Charakterisierung und Interaktionsstudien des 7
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Universitätsklinikum Ulm Institut für Virologie Prof. Dr. med. Thomas Mertens Charakterisierung und Interaktionsstudien des 7-Transmembrandomänen-Proteins pUL78 des humanen Zytomegalievirus Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie (Dr. biol. hum.) der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Svenja Maria Denise Wagner aus Neu-Ulm 2011 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Detlef Michel 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Günter Speit Tag der Promotion: 27.01.2012 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Das humane Zytomegalievirus . . . . . . . . . . 1.2 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren . . . . . . . . 1.2.1 Homologe GPCR des HCMV . . . . . . 1.2.2 pUL78, ein putatives GPCR von HCMV 1.2.3 Oligomerisierung von GPCRs . . . . . . 1.3 Zielsetzung dieser Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Material und Methoden 2.1 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3 Antibiotika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4 Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6 Radiochemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.8 Oligonukleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.9 Sonstige Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . 2.10 Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.11 Viren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.12 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.13 Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.13.1 Medien für Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.13.2 Medien für Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . 2.14 Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.14.1 Standardlösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.14.2 Lösungen für SDS-PAGE und Western-Blotting 2.14.3 Lösungen für DNA-/Plasmidpräparation . . . . 2.15 Molekularbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . 2.15.1 Molekularbiologische Standardmethoden . . . . 2.15.2 PCR (Polymerase-Kettenreaktion) . . . . . . . 2.15.3 Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.16 Proteinbiochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . 2.16.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese . . . . . . 2.16.2 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.16.3 Ko-Immunopräzipitation (Ko-IP) . . . . . . . . I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 3 4 6 6 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 9 10 11 11 13 13 14 15 17 18 19 19 20 20 21 22 22 23 25 26 26 26 28 28 28 29 29 Inhaltsverzeichnis 2.17 Mikrobiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.17.1 Transformation in E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.17.2 Herstellung einer Glycerinkultur . . . . . . . . . . . . . . . 2.17.3 „En passant“-Mutagenese [1] . . . . . . . . . . . . . . . . 2.18 Zellbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.18.1 Zellkultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.18.2 Transfektion eukaryotischer Zellen mittels MetafectenePro 2.18.3 Infektion eukaryotischer Zellen . . . . . . . . . . . . . . . 2.18.4 Extraktion von HCMV-DNA aus infizierten Zellen . . . . . 2.18.5 Titerbestimmung eines Virusstocks . . . . . . . . . . . . . 2.18.6 Wachstumskinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.18.7 Immunfluoreszenz-Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.18.8 Internalisierungsassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.18.9 Bimolecular Fluorescence Complementation Assay . . . . . 2.18.10 Messung von Inositolphosphaten in COS7-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Ergebnisse 3.1 Lokalisationsstudien des putativen 7-TM-Proteins pUL78 von HCMV . 3.1.1 Lokalisation von pUL78 in transfizierten Zellen . . . . . . . . . . 3.1.2 Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation von pUL78 in transfizierten Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3 Untersuchung der Oberflächenexpression von pUL78 in transfizierten Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.4 Internalisierungsassay von pUL78 in transfizierten Zellen . . . . 3.1.5 Analyse der Lokalisation von pUL78 in Virus-infizierten Zellen . 3.1.6 Internalisierungsassay von pUL78 in infizierten Zellen . . . . . . 3.2 Bimolecular Fluorescent Complementation Assay zur Analyse von Interaktionen zwischen HCMV Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Etablierung der Methode mit einer bekannten Interaktion (proof of principle) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2 Untersuchung der Homomerisierung von pUL78 . . . . . . . . . 3.2.3 Analyse der Interaktionsdomäne von pUL78 . . . . . . . . . . . 3.2.4 Untersuchungen zur Heteromerisierung von pUL78 und weiteren putativen GPCRs aus HCMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3 Ko-Immunopräzipitationen zur Bestätigung der Interaktionen des 7-TMProteins pUL78 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1 Homomerisierung von pUL78 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.2 Heteromerisierung von pUL78 und pUS28 . . . . . . . . . . . . II 30 30 30 30 32 32 33 33 34 34 34 35 36 36 38 39 39 39 41 44 45 52 53 55 55 57 59 63 65 65 66 Inhaltsverzeichnis 3.4 Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung des UL78-Proteins . . . . 3.4.1 Einfluss von pUL78 auf die Induktion von Inositoltriphosphat (IP3) durch pUS28 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.2 Einfluss des 7-TM-Proteins pUL78 auf die virale Replikation in Fibroblasten und Epithelzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 68 69 4 Diskussion 75 5 Zusammenfassung 86 Literatur 87 Danksagung 99 III Abkürzungsverzeichnis 7-TM AIDS AS BAC CAM CPE Da DAPI DMSO E EEA-1 EGFP FCS FITC GCV GFP GPCR HCMV HFF HHV IE Knr L LAMP-1 MCMV m.o.i. ORF PFA pfu p.i. pp RANTES UL US WT YFP 7-Transmembrandomäne acquired immunodeficiency syndrome Aminosäure bacterial artifical chromosome Chloramphenicol cytopathic effect (zytopathischer Effekt) Dalton 4,6-diamidino-2-phenylindole Dimethylsulfoxid early early endosome antigen 1 enhanced green fluorescent protein fetal calf serum (fötales Kälberserum) Fluoresceinisothiocyanat Ganciclovir grün fluoreszierendes Protein G-Protein gekoppelter Rezeptor humanes Zytomegalievirus human foreskin fibroblasts humanes Herpesvirus immediate early Kanamycin-Resistenz late Lysosomal-associated membrane protein 1 murines Zytomegalievirus multiplicity of infection open reading frame (offener Leseraster) Paraformaldehyd plaque forming unit (Plaque-erzeugende Einheit) post infection (nach Infektion) Phosphoprotein Regulated upon Activation, Normal T cell Expressed and Secreted unique long unique short Wildtyp yellow fluorescent protein IV 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Das humane Zytomegalievirus Allgemeines Das humane Zytomegalievirus (HCMV) zählt zur Familie der Herpesviridae, welche sowohl human-, als auch tierpathogene Vertreter umfasst. In Abhängigkeit von biologischen und molekulargenetischen Merkmalen, werden diese in drei Subfamilien unterteilt: α-, β- und γ-Herpesviren. Das humane Zytomegalievirus wird in der offiziellen Nomenklatur als humanes Herpesvirus 5 (HHV-5) bezeichnet und gehört zu den βHerpesviren. Kennzeichnend für diese Viren sind ein langer Vermehrungszyklus in vitro, persistierende Infektionen und ein enger Wirtsbereich [2]. In vivo kann das HCMV verschiedene Zelltypen wie Fibroblasten, Endothelzellen, Monozyten und Makrophagen infizieren [3]. Charakteristisch ist hierbei der ausgeprägte zytopathische Effekt (CPE), der zur Abrundung und Vergrößerung der infizierten Zellen führt. Das doppelsträngige, etwa 235 kb große DNA-Genom, befindet sich in einem ikosaedrischen Kapsid, das von einer Proteinschicht, dem Tegument, umhüllt ist. Das HCMV-Genom wird durch interne repetitive Sequenzen (IRS , IRL ) in Segmente unterteilt, die als UL (unique long) und US (unique short) bezeichnet werden [2]. Außen wird das Viruspartikel von einer Lipiddoppelschicht umschlossen. In dieser Membranhülle befinden sich virale Glykoproteine und zu G-Protein-gekoppelten Rezeptoren homologe Proteine (GPCR). Die Glykoproteine dienen der Anheftung und der Penetration, wodurch das Kapsid und die Tegumentproteine in die Zielzelle gelangen. Die Aufklärung der Rolle der viralen GPCRs für das HCMV, ist von großer Bedeutung. Vermutet wird, dass über die Hälfte der über 70 in infektiösen Partikeln gefundenen viralen Proteine, Komponenten des Teguments sind [4]. Zusätzlich zu der DNA und den Proteinen, befinden sich mRNAs im Virion, deren funktionelle Relevanz noch unbekannt ist [5]. In CMV-infizierten Zellen sind drei verschiedene Viruspartikel zu finden, die sich aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften unterscheiden: Infektiöse Virionen, NIEPs (noninfectious enveloped particles) und dense bodies. NIEPs ähneln bis auf das fehlende Genom sehr den Virionen. Wie die dense bodies, sind diese nicht infektiös. Dense bodies besitzen weder ein Genom noch ein Kapsid. Diese Partikel sind aus mehreren Tegumentproteinen, hauptsächlich pp65 (UL83), zusammengesetzt [2]. 1 1 Einleitung Epidemiologie und Klinik Das HCMV wird über Speichel, Blut, Urin, Muttermilch und Genitalflüssigkeiten übertragen [6, 7]. Die Seroprävalenz liegt zwischen 50 und 90 %, abhängig von dem Entwicklungsstand in den Ländern [8]. Aufgrund der guten Anpassung an den Wirt, verläuft eine postnatale Infektion bei immunkompetenten Menschen meist asymptomatisch. Nur bei etwa 5 % kommt es zu einem der Mononukleose ähnlichen Krankheitsbild [9]. Das Virus hat zusätzlich zum latenten Status die Fähigkeit zur sporadischen Reaktivierung. Vertikale Transmissionen des Virus auf den Embryo während einer Primärinfektion der Mutter, können zu schwerwiegenden neurologischen Erkrankungen führen, etwa zu einem bilateralen Hörverlust [10]. Bei 5 bis 10 % der HCMV-positiven Neugeborenen, hat die Infektion tödliche Folgen. Bei immunsupprimierten (Transplantations- oder Krebspatienten) und immundefizienten Individuen (AIDS-Patienten), kann die HCMV-Infektion zu lebensbedrohlichen Erkrankungen führen. Kürzlich konnte das Vorkommen von HCMV in humanen Glioblastoma-Zellen gezeigt werden [11]. Vermutlich fördert HCMV auch das Fortschreiten der Krankheit [11]. Therapie Zur Behandlung von HCMV finden momentan verschiedene antivirale Substanzen Anwendung: die Nukleosidanaloga Ganciclovir, Valganciclovir (L-Valinylester von Ganciclovir) und Cidofovir, das Pyrophosphatanalog Foscarnet und das Antisense-Präparat Formivirsen, welches in Europa allerdings vom Markt genommen wurde [12]. Mit Ausnahme von Formivirsen, haben diese antiviralen Substanzen das gleiche Zielmolekül, die virale DNA-Polymerase UL54. Der antivirale Effekt von Formivirsen basiert auf der antisense-vermittelten Inhibierung der IE2-Genexpression. Die Gabe dieser Medikamente ist aufgrund von Toxizität, mangelnder oraler Bioverfügbarkeit, der Entwicklung von Resistenzen und starker Nebenwirkungen, limitiert. Keines der Medikamente ist zur Behandlung kongenitaler Infektionen zugelassen [12]. Deshalb ist die Entwicklung neuer, verbesserter Pharmazeutika von großem Interesse. Hierfür ist es nötig, neue Zielproteine aufzuspüren. 2 1 Einleitung 1.2 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Abbildung 1: Schematische Darstellung eines typischen heptahelikalen G-Protein-gekoppelten Rezeptors. Der N-Terminus ist extrazellulär und der C-Terminus befindet sich intrazellulär. Die Membran wird von sieben Transmembrandomänen durchzogen, die durch drei extra- und drei intrazelluläre Loops verbunden sind ([13], modifiziert). G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), gehören zu den am intensivsten untersuchten Zielen für die Entwicklung neuer Medikamente in der Arzneimittelindustrie. Durch Mutationen hervorgerufene Funktionsstörungen, wie beispielsweise eine konstitutive Aktivität der Rezeptoren [118], können zu zahlreichen Krankheiten führen. 50-60 % der zurzeit verwendeten Medikamente beeinflussen direkt oder indirekt ein GPCR [14]. Zelluläre GPCRs sind die größte und vielseitigste Gruppe von Membranrezeptoren, die an der Signaltransduktion beteiligt sind [14]. Sie dienen der Verarbeitung von Licht-, Geruchs- und einer Vielzahl von Geschmacksreizen und dem Transport von Stoffen durch die Zellmembran (Endozytose und Exozytose) [15]. Die Signalweiterleitung in das Zellinnere erfolgt über heterotrimere GTP-bindende Proteine (G-Proteine). Diese ubiquitär exprimierten Proteine gehören zur Familie der GTPasen und bestehen aus drei Untereinheiten, Gα, Gβ und Gγ [16]. GPCRs bestehen aus sieben, die Zellmembran durchspannenden (transmembranären) Helixstrukturen, die alternierend durch drei intrazelluläre und drei extrazelluläre 3 1 Einleitung Schleifen miteinander verbunden sind. Aufgrund dieser Struktur werden die GPCRs auch als 7-Transmembrandomänen-Proteine (7-TM), oder Serpentinenrezeptoren bezeichnet [13]. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren besitzen eine extrazelluläre oder transmembranäre Bindungsdomäne für einen Liganden, beispielsweise einem Chemokin. Das G-Protein bindet an der intrazellulären Seite des Rezeptors. Durch Bindung des Liganden erfolgt die Aktivierung des GPCRs und führt zu einem Austausch des gebundenen GDP durch GTP an der α- Untereinheit des G-Proteins. Das heterotrimere G-Protein wird instabil und durch Konformationsänderung in die α- und βγ- Untereinheiten gespalten. Die dissoziierten Untereinheiten leiten die Signaltransduktion ein [17]. GPCRs werden in fünf Familien unterteilt: die Rhodopsin-Familie, die Familie der Sekretin-Rezeptoren, die Familie der metabotropen Glutamatrezeptoren, die Familie der Adhäsion-Rezeptoren und die Familie der Frizzled/Taste2-Rezeptoren [18]. Zur Rhodopsinfamilie, in der die meisten Vertreter zu finden sind, gehören die Chemokinrezeptoren [19]. Diese binden Chemokine, die zur Migration von Zellen führen. Unterschieden wird zwischen homöostatischen (konstitutiv gebildet) und inflammatorischen Chemokinen. Inflammatorische Chemokine werden bei einer Immunantwort induziert, um Immunzellen zum Ort der Infektion zu rekrutieren. Homöostatische Chemokine sind an der Kontrolle des Immunsystems beteiligt und spüren beispielsweise B- oder T-Zellen auf, die Antigene auf ihrer Oberfläche präsentieren. Die Bindung eines Chemokins an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor führt über die Erhöhung von intrazellulärem Ca2+ zu verschiedenen Zellantworten. 1.2.1 Homologe GPCR des HCMV Herpesviren haben während der Ko-Evolution mit ihrem Wirt verschiedene Strategien entwickelt, um zelluläre Abwehrmechanismen zu manipulieren. Ein Angriffspunkt bietet das Chemokinsystem des Wirts, das durch Regulation der Expression von Chemokinen und Chemokinrezeptoren beeinflusst wird. Herpesviridae und Poxviridae sind die beiden einzigen Virusfamilien, die für GPCRs kodieren, wobei die Familien der Herpesviridae β- und γ-Herpesviren, GPCRs besitzen [20]. HCMV kodiert für vier Proteine, pUS27, pUS28, pUL33 und pUL78, die Homologien zu zellulären GPCRs aufweisen [21, 22]. Diese vGPCRs sind in allen CMVs der Primaten konserviert. pUL33 und pUL78 besitzen zusätzlich Homologe in MCMV (mouse CMV), RCMV (rat CMV), GPCMV (guinea pig CMV) und in den humanen Herpesviren HHV-6 und HHV-7. pUS28 ist das bis jetzt am besten charakterisierte GPCR-Homolog von HCMV. pUS28 besitzt Homologien zu den CC-Chemokinrezeptoren [23] und bindet ein großes Spektrum an CC-Chemokinen, wie RANTES/CCL5, MCP-1/CCL2, MCP-3/CCL7 4 1 Einleitung und MIP-1β/CCL4. Zusätzlich bindet pUS28 mit hoher Affinität auch das CX3 CChemokin Fraktalkine/CX3 CL1 [24, 25]. Diese Promiskuität von pUS28 ist eine Besonderheit unter den Chemokinrezeptoren. Die Bindung von Chemokinen an pUS28 führt zu verschiedenen zellulären Signalwegen [24, 26] und es wird angenommen, dass pUS28 zur Manipulation des Immunsystems immunmodulatorische Chemokine bindet, um sie der infizierten Zelle zu entziehen [27, 28]. Ein weiterer Hinweis auf die Sequestration der Chemokine aus der zellulären Umgebung ist, dass pUS28, unüblich für zelluläre Chemokinrezeptoren, überwiegend in Endosomen lokalisiert ist und nur in geringem Maße an der Zelloberfläche vorliegt [27, 29]. pUS28 weist in Abwesenheit von Liganden eine konstitutive Aktivität in verschiedenen Zelllinien auf [28]. Die konstitutive Signalweiterleitung führt zur Induktion der Phospholipase C, wodurch Inositoltriphosphat generiert und der Transkriptionsfaktor NF-κB (nuclear factor kappa B ) aktiviert wird [28, 30]. pUS28 ist ebenfalls an der Induktion der Chemotaxis von SMC (smooth muscle cells) [31] und Makrophagen beteiligt [32]. Die Proteine pUS27 und pUS28 zeigen eine hohe Similarität ihrer Sequenzen und liegen im viralen Genom nebeneinander. Aufgrund der Ähnlichkeit von pUS27 mit pUS28, wird angenommen, dass pUS27 ebenfalls als Chemokinrezeptor fungiert [29] und möglicherweise auch an der Sequestration von Chemokinen beteiligt ist. Dies konnte bis jetzt jedoch nicht bestätigt werden. Die Expression von pUS27 führt zu keinem Anstieg von Inositoltriphosphat und zu keiner Aktivierung von NF-κB [33]. pUS27 wird nach der Lokalisation an der Zelloberfläche rasch endozytiert und befindet sich dann in zellulären Kompartimenten, in denen Marker für späte Endosomen und Lysosomen vorkommen [29]. pUS27 ist ein late-Protein und befindet sich in der Membran der Virionen [29, 34, 35]. pUL33 ist wie pUS28 in endozytotischen Vesikeln lokalisiert [29]und zeigt eine Liganden-unabhängige konstitutive Aktivität, die zu einer Anhäufung von Inositolphosphat über Gαq- und Gαi/o-Proteine führt [33, 36]. Aktivierende Liganden sind für pUL33 bisher nicht bekannt. Für das Wachstum in vitro von HCMV in Fibroblasten ist pUL33 nicht essentiell [37], wohingegen R33 von RCMV wichtig für die virale Pathogenese ist. M33 induziert eine smooth muscle cell (SMC) Migration [38], ähnlich der durch pUS28 ausgelösten Chemotaxis von SMCs [31]. Über die biochemischen Eigenschaften und die Signalweiterleitung von pUL78, ist im Gegensatz zu den anderen vGPCRs von HCMV, kaum etwas bekannt. 5 1 Einleitung 1.2.2 pUL78, ein putatives GPCR von HCMV Aufgrund struktureller Eigenschaften, wie sieben putative hydrophobe Regionen, zwei Cysteine, die für die richtige Faltung von GPCRs erforderlich sein können und eine Region die Similarität zu einer Domäne zeigen, die für die Bindung von G-Proteinen wichtig ist, wird angenommen, dass es sich bei pUL78 um ein 7-TM-Rezeptor handelt [39]. Bisher konnten jedoch noch keine aktivierenden Liganden für pUL78 gefunden werden. pUL78 ist demnach wie pUS27 und pUL33 ein orphan-Rezeptor. Auch eine konstitutive Aktivität von pUL78 konnte noch nicht nachgewiesen werden. Wie bereits in Abschnitt 1.2.1 erwähnt, besitzt die UL78-Familie Mitglieder in verschiedenen β-Herpesviren: HCMV UL78, MCMV M78, RCMV R78 und U51 bei HHV-6 und HHV-7 (ORF U51). U51 von HHV-6 bindet beispielsweise das Chemokin RANTES/CCL5 mit nanomolarer Affinität und ist für die Herunter-Regulierung der Transkription dieses Chemokins verantwortlich [40]. pM78 und pR78 sind im Gegensatz zu pUL78 für eine effiziente Zell-zu-Zell-Ausbreitung des Virus in Gewebekulturen essentiell [41, 42]. Deletionsmutanten zeigten eine signifikante Abschwächung der Replikation in vivo [43, 44]. Anhand UL78-defizienter Mutanten konnte gezeigt werden, dass das Fehlen von pUL78 keinen Einfluss auf die Replikation von HCMV in Fibroblasten hat, obwohl pUL78 in klinischen HCMV Isolaten recht konserviert ist [42]. 1.2.3 Oligomerisierung von GPCRs Ursprüngliche Modelle der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren basieren auf der Annahme, dass GPCRs als Monomere fungieren. In den letzten Jahren wurde diese Hypothese durch verschiedene Studien widerlegt. Demnach können GPCRs als Homo- und Heterodimere und höher komplexe Oligomere (Homo- und Hetereomere) auftreten, wobei die Oligomerisierung die Funktion der Rezeptoren beeinflusst [45, 46, 47, 48, 49]. Die Heteromerisierung bei GPCRs kann entscheidend für die Reifung, die Signalweiterleitung und den Transport der GPCRs sein [50, 51, 52, 53, 49]. Kürzlich wurde die Dimerisierung des pUL78-Homologs pM78 des murinen Zytomegalievirus nachgewiesen [41]. Oligomerisierung und deren Funktion, konnte ebenfalls bei dem GABAb -Rezeptor gezeigt werden [54, 55, 56]. Der funktionelle GABAb -Rezeptor ist ein Heterodimer aus dem GABAb -R1-Rezeptor und dem GABAb -R2-Rezeptor. Die Ko-Expression beider Untereinheiten ist die Voraussetzung für die Funktionalität des Rezeptors. In Abwesenheit der R2-Untereinheit bleibt die R1-Untereinheit im endoplasmatischen Retikulum (ER). Die Interaktion findet kurz nach der Biosynthese der beiden Untereinheiten 6 1 Einleitung statt und zeigt, dass Dimerisierungen eine Rolle bei der GPCR-Reifung spielen kann [52, 57, 58]. Nur die R1-Untereinheit ist für die Ligandenbindung zuständig, weshalb die R2-Untereinheit als orphan 7-TM-Protein des Heterodimers betrachtet werden kann. Ein weiteres Beispiel einer solchen Interaktion ist die Heterodimerisierung der humanen Rezeptoren GPR50 und des Melatonin-Rezeptors MT1 . GPR50 ist ein oprhan Rezeptor und verhindert die Bindung von Melatonin und G-Proteinen an den Rezeptor MT1 [59]. Anhand dieser Beispiele wird deutlich, dass orphan-Rezeptoren durch Heteromerisierung einen Einfluss auf die Aktivität von GPCRs haben können, die Liganden binden. Die fünf Phasen des Lebenszyklus eines GPCRs, die durch Oligomerisierung beeinflusst werden können, sind in der Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 2: Mögliche Funktion von GPCR-Dimerisierung während des GPCR Lebenszyklus. (1) GPCR-Reifung, (2) Liganden-abhängige Regulation, (3) Einfluss auf die LigandenBindung, (4) Einfluss auf die Signalweiterleitung, (5) Internalisierung eines GPCR durch Heterodimerisierung ([52] modifiziert). Die Analyse von GPCR Oligomerisierungen könnte zur Aufklärung der Funktion des Rezeptors beitragen und zusätzlich einen Ansatz für die Entwicklung neuer Medikamente darstellen. 7 1 Einleitung 1.3 Zielsetzung dieser Arbeit Zytomegalieviren haben verschiedene Strategien entwickelt, um dem Abwehrmechanismen ihrer Wirte zu entgehen. Immunmodulierende Proteine, die eine Rolle bei dem Umgehen des Immunsystems spielen, ähneln zellulären Proteinen [60]. Die viralen Gene, die für diese Proteine kodieren, haben sich die Zytomegalieviren während einer Ko-Evolution zwischen Pathogen und Wirt angeeignet. Darunter befinden sich auch Gene, die für GPCRs kodieren. Das humane Zytomegalievirus kodiert vier putative GPCRs. Die Funktion dieser Proteine für das Virus ist ein bedeutendes Forschungsziel. 50-60 % der derzeitigen therapeutischen Agentien modifizieren direkt oder indirekt die Aktivität eines G-Proteingekoppelten Rezeptors [14]. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion des homologen GPCRs pUL78 zu analysieren, um einen neuen Ansatz zur Entwicklung antiviraler Substanzen gegen HCMV zu finden. Da bisher kaum etwas über diesen orphan-Rezeptor bekannt ist, sollte pUL78 hinsichtlich seiner Expression, Lokalisation und Funktion untersucht werden. Einige GPCRs liegen als Oligomere vor. Aus diesem Grund sollte mithilfe des BiFC untersucht werden, ob pUL78 die Fähigkeit zur Heteromerisierung besitzt. Zusätzlich war von Interesse, ob pUL78 mit anderen homologen GPCRs aus HCMV interagiert und somit Heteromere bilden kann. Da pUL78 nicht essentiell für die Replikation in Fibroblasten ist, sollte überprüft werden, ob dies auch für andere Zellarten gilt. 8 2 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Geräte 310er Perkin Elmer Sequencer Applied Biosystems ASI, Schwerzenbach, Schweiz Bakterienschüttler Certomat IS B. Braun Biotech International, Melsungen Electropheresis Power Supply Consort E835 Sigma, München Elektrophoreseapparaturen Biometra, Göttingen Elektroporationsgerät EasyjecT Optima Equibio, Kent, UK Eppendorf Mixer 5432 Eppendorf, Hamburg Eppendorf Thermomixer compact Eppendorf, Hamburg Fluoreszenzmikroskop Axiovert 200 Zeiss, Jena Fluoreszenzmikroskop Observer.Z1 Zeiss, Jena Gel Doc 2000 Bio-Rad, München Gene Pulser Bio-Rad, München Hybridization Incubator Model 2000 Micro Robbins Scientific Corp., Sunnyvale, CA, USA Mikroskop Axiovert 25 Zeiss, Jena Panther Semidry Electroblotter HEP-1 OWL, Portsmouth, NH, USA pH-Meter pH526 WTW GmbH, Weilheim Photometer: Gene Quant Pharmacia, Uppsala, Schweden Pipetten: Eppendorf Pipetus Eppendorf, Hamburg ® Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt SDS-PAGE-Kammer Biometra, Hanau Sealmaster 421 Audion Elektro, Kleve Sonifier Power Supply B-12 Branson Sonic Power Company, Danbury, CT, USA 9 2 Material und Methoden gjhjg Sterilbank Lamin Air HBB 2472S Heraeus, Hanau Thermocycler T3 Biometra, Göttingen Tischzentrifugen: Heraeus Biofuge 13 Heraeus, Hanau Heraeus Biofuge fresco Heraeus, Hanau Heraeus Biofuge pico Heraeus, Hanau Zentrifugen: Avanti IM J-25 Beckmann Coulter GmbH, Krefeld Megafuge 1.0 R Heraeus, Hanau Minifuge RI Heraeus, Hanau L7-65 Ultrazentrifuge Beckmann Coulter GmbH, Krefeld Varifuge 3.0 R Heraeus, Hanau 2.2 Chemikalien Acrylamid-bisacrylamid-Lösung Roth, Heidelberg AEC-Tabletten Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Agarose Roth, Heidelberg Ammoniumpersulfat BioRad, Hercules, CA, USA Aqua demin. / Aqua bidest. Universität Ulm Bacto-Agar Difco, Detroit, MI, USA Bacto-Trypton Difco, Detroit, MI, USA BSA (bovines Serumalbumin) Sigma, St. Louis, MO, USA DAPI Invitrogen GmbH, Karlsruhe DMEM Gibco BRL, Eggenstein DTT Sigma, Steinheim Dynasore Ascent Scientific Ltd, Bristol, UK EDTA-Lösung Biochrom KG, Berlin Ethanol Merck KGaA, Darmstadt Ethidiumbromid Serva, Heidelberg FCS (fötales Kälberserum) Gibco BRL, Eggenstein L-Glutamin PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich 10 2 Material und Methoden Glycerol Calbiochem (Merck), Darmstadt Isopropanol Merck KGaA, Darmstadt Magermilchpulver Saliter, Obergünzburg MEM Gibco BRL, Eggenstein Methanol Sigma, Steinheim Na2 HPO4 Merck KGaA, Darmstadt NaCl Merck KGaA, Darmstadt NaH2 PO4 Merck KGaA, Darmstadt Nukleotidtriphosphat Fermentas GmbH, St.Leon-Rot Opti-MEM Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA Phenol Roth, Karlsruhe SDS Serva, Heidelberg Tris USB, Cleveland, OH, USA Triton X-100® Serva, Heidelberg Tween 20 Sigma, Deisenhofen Yeast-extract Difco, Detroit, MI, USA 2.3 Antibiotika Ampicillin Serva, Heidelberg Penicillin / Streptomycin PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich 2.4 Antikörper Primärantikörper: • anti-HA (Y-11), polyklonal, rabbit IgG, sc-805, Lot I3008, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; (Immunfärbung 1:100) • anti-HA (F-7), monoklonal, mouse, sc-7392, Lot G1808, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; ( Immunfärbung 1:100) • anti-flag rabbit, F7425, Sigma-Aldrich, MO, USA; (Immunfärbung 1:500, Western Blot 1:1000) 11 2 Material und Methoden • anti-flag M2, monoklonal, mouse, affinity purified, F1804, Sigma-Aldrich, MO, USA; (Immunfärbung 1:600, Western Blot 1:1000) • anti-c-myc rabbit, pAb, A00172, GenScript, NJ, USA; (Immunfärbung 1:100, Western Blot 1:2000) • anti-c-myc, monoklonal, mouse (9E10), sc-40, Lot H3109 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; (Immunfärbung 1:200, Western Blot 1:5000) • anti-γAdaptin (AP-1), monoklonal, mouse, A4200, Lot 037K4878 Sigma-Aldrich, MO, USA; (Immunfärbung 1:1000) • anti-EEA1, mouse, purified, Cat. 610457, Lot 70226, BD Transduction LaboratoriesT M , BD Biosciences, NJ, USA; (Immunfärbung 1:100) • anti-LAMP-1, mouse, purified, Cat. 555798, Lot 78023, BD PharmingenT M , BD Biosciences, NJ, USA; (Immunfärbung 1:100) • anti-Calreticulin, rabbit IgG, C4606, Lot 121K4826 Sigma-Aldrich, MO, USA; (Immunfärbung 1:100) Sekundärantikörper: • HRP-konjugierter anti-rabbit Antikörper, Schwein DAKO Cytomation A/S, Kopenhagen, Dänemark; (Western Blot 1:3000) • HRP-konjugierter anti-mouse Antikörper, Kaninchen DAKO Cytomation, Glostrup, Dänemark; (Western Blot 1:5000) • anti-rabbit Alexa Fluor® 555 f(ab’)2 , Ziege Invitrogen GmbH, Karlsruhe; (Immunfärbung 1:1000) • anti-rabbit Alexa Fluor® 488 f(ab’)2 , Ziege Invitrogen GmbH, Karlsruhe; (Immunfärbung 1:1000) 12 2 Material und Methoden • anti-rabbit Alexa Fluor® 647 f(ab’)2 , Ziege Invitrogen GmbH, Karlsruhe; (Immunfärbung 1:1000) • anti-mouse Alexa Fluor 555 f(ab’)2 , Ziege Invitrogen GmbH, Karlsruhe; (Immunfärbung 1:1000) • anti-mouse Alexa Fluor® 488 f(ab’)2 , Ziege Invitrogen GmbH, Karlsruhe; (Immunfärbung 1:1000) 2.5 Enzyme PhusionTM Hot Start High Fidelity Finnzymes OY, Espoo, Finnland Proteinkinase K Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Restriktionsenzyme diverse Fermentas GmbH, St. Leon-Rot RNase A Fermentas GmbH, St. Leon-Rot T4 DNA Ligase Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Taq-Polymerase BioLabs, Ipswich, MA, USA Trypsin PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich 2.6 Radiochemikalien myo-[2-3 H]inositol wurde aus der Zentralen Einrichtung für Isotopenanwendung der Universität Ulm bezogen. 13 2 Material und Methoden 2.7 Plasmide Plasmidname Referenz pcDNA3.1 (+) Invitrogen GFP mychisha Labor Prof. Michel 2006 myc-UL78 A. Schreiber 2009 (Labor Prof. Michel) MCFD2-YFP1 Hans-Peter Hauri (Universität Basel) MCFD2-YFP2 Hans-Peter Hauri (Universität Basel) UL78-YFP1 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) UL78-YFP2 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) US27-YFP1 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) US27-YFP2 S. Wagner (UniversitätsklinikumUlm) US28-YFP1 S. Wagner (UniversitätsklinikumUlm) US28-YFP2 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) UL33-YFP1 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) UL33-YFP2 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) flag-US28 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) flag-UL78 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) HA-US28 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) UL78-del232-242-YFP1 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) UL78-del232-242-YFP2 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) UL78-del299-310-YFP1 S. Wagner (UniversitätsklinikumUlm) UL78-del299-310-YFP2 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) UL78-delTD-YFP1 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) UL78-delTD-YFP1 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) YFP1 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) YFP2 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) UL35-YFP1 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) UL82-YFP2 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) myc-CCR5 S. Wagner (Universitätsklinikum Ulm) UL78-CxxxC-YFP1 F. Arnold 2010 (Labor Prof. Michel, Universität Ulm) UL78-CxxxC-YFP2 F. Arnold 2010 (Labor Prof. Michel, Universität Ulm) UL78-C187S-YFP1 F. Arnold 2010 (Labor Prof. Michel, Universität Ulm) UL78-C187S-YFP2 F. Arnold 2010 (Labor Prof. Michel, Universität Ulm) 14 2 Material und Methoden HA-UL33 S. Wagner ( Ulm) IRES-GFP-CCR5 Labor Prof. Münch (Universität Ulm) UL71-YFP2 Labor Dr. von Einem (Universitätsklinikum Ulm) Plc-B-Rac Labor Dr. Walliser (Universität Ulm) pEP-kan-S Tischer et al. ([1]) Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Klonierungen erfolgte ausschließlich im pcDNA3.1+ Vektor. 2.8 Oligonukleotide In dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide: Name Sequenz UL82-Hind III+ 5’-ggcaaagcttatgtctcaggcatcgtcctc-3’ UL82-ClaI- 5’-ggcaatcgatgatgcggggtcgactgcgtg-3’ UL35-Hind III+ 5’-ggcaaagcttatggcccaaggatcgcgagc-3’ UL35-ClaI- 5’-ggcaatcgatgagattccgtaggttttcg-3’ UL78-Hind III+ 5’-ggcaaagcttatgtccccttctgtggagga-3’ UL78-ClaI- 5’-ggcaatcgattaatgccgtcaccgttgcgt-3’ US28-Hind III+ 5’-ggcaaagcttatgacgccgacgacgacgac-3’ US28-ClaI- 5’-ggcaatcgatcggtataatttgtgagacg-3’ UL33-Hind III+ 5’-ggcaaagcttatgacagggccgctattcgc-3’ UL33-ClaI- 5’-ggcaatcgattaccccgctgaggttatgat-3’ US27-Hind III+ 5’-ggcaaagcttatgaccacctctacaaacca-3’ US27-ClaI- 5’-ggcaatcgatcaatagaaattcctcctcc-3’ US28-flag-Hind III+ 5’-ggacaagcttatggactacaaggacgacgatga caagacgccgacgacgacgaccac-3’ US28-EcoRI- 5’-ggcagaattcttacggtataatttgtgaga-3’ myc-UL78Hind III + 5’-ggcaaagcttatggagcaaaagctcatttctg aagaggacttgtccccttctgtggaggagac-3’ myc-CCR5 p 5’-ggcaaagcttatggagcaaaagctcatttctga agaggacttgatggattatcaagtgtcaag-3’ myc-CCR5 m 5’-ggcaggatcctcacaagcccacagatattt-3’ flag-UL78Hind III+ 5’-ggcaaagcttatggactacaaggacgacgatg acaagtccccttctgtggaggagac-3’ UL78BamHI- 5’-ggcaggatcctcataatgccgtcaccgtcaccgttg-3’ UL78-del232-242+ 5’-cgtctggtcctgtctcatgctgtttgtgcc-3’ UL78-del232-242- 5’-gcatgagacaggaccagacgtggtcgcgcc-3’ 15 2 Material und Methoden UL78-299-310+ 5’-tatcattgcgtcctttgattatctggtcga-3’ UL78-299-310- 5’-aatcaaaggacgcaatgataaagagcggca-3’ UL78-delTD+ 5’-ctcggatctatcccgcgagcccaccaagga-3’ UL78-delTD- 5’-gctcgcgggatagatccgaggcggcgcgat-3’ BGH_seq 5’-ctagaaggcacagtcgaggctg-3’ HCMVep 5’-gcaaatgggcggtaggcgtg-3’ YFP1+ 5’-ggcaaagcttatgggtggcggtggctctggagg-3’ YFP1- 5’-ggcagaattcttactgcttgtcggccatga-3’ YFP2+ 5’-ggcaaagcttatgggtggcggtggctctggagg-3’ YFP2- 5’-ggcagaattcttacttgtacagctcgtcca-3’ US27-HA-Hind III+ 5’-ggcaaagcttatgtatccatatgatgttccacatta tgctaccacctctacaaaccaaac-3’ US27-BamHI- 5’-ggcatggatcctacaatagaaattcctcct-3’ ep_UL78_aa47stop for 5’-tcggccgatcgcgccgcctcggatctactcatcggcatg taaggctccgttagcctggtcaggatgacgacgataagtaggg-3’ ep_UL78_aa47stop rev 5’-aaccgatgatagtcagcaggttgaccaggctaacggagc cttacatgccgatgagtagatcaaccaattctgattag-3’ ep_UL78-CxxxC-F 5’-atgcgtcttggcattctgccgctctttatcattgcgttcttctccc gcgagcccaccaag-3’ ep_UL78-CxxxC-R 5’-ggacgtagaaaagtaacacacggccagctccacgctatacata gcccgcttcaacgcctgcaccaaccgacgtacgaaatgaccgtggc tgctttgctgagatctctcgacccaaccaattaaccaattctgattag-3’ UL78p112753 5’-cgtccctctttaacgtcaacg-3’ UL78intern500M 5’-atagggatctgacagcctagc-3’ UL78_delta_test 5’-gggtatattcgttcggcgag-3’ 16 2 Material und Methoden 2.9 Sonstige Verbrauchsmaterialien AGFA Cronex 5 Röntgenfilme ® Big Dye Cycle Sequencing Kit Agfa, Mortsel, Belgien Applied Biosystems ASI, Schwerzenbach, Schweiz TM ChemiLucent Western Blotting Detection System Chemicon® International, Hofheim DNA Molecular Weight Marker X Roche Applied Science, Penzberg Dowex® 1 × 8–200 ion exchange resin Sigma, Deisenhofen Eppendorf Tubes Eppendorf, Hamburg Falcon TM Tubes BD Bioscience, San Jose, CA, USA GFXTM PCR-DNA and Gel Band Purification Kit GE Healthcare, Little Chalfont, UK GeneRuler DNA Ladder mix Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Immun-BlotTM PVDF-Membran Bio-Rad, Hercules, CA, USA Metafectene® Pro Biontex Laboratories GmbH, Planegg/Martinsried mini Quick Spin DNA Columns Roche Diagnostics GmbH, Mannheim NucleoBond® Xtra Midi Endotixin-free Plasmid DNA Purification + Macherey-Nagel, Düren Nylon-Membran geladen Roche, Mannheim Protease Inhibitor complete Roche, Basel, Schweiz Protein Standard Precision Plus all blue Biorad, Hercules, CA, USA Redi-prime II Kit Amersham Pharmacia Szintillationsflüssigkeit Ultima Gold™, PerkinElmer Life Sciences, Rodgau-Jügesheim Whatman Filterpapier 3MM Whatman, Maidstone, UK Zellkultur Plastikflaschen und Schalen Greiner Bio-One, Frickenhausen 17 2 Material und Methoden 2.10 Bakterien DH10B: F− araD139 _(ara,leu)7697 _lacX74 galU galK rpsL deoR _80 dlacZ_M15 endA1 nupG recA1 mcrA_(mrr hsdRMS mcrBC) (Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland) DH5α: fhuA2 (argF-lacZ)U169 phoA glnV44 80 (lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland) GS1783: auf DY380 E.coli basierend, trägt zusätzlich die Sequenz der Homingendonuklease I-SceI (Arabinose induzierbar), im Genom; (von Greg A. Smith Northwestern University Chicago, USA bereitgestellt) DY380: auf DH10B basierend; F-mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlycZ M15 ∆lacX74 deoR racA1 endA1 araD139 ∆(ara, leu) 7649 galU galK rspL nupG [λcl587 (cro-bio < > tet] (Lee EC 2001) F D D 18 2 Material und Methoden 2.11 Viren TB40E-BAC4: Sinzger, 2008 [61] enthält das Genom des endothelzell-adaptierten TB40E HCMV Stammes flag-UL78-TB40E-BAC4: A. Schreiber (Labor Prof. Michel) enthält ein flag-tag am N-Terminus von pUL78; generiert mittels markerloser BAC-Mutagenese ausgehend von TB40E-BAC4 TB40E-BAC4-∆US28: A. Schreiber (Dissertation 2009, [62]) Deletion des kompletten ORF US28; generiert mittels markerloser BAC-Mutagenese ausgehend von TB40E-BAC4 TB40E-BAC4-UL78aa47stop: UL78-defiziente Virusvariante; AS-Position 47: Austausch von Phenylalanin gegen Stop-Codon; generiert mittels markerloser BAC-Mutagenese ausgehend von TB40E-BAC4 2.12 Zellen COS7: Nierenfibroblasten der Grünen Meerkatze HFF: Humane Vorhautfibroblasten 293T Hek: humane embryonale Nierenzellen (SV40 large T-antigen) HeLa: humane Epithelzellen RPE-1 retinale Pigmentzellen 19 2 Material und Methoden 2.13 Medien 2.13.1 Medien für Zellen COS7: MEM (Gibco BRL, Eggstein) FCS Penicillin/Streptomycin L-Glutamin 500 10 1 1 ml % (v/v) % (v/v) % (v/v) HFF: MEM (Gibco BRL, Eggstein) FCS Penicillin/Streptomycin L-Glutamin Nicht essentielle AS 500 10 1 1 1 ml % (v/v) % (v/v) % (v/v) % (v/v) 293T Hek: DMEM (Gibco BRL, Eggstein) FCS Penicillin/Streptomycin L-Glutamin 500 10 1 1 ml % (v/v) % (v/v) % (v/v) HeLa: MEM (Gibco BRL, Eggstein) FCS Penicillin/Streptomycin L-Glutamin 500 10 1 1 ml % (v/v) % (v/v) % (v/v) REP-1: DMEM (Gibco BRL, Eggstein) HAM’s F12 (Lonza GmbH, Köln) FCS L-Glutamin NaHCO3 Penicillin/Streptomycin 250 250 10 1 3,48 1 ml ml % (v/v) % (v/v) % (v/v) % (v/v) 20 2 Material und Methoden 2.13.2 Medien für Bakterien LB-Medium: Trypton Hefeextrakt NaCl ad 1 l Aqua bidest 10 5 10 g g g Typ-Medium: Trypton Hefeextrakt NaCl K2 HPO4 ad 1 l Aqua bidest 16 16 5 2,5 g g g g Glycerinkulturmedium: 100 %-iges Glycerin 1 M MgSO4 x 7 H2 O 100 mM Tris HCl 6,5 1 2,5 ml ml ml 21 2 Material und Methoden 2.14 Lösungen 2.14.1 Standardlösungen 2x Lysispuffer: 40 mM Tris pH 8,0-8,5 200 mM EDTA 1x PBS: NaCl KCl Na2 HPO4 - 7 H2 O KH2 PO4 8 0,2 2,68 0,24 g g g g 0,01 M PBS: NaCl KH2 PO4 ad 2 l Aqua bidest pH 7,8 17 2,72 g g 0,01 M PBS/EDTA: 0,01 M PBS 1 % EDTA Stammlösung 10 % (w/v) SDS: SDS →68 °C mit HCl konz. auf pH 7,2 eingestellt ad 1 l Aqua bidest 100 g 22 2 Material und Methoden 2.14.2 Lösungen für SDS-PAGE und Western-Blotting Trenngel für SDS-PAGE: Lösungen Trenngel 10 % Aqua bidest 10 ml 30 % Acrylamid/ 0,8 % Bisacrylamid 8,4 ml 1,5 M Tris/HCl pH 8,8 Sammelgel für SDS-PAGE: 6,25 ml 10 % SDS 250 µl 10 % APS 125 µl TEMED 20µl Lösungen Sammelgel 4 % Aqua bidest 12,2 ml 30 % Acrylamid/ 0,8 % Bisacrylamid 2,6 ml 1,5 M Tris/HCl pH 6,8 5 ml 10 % SDS 200 µl 10 % APS 100 µl TEMED 20µl 10 % APS-Lösung: APS ad 10 ml Aqua bidest 1 g 10x Lämmli-Puffer: Tris Glycin SDS ad 1 l Aqua bidest 30 144 10 g g g 2x SDS-Ladepuffer: 0,5 M Tris/HCl pH 6,8 1 M DTT 10 % SDS Glycerin (100 %) 2 % Bromphenolblau 200 400 400 200 100 µl µl µl µl µl 23 2 Material und Methoden 4x SDS-Ladepuffer: 0,5 M Tris/HCl pH 6,8 2-Mercaptoethanol 10 % SDS Glycerin 2 % Bromphenolblau 2 800 3,2 1,6 ml µl ml ml Blotpuffer: 48 mM Tris 39 mM Glycin 1,3 mM SDS 20 % Methanol ad 1 l Aqua bidest pH 9,2 5,8 2,9 0,37 g g g Tris/HCl pH 7,5: 50 mM Tris/HCl ad 1 l Aqua bidest 6,06 g Blocklösung: 5 % Magermilchpulver 0,3 % Tween ad 200 ml 1x PBS 10 600 g µl RIPA-Lysispuffer: 1 M Tris/HCl pH 7,5 5 M NaCl NP-40 Natriumdeoxycholat SDS ad 100 ml Aqua bidest 5 3 1 0,5 0,1 ml ml ml g g 24 2 Material und Methoden 2.14.3 Lösungen für DNA-/Plasmidpräparation Lösung I: 50 mM Glucose 25 mM Tris 10 mM EDTA ad 200 ml Aqua bidest Lösung II: 10 % SDS 2 N NaOH ad 10 ml Aqua bidest Lösung III: 3 M KaAc 1,8M HCOOH ad 100 ml Aqua bidest 1,89 0,61 0,74 g g g 1 1 ml ml 24,9 7,7 g ml 25 2 Material und Methoden 2.15 Molekularbiologische Methoden 2.15.1 Molekularbiologische Standardmethoden Die Durchführung folgender molekularbiologischer Standardmethoden, erfolgte nach Sambrook et al. (1989). Deshalb werden diese Methoden nicht näher beschrieben. • Alkoholpräzipitation • Klonierung • Photometrische Bestimmung von DNA-Konzentrationen • Restriktionsspaltungen • Agarose-Gelelektrophorese • Ligationen 2.15.2 PCR (Polymerase-Kettenreaktion) Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht eine in vitro Amplifikation von DNASequenzen. Die in dieser Arbeit durchgeführten PCR-Reaktionen, erfolgten in Biometra T3 Thermocyclern. Als Standard-Polymerase zu analytischen Zwecken, diente die Taq-Polymerase. Für Amplifizierungen von DNA-Sequenzen für Klonierungen, wurde die Phusion Hot Start Polymerase aufgrund ihrer „proofreading” Fähigkeit bevorzugt. 26 2 Material und Methoden Standard-Reaktionsmix (Taq-Polymerase) Template DNA 50-500 5’ Primer [10 pmol] 1,5 3’ Primer [10 pmol] 1,5 dNTPs [2 mM] 5 10x PCR-Puffer 5 Taq-Polymerase 0,5 H2 O ad 50 ng µl µl µl µl µl µl PCR-Reaktionsmix (Phusion Hot Start Polymerase) Template DNA 50-500 5’ Primer [10 pmol] 1,5 3’ Primer [10 pmol] 1,5 dNTPs [2 mM] 5 10x PCR-Puffer 5 Taq-Polymerase 0,5 H2 O ad 50 ng µl µl µl µl µl µl Standard PCR Programm bei Verwendung der Taq-Polymerase Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation End-Elongation Kühlung 5 30 30 1,5 5 ∞ min 94 s 94 s 55 min 72 min 72 4 °C °C °C °C °C °C 30 Zyklen Standard PCR-Programm bei Verwendung der Phusion Hot Start Polymerase Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation End-Elongation Kühlung 30 s 98 °C 5 s 98 °C 15 s 60-72 °C 15 s/1 kb 72 °C 5 min 72 °C ∞ 4 °C 34 Zyklen In Abhängigkeit der Schmelztemperaturen der verwendeten Primer, wurde die Annealingtemperatur variiert. Die Elongationszeit wurde an die Länge des amplifizierten PCR-Produktes angepasst. 27 2 Material und Methoden 2.15.3 Sequenzierung Zur Überprüfung verwendeter DNA-Sequenzen wurde nach dem Sanger-Verfahren sequenziert. Die Sequenzierungen erfolgten mit einem Kapillarsequenziergerät im Institut für Virologie. Sequenzen mit einer Länge von etwa 500 Nukelotiden konnten hiermit analysiert werden. Zur Amplifizierung und Markierung der DNA-Fragmente, wurde folgender PCR-Ansatz verwendet: Template DNA Big Dye Sequenziermix (Perkin Elmer) 5x Puffer Primer [10 pmol] H2 O ad 750 4 ng µl 4 2 20 µl µl µl Mittels folgenden PCR-Programms wurde die Template-DNA amplifiziert. Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Kühlung 30 10 10 4 ∞ s 96 °C s 96 °C s 50 °C min 60 °C 4 °C 25 Zyklen 2.16 Proteinbiochemische Methoden 2.16.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese Zur Auftrennung von Proteinen nach ihrer Größe, mittels der Gelelektrophorese, müssen diese zunächst denaturiert werden. Das anionische Detergens SDS (sodium dodecyl sulfat) zerstört die dreidimensionale Struktur der Proteine und verleiht ihnen zusätzlich eine einheitliche negative Ladung. Die Anzahl der an die Proteine gebundenen negativen Ladungen ist proportional zur Proteingröße. Proteingemische wurden mittels vertikaler SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteinproben wurden hierfür zunächst mit 4x SDS Ladepuffer, RIPA-Puffer und Proteaseinhibitor versetzt. Die Proben wurden 3-mal für durchschnittlich 30 Sekunden sonifiziert und anschließend für 5 min bei 95 °C denaturiert. Zwischen den einzelnen Sonifizierungsschritten wurden die Proteinproben bei -20 °C eingefroren. Bei der Auftrennung von GPCRs ist zu beachten, dass diese nicht bei 95 °C denaturiert werden, damit die Struktur der GPCRs erhalten bleibt und die Auftrennung nicht negativ beeinflusst wird. Die Zugabe von 0,2 %-igem UREA, trägt zur erfolgreichen Seperation der 7-TM-Proteine bei. 28 2 Material und Methoden Die Auftrennung erfolgte in 10 %-igen SDS-PAGE-Gelen. Zur Bestimmung der Größen der aufgetrennten Proteine, diente ein Proteinstandard, der zusätzlich zu den Proben aufgetragen wurde. Verwendet wurden der Precision Plus Marker von Biorad und der Page RulerTM Prestained Protein Ladder von Fermentas. Die Gelelektrophorese erfolgte bei 200 mV für 40 min in 1x Lämmli-Puffer. Zur Detektion von Proteinen wurden Antikörper eingesetzt. Das weitere Vorgehen ist in Abschnitt 2.16.2 beschrieben. 2.16.2 Western Blot Zur Identifizierung bestimmter Proteine in Proteingemischen, wurden spezifische Antikörper eingesetzt. Zunächst erfolgte der elektrische Transfer der Proteine von Acrylamidgelen auf eine Nitrocellulosemembran (Immun-BlotTM PVDF-Membrane). Zur Aktivierung der Membran, wurde diese für etwa 5 min in Methanol inkubiert. Acrylamidgele und Whatman-Papiere wurden in Blot-Puffer equilibriert. Zum Transfer wurde das Gel auf drei der getränkten Whatman-Papiere gelegt. Als nächstes folgte die Membran, auf welche drei weitere Whatman-Papiere geschichtet wurden. Bei 10 V und 110 mA wurden die Proteine auf die Membran übertragen. Der Transfer erfolgte für etwa 2 h in einer Semidry-blotting-Apparatur. Zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen, diente eine Inkubation der Membran in Blocking-Lösung (1x PBS, 5 % Milchpulver, 0,3 % Tween 20) bei 4 °C über Nacht, oder alternativ für ca. 2 h bei RT. Nach der Absättigung erfolgte eine Inkubation der jeweiligen Primärantikörper für ca. 1 h bei RT. Die Verdünnung der Antikörper erfolgte in Blocking-Lösung. Um unspezifisch gebundene Erstantikörper zu entfernen, wurde dreimal für je 10 min mit Blocking-Lösung gewaschen. Anschließend wurde ein HRP-konjugierter Sekundärantikörper zugegeben, der ebenfalls in Blocking-Lösung verdünnt wurde. Die Inkubation erfolgte bei RT für 1 h. Erneut wurden unspezifische Bindungen durch dreimaliges Waschen (1x PBS) entfernt. Zur Neutralisation der Membran diente 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,5. Nach 10 minütiger Inkubation, erfolgte der Nachweis des Zweitantikörpers. Hierbei wird die an den Antikörper gekoppelte Peroxidase, mit Hilfe des ChemiLucent western blotting detection kit von Millipore detektiert. Dies erfolgte ohne Abweichungen von dem Protokoll des Herstellers. Auf die Membran aufgelegte Röntgenfilme, wurden nach einer Expositionszeit von 1-10 min entwickelt. Dadurch konnte die entstandene Chemilumineszenz nachgewiesen werden. 2.16.3 Ko-Immunopräzipitation (Ko-IP) Zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, wurde das Verfahren der KoImmunopräzipitation angewendet. Hierfür wurden 293T Hek-Zellen in 6-well -Platten ausgelegt und mittels Metafectene® Pro transfiziert. Das Medium wurde 4 h nach der 29 2 Material und Methoden Transfektion durch ein neues Medium ersetzt. Die Ko-IP wurde ohne Abweichungen mit Hilfe des Pierce® Mammalian c-Myc Tag IP/Co-IP Kit von Thermo Scientific, durchgeführt. 