und Jugendmedizin Direktor Univ.-Prof. Dr. med. Norbert Wagner
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin Direktor Univ.-Prof. Dr. med. Norbert Wagner Apoptose neonataler und adulter Monozyten im Infektionsmodell mit Escherichia coli: Die Rolle des TNF-alpha Signalwegs Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigte Dissertation vorgelegt von Martin Haas aus Wittlich Berichter: Herr Universitätsprofessor Dr.med. Thorsten Orlikowsky Herr Universitätsprofessor Dr.med. Dr.phil. Frank Tacke Tag der mündlichen Prüfung: 2. Juli 2013 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis............................................................................................................ 2 Abkürzungen ................................................................................................................... 4 I. Einleitung ..................................................................................................................... 1 I.1 Epidemiologie der Sepsis ...................................................................................... 1 I.2 Humorale Faktoren bei der Sepsis....................................................................... 1 I.3 Monozyten und Infektion...................................................................................... 3 I.4 Rolle der Apoptose und Initiierung ..................................................................... 3 I.5 Das frühkindliche Immunsystem ......................................................................... 5 II. Zielsetzung der Arbeit ............................................................................................... 6 III. Material & Methoden .............................................................................................. 8 III.1 Material ............................................................................................................... 8 III.1.1 Zellen ............................................................................................................. 8 III.1.2. Materialien .................................................................................................... 8 III.1.3. FACS-Materialien......................................................................................... 9 III.1.4. Kits, Assays................................................................................................... 9 III.1.5. ELISA ........................................................................................................... 9 III.1.6. Geräte .......................................................................................................... 10 III.2 Methoden........................................................................................................... 11 III.2.1 Zellen ........................................................................................................... 11 III.2.1.1 Spender...................................................................................................... 11 III.2.1.2 Isolation mononukleärer Zellen ................................................................ 11 III.2.1.3 Zellzahlbestimmung.................................................................................. 12 III.2.1.4 Zellkultur................................................................................................... 12 III.2.2. Bakterien ..................................................................................................... 12 III.2.2.1 GFP-Bakterien .......................................................................................... 12 III.2.2.2 EOSFP-Bakterien...................................................................................... 13 III.2.3 Infektions- und Stimulationsversuche.......................................................... 13 III.2.3.1 Infektion mit E.coliGFP .............................................................................. 13 III.2.3.1.1 Proteinsynthesehemmung durch CHX................................................... 14 III.2.3.2 Infektion mit EOSFP Bakterien ................................................................ 14 III.2.3.3 Stimulation mit rekombinantem TNF-α.................................................... 14 III.2.4 TNF-α ELISA .............................................................................................. 14 III.2.5 FACS-Analysen ........................................................................................... 15 III.2.5.1 FACS-Gerät .............................................................................................. 15 III.2.5.2 Zellcharakterisierung und Immunophänotypisierung ............................... 15 III.2.5.3 Apoptose-Assays....................................................................................... 16 III.2.5.3.1 Modifizierte Färbung nach Nicoletti...................................................... 16 III.2.5.3.2 Vybrant Zellzyklus Analyse................................................................... 17 III.2.5.3.3 TUNEL-Färbung.................................................................................... 18 III.2.5.4 Phagozytose-Assay ................................................................................... 19 III.2.5.4.1 E.coliGFP ................................................................................................. 19 III.2.5.4.2 E.coliEOSFP .............................................................................................. 20 III.2.5.5 Intrazelluläre TNF-α Färbung ................................................................... 21 III.2.5.6 TNFR1-Färbung ........................................................................................ 22 III.2.6. Statistische Auswertung.............................................................................. 22 IV. Ergebnisse................................................................................................................ 23 IV.1 Infektion mit E.coliGFP und CHX .................................................................... 23 IV.2 Infektionsversuch Subpopulation ................................................................... 25 IV.3 TNF-α ELISA.................................................................................................... 26 IV.4 TNF-α Stimulation............................................................................................ 28 IV.5 Intrazelluläre TNF-α Färbung ........................................................................ 29 IV.6 TNFR1 Färbung ................................................................................................30 IV.7 Infektion mit E.coliEOSFP ..................................................................................31 IV.7.1 Kinetik der Phagozytose ..............................................................................32 IV.7.2 E.coliEOSFP Infektion und Apoptose.............................................................34 IV.7.3 E.coliEOSFP Infektion und intrazelluläre TNF-α Färbung.............................35 V. Diskussion .................................................................................................................37 V.1 Infektion und Apoptose von Monozyten ..........................................................37 V.2 Bystander-Apoptose, E.coliGFPund CHX .........................................................37 V.2.1 Bystander-Apoptose in nicht-phagozytierenden Monozyten – Verifizierung durch das E.coliEOSFP Modell ..................................................................................38 V.3 TNF-α Quantifizierung in Versuchsüberständen mittels ELISA..................39 V.4 Stimulation mit TNF-α ......................................................................................41 V.4.1 Intrazelluläre TNF-α Färbung .......................................................................42 V.5 TNF-α Rezeptor 1...............................................................................................43 V.6 Einordnung und Ausblick .................................................................................44 VI Zusammenfassung ...................................................................................................46 VII Anhang ....................................................................................................................47 VII.1 Referenzen .......................................................................................................47 VII.2 Publikationen...................................................................................................60 VII.3 Danksagungen .................................................................................................61 VII.4 Erklärung zur Datenaufbewahrung..............................................................62 VII.5 Erklärung über den Eigenanteil ....................................................................63 VII.6 Lebenslauf........................................................................................................64 Abkürzungen Ak Antikörper APC Antigen Presenting Cell Bim Bcl-2 Interacting Mediator of Cell Death CARS Compensatory Anti-inflammatory Response Syndrome CCL2 Chemokine (C-C motif) ligand 2 CD Cluster of Differentiation CBMO Cord Blood Monocytes CHX Cycloheximid DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol DC Dendritic Cell DNA Desoxyribonucleinsäure dUTP 2'-Deoxyuridin 5'-Triphosphat E.coli Escherichia coli E.coliEOSFP Fixierte Escherichia coli mit EOSFP-Fluorchrom E.coliGFP GFP exprimierende Escherichia coli ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EOSFP Fluoreszierendes Protein aus der Steinkoralle Lobophyllia hemprichii FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FCS Fetal Calf Serum FITC Fluorescein Isothiocyanate FLIP(L) FLICE-Like Inhibitory Protein GFP Grün fluoreszierendes Protein GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor Ig Immunglobulin IL Interleukin LPS Lipopolysaccharid mRNA Messenger RNA Mo Monozyten Mo BI Monozyten, die E.coliEOSFP binden oder phagozytieren MoGFP- Monozyten, die keine E.coliGFP gebunden haben MoGFP+ Monozyten, die E.coliGFP gebunden haben MOI Multiplicity of Infection MoNC Monozyten, die keinen Kontakt zu E.coliEOSFP hatten MoPH Monozyten, die E.coliEOSFP in das Phagolysosom transportiert haben NF-kappaB Nuclear Factor 'kappa-light-chain-enhancer' of Activated B-cells OD Optische Dichte PBMO Peripheral Blood Monocytes PBS Phosphat Buffered Saline PE Phycoerythrin PFA Paraformaldehyd PI Propidiumiodid PICD Phagocytosis Induced Cell Death PUMA p53 Upregulated Modulator of Apoptosis RNA Ribonukleinsäure Rpm Revolutions per minute (“Umdrehungen pro Minute”) SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome Tdt Terminale Desoxyribonukleotidyltransferase TNF-α Tumor Necrosis Factor alpha TNFR1 Tumor Necrosis Factor alpha Rezeptor 1 TRAIL TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling TWEAK TNF-related Weak Inducer of Apoptosis I. Einleitung I.1 Epidemiologie der Sepsis Fast anachronistisch erscheint die Häufigkeit und Mortalität der Sepsis in der Zeit von antimikrobiellen und immunmodulatorischen Therapien. Mit einer Inzidenz von 240/100.000 (Sepsis) und 51-95/100.000 (schwere Sepsis) in den USA spielt sie noch heute eine ökonomisch wichtige Rolle und gilt als die 10. häufigste Todesursache. Ungeachtet der Tatsache, dass die Sterblichkeit bei Sepsis von vielerlei individuellen Faktoren abhängt und selbst zwischen verschiedenen US-Staaten um den Faktor 2 variiert, spiegelt eine durchschnittliche Mortalität von 65,9/100.000 Einwohner zwischen 1999 und 2005 in den Vereinigten Staaten dennoch die immense Rolle dieser Erkrankung wieder (Wang et al., 2010). Da die Inzidenz in den letzten 2 Jahrzehnten deutlich angestiegen ist (Danai et al., 2005), hat die Notwendigkeit die Ursachen der Sepsisgenese zu untersuchen weiter zugenommen. Betrachten wir nun die Fallzahlen der Neugeborenensepsis (1. bis 28. Lebenstag) bietet sich ein noch drastischeres Bild. Hier erreichen die Erkrankungshäufigkeiten bis zu 30% (30.000/100.000) bei Neugeborenen mit sehr geringem Geburtsgewicht (< 1500 g), über 0,4 % (400 / 100.000) bei Frühgeborenen bis zu ca. 0,1 % (100 / 100.000) bei Reifgeborenen (Parravacini et al., 2002), was auf die Unreife des frühkindlichen Immunsystems zurückgeführt wird. Die durchschnittliche Mortalität betrug in verschiedenen Studien jeweils etwa 10% (Watson et al., 2003; Isaacs et al., 1995). Die Tatsache, dass besonders Frühgeborene und ältere Menschen (Angus et al., 2001), und damit potentiell immunkompromittierte Patienten suszeptibel für die Sepsis sind, führt uns nochmals die wichtige Rolle des Immunsystems und dessen molekularbiologischen Interaktionen mit Krankheitserregern bei der Pathogenese der Sepsis vor Augen. I.2 Humorale Faktoren bei der Sepsis Lange Zeit galt eine Hyperinflammation mit humoraler und zellulärer Aktivierung als Reaktion auf eine Infektion als ursächlich für die Sepsis (Warren, 1997; Stone, 1994), 1 oder genauer für ein SIRS (= Systemic Inflammatory Response Syndrome) (Bone et al., 1992). Dieses Konzept wird in den letzten Jahren durch einen komplexeren Ansatz abgelöst, der auf verschiedene Erkenntnisse zurückzuführen ist. Zum Einen blieben viele immunmodulatorische Therapieansätze mit dem Ziel der überschießenden Inflammation entgegenzuwirken ohne den gewünschten Erfolg. So gehören AntiEndotoxin-Antikörper (Ziegler et al., 1991), Kortikosteroide (Bone et al., 1987), TNF-α (Tumor Nekrose Faktor alpha) –Antagonisten (Abraham et al., 1995; Fisher et al., 1996) und IL-1 Rezeptor-Antagonisten (Fisher et al., 1994) in die Liste erfolgloser Therapieversuche für die vermeintliche Hyperinflammation. Des Weiteren konnte eine signifikante Anfälligkeit für opportunistische Infektionen nach initialem Sepsisgeschehen im Mausmodell nachgewiesen werden. Die Versuchstiere waren vier Tage nach der artifiziellen Sepsis deutlich anfälliger für eine Atemwegsinfektion mit Pseudomonas aeruginosa und wiesen vermehrt Apoptose von Immunzellen auf (Muenzer et al., 2010). Beides spricht für die Existenz einer immunosuppressiven Komponente bei der Pathogenese und dem Verlauf der Sepsis (Hotchkiss et al., 2003). Folglich geht man heute von einer anfänglich überschießenden Immunreaktion auf Erregerkontakt aus, die von einer längeren Phase der Immunsuppression abgelöst wird und erheblichen Einfluss auf die Prognose hat (Hotchkiss et al., 2009). Diese Phase wird auch gemeinhin als CARS (= Compensatory Anti-inflammatory Response Syndrome) bezeichnet (Oberholzer et al., 2001). In einer Studie aus dem Jahre 1995 konnte nach Stimulation von Vollblut-Proben verschiedener Probanden mit LPS eine signifikant geringere Menge der pro-inflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-6 und IL1β bei Sepsis-Patienten verglichen mit der Kontroll-Gruppe festgestellt, und damit die Suppression messbar gemacht werden (Ertel et al., 1995). Eine teilweise Wiederherstellung der monozytären TNF-α Synthese septischer Patienten konnte die Behandlung mit Interferon-γ bewirken, und sogar das Überleben betroffener Patienten verbessern (Docke et al., 1997). Des Weiteren stellte man in Patienten mit schwerer Sepsis einen erhöhten Level an IL-10 (anti-inflammatorisch) fest, welcher außerdem mit der Mortalität der Patienten korrelierte (Gogos et al., 2000). Eine Reaktivierung des Cytomegalievirus konnte im betreffenden Patientenklientel in neueren Studien nachgewiesen werden, dessen Erstinfektion bei immunkompetenten Patienten in der Regel inapparent verläuft (Limaye et al., 2008). 