Druckfassung korrigiert-Promotion Einfluss des HDAC
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Aus dem Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig und der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie Universitätsklinikum Heidelberg der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Einfluss des Histondeacetylase-Inhibitors 4-Phenylbutyrat auf das Wachstum des experimentellinduzierten Pankreaskarzinoms Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von Alexandra Friske aus Aalen Leipzig, 2015 Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Dekan: Betreuer: Prof. Dr. Manfred Coenen Prof. Dr. Heinz-Adolf Schoon Prof. Dr. med. Jens Werner Gutachter: Prof. Dr. Heinz-Adolf Schoon, Institut für Veterinär-Pathologie, Leipzig Prof. Dr. med. Jens Werner, Klinik für Allgemein-, Viszeral-, Transplantations-, Gefäß- und Thoraxchirurgie, München Prof. Dr. med. Maximilian Bockhorn, Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Viszeral- und Thoraxchirurgie, Hamburg-Eppendorf Tag der Verteidigung: 14.04.2015 Petra und Klaus in Dankbarkeit Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ...................................................................................................... I Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... IV Abbildungsverzeichnis ........................................................................................... VII Tabellenverzeichnis ............................................................................................... VIII 1 Einleitung ............................................................................................................. 1 2 Literatur ............................................................................................................... 3 2.1 Das Pankreaskarzinom ................................................................................ 3 2.2 Epigenetische Mechanismen der Karzinom- entstehung .......................... 3 2.2.1 Das menschliche Genom und die Regulation der Genexpression ........... 3 2.2.2 Histone, HDAC-Enzyme und deren epigenetische Veränderung bei der Karzinogenese .......................................................................................... 5 2.3 Hemmung der HDAC-Enzyme als therapeutische Strategie bei der Tumorbekämpfung ........................................................................................ 8 2.4 Die Auswirkung verschiedener HDAC-Inhibitoren auf das Pankreaskarzinom ....................................................................................... 12 2.4.1 4-Phenylbutyrat ...................................................................................... 12 2.4.2 Valproinsäure ......................................................................................... 12 2.4.3 Trichostatin ............................................................................................ 13 2.4.4 SAHA (Vorinostat) ................................................................................. 13 2.4.5 MS-275 .................................................................................................. 14 2.5 Connexinexpression und das Tumorwachstum ..................................... 14 2.5.1 Veränderung der Connexine und der Gap-Junctions in der Karzinogenese ........................................................................................ 14 2.5.2 Upregulation der Connexinexpression durch HDACi in der Therapie und Prophylaxe der Tumorerkrankungen ...................................................... 16 2.6 3 Zielsetzung der Arbeit ................................................................................ 18 Material und Methoden ..................................................................................... 19 3.1 Material ........................................................................................................ 19 3.1.1 Geräte .................................................................................................... 19 I 3.1.2 Verbrauchsmaterialien ........................................................................... 20 3.1.3 Chemikalien ........................................................................................... 21 3.1.4 Antikörper .............................................................................................. 22 3.1.5 Puffer und Lösungen ............................................................................. 23 3.1.6 Software ................................................................................................. 24 3.2 Zelllinien ...................................................................................................... 25 3.3 Tiere ............................................................................................................. 25 3.4 Methoden .................................................................................................... 25 3.4.1 Zellbiologische Methoden ...................................................................... 25 3.4.1.1 Kultivierung von Zellen ..................................................................... 25 3.4.1.2 Vorbereiten von Zellen zur in vivo Injektion ..................................... 26 3.4.1.3 Untersuchung der Zellproliferation (MTT-Assay) ............................. 27 3.4.2 Tierexperimentelle Methoden ................................................................ 