Untersuchungen über den Kollagenabbau durch Rattenorgane
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HOPPE-SEYLER'S Z. PHYSJOL. CHEM. Bd. 350, S. 1437—1448, November 1969 Untersuchungen über den Kollagenabbau durch Rattenorgane Differenzierung und Charakterisierung Prolinpeptid-spaltender Enzyme Von HEIDRUN KIRSCHKE und HORST HANSON A us dem Physiologisch-Chemischen Institut der Universität Halle an d. Saale* (Direktor: Prof. Dr. H. Hanson) (Der Schriftleitung zugegangen am 11. Juli 1969) Zusammenfassung: Einige prolin- und glycinhaltige Di- und Tripeptide, poly-Pro, ein am Aminoende geschütztes Pentapeptid (Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-DArg) und eine Kollagenpräparation (säurelösliches Kollagen) wurden auf ihre enzymatische Hydrolysierbarkeit durch Rattenorganhomogenate, Organzellfraktionen und Elektrophoresefraktionen vom Cytosol einiger Organe untersucht. Dabei ergaben sich u.a. folgende Befunde: 1. Prolinase, Prolidase und eine Pro-Gly-Gly-spaltende Tripeptidase sind im Cytosol von Niere und Leber lokalisiert. 2. Die Prolinase in den Organen der Ratte kann nicht durch Cd2@-Zusatz aktiviert werden wie die Prolinase aus Schweinenieren. 3. Die Prolidase aus dem Cytosol von Leber, Niere, Lunge und Gehirn der Ratte wandert bei der Elek- trophorese (Papier- und trägerfreie Elektrophorese, pH 7,4—8,6), am weitesten zur Anode. 4. Die Relationen der Hydrolyse von Pro-Gly-Gly und Gly-Gly-Gly sind in den untersuchten Organen sehr unterschiedlich. Die Pro-Gly-Gly-spaltende Aktivität ist im Cytosol der Niere und die Gly-Gly-Gly-spaltende in der Mikrosomenfraktion lokalisiert. 5. Eine geringe Hydrolyse des synthetischen Kollagenasesubstrates war lediglich in Nieren- und Uterushomogenat nachweisbar. 6. Die Kollagenpräparation wurde bei Istdg. Inkubation bei 30°C von Trypsin und Chymotrypsin schwach, von Nierenhomogenat stärker hydrolysiert. Die Hydrolyse des Kollagens wurde durch Bestimmungen von Hydroxyprolin, Reststickstoff, -Aminostickstoff und durch Bestimmungen von Stickstoff nach LOWRY nachgewiesen. Summary: Studies on the degradation of collagen by rat organs. Differentiation and characterisation of proline peptide-cleamng enzymes. The enzymic hydrolysis of some Pro- and Gly-containing di- and * Postanschrift: Prof. Dr. H. HANSON, DDR-402 Halle (Saale), Hollystraße I. Abkürzungen: Pz- = p-Phenylazo-benzyloxycarbonylEnzyme: Chymotrypsin A (EC 3.4.4.5) Clostridiopeptidase A (EC 3.4.4.19) Iminodipeptidase (= Prolinase), L-Prolyl-Aminosäure-Hydrolase (EC 3.4.3.6) Imidodipeptidase (= Prolidase), Aminoacyl-]>Prolin-Hydrolase (EC 3.4.3.7) Leucinaminopeptidase, L-Leucyl-Peptid-Hydrolase (EC 3.4.1.1) Papain (EC 3.4.4.10) Prolin-Iminopeptidase, L-Prolyl-Peptid-Hydrolase (EC 3.4.1.4) Subtilopeptidase A (EC 3,4.4.16) Trypsin (EC 3.4.4.4) Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM 1438 H. KIRSCHKE und H. HANSON ßd. 350 (1969) tripeptides, poly-Pro, an Af-protected pentapeptide (Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg) and a collagen preparation (acid-soluble collagen) by rat organ homogenates, organ cell fractions and electrophoretic fractions of the cytosol of some organs was investigated. 1. Prolinase, prolidase and a Pro-Gly-Gly-cleaving tripeptidase are localized in the cytosol of liver and kidney. 2. Unlike the prolinase of pig kidney, the prolinase in the organs of the rat is not activated by Cd2®. 3. In electrophoresis (paper and carrier-free, pH 7.4—8.6), the prolidase from the cytosol of rat liver, kidney, lung and brain shows the furthest anodic migration. 4. The relative rates of hydrolysis of Pro-Gly-Gly and Gly-Gly-Gly vary greatly for different organs. The Pro-Gly-Gly-cleaving activity is localized in the cytosol of the kidney and the Gly-Gly-Glycleaving activity in the microsomal fraction. 5. A low hydrolysis of the synthetic collagen substrate could only be detected in kidney and uterus homogenate. 6. After incubation for l h at 30 °C, the collagen preparation was weakly hydrolyzed by trypsin and chymotrypsin and more strongly by kidney homogenate. The hydrolysis of the collagen was determined by measurement of hydroxyproline, residual N, -amino-N and LowRY-N. Als Spaltprodukte des enzymatischen Kollagenabbaues bei Mensch und Tier sind prolin- und hydroxyprolinhaltige Peptide verschiedener Kettenlänge nachgewiesen, deren Ausscheidung im Harn festgestellt wurde1"3. Die vorliegende Arbeit soll zur Aufklärung des enzymatischen Abbaues kleinerer Kollagenspaltprodukte durch Organenzyme der Ratte beitragen. Hauptsächlich wurde auf solche Fermentwirkungen geprüft, die prolinund hydroxyprolinhaltige Peptide hydrolysieren. Allein 8—9% aller Aminosäurereste im Kollagen sind Hyp, 14% Pro und etwa 30% Gly. Wie aus Strukturuntersuchungen hervorgeht4, macht die Sequenz Gly-Pro allein 22 bis 24% aller Aminosäuren des Kollagens aus. Vom gesamten Pro des Kollagens sind nach den Ergebnissen von GRASSMANN4 75 % in der Sequenz Gly-Pro enthalten. Die Hydrolyse eines Di-, Tri- oder Polypeptids mit TV-terminaler Iminogruppe oder