Mikrobiologisches Grundpraktikum - *ISBN 3

Steve K. Alexander / Dennis Strete
Mikrobiologisches
Grundpraktikum:
Ein Farbatlas
Deutsche Bearbeitung von Erika Kothe
Aus dem Amerikanischen von Hans W. Kothe und Erika Kothe
Ein Imprint von Pearson Education
München • Boston • San Francisco • Harlow, England
Don Mills, Ontario • Sydney • Mexico City
Madrid • Amsterdam
Färbetechniken für Bakterien
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Darstellung morphologischer ­Merkmale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Anwendung im Labor: Einfachfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ziel und Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipps für die Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zu erwartende Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Anwendung im Labor: ­Negativkontrastierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ziel und Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipps für die Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zu erwartende Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Differenzierende Färbungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Anwendung im Labor: Gram-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ziel und Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipps für die Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zu erwartende Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ziel und Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipps für die Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zu erwartende Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Färbung von Zellstrukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Anwendung im Labor: Kapselfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ziel und Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipps für die Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zu erwartende Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Anwendung im Labor: ­Endosporenfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ziel und Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipps für die Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zu erwartende Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Anwendung im Labor: Geißelfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ziel und Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipps für die Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zu erwartende Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Ü b e r b l i c k
Anwendung im Labor: Vorbereitung der Zellen für die Färbung . . . . . . . . . . . . . .
Ziel und Vorgehensweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tipps für die Praxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zu erwartende Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Färbetechniken fü r B ak t e rie n
Werden Bakterien vor der mikroskopischen Untersuchung
angefärbt, erkennt man ihre typischen Merkmale zumeist
sehr viel besser, etwa die genaue Größe, die Form und die
Anordnung der Zellen, aber oft auch bestimmte chemische
Eigenschaften oder andere Besonderheiten des unter­
suchten Bakteriums. Dadurch ist es dann in vielen Fällen
sehr viel leichter, die entsprechenden Mikroorganismen zu
bestimmen. In diesem Kapitel sollen die wichtigsten Fär­
bemethoden für Bakterien vorgestellt werden, die man in
mikrobiologischen Labors routinemäßig zur Untersuchung
von Bakterien verwendet.
Anwendung im Labor: Vorbereitung der Zellen für die Färbung
Ziel und Vorgehensweise
Zu erwartende Resultate
Sowohl aus der Natur isolierte Bakterien als auch bakte­
rielle Krankheitserreger aus der klinischen Praxis werden
normalerweise auf Agar-Nährböden oder auch in Flüssigmedien kultiviert (siehe Kapitel 4). Um diese Organismen
anfärben zu können, muss man zunächst Ausstrichpräparate anfertigen, das heißt, man überträgt Teile der Kultur
mit einer sterilen Impföse auf einen Objektträger. Dazu
müssen Zellen, die von festen Nährböden stammen, sorg­
fältig in einen kleinen Wassertropfen auf dem Objektträger
gemischt werden, bis die Flüssigkeit eine leicht milchige
Farbe angenommen hat, während man aus einer hoch ge­
wachsenen Flüssigkultur einfach einen Tropfen Flüssigkeit
entnimmt und diesen auf den Objektträger überführt. An­
schließend lässt man die Flüssigkeit an der Luft eintrock­
nen und zieht den Objektträger dann mehrmals durch die
Flamme eines Bunsenbrenners, um die Zellen fest auf dem
Glas zu fixieren (Hitzefixierung).
Nach der Färbung ähnelt ein gutes Ausstrichpräparat der
Aufnahme aus EAbb. 3.1. Da die die Dichte der Zellen am
Rande normalerweise etwas geringer ist, beginnt man mit
der mikroskopischen Untersuchung am besten in der Mitte
und fährt von dort nach außen, bis man eine Stelle gefun­
den hat, wo die Zellen nicht mehr übereinander liegen.
Tipps für die Praxis
Bringen Sie die Flüssigkeitstropfen in der Mitte des
Objektträgers auf, damit Sie die Objekte beim Färben
und bei der mikroskopischen Untersuchung leichter
finden.
Achten Sie darauf, dass die Objekte auf einen kleinen
Bereich beschränkt bleiben, damit das Färbemittel
auch alle Zellen erreicht. Versuchen Sie ein Zusammenklumpen der Zellen zu
vermeiden, weil das Färbemittel die Bakterien im In­
neren eines solchen Haufens zumeist nicht erreicht.