28 3.4.2.1 Subkutane Tumorinokulation (subkutanes Mausmodel) .................. 28 3.4.2.2 Orthotope Tumorimplantation .......................................................... 29 3.4.3 Immunhistochemische Methoden .......................................................... 30 3.4.3.1 Allgemeines Protokoll des verwendeten immunhistochemischen Verfahrens ........................................................................................ 30 3.4.3.2 Immunhistochemie zum Nachweis proliferierender Zellen ............... 31 3.4.3.3 Immunhistochemie zur Bestimmung des Histon H4 ........................ 32 3.4.3.4 Immunhistochemie mit Anti-Human Epithelial Membrane Antigen .. 32 3.4.3.5 Immunhistochemie zum Nachweis von Connexin 43 ....................... 33 3.4.4 4 Hämatoxylin-Eosin-Färbung: Quantifizierung der Nekrose ................... 33 Ergebnisse ......................................................................................................... 35 4.1 In vitro Untersuchungen: Einfluss des 4- Phenylbutyrat auf die Zellproliferation mittels MTT-Assay .......................................................... 35 4.2 In vivo Untersuchungen: Einfluss von 4-Phenylbutyrat auf das Tumorwachstum im subkutanen und orthotopen Mausmodell ............. 37 4.3 In vivo Untersuchungen: Auswirkung einer Behandlung mit 4Phenylbutyrat auf die Ausbreitung der Nekrose im subkutan und orthotop gewachsenen Tumor ................................................................... 40 4.4 In vivo Untersuchungen: Einfluss des 4-Phenylbutyrat auf die Zellproliferation im subkutanen und orthotopen Mausmodell ............... 42 II 4.5 In vivo Untersuchungen: Einfluss des 4-Phenylbutyrat auf den Acetylierungsstatus des Histon H4 ........................................................... 45 4.6 In vivo Untersuchungen: Ausbildung einer Pseudokapsel bei Behandlung mit 4-PB im orthotopen Modell ............................................ 47 4.7 In vivo Untersuchungen: Auswirkung des 4- Phenylbutyrat auf die Verbreitung des Connexin- 43 ................................................................... 49 5 Diskussion ......................................................................................................... 51 5.1 Einfluss von 4-Phenylbutyrat auf Pankreastumorzellen in vitro ............ 52 5.2 Einfluss von 4-Phenylbutyrat auf das Pankreaskarzinom in vivo .......... 52 6 Zusammenfassung ........................................................................................... 59 7 Summary ............................................................................................................ 61 8 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 63 Danksagung ............................................................................................................. 74 III Abkürzungsverzeichnis Abb Abbildung ADP Adenosindiphosphat BAX Bcl-2–associated X protein bFGF basic Fibroblast Growth Factor Bid BH3 interacting domain death agonist BrdU/BrdUrd Bromodeoxyuridine BSA bovines Serum Albumin CD Adhäsionsmolekül CI-994 Histondeacetylase-Inhibitor N-acetyldinaline cm Zentimeter CO2 Kohlenstoffdioxid CX Connexin DNA Desoxyribonukleinsäure E2F Transkriptionsfaktor E2F EC50 half maximal effective concentration EDTA Ethylendiamintetraazetat ELISA Enzymed-linked Immunosorbent Assay eNOS endothelial Nitric Oxid Synthase g Gramm GATA-1 Globin Transkriptionsfaktor 1 h Stunde H3 Histon H3 H4 Histon H4 HAT Histon-Acetyl-Transferasen HDAC Histondeacetylase HDACi Histondeacetylase-Inhibitor H-E Hämatoxylin-Eosin i.p. intraperitoneal IFNγ Interferon gamma IgG Immunglobulin G IL-1 Interleukin 1 IV KG Körpergewicht Mad Mother Against Decapentaplegic (Onkogen) mg Milligramm MHC Major Histocompatibility Complex min Minute ml Milliliter mm Millimeter mmol/mM Millimol mRNA messenger Ribonukleinsäure MS-275 Histondeacetylase-Inhibitor Entinostat MTT Methylthiazoldiphenyltetrazoliumbromid MyoD myogener Faktor NFĸB Nuclear Factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells nm Nanometer o.t. orthotop transplantiert p21 Protein 21 p53 Protein 53 PBS Phosphat gepufferte Salzlösung PDAC pancreatic ductal adenocarcinoma Rb retinoblastom Protein (Tumorsuppressorgen) rpm revolutions per minute RPMI Zellkulturmedium s.c. subkutan SAHA Suberoyl-Anilid-Bishydroxamid SEM Standard Error of the Mean TBS Tris gepufferte Salzlösung TNFα Tumor-Nekrose-Faktor α TRAILR Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand Rezeptor TSA Trichostatin A VEGF Vascular Endothelial Growth Factor VPA Valproinsäure vs. versus µl Mikroliter V µm Mikrometer 4-PB 4-Phenylbutyrat VI Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Aufbau des menschlichen Chromatins 4 Abbildung 2: Darstellung des Histonoktamers und der Seitenketten 5 Abbildung 3: Vereinfachte Darstellung des Hetero- und Euchromatins 6 Abbildung 4: Effekte der HDACi 11 Abbildung 5: schematische Darstellung der Gap-Junctions von zwei gegenüberliegenden Zellen 15 Abbildung 6: Darstellung einer Gap-Junction in offenem und geschlossenem Zustand 15 Abbildung 7: Darstellung der Zellproliferation der Zelllinien T3M4-, ASPC und Panc-1 mit Hilfe des MTT-Assays unter Einfluss von 4-PB Abbildung 8: Beispiel des subkutanen Tumors im Mausmodell 36 38 Abbildung 9: subkutanes Tumorwachstum der 4-PB-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe 38 Abbildung 10: Beispiel des orthotop gewachsenen Tumors im Mausmodell 39 Abbildung 11: Nekrose im subkutanen (11A) und orthotop (11B) transplantierten Tumor 41 Abbildung 12: Prozentualer Anteil proliferierender Zellen im s.c. Modell 43 Abbildung 13: Prozentualer Anteil proliferierender Zellen im o.t. Modell 43 Abbildung 14: Beispiel für den Anteil proliferierender Zellen in der 4-PB s.c.