Regulation und Funktion von TGF-ß

Jahrbuch 2007/2008 | Oelgeschläger, Michael | Regulation und Funktion von TGF-ß-Signalen in der frühen
Embryonalentw icklung
Regulation und Funktion von TGF-ß-Signalen in der frühen
Embryonalentwicklung
Regulation and function of TGF-ß signals during early embryogenesi
Oelgeschläger, Michael
Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik, Freiburg
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Proteine der transformierenden Wachstumsfaktor-beta-Familie (TGF-ß) regulieren eine Vielzahl von zellulären
Prozessen. TGF-ß-Moleküle steuern die Differenzierung von Zellen w ie auch deren Proliferation, und
Mutationen in Komponenten des TGF-ß-Signalübertragungsw eges w urden in verschiedenen Tumoren bereits
identifiziert. Zusätzlich sind diese Wachstumsfaktoren von zentraler Bedeutung für frühe embryonale
Entw icklungsprozesse.
W issenschaftler
am
Max-Planck-Institut
für
Immunbiologie
haben
mithilfe von
Mikroarray-Analysen neue Gene identifiziert, durch die TGF-ß-Aktivitäten in der frühen Embryonalentw icklung
vermittelt w erden.
Summary
Abstract Proteins of the transforming grow th factor-beta (TGF-ß) family regulate a plethora of cellular
processes. TGF-ß proteins regulate cellular differentiation as w ell as proliferation and mutations in the TGF-ß
signal transduction pathw ay have been identified in various tumours. In addition, TGF-ß activity is of central
importance for early embryonic development. Scientists at the Max-Planck-Institute of Immunobiology have
identified new TGF-ß regulated genes that mediate TGF-ß activities during early embryonic development.
Einleitung
In der Embryonalentw icklung w ird eine Vielzahl an Zellarten zeitlich und räumlich koordiniert gebildet. Dabei
spielen Wachstumsfaktoren eine zentrale Rolle. Sie w erden in den extrazellulären Raum abgegeben und
stimulieren
durch
die
Bindung
an
membranständige
Rezeptoren
intrazelluläre
Signalkaskaden,
die
Genexpression steuern. Diese signalabhängige Regulation der Genexpression erlaubt die Koordinierung von
Zellproliferation, Zellw anderung und Zelldifferenzierung in komplexen Gew eben, insbesondere da Zellen
unterschiedlich auf das Signal reagieren, je nachdem w elche Kombinationen an Rezeptoren und intrazellulären
Mediatoren in der Zelle vorliegen. Der TGF-ß-Signalübertragungsw eg ist von zentraler Bedeutung für die
Determinierung verschiedener Zelltypen in der Embryonalentw icklung von W irbeltieren. Aber auch im
erw achsenen Organismus ist eine präzise Steuerung von TGF-ß-Signalen notw endig, besonders w eil
Mutationen in Komponenten der TGF-ß-Signalkaskade zur Bildung von malignen Tumoren führen [1].
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Der TGF-ß-Signalübertragungsweg
Proteine der TGF-ß-Familie binden an Proteinkomplexe in der Zellmembran, die aus den so genannten Typ IIund Typ I-Rezeptoren bestehen. Die Bindung des TGF-ß-Liganden stimuliert die Aktivierung des Typ IRezeptors durch den Typ II-Rezeptor. Der aktivierte Typ I-Rezeptor phosphoryliert und aktiviert intrazelluläre
Proteine der SMAD-Familie, die Rezeptor assoziierten Smads (R-Smads). Diese binden nun an Smad-4 und
steuern
im Zellkern
zusammen
mit
einer
Reihe
zusätzlicher
Transkriptionsfaktoren
(TF) spezifische
Gentranskription (Abb. 1A).