2 I.3 Monozyten und Infektion Monozyten aus Peripherblut kommen entscheidende Aufgaben bei der Initialisierung und nachfolgenden Steuerung einer Immunantwort im Infektionsfall zu. Zum Einen versorgen sie periphere Gewebe mit Vorläuferzellen von Dendritischen Zellen (DC) und Makrophagen, zum Anderen wandern sie gesteuert von Chemokinen (z.B. CCL2) zur direkten Erregerabwehr in entzündete Gewebe ein (Serbina et al., 2008). Monozyten sind in der Lage eingedrungene Pathogene zu phagozytieren und zu töten (Steigbigel et al., 1974) und nachfolgend als Antigen-präsentierende-Zellen T-Zellen zu aktivieren (Treves et al., 1981; Stearns-Kurosawa et al., 2010). Ihre entscheidende Rolle im Falle einer „polymikrobiellen“ Infektion konnte bereits im Mausmodell eindrucksvoll dargestellt werden: Mäuse ohne inflammatorische Monozyten wiesen im Sepsismodell eine deutlich höhere Mortalität auf als die physiologische Vergleichsgruppe (Ocuin et al., 2010). Sie beeinflussen in nachhaltiger Weise die Immunreaktion durch Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie z.B. TNF-α und IL-1 (Kornbluth et al., 1986; Flegel et al., 1989), als auch von anti-inflammatorischen Zytokinen wie z.B. IL-10 (Benoit et al., 2008), was insbesondere bei der Pathogenese und dem Verlauf der Sepsis eine wichtige Rolle spielt (Munoz et al., 1991). Auf Grund dieser Funktionen wird der Monozyt oft auch als Verbindung zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem angesehen (Hoebe et al., 2004). I.4 Rolle der Apoptose und Initiierung Apoptose von Zellen kann über verschiedene Signalwege ausgelöst werden. Unter diesen finden sich der Mitochondrien-vermittelte Signalweg, der primär durch Stresseinwirkung auf die Zelle (z.B. Ultraviolette Strahlung) initiiert wird (Pinheiro da Silva et al., 2009), als auch der extrinsische Signalweg. Letzterer vermittelt Apoptose über extrazelluläre Proteine wie den Tumor Nekrose Faktor-α, CD95-Ligand oder TRAIL, die durch Bindung an entsprechende Rezeptoren und Aktivierung von Caspasen den programmierten Zelltod einleiten (Ashkenazi et al., 1998). Der Apoptose kommt eine wichtige Rolle bei der Homöostase des Immunsystems und damit bei der Pathogenese der Sepsis zu (Power et al., 2002). Ein Verlust an Immunzellen und die „Trümmer“ abgestorbener Zellen führen zu einer Alteration der Immunantwort (Hotchkiss et al., 2001). Während des Vorgangs der Apoptose wird die 3 Zelle durch autolytische Prozesse in kleinere Bestandteile gespalten (Kerr et al., 1972). Bei Anwesenheit von apoptotischen Zellen synthetisieren Monozyten während ihrer Aktivierung vermehrt das anti-inflammatorische Zytokin IL-10, und vermindert proinflammatorische Signalstoffe wie TNF-α, IL-1 und IL-12 (Voll et al., 1997). Zusätzlich konnte Apoptose in weiteren Geweben beim Sepsisgeschehen beobachtet werden, wie z.B. dem Endothel (Hotchkiss et al., 2002) oder der Milz (Tinsley et al., 2003). Abbildung 1: Übernommen aus [10], Signalwege von „Todesrezeptoren“ bei der externen Induktion der Apoptose 4 I.5 Das frühkindliche Immunsystem Eine ganze Reihe an funktionellen Unterschieden konnte schon in NabelschnurblutImmunzellen verglichen mit denen aus Erwachsenenblut nachgewiesen werden. Gezeigt wurden eine verminderte Zytokinsynthese von IL-12, IL-15 und GM-CSF auf mRNAEbene (Suen et al., 1998), sowie eine reduzierte Menge an verschiedenen KomplementFaktoren (Wolach et al., 1994) und IgG-Antikörper Subtypen (Drossou et al., 1995). Auf zellulärer Ebene ist ein Dysfunktion im intrazellulären „Killing“ phagozytierter Bakterien, auf Grund eines Mangels an reaktiven Sauerstoffspezies beschrieben (Fleer et al., 1988), sowie eine relative Unempfindlichkeit neonataler Monozyten gegenüber dem Phagocytosis-induced Cell Death (Gille et al., 2008), als eine Ursache der Apoptose. 5 II. Zielsetzung der Arbeit Unter Berücksichtigung dieser Erkenntnisse beschäftigte sich unsere Arbeitsgruppe mit einem in vitro Infektions-/Sepsis-Modell, bei welchem Monozyten/Makrophagen aus Peripherblut (PBMO) mit Escherichia coli, einem der häufigsten Sepsiserreger (Weston et al., 2011; Kao et al., 2011) infiziert wurden. Verglichen wurden diese Untersuchungen mit neonatalen Monozyten aus Nabelschnurblut (CBMO), um mögliche Rückschlüsse auf die Pathogenese der neonatalen Sepsis zu ziehen. Die Phagozytose und intrazelluläre Abtötung von Bakterien ist ein entscheidendes Apoptosesignal für PBMO. Dieses Verhalten wird als Phagocytosis-Induced Cell Death bezeichnet, geht mit einer positiven Regulation pro-apoptotische Proteine einher und spielt eine wichtige Rolle in der Homöostase der Immunabwehr (Kirschnek et al., 2005). Darüber hinaus sind bereits Defizite bei dem Vorgang der PICD von CBMO beschrieben (Gille et al., 2008). Auch zeigten sich Monozyten Neugeborener verhältnismäßig unempfindlicher gegenüber einer Aktivierung durch IL-10 (Gille et al., 2006). Unsere Hypothese lautete nun, dass in einem in-vitro Infektionsmodell mit Monozyten nicht nur der direkte bakterielle Kontakt Apoptose in den Zellen induziert, sondern auch sogenanntes „Bystander-Killing“ oder „Trans-Apoptose“ stattfindet. Zur Verifizierung dieser Hypothese müsste Apoptose auch in Zellen nachgewiesen werden, die keinen bakteriellen Kontakt hatten und auf ein extrazelluläres Signal hin den programmierten Zelltod einleiten. Genauer sollen Signalstoffe umgebender Monozyten identifiziert werden, die Apoptose „nicht beteiligter“ Zellen auslösen. 6 Abbildung 2: Konzept des „Bystander Killing“, PICD (Phagocytosis-Induced Cell Death): Apoptose nach Phagozytose, grün: Bakterien, rot: löslicher Faktor induziert parakrin Apoptose, grau: Zellkern (Zersetzung bei Apoptose) 7 III. Material & Methoden III.1 Material III.1.1 Zellen PBMO wurden aus peripher venösem Blut gesunder, erwachsener Spender durch sterile Punktion gewonnen. Keine Infektionen oder chronischen Erkrankungen waren bei den Probanden zum Zeitpunkt der Probenentnahme bekannt. CBMO wurden aus dem Nabelschnurblut reifer Neugeborener isoliert. Keines der Neugeborenen wies Zeichen einer infektiösen Erkrankung auf und schriftliche Einwilligungen der Mütter zur Entnahme wurden im Voraus eingeholt. III.1.2. Materialien 2%-iges LB (lysogeny broth) -Medium Fa. Invitrogen, Karlsruhe Cycloheximid (CHX) Fa. Sigma, Taufkirchen DNAse1, RNAse 1 Fa. Sigma, Taufkirchen Escherichia coli DH5-α (GFP)-mut2 Prof. Deki, Biozentrum Basel, Schweiz E.coliEOSFP Prof. Schneider, Ulm FACS Flow Fa. Becton Dickinson, Heidelberg FACS Lysing Solution Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Fetales Kälberserum (FCS, hitzeinaktiviert) Fa. Invitrogen, Karlsruhe Ficoll Fa. Biochrom, Berlin Gentamicin Fa. Invitrogen, Karlsruhe Heparin-Natrium (5000 I.E.) Fa. Braun, Melsungen Isopropyl- β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Fa. Sigma, Taufkirchen Kanamicin Fa. Sigma, Taufkirchen Paraformaldehyd Fa. MP Biomedicals, Solon OH (USA) 8 PBS (Phosphat buffered saline) Fa. Invitrogen, Karlsruhe Rekombinantes TNF-α Fa. eBioscience, Frankfurt RPMI 1640 mit L-GLutamin Fa. Invitrogen, Karlsruhe Triton-X-100 Fa. Sigma, Taufkirchen III.1.3. FACS-Materialien Anti CD14-APC (Klon MEM-15, IgG1) Fa. Immunotools, Friesoythe Anti-Mouse Pacific Blue (F(ab’)2, Goat) Fa. Invitrogen, Karlsuhe Anti TNF-APC (Klon 6401.1111, IgG1 kappa) Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Anti-TNFR1 (Klon MABTNFR1-B1, IgG2A, kappa) Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Propidiumiodid (PI) Fa. Sigma, Taufkirchen Vybrant DyeCycle Violet Fa. Invitrogen, Karlsuhe III.1.4. Kits, Assays Cytofix/Cytoperm Fa. Becton Dickinson, -Fixation/Permeabilization Solution 125ml 1X Heidelberg -Perm/Wash buffer 100ml 10X TUNEL-Assay GE Healthcare, München III.1.5. ELISA Human TNF α ELISA Ready-SET-Go! Fa. eBioscience, -Capture Antibody Frankfurt -Detection Antibody -Standard -ELISA/ELISPOT Coating Buffer Powder -Assay Diluent 9 -Detection enzyme (Avidin-HRP) -Substrate Solution (Tetramethylbenzidine Subastrate Solution) -96 Well Plate III.1.6. Geräte Brutschrank (CO2 Inkubator) Fa. WTB Binder, Tuttlingen FACS-Gerät (FACS Canto II) Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Kühlschrank Fa. Liebherr, Kirchdorf an der Iller Lichtmikroskop (Axiovert 40 CFL) Fa. Zeiss, Oberkochen Lichtmikroskop (Axioplan 2) Fa. Zeiss, Oberkochen Photometer (Biophotometer) Fa. Eppendorf, Hamburg Rüttelbank (KS 4000 ic Control) Fa. IKA, Staufen im Breisgau Sterilbank (HERAsafe KS Class II) Fa. Thermo Fisher Scientific Inc,Waltham, Massachusetts (USA) Vortex (vv3) Fa. VWR International GmbH, Darmstadt Wasserbad (SW 20) Fa. Julabo, Seelbach Zentrifuge (Heraeus 3 S-R+ Multifuge Fa. Thermo Fisher Scientific Inc,Waltham, Massachusetts (USA) Zentrifuge (Heraeus Fresco 17) Fa. Thermo Fisher Scientific Inc,Waltham, Massachusetts (USA) 10 III.2 Methoden III.2.1 Zellen III.2.1.1 Spender Als Spender für die PBMO fungierten männliche und weibliche Personen im Alter von 24 bis 48 Jahren. Bei keinem der Spender waren chronische Erkrankungen oder Symptome einer akuten infektiösen Erkrankung beim Entnahmezeitpunkt bekannt. Blutproben für die CBMO wurden unmittelbar nach der Geburt durch sterile Punktion der Nabelschnur gewonnen. Die schwangeren Spenderinnen gaben vor Einleitung des Geburtsvorgangs ihr schriftliches Einverständnis. Es wurden lediglich Blutproben termingeborener Säuglinge verwendet, die keinerlei Hinweise auf eine intrauterine Infektion boten sowie einen komplikationslose Schwangerschaft durchlaufen hatten. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universitätsklinik Aachen bewilligt: Votum Nummer EK150/09. III.2.1.2 Isolation mononukleärer Zellen Sowohl das adulte Vollblut als auch das Nabelschnurblut wurden in einer mit Heparin versetzten (1000 IE) 20ml-Spritze aufgenommen und daraufhin im Verhältnis 1:3 mit PBS verdünnt. Zur Aufreinigung und Selektion mononukleärer Zellen wurde die Trennmethode nach Böyum (1977) mit Ficoll verwendet. Nach vorsichtiger Überschichtung von 13 ml des Ficoll Polysaccharids in einem 50 ml Falcon Tube mit den vorverdünnten Blutproben, folgte eine 35-minütige Zentrifugation bei 580 g ohne Bremse. Die in der Interphase zwischen Erythrozyten und Plasma befindlichen mononukleären Zellen wurden vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette abgenommen und in 30 ml PBS resuspendiert. Es schloss sich eine erneute Zentrifugation bei 337 g für 10 min an. Das entstandene Pellet wurde nun erneut in RPMI resuspendiert, auf 1 Mio Zellen /ml verdünnt und soviel FCS zugegeben, dass eine 10%ige Lösung entstand. 11 III.2.1.3 Zellzahlbestimmung Die Zellzahl wurde mittels Neubauer Zählkammer bestimmt. Falls nicht anders angegeben, kann von einer Zellkonzentration von 1 Millionen mononukleärer Zellen / ml ausgegangen werden. III.2.1.4 Zellkultur Isolierte mononukleäre Zellen wurden in RPMI mit 10% FCS auf Mikrotiterplatten übertragen (6-, oder 12-well) und für 1h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Unmittelbar danach folgten die Stimulations- oder Infektionsversuche. III.2.2. Bakterien III.2.2.1 GFP-Bakterien Für die Infektionsexperimente wurden Kanamycin resistente E.coli DH5α verwendet, welche das gfp-mut2-Gen unter Kontrolle des lac Promoters tragen (E.coliGFP) und somit das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren. Die Emission dieses Proteins kann im FITC-Kanal des FACS detektiert werden. Zur Anzüchtung wurde LB-Medium mit Kanamycin (Endkonzentration 50 µg/ml) zur Kontaminationsvermeidung und mit IPTG (Endkonzentration 1 mM/l) zur Aktivierung des lac Promoters versetzt. Nach Kultivierung genau einer Kolonie in 1 ml LB-Medium über Nacht (37°C), wurde diese Startkultur am nächsten Tag auf 10 ml mit LB-Medium überimpft und bei 37° C und 200 rpm in der Rüttelkammer kultiviert. Photometrisch konnte nun die Dichte ermittelt werden. Ab einer OD 600 von 0,5-0,6 wurde eine Bakteriendichte von 1 x 109 durch Ausstrich auf LB-Agarplatten bestimmt, die Probe zentrifugiert und das entstandene Pellet in 1 ml PBS resuspendiert. Die Infektion der mononukleären Zellen erfolgte nun mit einer MOI (Multiplicity of Infection) von 25. Dies bedeutet: 25 Bakterien auf 1 mononukleäre Zelle. 