Molekularbiologie und Hämostase

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© 2008
Schattauer GmbH
Molekularbiologie und Hämostase
Ch. Mannhalter
Klinisches Institut für Medizinische u. Chemische Labordiagnostik, Medizinische Universität Wien,
Österreich
Schlüsselwörter
Blutgerinnung, Molekularbiologie,
angeborene Blutungsneigung
Keywords
Thrombophilie,
Blood coagulation, genetics, thrombophilia, inherited
bleeding disorders
Zusammenfassung
Summary
Für die Diagnostik von Erkrankungen spielen molekularbiologische Methoden bei schweren angeborenen Krankheiten
(z. B. Hämophilie A oder B) eine wichtige Rolle. Auch zur Diagnostik polygenetischer Erkrankungen (z. B. venöse und arterielle Thrombosen) sind sie unentbehrlich. Neben der Analyse der zwei häufigsten genetischen Defekte (Inversion im
Intron 22 und Intron 1) im Faktor-VIII-Gen als Ursache der
schweren Hämophilie A wurde in den vergangenen Jahren
die Sequenzierung des Faktor-VIII-Gens in mehreren Zentren
eingeführt und wird nun in der Hämophilie- und Überträgerinnen-Diagnostik eingesetzt. Bei Patienten mit Thrombophilie trägt der Nachweis von Mutationen im Protein-C- und
Protein-S-Gen zur Verbesserung der Diagnostik bei bekanntem familiären Protein-C- bzw. -S-Mangel bei. Die Analysen
der Arg506Gln-Mutation im Faktor-V-Gen (Faktor-V-Leiden)
und die 20210G>A-Mutation im Prothrombin-Gen, die das
Risiko für venöse Thrombose beeinflussen, können potenziell
helfen, das individuelle Risiko für eine Thrombose bzw. Rezidivthrombose besser einzuschätzen. Allerdings führt die unkritische Untersuchung genetischer Ursachen der Thrombose
zu keinem wesentlichen Informationsgewinn hinsichtlich Behandlung und Beratung der Patienten und kostet Zeit und
Geld. Daher sollen immer nur jene Tests durchgeführt werden,
die medizinische bzw. therapeutische Konsequenzen nach
sich ziehen. Trotz der Bedeutung der molekulargenetischen
Diagnostik sind die Einsatzmöglichkeiten der Mutationsdiagnostik im klinischen Alltag eines Gerinnungslabors begrenzt.
Große Studien haben gezeigt, dass eine Mutation nicht bei
jedem Menschen die gleiche Auswirkung hat, da endogene
und exogene modulierende Faktoren den Phänotyp beeinflussen. Da sehr wenig über modulierende Faktoren bekannt
ist, ist es häufig schwierig, die Auswirkung einer Mutation in
ihrer Tragweite zu bewerten. Es ist daher von außerordentlicher Wichtigkeit, die Forschung voranzutreiben, um GenGen- und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen, damit in
Zukunft eine zuverlässige Interpretation der Mutationsergebnisse möglich wird.
Molecular biological methods have become increasingly
important not only in the diagnostics of inherited monogenetic diseases such as hemophilia A or B but also in the
diagnostics of polygenetic diseases e.g. venous and arterial
thrombosis. In haemophilia A, sequencing of the factor VIII
gene has been established in addition to the analysis of the
two most frequent genetic abnormalities, the inversions in
intron 22 and intron 1, in several centers. Molecular testing
has proved helpful to identify haemophilia patients at high
risk to develop inhibitors as well as in carrier analysis. In
patients with familial protein C or protein S deficiency mutation analysis contributes to the verification of the diagnosis. The frequently performed tests for the factor V Leiden
mutation and the prothrombin 20210G>A variation can
potentially support the estimation of the thrombotic risk as
well as the risk of recurrence. However, any uncritical application of these genetic tests does not improve diagnostics
nor does it support therapeutic decision making or counselling of the patient. Therefore, one should only do genetic
tests with medical or therapeutic consequences. The applicability of mutation analysis in the daily routine is still limited in spite of the importance of molecular diagnostics in
the understanding of pathomechanisms of haemostatic disorders. As has been demonstrated in large studies, the phenotypic effects of mutations can vary significantly between
individuals. Endogenous and exogenous modulators that
are still largely unknown, play a role. Currently, the understanding of these modulators is limited, and large multicenter studies and meta-analyses are needed for a better
understanding of gene-gene and gene-environment interactions.
D
und die Wundheilung nach Verletzungen zu
fördern. Jede Störung des hämostatischen
Gleichgewichtes kann zu erhöhter Bereitschaft zu abnormen Blutungen oder zu un-
as System der Blutstillung ist ein
homöostatischer Mechanismus
und dient dazu, abnorme Blutungen oder Gefäßverschlüsse zu verhindern
Molecular biology and haemostasis
Hämostaseologie 2008; 28: 272–288
gewöhnlichen (meist venösen, selten arteriellen) Verschlusskrankheiten führen. In
den vergangenen 30 Jahren konnte man bei
fast allen angeborenen Defekten des Hämostasesystems genetische Veränderungen
identifizieren.
Mit der Einführung von Genanalysen in
das medizinische Labor wurden neue Möglichkeiten zur direkten Untersuchung der
Erbsubstanz in unterschiedlichen biologischen Systemen geschaffen. Dies hat zu signifikanten Verbesserungen im medizinisch
diagnostischen Instrumentarium geführt.
Da die DNA in kernhaltigen Körperzellen
(z. B. weißen Blutkörperchen, Mundschleimhaut, Haarwurzeln, Urin) vorkommt, ist die Gewinnung des Untersuchungsmaterials relativ einfach.
Bei angeborenen Erkrankungen unterscheidet man zwischen vererbten und im
ungeborenen Lebewesen spontan entstandenen Fehlern der Erbmasse (Neumutationen). Beide können an künftige Generationen weitergegeben werden. Für die Weitergabe der genetischen Information von einer
Zelle zur anderen sind Schlüsselenzyme
(Polymerasen) verantwortlich. Sie sind ungeheuer leistungsfähig und zuverlässig –
und machen trotzdem Fehler. Zwar verfügt
der Körper über Kontroll- und Korrekturmechanismen, die solche Fehler beheben.
Doch wenn der Korrekturmechanismus versagt, kann das schwere Auswirkungen haben. Genügt die Veränderung in einem Gen
als Krankmacher, spricht man von einer monogenetischen Erbkrankheit.
Bei polygenetischen Krankheiten müssen mehrere Veränderungen vorliegen, damit es zur Erkrankung kommt.
Das Genom ist die genetische Gesamtinformation, die Blaupause des Bauplanes
des Organismus. Das menschliche Genom
besteht aus drei Milliarden Basenpaaren
und etwa jede 100. bis 300. Base ist von
Mensch zu Mensch verschieden (polymorphe DNA-Gestalt). Die Sequenzierung des
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Molekularbiologie, Hämostase
Genoms ist abgeschlossen, doch nicht alle
Gene (etwa 30 000) sind lokalisiert und
identifiziert. Welche Gene mit Erkrankungen assoziiert sind, muss zum großen Teil
noch erforscht werden.
Gen und Mutationen
Ein Gen ist eine physikalische und funktionelle Einheit der Vererbung. Es enthält die
Information für eine Funktion. Biochemisch ist es eine geordnete Abfolge von Nukleotiden (aus den Basen: Adenin, Guanin,
Cytosin, Thymin), die sich an einer bestimmten Position in unserem Genom befinden müssen. Findet sich ein Gen nicht an
der definierten Position des speziellen
Chromosoms, dann hat es nicht die Funktion, die es haben sollte. D. h., ein Gen muss
an der richtigen Stelle, im richtigen Umfeld
lokalisiert sein. Änderung der Position eines
Gens führen u. U. zu geänderten Funktionen
und evtl. zu Erkrankungen.
Man unterscheidet verschiedene Mutationen
Punkt- und kleine Mutationen sind
Änderungen der genetischen Information,
die eine oder wenige Nukleotide betreffen.
Sie können dazu führen, dass die im betroffenen DNA-Abschnitt festgelegte Information in verminderter oder erhöhter Menge
oder falsch abgelesen wird, was gravierende
Konsequenzen nach sich ziehen kann.
Große Mutationen (z. B. Chromosomenveränderungen wie Translokationen)
sind verbunden mit dem Austausch von Sequenzen zwischen Chromosomen, Inversionen mit Sequenzverschiebungen innerhalb
eines Chromosoms oder Gens, große Insertionen, große Deletionen sowie numerische
Veränderungen, bei denen sich bereits im
Mikroskop feststellen lässt, dass eine Abweichung von der Norm vorliegt. Große
Mutationen sind in der Regel mit dem Verlust der ursprünglichen Genfunktion verbunden. Unter Umständen kann es zur Ausprägung neuer Funktionen kommen.
Polymorphismen sind genetische Veränderungen (Mutationen), die in bestimmten Populationen häufig (>1%) zu finden
sind, meist nur geringe Auswirkungen haben und zur Diversität des Genoms beitra-
gen. Man rechnet mit mehreren Millionen
Polymorphismen im humanen Genom. Ein
bekanntes Beispiel einer polymorphen Variante aus dem Gebiet der Hämostaseologie
ist die Faktor-V-Leiden-Mutation.
Schon früh fand man heraus, dass Polymorphismen in unmittelbarer Nähe von
kausalen Mutationen liegen und mit diesen
vererbt werden können. Diese Polymorphismen eignen sich als genetische Marker in
Familien, wo man die Mutation nicht kennt
(d. h. man analysiert nicht die Mutation direkt sondern die Vererbung des Polymorphismus; man macht eine Vererbungsanalyse, eine Linkage-Analyse). Als genetische
Marker dienen z. B. Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLP) oder short
tandem repeats (STR).
Inzwischen weiß man, dass Polymorphismen auch in Steuerregionen von Genen,
z. B. Promoter oder 3’-untranslatierte Region (Prothrombin-20210G>A-Variante), vorkommen und die Konzentration eines Proteins beeinflussen. Diese Polymorphismen
stehen häufig in Zusammenhang mit der
synthetisierten Proteinmenge (z. B. führt
der Polymorphismus im Prothrombin-Gen
zu erhöhter Prothrombinkonzentration im
Plasma).
Genanalyse
Die moderne Diagnostik hat zum Ziel, die
Prophylaxe zu unterstützen und Erkrankungen zu verhindern. Dazu bedarf es einer spezifischen und sensitiven Diagnostik. Laboruntersuchungen mit konventionellen funktionellen oder biochemischen Tests sind
häufig von externen Störfaktoren beeinflusst und dadurch ungenau. Oft sind sie erst
nach Entnahme einer Gewebeprobe möglich. Genanalysen sind von externen Faktoren unabhängig. Bei molekulargenetischen
diagnostischen Anwendungen ist sorgfältig
zu beachten, dass
● Präanalytik,
● Qualitätssicherung,
● Standardisierung und Validierung der
Tests eine große Rolle spielen.
Genanalyse oder molekulargenetische
Diagnostik erhöht die diagnostische Si-
cherheit entscheidend. Zwei Möglichkeiten
gibt es auf der DNA-Ebene:
● Die direkte genomische Analyse ist die
Identifizierung der Mutationen im betroffenen Gen.
● Indirekte genomische Analyse (Kopplungsanalyse, Linkage-Analyse) ist die
Untersuchung von Markern, die eng mit
der im Gen lokalisierten Mutation gekoppelt sind.
