Aminosäureanalyse

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Aminosäureanalyse
1.
Freisetzung der Aminosäuren
a.
Enzymatische Hydrolyse
b.
Chemische Hydrolyse
i.
Saure Hydrolyse
ii.
Schnelle Hydrolyse
iii.
Basische Hydrolyse
2.
Nachweis der Aminosäuren
a.
Derivatisierung
b.
Dünnschichtchromatographie
c.
Elektrophorese
d.
Kapillarelektrophorese
e.
Flüssigkeitschromatographie
f.
Gaschromatographie
g.
Massenspektrometrie
3.
Seltene und modifizierte Aminosäuren
a.
Phosphoaminosäuren
b.
Glykoaminosäuren
c.
Weitere Aminosäuren
4.
Anwendungen
a.
Proteinanalytik
b.
Urinanalytik
Saure Hydrolyse
Moore (1963)
•
6 mol/L HCl, 110C, 24 h unter Ausschluss von Sauerstoff
Kompromiss zwischen Freisetzung und Stabilität der Aminosäuren
•
Ile-Val, Val-Val, Ile-Ile Bindungen sehr stabil (bis zu 96 h)
•
10-40% Verlust an Serin, Threonin und Methionin
•
50-100% Verlust an Cystein, Tryptophan, Phosphoaminosäuren
•
Hydrolyse von Asparagin und Glutamin (Asp, Glu)
Bei der Hydrolyse werden am leichtesten Kontaminationen eingebracht:
•
Oberflächen, Gefäße, Lösungsmittel
Gasphasenhydrolyse:
•
Reduktion der Verunreinigungen
•
sensitivere Analysetechnik
•
Standardbedingungen: 4 h bei 145C oder 1,5 h bei 165C
Alternative Säuren:
•
Propionsäure/HCl (1:1) bei 160C über 15 min
•
Trifluoressigsäure/HCl (1:2) bei 166C über 25 min
•
Organische Säuren: Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure:
Höhere Tryptophanausbeute von bis zu 90%
Sauerstoffausschluss: mehrfaches evakuieren und Stickstoff einleiten
•
reduziert Verluste von Methionin und Tryptophan durch Oxidation
•
Zusatz von Antioxidantien: 1% Phenol, 0,5% Thioglykolsäure,
0,1% 2-Mercaptoethanol
Mikrowellenhydrolyse:
Hydrolysezeit von wenigen Minuten!
Alkalische Hydrolyse
•
•
wird nur sehr selten angewandt
dient der Verbesserung der Tryptophanausbeute
Bedingungen
•
4 mol/L Barium-, Natrium- oder Lithiumhydroxid, 18-70 h bei 110C
•
Reaktionsansatz muss nach der Hydrolyse neutralisiert werden
•
Bariumionen werden mit Carbonat oder Sulfat gefällt
•
Spezielle Gefäße notwendig da Glas geätzt wird (Silikate
begünstigen Nebenbedingungen)
Anwendung
•
Säurelabile Modifikationen
•
Einsatz bei Lebensmittelanalyse
•
Identifizierung von Phosphoserin (basenlabil)
pTyr ist stabil und pThr wird nur langsam dephosphoryliert
Freisetzung von radioaktivem 32P-Phosphat
Enzymatische Hydrolyse
•
•
•
wird nur sehr selten angewandt
Glutamin und Asparagin werden nicht desamidiert
schonender Nachweis sulfatierter und phosphorylierter Aminosäuren
Einsatz verschiedener Endo- und Exopeptidasen mit breiter Spezifität
z.B. Pronase (Gemisch unspezifischer Proteasen)
Derivatisierung
Ideales Derivatisierungsreagenz
•
reagiert mit primären und sekundären Aminen
•
quantitative reproduzierbare Reaktion
•
nur ein Reaktionsprodukt pro Aminosäure
•
sensitive Detektion (Absorption, Fluoreszenz)
•
Reagenz soll Analytik nicht stören
•
milde Derivatisierungsbedingungen
Nachsäulenderivatisierung
•
Trennung der freien Aminosäuren (Ionenaustauscher)
•
Derivatisierung nach der Säule aber vor dem Detektor
Ninhydrin
•
Reaktionsschleife, 120C
•
Detektion bei 570 nm
•
Prolin und Hydroxyprolin ergeben gelbliches Produkt (440 nm)
•
Detektion der Aminosäuren erfolgt nicht über die Derivate sondern