12 III.2.2.2 EOSFP-Bakterien Hierbei handelt es sich um Bakterien eines E.coli Stammes, welche mit dem pHabhängigen Fluorchrom EOSFP versehen wurden (E.coliEOSFP). In „unbehandeltem“ Zustand konnte die Strahlung des Farbstoffes im PE-Kanal des FACS detektiert werden. Nach Transport der Bakterien in das Phagolysosom monozytärer Zellen und Azidifikation (Senkung des pH) veränderte sich die Emission und war nun eher im Bereich des FITC-Kanal zu detektieren (Wiedenmann und Nienhaus, 2006). Diese Unterscheidung erlaubte eine zeitliche Beurteilung des Phagozytosevorgangs im Rahmen unserer Infektionsexperimente. Es konnte der Vorgang der Bakterienadhäsion (Binding), vom weiter vorangeschrittenen Transport ins Phagolysosom differenziert und entsprechende Zell-Subpopulationen quantifiziert werden. Im Kontrast zu E.coliGFP handelte es sich bei E.coliEOSFP um fixierte, und damit nicht mehr teilungsfähige Bakterien. Die verwendeten E.coliEOSFP waren ein Geschenk von Prof. Dr. Marion Schneider, Abteilung für Experimentelle Anästhesiologie Universitätsklinikum Ulm. III.2.3 Infektions- und Stimulationsversuche III.2.3.1 Infektion mit E.coliGFP Isolierte mononukleäre Zellen wurden für die entsprechenden Zeiträume mit E.coliGFP (MOI 25, siehe 2.1) bei 37° C und 5% CO2 inkubiert. Es folgten das Ablösen der Zellen aus den Mikrotiterplatten und ein Zentrifugationsschritt bei 240 g für 10 min. Das entstandene Pellet wurde in 100 µl RPMI resuspendiert und vorsichtig auf 750 µl FCS geschichtet. Eine weitere Zentrifugation (240 g, 10 min) zur Entfernung extrazellulärer Bakterien schloss sich an. Abschließend wurden die Zellen in 200 µl RPMI mit 10 % FCS und Gentamicin (Endkonzentration 200 µg/ml) aufgenommen, was dem Abtöten verbleibender Bakterien dienen sollte. 13 III.2.3.1.1 Proteinsynthesehemmung durch CHX CHX ist ein bekannter in vitro Proteinbiosynthesehemmer eukaryotischer Zellen. Durch spezifische Bindung an die ribosomale 60s-Untereinheit wird die Translation inhibiert. CHX ist ein von Streptomyces griseus synthetisiertes Antibiotikum und gehört zur Stoffgruppe der Carbonsäureimide. In den beschriebenen Versuchen wurde CHX den Zellkulturen in verschiedenen Konzentrationen (10 µg/ml, 100 µg/ml, 1 mg/ml) 20 min vor Infektion hinzugefügt. III.2.3.2 Infektion mit EOSFP Bakterien Die Infektion erfolgte analog zu den Experimenten mit E.coliGFP (siehe 3.1). III.2.3.3 Stimulation mit rekombinantem TNF-α Aufgereinigte Zellkulturen bei einer Dichte von 1 Mio Zellen/ml wurden für 4h mit rekombinantem TNF-α (5 ng/ml) inkubiert, anschließend bei 240 g für 10 min zentrifugiert und das entstandene Pellet in 200 µl RPMI + 10% FCS + Gentamicin (1 / 250) resuspendiert. Die verwendete Konzentration an TNF-α entsprach dabei der durchschnittlich im Überstand gemessenen Menge nach 4-stündiger Infektion und kann deswegen als pathophysiologisch betrachtet werden. III.2.4 TNF-α ELISA Bei den Infektionsexperimenten mit und ohne CHX-Zugabe wurden die Überstände nach der ersten Zentrifugation vorsichtig abgenommen und in neue Eppendorf-Hütchen überführt. Durch erneutes, zweimaliges Zentrifugieren bei 1000 g für 10 min und vorsichtigem Abnehmen des Überstandes, sollten verbliebene Zell- und Bakterientrümmer beseitigt werden. Der so gewonnene Überstand konnte mittels TNF-α ELISA auf die enthaltene Konzentration an TNF-α untersucht werden. Um gleiche Voraussetzungen für die einzelnen Proben zu gewährleisten, wurde vor Infektion der Anteil CD14+ -Zellen an der Gesamtpopulation bei CBMO und PBMO bestimmt. Bei 14 dem verwendeten ELISA handelt es sich um ein „Human TNF α ELISA Ready-SETGo!“ von eBioscience. Es wurde sich bei der Durchführung strikt an die Angaben des Herstellers gehalten. III.2.5 FACS-Analysen III.2.5.1 FACS-Gerät Die FACS-Analyse erlaubt die qualitative sowie quantitative Untersuchung einer Zellsuspension hinsichtlich Größe, Granularität und Oberflächenexpression bestimmter Zellmarker. Sämtliche Messungen wurden an einem FACS Canto II der Firma BD Biosciences (Heidelberg) durchgeführt. Anschließende Auswertungen erfolgten mittels FCS Express Software (De Novo Software, Los Angeles, CA). III.2.5.2 Zellcharakterisierung und Immunophänotypisierung Die Differenzierung der Monozytenpopulation konnte über die Messung der Größe (FSC = Forward Scatter) und Granularität (SSC = Sideward Scatter) mittels Streulichtanalyse bewerkstelligt werden. So ließ sich die entscheidende Zellpopulation von Lymphozyten und anderen mononukleären Zellen abgrenzen. Darüber hinaus wurde eine Immunophänotypisierung zur Darstellung des Oberflächenmarkers CD14 (Andreesen et al., 1988) durchgeführt, mithilfe eines CD14-APC Antikörpers (Klon MEM-15, IgG1, Immunotools). 200 µl der Zellsuspension ( 1 x 106 Zellen / ml) wurden mit einer Antikörper-Verdünnung von 1 / 400 für 15 min bei Raumtemperatur in Dunkelheit inkubiert. Nach einmaligem Waschen in 1ml PBS, Zentrifugation und Resuspension in 200 µl PBS folgte die Messung. 15 Abbildung 3: Gating-Strategie, links: CD14-positive Population im APC-Kanal (rot), rechts: gleiche Population im Forward-Sideward-Scatter III.2.5.3 Apoptose-Assays III.2.5.3.1 Modifizierte Färbung nach Nicoletti Zu den resuspendierten Zellen (s. 3.1-3.3) wurden 200 µl 2%iger Paraformaldehydlösung beigefügt, und die Suspension über Nacht bei 4°C inkubiert. Auf erneute Zentrifugation bei 240 g für 10 min folgte eine einmalige Waschung in 1ml PBS zur Entfernung verbliebener Reste des PFA mit anschließender Zentrifugation. Danach wurde das entstandene Pellet in 200 µl 0,1%iger Triton X-100 Lösung für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die nun permeabilisierten Zellen konnten dann mittels Propidiumiodid (PI) in einer Konzentration von 70 µg/ml angefärbt werden. RNAse wurde zur Kontaminationsvermeindung beigefügt. Der Farbstoff PI interkaliert mit der DNA der betroffenen Zellen und war nachher im PE-Kanal des FACS detektierbar. Hier zeigten die Zellen ein Signal proportional zu ihrer DNA-Menge. Zellen mit einfachem Chromosomensatz (G1/G0 Peak) konnten von apoptotischen Zellen mit vermindertem DNA-Gehalt (sub G1) unterschieden werden, was als Zellzyklusanalyse bezeichnet wird. Im Unterschied zur ursprünglichen Methode von Nicoletti (Nicoletti et al, 1991), in welcher Methanol zur Permeabilisierung und Fixierung benutzt wurde, löst die Behandlung mit PFA und Triton X-100 nicht bakterielle Proteine (besonders das GFP) von der Oberfläche der Zellen ab und erlaubt 16 somit eine Unterscheidung zwischen Monozyten mit Bakterienkontakt (MoGFP+) und ohne (MoGFP-). Abbildung 4: Nicoletti-Färbung zur Quantifizierung der Apoptose, apoptotische Zellen im „sub G1“ III.2.5.3.2 Vybrant Zellzyklus Analyse Alternativ zur modifizierten Methode nach Nicoletti, wurden auch ApoptoseMessungen mittels Vybrant-Färbung durchgeführt. Ähnlich wie PI interkaliert der verwendete Farbstoff (Vybrant Dyecycle Violet, Invitrogen) mit der DNA behandelter Zellen und ermöglicht so eine Zellzyklusanalyse. Abweichend wird Vybrant jedoch als Lebendfarbstoff eingesetzt, da er durch die intakte Zellmembran aufgenommen wird und somit keine Permeabilisation und Fixierung zu färbender Zellen benötigt. Eine Stunde vor Ende des Infektionsintervalls wurde der Farbstoff mit einer Verdünnung von 1/1000 dem Medium der inkubierenden Zellen (1 X 106 Zellen / ml) zugefügt. Nach Ablauf des Intervalls konnte ein 200 µl Aliquot entnommen und sofort am FACS gemessen werden. Der Vybrant-Farbstoff emittiert in den Pacific Blue - Kanal und kann darüber im Rahmen der Zellzyklusanalyse ausgewertet werden. Durch zusätzliche Inkubation mit PI, was nur die DNA schon permeabilisierter Zellen anfärben kann, wurden apoptotische von nekrotischen Monozyten unterschieden. Zellen, die ihre Membranintegrität –weil nekrotisch- verloren hatten, waren durch PI-Färbung erkennbar, apoptotische Zellen durch Vybrant-Färbung. 17 III.2.5.3.3 TUNEL-Färbung Als weitere Färbemethode zur Diskriminierung apoptotischer Zellen (genauer: Zellen mit vermindertem DNA-Gehalt) wurde auch der TUNEL-Assay herangezogen. Der Zellsuspension aus den Infektionsexperimenten (s. 3.1) wurden 200 µl PFA beigefügt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Es folgte ein Waschschritt in 1 ml PBS mit anschließender Zentrifugation (240 g, 10 min). Daraufhin wurden die Pellets in 100 µL der Permeabilisierungs-Lösung (0,1 % Triton X-100, 0,1% Na-Citrat) resuspendiert und für genau 2 min auf Eis inkubiert. Es schloss sich wiederum zweimaliges Waschen in PBS (1 ml) und Zentrifugation an, um letztendlich 50 µl des TUNEL-Reagenz zuzusetzen und den Ansatz 1h bei 37°C zu inkubieren. Dieses Reagenz besteht in der Hauptsache aus den beiden Komponenten Tdt und dUTP. Das Enzym Tdt ist in der Lage an offene 3’-OH-Gruppen (Hydroxygruppen) Nukleotide anzuhängen. Dies bedeutet, dass gebrochene DNA-Stränge mit Nukleotiden versehen werden. Als Substrat für diese Reaktion dient das dUTP, welches wiederum mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist und damit im Mikroskop oder im FACS detektiert werden konnte. Da Doppelstrangbrüche als Merkmal apoptotischer Zellen angesehen werden, konnte mit dieser Methode ein sensitiver Nachweis für den Anteil apoptotischer Zellen an der Monozytenpopulation erbracht werden. Zum Vergleich mit der Nicoletti-Färbung bleibt zu sagen, dass das TUNEL-Assay in der Lage war weit frühere Stadien der Apoptose zu erkennen und somit eine Kombination beider Methoden sowohl eine gegenseitige Validierung, als auch eine Beurteilung des Apoptosefortschritts erlaubte. Zur Positivkontrolle wurden einzelne Proben vor Beginn der Färbung für 15 min mit DNAse (10 U) inkubiert und zur Negativkontrolle wurden Proben mit TUNEL-Reagenz ohne Tdt versehen. 18 Abbildung 5: TUNEL-Assay zur Quantifizierung der Apoptose, apoptotische Zellen unterhalb des Markers (PE-positiv) III.2.5.4 Phagozytose-Assay III.2.5.4.1 E.coliGFP Da das GFP des verwendeten E.coli-Stammes im FACS detektiert werden kann (s. 2.1), erlaubte dies eine Differenzierung von Monozyten in verschiedene Subpopulationen. Monozyten mit Bakterienkontakt (MoGFP+), die im FACS ein deutliches Signal im FITC-Kanal zeigten, konnten von Monozyten ohne Bakterienkontakt (MoGFP-, kein FITC-Signal) unterschieden werden. Die Stadien der Bakterienaufnahme durch die Phagozyten (Adhäsion, Internalisation, Transport ins Phagolysosom) innerhalb der MoGFP+ konnte mit diesem Assay jedoch nicht dargestellt werden. 19 Abbildung 6: Bestimmung des Phagozytose-Index mittels GFP-exprimierender E.coli im FACS III.2.5.4.2 E.coliEOSFP Analog zu den E.coliGFP kann auch die Emission der E.coliEOSFP im FACS detektiert werden. Durch die Verschiebung der Emissionswellenlänge des EOSFP-Farbstoffes nach Kontakt mit sauren Flüssigkeiten (Azidifikation) kann die Kinetik des Phagozytosevorgangs weiter differenziert werden. Monozyten ohne Bakterienkontakt (MoNC = No Contact) können von Monozyten mit Bakterienkontakt (MoBI = Binding/Ingestion) und von Monozyten mit Bakterien im Phagolysosom (MoPH = Phagocytosed) unterschieden werden. 20 Abbildung 7: Bestimmung des Phagozytose-Index mittels E.coliEOSFP, deutliche Zunahme MoPH nach 4-stündiger Infektion III.2.5.5 Intrazelluläre TNF-α Färbung Für intrazelluläre Antikörperfärbungen fand das Cytofix/Cytoperm Kit (Becton Dickinson, Heidelberg) Verwendung. Zellen aus den Infektionsexperimenten (s. 3.13.3) wurden erneut zentrifugiert, in 250 µl der „Fixation/Permeabilisation Solution“ resuspendiert und für 20 min bei 4°C inkubiert. Es schlossen sich 2 Waschschritte in 1 ml des „BD Perm/Wash buffer“ mit nachfolgender Zentrifugation (240 g, 10 min) an. Die Zellsuspension wurde dann für 15 min bei Raumtemperatur mit einem anti-TNF-αAPC-Antikörper (Klon 6401.1111, IgG1 kappa, Beckton Dickinson) in 1/400 Verdünnung inkubiert. Nach abschließendem Waschen in 1 ml „BD Perm/Wash buffer“, Zentrifugation und Resuspension in 200 µl PBS folgte die Messung. 21 III.2.5.6 TNFR1-Färbung Zellen aus den Infektionsexperimenten (s. 3.1-3.3) wurden für 15 min bei Raumtemperatur mit einer 1/400 Verdünnung des Anti-TNFR1-Antikörper (Beckton Dickinson) inkubiert. Dies erfolgte vor der Fixierung, um bei erhaltener Membranintegrität ausschließlich membranständige Rezeptoren anzufärben. Danach wurden die Zellen zentrifugiert und mit dem Cytofix/Cytoperm Kit (Beckton Dickinson, Heidelberg) behandelt (siehe 5.5). Es folgte eine 15-minütige Inkubation mit einem Anti-Mouse-PacificBlue-Antikörper (Invitrogen, Karlsruhe) bei Raumtemperatur und Dunkelheit mit einer 1/400 Verdünnung. Anschließend wurden die Zellen nochmals in 1 ml der des „Perm/Wash-Buffer“ gewaschen, zentrifugiert (10 min, 240 g) und für die Messung mittels FACS in 200 µl des Buffers resuspendiert. Die Immunophänotypisierung erfolgte mittels CD14-Antikörper (siehe 5.2). III.2.6. Statistische Auswertung Alle statistischen Auswertungen wurden mit der GraphPad Prism Software (GraphPad Software, La Jolla, California, USA) bewerkstelligt. Bei Vergleichen zweier Mittelwerte kam der t-Test zum Einsatz , sowie der 2-way ANOVA beim Vergleich von CBMO und PBMO, wobei p-Werte kleiner als 0,05 als signifikant erachtet wurden. Alle im Text beschriebenen Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Fehlerbalken stellen die einfache Standardabweichung dar. 22 IV. Ergebnisse IV.1 Infektion mit E.coliGFP und CHX Durch den Proteinbiosynthesehemmer CHX sollte die Herstellung löslicher Faktoren, die parakrin „Bystander-Apoptose“ induzieren, verhindert werden. Da CHX selbst auch Apoptose induzieren kann (Collins et al., 1991), wurden zunächst Titrationsversuche durchgeführt, um CHX – Konzentrationen zu ermitteln, die für die inkubierten Monozyten nicht toxisch waren. Bei Inkubation für 4h mit 100 µg/ml und Auswertung mittels Nicoletti-Färbung bot sich folgendes Bild: Abbildung 8: Apoptose von CBMO/PBMO nach 4-stündiger Inkubation mit 100 µg/ml CHX, Nicoletti-Färbung (n=4) Weder bei den PBMO noch bei den CBMO fiel eine signifikante Modulation des apoptotischen Verhaltens durch alleinige Zugabe von CHX im untersuchten Zeitraum auf. Unter Berücksichtigung dieser Tatsache wurde nun ein Infektionsmodell mit E.coli Bakterien initiiert. Wir verglichen auch hier bei Infektion die Proben mit und ohne CHX-Vorinkubation. Der Apoptose-Readout wurde mittels der Nicoletti-Färbung nach 4h Inkubationszeit durchgeführt. 