Wie erwähnt, ist die DNA sehr polymorph –
die meisten Gene existieren in verschiedenen Ausprägungen. Man bezeichnet diese
als Allele. Üblicherweise benennt man die
häufigste Form als Wildtyp, die anderen Allele werden als Varianten bezeichnet.
Aussagesicherheit
Bei der direkten genomischen Diagnostik
liegt die Sicherheit der Aussage bei 99%, da
die kausale Mutation direkt bestimmt wird
(41). Bei der indirekten genomischen Diagnostik hängt sie von der Lage der Marker ab:
Liegt der Marker innerhalb des Gens (intragener Polymorphismus), ist z. B. bei Hämophilie B (mit dem relativ kleinen FIX-Gen)
mit einer Aussagesicherheit von 99% zu
rechnen. Liegt der Marker außerhalb des
Gens (extragener Polymorphismus), dann
ist die Aussagesicherheit geringer. Die Verminderung ist umso größer, je weiter der
Marker vom Gen entfernt ist. Der Grund dafür ist das Crossing-over zwischen Marker
und Mutationsort während der Reduktionsteilung (Meiose).
Für extragenische Marker liegt die Aussagesicherheit in der Regel bei etwa 95%.
Rechtliche Rahmenbedingungen
In den vergangenen Jahren wurde in den
meisten europäischen Ländern festgelegt,
dass Patienten genetischen Untersuchungen
zustimmen müssen. Die genauen Anforderungen sind in der EU in nationalen Gesetzen, Verordnungen oder Leitlinien festgelegt. Sie unterscheiden sich in den EUMitgliedsländern. In Österreich und
Deutschland gelten ähnliche Anforderungen, die hier besprochen werden sollen.
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Mannhalter
Deutschland
Genetische und pränatale Untersuchungen,
einschließlich Reihenuntersuchungen, sind
nur erlaubt, wenn die betroffene Person frei
und nach hinreichender Aufklärung zugestimmt hat. Vorbehalten bleiben die in einem Bundesgesetz vorgesehenen Ausnahmen. Ist die betroffene Person urteilsunfähig, so erteilt die Zustimmung ihr gesetzlicher Vertreter. Die Zustimmung kann jederzeit widerrufen werden. Im deutschen Bundesgesetz über genetische Untersuchungen
beim Menschen sind
● genetische Untersuchungen: zytogenetische und molekulargenetische Untersuchungen zur Abklärung ererbter oder
während der Embryonalphase erworbener Eigenschaften des Erbguts sowie
weitere Laboruntersuchungen, die unmittelbar darauf zielen, solche Informationen über das Erbgut zu erhalten.
– Zytogenetische Untersuchungen: Klärung der Zahl und der Struktur der
Chromosomen,
– molekulargenetische Untersuchungen:
Klärung der molekularen Struktur der
Nukleinsäuren (DNA und RNA) sowie
des unmittelbaren Genprodukts,
● präsymptomatische genetische Untersuchungen mit dem Ziel, Krankheitsveranlagungen vor dem Auftreten klinischer
Symptome zu erkennen, mit Ausnahme
der Untersuchungen, die ausschließlich
zur Abklärung der Wirkungen einer geplanten Therapie dienen;
● pränatale genetische Untersuchungen
zwecks pränataler Risikoabschätzung
während der Schwangerschaft zur Abklärung von Eigenschaften des Erbguts
des Embryos oder Fötus,
● pränatale Risikoabklärungen: Laboruntersuchungen, die Hinweise auf das
Risiko einer genetischen Anomalie des
Embryos oder Fötus geben sowie Untersuchungen des Embryos oder Fötus mit
bildgebenden Verfahren,
● Untersuchungen zur Familienplanung:
genetische Untersuchungen zur Abklärung eines genetischen Risikos für Nachkommen,
● Reihenuntersuchungen: genetische Untersuchungen, die systematisch der gesamten Bevölkerung oder bestimmten
●
Personengruppen angeboten werden, ohne dass bei der einzelnen Person ein Verdacht besteht, dass die gesuchten Eigenschaften vorhanden sind.
Genetische In-vitro-Diagnostika sind
fertige Erzeugnisse zum Nachweis von
Eigenschaften des Erbguts.
Österreich
Genetische Analysen sind Laboranalysen,
die zu Aussagen über konkrete Eigenschaften hinsichtlich Anzahl, Struktur oder Sequenz von Chromosomen, Genen oder
DNA-Abschnitten oder von Produkten der
DNA und deren konkrete chemische Modifikationen führen und die damit nach dem
Stand von Wissenschaft und Technik Aussagen zu Überträgerstatus, Krankheitsrisiko,
eine vorliegende Krankheit oder einen
Krankheits- oder Therapieverlauf am Menschen ermöglichen. Genetische Analysen
dienen der Feststellung einer
● bestehenden Erkrankung, die auf einer
Keimbahnmutation beruht,
● Prädisposition für eine Krankheit, insbesondere eine Veranlagung für eine
möglicherweise künftig ausbrechende
genetisch bedingte Erkrankung oder
Feststellung eines Überträger(innen)status, für die nach dem Stand von Wissenschaft und Technik Prophylaxe oder Therapie möglich sind,
● Prädisposition für eine Krankheit, insbesondere eine Veranlagung für eine
möglicherweise künftig ausbrechende
genetisch bedingte Erkrankung oder
Feststellung eines Überträger(innen)status, für welche nach dem Stand von Wissenschaft und Technik keine Prophylaxe
oder Therapie möglich sind einschließlich einer genetischen Analyse im Rahmen einer pränatalen Untersuchung.
Genetische Analysen dürfen nur bei Vorliegen einer schriftlichen Bestätigung der
zu untersuchenden Person durchgeführt
werden, die zuvor durch einen in Humangenetik/medizinischer Genetik ausgebildeten oder einen für das Indikationsgebiet
zuständigen Facharzt über deren Wesen,
Tragweite und Aussagekraft aufgeklärt
worden ist und aufgrund eines auf diesem
Wissen beruhenden freien Einverständ-
nisses der genetischen Analyse zugestimmt hat.
Humangenetische Beratung
Mit molekulargenetischer Diagnostik kann
z. B. die Vererbung von Hämophilie A und B
innerhalb der Familie verfolgt werden (40).
Welche Familienmitglieder in die Untersuchungen für die genetische Familienberatung einbezogen werden, hängt von der Familiensituation ab. Die humangenetische
Beratung ist fixer Bestandteil der genetischen Diagnostik und in Deutschland und
Österreich verpflichtend vorgeschrieben.
Ins Beratungsgespräch sind auch Fragen zur
Behandlung und Betreuung von Hämophilen und die spezifische Situation der Familie einzuschließen. Das Beratungsgespräch
ist schriftlich zu dokumentieren. Untersuchungen dürfen nur auf Wunsch des/der
Ratsuchenden erfolgen – Freiwilligkeit! Die
Konsequenzen aus den Ergebnissen der humangenetischen Diagnostik und Beratung
hat immer die Familie, der oder die Ratsuchende(n) zu treffen.
Gerinnungsstörungen
Molekularbiologische Diagnostik
bei Blutungsneigungen
Faktor VIII, Faktor-VIII-Mangel
und Hämophilie A
Faktor VIII (FVIII) ist ein Pro-Kofaktor, der
durch Thrombin aktiviert wird und dann als
Kofaktor des Faktors IX wirkt. Sein Molekulargewicht beträgt 280 kDa. Die normale
FVIII-Konzentration im Plasma liegt bei etwa
0,15 mg/l, bzw. 50–150%. Der plasmatische
Faktor-VIII-Spiegel ist beeinflusst durch die
Blutgruppe. Personen mit Blutgruppe 0 haben
signifikant niedrigere FVIII-Spiegel als Personen mit anderen Blutgruppen. Faktor VIII
ist als Akute-Phase-Protein bei Stress, Entzündung usw. erhöht. Die bei venösen und arteriellen Verschlusskrankheiten erhöhten FVIIISpiegel sind jedoch bei den meisten Patienten
unabhängig von Entzündungsvorgängen.
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Mannhalter
Das humane Faktor-VIII-Gen befindet
sich auf dem langen Arm des X-Chromosoms (Region Xq28) und besteht aus 26
Exons mit 186 Kilobasenpaaren (kb). Es gehört zu den großen Genen des menschlichen
Genoms (2). Von den 25 Introns sind sechs
länger als 14 kb. Das Intron 22 (IVS22) ist 32
kb lang und enthält die intronlosen Gene F8A
und F8B. F8B wird in der gleichen Richtung
wie das FVIII-Gen transkribiert, F8A wird in
die entgegengesetzte Richtung transkribiert.
Circa 400 kb in telomerischer Richtung vom
FVIII-Gen entfernt liegen zwei bis drei Kopien des F8A-Gens, die in der gleichen Transkriptionsrichtung wie das FVIII-Gen abgelesen werden. Die FVIII-mRNA enthält die
Information für ein Protein mit 2351 Aminosäureresten. Das Exon 14, das für die funktionell wenig bedeutende B-Domäne im
FVIII-Protein kodiert, umfasst nahezu 40%
der kodierenden Sequenz (cDNA).
Mit dem Namen Hämophilie bezeichnet
man die Bluterkrankheit, bei der zwei Formen unterschieden werden (Hämophilie A
und B), je nachdem, ob der Gerinnungsfaktor VIII oder IX im Blut fehlt. Die Krankheit
wird X-chromosomal vererbt und trifft in
erster Linie Männer. Frauen können Trägerinnen der Erkrankung sein und sie an ihre Söhne weitergeben, bei denen sie phänotypisch ausgeprägt ist. Töchter sind in der
Regel klinisch nicht betroffen, sie können
die Erkrankung an die nächste Generation
vererben. Da Frauen meistens asymptomatisch sind, können X-chromosomale Defekte mehrere Generationen überspringen. In
Einzelfällen ist eine Hämophilie bei Frauen
möglich, die Ursachen dafür sind vielfältig
und nicht vollständig erforscht. Bei chirurgischen Eingriffen können die bei Überträgerinnen häufig verminderten Faktor-VIIIGerinnungsaktivitäten zu Blutungskomplikationen führen.
Wir wissen, dass Hämophilie A durch
komplettes Fehlen, schweren Mangel oder
defekte Funktion des Gerinnungsfaktors
VIII ausgelöst wird. Da die Hämophilie B
durch einen Defekt oder den Mangel an Gerinnungsfaktor IX, einem Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsprotein, verursacht
wird, ist eine Unterscheidung der beiden Erkrankungen aus therapeutischen Gründen
essenziell. Mittels Gerinnungstest ist die
Differenzierung möglich.
Genetische Untersuchungen
Das Faktor-VIII- und Faktor-IX-Gen wurden Mitte der 1980er Jahre entschlüsselt.
Seitdem ist es möglich, die genetischen Ursachen bei Patienten und ihren weiblichen
Angehörigen zu identifizieren. Hämophilie
A tritt bei etwa einem von 8000 bis 10 000
Männern auf, die Hämophilie B nur bei etwa einem von 50 000 Männern.
Das klinische Bild der Hämophilie A ist
heterogen. Man unterscheidet entsprechend
der Faktor-VIII-Aktivität (90) Patienten mit
● schwerer Hämophilie A (<1%),
● mittelschwerer (1–5%) und
● leichter Hämophilie A (>5% – <40%).
Meistens geht die verminderte funktionelle
Aktivität mit dem Fehlen des FVIII-Proteins
im Plasma einher. In Einzelfällen ist mit immunologischen Methoden ein defektes
FVIII-Protein im Plasma detektierbar.