(14A), Kontrolle s.c.(14B), 4-PB o.t.(14C) und Kontrolle o.t.(14D) 44 Abbildung 15: Prozentualer Anteil acetylierter Zellen 45 Abbildung 16: Beispiel für den Anteil acetylierter Zellen in der 4-PB-Gruppe (16A) und der Kontrollgruppe (16B) 46 Abbildung 17: Beispiel der Pseudokapsel in der 4-PB-Gruppe 47 Abbildung 18: Beispiel der Pseudokapsel in der Kombinationsgruppe 48 Abbildung 19: Beispiel der Pseudokapsel in der Kontrollgruppe 48 Abbildung 20: Verteilung der Connexine zwischen den Tumorzellen in der 4-PB-Gruppe (21A) und der Kontrollgruppe (21B) und in Nekrosenähe in der 4-PB-Gruppe (21C) und der Kontrollgruppe (21D) VII 50 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Behandlungsschema der einzelnen Versuchsgruppen ............................ 28 VIII Einleitung 1 Einleitung Tumorerkrankungen sind in den USA und Europa eine der wichtigsten Todesursachen und das Pankreaskarzinom (PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma) ist dabei die am 4. häufigsten auftretende Krebsart (LEHMANN et al. 2009). Die Mehrzahl der Patienten verstirbt innerhalb eines Jahres nach Diagnosestellung und diese erfolgt meist erst im fortgeschrittenen Stadium. Auf Grund dessen sind die therapeutischen Möglichkeiten wie Strahlen- oder Chemotherapie und chirurgische Resektion nur begrenzt möglich und führen bestenfalls zu einer Verzögerung der Erkrankung (ARNOLD et al. 2007, GAHR et al. 2007). So zeigt sich, dass eine adjuvante postoperative Chemotherapie, basierend auf 5-Fluorouracil oder Gemcitabine, das Überleben des Patienten verbessert (CUNNINGHAM et al.2009). Die Fünfjahresüberlebensrate steigt aber selbst bei optimalen Behandlungsbedingungen nicht über 25% (NEOPTOLEMOS et al. 2010). Die Untersuchung neuer Medikamente und Therapieansätze ist dementsprechend äußerst wichtig. Ein möglicher Therapieansatz ist etwa die Beeinflussung der Genexpression über die Hemmung der Histondeacetylasen, welche unter anderem eine Rolle in der Zelldifferenzierung, der Proliferation, dem Zelltod und der Angiogenese spielen (MARKS u. XU 2009, SCHÜLER et al. 2010). Eine Hemmung der Histondeacetylasen durch HDACInhibitoren könnte zu einer Wachstumshemmung des Tumors führen, was durch verschiedene Knockdown-Versuche auch schon einmal bestätig wurde (GLASER et al. 2003, ZHU et al. 2004, WILSON et al. 2006). 4-Phenylbutyrat ist ein HDAC-Inhibitor, der schon in der Behandlung von malignen Gliomen getestet wurde und als gut toleriertes Medikament mit geringen Nebenwirkungen gilt (BHALLA u. LIST 2004, PHUPHANICH et al. 2005). Bezüglich des Pankreaskarzinoms zeigt dieses Präparat gute inhibitorische Eigenschaften auf verschiedene Pankreaskrebszelllinien in in-vitro Versuchen (AMMERPOHL et al. 2007). Im Hinblick auf die Auswirkungen in-vivo herrscht jedoch noch großer Forschungsbedarf. Auch in der Tiermedizin, vor allem bei Hunden und Katzen, kommt es, wie beim Menschen, zu Erkrankungen des exokrinen Pankreas, was jedoch auf Grund der diagnostischen Schwierigkeit in der Praxis selten festgestellt wird. So scheinen Neoplasien der Bauchspeicheldrüse bei diesen 1 Tieren zunehmend häufiger Einleitung vorzukommen und machen beim Hund etwa 3% der abdominalen Tumore aus (KESSLER.2005). In einer retrospektiven, pathologischen Studie zu den Erkrankungen des exokrinen Pankreas wurden 9342 Bauchspeicheldrüsen von an verschiedenen Ursachen verstorbener Hunde untersucht, von denen 162 Pankreata pathologische Veränderungen zeigten. Dabei war die Pankreatitis die am häufigsten festgestellte Veränderung (n=96; 1,03%), gefolgt von dem Pankreaskarzinom mit immerhin 40 Tieren (0,43%). Im Rahmen derselben Studie wurden auch 6504 Katzenpankreata untersucht. Auch hier war die Pankreatitis mit 0,6% die am häufigsten festgestellte Veränderung, gefolgt von dem Pankreaskarzinom mit 0,4% (HÄNICHEN und MINKUS. 1990). Für Tiere, die an einem Adenokarzinom des exokrinen Pankreas erkrankt sind, ist die Prognose äußerst schlecht. Die Überlebenszeit nach Auftreten der klinischen Symptome beträgt nur Tage bis wenige Wochen. Vergleichbar mit dem Menschen, sind auch beim Tier die Symptome äußerst unspezifisch. Man beobachtet starken Gewichtsverlust, Inappetenz, Vomitus, Aszites und Ikterus. Selten ist die Tumormasse zu palpieren, jedoch ist das Abdomen oft schmerzhaft angespannt. Röntgenologisch kann im fortgeschrittenen Stadium eine Tumormasse im kranialen Abdomen erkannt werden. Die Untersuchung der Blutparameter ist, wie beim Menschen, wenig aussagekräftig und auch mit einer exokrinen Pankreasinsuffizienz ist in den wenigsten Fällen zu rechnen. Auch beim Tier hat das Pankreaskarzinom die Tendenz schnell zu metastasieren, bevorzugt in Leber, Lymphknoten, Omentum, Zwerchfell, Lunge und Knochen (KESSLER. 2005, FOSSUM. 2007). Therapeutisch sind in der Tiermedizin, wie auch in der Humanmedizin, aufgrund des späten Diagnosezeitpunktes Grenzen gesetzt. Sofern sich der Tumor nur auf das Pankreas beschränkt, kann eine komplette Pankreatektomie als lebensverlängernde Maßnahme durchgeführt werden. Von einer Chemotherapie wird in der Tiermedizin wegen der geringen Effizienz abgesehen (KESSLER. 