23 Abbildung 9: Apoptose von PBMO/CBMO nach 4-stündiger E.coli Infektion unter Zugabe von CHX (100 µg/ml), Nicoletti-Färbung, * für p < 0,05; **für p < 0,01 (n=4) In beiden Populationen stieg die Anzahl apoptotischer Zellen nach Infektion an (PBMO: 10,72% ± 4,57 gegen 23,60 % ± 5,19 %; CBMO: 6,61 % ± 2,60 % gegen 13,73 % ± 4,41 %). Bei den PBMO konnte durch Zugabe von 100 µg CHX / ml eine signifikante Reduktion der Apoptose beobachtet werden (23,60 % ± 5,19 % gegen 14,19 % ± 4,26 %). Wie bereits beschrieben (Gille et al., 2008) findet sich bei den CBMO nach Infektion eine geringere Prozentzahl apoptotischer Zellen (13,73 % ± 4,41 %). Eine signifikante Alteration der Apoptose Induktion nach CHX Gabe ließ sich bei den CBMO nicht feststellen (11,02 % ± 6,14 %). Mit Hilfe der TUNEL Methode konnten diese Ergebnisse reproduziert werden (Daten nicht gezeigt). 24 IV.2 Infektionsversuch Subpopulation Um unsere Hypothese zu untersuchen, unterschieden wir innerhalb eines Infektionsansatz zwischen folgenden Subpopulationen: 1. „phago +“, GFP-positive Monozyten, die Kontakt mit Bakterien hatten 2. „phago -„, GFP-negative Monozyten, die keinen Kontakt mit Bakterien hatten. Die Anzahl apoptotischer Zellen und der mögliche Einfluss von CHX auf diesen Vorgang konnte nun in den beiden Subpopulationen getrennt ausgewertet werden. Auch hier wurden PBMO mit CBMO verglichen. Abbildung 10: Apoptose von PBMO/CBMO nach 4-stündiger E.coli-Infektion und CHX-Zugabe (100 µg/ml), Betrachtung der Subpopulationen, NicolettiFärbung, * für p < 0,05 (n=4) 25 Diese definierten Subpopulationen wiesen eine gänzlich verschiedene Reaktion auf die Gabe von CHX auf. PBMO, bei denen im FACS der Kontakt mit fluoreszierenden Bakterien nachgewiesen werden konnte, reagierten nur wenig auf das Antibiotikum (18,45 % ± 6,81 % gegen 16,74 % ± 1,37 %). Im Gegensatz hierzu reduzierte CHX die Apoptose bei den „GFP-negativen“ Monozyten signifikant (35,59 % ± 10,68 % gegen 16,84 % ± 8,21 %). Bei Betrachtung der CBMO fallen dagegen keine signifikanten Unterschiede ins Auge. Zwar scheint es so, als hätte CHX eine größere Wirkung auf GFP-negative Monozyten, aber es können keine mit statistischer Signifikanz belegten Aussagen gemacht werden. Statistisch belegbar ist auch, dass PBMO ohne Bakterienkontakt nach einem Zeitintervall von 4h in höherem Maße apoptotisch wurden als solche mit Kontakt (35,59 % ± 10,68 % gegen 18,45 % ± 6,81 %). IV.3 TNF-α ELISA Da TNF-α als potentes immunmodulatorisches Zytokin und als ein extrazellulärer Induktor der Apoptose gilt (Cossarizza et al., 1995), führten wir quantifizierte Untersuchungen der Versuchsüberstände auf TNF-α durch. TNF-α wird oft als „Monozyten-/Makrophagen-assoziiertes“ Zytokin angesehen (Kornbluth et al., 1986) und war ein vielversprechender Kandidat für die Vermittlung der Transapoptose. 26 Abbildung 11: Messung von TNF-α in Überständen von PBMO/CBMO nach 4stündiger E.coli-Infektion und CHX Zugabe (100 µg/ml), TNF- α ELISA (n=5) In den nicht-infizierten Proben, konnte lediglich in dem Ansatz der PBMO ohne CHXZugabe eine TNF-α Menge über der Nachweisgrenze ermittelt werden (13,92 pg ± 23,14 pg). Bei den Ansätzen mit E. coli Bakterien wurden nach 4h sowohl bei den PBMO (4555,70 pg ± 4826,68 pg) als auch bei den CBMO (2281,57 pg ± 2272,64 pg) signifikante Mengen des Zytokins detektiert. Bei Zugabe der bereits beschriebenen Menge CHX war in keinem der beiden Überstände infizierter Zellen TNF-α in Konzentrationen über der Nachweisgrenze messbar. Auf Grunde der relativ großen Schwankungen zwischen verschiedenen Versuchen, konnte leider kein signifikanter Unterschied bei der TNF-α Synthese von CBMO und PBMO festgestellt werden. Innerhalb eines Versuchansatzes (PBMO gegen CBMO) jedoch, lag die Zytokinsynthese der PBMO immer deutlich über der CBMO. Um diesen Sachverhalt darzustellen, wurde für jeden Einzelversuch eine „(PBMO 4h moi 25) / (CBMO 4h moi 25)“ – Ratio gebildet. Dieser Wert gibt an, um welchen Faktor die PBMO mehr TNF-α synthetisierten, als die CBMO. 27 Abbildung 12: Links: Auswertung TNF-α in den Überständen (4h, Infiziert, PBMO/CBMO), jeder Einzelversuch durch gleiches Symbol gekennzeichnet, im direkten Vergleich innerhalb eines Versuches: PBMO immer mehr TNF-α als CBMO (n=5); Rechts: TNF-α in den Überständen, schwarzer Balken: PBMO (4h, infiziert) / CBMO (4h, infiziert), grauer Balken: CBMO (4h, infiziert) / CBMO (4h, infiziert) -> =1, * für p < 0,05 (n=5) Durchschnittlich synthetisierten die PBMO also doppelt so viel lösliches TNF-α (2,04 ± 0,98) wie die CBMO. Da sich zwischen den verschiedenen Versuchen teils erhebliche Schwankungen bei der Messung der TNF-α Konzentration in den Überständen beobachten ließen, konnten Unterschiede zwischen CBMO und PBMO nur bei Vergleichen innerhalb der Einzelversuche bestätigt werden. IV.4 TNF-α Stimulation Zur Validierung unserer Hypothese und zur Klärung der Relevanz vorhergegangener ELISA Messungen, wurden nun Stimulationsversuche mit TNF-α durchgeführt. Isolierte PBMO und CBMO wurden in bekannter Verdünnung (1 Millionen Zellen / ml Medium) für 4h mit 5 ng TNF-α / ml inkubiert. Dies spiegelte die durchschnittlich gemessene Menge des Zytokins in den Überständen aus den Infektionsversuchen der PBMO wider und kann als pathophysiologischer Durchschnittswert angesehen werden. Die Anzahl apoptotischer Zellen wurden wieder mittels der Nicoletti-Färbung nach 4h am FACS bestimmt. 28 Abbildung 13: TNF-α Stimulation von PBMO/CBMO mit 5 ng TNF- α /ml für 4h, Nicoletti Färbung, ** für p < 0,01 (n=4) Bei den PBMO konnte ein signifikanter Anstieg apoptotischer Zellen nach TNF- α Gabe beobachtet werden (1,19 % ± 0,76 % gegen 16,82 % ± 0,72 %). Die CBMO zeigten dagegen keine apoptotische Reaktion auf die Zugabe des Zytokins (2,67 % ± 0,48 gegen 2,76 % ± 1,30 %). IV.5 Intrazelluläre TNF-α Färbung Zellen aus den Infektionsversuchen (s. 3.1) wurden zur Vorbereitung auf die intrazelluläre TNF-α Färbung mit dem Cytofix / Cytoperm Kit (BD Biosciences, Heidelberg) behandelt. Damit konnten die Zellen fixiert und permeabilisiert werden. Für den benutzten anti-TNF-α-Antikörper (BD Biosciences, Heidelberg) dienen sowohl das membranständige (mTNF-α), als auch das lösliche TNF-α (sTNF-α) als Epitop, sodass die hier gezeigten Färbungen wohl am ehesten eine Gesamtfärbung des in und auf der Zelle vorhandenen TNF-α darstellen. Die Auswertung erfolgte mittels FACS-Analyse. 29 Abbildung 14: Intrazelluläre TNF-α Färbung von PBMO/CBMO nach 4-stündiger E.coli Infektion, * für p < 0,05; ** für p < 0,01; # für p = 0,102 (n=3) Im nicht infizierten Zustand exprimierten äquivalent viele PBMO und CBMO TNF-α (10,91 % ± 4,82 % gegen 13,03 % ± 2,30 %) und auch die erhöhte Anzahl nach Bakterienkontakt zeigte bei beiden Populationen ein ähnliches Bild (47,20 % ± 11,03 % gegen 47,61 % ± 28,18 %). Bei den PBMO ließ sich eine signifikante Steigerung nach Infektion nachweisen, die bei den CBMO wegen den relativ hohen Schwankungen nur als statistisch wahrscheinlich gedeutet werden konnte. Darüber hinaus exprimierten innerhalb eines Infektionsansatzes mehr Erwachsenenmonozyten mit Bakterienkontakt TNF-α, als Zellen ohne (MoGFP+ : 62,89 % ± 9,73 % gegen MoGFP- : 32,39 % ± 9,64 %). Auch hier zeichnete sich bei den Neugeborenenmonozyten nur eine statistisch nicht signifikante Tendenz zur TNF-α Mehrsynthese der MoGFP+ ab. IV.6 TNFR1 Färbung Um zu erklären, warum CBMO und PBMO unterschiedlich auf TNF-α Stimulation reagierten, wurden die mononukleären Zellen nach Infektion (s. 3.1) auf ihre TNFR1Expression untersucht. Die Färbung wurde hier bei erhaltener Membranintegrität durchgeführt, sodass nur membranständige, extrazelluläre Rezeptoren zum Signal 30 beitragen konnten. Die Auswertung wurde erneut nach 4h mittels FACS-Analyse durchgeführt. Abbildung 15: TNF-α-Rezeptor 1 Färbung auf Zellmembran von PBMO/CBMO nach 4-stündiger Infektion mit E.coli, * für p < 0,05; ** für p < 0,01 (n=5) Die Anzahl TNFR1-exprimierender Zellen unterschied sich bei PBMO und CBMO signifikant (15,60 % ± 6,58 % gegen 3,73 % ± 2,49 %). Die Erwachsenenmonozyten exprimierten mehr TNFR1 und zeigten eine messbare Herabregulation nach Infektion (15,60 % ± 6,58 % gegen 4,67 % ± 4,45 %). Die ohnehin geringe Expression der CBMO, blieb weitestgehend von dem Infektionsgeschehen unbeeinflusst. IV.7 Infektion mit E.coliEOSFP Für die genauere Untersuchung der Phagozytose wurden Infektionsexperimente mit E.coliEOSFP durchgeführt (s. 3.3). Nach Transport des Farbstoffes ins Phagolysosom sorgt der dort vorherrschende niedrige pH-Wert für einen „Shift“ im 31 Emissionsmaximum. Bakterienbestandteile vor Fusion mit Phagolysosomen fluoreszieren im roten Spektralbereich, nach Fusion eher im grünen Spektralbereich (Schreiner et al., 2011). Abbildung 16: Mikroskopische Aufnahme von CBMO (links) und PBMO (rechts) nach 4-stündiger Infektion mit E.coliEOSFP, Zellkernfärbung DAPI (blau), Bakterien im Frühstadium der Phagozytose (rot), Bakterien im Phagolysosom (grün) IV.7.1 Kinetik der Phagozytose Der Einsatz der E.coliEOSFP erlaubte eine zeitliche Betrachtung des Phagozytosevorgangs. CBMO und PBMO wurden jeweils 1h, 4h und 24h nach Infektion auf ihren Prozentsatz an MoNC („No contact“), MoBI („Binding/Ingesting“) und MoPh („Phagocytosed“) untersucht (s. 5.4.2). Die Auswertung erfolgte auch hier nach Fixation mittels FACS-Analyse. 32 Abbildung 17: Auswertung der Phagozytose von PBMO/CBMO nach Infektion mit E.coliEOSFP, Monozyten ohne Bakterienkontakt (schwarz), Frühstadium der Phagozytose (rot), Bakterien im Phagolysosom (grün), (n=3) 0 h markierte den Zeitpunkt der Bakterienzugabe. Nach 1h hatten der größte Teil der Monozyten Bakterien auf ihrer Oberfläche gebunden oder befanden sich im Frühstadium der Phagozytose (PBMO: 83,50 % ± 9,27 %, CBMO: 77,99 % ± 4,63 %). Entsprechend gering war der Anteil an Phagozyten im Stadium der Phagolysosomfusion (PBMO: 10,74 % ± 6,37 %, CBMO: 18,53 % ± 9,32 %). Auch die Immunzellen ohne Bakterienkontakt machten bereits nach einer Stunde einen geringen Prozentsatz an der Gesamtpopulation aus (PBMO: 9,27 % ± 5,69 %, CBMO: 8,34 % ± 1,39 %). Nach 4 Stunden hatte sich der Anteil an Monozyten im Spätstadium der Phagozytose signifikant erhöht (PBMO: 47,90 % ± 13,01 %, CBMO: 49,74% ± 20,58 %). Entsprechend weniger Phagozyten befanden sich noch in der Phase der Bakterienadhärenz (PBMO: 43,36 % ± 14,66 %, CBMO: 45,27 % ± 16,45 %). Zellen ohne Bakterienkontakt stellten erwartungsgemäß die geringste Fraktion nach vierstündiger Infektion (PBMO: 9,62 % ± 1,24 %, CBMO: 6,20 % ± 3,77 %). Nach 24stündiger Infektion schließlich repräsentierten die MoPH die mit Abstand größte Population (PBMO: 87,40 % ± 2,38 %; CBMO: 77,41 % ± 13,65 %). Nahezu alle Monozyten hatten bereits die zugegebenen Bakterien ins Phagolysosom transportiert. Erwartungsgemäß gering waren die zugehörigen Fraktionen der MoBI (PBMO: 5,19 % ± 3,44 %; CBMO: 6,57 % ± 0,27 %) und MoNC (PBMO: 3,37 % ± 4,13 %; CBMO: 9,10 % ± 12,42 %). 33 IV.7.2 E.coliEOSFP Infektion und Apoptose Nach Infektion der Monozyten mit E.coliEOSFP wurde nach 4-stündiger Inkubation eine Messung des apoptotischen Verhaltens vorgenommen. Diese erfolgte hier durch Einsatz der Vybrant-Färbung (s. 5.3.2), da die verwendeten Bakterien auch im PE-Kanal des FACS zu detektieren sind, und so eine Nicoletti-Färbung mit PI (s. 5.3.1) unbrauchbar machen würden. Abbildung 18: Apoptose von PBMO/CBMO nach 4-stündiger Infektion mit E.coliEOSFP und Auswertung der Subpopulationen (MoNC, MoBI, MoPH), Vybrant-Färbung, * für p < 0,05; ** für p < 0,01 (n=3-4) Obwohl es sich bei den benutzten E.coliEOSFP um nicht mehr teilungsfähige, fixierte Bakterien handelte, konnte bei den PBMO ein signifikanter Anstieg der Apoptose nach Infektion festgestellt werden. Der Zelltod von Monozyten mit Bakterienkontakt (MoBI) übertraf den der uninfizierten Kontrollgruppe (3,34 % ± 2,44 % gegen 12,11 % ± 2,96 %). Im Gegensatz dazu fiel die Reaktion der CBMO auf Bakterienzugabe unspezifisch aus (3,00 % ± 1,08% gegen 1,37 % ± 1,08 %). Bei weiterer Auswertung konnte 34 festgestellt werden, dass Erwachsenenmonozyten ohne Bakterienkontakt (MoNC) und im Frühstadium der Phagozytose (MoBI) signifikant mehr apoptotisch wurden als solche, die Bakterien bereits ins Phagolysosom transportiert hatten (9,00 % ± 5,72% und 12,11 % ± 2,96 % gegen 0,94 % ± 0,10 %). Bei den Nabelschnurmonozyten, konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Subpopulationen ausgemacht werden. IV.7.3 E.coliEOSFP Infektion und intrazelluläre TNF-α Färbung Auch nach Infektion mit den E.coliEOSFP wurden die inkubierten Zellen auf intrazelluläres TNF-α hin untersucht. Nach analoger Vorgehensweise (s. IV.7.2) und 4stündiger Inkubation bot sich im FACS folgendes Bild. Abbildung 19: Intrazelluläre TNF-α Färbung von PBMO/CBMO nach 4stündiger Infektion mit E.coliEOSFP und Auswertung von Subpopulationen, * für p < 0,05; ** für p < 0,01 (n=3) 35 Wieder konnten äquivalent viele PBMO und CBMO im nicht infizierten Zustand ausgemacht werden, in denen TNF-α nachweisbar war (10,91 % ± 4,82 % gegen 13,03 % ± 2,30 %). Auch hier führte die Infektion zum signifikanten Anstieg TNF-α positiver Zellen in beiden Populationen (29,42% ± 8,75 % gegen 34,89 % ± 7,20 %). Darüber hinaus erlaubte die Infektion mit fluoreszierenden E.coliEOSFP die Differenzierung gemessener Monozyten in Subpopulationen (MoNC, MoBI, MoPH) und die Beurteilung des individuellen Anteils TNF-α exprimierender Zellen. Signifikant am meisten TNF-α positive Zellen fanden sich bei den Monozyten mit bakteriellen Bestandteilen im Phagolysosom (MoPH), sowohl bei den PBMO (MoPH: 55,49 % ± 3,76 %, MoBI: 15,51% ± 5,80 %, MoNC: 5,06 % ± 1,87 %) als auch bei den CBMO (MoPH: 57,65 % ± 4,65 %, MoBI: 23,52% ± 16,22 %, MoNC: 12,23 % ± 6,07 %). 