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Abb. 3.1 Ein hitzfixierter und mit Kristallviolett gefärbter Bakterien­
ausstrich auf einem Objektträger. Die Mitte solcher Präparate ist für
die Untersuchung zumeist ungeeignet, weil die Zellen dort zu dicht
liegen, so dass man sich am besten eine Stelle in den äußeren Berei­
chen heraussucht.
Darstellung morphologischer Merkmale
Darstellung morphologischer
­Merkmale
Um morphologische Merkmale von Bakterien darzustellen,
werden entweder die Zellen oder auch der Hintergrund
des Präparates gefärbt, weil man dadurch normalerweise
genauere Informationen über Zellgröße oder Form und An­
ordnung der Objekte erhält. Grundsätzlich lassen sich die
verwendeten Farbstoffe in zwei Gruppen unterteilen: In
basische, positiv geladene und saure, negativ geladene Fär­
bemittel. Der Unterschied besteht darin, dass sich basische
Farbstoffe an negativ geladene, also basophile (saure) Kom­
ponenten des Untersuchungsobjektes anlagern, während
es bei sauren Farbstoffen die positiv geladenen, also azi­
dophilen (basischen) Komponenten sind. Daher gilt bei
Bakterienfärbungen: basische Farbstoffe färben die negativ
geladene Bakterienzellwand, während saure, negativ gela­
dene Färbemittel abgestoßen werden. Dadurch nehmen die
Zellen im erstgenannten Fall die Farbe des Färbemittels
an, während im zweiten Fall nur die Umgebung der Zel­
le gefärbt wird, was allerdings die Umrisse der Bakterien
deutlicher hervortreten lässt (Negativfärbung). Typische,
basische Farbstoffe sind Kristallviolett, Methylenblau und
Safranin; zu den sauren Farbstoffen gehören Kongorot, Ni­
grosin und Eosin.
Anwendung im Labor: Einfachfärbung
Ziel und Vorgehensweise
Im einfachsten Fall werden Bakterien mit nur einem Farb­
stoff gefärbt, um Größe, Form und Anordnung der Zellen
besser erkennen zu können. Das Färbemittel wird auf das
hitzefixierte Präparat getropft und anschließend mit Was­
ser wieder abgespült. Nach dem Trocknen kann das Präpa­
rat dann im Mikroskop untersucht werden.
Tipps für die Praxis
Achten Sie darauf, dass das Färbemittel über den
gesamten Ausstrich verteilt ist.
Drücken Sie beim Spülen des Präparats mit der
Abb. 3.2 Mit Kristallviolett gefärbte, kugelförmige Zellen von Sta­
phylococcus aureus (x 2.500).
Spritzflasche nicht zu stark, damit die Objekte nicht
abgewaschen werden.
Spülen Sie das Präparat so lange, bis sich keine Farb­
wolken mehr lösen.
Wischen Sie das Präparat keinesfalls ab, sondern las­
sen Sie es an der Luft trocknen.
Zu erwartende Resultate
Die EAbb. 3.2 bis 3.4 zeigen Bakterien, die mit Kristallviolett
oder Methylenblau gefärbt wurden. Da die Zellen die Farbe
des jeweiligen Färbmittels angenommen haben, sind Grö­
ße, Form und Anordnung besser zu erkennen.
Abb. 3.3 Mit Methylenblau gefärbte, stäbchenförmige Zellen von
Escherichia coli (x 2.500).
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Färbetechniken fü r B ak t e rie n
Kokken
Stäbchen
Abb. 3.4 Mit Methylenblau gefärbte Mischkultur von kugelförmigen
Staphylococcus aureus- und stäbchenförmigen Escherichia coliZellen (x 2.500).
Anwendung im Labor: ­Negativkontrastierung
Ziel und Vorgehensweise
Bestimmte Bakterien, etwa Spirillen oder Spirochäten,
lassen sich mit basischen Farbstoffen nur sehr schlecht
anfärben, so dass man bei ihnen normalerweise eine Nega­
tivfärbung mit sauren Farbstoffen durchführt. Dabei nimmt
die Umgebung der Zellen die Farbe des Färbemittels an,
mit dem Ergebnis, dass die Größe, Form und Anordnung
der Bakterien deutlicher hervortritt. Die Negativkontras­
tierungen haben aber noch einen weiteren Vorteil: Da bei
ihnen keine Hitzefixierung notwenig ist und zudem keine
Färbung der Zellen selbst erfolgt, ist die Veränderung der
Bakterien durch äußere Einflüsse deutlich geringer, so dass
sich die Form und Größe der Untersuchungsobjekte zu­
meist sehr viel genauer bestimmen lässt. Zur Präparation werden die Bakterien in einen Tropfen
Nigrosin (oder eine andere saure Färbelösung) auf einen
Objektträger überführt. Anschließend streicht man den
Tropfen mit einem zweiten Objektträger zu einem dünnen
Film aus und lässt das Präparat an der Luft trocknen. Da­
nach kann die mikroskopische Untersuchung dann durch­
geführt werden.