Folgende Mutationstypen wurden bei
Patienten mit Hämophilie A gefunden:
● große Deletionen und Insertionen (im
kb-Bereich),
● Inversionen,
● kleine Deletionen bzw. Insertionen
(<100 bp) und
● Punktmutationen.
mutationen können im gesamten FVIII-Gen
entstehen und mit schweren oder leichten
Formen assoziiert sein.
Da in der Meiose weiblicher Keimzellen
die homologe Paarung der X-Chromosomen eine Rekombination wenig wahrscheinlich macht, treten bestimmte Veränderungen im FVIII-Gen (v. a. die Inversion im Intron 22) überwiegend in männlichen Keimzellen auf.
Inversionen im Faktor-VIII-Gen
Die Inversion im Intron 22 geht auf eine
Paarung zwischen dem im Intron 22 liegenden F8A-Gen und dessen extragenen Kopien zurück. Crossing-over-Ereignisse zwischen der distalen extragenen Kopie und
dem Intron-22-F8A-Gen führen zur Typ1-Inversion, Crossing over zwischen der
proximalen extragenen Kopie und dem intragenen F8A-Gen zur Typ-2-Inversion. Die
Inversionstypen 3A und 3B weisen auf eine
dritte extragene F8A-Kopie hin. Die Inversion zerstört die FVIII-Genstruktur (schwere Hämophilie A).
Eine Inversion im Intron-1 wurde vonBagnall et al. (4) beschrieben, die für 2–5% der
schweren Hämophilien verantwortlich ist.
Weitere Mutationstypen
Deletionen und Insertionen
In den ersten Untersuchungen fand man bei
ca. 5% der Patienten mit Hämophilie A große Deletionen, d. h. ein Stück des FVIIIGens fehlt. Interessanterweise hatte jeder
Patient seine individuelle Deletion. Das
Ausmaß dieser Deletionen variierte zwischen einem kleinen Stück und der totalen
Deletion des FVIII-Gens.
Bei einigen Patienten mit Hämophilie A
wurden Insertionen im FVIII-Gen gefunden. Sie kommen nur selten vor, und bei den
wenigen beschriebenen Fällen handelte es
sich stets um Neuerkrankungen.
Da Hämophilie A bis vor relativ kurzer
Zeit tödlich war, ihre Häufigkeit aber über
Jahrtausende etwa gleich blieb, war naheliegend, dass immer wieder Neumutationen
vorkommen. Daher kann auch bei Familien
ohne bekannten Erbgang Hämophilie A auftreten. Etwa 30% der Hämophilie-A-Erkrankungen sind Neuerkrankungen. Neu-
Mit einer Häufigkeit von je etwa 10–15%
findet man
● Nonsense-Mutationen, die zu einem
Stopp bei der Translation führen,
● Missense-Mutationen, bei denen es zum
Austausch einer Aminosäure kommt,
● kleine Insertionen oder Deletionen, bei
denen einzelne Nukleotide eingefügt
werden oder fehlen und oft zur Verschiebung des Leserahmens führen,
● Spleißstellenmutationen, bei denen das
Herausschneiden der Introns gestört ist.
Patienten mit Faktor-VIII-Inhibitor
In den vergangenen Jahren zeigte sich, dass
die Art der Mutation das Risiko einer
Hemmkörperbildung wesentlich beeinflusst. Etwa 20–25% der Patienten mit
schwerer Hämophilie A entwickeln gegen
den therapeutisch zugeführten Faktor VIII
Antikörper, was die Behandlung beträcht-
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Molekularbiologie, Hämostase
lich komplizieren kann. Die Hemmkörperprävalenzen reichen von 88% bei großen,
mehrere Proteindomänen umfassenden Deletionen bis zu 3% bei Spleißstellen-Mutationen. Die Inversion im Intron 22 ist ebenso wie große Deletionen mit einem erhöhten
Risiko der Inhibitorentwicklung verbunden
(74). Aus diesem Grund ist es wichtig, nicht
nur den Faktor-VIII-Spiegel zu bestimmen,
sondern auch die Mutation eines Patienten
zu kennen. Dank der relativ einfachen
Nachweisbarkeit ist es heute möglich, mit
vertretbarem Aufwand die Mutationen zu
identifizieren.
Tab. 1 Faktor-VIII-Gerinnungsuntersuchung und molekulare Diagnostik bei weiblichen Verwandten von Hämophilie-A-Patienten: Der Überträgerinnenstatus wurde
durch Nachweis der kausalen, familienspezifischen Mutation gesichert.
Nr.
1
2
Überträgerin
nein
122
41
4
104
5
ja
6
7
9
Die Überträgerinnendiagnostik ist ein wichtiger Bestandteil der Hämophilie-Diagnostik. Frühe Methoden basierten auf der Faktor-VIII-Aktivität, die aber bei bei Überträgerinnen oft nicht eindeutig vermindert ist
(Tab. 1). Die Aussagesicherheit beträgt daher bestenfalls 70–85%.
Ein entscheidender Durchbruch in der
Konduktorinnendiagnostik war die Entdeckung genetischer Varianten (Polymorphismen) im FVIII-Gen. Diese sind
nicht für die Erkrankung verantwortlich, erlauben aber die Erkennung des Erbgangs
des krankheitskausalen Faktor-VIII-Gens
(Kopplungsanalyse, Linkage-Analyse).
Die Linkage-Analyse (Kopplungsanalyse) unterliegt mehreren Einschränkungen:
● Neben dem Erkrankten müssen alle nah
Verwandten (Eltern, evtl. Großeltern,
Geschwister) für die Untersuchung zur
Verfügung stehen.
● Die Vaterschaft muss gesichert sein.
● Manche Familien sind für die im FaktorVIII-Gen liegenden genetischen Merkmale (intragenische polymorphe Marker) nicht informativ (d. h. beide
X-Chromosomen der Überträgerin sind
nicht unterscheidbar). Hier kann die Vererbungsanalyse mit intragenischen Markern nicht durchgeführt werden.
● Mit zusätzlichen Markern, die außerhalb
des Faktor-VIII-Gens liegen (extragenische Marker), kann die Informativität
zwar erhöht werden, aber nur eine
95–96% diagnostische Sicherheit erreicht werden (Cross over).
● Neumutationen bleiben unerkannt.
81
3
10
70
171
nein
140
97
8
Überträgerinnendiagnostik
Faktor VIII (%)
ja
80
68
Natürlich ist die direkte Mutationsanalyse
und der Nachweis des familiären ursächlichen Gendefekts (Mutation) anzustreben,
da das am sichersten ist. Alle Mutationen
sind einer Datenbank HAMSTeRS (International Hemophilia A Mutation, Structure,
Test and Resource Site) zu entnehmen (49):
http://europium.csc.mrc.ac.uk.
Protein, wird im Endothel und den Plättchen
gebildet und nach Freisetzung ins Blut von
einer Metalloprotease (ADAMTS13) proteolytisch gespalten und in seine physiologische Form umgewandelt. Das VWF-Gen befindet sich auf Chromosom 12p13. Neben
dem funktionell aktiven Gen existiert ein
Pseudogen auf Chromosom 22.
Defekte in den Faktoren VII, IX, X
Die drei Faktoren VII, IX und X gehören neben Prothrombin zu den Vitamin-K-abhängigen prokoagulatorischen Gerinnungsfaktoren. Sie werden in der Leber synthetisiert
und zirkulieren, so wie der Faktor II (Prothrombin), im Blut als Proenzyme von Serinproteasen. Die Exon/Intron-Organisation
der Gene von FVII, FIX und FX ist identisch. Sie gehören zur gleichen Genfamilie
(13). Jedes Exon kodiert für eine Domäne:
● Exon 1 kodiert das Signalpeptid,
● Exon 2 das Propeptid und die GlaDomaine,
● Exon 3 die aromatische Aminosäuredomaine,
● Exon 4 und 5 die EGF-Regionen,
● Exon 6 die Aktivierungsdomaine und
● Exon 7 und 8 die katalytische Domaine.
Von-Willebrand-Syndrom
Das von-Willebrand-Syndrom (VWS), die
häufigste angeborene Blutungsstörung, ist
ausgelöst durch ein Fehlen oder Defekte im
von-Willebrand-Faktor (VWF). Sowohl der
qualitative als auch der quantitative VWFMangel sind durch genetische Veränderungen verursacht, die im Beitrag von Schneppenheim und Budde detailliert behandelt
werden (Hämostaseologie 2008; 28:
312–319).
Der VWF ist ein Adhäsivprotein, das in
der primären Hämostase die Verbindung
von Plättchen zum Subendothel herstellt
und auch Faktor VIII im Komplex bindet,
was ihn vor vorzeitigem Abbau schützt. Die
normale Plasmakonzentration beträgt 10
mg/l, bzw. 40–240%. Bei Personen mit
Blutgruppe 0 ist die VWF-Konzentration im
Blut um 25% niedriger als bei denen mit anderen Blutgruppen.
Der VWF, eines der größten Glykoproteine im Blut und gleichzeitig ein Akute-Phase-
Faktor IX und Faktor-IX-Mangel
Faktor IX (FIX) wird durch Faktor XI oder
den FVIIa-Tissue-Faktor-Komplex aktiviert. FIXa spaltet im Komplex mit FVIII,
Phospholipiden und Kalzium (Tenasekomplex) den Faktor X. Die Plasmakonzentration von FIX beträgt etwa 5 mg/l, bzw.
70–120%, bzw. 0,7–1,2 E/ml.
Das humane FIX-Gen besteht aus acht
Exons und sieben Introns, ist 33 kb lang und
auf dem langen Arm des X-Chromosoms in
Region Xq27.1 lokalisiert.
Der angeborene FIX-Mangel, die Hämophilie B, wird durch Fehlen oder funktionelle Defekte des Faktors IX verursacht, und
wie die Hämophilie A X-chromosomal-rezessiv vererbt. Daher gelten dieselben Vererbungsregeln. Die Häufigkeit der Hämophilie B beträgt etwa 1 in 50 000.
Wie bei Hämophilie A wurden folgende
Mutationstypen gefunden: große Deletionen (im kb-Bereich), kleine Deletionen
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Mannhalter
bzw. Insertionen (bis 30 bp) und Punktmutationen. Der größte Teil der zu einer Hämophilie B führenden Mutationen betreffen
einzelne Nukleotide, die in 68% der Fälle
Missense- und in 14% Nonsense-Mutationen darstellen. Deletionen oder komplexere
Veränderungen des Gens sind für 3% der
Faktor-IX-Gendefekte verantwortlich. Die
mit einer Hämophilie B assoziierten Mutationen sind in einem internationalen Register aufgeführt (vgl. www.kcl.ac.uk/ip/pe
tergreen/haembdatabase.html.).
Eine Besonderheit stellt die HämophilieB-Leyden dar. Sie beruht auf genetischen
Defekten, die in einem Bereich von 40 Nukleotiden in der FIX-Promoterregion angesiedelt sind. In dieser Region wurden spezifische Bindungsregionen für Transkriptionsfaktoren identifiziert und charakterisiert, z. B. binden hier NF1 (nuclear factor
1), HNF4 (hepatocyte nuclear factor 4) oder
DBP (D-site Bindungsprotein). Man konnte
zeigen, dass die Bindung der Transkriptionsfaktoren einem hormonellen Einfluss
unterliegt und Mutationen in den Bindungsorten für diese Transkriptionsfaktoren zu
Hämophilie-B-Leyden-Varianten führen.
Faktor VII und Faktor-VII-Mangel
Faktor VII nimmt eine Schlüsselstellung am
Anfang der Gerinnungskaskade ein. Er wird
durch die Faktoren IXa, Xa und XIIa aktiviert.