36 V. Diskussion V.1 Infektion und Apoptose von Monozyten Die Initiierung des programmierten Zelltods von Monozyten nach Infektion mit Escherichia coli ist sowohl für PBMO (Fernandez-Prada et al., 1998) als auch für CBMO beschrieben (Gille et al., 2003). In dieser Arbeit konnte das Einsetzen der Apoptose bei bereits kurzen Inkubationszeiträumen (4h) dargestellt werden. Auch hier waren Monozyten erwachsener Spender deutlich suszeptibler für die Induktion der Apoptose als Immunzellen aus Nabelschnurblut (s. Abb. 9). Apoptose wird als wichtiger Mechanismus zur Regulation einer physiologischen Immunantwort und als signifikanter Einfluss auf die Homöostase von Immunzellen angesehen (Moraes et al., 2006). Bisher wurde eine vermehrte apoptotische Aktivität von peripheren Monozyten in septischen Patienten mit einem verbesserten Überleben assoziiert (Giamarellos-Bourboulis et al., 2006). Allerdings sprechen Ansätze im Tiermodell gegen diese Theorie, insbesondere im Frühstadium der Infektion (Antonopoulou et al., 2007). Gemeinhin spielen in den genannten Studien der Zeitpunkt und beteiligte Mechanismen monozytärer Apoptose eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Sepsis. V.2 Bystander-Apoptose, E.coliGFPund CHX Das Infektionsmodell mit GFP-exprimierenden E.coli Bakterien erlaubte die Unterscheidung von Monozyten, die innerhalb der 4-stündigen Inkubationszeit (permanenten) Kontakt mit den Bakterien hatten (MoGFP+), und denen die keine oder nur eine kurze, reversible Bindung zu Bakterien hatten (MoGFP-). Die Apoptose von Immunzellen nach Phagozytose wird als PICD (Phagocytosis induced cell death) bezeichnet (DeLeo, 2004). PICD entsprach hier im vorliegenden Ansatz der nachgewiesenen Apoptose der MoGFP+. PICD der Monozyten/Makrophagen ist bereits nach Infektion mit verschiedenen Erregern wie Borrelien und Streptokokken beschrieben (Cruz et al., 2008; Monack et al., 1996; Timmer et al., 2009). Interessanterweise wurden in unserem Infektionsmodell auch MoGFP- in ausgeprägtem Maße apoptotisch, was als „Bystander-Killing“ bezeichnet wird. Dieses Verhalten betraf sowohl CBMO, als auch PBMO, bei welchen die Rate des Zelltods der 37 Monozyten ohne bakteriellen Kontakt sogar den der mit Kontakt übertraf (s. Abb. 10). Dies machte deutlich, dass für den Zelltod von Monozyten die Anwesendheit von E.coli ausreichend, und nicht Phagozytose obligatorisch ist. Beschrieben wurden bereits Transferexperimente, bei welchen die Überstände infizierter Monozyten Apoptose in bisher unbehandelten PBMO auslösten. Die beteiligten Studien gingen von einer zentralen Rolle des CD95-Signalwegs aus (Dockrell et al., 2001; Brown et al., 1999). Die zusätzliche Inkubation mit dem Ribosomen-Inhibitor CHX konnte zeigen, dass der Vorgang des „Bystander-Killing“ von PBMO abhängig von der Protein de-novo Synthese ist, nicht jedoch der PICD. Bei den CBMO ließ sich auf Grund der geringen Apoptose lediglich eine ähnliche Tendenz ausmachen (s. Abb. 10). Somit wurde davon ausgegangen, dass den Vorgängen des Bystander-Killing und des PICD verschiedene Mechanismen mit unterschiedlichen Einflussfaktoren zu Grunde liegen. Bisher konnte in Studien eine Abhängigkeit des PICD von der Protein de-novo Synthese bei Infektion von Makrophagen mit Streptokokken, und des extrinsischen Apoptoseweges über den Fas-Rezeptor in U937-Zellen ausfindig gemacht werden (Dockrell et al., 2001; Blomberg et al., 2008). V.2.1 Bystander-Apoptose in nicht-phagozytierenden Monozyten – Verifizierung durch das E.coliEOSFP Modell Mit dem Einsatz von E.coliEOSFP konnte eine detaillierte Betrachtung des PhagozytoseFortschritts erfolgen. Die Kinetik von der Bakterienadhärenz bis zum Transport ins Phagolysosom wurde eindeutig nachvollzogen und unterschied sich nicht bei PBMO und CBMO. Interessanterweise hatten nach der Inkubationszeit von 4h erst ca. 50% der Zellen bakterielle Bestandteile zur Degradation in die Phagolysosomen transportiert, obschon fast 85% der Monozyten nach 1h bereits Bakterien an der Oberfläche adhärierten. Zur Validierung dieses Infektionsassays wurden auch Proben nach 24stündiger Inkubation ausgewertet, die zeigten, dass sich wirklich bei fast allen Monozyten (ca. 80%) Bakterien im Phagolysosom befanden (s. Abb. 17). Trotz ähnlicher Aufnahmemechanismen von bakteriellen Pathogenen, verhielten sich die beiden Populationen doch auch hier bei der Auswertung apoptotischer Zellen gegensätzlich. War in den Monozyten aus Nabelschnurblut keine signifikante Zunahme des Zelltods nach Infektion zu ermitteln, konnte dagegen gezeigt werden, dass auch fixierte, nicht mehr teilungsfähige E.coli in der Lage sind in signifikantem Maße 38 Apoptose in den PBMO zu induzieren (s. Abb. 18). Dieses Verhalten erwachsener Monozyten schließt eine „aktive“ Induktion des programmierten Zelltods, wie sie für vorwiegend intrazelluläre Erreger beschrieben ist (Gao et al., 2000; Fink et al., 2008; Keane et al., 1997) durch die phagozytierten E.coli aus, und spricht eher für die Auslösung der Apoptose mittels Zell-Zell Kommunikation. Bestätigend konnte für PBMO gezeigt werden, dass gerade Monozyten im bereits fortgeschrittenen Phagozytosestadium nach 4 Stunden in deutlich geringerem Maße apoptotisch wurden als Zellen im Frühstadium oder ohne bakteriellen Kontakt (s. Abb. 18). Dies führte uns nochmals die wichtige Rolle des Bystander-Killing im beschriebenen Infektionsmodell mit E.coli vor Augen. Allgemein ist die Auslösung des Zelltodes monozytärer Zellen nach Infektion mit verschiedenen Pathogenen über unterschiedliche Signalwege, in vivo und in vitro beschrieben (Peck-Palmer et al., 2009; Webster et al., 2010; Adrie et al., 2001; Guichon et al., 1997). Für Infektionen mit anderen Erregern, wie Pneumokokken sind Vorgänge der späten Phagozytose (Bildung reaktiver Sauerstoffspezies) ein wichtiges Apoptosesignal (Marriott et al., 2004), was in unserem Infektionsmodell mit E.coli offensichtlich keine Rolle spielte. V.3 TNF-α Quantifizierung in Versuchsüberständen mittels ELISA TNF-α Synthese und Sekretion von Monozyten als Reaktion auf LPS Stimulation (Kornbluth et al., 1986) oder auf bakteriellen Kontakt mit Erregern wie Streptokokken, Staphylokokkus aureus oder Borrelien ist ein bereits bekanntes Phänomen (Currie et al., 2011; Kapetanovic et al., 2011; Ssalazar et al., 2009). Nach 4-stündiger Inkubation von PBMO und CBMO mit E.coli konnten wir in beiden Ansätzen signifikante Mengen des Zytokins nachweisen, wohingegen in uninfizierten Proben kein TNF-α detektierbar war (s. Abb. 11). Auch Lymphozyten gelten als potentielle Produzenten von geringen Mengen an TNF-α, zeigten dieses Verhalten in vorausgegangen Studien jedoch nicht auf Stimulus mit LPS (Cuturi el al., 1987). Somit gingen wir bei unseren Ergebnissen, von einer vorrangig durch Monozyten bewerkstelligte Synthese des TNF-α aus. Eine verminderte Sekretion des Zytokins von Monozyten aus Nabelschnurblut erschien wahrscheinlich, wenn auch nicht unmittelbar statistisch signifikant (s. Abb. 12). Dieser Sachverhalt stellt sich in der Literatur uneinheitlich dar. Beschreiben einige Studien eine verminderte TNF-α Sekretion von CBMO verglichen mit PBMO nach Stimulation 39 (Pillay et al., 1994; Sautois et al., 1997), präsentierten andere eine ähnliche Zytokinsynthese der Neugeborenenmonozyten (Müller et al., 1996; Darville et al., 1994) oder lediglich eine Defizienz von Immunzellen Frühgeborener (Weatherstone et al., 1989; Kaufman et al., 1999). Weiterführend konnte die Inkubation mit CHX die Sekretion von TNF-α effizient sowohl in CBMO, als auch in den PBMO inhibieren. Die Nachweisgrenze des TNF-α ELISA von 4 pg/ml wurde in diesen Überständen nicht überschritten (s. Abb. 11), was die wichtige Rolle der Protein de-novo Synthese für die Sekretion von löslichem TNF-α untermauert. Diese Ergebnisse decken sich mit älteren Untersuchungen zu PBMO (Voitenok et al., 1989). Die Korrelation von inhibierter TNF-α Synthese und gleichzeitigem Rückgang des Bystander-Killings nach CHX Applikation, ließ eine wichtige Rolle von löslichem TNF-α im Vorgang der Apoptoseinduktion nicht-phagozytierender Monozyten vermuten. Möglicherweise könnte auch die Inhibition der Synthese anderer Proteine, die zur Induktion der Apoptose beitragen diese Ergebnisse erklären. Ein Einfluss der Liganden CD95L (Brown et al., 1999), TRAIL und TWEAK ist bei der Apoptose von Monozyten bereits beschrieben (Kaplan et al., 2002). Diese Vermittler des extrinsischen Signalweges (Xu et al., 2007; s. Abb. 1) könnten auch in unserem Infektionsmodell eine Rolle spielen. Auch pro- und antiapoptotische Proteine mit essentiellen Funktionen in intrazellulären Signalwegen des programmierten Zelltods könnten hier zum Gesamtbild beitragen, ist ihr immenser Einfluss im Rahmen der Sepsis bereits bekannt (Peck-Palmer et al., 2009). So würde etwa die verminderte Expression von proapoptotischen Proteinen wie Bim oder PUMA, deren Funktion beim PICD oder bei der Apoptoseinduktion durch TNF-α bereits bekannt ist (Wang et al., 2009; Kirschnek et al., 2005), einen weiteren Erklärungsansatz darstellen. Zur Klärung dieser Fragestellung konnten vorhergehende Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe beitragen, die zeigten, dass die Vorinkubation mit einem löslichem antiTNF-α Antikörper (Enbrel) in signifikantem Maße die Apoptose von Monozyten nach E.coliGFP Infektion verminderte. Enbrel konnte den programmierten Zelltod nicht im selben Maße wie CHX verhindern, was für die zusätzliche Beteiligung weiterer Signalwege beim Bystander-Killing spricht. Darüber hinaus schlossen sich nun Untersuchungen über die exogene Gabe von TNF-α und dessen Einfluss auf den monozytären Zelltod an. 40 V.4 Stimulation mit TNF-α Die Induktion der Apoptose von Monozyten durch lösliches TNF-α ist ein bekanntes Phänomen (Mitchell et al., 2006; Misasi et al., 2004). Durch exogene Zugabe von rekombinantem TNF-α konnten wir in PBMO nach 4h in signifikantem Maße Zelltod auslösen (s. Abb. 13). Die ausgewählte Menge (5 ng/ml ) entsprach dabei den durchschnittlich gemessenen Mengen des Zytokins in Überständen von 4-stündigen Infektionsversuchen im ELISA. Eine Steigerung der Konzentration konnte das apoptotische Verhalten nicht signifikant verändern (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise zeigten sich die Neugeborenen-Monozyten relativ unempfindlich gegenüber der TNF-α Stimulation. Die Anzahl apoptotischer Zellen übertraf kaum die obligat stattfindende Spontanapoptose im unstimulierten Ansatz (s. Abb. 13). TNF-α ist ein extrem pleiotropes Zytokin, dass –wie bereits erwähnt- primär von Vertretern der monozytären Zelllinie synthetisiert wird (Flynn et al., 1995) und seinen Einfluss sowohl membrangebunden als auch in löslicher Form parakrin, autokrin und endokrin vermittelt (Perez et al., 1990; Grell, 1995). Autokrine Stimulation von Makrophagen nach LPS Zugabe mittels TNF-α konnte so unter gewissen Umständen auch als antiapoptotisches Signal fungieren (Lombardo et al., 2007). Bereits früh wurde seine wichtige Rolle im Rahmen entzündlicher Erkrankungen (z.B. Rheumatoide Arthritis) und seine Funktion als einem „Hauptregulator“ der proinflammatorischen Immunantwort erkannt (Feldmann et al., 1994; Maini et al., 1995; Clark, 2007). Applikation von anti-TNF-α Antikörpern (Infliximab) konnte einen messbaren Benefit bei der Behandlung von Patienten mit Morbus Crohn und Spondylitis ankylosans bewirken (Hanauer et al., 2002; Sands et al., 2004; Baraliakos et al., 2005). Beim Krankheitsbild Sepsis ist der entscheidende Einfluss des Tumor Nekrose Faktors unbestritten. Verschiedene Messungen von TNF-α im Serum betroffener Patienten lieferten eindeutige Ergebnisse, hat diese Methode es trotzdem noch nicht in die Routinediagnostik der Sepsis geschafft (Hammerle et al., 1990; Schaumann et al., 1997). Therapeutische Interventionen in der TNF-α Signalkaskade in einem murinen Sepsis-Modell zeigten darüber hinaus einige Erfolge (Barkhausen et al., 2009; Fei et al., 2011). Trotzdem lieferten Inhibitionsversuche im Rahmen klinischer Sepsisstudien am Menschen bisher keine überzeugenden Ergebnisse (Gallagher et al., 2001; Schattner et al., 1997). 