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Tipps für die Praxis
Verwenden Sie unbedingt sehr saubere, fettfreie Ob­
jektträger. Überführen Sie die Bakterien in einen möglichst klei­
nen Tropfen Nigrosin.
Setzen Sie die Kante des zweiten Objektträgers an
den Rand des Tropfens, damit die Flüssigkeit sich
kapillar am Glas verteilt, und ziehen sie ihn dann
über den unteren Objektträger. Durch Schieben wird
eine schlechte Verteilung erzielt.
Führen Sie keine Hitzefixierung durch, sondern las­
sen Sie das Präparat vollständig an der Luft trock­
nen.
Zu erwartende Resultate
Nach einer Negativfärbung erscheint die Umgebung der
Zellen farbig, während die Zellen selbst ungefärbt bleiben. Das Resultat einer solchen Färbung zeigt EAbb. 3.5.
Differenzierende Färbungen
Abb. 3.5 Durch die Negativfärbung des Bacillus-Präparates mit Nig­
rosin treten die stäbchenförmigen Zellen deutlicher hervor (x 3.600).
Differenzierende Färbungen
Mit Hilfe differenzierender Färbungen, zu denen die GramFärbung und die Säurefestigkeitsfärbung gehören, lassen
sich Bakterien anhand der unterschiedlichen Zusammen­
setzung ihrer Zellwand einordnen. Zur Durchführung einer
solchen Färbung werden zwei verschiedene Färbelösungen
benötigt, von denen man die erste für die Primärfärbung
und die zweite für die Gegenfärbung nimmt; außerdem
wird zwischen den beiden Färbungen ein Entfärbungs­
schritt durchgeführt. Abhängig vom Zellwandtyp der Bak­
terien findet dabei eine Entfärbung statt und es kann eine
Gegenfärbung erfolgen, oder die Primärfärbung bleibt trotz
des Entfärbungsschrittes erhalten.
Anwendung im Labor: Gram-Färbung
Ziel und Vorgehensweise
Die Zellwand der meisten Eubakterien besteht aus Peptidoglykan, wobei grampositive Bakterien bis zu 40 Pepti­
doglykanschichten besitzen, während bei gramnegativen
Bakterien nur eine dünne Peptidoglykanschicht, dafür
aber zusätzlich eine äußere Membran mit Lipopolysacchariden vorliegt. Diese Unterschiede lassen sich durch
die Gram-Färbung sichtbar machen, so dass man mit Hilfe
dieser Methode zwei verschiedene Gruppen unterscheiden
kann. Verwendung findet diese Methode vor allem bei der
Identifizierung unbekannter Isolate aus der Natur oder aus
dem klinischen Bereich.
Bei der Gram-Färbung wird der fixierte Ausstrich zu­
nächst mit Kristallviolett gefärbt und dann, nachdem ge­
spült wurde, mit einer Jodlösung behandelt. Anschließend
entfärbt man die zu untersuchende Probe mit 96%-igem
Alkohol und macht dann eine Gegenfärbung mit Safranin. Die sichtbaren Unterschiede entstehen dadurch, dass die
grampositiven Bakterien wegen der dicken Peptidoglykan­
schicht nach der Alkoholbehandlung nicht mehr entfärbt
werden können, sondern weiterhin das Kristallviolett des
ersten Färbungsschrittes enthalten, während das Färbemit­
tel bei gramnegativen Bakterien durch den Alkohol ausge­
waschen wird, so dass sie sich anschließend durch Safra­
nin anfärben lassen. Durch eine Gram-Färbung enthält man
aber nicht nur Hinweise auf den Bau der Bakterienzell­
wand, sondern man kann die Größe, Form und Anordnung
der Zellen auch besser erkennen.
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Färbetechniken fü r B ak t e rie n
Tipps für die Praxis
Beenden Sie das Spülen mit Alkohol, wenn die ab­
laufende Flüssigkeit klar bleibt.