Die TGF-ß-Familie kann dabei in zw ei Gruppen eingeteilt w erden, die Bone morphogenetic protein-Gruppe (BMP)
und die Nodal-Gruppe. Die BMP-Gruppe aktiviert mithilfe spezifischer Typ I-Rezeptoren die R-Smads Smad-1,
Smad-5 und Smad-8, w ährend die Nodal-Gruppe Smad-2 und Smad-3 aktiviert [2]. Durch die Aktivierung
spezifischer Smad-Proteine stimulieren die beiden TGF-ß-Gruppen sehr unterschiedliche Prozesse. In der
frühen Embryonalentw icklung sind Nodal-Proteine vor allem für die Bildung des Mesoderms notw endig, aus
dem ein Großteil der inneren Organe entsteht. BMP-Signale hemmen die Bildung von Nervengew ebe und
stimulieren die Bildung von Epidermis (Haut) und ventralem Mesoderm, aus dem z.B. Nieren und Blut
hervorgehen (Abb. 1B)
Die TGF-Signalkaskade (A) TGF-ß-P rote ine binde n a n
Tra nsm e m bra nk om ple x e , die Sm a d-P rote ine inne rha lb de r
Ze lle phosphorylie re n und da durch a k tivie re n. Sm a ds bilde n
Kom ple x e m it Sm a d-4 und ste ue rn m it zusä tzliche n
Tra nsk riptionsfa k tore n (TF) spe zifische Ge ne x pre ssion. (B)
R e ze ptork om ple x e , a n die BMP s binde n, a k tivie re n Sm a d-1,
Sm a d-5 und Sm a d -8 und stim ulie re n die Bildung von Ha ut,
Blut und Nie re nge we be , wä hre nd die Bildung von
Ne rve nge we be ge he m m t wird. Noda l-Signa le a k tivie re n Sm a d2 und -3, die für die Bildung de s Me sode rm s und de r
Eta blie rung de r Link s-re chts-Asym m e trie notwe ndig sind.
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Die Regulation der Genexpression durch TGF-ß-Signale ist sehr Dosis-abhängig. Bereits kleine Variationen in
der BMP- oder Nodal-Konzentration stimulieren die Bildung verschiedener embryonaler Gew ebe. Daher gibt es
eine Vielzahl an Mechanismen, durch die TGF-ß-Signale innerhalb und außerhalb der Zelle reguliert w erden.
Von besonderem Interesse ist die Regulation von BMP-Signalen im extrazellulären Raum. Genetische Studien
im Fischembryo und funktionelle w ie auch biochemische Analysen im Froschembryo haben ein sehr komplexes
Netzw erk aus Protein-Protein-Wechselw irkungen identifiziert, durch die die Bindung von BMPs an BMPRezeptorkomplexe reguliert w ird, einschließlich des BMP-Antagonisten Chordin, Metalloproteinasen der TolloidFamilie, sow ie Twisted Gastrulation und Sizzled [2, 3]. Der BMP-Antagonist Chordin bindet BMPs und hemmt
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dadurch die Interaktion von BMPs mit Rezeptorkomplexen. Diese Hemmung ist reversibel, da Tolloid Chordin
spalten und BMP w ieder freisetzen kann. Twisted gastrulation stimuliert die Bindung von Chordin an BMP w ie
auch die Spaltung von Chordin durch Tolloid, w ährend Sizzled die proteolytische Spaltung von Chordin durch
Tolloid hemmt. Verschiedene Komponenten dieses Netzw erks w urden in Mensch, Maus und Frosch, aber auch
in Fliege und Seeanemone gefunden. Dabei stellte man fest, dass – trotz der Unterschiede in den sich
bildenden
Strukturen
–
zumindest
einige
Proteine
dieses
regulatorischen
Netzw erkes
vergleichbare
Funktionen ausüben [4, 5, 6]. W ährend der frühen Embryogenese w ird Chordin im Frosch, w ie auch im Fisch
oder der Maus, lokal sezerniert und generiert dadurch einen BMP-Signalgradienten. Dieser Gradient w ird im
Embryo
auf verschiedene
Weise
interpretiert. Zum einen
w erden
Zelltypen
konzentrationsabhängig
determiniert. Zum anderen steuert der Gradient gerichtete Zellbew egungen [7], durch die aus dem
kugelförmigen Ei ein länglicher Embryo geformt w ird (Abb. 2).