41 V.4.1 Intrazelluläre TNF-α Färbung Der intrazelluläre Nachweis von TNF-α in PBMO bzw. CBMO nach Stimulation mit E.coliGFP und E.coliEOSFP gewährte weitere Einblicke in die Kinetik der TNF-α Synthese. Eine signifikanter Anstieg TNF-α positiver Zellen war nach Infektion in beiden Zellpopulationen zu erkennen (s. Abb. 14). Auch die fixierten, nicht mehr teilungsfähigen E.coliEOSFP waren in der Lage die TNF-α Synthese signifikant zu initiieren. Wiederum erlaubte das EOSF-P Fluorchrom eine weitere Differenzierung der Monozyten. Immunzellen mit Bakterien im Phagolysosom (MoPH) stellten signifikant die größte Population an TNF-α positiven Zellen (s. Abb. 19). Sowohl bei den PBMO als auch bei den CBMO übertrafen sie Monozyten im frühen Phagozytose-Stadium (MoBI) und ohne bakteriellen Kontakt (MoNC). Zusammenfassend konnte dargestellt werden, dass PBMO und CBMO äquivalent viele TNF-α positive Zellen in ihrer Population nach bakteriellem Stimulus haben und Phagozytose mit anschließendem Transport ins Phagolysosom den wichtigsten Stimulus für die TNF-α Synthese darstellt. Einschränkend sollte jedoch erwähnt werden, dass die benutzte Vorgehensweise sämtliches in den Zellen enthaltene TNF-α färbte. Sie gab keinen Aufschluss darüber, welcher Anteil membranständig (mTNF-α), in löslicher Form (sTNF-α) oder am TNF-α Rezeptor gebunden durch Sekretion umgebender Monozyten vorlag. Darüber hinaus wurde zur Validierung kein entsprechender Iso-Antikörper, sondern eine „Kompetetive Färbung“ verwendet. Wir konnten die Spezifität der Färbung mittels zweier Kompetetions-Assays nachweisen. Zum Einen gelang eine Reduktion des Signals nach exogener Gabe von löslichem TNF-α, das mit dem intrazellulären TNF-α um Bindung mit dem fluorchrommarkierten Antikörper konkurrierte. Zum Anderen konnten wir ein vermindertes Signal durch exogene Gabe eines ungefärbten anti-TNFα-Antikörpers erreichen, der mit dem fluorchrommarkierten Antikörper um die Bindung an dem intrazellulären TNF-α konkurrierte. Anschließen sollten sich weitere Untersuchungen mit Inhibitoren des Golgi-Apparats wie Brefeldin A. Durch die Hemmung wird der Transport neu synthetisierter Proteine an die Zellmembran und damit die Sekretion verhindert (Klausner et al., 1992). Die folgende Akkumulation entsprechender Proteine in der Zelle könnte anschließend durchflusszytometrisch gemessen werden und spezifischere Aussagen über die TNF-α Syntheseleistung einzelner Zellen in entsprechenden Zeiträumen erlauben. 42 V.5 TNF-α Rezeptor 1 Das Zytokin TNF-α vermittelt seine Funktionen über zwei Transmembran-Rezeptoren: TNFR1 und TNFR2 (Tartaglia et al., 1991). Im Gegensatz zum TNFR1 gelingt eine vollständige Aktivierung des TNFR2 nur durch das membranständige TNF-α, das auch auf PBMO nachgewiesen werden konnte (Eissner et al., 2000) und nicht durch lösliches TNF-α (Grell et al., 1995). Beide Rezeptoren können jedoch auch von der Zelloberfläche abgetrennt werden und als lösliche Faktoren über Bindung von extrazellulärem TNF-α die Immunantwort modulieren (Van Zee et al., 1992; Madge et al., 1999). Nach Bindung von TNF-α vermittelt der TNFR1 viele der inflammatorischen Reaktionen letztendlich über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkappaB (Abu-Amer et al., 1998). Eine Vielzahl an Genen, die essentielle Proteine der Immunantwort wie κ-Leichtketten von Immunglobulinen, MHC-Antigene, Zytokine und Zytokinrezeptoren, sowie Adhäsionsmoleküle kodieren unterstehen der transkriptionalen Regulation durch NFkappaB (Baeuerle und Henkel, 1995). Da TNFR1, nicht jedoch TNFR2, über eine intrazelluläre „Death-Domain“ verfügt, ist von einer essentiellen Rolle des TNFR1 bei der extrazellulären Induktion der Apoptose auszugehen (Grell et al., 1995). Neben der Aktivierung von NFkappaB, bildet sich ein weiterer Signalkomplex nach Aktivierung des TNFR1 im Zytoplasma, der stark proapoptotische Proteine wie Procaspase-8 und -10 enthält. Inhibiert wird dieser Komplex vom antiapoptotischen FLIP(L) (Zaitseva et al., 2011), welches nach Aktivierung von NFkappaB vermehrt synthetisiert wird. TNF-α induziert also als pleiotropes Zytokin in Zielzellen sowohl die Synthese von pro-, als auch von antiapoptotischen Proteinen. Die Auslösung der Apoptose in betroffenen Zellen, ist also das Ergebnis eines Ungleichgewichts pro- und antiapoptotischer Proteine (Micheau und Tschopp , 2003). Darüber hinaus spielt der TNFR1 auch eine wichtige Rolle bei der Auslösung des programmierten Zelltods über den CD95-CD95L-Signalweg (Parameswaran und Patial, 2010). Bei der Bestimmung von membranständigen TNFR1 in unseren Versuchsansätzen, konnten wir im unstimulierten Zustand bei den CBMO signifikant weniger TNFR1positive Zellen nachweisen, als bei den PBMO. Nach Infektion reduzierte sich die Anzahl bei den Zellen erwachsener Spender, wohingegen die Nabelschnurmonozyten weiterhin den Rezeptor in nur geringem Maße exprimierten (s. Abb. 15). Der relative Mangel an TNF-α Rezeptor 1 auf der Zellmembran neonataler Monozyten könnte als 43 mögliche Erklärung für die Toleranz dieser Zellen gegenüber der Apoptoseinduktion durch TNF-α gewertet werden. Die essentielle Rolle der TNF-α Rezeptoren für die Immunantwort und das Überleben beim Sepsisgeschehen konnte schon im Mausmodell einer polymikrobiellen Infektion gezeigt werden (Secher et al., 2009). TNFR1 knockout Mäuse waren resistent gegenüber normalerweise letalen Dosen an LPS oder Enterotoxin B von Staphylokokkus aureus (Pfeffer et al., 1993). Auf der anderen Seite zeigten diese Tiere Defizite in der Beseitigung des fakultativ intrazellulären Erregers Listeria monocytogenes (Rothe et al., 1993). Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass Bystander-Apoptose in CBMO nach Infektion mit E.coli in geringerem Ausmaß stattfindet, als bei PBMO und dass die TNF-α Signaltransduktion maßgeblich an der Regulation der BystanderApoptose beteiligt ist. V.6 Einordnung und Ausblick Das Zytokin TNF-α spielt eine maßgebliche Rolle in der Pathogenese der Sepsis. Es initiiert Entzündungsreaktionen über die Freisetzung von weiteren Zytokinen wie IL-1 und die Expression von Leukozytenadhäsionsmolekülen durch Endothelzellen (Locksley et al., 1987; Broudy et al., 1987). Es trägt zur „Sepsistypischen“ Endotheldysfunktion bei (Ferro et al., 2000), die wiederum als pathophysiologische Grundlage des multiplen Organversagens im Rahmen eines septischen Schocks angesehen wird (Wort et Evans, 1999; Hocking et al., 1990). Eine intravenöse Gabe von TNF-α löst die typischen Symptome eines septischen Geschehens wie Fieber, Müdigkeit, Kopfschmerzen, Leukopenie und Hypotonie aus (Schwartz et al., 1989; Feinberg et al., 1988; Sacks et Rosenblum, 1992). Im Tiermodell konnte darüber hinaus nach Applikation das Vollbild eines septischen Schocks beobachtet werden (Tracey et al., 1986). Obwohl TNF-α im Serum in der Routinediagnostik nicht bestimmt wird, wurde gerade bei Patienten mit schweren Sepsisverläufen deutlich erhöhte Werte des Zytokins ermittelt (Damas et al., 1989; Hammerle et al., 1990). Viele körpereigene Mechanismen zur Begrenzung der durch TNF-α induzierten Inflammation wurden bereits untersucht. Dazu gehören das Ablösen („Shedding“) des TNF-α Rezeptor 1 von der Zellmembran zur Neutralisation von löslichem TNF-α 44 (Xanthouela et al., 2004), als auch die simultane Synthese des anti-inflammatorischen IL-10 zur Suppression aktivierter Monozyten (Ocuin et al., 2011; van Furth et al., 1999). Wir beschreiben in unseren Versuchsansätzen nun einen potentiell autoregulatorischen Mechanismus, bei welchem lösliches TNF-α über die Induktion monozytärer Apoptose die eigene Synthese limitiert. Diese Suppression ist bei neonatalen Monozyten durch den signifikanten Mangel an TNF-α Rezeptor 1 gestört. Diese Defizienz könnte einen wichtigen Mechanismus in der Pathogenese der fulminanten neonatalen Sepsis darstellen und ein mögliches Ziel für zukünftige therapeutische Interventionen bieten. Abbildung 20: Konzept der Apoptosesignalwege bei der Infektion von CBMO (orange) und PBMO (gelb), grün: Bakterien 45 VI Zusammenfassung Der programmierte Zelltod von Immunzellen im Rahmen von Infektionen ist ein gut dokumentiertes Phänomen und ein wichtiger Mechanismus in der Regulation der Immunantwort. Besonders im Maximalfall einer Infektion (Sepsis) sind die Begrenzung der Immunreaktion und eine eng gesteuerte Erregerabwehr maßgeblich für den Krankheitsverlauf und die Prognose. Apoptose auslösende Faktoren involvieren vielerlei verschiedene Mechanismen und unterscheiden sich zwischen unterschiedlichen Erregern. Gerade Monozyten kommen in ihrer Funktion als Phagozyten, Antigenpräsentierenden Zellen und Hauptproduzenten von TNF-α eine immense Rolle bei der Immunantwort zu und bedürfen einer begrenzenden Kontrolle. In der vorliegenden Arbeit konnten in einem 4h Infektionsansatz GFP-positiver Escherichia coli und E.coliEOSFP mit Monozyten Erwachsener und Neugeborener folgende Beobachtungen gemacht werden: 1. Neben dem PICD (Phagocytosis induced cell death) kommt es zu einem „Bystander-Killing“ nicht phagozytierender Monozyten. 2. „Bystander Killing“ und PICD liegen verschiedene Mechanismen zu Grunde. 3. „Bystander Killing“ ist reduziert in CBMO. 4. TNF-α spielt eine wichtige Rolle bei der Apoptose von Monozyten und insbesondere beim „Bystander Killing“. 5. CBMO reagieren deutlich weniger auf die Apoptoseinduktion durch TNF-α, was durch eine verminderte Expression von TNFR1 erklärt werden kann. 6. CBMO und PBMO unterscheiden sich nicht beim Vorgang der Bakterienphagozytose. Die vorgelegten Ergebnisse beschreiben, dass dem bei Infektion im Überschuss produzierten Zytokin TNF-α Aufgaben bei der Terminierung der Immunantwort durch Apoptoseinduktion in Monozyten zukommen. Diese autoregulatorische Funktion ist bei CBMO durch eine vermeintlich verringerte TNF-α Sekretion und dem signifikanten Mangel an membranständigem TNFR1 gestört. Die Unfähigkeit eine initiierte Immunantwort effizient zu terminieren, könnte eine wichtige Rolle bei typischen frühkindlichen Krankheitsbildern wie der Nekrotisierenden Enterokolitis oder der hier im Mittelpunkt stehenden neonatalen Sepsis spielen. 46 VII Anhang VII.1 Referenzen 1. Abraham E, Wunderink R, Silverman H, et al. Efficacy and safety of monoclonal antibody to human tumor necrosis factor alpha in patients with sepsis syndrome: a randomized, controlled, double-blind, multicenter clinical trial. JAMA 1995;273:934-941. 2. Abu-Amer Y, Ross FP, McHugh KP, Livolsi A, Peyron JF, Teitelbaum SL. Tumor necrosis factor-alpha activation of nuclear transcription factor-kappaB in marrow macrophages is mediated by c-Src tyrosine phosphorylation of Ikappa B alpha. J Biol Chem. 1998 Nov 6;273(45):29417-23. 3. Adrie C, Bachelet M, Vayssier-Taussat M, Russo-Marie F, Bouchaert I, AdibConquy M, Cavaillon JM, Pinsky MR, Dhainaut JF, Polla BS. Mitochondrial membrane potential and apoptosis peripheral blood monocytes in severe human sepsis. Am J Respir Crit Care Med. 2001 Aug 1;164(3):389-9. 4. Angus DC, Linde-Zwirble WT, Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR.Epidemiology of severe sepsis in the united states: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 2001 Jul;29(7):1303-10. 5. Antonopoulou A, Raftogiannis M, Giamarellos-Bourboulis EJ, Koutoukas P, Sabracos L, Mouktaroudi M, Adamis T, Tzepi I, Giamarellou H, Douzinas EE. Early apoptosis of blood monocytes is a determinant of survival in experimental sepsis by multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa. Clin Exp Immunol. 2007 Jul;149(1):103-8. Epub 2007 May 4. 6. Ashkenazi A, Dixit VM. Death receptors: signaling and modulation. Science. 1998 Aug 28;281(5381):1305-8. 7. Baeuerle PA, Henkel T. Function and activation of NF-kappa B in the immune system. Annu Rev Immunol. 1994;12:141-79. 8. Baraliakos X, Listing J, Rudwaleit M, Brandt J, Sieper J, Braun J. Radiographic progression in patients with ankylosing spondylitis after 2 years of treatment with the tumor necrosis factor alpha antibody infliximab. Ann Rheum Dis. 2005 Oct;64(10):1462-6. Epub 2005 Mar 18. 9. Barkhausen T, Hildebrand F, Krettek C, van Griensven M. DHEA-dependent and organ-specific regulation of TNF-alpha mRNA expression in a murine 47 polymicrobial sepsis and trauma model. Crit Care. 2009;13(4):R114. Epub 2009 Jul 13. 10. Beere HM. Death versus survival: functional interaction between the apoptotic and stress-inducible heat shock protein pathways. J Clin Invest. 2005 Oct;115(10):2633-9. 11. Blomberg J, Ruuth K, Santos D, Lundgren E. Acquired resistance to Fas/CD95 ligation in U937 cells is associated with multiple molecular mechanisms. Anticancer Res. 2008 Mar-Apr;28(2A):593-9. 12. Bone RC, Balk RA, Cerra FB, Dellinger RP, Fein AM, Knaus WA, Schein RM, Sibbald WJ. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Chest 1992;101:1644-1655. 13. Bone RC, Fisher CJ Jr, Clemmer TP, et al. A controlled clinical trial of highdose methylprednisolone in the treatment of severe sepsis and septic shock. N Engl J Med 1987;317:653-658. 14. Boyum A. Separation of lymphocytes, lymphocyte subgroups and monocytes: a review. Lymphology. 1977 Jun;10(2):71-6. 15. Broudy VC, Harlan JM, Adamson JW. Disparate effects of tumor necrosis factor-alpha/cachectin and tumor necrosis factor-beta/lymphotoxin on hematopoietic growth factor production and neutrophil adhesion molecule expression by cultured human endothelial cells. J Immunol. 1987 Jun 15;138(12):4298-302. 16. Brown SB, Savill J. Phagocytosis triggers macrophage release of Fas ligand and induces apoptosis of bystander leukocytes. J Immunol.1999 162(1): 480-5. 17. Clark IA. How TNF was recognized as key mechanism of disease. Cytokine Growth Factor Rev. 2007 Jun-Aug;18(3-4):335-43. Epub 2007 May 9. 18. Collins RJ, Harmon BV, Souvlis T, Pope JH, Kerr JF. Effects of cycloheximide on B-chronic lymphocytic leukaemic and normal lymphocytes in vitro : induction of apoptosis. Br J Cancer. 1991 Sep;64(3):518-22. 19. Cossarizza A, Franceschi C, Monti D, Salvioli S, Bellesia E, Rivabene R, Biondo L, Rainaldi G, Tinari A, Malorni W. Protective effect of Nacetylcysteine in tumor necrosis-factor-alpha-induced apoptosis in U937 cells: the role of mitochondria. Exp Cell Res. 1995 Sep;220(1):232-40. 20. Cruz AR, Moore MW, La Vake CJ, Eggers CH, Salazar JC, Radolf JD. Phagocytosis of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease spirochete, potentiates 48 innate immune activation and induces apoptosis in human monocytes. Infect Immun. 2008 Jan;76(1):56-70. Epub 2007 Oct 15. 21. Currie, A.J., et al., Preterm infants have deficient monocyte and lymphocyte cytokine responses to group B streptococcus. Infect Immun, 2011. 