposarkomzellen banden. Folglich musste die Peptidmenge erhöht werden, um eine vergleichbare Wirksamkeit zu erreichen. Um die gerade getroffenen Annahme jedoch exakter zu verifizieren, sind umfassende weiterführende Studien nötig, die detailliert die Unterschiede in der Membranbeschaffenheit zwischen Liposarkomzellen und Fibroblasten darstellen. Denn je genauer der Unterschied zwischen diesen beiden Zellarten verstanden wird, umso individueller und zielgerichteter können HDPs in Zukunft gestaltet 87 werden. Insgesamt sind aber die hier dargestellt in vitro Ergebnisse ein wichtiger Schritt in die richtige Richtung, da hier gezeigt werden konnte, dass das synthetische Designer-HDP [D]-K3H3L9 grundsätzlich hochpotente onkolytische Eigenschaften gegenüber Liposarkomzellen besitzt. Denn im Gegensatz zu den oftmals vielversprechenden therapeutischen Ansätzen in der Prostatakarzinomtherapie [78, 167] sind die therapeutischen Optionen gegenüber den äußerst aggressiven und therapieresistenten Weichgewebssarkomen im klinischen Alltag heute oftmals noch unbefriedigend [32, 159]. Eine Möglichkeit, um die eben beschriebene mangelnde Selektivität von [D]K3H3L9 zu optimieren und somit die gezielte onkolytische Aktivität zu verbessern, besteht z.B. darin, die positive Ladung des Designer Host Defense Peptides zu erhöhen. Dies kann durch den zusätzlichen Anbau kationischer Aminosäuren wie z.B. Lysin oder Histidin an das bestehende Peptid geschehen. Diese Idee stammt aus dem antimikrobiellen Einsatzbereich von Host Defense Peptiden [148]. So zeigte sich, dass einige Bakterien wie z.B. Staphylococcus aureus in der Lage waren, dem Angriff bestimmter HDPs zu entgehen, indem sie die anionische Ladung ihrer Zellwand durch den Einbau kationischer Moleküle reduzierten [147]. Dadurch wurde die Affinität der kationischen HDPs an die bakterielle Zellwand reduziert und die bakterielle Resistenz gegenüber einigen HDPs gestärkt [49, 146]. Dieser bakterielle Abwehrmechanismus konnte jedoch effektiv bekämpft werden, indem die positive Ladung der HDPs zusätzlich verstärkt wurde. So stellte sich beispielsweise heraus, dass das Host Defense Peptid hBD-3, das humane Defensin mit der stärksten antimikrobiellen Aktivität gegenüber Staphylococcus aureus zugleich das Defensin mit der höchsten kationischen Ladung von +10 ist [63]. Dieser Mechanismus, schwächer anionische Zielstrukturen durch umso kationischere HDPs effektiv zu bekämpfen, könnte auch auf Tumorzellen übertragen werden, gegenüber denen HDPs aktuell noch wenig selektiv sind. Denn wie soeben beschrieben könnte ein Hauptgrund für die mangelnde Selektivität von [D]-K3H3L9 in dieser Studie auch in einem zu geringen Ladungsunterschied der Zelloberflächen von SW-872 Liposarkomzellen im Vergleich zu den Fibroblasten liegen. Entsprechend dem Vorbild aus der antimikrobiellen Wirkung könnte daher die Erhöhung der kationischen Ladung hier ein plausibler Lösungsansatz sein. Bei der Analyse der BrdU- und MTT-Ergebnisse (Abb. 10, Tab. 7 + 8) schienen die Chemotherapeutika Vincristin und Doxorubicin auf den ersten Blick dem Designer88 HDP [D]-K3H3L9 überlegen. Denn beim BrdU-Assay erwies sich Vincristin im Bereich von 3,1 µM – 25 µM hochsignifikant (p<0,01) selektiv antiproliferativ wirksam gegenüber den SW-872 Liposarkomzellen (Abb. 10A, Tab. 7). Die IC50 Werte von Vincristin bzgl. der Fibroblasten lagen mit 28 µM um 19 µM über dem Wert der Liposarkomzellen (Tab. 7), was die Selektivität weiterhin bestätigte. Auch beim MTT-Assay spiegelte sich ein ähnliches Bild wider (Abb. 10B, Tab. 8). Hier stellte sich Doxorubicin im Bereich zwischen 25 µM – 100 µM als hochsignifikant (p<0,01) selektiv antimetabolisch gegenüber den SW-872 Liposarkomzellen dar. Die IC50-Werte von Doxorubicin bzgl. der Fibroblasten lagen über 100 µM, wohingegen der IC50-Wert bzgl. der Liposarkomzellen 89 µM betrug (Tab. 8). Auch Vincristin zeigte im Bereich von 25 µM – 100 µM im MTT-Assay ein hochsignifikant (p<0,01) selektiv antimetabolisches Verhalten gegenüber den SW872 Liposarkomzellen (Abb. 10B). Angesichts dieser Datenlage stellt sich die Frage, inwieweit [D]-K3H3L9 gegenüber den in vitro selektiven Chemotherapeutika überhaupt einen Behandlungsvorteil in der aktuellen Sarkomtherapie bringen könnte. In Anbetracht des Nebenwirkungsprofils und des Patienten-Outcomes unter der aktuellen Chemotherapie relativiert sich jedoch schnell diese scheinbare Überlegenheit der Chemotherapeutika. Zum Nebenwirkungsspektrum von Vincristin gehören beispielsweise gastrointestinale Blutungen, Krampfanfälle, Koma, Blutbildveränderungen, Psychosen, akute Niereninsuffizienz oder Kardiotoxizität [156]. Im Falle von Doxorubicin konnte im Rahmen von kleineren Studien an high-grade Sarkomen eine komplette Tumornekrose bisher in nur 5-9 % der Patienten erzielt werden [69, 134]. In verschiedenen Studien konnte außerdem gezeigt werden, dass eine adjuvante Chemotherapie im Rahmen der Sarkomtherapie weder das Gesamtüberleben noch das krankheitsfreie Überleben verbesserte [32, 159]. Aufgrund des bisher ausbleibenden klinischen Erfolges und der oftmals gravierenden Nebenwirkungen spielt momentan die Chemotherapie in der Sarkomtherapie eine untergeordnete und experimentelle Rolle. Im Gegensatz dazu konnte beim Designer Host Defense Peptid [D]-K3H3L9 bis zu einer systemischen Gabe von 30 mg/kg noch keinerlei Toxizität nachgewiesen werden [108]. Gemäß der aktuellen Datenlage ist somit das Designer Host Defense Peptid [D]-K3H3L9 in vitro onkolytisch hochwirksam ohne den Organismus zugleich durch schädliche Nebenwirkungen zu beeinträchtigen. Um jedoch eine noch differenziertere Aussage über das Nebenwirkungsspektrum dieses Peptids machen zu können, sind in einem 89 nächsten Schritt ausgedehnte Langzeitstudien mit [D]-K3H3L9 gegenüber den SW-872 Liposarkomzellen sinnvoll, bei denen detailliert Nebenwirkungen analysiert und histologisch untersucht werden müssen. Einen ersten Eindruck von der guten Langzeitverträglichkeit onkolytischer Designer-HDPs lieferten Papo et al. in ihrer Studie. So zeigten sie, dass beim strukturell sehr ähnlichen onkolytischen Designer-HDP [D]-K6L9 auch 165 Tage nach Ende einer systemischen Peptidtherapie kein Tier in der Behandlungsgruppe gestorben war. Im Gegensatz dazu waren alle Tiere der Kontrollgruppe 75 Tage nach TherapieEnde ihrem 22RV1 Prostatakarzinomleiden erlegen [137]. Eine abschließende und absolute Aussage über Effektivität und Nebenwirkungen von Host Defense Peptiden im Vergleich zu Chemotherapeutika wird aber sicherlich erst nach einer klinischen HDP-Applikation bei Weichgewebssarkom-Patienten möglich sein. Dem ungeachtet dürfen in einer zukünftigen Weichgewebssarkom-Therapie die aktuellen Chemotherapeutika und die Klasse der HDPs nicht als kompetitive oder gar antagonistische Konkurrenten missverstanden werden. In mehreren Studien hat sich im Gegenteil gezeigt, dass sich Chemotherapeutika und HDPs in ihrer Wirkung in vitro additiv ergänzen oder sogar synergistisch verstärken [75, 130, 136, 140]. Papo et al. zeigte in einer in vitro Studie beispielsweise, dass das strukturell verwandte Designer-HDP Amphipathic-D in Kombination mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin synergistisch onkolytisch gegenüber den Prostatakarzinom-Zelllinien CL1, 22RV1 und LNCaP wirkte [136]. Der genaue Wirkmechanismus, der diesem synergistischen Effekt zugrunde lag, wurde aber bisher noch nicht genau erforscht [136]. Möglicherweise konnte durch das Designer-HDP Amphipathic-D die Permeabilität der Chemotherapeutika in die Karzinomzelle gesteigert werden [136]. Inwieweit sich solch additive bzw. synergistische Effekte auch bei [D]-K3H3L9 in Kombination mit aktuellen „GoldStandard“-Chemotherapeutika finden und welcher Wirkmechanismus dabei zugrunde liegt, muss Gegenstand zukünftiger Studien sein. Bei genauer Betrachtung der Ergebnisse des BrdU- und MTT-Assays zeigte sich überdies ein weiteres Phänomen. So schien das Peptid [D]-K3H3L9 bei geringen Konzentrationen das Wachstum der SW-872 Liposarkomzellen Im Gegensatz zu den Kontrollzellen sogar zu fördern (Abb. 10). Denn bis zu einer Dosis von 25 µM (Abb. 10A) nahm im BrdU-Assay die Zellproliferation hochsignifikant (p<0,01) zu. Auch im MTT-Assay wirkte das Peptid bis zu einer Dosierung von 12,5 µM auf die Liposarkomzellen hochsignifikant (p<0,01) stoffwechselanregend (Abb. 10B). 90 In der Tat existieren einige Studien, die zeigten, dass beispielsweise das im Menschen exprimierte HDP hCAP18/LL-37 in gewissen Konzentrationen tumorförderlich wirkte [28, 65, 198]. Coffelt et al. berichteten, dass hCAP18/LL-37 das Wachstum von Ovarialkarzinomen u.a. über eine pro-angiogenetischen Wirkung anregte [28]. Heilborn et al. beschrieben, dass hCAP18/LL-37 auch in einigen Brustkarzinomzellen exprimiert wurde und dort über einen proliferationsfördernden Mechanismus das Tumorwachstum unterstützte [65]. Weber et al. zeigten zusätzlich, dass hCAP18/LL-37 bei einer geringen Konzentration von nur 2 µM die Bildung von Metastasen bei Brustkrebs anregte [198]. Jedoch muss darauf hingewiesen werden, dass es sich bei hCAP18/LL-37 und dem in dieser Studie untersuchtem Peptid [D]-K3H3L9 um zwei strukturell grundsätzlich verschiedene HDPs handelt. [D]-K3H3L9 ist ein synthetisch hergestelltes Designer-HDP, welches aus 15 D- und L-Aminosäureresten besteht und lediglich auf 3 verschiedene Aminosäuren als Grundbausteine zurückgreift [108]. Im Gegensatz dazu ist LL-37 ein natürliches HDP, das aus 37 L-Aminosäureresten aufgebaut ist und sich dabei 13 verschiedener Aminosäuren als Grundbausteine bedient [47]. Aufgrund dieser beträchtlichen Unterschiede ist es fraglich, ob bei [D]-K3H3L9 ähnliche Wirkmechanismen den beobachteten proliferationsfördernden bzw. stoffwechselanregenden Aktivitäten zugrunde lagen, wie es bei hCAP18/LL-37 der Fall war. Der im MTT-Assay gezeigte Anstieg des oxidativen Stoffwechsels könnte schlicht auch durch akuten Stress ausgelöst worden sein, der bei subtoxischen Dosierungen durch [D]-K3H3L9 auf die Zellen einwirkte. Denn auf akute Stresssituationen antwortet die Zelle mittels komplexer Abwehrmechanismen, zu denen beispielsweise auch die Expression von Hitzeschockproteinen gehört, deren Produktion auch zu einem im MTT-Assay nachweisbaren Anstieg des oxidativen Zellmetabolismus führen könnte [79, 155, 199]. Letztendlich ist das Verhalten von [D]-K3H3L9 gegenüber SW-872 Liposarkomzellen im Allgemeinen und bei geringer Konzentration im Speziellen nicht erforscht. Diese Arbeit gibt einen ersten Einblick in den onkolytischen Wirkmechanismus des Peptides. Dennoch sind weiterführende Studien nötig, um die unterschiedlichen tumorfördernden bzw. onkolytischen Aktivitäten des Peptides bei geringen bzw. hohen Konzentrationen im Detail zu verstehen. 91 5.2. ONKOLYTISCHE WIRKSAMKEIT IN VIVO Die in vivo Versuche bestätigten die bereits in vitro ersichtliche onkolytische Wirksamkeit des Designer Host Defense Peptides [D]-K3H3L9. Zusammfassend ergab eine intratumorale Peptidbehandlung am SW-872-Liposarkom-XenograftModel in 43 % der Tiere eine makroskopische Vollremission und in weiteren 43 % der Tiere eine partielle Remission (Abb. 15 + 17). Zum Versuchsende war das durchschnittliche Tumorvolumen der Kontrollgruppe achtmal größer als das Tumorvolumen der Behandlungsgruppe. Entsprechend war das Tumorgewicht in der Therapiegruppe signifikant (p<0,05) um 88 % reduziert (Abb. 16). Die histologischen Ergebnisse entsprachen den makroskopischen Befunden. Hierbei ist aber zu beachten, dass histologische Analysen in der Behandlungsgruppe nur von vitalem Tumorgewebe möglich waren. Vitales Tumorgewebe wiederum war nur von Tumoren erhältlich, welche kaum oder nur im Zuge einer partiellen Remission auf die Behandlung ansprachen. Von den besonders erfolgreich behandelten Tumoren war nach einer Vollremission folglich kein ausreichendes Gewebe für eine histologische Analyse mehr erhältlich. Somit reflektierten die histologischen Analysen in gewissem Maße ein verfälschtes Bild, da nur Gewebe von weniger erfolgreich therapierten Tieren untersucht werden konnte. Es ist davon auszugehen, dass die entsprechenden Effekte bei Vollremission noch deutlich drastischer ausfielen. Trotz allem zeigte sich in der Behandlungsgruppe gemäß der BrdU-Assay-Ergebnisse der in vitro Analysen auch in vivo ein entsprechend anti-proliferatives Bild. Die histologische Auszählung Ki67-positiver Zellen ergab hier eine um 87 % hochsignifikant (p=0,0006) reduzierte Proliferationsrate (Abb. 19 + 20). Die Mitoserate war demgemäß um 39 % reduziert (Abb. 21 + 22). Des Weiteren war der Anteil der nekrotischen Fläche in der Therapiegruppe verdoppelt, was die im MTT- und TUNEL-Assay bereits gezeigte zytotoxische Wirkung des Peptides in vivo verifizierte (Abb. 23 + 24). Darüber hinaus stellte sich heraus, dass in der Behandlungsgruppe die Gefäßdichte um 52 % signifikant (p=0,0356) verringert war (Abb. 25 + 26). Insgesamt konnte die bereits in vitro gezeigte onkolytische Aktivität damit erfolgreich auf ein entsprechendes in vivo Model übertragen werden. 