nur über die Retentionszeit (Quantitativ)
Ionenaustausch-Chromatographie
Trennung
•
Citratpuffer pH 2
•
Stufengradient mit steigender Ionenstärke und ansteigendem pH
•
Nachweisgrenze ca. 50 pmol
ortho-Phthaldialdehyd (OPA)
•
reagiert nur mit primären Aldehyden
•
fluoreszierendes Isoindol-Derivat
Anregung 330 nm, Emission 460 nm
UV-Absorption bei 230 nm
•
Raumtemperatur; pH 9,5; Reaktionszeit: wenige Minuten
•
•
Sekundäre Amine reagieren nicht
Nachweisgrenze 50 pmol (Fluoreszenz)
Vorsäulenderivatisierung
•
•
•
•
•
•
•
durch Entwicklung der RP-HPLC ermöglicht
polare Aminosäuren werden durch Derivatisierung deutlich
hydrophober
kurze Trennzeiten (15 min)
gesteigerte Nachweisempfindlichkeit durch Chromo- und Fluorophore
Nachweisgrenzen teilweise bei 50 fmol (in Praxis nicht zu erreichen)
Probenvorbereitung limitierend
zumeist vollständig automatisiert
Reagenzien
ortho-Phthaldialdehyd (OPA)
•
unterschiedliche Thiole werden eingesetzt
2-Mercaptoethanol, Ethanthiol, 3-Mercaptopropionsäure
•
je nach Thiol unterschiedliche Hydrophobizität und Stabilität
•
unterschiedliche chromatographische Bedingungen
•
Nachweisgrenzen:
UV-Absorption
10 pmol
Fluoreszenz
100 fmol
Reagenzien
Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC)-chlorid
•
reagiert mit primären und sekundären Aminen sehr schnell (pH 4,2)
•
Absorption bei 260 nm
•
Fluoreszenz bei 305 nm (Anregung: 266 nm)
•
Detektionsgrenze: 50 fmol
Dabsylchlorid (DABS-Cl)
•
4- Dimethylaminoazobenozol-4'-sulfonylchlorid
•
reagiert mit primären und sekundären Aminen
•
Bedingungen: 70C, pH 9,0, 15 min
•
Absorptionsmaximum bei 436 nm
•
hohe Stabilität der Derivate
•
Nachteil: genau vierfache Reagenzmenge notwendig
•
Nachweisgrenze: 1 pmol
Quantifizierung
Nullwertanalyse
Hintergrund in Lösungsmittel, Gefäßen usw. abziehen
Analyse ohne Probe
Interne Standards
Norleucin, -Alanin in definierter Menge der Probe zusetzen
korrigiert Verluste der einzelnen Analyseschritte
Korrekturfaktoren
unvollständige Hydrolyse
hydrophobe Aminosäuren, Val-Val, Leu-Leu, Ile-Ile usw.
Hydrolyse bei 24, 48 und 72 h, Extrapolation auf 100 h
Zerstörung der Aminosäuren
Serin, Threonin, Tryptophan usw.
Hydrolyse bei 24, 48 und 72 h, Extrapolation auf 0 h
Unvollständige Derivatisierung
Mehrere Peaks pro Aminosäure
Cystein
Amino acid
Effekte
Saure Hydrolyse
Glu, Ser, Gly
Kontaminationen in Lösungsmitteln, Gefäßen
Thr, Ser
langsam zerstört
Trp, Cys, Asn, Gln
Nahezu komplett durch zerstört
Tyr, Met
Werden oxidiert
Val, Ile, Leu
hydrophoben Bindungen hydrolysieren langsam
Vorsäulenderivatisierung
Pro
Geringe Ausbeute, schlecht zu quantifizieren
Nachsäulenderivatisierung
Asp, Glu
Sehr starke Signale, schwer zu quantifizieren
Oft Nebenprodukte
Allgemein
Matrixeffekte stören die Quantifizierung
Reagenz
Detektion
Nachweisgrenze
Analysezeit
Reaktion
Ninhydrin
UV 570 nm, 440 nm
50 pmol
80 min
prim./sek. Amine
PITC
UV 245 nm
10 pmol
30 min
prim./sek. Amine
Fluorescamin
Fluoreszenz
390 nm/475 nm
90 min
prim. Amine
Dabsyl-Cl
UV 436 nm
1 pmol
30 min
prim./sek. Amine
OPA
UV 360 nm
Fluoreszenz
330 nm/460 nm
10 pmol
50 fmol
30 min
prim. Amine
FMOC
Fluoreszenz
266 nm/305 nm
50 fmol
30 min
prim./sek. Amine
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