Der BMP-Signalgradient (A) Durch lok a le Se ze rnie rung von
Anta goniste n wird im Em bryo e in BMP -Signa lgra die nt e ta blie rt,
durch de n ve rschie de ne Ge we be im Ek tode rm (bla u) und
Me sode rm (grün) de te rm inie rt we rde n. (B) Einige Stunde n
spä te r wa nde rn Ze lle n e ntla ng de s BMP -Gra die nte n von de r
Ba uch- zur R ück e nse ite und form e n a us e ine m k uge lförm ige n
Ei e ine n lä ngliche n Em bryo.
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Identifizierung von BMP-Zielgenen
Der südafrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis w ird häufig für die Analyse von Signalkaskaden und deren
Wechselw irkung mit bekannten oder neuen Proteinen eingesetzt. Die Froscheier sind sehr groß (1.5 mm im
Durchmesser) und ermöglichen eine Vielzahl embryologischer Manipulationen. Zusätzlich legt ein Weibchen
über 2000 Eier am Tag, die eine fast unerschöpfliche Quelle für die Isolation von DNA, RNA oder Proteinen
darstellen. Durch Mikroinjektion von frühen Froschembryonen mit synthetischer mRNA oder chemischer
Behandlung, z.B. mit Lithiumchlorid, können Signale stimuliert oder gehemmt w erden und ausreichende
Mengen an RNA aus verschiedenen embryonalen Stadien isoliert w erden, die eine vergleichende Analyse
mithilfe von Mikroarray-Chips erlauben. Die Arbeitsgruppe um Michael Oelgeschläger hat eine Reihe von neuen
Genen identifiziert, die durch BMP-Signale transkriptional reguliert w erden und verschiedene BMP-Aktivitäten
im frühen Froschembryo vermitteln. Dafür w urde RNA aus frühen Froschembryonen isoliert, in denen BMPAktivität durch Mikroinjektion synthetischer mRNA oder chemischer Behandlung entw eder stimuliert oder
gehemmt w orden w ar und mithilfe von Mikroarray-Analysen verglichen. Die Expression der isolierten Gene
korrelierte dabei sehr gut mit BMP-Aktivität. Vor allem in frühen Embryonalstadien w ird der BMP-Signalgradient
durch die Expression dieser Gene deutlich sichtbar. BMP-Signalgradienten determinieren w ährend der
Gastrulation, in der Mesoderm in den Embryo einw andert, die dorsal-ventrale (Rücken-Bauch) Körperachse. In
der dorsalen oder Rückenseite des Embryos w ird w ährend der Neurulation die Neuralplatte gebildet, aus der
das zentrale Nervensystem hervorgeht. Da in der Neuralplatte kaum BMP-Aktivität nachzuw eisen ist, w erden
in diesem Bereich vor allem Gene transkribiert, deren Expression durch BMP- Signale gehemmt w ird, w ährend
Transkripte BMP-aktivierter Gene von der Neuralplatte ausgeschlossen sind. (Abb. 3).
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Expression BMP-regulierter Gene Die Ex pre ssion von Ge ne n,
die durch BMP -Signa le stim ulie rt we rde n, ist von de r R ück se ite
wä hre nd de r Ne urula tion a usge schlosse n (A, B), wo
a usschlie ßlich Ge ne e x prim ie rt we rde n, die durch BMP -Signa le
ge he m m t we rde n (C , D). Die Ex pre ssion von x Tspa n-1
wä hre nd de r Ga strula tion m a cht de n BMP -Signa lgra die nte n
sichtba r (E). LiC l-Be ha ndlung he m m t BMP -Ak tivitä t, soda ss
x Tspa n-1-m R NA nun gle ichm ä ßig im ga nze n Em bryo
na chwe isba r ist (F). Die rote n Gra die nte n ste lle n die BMP Ak tivitä t für die je we ilige n e m bryona le n Sta die n sche m a tisch
da r.