Benutzen Sie Präparate von bekannten Stämmen zum
Vergleich Ihrer Färbungen. Solche Kontrollpräparate
sind im Fachhandel erhältlich (EAbb. 3.6); man kann
sie sich aber auch selbst anfertigen. Führen Sie die Gram-Färbung mit Ansätzen durch,
die etwa 24 Stunden gewachsen sind, da man bei
älteren Kulturen häufig uneinheitliche Ergebnisse
Abb. 3.6 Ein handelsüblicher Objektträger mit einer grampositiven
Kontrolle (oben) und einem Gram-negativen Vergleichsorganismus
(unten).
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erhält. So sind beispielsweise 24 Stunden alte Zellen
von Staphylococcus aureus nach einer Gram-Färbung
erwartungsgemäß durchgehend grampositiv gefärbt
(EAbb. 3.7), während man in 48 Stunden alten Kul­
turen bereits einige Bakterien findet, die die GramFärbung nicht aufgenommen haben (EAbb. 3.8), und
nach 72 Stunden hat dieser Anteil noch deutlich
zugenommen(EAbb. 3.9). Auf der anderen Seite sind
24 Stunden alte Escherichia coli-Zellen durchgehend
gramnegativ (EAbb. 3.10), während es in 48 und 72
Stunden gewachsenen Kulturen zahlreiche Zellen
gibt, die die Gegenfärbung schlecht angenommen
haben (EAbb. 3.11 und 3.12).
Abb. 3.7 24 Stunden alte Kultur von Staphylococcus aureus nach
einer Gram-Färbung. Alle Bakterien sind tiefviolett gefärbt, zeigen also
eine grampositive Reaktion.
Anwendung im Labor: Gram-Färbung
Zu erwartende Resultate
Grampositive Bakterien zeigen im mikroskopischen Bild
eine tiefviolette Färbung. Färbt man eine Mischkultur,
dann lassen sich grampositive und gramnegative Bakterien
gut voneinander unterscheiden (EAbb. 3.13), und das gilt
auch für klinische Abstriche (EAbb. 3.14). Neben der bereits
mehrfach erwähnten Art Staphylococcus aureus gehören u.a. Bacillus cereus (EAbb. 3.15), Enterococcus faecalis (EAbb. 3.16),
Micrococcus luteus (EAbb. 3.17) und Staphylococcus epidermi­
dis (EAbb. 3.18) zu den grampositiven Bakterien.
Gramnegative Bakterien sind im mikroskopischen Bild
rötlich gefärbt. Einige Beispiele gramnegativer Bakterien
sind: Escherichia coli (EAbb. 3.10), Alcaligenes faecalis (EAbb.
3.19), Enterobacter aerogenes (EAbb. 3.20), Pseudomonas aeru­
ginosa (EAbb. 3.21) und Serratia marcescens (EAbb. 3.22).
Abb. 3.9 Bei dieser 72 Stunden alten Kultur der grampositiven Bakte­
rien-Art Staphylococcus aureus zeigen fast ebenso viele Zellen eine
gramnegative wie eine grampositive Reaktion (x 3.600).
Abb. 3.8 Eine Gram-gefärbte, 48 Stunden alte Kultur der gramposi­
tiven Bakterien-Art Staphylococcus aureus. Zwar zeigen die meisten
Zellen in diesem Präparat die erwartete violette Färbung, es gibt aber
auch eine Reihe von Bakterien, die rötlich aussehen, was einer gram­
negativen Reaktion entspricht (x 3.600).
Abb. 3.10 Eine Gram-gefärbte, 24 Stunden alte Kultur des gramnega­
tiven Bakteriums Escherichia coli. Das Ergebnis ist eindeutig, denn
alle Zellen sind stark rötlich gefärbt (x 3.600).
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Färbetechniken fü r B ak t e rie n
Abb. 3.11 Auch in diesem Gram-gefärbten Präparat, das mit einer 48
Stunden alten Escherichia coli-Kultur hergestellt wurde, haben die
meisten Zellen eine kräftige, rosa Farbe, aber es gibt eine Reihe von
Bakterien, die nur schwach gefärbt sind (x 3.600).
Abb. 3.13 In diesem Präparat wurde eine Mischkultur aus der
grampositiven Art Staphylococcus aureus und dem gramnegativen
Bakterium Escherichia coli einer Gram-Färbung unterzogen.
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Abb. 3.12 Eine Gram-gefärbte, 72 Stunden alte Kultur von Escheri­
chia coli. Es sind nur noch wenige Zellen kräftig rosa gefärbt,
wogegen­ die meisten Bakterien eine untypisch helle Färbung zeigen
(x 3.600).