2.17 Mikrobiologische Methoden 2.17.1 Transformation in E.coli Das Einbringen von DNA in Bakterien wurde mittels chemischer Transformation nach der CaCl2 -Methode oder durch Elektroporation durchgeführt. Zur chemischen Transformation wurde 2 ml Medium mit einer Einzelkolonie chemisch-kompetenter Bakterien (DH5α) angeimpft und über Nacht bei 37 °C geschüttelt. Anschließend wurde 100 ml LB-Medium mit 1-2 ml der Übernachtkultur inokuliert und 60-90 min bei 37 °C bis zum Erreichen einer O.D.600 zwischen 0,3-0,4 geschüttelt. Nach Zentrifugation für 5 min bei 3000 rpm wurde der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 50 ml 0,1 M MgCl2 aufgenommen und erneut zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Sediment in 1-5 ml 50 mM CaCl2 resuspendiert und 15 %-iges Glycerin zugegeben. Nach 20-minütiger Inkubation auf Eis, wurden 200 µl zur Transformation eingesetzt. Dafür wurde die DNA nach erfolgter Ligation zu den chemisch-kompetenten Bakterien gegeben und auf Eis 20 min inkubiert. Es folgte ein Hitzeschock für 2 min bei 42 °C. Nach Zugabe von 800 µl LB-Medium, wurden die Bakterien für 20 min bei 37 °C inkubiert und anschließend für 1 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes, wurde das Pellet im Restvolumen des Mediums gelöst und auf eine Agarplatte ausplattiert. Für das Einbringen von DNA in Bakterien mittels Elektroporation, wurden zu den auf Eis aufgetauten kompetenten Bakterien (DH10B, DH5α), 1-1,5 µl eines Ligationsansatzes gegeben. Nach 1 min wurden die inkubierten Bakterien in eine Elektroporationsküvette überführt. Die Elektroporation erfolgte bei 2,5 kV und 25 µF. 2.17.2 Herstellung einer Glycerinkultur Zur dauerhaften Lagerung von Bakterienkulturen, wurden Glycerinstocks angelegt und diese bei -70 °C gelagert. Dafür wurde 1 ml Flüssigkultur (LB-Medium) mit 1 ml Glycerinkulturmedium versetzt. 2.17.3 „En passant“-Mutagenese [1] Das von Tischer et al. beschriebenen Verfahren der „en passant”-Mutagenese, beruht auf der markerlosen Rekombination von BACs (bacterial artifical chromosomes) in E. coli [1]. Dabei erfolgt eine homologe Rekombination über das in den GS1783 E. 30 2 Material und Methoden coli, unter der Kontrolle eines temperatursensitiven Promotors vorliegendem Redab Rekombinationssystem. Die im folgenden beschriebene Methode wurde zur Rekombination von BACs des HCMV optimiert [62]. Die Generierung eines linearen Templates stellt den ersten Schritt der BAC-Mutagenese dar. Amplifiziert wird ausgehend von dem pEP-kan-S-Plasmid, welches über eine universelle Kanamicin-Rekombinationskassette verfügt. Mit folgendem PCR-Ansatz und PCR-Programm, wurde das lineare Konstrukt mit speziell generierten Primern synthetisiert: pEP-kan-S 5’ Primer 3’ Primer dNTPs [2mM] 10x PCR-Puffer Taq-Polymerase H2 O ad 25 ng - 50 ng 5 µM 5 µM 5 µl 5 µl 2,5 µl 50 µl Initiale Denaturierung Denaturierung Annealing Elongation Denaturierung Annealing Elongation Denaturierung End-Elongation Kühlung 5 30 30 1,5 30 30 1,5 30 7 ∞ min 94 s 94 s 48 min 72 s 94 s 68 min 68 s 94 min 72 4 °C °C °C °C °C °C °C °C °C °C 10 Zyklen 25 Zyklen Die Korrektheit der PCR wurde anhand einer Gelelektrophorese überprüft. Anschließend erfolgte ein Restriktionsschnitt für 30 min bei 37 °C mit DpnI, um mögliche Vektor-Kontaminationen des Templates zu verhindern. Nach einer GFX-Aufreinigung wurde das Template in 30 µl H2 O aufgenommen. 3-5 µl des aufgereinigten PCRProduktes wurden in rekombinations- und elektroporationskompetente GS1783 E. coli mit TB40E-BAC4 transformiert. Die Bakterien-Suspension wurde auf LB-Chloramphenicol/Kanamycin Selektionsplatten ausgestrichen und für ca. 30 h bei 32 °C inkubiert. Die erhaltenen Klone wurden mittels Kolonie-PCR und RFLP-Analyse auf den korrekten Einbau des Templates überprüft. Positive Klone wurden in 2 ml LB-Chloramphenicol Selektionsmedium bei 32 °C für 2-3 h inkubiert. Anschließend wurde die I-SceI-Expression durch Zugabe von 2 ml 31 2 Material und Methoden LB Chloramphenicol mit 2x Arabinose induziert. Nach weiteren 60 min bei 32 °C, erfolgte eine Erhöhung auf 42 °C für 30 min, wodurch eine zweite Redab -Rekombination stattfand, da die Redab -Komponenten unter der Kontrolle eines temperatursensitiven Promotors standen. Ein durch die Homingendonuklease I-SceI hervorgerufener Doppelstrangbruch des BACs, ermöglicht aufgrund der zweiten Redab -Rekombination, das vollständige Entfernen der Kanamicin-Rekombinationskassette. Die Bakterienkulturen wurden für 1 min auf Eis abgekühlt und anschließend bei 32 °C für 2-3 h inkubiert. Die Bakterienkulturen wurden entsprechend ihrer OD600 verdünnt (1:300 bei OD600 < 0,5, 1:500 bei OD600 0,5 – 0,8, 1: 1000 bei OD600 > 0,8) und 40 µl davon auf einer LB-Chloramphenicol-1x Arabinoseplatte ausgestrichen und für ca. 30 h bei 32 °C kultiviert. Die erfolgreiche Auflösung der Integrate durch die zweite Redab -Rekombination wurde mittels Kolonie-PCR, einer RFLP-Analyse und einer Sequenzierung, kontrolliert. Durch Präparation des rekombinierten BACs mit Hilfe des NucleoBond® Xtra Midi Endotixin-free Plasmid DNA Purification Kits und anschließender Elektroporation in HFF-Zellen wurden replikationsfähige Viren rekonstituiert. 2.18 Zellbiologische Methoden Steriles Arbeiten ist die Voraussetzung für den erfolgreichen Umgang mit Viren und eukaryotischen Zellen. Daher wurden alle zellbiologischen Methoden in einer Lamin Air Flow unter Verwendung steriler Materialien durchgeführt. Die hierbei genutzten Lösungen und Medien wurden auf 37 °C erwärmt. 2.18.1 Zellkultivierung Die Kultivierung von COS7-, 293T Hek-, HeLa-, RPE-1 und HFF-Zellen, erfolgte im jeweils geeigneten Medium bei 37 °C, 96 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 -Gehalt im Inkubator. Zur Subkultivierung wurden COS7-, 293T-Hek, RPE-1 und HeLa-Zellen dreimal mit 0,01 M PBS gewaschen und anschließend mit 1 ml 0,25 %-igem Trypsin für etwa 5 min bei 37 °C inkubiert. Die Waschschritte erfolgten bei HFF-Zellen mit 0,01 M PBS/EDTA. Nach Ablösen der Zellen vom Boden der Kulturflaschen, wurden die Zellen in Medium suspendiert und auf neue Kulturflaschen verteilt. Abhängig von deren Verwendung wurden die Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen gesplittet. 32 2 Material und Methoden 2.18.2 Transfektion eukaryotischer Zellen mittels Metafectene® Pro Zur transienten Transfektion eukaryotischer Zellen, diente Metafectene® Pro. Metafectene® Pro ist ein polykationisches Transfektionsreagenz, das die zu transfizierende DNA zu kompakten Strukturen komplexiert. Zum effizienten Einbringen der DNA in COS7-, HeLa- oder 293T Hek-Zellen, wurden diese bis zum Erreichen einer Konfluenz von etwa 80 %, kultiviert. Für ein optimales Ergebnis sollten die Zellen nicht länger als 24 h bei 37 °C inkubiert werden. Die Kultivierung erfolgte je nach Versuch in 6- oder 24-well -Platten, oder in 8-well -ibidi-slides. Die DNA wurde im Verhältnis 1:2 oder 1:5 (µg DNA:µl Metafectene® Pro) zu dem Transfektionsreagenz gegeben. Zunächst wurden die Plasmidlösungen und die Menge an Metafectene® Pro getrennt voneinander in Eppendorfgefäßen mit der, abhängig von den verwendeten Kulturplatten (siehe Tabelle 1), entsprechenden Menge an serum- und antibiotikafreiem Medium zusammengeführt. Durch einmaliges vorsichtiges Auf- und Abpipettieren wurden die Lösungen vermischt. Anschließend wurden beide Lösungen vereinigt. Zu beachten ist, dass die DNA-Lösung zu der Metafectene® Pro-Lösung gegeben wird und nicht umgekehrt. Nach der Vereinigung erfolgte eine Inkubation bei RT für 20 min. Daraufhin wurden die entstandenen DNA-Lipid-Komplexe zu den Zellen gegeben. Die Transfektion wurde durch Mikroskopie nach 24-72 h überprüft. 6-well -Platte 3,5·105 24-well -Platte 1·105 8-well -ibidi-slide 1,2·104 DNA [µg] 1,25 0,5 0,3 Metafectene® Pro [µl] 6,25 1 0,6 Verdünnungsvolumen von DNA [µl] Verdünnungsvolumen von Metafectene® Pro [µl] Totalvolumen [ml] 100 50 50 100 50 50 2 1 0,2 Ausgesäte Zahl adhärenter Zellen Tabelle 1: Einzusetzende Mengen bei der Transfektion mit Metafectene® Pro. 2.18.3 Infektion eukaryotischer Zellen Die Infektion von HFF-Zellen erfolgte mit einer von den jeweiligen Versuchen abhängigen m.o.i. (multiplicity of infection). Die Zellen wurden hierfür bis zu einer Konfluenz von etwa 80 % kultiviert. Nach Abnahme des Mediums wurde eine definierte Menge an Virus aus einem Stock zu den Zellen gegeben. Durch 15-minütiges Schwenken 33 2 Material und Methoden der Kulturflaschen oder -platten bei RT, wurde das Inokulum gleichmäßig verteilt. Die Inkubation der infizierten Zellen erfolgte bis zum Erntezeitpunkt in serumhaltigem Medium bei 37 °C. 2.18.4 Extraktion von HCMV-DNA aus infizierten Zellen Die kodierenden Regionen der putativen homologen GPCRs aus HCMV, wurden aus der viralen DNA von TB40E-BAC4 amplifiziert. Hierzu wurde zu 200 µl Viruslösung aus einem Stock 200 µl, 2x Lysispuffer und 2 µl Proteinkinase K gegeben. Es folgte eine Inkubation für eine Stunde bei 56 °C. Die Inaktivierung der Proteinase K, wurde durch Erhitzen bei 95 °C für 5 min erreicht. Anschließend erfolgte eine DNA-Aufreinigung mittels des PCR-DNA and Gel Band Purification Kit. 2.18.5 Titerbestimmung eines Virusstocks Zur Bestimmung der Anzahl plaquebildender Einheiten pro Überstand infizierter Zellen, oder pro Milliliter Virusstock, diente eine Endpunkt-Titration. Hierfür wurden HFF-Zellen in 96-well -Platten bis zum Erreichen einer Konfluenz von 80 % kultiviert. Die Titration erfolgte in einem Doppelansatz. Von den Überständen oder der Virusstocks wurden Verdünnungsreihen von 10−1 bis 10−8 erstellt. 100 µl der Virussuspension wurden nach Mediumabnahme auf die Zellen gegeben und 4 Tage bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Fixierung der Zellen. Hierfür wurde die Virussuspension von den Zellen entfernt und die Platte bei RT getrocknet. Mit einem -20 °C kaltem 1:2 Methanol/Aceton-Gemisch, wurden die Zellen für 20 min bei -20 °C fixiert. Die bei der Infektion entstandenen Plaques wurden durch eine Immunfärbung gegen das HCMV Protein pp65 markiert und konnten so gezählt werden. Für die Immunfärbung wurden die Zellen zunächst dreimal mit 1x PBS gewaschen und dann mit einem monoklonalen pp65 Antikörper (1:10 in 1x PBS mit 1 % BSA verdünnt) für 1 h bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Zellen erneut dreimal mit 1x PBS gewaschen. Die Inkubation mit dem sekundären, anti-mouse HRP Antikörper (1:100 in 1x PBS mit 1 % BSA verdünnt) erfolgte für 1 h bei RT. Die Zellen wurden daraufhin mit 1x PBS gewaschen. Mit einer AEC-Färbelösung erfolgte die Detektion der gebundenen Antikörper. Diese Lösung wurde 30 min bei RT inkubiert und durch Waschen mit 1x PBS entfernt. Die Anzahl der infizierten Zellen wurde mit einem Lichtmikroskop ermittelt. 2.18.6 Wachstumskinetik In Abschnitt 2.17.3 wurde die Generierung rekombinanter Viren beschrieben. Die Replikationsfähigkeit dieser Virusmutanten wurde mit Hilfe von Wachstumskinetiken in verschiedenen Zelltypen (HFF und RPE-1) untersucht. Die Zellen wurden in 12-well - 34 2 Material und Methoden Platten kultiviert und mit einer m.o.i. von 0,1 und 1 infiziert. Die eingesetzten Inokula wurden zur Kontrolle der tatsächlichen Titer titriert. Die Inkubation der infizierten Zellen erfolgte bei 37 °C. Nach 4 h wurde das Medium abgenommen und bei -70 °C aufbewahrt. Diese Probeentnahme entsprach Tag 0. Das Medium wurde nach einmaligen Waschen mit 0,01 M PBS erneuert und die Zellen wurden bei 37 °C 12 Tage lang inkubiert. An den Tagen 3, 6, 9 und 12, wurden weitere Proben entnommen und bei -70 °C eingefroren. Jedes Mal wurde das abgenommene Medium durch frisches Medium ersetzt. Zur Erstellung einer Wachstumskurve wurden die Virustiter, wie in Abschnitt 2.18.5 beschrieben, ermittelt. 2.18.7 Immunfluoreszenz-Analysen Die Lokalisation der homologen GPCRs von HCMV in eukaryotischen Zellen wurde mit Hilfe von Immunfluoreszenz-Untersuchungen analysiert. Hierfür wurden COS7-, HFFoder HeLa-Zellen mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert oder mit Virusstocks infiziert. Die zur Transfektion eingesetzte DNA-Konzentration betrug 0,5 µg/µl. Die Zellen wurden in 24-well -Platten oder Ibidi-Slides bis zu einer Konfluenz von 80 % kultiviert. Eine 10-minütige Fixierung mit 4 %-igem PFA bei RT, erfolgte 24-48 h nach Transfektion und 48 h-5 d nach Infektion. Zur Permeabilisierung wurden die Zellen mit 0,1 %-igem Triton X-100 in PBS für 10 min bei RT inkubiert. Mit 3 % BSA und 6 % humanem CMV-negativen Serum, wurde bei 4 °C für 30 min geblockt. Die entsprechenden Primärantikörper wurden in Milchlösung verdünnt und für 1 h bei 4 °C auf die Zellen gegeben. Nach 3 Waschschritten mit 1x PBS, 1 % BSA und 0.1 % Triton X-100, erfolgte eine Inkubation für 45 min bei 4 °C mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Sekundärantikörper. Zur Markierung der DNA wurde für 10 min bei 4 °C mit DAPI gegengefärbt. Erneut erfolgten 3 Waschschritte von je 5 min bei 4 °C. Anschließend wurde mit Hilfe konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, die Immunfluoreszenz untersucht. 35 2 Material und Methoden 2.18.8 Internalisierungsassay Die Analyse der Endozytose von GPCR-Homologen in HCMV, erfolgte mit Hilfe des Internalisierungsassays in transfizierten und infizierten Zellen. In transfizierten Zellen HeLa-Zellen in 8-well -Ibidi-Slides wurden mittels Metafectene ® Pro transfiziert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen 3 mal mit 4 °C gekühltem PBS gewaschen und anschließend mit einem in Bindungsmedium verdünnten Primärantikörper bei 4 °C für 2 h inkubiert. Zur Initialisierung der Endozytose, folgte ein Transfer der Zellen in 37 °C, für 0, 5, 10, 30 und 60 min. Nach jedem Transfer, wurden die Zellen dreimal mit 1x PBS gewaschen, mit 4 % PFA fixiert und mit 0,1 % Triton permeabilisiert. Anschließend erfolgte eine einstündige Inkubation mit dem entsprechenden Sekundärantikörper bei RT. Nach anschließender DAPI-Färbung wurde die Endozytose per konfokaler Mikroskopie analysiert. Die Internalisierung von GPCRs erfolgt im Allgemeinen über clathrin coated Vesikel. Diese werden mit Hilfe der GTPase Dynamin von der Zellmembran abgeschnürt. Das zellpermeable Reagenz Dynasore inhibiert Dynamin und verhindert die Bildung der Vesikel und somit die Internalisierung [63]. Dynasore wurde eingesetzt, um zu bestätigen, dass es sich bei dem Transport von Rezeptoren von der Zelloberfläche ins Zellinnere um Endozytose handelt. Dazu wurden vor Durchführung des Internalisierungsassays die Zellen mit unterschiedlichen Mengen an Dynasore, eine halbe Stunde bei RT vorinkubiert. Dynasore lag als 80 mM Stocklösung in 0,8 % DMSO (Dimethylsulfoxid) vor. Für die Inkubation auf den Zellen, wurde es in Bindungsmedium verdünnt. Auch bei der Inkubation des Primärantikörpers, wurde Dynasore zugegeben. Der Internalisierungsassay mit Dynasore erfolgte ohne weitere Abweichungen und wurde in transfizierten Zellen durchgeführt. In infizierten Zellen Zur Untersuchung der Endozytose von GPCRs in infizierten Zellen, wurden HFF-Zellen in 24-well -Platten ausgelegt und am nächsten Tag mit m.o.i. 1 infiziert. 5 Tage nach der Infektion erfolgte die Durchführung des Internalisierungsassays, wie bei dem Verfahren bei transfizierten Zellen. 2.18.9 Bimolecular Fluorescence Complementation Assay Eine weitere Methode zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen ist der Bimolecular Fluorescence Complementation Assay (BiFC). Dafür wurde ein yellow fluorescent protein (YFP) in zwei nicht-fluoreszierende Teile gespalten: YFP1 (AS 1-158) und YFP2 (AS 159-239). YFP1 und YFP2 wurden an den C-Terminus der Proteine von Interesse fusioniert. Zwischen den zwei fusionierten Proteinen befindet sich ein 36 2 Material und Methoden (G4 S2 )2 -Linker, der die Flexibilität erhöht. In Abbildung 3 ist der BiFC-Assay zweier hypothetischer Proteine graphisch dargestellt. Abbildung 3: Graphische Darstellung des BiFC Assays. Interaktion zweier hypothetischer Proteine A und B und Rekonstitution des Reporterproteins, hier Venus, ein gelb fluoreszierendes Protein. Das N-terminale Fragment wird als VN und das C-terminale Fragment als VC bezeichnet. Die Interaktion der Proteine A und B und die daraus resultierende räumliche Nähe der Reporterfragmente, führt zur Komplementation des Reporterporteins. Das Auftreten eines Fluoreszenzsignals dient somit dem Nachweis einer Protein-Protein-Interaktion ([64], modifiziert). Mit Hilfe des BiFC Assays konnte bereits die Homomerisierung des α1b Adrenorezeptors gezeigt werden [65]. Adrenorezeptoren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die wie die homologen GPCRs von HCMV, zur Rhodopsin-Familie gehören. Auch die gut untersuchte Interaktion zwischen dem Adenosin AA2 und dem Dopamin D2 Rezeptor [66], konnte vor Kurzem anhand des BiFC Assays bestätigt werden [67]. COS7-Zellen wurden in der vorliegenden Arbeit zur Analyse von Interaktionen von GPCR-Homologen des HCMV in 8-well -Ibidi-Slides ausgelegt und mittels Metafectene ® Pro mit zwei Expressionsvektoren (x-YFP1 und x-YFP2) ko-transfiziert. Diese Vektoren exprimieren ein GPCR-Homolog, das c-terminal mit YFP1 oder YFP2 fusioniert ist. 18 h nach Transfektion, wurden die Zellen mit 4 %-igem PFA fixiert und mit 0,1 % Triton permeabilisiert. Nach anschließender DAPI-Färbung wurde die mögliche Interaktion der Proteine unter Anwendung der konfokalen Mikroskopie analysiert. 37 2 Material und Methoden 2.18.10 Messung von Inositolphosphaten in COS7-Zellen Die Messung von der Bildung von Inositolphosphaten erfolgte wie bereits beschrieben [68, 69]. COS7-Zellen wurden in 12-well -Platten kultiviert, wobei zur Erhöhung der Adherenz der Zellen, die Platten vor Verwendung mit Poly-Lysin (0.1 % (w/v) in H2 O, Sigma-Aldrich) beschichtet wurden. Auf jedes well wurden hierfür 300 µl einer 1:10 Verdünnung der Poly-Lysin-Lösung aufgetragen und 5 min bei RT inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit H2 O, wurden die Platten 30 min bei RT getrocknet. COS7Zellen wurden ausgesät und bis zu einer Konfluenz von etwa 80 % bei 37 °C inkubiert. Nach einem Mediumwechsel, wurden die Zellen per Metafectene® Pro im Dreifachansatz transfiziert. Pro Plasmid wurden 0,25 µg DNA eingesetzt. Die Transfektion erfolgte in serumfreien Opti-MEM. Nach einer Inkubation von 24 h bei 37 °C, erfolgte die radioaktive Markierung. Hierfür wurde Medium abgenommen, die Zellen mit 500 µl 1x PBS gewaschen. 2,5 µCi/ml myo-[2-3 H]inositol und 10 mM LiCl wurden pro Ansatz in 400 µl Opti-MEM gelöst und auf die Zellen verteilt. Nach einer Inkubation für 24 h bei 37 °C, folgte eine Säulenchromatographie. In den Säulen befand sich 0,25 ml Dowex® 1 × 8–200 ion exchange resin. Nach Zugabe von 200 µl Ameisensäure pro Ansatz, wurden die Zellen auf Eis 30 min lang geschüttelt. Anschließend wurden 200 µl Zellextrakt zu 300 µl Ammoniumhydroxid gegeben, gevortext und bei 14000 rpm 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde auf die Säulen gegeben, die zuvor mit 3 ml H2 O äquilibriert wurden [70]. Nach dem vollständigen Durchfluss wurden die Säulen zweimal mit 3,5 ml eines Gemisches aus 5 mM Natriumborat (Dinatriumtetraborat-Decahydrat) und 60 mM Natriumformiat gewaschen. Mit 1 M Ammoniumformiat / 0,1 M Ameisensäure erfolgte die Eluierung. Nach Zugabe von 15 ml Szintillationsflüssigkeit erfolgte die Inositolphosphat-Messung. Mit 8 ml eines Gemisches aus 2 M Ammoniumformiat und 0,1 M Ameisensäure, konnten die Säulen zur Wiederverwendung regeneriert werden [70]. Nach vollständigem Durchfluss wurde mit 10 ml H2 O gewaschen. 38 3 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Lokalisationsstudien des putativen 7-TM-Proteins pUL78 von HCMV 3.1.1 Lokalisation von pUL78 in transfizierten Zellen Für eine optimale Signalweiterleitung, lokalisieren G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erwartungsgemäß an der Zelloberfläche. Um einen Hinweis auf die mögliche Funktion des putativen vGPCRs pUL78, das Merkmale eines 7-TM-Proteins aufweist, zu erhalten, ist von Interesse, ob dieses Protein eine ähnliche Lokalisation wie zelluläre GPCRs aufweist. Da zur Immunfluoreszenzanalyse bis zu diesem Zeitpunkt noch kein Antikörper gegen pUL78 zur Verfügung stand, wurde pUL78 mit unterschiedlichen tags versehen. Verwendet wurden ein flag- und ein myc-tag, die jeweils N-terminal mit UL78 fusioniert wurden. Für die Klonierung des myc-UL78- und des flag-UL78-Plasmids wurde die kodierende Region für UL78 aus dem TB40E-BAC4 mit den Primern mycUL78Hind III+/UL78BamHI- und flag-UL78Hind III+/UL78BamHI- amplifiziert (siehe 2.8). Die Klonierung erfolgte nach Restriktionsverdau mit den Enzymen Hind III und BamHI in den Vektor pcDNA3.1+. Die generierten Plasmide wurden anhand von Restriktionsschnitten und Sequenzierung kontrolliert. 24 h nach der Transfektion der beschriebenen Plasmide, wurden die Zellen mittels 4 %-igem PFA fixiert und nach der Permeabilisierung mit DAPI gefärbt. Mit Hilfe von Antikörpern die gegen den flag- oder den myc-tag gerichtet waren, wurde die intrazelluläre Verteilung von pUL78 untersucht. Die Ergebnisse der Fluoreszenzaufnahmen zur Analyse der Lokalisation, aufgenommen anhand konfokaler Mikroskopie, sind in Abbildung 4 zusammengefasst. Die N-terminalen Fusionen wurden mittels direkter Immunfluoreszenz mit der Lokalisation eines markierten UL78-EGFP-Proteins verglichen (siehe Abbildung 4 A-C). EGFP ist hier an den C-Terminus des pUL78 fusioniert. Das Plasmid wurde von Andreas Schreiber generiert [62]. Die Wahl von C- und N-terminaler Fusionierung erfolgte, weil nicht bekannt war, ob die Lokalisation oder die Funktion von pUL78, durch das Anbringen eines tags beeinflusst wird. 39 3 Ergebnisse UL78-EGFP DAPI überlagert EGFP myc-UL78 flag-UL78 Abbildung 4: Immunofluoreszenz-Analyse von pUL78 in transfizierten COS-7 Zellen. 