2005, FOSSUM. 2007). Wie festzustellen ist, ist die Therapie des Pankreaskarzinoms stark begrenzt, weshalb der Erforschung weiterer Therapiemöglichkeiten großes Interesse entgegengebracht wird, um diese dann auch in die Tiermedizin übertragen zu können. 2 Literatur 2 Literatur 2.1 Das Pankreaskarzinom Das Pankreaskarzinom gilt als eine der aggressivsten Tumorerkrankungen überhaupt und hat mit einer mittleren Überlebensrate von gerade einmal 4-6 Monaten nach Diagnosestellung eine äußerst schlechte Prognose. Die Fünfjahresüberlebensrate liegt bei unter 3% (ARNOLD et al. 2007), was dadurch begründet wird, dass die Diagnose Pankreaskarzinom auf Grund von unspezifischen Symptomen häufig erst sehr spät gestellt wird (HAYCOX et al. 1998). Des Weiteren neigt das Pankreaskarzinom schnell über das Blut- und Lymphsystem zur Metastasierung und zeigt zudem ein sehr aggressives Tumorzellwachstum. Hinsichtlich dieser Eigenschaften ist der Tumor gegenüber der klassischen Chemo- und Strahlentherapie weitgehend therapieresistent (COWGILL et al. 2003). Die einzige Möglichkeit, ein längerfristiges Überleben zu erreichen, ist deshalb eine komplette chirurgische Resektion. Allerdings kann diese wegen der Vielfältigkeit des Tumors nur bei 15-20% der Patienten durchgeführt werden (KUVSHINOFF et al. 2000). Die Entwicklung alternativer Behandlungsmethoden ist demnach ein äußert wichtiges Unterfangen. Insbesondere bei der Erforschung von Chemotherapeutika als Alternative zum Gemcitabine herrscht noch großer Handlungsbedarf. Bis heute gilt eine adjuvante postoperative Chemotherapie mit Gemcitabine als Standardbehandlung beim Pankreaskarzinom (BRUS und Saif 2010). Mit dieser Behandlung kann zwar das Überleben des Patienten verlängert werden (CUNNINGHAM et al. 2009), aber die Fünfjahresüberlebensrate steigt selbst bei optimalen Behandlungsbedingungen nicht über 25% (NEOPTOLEMOS et al. 2010). 2.2 Epigenetische Mechanismen der Karzinom- entstehung 2.2.1 Das menschliche Genom und die Regulation der Genexpression Das menschliche Genom wird aus der doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäure (DNA) gebildet, deren Basensequenz die genetische Information kodiert. Diese Nukleinsäurekette wird in den Zellen mit Hilfe von Proteinen zum sogenannten Chromatin 3 Literatur aufgerollt. Dabei sind jeweils 146 Basenpaare um die Hilfsproteine gewickelt, welche aus einem Histon-Oktamer-Kernkomplex bestehen (ITO et al. 2000, SZERLONG u. HANSEN 2011). Die dadurch entstehende Struktur wird als Nukleosom bezeichnet (Abbildung 1). Zwischen zwei Nukleosomen liegt ein kurzes Stück DNA „frei“, welche durch ein weiteres Protein, Histon H1, stabilisiert wird (ITO et al. 2000, SZERLONG u. HANSEN 2011). Abbildung 1: Aufbau des menschlichen Chromatins (adaptiert aus: http://nicerweb.com/bio3400/Locked/media/ch12/chromatin.html). Die Umwandlung der genetischen Information erfolgt durch Transkription der DNA in eine messenger Ribonukleinsäure (mRNA) und die nachfolgende Translation in die Aminosäuresequenz des Genprodukts (KOOLMAN u. RÖHM 1994). Die Aktivität jedes Gens wird dabei durch verschiedene Kontrollmechanismen reguliert. Dadurch kommt es zur Steigerung oder Minderung der Aktivität des betroffenen Gens. Insbesondere Gene, deren Produkte in den Signalweg des Zellzyklus, der Zellproliferation, des Zellüberlebens und der Apoptose eingebunden sind, haben besondere Bedeutung (HEINOLD. 2007). Kommt es in der DNA-Basenfolge durch Mutation zu einer Veränderung, können solche oder andere Gene eine fehlerhafte Aktivität aufzeigen. Die Folge kann sowohl eine Aktivitätsminderung oder ein Aktivitätsverlust, als auch 4 Literatur eine übermäßige Aktivitätssteigerung sein (KOOLMAN u. RÖHM 1994). So kann es zum Beispiel durch die Inaktivierung von Tumor-Suppressor-Genen aber auch durch die Überaktivierung von Onkogenen zu einer malignen Umwandlung der Zelle kommen. Man nimmt an, dass eine Zelle durch die Anhäufung solcher fehlerhaft regulierten Gene zu einer Krebszelle entartet und mit der Zeit zu einem sichtbaren Tumor heranwächst (KOOLMAN u. RÖHM 1994). 2.2.2 Histone, HDAC-Enzyme und deren epigenetische Veränderung bei der Karzinogenese Zusätzlich zu den eben beschriebenen Veränderungen, welche die DNA direkt betreffen, sind auch Modifikationen von Bedeutung, die sich um die mit der DNA kommunizierenden Proteine drehen. Diese Proteine spielen eine ebenso wichtige Rolle in der Kontrolle der Genexpression und sind an der Bildung von maligne transformierten Zellen beteiligt (HEINOLD. 2007). Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die oben genannten Histon-Oktamer-Kernkomplexe gerichtet werden. Jeder Oktamer- Kernkomplex besteht aus je zwei der Histon-Proteine H2A, H2B, H3 und H4, die jeweils einen aminoterminalen Schwanz tragen (Abb. 2). Dieser Schwanz überragt die um den Komplex gewickelte DNA (LUGER et al. 1997) und kann mit regulatorischen Proteinen Interaktionen eingehen, welche die Chromatinstruktur und somit die Genexpression beeinflussen. Abbildung 2: Darstellung des Histonoktamers und der Seitenketten, die die um den Komplex gewickelte DNA überragen (adaptiert aus WOLFFE u. HAYES 1999). 