Anwendung im Labor: Gram-Färbung
Epithelzelle
grampositive
Stäbchen
grampositive
Streptokokken
Abb. 3.15 Gram-Färbung bei Bacillus cereus, einem stäbchenför­
migen, grampositiven Bakterium (x 2.500).
grampositive
Staphylokokken
Hefezellen
Abb. 3.14 Gram-gefärbtes Abstrichpräparat von menschlichen
Zähnen. Wie unschwer zu erkennen ist, überwiegen die grampositiven
Bakterien (x 3.600).
Abb. 3.16 Gram-gefärbtes Präparat von Enterococcus faecalis,
einem grampositiven Kokkus. Typisch für diese Art ist die Bildung von
Zellketten (x 2.500).
Tetraden
Abb. 3.17 Präparat von Micrococcus luteus, einem kugelförmigen,
grampositiven Bakterium nach einer Gram-Färbung. Typisch für diese
Art ist die Tetradenbildung (x 2.500).
Abb. 3.18 Gram-gefärbtes Präparat von Staphylococcus epidermi­
dis, einem kugelförmigen, grampositiven Bakterium. Charakteristisch
für die Gruppe der Staphylokokken ist die traubenartige Zusammenla­
gerung mehrerer Zellen (x 2.500).
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Färbetechniken fü r B ak t e rie n
Abb. 3.19 Gram-Färbung bei einer Kultur von Alcaligenes faecalis,
einer gramnegativen Art, bei der die kurzen Stäbchen alle etwa die
gleiche Länge haben (x 2.500).
Abb. 3.20 Präparat von Enterobacter aerogenes, einem gramne­
gativen Bakterium. Bei dieser Art sind einige der stäbchenförmigen
Zellen so kurz, dass man sie leicht für Kokken halten könnte (x 2.500).
Abb. 3.21 Gram-gefärbtes Präparat von Pseudomonas aeruginosa,
einem gramnegativen Bakterium. Bei dieser Art sind die stäbchenför­
migen Zellen etwa 1,5- bis 2-Mal so lang wie die von Alcaligenes
faecalis (Abb. 3.19; x 2.500).
Abb. 3.22 Bei einer Kultur von Serratia marcescens durchgeführte
Gram-Färbung. Bei dieser Art sind die stäbchenförmigen Zellen eben­
falls so kurz, dass man sie leicht mit Kokken verwechseln kann
(x 2.500).
Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung
Ziel und Vorgehensweise
Mit Hilfe der Säurefestigkeitsfärbung lassen sich eine Rei­
he von Bakterien zuordnen, die einen hohen Gehalt an
hydrophoben Substanzen (Wachsen) in der Zellwand auf­
weisen und daher auf eine herkömmliche Gram-Färbung
nicht ansprechen. Dafür wird allerdings Karbolfuchsin auf­
genommen und auch durch Waschen mit einem Salzsäu­
re-Ethanol-Gemisch nicht wieder freigesetzt, so dass man
solche Bakterien als säurefest bezeichnet. Andere Arten,
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denen der hohe Anteil an hydrophoben Substanzen fehlt,
lassen sich dagegen durch das Säure-Ethanol-Gemisch ent­
färben und mit Methylenblau nachfärben. Solche Bakterien
werden als nicht säurefest bezeichnet. Eingesetzt wird di­
ese Form der Färbung vor allem zur Identifizierung von
säurefesten Arten aus der Gattung Mycobacterium, darunter
Mycobacterium tuberculosis, des Erregers der Tuberkulose
und Mycobacterium leprae, einer Art, die Lepra verursacht.
Anwendung im Labor: Säurefestigkeitsfärbung
Bei der Säurefestigkeitsfärbung nach Ziehl-Neelsen, der
am häufigsten verwendeten Form dieser Methode, wird ein
Ausstrichpräparat mit Fließpapier bedeckt, das man an­
schließend mit Karbolfuchsinlösung tränkt. Danach wird
der Objektträger vorsichtig über einem Wasserbad erhitzt,
bevor man das Fließpapier entfernt und den Ausstrich mit
Wasser spült. Schließlich entfärbt man das Präparat mit
einem Salzsäure-Ethanolgemisch und führt zum Schluss
eine Gegenfärbung mit Methylenblau durch.
Während der Hitzefixierung sollte weiteres Karbol­
fuchsin zugegeben werden, um ein völliges Austrock­
nen des Präparates zu verhindern.
