Aminosäureanalyse
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Aminosäureanalyse 1. Freisetzung der Aminosäuren a. Enzymatische Hydrolyse b. Chemische Hydrolyse i. Saure Hydrolyse ii. Schnelle Hydrolyse iii. Basische Hydrolyse 2. Nachweis der Aminosäuren a. Derivatisierung b. Dünnschichtchromatographie c. Elektrophorese d. Kapillarelektrophorese e. Flüssigkeitschromatographie f. Gaschromatographie g. Massenspektrometrie 3. Seltene und modifizierte Aminosäuren a. Phosphoaminosäuren b. Glykoaminosäuren c. Weitere Aminosäuren 4. Anwendungen a. Proteinanalytik b. Urinanalytik Saure Hydrolyse Moore (1963) • 6 mol/L HCl, 110C, 24 h unter Ausschluss von Sauerstoff Kompromiss zwischen Freisetzung und Stabilität der Aminosäuren • Ile-Val, Val-Val, Ile-Ile Bindungen sehr stabil (bis zu 96 h) • 10-40% Verlust an Serin, Threonin und Methionin • 50-100% Verlust an Cystein, Tryptophan, Phosphoaminosäuren • Hydrolyse von Asparagin und Glutamin (Asp, Glu) Bei der Hydrolyse werden am leichtesten Kontaminationen eingebracht: • Oberflächen, Gefäße, Lösungsmittel Gasphasenhydrolyse: • Reduktion der Verunreinigungen • sensitivere Analysetechnik • Standardbedingungen: 4 h bei 145C oder 1,5 h bei 165C Alternative Säuren: • Propionsäure/HCl (1:1) bei 160C über 15 min • Trifluoressigsäure/HCl (1:2) bei 166C über 25 min • Organische Säuren: Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure: Höhere Tryptophanausbeute von bis zu 90% Sauerstoffausschluss: mehrfaches evakuieren und Stickstoff einleiten • reduziert Verluste von Methionin und Tryptophan durch Oxidation • Zusatz von Antioxidantien: 1% Phenol, 0,5% Thioglykolsäure, 0,1% 2-Mercaptoethanol Mikrowellenhydrolyse: Hydrolysezeit von wenigen Minuten! Alkalische Hydrolyse • • wird nur sehr selten angewandt dient der Verbesserung der Tryptophanausbeute Bedingungen • 4 mol/L Barium-, Natrium- oder Lithiumhydroxid, 18-70 h bei 110C • Reaktionsansatz muss nach der Hydrolyse neutralisiert werden • Bariumionen werden mit Carbonat oder Sulfat gefällt • Spezielle Gefäße notwendig da Glas geätzt wird (Silikate begünstigen Nebenbedingungen) Anwendung • Säurelabile Modifikationen • Einsatz bei Lebensmittelanalyse • Identifizierung von Phosphoserin (basenlabil) pTyr ist stabil und pThr wird nur langsam dephosphoryliert Freisetzung von radioaktivem 32P-Phosphat Enzymatische Hydrolyse • • • wird nur sehr selten angewandt Glutamin und Asparagin werden nicht desamidiert schonender Nachweis sulfatierter und phosphorylierter Aminosäuren Einsatz verschiedener Endo- und Exopeptidasen mit breiter Spezifität z.B. Pronase (Gemisch unspezifischer Proteasen) Derivatisierung Ideales Derivatisierungsreagenz • reagiert mit primären und sekundären Aminen • quantitative reproduzierbare Reaktion • nur ein Reaktionsprodukt pro Aminosäure • sensitive Detektion (Absorption, Fluoreszenz) • Reagenz soll Analytik nicht stören • milde Derivatisierungsbedingungen Nachsäulenderivatisierung • Trennung der freien Aminosäuren (Ionenaustauscher) • Derivatisierung nach der Säule aber vor dem Detektor Ninhydrin • Reaktionsschleife, 120C • Detektion bei 570 nm • Prolin und Hydroxyprolin ergeben gelbliches Produkt (440 nm) • Detektion der Aminosäuren