5 Literatur Zu den Modifikationen an den Seitenketten zählen Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung und ADP-Ribolysierung (OUAISSI u. OUAISSI 2006), wobei die Acetylierung am besten untersucht ist (DE RUIJTER et al. 2003). Eine gesteigerte Acetylierung (Hyperacetylierung) der Histone einer DNA Region führt zu einem Nachlassen der Bindung zwischen Histonen und DNA. Dadurch wird das Chromatin aufgelockert (offenes oder Euchromatin), was das Ablesen der DNA erleichtert. Die Folge ist eine gesteigerte transkriptionelle Aktivität (Abb. 3). Eine Deacetylierung (Hypoacetylierung) induziert stattdessen eine Unterdrückung der Genexpression, da die Bindungen zwischen DNA und Histonen stärker sind und dadurch das Chromatin konzentriert wird (NORTON et al. 1989, WADE. 2001). Es zeigt sich, dass die Acetylierung eine Schlüsselrolle in der Genexpression spielt (BOLDEN et al. 2006). Abbildung 3: Vereinfachte Darstellung deacetylierter Histone im geschlossenen Hete-­‐ rochromatin und acetylierter Histone im offenen Euchromatin (adaptiert aus http://respiratory-­‐research.com/content/figures/1465-­‐9921-­‐7-­‐21-­‐1.jpg). 6 Literatur Der stabile Acetylierungsstatus der Histone resultiert dabei aus dem Gleichgewicht zwischen zwei Enzymen: den Histon-Acetyl-Transferasen (HAT) und den HistonDeacetylasen (MARKS et al. 2001, WADE. 2001). Bis heute sind 18 verschiedene HDAC bekannt, welche nach ihrer Ähnlichkeit zu unterschiedlichen Hefeproteinen in vier Klassen eingeteilt werden (BOLDEN et al. 2006). Von diesen vier Klassen sind Klasse I und II die Bedeutendsten, da ihnen die typischen Mitglieder der HDACFamilie angehören. Dabei sind die HDACs der Klasse I (HDAC 1, 2, 3, 8) im Zellkern angesiedelt und ubiquitär in allen Geweben verteilt. Klasse II (HDAC 4, 5, 6, 7, 9, 10) wechselt zwischen Zellkern und Zytoplasma und ist vor allem in Herz, Hirn und Skelettmuskulatur zu finden (DE RUIJTER et al. 2003, BOLDEN et al. 2006, LEMOINE. 2010). Aber nicht nur die Histone zählen zu den Substraten der Histondeacetylasen. Auch Transkriptionsfaktoren und ihre Regulatorproteine (z.B. p53, GATA-binding protein-1 (GATA-1), E2F), der Mikrotubulusapparat (α-Tubulin) und andere zelluläre Proteine (z.B. myogener Faktor (MyoD), nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells (NFкB)) sind deren Ziele (JUAN et al. 2000, HUBBERT et al. 2002, LEHMANN et al. 2009, MARKS u. XU 2009). Neben den gerade genannten Faktoren zählen auch Onkogene und Tumorsuppressorgene (Mother Against Decapentaplegic (Mad), retinoblastom Protein (Rb)) zu den Reaktionspartnern der HDACs (CRESS et al. 2000, TIMMERMANN et al. 2001, OUAISSI u. OUAISSI 2006). Dies kann für die Karzinogenese entscheidend sein, da die Substrate sowohl in der Genexpression als auch in der Zelldifferenzierung, Zellproliferation und beim Zelltod eine Rolle spielen. So hat man festgestellt, dass die Funktion der Transkriptionsfaktoren in Krebszellen verändert ist, da in diesen Zellen die HDAC-Aktivität und HDAC-Expression erhöht ist (GLOZAK et al. 2005, MARKS u. XU 2009). Dies führt letztendlich zu einer veränderten Genexpression und einer gesteigerten Proliferation (MINUCCI u. PELICCI 2006). Die Arbeitsgruppe FRAGA et al. (2005) fand zudem heraus, dass ein gemeinsames Merkmal aller humanen Tumoren eine Hypoacetylierung des Histon H4 ist. Durch diese Erkenntnisse ist festzustellen, dass eine abweichende Expression der HDACs eine entscheidende Rolle in der Tumorentstehung und im Fortschreiten einer Tumorerkrankung spielt (BOLDEN et al. 2006). Dies wird auch von Studien bestätigt, welche durch ein Knockdown von überexprimierten HDACs das Tumorzellwachstum und das Überleben der Tumorzelllinien unterdrücken konnten (GLASER et al. 2003, 7 Literatur ZHU et al. 2004, HUANG et al. 2005, WILSON et al. 2006). Diese Erkenntnisse machen die HDACs zu einem interessanten Ziel für die Krebstherapie (BOLDEN et al. 2006). 2.3 Hemmung der HDAC-Enzyme als therapeutische Strategie bei der Tumorbekämpfung Die epigenetischen Vorgänge wie Acetylierung und Deacetylierung sind potentiell reversible Vorgänge. Man geht davon aus, dass es möglich ist, durch die Wiederherstellung des normalen epigenetischen Status die gestörten Zellproliferations- und Zelltodmechanismen maligner Zellen wieder zu normalisieren und dies therapeutisch zu nutzen (VILLAR-GAREA u. ESTELLER 2003, BOLDEN et al. 2006). Eine Möglichkeit hierzu wäre die Hemmung der HDACs durch sogenannte HDAC-Inhibitoren (HDACi). In den 90er Jahren gelang es, eine eindeutige Verbindung zwischen der Unterdrückung des Tumorzellwachstums und der Hemmung der HDAC-Aktivität festzustellen (YOSHIDA et al. 1990, RICHON et al. 1998), was das Interesse an der Erforschung von HDAC-hemmenden Substanzen immens steigerte. Auf Grund dieser Eigenschaft und dank ihrer geringen Toxizität, können HDAC-Inhibitoren eine neue Klasse von Antikrebsmitteln repräsentieren (VIGUSHIN u. COOMBES 2002). Derzeit können die HDACi, basierend auf ihrer chemischen Struktur, in 4 Klassen eingeteilt werden. Dabei ist die Hemmung der enzymatischen Aktivität der HDACs von unterschiedlicher Effizienz (BOLDEN et al. 2006). Die verschiedenen Gruppen der HDACi mit ihren wichtigsten Vertretern sind: 1.Hydroxamsäuren: Bekannteste Mitglieder dieser Gruppe sind das Trichostatin A (TSA) und das Suberoyl-Anilid-Bishydroxamid (SAHA, Vorinostat). Trichostatin A, ein Fermentationsprodukt von Streptomyces, ist eine der ersten Substanzen bei denen eine HDAC-hemmende Wirkung festgestellt wurde und ist der bisher potenteste HDACi. Allerdings ist TSA wegen seiner Toxizität und der geringen Spezifität für die klinische Anwendung nicht geeignet und wird nur noch in der Forschung angewendet (YOSHIDA et al. 1990, DE RUIJTER et al. 2003). SAHA ist der in den klinischen Studien am weitesten entwickelte HDACi (MARKS u. XU 2009) und zeigt hemmende Effekte in für den Patienten gut tolerierbaren Dosen (KUMAGAI et al. 2007). Zudem 8 Literatur ist SAHA der erste von der „Federal Drug Administration“ für eine Krebstherapie, beim fortgeschrittenen kutanen T-Zell-Lymphom, genehmigte HDACi (MARKS u XU 2009, LEMOINE. 