Zusammen mit dem Tissue-Faktor (TF) aktiviert er die Faktoren IX und X. Die Aktivierung von FX erfolgt zusätzlich über FIXa.
Die Exon/Intron-Organisation des FVIIGens ist identisch mit der des FIX-Gens.
Auch die Aminosäuresequenzen in beiden
Proteinen zeigen hohe Homologien. Das
humane FVII-Gen bestehend aus 8 Exons
ist 12 kb groß, am Chromosom 13q34 lokalisiert und enthält fünf polymorphe Stellen,
die für ~30% der Variation des FVII-Spiegel
im Plasma verantwortlich sind (22).
Erblicher FVII-Mangel ist ein seltener
Hämostasedefekt (Häufigkeit ca. 1 :
500 000) (73), der autosomal rezessiv weitergegeben wird. Die FVII-Konzentration
im Blut ist mit 500 µg/l (10 nmol/l) sehr gering. Ca. 1% des Faktors VII liegen im Blut
auch bei gesunden Personen in aktivierter
Form als Faktor VIIa vor (64). FVII-Database: www.europium.csc.mrc.ac.uk.
Molekulare Genetik des Faktor-VII-Mangels
Die häufigste Mutation stellt die MissenseMutation Ale294Val dar. Sie wurde in 78
nicht verwandten Patienten nachgewiesen.
Die hämorrhagische Prädisposition der Betroffenen ist sehr variabel. Die Korrelation
zwischen FVII-Aktivität und Blutungsneigung ist eher schlecht. Patienten mit einer
FVII-Aktivität unter 1% können unter
schweren Blutungen leiden. Patienten, die
homozygote oder doppelt heterozygote
FVII-Mutationen tragen, sind meist schwerer betroffen, Heterozygote sind in der Regel asymptomatisch (41).
Bemerkenswert ist, dass bei homozygoter Mutationen und sehr niedriger FVII-Aktivität die klinische Ausprägung variabel ist.
Extrem schwere klinische Symptomatik
wurde für homozygote Patienten der
Cys135Arg-Substitution (FVII-Aktivität
1–4%) beschrieben. Die Behandlung erforderte prophylaktische FVII-Substitutionen.
Bei doppelt Heterozygoten für verschiedene Mutationen ergibt sich ein differenziertes
Bild. Doppelt Heterozygote für die Mutationen Ala294Val und Val 281Phe weisen in allen Fällen eine schwere Symptomatik auf.
Die FVII-Aktivität bei diesen Patienten
(FVII : C < 1–5%) ist stark reduziert. Ein
ähnlich ausgeprägter FVII-Mangel und
schwere Symptomatik findet sich bei doppelter Heterozygotie von
● Ala294Val;404delC/Arg152stop und
● Asp242-His/Thr359-Met.
Soweit man aus den Daten ableiten kann,
scheint eine Korrelation zwischen spezifischen Mutationen und klinischer Symptomatik zu bestehen. Weitere Studien zur Abklärung dieser Beobachtung und zur Aufklärung der Mechanismen sind erforderlich.
Faktor X und Faktor-X-Mangel
Die Plasmakonzentration des Faktors X beträgt 8–10 mg/l (170 nmol/l). Der aktivierte
Faktor Xa spaltet im Komplex mit Faktor
Va, Phospholipiden und Kalziumionen Prothrombin zu Thrombin. Das FX-Gen (Länge: >27 kb) ist am Chromosom 13q34
stromabwärts (2,8 kb) vom FVII-Gen lokalisiert. Verschiedene Polymorphismen im
FX-Gen wurden beschrieben, doch ihre Be-
deutung für die Bildung und Regulierung
von Faktor-X-Spiegeln im Plasma ist nicht
gesichert.
Der angeborene FX-Mangel ist ein extrem seltenes (1 : 1 000 000) (13, 73), autosomal rezessiv vererbtes Blutungsleiden.
Als Ursache wurden bei einigen Patienten
große Deletionen nachgewiesen, aber die
meisten Defekte sind auch hier Einzelnukleotid-Mutationen, meistens MissenseMutationen (10). Im Rahmen des Greifswalder Registers (Greifswald registry congenital FX deficiency) wurden mehr als 59
Patienten aus 28 Zentren verschiedener
Länder (Deutschland, Slovakei, Costa Rica,
Venezuela, Polen und Schweden) untersucht. 33 Mutationen wurden identifiziert.
Data base Factor X: www.hgmd.org.
Heterozygote FX-Mangelzustände weisen im Allgemeinen keine Blutungsneigung auf, die Patienten können aber perioperativ bluten. In der Greifswalder Studie
wurden 28 homozygote und 7 compoundheterozygote Patienten mit FX-Mangel
identifiziert, deren FX-Aktivitäten unter
2% bzw. 3% liegen. 67 Patienten mit heterozygoten FX-Mutationen wurden analysiert: Schwere Blutungen, z. B. Hirnblutungen (21% der Patienten), gastrointestinale Blutungen (12%) und Hämarthrose
(33%) traten nur bei FX-Aktivitäten <1%
auf (41).
Faktor II und Faktor-II-Mangel
Der Faktor II (Prothrombin, FII) ist das Proenzym der zentralen Serinprotease des Gerinnungssystems, Thrombin. Prothrombin
wird durch den Prothrombinase-Komplex,
(FXa, FVa, Phospholipide und Kalziumionen) zu Thrombin umgewandelt. FII wird
in der Leber gebildet und ist Vitamin-K-abhängig. Das Molekulargewicht beträgt 72
kDa, die Plasmakonzentration liegt bei
100–200 mg/l bzw. 1,4 µmol/l. Das Gen für
Faktor II ist auf Chromosom 11p11-q12 lokalisiert, etwa 20 kb lang und hat 14 Exons.
Der kongenitale FII-Mangel wird autosomal-rezessiv vererbt und ist extrem selten
(1 : 1 Mio. bis 1 : 2 Mio) (73). Die Blutungsneigung hängt vom Ausmaß der Verminderung ab. Vollständiger Mangel an Prothrombin ist wahrscheinlich mit dem Leben
unvereinbar. Mehr als 30 verschiedene Mu-
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Molekularbiologie, Hämostase
tationen sind bekannt. Ein Beispiel ist
Thrombin Quick I, das bei Verwendung niedermolekularer, synthetischer, thrombinspezifischer Substrate eine normale Aktivität aufweist, die jedoch bei Verwendung des
physiologischen Substrates Fibrinogen hundertfach geringer ist (38).
Faktor V und Faktor-V-Mangel
Faktor V (FV) ist ein Makromolekül (Molekulargewicht 330 kDa) und wird durch
Thrombin zu FVa gespalten. Dieser wirkt
als Kofaktor für Faktor Xa zusammen mit
Phospholipiden und Kalziumionen und beschleunigt die Spaltung von Prothrombin zu
Thrombin. FV wird primär in der Leber gebildet. Die Plasmakonzentration wird mit
4–14 mg/l bzw. 20 nmol/l (10, 48) angegeben.
Das FV-Gen ist auf dem langen Arm des
Chromosoms 1q23 lokalisiert, nicht weit
vom Antithrombin-Gen, hat eine ungefähre
Länge von 80 kb und enthält 25 Exons (14).
Der kongenitale schwere FV-Mangel
(FV < 1%) ist ein sehr seltenes Blutungsleiden (1 : 1 Mio), das autosomal rezessiv vererbt wird. Heterozygote Fälle sind etwas
häufiger. Die Blutungsbereitschaft ist meist
mäßig ausgeprägt, kann aber schwer sein
wie bei dem erstbeschriebenen Fall durch
Owren 1947.
Interessant sind die sehr seltenen Fälle
von angeborenem, kombiniertem Faktor-Vund -VIII-Mangel, wobei die Aktivitäten sowohl von FV als auch FVIII <10% sein können. Die Mutationen hierfür wurden auf
dem Chromosom 18 lokalisiert. Die Ursache für den kombinierten Mangel liegt in einem Defekt eines intrazellulären Transportproteins (ERGIC-53, jetzt LMAN1 genannt). In einzelnen Patienten wurden auch
Kombinationen eines FV-Mangels mit einer
Verminderung anderer Gerinnungsfaktoren
beschrieben.
Faktor XI und Faktor-XI-Mangel
Faktor XI wird in der Leber synthetisiert
und ist das Proenzym der Serinprotease
FXIa, die Faktor IX aktiviert. Faktor XI wird
durch Faktor XII und durch Thrombin zu
Faktor XIa aktiviert, wobei die Aktivierung
durch Thrombin einen Verstärkungsmecha-
nismus darstellt, wodurch zusätzliches
Thrombin gebildet wird. Die FXI-Konzentration im Plasma beträgt 4–6 mg/l bzw.
30–60 nmol/l. Das FXI-Gen ist auf Chromosom 4q34-q35 lokalisiert und dem Präkallikrein-Gen benachbart. Es besteht aus
15 Exons, die sich über 23 kb erstrecken.
Der angeborene Faktor-XI-Mangel wird
autosomal vererbt. Der Vererbungsmodus
ist nicht eindeutig rezessiv, da auch Heterozygote eine leichte, aber eindeutige Blutungsneigung aufweisen können (10). FXIMangel kommt sehr selten vor, bei Ashkenaze-Juden tritt er häufiger auf. Die Blutungsneigung manifestiert sich fast ausschließlich perioperativ. Nur selten kommen spontane Blutungen vor. Dieses gilt
auch für schwere Mangelzustände von <1%.
Faktor XII und Faktor-XII-Mangel
Gerinnungsfaktor XII (FXII, HagemanFaktor) ist ein Proenzym einer Serinprotease und wird in der Leber gebildet. Er wird
durch den Kontakt mit negativ geladenen
Oberflächen gespalten und dadurch aktiviert. Faktor XIIa aktiviert Faktor XI, ist
aber auch am fibrinolytischen System sowie
am Kinin-Kallikrein-System und am Komplement-System beteiligt. Seine Plasmakonzentration beträgt 30 µg/ml bzw. 0,375
µmol/l. Das Faktor-XII-Gen ist 12 kb lang
mit 14 Exons und auf Chromosom
5q33-qter lokalisiert (10).
Im Allgemeinen besteht bei Patienten
mit angeborenem FXII-Mangel keine abnorme Blutungsneigung, wenngleich der
globale Gerinnungstest, die aPTT, beim
Faktor-XII-Mangel ungewöhnlich stark verlängert ist. Ein eindeutiger Zusammenhang
zwischen spezifischen Punktmutationen im
FXII-Gen und FXII-Mangel konnte nicht
nachgewiesen werden (10). Im Gegenteil,
sowohl schwere als auch milde FXII-Mangelzustände wurden mit einem erhöhten Risiko für venöse und arterielle Thrombosen
in Verbindung gebracht, nicht zuletzt, weil
der erste Patient, Hageman, bei dem ein
kongenitaler FXII-Mangel nachgewiesen
wurde, an einer Lungenembolie verstarb.
Man weiß schon lange, dass es große individuelle Unterschiede in den Plasmakonzentrationen von FXII gibt. Heute ist klar,
dass FXII-Spiegel u. a. genetisch geregelt
sind. Verantwortlich dafür ist ein Polymorphismus in der Promoterregion des FXII
Gens (-4C>T), der zur Bildung einer neuen
ATG-Sequenz (Start-, Kozak-Sequenz)
führt, die weniger aktiv ist als die originale
Kozak-Sequenz und zu niedrigeren FXIISpiegeln führt (47). Der Polymorphismus
findet sich besonders häufig in der ostasiatischen Bevölkerung und könnte für die
niedrigen Plasma-FXII-Spiegel bei Japanern verantwortlich sein. Ob der Polymorphismus das Thromboserisiko, beeinflusst,
bedarf weiterer Untersuchungen.