24 h.p.t. wurden die Zellen mit 4 %-igem PFA fixiert. A-C: pUL78 C-terminal fusioniert mit EGFP; D-F: EGFP; G-I: pUL78 N-terminal fusioniert mit einem myc-tag; K-M: pUL78 N-terminal fusioniert mit einem flag-tag. Die nukleäre Färbung erfolgte mittels DAPI (B, E, H und L). myc-UL78 und flag-UL78 wurden mit Antikörpern detektiert, die gegen den myc- bzw. den flag-tag gerichtet sind. Als sekundärer Antikörper wurde ein anti-rabbit-Alexa488-Antikörper verwendet. Die Überlagerungen des DAPI-Signals mit Alexa488 bzw. EGFP, sind in C, F, G und I dargestellt. Die Lokalisation des UL78-EGFP-Fusionsproteins (Abb.4, A-C) zeigte eine zytoplasmatische, den Kern aussparende Verteilung. Das EGFP war im Gegensatz dazu über die gesamte Zelle verteilt und zeigte keine Aussparung des Zellkerns (siehe Abbildung 4, D-F).Für die Fusionsproteine myc-UL78 und flag-UL78 war nach indirekter Immunfluoreszenz die gleiche Lokalisation zu erkennen (Abb.4, G-M). Unabhängig davon, ob sich der tag am C- oder N-Terminus von UL78 befand, wiesen die Fusionsproteine eine übereinstimmende Verteilung in der Zelle auf. 40 3 Ergebnisse 3.1.2 Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation von pUL78 in transfizierten Zellen Zur weiteren Analyse der Lokalisation von pUL78, wurde die subzelluläre Verteilung dieses 7-TM-Proteins mit verschiedenen zellulären Markerproteinen verglichen. Hierfür wurden Zellen mit einem flag-UL78-Plasmid mittels Metafectene® Pro transfiziert. Nach 24 h erfolgte die Immunfluoreszenzanalyse. Die durch konfokale Mikroskopie erhaltenen Fluoreszenzaufnahmen sind in Abbildung 5 dargestellt. anti-Calreticulin anti-flag DAPI überlagert anti-γ-Adaptin anti-EEA-1 anti-LAMP-1 Abbildung 5: Analyse der subzellulären Lokalisation von pUL78 in transfizierten Zellen im Vergleich mit zellulären Markern. Transfektion von COS7-Zellen mit einem flag-UL78-Fusionsplasmid. Fixierung der Zellen mit 4 %-igem PFA 24 h nach Transfektion. A: ER-Marker, anti-Calreticulin (rabbit); E: trans-Golgi-Marker, anti-Adaptin (mouse); I: Early Endosom-Marker, anti-EEA-1 (early endosome 1 , mouse); N: Lysosom-Marker, anti-LAMP-1 (mouse); B: Detektion von flag-UL78 mittels einem gegen den flag-tag gerichteten Antikörper, dieser wurde mit einem anti-mouse-Alexa488-Antikörper nachgewiesen. F, K und O: Detektion von flag-UL78 mittels einem gegen den flag-tag gerichteten Antikörper, dieser wurde mit einem anti-rabbit-Alexa555-Antikörper nachgewiesen. Zur nukleären Färbung diente DAPI (C, G, L und P). D, H, M und Q stellen die Überlagerungen von DAPI mit flag-UL78 und den jeweiligen zellulären Markern dar. 41 3 Ergebnisse Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist entscheidend für die Reifung von Proteinen, da in diesem Kompartiment die Translation, Proteinfaltungen und posttranslationale Modifikationen stattfinden. Zur weiteren Modifizierung werden die Proteine in Vesikeln zum Golgi-Apparat transportiert. Anschließend gelangen die Proteine an den Ort ihrer Bestimmung. Bei der Reifung von GPCRs spielen das ER und der Golgi-Apparat eine wichtige Rolle, da nur korrekt gefaltete und modifizierte GPCRs an die Zellmembran transportiert werden. Mit Hilfe des Proteins Calreticulin wurde untersucht, ob pUL78 in Strukturen des ER zu finden ist. In Abbildung 5 (A-D) sind die Aufnahmen der Immunfluoreszenz von pUL78 (FITC) und Calreticulin (Ds-Red) dargestellt. Bei der Überlagerung der beiden Signale ist, durch das Auftreten gelblich-oranger Signale, eine deutliche Ko-Lokalisation zu erkennen. Ebenfalls untersucht wurde, ob pUL78 im Golgi-Apparat lokalisiert ist. γ-Adaptin diente als trans-Golgi-Marker und wurde mit Hilfe spezifischer Antikörper nachgewiesen. In Abbildung 5, E-H, zeigt sich nur eine geringe Überlagerung der Signale von pUL78 und γ-Adaptin. Da GPCRs häufig durch Internalisierung einen hohen turnover aufweisen, sind sie, neben der Lokalisation an der Zelloberfläche, in Endosomen und Lysosomen zu finden. Werden die GPCRs recycled und wieder an die Zelloberfläche transportiert, befinden sie sich in frühen Endosomen. Der Abbau von GPCRs erfolgt in Lysosomen. Zur Markierung von frühen Endosomen wurden Antikörper gegen das Protein EEA-1 (early endosome antigen 1 ) [71] verwendet (Abbildung 5 I und M). Bei der Überlagerung der Signale von EEA-1 und pUL78 war nur eine geringe Ko-Lokalisation erkennbar (Abbildung 5, M). Mit dem Protein LAMP-1 (lysosomal-associated membrane protein 1 ), das als Marker für Lysosomen dient [72], zeigte sich keine Ko-Lokalisation. 24 h nach der Transfektion scheint pUL78 demnach in Strukturen des endoplasmatischen Retikulums lokalisiert zu sein. Ebenfalls ist pUL78 in Regionen des Golgi-Apparats und teilweise auch in Endosomen zu finden. In Lysosomen konnte pUL78 nicht nachgewiesen werden. Als nächstes wurde die subzelluläre Lokalisation von pUL78 mit der Lokalisation des bereits gut untersuchten GPCR Homologs pUS28 des HCMV verglichen. Zur Detektion von pUS28 wurde dieses N-terminal mit einem flag-tag versehen. Die kodierende Region für pUS28 wurde aus dem TB40E-BAC4 mit den Primern US28-flag-Hind III+ und US28-EcoRI amplifiziert (siehe 2.8) und es folgte ein Restriktionsverdau mit Hind III und EcoRI. Kloniert wurde das geschnittene Amplifikat in den Vektor pcDNA3.1+. Die Immunfluoreszenzanalyse erfolgte 24 h nach der Transfektion mit den gleichen zellulären Markerproteinen, die für die Lokalisationsstudien von pUL78 eingesetzt wurden. Die durch konfokale Mikroskopie erhaltenen Aufnahmen sind in Abbildung 6 dargestellt. 42 3 Ergebnisse anti-Calreticulin anti-flag DAPI überlagert anti-γ-Adaptin anti-EEA-1 anti-LAMP-1 Abbildung 6: Analyse der subzellulären Lokalisation von pUS28 im Vergleich mit zellulären Markern in transfizierten Zellen. Transfektion von COS7-Zellen mit einem flag-US28-Fusionsplasmid. Fixierung der Zellen mit 4 % PFA 24 h nach Transfektion. A: ER-Marker, anti-Calreticulin (rabbit); E: trans-Golgi-Marker, anti-Adaptin (mouse); I: Early Endosom-Marker, anti-EEA-1 (early endosome 1 , mouse); N: Lysosom-Marker, anti-LAMP-1 mouse; B: Detektion von flag-UL78 mit einem gegen den flag-tag gerichteten Antikörper. Als Sekundärantikörper diente ein anti-mouse-Alexa488-Antikörper. F, K und O: Detektion von flagUL78 mit einem gegen den flag-tag gerichteten Antikörper. Als Sekundärantikörper diente ein anti-rabbit-Alexa555-Antikörper. Zur nukleären Färbung diente DAPI (C, G, L und P). D, H, M und Q stellen die Überlagerungen von DAPI mit flag-UL78 und den jeweiligen zellulären Markern dar. Das 7-TM-Protein pUS28 zeigte, wie pUL78 (Abbildung 4), eine zytoplasmatische, den Zellkern aussparende Lokalisation (siehe Abbildung 6 B, F, K und N). Mit dem ER-ständigen Protein Calreticulin ergab sich eine Ko-Lokalisation (D). Zwischen den Markerproteinen für trans-Golgi Strukturen (Adaptin (H)), frühen Endosomen (EEA1(M)) und Lysosomen (LAMP-1 (Q)) konnte keine eindeutige Ko-Lokalisation mit pUS28 gefunden werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die 7-TM-Proteine pUL78 und pUS28 24 h 43 3 Ergebnisse nach der Transfektion in Strukturen des endoplasmatischen Retikulums nachgewiesen wurden. pUL78 zeigte zusätzlich eine geringe Ko-Lokalisation mit trans-Golgi Strukturen und frühen Endosomen. 3.1.3 Untersuchung der Oberflächenexpression von pUL78 in transfizierten Zellen Als nächstes wurde untersucht, ob pUL78 auf der Zelloberfläche lokalisiert ist, oder nur intrazellulär im Zytoplasma vorliegt. Hierfür wurden Zellen mit einem myc-UL78Fusionsplasmid transfiziert. Um die Lokalisation von pUL78 mit einem zellulären GPCR vergleichen zu können, erfolgte eine Transfektion mit einem myc-CCR5-Fusionsplasmid. CCR5 ist ein humaner Chemokinrezeptor, der in der Zellmembran vorliegt und durch Bindung seiner Liganden, z.B. RANTES (Regulated upon Activation, Normal Tcell Expressed, and Secreted ), in das Zellinnere transportiert wird. In Abwesenheit der Liganden wird CCR5 nicht internalisiert und befindet sich in der Zellmembran. Zum besseren Vergleich wurde CCR5 wie pUL78 N-terminal mit einem myc-tag fusioniert. Die Amplifikation von myc-CCR5 erfolgte mit den Primern myc-CCR5+ und mycCCR5- (siehe 2.8) ausgehend von dem Plasmid IRES-GFP-CCR5 (siehe 2.7). Die Klonierung erfolgte nach dem Restriktionsverdau mit den Enzymen BamHI und Hind III in den Vektor pcDNA3.1+. Zum Vergleich wurde ebenfalls die Oberflächenexpression von pUS28 untersucht. 24 h nach der Transfektion wurden die nicht-permeabilisierten Zellen mit Antikörpern, die gegen den myc- bzw. flag-tag gerichtet waren, bei 4 °C inkubiert. Die indirekte Immunfärbung erfolgte aufgrund der fehlenden Permeabilisierung ausschließlich auf der Zelloberfläche. Nach zweistündiger Inkubation des Primärantikörpers wurden die Zellen mit 4 %-igem PFA fixiert. Die Immunofluoreszenzaufnahmen mit konfokaler Mikroskopie sind in Abbildung 7 dargestellt. 44 3 Ergebnisse c-myc-UL78 c-myc-CCR5 flag-US28 Abbildung 7: Analyse der Lokalisation von pUL78 an der Zelloberfläche in transfizierten HeLaZellen. Fixierung der Zellen mit 4 %-igem PFA 24 h.p.t.. Detektion von c-myc-UL78 und c-myc-CCR5 mit einem gegen den myc-tag gerichteten Antikörper. Nachweis von pUS28 mit einem Antikörper, der den flag-tag erkennt. A: c-myc-UL78 (anti-mouseAlexa488-Antikörper); B: c-myc-CCR5 (anti-mouse-Alexa555-Antikörper); C: flagUS28 (anti-mouse-Alexa555-Antikörper). Die nukleäre Färbung erfolgte mit DAPI. Zusammenfassend war festzustellen, dass pUL78 in nicht-permeabilisierten Zellen an der Zelloberfläche lokalisiert. Der humane GPCR CCR5 zeigte die gleiche Oberflächenexpression wie pUL78. Und auch pUS28 konnte in nicht-permeabilisierten Zellen an der Zelloberfläche nachgewiesen werden. In transfizierten Zellen ist pUL78 demnach, zusätzlich zur intrazellulären Verteilung, auch extrazellulär an der Zelloberfläche lokalisiert. Nun war von Interesse, ob pUL78 durch Endozytose von der Zelloberfläche ins Zellinnere transportiert wird (Internalisierung). 3.1.4 Internalisierungsassay von pUL78 in transfizierten Zellen Die Internalisierung von GPCRs dient der Regulation der Signalweiterleitung. Um einen Hinweis auf die Funktion von pUL78 zu bekommen, ist es deshalb wichtig, neben der Lokalisation auch die Fähigkeit zur Internalisierung zu untersuchen. Dazu wurden Zellen mit einem Vektor transfiziert, der ein pUL78 exprimiert, das am N-Terminus ein myc-tag trägt. 24 h nach der Transfektion erfolgte die Inkubation mit einem gegen den myc-tag gerichteten Antikörper bei 4 °C. Die Initialisierung der Endozytose erfolgte durch einen Temperaturwechsel von 4 °C auf 37 °C. Die Zellen wurden für 0, 5, 10, 30 und 60 min bei 37 °C inkubiert, um die Internalisierung zeitlich festzulegen. Mittels konfokaler Mikroskopie wurde die Endozytose von pUL78 analysiert, dargestellt in Abbildung 8. Zur Kontrolle diente wieder der zelluläre GPCR CCR5. Dieser zeigt in Abwesenheit seines Liganden RANTES keine Internalisierung. Die Fähigkeit zur Internalisierung von pUS28 wurde zum Vergleich ebenfalls untersucht. 45 3 Ergebnisse 37 °C: 0 min 5 min 10 min 30 min 60 min myc-UL78 myc-CCR5 flag-US28 Abbildung 8: Internalisierungsassay von pUL78 in transfizierten Zellen. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen auf 4 °C gekühlt. Anschließend erfolgte die Inkubation der Primärantikörper für 2 h bei 4 °C. Detektiert wurden myc-UL78 (A-E) und myc-CCR5 (F-J) mit einem gegen den myc-tag gerichteten Antikörper. flag-US28 (K-O) wurde mit Hilfe eines Antikörpers detektiert, der gegen den flag-tag gerichtet ist. Durch einen Temperaturwechsel auf 37 °C wurde die Internalisierung eingeleitet. Nach Fixierung der Zellen mit 4 %-igem PFA und Permeabilisierung mit 0,1 %-igem Triton erfolgte die Inkubation mit einem Sekundärantikörper. Verwendet wurden ein anti-mouse-Alexa488-Antikörper (A-E), ein anti-mouse-Alexa555-Antikörper (F-J) und ein anti-rabbit-Alexa555-Antikörper (K-O). Die aufgeführten Zeitangaben beziehen sich auf die Dauer, für die die Zellen bei 37 °C inkubiert wurden. 0 und 5 Minuten nach dem Transfer auf 37 °C (A und B der Abbildung 8) konnte pUL78 in nicht-permeabilisierten Zellen an der Zelloberfläche detektiert werden. Es hat zu diesem Zeitpunkt noch keine Internalisierung stattgefunden. Auch nach 10 Minuten (C) zeigte sich keine deutliche Endozytose. Die Internalisierung von pUL78 setzte nach 30 Minuten (D) ein und war eindeutig nach 60 Minuten (E) zu sehen, erkennbar an der Abnahme des membranständigen pUL78 und der Zunahme an pUL78 im Zellinneren. Die Kontrolle mit dem humanen GPCR CCR5 (F-J) zeigte unabhängig von den Zeitpunkten, keine Internalisierung. CCR5 konnte nur an der Zelloberfläche detektiert werden. Das Fusionsprotein flag-US28 zeigte nach 0, 5 und 10 Minuten (K-M) eine eindeutige Oberflächenexpression. Erst nach 30 Minuten (N) konnte pUS28 ebenfalls intrazellulär nachgewiesen werden. Diese Lokalisation war auch nach 60 Minuten zu erkennen (O). Diese Untersuchung zeigte, dass pUL78 an der Zelloberfläche lokalisiert ist und relativ schnell internalisiert wird. Dies war ebenfalls bei dem GPCR Homolog pUS28 zu beobachten. Anschließend wurde die Lokalisation von pUL78 im Internalisierungsassay mit der Lo- 46 3 Ergebnisse kalisation des zellulären Proteins EEA-1 verglichen. EEA-1 dient als Marker für frühe Endosomen. Hierfür wurden HeLa-Zellen mit einem myc-UL78-Fusionsplasmid transfiziert. 24 h nach der Transfektion erfolgte der Internalisierungsassay. Dieser wurde, wie bereits in diesem Abschnitt beschrieben, durchgeführt, jedoch wurden nur die zwei Zeitpunkte 0 und 60 min gewählt. Bei dem Vergleich der Lokalisation von pUL78 und EEA-1 sollte zwischen internalisierten und nicht-internalisierten Proteinen unterschieden werden. Zur Detektion des myc-UL78-Fusionsproteins wurde im Internalisierungsassay erneut ein gegen den myc-tag gerichteter Antikörper verwendet. anti-myc anti-EEA-1 DAPI Überlagerung myc-UL78 0 min pcDNA3.1+ myc-UL78 60 min pcDNA3.1+ Abbildung 9: Vergleich von pUL78 mit dem Endosom-Marker EEA-1 im Internalisierungsassay. Transfektion von HeLa-Zellen. A-D und I-L: Transfektion mit myc-UL78; E-H und MP: Transfektion mit pcDNA3.1+ (Leerplasmid). Der Internalisierungsassay wurde 24 h nach Transfektion der Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden auf 4 °C gekühlt und die primären Antikörper wurden für 2 h bei 4 °C inkubiert. Ein Temperaturwechsel von 4 °C auf 37 °C erfolgte für 0 (A-H) und 60 Minuten (I-P). Detektion von myc-UL78 mit einem gegen den myc-tag gerichteten Antikörper, als Sekundärantikörper diente ein anti-rabbit-Alexa488-Antikörper. Detektion von EEA-1 mit einem anti-EEA-1Antikörper, als Sekundärantikörper diente ein anti-mouse-Alexa555-Antikörper. Durch den Temperaturwechsel von 4 °C auf 37 °C wird die Internalisierung gestartet. Ohne eine Inkubation bei 37 °C konnte pUL78 erneut ausschließlich auf der Zelloberfläche detektiert werden (siehe Abbildung 9 A, D). Dies zeigt bereits die Abbildung 8. Das Protein EEA-1, das ein Marker für frühe Endosomen darstellt, ist dagegen punktförmig in der ganzen Zelle verteilt (B). pUL78 zeigte ohne Temperaturwechsel keine Ko-Lokalisation mit frühen Endosomen (EEA-1 (D)). In Zellen, die mit dem Leerplasmid pcDNA3.1+ transfiziert wurden, traten bei dem gegen den myc-tag gerichteten 47 3 Ergebnisse Antikörper keine Signale auf (E). Mit dem Antikörper gegen EEA-1 zeigte sich eine punktförmige Verteilung von EEA-1 (F), die ebenfalls bei den mit pUL78 transfizierten Zellen beobachtet wurde (B). Die Transfektion von pUL78 hatte demnach keinen Einfluss auf die Lokalisation von frühen Endosomen. 60 Minuten nach dem Beginn der Internalisierung, war pUL78 in der Zellmembran lokalisiert (I) und zeigte eine Ko-Lokalisation mit frühen Endosomen (L). In Zellen, die mit pcDNA3.1+ transfiziert wurden, zeigten sich erneut keine Signale mit einem gegen den myc-tag gerichteten Antikörper (M, P). Die Lokalisation von EEA-1 war erneut in pcDNA3.1+ (J) und myc-UL78 transfizierten Zellen (N) gleich. Zur Veranschaulichung der Ko-Lokalisation von internalisiertem pUL78 und frühen Endosomen, ist eine Zelle in Abbildung 10 vergrößert dargestellt. anti-myc + anti-EEA-1 + DAPI Abbildung 10: Ko-Lokalisation von pUL78 und early Endosomen (EEA-1). Transfektion von HeLa-Zellen mittels Metafectene® Pro mit einem myc-UL78Plasmid. Inkubation des primären Antikörpers für 2 h bei 4 °C. Verwendet wurde ein Antikörper, der den myc-tag erkennt (rabbit). Einleitung der Internalisierung für 60 Minuten bei 37 °C 24 h nach Transfektion. Anschließende Fixierung und Permeabilisierung der Zellen. Es folgte die Inkubation des anti-EEA-1-Antikörpers (mouse). Als sekundäre Antikörper wurden ein anti-rabbit-Alexa488- und ein antimouse-Alexa555-Antikörper verwendet. Nukleäre Färbung mit DAPI. myc-UL78: grün, EEA-1: rot. A: Überlagerung der Signale von myc-UL78 (grün), EEA-1 (rot) und DAPI (blau); B: myc-UL78; C: EEA-1. In der Region, die durch ein weißes Rechteck gekennzeichnet ist, sind viele Ko-Lokalisationen der Signale von myc-UL78 und EEA-1 aufgetreten. pUL78 ist durch eine grüne und EEA-1 durch eine rote Fluoreszenz dargestellt. Mehrere Punkte waren doppelt-positiv und zeigten daher ein gelbes Signal. Es zeigten sich jedoch auch Signale, die nicht ko-lokalisierten. pUL78 ist demnach in frühen Endosomen lokalisiert, aber nicht ausschließlich. Da pUL78 nur teilweise in frühen Endosomen 48 3 Ergebnisse zu finden ist, wurde die Lokalisation von pUL78 nach der Internalisierung mit weiteren zellulären Markern, die bei der Endozytose von Bedeutung sind, verglichen. In Abbildung 11 ist der Vergleich der Lokalisation von pUL78 mit dem Protein CD63 dargestellt. CD63 ist in späte Endosomen und Lysosomen zu finden und wird als Marker für diese Kompartimente verwendet [73]. Diese spielen bei dem Abbau von Proteinen eine Rolle. anti-myc-UL78 + anti-CD63 + DAPI Abbildung 11: Ko-Lokalisation von pUL78 und late Endosomen (CD63). Transfektion von HeLa-Zellen mittels Metafectene® Pro mit einem myc-UL78Plasmid. Inkubation des primären Antikörpers für 2 h bei 4 °C. Verwendet wurde ein gegen den myc-tag gerichteter Antikörper (rabbit). Initialisierung der Internalisierung für 60 Minuten bei 37 °C 24 h nach Transfektion. Anschließende Fixierung und Permeabilisierung der Zellen. Es folgte eine Inkubation des anti-CD63-Antikörpers (mouse). Als Sekundärantikörper wurden ein anti-rabbit-Alexa488- und ein antimouse-Alexa555-Antikörper verwendet. Nukleäre Färbung mit DAPI. myc-UL78: grün, EEA-1: rot. A: Überlagerung der Signale von myc-UL78 (grün), CD63 (rot) und DAPI (blau); B: myc-UL78; C: CD63. Es wird deutlich, dass die Lokalisation des internalisierten Fusionsproteins myc-UL78 nicht mit der Lokalisation von späten Endosomen übereinstimmt. Es sind keine doppeltpositiven Signale aufgetreten. Zusätzlich wurde untersucht, ob pUL78 nach der Internalisierung in Lysosomen zu finden ist. Hierfür wurde als Vergleich der Lysosomen-Marker LAMP-1 verwendet. 49 3 Ergebnisse anti-myc + anti-LAMP-1 + DAPI Abbildung 12: Ko-Lokalisation von pUL78 und Lysosomen (LAMP-1). Transfektion von HeLa-Zellen mittels Metafectene® Pro mit einem myc-UL78Plasmid. Inkubation des primären Antikörpers für 2 h bei 4 °C. Verwendet wurde ein gegen den myc-tag gerichteten Antikörper (rabbit). Initialisierung der Internalisierung für 60 Minuten bei 37 °C 24 h nach Transfektion. Anschließende Fixierung und Permeabilisierung der Zellen. Es folgte eine Inkubation des anti-LAMP1-Antikörpers (mouse). Als Sekundärantikörper wurden ein anti-rabbit-Alexa488und ein anti-mouse-Alexa555-Antikörper verwendet. Nukleäre Färbung mit DAPI. myc-UL78: grün, LAMP-1: rot. A: Überlagerung der Signale von myc-UL78 (grün), LAMP-1 (rot) und DAPI (blau); B: myc-UL78; C: LAMP-1. Das Fusionsprotein myc-UL78 zeigte keine Ko-Lokalisation mit dem Lysosomen-Marker LAMP-1 (siehe Abbildung 12). Nach Initialisierung der Internalisierung von pUL78 konnte somit nur eine partielle Ko-Lokalisation mit frühen Endosomen nachgewiesen werden, in späten Endosomen und Lysosomen war pUL78 nicht zu finden. Die rezeptorabhängige Endozytose erfolgt über clathrin-coated Vesikel, die durch Einstülpung an der Zellmembran entstehen. Daran beteiligt ist die GTPase Dynamin [74, 75, 76, 77]. Diese wird durch das Reagenz Dynasore blockiert [63], wodurch die Abschnürung der Vesikel und somit die Endozytose verhindert wird. Um zu bestätigen, dass es sich bei dem Transport von pUL78 von der Zelloberfläche in das Zellinnere um Endozytose handelt, wurde der zellpermeable Inhibitor Dynasore im Internalisierungsassay verwendet. Hierfür wurden Zellen transfiziert. 24 h nach der Transfektion erfolgte der Internalisierungsassay. Die Zellen wurden zunächst mit unterschiedlichen Mengen an Dynasore für eine halbe Stunde bei 4 °C vorinkubiert. Als Stocklösung wurde 80 mM Dynasore verwendet, das in 0,8 % DMSO gelöst vorlag. Zur Kontrolle dienten unbehandelte Zellen. Die anschließende Inkubation des primären Antikörpers (anti-myc bzw. anti-flag) erfolgte für 2 h bei 4 °C ebenfalls mit Dynasore. Die Initialsierung der 50 3 Ergebnisse Internalisierung erfolgte für 60 min bei 37 °C. Die Zellen wurden daraufhin mit PBS gewaschen, mit 4 %-igem PFA fixiert und mit 0,1 %-igem Triton permeabilisiert. Als sekundärer Antikörper diente ein anti-rabbit-Alexa555-Antikörper. Das Einsetzten einer Internalisierung wurde mithilfe konfokaler Mikroskopie analysiert (siehe Abbildung 13). Dynasore: - 1,6 M - 1,6 M + DMSO myc-UL78 Dynasore: myc-CCR5 Abbildung 13: Inhibierung der Internalisierung von pUL78 mit dem zellpermeablen Reagenz Dynasore. Transfektion von HeLa-Zellen mittels Metafectene® Pro. Vorinkubation der Zellen mit 1,6M Dynasore für 30 min bei 4 °C. Unbehandelte Zellen dienten als Kontrolle (A und D). Zusätzlich wurden Zellen, die myc-pUL78 exprimierten mit DMSO behandelt (C). Inkubation des primären Antikörpers, der den myc-tag erkennt, für 2 h bei 4 °C in Bindungsmedium mit Dynasore. Initialisierung der Internalisierung für 60 Minuten bei 37 °C 24 h nach Transfektion. Anschließende Fixierung und Permeabilisierung der Zellen. Inkubation mit den sekundären Antikörpern Alexa488 bzw. Alexa555. Nukleäre Färbung mittels DAPI. A-F: myc-UL78; G-H: myc-CCR5. Unbehandelte Zellen, die das Fusionsprotein myc-UL78 exprimierten, zeigten eine punktförmige, intrazelluläre Verteilung von pUL78 (siehe Abbildung 13, A). Bei Einsatz von 80 und 160 µM Dynasore zeigte sich keine deutliche Veränderung der Lokalisation (nicht dargestellt). Das Fusionsprotein myc-UL78, war bei diesen Experimenten intrazellulär nachweisbar. Bei einer Konzentration von 1,6 mM, konnte Dynasore die Internalisierung von pUL78 verhindern. In Zellen, die das Fusionsprotein myc-UL78 exprimierten, konnte pUL78 nur an der Zelloberfläche detektiert werden (siehe Abbildung 13, B). 51 3 Ergebnisse Um zu überprüfen, ob das in der Dynasore-Lösung vorhandene DMSO eine Auswirkung auf die Lokalisation und die Internalisierung von pUL78 hat, wurden Zellen, die das Protein myc-UL78 exprimieren, mit DMSO in Abwesenheit von Dynasore behandelt (siehe Abbildung 13, C). Die dabei eingesetzte Menge an DMSO entsprach der Konzentration bei 1,6 M Dynasore. In den mit DMSO behandelten Zellen zeigte sich eine punktförmige, zytoplasmatische Verteilung von pUL78, wie sie in unbehandelten Zellen zu beobachten war. Es konnte auch keine Beeinträchtigung der Zellviabilität beobachtet werden. DMSO hat demnach keinen Einfluss auf die Internalisierung von pUL78. Die Auswirkung des Inhibitors Dynasore auf die Lokalisation des humanen GPCR CCR5 wurde ebenfalls analysiert. Dies wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob DMSO oder das darin gelöste Dynasore, einen Effekt auf die Lokalisation eines Rezeptors hat, der in Abwesenheit seines Liganden nicht endozytiert wird. In Abbildung 13 ist die Lokalisation von CCR5 in An- und Abwesenheit von Dynasore dargestellt (D und E). In beiden Fällen ist CCR5 an der Zelloberfläche zu finden. Auch die Zellviabilität wurde durch den Einsatz von Dynasore nicht beeinträchtigt. Dynasore und DMSO hatten somit keinen Effekt auf die Expression und Lokalisation von CCR5. Da es möglich ist, dass andere Proteine des HCMV Einfluss auf die Funktion und Lokalisation von pUL78 haben, erfolgten die durchgeführten Untersuchungen auch in infizierten Zellen. 