2010) 2.Kurzkettige Fettsäuren: Zu dieser Gruppe gehören unter anderem das 4Phenylbutyrat (4-PB) und die Valproinsäure (VPA). Alle Mitglieder dieser Gruppe zeigen eine geringere Effizienz in ihrer Kapazität die HDAC zu hemmen, verglichen mit TSA (DE RUIJTER et al. 2003). Vorteil ist aber, dass sie wenig toxisch und gut verträglich sind (RUBENSTEIN u. ZEITLIN 1998). 3.Cyclische Tetrapeptide: Charakteristisch für diese Gruppe sind ihre komplizierte Struktur und das hohe Potential der HDAC Hemmung. Die meisten Angehörigen dieser Gruppe sind Produkte von Bakterien oder Pilzen. Es gibt aber auch chemisch hergestellte, welche eine Kombination von Hydroxamsäuren und cyclischen Tetrapeptiden sind. Beispiel für diese Gruppe sind Trapoxin A oder Apicidin (DE RUIJTER et al. 2003). 4.Benzamide: Zu dieser Gruppe gehören z.B. die HDAC Inhibitoren MS-275 (Entinostat) und Cl-994 (N-acetyldinaline). MS-275 hat in vivo einen viel stärkeren Antitumoreffekt bei einer wesentlich geringeren Toxizität als TSA (SAITO et al. 1999). In klinischen Studien der Phase I und II wird MS-275 sowohl als alleiniges Medikament als auch in Kombination mit anderen Stoffen untersucht. Es zeigt sich dabei als gut toleriert mit moderaten Auswirkungen auf solide Tumore und auf Leukämie (GORE et al. 2008, PRINCE et al. 2009, PILI et al. 2012). Bei dem Einsatz von HDAC-Inhibitoren werden verschiedene Effekte beobachtet, die sich negativ auf die Weiterentwicklung eines Tumors auswirken (Abb. 4, S.11). In malignen Zellen bewirken HDAC-Inhibitoren einen Zell-Zyklus-Arrest, der hauptsächlich in der G1-Phase des Zellzyklus stattfindet (MARKS et al. 2000, MARKS et al. 2001, JOHNSTONE. 2002, LINDEMANN et al. 2004). Hohe Konzentrationen von HDAC-Inhibitoren können aber auch zu einem Stopp in der G2/M Phase führen (MARKS u. XU. 2009). Die Ursache des Zellzyklusarrestes könnte zum einen die 9 Literatur Hemmung von Enzymen sein, die normalerweise an der Synthese der DNA beteiligt sind (GLASER et al. 2003, BOLDEN et al. 2006). Zum anderen könnte aber auch die direkte Beeinflussung der Chromatinstruktur zu einer veränderten Genexpression und so zu einem Zyklusarrest führen (NAKANO et al. 1997, HUANG et al. 2000, BOLDEN et al. 2006). Eine weitere wichtige Eigenschaft der HDACi ist die Induktion der Apoptose. Sie sind in der Lage, sowohl den extrinsischen als auch den intrinsischen apoptotischen Signalweg zu aktivieren. Dabei ist der intrinsische oder mitochondriale Signalweg, bei dem apoptotisch wirkende Proteine aus den Mitochondrien freigesetzt werden, der Hauptmechanismus des HDACi induzierten Zelltodes (BOLDEN et al. 2006, MARKS u. XU. 2009). Beim extrinischen apoptotischen Signalweg kommt es durch die Aktivierung verschiedener Todes-Rezeptoren wie dem Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα) oder dem Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand Rezeptor (TRAILR) zu einem Zelltod (NAKATA et al. 2004, INSINGA et al. 2005, SINGH et al. 2005, MARKS u. XU. 2009). Ein weiterer Weg der Apoptose, den die HDACi induzieren, ist der mitotische Zelltod. Durch die gesteigerte Acetylierung der Histone, welche die HDACi verursachen, kommt es zu einer Veränderung der Chromatinstruktur und somit auch zu einer Störung des Spindelapparates (ROBBINS et al. 2005). Die Folge ist eine anormale Mitose, aus der ein mitotischer Zelltod oder eine Apoptose resultiert (XU et al. 2007). Ein weiterer Effekt der HDACi ist die Hemmung der Angiogenese. Die Antiangiogenetischen Eigenschaften sind dabei verbunden mit einer verminderten Expression von proangiogenetischen Genen, wie zum Beispiel dem Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), dem basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) oder der endothelial Nitric Oxid Synthase (eNOS) (PILI et al. 2001, DEROANNE et al. 2002, ROSSIG et al. 2002, SASAKAWA et al. 2003, MICHAELIS et al. 2004, LEMOINE. 2010). Neben den bisher genannten Eigenschaften sind HDACi auch in der Lage, die Immunabwehr zu steigern. Auf der einen Seite können sie die Tumorzellen direkt beeinflussen, indem sie dafür sorgen, dass Major-Histocompatibilitiy-Complex-Proteine (MHC-Proteine) der Klasse I und II und Adhäsionsmoleküle wie CD 40, CD 80 und CD 86 hochreguliert werden. Somit werden die Tumorzellen als immunologisches Ziel attraktiver (MAEDA et al. 2000, MAGNER et al. 2000). Auf der anderen Seite können sie die Immunzellaktivität direkt oder indirekt über die Zytokinproduktion ver10 Literatur ändern. SAHA zum Beispiel hemmt pro-inflammatorische Zytokine wie TNFα, Interleukin-1 (IL-1) oder Interferonγ (IFNγ) (REDDY et al. 2004). Abbildung 4: Effekte der HDACi (adaptiert aus BOLDEN et al. 2006). Zusammengefasst induzieren HDAC-Inhibitoren in den Tumoren eine Wachstumsinhibierung, Apoptose, Proliferationshemmung und Zelldifferenzierung sowohl unter invitro als auch in-vivo Bedingungen (MARKS et al. 2001, DE RUIJTER et al. 2003). Dies bestätigen auch verschiedene präklinische Tierversuche und klinische Versuche, in denen HDACi potente Antitumor-Aktivitäten haben bei Konzentrationen, die minimal toxisch sind (DOKMANOVIC u. MARKS 2005, DRUMMOND et al. 2005). 