79(4): p. 1588-96. 22. Cuturi MC, Murphy M, Costa-Giomi MP, Weinmann R, Perussia B, Trinchieri G. Independent regulation of tumor necrosis factor and lymphotoxin production by human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 1987 Jun 1;165(6):158194. 23. Damas P, Reuter A, Gysen P, Demonty J, Lamy M, Franchimont P. Tumor necrosis factor and interleukin-1 serum levels during severe sepsis in humans. Crit Care Med. 1989 Oct;17(10):975-8. 24. Danai P, Martin GS. Epidemiology of sepsis: recent advances. Curr Infect Dis Rep 2005 Sep;7(5):329-34. 25. Darville T, Tabor D, Simpson K, Jacobs RF. Intravenous immunoglobulin modulates human mononuclear phagocyte tumor necrosis factor-alpha production in vitro. Pediatr Res. 1994 Apr;35(4 Pt 1):397-403. 26. DeLeo FR. Modulation of phagocyte apoptosis by bacterial pathogens. Apoptosis. 2004 Jul;9(4):399-413. 27. Djaldetti M, Salman H, Bergman M, Djaldetti R, Bessler H. Phagocytosis – the mighty weapon of the silent warriors. Microsc Res Tech. 2002 Jun 15;57(6):421-31. 28. Docke WD, Randow F, Syrbe U, et al. Monocyte deactivation in septic patients: restoration by IFN-gamma treatment. Nat Med 1997;3:678-681. 29. Dockrell DH, Lee M, Lynch DH, Read RC. Immune-mediated phagocytosis and killing of Streptococcus pneumoniae are associated with direct and bystander macrophage apoptosis. J Infect Dis. 2001 Sep 15;184(6):713-22. Epub 2001 Aug 24. 30. Drossou V, Kanakoudi F, Diamanti E, Tzimouli V, Konstantinidis T, Germenis A, Kremenopoulos G, Katsougiannopoulos V. Concentrations of main serum opsonins in early infancy. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 1995 May;72(3):F172-5. 31. Eissner G, Kirchner S, Lindner H, Kolch W, Janosch P, Grell M, Scheurich P, Andreesen R, Holler E. Reverse signaling through transmembrane TNF confers 49 resistance to lipopolysaccharide in human monocytes and macrophages. J Immunol. 2000 Jun 15;164(12):6193-8. 32. Ertel W, Kremer J-P, Kenney J, et al. Downregulation of proinflammatory cytokine release in whole blood from septic patients. Blood 1995;85:1341-1347. 33. Fei Y, Wang W, Kwiecinski J, Josefsson E, Pullerits R, Jonsson IM, Magnusson M, Jin T. The combination of a tumor necrosis factor inhibitor and antibiotic alleviates staphylococcal arthritis and sepsis in mice. J Infect Dis. 2011 Aug;204(3):348-57. 34. Feinberg B, Kurzrock R, Talpaz M, Blick M, Saks S, Gutterman JU. A phase I trial of intravenously-administered recombinant tumor necrosis factor-alpha in cancer patients. J Clin Oncol. 1988 Aug;6(8):1328-34. 35. Feldmann M, Brennan FM, Elliott M, Katsikis P, Maini RN. TNF alpha as a therapeutic target in rheumatoid arthritis. Circ Shock. 1994 Aug;43(4):179-84. 36. Fernandez-Prada C, Tall BD, Elliott SE, Hoover DL, Nataro JP, Venkatesan MM. Hemolysin-positive enteroaggregative and cell-detaching Escherichia coli strains cause oncosis of human monocyte-derived macrophages and apoptosis of murine J774 cells. Infect Immun. 1998 Aug;66(8):3918-24. 37. Ferro T, Neumann P, Gertzberg N, Clements R, Johnson A. Protein kinase Calpha mediates endothelial barrier dysfunction induced by TNF-alpha. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000 Jun;278(6):L1107-17. 38. Fink SL, Bergsbaken T, Cookson BT. Anthrax lethal toxin and Salmonella elicit the common cell death pathway of caspase-1-dependent pyroptosis via distinct mechanisms. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Mar 18;105(11):4312-7. Epub 2008 Mar 12. 39. Fisher CJ Jr, Agosti JM, Opal SM, et al. Treatment of septic shock with the tumor necrosis factor receptor:Fc fusion protein. N Engl J Med 1996;334:16971702. 40. Fisher CJ Jr, Slotman GJ, Opal SM, et al. Initial evaluation of human recombinant interleukin-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome: a randomized, open-label, placebo-controlled multicenter trial. Crit Care Med 1994;22:12-21. 41. Fleer A, Gerards LJ, Verhoef J. Host defence to bacterial infection in neonate. J Hosp Infect. 1988 Feb;11 Suppl A:320-7. 50 42. Flegel WA, Wölpl A, Männel DN, Northoff H. Inhibition of endotoxin-induced activation of human monocytes by human lipoproteins. Infect Immun. 1989 Jul;57(7):2237-45. 43. Flynn JL, Goldstein MM, Chan J, Triebold KJ, Pfeffer K, Lowenstein CJ, Schreiber R, Mak TW, Bloom BR. Tumor necrosis factor-alpha is required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice. Immunity. 1995 Jun;2(6):561-72. 44. Gallagher J, Fisher C, Sherman B, Munger M, Meyers B, Ellison T, Fischkoff S, Barchuk WT, Teoh L, Velagapudi R. A multicenter, open-label, prospective, randomized, dose-ranging pharmacokinetic study of the anti-TNF-alpha antibody afelimomab in patients with sepsis syndrome. Intensive Care Med. 2001 Jul;27(7):1169-78. 45. Gao LY, Kwaik YA. The modulation of host cell apoptosis by intracellular pathogens. Trends Microbiol. 2000 Jul;8(7):306-13. 46. Giamarellos-Bourboulis EJ, Routsi C, Plachouras D, Markaki V, Raftogiannis M, Zervakis D, Koussoulas V, Orfanos S, Kotanidou A, Armaganidis A, Roussos C, Giamarellou H. Early apoptosis of blood monocytes in the septic host: is it a mechanism of protection in the event of septic shock?. Crit Care. 2006;10(3):R76. Epub 2006 May 12. 47. Gille C, Spring B, Tewes LJ, Löffler J, Dannecker GE, Hoffmann MK, Eichner M, Poets CF, Orlikowsky TW. Diminished response to interleukin-10 and reduced antibody-dependent cellular cytotoxicity of cord blood monocytederived macrophages. Pediatr Res. 2006 Aug;60(2):152-7. 48. Gille C, Leiber A, Spring B, Kempf VA, Loeffler J, Poets CF, Orlikowsky TW. Diminished phagocytosis-induced cell death (PICD) in neonatal monocytes upon infection with Escherichia coli. Pediatr Res. 2008 Jan;63(1):33-8. 49. Gogos CA, Drosou E, Bassaris HP, Skoutelis A. Pro- versus anti-inflammatory cytokine profile in patients with severe sepsis: a marker for prognosis and future therapeutic options. J Infect Dis 2000;181:176-180. 50. Grell M, Douni E, Wajant H, Löhden M, Clauss M, Maxeiner B, Georgopoulos S, Lesslauer W, Kollias G, Pfizenmaier K, Scheurich P. The transmembrane form of tumor necrosis factor is the prime activating ligand of the 80kDa tumor necrosis factor receptor. Cell. 1995 Dec 1;83(5):793-802. 51. Grell M. Tumor necrosis factor (TNF) receptors in cellular signaling of soluble and membrane-expressed TNF. J Inflamm. 1995-1996;47(1-2):8-17. 51 52. Guichon A, Zychlinsky A. CLinical isolates of Shigella species induce apoptosis in macrophages. J Infect Dis. 1997 Feb;175(2):470-3. 53. Hammerle AF, Krafft P, Wagner OA, Pöschl G, Winternitz J, Plattner H, Weinstabl C. Is TNF-alpha “ripe” for routine diagnosis in sepsis? Anaesthesist. 1990 Oct;39(10):547-51. 54. Hanauer SB, Feagan BG, Lichtenstein GR, Mayer LF, Schreiber S, Colombel JF, Rachmilewitz D, Wolf DC, Olson A, Bao W, Rutgeerts P; ACCENT I Study Group. Maintenance infliximab for Crohn’s disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 2002 May 4;359(9317):1541-9. 55. Hocking DC, Phillips PG, Ferro TJ, Johnson A. Mechanisms of pulmonary edema induced by tumor necrosis factor-alpha. Circ Res. 1990 Jul;67(1):68-77. 56. Hoebe K, Janssen E, Beutler B. The interface between innate and adaptive immunity. Nat Immunol. 2004 Oct;5(10):971-4. 57. Hotchkiss RS, Coopersmith CM, McDunn JE, Ferguson TA. The sepsis seesaw: tilting toward immunosuppression. Nat Med. 2009 May;15(5):496-7. 58. Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of Sepsis. N Engl J Med. 2003 Jan 9;348(2):138-50. 59. Hotchkiss RS, Tinsley KW, Swanson PE, et al. Sepsis-induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+ T lymphocytes in humans. J Immunol 2001;166:6952-6963. 60. Hotchkiss RS, Tinsley KW, Swanson PE, Karl IE. Endothelial cell apoptosis in sepsis. Crit Care Med. 2002 May;30(5 Suppl):S225-8. 61. Isaacs D, Barfield CP, Grimwood K, McPhee AJ, Minutillo C, Tudehope DI. Systemic bacterial and fungal infections in infants in Australian neonatal units.Australian Study Group for Neonatal Infections. Med J Aust 1995,162(4):198-201. 62. Kao CH, Kuo YC, Chen CC, Chang YT, Chen YS, Wann SR, Liu YC. Isolated pathogens and clinical outcomes of adult bacteremia in the emergency department: a retrospective study in a tertiary Referral Center. J Microbiol Immunol Infect. 2011 Jun;44(3):215-21. Epub 2011 Jan 18. 63. Kapetanovic, R., Parlato M, Fitting C, Quesniaux V, Cavaillon JM, AdibConquy M. Mechanisms of TNF induction by heat-killed Staphylococcus aureus differ upon the origin of mononuclear phagocytes. Am J Physiol Cell Physiol, 2011. 300(4): p. C850-9. 52 64. Kaplan MJ, Lewis EE, Shelden EA, Somers E, Pavlic R, McCune WJ, Richardson BC. The apoptotic ligands TRAIL, TWEAK, and Fas ligand mediate monocyte death induced by autologous lupus T cells. J Immunol. 2002 Nov 15;169(10):6020-9. 65. Kaufman D, Kilpatrick L, Hudson RG, Campbell DE, Kaufman A, Douglas SD, Harris MC. Decreased superoxide production, degranulation, tumor necrosis factor alpha secretion, and CD11b/CD18 receptor expression by adherent monocytes from preterm infants. Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Jul;6(4):525-9. 66. Keane J, Balcewicz-Sablinska MK, Remold HG, Chupp GL, Meek BB, Fenton MJ, Kornfeld H. Infection by Mycobacterium tuberculosis promotes human alveolar macrophage apoptosis. Infect Immun. 1997 Jan;65(1):298-304. 67. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 1972 August; 26(4): 239–257. 68. Kirschnek S, Ying S, Fischer SF, Häcker H, Villunger A, Hochrein H, Häcker G. Phagocytosis-induced apoptosis in macrophages is mediated by up-regulation and activation of the Bcl-2 homology domain 3-only protein Bim. J Immunol. 2005 Jan 15;174(2):671-9. 69. Kirschnek S, Ying S, Fischer SF, Häcker H, Villunger A, Hochrein H, Häcker G. Phagocytosis-induced apoptosis in macrophages is mediated by up-regulation and activation of the Bcl-2 homology domain 3-only protein Bim. J Immunol. 2005 Jan 15;174(2):671-9. 70. Klausner RD, Donaldson JG, Lippincott-Schwartz J. Brefeldin A: insights into the control of membrane traffic and organelle structure. J Cell Biol. 1992 Mar;116(5):1071-80. 71. Kornbluth RS, Edgington TS. Tumor necrosis factor production by human monocytes is a regulated event: induction of TNF-alpha-mediated cellular cytotoxicity by endotoxin. J Immunol. 1986 Oct 15;137(8):2585-91. 72. Limaye AP, Kirby KA, Rubenfeld GD, Leisenring WM, Bulger EM, Neff MJ, Gibran NS, Huang ML, Santo Hayes TK, Corey L, Boeckh M. Cytomegalovirus reactivation in critically ill immunocompetent patients. JAMA. 2008 Jul 23;300(4):413-22. 73. Locksley RM, Heinzel FP, Shepard HM, Agosti J, Eessalu TE, Aggarwal BB, Harlan JM. Tumor necrosis factors alpha and beta differ in their capacities to 53 generate interleukin 1 release from human endothelial cells. J Immunol. 1987 Sep 15;139(6):1891-5. 74. Lombardo E, Alvarez-Barrientos A, Maroto B, Boscá L, Knaus UG. TLR4mediated serviva of macrophages is MyD88 dependent and requie TNF-alpha autocrine signalling. J Immunol. 2007 Mar 15;178(6):3731-9. 75. Madge LA, Sierra-Honigmann MR, Pober JS. Apoptosis-inducing agents cause rapid shedding of tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1). A nonpharmacological explanation for inhibition of TNF-mediated activation. J Biol Chem. 1999 May 7;274(19):13643-9. 76. Maini RN, Elliott MJ, Brennan FM, Feldmann M. Beneficial effects of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) blockade in rheumatoid arthritis (RA). Clin Exp Immunol. 1995 Aug;101(2):207-12. 77. Marriott HM, Ali F, Read RC, Mitchell TJ, Whyte MK, Dockrell DH. Nitric oxide levels regulate macrophage commitment to apoptosis or necrosis during pneumococcal infection. FASEB J. 2004 Jul;18(10):1126-8. Epub 2004 May 7. 78. Micheau O, Tschopp J. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes. Cell. 2003 Jul 25;114(2):181-90. 79. Misasi R, Garofalo T, Di Marzio L, Mattei V, Gizzi C, Hiraiwa M, Pavan A, Grazia Cifone M, Sorice M. Prosapin: a new player in cell death prevention of U937 monocytic cells. Exp Cell Res. 2004 Aug 1;298(1):38-47. 80. Mitchell JW, Baik N, Castellino FJ, Miles LA. Plasminogen inhibits TNF-alpha induced apoptosis in monocytes. Blood. 2006 Jun 1;107(11):4383-90. Epub 2006 Feb 14. 81. Monack DM, Raupach B, Hromockyj AE, Falkow S. Salmonella typhimurium invasion induces apoptosis in infected macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Sep 3;93(18):9833-8. 82. Moraes TJ, Downey GP. Death of the septic monocyte: is more better?. Crit Care. 2006;10(3):146. Epub 2006 Jun 2. 83. Muenzer JT, Davis CG, Chang K, Schmidt RE, Dunne WM, Coopersmith CM, Hotchkiss RS. Characterization and Modulation of the Immunosuppressive Phase of Sepsis. Infect Immun. 2010 April; 78(4): 1582–1592. 84. Müller K, Zak M, Nielsen S, Pedersen FK, de Nully P, Bendtzen K. In vitro cytokine production and phenotype expression by blood mononuclear cells from umbilical cords, children and adults. Pediatr Allergy Immunol. 1996 Aug;7(3):117-24. 54 85. Munoz C, Carlet J, Fitting C, Misset B, Blériot JP, Cavaillon JM. Dysregulation of in vitro cytokine production by monocytes during sepsis. J Clin Invest. 1991 Nov;88(5):1747-54. 86. Oberholzer A, Oberholzer C, Moldawer LL. Sepsis syndromes: understanding the role of innate and acquired immunity. Shock 2001;16:83-96. 87. Ocuin LM, Bamboat ZM, Balachandran VP, Cavnar MJ, Obaid H, Plitas G, DeMatteo RP. Neutrophil IL-10 suppresses peritoneal inflammatory monocytes during polymicrobial sepsis. J Leukoc Biol. 2011 Mar;89(3):423-32. Epub 2010 Nov 24. 88. Parameswaran N, Patial S. Tumor necrosis factor-alpha signaling in macrophages. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2010;20(2):87-103. 