3.1.5 Analyse der Lokalisation von pUL78 in Virus-infizierten Zellen Nachdem in transfizierten Zellen gezeigt werden konnte, dass pUL78 sowohl in Strukturen des endoplasmatischen Retikulums im Zytoplasma, als auch an der Zelloberfläche auftritt, wurde untersucht, ob pUL78 in infizierten Zellen die gleiche Verteilung aufweist. Zur Analyse der Lokalisation in infizierten Zellen wurde eine TB40E-BAC4flag-UL78 Mutante verwendet. Bei diesem Virus wurde im TB40E-BAC4 mittels „en passant”-Mutagenese UL78 N-terminal mit einem flag-tag versehen [62]. Dass die Fusionierung des tags auf das Wachstum von HCMV keinen Einfluss hat, wurde anhand einer Wachstumskinetik in der Masterarbeit von Franziska Arnold bestätigt [78]. Auch die Integrität des HCMV-Genoms wurde durch die „en passant” Mutagenese nicht beeinflusst, wie anhand einer RFLP-Analyse untersucht wurde [78]. Für die Immunofluoreszenz-Analyse wurden HFF-Zellen mit der TB40E-BAC4-flagUL78 Mutante mit einer m.o.i. von 1 infiziert und nach 48 h mit 4 %-igem PFA fixiert. Die zeitliche Expression von pUL78 wurde mit Hilfe eines Western-Blots untersucht [78]. Dabei zeigte sich, dass pUL78 nach 24 h detektierbar ist. Die Stärke der Expression nahm 48 h nach der Infektion noch deutlich zu, weshalb die Immunfluoreszenz-Analyse 52 3 Ergebnisse zu diesem Zeitpunkt durchgeführt wurde. Zum Nachweis der Infektion diente ein IE/E (immediate early/early) Antikörper-Mix, der HCMV-spezifische Proteine im Zellkern erkennt. Flag-UL78 wurde mit einem anti-flag Antikörper nachgewiesen. anti IE/E anti-flag überlagert Abbildung 14: Lokalisation von pUL78 in infizierten HFF-Zellen. Infektion von HFF mit einer TB40E-BAC4-flag-UL78 Mutante. 48 h.p.i. wurden die Zellen mittels 4 % PFA fixiert. A: Detektion der Infektion mit einem antiIE/E Antikörper (mouse). Als Sekundärantikörper diente ein anti-mouse-Alexa555Antikörper; B: Detektion von flag-UL78 mit einem gegen den flag-tag gerichteten Antikörper. Als Sekundärantikörper wurde ein anti-rabbit-Alexa488-Antikörper verwendet; C: Überlagerung von IE/E und flag-UL78. In Abbildung 14 B ist die Detektion des Fusionsproteins flag-UL78 dargestellt (grüne Signale). Hier zeigte sich eine, den Zellkern aussparende Lokalisation von pUL78. Die Überlagerung der Signale von pUL78 und IE/E verdeutlicht diese Beobachtung (siehe Abbildung 14 C). In infizierten Fibroblasten ist demnach die gleiche Lokalisation von pUL78 zu finden, wie in transfizierten Zellen. 3.1.6 Internalisierungsassay von pUL78 in infizierten Zellen Nachdem die Internalisierung von pUL78 in transfizierten Zellen gezeigt werden konnte, wurde die Endozytose von pUL78 auch in infizierten Zellen untersucht. Hierfür wurden HFF-Zellen mit der TB40E-BAC4-flag-UL78 Mutante mit einer m.o.i. von 1 infiziert. 5 Tage nach der Infektion erfolgte der Internalisierungsassay. Dieser Zeitpunkt wurde gewählt, da Franziska Arnold in ihrer Masterarbeit anhand einer Wachstumskinetik zeigen konnte, dass nach 5 Tagen die maximale Expression von pUL78 stattgefunden hat [78]. Zum Nachweis des Fusionsproteins flag-UL78, wurde ein gegen den flag-tag gerichteter Antikörper verwendet. Der Internalisierungsassay erfolgte wie bereits in Abschnitt 3.1.4 beschrieben. Damit eine Internalisierung vor dem Temperaturwechsel auf 37 °C verhindert wird, wurden die Zellen vor der Inkubation mit dem Primärantikörper für etwa 1 h auf Eis gekühlt. 53 3 Ergebnisse 37 °C: 0 min 5 min 10 min 30 min 60 min TB40E-BAC4-flag-UL78 Abbildung 15: Internalisierung von pUL78 in infizierten Zellen. Infektion mit einer TB40E-BAC4-flag-UL78 Mutante. 5 d.p.i. wurde der Internalisierungsassay durchgeführt. Die Detektion von pUL78 erfolgte mit einem gegen den flag-tag gerichteten Antikörper. Inkubation des Primärantikörpers bei 4 °C für 2 h. Anschließend erfolgte ein Temperaturwechsel auf 37 °C mit unterschiedlicher Dauer. Nach Fixierung der Zellen mit 4 %-igem PFA folgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper. Hierfür wurde ein anti-rabbit-Alexa488-Antikörper verwendet. Die aufgeführten Zeitangaben beziehen sich auf die Dauer, für die die Zellen bei 37 °C inkubiert wurden. Abbildung 15 zeigt eine ausschließliche Lokalisation des Fusionsproteins flag-UL78 an der Zelloberfläche nach 0 (A) und 5 (B) Minuten. Nach 10 Minuten (C) trat neben dieser Oberflächenlokalisation eine intrazelluläre Verteilung auf. Auch nach 30 (D) und 60 (E) Minuten, wurde pUL78 extra- und intrazellulär detektiert. In infizierten Zellen zeigte sich demnach ebenfalls eine Internalisierung von pUL78, jedoch schon nach 10 Minuten also früher als bei transfizierten Zellen, in denen eine deutliche Endozytose erst nach 30 Minuten aufgetreten ist (siehe Abbildung 8). Zusätzlich zur Analyse der Lokalisation und Internalisierung von pUL78 folgten Untersuchungen zur Aufklärung der Funktion dieses 7-TM-Proteins. Wie in Abschnitt 1.2.3 beschrieben, liegen verschiedene GPCRs als Homo- oder Heterooligomere vor, weshalb es von Interesse war, die Fähigkeit zur Oligomerisierung von pUL78 zu überprüfen. In den folgenden Abschnitten werden die Interaktionsstudien von pUL78 beschrieben. 54 3 Ergebnisse 3.2 Bimolecular Fluorescent Complementation Assay zur Analyse von Interaktionen zwischen HCMV Proteinen 3.2.1 Etablierung der Methode mit einer bekannten Interaktion (proof of principle) Die Oligomerisierung eines GPCRs kann einen erheblichen Einfluss auf dessen Funktion haben. Deshalb ist es von großem Interesse, die Fähigkeit der Homo- und Heteromerisierung von pUL78 zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde die Methode des BiFC angewendet. Diese Methode beruht auf der Fähigkeit von zwei nicht-fluoreszierenden Reporterproteinfragmenten, ihre Fluoreszenz, aufgrund der Interaktion zweier fusionierter Proteine, wieder zu erlangen. Für dieses Verfahren wurde das yellow fluorescent Protein (YFP) in zwei Fragmente gespalten, YFP1 (AS 1-158) und YFP2 (AS 159-239) [79, 80]. Ein (G4 S2 )2 -Linker zwischen den fusionierten Proteinen, erhöht die Beweglichkeit und verhindert somit die sterische Behinderung zwischen den Proteinen [79]. Zur Etablierung dieser Methode als Nachweissystem von Interaktionen von HCMV Proteinen, diente eine bereits bekannte Interaktion zwischen den HCMV-Proteinen ppUL35 und ppUL82 (pp71). Damit sollte gezeigt werden, dass es mit dieser Methode möglich ist, Interaktionen nachzuweisen. Die Interaktion der Proteine ppUL35 und ppUL82 wurde bereits mit Hilfe des Yeast-Two-Hybrid Systems nachgewiesen [81]. Zur Analyse dieser gezeigten Interaktion mittels BiFC, erfolgte die Fusion von UL35 an den N-Terminus des YFP1-Fragments und von UL82 an den N-Terminus des YFP2Fragments. Die Amplifikation der ORFs UL82 und UL35 erfolgte vom TB40E-BAC4 mit den Primern UL82-Hind III+/UL82-ClaI- und UL35-Hind III+/UL35-ClaI-(siehe 2.8). Über eine Hind III- und eine ClaI-Schnittstelle wurden die Amplifikate von UL35 und UL82 in die Vektoren MCFD2-YFP1 und MCFD2-YFP2 eingebracht, aus denen zuvor das ORF MCFD2 ausgeschnitten wurde. Restriktionsschnitte und Sequenzierungen bestätigten die korrekte Klonierung der Plasmide. Die Plasmide, die dann nur noch die ORFs für die YFP-Fragmente trugen, wurden im folgenden als Plasmide YFP1 und YFP2 bezeichnet. Zur Veranschaulichung sind die Expressionsplasmide UL35-YFP1 und UL82-YFP2, graphisch in der Abbildung 16 dargestellt. 55 3 Ergebnisse UL35-YFP1 UL82-YFP2 Abbildung 16: Graphische Darstellung der Fusionsplasmide UL35-YFP1 und UL82-YFP2. Um die Interaktion nachzuweisen, wurden Zellen mit den Expressionsplasmiden UL35YFP1und UL82-YFP2 ko-transfiziert. Nach etwa 18 h wurden die Zellen mit 4 %-igem PFA fixiert und mikroskopisch untersucht. UL35-YFP1 + UL82-YFP2 überlagert YFP Abbildung 17: BiFC von UL35 und UL82. Ko-Transfektion von COS7-Zellen mit UL35-YFP1 und UL82-YFP2. Fixierung der Zellen mit 4 %-igem PFA 18 h.p.t.. In B und D ist das entstandene YFP-Signal nach Ko-Transfektion zu sehen. Zur nukleären Färbung wurde DAPI verwendet. A und C zeigen die Überlagerungen von DAPI und dem YFP-Signal. In Abbildung 17 ist das Auftreten eines YFP-Signals nach Ko-Transfektion mit UL35YFP1 und UL82-YFP2 dargestellt. Die Signale waren punktförmig im Zellkern lo- 56 3 Ergebnisse kalisiert und bestätigen die bekannte Interaktion zwischen den Proteinen ppUL35 und ppUL82 [81]. Damit war gezeigt, dass das BiFC-System für Untersuchungen von HCMV-Protein-Protein-Interaktionen geeignet ist. Zur Überprüfung des Auftretens von falsch positiven Signalen, wurden die Plasmide YFP1 und YFP2 ohne fusionierte Proteine in COS7-Zellen ko-transfiziert. Es bestand nämlich die Möglichkeit, dass eine Komplementation der YFP-Fragmente ohne interagierende Proteine stattfinden könnte. Dies ist zwar sehr unwahrscheinlich, aufgrund der Überexpression der Fragmente in den Zellen jedoch nicht ausgeschlossen, da die Fragmente für eine Komplementation räumlich nah genug in Kontakt treten könnten. Zusammenfassend zeigten diese Versuche, dass in wenigen Zellen sehr schwache YFPSignale zu erkennen waren, die diffus über die gesamte Zelle verteilt waren und keine spezifische Lokalisation wie bei dem BiFC von ppUL82 und ppUL35 zeigte. 3.2.2 Untersuchung der Homomerisierung von pUL78 Nachdem die Funktionalität des BiFC-Verfahrens bestätigt werden konnte, erfolgten nun mit Hilfe dieser Methode Interaktionsstudien von pUL78. Zur Analyse wurde das bereits etablierte BiFC Verfahren angewendet. Es wurden zwei Fusionskonstrukte generiert: pUL78-YFP1 und pUL78-YFP2. Die Amplifikation von UL78 erfolgte aus dem TB40E-BAC4 mit den Primern UL78-Hind III+ und UL78ClaI- (siehe 2.8). Nach dem Restriktionsverdau mit den Enzymen Hind III und ClaI, wurden die Amplifikate in die Plasmide YFP1 und YFP2 kloniert. Erneut befand sich zur Erhöhung der Flexibilität ein (G4 S2 )2 -Linker zwischen den fusionierten Proteinen. Restriktionsschnitte und Sequenzierungen bestätigten die korrekte Klonierung der Plasmide. Für das BiFC-Verfahren wurden COS7-Zellen mittels Metafectene® Pro mit den generierten Expressionsplasmiden ko-transfiziert. Damit eine Komplementation der YFPFragmente nicht aufgrund der hohen Anzahl der exprimierten Proteine entstehen konnte, wurde mit relativ geringer DNA-Konzentration gearbeitet. Bei der Etablierung der Methode hat sich der Einsatz von 0,5 µg pro Plasmid als erfolgreich erwiesen. Die gleiche Konzentration wurde für die BiFC-Analyse von pUL78 eingesetzt. Nach etwa 18 Stunden wurden die Zellen fixiert und nach dem Auftreten von YFP-Signalen mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Zur Überprüfung, ob das Transfektionsreagenz und das Einbringen der DNA in die Zellen einen Einfluss auf diese hat, wurden COS7-Zellen mit dem Leerplasmid pcDNA3.1+ transfiziert (siehe Abbildung 18 AC). pcDNA3.1+ diente als Ausgangsplasmid für die Klonierung der Fusionsplasmide. Zur Negativkontrolle wurde das HCMV-Protein pUL71 eingesetzt, da zwischen diesem Tegumentprotein und pUL78 eine Interaktion bisher nicht beschrieben wurde. 57 3 Ergebnisse YFP DAPI überlagert pcDNA3.1+ YFP1 + YFP2 UL78-YFP1 + UL78-YFP2 UL78-YFP1 + UL71-YFP2 Abbildung 18: Fluoreszenzaufnahmen der BiFC-Analyse von pUL78. Transfizierte COS7-Zellen wurden 18 h.p.t. mit 4 % PFA fixiert. A-C: Transfektion mit dem Leerplasmid pcDNA3.1+ als Kontrolle. D-F: Ko-Transfektion mit YFP1 und YFP2. G-I: Ko-Transfektion mit UL78-YFP1 und UL78-YFP2. J-K: KoTransfektion von UL78-YFP1 und UL71-YFP2 als Negativkontrolle. Zur nukleären Färbung diente DAPI (B, E, H und K). A, D, G und J zeigen die entstandenen YFP-Signale. Die Überlagerung der YFP-Signale mit DAPI sind in C, F, I und L dargestellt. In den, mit dem Leerplasmid pcDNA3.1+ transfizierten COS7-Zellen, zeigten sich eine gleichmäßige Anfärbung der Zellkerne mit DAPI (Abbildung18, A-C). Das Transfektionsreagenz hatte keinen negativen Einfluss auf die Zellen. In Abbildung 18 D-F sind zur Veranschaulichung die Aufnahmen der Negativkontrolle YFP1 + YFP2 abgebildet. Erkennbar war ein sehr schwaches, diffuses Leuchten. Auch nach Transfektion der Zellen mit UL78-YFP1 + YFP2 und YFP1 + UL78-YFP2, hier nicht dargestellt, zeigten sich entweder gar keine Signale oder nur sehr schwache. Nach der Ko-Transfektion der Plasmide UL78-YFP1 und UL71-YFP2 konnten ebenfalls keine BiFC-Signale beobachtet werden (nicht dargestellt). In wenigen Zellen war ein unspezifisches Signal zu sehen, das an einer Stelle in der Zelle akkumulierte (Abbildung 18, J-L) Im Gegensatz dazu waren bei der gleichzeitigen Expression von pUL78-YFP1 und pUL78-YFP2 deutliche YFP-Signale aufgetreten (Abbildung 18 G-I). Diese Signale zeigten eine, den Zellkern aussparende, zytoplasmatische Lokalisation, wie sie bereits für pUL78 in Abschnitt 3.1.1 beschrieben wurde. 58 3 Ergebnisse Somit konnte mit Hilfe des BiFC-Verfahrens eine Homomerisierung von pUL78 nachgewiesen werden. Um dies zu bestätigen, wurde zusätzlich die Lokalisation des BiFCSignals mit der Lokalisation eines flag-UL78-Fusionsproteins verglichen. Dazu wurden Zellen mit den Plasmiden UL78-YFP1, UL78-YFP2 und flag-UL78 ko-transfiziert. Nach etwa 18 h wurden die Zellen mit 4 %-igem PFA fixiert. Das flag-UL78-Fusionsprotein wurde mit einem gegen den flag-tag gerichteten Antikörper detektiert (Abbildung 19 A). Als Sekundärantikörper wurde ein Alexa555-Antikörper verwendet. flag UL78 UL78-YFP1 + UL78-YFP2 DAPI überlagert Abbildung 19: Vergleich der Lokalisation der BiFC-Signale mit der Lokalisation von flag-UL78. COS7-Zellen wurden mit drei verschiedenen Expressionskonstrukten transfiziert. Nach 18 h erfolgte die Fixierung mit 4 %-igem PFA. A: Detektion von flag-UL78 mit einem gegen den flag-tag gerichteten Antikörper. Als Sekundärantikörper diente ein anti-rabbit-Alexa555-Antikörper, B: YFP-Signal von UL78-YFP1 + UL78-YFP2, C: DAPI, nukleäre Färbung, D: Überlagerung der Signale aus A, B und C. Die Fluoreszenzaufnahmen von flag-UL78 in Abbildung 19 A, zeigen die zytoplasmatische, den Zellkern aussparende Lokalisation, die bereits in vorherigen Experimenten aufgetreten war (siehe Abbildung 4). Nach gleichzeitiger Expression der Fusionsproteine pUL78-YFP1 und pUL78-YFP2, wurden erneut BiFC-Signale erhalten (Abbildung 19, B). Die Überlagerung der BiFC-Signale mit denen des detektierten flag-UL78Fusionsproteins verdeutlichte eine Ko-Lokalisation der hellgrünen YFP-Signale und der roten Signale für flag-UL78 (siehe Abbildung 19, C) und bestätigte somit, dass die Verteilung der YFP-Signale mit der Lokalisation der flag-UL78-Fusionsproteine übereinstimmte. Im nächsten Schritt wurde versucht, die Interaktionsdomäne in pUL78 zu bestimmen. Durch Mutation dieser Region wäre es möglich, die Interaktion zu verhindern und die daraus resultierenden Folgen zu untersuchen. 3.2.3 Analyse der Interaktionsdomäne von pUL78 Es wurden verschiedene Mutationen der putativen Interaktionsdomänen durch sitedirected Mutagenesis in die UL78-YFP-Konstrukte eingeführt. Die Mutationen (Punktmutationen und Deletionen) wurden aufgrund der von Michel et al. beschriebenen 59 3 Ergebnisse Struktur von pUL78 gewählt [42]. Zur Veranschaulichung ist in Abbildung 20 das 7TM-Protein pUL78 mit den mutierten Regionen dargestellt. Abbildung 20: Graphische Darstellung des 7-TM-Proteins pUL78. Die Regionen, die zur Analyse der Interaktionsdomäne mutiert wurden, sind blau gekennzeichnet. Der N-Terminus, der C-Terminus und der Transmembranbereich wurden komplett deletiert. Ebenso die AS-Bereiche 232-242 und 299-310. Durch Punktmutationen wurden mögliche relevante Cysteine durch andere AS ausgetauscht. Des weiteren wurden die putative Internalisierungs- und Proteinsortingdomäne EKATL, die putative G-Proteinbindestelle DRL, die Glykolisierungsstelle und die Phosphorylierungsstelle, mutiert. Für GPCRs sind verschiedene Regionen bekannt, die für die Oligomerisierung dieser 7-TM-Proteine verantwortlich sind. Zwischen den Cysteinen an Stelle 109 und 187, befindet sich eine putative Disulfidbrücke (siehe Abbildung 20). Da bei Dimerisierungen möglicherweise Disulfidbrücken und nicht-kovalente Bindungen involviert sind [82] wurde der Austausch von Cystein gegen Serin an AS-Postion 187 von Franziska Arnold vorgenommen und in dieser Arbeit erneut untersucht. Zusätzlich wurden die Deletionen delTD, del232-242 und del299-310 untersucht. Sowie die Mutanten delN (Deletion des N-Terminus) und delC (Deletion des C-Terminus). 60 3 Ergebnisse Als extreme Deletion wurde der komplette Transmembranbereich von pUL78 deletiert. Die Klonierung setzte sich aus zwei Amplifikationen zusammen. Ein Amplifikat wurde mit den Primern UL78-Hind III+ und UL78-delTD- (siehe 2.8) aus TB40E-BAC4 generiert. Eine weitere Amplifikation erfolgte mit den Primern UL78-ClaI- und UL78delTD aus TB40E-BAC4. Diese beiden Amplifikate wurden in einer weiteren PCR mit Hilfe der Primer UL78-Hind III+ und UL78-ClaI- zu einem Amplifikat vereinigt und nach Restriktionsverdau in die Plasmide YFP1 und YFP2 kloniert (siehe 2.7). Dass Transmembrandomänen eine Rolle bei der Oligomerisierung von GPCRs spielen, zeigten bereits verschiedene Gruppen [83, 84, 85]. Dadurch kann untersucht werden, ob sich die Interaktionsdomäne in diesem Bereich befindet, um anschließend die Region weiter einzugrenzen. Die Deletion der AS 232-242 wurde, da sich an AS-Position 237 ein Cystein befindet, das im Transmembranbereich liegt. Deletiert wurde die gesamte Region 232-242, um mögliche Auswirkungen benachbarter Aminosäuren zu untersuchen. Die Generierung der Deletion erfolgte erneut durch zwei Amplifikate. Ein Amplifikat wurde mit den Primern UL78-Hind III+ und UL78-del232-242- aus TB40E-BAC4 generiert (siehe 2.8). Eine weitere Amplifikation wurde mit den Primern UL78-ClaI- und UL78del232-242+ durchgeführt. Die beiden Fragmente wurden mit Hilfe der Primer UL78-Hind III+ und UL78-ClaI- in einer weiteren PCR zu einem Amplifikat vereinigt und in die Vektoren YFP1 und YFP2 (siehe 2.7) nach Restriktionsverdau kloniert. Die generierten Plasmide wurden mit Hilfe von Restriktionsschnitten und Sequenzierungen kontrolliert und anschließend für die BiFC-Analyse eingesetzt. Die Deletion del299-310 wurde gewählt, weil sich an Stelle 305 im C-terminalen Bereich eine putative Phosphorylierungsstelle, die durch eine Tyrosinkinase phosphoryliert wird, befindet. Die Phosphorylierung eines GPCRs führt zur Internalisierung und dient somit der Regulierung. Die Deletion erfolgte durch die Amplifikation zweier UL78Bereiche. Ein Amplifikat wurde mit den Primern UL78-Hind III+ und UL78-del299310- aus TB40E-BAC4 generiert (siehe 2.8). Die weitere Amplifikation erfolgte mit den Primern UL78-ClaI- und UL78-del299-310+. Zur Vereinigung der beiden Amplifikate erfolgte eine PCR mit den Primern UL78-Hind III+ und UL78-ClaI-. Dieses Amplifikat wurde in die Plasmide YFP1 und YFP2 kloniert (siehe 2.7). Restriktionsschnitte und Sequenzierungen bestätigten die korrekte Klonierung der Plasmide. Die Mutationen wurden hinsichtlich einer Veränderung des BiFC-Signals untersucht. Eine Änderung wurde definiert als modifizierte Verteilung des YFP-Signals, eine reduzierte Signalstärke, oder ein völliges Ausbleiben des Leuchtens. Die BiFC-Analysen der verschiedenen Mutanten sind in Abbildung 21 dargestellt. 61 3 Ergebnisse DAPI überlagert delTD del299-310 del232-242 C187S YFP Abbildung 21: Bestimmung der Interaktionsdomäne von pUL78 mit Hilfe des BiFC-Verfahrens. Ko-Transfektion von COS7-Zellen mittels Metafectene® Pro. Fixierung der Zellen etwa 18 h nach Transfektion. Nukleäre Färbung durch DAPI (B, E, H, K und N). Die UL78-Mutanten wurden jeweils mit YFP1 und YFP2 fusioniert und ko-transfiziert. Die aufgetretenen YFP-Signale sind in A, D, G, J und M aufgeführt. In C, F, I, L und O sind die Überlagerungen der YFP- und DAPI-Signale zu finden. Nach dem Austausch der AS Cystein gegen Serin an Postion 187 von pUL78, zeigte sich bei dem BiFC-Verfahren ein deutliches YFP-Signal (siehe Abbildung 21 A-C). Die erhaltenen Signale wiesen eine andere Verteilung auf, wie sie sonst für pUL78 üblich ist (siehe Abbildung 18 G-L). Das BiFC-Signal der Homomerisierung des Wildtyps ist über die gesamte Zelle verteilt, wobei der Zellkern ausgespart ist. Bei der Mutante C187S zeigte sich hingegen eine ringförmige Anordnung um den Zellkern. Bei den Deletionen der Aminosäuren 232-242 (Abbildung 21 D-F) und 299-310 (Abbildung 21 G-I) von pUL78, konnten in dem BiFC-Assay YFP-Signale nachgewiesen werden. Diese Signale zeigten die typische Lokalisation von pUL78. Die Signale waren gleichmäßig im Zytoplasma verteilt und wiesen keine Akkumulation auf. Dies zeig- 62 3 Ergebnisse te, dass die Homomerisierung von pUL78 durch das Fehlen dieser Aminosäuren nicht beeinträchtigt wird. Nach Deletion des gesamten Transmembranbereichs (siehe Abbildung 21, J-L) sind ebenfalls ein YFP-Signale aufgetreten, die jedoch nur an einer Stelle in der Zelle akkumulierten. Die typische Lokalisation von pUL78 war nicht aufgetreten. Diese Akkumulation trat nur bei wenigen Zellen auf. Bei vielen untersuchten Zellen war es nicht möglich, ein Signal zu detektieren. Zur Veranschaulichung sind in der Tabelle 2 die Mutationen dargestellt, die in dieser Arbeit und in Zusammenarbeit mit Franziska Arnold analysiert wurden. Mutation delC delN EKATL DRL-EHP N105Q C109S C252S CxxxC C187S del232-242 del299-310 delTD Beschreibung Deletion des C-terminalen Bereichs Deletion des N-terminalen Bereichs putative Internalisierungs- und Proteinsortingdomäne putative G-Protein Bindestelle putative Glykosylierungsstelle Cystein im N-terminalen Bereich Cystein im Transmembranbereich Cysteine im C-terminalen Bereich kompletten Transmembrandomäne Austausch von Cystein im Transmembranbereich Deletion der AS 232-242 Deletion der AS 299-310 Deletion der kompletten Transmembrandomäne Intensität des BiFC-Signals +++ +++ +++ ++ + + (+) ++ +(+) + + (+) + + (+) +++ +++ (+) Tabelle 2: Analysierte Mutationen von pUL78 zur Bestimmung der Interaktionsdomäne. Die Intensität des aufgetretenen YFP-Signals wird durch das Symbol + beschrieben, wobei + + + das stärkste und + das schwächste Signal darstellen. Befindet sich ein Signal zwischen zwei Intensitäten, wird dies durch eine Klammer deutlich gemacht. Von den untersuchten Mutationen zeigte nur die Deletion der gesamten Transmembrandomäne ein Ausbleiben des BiFC-Signals. Bei der Mutation C187S wiesen die Signale eine leicht veränderte Lokalisation auf. 3.2.4 Untersuchungen zur Heteromerisierung von pUL78 und weiteren putativen GPCRs aus HCMV Es sollte aufgeklärt werden, ob pUL78 auch mit anderen GPCR Homologen aus HCMV Oligomere, so genannte Heterooligomere, bildet. Zur Analyse dieser Heteromerisierung wurde erneut das BiFC-Verfahren gewählt. Zunächst wurden hierfür die folgenden Plas- 63 3 Ergebnisse mide kloniert: US27-YFP1, US27-YFP2, US28-YFP1, US28-YFP2, UL33-YFP1 und UL33-YFP2. Nach Bestätigung der erfolgreichen Klonierungen mittels Restriktionsschnitten und Sequenzierungen, erfolgte eine Ko-Transfektion dieser Konstrukte mit den Expressionsplasmiden UL78-YFP1 bzw. UL78-YFP2. Exemplarisch sind einige Ergebnisse in Abbildung 22 dargestellt. YFP DAPI überlagert UL78-YFP1 + US28-YFP2 UL78-YFP1 + US27-YFP2 UL78-YFP2 + UL33-YFP1 Abbildung 22: Fluoreszenzaufnahmen der Analyse der Heteromerisierung von pUL78 mit anderen GPCR Homologen des HCMV in transfizierten Zellen. COS7-Zellen wurden 18 h nach Ko-Transfektion mit 4 %-igem PFA fixiert. A-C: UL78-YFP1 + US28-YFP2, D-F: UL78-YFP1 + US27-YFP2, G-I: UL78-YFP2 + UL33-YFP1. Die BiFC-Signale sind in A, D und G dargestellt. Die nukleäre Färbung erfolgte mit DAPI und ist in B, E und H zu sehen. C, F und I stellen die Überlagerung der BiFC- und der DAPI-Signale dar. Bei einer Ko-Expression von pUL78-YFP1 und pUS28-YFP2, waren durch Rekonstitution der beiden YFP-Fragmente deutliche YFP-Signale aufgetreten (siehe Abbildung 18 A-C). Die durch Interaktion von pUL78 und pUS28 entstandene YFP-Signale, waren im Zytoplasma verteilt, wobei im Zellkern keine Interaktion zu erkennen war (C). Auch bei gleichzeitiger Expression von pUL78 und pUS27, zeigten sich YFP-Signale, die die eben beschriebene Lokalisation aufwies, allerdings waren starke Akkumulationen erkennbar (D-F). Zusätzlich wurde noch untersucht, ob pUL78 mit dem putativen 7-TM-Protein pUL33 interagiert. Nach Ko-Expression der Fusionsproteine pUL78-YFP2 und pUL33- 64 3 Ergebnisse YFP1 (siehe Abbildung 18 G-I), konnte eine Rekomplementation der YFP-Fragmente durch die aufgetretenen Signale nachgewiesen werden. Diese Signale wiesen jedoch Akkumulationen auf. Bei der Ko-Expression von pUL78-YFP1 und pUL33-YFP2 konnten keine YFP-Signale detektiert werden (nicht dargestellt). Mit Hilfe des BiFC-Verfahren konnte somit gezeigt werden, dass pUL78 neben der Bildung von Homooligomeren auch mit dem GPCR Homolog pUS28 interagiert und möglicherweise Heterooligomere bildet. Eine Interaktion mit pUS27 und pUL33 konnte nicht sicher nachgewiesen werden. 