11 Literatur 2.4 Die Auswirkung verschiedener HDAC-Inhibitoren auf das Pankreaskarzinom 2.4.1 4-Phenylbutyrat 4-Phenylbutyrat ist einer der wenigen HDACi, der schon klinisch bei der Behandlung von rezidivierenden malignen Gliomen und beim myelodysplastischen Syndrom getestet wurde (BHALLA u. LIST 2004, PHUPHANICH et al. 2005) und als gut toleriertes Medikament gilt. Über seine Wirkung auf das Pankreaskarzinom gibt es jedoch bis jetzt nur wenige Erkenntnisse. AMMERPOHL et al. (2007) untersuchten die Auswirkung von 4-PB auf verschiedene Pankreaskarzinomzelllinien. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass eine Behandlung der Zellen mit 4-PB zeit- und dosisabhängig das Wachstum der Tumorzellen hemmt, eine Apoptose induziert und einen Zell-Zyklus Arrest hervorruft. Des Weiteren wird die Expression von proapoptotischen Proteinen wie Caspase 8 und Bid gesteigert und die Aktivität der HDACs um bis zu 70% reduziert. Unter anderem wurde gezeigt, dass durch 4-PB die Kommunikation zwischen den Zellen gesteigert wird und die Gap-Junctions zwischen den Zellen vermehrt gebildet werden. Außerdem kommt es dabei zu einer Hemmung der extrazellulären Exportmechanismen, dadurch verbessert sich das Ansprechen der Pankreaskarzinomzellen auf Chemotherapeutika. 2.4.2 Valproinsäure Valproinsäure gehört zu den kurzkettigen Fettsäuren und hat eine gewisse inhibierende Wirkung auf verschiedene Krebsarten (CINATL et al. 1996, BLAHETA et al. 2005). Dies erreicht sie, indem sie über die Hemmung der HDACs das Tumorwachstum, die Metastasierung und die Angiogenese unterdrückt und eine Apoptose und Differenzierung induziert. Beim Pankreaskarzinom führte eine Behandlung mit VPA zu einer zeitabhängigen Hemmung der Zellproliferation. Dabei wurde die Adhäsion der Krebszellen an endotheliale Zellen um etwa 35% reduziert (JONES et al. 2008). Eine weitere Studie beschreibt, dass VPA anti-fibrogenetische Effekte auf PankreasSternzellen ausübt und auch deren Proliferation stark hemmt (BÜLOW et al. 2007). Dies ist von großer Bedeutung, da das Wachstum des Pankreaskarzinoms von Sternzellen beschleunigt wird (BACHEM et al. 2005). Die Arbeitsgruppe von SCHÜLER et al. (2010) berichtet, dass eine Kombinationsbehandlung von Pankre- 12 Literatur askarziomzellen mit VPA und TRAIL zu einer Abnahme der Zellviabilität und zu einer gesteigerten Fraktion von apoptotischen Zellen führt. 2.4.3 Trichostatin Trichostatin ist eine Hydroxamsäure und laut mehreren Studien wirksam bei der Behandlung des Pankreaskarzinoms. TSA hemmt die Proliferation von Pankreaskarzinomzellen und führt zu einem Zell-Zyklus Arrest in der G2/M-Phase (CECCONI et al. 2005, PIACENTINI et al. 2006, CECCONI et al. 2007, DONADELLI et al. 2007). Weiterhin wurde nachgewiesen, dass TSA eine Apoptose der Pankreaskarzinomzellen induziert und die Expression von proapoptotisch wirkenden Proteinen wie BAX und Caspase 8 und des Tumorsuppressorgens p21 fördert (GARCIA–MORALES et al. 2005, GAHR et al. 2007, EMONDS et al. 2010). Zusätzlich konnte man in mit TSA behandelten Zellen ein Anstieg von acetyliertem Histon H3 und H4 feststellen. Diese offensichtliche Hemmung der HDACs konnte man auch in etwas schwächerer Form in-vivo nachweisen (DONADELLI et al. 2007, EMONDS et al. 2010). Des Weiteren kommt es durch eine Behandlung mit TSA in den Krebszellen zu einer verminderten DNA-Synthese, da TSA den Einbau von Bromodeoxyuridine (BrdU) in den DNAStrang vermindert. Dies könnte die Ursache für die Unterdrückung der Zellproliferation und die Induktion der Apoptose sein (GAHR et al. 2007, EMONDS et al. 2010). Ein weiterer Effekt von TSA ist die Steigerung der Wirksamkeit anderer Chemotherapeutika. Vor allem auf Gemcitabine, welches als Goldstandard unter den Chemotherapeutika gilt, hat TSA einen besonders fördernden Effekt (CECCONI et al. 2005, PIACENTINI et al. 2006, DONADELLI et al. 2007). 2.4.4 SAHA (Vorinostat) Der Histondeacetylase-Inhibitor SAHA (Vorinostat) zeigt auf Pankreaskrebs-Zelllinien ebensolche Effekte wie sie schon allgemein für HDAC-Inhibitoren beschrieben wurden und das sowohl in-vitro als auch in-vivo. Der Unterschied zu anderen HDACi besteht darin, dass dies in einer niedrigen, gut tolerablen Dosierung stattfindet (KELLY et al. 2002, KELLY et al. 2003, KUMAGAI et al. 2007). Die Wachstumshemmung der Pankreaskrebszellen erfolgt bei SAHA dosisabhängig und auch bei xenograft transplantierten Zellen ist eine Wachstumshemmung festzustellen. (ARNOLD et al. 2007, KUMAGAI et al. 2007, NEUREITER et al. 2007). Diese Proliferationshemmung ist verbunden mit einer Apoptoseinduktion und einem Zell-Zyklus-Stop. Des Weiteren 13 Literatur konnte man feststellen, dass durch die Behandlung mit SAHA der Anteil an acetyliertem Histon H3 ansteigt, was darauf hinweist, dass SAHA die DeacetylierungsAktivität der HDACs hemmt (OGAWA et al. 2005, ARNOLD et al. 2007, KUMAGAI et al. 2007). Ein weiterer Effekt von SAHA ist eine gesteigerte Expression von Tumorsuppressorgenen, verbunden mit deren antiproliferativer Wirkung (KUMAGAI et al. 2007). In Kombination mit anderen Stoffen wie zum Beispiel Gemcitabine oder Zebularine werden diese anti-Tumor Effekte von SAHA weiter verstärkt (ARNOLD et al. 2007, NEUREITER et al. 2007). 