mit peptidgebundenem Imidostickstoff erfordert die Einwirkung speziell darauf eingestellter Peptidasen. Eine Proliniminodipeptidase (Prolinase), die Dipeptide mit TV-terminalem Pro oder Hyp hydrolysiert und eine. Prolinimidodipeptidase (Prolidase), die Dipeptide mit C-terminalem Pro oder Hyp spaltet, konnten in verschiedenen Organen nachgewiesen werden. Von SARID et al.5 wurde eine Proliniminopeptidase- aktivität in Organen der Ratte festgestellt. Dieses Ferment spaltet nur JV-terminales Pro von Di-, Tri- und Polypeptiden ab. Die Hydrolyse von ProGly-Gly bewirkt eine Aminotripeptidase6»7 die außerdem auch andere Tripeptide zu spalten vermag. Fermentaktivitäten, die spezifisch Tripeptide mit C-terminalem Pro in der Sequenz, z.B. GlyGly-Pro hydrolysieren, sind in tierischen Zellen nicht bekannt. Erst kürzlich wurde über eine Peptidase in Schweinenieren berichtet8»9, die Tripeptide mit mittelständigem Pro spaltet. 1 S. ANSORGE, S. FITTKAU u. H. HANSON, diese Z. 324, 17 [1961]. 2 S. ANSORGE u. H. HANSON, diese Z. 348, 334 [1967]. 3 H. HANSON u. B. WIEDERANDERS, Clin. chim. Acta [Amsterdam], im Druck. 4 W. GRASSMANN, J. ENGEL, K. HANNIG, H. HÖRMANN, K. KÜHN u.A. NORD WIG, Fortschr. Chem. org. Naturstoffe [Wien] 23, 195 [1965]. Methodik /. Substrate Wenn nicht anders vermerkt, wurden die Substrate nach der gemischten Anhydridmethode10 unter Verwendung von Chlorameisensäure-äthylester bzw. -isobutylester synthetisiert. 1. L-Pro-Gly als Substrat für Iminodipeptidase (EC 3.4.3.6) N-Gehalt: Ber. 14,75% Gef. 14;87% [a]*0 = -22,85° (c = 4,9 in Wasser) 5 S. SARID, A. BERGER u. E. KATCHALSKI, J. biol. Chemistry 237, 2207 [1962]. 6 E. ADAMS, N. C. DAVIS u. E. L. SMITH, J. biol. Chemistry 199, 845 [1952]. 7 S. WURSTER, Dipl.-Arbeit, unveröff., Univ. Halle 1964. 8 P.DEHM u. A.NORDWIG, Vortrag, 5, FEBS-Meeting, Prag 1968. 9 A. NORDWIG u. P. DEHM, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 160, 293 [1968]. 10 H. N. RYDON u. P. W. G. SMITH, J. ehem. Soc. [London] 1956, 3642. Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM Bd. 350 (1969) Kollagenabbau durch Rattenorgane 2. L-Hyp-Gly als Substrat für die Iminodipeptidase (EC 3.4.3.6) N-Gehalt: Ber. 14,89% Gef. 14,73% [a]20 = -19,2° (c = 5 in Wasser) 3. Gly-L-Pro als Substrat für die Tmidodipeptidase (EC 3.4.3.7) N-Gehalt:.Ber. 16,28% Gef. 16,10% [a]20 = - 108,0° (c = 2,75 in Wasser) 4. Gly-L-Pro-Gly als Substrat für eine Tripeptidase N-Gehalt: Ber. 18,34% Gef. 18,41 % [a]20 = -109,0° (c = 2 in Wasser) 5. Gly-Gly-L-Pro als Substrat für eine Tripeptidase N-Gehalt: Ber. 18,34% Gef. 18,40% [a]20 = -100,4° (c = 2,1 in Wasser) 6. L-Pro-Gly-Gly als Substrat für eine Tripeptidase N-Gehalt: Ber. 18,34% Gef. 18,20% [a]20 = -19,5° (c = 2 in Wasser) 7. Gly-Gly-Gly als Substrat für eine Tripeptidase N-Gehalt: Ber. 22,22% Gef. 22,3% (nach E. FiscHER11 synthetisiert) 8. L-Pro-ß-Naphthylamid · HBr als Substrat für eine Prolylpeptid-Hydrolase N-Gehalt:' Ber. 8,72% Gef. 8,66% [a]20 = -27,5° (c = 2 in Methanol) 9. L-Leucinamidacetat als Substrat für die Leucinaminopeptidase (EC 3.4.1.1). Die Synthese erfolgte nach den Angaben yon CHAMBERS und CARPENTER12. N-Gehalt: Ber. 14,75% Gef. 14,70% [a]20 = +10,0° (c = 5 in Wasser) 10. Poly-jL-Pro I und II als Substrate für die Proliniminopeptidase. Poly-Pro II wurde im wesentlichen nach der Vorschrift von RANDALLIS bereitet. Eine Reinigung und Abtrennung niedermolekularer Substanzen erfolgte an Sephadex G-50 in Eisessig/Wasser 1:3. Für die weiteren Versuche wurden nur die mit der Front eluierbaren Anteile des Polymeren 11 E. FISCHER, Untersuchungen über Aminosäuren, Polypeptide und Proteine, S. 350, Springer-Verlag, Berlin 1906. 12 R. W. CHAMBERS u. F. H. CARPENTER, J. Amer. ehem. Soc. 77, 1522 [1955]. 13 A. A. RANDALL, J. ehem. Soc. [London] 1962, 374. 1439 verwendet. Poly-Pro I wurde aus poly-Pro II nach einer „reverse mutarotation"14 in Eisessig/1-Propanol gewonnen. N-Gehalt: Gef. 14,1% poly-Pro I [a]20 = - 99,2° (c = 1,25 in Eisessig) poly-Pro II [a]20 = -520° (c = 0,25 in Eisessig) 11. Pz-L-Pro-L-Leu-Gly-L-Pro-D-Arg als Substrat die Clostridiopeptidase A (EC 3.4.4.19). Das Aminoende geschützte Pentapeptid wurde im sentlichen nach den Angaben von WÜNSCH HEiDRiCH15 synthetisiert. N-Gehalt: Ber. 17,23% Gef. 17,14% für am weund 12. SäurelöslichesKollagen alsSubstrat für Kollagenase. Zur Anwendung gelangte säurelösliches Kollagen aus Rattenschwanzsehnen. Die Präparation wurde in Anlehnung an die Angaben von GALLOP16 bereitet. Die zerkleinerten Schwanzsehnen wurden mit Natriumacetat und der Rückstand mit Citratpuifer extrahiert. Aus dem letztgenannten Extrakt wurde durch Dialyse gegen Na2HPÜ4 das säurelösliche Kollagen gefällt. Eine Lösung dieser Präparation in 0,05M Essigsäure wurde als Substrat verwendet. Die Lösungen (pH 3-—4) waren 0,2- bis 0,4proz. an Kollagen. Zur Ermittlung des Kollagengehaltes dienten quantitative Stickstoff-3 7 und HydroxyprolinBestimmungen18. Der Berechnung des Kollagengehaltes wurden die Angaben von GALLOP und SEIFTER19 (18,8% N in Kollagen) und die von NEUMAN und LoGAN20 (13,4% Hyp in Kollagen) zugrunde gelegt. //. Aktwitätsbestimmungen und Inkubationsansätze Nach enzymatischer Hydrolyse wurden folgende Aminosäuren mit den angegebenen Methoden quantitativ bestimmt. 