Das Auswaschen mit dem Säure-Ethanolgemisch
kann beendet werden, wenn die Flüssigkeit klar ab­
fließt.
Zu erwartende Resultate
Tipps für die Praxis
Wenn die zu untersuchenden Bakterien bei der Prä­
Säurefeste Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis sehen
unter dem Mikroskop rötlich aus (EAbb. 3.23), während
nicht säurefeste Arten blau gefärbt sind (EAbb. 3.24).
paration mit Ovalbumin vermischt werden, haften
sie besser am Objektträger.
Säurefeste Stäbchen
Abb. 3.23 Gefärbtes Präparat von Mycobacterium tuberculosis.
Die säurefesten, stäbchenförmige Zellen erscheinen im Mikroskop
rötlich gefärbt (x 3.600).
Nicht säurefeste Stäbchen
Abb. 3.24 Pseudomonas aeruginosa ist eine nicht säurefeste Art.
Die stäbchenförmigen Zellen erscheinen im Mikroskop blau gefärbt
(x 3.600).
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Färbetechniken fü r B ak t e rie n
Färbung von Zellstrukturen
Einige Färbungen lassen sich verwenden, um spezielle
Zellstrukturen im Mikroskop sichtbar zu machen, etwa
Kapseln, Endosporen oder Geißeln. Das ist insofern wich­
tig, als diese Bestandteile wichtige Merkmale für die Be­
stimmung sein können.
Anwendung im Labor: Kapselfärbung
Ziel und Vorgehensweise
Zu erwartende Resultate
Einige Bakterien scheiden während Wachstums Polysac­
charide und Polypeptide aus und bilden so außerhalb der
Zelle charakteristische Schleimkapseln. Zu den Arten mit
solchen Kapseln gehören auch einige Krankheitserreger,
darunter Klebsiella pneumoniae und Streptococcus pneumoni­
ae, die Lungenentzündung verursachen können. Für diese
Bakterien spielen die Kapseln eine wichtige Rolle, denn sie
schützen die Zelle vor Phagozytose durch Makrophagen
im Wirt.
Da sich Bakterienkapseln nicht anfärben lassen, färbt
man die Zelle und den Hintergrund des Präparates, um die
Kapseln deutlich hervortreten zu lassen. Verwendet wird
dazu eine Kombination aus Negativ- und Einfachfärbung,
wobei man eine saure Färbelösung wie Kongorot, Nigrosin
oder Tusche (India Ink) benutzt, um den Hintergrund zu
färben, während die Zelle mit einem basischem Farbstoff
wie Kristallviolett oder Karbolfuchsin angefärbt wird.
Im mikroskopischen Bild erscheinen die Kapseln als helle
Zonen zwischen den aufgrund der Einfachfärbung farbig
erscheinenden Zellen und dem durch eine Negativfärbung
ebenfalls farbigen Hintergrund. EAbb. 3.25 zeigt eine Kap­
selfärbung bei Klebsiella pneumoniae.
Kapseln
Stäbchenförmige
Zellen
Tipps für die Praxis
Damit auch tatsächlich eine Kapselbildung erfolgt,
sollten Sie die entsprechenden Bakterien auf Magermilch-Agar wachsen lassen.
Führen Sie keine Hitzefixierung durch, weil die
Bakterien dabei leicht schrumpfen, so dass sich ein
falsches Bild der Kapsel ergeben kann.
Spülen Sie die Präparate sehr vorsichtig, damit die
Zellen nicht abgewaschen werden.
Dehnen Sie das Spülen nicht unnötig aus, denn das
Kapselmaterial ist wasserlöslich.
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Gefärbter Hintergrund
Abb. 3.25 Kapselfärbung bei Klebsiella pneumoniae, einer Bakte­
rien-Art mit stäbchenförmigen Zellen.
Anwendung im Labor: Endosporenfärbung
Anwendung im Labor: ­Endosporenfärbung
Ziel und Vorgehensweise
Einige grampositiven Bakterien können unter bestimmten
Bedingungen sehr widerstandsfähige Sporen, so genannte
Endosporen, bilden (EAbb. 3.26). Sie entstehen durch ver­
gleichsweise komplexe Differenzierungsprozesse in den
vegetativen Zellen der Bakterien und werden freigesetzt,
wenn diese absterben. Die freigesetzten Sporen sind außer­
ordentlich robuste Strukturen, die Bedingungen überste­
hen können, unter denen vegetative Bakterienzellen längst
abgestorben wären. Verbessern sich die Wachstumsbedin­
gungen für die Organismen, dann findet eine Keimung der
Endosporen und eine erneute Bildung vegetativer Bakteri­
enzellen statt.