92 Im Vergleich zur Arbeit von Makovitzki et al. war in meiner Studie jedoch eine deutlich höhere intratumorale Peptiddosis nötig, um eine analoge Tumorremission zu erzielen [108]. Unter einem vergleichbaren in vivo Behandlungsprotokoll injizierten Makovitzki et al. bei der Therapie der humanen ProstatakarzinomZelllinie 22RV1 lediglich 1 mg/kg des gleichen Peptides [D]-K3H3L9 intratumoral [108]. Dies führte zu einer Verringerung des Tumorgewichtes um 81 %. Um eine entsprechende Reduktion des Tumorgewichtes um 88 % zu erreichen (Abb. 16), war in der vorliegenden Studie eine um das 8,5-fach höhere Peptiddosis von 8,5 mg/kg nötig. Ein wichtiger Grund für eine höhere Peptiddosis lag sicherlich im höheren durchschnittlichen Tumorvolumen zu Beginn der Peptidtherapie. So wurde hier die Therapie erst ab einem Tumorvolumen von durchschnittlich 216 mm3 begonnen (Abb. 17B). In Vorversuchen zeigte sich, dass ab dieser durchschnittlichen Tumorgröße das Tumorwachstum exponentiell anstieg und somit besonders verlässlich ein Erfolg bzw. Misserfolg der Therapie messbar war. Um bei einem größeren Tumorvolumen dieselbe Wirkung zu erreichen, waren folglich entsprechend höhere Peptidgaben notwendig. Zudem starteten Makovitzki et al. die intratumorale Applikation bereits ab einem Tumordurchmesser von ungefähr 5 mm [108]. Bei einem solchen Durchmesser lag das Tumorvolumen laut der eingesetzten Formel zur Tumorvolumenberechnung (siehe 3.4.2.) bei maximal 62,5 mm3 und betrug damit nur knapp 30 % des Tumorvolumens dieser Studie. Inwieweit sich diese Tumoren bei einer solch geringen Größe überhaupt in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, gilt es zu hinterfragen. Überdies ist es fragwürdig, inwieweit Makovitzki et al. bei einem Tumovolumen von 62,5 mm3 ein Peptidvolumen von 100 mm3 injizieren konnten [108]. Aus eigener Erfahrung mit diesem Tiermodell kann ein solch kleiner Tumor kaum diese großen Mengen an Flüssigkeit aufnehmen. Vielmehr wird die Injektionslösung und somit das Peptid wieder aus dem Tumorgewebe ausgepresst und gelangt in das umliegende Gewebe. Ein weiterer Grund für eine erhöhte Peptiddosierung könnte in der bereits in vitro aufgefallenen höheren Widerstandsfähigkeit der Liposarkomzellen gegenüber dem Peptid liegen. Denn wie bereits diskutiert (siehe 5.1.), ist das Peptid gegenüber SW-872 Zellen weniger zellen (Abb. 10, Tab. 7 + 8). selektiv Diese als gegenüber mangelnde Prostatakarzinom- Selektivität könnte auch in vivo dazu führen, dass nicht alle der intratumoral injizierten Peptidmoleküle zielgenau an die Liposarkomzellen binden konnten, sondern nur ein jeweils 93 geringerer Anteil. Um sicherzustellen, dass eine vergleichbare Peptidanzahl an die Liposarkomzellen binden und eine entsprechende Wirkung entfalten konnte, musste folglich eine höhere Peptidmenge appliziert werden. Insgesamt würde sich damit die bereits in vitro aufgefallene mangelnde Selektivität von [D]-K3H3L9 auch in vivo bestätigen. Letztendlich unterstreicht dieses Ergebnis erneut die Notwendigkeit, in zukünftigen Studien die spezifischen Zellmembraneigenschaften von Liposarkomzellen genauer zu erforschen, um daraufhin ein optimierteres und zielgenaueres Peptid zu entwickeln. Bei genauem Betrachten der histologischen Schnitte der Peptidinjektionsstelle (Abb. 18A + B, linke Seite) stellte sich darüber hinaus die Frage, ob die Peptidbehandlung überhaupt auf das restliche Tumorgewebe neben der Injektionsstelle einwirkte. Denn bei geringer Vergrößerung schien das Tumorgewebe jenseits des Injektionsareals (Abb. 18A + B, rechte Seite) vital und von der onkolytischen Peptidtherapie kaum beeinträchtigt zu sein. Es galt also zu klären, inwieweit die Peptidwirkung nur auf das Injektionsareal beschränkt war oder ob der gesamte Tumor perfundiert werden konnte. Sicherlich ist an den großen nekrotischen Tumorflächen im Bereich des Injektionsareals die onkolytischen Aktivität des Peptides am deutlichsten sichtbar (Abb. 18A + B, linke Seite). Durch das Ausmessen der nekrotischen Fläche konnte dieser Effekt nochmals quantifiziert werden (Abb. 23 + 24). So bestätigte die Verdopplung der nekrotischen Fläche in den behandelten Tumoren diese sichtliche onkolytische Wirkung. Bei der detaillierten mikroskopischen Analyse der histologischen Schnitte wurde aber schnell deutlich, dass auch die scheinbar vitalen Tumoranteile stark von der Peptidbehandlung beeinträchtigt wurden. So ergaben die High Power Field Auszählungen dieser vermeintlich vitalen Tumorbereiche, dass es hier unter der Peptidtherapie zu einer hochsignifikanten (p=0,0006) Reduktion der Zellproliferation um 87 % bzw. zu einer Verringerung der Mitoserate um 39 % kam (Abb. 19 - 22). Darüber hinaus ergab die Analyse der Angiogenese, dass in der Behandlungsgruppe die Gefäßdichte signifikant (p=0,0356) um 52 % verringert wurde (Abb. 25 + 26). Eine ausreichende Gefäßinfrastruktur ist gerade für hochproliferative und daher hochmaligne Tumoren essentiell, um den stetig wachsenden Sauerstoff- und Nährstoffbedarf zu decken [135, 186]. Eine entsprechende Gefäßversorgung limitiert dabei nicht nur die Nährstoffzufuhr deutlich, sondern auch den Abtransport der Stoffwechselendprodukte [135, 186]. Aufgrund der reduzierten Proliferation 94 und dem somit langsameren Tumorwachstum in der Behandlungsgruppe wäre eigentlich zu erwarten gewesen, dass hier die Angiogenese mit dem langsameren Tumorwachstum mithalten könnte und somit eine entsprechend höhere Gefäßdichte zu verzeichnen wäre. Jedoch war in der Therapiegruppe die Gefäßdichte sogar noch geringer als in den schnell wachsenden Tumoren der Kontrollgruppe, deren Tumorvolumen zum Versuchsende im Durchschnitt immerhin um das 8-fache größer war als das der Behandlungsgruppe (Abb. 17B). Auf welche Art und Weise das Peptid diese anti-angiogenetischen Wirkung ausübte, muss in zukünftigen Studien erst noch genauer geklärt werden. Mögliche Ursachen könnten beispielsweise die Pepitd-induzierte Ausschüttung Angiogenese-inhibitierender Faktoren wie z.B. Angiostatin sein oder, wie bereits von Dings et al. beschrieben, die Peptid-induzierte Apoptose von aktivierten Endothelzellen [42, 137]. Auch eine direkte Aktivität von [D]-K3H3L9 an den Endothelzellen wäre durchaus denkbar. So berichteten Ran et al., dass auch an Endothelzellen von Tumoren anionisches Phosphatidylserin vermehrt exprimiert wurde. Bei physiologischem Gefäßendothel konnte dagegen keine erhöhte PSExpression nachgewiesen werden [153-154]. Daher wäre es auch möglich, dass kationische HDPs gezielt an die anionischen PS-Moleküle der Endothelzellen von Tumoren banden und somit eine selektive anti-angiogenetischen Wirkung auslösten. Zusammenfassend belegen diese antiproliferativen und anti-angiogenetischen Effekte, dass die Wirkung des von [D]-K3H3L9 nicht auf das Peptidinjektionsareal beschränkt blieb, sondern die Gesamtheit des Tumorgewebes umfasste. Auch die erreichte Reduktion des durchschnittlichen Tumorvolumens auf ein Achtel des Wertes der Kontrollgruppe (Abb. 17B) und die signifikante (p<0,05) Verringerung des Tumorgewichtes um 88 % in der Therapiegruppe (Abb. 16) ist in diesem Ausmaß nur im Rahmen einer umfassenden onkolytischen Wirkung auf das gesamte Tumorgewebe möglich. Letztendlich ist die onkolytische Wirkung einer Substanz oft nicht nur auf einen einzigen Effekt allein zurückzuführen, sondern stellt meist, wie im Falle von [D]-K3H3L9, das erfolgreiche Zusammenspiel mehrerer, zugleich ablaufender onkolytischer Effekte dar. Interessanterweise konnte diese inhibierende Wirkung auch beim Tumorgewebe des einzigen scheinbar erfolglos behandelten Tumors nachgewiesen werden. Vorerst entstand hier der Eindruck, dass wegen dem vergleichsweise großen Tumorvolumen von 1003 mm3 die Peptid-Therapie erfolglos gewesen sein 95 könnte (Abb. 17B). Bei genauerer histologischer Analyse fiel aber auf, dass 22 % der Tumorschnittfläche nekrotisch waren und dass das übrige Tumorgewebe im Zuge der Peptid-Therapie massiv beeinträchtigt wurde. Denn obgleich es unter der Peptidtherapie hier zu keiner Remission des Tumorvolumens kam, unterschied sich das Tumorgewebe hinsichtlich Proliferationsrate, Mitoserate, Nekrosefläche und Gefäßdichte nicht von den anderen Peptid-behandelten Tumoren. In zukünftigen Studien wird sich herausstellen, inwieweit es sich bei diesem Tumor um eine Ausnahme handelte. Sollte dieses Phänomen gehäuft auftreten, muss das gesammelte Gewebe dieser scheinbar erfolglos behandelten Tumoren im Rahmen gezielter Untersuchungen genau erforscht werden. Im speziellen muss dabei nachgeprüft werden, wie es trotz der inhibierenden Aktivität zu einem Tumorvolumenanstieg kommen konnte. Ein weiterer wichtiger Diskussionspunkt ist die Art der Peptidapplikation, wie sie in dieser Arbeit durchgeführt wurde. Eine intratumorale Peptidapplikation wie in dieser Studie birgt einige Schwächen gegenüber einer systemischen Gabe. Denn durch die intratumorale Injektion wurde sichergestellt, dass das Peptid direkt an den gewünschten Wirkort gelangte. Solch eine gezielte Applikation und eine so umfassende Infiltration des Tumors mit dem Wirkstoff ist aber in der Klinik z.B. bei großen retroperitonealen Tumoren oft schwierig. Durch die topische Gabe könnte außerdem keine ausreichende Behandlung von eventuell bereits aufgetretenen, subklinischen Mikrometastasten z.B. in der Lunge erfolgen, die durch eine systemische Gabe therapiert werden könnten [32, 77]. Nach den vielversprechenden Ergebnissen dieser Studie ist eine umfassende Untersuchung der onkolytischen Wirksamkeit des Designer-HDPs [D]-K3H3L9 bei systemischer Gabe sicherlich der nächste logische Schritt. Aus mehren Gründen wäre es aber nicht sinnvoll gewesen, die systemische Applikation vor der intratumoralen Verabreichung durchzuführen. Denn indem das Peptid direkt in das Tumorgewebe injiziert wurde, konnte zunächst gezielt die isolierte Wirkung des Peptids auf das Zielgewebe allein untersucht werden. Zugleich konnte leicht die bestwirksame Peptiddosierung für die Therapie des Liposarkom-Xenografts erarbeitet werden. Zudem wurde durch die intratumorale Applikation der Blutkreislauf weitestgehend umgangen und somit gelangte ein Großteil des Peptids direkt und unverdünnt in das Tumorgewebe, was zu einer hohen lokalen Peptidkonzentration führte. Einen ersten Eindruck des onkolytischen Potentials von [D]-K3H3L9 nach systemischer Applikation geben die Ergebnisse von Makovitzki et al. [108]. Hier wurde bereits 96 die systemische Wirkung des gleichen Designer-HDPs jedoch auf ein humanes 22RV1-Prostatakarzinom-Xenograft an der männlichen CD1 Nacktmaus analysiert. Die dabei gewonnenen Ergebnisse waren durchaus erfolgversprechend und zeigten, dass eine systemische Therapie generell möglich war. So wurde in vivo durch eine systemische Applikation von 9 mg/kg eine signifikante Verminderung des Tumorwachstums erzielt und eine signifikante Reduktion des Tumorgewichtes um 75 % im Vergleich zur Kontrollgruppe erreicht. Im Rahmen weiterführender Studien stellt sich neben der systemischen Wirksamkeit des Peptides auch die Frage nach eventuell auftretenden Nebenwirkungen insbesondere nach längerfristiger Peptid-Behandlung. So gilt es beispielsweise zu klären, ob die beobachtete anti-angiogenetische Aktivität auf das pathologische Tumorgewebe begrenzt bleibt oder ob auch physiologische Strukturen z.B. das Kapillarsystem von Leber, Lunge oder Gehirn diesbezüglich gefährdet sein könnten. Viele Forschungsergebnisse belegten jedoch bereits die gute Verträglichkeit von [D]-K3H3L9 in der Tumortherapie [108, 136-137, 140, 175]. Auch in dieser Studie musste weder ein Tier der Therapiegruppe aufgrund offensichtlicher Nebenwirkungen aus der Studie genommen werden noch lieferte die makroskopische Inspektion der Organe etwaige Anzeichen massiver Nebenwirkungen. Des Weiteren zeigten etwa Steinsträßer et al. in ihrer Analyse der hämolytischen Aktivität von [D]-K3H3L9, dass selbst bei Gabe der maximalen Peptiddosis von 100 µM und bis hin zu einer maximalen Inkubationszeit von 2 Stunden der Anteil zerstörter muriner bzw. humaner Erythrozyten noch unter 10 % lag [175]. Darüber hinaus konnte bei einer einmaligen systemischen Gabe von bis zu 30 mg/kg auch nach 6 Tagen keine Anzeichen einer akuten Toxizität bei [D]-K3H3L9 nachgewiesen werden [108]. Auch erste Langzeiterfahrungen mit einem strukturell sehr ähnlichen onkolytischen Designer-HDP, wie in der oben erwähnten Studie von Papo et al. (siehe 5.1.) zeigten, dass onkolytische HDPs auch im Langzeitverlauf einen entscheidenden Behandlungsvorteil bringen könnten [137]. Weitere, besonders die Neurologie oder die Psyche des Patienten betreffende Nebenwirkungen können freilich erst bei einer späteren Anwendung am Menschen abschließend ausgeschlossen werden. Dennoch lassen diese ersten Ergebnisse auf eine besonders gute systemische Verträglichkeit bei zugleich hochpotenter onkolytischer Wirksamkeit des Designer Host Defense Peptides [D]-K3H3L9 hoffen. 