Fibrinogen und Fibrinogendefekte
Fibrinogen ist ein 340-kDa-Glykoprotein,
wird in der Leber gebildet und ist auch in
den Plättchen nachweisbar. Es besteht aus
drei paarweise angeordneten Polypeptidketten (Aα, Bβ, γ), die durch Disulfidbrücken
zusammengehalten werden. Die einzelnen
Ketten bestehen aus 610, 461 und 411 Aminosäureresten (62, 66, 89).Obwohl die
meisten biologischen und medizinischen
Eigenschaften des Fibrinogens mit seiner
Rolle in der Gerinnung zusammenhängen,
handelt es sich um ein Protein mit vielen
Funktionen: So vermittelt es die Plättchenaggregation wie auch andere Zell-zu-ZellInteraktionen. Als Bestandteil der extrazellulären Matrix ist es an normaler und gestörter Zellproliferation im Zusammenhang mit
z. B. Wundheilung, Angiogenese, Tumorentstehung, Metastasierung beteiligt (66).
Fibrinogen wird durch Thrombin zum
Fibrinpolymer umgewandelt unter Abspaltung von Fibrinopeptid A von den α- und
Fibrinopeptid B von den β-Ketten. Das Polymer wird durch Faktor XIII quervernetzt
und stabilisiert. Der Konzentrationsbereich
gerinnbaren Fibrinogens beträgt im Plasma
1,6–4,0 g/l oder 5–12 µmol/l, der des Fibrinogens 2,5–6,0 g/l. Die Fibrinogenkonzentrationen können inter- und intraindividuell
im physiologischen und pathologischen Bereich erheblich schwanken. Sie werden
hochreguliert in Akute-Phase-Situationen
durch eine Aktivierung der IL-6-responsiven Elemente in der Promoterregion der Fibrinogenketten (43, 86). Dieses ist von besonderem Interesse, da Akute-Phasen-Reaktionen durch Stimuli (z. B. Entzündung,
Rauchen) mit der Entwicklung kardiovasHämostaseologie 5/2008
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280
Mannhalter
kulärer Erkrankungen in Zusammenhang
gebracht wurden.
Für die drei Untereinheiten kodieren die
Gene FGG, FGA und FGB, die in dieser
Reihenfolge benachbart auf dem Chromosom 4q28 liegen. Dieser Gen-Cluster umfasst ca. 45 Kilobasen. Die kodierenden Sequenzen sind für das Gen FGA in fünf, für
FGB in sieben und für FGG in neun Exons
organisiert (10, 89). Genetische Variationen
erklären ca. 50% der Fibrinogen-Variabilität im Plasma; vgl. www.geht.org/database
ang/fibrinogen.
Die kongenitale Afibrinogenämie ist ein
extrem seltenes autosomal-rezessiv vererbtes Blutungsleiden. Mehr als 30 Mutationen
wurden beschrieben, die meisten im Gen
der Aα-Kette und nur wenige in dem der
Bβ-Kette (39). Bei der Afibrinogenämie ist
im Plasma Fibrinogen nicht oder nur in Spuren nachweisbar, während bei der Hypofibrinogenämie die Plasmaspiegel unabhängig von der Bestimmungsmethode deutlich
unter dem Referenzbereich (<1,5 g/l) liegen. Hypofibrinogenämien sind ebenfalls
sehr selten. Sie weisen kaum Spontanblutungen auf und sind generell durch eine eher
geringe Blutungsneigung charakterisiert.
Im Gegensatz zu diesen rein quantitativen Mängeln handelt es sich bei den
Dysfibrinogenämien um strukturelle Defekte des Fibrinogenmoleküls, häufig erkennbar durch die Diskrepanz zwischen erniedrigter Fibrinogenkonzentration, die mit
funktionellen Methoden (z. B. Clauss-Methode) bestimmt wurden und (sub)normalen
Antigenwerten. Dysfibrinogenämien können mit einer abnormen Blutungsneigung
oder auch in ca. 20% der Fälle mit einer erhöhten Bereitschaft zu venösen oder arteriellen Gefäßverschlüssen einhergehen.
Auch das gleichzeitige Vorkommen von
Thrombosen und Blutungsneigung wurde
beschrieben (10, 69, 70).
Dysfibrinogenämien sind durch eine
große Anzahl Mutationen bedingt (>350),
zumeist handelt es sich um Missense-Mutationen (65).
Gelegentlich werden auch kombinierte
Defekte gefunden, bei denen relativ niedrige Plasmakonzentrationen mit strukturellen Änderungen des Fibrinogens einhergehen. Die ersten molekularen Defekte im
Fibrinogen wurden vor mehr als 20 Jahren
durch exzellente, damals aufwändige proteinanalytische Arbeiten aufgeklärt (8). Mit
der Einführung DNA-diagnostischer Methoden ist die Aufklärungsrate von Mutationen in den Fibrinogengenen sprunghaft gestiegen.
Inzwischen wird von einer französischen
Arbeitsgruppe eine im Internet zugängliche
Datenbank aller Mutationen in den Fibrinogengenen regelmäßig aktualisiert (26): Fibrinogen variants database (www.geht.org).
Polymorphismen der Fibrinogengene
In den Fibrinogengenen wurde eine beträchtliche Zahl von DNA-Polymorphismen
identifiziert (25, 32): im kodierenden Bereich, in den Introns, im Promotor und anderen nicht translatierten Sequenzen.
Das Interesse an solchen Polymorphismen
resultiert vor allem aus dem Zusammenhang zwischen erhöhter Plasmafibrinogenkonzentration und dem Risiko für koronare
Herzkrankheit (24, 32).
Da die Fibrinogenkonzentration zumindest teilweise genetisch determiniert ist,
wurde nach DNA-Polymorphismen gesucht, die mit diesem Risikofaktor assoziiert sind. Tatsächlich steht insbesondere ein
Polymorphismus im Promotor des FGBGens (–455 G/A) im Verdacht, die Syntheserate der Bβ-Ketten und damit die plasmatische Fibrinogenkonzentration zu beeinflussen. Es wurde gezeigt, dass diese Position im Promoter die Bindung von Transkriptionsfaktoren beeinflusst und damit ein
funktioneller Zusammenhang zwischen Polymorphismus und Proteinbiosyntheserate
möglich erscheint (33).
Faktor XIII und Faktor-XIII-Mangel
Der Gerinnungsfaktor XIII (FXIII) ist das
Proenzym einer Transglutaminase, das
durch Thrombin, aber auch durch FXa aktiviert wird. FXIII kommt im Plasma als Heterotetramer (A2B2) mit zwei katalytischen
Untereinheiten A und zwei Träger-Untereinheiten B vor. In Plättchen findet sich nur
die A2-Form.
FXIIIa katalysiert die Quervernetzung
des Fibrins durch die Bildung von kovalenten ε(γ-Glutamyl)-Lysyl-Bindungen zwischen den γ- und α-Ketten des Fibrins. Die-
se Quervernetzung stabilisiert das Gerinnsel und schützt es vor vorzeitiger Auflösung
durch das fibrinolytische Enzym Plasmin.
FXIII vernetzt auch andere Proteine. Die
Plasmakonzentration von FXIII beträgt ca.
21 µg/ml. Das Gen für die Untereinheit A
liegt auf Chromosom 6p24–25. Es ist ca.
160 kb lang und enthält 15 Exons. Das Gen
für die Untereinheit B liegt auf Chromosom
1q31–32.1, ist ca. 28 kb lang und hat 12
Exons. Bislang wurden annähernd 50 Mutationen im Gen der A-Kette gefunden, die
über die gesamte kodierende Sequenz verteilt sind. Es gibt keine häufig wiederkehrenden Defekte, praktisch jede Patientenfamilie trägt ihre spezifische (private) Mutation (18, 44).
Kongenitaler FXIII-Mangel ist eine sehr
seltene autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung (1 : 5 Mio) (62). Eine schwere Blutungsneigung mit Spontanblutungen, aber
auch Gelenkblutungen und Hirnblutungen
besteht erst, wenn der FXIII <1% ist. Betroffene Frauen neigen zu wiederholten
Spontanaborten. Häufig ist die Wundheilung gestört mit abnormen Narbenbildungen. Allerdings wurde auch bei einigen Heterozygoten eine – meist leichte – Blutungsneigung beschrieben, sodass angenommen
wird, dass die Vererbung nicht ausschließlich rezessiv ist. Die meisten Heterozygoten
sind asymptomatisch, wenngleich perioperativ abnorme Blutungen vorkommen können.
Molekularbiologische
Diagnostik
und Thrombophilie
Ein funktionierendes Gerinnungssystem
war für das Überleben der Menschheit essenziell. Blutungsereignisse während der
Geburt sowie bei Verletzungen stellten
wichtige Todesursachen im jungen Alter
dar. Daraus resultierte ein starker Evolutionsdruck auf das Gerinnungssystem – geringer Blutverlust infolge einer Hyperreaktivität des Hämostasesystems war ein Überlebensvorteil unter damaligen Lebensbedingungen. Auch heute ist ein aktives Gerinnungssystem wichtig, aber es muss aus-
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Molekularbiologie, Hämostase
gewogen und im Gleichgewicht mit dem inhibitorischen und dem fibrinolytischen System stehen. Durch Ungleichgewicht und
Hyperreaktivität kommt es zu thrombotischen Erkrankungen, die die wichtigsten
Gründe für Morbidität und Mortalität in industrialisierten Ländern darstellen. Die
Thromboseentstehung ist auf drei Mechanismen zurückzuführen: Veränderungen der
● Gefäßwand (Alteration der Gefäßintima),
● Blutströmung (Stase),
● Blutzusammensetzung (Hyperkoagulabilität).
Erkrankungen mit einer Tendenz zur Hyperkoagulabilität des Blutes werden unter der
Bezeichnung Thrombophilie zusammengefasst. Schon lange ist die familiäre Komponente der Thrombophilie bekannt. Bei
mehreren Familien mit erhöhter Thrombosehäufigkeit konnten Mängel wichtiger Gerinnungsinhibitoren als Ursache der familiären Thromboseneigung identifiziert werden (Tab. 2). Aufgrund der Stammbaumanalysen nahm man zunächst einen autosomal
dominanten Erbgang an. Verschiedene
nachfolgende Studien stellten jedoch infrage, dass es sich bei der Thrombophilie um
eine monogenetische Erkrankung handelt.
Exemplarisch seien die Beobachtungen von
Miletich et al. genannt (63). Die Autoren
zeigten, dass Protein-C-Verminderungen
bei unselektierten Blutspendern viel häufiger vorkommen, als man aufgrund der Häufigkeit des Protein-C-Mangels bei Thrombosepatienten erwarten kann. Miletich et al.
postulierten, dass der Phänotyp der familiären Thrombophilie durch die Kombination
mehrerer Defekte (kombinierte Defekte)
ausgelöst wird. Neben dem Antithrombin(AT)-Mangel, der im Jahr 1965 beschrieben wurde (19), sind der Protein-C-Mangel
und der Protein-S-Mangel als Ursachen der
hereditären Thrombophilie seit etwa 30 Jahren bekannt (34).
Obwohl man annahm, dass die Wahrscheinlichkeit der Manifestation der
Thrombophilie mit der Anzahl der erworbenen und angeborenen Risikofaktoren eines
Patienten zusammenhängt (Tab. 2), dauerte
es bis 1993, bis der nächste wichtige Thromboserisikofaktor beschrieben wurde.