1. Prolin als Ninhydrinkomplex bei pH 1,521, 14 1. Z. STEINBERG, W. F. HARRINGTON, A. BERGER, M. SELA u. E. KATCHALSKI, J. Amer. ehem. Soc. 82,5263 [I960]. 15 E. WÜNSCH u. H.-G. HEIDRICH, diese Z. 332, 300 [1963]. 16 P. M. GALLOP, Arch. Biochem. Biophysics 54, 486 [1955]. 17 p. BOHLEY, diese Z. 348, 100 [1967]. 18 J. F. WOESSNER, JR., Arch. Biochem. Biophysics 93,440 [1961]. 19 P. M. GALLOP u. S. SEIFTER, Methods in Enzymol. 6, 635 [1963]. 20 R. E. NEUMAN u. M. A. LOGAN, J. biol. Chemistry 186, 549 [1950]. 21 H. HANSON, P. BOHLEY, D. GLÄSSER u. H. KIRSCHKE, Acta biol. med. german. 11, 736 [1963]. Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM 1440 H. KIRSCHKE und H. HANSON 2. Hydroxyprolin nach Oxydation (ChloraminT - Natrium -/7-toluolsulfonchloramid) mit p-Aminobenzaldchyd18, 3. Glycin und Lcucin papicrchromatographisch21, 4. ß-Naphthylamin nach Diazotiercn und Kupplung mit A^-Naphthyl-(i)-äthylendiamin 22 . Die enzymatische Hydrolyse von Gly-Gly-Gly wurde mit der Nickel-Biuret-Methode23 und die des Pz-ProLeu-Gly-Pro-D-Arg nach der Methode von WÜNSCH und HEiDRicH24 quantitativ bestimmt. Bei der enzymatischcn Hydrolyse des Kollagens wurden nur die Peptidc als Spaltprodukte erfaßt, die bei 4°C in 6proz. Trichloressigsäure und 20proz. Methanol löslich waren. In diesem Trichloressigsäure-Methanol-Uberstand wurden Ammo-Stickstoff25·26, Rest-Stickstoff17 und, nach Hydrolyse in ON HC1, Hydroxyprolin18 bestimmt. Die Inkubationsansätze mit Peptidsubstraten waren wie folgt zusammengesetzt: 0,1 ml Substrat, 0,2 ml Puffer und Effektor, 0,2 m/ Fermentlösung. Die Substrate waren 2 · 10~2M außer Proß-naphthylamid 2,5 · 10~3M, Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-DArg 5 · 10~3M, poly-Pro 0,3proz. im Ansatz. Die Ansätze mit Kollagen als Substrat enthielten: 0,25 ml 0,2—0,4proz. Kollagen in 0,05M Essigsäure; 0,25 ml Puffer und die berechnete Menge NaOH zur Einstellung von pH 7,0;, 0,1 ml Enzymlösung. Nach Durchmischen des Substrates mit Puffer, NaOH und Enzym erstarrte der gesamte Inkubationsansatz gallertartig und verflüssigte sich während der Bebrütung je nach Stärke der Enzymwirkung wieder. Bd. 350(1969) in der VaP-Apparatur der Firma Bender & Hobein, München. Für die trägerfreie Elektrophorese wurden Tris- und Phosphatpuffer, pH 7,4—8,6, eingesetzt. Bei 40 V/cm2 konnten bis zu 27 mg Protein/Std. getrennt werden. Folgende kristallisierte Enzyme wurden verwendet: Trypsin (EC 3.4.4.4) Serva, Chymotrypsin (EC 3.4.4.5) Spofa Papain (EC 3.4.4.10) Serva, Clostridiopeptidase A (EC 3.4.4.19) Serva, Pronase Serva, Subtilopeptidase A (EC 3.4.4.16) Serva. IV. Protein-Bestimmung Der Proteinstickstoff-Gehalt eines Homogenats oder einer Fermentpräparation diente als Bezugswert für die Fermentaktivität. Die Protein- und Stickstoff-Bestimmungen wurden nach KiELDAHL27, nach einer Ultramikro-Methode von BOHLEYI? und nach LowRY28 durchgeführt. Ergebnisse /. Hydrolyse der untersuchten Peptide durch rohe Homogenate In Tab. l sind die spezifischen Aktivitäten verschiedener Organhomögenate der Ratte gegenüber eingesetzten Peptiden zusammengestellt. Die Hydrolysenraten sind Mittelwerte aus 8—50 Versuchen. Dazu wurde die mittlere Abweichung vom Mittelwert angegeben. Die Inkubationen wurden bei den entsprechenden pH-Aktivitätsoptima durchgeführt: Leu-NH2: pH 8,9-9,029>30; Pro-Gly, Hyp-Gly: pH 7,9-8,031; Gly-Pro:pH7,9-8,032; Pro-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Pro, Gly-ProGly: pH 7,9-8,0. . FennentpräparatIonen Die verwendeten Organhomögenate der Ratte (Leber, Niere, Herz, Lunge, Milz, Gehirn, Uterus) enthielten meist 0,1 % Triton. Zur Zellfraktionierung wurden die zerschnittenen Organe mit 0,44M Rohrzuckerlösung verdünnt, vorsichtig unter Eiskühlung homogenisiert und fraktioniert zentrifugiert. Dabei wurden folgende Fraktionen erhalten: Kernfraktion (Sediment nach 10 Min. bei 660 xg), Mitochondrien und Lysosomen (Sediment nach 20 Min. bei 8500 x^), Mikrosomen (Sediment nach 60 Min. bei 105000 x^) und Cytosol Das Nierenhomogenat besitzt für beinahe alle ein(Überstand nach 60 Min. bei 105000 x^). Alle Frak- gesetzten Peptide die höchste hydrolytische Aktitionen wurden gewaschen und die vereinigten Wasch- 27 K. HINSBERG u. K. LANG, Medizinische Chemie, wässer als Restfraktion zu Bilanzzwecken bei den InS. kubationen mit eingesetzt. Elektrophoresen erfolgten 28 511, Urban & Schwarzenberg, München/Berlin 1951. O. H. LOWRY, N. J. ROSEBROUGH, A. L. FARR u. 22 A. C. BRATTON u. E. K. MARSHALL, J. biol. Chemistry R. J. RANDALL, J. biol. Chemistry 193, 265 [1951]. 29 E. L. SMITH u. D. H. SPACKMAN, J. biol. Chemistry V128, 537 [1939]. 23 H. KIRSCHKE u. H. HANSON, Acta biol. med. german. 212, 271 [1955]. 30 16, 264 [1966]. H. HANSON, D. GLÄSSER u. H. KIRSCHKE, diese Z. 24 E. WÜNSCH u. H.-G. HEIDRICH, diese Z. 333, 149 340, 107 [1965]. 