89. Parravacini E, van de Ven C, Anderson L, Cairo MS. Myeloid Hematopoietic Growth Factor and Their Role in Prevention and/or Treatment of Neonatal Sepsis. Transfus Med Rev 2002,16(1):11-24. 90. Peck-Palmer OM, Unsinger J, Chang KC, McDonough JS, Perlman H, McDunn JE, Hotchkiss RS. Modulation of the Bcl-2 family blocks sepsis-induced depletion of dendritic cells and macrophages. Shock. 2009 Apr;31(4):359-66. 91. Perez C, Albert I, DeFay K, Zachariades N, Gooding L, Kriegler M. A nonsecretable cell surface mutant of tumor necrosis factor (TNF) kills by cell-tocell contact. Cell. 1990 Oct 19;63(2):251-8. 92. Pfeffer K, Matsuyama T, Kündig TM, Wakeham A, Kishihara K, Shahinian A, Wiegmann K, Ohashi PS, Krönke M, Mak TW. Mice deficient for the 55 kd tumor necrosis factor receptor are resistant to endotoxic shock, yet succumb to L. Monocytogenes infection. Cell. 1993 May 7;73(3):457-67. 93. Pillay V, Savage N, Laburn H. Circulating cytokine concentrations and cytokine production by monocytes from newborn babies and adults. Pflugers Arch. 1994 Oct;428(3-4):197-201. 94. Pinheiro da Silva F, Nizet V. Cell death during sepsis: integration of disintegration in the inflammatory response to overwhelming infection. Apoptosis. 2009 Apr;14(4):509-21. 95. Power C, Fanning N, Redmond HP. Cellular apoptosis and organ injury in sepsis: a review. Shock. 2002 Sep;18(3):197-211. 96. Rothe J, Lesslauer W, Lötscher H, Lang Y, Koebel P, Köntgen F, Althage A, Zinkernagel R, Steinmetz M, Bluethmann H. Mice lacking the tumor necrosis 55 factor receptor 1 are resistant to TNF-mediated toxicity but highly susceptible to infection by Listeria monocytogenes. Nature. 1993 Aug 26;364(6440):798-802. 97. Saks S, Rosenblum M. Recombinant human TNF-alpha: preclinical studies and results from early clinical trials. Immunol Ser. 1992;56:567-87. 98. Salazar, J.C., et al., Activation of human monocytes by live Borrelia burgdorferi generates TLR2-dependent and -independent responses which include induction of IFN-beta. PLoS Pathog, 2009. 5(5): p. e1000444. 99. Sands BE, Anderson FH, Bernstein CN, Chey WY, Feagan BG, Fedorak RN, Kamm MA, Korzenik JR, Lashner BA, Onken JE, Rachmilewitz D, Rutgeerts P, Wild G, Wolf DC, Marsters PA, Travers SB, Blank MA, van Deventer SJ. Infliximab maintenance therapy for fistulizing Crohn’s disease. N Engl J Med. 2004 Feb 26;350(9):876-85. 100. Sautois B, Fillet G, Beguin Y. Comparatice cytokine production by in vitro stimulated mononucleated cells from cord blood and adult blood. Exp Hematol. 1997 Feb;25(2):103-8. 101. Schattner A, el-Hador I, Hahn T, Landau Z. Triple antiTNF-alpha therapy in early sepsis: a preliminary report. J Int Med Res. 1997 MarApr;25(2):112-6. 102. Schaumann R, Schlick T, Schaper M, Shah PM. Is TNF-alpha a prognostic factor in patients with sepsis? Clin Microbiol Infect. 1997 Feb;3(1):24-31. 103. Schreiner L, Huber-Lang M, Weiss ME, Hohmann H, Schmolz M, Schneider EM. Phagocytosis and digestion of pH-sensitive fluorescent dye (EosFP) transfected E. coli in whole blood assays from patients with severe sepsis and septic shock. J Cell Commun Signal. 2011 Jun;5(2):135-44. 104. Schwartz JE, Scuderi P, Wiggins C, Rudolph A, Hersh EM. A phase I trial of recombinant tumor necrosis factor (rTNF) administered by continuous intravenous infusion in patients with disseminated malignancy. Biotherapy. 1989;1(3):207-14. 105. Secher T, Vasseur V, Poisson DM, Mitchell JA, Cunha FQ, Alves-Filho JC, Ryffel B. Crucial role of TNF receptors 1 and 2 in the control of polymicrobial sepsis. J Immunol. 2009 Jun 15;182(12):7855-64. 106. Serbina NV, Jia T, Hohl TM, Pamer EG. Monocyte-mediated defense against Microbial Pathogens. Annu Rev Immunol. 2008; 26: 421–452. 56 107. Stearns-Kurosawa DJ, Osuchowski MF, Valentine C, Kurosawa S, Remick DG. The pathogenesis of sepsis. Annu Rev Pathol. 2011 Feb 28;6:1948. 108. Steigbigel RT, Lambert LH Jr, Remington JS. Phagocytic and bacterial properties of normal human monocytes. J Clin Invest. 1974 Jan;53(1):131-42. 109. Stone R. Search for sepsis drugs goes on despite past failures. Science 1994;264:365-367. 110. Suen Y, Lee SM, Qian J, van de Ven C, Cairo MS. Dysregulation of lymphokine production in the neonate and its impact on neonatal cell mediated immunity. Vaccine. 1998 Aug-Sep;16(14-15):1369-77. 111. Tartaglia LA, Weber RF, Figari IS, Reynolds C, Palladino MA Jr, Goeddel DV. The two different receptors for tumor necrosis factor mediate distinct cellular responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Oct 15;88(20):92926. 112. Timmer AM, Timmer JC, Pence MA, Hsu LC, Ghochani M, Frey TG, Karin M, Salvesen GS, Nizet V. Steptolysin O promotes group A Streptococcus immune evasion by accelerated macrophage apoptosis. J Biol Chem. 2009 Jan 9;284(2):862-71. Epub 2008 Nov 11. 113. Tinsley KW, Grayson MH, Swanson PE, Drewry AM, Chang KC, Karl IE, Hotchkiss RS. Sepsis induces apoptosis and profound depletion of splenic interdigitating and follicular dendritic cells. J Immunol. 2003 Jul 15;171(2):90914. 114. Tracey KJ, Beutler B, Lowry SF, Merryweather J, Wolpe S, Milsark IW, Hariri RJ, Fahey TJ 3rd, Zentella A, Albert JD, et al. Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin. Science. 1986 Oct 24;234(4775):4704. 115. Treves AJ, Tal T, Barak V, Fuks Z. Antigen presentation and regulatory functions of human monocytes in the in vitro response of lymphocytes against purified protein derivative of tuberculin (PPD). Eur J Immunol. 1981 Jun;11(6):487-92. 116. Van Furth AM, Verhard-Seijmonsbergen EM, Langermans JA, van Dissel JT, van Furth R. Anti-CD14 monoclonal antibodies inhibit the production of tumor necrosis factor alpha and interleukin-10 by human monocytes stimulated with killed and live Haemophilus influenzae or Streptococcus pneumoniae organisms. Infect Immun. 1999 Aug;67(8):3714-8. 57 117. Van Zee KJ, Kohno T, Fischer E, Rock CS, Moldawer LL, Lowry SF. Tumor necrosis factor soluble receptors circulate during experimental and clinical inflammation and can protect against excessive tumor necrosis factor alpha in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Jun 1;89(11):4845-9. 118. Voitenok NN, Misuno NI, Panyutich AV, Kolesnikova TS. Induction of tumor necrosis factor synthesis in human monocytes treated by transcriptional inhibitors. Immunol Lett. 1989 Jan 15;20(1):77-82. 119. Voll RE, Herrmann M, Roth EA, Stach C, Kalden JR, Girkontaite I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature 1997;390:350-351. 120. Wang H, Devereaux R, Yealy D, Safford M, Howard G. National variation in United States sepsis mortality: a descriptive study. Int J Health Geogr. 2010 Feb; 9: 9 121. Wang P, Qiu W, Dudgeon C, Liu H, Huang C, Zambetti GP, Yu J, Zhang L. PUMA is directly activated by NF-kappaB and contributes to TNF-alphainduced apoptosis. Cell Death Differ. 2009 Sep;16(9):1192-202. Epub 2009 May 15. 122. Warren HS. Strategies for the treatment of sepsis. N Engl J Med 1997;336:952-953. 123. Watson RS, Carcillo JA, Linde-Zwirble WT, Clermont G, Lidicker J, Angus DC. The epidemiology of severe sepsis in children in the United States. Am J Respir Crit Care Med. 2003 Mar 1;167(5):695-701. 124. Weatherstone KB, Rich EA. Tumor necrosis factor/cachectin and interleukin-1 secretion by cord blood monocytes from premature and term neonates. Pediatr Res. 1989 Apr;25(4):342-6. 125. Webster SJ, Daigneault M, Bewley MA, Preston JA, Marriott HM, Walmsley SR, Read RC, Whyte MK, Dockrell DH. Distinct cell death programs in monocytes regulate innate responses following challenge with common causes of invasive bacterial disease. J Immunol. 2010 Sep 1;185(5):2968-79. Epub 2010 Jul 23. 126. Weston EJ, Pondo T, Lewis MM, Martell-Cleary P, Morin C, Jewell B, Daily P, Apostol M, Petit S, Farley M, Lynfield R, Reingold A, Hansen NI, Stoll BJ, Shane AL, Zell E, Schrag SJ. The Burden of invasive early-onset Neonatal Sepsis in the United States, 2005-2008. Pediatr Infect Dis J. 2011 Jun 7. 58 127. Wiedenmann J, Nienhaus GU. Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family. Expert Rev Proteomics. 2006 Jun;3(3):361-74. 128. Wolach B, Carmi D, Gilboa S, Satar M, Segal S, Dolfin T, Schlesinger M. Some aspects of the humoral immunity and the phagocytic function in newborn infants. Isr J Med Sci. 1994 May-Jun;30(5-6):331-5. 129. Wort SJ, Evans TW. The role of the endothelium in modulating vascular control in sepsis and related conditions. Br Med Bull. 1999;55(1):30-48. 130. Xanthoulea S, Pasparakis M, Kousteni S, Brakebusch C, Wallach D, Bauer J, Lassmann H, Kollias G. Tumor necrosis factor (TNF) receptor shedding controls thresholds of innate immune activation that balance opposing TNF functions in infectious and inflammatory diseases. J Exp Med. 2004 Aug 2;200(3):367-76. 131. Xu G, Shi Y. Apoptosis signaling pathways and lymphocyte homeostasis. Cell Res. 2007 Sep;17(9):759-71. 132. Zaitseva L, Rushworth SA, MacEwan DJ. Silencing FLIP(L) modifies TNF-induced apoptotic protein expression. Cell Cycle. 2011 Apr 1;10(7):106772. Epub 2011 Apr 1. 133. Ziegler EJ, Fisher CJ Jr, Sprung CL, et al. Treatment of gram-negative bacteremia and septic shock with HA-1A human monoclonal antibody against endotoxin: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. N Engl J Med 1991;324:429-436. 59 VII.2 Publikationen a) Publikationen, die den Inhalt der Dissertation darstellen: 1. “Infection-induced Bystander-Apoptosis of Monocytes is TNF-alpha-mediated.” Stephan Dreschers, Christian Gille, Martin Haas, Julia Grosse-Ophoff, Marion Schneider, Anja Leiber, Hans-Jörg Bühring, Thorsten W. Orlikowsky. Accepted. PLOS ONE b) weitere Publikationen: 2. “CD95/CD95L-pathway is involved in phagocytosis induced cell death (PICD) of monocytes and may account for sustained inflammation in neonates.” Christian Gille, Stephan Dreschers, Anja Leiber, Florian Leiporz, Matthias Krusch, Julia Grosse-Ophoff, Bärbel Spring, Martin Haas, Michael Urschitz, Christian F. Poets, Thorsten W. Orlikowsky. Accepted. Pediatric Research 60 VII.3 Danksagungen Bei der Entstehung dieser Arbeit waren viele Menschen beteiligt, denen ich herzlichst danken möchte. Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. Th. Orlikowsky für die Annahme als Doktorand, die aufmerksame und enthusiastische Verfolgung des Arbeitsfortschritts sowie die regelmäßigen Hilfestellungen und Ergebnisdiskussionen. Weiterhin möchte ich mich herzlichst bei Fr. Dr. Angela Schippers und dem ganzen Laborteam (Dr. Th. Claßen, PD Dr. Kl. Tenbrock, Dr. Kim Ohl, Nora Honke, Karin, Göran) für das unwahrscheinlich angenehme Arbeitsklima, die freundliche Unterstützung und Hilfsbereitschaft und eine schöne Zeit bedanken. Mein größter Dank gilt wohl Dr. Stephan Dreschers, ohne dessen unermüdliche Hilfsbereitschaft, Geduld, Expertise, Humor und Begeisterung es wohl nie zu dieser Arbeit gekommen wäre. Echt jetzt: Danke! Bedanken möchte ich mich auch beim Hebammenteam des Uniklinikums Aachen, das uns mit uneingeschränktem Engagement bei der Gewinnung der Nabelschnurproben unterstützt hat. Bei den freundlichen Mitarbeitern des biochemischen Instituts bedanke ich mich für die unkomplizierte Hilfe bei ELISA, FACS und Mikroskopie. Zuletzt möchte ich mich bei meinen Eltern Brigitte und Heribert, sowie dem Rest meiner Familie Kerstin, Ralf und Heidi für die Unterstützung in jeglicher Hinsicht bedanken! 61 VII.4 Erklärung zur Datenaufbewahrung Hiermit erkläre ich, dass die dieser Dissertation zu Grunde liegenden Originaldaten in der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin Sektion Neonatologie des Universitätsklinikums Aachen hinterlegt sind. 62 VII.5 Erklärung über den Eigenanteil Eidesstattliche Erklärung gemäß § 5 Abs. (1) und § 10 Abs. (3) 12. der Promotionsordnung Hiermit erkläre ich, Herr Martin Haas an Eides statt, dass ich folgende in der von mir selbstständig erstellten Dissertation „Apoptose neonataler und adulter Monozyten im Infektionsmodell mit Escherichia coli: die Rolle des TNF-alpha Signalwegs“ dargestellten Ergebnisse erhoben habe: Durchführung sämtlicher dargestellter Experimente, sowie deren statistische Auswertung . Bei der Durchführung der Arbeit hatte ich folgende Hilfestellungen, die in der Danksagung angegeben sind: A. Dr. rer. nat. Stephan Dreschers: Einarbeitung in die komplette Methodik: FACS, ELISA, Zellkultur, Mikroskopie. Hilfe bei der Datenauswertung, sowie Diskussion von Ergebnissen und Versuchsaufbau. B. Prof. Dr. med. Thorsten Orlikowsky: Diskussion von Ergebnissen und Versuchsaufbau. C. Arbeitsgruppe um Dr. rer. nat. Angela Schippers: Einarbeitung in das Labor. Unterstützung bei Organisation, Zellkultur und Methodik. D. Hebammenteam Universitätsklinikum Aachen: Unterstützung bei der Blutentnahme aus Nabelschnüren. Martin Haas Als Betreuer der obigen Dissertation bestätige ich die Angaben von Herrn Martin Haas Univ.-Prof. Dr. med. Thorsten Orlikowsky 63 VII.6 Lebenslauf Persönliche Daten: Name Martin Haas Geburtsdatum 18.11.1986 Geburtsort Wittlich Schulausbildung 1993 – 1997 Grundschule Wehr 1997 – 2006 Peter-Joerres-Gymnasium, Bad Neuenahr-Ahrweiler 2006 – 2011 Dienst im Katastrophenschutz: Deutsches Rotes Kreuz Ortsverein Wehr Studium Seit 2006 Studium der Humanmedizin an der RWTH Aachen (Modellstudiengang) 10/2009 Basisprüfung (Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung) 2010 – 2012 Promotionsarbeit in der Kinder- und Jugendmedizin Sektion Neonatologie des Universitätsklinikum Aachen unter Prof. Dr. Thorsten Orlikowsky. 2011 – 2012 Praktisches Jahr: 1. Tertial: Chirurgie Bethlehem Krankenhaus Stolberg 2. Tertial: Innere Medizin Bethlehem Krankenhaus Stolberg 3. Tertial: Pädiatrie Universitätsklinikum Aachen 11/2012 Approbation als Arzt Seit 06/2013 Assistenzarzt Städtisches Krankenhaus Kiel 1. Medizinische Klinik (Kardiologie, Pneumologie, Nephrologie) 64