Tab. 2
●
●
●
●
●
●
●
●
●
Einige Thrombose-Risikofaktoren
Antithrombinmangel
Protein-C-Mangel
Protein-S-Mangel
Faktor-V-Leiden-Mutation (FV : R506Q)
Prothrombinvariante (FII G20210A)
erhöhter Faktor VIII
erhöhte Faktoren IX, XI, XII
Mutationen in Thrombomodulin
Mutationen im EPCR (endothelial cell protein C receptor)
Antithrombin-Mangel
Im Jahr 1965 beschrieben Egeberg et al (19)
mit Hilfe eines Tests den Antithrombinmangel als Ursache der familiären venösen
Thrombose. Antithrombin gehört zur Familie der Serpine und kann alle aktiven Enzyme der Gerinnungskaskade hemmen, bevorzugt inhibiert es Thrombin, Faktor Xa und
Faktor IXa. Ohne Kofaktoren ist Antithrombin ein langsamer Inhibitor, dessen Aktivität
aber durch Heparansulfate signifikant erhöht wird. Heparin, das zu den Heparansulfaten gehört, stimuliert die AntithrombinWirkung. Mit röntgenkristallographischen
Untersuchungen wurden die Konformationsänderungen im Antithrombin, die für die
Aktivierung verantwortlich sind, aufgeklärt
werden. Auch die Heparinbindungsregion
und die Domänen, die für die Interaktion
mit Thrombin und FXa verantwortlich sind,
wurden lokalisiert und charakterisiert.
Das Antithrombin-Gen ist auf dem langen Arm von Chromosom 1 (1q23–25) gelegen und umspannt sieben Exons und sechs
Introns. Molekulargenetische Untersuchungen haben unterschiedliche Mutationen
(Missense, Nonsense, Deletionen) als UrsaTab. 3 Prävalenz hereditärer Veränderungen in der
Normalbevölkerung
Gerinnungsstörung
Häufigkeit (%)
Antithrombinmangel
<1
Protein-C-Mangel
0,3
Protein-S-Mangel
<1
Faktor-V-Leiden heterozygot
5
Faktor V-Leiden homozygot
0,2
Prothrombin G20210A
2
erhöhter Faktor VIII
5
che des Mangels identifiziert. Diese können
zu verminderter Konzentration (Typ I) oder
funktionellen Defekten (Typ II) führen (vgl.
Lindhoff-Last et al. Hämostaseologie 2008;
28: 365–375). Bisher wurde noch kein Fall
eines homozygoten Typ-I-AntithrombinMangels detektiert, was darauf hinweist,
dass ein kompletter AT-Mangel mit dem Leben unvereinbar ist. Es gibt allerdings Berichte über homozygote Typ-II-Mängel mit
Mutationen in der Heparin-Bindungsregion. Auch der heterozygote Typ-I-Antithrombin-Mangel ist selten und findet sich
bei ca. einer von 2000 Personen (Tab. 3).
Betroffene haben ein etwa zehnfach erhöhtes Thromboserisiko. Bei Patienten mit venöser Thrombose stellt der AT-Mangel in ca.
1–2% aller Fälle die Ursache für die Erkrankung dar.
Protein-C-System
Das Protein-C-System basiert wie das Gerinnungssystem auf der regulierten Aktivierung von Serinproteinasen, wobei Thrombin nach Bindung an Thrombomodulin eine
neue Substratspezifität erhält und Protein C
(PC) zu aktiviertem PC (aPC) umwandelt.
Unter Mitwirkung der Kofaktoren Protein S
und Faktor V spaltet aPC die aktivierten
Faktoren V und VIII.
Protein C
Protein C gehört zu den Vitamin-K-abhängigen Plasmaproteinen. Es wird hauptsächlich in der Leber als einkettiges Polypeptid
synthetisiert und umfangreich posttranslational modifiziert (β-Hydroxylierung,
γ-Carboxylierung, Glykosylierung). Das
modifizierte PC hat ein Molekulargewicht
von 62 kD und besteht aus zwei Ketten, die
über Disulfidbrücken verbunden sind. In
der leichten Kette finden sich die γ-Carboxyglutaminsäure-Reste, die für die
Kalzium-vermittelte Bindung des Moleküls
an Phospholipidmembranen verantwortlich
sind. Das aktive Zentrum liegt in der schweren Kette des PC. Die PC-Plasmakonzentration beträgt 50 bis 80 nmol/l. Durch Abspaltung eines 12 Aminosäurereste langen Aktivierungspeptids vom aminoterminalen Ende der schweren Kette durch den Thrombin/
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282
Mannhalter
TM-Komplex wird PC in aktiviertes PC
(aPC) umgewandelt, das FVa und FVIIIa
durch spezifische proteolytische Spaltung
inaktiviert, wodurch die Thrombinbildung
gehemmt wird. Die nicht aktivierten Faktoren V und VIII werden nicht oder nur in geringem Ausmaß durch aPC angegriffen.
Das PC-Gen befindet sich am langen
Arm von Chromosom 2 (2q13), ist 11 kb
lang und besteht aus neun Exons, von denen
nur die Exons 2 bis 9 translatiert werden.
Die Exon-Intron-Organisation ist sehr ähnlich jener der anderen Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsfaktoren.
Die meisten Patienten mit ProteinC-Mangel zeigen eine Verminderung der
PC-Werte auf ca 35–60% des Normalwertes. Bei etwa 15% der Patienten findet man
einen Typ-II-Mangel mit normalem Antigen
und reduzierter Aktivität. In der 1995 aktualisierten Protein-C-Datenbank sind über
330 Mutationen beschrieben (75). Die hohe
Anzahl an Mutationen, die sich bei ProteinC-Mangel nachweisen lassen, weist darauf
hin, dass es für keine der Mutationen einen
positiven Selektionsdruck gegeben hat.
Wiederkehrende Mutationen finden sich
immer an besonders anfälligen Positionen
(hot spots). Etwa 3/4 der Mutationen sind
Missense-Mutationen. Nonsense-Mutationen oder kleine Insertionen bzw. Deletionen
finden sich bei etwa ¼ der Patienten. Bei
Typ-II-Mangel nachweisbare Mutationen
sind ausschließlich Missense-Mutationen.
In der Promoterregion des PC-Gens wurden Polymorphismen entdeckt, die den PCSpiegel beeinflussen. In einer kritischen
Evaluierung der Laboranalytik für Patienten
mit Verdacht auf PC-Mangel konnte bei
11/17 Patienten mit PC-Werten <70% eine
Mutation detektiert werden. Die PC-Werte
bei Patienten ohne nachweisbare Mutation
lagen bei 64 ± 7% während sie bei Patienten
mit Mutation deutlich niedriger, 50 ± 17%,
waren (53). Die Sequenzierung des PCGens ermöglicht eine Abgrenzung des erworbenen vom hereditären Protein-C-Mangel und stellt eine wertvolle diagnostische
Ergänzung zum Nachweis des hereditären
Protein-C-Mangels bzw. zur Feststellung
des Trägerstatus bei gut charakterisierten
Patienten und ihren Familien dar. Die Sequenzierung sollte erst zum Einsatz kommen, nachdem der PC-Mangel eindeutig
nachgewiesen wurde. Die diagnostische
Strategie sollte dem Schema folgen: Erhebung der klinischen Parameter,
● wenn gerechtfertigt → PC-Aktivitätsbestimmung,
● wenn gerechtfertigt → PC-Antigenbestimmung
● bei nachgewiesenem Mangel → PCGen-Sequenzierung.
Protein-S-Mangel
Protein S (PS) ist ein Vitamin-K-abhängiges
Plasmaprotein mit einem Molekulargewicht
von ca. 70 kD. Es wird überwiegend in der
Leber gebildet, aber auch in Endothelzellen,
Megakaryozyten und einigen anderen Geweben. Die PS-Plasmakonzentration beträgt ungefähr 330 nmol/l. Etwa 60–70%
sind an C4b-bindendes Protein, einem Bestandteil des Komplementsystems, gebunden. Der Rest zirkuliert frei im Plasma und
steht als Kofaktor für aktiviertes PC zur Verfügung. PS zeigt sowohl in gereinigten als in
plasmatischen Systemen eine PC-unabhängige gerinnungshemmende Wirkung.
Der PS-Genlocus befindet sich auf
Chromosom 3 in der Nähe des Zentromers
(3q11.1–3q11.2). Er setzt sich aus zwei Genen zusammen, dem funktionellen α-Gen
(PROS1) und einem inaktiven β-Gen (Pseudogen, PROS2). PROS1 ist über 80 kb lang
und umfasst 15 Exons.
Der Protein-S-Mangel wird durch Messung des freien und gesamten PS bestimmt.
Drei Formen des PS-Mangels werden unterschieden: Verminderte Aktivitä und bei
● Typ I: vermindertes und freies PS,
● Typ II: normales gesamtes und freies PS,
Typ III: normales gesamtes, vermindertes freies PS.
Die Angaben zur Häufigkeit des PS-Mangels
in Kaukasiern variieren zwischen 0,005 und
2,3% (Tab. 3). Diese weite Streuung der Angaben hängt zum Teil mit der diagnostischen
Unsicherheit des PS-Mangels zusammen.
Die klinische Bedeutung des PS-Mangels
wurde durch Familienuntersuchungen demonstriert. Das Thromboserisiko der PSMangelpatienten in einer großen schwedischen Familie war elfmal größer als das der
Angehörigen ohne PS-Mangel (82). Die kau-
salen Mutationen beim PS-Mangel sind recht
vielgestaltig und betreffen die gesamte Sequenz des PPOS1-Gens (67). In der 1997 aktualisierten PS-Datenbank sind 90 Mutationen erfasst. Die Heterogenität der
PROS1-Genmutationen konnte auch in der
2005 veröffentlichten PROSIT-Studie bestätigt werden. In 79 Mangelfamilien wurden 38
PROS1-Mutationen identifiziert. Expressionsuntersuchungen einzelner Mutationen
zeigten unterschiedliche Auswirkungen hinsichtlich PS-Expression und Thromboserisiko. Die molekulare Heterogenität macht eine
genaue Bestimmung des Thromboserisikos,
das einzelne PROS1-Mutationen vermitteln,
schwierig (7). Auch in der Studie von Labrouche et al. war nur bei der Hälfte aller untersuchten Patienten mit PS-Mangel eine heterozygote Mutation detektierbar. Interessanterweise war die Treffsicherheit der Sequenzanalyse bei Männern 90% im Gegensatz zu
39% bei Frauen (53).
Thrombomodulin
Thrombomodulin (TM) ist ein Membranglykoprotein mit einem Molekulargewicht
von 105 kD und besteht aus einer kurzen zytoplasmatischen Sequenz, einer Transmembranregion und einer extrazellulären Sequenz mit sechs epidermalen Wachstumsfaktor(EGF)-Domänen. TM findet sich vor
allem an den Endothelzellen der Blutgefäße
und des lymphatischen Systems, das Protein
wird aber auch ins Plasma abgegeben und
zirkuliert als lösliches Protein mit einem
MG von 85 kD.
Das Intron-lose Thrombomodulin-Gen
umfasst eine Länge von 3,6 kb und liegt auf
Chromosom 20. Thrombomodulin spielt eine bedeutende Rolle in der Regulation der
intravaskulären Gerinnung. Neben der bekannten Funktion in der Protein-C-Aktivierung wurde eine prothrombotische Wirkung
des Thrombin-TM-Komplexes beschrieben,
die auf der Aktivierung des Thrombin-aktivierbaren Fibrinolyse-Inhibitors TAFI beruht. Bei Patienten mit venöser Thrombose
wurden mehrere Punktmutationen im TMGen identifiziert. Allerdings konnte ihre
Relevanz für die Thrombophilie nicht eindeutig nachgewiesen werden, da Familienstudien weitgehend fehlen.