97 5.3. ONKOLYTISCHER WIRKMECHANISMUS Die Analyse des onkolytischen Wirkmechanismus wurde sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt. In vitro führte die Inkubation von SW-872 Liposarkomzellen mit der Letaldosis des Designer Host Defense Peptid [D]-K3H3L9 zu einem hochsignifikanten (p<0,01) Anstieg der toten Zellen (Abb. 12 + 13A). Die synchrone Messung der apoptotischen Zellen ergab eine gleichzeitige, teils hochsignifikante (p<0,01) Abnahme der apoptotischen Zellen (Abb. 12 + 13B). Demzufolge wurde nicht das Absterben durch Apoptose, sondern vielmehr der Zelltod durch Nekrose als hauptsächliche Ursache des Peptid-induzierten Zellsterbens postuliert. Mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie konnte in einem eigens für diesen Zweck entwickelten Versuchsaufbau die Peptidlokalisation im zeitlichen Verlauf genau beobachtet und somit der nekrotische Wirkmechanismus weiter aufgeklärt werden (Abb. 14). Hierbei legte sich das Peptid [D]-K3H3L9 in einem ersten Schritt an der Zelloberfläche an, worauf anschließend der Zellnekroseprozess mit den einzelnen morphologischen Charakteristika ablief. Angefangen von der Zellschwellung kam es hier zur Zellmembranauflösung mit abschließender totaler Zellzerstörung. Ebenso bestätigte eine erste Analyse der behandelten Tumoren, dass das Peptid [D]-K3H3L9 die Tumorzellen auch in vivo über den Nekrosemechanismus abtötete (Abb. 27). Bei dieser rein morphologischen Untersuchung der histologischen Tumorschnitte anhand des Semidünnschnittverfahrens waren wieder die entsprechenden Korrelate der Nekrose sichtbar. Auch hier waren im Randbereich zum Peptidinjektionsareal zahlreiche geschwollene Zellen wie auch Zellen mit zerborstener Zytoplasmamembran nachweisbar. All diese in vitro und in vivo Befunde unterstrichen daher die Annahme, dass es sich bei dem gesuchten onkolytischen Wirkmechanismus von [D]-K3H3L9 gegenüber den SW-872 Liposarkomzellen um den Zelltod durch Nekrose handelte. Im Allgemeinen ist der exakte Wirkmechanismus von Host Defense Peptiden gegenüber Tumorzellen kaum bzw. der Wirkmechanismus von [D]-K3H3L9 gegenüber SW-872 Liposarkomzellen im Speziellen überhaupt nicht verstanden [73, 140, 208]. Mehrere Arbeiten zeigten aber, dass HDPs die entsprechenden Zielzellen auf unterschiedlichste Art und Weise und über diverse Mechanismen abtöten können (siehe 1.2.4) [24, 99, 106, 140, 142-143, 164]. Um in Zukunft durch optimiertes Peptid-Design eine gezieltere Wirkung auf Tumorzellen zu 98 gewährleisten und somit die onkolytische Wirkung zu verbessern und zugleich potentielle Nebenwirkungen zu reduzieren, ist ein klares Verständnis des onkolytischen Wirkmechanismus von [D]-K3H3L9 gegenüber SW-872 Liposarkomzellen essentiell. Grundsätzlich werden zwei bis drei Hauptformen des Zelltodes unterschieden [45, 54, 74, 87]. In jedem Falle gehören dazu die Apoptose sowie die Nekrose. Ob die Autophagie als eigenständige dritte Form des Zelltodes anerkannt werden soll, wird in der Literatur aktuell noch diskutiert [45, 68, 74, 85, 97, 183]. Grund für Zweifel gibt u.a. die enge Vernetzung von Autophagie und Apoptose. Bei der Apoptose handelt es sich um die klassische Form des programmierten Zelltodes [87]. Sie kann prinzipiell über zwei Hauptwege iniziiert werden [45, 74]. Zum einen über den intrinsischen oder mitochondrialen Weg, zum anderen über den extrinsischen oder death-receptor Weg [183]. Ausgelöst durch intra- oder extrazellulären Stress z.B. durch intrazelluläre Toxine oder durch Auslösen membranständiger Todesrezeptoren führen beide Wege über Aktivierung einer Caspasen-Kaskade zum kontrollierten Abbau der einzelnen Zellbestandteile [45, 58, 74, 112, 121, 207]. Die verschiedenen Zelltodarten können verlässlich aufgrund morphologischer Kriterien unterschieden werden [45, 68]. Zu den mikroskopisch sichtbaren Charakteristika der Apoptose zählt die Karyopyknose, die Schrumpfung des Zellkerns mit Chromatin-Kondensation. Es folgt die Karyorrhexis, die Fragmentierung des Zellkerns in Chromatinstücke mit Bildung von Plasmamembranblasen, was auch als „Blebbing“ bezeichnet wird [45, 74]. Die dabei entstehenden apoptotische Körperchen werden schließlich von Phagozyten aufgenommen und verwertet [45]. Im Gegensatz zur Nekrose bleibt die Plasmamembran hier lange intakt [74]. Bei der Inkubation von SW-872 Liposarkomzellen mit dem Designer-HDP [D]-K3H3L9 kam es in vitro kaum zu apoptotischen Prozessen. Die Tatsache, dass während der FACS-Analyse unter den Peptid-behandelten Zellen sowie unter den Kontrollzellen eine geringe Menge apoptotischer Zellen nachzuweisen war (Abb. 12 + 13B), ist höchstwahrscheinlich dem enormen Stress zuzuschreiben, dem die Zellen im Versuchsverlauf ausgesetzt waren und der auch zur Zunahme der Anzahl toter Zellen in der Kontrolle führte. Dieser exogene Stress kann ebenfalls zur Apoptose führen [45, 74]. Trotz der Behandlung mit dem hochaggressiven Peptid kam es aber in der Behandlungsgruppe sogar zu einer teils hochsignifikanten (p<0,01) Reduktion des Anteils apoptotischer Zellen 99 (Abb. 13B). Dieser Befund macht die Apoptose nach Peptidinkubation als vornehmlichen Wirkmechanismus unwahrscheinlich. Auch in vivo konnten im Bereich des Peptidinjektionsareals kaum apoptotische Zellen nachgewiesen werden (Abb. 27). Bei der Autophagie als ein weiteres, potentielles Zelltodprogramm handelt es sich um eine Art Notfallprogramm. Dabei verarbeiten hungernde Zellen ihre eigenen Organellen zur Energiegewinnung. Bei weiterem Ausbleiben der Energiezufuhr bzw. von Wachstumsfaktoren kommt es schließlich zum Tod der Zelle [74]. Morphologisch sind charakteristischen, Zellen im Prozess membranumhüllten der Autophagie aufgrund ihrer Autophagosomen, welche mit zytoplasmatischen Partikeln und angedauten Organellen gefüllt sind, leicht zu erkennen [74, 197]. In dieser Studie wurden Autophagosomen jedoch weder in vitro (Abb. 14) noch in vivo (Abb. 27) gefunden. Somit konnte die Autophagie allein aufgrund ihrer morphologischen Kriterien als möglicher Peptid- Wirkmechanismus ausgeschlossen werden. Die Nekrose unterscheidet sich in mehreren Aspekten grundsätzlich von den alternativen Zelltodprogrammen der Apoptose bzw. der Autophagie. Bei der Nekrose handelt es sich um eine vornehmlich unprogrammierte Form des Zelltodes, die klassischerweise durch akute ischämische Minderversorgung mit folglichem ATP-Mangel, aber auch durch unphysiologische Zustände wie z.B. mechanische Kraft, Hyperthermie oder membranaktive Toxine, etwa Host Defense Peptide, ausgelöst wird [74, 94, 109, 138]. Zu den zentralen morphologischen Kennzeichen der Nekrose gehören die Schwellung der Zelle und deren Organellen wie auch die Ruptur der Zellmembran [74, 107]. Genau diese morphologischen Charakteristika konnten auch in der vorliegenden Studie nach der Therapie der SW-872 Liposarkomzellen mit [D]-K3H3L9 in vitro und in vivo (Abb. 14 + 27) nachgewiesen werden und bestätigten damit die Nekrose als primären onkolytischen Wirkmechanismus. Wie oben erwähnt gilt die Nekrose als vornehmlich unprogrammierte Form des Zelltodes. In jüngster Zeit änderte sich aber dieses Verständnis und so gibt es zunehmende Anzeichen dafür, dass der Nekrose-Prozess regulierter abläuft als früher angenommen [45, 68, 74, 194]. Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass Nekrose auch durch die Aktivierung ausgewählter Oberflächenrezeptoren wie z.B. von Toll-like Rezeptoren ausgelöst werden kann [104, 194]. Auch in Weichgewebssarkomen konnten bereits entsprechende Mechanismen 100 nachgewiesen werden. So konnte in murinen L929 Fibrosarkomzellen durch synthetische dsRNA die Nekrose über den Toll-like Rezeptor 3 induziert werden [80]. Es ist daher in zukünftigen Studien zu hinterfragen, inwieweit auch bei der Peptid-induzierten Nekrose der SW-872 Liposarkomzellen solche Rezeptoraktivierungen eine Rolle gespielt haben könnten. Sollten entsprechende HDP-Targets identifiziert werden, so könnte das HDP-Design entsprechend daraufhin abgestimmt werden, um die aktuell noch mangelhafte Selektivität zu verbessern. Denkbar wäre hier z.B. eine Kopplung von HDPs an homing domains oder Antikörper, um somit gezielt an solche HDP-Targets zu binden [106, 140]. Nachdem nun die Nekrose als wahrscheinlichster onkolytischer Wirkmechanismus des Designer-HDPs [D]-K3H3L9 gegenüber den SW-872 Liposarkomzellen identifiziert wurde, stellte sich folglich die Frage nach den exakten Abläufen, die zu dieser Art des Zelltodes führten. Mittels der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie konnte die stufenweise Zerstörung der SW-872 Liposarkomzelle nach Inkubation mit der Letaldosis von [D]-K3H3L9 studiert werden (Abb. 14). Wie zuvor schon von onkolytischen Peptiden ähnlicher Bauart berichtet [137], lagerte sich das Peptid auch hier anfangs an der äußeren Zellmembran an. Bindungspartner könnten hier anionische Membranbestandteile wie Phosphatidylserin sein so wie es beim strukturell ähnlichen [D]-K6L9 der Fall war [137]. Im Gegensatz zu physiologischen Zellen ist nämlich der Anteil an PS in der Zellmembran von malignen Zellen typischerweise um das 3-fache auf 3 % - 9 % erhöht [40, 43, 190191, 209]. Als typisches Zeichen der Zellnekrose war in der vorliegenden Arbeit nach einer Minute die Zelle bereits sichtlich geschwollen. Nach einer Stunde schließlich war auch hier die Plasmamembran aufgelöst und es verblieben lediglich die adhärenten Zellkerne (Abb. 14). Wie oben beschrieben (siehe 1.2.4.) gibt es prinzipiell drei Wege, auf denen das HDP die Membran auflösen und somit die Nekrose einleiten kann (Abb. 7) [140]: Nekrose nach dem „Carpet-Model“ [132, 150], dem „Toroidal-Pores-Model“ [103, 113] oder gemäß dem „Barrel-Stave-Model“ [48]. Das „Carpet-Model“ findet sich vornehmlich bei HDPs, die hochselektiv gegenüber Tumorzellen sind [140]. In der Studie von Makovitzki et al. könnte daher das Peptid [D]-K3H3L9 die 22RV1 Prostatakarzinomzellen nach dem „Carpet-Model“ abtöten. Im Gegensatz dazu war das gleiche Peptid in dieser Arbeit aber kaum selektiv. Daher könnte hier weniger ein Mechanismus nach dem „Carpet-Model“, sondern vielmehr der Zelltod nach dem „Toroidal-Pores-Model“ oder dem „Barrel-Stave-Model“ in Frage 101 kommen. Für das „Toroidal-Pores-Model“ spricht die in der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie nach einer Minute sichtbare typische Bindung der HDPs an der Oberfläche der Plasmamembran. Für das „Barrel-Stave-Model“ spricht die Tatsache, dass sich dieser Mechanismus primär bei HDPs nachweisen lässt, welche nicht