31 [1963]. H.HANSON u. H.KIRSCHKE, Z. Vitamin-, Hormon- u. 25 H. ROSEN, Arch. Biochem. Biophysics 67, 10 [1957]. Fermentforsch. [Wien] 11, 343 [1960/61]. 26 K. SATAKE, T. OKUYAMA, M. OHASHI u. T. SHINODA, 32 E. ADAMS u. E. L. SMITH, J. biol. Chemistry 198, 671 J. Biochemistry [Tokyo] 47, 654 [I960]. [1951]. Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM Bd. 350 (1969) Kollagenabbau durch Rattenorgane 1441 Tab. 1. Spezifische Aktivitäteil (Organhomogenate). Die spezif. Aktiv, wurden in ! abgespaltene Aminosäure/l mg Proteinstickstoff und m/ Ansatz je Std. angegeben (Mittelwerte aus 8 bis 50 Versuchen), inkubationsansätze: 2 · 10~2M Substrate in Tris- oder Phosphatpuffer, pH 7,9 (Leu-NH2: pH 9,0), ohne Zusatz von Effektoren bei 38°C inkubiert. (Weitere Angaben s. unter Methodik II.) l: Gly wurde quantitativ (papierchromatographisch) bestimmt. 2: Pro wurde quantitativ bestimmt (freies Pro entsteht erst durch sekundäre enzymatische Hydrolyse). Niere Leu-NH2 Pro-Gly Hyp-Gly Gly-Pro Pro-Gly-GIy Gly-Gly-Gly Gly-Gly-Pro 1 2 Gly-Pro-Gly 1 2 •82,8 ± 9,2 37,0 ± 3,6 19,2 ± 6,1 28,4 ± 5,0 59,4 ± 8,1 250,0 ±28,1 172,0 ±31,3 31,7 ± 4,1 39,8 ± 7,1 27,7 ± 5,3 Leber 74,1 ± 12,0 ± 5,8 ± 5,4 ± 60,3 ± 36,8 ± , ± 5,9 ± 3,7 ± 2,1 ± 8,7 3,0 2,2 3,0 10,3 4,3 2,9 1,2 1,0 0,8 vität. Auffallend sind die unterschiedlichen Relationen, in denen Gly-Gly-Gly und Pro-Gly-GIy in den verschiedenen Organen hydrolysiert werden. Es kann jedoch nichts darüber ausgesagt werden, ob an der Hydrolyse lediglich ein Ferment mit unterschiedlicher Spezifität in den einzelnen Organen oder mehrere,-Fermente beteiligt sind. Untersuchungen anderer Autoren6»7 sprechen dafür, daß beide Substrate durch eine Aminotripeptidase gespalten werden. Die primäre Hydrolyse der Tripeptide Gly-Gly-Pro und Gly-Pro-Gly betrifft, wie wir papierchromatographisch nachweisen konnten, die Abspaltung der ^ferminalert Aminosäure. Die sekundäre Spaltung dieser beiden Peptide wurde nach Inkubation mit Organhomogenaten durch quantitative Bestimmung von Prolin ermittelt (s. Tab. 1). //. Verteilung der Enzymaktivitäten in den Zellfraktionen von Leber und Niere Zwecks weiterer Differenzierung der in den Homogenaten ermittelten Fermentaktivitäten wurde versucht, ihre Lokalisätion in den Zellbestandteilen zu bestimmen. Die Substrate wurden mit den Zellfraktionen (s. S. 1440) ohne Zusatz von Effektoren bei dem jeweiligen optimalen pH-Wert (s. S. 1440) inkubiert. Aus Abb. l geht hervor, daß die Fermente der Lunge Milz Herz Gehirn 28,2 ± 2,0 24,4 ± 2,9 14,8 ± 3,6 11,0 ± 2,1 106,8 ±21, 2 168,5 ±11,0 18,5± 6,1 10,7 ± 2,3 8,4 ± 3,2 4,9 ± 1,4 26,5 ± 3,5 14,1 ±2,7 5,2 ±3,6 6,9 ±0,5 47,5 ± 7,9 107,1 ±9,4 17,1 ± 5,2 9,4 ± 1,9 5,3 ± 3,0 1,9 ±0,5 23,8 ± 1,9 15,9 ±3,8 6,6 ± 5,2 4,9 ± 0,6 29,7 ± 3,1 13,3 ± 2,5 5,5 ± 3,0 2,4 ±0,8 1,4 ±0,8 1,1 ±0,2 — 13,6 ±4,2 5,3 ± 2,1 5,1 ± 1,0 28,9 ± 5,9 — — 3,3 ±1,2 — 1,1 ±0,4 Niere, die Pro-Gly, Gly-Pro und Pro-Gly-GIy hydrolysieren, hauptsächlich im Cytosol zu finden sind. Die Enzyme der Niere, die Gly-Gly-Gly, Leu-NH2*, Gly-Gly-Pro und Gly-Pro-Gly spalten, sind mikrosomal gebunden. Kollagen wird bei pH 3,5 und auch bei pH 7,0 durch die MitochondrienLysosomenfraktion der Niere am besten abgebaut. Ein anderes Verteilungsmuster findet sich in der Leber. Hier ist der überwiegende Teil der untersuchten Exopeptidaseaktivitäten im Cytosol lokalisiert. Lediglich die Enzyme, die Gly-Gly-Pro und GlyPro-Gly hydrolysieren, haben ihre Hauptaktivität in den Leberzellkernen. Ihr Verteilungsmuster in den Zellorganellen wurde in Abb. l nicht mit aufgenommen, da die Hydrolysenraten (s. Tab. 1) zu gering sind. ///. Elektroplioretische Auftrennung der untersuchten Fermentaktivitäten Allein mit rohen Homogenaten, ohne zusätzliche Anwendung von Effektoren, war eine Differenzierung der Fermentaktivitäten nicht möglich (s. S. 1440). Auch durch Bestimmung der Lokalisie* Nach Zusatz von Mn2® ergab sich gegenüber LeuNÜ2 eine andere Verteilung der Aktivitäten auf die Zellfraktionen. Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM Bd. 350 (1969) H. KIRSCHKE und H, HANSON 1442 Leber Niere Pro-6ly Pro-NA 6ly-Gly-Pro 6ly-Pro-6ly 20 33 20 1*0 60 % des ges. Prot.-N- 100 C. DE DUVE, B. C. PRESSMAN, R. GIANETTO, R. WATTIAUX u. F. APPELMANS, Biochem. J. 60, 604 [1955]. LQ 60 80 % des ges. Prot-N —* WO Abb. 1. Relative spezifische Aktivitäten der Zellfraktionen von Niere und Leber. Die relativen spezif. Aktiv, (definiert als spezif. Aktiv, jeder Fraktion/spezif. Aktiv, des Homogenats) wurden nach DE DUVE et al.33 aufgetragen. Auf der Abszisse wurde der Proteinstickstoff-Gehalt der Fraktionen in der Reihenfolge: Kerne (K), Mitochondrien und Lysosomen (M + L), Mikrosomen (P) und Cytosol und Waschwässer (C) als prozentualer Anteil des GesamtProteinstickstoffs aller Fraktionen dargestellt. Inkubationsbedingungen: Tris- oder Phosphatpuffer, pH 7,9 (Leu-NHs: pH 9,0); kein Zusatz von Effektoren; 2· 10~2M Substrate (Prolin-ß-naphthylamid (Pro-NA): 2,5 · 10~3M). Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM Bd. 350 (1969) Kollagenabbau durch Rattenorgane W Frakt-Nr. 15 1443 20 23 Abb. 2. Trägerfreie Elektrophorese eines 105000x#-Überstandes aus Nierenhomogenat der Ratte. Elektrophoresebedingungen: 10~2M Phosphatpuffer, pH 7,4; 26,4 mg Protein/Std. aufgetragen; Auftragstelle über Frakt. 46 (kathodisch); 1800 V, 175 m A; 3 °C Abluft; Durchflußgeschwindigkeit: 2m//Std. und Fraktion. I = Gly-Pro, II = Pro-Gly, III = Pro-Gly-Gly, IV = Gly-Gly-Gly, V = Leu-NH2 (LeucinaminopeptidaseSubstrat), VI == Proteinstickstoff, nach LowRY28 bestimmt. HR = Hydrolysenrate ( ! abgespaltene Aminosäure/mg Proteinstickstoff je Std. und m/ Ansatzvolumen). rung der Fermentaktivitäten in den einzelnen Zellfraktionen gelang es nür7"einige Peptidasen voneinander abzugrenzen. Zur weiteren Differenzierung der untersuchten Peptidasen, vor allem zur Unterscheidung der im Cytosol vorhandenen Aktivitäten voneinander, sollte eine . elektrophoretische Auftrennung und anschließende Prüfung der enzymatischen Aktivität der Fraktionen dienen. Die Elektrophorese von Nierencytosol, dargestellt in Abb. 2, soll als Beispiel für eine elektrophoretische Trennung der untersuchten Peptidasen in den 105 000 ^-Überständen von Homogenaten verschiedener Organe dienen. Im Cytosol von Niere, Leber, Lunge und Gehirn der Ratte konnte stets Prolidase (Substrat: Gly-Pro) als das am weitesten anodisch wandernde Enzym nachgewiesen werden. Aus Abb. 2 geht hervor, daß alle untersuchten Pep- tidasen einen isoelektrischen Punkt haben, der kleiner sein muß als der der Leucinaminopeptidase. (Der isoelektrische Punkt von Leucinaminopeptidase aus Schweinenieren und aus Rinderaugenlinsen liegt zwischen pH 4 und 5). Die höchste Aktivität der Fermente, die Pro-Gly-Gly und GlyGly-Gly spalten, ist von dem Gipfel der Leucinaminopeptidase nur um eine Fraktion verschoben. Diese geringfügige Trennung ist signifikant; sie konnte in weiteren Elektrophoresen unter den gleichen Bedingungen und auch bei Verwendung von Trispuffer, pH 8,6, mit 5 · 10~3M MgSO4 reproduziert werden. Bei Mg2e-haltigem Puffer ist die Aktivität der Leucinaminopeptidase wesentlich größer als ohne Metallionenzusatz. Die Abb. 2 zeigt eine eindeutige Abtrennung der Prolinase (Substrat: Pro-Gly) von den Aktivitätsgipfeln der Leucinaminopeptidase und der Tripeptidase. Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM H. KIRSCHKE und H. HANSON 1444 IV. Charakterisierung des Enzyms^ das in Rattenorgancn Pro-Gly und Hyp-Gly hydrolysiert SMITH et al.34·35 konnten aus Schweinenieren ein Ferment (Prolinase) anreichern, das Pro-Gly und Hyp-Gly spaltet. Aus den vorliegenden Untersuchungen geht hervor, daß beide Peptide auch in Rattenorganen durch dasselbe Enzym hydrolysiert werden. Das Verhältnis der Pro-Gly- zur HypGly-Hydrolyse ist in den untersuchten Organhomogenaten der Ratte annähernd konstant (s. Tab. 2). Tab. 2. Verhältnis der Prolyl-glycin- zur Hydroxyprolyl-glycin-Hydrolyse in Organhomogenaten der Ratte. Inkubationsbedingungen: 38°C, Trispuffer, pH 8,0, ohne Zusatz von Effektoren, Substratkonzentration 2 · 10~2M im Ansatz. Die linke Spalte gibt die Absolutwerte für die Hydrolysenraten (HR vgl. Legende zu Abb. 2) gegenüber ProGly an und die rechte Spalte die Hydrolysenraten für Hyp-Gly in % der Pro-Gly-Werte. Homogenat von Leber Niere Lunge Milz Herz Gehirn Pro-Gly (HR) (%HR Pr0 -Gly) Hyp-Gly 11,96 37,04 24,35 14,08 15,89 13,55 48,6 51,8 54,4 40,5 39,1 41,6 Als spezifisches Substrat für Prolinase wird im allgemeinen Hyp-Gly verwendet, weil Pro-Gly außerdem durch Prolin-Iminopeptidase5 und durch Leucinaminopeptidase29'36 hydrolysiert werden kann. Unsere Untersuchungen mit kristalliner Leucinaminopeptidase aus Rinderaugenlinsen ^ergaben·, daß auch Hyp-Gly in demselben Maße wie ProGly durch dieses Enzym gespalten wird. Die Hydrolysenrate von Leu-NH2 verhielt sich zu der von Hyp-Gly wie 100:2,4 und zu der von Pro-Gly wie 100:2,1. Da in den untersuchten Organen der Ratte nur eine sehr geringe Prolin-Iminopeptidase-Aktivität (Substrat: poly-Pro) (s. S. 1445) und die quantitative Bestimmung von Pro (s. S. 1439) wesentlich einfacher vorzunehmen ist als die von Hyp (s. S. 1440), wurde in den vorliegenden Untersu34 R. E. NEUMAN u. E. L. SMITH, J. biol. Chemistry 193, 97 [1951]. 35 N. C. DAVIS u. E. L, SMITH, J. biol. Chemistry 200, 373 [1953]. 36 D. GLÄSSER u. H. HANSON, diese Z. 329, 249 [1962]. Bd. 350(1969) chungen Pro-Gly als Substrat für die Prolinase verwendet. In rohen Leber- und Nierenhomogenaten aus Rattenorganen konnte keine Aktivierung der ProGly-Hydrolyse durch Zusatz von Cd2^ erreicht werden, wie sie von NEUMAN und SMITH34 sowie von DAVIS und SMITH35 für angereicherte Prolinase und von SARID et al.5 für rohen Schweinenierenrindenextrakt angegeben wird. Die Inkubationsansätze, denen Cd2® zugesetzt wurde, waren stärker getrübt als jene, die Mn2® oder Ca2® enthielten. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei um Eiweißfällungen, bei denen eventuell Prolinase mitgerissen wurde. Durch Zusatz von Triton X-100 wurde zwar die Eiweißfällung vermindert, aber dennoch keine Aktivierung erreicht (s. Tab. 3). Bei einem vergleichenden Versuch mit Schweinenierenhomogenat konnte eine Aktivierung der ProGly-Spaltung durch Cd2® gemessen werden (s. Tab. 3). Die Prolinaseaktivität in den Zellfraktionen von Nieren- und Leberhomogenaten aus Rattenorganen wurde durch Mn2e-Zusatz stark aktiviert, durch Ca2® nicht beeinflußt und durch Cd2® gering gehemmt. Die Aktivität, die Pro-Gly spaltet, konnte mit der trägerfreien Hochspannungselektrophorese bei pH 8,6 einwandfrei von der Leucinaminopeptidase, von den Enzymen, die Pro-GlyGly und Gly-Gly-Gly hydrolysieren, sowie von der Prolidase abgetrennt werden (s. Abb. 2). Die Prolinase wandert weiter anodisch als die Leucinaminopeptidase, jedoch nicht so weit wie die Prolidase. Bei Cd2®-Zusatz zu den Inkubationsansätzen, die Pro-Gly und die Elektrophoresefraktionen enthielten, konnten weder Aktivierung noch Hemmung der Hydrolyse gemessen werden. V. Lokalisierung in Zellbestandteilen und elektrophoretische Eigenschaften der Prolidase in RattenOrganen 37 BERGMANN und gaben einem Ferment, das spezifisch auf die Peptidbindung -CO-N< mit benachbarter freier Amino- oder Iminogruppe und freier Carboxylgruppe (Gly-Pro) eingestellt ist, den Namen Prolidase. Diese Dipeptidase wurde von DAVIS und SMITH38 aus Schweinenieren, von SMITH und BERGMANN30 aus Schweinedarm-Mucosa und 37 M. BERGMANN u. J. S. FRUTON, J. biol. Chemistry 117, 189 [1937]. 38 N. C. DAVIS u. E. L. SMITH, J. biol. Chemistry 224, 261 [1957]. 39 E. L. SMITH u. M. BERGMANN, J. biol. Chemistry 153, 627 [1944]. Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM Bd, 350 (1969) Kollagenabbau durch Rattenorgane 1445 Tab. 3. Hydrolysenraten (HR) von Prolyl-glycin in Nierenhomogenat von Ratte und Schwein bei Zusatz von Cd2® und Triton X-100. Inkubationsbedingungen: 38°C; TrispufTer, pH 8,0; 2 · 10~2M Pro-Gly; l · 10~3M Cd2©; 0,05proz. Triton X-100 im Ansatz. * ' Rattennierenhomogenat: 0,0645 mg Protein-N/l-m/-Ansatz; Schweinenierenhomogenat: 0,0936 mg Protein-N/l-m/-Ansatz. HRim .Nierenhomogenat von Ratte Schwein ohne Zusatz mit Triton X-100 mit Cd ® 37,0 21,4 36,8 35,1 35,9 von ADAMS und SMITH32 aus Pferdeerythrozyten in angereicherter Form erhalten. In allen untersuchten Organen der Ratte konnte eine Prolidase nachgewiesen werden (s. Tab. 1). Das Nierenhomogenat besitzt die höchste spezifische Aktivität (Hydrolysenrate = 28,4, ohne Zusatz von Effektoren). , und 0,OOlMMn2@ im Inkubationsansatz bewirkten ohne Präinkubation der Fermentpräparation keine wesentliche Steigerung der Hydrolyse von Gly-Pro. Die Aktivierung durch Mn2@ gelingt erst nach einstündiger Präinkubation des Homogenates. Ein auffallendes Ergebnis lieferte die elektrophoretische Auftrennung des Cytosols von Niere, Leber, Lunge und Gehirn der Ratte. Bei pH-Werten von 7,4 und 8,6 konnte in allen Fällen die Prolidase als das am weitesten anodisch wandernde Enzym bestimmt werden (s. Abb. 2). VL Beschreibung einer Fermentaktivität, die Prolin$-naphthylamid spaltet FOLK und BuRSTONE40 sowie WAkABAYASHi41 beschrieben das Vorkommen einer „Prolyl-peptidHydrolase" in Organen der Ratte und des Hühnchens. Dieses Ferment hydrolysiert Pro-ß-Naphthylamid und ist durch Ca2® aktivierbar. Die Hydrolysenraten von Pro-ß-Naphthylamid betragen in Leberhomogenat 0,043 und in Nierenhomogenat 0,048. Obwohl die Hydrolysenraten gering waren, konnte die Hydrolyse gut gemessen werden. Diese geringe Hydrolysierbarkeit ist vermutlich auf die niedrige Substratkonzentration von 40 2 J. E. FOLK u. M. S. BURSTONE, Arch. Biochem. Biophysics 61, 257 [1956]. 41 K. WAKABAYASHI, J. Biochemistry [Tokyo] 55, 244 [1964]. mit Cd2® und Triton X-100 34,9 Pro-ß-Naphthylamid im Ansatz zurückzuführen (2,5 im l-m/-Ansatz). Wie aus Abb. l ersichtlich, ist die Enzymaktivität, die Pro-ß-Naphthylamid hydrolysiert, in der Niere hauptsächlich in der Mitochondrien-LysosomenFraktion und in den Mikrosomen vorhanden. In der Leber ist die stärkste Aktivität dieses Enzyms im Cytosol lokalisiert. In allen Fraktionen der Leber und Niere wird die Hydrolyse von Pro-ß-Naphthylamid durch Ca2@ aktiviert und durch Mn2@ und Cd2® gehemmt. VIL Über das Vorkommen einer Proliniminopeptidaseaktivität in Leber- und Nierenhomogenat SARID et al.42 konnten eine Prolin-IminopeptidaseAktivität in Escherichia coli nachweisen und anreichern. Das Ferment spaltet -terminales Pro von Di-, Tri- und Polypeptiden ab. Als synthetisches Substrat wird poly-Pro verwendet. SARID et al.5 konnten auch in Organhomogenaten von Ratten eine Hydrolyse von poly-Pro nachweisen. Die Hydrolyse von poly-Pro durch Nieren- und Leberhomogenat ist aus Tab. 4 ersichtlich. Die Spaltung von poly-Pro ist im Vergleich zu der der anderen Peptide außerordentlich gering. Infolge der minimalen Aktivität war die Lokalisation der Prolin-Iminopeptidase in den Zellfraktionen nicht eindeutig bestimmbar. Die Inkubation von polyPro mit den Elektrophoresefraktionen war ebenfalls ergebnislos, weil in ihnen die Eiweißkonzentration zu gering war. Poly-Pro I und II unterscheiden sich nicht hinsichtlich ihrer Hydrolysierbarkeit durch Organhomogenate (s. Tab. 4). 