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Molekularbiologie, Hämostase
Kürzlich wurde nachgewiesen, dass TM
einer zirkadianen Regulation unterliegt.
Verantwortlich dafür dürften die Gene
CLOCK und BMAL2 sein, für die Bindungssequenzen im TM-Promoter identifiziert wurden (83).
In einigen Untersuchungen wurde die
C>T-Mutation an Nukleotidposition 1418
(Ala455Val) mit einem erhöhten Risiko für
venöse Thrombose assoziiert. Dieser Zusammenhang konnte in großen Folgeuntersuchungen (Atherosclerosis Risk in Community = ARIC Studie, Cardiovascular Health Study, Olmsted County Study) aber
nicht bestätigt werden (1, 37).
APC-Resistenz
Im Jahr 1993 identifizierten Dahlbäck et al.
eine Resistenz gegen aPC (aPC-Resistenz)
als Ursache für familiär gehäufte venöse
Thrombosen (17). Im Jahr 1994 wurde eine
Punktmutation im Faktor-V-Gen als Ursache für die aPC-Resistenz nachgewiesen.
Die Mutation wurde nach dem Ort ihrer
Entdeckung (Leiden, Niederlande) FaktorV-Leiden-Mutation genannt (6). Durch die
FVL-Mutation wird das Codon für Arginin
an Position 506 des Faktor-V-Moleküls, an
der aktiviertes Protein C den Faktor Va spaltet und inaktiviert, durch das Codon für Glutamin ersetzt (6). Das durch die Mutation
entstandene Faktor-V-Leiden-Protein ist
weniger sensitiv auf Spaltung durch aktiviertes Protein C als der normale Faktor Va.
Daher wird der durch die Mutation entstandene Faktor Va mit einer zehnfach langsameren Rate inaktiviert und bleibt länger in
der Zirkulation. Das führt zu einer erhöhten
Thrombingenerierung und damit zu einem
hyperkoagulabilen Zustand. Die FVL-Mutation ist für ca. 95% der Fälle von aPC-Resistenz verantwortlich (6).
Der FV-Leiden ist der häufigste erbliche
Gerinnungsdefekt in der kaukasischen Bevölkerung (Tab. 3). In Asien findet man die
Mutation nur in Teilen der indischen, arabischen und israelischen Bevölkerung. In
Schwarzafrikanern und australischen Ureinwohnern fehlt die Mutation. Der Grund
für die Exklusivität von FV-Leiden in der
weißen Bevölkerung liegt mit hoher Wahrscheinlichkeit darin, dass es sich um eine
Founder-Mutation handelt. Sie ist vermutlich etwa 25 000 Jahre alt und entstand zu einem Zeitpunkt, wo die Trennung der Kaukasier von den Asiaten und Afrikanern stattgefunden hatte (94).
Im Jahr 1997 beschrieben Bernardi et al.
einen bestimmten Haplotyp des FV Gens,
den sie Haplotyp HR2 nannten und der bei
Italienern, Indern und Somalis mit einer
Häufigkeit von 8–10% vorkam (5). Die Autoren zeigten, dass der HR2-Haplotyp die
aPC-Resistenz verstärkt und möglicherweise einen Risikofaktor für venöse Thrombosen (VTE) darstellt. Die Assoziation mit
VTE konnte jedoch nicht in allen Studien
nachgewiesen werden. 1998 wurde eine
weitere Mutation im FV-Gen in Codon 306
gefunden. Diese betrifft die zweite aPCSpaltstelle im Faktor-V-Gen, ist unter dem
Namen FV-Cambridge beschrieben und
wurde nur bei einzelnen Personen vorwiegend chinesischer Abstammung detektiert.
Ihre Bedeutung für das Thromboserisiko ist
unklar.
Die FV-Leiden-Mutation regte die
Thromboseforschung an, wie keine genetische Veränderung zuvor. Das mit der Mutation verbundene Thromboserisiko ist in vielen Fall-Kontrollstudien eindeutig nachgewiesen und statistisch gesichert. Die heterozygote Mutation führt zu einem drei- bis
siebenfach erhöhten Risiko für VTE, während die homozygote Mutation das Risiko
20- bis 80-fach erhöht. Interessanterweise
sind bestimmte Ausprägungen der Thrombophilie bei der FV-Leiden-Mutation selten.
So ist z. B. das Risiko, eine Lungenembolie
zu entwickeln, relativ niedrig, vielleicht,
weil diese Patienten seltener eine iliofemorale tiefe Venenthrombose haben als NichtMutationsträger (59).
Die Einschätzung der Bedeutung der FVLeiden-Mutation für das Rezidiv-Thromboserisiko war bis vor Kurzem kontrovers. In
einer Metaanalyse wurden alle randomisierten, kontrollierten Studien und prospektiven
Kohortenstudien ausgewertet. Die Statistik
zeigte klar, dass die heterozygote FV-Leiden-Mutation mit einem erhöhten Rezidivrisiko assoziiert ist (relative Risikoerhöhung 1,39) (57).
Übereinstimmung herrscht, dass ein generelles Screening nicht von Nutzen ist, die
getesteten Personen verunsichern kann und
daher grundsätzlich abzulehnen ist. Eine gezielte Untersuchung von Patienten, die eine
Thrombose erlitten haben bzw. von Angehörigen, die sich in Risikosituationen befinden,
kann sinnvoll sein. Als Gruppen mit hohem
Risiko gelten z. B. Frauen, die oral Östrogenpräparate nehmen, Schwangere und Patienten nach großen orthopädischen Eingriffen.
Sowohl für die hormonale Kontrazeption als
auch Hormonersatztherapie (HRT) gibt es einen gesicherten Zusammenhang zwischen
FV-Leiden-Mutation und VTE-Risiko (Tab.
4). Homozygote FV-Leiden-Mutationsträgerinnen haben ein 34-fach erhöhtes Risiko
während der Schwangerschaft eine Thrombose zu entwickeln. Auch die Abortusrate ist
bei FV-Leiden-Trägerinnen während der gesamten Schwangerschaftsdauer erhöht. Patientinnen mit rezidivierenden Aborten
könnten von einer FV-Leiden-Analyse und
anschließender Behandlung mit Antithrombotika wie unfraktioniertem Heparin oder
NMH profitieren (vgl. Lindhoff-Last et al.
Hämostaseologie 2008; 28: 365–375). Allerdings fehlen dazu derzeit Placebo-kontrollierte multizentrische Studien. (55, 72).
Eine Kosten/Nutzenrechnung zeigte,
dass selektives Thrombophilie-Screening
das auf vorangegangenen Ereignissen und
Familienanamnese aufbaut, kosteneffektiver als generelles Screening ist. Ein Screening vor HRT ist deutlich kosteneffizienter
als das vor Verschreibung hormonaler Kontrazeptiva (91).
Kombinierte genetische Defekte
Die hohe Prävalenz der FV-Leiden-Mutation und Prothrombinvariante machen eine
Vielzahl von Kombinationen mit anderen
erblichen Risikofaktoren wahrscheinlich.
Bereits 1994/95 fand man heraus, dass viele
Patienten mit dominantem Protein-C- oder
-S-Mangel auch eine FV-Leiden-Mutation
tragen (30, 68). Das beobachtete Thromboserisiko bei kombiniertem Mangel ist deutlich höher als das von Personen mit isoliertem PC- oder PS-Mangel. Die Thrombose
tritt bereits im jüngeren Lebensalter auf.
Wie wir und andere zeigten, kommt die FVLeiden-Mutation häufig in Kombination
mit dem zweithäufigsten genetischen Risikofaktor vor, der Prothrombinvariante
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Mannhalter
20210G>A. Patienten mit beiden Varianten
haben ein deutlich erhöhtes Thromboserisiko. In unserer Studie war die Wahrscheinlichkeit, eine Thrombose im Alter von 40
Jahren zu bekommen bei Vorhandensein
beider Mutationen etwa fünfmal so hoch
wie beim Vorliegen nur einer der beiden
Mutationen (78). Dieser beiden Mutationen
sind auch mit einer erhöhten Rezidivrate assoziiert (32)
In Europa sind etwa 15% der Bevölkerung Träger einer oder mehrerer hereditärer
Thrombophilie-Risikofaktoren.
Durch
Kombination thrombophiler Defekte mit
exogenen Faktoren (z. B. Rauchen, hormonale Kontrazeptiva, Hormonersatztherapie,
Operation oder Trauma) erhöht sich das
Thromboserisiko deutlich (20).
Faktor II und Thrombose
Die Prothrombin-Genvariante 20210G>A
ist der zweithäufigste genetische Thromboserisikofaktor neben FV-Leiden. Die Prävalenz der in der 3’ nicht translatierten Region
des Prothrombin-Gens liegenden Mutation
ist unter 5%, variiert aber stark je nach ethnischer Gruppe. Die Mutation führt zu einer
signifikant erhöhten Plasmakonzentrationen des Prothrombins (Faktor II) (74). Wie
in zahlreichen Studien gezeigt, ist die heterozygote Mutation mit einem zwei- bis dreifach höheren Thromboserisiko assoziiert.
Auffällig ist, dass etwa 40% der Personen
mit dem homozygoten 20210AA-Genotyp
asymptomatisch sind, und dass bei einer
großen Zahl der symptomatischen Patienten
zusätzliche Risikofaktoren nachweisbar
sind, die möglicherweise zum Phänotyp beitragen (9).
Wie kürzlich nachgewiesen, entwickeln
Träger der Prothrombin-20210G>A-Mutation deutlich öfter eine Pulmonalembolie
als Träger der FV-Leiden-Mutation (59).
Die Rolle der Prothrombin-Mutation für das
Rezidivrisiko wurde lange Zeit diskutiert.
In einer Metaanalyse, in der alle randomisierten, kontrollierten Studien und prospektiven Kohortenstudien ausgewertet wurden,
zeigte sich klar, dass die heterozygote Prothrombin-Mutation mit einem erhöhten Rezidivrisiko assoziiert ist (relative Risikoerhöhung 1,20) (57).
Tab. 4 Faktor-V-Leiden-Mutation, Hormone und venöse
Thrombose
SexualhormonGabe
Wildtyp heterozygot
homozygot
1
4–8fach
50–100fach
4fach
20–40fach
mehrere
100fach
Hormonersatz4,5fach
therapie
ca. 14fach
?
nein
orale
Kontrazeption
Faktor VII und Thromboserisiko
In verschiedenen Studien wurde eine erhöhte
Faktor-VII-Aktivität bei ischämischen Herzerkrankungen gefunden, z. B. Northwick
Park Heart Study (61), PROCAM-Studie
(36), was jedoch nicht in weiteren Studien
bestätigt wurde (42). Man vermutete, dass
bestimmte genetische Veränderungen, speziell einzelne Polymorphismen im Promoter
und in der kodierenden Region des FVIIGens, mit erhöhter Thromboseneigung assoziiert sind (58). Tatsächlich wurde in mehreren Studien gezeigt, dass der Aminosäureaustausch Arg353Gln, sowie drei häufige
Promotervarianten (eine 10-bp Insertions/
Deletionsvariante an Position –323 und die
beiden Punktmutationen –401G>T and
–402G>A) die plasmatische FVII-Konzentration beeinflussen. Die Bedeutung der verschiedenen Polymorphismen im FVII-Gen
für arterielle und venöse Thrombosen bzw.
koronare Herzkrankheiten ist unklar, wenngleich diese Polymorphismen interessante
Kandidaten für Risikovorhersagen bei der
koronaren Herzkrankheit sein könnten (79).