erfolgt nicht über die Derivate sondern nur über die Retentionszeit (Quantitativ) Ionenaustausch-Chromatographie Trennung • Citratpuffer pH 2 • Stufengradient mit steigender Ionenstärke und ansteigendem pH • Nachweisgrenze ca. 50 pmol ortho-Phthaldialdehyd (OPA) • reagiert nur mit primären Aldehyden • fluoreszierendes Isoindol-Derivat Anregung 330 nm, Emission 460 nm UV-Absorption bei 230 nm • Raumtemperatur; pH 9,5; Reaktionszeit: wenige Minuten • • Sekundäre Amine reagieren nicht Nachweisgrenze 50 pmol (Fluoreszenz) Vorsäulenderivatisierung • • • • • • • durch Entwicklung der RP-HPLC ermöglicht polare Aminosäuren werden durch Derivatisierung deutlich hydrophober kurze Trennzeiten (15 min) gesteigerte Nachweisempfindlichkeit durch Chromo- und Fluorophore Nachweisgrenzen teilweise bei 50 fmol (in Praxis nicht zu erreichen) Probenvorbereitung limitierend zumeist vollständig automatisiert Reagenzien ortho-Phthaldialdehyd (OPA) • unterschiedliche Thiole werden eingesetzt 2-Mercaptoethanol, Ethanthiol, 3-Mercaptopropionsäure • je nach Thiol unterschiedliche Hydrophobizität und Stabilität • unterschiedliche chromatographische Bedingungen • Nachweisgrenzen: UV-Absorption 10 pmol Fluoreszenz 100 fmol Reagenzien Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC)-chlorid • reagiert mit primären und sekundären Aminen sehr schnell (pH 4,2) • Absorption bei 260 nm • Fluoreszenz bei 305 nm (Anregung: 266 nm) • Detektionsgrenze: 50 fmol Dabsylchlorid (DABS-Cl) • 4- Dimethylaminoazobenozol-4'-sulfonylchlorid • reagiert mit primären und sekundären Aminen • Bedingungen: 70C, pH 9,0, 15 min • Absorptionsmaximum bei 436 nm • hohe Stabilität der Derivate • Nachteil: genau vierfache Reagenzmenge notwendig • Nachweisgrenze: 1 pmol Quantifizierung Nullwertanalyse Hintergrund in Lösungsmittel, Gefäßen usw. abziehen Analyse ohne Probe Interne Standards Norleucin, -Alanin in definierter Menge der Probe zusetzen korrigiert Verluste der einzelnen Analyseschritte Korrekturfaktoren unvollständige Hydrolyse hydrophobe Aminosäuren, Val-Val, Leu-Leu, Ile-Ile usw. Hydrolyse bei 24, 48 und 72 h, Extrapolation auf 100 h Zerstörung der Aminosäuren Serin, Threonin, Tryptophan usw. Hydrolyse bei 24, 48 und 72 h, Extrapolation auf 0 h Unvollständige Derivatisierung Mehrere Peaks pro Aminosäure Cystein Amino acid Effekte Saure Hydrolyse Glu, Ser, Gly Kontaminationen in Lösungsmitteln, Gefäßen Thr, Ser langsam zerstört Trp, Cys, Asn, Gln Nahezu komplett durch zerstört Tyr, Met Werden oxidiert Val, Ile, Leu hydrophoben Bindungen hydrolysieren langsam Vorsäulenderivatisierung Pro Geringe Ausbeute, schlecht zu quantifizieren Nachsäulenderivatisierung Asp, Glu Sehr starke Signale, schwer zu quantifizieren Oft Nebenprodukte Allgemein Matrixeffekte stören die Quantifizierung Reagenz Detektion Nachweisgrenze Analysezeit Reaktion Ninhydrin UV 570 nm, 440 nm 50 pmol 80 min prim./sek. Amine PITC UV 245 nm 10 pmol 30 min prim./sek. Amine Fluorescamin Fluoreszenz 390 nm/475 nm 90 min prim. Amine Dabsyl-Cl UV 436 nm 1 pmol 30 min prim./sek. Amine OPA UV 360 nm Fluoreszenz 330 nm/460 nm 10 pmol 50 fmol 30 min prim. Amine FMOC Fluoreszenz 266 nm/305 nm 50 fmol 30 min prim./sek. Amine