selektiv gegenüber Tumorzellen sind, sondern vielmehr an alle Arten von Zellmembranen binden [48, 140]. Diese Situation ist auch beim vergleichsweise unselektiven [D]-K3H3L9 gegenüber den SW-872 Liposarkomzellen gegeben. Beim „Barrel-Stave-Model“ muss zudem vorausgesetzt sein, dass die HDPs in ihrer Länge die Plasmamembran überspannen können, um eine transmembrane HDP-Pore zu bilden. Hierfür sind je nach Peptid-Sekundärstruktur im Falle von α-Helices mindestens 20 Aminosäurereste nötig und im Falle von β-Faltblättern mindestens 8 Aminosäurereste [73]. Welche exakte Sekundärstruktur [D]-K3H3L9 annimmt und ob damit die 15 Aminosäurereste dieses HDPs genügen, um eine transmembrane Pore zu bilden, ist aber aufgrund der Mischung von D- und L-Aminosäuren in diesem Peptid nur schwer zu beurteilen. Um letztendlich zu klären, welches genaue Modell hinter dem nekrotischen Wirkmechanismus von [D]-K3H3L9 gegenüber der SW-872 Liposarkomzellen steckt, sind weiterführende Studien nötig. Dabei müssen sowohl die Sekundärstruktur und die Länge von [D]-K3H3L9 untersucht werden, als auch an Membranstudien die Komposition der membranüberspannenden Pore analysiert werden, da sich das „Barrel-Stave-Model“ und das „Toroidal-Pores-Model“ insbesondere im Porenaufbau voneinander unterscheiden [73]. Des Weiteren gilt es, die exakten Bindungspartner von [D]-K3H3L9 auf der Oberfläche der Zellmembran zu identifizieren. Insgesamt zeigte sich aber, dass der onkolytische Wirkmechanismus des Peptides [D]-K3H3L9 nicht einfach von einer Krebsart auf die andere übertragbar war, sondern dass es berechtigte Gründe für die Annahme gab, dass sich das gleiche Peptid in seinem nekrotischen Wirkmechanismus gegenüber den SW-872 Liposarkomzellen von der Aktivität gegenüber den 22RV1 Prostatakarzinomzellen unterscheiden würde. Zuletzt soll noch auf die Frage der Resistenzentwicklung von Tumorzellen gegenüber onkolytischen Host Defense Peptiden eingegangen werden. Denn diese Problematik spielt bei der aktuellen chemotherapeutischen Behandlung von Weichgewebssarkomen neben den teils gravierenden Nebenwirkungen inzwischen eine wichtige Rolle. So können viele Chemotherapeutika wie z.B. Alkylantien oder Antimetabolite erst aktiv werden, wenn sie erfolgreich in die 102 Zielzelle eingedrungen sind. Dies ist jedoch mit entscheidenden Nachteilen hinsichtlich der Resistenzentwicklung verbunden. So kann die Zielzelle Resistenzen gegenüber solchen Chemotherapeutika entwickeln, indem sie diese z.B. mit Hilfe von multi-drug-resistant-proteins wieder aus dem Zytoplasma pumpt [56]. Diese Resistenzproblematik ist sicherlich auch mit dafür verantwortlich, dass die Ansprechrate von Weichgewebssarkomen gegenüber den aktuellen Chemotherapeutika so stark eingeschränkt ist [32, 69, 117, 134, 159]. Im Gegensatz dazu dürfte es für Tumorzellen vergleichsweise schwierig sein, entsprechende Resistenzmechanismen gegenüber HDPs zu entwickeln. Hierfür verantwortlich ist zum einen die Tatsache, dass das in dieser Arbeit vorgestellte Peptid [D]-K3H3L9 primär membranaktiv ist und nicht in die Zelle gelangen muss, um seine onkolytische Wirkung zu entfalten. Folglich sind die bei Chemotherapeutika hoch-effektiven Abwehrmechanismen wie z.B. der Einbau von multi-drug-resistant-proteins hier unwirksam. Lincke et al. untersuchten z.B. die onkolytische Wirksamkeit des HDPs Magainin 2 gegenüber unbehandelten BRO Melanomzellen und BRO Melanomzellen, welche zuvor mit dem MDR1-Gen transfiziert wurden, das für den multiple-drug-resistance-transporter-1 codiert [101]. Dabei stellte sich heraus, dass sich die beiden Zellen hinsichtlich des IC50Wertes nicht unterschieden, was die Wirkungslosigkeit des multiple-drugresistance-transporter-1 gegenüber HDPs bestätigte. Auch in vivo zeigten erste Langzeitstudien, dass auch längere Zeit nach der onkolytischen HDP-Therapie keine resistenten Tumorzellen in klinisch relevantem Ausmaß auftraten, welche ansonsten ein Tumorrezidiv verursacht hätten. So berichteten Papo et al., dass es selbst 3 Monate nach Therapieende zu keinerlei Tumorwachstum mehr kam [137]. Grundsätzlich deuten diese Ergebnisse damit erneut auf die potentielle Überlegenheit der onkolytischen Host Defense Peptide gegenüber den aktuellen Chemotherapeutika hin. 103 6. ZUSAMMENFASSUNG Weichgewebssarkome umfassen eine heterogene Gruppe seltener und hoch aggressiver maligner Tumoren, die vorwiegend aus dem embryonalen Mesoderm entspringen [32, 51, 76]. Aktuelle Therapieoptionen sind limitiert. Vor allem große Tumorvolumina, ausgedehnte Metastasierungen, die Nähe zu vitalen Strukturen sowie hohe Rezidivraten schränken die therapeutischen Möglichkeiten insbesondere bei den mehrheitlich vorkommenden und hochaggressiven G3Sarkomen stark ein [29, 32, 51, 76, 82, 91, 159]. Aufgrund mangelnder Effektivität und teils gravierender Nebenwirkungen spielt die systemische Chemotherapie aber aktuell eine eher untergeordnete, experimentelle Rolle und ist klinischen Studien vorbehalten [32, 64, 77, 92, 161]. Es ist bislang umstritten, ob Chemotherapeutika überhaupt einen Vorteil für das Gesamtüberleben oder das krankheitsfreie Überleben bringen [57, 89, 92, 159]. Angesichts solcher Herausforderungen ist ein wirksamerer und zugleich schonenderer Therapieansatz für Weichgewebssarkome dringend nötig. Host Defense Peptide (HDPs) sind Peptid-Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems und in der Tier- und Pflanzenwelt weit verbreitet [19, 59, 177, 208]. Dabei handelt es sich um amphipathische, meist kationische Peptide mit einer Länge von lediglich 5 - 40 Aminosäureresten [73]. HDPs zeichnen sich durch ein vielseitiges Wirkungsspektrum aus. Neben der antimikrobiellen und immunmodulatorischen Aktivität ist in jüngster Zeit das onkolytische Potential einzelner HDPs Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen [3, 59, 73, 140, 177]. Es stellte sich daher die Frage, inwieweit onkolytische HDPs auch eine Rolle in einer zukünftigen Sarkomtherapie spielen könnten. Ziel meiner in vitro und in vivo Studie war es, zu untersuchen, ob und auf welche Weise synthetische Designer-HDPs gegen das Liposarkom als häufigstes Weichgewebssarkom onkolytisch wirksam sind. Es zeigte sich, dass ein entsprechendes synthetisches Designer-HDP [D]-K3H3L9 in vitro hochpotente onkolytische Eigenschaften gegenüber SW-872 Liposarkomzellen besaß. So konnte ich im BrdU- bzw. MTT-Assay eine hochsignifikante (p<0,01) Reduktion der Zellproliferation bzw. des Zell- metabolismus der Sarkomzellen nachweisen. Verglichen mit aktuellen klinischen „Gold-Standard“-Chemotherapeutika (Doxorubicin, Vincristin, Methotrexat, Ifosfamid) erwies sich das Peptid als vergleichbar antiproliferativ bzw. als stärker 104 antimetabolisch wirksam. Im TUNEL-Assay zeigte sich eine starke genotoxische Wirksamkeit, so dass der antimetabolische Effekt nicht nur auf ein bloßes Sistieren des oxidativen Stoffwechsels zurückzuführen war, sondern vielmehr auf schwere genotoxische Schädigungen der Tumorzellen mit DNA-Fragmentierung. Mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie konnte ich in einem eigens für diesen Zweck entwickelten Versuchsaufbau die Lokalisation Antikörper-markierter HDPs an der Zellmembran im zeitlichen Verlauf beobachten. In Kombination mit den Ergebnissen der FACS-Analyse ließen sich daraus Rückschlüsse auf den onkolytischen Wirkmechanismus ableiten. Dabei stellte sich heraus, dass [D]-K3H3L9 über einen membranolytischen Mechanismus die Nekrose der Tumorzellen in vitro einleitete. Diese potente onkolytische Aktivität konnte ich auch in vivo auf ein Modell an der athymischen Nacktmaus (Foxn1nu/nu) übertragen. So war nach intratumoraler Peptidtherapie das durchschnittliche Tumorvolumen in der Behandlungsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe hochsignifikant reduziert. Nach Versuchsende mit neun Peptidinjektionen (Einzeldosis: 8,5 mg/kg) über einen Zeitraum von drei Wochen betrug das Tumorvolumen in der Therapiegruppe lediglich 13,1 % des Tumorvolumens der Kontrollgruppe. Makroskopisch konnte in 43 % volle Remission und in weiteren 43 % Teilremission verzeichnet werden. Das Tumorgewicht war in der Behandlungsgruppe signifikant um 88 % reduziert. Histologische und immunhistochemische Analysen zeigten in der Behandlungsgruppe eine hochsignifikante Verminderung der Proliferationsrate (-87 %), eine Reduktion der Mitoserate (-39 %), eine signifikante (p<0,05) Reduktion der Gefäßdichte (-52 %) sowie eine Vergrößerung der nekrotischen Fläche (+100 %). Die morphologische Analyse mittels Semidünnschnittverfahren bestätigte auch in vivo die Zellnekrose als wahrscheinlichsten onkolytischen Wirkmechanismus. Zusammenfassend konnte ich in meiner Dissertation darstellen, dass das Designer-HDP [D]-K3H3L9 gegenüber den SW-872 Liposarkomzellen in vitro und in vivo hochpotente onkolytische Eigenschaften besaß und die Zellen über einen membranolytischen Mechanismus via Zellnekrose abtötete. Im Rahmen weiterführender Studien wäre neben einer systemischen HDPApplikation sicherlich noch interessant, die genauen Unterschiede im Zellmembranaufbau maligner und benigner Zellen herauszuarbeiten sowie die exakten HDP-Bindungspartner zu identifizieren. 105 Dadurch könnte in Zukunft die Selektivität der HDPs durch ein entsprechend auf maligne Membranbestandteile und HDP-Targets abgestimmtes Peptid-Design weiter verbessert werden. Insgesamt lassen diese Ergebnisse aber hoffen, dass die neue Substanzklasse der onkolytischen Designer-HDPs in einer zukünftigen WeichgewebssarkomTherapie eine bedeutende Rolle als hochpotente und zugleich schonende Onkolytika einnehmen könnten. Die Ergebnisse dieser Dissertation wurden im International Journal of Cancer (Impact Factor: 4,926) veröffentlicht [179], auf diversen Fachkongressen präsentiert (siehe Lebenslauf) und auf dem 1. Annual Meeting des European Plastic Surgery Research Council (EPSRC) mit dem Preis des besten Vortrages ausgezeichnet. 106 7. LITERATUR [1] The Antimicrobial Peptide Database - APD (2012). (Zugriff vom 16.02.2012).http://aps.unmc.edu/AP/database/mysql.php [2] Al-Benna, S., Schubert, C., Steinau, H. U., Steinstraesser, L. (2009). Brachial neuropathy 22 years after radiation therapy for fibrosarcoma: a case report. Cases J 2, 6838 [3] Al-Benna, S., Shai, Y., Jacobsen, F., Steinstraesser, L. (2011). Oncolytic activities of host defense peptides. Int J Mol Sci 12, 8027-8051 [4] Alektiar, K. M., Brennan, M. F., Healey, J. H., Singer, S. (2008). Impact of intensity-modulated radiation therapy on local control in primary soft-tissue sarcoma of the extremity. J Clin Oncol 26, 3440-3444 [5] Alektiar, K. M., Velasco, J., Zelefsky, M. J., Woodruff, J. M., Lewis, J. J., Brennan, M. F. (2000). Adjuvant radiotherapy for margin-positive high-grade soft tissue sarcoma of the extremity. Int J Radiat Oncol Biol Phys 48, 10511058 [6] Baker, M. A., Maloy, W. L., Zasloff, M., Jacob, L. S. (1993). Anticancer efficacy of Magainin2 and analogue peptides. Cancer Res 53, 3052-3057 [7] Befus, A. D., Mowat, C., Gilchrist, M., Hu, J., Solomon, S., Bateman, A. (1999). Neutrophil defensins induce histamine secretion from mast cells: mechanisms of action. J Immunol 163, 947-953 [8] Benkirane, N., Friede, M., Guichard, G., Briand, J. P., Van Regenmortel, M. H., Muller, S. (1993). Antigenicity and immunogenicity of modified synthetic peptides containing D-amino acid residues. Antibodies to a D-enantiomer do recognize the parent L-hexapeptide and reciprocally. J Biol Chem 268, 26279-26285 [9] Billingsley, K. G., Burt, M. E., Jara, E., Ginsberg, R. J., Woodruff, J. M., Leung, D. H., Brennan, M. F. (1999). Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival. Ann Surg 229, 602-610; discussion 610-602 [10] Bowdish, D. M., Davidson, D. J., Hancock, R. E. (2006). Immunomodulatory properties of defensins and cathelicidins. Curr Top Microbiol Immunol 306, 27-66 [11] Bowdish, D. M., Davidson, D. J., Lau, Y. E., Lee, K., Scott, M. G., Hancock, R. E. (2005). Impact of LL-37 on anti-infective immunity. J Leukoc Biol 77, 451-459 [12] Braff, M. H., Bardan, A., Nizet, V., Gallo, R. L. (2005). Cutaneous defense mechanisms by antimicrobial peptides. J Invest Dermatol 125, 9-13 107 [13] Braff, M. H., Hawkins, M. A., Di Nardo, A., Lopez-Garcia, B., Howell, M. D., Wong, C., Lin, K., Streib, J. E., Dorschner, R., Leung, D. Y., Gallo, R. L. (2005). Structure-function relationships among human cathelicidin peptides: dissociation of antimicrobial properties from host immunostimulatory activities. J Immunol 174, 4271-4278 [14] Braff, M. H., Zaiou, M., Fierer, J., Nizet, V., Gallo, R. L. (2005). Keratinocyte production of cathelicidin provides direct activity against bacterial skin pathogens. Infect Immun 73, 6771-6781 [15] Brogden, K. A. (2005). Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol 3, 238-250 [16] Brown, K. L., Hancock, R. E. (2006). Cationic host defense (antimicrobial) peptides. Curr Opin Immunol 18, 24-30 [17] Bujko, K., Suit, H. D., Springfield, D. S., Convery, K. (1993). Wound healing after preoperative radiation for sarcoma of soft tissues. Surg Gynecol Obstet 176, 124-134 [18] Burdick, M. D., Harris, A., Reid, C. J., Iwamura, T., Hollingsworth, M. A. (1997). Oligosaccharides expressed on MUC1 produced by pancreatic and colon tumor cell lines. J Biol Chem 272, 24198-24202 [19] Cannon, M. (1987). Antimicrobial peptides. A family of wound healers. Nature 328, 478 [20] Canter, R. J., Martinez, S. R., Tamurian, R. M., Wilton, M., Li, C. S., Ryu, J., Mak, W., Monsky, W. L., Borys, D. (2010). Radiographic and histologic response to neoadjuvant radiotherapy in patients with soft tissue sarcoma. Ann Surg Oncol 17, 2578-2584 [21] Cappelli, G., Paladini, S., D'Agata, A. (1999). [Tumor markers in the diagnosis of pancreatic cancer]. Tumori 85, S19-21 [22] Chan, S. C., Hui, L., Chen, H. M. (1998). Enhancement of the cytolytic effect of anti-bacterial cecropin by the microvilli of cancer cells. Anticancer Res 18, 4467-4474 [23] Chen, H. M., Wang, W., Smith, D., Chan, S. C. (1997). Effects of the antibacterial peptide cecropin B and its analogs, cecropins B-1 and B-2, on liposomes, bacteria, and cancer cells. Biochim Biophys Acta 1336, 171-179 [24] Chen, Y., Xu, X., Hong, S., Chen, J., Liu, N., Underhill, C. B., Creswell, K., Zhang, L. (2001). RGD-Tachyplesin inhibits tumor growth. Cancer Res 61, 2434-2438 [25] Chromek, M., Slamova, Z., Bergman, P., Kovacs, L., Podracka, L., Ehren, I., Hokfelt, T., Gudmundsson, G. H., Gallo, R. L., Agerberth, B., Brauner, A. (2006). The antimicrobial peptide cathelicidin protects the urinary tract against invasive bacterial infection. Nat Med 12, 636-641 [26] Clark, M. A., Fisher, C., Judson, I., Thomas, J. M. (2005). Soft-tissue sarcomas in adults. N Engl J Med 353, 701-711 108 [27] Clarkson, P., Ferguson, P. C. (2004). Management of soft tissue sarcomas of the extremities. Expert Rev Anticancer Ther 4, 237-246 [28] Coffelt, S. B., Marini, F. C., Watson, K., Zwezdaryk, K. J., Dembinski, J. L., LaMarca, H. L., Tomchuck, S. L., Honer zu Bentrup, K., Danka, E. S., Henkle, S. L., Scandurro, A. B. (2009). The pro-inflammatory peptide LL-37 promotes ovarian tumor progression through recruitment of multipotent mesenchymal stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 3806-3811 [29] Coindre, J. M., Terrier, P., Bui, N. B., Bonichon, F., Collin, F., Le Doussal, V., Mandard, A. M., Vilain, M. O., Jacquemier, J., Duplay, H., Sastre, X., Barlier, C., Henry-Amar, M., Mace-Lesech, J., Contesso, G. (1996). Prognostic factors in adult patients with locally controlled soft tissue sarcoma. A study of 546 patients from the French Federation of Cancer Centers Sarcoma Group. J Clin Oncol 14, 869-877 [30] Coindre, J. M., Terrier, P., Guillou, L., Le Doussal, V., Collin, F., Ranchere, D., Sastre, X., Vilain, M. O., Bonichon, F., N'Guyen Bui, B. (2001). Predictive value of grade for metastasis development in the main histologic types of adult soft tissue sarcomas: a study of 1240 patients from the French Federation of Cancer Centers Sarcoma Group. Cancer 91, 19141926 [31] Coindre, J. M., Trojani, M., Contesso, G., David, M., Rouesse, J., Bui, N. B., Bodaert, A., De Mascarel, I., De Mascarel, A., Goussot, J. F. (1986). Reproducibility of a histopathologic grading system for adult soft tissue sarcoma. Cancer 58, 306-309 [32] Cormier, J. N., Pollock, R. E. (2004). Soft tissue sarcomas. CA Cancer J Clin 54, 94-109 [33] Costa, J. (1990). The grading and staging of soft tissue sarcomas. in Fletcher, C. D. M., McKee, P. H. (Hrsg.). Pathobiology of Soft Tissue Tumors. Churchill Livingstone, Edinburgh, 221-238 [34] Cruciani, R. A., Barker, J. L., Zasloff, M., Chen, H. C., Colamonici, O. (1991). Antibiotic magainins exert cytolytic activity against transformed cell lines through channel formation. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 3792-3796 [35] Daigeler, A., Lehnhardt, M., Khadra, A., Hauser, J., Steinstraesser, L., Langer, S., Goertz, O., Steinau, H. U. (2009). Proximal major limb amputations--a retrospective analysis of 45 oncological cases. World J Surg Oncol 7, 15 [36] Daigeler, A., Lehnhardt, M., Hauser, J., Steinstraesser, L., Steinau, H.U. (2009). Weichgewebssarkome des Rumpfes: Chirurgische Therapie. Der Onkologe 15, 364-373 [37] Davidson, D. J., Currie, A. J., Reid, G. S., Bowdish, D. M., MacDonald, K. L., Ma, R. C., Hancock, R. E., Speert, D. P. (2004). The cationic antimicrobial peptide LL-37 modulates dendritic cell differentiation and dendritic cell-induced T cell polarization. J Immunol 172, 1146-1156 109 [38] De Silva, C. M., Reid, R. (2003). Gastrointestinal stromal tumors (GIST): Ckit mutations, CD117 expression, differential diagnosis and targeted cancer therapy with Imatinib. Pathol Oncol Res 9, 13-19 [39] Deans, K. J., Haley, M., Natanson, C., Eichacker, P. Q., Minneci, P. C. (2005). Novel therapies for sepsis: a review. J Trauma 58, 867-874 [40] Dennison, S. R., Whittaker, M., Harris, F., Phoenix, D. A. (2006). Anticancer alpha-helical peptides and structure/function relationships underpinning their interactions with tumour cell membranes. Curr Protein Pept Sci 7, 487499 [41] De Vita, V. T., Hellman, S., Rosenberg, S. A. (2001). Cancer: Principles and Practice of Oncology. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia [42] Dings, R. P., Yokoyama, Y., Ramakrishnan, S., Griffioen, A. W., Mayo, K. H. (2003). The designed angiostatic peptide anginex synergistically improves chemotherapy and antiangiogenesis therapy with angiostatin. Cancer Res 63, 382-385 [43] Dobrzynska, I., Szachowicz-Petelska, B., Sulkowski, S., Figaszewski, Z. (2005). Changes in electric charge and phospholipids composition in human colorectal cancer cells. Mol Cell Biochem 276, 113-119 [44] Dorschner, R. A., Pestonjamasp, V. K., Tamakuwala, S., Ohtake, T., Rudisill, J., Nizet, V., Agerberth, B., Gudmundsson, G. H., Gallo, R. L. (2001). Cutaneous injury induces the release of cathelicidin anti-microbial peptides active against group A Streptococcus. J Invest Dermatol 117, 9197 [45] Duprez, L., Wirawan, E., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. (2009). Major cell death pathways at a glance. Microbes Infect 11, 1050-1062 [46] Dürr, H. R., Jansson, V. (2004). Operative Therapie von Knochen- und Weichteiltumoren. in Issels, R. (Hrsg.). Manual Knochentumoren und Weichteilsarkome. Tumorzentrum München und W. Zuckschwerdt Verlag, München, 37-57 [47] Durr, U. H., Sudheendra, U. S., Ramamoorthy, A. (2006). LL-37, the only human member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta 1758, 1408-1425 [48] Ehrenstein, G., Lecar, H. (1977). Electrically gated ionic channels in lipid bilayers. Q Rev Biophys 10, 1-34 [49] Ernst, R. K., Guina, T., Miller, S. I. (2001). Salmonella typhimurium outer membrane remodeling: role in resistance to host innate immunity. Microbes Infect 3, 1327-1334 [50] Finlay, B. B., Hancock, R. E. (2004). Can innate immunity be enhanced to treat microbial infections? Nat Rev Microbiol 2, 497-504 110 [51] Fletcher, C. D. M., Rydholm, A., Singer, S., Sundaram, M., Coindre, J. M. (2002). Soft tissue tumours: Epidemiology, clinical features, histopathological typing and grading. in Fletcher, C. D. M., Unni, K. K., Mertens, F. (Hrsg.). World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. IARC Press, Lyon, 12-18 [52] Frohm, M., Agerberth, B., Ahangari, G., Stahle-Backdahl, M., Liden, S., Wigzell, H., Gudmundsson, G. H. (1997). The expression of the gene coding for the antibacterial peptide LL-37 is induced in human keratinocytes during inflammatory disorders. J Biol Chem 272, 15258-15263 [53] Fulton, C., Anderson, G. M., Zasloff, M., Bull, R., Quinn, A. G. (1997). Expression of natural peptide antibiotics in human skin. Lancet 350, 17501751 [54] Galluzzi, L., Maiuri, M. C., Vitale, I., Zischka, H., Castedo, M., Zitvogel, L., Kroemer, G. (2007). Cell death modalities: classification and pathophysiological implications. Cell Death Differ 14, 1237-1243 [55] Ganz, T. (2003). Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat Rev Immunol 3, 710-720 [56] Garnier-Suillerot, A., Marbeuf-Gueye, C., Salerno, M., Loetchutinat, C., Fokt, I., Krawczyk, M., Kowalczyk, T., Priebe, W. (2001). Analysis of drug transport kinetics in multidrug-resistant cells: implications for drug action. Curr Med Chem 8, 51-64 [57] Gortzak, E., Azzarelli, A., Buesa, J., Bramwell, V. H., van Coevorden, F., van Geel, A. N., Ezzat, A., Santoro, A., Oosterhuis, J. W., van Glabbeke, M., Kirkpatrick, A., Verweij, J. (2001). A randomised phase II study on neoadjuvant chemotherapy for 'high-risk' adult soft-tissue sarcoma. Eur J Cancer 37, 1096-1103 [58] Green, D. R. (2005). Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell 121, 671-674 [59] Hancock, R. E. (1997). Peptide antibiotics. Lancet 349, 418-422 [60] Hancock, R. E., Diamond, G. (2000). The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol 8, 402-410 [61] Hancock, R. E., Rozek, A. (2002). Role of membranes in the activities of antimicrobial cationic peptides. FEMS Microbiol Lett 206, 143-149 [62] Hardell, L., Sandstrom, A. (1979). Case-control study: soft-tissue sarcomas and exposure to phenoxyacetic acids or chlorophenols. Br J Cancer 39, 711-717 [63] Harder, J., Bartels, J., Christophers, E., Schroder, J. M. (2001). Isolation and characterization of human beta -defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic. J Biol Chem 276, 5707-5713 111 [64] Hartmann, J. T. (2007). Systemic treatment options for patients with refractory adult-type sarcoma beyond anthracyclines. Anticancer Drugs 18, 245-254 [65] Heilborn, J. D., Nilsson, M. F., Jimenez, C. I., Sandstedt, B., Borregaard, N., Tham, E., Sorensen, O. E., Weber, G., Stahle, M. (2005). Antimicrobial protein hCAP18/LL-37 is highly expressed in breast cancer and is a putative growth factor for epithelial cells. Int J Cancer 114, 713-719 [66] Heilborn, J. D., Nilsson, M. F., Kratz, G., Weber, G., Sorensen, O., Borregaard, N., Stahle-Backdahl, M. (2003). The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol 120, 379-389 [67] Helman, L. J., Meltzer, P. (2003). Mechanisms of sarcoma development. Nat Rev Cancer 3, 685-694 [68] Henriquez, M., Armisen, R., Stutzin, A., Quest, A. F. (2008). Cell death by necrosis, a regulated way to go. Curr Mol Med 8, 187-206 [69] Henshaw, R. M., Priebat, D. A., Perry, D. J., Shmookler, B. M., Malawer, M. M. (2001). Survival after induction chemotherapy and surgical resection for high-grade soft tissue sarcoma. Is radiation necessary? Ann Surg Oncol 8, 484-495 [70] Hiratsuka, T., Nakazato, M., Date, Y., Ashitani, J., Minematsu, T., Chino, N., Matsukura, S. (1998). Identification of human beta-defensin-2 in respiratory tract and plasma and its increase in bacterial pneumonia. Biochem Biophys Res Commun 249, 943-947 [71] Hirota, S., Isozaki, K., Moriyama, Y., Hashimoto, K., Nishida, T., Ishiguro, S., Kawano, K., Hanada, M., Kurata, A., Takeda, M., Muhammad Tunio, G., Matsuzawa, Y., Kanakura, Y., Shinomura, Y., Kitamura, Y. (1998). Gain-offunction mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science 279, 577-580 [72] Hisada, M., Garber, J. E., Fung, C. Y., Fraumeni, J. F., Jr., Li, F. P. (1998). Multiple primary cancers in families with Li-Fraumeni syndrome. J Natl Cancer Inst 90, 606-611 [73] Hoskin, D. W., Ramamoorthy, A. (2008). Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta 1778, 357-375 [74] Hotchkiss, R. S., Strasser, A., McDunn, J. E., Swanson, P. E. (2009). Cell death. N Engl J Med 361, 1570-1583 [75] Hui, L., Leung, K., Chen, H. M. (2002). The combined effects of antibacterial peptide cecropin A and anti-cancer agents on leukemia cells. Anticancer Res 22, 2811-2816 [76] Issels, R., Lindner, L. H., Licht, T., Röper, B., Nathrath, M., Sauer, H. (2004). Weichteilsarkome. in Issels, R. (Hrsg.). Manual Knochentumoren und Weichteilsarkome. Tumorzentrum München und W. Zuckschwerdt Verlag, München, 92-107 112 [77] Issels, R., Lindner, L. H., Lutz, L., Salat, C., Sauer, H. (2004). Chemotherapie. in Issels, R. (Hrsg.). Manual Knochentumoren und Weichteilsarkome. Tumorzentrum München und W. Zuckschwerdt Verlag, München, 73-78 [78] Jani, A. B., Hellman, S. (2003). Early prostate cancer: clinical decisionmaking. Lancet 361, 1045-1053 [79] Javid, B., MacAry, P. A., Lehner, P. J. (2007). Structure and function: heat shock proteins and adaptive immunity. J Immunol 179, 2035-2040 [80] Kalai, M., Van Loo, G., Vanden Berghe, T., Meeus, A., Burm, W., Saelens, X., Vandenabeele, P. (2002). Tipping the balance between necrosis and apoptosis in human and murine cells treated with interferon and dsRNA. Cell Death Differ 9, 981-994 [81] Karakousis, C. P., Emrich, L. J., Rao, U., Krishnamsetty, R. M. (1986). Feasibility of limb salvage and survival in soft tissue sarcomas. Cancer 57, 484-491 [82] Karakousis, C. P., Perez, R. P. (1994). Soft tissue sarcomas in adults. CA Cancer J Clin 44, 200-210 [83] Karpeh, M. S., Brennan, M. F., Cance, W. G., Woodruff, J. M., Pollack, D., Casper, E. S., Dudas, M. E., Latres, E., Drobnjak, M., Cordon-Cardo, C. (1995). Altered patterns of retinoblastoma gene product expression in adult soft-tissue sarcomas. Br J Cancer 72, 986-991 [84] King, T. M. (2002). Epidemiology. in Pollock, R. E. (Hrsg.). Atlas of Clinical Oncology - Soft Tissue Sarcomas. BC Decker Inc. , London, 1-10 [85] Klionsky, D. J. (2007). Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 931-937 [86] Koczulla, A. R., Bals, R. (2003). Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential. Drugs 63, 389-406 [87] Kroemer, G., Galluzzi, L., Vandenabeele, P., Abrams, J., Alnemri, E. S., Baehrecke, E. H., Blagosklonny, M. V., El-Deiry, W. S., Golstein, P., Green, D. R., Hengartner, M., Knight, R. A., Kumar, S., Lipton, S. A., Malorni, W., Nunez, G., Peter, M. E., Tschopp, J., Yuan, J., Piacentini, M., Zhivotovsky, B., Melino, G. (2009). Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ 16, 3-11 [88] Kruzelock, R. P., Hansen, M. F. (1995). Molecular genetics and cytogenetics of sarcomas. Hematol Oncol Clin North Am 9, 513-540 [89] Le Cesne, A., Van Glabbeke, M., Woll, P. J., Bramwell, V. H., Casali, P. G., Hoekstra, H. J., Reichardt, P., Hogendoorn, P. C., Hohenberger, P., Blay, J. Y. (2008). The end of adjuvant chemotherapy (adCT) era with doxorubicinbased regimen in resected high-grade soft tissue sarcoma (STS): Pooled analysis of the two STBSG-EORTC phase III clinical trials. . J Clin Oncol 26 (No 15S), 10525 113 [90] Lehmann, J., Retz, M., Sidhu, S. S., Suttmann, H., Sell, M., Paulsen, F., Harder, J., Unteregger, G., Stockle, M. (2006). Antitumor activity of the antimicrobial peptide magainin II against bladder cancer cell lines. Eur Urol 50, 141-147 [91] Lehnhardt, M., Hirche, C., Daigeler, A., Goertz, O., Ring, A., Hirsch, T., Drucke, D., Hauser, J., Steinau, H. U. (2012). Soft tissue sarcoma of the upper extremities. Analysis of factors relevant for prognosis in 160 patients. Chirurg 83, 143-152 [92] Lehnhardt, M., Schmitt, T., Bischof, M., Daigeler, A., Egerer, G. (2011). Current state of neoadjuvant therapy of soft tissue sarcoma. Chirurg 82, 995-1000 [93] Lehrer, R. I., Ganz, T. (1999). Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence. Curr Opin Immunol 11, 23-27 [94] Leist, M., Single, B., Castoldi, A. F., Kuhnle, S., Nicotera, P. (1997). Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J Exp Med 185, 1481-1486 [95] Lejeune, F. J., Lienard, D., Matter, M., Ruegg, C. (2006). Efficiency of recombinant human TNF in human cancer therapy. Cancer Immun 6, 6 [96] Lejeune, F. J., Pujol, N., Lienard, D., Mosimann, F., Raffoul, W., Genton, A., Guillou, L., Landry, M., Chassot, P. G., Chiolero, R., Bischof-Delaloye, A., Leyvraz, S., Mirimanoff, R. O., Bejkos, D., Leyvraz, P. F. (2000). Limb salvage by neoadjuvant isolated perfusion with TNFalpha and melphalan for non-resectable soft tissue sarcoma of the extremities. Eur J Surg Oncol 26, 669-678 [97] Levine, B., Yuan, J. (2005). Autophagy in cell death: an innocent convict? J Clin Invest 115, 2679-2688 [98] Levine, E. A. (1999). Prognostic factors in soft tissue sarcoma. Semin Surg Oncol 17, 23-32 [99] Li, H., Kolluri, S. K., Gu, J., Dawson, M. I., Cao, X., Hobbs, P. D., Lin, B., Chen, G., Lu, J., Lin, F., Xie, Z., Fontana, J. A., Reed, J. C., Zhang, X. (2000). Cytochrome c release and apoptosis induced by mitochondrial targeting of nuclear orphan receptor TR3. Science 289, 1159-1164 [100] Lienard, D., Ewalenko, P., Delmotte, J. J., Renard, N., Lejeune, F. J. (1992). High-dose recombinant tumor necrosis factor alpha in combination with interferon gamma and melphalan in isolation perfusion of the limbs for melanoma and sarcoma. J Clin Oncol 10, 52-60 [101] Lincke, C. R., van der Bliek, A. M., Schuurhuis, G. J., van der Velde-Koerts, T., Smit, J. J., Borst, P. (1990). Multidrug resistance phenotype of human BRO melanoma cells transfected with a wild-type human mdr1 complementary DNA. Cancer Res 50, 1779-1785 114 [102] Lindberg, R. D., Martin, R. G., Romsdahl, M. M., Barkley, H. T., Jr. (1981). Conservative surgery and postoperative radiotherapy in 300 adults with soft-tissue sarcomas. Cancer 47, 2391-2397 [103] Ludtke, S. J., He, K., Heller, W. T., Harroun, T. A., Yang, L., Huang, H. W. (1996). Membrane pores induced by magainin. Biochemistry 35, 1372313728 [104] Ma, Y., Temkin, V., Liu, H., Pope, R. M. (2005). NF-kappaB protects macrophages from lipopolysaccharide-induced cell death: the role of caspase 8 and receptor-interacting protein. J Biol Chem 280, 41827-41834 [105] Mader, J. S., Hoskin, D. W. (2006). Cationic antimicrobial peptides as novel cytotoxic agents for cancer treatment. Expert Opin Investig Drugs 15, 933946 [106] Mai, J. C., Mi, Z., Kim, S. H., Ng, B., Robbins, P. D. (2001). A proapoptotic peptide for the treatment of solid tumors. Cancer Res 61, 7709-7712 [107] Majno, G., Joris, I. (1995). Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol 146, 3-15 [108] Makovitzki, A., Fink, A., Shai, Y. (2009). Suppression of human solid tumor growth in mice by intratumor and systemic inoculation of histidine-rich and pH-dependent host defense-like lytic peptides. Cancer Res 69, 3458-3463 [109] Malhi, H., Gores, G. J., Lemasters, J. J. (2006). Apoptosis and necrosis in the liver: a tale of two deaths? Hepatology 43, S31-44 [110] Mangoni, M. L., Shai, Y. (2011). Short native antimicrobial peptides and engineered ultrashort lipopeptides: similarities and differences in cell specificities and modes of action. Cell Mol Life Sci 68, 2267-2280 [111] Markhede, G., Angervall, L., Stener, B. (1982). A multivariate analysis of the prognosis after surgical treatment of malignant soft-tissue tumors. Cancer 49, 1721-1733 [112] Marsden, V. S., Strasser, A. (2003). Control of apoptosis in the immune system: Bcl-2, BH3-only proteins and more. Annu Rev Immunol 21, 71-105 [113] Matsuzaki, K., Murase, O., Miyajima, K. (1995). Kinetics of pore formation by an antimicrobial peptide, magainin 2, in phospholipid bilayers. Biochemistry 34, 12553-12559 [114] McPhee, J. B., Hancock, R. E. (2005). Function and therapeutic potential of host defence peptides. J Pept Sci 11, 677-687 [115] McPhee, J. B., Scott, M. G., Hancock, R. E. (2005). Design of host defence peptides for antimicrobial and immunity enhancing activities. Comb Chem High Throughput Screen 8, 257-272 115 [116] Mentzel, T., Pedeutour, F. (2002). Pleomorphic liposarcoma. in Fletcher, C. D. M., Unni, K. K., Mertens, F. (Hrsg.). World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. IARC Press, Lyon, 44-45 [117] Meric, F., Hess, K. R., Varma, D. G., Hunt, K. K., Pisters, P. W., Milas, K. M., Patel, S. R., Benjamin, R. S., Plager, C., Papadopoulos, N. E., Burgess, M. A., Pollock, R. E., Feig, B. W. (2002). Radiographic response to neoadjuvant chemotherapy is a predictor of local control and survival in soft tissue sarcomas. Cancer 95, 1120-1126 [118] Mookherjee, N., Hancock, R. E. (2007). Cationic host defence peptides: innate immune regulatory peptides as a novel approach for treating infections. Cell Mol Life Sci 64, 922-933 [119] Moore, K. L., Vidyha, T., Persaud, N. (2007). Embryologie. Urban und Fischer, München, Jena [120] Myhre-Jensen, O., Kaae, S., Madsen, E. H., Sneppen, O. (1983). Histopathological grading in soft-tissue tumours. Relation to survival in 261 surgically treated patients. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand A 91, 145150 [121] Newton, K., Harris, A. W., Bath, M. L., Smith, K. G., Strasser, A. (1998). A dominant interfering mutant of FADD/MORT1 enhances deletion of autoreactive thymocytes and inhibits proliferation of mature T lymphocytes. EMBO J 17, 706-718 [122] Nielsen, G. P., Mandahl, N., Rosenberg, A. E., Sciot, R., Meis-Kindblom, J. M., Kindblom, L. G., Miettinen, M. M., Fanburg-Smith, J. C., Dei Tos, A. P., Pedeutour, F., Antonescu, C., Ladanyi, M., Mentzel, T. (2002). Adipocytic Tumours. in Fletcher, C. D. M., Unni, K. K., Mertens, F. (Hrsg.). World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. IARC Press, Lyon, 19-46 [123] Niyonsaba, F., Iwabuchi, K., Someya, A., Hirata, M., Matsuda, H., Ogawa, H., Nagaoka, I. (2002). A cathelicidin family of human antibacterial peptide LL-37 induces mast cell chemotaxis. Immunology 106, 20-26 [124] Niyonsaba, F., Someya, A., Hirata, M., Ogawa, H., Nagaoka, I. (2001). Evaluation of the effects of peptide antibiotics human beta-defensins-1/-2 and LL-37 on histamine release and prostaglandin D(2) production from mast cells. Eur J Immunol 31, 1066-1075 [125] Niyonsaba, F., Ushio, H., Nagaoka, I., Okumura, K., Ogawa, H. (2005). The human beta-defensins (-1, -2, -3, -4) and cathelicidin LL-37 induce IL-18 secretion through p38 and ERK MAPK activation in primary human keratinocytes. J Immunol 175, 1776-1784 116 [126] Niyonsaba, F., Ushio, H., Nakano, N., Ng, W., Sayama, K., Hashimoto, K., Nagaoka, I., Okumura, K., Ogawa, H. (2007). Antimicrobial peptides human beta-defensins stimulate epidermal keratinocyte migration, proliferation and production of proinflammatory cytokines and chemokines. J Invest Dermatol 127, 594-604 [127] Nizet, V., Ohtake, T., Lauth, X., Trowbridge, J., Rudisill, J., Dorschner, R. A., Pestonjamasp, V., Piraino, J., Huttner, K., Gallo, R. L. (2001). Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature 414, 454-457 [128] Noorda, E. M., Vrouenraets, B. C., Nieweg, O. E., van Coevorden, F., van Slooten, G. W., Kroon, B. B. (2003). Isolated limb perfusion with tumor necrosis factor-alpha and melphalan for patients with unresectable soft tissue sarcoma of the extremities. Cancer 98, 1483-1490 [129] O'Sullivan, B., Davis, A. M., Turcotte, R., Bell, R., Catton, C., Chabot, P., Wunder, J., Kandel, R., Goddard, K., Sadura, A., Pater, J., Zee, B. (2002). Preoperative versus postoperative radiotherapy in soft-tissue sarcoma of the limbs: a randomised trial. Lancet 359, 2235-2241 [130] Ohsaki, Y., Gazdar, A. F., Chen, H. C., Johnson, B. E. (1992). Antitumor activity of magainin analogues against human lung cancer cell lines. Cancer Res 52, 3534-3538 [131] Ong, P. Y., Ohtake, T., Brandt, C., Strickland, I., Boguniewicz, M., Ganz, T., Gallo, R. L., Leung, D. Y. (2002). Endogenous antimicrobial peptides and skin infections in atopic dermatitis. N Engl J Med 347, 1151-1160 [132] Oren, Z., Shai, Y. (1998). Mode of action of linear amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides. Biopolymers 47, 451-463 [133] Osuna, D., de Alava, E. (2009). Molecular pathology of sarcomas. Rev Recent Clin Trials 4, 12-26 [134] Ottaiano, A., De Chiara, A., Fazioli, F., De Rosa, V., Ravo, V., Boccia, V., Botti, G., Petrillo, A., Fiore, F., Mori, S., Mozzillo, N., Iaffaioli, V. R., Apice, G. (2002). Neoadjuvant chemotherapy for intermediate/high-grade soft tissue sarcomas: five-year results with epirubicin and ifosfamide. Anticancer Res 22, 3555-3559 [135] Pan, J. G., Mak, T. W. (2007). Metabolic targeting as an anticancer strategy: dawn of a new era? Sci STKE 2007, pe14 [136] Papo, N., Braunstein, A., Eshhar, Z., Shai, Y. (2004). Suppression of human prostate tumor growth in mice by a cytolytic D-, L-amino Acid Peptide: membrane lysis, increased necrosis, and inhibition of prostatespecific antigen secretion. Cancer Res 64, 5779-5786 [137] Papo, N., Seger, D., Makovitzki, A., Kalchenko, V., Eshhar, Z., Degani, H., Shai, Y. (2006). Inhibition of tumor growth and elimination of multiple metastases in human prostate and breast xenografts by systemic inoculation of a host defense-like lytic peptide. Cancer Res 66, 5371-5378 117 [138] Papo, N., Shahar, M., Eisenbach, L., Shai, Y. (2003). A novel lytic peptide composed of DL-amino acids selectively kills cancer cells in culture and in mice. J Biol Chem 278, 21018-21023 [139] Papo, N., Shai, Y. (2004). Effect of drastic sequence alteration and D-amino acid incorporation on the membrane binding behavior of lytic peptides. Biochemistry 43, 6393-6403 [140] Papo, N., Shai, Y. (2005). Host defense peptides as new weapons in cancer treatment. Cell Mol Life Sci 62, 784-790 [141] Paraskeva, P., Katsaronis, P., Spartalis, E. D., Lazaris, A. C., Gakiopoulou, H., Mallis, P., Tomos, P. (2009). Giant liposarcoma of the back with 4 types of histopathology: a case report. Cases J 2, 9339 [142] Pardo, J., Perez-Galan, P., Gamen, S., Marzo, I., Monleon, I., Kaspar, A. A., Susin, S. A., Kroemer, G., Krensky, A. M., Naval, J., Anel, A. (2001). A role of the mitochondrial apoptosis-inducing factor in granulysin-induced apoptosis. J Immunol 167, 1222-1229 [143] Park, N. G., Lee, S., Oishi, O., Aoyagi, H., Iwanaga, S., Yamashita, S., Ohno, M. (1992). Conformation of tachyplesin I from Tachypleus tridentatus when interacting with lipid matrices. Biochemistry 31, 12241-12247 [144] Peat, B. G., Bell, R. S., Davis, A., O'Sullivan, B., Mahoney, J., Manktelow, R. T., Bowen, V., Catton, C., Fornasier, V. L., Langer, F. (1994). Woundhealing complications after soft-tissue sarcoma surgery. Plast Reconstr Surg 93, 980-987 [145] Penel, N., Grosjean, J., Robin, Y. M., Vanseymortier, L., Clisant, S., Adenis, A. (2008). Frequency of certain established risk factors in soft tissue sarcomas in adults: a prospective descriptive study of 658 cases. Sarcoma 2008, 459386 [146] Peschel, A. (2002). How do bacteria resist human antimicrobial peptides? Trends Microbiol 10, 179-186 [147] Peschel, A., Jack, R. W., Otto, M., Collins, L. V., Staubitz, P., Nicholson, G., Kalbacher, H., Nieuwenhuizen, W. F., Jung, G., Tarkowski, A., van Kessel, K. P., van Strijp, J. A. (2001). Staphylococcus aureus resistance to human defensins and evasion of neutrophil killing via the novel virulence factor MprF is based on modification of membrane lipids with l-lysine. J Exp Med 193, 1067-1076 [148] Peschel, A., Sahl, H. G. (2006). The co-evolution of host cationic antimicrobial peptides and microbial resistance. Nat Rev Microbiol 4, 529536 [149] Pollock, R. E., Karnell, L. H., Menck, H. R., Winchester, D. P. (1996). The National Cancer Data Base report on soft tissue sarcoma. Cancer 78, 22472257 [150] Pouny, Y., Shai, Y. (1992). Interaction of D-amino acid incorporated analogues of pardaxin with membranes. Biochemistry 31, 9482-9490 118 [151] Presant, C. A., Russell, W. O., Alexander, R. W., Fu, Y. S. (1986). Softtissue and bone sarcoma histopathology peer review: the frequency of disagreement in diagnosis and the need for second pathology opinions. The Southeastern Cancer Study Group experience. J Clin Oncol 4, 1658-1661 [152] Pschyrembel - Klinisches Wörterbuch. (2007). Walter de Gruyter, Berlin, 261 [153] Ran, S., Downes, A., Thorpe, P. E. (2002). Increased exposure of anionic phospholipids on the surface of tumor blood vessels. Cancer Res 62, 61326140 [154] Ran, S., Thorpe, P. E. (2002). Phosphatidylserine is a marker of tumor vasculature and a potential target for cancer imaging and therapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 54, 1479-1484 [155] Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. (2010). The heat shock response: life on the verge of death. Mol Cell 40, 253-266 [156] Rote Liste Service GmbH. (2010). Rote Liste 2010. Frankfurt am Main [157] Sadoski, C., Suit, H. D., Rosenberg, A., Mankin, H., Efird, J. (1993). Preoperative radiation, surgical margins, and local control of extremity sarcomas of soft tissues. J Surg Oncol 52, 223-230 [158] Salzet, M. (2002). Antimicrobial peptides are signaling molecules. Trends Immunol 23, 283-284 [159] Sarcoma Meta-analysis Collaboration. (1997). Adjuvant chemotherapy for localised resectable soft-tissue sarcoma of adults: meta-analysis of individual data. Sarcoma Meta-analysis Collaboration. Lancet 350, 16471654 [160] Schauber, J., Dorschner, R. A., Coda, A. B., Buchau, A. S., Liu, P. T., Kiken, D., Helfrich, Y. R., Kang, S., Elalieh, H. Z., Steinmeyer, A., Zugel, U., Bikle, D. D., Modlin, R. L., Gallo, R. L. (2007). Injury enhances TLR2 function and antimicrobial peptide expression through a vitamin Ddependent mechanism. J Clin Invest 117, 803-811 [161] Schlag, P. M., Dominkus, M. (2008). Weichgewebssarkome. in Gnant, M., Schlag, P. M. (Hrsg.). Chirurgische Onkologie - Strategien und Standards für die Praxis. Springer, Wien, New York, 467-480 [162] Schroder, J. M., Harder, J. (2006). Antimicrobial skin peptides and proteins. Cell Mol Life Sci 63, 469-486 [163] Segal, N. H., Pavlidis, P., Antonescu, C. R., Maki, R. G., Noble, W. S., DeSantis, D., Woodruff, J. M., Lewis, J. J., Brennan, M. F., Houghton, A. N., Cordon-Cardo, C. (2003). Classification and subtype prediction of adult soft tissue sarcoma by functional genomics. Am J Pathol 163, 691-700 [164] Sharma, S. V. (1992). Melittin resistance: a counterselection for ras transformation. Oncogene 7, 193-201 119 [165] Singer, S. (1999). New diagnostic modalities in soft tissue sarcoma. Semin Surg Oncol 17, 11-22 [166] Smith, A. H., Pearce, N. E., Fisher, D. O., Giles, H. J., Teague, C. A., Howard, J. K. (1984). Soft tissue sarcoma and exposure to phenoxyherbicides and chlorophenols in New Zealand. J Natl Cancer Inst 73, 1111-1117 [167] Souhami, R., Tobias, J. (2005). Cancer and its Management Blackwell Publishing, Oxford [168] Sramkoski, R. M., Pretlow, T. G., 2nd, Giaconia, J. M., Pretlow, T. P., Schwartz, S., Sy, M. S., Marengo, S. R., Rhim, J. S., Zhang, D., Jacobberger, J. W. (1999). A new human prostate carcinoma cell line, 22Rv1. In Vitro Cell Dev Biol Anim 35, 403-409 [169] Stam, T. C., Swaak, A. J., de Vries, M. R., ten Hagen, T. L., Eggermont, A. M. (2000). Systemic toxicity and cytokine/acute phase protein levels in patients after isolated limb perfusion with tumor necrosis factor-alpha complicated by high leakage. Ann Surg Oncol 7, 268-275 [170] Steinau, H. U., Daigeler, A., Langer, S., Steinstrasser, L., Hauser, J., Goertz, O., Lehnhardt, M. (2010). Limb salvage in malignant tumors. Semin Plast Surg 24, 18-33 [171] Steinau, H. U., Homann, H. H., Drucke, D., Torres, A., Soimaru, D., Vogt, P. (2001). Resection method and functional restoration in soft tissue sarcomas of the extremities. Chirurg 72, 501-513 [172] Steinau, H. U., Steinstrasser, L., Hauser, J., Tilkorn, D., Stricker, I., Daigeler, A. (2012). Soft tissue sarcoma : Resection and plastic reconstruction. Orthopaede 41, 165-176 [173] Steinstraesser, L. (2004). Sepsis--new strategies with host defense peptides? Crit Care Med 32, 2555-2556 [174] Steinstraesser, L., Hauk, J., Al-Benna, S., Langer, S., Ring, A., Kesting, M., Sudhoff, H., Becerikli, M., Kafferlein, H., Jacobsen, F. (2012). Genotoxic and cytotoxic activity of host defense peptides against human soft tissue sarcoma in an in vitro model. Drug Chem Toxicol 35, 96-103 [175] Steinstraesser, L., Hauk, J., Schubert, C., Al-Benna, S., Stricker, I., Hatt, H., Shai, Y., Steinau, H.-U., Jacobsen, F. (2011). Suppression of soft tissue sarcoma growth by a host defense-like lytic Peptide. PLoS One 6, e18321 [176] Steinstraesser, L., Koehler, T., Jacobsen, F., Daigeler, A., Goertz, O., Langer, S., Kesting, M., Steinau, H., Eriksson, E., Hirsch, T. (2008). Host defense peptides in wound healing. Mol Med 14, 528-537 [177] Steinstraesser, L., Kraneburg, U., Jacobsen, F., Al-Benna, S. (2011). Host defense peptides and their antimicrobial-immunomodulatory duality. Immunobiology 216, 322-333 120 [178] Steinstraesser, L., Oezdogan, Y., Wang, S. C., Steinau, H. U. (2004). Host defense peptides in burns. Burns 30, 619-627 [179] Steinstraesser, L., Schubert, C., Hauk, J., Becerikli, M., Stricker, I., Koeller, M., Hatt, H., von Duering, M., Shai, Y., Steinau, H. U., Jacobsen, F. (2011). Oncolytic designer host defense peptide suppresses growth of human liposarcoma. Int J Cancer 128, 2994-3004 [180] Steinstraesser, L., Schubert, C., Jacobsen, F., Al-Benna, S. (2010). Editorial: glycyrrhizin against multi-resistant bacteria? J Leukoc Biol 87, 7-8 [181] Steinstraesser, L., Tack, B. F., Waring, A. J., Hong, T., Boo, L. M., Fan, M. H., Remick, D. I., Su, G. L., Lehrer, R. I., Wang, S. C. (2002). Activity of novispirin G10 against Pseudomonas aeruginosa in vitro and in infected burns. Antimicrob Agents Chemother 46, 1837-1844 [182] Stratton, M. R., Moss, S., Warren, W., Patterson, H., Clark, J., Fisher, C., Fletcher, C. D., Ball, A., Thomas, M., Gusterson, B. A. (1990). Mutation of the p53 gene in human soft tissue sarcomas: association with abnormalities of the RB1 gene. Oncogene 5, 1297-1301 [183] Sun, Y., Peng, Z. L. (2009). Programmed cell death and cancer. Postgrad Med J 85, 134-140 [184] Takeda, K., Akira, S. (2005). Toll-like receptors in innate immunity. Int Immunol 17, 1-14 [185] Tamamura, H., Murakami, T., Horiuchi, S., Sugihara, K., Otaka, A., Takada, W., Ibuka, T., Waki, M., Yamamoto, N., Fujii, N. (1995). Synthesis of protegrin-related peptides and their antibacterial and anti-human immunodeficiency virus activity. Chem Pharm Bull (Tokyo) 43, 853-858 [186] Tannock, I. F., Rotin, D. (1989). Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation. Cancer Res 49, 4373-4384 [187] Thway, K. (2009). Pathology of soft tissue sarcomas. Clin Oncol (R Coll Radiol) 21, 695-705 [188] Trojani, M., Contesso, G., Coindre, J. M., Rouesse, J., Bui, N. B., de Mascarel, A., Goussot, J. F., David, M., Bonichon, F., Lagarde, C. (1984). Soft-tissue sarcomas of adults; study of pathological prognostic variables and definition of a histopathological grading system. Int J Cancer 33, 37-42 [189] Ulfig, N. (2005). Kurzlehrbuch Histologie. Thieme, Stuttgart, New York [190] Utsugi, T., Schroit, A. J., Connor, J., Bucana, C. D., Fidler, I. J. (1991). Elevated expression of phosphatidylserine in the outer membrane leaflet of human tumor cells and recognition by activated human blood monocytes. Cancer Res 51, 3062-3066 [191] Van Blitterswijk, W. J., De Veer, G., Krol, J. H., Emmelot, P. (1982). Comparative lipid analysis of purified plasma membranes and shed extracellular membrane vesicles from normal murine thymocytes and leukemic GRSL cells. Biochim Biophys Acta 688, 495-504 121 [192] Van Glabbeke, M., van Oosterom, A. T., Oosterhuis, J. W., Mouridsen, H., Crowther, D., Somers, R., Verweij, J., Santoro, A., Buesa, J., Tursz, T. (1999). Prognostic factors for the outcome of chemotherapy in advanced soft tissue sarcoma: an analysis of 2,185 patients treated with anthracycline-containing first-line regimens--a European Organization for Research and Treatment of Cancer Soft Tissue and Bone Sarcoma Group Study. J Clin Oncol 17, 150-157 [193] van Unnik, J. A., Coindre, J. M., Contesso, C., Albus-Lutter, C. E., Schiodt, T., Sylvester, R., Thomas, D., Bramwell, V., Mouridsen, H. T. (1993). Grading of soft tissue sarcomas: experience of the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group. Eur J Cancer 29A, 2089-2093 [194] Vanlangenakker, N., Vanden Berghe, T., Krysko, D. V., Festjens, N., Vandenabeele, P. (2008). Molecular mechanisms and pathophysiology of necrotic cell death. Curr Mol Med 8, 207-220 [195] Verkleij, A. J., Zwaal, R. F., Roelofsen, B., Comfurius, P., Kastelijn, D., van Deenen, L. L. (1973). The asymmetric distribution of phospholipids in the human red cell membrane. A combined study using phospholipases and freeze-etch electron microscopy. Biochim Biophys Acta 323, 178-193 [196] Vogelstein, B., Fearon, E. R., Hamilton, S. R., Kern, S. E., Preisinger, A. C., Leppert, M., Nakamura, Y., White, R., Smits, A. M., Bos, J. L. (1988). Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med 319, 525-532 [197] Watanabe, E., Muenzer, J. T., Hawkins, W. G., Davis, C. G., Dixon, D. J., McDunn, J. E., Brackett, D. J., Lerner, M. R., Swanson, P. E., Hotchkiss, R. S. (2009). Sepsis induces extensive autophagic vacuolization in hepatocytes: a clinical and laboratory-based study. Lab Invest 89, 549-561 [198] Weber, G., Chamorro, C. I., Granath, F., Liljegren, A., Zreika, S., Saidak, Z., Sandstedt, B., Rotstein, S., Mentaverri, R., Sanchez, F., Pivarcsi, A., Stahle, M. (2009). Human antimicrobial protein hCAP18/LL-37 promotes a metastatic phenotype in breast cancer. Breast Cancer Res 11, R6 [199] Welch, W. J. (1992). Mammalian stress response: cell physiology, structure/function of stress proteins, and implications for medicine and disease. Physiol Rev 72, 1063-1081 [200] Wexler, L. H., Helman, L. J. (1994). Pediatric soft tissue sarcomas. CA Cancer J Clin 44, 211-247 [201] Wieberdink, J., Benckhuysen, C., Braat, R. P., van Slooten, E. A., Olthuis, G. A. (1982). Dosimetry in isolation perfusion of the limbs by assessment of perfused tissue volume and grading of toxic tissue reactions. Eur J Cancer Clin Oncol 18, 905-910 [202] Williard, W. C., Hajdu, S. I., Casper, E. S., Brennan, M. F. (1992). Comparison of amputation with limb-sparing operations for adult soft tissue sarcoma of the extremity. Ann Surg 215, 269-275 122 [203] Wurster, K. (2004). Definition und Häufigkeit. in Issels, R. (Hrsg.). Manual Knochentumoren und Weichteilsarkome. Tumorzentrum München und W. Zuckschwerdt Verlag, München, 1-2 [204] Yang, D., Biragyn, A., Hoover, D. M., Lubkowski, J., Oppenheim, J. J. (2004). Multiple roles of antimicrobial defensins, cathelicidins, and eosinophil-derived neurotoxin in host defense. Annu Rev Immunol 22, 181215 [205] Yasin, B., Pang, M., Turner, J. S., Cho, Y., Dinh, N. N., Waring, A. J., Lehrer, R. I., Wagar, E. A. (2000). Evaluation of the inactivation of infectious Herpes simplex virus by host-defense peptides. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 19, 187-194 [206] Yoon, W. H., Park, H. D., Lim, K., Hwang, B. D. (1996). Effect of Oglycosylated mucin on invasion and metastasis of HM7 human colon cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 222, 694-699 [207] Yu, J. W., Shi, Y. (2008). FLIP and the death effector domain family. Oncogene 27, 6216-6227 [208] Zasloff, M. (2002). Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395 [209] Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M. (2005). Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell Mol Life Sci 62, 971-988 [210] Zwaal, R. F., Schroit, A. J. (1997). Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells. Blood 89, 1121-1132 123 8. ANHANG DSMZ-Bestätigung über Reinheit und Authentizität der Liposarkomzelllinie SW-872 124 DANKSAGUNGEN Besonders möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Lars Steinsträßer für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe des Labors für Molekulare Onkologie und Wundheilung der Klinik für Plastische Chirurgie unter Leitung von Herrn Prof. Dr. Hans-Ulrich Steinau bedanken. Die individuelle Förderung seiner Doktoranden war und ist ein zentrales Anliegen von Herrn Professor Steinsträßer. Ausgestattet mit großzügigen finanziellen, technischen und personellen Ressourcen konnte ich in diesem Labor meine wissenschaftlichen Ideen frei entfalten und realisieren. Stets nutzte Herr Prof. Steinsträßer auch sein enges wissenschaftliches Netzwerk, um meine Arbeit zu unterstützen. Darüber hinaus gab er mir die Möglichkeit, meine Ergebnisse an Fachkongressen im In- und Ausland zu präsentieren. Ebenso möchte ich Herrn Dr. Frank Jacobsen und Frau Andrea Rittig für ihre stetige Hilfe während meines Forschungsprojektes danken. Ohne das exzellente und kritische Fachwissen von Herrn Dr. Jacobsen und ohne das herausragende Talent von Frau Andrea Rittig, theoretischen Ideen in praktische Versuche umzusetzen, wäre diese Arbeit schlicht nicht möglich gewesen. Dem gesamten Team des Labors für Molekulare Onkologie und Wundheilung danke ich für die äußerst freundliche und hilfsbereite Art. Besonders Frau Jennifer Hauk möchte ich für Ihre Unterstützung während der gesamten Projektarbeit hervorheben. Mein herzlicher Dank gilt auch Herrn Prof. Yechiel Shai vom Department of Biological Chemistry des Weizmann Institute of Science in Rehovot, Israel für die Bereitstellung des Designer Host Defense Peptides [D]-K3H3L9, Herrn Dr. Ingo Stricker für sämtliche Unterstützung rund um die Pathologie, Herrn Prof. Manfred Koeller für die Hilfe bei der FACS-Analyse, Herrn Professor Hanns Hatt für die Bereitstellung des konfokalen Laser Scanning Mikroskops sowie ganz besonders Frau Prof. Monika von Düring für ihre Unterstützung beim Semidünnschnittverfahren und für konstruktive Diskussionen rund um das Thema Apoptose und Nekrose. Zuletzt möchte ich mich ganz herzlich bei meiner Familie und besonders auch bei Kathrin Walchshöfer bedanken. Von ihnen habe ich im aller größten Maße Verständnis, Geduld und Motivation abverlangt. Ohne sie wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Danke! LEBENSLAUF Cornelius Dieter Schubert * 04/07/1984 in Roth, Deutschland AUSBILDUNG 12/2012 Approbation als Arzt 12/2012 Universität Regensburg, Regensburg Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung 08/2008 – 10/2009 Ruhr-Universität Bochum, Bochum BG Universitätsklinikum Bergmannsheil GmbH Klinik für Plastische Chirurgie Labor für Molekulare Onkologie und Wundheilung Forschungsaufenthalt in Vollzeit 09/2007 Universität Regensburg, Regensburg Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung 10/2005 – 12/2012 Universität Regensburg, Regensburg Studium der Humanmedizin 09/1995 – 06/2005 Gymnasium Roth, Roth Allgemeine Hochschulreife 07/2001 – 07/2002 Turramurra High School, Sydney (Australien) High School Year AUSZEICHNUNGEN 05/2010 Plastic Surgery Research Council (PSRC) / Stanford University School of Medicine, Palo Alto (USA) Einladung als Redner zum 55th Annual Meeting des PSRC, San Francisco: Host defense-like lytic peptide suppresses growth of human liposarcoma 08/2009 European Plastic Surgery Research Council (EPSRC), Hamburg, 1st Annual Meeting, Preis des besten Vortrages Host defense-like lytic peptide suppresses growth of human liposarcoma PUBLIKATIONEN Fachzeitschriften 04/2012 Schubert C, Hui-Chou HG, Deune EG: Demographics of trigger finger and efficacy of corticosteroid injection therapy: A retrospective study of 362 patients and 577 trigger fingers, Journal of Hand Surgery. (in submission) 04/2012 Schubert C, Frassica FJ, Attar S, Deune EG: Rotational vascularised tibiaplasty after oncological resection and major wound healing problems – a novel technique., Annals of Plastic Surgery. (in submission) 03/2011 Steinstraesser L, Hauk J, Schubert C, Al-Benna S, Stricker I, Hatt H, Shai Y, Steinau H.U., Jacobsen F: Suppression of soft tissue sarcoma growth by a host defense-like lytic peptide, PLoS One. 2011 Mar 31;6(3):e18321 08/2010 Steinstraesser L, Schubert C, Hauk J, Becerikli M, Stricker I, Koeller M, Hatt H, Duering M von, Shai Y, Steinau HU, Jacobsen F: Oncolytic designer host defense peptide suppresses growth of human liposarcoma, Int J Cancer. 2010 Aug 23. [Epub ahead of print] 05/2010 Steinstraesser L, Jacobsen F, Schubert C, Gevers K, Steinau HU, Al-Benna S.: Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice, Hum Cell. 2010 May 1;23(2):50-7. 01/2010 Steinstraesser L, Schubert C, Jacobsen F, Al-Benna S: Editorial: glycyrrhizin against multi-resistant bacteria? J Leukoc Biol. 2010 Jan; 87(1): 7-8. 09/2009 Al-Benna S, Schubert C, Steinau HU, Steinstraesser L: Brachial neuropathy 22 years after radiation therapy for fibrosarcoma: a case report. Cases J. 2009 Sep 15; 2: 6838. Buchbeiträge 04/2010 Schubert C, Hauk J, Jacobsen F, Daigeler A, Langer S, Hirsch T, Stricker I, Shai Y, Steinau HU, Steintraesser L: Designer Host Defense Peptide als neue Therapieoption bei Weichgewebssarkomem?. In: Gradinger R., Menger M.D., Meyer H.-J., eds., Chirurgisches Forum – DGAV Forum – 2010. Heidelberg:Springer; 2010. p. 103-105 Kongresse Vorträge 05/2011 Hauk J, Jacobsen F, Schubert C, Langer S, Stricker I, Shai Y, Steinau HU, Steinstraesser L: Die Verwendung onkolytischer Peptide als potentielle Therapiealternative bei Weichgewebssarkomen. 128. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie (DGCH), München 09/2010 Jacobsen F, Hauk J, Schubert C, Langer S, Hirsch T, Stricker I, Shai Y, Steinau HU, Steinstraesser L: Onkolytische Designerpeptide als Therapiealternative bei Weichgewebssarkomen. 41. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft der Plastischen, Rekonstruktiven und Ästhetischen Chirurgen (DGPRÄC), Dresden 05/2010 Schubert C, Hauk J, Jacobsen F, Rittig A, Shai Y, Steinau HU, Steinstraesser L: Host defense-like lytic peptide suppresses growth of human liposarcoma. 55th Annual Meeting, Plastic Surgery Council (PSRC), San Francisco,(USA) 05/2010 Hauk J, Schubert C, Jacobsen F, Al-Benna S, Steinau HU, Shai Y, Steinstraesser L: Host defense-like lytic peptide suppresses growth of human synovial- and fibrosarcoma. 55th Annual Meeting, Plastic Surgery Research Council (PSRC), San Francisco, (USA) 05/2010 Schubert C, Hauk J, Jacobsen F, Rittig A, Stricker I, Koeller M, Hatt H, von Duering M, Shai Y, Steinau HU, Steinstraesser L: Killing mechanism of oncolytic designer host defense peptide – necrosis or apoptosis?.55th Annual Meeting, Plastic Surgery Research Council (PSRC), San Francisco, (USA) 04/2010 Schubert C, Hauk J, Jacobsen F, Daigeler A, Langer S, Hirsch T, Stricker I, Shai Y, Steinau HU, Steintraesser L: Designer Host Defense Peptide als neue Therapieoption bei Weichgewebssarkomem?. 127. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie (DGCH), Berlin 08/2009 Schubert C, Hauk J, Jacobsen F, Rittig A, Shai Y, Steinau HU, Steinstraesser L: Host defense-like lytic peptide suppresses growth of human liposarcoma. 1st Annual Meeting, European Plastic Surgery Research Council (EPSRC), Hamburg Poster 02/2012 Lee RJ, Laporte DM, Brooks J, Schubert C, Cohan TL, KerrLogan J. Deune EGD: Hand surgery after axillary lymph node dissection for cancer. 2012 Annual Meeting, American Academy of Orthopaedic Surgeons (AAOS), San Francisco, (USA) 11/2009 Hauk J, Schubert C, Jacobsen F, Hirsch T, Al-Benna S, Stricker I, Shai Y, Steinau HU, Steinstraesser L: Host defenselike lytic peptide suppresses growth of human sarcoma.15th World Congress, International Confederation for Plastic Reconstructive and Aesthetic Surgery (IPRAS), New Delhi, (Indien) 09/2009 Hauk J, Schubert C, Jacobsen F, Rittig A, Steinau HU, Steinstraesser L: Host Defense Peptid besitzt breite onkolytische Aktivität gegen Weichgewebssarkome. 40. Jahrestagung, Deutschen Gesellschaft der Plastischen, Rekonstruktiven und Ästhetischen Chirurgen (DGPRÄC), Hannover 08/2009 Hauk J, Schubert C, Jacobsen F, Rittig A, Shai Y, Steinau HU, Steinstraesser L: Host defense-like lytic peptide suppresses growth of human fibrosarcoma. 1st Annual Meeting, European Plastic Surgery Research Council (EPSRC), Hamburg 03/2009 Hauk J, Schubert C, Jacobsen F, Hirsch T, Al-Benna S, Stricker I, Shai Y, Steinau HU, Steinstraesser L: Host defenselike lytic peptide suppresses growth of human sarcoma. Gordon Research Conference – Antimicrobial Peptides, Ventura, (USA)