Nach unseren eigenen Ergebnissen ist
die –402G>A-Variation für das Schlaganfallrisiko von Bedeutung. Der homozygote –402AA-Genotyp, der zu erhöhten
FVII-Spiegeln führt, findet sich häufiger
bei Patienten mit ischämischem Schlaganfall als bei Gesunden (27).
Bei wenigen Patienten mit nachgewiesenem FVII-Mangel wurden ebenfalls Thrombosen beschrieben. In neueren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass bei diesen
Patienten mit FVII-Mangel und Thrombosen kein Zusammenhang mit einem bestimmten Genotyp/Mutation besteht (41).
FIX und venöse Thromboembolien
Erhöhte FIX-Spiegel im Plasma scheinen
mit einem erhöhten Risiko für venöse
Thrombosen (56, 84) und Myokardinfarkt
einherzugehen. Van Hylckama et al.zeigten,
dass Personen mit FIX-Spiegeln oberhalb
der 90. Perzentile ein zwei- bis dreifach höheres Risiko für venöse Thrombosen hatten
– unabhängig von Alter, Geschlecht, hormonaler Kontrazeption oder hohen FVIIIKonzentrationen. Kürzlich wurden in Probanden der Leiden-Thrombophilie-Studie
zwei Varianten im FIX-Gen identifiziert
(–816G>A und 32781A>G), die in gesunden Personen einen Einfluss auf FIX-Spiegel haben (–816AA+GA Träger: 116U/dl
versus –816GG Träger 103U/dl; 32781
GG+GA Träger 87U/dl versus 32781AATräger 103U/dl) (85). Es bedarf nun großer
Studien in weiteren Kollektiven, um diese
Daten zu bestätigen. Ob und welche Haplotypen des FIX-Gens das Thromboserisiko
beeinflussen, ist unklar.
Faktor VIII und Thrombose
Faktor-VIII-Spiegel zeigen eine hohe interindividuelle Variabilität. In mehreren Studien wurde der Zusammenhang zwischen
FVIII-Aktivität und Heredität nachgewiesen. Als genetische Komponenten konnten
Polymorphismen im AB0-Blutgruppenlocus identifiziert werden. Ein konstant erhöhter FVIII-Spiegel gilt inzwischen als
anerkannter Risikofaktor für venöse
Thromboembolien (45, 46) und arterielle
Thrombosen. Das Rezidivrisiko in Patienten mit einer ersten idiopathischen Thrombose ist bei FVIII-Spiegeln oberhalb der 90.
Perzentile mehr als fünffach erhöht (15,52).
Eine genetische Variation im Faktor VIII
Gen, die 92714C>G Mutation, die für einen
Aminosäureaustausch in Codon 1241 von
Asp>Glu kodiert, konnte eindeutig mit Faktor-VIII-Aktivität assoziiert werden. Bei
Trägern des C-Allels findet man signifikant
höhere FVIII-Aktivitäten (87). Ob diese Variante mit einem erhöhten Thromboserisiko
assoziiert ist, bedarf noch weiterer Untersuchungen.
Neben Veränderungen im FVIII-Gen
dürften auch Modifikationen in Rezeptoren
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Molekularbiologie, Hämostase
für die Regulation des FVIII von Bedeutung
sein. Wir konnten nachweisen, dass ein Polymorphismus im LDL-Rezeptor-relatedProtein 1 (LRP1), das an der Endozytose
und dem Abbau des FVIII beteiligt ist, zur
Regulation der FVIII-Spiegel beiträgt und
mit einem erhöhten Thromboserisiko assoziiert ist (88).
VWF und Thrombose
Für den von-Willebrand-Faktor (VWF) gilt,
wie für den Faktor VIII, dass zwar bei venösen und arteriellen Thromboembolien erhöhte VWF-Spiegel unabhängig von anderen Akute-Phase-Proteinen gemessen werden, dass aber ursächlich verantwortliche
Polymorphismen nicht eindeutig nachgewiesen werden konnten. Es bedarf weiterer intensiver Forschung, um zu verstehen,
wie VWF reguliert wird und welche genetischen Komponenten daran beteiligt sind.
Bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 1
und mikrovaskulären Komplikationen hat
man einen Polymorphismus in der kodierenden Region des VWF-Gens (Thr789Ala)
gefunden, der anscheinend mit einem erhöhten Risiko für koronare Herzkrankheit
assoziiert ist (54).
Faktor XII und Thrombose
Ein Zusammenhang zwischen Faktor-XIIMangel und venösen Thromboembolien
wurde schon vor Jahren angenommen,
wenngleich die ursprünglichen Arbeiten
von Halbmayer et al. (35) von anderen Autoren nicht bestätigt werden konnten. Die klinische Relevanz verminderter FXII-Aktivität für venöse und arterielle Thrombose ist
nicht endgültig geklärt, obwohl mehrere Arbeiten übereinstimmend zeigen, dass Menschen mit FXII-Konzentrationen zwischen
90% und 10% ein höheres Thromboserisiko
tragen als Menschen >100% oder <10%
FXII-Aktivität (3, 23, 29, 31, 92).
Kanaji et al. identifizierten eine genetische Variante im Faktor-XII-Gen, die für die
Regulation der Faktor-XII-Spiegel verantwortlich ist. Sie bestimmt die interindividuelle Variation der FXII-Spiegel, wenngleich
FXII-Spiegel auch von HypertriglyceridHämostaseologie 5/2008
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Mannhalter
ämien, Rauchen, Östrogen, Defekten im
FXII-Gen beeinflusst werden (21, 47).
Wahrscheinlich ist die 46C>T-Variante
nicht für eine erhöhte Bereitschaft zu venösen Thromboembolien verantwortlich. Bezüglich der Bedeutung für arterielle Thrombosen liegen zum Teil widersprüchliche Daten vor. Es werden weitere Studien benötigt
(51, 77, 92, 93).
Kürzlich konnte eine FXII-Knock-outMaus generiert werden. Mit Hilfe dieses
Modells war es möglich, zu verifizieren,
dass kompletter FXII-Mangel nicht mit erhöhter Blutungsneigung assoziiert ist.
Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass
FXII zur Thrombusbildung beiträgt und
Mäuse mit komplettem FXII-Mangel vor
arteriellen Thrombosen geschützt waren
(28, 50, 76). FXII könnte also ein neues Target antithrombotischer Therapiekonzepte
darstellen (80).
Fibrinogen und Thrombose
Erhöhte Fibrinogenspiegel im Plasma gelten
als wichtiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen. Die zwei best untersuchten Polymorphismen sind der Bc/I-Polymorphismus und der G(–455)A-Polymorphismus, beide in der Promoterregion der BβKette angesiedelt. Die Verbindung zwischen
diesen Polymorphismen und den Plasma-Fibrinogenspiegeln wurde in mehreren Studien nachgewiesen. Der –455G/A-Polymorphismus in der Promotorregion des Fibrinogen-Betaketten-Gens verursacht eine Steigerung der Produktionsrate der FibrinogenBeta-Kettenmoleküle und ist für eine ca.
11%ige Steigerung der Fibrinogenspiegel
verantwortlich, da die Bβ-Ketten-Transkription der limitierende Schritt in der Synthese
von Fibrinogen ist. Durch den höheren Fibrinogenspiegel wird auch die Viskosität des
Blutes erhöht. Hohe Fibrinogenspiegel im
Plasma führen zu dicken Fibrinfäden, die in
weiterer Folge in wenig permeablen und dadurch schwer lysierbaren Fibringerinnseln
resultieren. Durch den erschwerten Abbau
steigt das Risiko, dass diese Gerinnsel zu
Thrombosen führen. In einigen Arbeiten
wird beschrieben, dass Mutationen in den
Fibrinogengenen sowie bestimmte Haplotypen möglicherweise Risikofaktoren für das
Entstehen von Thrombosen sein können (11,
16, 80).
Bislang ist die Beweislage für die Bedeutung genetischer Varianten kontrovers. Geht
man davon aus, dass Fibrinogen ein AkutePhase-Protein ist, könnten der Entzündungsstatus arteriosklerotisch veränderter
Gefäße und die damit verbundenen hohen
Fibrinogenspiegel mindestens ebenso wichtig sein.
FXIII und Thrombose
Der Val34Leu-Polymorphismus ist eine
häufige Variabilität des Faktors XIII. Dabei
wird im Exon 2 des für FXIII A kodierenden
Gens G143 durch T ersetzt, was im fertigen
Protein dazu führt, dass die Aminosäure
Val34 im Protein durch Leucin ausgetauscht
wird. Das Allel für Valin ist das häufigere
(ca. 77%), die Frequenz des Leu-Allels bei
Europäern (und anderen Kaukasiern) beträgt ca. 23%.
Die mutierte Stelle im FXIII befindet
sich in der Nähe der Thrombin-Schnittstelle. Die Aminosäuresubstitution steigert die
Aktivierbarkeit von FXIII um das Zwei- bis
Dreifache. Dies bewirkt eine eine beschleunigte Quervernetzung der γ- und α-Ketten
der Fibrinmoleküle. Die Val34Leu-Mutation hat wahrscheinlich aufgrund der beschleunigten Fibrinquervernetzung bedeutsame Auswirkungen auf die Gerinnselstruktur. Sie sind durch dünnere Fibrinfasern und
kleinere Poren elektronenmikroskopisch erkennbar. Der Val34Leu-Austausch beeinflusst nicht die FXIII-Plasmakonzentration.
Die FXIII-Leu-Variante scheint mit einem verminderten Risiko für venöse
Thromboembolien bei Trägern einhergehen
(Odds-Ratio 0,63), unabhängig von anderen
Risikofaktoren wie FV-R506Q-, Prothrombin-G20210A-Variante, Geschlecht oder
Alter. Diese Beobachtung wurde nicht in allen Arbeiten bestätigt. Vermutlich hängen
die widersprüchlichen Ergebnisse mit einen
Polymorphismus im Gen der α-Fibrinogenkette (Th312Ala) zusammen, da dieser Polymorphismus die Gerinnselfestigkeit bei
Trägern des FXIII-34Leu-Allels zu beeinflussen scheint.
Die FXIII-34Leu-Variante findet sich
seltener bei Patienten mit Myokardinfarkt,
wenngleich das ebenfalls nicht von allen
Autoren bestätigt wurde. Allerdings wurde
der protektive Effekt des Leu-Allels bei arteriellen Verschlusskrankheiten in zahlreichen Studien beobachtet und auch im venösen System scheint dieser Polymorphismus
eine Rolle zu spielen (12). Die Rolle dieser
Mutation bei der Hirnblutung bzw. bei der
Verhütung von Hirninfarkten wird kontrovers diskutiert (22).
Schlussfolgerung
Von den vielen beschriebenen Mutationen/
Varianten/Polymorphismen konnten nur einige wenige in unabhängigen Studien als
Thromboserisikofaktor bestätigt werden.
Im Wesentlichen sind dies die Faktor-V-Leiden-Mutation und die Prothrombin-20210G>A-Variante. Gründe für die
widersprüchlichen Ergebnisse sind sicher
die Patientenzahl, unterschiedliches Studiendesign, verschiedene Einschlusskriterien,
Differenzen im ethnischen Hintergrund und
retrospektives Studiendesign.
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Prof. Dr. med. Christine Mannhalter
Medizinische Universität Wien, Klinisches Institut für
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Währinger Gürtel 18–20, 1090 Wien, Österreich
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