Da Endosporen und ihre intrazelluläre Lage in der Mut­
terzelle recht unterschiedlich sein können, sind sie wich­
tige Merkmale für die Vertreter bestimmter Bakteriengat­
tungen, vor allem Bacillus und Clostridium. So bildet Bacillus
anthracis, der Erreger des Milzbrands, ovale Endosporen in
der Mitte der vegetativen Zellen, während sie bei Clostri­
dium botulinum, einem der häufigeren Botulismus-Verur­
sacher, deutlich zu einer der Seiten verschoben sind. Bei
Clostridium tetani, dem Tetanuserreger, sitzen die Sporen an
einem Ende der Zellen. Vegetative Zelle
Wegen ihres speziellen Aufbaus, aber auch aufgrund ih­
rer chemischen Zusammensetzung nehmen Endosporen
kein Methylenblau auf. Daher kann man die Sporen nach
einer Einfachfärbung entsprechender Bakterien auch gut
als ungefärbte, stark lichtbrechende Objekte innerhalb der
gefärbten Zellen erkennen (EAbb. 3.27). Noch besser lassen
sich Endosporen aber durch eine spezielle Sporenfärbung
sichtbar machen. Eine häufig verwendete Methode zum Anfärben von En­
dosporen ist die Sporenfärbung nach Schaeffer-Fulton. Da­
zu bedeckt man ein Ausstrichpräparat mit Fließpapier und
tränkt dieses mit einer Malachitgrünlösung. Anschließend
wird der Objektträger vorsichtig über einem Wasserbad
erhitzt, und nach dem Abkühlen und dem Entfernen des
Fließpapiers mit Wasser gespült. Dabei wird der Farbstoff,
der durch die Hitzeeinwirkung in die Endosporen einge­
drungen ist, nicht mit ausgewaschen, so dass die Sporen
anschließend gefärbt sind. Zum Schluss erfolgt dann noch
eine Gegenfärbung der Zellen mit Safranin.
Endosporen
Endospore
Sporenbildung
Freie
Endospore
Vegetative Zelle
Sporenkeimung
Auskeimende Spore
Abb. 3.26 Lebenszyklus eines Endosporen bildenden Bakteriums.
Abb. 3.27 Ungefärbte Endosporen in den gefärbten, vegetativen
Zellen einer Bacillus-Art (x 3.600).
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3
Färbetechniken fü r B ak t e rie n
Tipps für die Praxis
Zu erwartende Resultate
Tropfen Sie während des Erhitzens weiteres Ma­
lachitgrün auf das Fließpapier, damit das Präparat
nicht austrocknet.
Spülen Sie das Präparat nach der Malachitgrünfär­
bung sehr sorgfältig aus, weil die Zellen sonst kein
Safranin mehr aufnehmen.
Endospore
Vegetative Zellen
Abb. 3.28 Sporenfärbung bei einer 1-2 Tage alten Kultur von Bacillus
cereus, einem Endosporenbildner. Diese junge Kultur enthält viele
vegetative Zellen, aber nur wenige Endosporen (x 4.250).
48
Nach Durchführung der Färbung, sind die runden oder
ovalen Sporen als grünliche Objekte deutlich zu erkennen,
so dass sich Endosporen bildende Bakterien mit dieser
Methode leicht identifizieren lassen (EAbb. 3.28 bis 3.30). Damit auch ausreichend Sporen vorhanden sind, sollte
man ältere Kulturen verwenden, die auf nährstoffarmem
Medium gezogen wurden. Wie unterschiedlich die Zahl
der Endosporen in Abhängigkeit vom Alter der Kulturen
sein kann, zeigen die EAbb. 3.28 bis 3.30. Bei einer Bakte­
rienart, die keine Endosporen ausbilden kann, sind nach
einer Schaeffer-Fulton-Sporenfärbung im Präparat keine
grünlich gefärbten Endosporen vorhanden, sondern nur
rötlich aussehende, vegetative Zellen (EAbb. 3.31).
Vegetative Zellen
Freie Sporen
Abb. 3.29 Sporenfärbung bei einer 3-4 Tage alten Kultur von Bacillus
cereus. In diesem Präparat sind immer noch viele vegetative Zellen
vorhanden, aber auch schon zahlreiche, teilweise frei gewordene
Endosporen (x 4.250).