42 S. SARID, A. BERGER u. E. KATCHALSKI, J. biol. Chemistry 234, 1740 [l959]. Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM 1446 H. KJRSCHKE und H. HANSON Bd. 350(1969) Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte lediglich untersucht werden, ob in den Organhomogenaten der Ratte eine Hydrolyse des für Clostridiopeptidase A spezifischen Substrates Pz-Pro-LeuGJy-Pro-D-Arg nachgewiesen werden kann. Die Hydrolyse der Kollagenpräparation sollte dabei als Vergleich dienen. Die Hydrolyse des synthetischen Substrates in den Organhomogenaten von Leber, Lunge, Milz, Herz, Leberhomogenat Nierenhomogenat Gehirn und Knochenextrakten war im physiologia 65,6 Poly-Pro I 24,2 schen pH-Bereich so gering, daß eine quantitative Bestimmung nicht möglich war. Eine sehr schwache, Poly-Pro IIa 65,0 25,1 aber meßbare Hydrolyse des Substrates war ledigPro-GIy 4259,0 1375,4 lich durch Inkubation mit Homogenaten von NiePro-Gly-Gly 6934,5 68J9,5 ren und Uterus (post partum) zu erreichen (^1,5% a) Poly-Pro l und II vgl. S. 1439. Substratleerwerte wurden in jedem Spaltung/mg Proteinstickstoff in 4 Std.). Fall abgezogen. Die Hydrolyse der Kollagenpräparation (gemessen an der Freisetzung der in Trichloressigsäure-3VV.haVI/I. Kollagen- und Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-O-Argnol löslichen, hydroxyprolinhaltigen Peptide) durch Hydrolyse Schon lange wird nach einer Kollagenase im tieri- die Organhomogenate (außer Nierenhomogenat) schen Organismus gesucht, die in ihrer Spezifität war ebenfalls bei pH 7,0 nicht quantitativ bestimmbar. mit der Clostridiopeptidase A vergleichbar ist. Dieses Ferment spaltet Kollagen in den apolaren Be- Nach Inkubation des Kollagens mit Nierenhomogenat konnte im säurehydrolysierten Trichloressigreichen (Anhäufung von Pro und Hyp): säure-Methanol-Überstand Hydroxyprolin nachX-Pro(Hyp)-X^Gly-Pro(Hyp)-X. gewiesen werden. Wir versuchten, diese kollagenoX = beliebige Aminosäure. lytische Aktivität zu charakterisieren. Dazu wurde Erst in jüngster Zeit wurde ein solches Ferment von die Kollagenpräparation auf die Spaltbarkeit durch STRAUCH und VENCELJ43 in HeLa-Zellen und in den andere Endopeptidasen untersucht. Die Analyse Zellen von Mäusefibroblästenkulturen nachgewie- der Spaltprodukte erfolgte mit verschiedenen sen. Die von GROSS et al.44~46 und von FULLMER Methoden (Bestimmung von Hydroxyprolin, Restet al.47"50 gefundene kollagenolytische Aktivität in Stickstoff, -Aminostickstoff und von Stickstoff Kulturmedien verschiedener tierischer Zellen be- nach LOWRY), um Anhaltspunkte über Denaturiesitzt eine andere Spezifität als die Clostridiopepti- rung des Kollagens und Beschaffenheit der Spaltdase. Dieses Ferment katalysiert die Spaltung nati- produkte zu gewinnen (s. Tab. 5). ver Kollagenmoleküle in Fragmente, die etwa */4 Bei Auswertung der enzymatischen Spaltung des und 3/4 der Länge der normalen „long-spacing"- Kollagens durch Bestimmung von Hydroxyprolin, Segmente entsprechen. Reststickstoff und Stickstoff nach LOWRY wird deutlich, daß die höchsten hydrolytischen Aktivi43 L. STRAUCH u. H. VENCELJ, diese Z. 348, 465 [1967]. täten durch Clostridiopeptidase, Pronase und 44 J. GROSS u. Y. NAGAI, Proc. nat. Acad. Sei. USA 54, Nierenhomogenat erreicht werden. 1197 [1965]. 45 Y. NAGAI, C. LAPIERE u. J. GROSS, Federat. Proc. Die relativ geringen Spaltungen durch die anderen 22, 648 [1963]. Endopeptidasen lassen erkennen, daß die ein46 J. M. EVANSON, J. J. JEFFREY u. S. M. KRANE, Science gesetzte Kollagenpräparation nicht in größerem [Washington] 158, 499 [1967]. Ausmaß denaturiert war. 47 H. M. FULLMER, J. Dental Res. 45, 469 [1966]. 48 W. GIBSON u. H. M. FULLMER, J. Dental Res. 45,1225 Die Hydrolyse des Kollagens durch die Clostridiopeptidase A kann ohne größeren Fehler sowohl [1966]. 49 H. M. FULLMER u. G. S. LAZARUS, Israel J. med. Sei. durch die Bestimmung des Hydroxyprolins in den 3, 758 [1967]. Trichloressigsäure-Methanol-löslichen Peptiden als 50 G. S. LAZARUS, R. S. BROWN, J. R. DANIELS u. H. M. auch durch Bestimmung des Stickstoffgehaites dieFULLMER, Science [Washington] 159,1483 [1968]. ser Peptide erfaßt werden. Tab. 4. Hydrolyse von poly-Prolin I und II, Prolylglycin und Proiyl-glycyl-glycin durch Nieren- und Leberhomogcnat. Angegeben sind g Pro, die durch l mg Proteinstick· Stoff der Homogenate in I Std. abgespalten wurden. Inkubationsbedingungen (l-m/·Ansatz): 38°C; Tris2 puffcr, pH 8,0; 5 · 1Q-3M ; poly-Pro: 3,0mg; Pro-GIy: 2 · 10~2M = 3,44 mg; Pro-Giy-Gly: 2 · 10~2M - 4,58 mg. Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM Bd. 350 (1969) Kollagenabbau durch Rattenorgane 1447 Tab. 5. Hydrolyse von Kollagen durch verschiedene Endopeptidasen und Nierenhomogenat. Analyse des in Trichloressigsäure-Methanol löslichen Materials. Inkubationsbedingungen: säurelösliches Kollagen 0,1 bis 0,2proz. im Ansatz (mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt); Phosphatpuffer, pH 7,0; 60 Min. bei 30°C inkubiert. Enzym-Substrat-Verhältnis: Trypsin, Chyrpoirypsin und Pronase 1:5; Papain, Subtilopeptidase A l :10; Clpstridiopeptidase A l :70; Nierenhomogenat 0,5 bis 0,7 mg Proteinstickstoff/m/ Ansatz. Von den Werten dieser Tabelle wurden jeweils die entsprechenden Leerwerte des Kollagens und beim Nierenhomogenat außerdem die Autolysewerte des Homogenats abgezogen. Die Werte sind Mittelwerte aus 2—3 Versuchen. Jede Ziffer eines Versuchs ist der Mittelwert aus 6—9 Einzelmessungen. Clostridiopeptidase A Trypsin Chymotrypsin Pronase Papain Subtilopeptidase A Nierenhomogenat a) Bestimmung nach ROSEN". % Hyp vom Gesamt-Hyp %Rest-Nvom Gesamt-N 37,20 5,05 2,65 25,30 2,58 4,25 15,10 30,70 4,45 0,85 33,50 3,55 5,70 9,36 % LOWRY-N vom % -NH2-N vom Gesamt-N Gesamt-N Rest-N 18,20 2,05 5,48 27,80 6,40 4,70 7,39 2,53a/ 2,24b 0 0 3,29 0,48 / 0,42 0,88 / 0,90 0,55 •8,24V 7,3» — — 9,84 13,5 15,4 / 15,8 5,88 b) Bestimmung nach SATAKE et al.2e. Die Spaltprodukte nach Einwirken von Pronase sind Peptide mit weniger Hydroxyprolin aber mehr LowRY-positiven Aminosäuren. Die Hydrolyse des Kollagens mit Papain und. Subtilopeptidase A ist sehr gering. Der oc-NH2-Gehalt der Peptide nach der Hydrolyse des Kollagens durch Nierenhomogenat ist im Verhältnis ium Hydroxyprolingehalt klein. Der Befund spricht für die Abspaltung größerer (wenig a-NH2N), sehr hydroxyprolinreicher Peptide. Diskussion Die Summe der spezifischen Aktivitäten einiger Enzyme in den Zellfraktionen ist größer als die spezifische Aktivität im Gesamthomogenat (s. Abb. 1). Das ist besonders deutlich bei einigen CytosolEnzymen, wie die Pro-Gly-Gly-spaltende Tripeptidase in Niere und Leber, das Gly-Gly-Gly-spaltende Enzym in Leber und die Prolinase in Niere. Die Homogenate wurden vor Inkubation stets mit Triton X-100 versetzt (Triton hemmte die getesteten Enzymaktivitäten nicht). Für diese CytosolEnzyme existieren wahrscheinlich in einer oder in mehreren Partikelfraktionen Inhibitoreffekte. Die Inkubationen wurden unter möglichst physiologischen Bedingungen ohne Zusatz von Effektoren durchgeführt. SARBD etal 5 verwendeten für den Nachweis der Prolin-Iminopeptidase poly-Pro als Substrat. Wir setzten dieses Substrat aus folgenden Gründen ein: aus der Hydrolysengeschwindigkeit Von poly-Pro sollte ein Maß für die Fermentaktivität gefunden werden, die TV-terminal gebundenes Prolin abzuspalten vermag. Die Hydrolyse von poly-Pro sollte einen Anhaltspunkt für die Spaltung von Pro-Gly- und Pro-Gly-Gly durch die Proliniminopeptidase-Aktivität geben. Die Spaltung von poly-Pro durch Nieren- und Leberhomogenat ist aber so gering (s. Tab. 4), daß der Anteil der evtl. vorhandenen Prolin-Iminopeptidase an der Hydrolyse von Pro-Gly und Pro-Gly-Gly nicht berücksichtigt zu werden braucht. Eine kollagenolytische Aktivität mit einer Spezifität, die der von GROSS et al.44~46 und von FULLMER et al.47~50 beschriebenen gleicht, konnte mit unserer Methodik wahrscheinlich nicht erfaßt werden, da die Spaltprodukte sicherlich in TrichloressigsäureMethanol sedimentierbar sind. Die Hydrolyse des synthetischen Peptids Pz-ProLeu-Gly-Pro-D-Arg war lediglich in Nieren- und Uterushomogenat gerade noch nachweisbar. Inzwischen ist aber bekannt geworden51, daß die Spaltung derartiger synthetischer Substrate eher durch eine „Pseudokollagenase" als durch eine echte Kollagenase katalysiert werden kann. Bei Verwendung von Kollagen als Substrat für eine Kollagenase muß man berücksichtigen, daß das 51 W. M. MITCHELL, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 159, 554 [1968]. Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM 1448 Kollagenabbau durch Rattenorgane KoJlagen durch Extraktion und Fällung evtl. so verändert ist, daß ein in vivo wirksames Ferment mit einer Kollagenpräparation als Substrat nicht nachgewiesen werden kann. Wir wählten als Inkubationstemperatur für die Ansätze mit Kollegen 30°C. KÜHN et al.52 konnten für säurelösliches Kollagen nach 19stdg. Bebrütung bei 30°C keine Änderung der negativen spezifischen optischen Rotation messen. Nach Inkubation mit Trypsin und Pronase ändert sich der Helixgehalt durch Hydrolyse von Peptidbindungen. Eine einstündige Bebrütung bei Körpertemperatur würde die Kollagenpräparation bereits vollständig denaturieren. Im Organismus selbst wird das Kollagen wahrscheinlich Eigenschaften besitzen, die sich aus 52 K. KÜHN, P. FIETZEK u. J. KÜHN, Biochem. Z. 344, 418 [1966]. Bd. 350 (1969) seiner Einbeziehung in die Feinstruktur der Gewebe ergeben. Wir haben bei unserer Versuchsanordnung nachgewiesen, daß eine säurelösliche Kollagenpräparation durch Endopeptidasen, die in der Niere vorhanden sind, relativ schnell (im Vergleich zu Trypsin und Chymotrypsin) abgebaut wird. Hierbei entstehen wahrscheinlich größere (wenig a-Aminostickstoff) hydroxyprolinreiche Peptide (s. Tab. 5). Für den ersten Abbauschritt von Organkollagen, das sich ja außerhalb der Zellen befindet, müßte man ein Ferment(-system) annehmen, das von den Zellen sezerniert wird und evtl. die Spezifität der von GROSS et al.44~46 und von FULLMER et al.47"50 nachgewiesenen Kollagenase besitzt. Der Nachweis eines solchen Fermentes in Nieren(-zellkulturmedien) steht noch aus. Unauthenticated Download Date | 5/12/16 3:41 AM