3.3 Ko-Immunopräzipitationen zur Bestätigung der Interaktionen des 7-TM-Proteins pUL78 3.3.1 Homomerisierung von pUL78 Zur Bestätigung der gezeigten Homomerisierung von pUL78 anhand des BiFC-Verfahrens (Abschnitt 3.2.2), wurde eine weitere Methode zur Bestimmung von Protein-ProteinInteraktionen, die Ko-Immunopräzipitation, angewandt. Transfiziert wurden die Plasmide myc-UL78 und flag-UL78 jeweils alleine, oder in Kombination. Zur Kontrolle wurden die Zellen mit dem Leerplasmid pcDNA3.1+ (mock) transfiziert. Die erfolgreiche Expression der Proteine wurde in Lysaten, vor der Ko-Immunopräzipitation, kontrolliert. Die Western-Blots der Ko-Immunopräzipitation und der Lysatkontrollen, sind in Abbildung 23 dargestellt. Abbildung 23: Ko-Immunopräzipitation zum Nachweis der Homomerisierung von pUL78 in transfizierten Zellen. A: Western-Blot nach Ko-Immunopräzipitation mit einem gegen den myc-tag gerichteten Antikörper. Detektion der präzipitierten Proteine mit einem Antikörper, der den flag-tag erkennt. B: Western-Blot der Lysatkontrollen vor der KoImmunopräzipitation. Detektion mit eigen gegen den flag-tag gerichteten Antikörper. 65 3 Ergebnisse Die erwartete Größe von myc-UL78 und flag-UL78 liegt bei ca. 47 kDa. In Abbildung 23 A, ist eine Bande in der erwarteten Größe für flag-UL78 bei der Ko-Expression von mycUL78 und flag-UL78 aufgetreten (Spur 4). Zusätzlich sind in dieser Spur eine weitere Bande bei etwa 100 kDa und eine Bande, die größer als 130 kDa ist, aufgetreten. Hierbei könnte es sich um Multimere des pUL78 handeln. Bei der Expression von pcDNA3.1+, myc-UL78 und flag-UL78 alleine (Spur 1, 2 und 3), waren keine Banden zu erkennen. Der Western-Blot der Lysatkontrolle (Abbildung 23 B), bestätigte die Expression von flag-UL78. Bei der Expression von flag-UL78 alleine (Spur 2) und der Ko-Expression von flag-UL78 mit myc-UL78 (Spur 3), war jeweils eine Bande in der erwarteten Größe aufgetreten. Die Kontrolle mit dem Leerplasmid pcDNA3.1+ zeigte keine spezifischen Banden in Spur 1. Die Homomerisierung konnte, zusätzlich zu dem BiFC-Verfahren, ebenfalls mit der Methode der Ko-Immunopräzipitation bestätigt werden. Das Verfahren der Ko-Immunopräzipitation sollte nun auch zum Nachweis der Heteromerisierung von pUL78 und pUS28 dienen. 3.3.2 Heteromerisierung von pUL78 und pUS28 Zur Analyse der Interaktion zwischen pUL78 und pUS28, wurden die Zellen mit den Plasmiden myc-UL78 und flag-US28 ko-transfiziert. Die Western-Blots der Ko-Immunopräzipitation und der Lysatkontrollen, sind in Abbildung 24 dargestellt. Die Ko-Immunopräzipitation erfolgte mit an Sepharose gebundenen myc-Antikörpern, die zur Bindung von myc-UL78 und möglichen interagierenden Proteine führen sollen. Der Western-Blot zur Detektion der ko-präzipitierten Proteine, in diesem Fall flag-US28, wurde mit einem gegen den flag-tag gerichteten Antikörper durchgeführt. Die Kontrolle der Expression der Lysate erfolgte mit Antikörpern, die den flag- bzw. den myc-tag erkennen. 66 3 Ergebnisse Abbildung 24: Ko-Immunopräzipitation zum Nachweis der Heteromerisierung von pUL78 und pUS28 in transfizierten Zellen. Dargestellt sind die Western-Blots der Ko-Immunopräzipitation (A) und der Lysatkontrollen (B und C). 48 h.p.t. erfolgte die Ko-Immunopräzipitation mit einem gegen den myc-tag gerichteten Antikörper, zur Bindung von myc-UL78. Die Lysatkontrollen wurden vor der Ko-Immunopräzipitation abgenommen. A: Western-Blot nach Ko-Immunopräzipitation, Detektion der ko-präzipitierten Proteine mit einem Antikörper, der den flag-tag erkennt; B: Western-Blot der Lysat-Kontrolle mit einem gegen den flag-tag gerichteten Antikörper; C: Western-Blot der Lysatkontrolle mit einem Antikörper, der den myc-tag erkennt. Die korrekte Expression der Fusionsproteine myc-UL78 und flag-US28, konnte anhand der Lysatkontrollen in Abbildung 24 B und C gezeigt werden. Die erwartete Größe von myc-UL78 betrug 47 kDa. Eine Bande dieser Größe, konnte nach Einzeltransfektion von myc-UL78 und nach Doppeltransfektion von myc-UL78 und flag-US28 detektiert werden. Spur 2 (myc-UL78) und Spur 3 (myc-UL78 + flag-US28) des Western-Blots in Abbildung 24 C, zeigten die erwartete Bande. Die korrekte Expression von pUS28 wurde anhand der Abbildung 24 B belegt. Das Protein flag-US28 hatte erwartungsgemäß eine Größe von etwa 37 kDa. Diese Bande konnte bei der Expression von flag-US28 alleine (Spur 2) und bei der gemeinsamen Expression von flag-US28 und myc-UL78 nachgewiesen werden. In den mit dem Leerplasmid pcDNA3.1+ transfizierten Zellen (Spur 1 der WesternBlots B und C), konnte mit Antikörpern, die den flag- bzw. den myc-tag erkennen, kein Signal detektiert werden. Der Nachweis von myc-UL78 und flag-US28 ist demnach spezifisch. Nach der Ko-Immunopräzipitation (Abbildung 24, A) mit einem gegen den myc-tag gerichteten Antikörper, zeigte sich eine Bande bei der Ko-Expression von myc-UL78 und flag-US28 (Spur 4). Dieser Western-Blot erfolgte mit einem gegen den flag-tag gerichteten Antikörper. Die Präzipitation von flag-US28 durch myc-UL78, kann dadurch bestätigt werden. In Zellen, in denen flag-US28 in Abwesenheit von myc-UL78 67 3 Ergebnisse exprimiert wird, war es nicht möglich pUS28 nach der Ko-Immunopräzipitation nachzuweisen (Spur 3). Mit einem Antikörper, der den flag-tag erkennt, wurde myc-UL78 erwartungsgemäß nicht detektiert (Spur 2). Auch bei der Negativkontrolle pcDNA3.1+, waren keine Banden aufgetreten (Spur 1). Mit Hilfe der Ko-Immunopräzipitation konnte die Heteromerisierung von pUL78 und pUS28 ebenfalls bestätigt werden. Die Bestätigung der Interaktion von pUL78 mit den GPCR Homologen pUL33 und pUS27, konnte mit der Methode der Ko-Immunopräzipitation bisher nicht erfolgen (Daten nicht dargestellt). 3.4 Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung des UL78-Proteins 3.4.1 Einfluss von pUL78 auf die Induktion von Inositoltriphosphat (IP3) durch pUS28 Bisher konnte gezeigt werden, dass die konstitutive Signalweiterleitung von pUS28 zur Induktion der Phospholipase C führt, wodurch Inositoltriphosphat in HCMV-infizierten Zellen generiert wird [28, 30]. Dies könnte ein Anhaltspunkt für die Funktion der Heteromerisierung darstellen. Es wurde untersucht, ob die Interaktion von pUL78 mit pUS28 einen Einfluss auf die Synthese von Inositoltriphosphat hat und hierfür die Inositoltriphosphat Akkumulation in transfizierten COS7-Zellen gemessen. Diese Messung erfolgte über eine radioaktive Markierung mit myo-[2-3 H]inositol. Dazu wurden COS7-Zellen transfiziert. Zur IP3-Messung wurden die in dieser Arbeit hergestellten BiFC-Plasmide genutzt. In Abbildung 25 sind die erhaltenen Messdaten dargestellt. 68 3 Ergebnisse Abbildung 25: Messung der Inositoltriphosphat-Akkumulation in transfizierten COS7-Zellen. Zellen wurden mit je einem Plasmid transfiziert (schwarze Balken) oder mit zweien ko-transfiziert (gestreifte Balken). Die Messung der Inositoltriphosphat-Synthese erfolgte durch radioaktive Markierung mit myo-[2-3 H]inositol. Als Negativkontrolle wurden Zellen mit dem Leerplasmid pcDNA3.1+ transfiziert. Das Plc-B-Rac-Plasmid diente als Positivkontrolle für die Initialisierung der Inositoltriphosphat Synthese [69] und wurde freundlicherweise von Dr. Walliser (Universität Ulm) zur Verfügung gestellt. Abbildung 25 zeigt, dass in Zellen, die pUS28 exprimieren, ein deutlicher Anstieg der IP3-Synthese zu verzeichnen war. Bei zusätzlicher Expression von pUL78 (US28-YFP2 + UL78-YFP1 und US28-YFP1 + UL78-YFP2), ergab sich eine vergleichbar hoher IP3-Gehalt. Ein deutlich niedrigeres Niveau ist in Zellen aufgetreten, in denen nur pUL78 exprimiert wurde. Ein Anstieg der Bildung von IP3 wurde demnach nur durch pUS28 hervorgerufen. pUL78 zeigte keinen Einfluss auf die IP3-Synthese. Es sind weitere Untersuchungen nötig, um die Funktion dieser Hetereooligomerisierung zu bestimmen. 3.4.2 Einfluss des 7-TM-Proteins pUL78 auf die virale Replikation in Fibroblasten und Epithelzellen Obwohl pUL78 in klinischen Isolaten konserviert ist, zeigt die Deletion von pUL78 keinen Einfluss auf die Replikation von HCMV in Fibroblasten oder in OrgankulturSystemen [42]. Im Gegensatz dazu weisen Deletionsmutanten von pM78 und pR78 69 3 Ergebnisse eine signifikante Abschwächung der Replikation in vivo auf [43, 44]. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit eine Stopmutante, ausgehend von dem TB40E-BAC4, das einen hohen Zelltropismus aufweist, generiert werden. Dabei handelt es sich um ein auf Endothelzellen passagiertes klinisches Isolat (TB40E), das als BAC kloniert wurde [61]. TB40E-BAC4 ist hoch endotheliotrop und komplett sequenziert [61]. Mit Hilfe der „en passant“-Mutagenese [1] wurde eine Stop-Codon an Aminosäurenstelle 47 der kodierenden Region von pUL78 eingebracht. Zur Charakterisierung der Mutante TB40E-BAC4-UL78aa47stop auf genomischer Ebene, erfolgten Restriktions-FragmentLängen-Polymorphismus-Analysen. Hierbei wurde die Integrität des BACs der StopMutante im Vergleich zum Wildtyp-BAC, mittels Restriktionsschnitten mit den Enzymen BamHI und Hind III, überprüft. Der Austausch der AS Phenylalanin (TTC) gegen das Stopcodon TAA, hatte keinen Einfluss auf die Restriktionsschnittstellen. Es sollte demnach kein Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus durch die Mutagenese aufgetreten sein. In Abbildung 26 sind die Restriktionsschnitte des Wildtyps und der Mutante zu sehen. Abbildung 26: Analyse des Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus der generierten TB40E-BAC4UL78aa47stop Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Restriktionsschnitte des Wildtyps und zweier Klone der Mutante mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII. Die elektrophoretische Auftrennung der Proben erfolgte mit Hilfe eines 0,6 %-igem Agarosegel ü.N. 1: TB40E-BAC4 2: TB40E-BAC4-UL78aa47stop (Klon 1) 3: TB40E-BAC4-UL78aa47stop (Klon 2) 70 3 Ergebnisse Die Restriktionsschnitte des Wildtyps und der Mutante (2 Klone), wiesen erwartungsgemäß keine Unterschiede auf (siehe Abbildung 26). Die Position und die Anzahl der Restriktionsschnittstellen wurden demnach durch die Mutagenese nicht beeinflusst. Zusätzlich wurde das Vorhandensein der eingeführten Mutation durch Sequenzierung bestätigt (siehe Abbildung 27). Abbildung 27: Sequenzierung der TB40E-BAC4-UL78aa47stop-Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Amplifizierung der zu sequenzierenden Region mit den Primern UL78p112753 und UL78intern500M. Die Sequenzierung erfolgte anhand des Primers UL78_delta_test. Nach erfolgreicher RFLP-Analyse und der Bestätigung der eingebrachten Mutation durch Sequenzierung, konnte die Mutante für Wachstumsversuche eingesetzt werden. Mit der TB40E-BAC4-UL78aa47stop Mutante wurden Wachstumskinetiken in Fibroblasten und Epithelzellen im Vergleich zu dem TB40E-BAC4 Wildtyp erstellt. Hierfür wurden die Zellen mit einer m.o.i. von 0,1 und 1 mit TB40E-BAC4 und TB40E-BAC4UL78aa47stop infiziert. Die Produktion infektiöser Partikel im Überstand wurde über 12 Tage in einem Doppelansatz ermittelt. In den Abbildungen 28 und 29 sind die erhaltenen Werte grafisch dargestellt. 71 3 Ergebnisse A B Abbildung 28: Einfluss der Mutation von pUL78 auf die virale Replikation in Fibroblasten und Epithelzellen (m.o.i. 1). Infektion von Fibroblasten (HFF) und Epithelzellen (RPE-1) mit TB40E-BAC4 und TB40E-BAC4UL78aa47stop mit m.o.i. 1. Die Titer der eingesetzten Virusstocks wurden durch eine Rücktitration bestimmt (Tag 0). Die Abnahme der Überstände erfolgte über 12 Tage alle 3 Tage (angegeben in d.p.i (days post infection)). Die Anzahl der darin enthaltenen infektiösen Viruspartikel sind in p.f.u. (plaque forming units) pro ml angegeben. A: Wachstumskinetik in Fibroblasten, m.o.i. 1 B: Wachstumskinetik in Epithelzellen, m.o.i. 1 In Fibroblasten konnte kein deutlicher Unterschied zwischen TB40E-BAC4 und TB40EBAC4-UL78aa47stop beobachtet werden (siehe Abbildung 28 A). 3 und 6 Tage nach der Infektion zeigte die Stopmutante eine geringen Wachstumsnachteil. Der Anfangstiter der Mutante lag aber ebenfalls etwas unter dem Titer des Wildtyps. 9 und 12 Tage nach der Infektion war kein Wachstumsunterschied mehr zwischen dem Wildtyp und 72 3 Ergebnisse der Mutante zu erkennen. Im Gegensatz dazu, zeigte sich ein deutlicher Unterschied in der Produktion infektiöser Viruspartikel im Überstand infizierter Epithelzellen (siehe Abbildung 28 B). Im Vergleich zu den Fibroblasten, konnte bei der Mutante und dem Wildtyp ein deutlich vermindertes Wachstum in Epithelzellen beobachtet werden. A B Abbildung 29: Einfluss der Mutation von pUL78 auf die virale Replikation in Fibroblasten und Epithelzellen (m.o.i. 0,1). Infektion von Fibroblasten (HFF) und Epithelzellen (RPE-1) mit TB40E-BAC4 und TB40E-BAC4UL78aa47stop mit m.o.i. 0.1. Die Titer der eingesetzten Virusstocks wurden durch eine Rücktitration bestimmt (Tag 0). Die Abnahme der Überstände erfolgte über 12 Tage alle 3 Tage (angegeben in d.p.i (days post infection)). Die Anzahl der darin enthaltenen infektiösen Viruspartikel sind in p.f.u. (plaque forming units) pro ml angegeben. A: Wachstumskinetik in Fibroblasten, m.o.i. 0,1 B: Wachstumskinetik in Epithelzellen, m.o.i. 0,1 73 3 Ergebnisse In der low -m.o.i.-Wachstumskinetik zeigte sich in Fibroblasten ebenfalls kein deutlicher Unterschied zwischen Wildtyp und Mutante (siehe Abbildung 29 A). In Epithelzellen trat erneut ein deutlicher Wachstumsdefekt der Stop-Mutante im Vergleich zum Wildtyp auf (siehe Abbildung 28 B). Das Wachstumsverhalten der Stop-Mutante (TB40E-BAC4-UL78aa47stop) entsprach in Fibroblasten dem des Wildtyps (TB40E-BAC4). Dass pUL78 in Fibroblasten keinen Einfluss auf die Virusreplikation hat, wurde ebenfalls von Michel et al. mit einer Deletionsmutante, ausgehend von dem Laborstamm AD169, erwiesen [42]. Im Gegensatz dazu zeigte die Stopmutante in der vorliegenden Arbeit einen Wachstumsdefekt in Epithelzellen im Vergleich zum Wildtyp. Das 7-TMProtein hat somit einen Einfluss auf den Replikationszyklus in Epithelzellen. 74 4 Diskussion 4 Diskussion Zur Behandlung von Erkrankungen durch das humane Zytomegalievirus werden zurzeit vier verschiedene Medikamente eingesetzt: Ganciclovir, Valganciclovir, Foscarnet und Cidofovir [9]. Diese Medikamente weisen verschiedene Limitationen auf, wie beispielsweise mangelnde orale Bioverfügbarkeit, Resistenzentwicklung, Toxizität und das Auftreten von Nebenwirkungen. Ein weitere Nachteil ist, dass keines dieser Medikamente zur Behandlung kongenitaler Infektionen zugelassen ist [9]. Allen Substanzen gemeinsam ist, dass sie als Zielprotein die virale DNA-Polymerase pUL54 haben. Deshalb ist es wichtig, andere Proteine des Zytomegalievirus zu finden, die als potentielle Angriffspunkte dienen können. Das humane Zytomegalievirus kodiert vier putative GPCRs: pUS27, pUS28, pUL78 und pUL33 [21, 22]. Die Aufklärung der Rolle dieser 7-TM-Proteine ist von großer Bedeutung, da sie potentielle Angriffspunkte für Medikamente zur Behandlung einer HCMV-Infektion darstellen könnten. pUS28 der am Besten untersuchte putative GPCR von HCMV, weist Homologien zu den humanen CC-Chemokinrezeptoren auf [26] und bindet verschiedenen Chemokine [33, 24, 25]. Für die anderen 7-TM-Rezeptoren von HCMV, sind bisher keine Liganden bekannt [86, 87]. Subzelluläre Lokalisation des pUL78 Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung des orphan GPCR-homologen Proteins pUL78, über das bisher wenig bekannt ist. Zunächst wurde die Lokalisation von pUL78 analysiert. Von Interesse war hierbei die intrazelluläre Verteilung und die Überprüfung, ob pUL78 auch auf der Zelloberfläche zu finden ist. Für eine optimale Signalweiterleitung von GPCRs, ist eine Lokalisation in der Zellmembran entscheidend. Da keine kommerziellen Antikörper gegen pUL78 zur Verfügung standen, wurden für die meisten durchgeführten Untersuchungen Fusionsproteine benutzt, bei denen das UL78-Protein einen tag trägt, über den das Protein nachweisbar ist. Um einen Einfluss des tags auf die subzellulären Lokalisation von pUL78 auszuschließen, wurden C- und N-terminal fusionierte tags angewandt. Es konnte beobachtet werden, dass das pUL78 in transfizierten Zellen eine zytoplasmatische, den Zellkern aussparende Lokalisation aufwies, unabhängig von der Art und der Fusionsstelle der verwendeten tags (siehe Abbildung 4). Die beobachtete Lokalisation zeigte sich auch in infizierten HFF-Zellen, 48 h nach der Infektion mit einer TB40E-BAC4-flag-UL78 Mutante, die ebenfalls für eine getaggtes UL78-Fusionsprotein kodiert (siehe Abbildung 14). 75 4 Diskussion Um die beobachtete zytoplasmatische Verteilung von pUL78 auf subzellulärer Ebene eingehender zu untersuchen, wurde die Lokalisation mit verschiedenen zellulären Markerproteinen in transfizierten Zellen verglichen (siehe Abbildung 5). Eine deutliche Ko-Lokalisation zeigte sich mit dem zellulären Protein Calreticulin, das als Marker für das ER diente. Das Verlassen des ER ist ein wichtiger Schritt in der Biosynthese der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, da damit die Expression an der Zelloberfläche kontrolliert wird [88]. Eine Lokalisation im endoplasmatischen Retikulum, könnte ein Hinweis darauf sein, dass pUL78 nach der Transkription nicht richtig gefaltet wird und im ER festgehalten wird, weil das interne ER-Qualitätssystem einen weiteren Transport verhindert. Eine partielle Ko-Lokalisation zeigte sich auch mit dem zellulären Protein γ-Adaptin, das für den trans-Golgi-Apparat einen Marker darstellt. Der trans-Golgi Bereich ist von der Orientierung dem ER ab- und der Zellmembran zugewandt. Diese Region besteht aus einem Netzwerk aus Membranen und assoziierten Vesikeln [89]. Proteine gelangen, nachdem ihre korrekte Faltung im ER überprüft wurde, zur Modifizierung in den Golgi-Apparat. Dort werden sie anschließend in Vesikeln verpackt und zu ihrem Zielort transportiert [89]. Die teilweise aufgetretene Ko-Lokalisation mit γ-Adaptin könnte bedeuten, dass pUL78 doch das ER in Richtung Golgi-Apparat verlassen kann und würde sich so einen Schritt weiter im Reifungsprozess befinden. Auch mit dem endosomalen Marker EEA-1, zeigte sich eine geringe Ko-Lokalisation. Für die weiteren putativen GPCRs von HCMV, pUS27, pUS28 und pUL33 konnte bereits nachgewiesen werden, dass diese in Endosomen lokalisiert sind [27, 29]. Weitere Versuche zeigten, dass pUL78 neben der intrazellulären Lokalisation, auch auf der Zelloberfläche zu finden ist (siehe Abbildung 7), was typisch für GPCRs ist und ihrer Funktion entspricht. Auch für pUS28 und den humanen GPCR CCR5, konnte in dieser Arbeit eine partielle Oberflächenexpression beobachtet werden. Die Oberflächenlokalisation von pUS28 konnte bereits nachgewiesen werden [27, 29]. Jedoch lokalisiert pUS28 nur zu einem geringen Anteil an der Zelloberfläche und ist überwiegend in Endosomen zu finden [27, 29]. Dies scheint auch für pUL78 so zu sein. Zur Regulierung der Aktivität von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, gibt es verschiedene Möglichkeiten. Auf eine anhaltende Stimulierung des Rezeptors, wird die Rezeptoraktivität durch Desensibilisierung nach unten reguliert. Dies geschieht durch eine Verhinderung der Interaktion zwischen dem GPCR und dem G-Protein, oder durch Internalisierung des Rezeptors über Endozytose [90]. Diese beiden Prozesse laufen über Phosphorylierung durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs), oder durch Proteinkinasen, die durch G-Protein vermittelte Produktion von second messenger aktiviert werden. Die Internalisierung von viralen GPCRs kann dem Abfangen von zellulären Chemokinen dienen, die ins Zellinnere transportiert werden und so den zellulären 76 4 Diskussion GPCRs nicht mehr zur Verfügung stehen. Dadurch können Viren einen Einfluss auf das Immunsystem nehmen und dieses manipulieren. Für pUL78 ist bisher nicht bekannt, ob es Chemokine bindet oder konstitutiv aktiv ist. Für den homologen GPCR pUS28 wird angenommen, dass dieser immunmodulatorische Chemokine bindet, um sie der Zelle zu entziehen [27, 28]. Dafür spricht, dass pUS28 fast ausschließlich in Endosomen zu finden und nur in geringen Maße an der Zelloberfläche lokalisiert ist [27, 29]. Es konnte auch gezeigt werden, dass pU28 konstitutiv internalisiert wird und das die Endozytose über clathrin-coated pits verläuft, aber unabhängig von β-Arrestinen stattfindet [91]. Es gibt mehrere Rezeptoren, die über einen alternativen Weg internalisiert werden. Beispielsweise über die Bildung von Caveolae [92, 93]. Nur etwa 20 % des exprimierten pUS28 befinden sich an der Zelloberfläche, der Großteil ist intrazellulär in Endosomen enthalten [94]. Bei einem weiteren orphan-Rezeptor des HCMV, pUL33, konnte eine konstitutive Aktivität nachgewiesen werden, die zur Inositolphosphat Akkumulation über die Bindung von Gαq- und Gαi/o-Proteinen führt [33, 36]. Internalisierung des pUL78 Die vorliegenden Arbeit belegt, dass pUL78 von der Zelloberfläche in das Zellinnere transportiert werden kann. Doch unklar bleibt, welche Funktion pUL78 an der Zelloberfläche hat und warum die Internalisierung stattfindet. Um einen Hinweis auf die Rolle der Internalisierung zu bekommen, wurde mit Hilfe des Markerproteins EEA-1 überprüft, ob pUL78 nach dem Transport ins Zellinnere in frühen Endosomen vorliegt. Das 7TM-Protein pUL78 zeigte eine deutliche Ko-Lokalisation mit EEA-1 (siehe Abbildung 9 und 10). Die Internalisierung von GPCRs erfolgt in der Regel über die Bindung von Arrestin an durch GRKs phosphorylierte Rezeptoren. An die Rezeptor-Arrestin-Komplexe binden Clathrin-Moleküle, die zum Transport ins Zellinnere über Vesikel (clathrin-coated-pits) führen [95, 96]. Diese Vesikel fusionieren mit frühen Endosomen. Die endozytierten Rezeptoren werden anschließend entweder in Lysosomen abgebaut oder recycled und wieder an die Zelloberfläche transportiert [96]. Eine deutliche Ko-Lokalisation von pUL78 in frühen Endosomen nach der Internalisierung konnte nachgewiesen werden. Dies könnte bedeuten, dass pUL78 nach der Internalisierung in frühen Endosomen lokalisiert, um anschließend wieder an die Zellmembran transportiert zu werden. Jedoch zeigte sich keine Ko-Lokalisation mit späten Endosomen (siehe Abbildung 11) und mit Lysosomen (siehe Abbildung 12). Späte Endosomen und Lysosomen dienen dem Abbau von Proteinen. Da pUL78 in diesen Organellen nicht zu finden war, scheint pUL78 nicht degradiert, sondern recycelt zu werden. Die Internalisierung von Proteinen über clathrin-coated Vesikel, kann über den Inhibitor Dynasore verhindert werden [63]. Das Abschnüren dieser Vesikel erfolgt über das Enzym Dynamin [74, 75, 76, 77], das durch Dynasore inhibiert wird. Beim Einsatz von 1,6 mM 77 4 Diskussion Dynasore trat keine Internalisierung von pUL78 mehr auf (siehe Abbildung 13). DMSO (Dimethylsulfoxid) alleine hatte keinen Einfluss auf die Internalisierung von pUL78. Dies ist ein Hinweis, dass die Internalisierung von pUL78 über clathrin-coated Vesikel stattfindet und es sich bei dem Transport von pUL78 wirklich um Internalisierung handelt und nicht nur um die Aufnahme der gebundenen Antikörper. Die in transfizierten Zellen gefundene pUL78-Internalisierung, konnte auch in infizierten HFF-Zellen bestätigt werden (siehe Abbildung 15). Die Internalisierung von pUL78 fand bereits nach 10 Minuten statt, also früher als in transfizierten Zellen. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass andere HCMV-Proteine einen Einfluss auf die Endozytose von pUL78 haben. Bei der Herunterregulierung von Rezeptoren gibt es zwei Möglichkeiten: die homologe und die heterologe Desensibilisierung. Bei der homologen Form führt der aktivierte Rezeptor zu seiner eigenen Internalisierung [123]. Wird die Internalisierung durch die Aktivierung eines anderen Rezeptors hervorgerufen, spricht man von heterologer Internalisierung [123]. Dass die Aktivierung eines anderen Rezeptors Einfluss auf die Internalisierung von pUL78 haben kann, ist eine Erklärung für die bei dem Internalisierungsassay aufgetretenen unterschiedlichen Zeiten in transfizierten und infizierten Zellen. Aus diesem Grund ist es von Interesse, zu überprüfen, ob pUL78 mit den anderen GPCR-Homologen oder anderen Proteinen des HCMV interagiert. Oligomerisierung des pUL78 Da für pUL78 bisher auch noch keine Liganden bekannt sind und es keine Hinweise auf die Funktion gibt, könnte eine Interaktion mit anderen GPCRs zur Aufklärung der Rolle dieses 7-TM-Proteins führen. Früher wurde angenommen, das GPCRs nur als Monomere vorliegen. Seit kurzem ist jedoch bekannt, dass GPCRs auch als Oligomere auftreten und dass diese Oligomerisierungen die Funktion der Rezeptoren beeinflussen. Neben der Interaktion mit anderen Rezeptoren (Heteromerisierung), bilden manche Rezeptoren auch Homooligomere. Der GABA-Rezeptor ist ein Beispiel für eine Heteromerisierung von GPCRs, da der funktionelle Rezeptor ein Heterodimer der Untereinheiten GABAb -R1 und GABAb-R2 darstellt [54, 55, 56]. Durch die Interaktion der Untereinheiten wird eine Lokalisation des GABA-Rezeptors in der Zellmembran ermöglicht. Tritt diese Heterodimerisierung nicht auf, bleibt die R1Untereinheit im ER hängen und die in der Zellmembran befindliche R2-Untereinheit ist nicht funktionsfähig. Zunächst wurde untersucht, ob auch pUL78 Homooligomere bildet. Als Methode zur Analyse von Interaktionen, wurde das BiFC-Verfahren gewählt. Diese Methode basiert auf der Fähigkeit der Rekomplementation zweier nicht fluoreszierender Fragmente eines Reporterproteins. Dabei entsteht wieder das funktionsfähige Reporterprotein und die Interaktion kann durch das Auftreten eines Fluoreszenzsignals nachgewiesen werden. Zur Etablierung dieser Methode und als proof of principle, wurde eine bereits be- 78 4 Diskussion kannte Interaktion der HCMV-Proteine ppUL82 und ppUL35 verwendet, die anhand des Yeast-Two-Hybrid Verfahrens in transfizierten und infizierten Zellen nachgewiesen wurde [81]. Das Tegumentprotein ppUL82 aktiviert die immediate-early Transkription über den HCMV major immediate-early enhancer-promoter (MIEP) [97]. Kurz nach der Infektion lokalisiert ppUL82 in promyelocytic leukemia oncogenic domains (PODs). ppUL35 ist in Abwesenheit von ppUL82 diffus im Zellkern verteilt. Bei einer Ko-Expression beider Proteine lokalisiert ppUL35 mit ppUL82 in PODs. Bei Verwendung der BiFC-Methode zeigten sich punktförmige Signale im Zellkern (siehe Abbildung 17). Bei einer gleichzeitigen Expression von UL78-YFP1 und UL78-YFP2, konnte ein YFPSignal detektiert werden, das im Zytoplasma verteilt war und nicht im Zellkern vorlag (siehe Abbildung 18). Dies entspricht der in dieser Arbeit beobachteten Lokalisation von pUL78. Zur genaueren Untersuchung erfolgte ein Vergleich des erhaltenen BiFCSignals mit der Lokalisation eines flag-UL78-Fusionsplasmids. Dabei zeigte sich eine übereinstimmende Verteilung beider Signale (siehe Abbildung 18). Interessanterweise konnte kürzlich auch die Homomerisierung des pUL78-Homologs M78 des murinen Zytomegalievirus gezeigt werden [41]. Ob pUL78 als Homodimer oder als Homooligomer vorliegt, kann mit dieser Methode nicht nachgewiesen werden. Mit dem BiFC-Verfahren ist es nur möglich, eine räumliche Nähe der Proteine zu bestätigen und somit einen Hinweis auf eine Interaktion zu erhalten. Die BiFC-Methode wurde bereits erfolgreich zum Nachweis von ProteinProtein-Interaktionen verwendet. Die Homomerisierung des α1b Adrenorezeptors konnte beispielsweise mit dem BiFC-Assay nachgewiesen werden [65]. Bei dem α1b Adrenorezeptor handelt es sich um ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor und die Homomerisierung wurde zuvor mit Hilfe der Ko-Immunopräzipitation und FRET gezeigt [65]. Lopez-Gimenez et al., konnten durch Punktmutationen in den Transmembrandomänen I und IV des α1b Adrenorezeptors, die den Transport in die Zellmembran verhindern, nachweisen, dass die Oligomerisierung während der Synthese des Rezeptors stattfindet und nicht erst in der Zellmembran. Dadurch konnte ausgeschlossen werden, dass das aufgetretenen BiFC-Signal nur durch die räumliche Nähe der Rezeptoren in der Zellmembran hervorgerufen wurde. Auch Bulenger et al. beschreiben, dass die Oligomerisierung von GPCRs während der Synthese erfolgt [53]. Zur Bestätigung der Homomerisierung von pUL78 wurde das Verfahren der Ko-Immunopräzipitation angewendet. Mit Hilfe dieser Methode zeigte sich eine Interaktion zwischen den Fusionsproteinen myc-UL78 und flag-UL78 (siehe Abbildung 23). Zur Erhöhung der Löslichkeit der GPCRs wurden diese vorher mit Urea versetzt. Die Unlöslichkeit von Membranproteinen ist ein limitierender Schritt bei der Ko-Immunopräzipitation [98]. Neben der erwarteten Bande von 47 kDa sind weitere Banden aufgetreten. Hierbei 79 4 Diskussion könnte es sich um Oligomere von pUL78 handeln. Die Bande bei 100 kDa war etwa doppelt so groß wie erwartet (47 kDa) und ist ein Hinweis auf die Homodimerisierung von pUL78. Das Auftreten von Homooligomeren kann durch die Bande erklärt werden, die über 130 kDa lag. Die Homomerisierung von pUL78 konnte somit durch zwei verschiedene Methoden bestätigt werden. Um einen Hinweis auf die Funktion der Homomerisierung von pUL78 zu bekommen, ist es wichtig, die Interaktionsdomäne zu bestimmen. Ist diese bekannt, kann die Interaktion durch Mutation der Domäne verhindert werden, um so Rückschlüsse auf die Funktion für das humane Zytomegalievirus zu erhalten. Im Allgemeinen werden verschiedene Regionen von GPCRs als relevant für die Oligomerisierung angesehen. Disulfidbrücken zwischen Cysteinen und auch nicht kovalente Bindungen sind möglicherweise an der Oligomerisierung beteiligt [82]. Es wird angenommen, dass Regionen, die für die Oligomerisierung zuständig sind, im N-Terminus und in extrazellulären Bereichen [99, 100, 101], im C-Terminus [102, 55], in intrazellulären Loops [103] und in Transmembrandomänen [83, 84, 85] vorliegen können. Franziska Arnold hat in ihrer Masterarbeit einige Positionen in pUL78 mutiert, die möglicherweise an einer Interaktion beteiligt sind [78]. Bei der Punktmutation C187S beschrieb sie eine starke Abschwächung des Signals. Zwischen den Cysteinen an Stelle 109 und 187 befindet sich eine putative Disulfidbrücke. Da bei Dimerisierungen möglicherweise Disulfidbrücken involviert sind [82] und der Austausch von Cystein gegen Serin an AS-Postion 187 zu einer Abschwächung des BiFC-Signals geführt hat, wurde die Mutation C187S in der vorliegenden Arbeit erneut untersucht (siehe Abbildung 21). Dabei konnte in manchen Zellen ein BiFC-Signal detektiert werden, dass eine veränderte Lokalisation aufwies. Das Signal war ringförmig um den Zellkern verteilt, aber zeigte keine gleichmäßige Verteilung im Zytoplasma. Die Mutation könnte möglicherweise einen Einfluss auf die Homomerisierung und/oder den Transport auf die Zelloberfläche, oder die Internalisierung haben. Ob die Mutation C187S wirklich einen Einfluss auf die Homomerisierung von pUL78 hat, konnte mit Hilfe des BiFC-Assays somit nicht nachgewiesen werden. Weitere Untersuchungen, wie zum Beispiel die Durchführung einer Ko-Immunopräzipitation, sind deshalb nötig. In der vorliegenden Arbeit wurden weitere Mutationen generiert und untersucht. Die Deletion des kompletten extrazellulären N-terminalen Bereichs (delN), hatte keinen Einfluss auf die Homomerisierung von pUL78 und die Versuche mit der Deletion des intrazellulären C-terminalen Bereichs lieferten keine auswertbaren Ergebnisse [78]. An der AS Position 305 im C-terminalen Bereich befindet sich eine putative Phosphorylierungsstelle, die durch eine Tyrosinkinase phosphoryliert werden kann. Die Phosphorylierung eines GPCRs führt zur Internalisierung der Rezeptoren und dient somit der 80 4 Diskussion Regulierung. In der vorliegenden Arbeit wurden die AS 299-310 deletiert um zu untersuchen, ob dieser Bereich möglicherweise einen Einfluss auf die Homomerisierung von pUL78 hat. Das bei dem BiFC erhaltene YFP-Signal zeigte jedoch keine Veränderung (siehe Abbildung 21). Das Fluoreszenzsignal wies die gleiche Verteilung auf, die auch bei dem nicht mutierten pUL78 auftrat. Auch der komplette Transmembranbereich wurde deletiert (delTD), da mehrere Gruppen zeigten, dass in diesem Bereich ebenfalls relevante Regionen für die Bildung von Oligomeren vorliegen [83, 84, 85]. Die Mutation delTD führte in dem BiFC-Assay zum Ausbleiben oder zu einer starken Abschwächung des YFP-Signals (siehe Abbildung 21). Falls ein YFP-Signal auftrat, war dieses an einer Stelle in der Zelle akkumuliert und nicht mehr gleichmäßig im Zytoplasma verteilt. Um den Bereich weiter einzugrenzen, wurde eine weitere Mutante generiert: del232242. An AS-Position 237 befindet sich ein Cystein, das möglicherweise zur Bildung von Disulfidbrücken beiträgt. Kroeger et al. haben beschrieben, dass Cysteinbrücken an der Bildung von Oligomeren beteiligt sind [82]. Die Mutation del232-242 zeigte jedoch keine Veränderung des YFP-Signals (siehe Abbildung 21) und somit befindet sich in dieser Region keine Interaktionsdomäne. Weitere AS-Positionen im Transmembranbereich müssen untersucht werden. Die Auswertung von BiFC-Signalen ist kompliziert, da auch die Reporterfragmente mit einer sehr geringen Effizienz die Fähigkeit zur Rekonstitution besitzen, obwohl keine Interaktion der fusionierten Proteine stattfindet [104]. Dies zeigte sich auch in der vorliegenden Arbeit bei der gleichzeitigen Expression der Fragmente YFP1 und YFP2 ohne fusionierte Proteine. Die detektierten Signale waren aber sehr gering und diffus über die Zelle verteilt. Nach den durchgeführten BiFC-Experimenten mit verschiedenen Mutanten sieht es so aus, als ob die Interaktionsdomäne im Transmembranbereich zu finden ist. Eine genauere Lokalisation der Domäne war bisher nicht erfolgreich. Weitere Analysen der Transmembrandomäne müssen folgen. Interaktionen mit anderen GPCR-homologen des HCMV Bei der Durchführung des BiFC-Verfahrens konnte eine Interaktion von pUL78 mit den drei GPCR Homologen pUS27, pUS28 und pUL33, nur für pUS28 eindeutig gezeigt werden (siehe Abbildung 22). Die Ergebnisse dieser Experimente konnten durch Ko-Immunopräzipitationen bestätigt werden. Neben der erwarteten US28-Bande von etwa 37 kDa, ist eine weitere Bande bei etwa 60 kDa aufgetreten, die die Heterodimere darstellen sollte. Die korrekte Expression der Fusionsproteine flag-US28 und myc-UL78, konnte in den Lysatkontrollen nachgewiesen werden. Die hier gefundene Interaktion konnte interessanterweise kürzlich von Tschische et al. 81 4 Diskussion ebenfalls mit Hilfe der Ko-Immunopräzipitation und dem Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) gezeigt werden [105]. Die Autoren waren auf der Suche nach Interaktionen des pUS28 mit den GPCR Homologen pUL78, pUS27 und pUL33. Tschische et al. bestätigten eine Ko-Lokalisation von pUS28 mit pUL78 und pUL33 und eine bereits beschriebene Ko-Lokalisation von pUS28 und pUS27 [91, 105]. Dass Heteromerisierungen die Eigenschaften von GPCRs, beispielsweise die Signalweiterleitung, beeinflussen können, wurde bereits beschrieben [106, 107, 48]. Insbesondere orphan-Rezeptoren besitzen die Fähigkeit die Aktivität von anderen Rezeptoren zu modulieren. Ein Beispiel, das in der vorliegenden Arbeit beschrieben wurde, ist der orphan-Rezeptor GPR50, der einen Einfluss auf den Melantonin Rezeptor MT1 hat und so die Bindung von Melantonin und G-Proteinen verhindert [59]. Bei dem 7-TMProtein pUL78 handelt es sich ebenfalls um einen orphan-Rezeptor. Deshalb wurde untersucht, ob pUL78 einen Einfluss auf die Aktivität von pUS28 hat. In Abbildung 30 sind die in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Ergebnisse zu Lokalisations- und Internalisierungsanalysen von pUL78 zu einem hypothetischen Transportweg zusammengefasst. Das 7-TM-Protein pUL78 ist nach der Expression zunächst im endoplasmatischen Retikulum zu finden. Das ER spielt eine wichtige Rolle bei der Biosynthese von Proteinen, da hier die Faltung und die posttranslationalen Modifizierungen von Proteinen stattfinden. Von dort aus wird pUL78 zum Golgi-Apparat transportiert, um anschließend an seinen Zielort, die Zellmembran, zu gelangen. Das 7-TM-Protein pUL78 zeigte bei der Analyse der subzellulären Verteilung keine KoLokalisation mit späten Endosomen oder Lysosomen. Durch Internalisierung wird pUL78 zurück in das Zellinnere transportiert. Ob dies in Folge einer Ligandenbindung geschieht, ist nicht bekannt, da pUL78 noch zu den orphan-Rezeptoren gehört. Nach der Internalisierung befindet sich pUL78 in frühen Endosomen. Da das 7-TM-Protein jedoch weder in späten Endosomen, noch in Lysosomen zu finden ist, wird davon ausgegangen, dass pUL78 nicht abgebaut, sondern für einen Rücktransport an die Zelloberfläche recycelt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass pUL78 Heteromere mit dem 7-TM-Protein pUS28 bildet. Ein Einfluss dieser Interaktion auf die Internalisierung von pUL78 konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Ob die Interaktion die Internalisierung von pUS28 beeinflusst, ist noch nicht geklärt. 82 4 Diskussion Abbildung 30: Hypothetische Darstellung der Lokalisation des 7-TM-Proteins pUL78. Der Transportweg von pUL78 ist durch blaue Pfeile gekennzeichnet. Organelle, die mit pUL78 eine Ko-Lokalisation aufweisen, sind durch blaue Ovale markiert. Das 7-TM-Protein pU28 ist in grün dargestellt. Der weitere Transportweg nach der Internalisierung von pUS28 ist nicht dargestellt. pUS28 weist in Abwesenheit von Liganden eine konstitutive Signalweiterleitung auf, die zur Akkumulation von Inositoltriphosphat (IP3) in der Zelle und zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB (nuclear factor kappa B ) führt [28, 30]. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob pUL78 einen Einfluss auf die von pUS28-abhängige IP3-Anhäufung hat. Das orphan GPCR-Homolog pUL33 des HCMV ist konstitutiv aktiv und führt wie pUS28 zu einer Erhöhung der IP3-Produktion [33, 36]. Eine Induktion der IP3-Synthese konnte durch pUL78 nicht hervorgerufen werden (siehe Abbildung 25). Die Expression von pUL78 hat demnach keinen Einfluss auf die durch die konstitutive Aktivität von pUS28 hervorgerufene Synthese von IP3. Dies konnte auch von einer anderen Gruppe kürzlich bestätigt werden. Tschische et al. untersuchten die von pUS28 induzierte IP3-Bildung in An- und Abwesenheit der homologen GPCRs pUS27, pUL33 und pUL78 mit Hilfe des ELISA-Verfahren [105]. Sie konnten keinen direkten Einfluss der anderen GPCRs auf die von pUS28-induzierte IP3-Synthese zeigen. Des weiteren untersuchten Tschische et al. die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB. Hierbei konnten sie einen negativen Einfluss von pUL78 und pUL33 auf diese 83 4 Diskussion Aktivierung nachweisen. Es trat ein signifikanter Rückgang der Aktivierung von NFκB auf. NF-κB spielt eine Rolle bei der angeborenen bzw. erworbenen Immunantwort, bei Entzündungsreaktionen und bei der Regulierung der Zellviabilität [108]. Tschische et al. konnten somit einen Hinweis auf die Funktion der Heteromerisierung von pUL78 und pUS28 geben [105]. Funktionsanalyse von pUL78 Die UL78-Familie besitzt Mitglieder in verschiedenen β-Herpesviren. Aus diesem Grund wird eine wichtige Rolle dieser Gene in der Pathogenese der Infektion vermutet [42]. Überraschenderweise zeigte eine von Michel et al. generierte pUL78 Deletionsmutante, keinen Wachstumsdefekt in Fibroblasten[42]. Die Ergebnisse von Michel et al. weisen darauf hin, dass pUL78 im Gegensatz zu R78 und M78 für die Replikation in diesem Zelltyp nicht von Bedeutung ist [42]. Um das Wachstumsverhalten einer UL78-defizienten Mutante in weiteren Zelltypen in vitro zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein Stop-Codon in die kodierende Region von pUL78 eingefügt. Mittels der „en passant”-Mutagenese, wurde die Stop-Mutante ausgehend von TB40E-BAC4 generiert. Dieser BAC, der ausgehend von dem Klinikisolat TB40 kloniert wurde, zeigt einen hohen Zelltropismus und ist komplett sequenziert [61]. Im Gegensatz zur Deletionsmutante, die ausgehend von dem Laborstamm AD169 hergestellt wurde [42], ist demnach mit der Stop-Mutante die Infektion weitere Zelltypen möglich. In Fibroblasten trat ebenfalls kein Wachstumsdefekt der Stop-Mutante auf. pUL78 scheint für die Replikation in Fibroblasten nicht von Bedeutung zu sein. Des weiteren wurde das Wachstumsverhalten in Epithelzellen untersucht, da dieser Zelltyp einen klinisch relevanten Zelltyp darstellt. Es zeigte sich ein deutlicher Unterschied zwischen dem Wildtyp und der Stop-Mutante. Die Mutation von pUL78 hat einen Wachstumsdefekt in Epithelzellen zur Folge. Demnach scheint pUL78 in Epithelzellen eine Rolle im Replikationszyklus des humanen Zytomegalievirus zu spielen. Aussicht In Zukunft sollte der Mechanismus des pUL78-traffickings in der virusinfizierten Zelle genauer untersucht werden. Dazu gehört z.B. auch die Lokalisierung der Interaktionsdomäne oder -domänen. Genauer zu klären ist auch, ob die beschriebenen Interaktionen real sind, oder ob es sich dabei um Artefakte durch Effekte der Überexpression handeln könnte, die möglicherweise durch die transiente Expression auftreten. Da das UL78-Protein in Fibroblasten nicht essentiell für die Replikation ist, aber in Epithelzellen eine bedeutende spielt, sollten weitere Zellarten untersucht werden, die im natürlichen Wirt eine wichtige Rolle für Replikation oder Virusdissemination spielen, wie z.B. Makrophagen. Die Generierung einer Revertante ist notwendig, um die Auswirkung der Stop-Mutante in Epithelzellen zu verifizieren. Ebenso muss geklärt 84 4 Diskussion werden, welche Rolle pUL78 im Replikationszyklus in Epithelzellen spielt. 85 5 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Das 7-Transmembrandomänen-Protein (7-TM) pUL78 ist ein putativer G-Proteingekoppelter Rezeptor (GPCR) des humanen Zytomegalievirus (HCMV), über den kaum etwas bekannt ist. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, pUL78 zu untersuchen, um die Rolle dieses 7-TM-Proteins für das humane Zytomegalievirus darzustellen. pUL78 zeigte in transfizierten und infizierten Zellen eine gleichmäßige Verteilung im Zytoplasma, wobei der Zellkern ausgespart blieb. In transfizierten Zellen lokalisierte pUL78 in Strukturen des endoplasmatischen Retikulums und war zusätzlich an der Zelloberfläche zu finden. Wie bereits für pUS28 beschrieben, wird pUL78 von der Zelloberfläche ins Zellinnere transportiert. Dass pUL78 als Homooligomer vorliegt, konnte mit den Verfahren der Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC) und der Ko-Immunopräzipitation gezeigt werden. Die genaue Bestimmung der Interaktionsdomäne war nicht erfolgreich, aber die Eingrenzung auf den Transmembranbereich war möglich. Neben der Homomerisierung bildet pUL78 Heterooligomere mit dem putativen GPCR Homolog pUS28. Diese Interaktion konnte ebenfalls mit dem BiFC-Verfahren und der Ko-Immunopräzipitation nachgewiesen werden. Ein Ansatzpunkt für die Aufklärung der Funktion der Interaktion zwischen pUL78 und pUS28, war die durch pUS28-induzierte Synthese von Inositoltriphosphat (IP3). pUL78 zeigte keinen Einfluss auf die IP3-Bildung und hatte auch keinen Effekt auf die durch pUS28 hervorgerufene IP3-Akkumulation. Die Funktion der Homo- und Heteromerisierung und die Rolle von pUL78 für das humane Zytomegalievirus, blieben jedoch ungeklärt. Es konnte lediglich gezeigt werden, dass eine pUL78-Stop-Mutante in Epithelzellen einen Wachstumsdefekt zur Folge hatte. Einen Hinweis auf eine wichtige Funktion von pUL78, zeigte sich nach Untersuchungen mit einer pUL78-defizienten Virusvariante. Hierbei zeigte sich, dass das Fehlen des pUL78 für die Replikation in Fibroblasten nicht essentiell war. Nach der Infektion von retinalen Epithelzellen wies die pUL78-defiziente Mutante aber einen deutlichen Replikationsnachteil auf. 86 Literatur Literatur [1] Tischer B.K., von Einem J., and Osterrieder N. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli., Biotechniques 40, 191–197 (2006). [2] Mocarski E. and Courcelle C. Cytomegaloviruses and their replication., Fields: Virology Fourth Edition, Chapter 76 2, 2629–2673 (2001). [3] Sinzger C., Kahl M., Laib K., Klingel K., Rieger P., Plachter B., and Jahn G. Tropism of human cytomegalovirus for endothelial cells is determined by a postentry step dependent on efficient translocation to the nucleus., J. Gen. Virol. 81, 3021–3035 (2000). [4] Kalejta R.F. Tegument Proteins of Human Cytomegalovirus., Microbiology and Molecular Biology Reviews 72, 249–265 (2008). [5] Bresnahan W.A. and Shenk T. A subset of viral transcripts packaged within human cytomegalovirus particles., Science 288, 2327–2328 (2000). [6] Reynolds D.W., Stagno S., Hosty T.S., Tiller M., and Alford Jr. C.A. Maternal cytomegalovirus excretion and perinatal infection., N. Engl. J. Med. 289, 1–5 (1973). [7] Stagno S., Reynolds D.W., Pass R.F., and Alford Jr. C.A. Breast milk and the risk of cytomegalovirus infection., N. Engl. J. Med. 302, 1073–1076 (1980). [8] Sinclair J. and Sissons P. Latency and reactivation of human cytomegalovirus., Journal of General Virology 87, 1763–1779 (2006). [9] Pass R. Cytomegalovirus., Fields, virology fourth Edition, Chapter 77 2, 2675– 2707 (2001). [10] Grosse S.D., Ross D.S., and Dollard S.C. Congenital cytomegalovirus (CMV) infection as a cause of permanent bilateral hearing loss: a quantitative assessment., J. Clin. Virol. 41, 57–62 (2008). [11] Scheurer M.E., Bondy M.L., Aldape K.D., Albrecht T., and El-Zein R. Detection of human cytomegalovirus in different histological types of gliomas., Acta. Neuropathol. 116, 79–86 (2008). [12] Andrei G., De Clercq E., and Snoeck R. Novel inhibitors of human CMV., Curr. Opin. Investig. Drugs 9, 132–145 (2008). 87 Literatur [13] Lefkowitz. The superfamily of heptahelical receptors., Nature Cell Biology 2, 133–136 (2000). [14] Flower D.R. Modelling G-protein-coupled receptors for drug design., Biochim Biophys Acta 1422, 207–234 (1999). [15] Marinissen M.J. and Gutkind J.S. G-protein-coupled receptors and signaling networks: emerging paradigms., Trends Pharmacol. Sci. 22(7), 368–376 (2001). [16] Offermanns S. G-proteins as transducers in transmembrane signalling., Prog. Biophys. Mol. Biol. 83, 101–130 (2003). [17] Gilman A.G. G proteins: transducer of receptor-generated signals., Annu. Rev. Biochem. 