Anwendung im Labor: Geißelfärbung
Vegetative Zellen
Freie Sporen
Abb. 3.30 Sporenfärbung bei einer 5-7 Tage alten Kultur von Bacillus
cereus. In diesem Präparat sind nur noch wenige vegetative Zellen zu
erkennen, dafür aber viele freie Endosporen (x 4.250).
Abb. 3.31 Sporenfärbung bei einer Kultur von Escherichia coli,
einem Bakterium, das keine Endosporen bildet. In dem Präparat sind
ausschließlich rot gefärbte Stäbchen zu erkennen, aber keine grün­
lichen Endosporen (x 4.250).
Anwendung im Labor: Geißelfärbung
Ziel und Vorgehensweise
Einige Bakterien besitzen der Beweglichkeit dienende,
­fadenartige Anhänge, die Geißeln oder Flagellen genannt
werden. Im Mikroskop sind diese sehr feinen Strukturen
nur zu erkennen, wenn zuvor eine Quellung und Beizfär­
bung durchgeführt wurde. Um bewegliche Bakterien präparieren zu können, muss
man zunächst eine bewachsene Agarplatte mit Flüssigme­
dium überschichten, um darin bewegliche Zellen aufzufan­
gen. Anschließend wird die Flüssigkeit abgesaugt und mit
niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, bis ein deutlicher
Niederschlag (Pellet) am Boden des Zentrifugenröhrchens
zu erkennen ist. Dieses Pellet nimmt man in 10%-igem For­
malin auf, und überträgt davon einen Tropen auf einen Ob­
jektträger. Dieser wird anschließend etwas geneigt, damit
der sich Tropfen auf dem Glas verteilen kann. Nach dem
Trocknen an der Luft überschichtet man die entsprechende
Stelle dann mit einer Pararosanilinlösung, und spült das
Präparat mit Wasser, sobald sich ein goldfarbener Film an
der Oberfläche des Färbemittels sowie ein sichtbarer Nie­
derschlag gebildet hat.
Tipps für die Praxis
Verwenden Sie unbedingt sehr saubere Objektträger.
Führen Sie die beschriebenen Schritte möglichst
vorsichtig durch, denn Geißeln sind außerordentlich
empfindliche Strukturen, die leicht abbrechen.
Suchen Sie das Präparat im Mikroskop sehr gründ­
lich ab, da nicht alle Zellen noch Geißeln besitzen
werden. Vergleichsweise häufig findet man begeißel­
te Stadien in den Randbereichen. Zu erwartende Resultate
Bei Bakterien gibt es vier Begeißelungstypen (EAbb. 3.32),
die sich in vielen Fällen zur Bestimmung verwenden
­lassen. So besitzt die Art Pseudomonas aeruginosa nur eine ­Geißel,
ist also monotrich begeißelt (EAbb. 3.33), während Spirillum
volutans Flagellen an beiden Seiten aufweist und somit
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Färbetechniken fü r B ak t e rie n
amphitrich begeißelt ist (EAbb. 3.34). Pseudomonas margi­
nalis hat mehrere Flagellen an einer Seite, weist also eine
lophotriche Begeißelung auf (EAbb. 3.35), während Proteus
vulgaris rundum, also peritrich begeißelt ist (EAbb. 3.36).
Monotrich
(siehe Abb. 3.33)
Amphitrich
(siehe Abb. 3.34)
Geißel
Abb. 3.33 Monotriche Begeißelung bei Pseudomonas aeruginosa
(x 3.600).
Lophotrich
(siehe Abb. 3.35)
Geißeln
Peritrich
(siehe Abb. 3.36)
Abb. 3.32 Begeißelungstypen bei Bakterien. Monotrich begeißelte
Arten haben eine einzelne Geißel an einem ihrer Zellpole, beim
amphitrichen Begeißelungstyp sitzt an beiden Enden je eine Geißel.
Bei Bakterien mit einem lophotrichen Begeißelungstyp sind an einem
Ende mehrere Geißeln vorhanden, und bei peritrich begeißelten Arten
sitzen die Fortbewegungsorgane überall auf der Zelloberfläche.
Abb. 3.34 Amphitriche Begeißelung bei Spirillum volutans
(x 3.600).
Geißeln
Geißeln
Abb. 3.35 Lophotriche Begeißelung bei Pseudomonas marginalis
(x 3.600).
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Abb. 3.36 Peritriche Begeißelung bei Proteus vulgaris (x 3.600).