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Eines
der
Gene,
die
durch
BMP-Signale
in
ihrer
Expression
gehemmt
w erden,
kodiert
für
ein
Transmembranprotein, xTspan-1. Durch Mikroinjektion synthetischer mRNA konnte gezeigt w erden, dass
xTspan-1 Zelladhäsion und Zellmigration reguliert [8]. Dies w urde unter anderem durch sogenannte
Reaggrations-Assays nachgew iesen. Dafür w urde ein Aggregat aus unbehandelten embryonalen Zellen und
xTspan-1 injizierten Zellen, die zusätzlich einen fluoreszierenden Marker exprimierten, hergestellt. Die xTspan1-positiven Zellen mischten sich nicht mit den unbehandelten Zellen, sondern sammelten sich an der
Oberfläche
des
Aggregats an.
Dieser
Effekt
konnte
durch
Ko-Injektion
von
mRNAs,
die
für
Zelladhäsionsproteine der Cadherin-Familie kodierten, aufgehoben w erden. Diese Ergebnisse w eisen auf eine
Hemmung der Zelladhäsion durch xTspan-1 hin, die unter anderem durch reduzierte Cadherin-Aktivität in den
xTspan-1 exprimierenden Zellen erklärt w erden kann. Zusätzlich w urde mithilfe von Morpholino-Oligomeren,
die spezifisch die Proteinsynthese von endogenem xTspan-1 hemmen, nachgew iesen, dass xTspan-1 für die
Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen notw endig ist (Abb. 4).
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xTspan-1 hemmt Zelladhäsion und stimuliert die Bildung von
Nervenzellen. (A) Die x Tspa n-1 e x prim ie re nde n Ze lle n
m ische n sich nicht m it norm a le n e k tode rm a le n Ze lle n.
Sta ttde sse n a k k um ulie re n sie a uf de r O be rflä che de s
Aggre ga ts, wa s a uf e ine re duzie rte Ze lla dhä sion hinwe ist. (B)
Die se r Effe k t k a nn durch Ko-Ex pre ssion von C a dhe rine n
a ufge hobe n we rde n. Zusä tzlich ve rhinde rt die He m m ung de r
P rote insynthe se von e ndoge ne m x Tspa n-1 die Bildung von
diffe re nzie rte n Ne rve nze lle n (C ; N-tubulin) a ls a uch
ne urona le n Vorlä ufe rze lle n (D; x de lta -1). Die injizie rte n Ze lle n
a uf de r re chte n Se ite sind grün ge fä rbt, da sie zusä tzlich ßGa la k tosida se e x prim ie re n. Tspa n-1 he m m t Ze lla dhä sion wie
a uch Ze llm igra tion und stim ulie rt Ne ura linduk tion; zwe i BMP a bhä ngige P roze sse .
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Dieses Protein ist also an den oben beschriebenen BMP-abhängigen Prozessen beteiligt und stellt eines der
ersten BMP-regulierten Gene dar, das sow ohl Zellbew egungen als auch die Differenzierung von Nervenzellen
regulieren kann.
Ausblick
Diese Arbeiten haben zur Identifizierung einer Vielzahl neuer BMP-regulierter Gene geführt, einschließlich
Tspan-1, das an der Regulation von Zellbew egungen und der Differenzierung von Nervenzellen beteiligt ist.
Die w eitere Analyse dieser Gene w ird unser Verständnis für die molekularen Mechanismen, durch die BMPSignale eine Vielzahl an biologischen Aktivitäten in der Embryogenese w ie auch im adulten Organismus
steuern, w eiter vertiefen. Die überraschend ausgeprägte Ähnlichkeit von BMP-Aktivitäten in verschiedenen
W irbeltierarten
lässt
erw arten,
dass
homologe
Gene
in
Säugetieren,
einschließlich
des
Menschen,
vergleichbare Funktionen ausüben.
Originalveröffentlichungen
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