56, 615–649 (1987). [18] Fredriksson R. and Schöth H.B. The repertoire of G-protein-coupled receptors in fully sequenced genomes., Mol. Pharmacol. 67, 1414–1425 (2005). [19] Pierce K.L., Premont R.T., and Lefkowitz R.J. Seven-transmembrane receptors., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 639–650 (2002). [20] Couty J.P. and Gershengorn M.C. G-protein-coupled receptors encoded by human herpesviruses., Trends Pharmacol. Sci. 26, 405–411 (2005). [21] Murphy E., Yu D., Grimwood J., Schmutz J., Dickson M., Jarvis M.A., Hahn G., Nelson J.A., Myers R.M., and Shenk T.E. Coding potential of laboratory and clinical strains of human cytomegalovirus., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14976–14981 (2003). [22] Beisser P.S., Goh C.S., Cohen F.E., and Michelson S. Viral chemokine receptors and chemokines in human cytomegalovirus trafficking and interaction with the immune system. CMV chemokine receptors., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 269, 203–234 (2002). [23] Gao J.L. and Murphy P.M. Human cytomegalovirus open reading frame US28 encodes a functional beta chemokine receptor., J. Biol. Chem. 269, 28539–28542 (1994). [24] Kledal T.N., Rosenkilde M.M., and Schwartz T.W. Selective recognition of the membrane-bound CX3C chemokine, fractalkine, by the human cytomegalovirusencoded broad-sprectrum receptor US28., FEBS letters 441, 209–214 (1998). 88 Literatur [25] Kuhn D.E., Beall C.J., and Kolattukudy P.E. The Cytomegalovirus US28 Protein Binds Multiple CC Chemokines with High Affinity., Biochemical and Biophysical Research Communications 211, 325–330 (1995). [26] Casarosa P., Waldhoer M., LiWang P.J., Vischer H.F., Kledal T., Timmerman H., Schwartz T.W., Smit M.J., and Leurs R. CC and CX3C chemokines differnetially interact with the N terminus of the human cytomegalovirus-encoded US28 receptor., J. Biol. Chem. 280, 3275–3285 (2005). [27] Bodhagi B., Jones T.R., Zipeto D., Vita C., Sun L., Laurent L., ArenzanaSeisdedos F., Virelizier J.L., and Michelson S. Chemokine sequestration by viral chemoreceptors as a novel viral escape strategy: withdrawl of chemokines from the environment of cytomegalovirus-infected cells., J. Exp. Med. 188, 855–866 (1998). [28] Casarosa P., Bakker R.A., Verzijl D., Navis M., Timmerman H., Leurs R., and Smit M.J. Constitutive signaling of the human cytomegalovirus-encoded chemokine receptor US28., J. Biol. Chem. 276, 1133–1137 (2001). [29] Fraile-Ramos A., Pelchen-Matthews A., Kledal T.N., Browne H., Schwartz T.W., and Marsh M. Localization of HCMV UL33 and US27 in endocytotic compartments and viral membranes., Traffic 3, 218–232 (2002). [30] Minsini R., Tulone C., Lüske A., Michel D., Mertens T., Gierschik P., and Moepps B. Constitutive Inositol Phosphate formation in Cytomegalovirus-Infected human fibroblasts is due to expression of the chemokine receptor homologue pUS28., Journal of Virology 77, 4489–4501 (2003). [31] Streblow D.N., Söderberg-Nauclér C., Vieira J., Smith P., Wakabayashi E., Rutchi F., Mattison K., Altschuler Y., and Nelson J.A. The human cytomegalovirus chemokine receptor US28 mediates vascular smooth muscle cell migration., Cell 99, 511–520 (1999). [32] Vomaske J., Nelson J.A., and Streblow D.N. Human cytomegalovirus US28: a functionally selective chemokine binding receptor., Infect Disord Drug Targets. 9, 548–556 (2009). [33] Waldhoer M., Kledal T.N., Farrell H., and Schwartz T.W. Murine cytomegalovirus (CMV) and human CMV US28 receptors exhibit similar constitutive signaling activities., J. Virol. 76, 8161–8168 (2002). 89 Literatur [34] Margulies B.J. and Gibson W. The chemokine receptor homologue encoded by US27 of human cytomegaloviurs is heavily glycosilated and is present in human foreskin fibroblasts and enveloped virus particels.., Virus Res. 123(1), 57–71 (2007). [35] O’Connor C.M. and Shenk T. Human Cytomegalovirus pUS27 G ProteinCoupled Receptor Homologue Is Required for Efficient Spread by the Extracellular Route Not for Direct Cell-to-Cell Spread., J. Virol. 85(8), 3700–3707 (2011). [36] Casarosa P., Gruijthuijsen Y.K., Michel D., and et al. Constitutive signaling of the human cytomegalovirus-encoded receptor UL33 differs from that of its rat cytomegalovirus homolog R33 by promiscuous activation of G proteins of the G_q, g_i and G_s classes., J. Biol. Chem. 278, 50010–50023 (2003). [37] Margulies B.J., Browne H., and Gibson W. Identification of the human cytomegalovirus G protein-coupled receptor homologue encoded by UL33 in infected cells and enveloped virus particles., Virology 225, 111–125 (1996). [38] Liston A. and McColl S. Subversion of the chemokine world by microbial pathogens., Bioessays 25, 478–488 (2003). [39] Gompels U.A., Nicholas J., Lawrence G., Jones M., Thomson B.J, Martin M.E., Efstathiou S., Craxton M., and Macaulay H.A. The DNA sequence of human herpesvirus-6: structure, coding content, and genome evolution., Virology 209, 29–51 (1995). [40] Milne R.S., Mattick C., Nicholson L., Devaraj P., Alcami A., and Gompels U.A. RANTES binding and down-regulation by a novel human herpesvirus-6 beta chemokine receptor., J. Immunol. 164, 2396–2404 (2000). [41] Sharp E.L., Davis-Poynter N.J., and Farrell H.E. Analysis of the subcellular trafficking properties of murine cytomegalovirus M78, a 7 transmembrane receptor homologue., J. Gen. Virol. 90, 59–68 (2009). [42] Michel D., Milotic I., Wagner M., Vaida B., Holl J., Ansorge R., and Mertens T. The human cytomegalovirus UL78 gene is highly conserved among clinical isolates, but is dispensable for replication in fibroblasts and a renal artery organculture system, J. Gen. Virol. 86, 297–306 (2005). [43] Beisser P.S., Grauls G., Bruggeman C.A., and Vink C. Deletion of the R78 Gprotein-coupled receptor gene from rat cytomegalovirus results in an attenuated, syncytium-inducing mutant strain., J. Virol. 73, 7218–7230 (1999). 90 Literatur [44] Oliveira S.A. and Shenk T.E. Murine cytomegalovirus M78 protein, a G proteincoupled receptor homologue, is a constitutent of the virion and facilitates accumulation of immediate-early viral mRNA., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3237–3242 (2001). [45] Bouvier M. Oligomerization of G-protein-coupled transmitter receptors., Nat. Rev. Neurosci. 2, 274–286 (2001). [46] Angers S., Salaphur A., and Bouvier M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42, 409–435 (2002). [47] George S.R., O’Dowd B.F., and Lee S.P. G-protein-coupled receptor oligomerization and its potential for drug discovery., Nat. Rev. Drug Discov. 1, 808–820 (2002). [48] Milligan G. G-protein-coupled receptor dimerization: function and ligand pharmacology., Mol. Pharmacol. 66, 1–7 (2004). [49] Hipser C., Bushlin I., Gupta A., Gomes I., and Devi L.A. Role of antibodies in developing drugs that taget G-protein-coupled receptor dimers., Mt. Sinai. J. Medl. 77(4), 374–380 (2010). [50] Devi L.A. G-protein-coupled receptor dimers in the lime light., Trends Pharmacol. Sci. 21, 324–326 (2000). [51] Jordan B.A., Trapaidze N., Gomes I., and et al. Dimerization of opioid receptors with beta 2-adrenergic receptors: a role in trafficking and mitogen activated protein kinase activation., EMBO Rep. 98, 343–348 (2001). [52] Terrillon S. and Bouvier M. Roles of G-protein-coupled receptor dimerization., EMBO Rep. 5, 30–34 (2004). [53] Bulenger S., Marullo S., and Bouvier M. Emerging role of homo- and heterodimerization in G-proteincoupled receptor biosynthesis and maturation., Trends Pharmacol Sci. 26, 131–137 (2005). [54] Jones K.A., Borowsky B., Tamm J.A., and et al. GABAb receptors function as a heteromeric assembly of the subunits GABAbR1 and GABAbR2., Nature 396, 674–679 (1998). [55] White J.H., Wise A., Main M.J., and et al. Heterodimerization is required for the formation of a functional GABAb receptor., Nature 396, 679–682 (1998). 91 Literatur [56] Kaupmann K., Malitschek B.K., Schuler V.K., and et al. GABAb-receptor subtypes assemble into funcitonal heteromeric complexes., Nature 396, 682–687 (1998). [57] Galvez T., Duthey B., Kniazeff J., and et.al. Allossteric interactions between GB1 and GB2 subunits are required for optimal GABA receptor function., EMBO J. 20, 2152–2155 (2001). [58] Marshall F.H., Jones K.A., Kaupmann K., and Bettler B. GABA receptors- the fist 7TM heterodimers., Trends Pharmacol. Sci. 20, 396–399 (1999). [59] Levoye A., Dam J., Ayoub M.A., Guillaume J.L., Couturier C., and Delagrange P. et al. The orphan GPR50 receptor specifically inhibits MTI melantonin receptor function through heterodimerization ., EMBO J. 25 (13), 3012–3023 (2006). [60] van Cleef K.W.R., Smit M.J., Bruggeman C.A., and Vink C. Cytomegalovirusencoded homologs of G protein-coupled receptors and chemokines., Journal of Clinical Virology 35, 343–348 (2006). [61] Sinzger C., Hahn G., Digel M., Katona R., Samaio K.L., Messerle M., Hengel H., Koszinowski U., Brune W., and Adler B. Cloning and sequencing of a highly productive, endotheliotropic virus strain derived from human cytomegalovirus TB40/E., J. Gen. Virol. 89, 359–368 (2008). [62] Schreiber Andreas. Etablierung eines schnellen Mutagenesesystems für Zytomegalieviren zur Charakterisierung von potentiellen Targetproteinen der antiviralen Therapie., Dissertation (2009). [63] Macia E., Ehrlich M., Massol R., Boucrot E., Brunner C., and Kirchhausen T. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin., Developlmental Cell 10, 839– 850 (2006). [64] Vidi P.A. and Watts V.J. Fluorescent and Bioluminescent Protein-Fragment Complementation Assay in the study of G-protein-coupled receptor oligomerization and signaling., Mol. Pharmacol. 75, 733–739 (2009). [65] Lopez-Gimenez J.F., Canals M., Pediani J.D., and Milligan G. The alpha1badrenoreceptor exists as a higeer-order oligomer: effective oligomerization is required for receptor maturation, surface delivery, and function., Mol. Pharmacol. 71, 1015–1029 (2007). [66] Fuxe K., Canals M., Torvinen M., Marcellino D., Terasmaa A., Genedani S., Leo G., Guidolin D., Diaz-Cabiale Z., and Rivera A. Intramembrane receptor-receptor 92 Literatur interactions: a novel principle in molecular medicine., J. Neural. Transm. 114, 49–75 (2007). [67] Vidi P.A., Chemel B.R., Hu C.D., and Watts V.J. Ligand-dependent oligomerization of dopamine D2 and adenosine A2A receptors in living neuronal cells., Mol. Pharmacol. 74, 544–551 (2008a). [68] Piechulek T., Rehlen T., Walliser C., Vatter P., Moepps B., and Gierschik P. rac regulates its effector phospholipase Cgamma2 through interaction with a split pleckstrin homology domain., J. Biol. Chem. 280, 38923–38931 (2005). [69] Walliser C., Retlich M., Haris R., Everett K.L., Josephs M.B, Vatter P., Esposito D., Driscoll P.C., Katan M., Gierschik P., and Bunney T.D. rac regulates its effector phospholipase Cgamma2 through interaction with a split pleckstrin homology domain., J. Biol. Chem. 283, 30351–30362 (2008). [70] Camps M., Hou C.F., Jakobs K.H., and Gierschik P. Guanosine 5’-[gammathio]triphosphate-stimulated hydrolysis of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in HL-60 granulocytes. Evidence that the guanine nucleotide acts by relieving phospholipase C from an inhibitory constraint., Biochem. J. 271, 743–748 (1990). [71] Mu F.T., Callaghan J.M., Steele-Mortimer O., Stenmark H., Parton R.G., Campbell P.L., McCluskey J., Yeo J.P., Tock E.P., and Toh B.H. EEA1, an early endosome-associated protein. EEA1 is a conserved alpha-helical peripheral membrane protein flanked by cysteine "fingersänd contains a calmodulin-binding IQ motif., J. Biol. Chem. 270(22), 13503–13511 (1995). [72] Kornfeld S. and Mellman I. The biogenesis of lysosomes., Annu. Rev. Cell Biol. 5, 483–525 (1989). [73] Pols M.S. and Klumperman J. Trafficking and function of the tetraspanin CD63., Exp. Cell Res. 315(9), 1584–1592 (2009). [74] Damke H., Baba T., Warnock D.E., and Schmid S.L. Induction of mutant dynamin specifically blocks endocytotic coated vescile formation., J. Cell Biol. 127, 915–934 (1994). [75] Hill E., van der Kaay J., Downes C.P., and Smythe E. The role of dynamin and its binding partners in coated pit invagination and scission., J. Cell Biol. 152, 309–323 (2001). 93 Literatur [76] Abazeed M.E., Blanchette J.M., and Fuller R.S. Cell-free transport from the trans-golgi network to late endosome requires factors involved in formation and consumption of clathrin-coated vesicles., J. Biol. Chem. 280, 4442–4450 (2005). [77] Cao H., Weller S., Orth J.D., Chen J., Huang B., Chen J.L., Stamnes M., and McNiven M.A. Actin and Arf1-dependent ransportecruitment of a cortactindynamin complex to the Golgi regulates post-Golgi tr., Nat. Cell Biol. 7, 483–492 (2005). [78] Arnold Franziska. Functional Characterization of the Cytomegalovirus Protein pUL78 and its Dimerization., Masterarbeit (2010). [79] Remy I., Montmarquette A., and Michnick S. W.. PKB/Akt modulates TGFbeta signalling through a direct interaction with Smad3., Nat. Cell Biol. 6, 358– 365 (2004). [80] Nyfeler B., Michnick S.W., and Hauri H.P. Capturing protein interactions in the secretory pathway of living cells., PNAS 102(18), 6350–6355 (2005). [81] Schierling K., Stamminger T., Mertens T., and Winkler M. Human Cytomegalovirus Tegument Protiens ppUL82 (pp71) and ppUL35 Interact and Cooperatively Activate the Major Immediate-Early Enhancer., J. Virol. 78, 9512–9523 (2004). [82] Kroeger K.M., Hanyaloglu A.C., Seeber R.M., Miles L.E., and Eidne K.A. Constitutive and agonist-dependent homo-oligomerization of the thryotropin-releasing hormone receptor. Detection in living cells using bioluminescence resonance energy transfer., J. Biol. Chem. 276 (16), 12736–12743 (2001). [83] Hebert T.E., Moffett S., Morello J.P., Loisel T.P., Bichet D.G., Barret C., and Bouvier M. A peptide derived from a beta2-adrenergic receptor transmembrane domain inhibits both receptor dimerization and activation., J. Biol. Chem. 271, 16384–1639 (1996). [84] Zhu X. and Wess J. Truncated V2 vasopressin receptors as negative regulators of wild-type V2 receptor function., Biochemistry 37, 15773–15784 (1998). [85] Ng G.Y., O’Dowd B.F., Lee S.P., Chung H.T., Brann M.R., Seeman P., and George S.R. Dopamine D2 receptor dimers and receptor-blocking peptides., Biochem. Biophys. Res. Commun. 227, 200–204 (1996). [86] Rosenkilde M.M., Waldhoer M., Luttichau H.R., and Schwartz T.W. Virally encoded 7TM receptors., Oncogene 20(13), 1582–93 (2001). 94 Literatur [87] Rosenkilde M.M., Smit M.J., and Waldhoer M. Structure, function and physiological consequences of virally encoded chemokine seven transmembrane receptors., Br. J. Pharmacol. 153, 154–166 (2008). [88] Petaja-Repo U.E., Hogue M., Laperriere A., Walker P., and Bouvier M. Export from the endoplasmatic reticulum represents the limiting step in the maturation and vell surface expression of the human opoid receptor., J. Biol. Chem. 275, 13727–13736 (2000). [89] Lodish H., Berk A., Darnell J., Kaiser C.A., and Krieger M. G proteins: transducer of receptor-generated signals., Annu. Rev. Biochem. 56, 615–649 (1987). [90] Ferguson S.S. Evolving concepts in G protein-coupled receptor endocytosis: the role in receptor desensitization and signaling., Pharmacol. Rev. 53, 1–24 (2001). [91] Fraile-Ramos A., Kohout T.A., Waldhoer M., and Marsh M. Endocytosis of the viral chemokine receptor US28 does not require beta-arrestin but is dependent on the clathrin-mediated pathway., Traffic 4(4), 243–253 (2003). [92] Chun M., Liyanage U.K., Lisanti M.P., and Lodish H.F. Signal transduction of a G protein-coupled receptor in caveolae: colocalization of endothelin and its receptor with caveolin., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11728–11732 (1994). [93] Feron O., Smith T.W., Michel T., and Kelly R.A. Dynamic targeting of the agonist-stimulated m2 muscarinic acetylcholine receptor to caveolae in cardiac myocytes., J. Biol. Chem. 272, 17744–17748 (1997). [94] Fraile-Ramos A., Kledal T.N., Pelchen-Mathews A., Bowers K., Schwartz T.W., and Marsh M. The human cytomegalovirus US28 protein is located in endocytotic vesicels and undergoes constitutive endocytosis and recycling., Mol. Biol. Cell 12(6), 1737–1749 (2001). [95] Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., and Kjeken R. Clathrin-dependent endocytosis., Biochem. J. 377, 1–16 (2004). [96] Gatinetdinov P.R., Premont R.T., Bohn L.M., Lefkowitz R.J., and Caron M.G. Desensitization of G protein-coupled receptors and neuronal functions., Annu. Rev. Neurosci. 27, 107–144 (2004). [97] Lui B and Stinski M.F. Human Cytomegalovirus contains a tegument protein that enhancer transcription from the enhances transcription from promoters with upstream ATF and AP-1 cis-acting elements., J. Virol. 66, 4434–4444 (1992). 95 Literatur [98] Milligan G. and Bouvier M. Methods to minitor the quaternary structure of G protein-coupled receptors., FEBS J. 272, 2914–2925 (2005). [99] Romano C., Yang W.L., and O’Malley K.L. Metabotropic glutamate receptor 5 is a disulfide-linked dimer., J. Biol. Chem. 271, 28612–28616 (1996). [100] Zaki E. AbdAlla S., Lother H., and Quitterer U. Involvement of the amino terminus of the B(2) receptor in agonist-induced receptor dimerization., J. Biol. Chem. 274, 26079–26084 (1999). [101] Ray K., Hauschild B.C., Steinbach P.J., Goldsmith P.K., Hauache O., and Spiegel A.M. Identification of the cysteine residues in the amino-terminal extracellular domain of the human Ca(2+) receptor critical for dimerization. Implications for function of monomeric Ca(2+) receptor., J. Biol. Chem. 274, 27642–27650 (1999). [102] Cvejic S. and Devi L.A. Dimerization of the delta opioid receptor: implication for a role in receptor internalization., J. Biol. Chem. 272, 26959–26964 (1997). [103] Maggio R., Barbier P., Fornai F., and Corsini G.U. Functional role of the third cytoplasmic loop in muscarinic receptor dimerization., J. Biol. Chem. 271, 31055– 31060 (1996). [104] Kerppola T.K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells., Nature Protocols 1, 1278–1286 (2006). [105] Tschische P., Tadagaki K., Kamal M., Jockers R., and Waldhoer M. Heteromerization of human cytomegalovirus encoded chemokine receptors., Biochem. Pharmacol. epub ahead of print (2011). [106] Neote K., DiGregorio D., Mak J.Y., Horuk R., and Shall T.J. Molecular cloning, functional expression, and signaling characteristics of a C-C chemokine receptor., Cell 72(3), 415–425 (1993). [107] Ferre S., Baler R., Bouvier M., Caron M.G., Devi L.A., Durroux T., and et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers., Nat. Chem. Biol. 5(3), 131–134 (2009). [108] Horton C.A. Ashall L., Nelson D.E., Paszek P., Harper C.V, Sillitoe K., and et al. Pulsatile stimulation determines timing and specifity of NF-kappaB-dependent transcription., Sciene 324(5924), 242–246 (2009). 96 Literatur [109] Terillon. Roles of G-protein-coupled receptor dimerization., EMBO Rep. 5(1), 30–34 (2004). [110] Sodhi A., Montaner D., and Gutkind J.S. Viral hijacking of G-protein-coupledreceptor signalling networks., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 998–1012 (2004). [111] Reddehase M. Cytomegaloviruses- molecular biology and immunology., Caister Academic Press (2006). [112] Compton T., Nepomuceno R.R., and Nowlin D.M. Human cytomegalovirus penetrates host cells by pH-independent fusion at the cell surface., Virology 191, 387–395 (1992). [113] Ryckman B.J., Jarvis M.A., Drummond D.D., Nelson J.A., and Johnson D.C. Human cytomegalovirus entry into epithelia and endothelial cells depends on genes UL128 to UL150 and occurs by endocytosis and low-pH fusion., J. Virol. 80, 710–722 (2006). [114] Spaete R.R. and Mocarski E.S. regulation of cytomegalovirus gene expression: alpha und beta promoters are trans activated by viral functions in permissive human fibroblasts., J. Virol. 56, 135–143 (1985). [115] Stinski M.F. and Roehr T.J. Activation of the major immediate early gene of human cytomegalovirus by cis-acting elements in the promoter-regulatory sequence and by virus-specific trans-acting components., J. Virol. 55, 431–441 (1985). [116] Pin J.P., Kniazeff J., Liu J., Binet V., Goudet C., Rondard P., and Prezeau L. Allosteric functioning of dimeric class C G-protein-coupled receptors., FEBS 272, 2947–2955 (2005). [117] Vischer H.F., Leurs R., and Smit M.J. HCMV-encoded G-protein-coupled receptors as constitutively active modulators of signaling networks., Trends Pharmacol. Sci. 27, 56–63 (2006b). [118] Schöneberg T., Schulz A., Biebermann H., Hermsdorf T., Rompler H., and Sangkuhl K. Mutant G-protein-coupled receptors as a cause of human diseases., Pharmacol. Ther. 104, 173–206 (2004). [119] Ishov A.M., Vladimirova O.V., and Maul G.G. Daxx-mediated accumulation of human cytomegalvirus tegument protein pp71 at ND10 facilitates initiation of viral infection at these nuclear domains., J. Virol. 76, 7705–7712 (2002). 97 Literatur [120] Ho M. Epidemiology of cytomegalovirus infections., Rev. Infect. Dis. 12, 701–710 (1990). [121] Morell M., Espargaro A., Aviles F.X., and Ventura S. Study and selection of in vivo protein interactions by coupling bimolecular fluorescence complementation and flow cytometry., Nature Protocols 3, 22–33 (2008). [122] Premont R.T. Once and future signaling: G protein-coupled receptor kinase control of neuronal sensitivity., Neuromolecular Med. 7, 129–147 (2005). [123] Bünemann M. and Hosey M.M. G-protein coupled receptor kinases as modulators of G-protein signalling., J. Physiol. 517, 5–23 (1999). [124] Chee M.S., Bankier A.T., Beck S., Bohni R., Brown C.M., Cerny R., Horsnell T., Hutchinson C.A. 3rd, Kouzarides T., Martignetti J.A., and et al. Analysis of the potein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD169., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154, 125–169 (1990). 98 Danksagung Danksagung Danke an meinen Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Michel, der mir während der Dissertation eine sehr große Hilfe war. Geduldig hat er all meine Fragen beantwortet und mit neuen, interessanten Ideen zum Gelingen meiner Arbeit beigetragen. Danke an Herrn Prof. Dr. Mertens, dass er mich in seiner Abteilung meine Doktorarbeit absolvieren ließ und für die Bereitschaft, diese zu korrigieren. Danke an Herrn Prof. Dr. Weidemann, für die Erstellung des Zweitgutachtens. Danke an Dr. Axel Schubert, Ramona Ansorge und Manuela Michel. Ohne sie wäre die Zeit im Labor nur halb so schön gewesen. Sie haben mich unterstützt und sind mir immer mit Rat und Tat zur Seite gestanden. Ich bin ihnen sehr dankbar, für ihre Freundschaft und Geduld. Danke an alle Mitarbeiter des Instituts, die auf unterschiedliche Weise zur Erstellung meiner Doktorarbeit und zu einer tollen, kollegialen Atmosphäre beigetragen haben. Danke an Stephanie Glatz, Achim Jerg, Stefan Becker, Carina Bayer, Benjamin Renner, Daniela Fischer und Martin Schauflinger für den vielen Spaß, den wir sowohl im Labor und auch außerhalb hatten. Danke an meinen Vater, der geduldig meine Arbeit korrigiert hat, auch wenn er vielleicht nicht alles verstanden hat. King) Olli, die oft auf mich Danke an meine Familie und meinen Freund ( verzichten mussten und meine Launen geduldig ertragen haben. 99