2.4.5 MS-275 Obwohl die Wirkung dieses HDAC-Inhibitors schon bei verschiedenen Krebsarten untersucht wurde, liegen nur sehr wenige Ergebnisse bezüglich der Auswirkungen auf das Pankreaskarzinom vor. Eine Studie von SAITO et al. (1999) untersucht zum einen die Auswirkung von MS-275 auf mehrere Zelllinien, unter anderem auf eine Pankreaskrebszelllinie, zum anderen die Auswirkung auf xenograft transplantierte Tumore. In den Zelllinien bewirkt MS-275 eine Induktion des Tumorsuppressorgens p21 und hemmt die Zellproliferation. Dabei ist festzustellen, dass die Akkumulation von p21 schneller und beträchtlicher ist, je sensitiver die Zellen auf MS-275 reagieren. Die Pankreaskrebszelllinie zeigt dabei eine relativ gute Sensitivität gegenüber MS-275. Bei den in-vivo Versuchen zeigt der HDAC-Inhibitor ebenfalls einen moderaten hemmenden Effekt auf das Wachstum eines in Nacktmäuse xenograft implantierten Pankreastumors. 2.5 Connexinexpression und das Tumorwachstum 2.5.1 Veränderung der Connexine und der Gap-Junctions in der Karzinogenese Alle Zellen benötigen zu ihrer Kommunikation und zum gegenseitigem Signalaustausch bestimmte Proteinkanäle. Über diese sogenannten Gap-Junctions werden Moleküle transportiert, die für Wachstum, Differenzierung, Apoptose und Homöostase (LOEWENSTEIN. 1990, YAMASAKI u. NAUS 1996, YAMASAKI et al. 1999, WILSON et al. 2000, TROSKO u. CHANG 2001) von Bedeutung sind. Zusammengesetzt sind Gap-Junctions (Abb. 5 und 6, S. 15) aus zwei gegenüberliegenden Halb- 14 Literatur kanälen, den Connexonen, die aus jeweils 6 Connexinen bestehen (ASKLUND et al. 2003). Abbildung 5: Schematische Darstellung der Gap-­‐Junctions von zwei gegenüberliegenden Zellen (adaptiert aus: http://de.wikipedia.org/wiki/Gap_junction). Abbildung 6: Darstellung einer Gap-­‐Junction in offenem und geschlossenem Zustand (adap-­‐ tiert aus: http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Connexon_and_connexin_structure.svg&file timestamp=20060606185341). 15 Literatur Connexine, und daraus resultierend die Gap-Junctions, sind an der Wachstumsregulierung der Zelle beteiligt (YAMASAKI et al. 1999, ASKLUND et al. 2003), wobei die Connexine auch vollständig unabhängig von den Gap-Junctions agieren können (JIANG u. GU 2005). MOORBY und PATEL (2001) zeigen in ihrer Studie, dass trotz Blockade der Gap-Junctions, die Kontrollwirkung der Connexine auf das Zellwachstum unbeeinflusst bleibt. Ebenso haben Connexine einen völlig unabhängigen Einfluss auf die Zelldifferenzierung (JIANG u. GU 2005). Demzufolge liegt es nahe, dass eine verringerte Connexinexpression eine mangelhafte Zell-Zell-Kommunikation nach sich zieht (YAMASAKI u. NAUS 1996, MESNIL et al. 2005). Dies könnte in der Entwicklung des Krebses eine Rolle spielen. Einige Arbeitsgruppen konnten auch nachweisen, dass in Tumorgewebe ein Mangel an Connexinen herrscht. Gleichzeitig wurde in diesen Studien nachgewiesen, dass die Expression und Lokalisation von Connexinen herabgesetzt und verändert ist und dass es in Tumoren zu Mutationen der Connexine kommen kann (YAMASAKI u. NAUS 1996, YAMASAKI et al. 1999, VINE u. BERTRAM 2002, JIANG u. GU 2005, KING u. BERTRAM 2005, MESNIL et al. 2005). Folglich kann man davon ausgehen, dass in Tumoren die interzelluläre Kommunikation verringert ist und die Kontrolle des Zellwachstums und der Differenzierung gestört ist. Dies bedeutet, dass die Connexine eine Umwandlung zur Tumorzelle zu verhindern könnten (JIANG u. GU 2005, MC LACHLAN et al. 2006). 2.5.2 Upregulation der Connexinexpression durch HDACi in der Therapie und Prophylaxe der Tumorerkrankungen Nach der Feststellung, dass sich die Karzinogenese negativ auf die Expression, Lokalisation und Funktionalität der Connexine auswirkt, könnte eine Beeinflussung dieser Zellbestandteile einen hemmenden Effekt auf das Tumorwachstum haben. Connexine können sich nämlich wie Tumorsuppressorgene verhalten, die unterdrückt werden müssen, damit eine Tumorentwicklung zustande kommt (WEINBERG. 1991). Eine Wiederherstellung und Steigerung der Connexinexpression resultiert demnach in einem verminderten neoplastischen Potential. Dies äußert sich in einem reduzierten Tumorwachstum, gibt den Zellen die Möglichkeit sich zu differenzieren und reduziert die Migration von Tumorzellen (YAMASAKI et al. 1999, KING u. BERTRAM 2005, MC LACHLAN et al. 2006). Möglich ist die Entwicklung dieser connexinfördernden Wirkung durch die Verabreichung verschiedener antitumorös wir16 Literatur kender oder wachstumsvorbeugender Stoffe wie Retinoide, Glucocorticoide oder Vitamin D (YAMASAKI et al. 1999, KING u. BERTRAM 2005). Aber auch HDACi sind in der Lage, die Connexinexpression zu erhöhen (KING u. BERTRAM 2005). Eine Behandlung mit 4-PB führt in-vitro und in- vivo zu einer erhöhten Expression von Connexinen und lässt die interzelluläre Kommunikation durch Gap-Junctions ansteigen (ASKLUND et al. 2003, AMMERPOHL et al. 2007, HATTORI et al. 2007). Diese führt zu einer erhöhten Apoptoserate der Tumorzellen und einem reduzierten Tumorwachstum. Auch für die HDAC-Inhibitoren SAHA und TSA konnte die connexinförderne Wirkung nachgewiesen werden (OGAWA et al. 2005, VINKEN et al. 2006). Der Verlust von Connexinen und Gap-Junctions ist ein wichtiges Ereignis in der Karzinogenese. Durch diese Erkenntnis und die Tatsache, dass die Beeinflussung dieser Faktoren sich auf das Tumorwachstum auswirkt, werden sie zu möglichen Angriffspunkten in der Krebstherapie (KING u. BERTRAM 2005). Zusätzlich zur Therapiemöglichkeit bietet sich auf diesem Weg aber auch eine Möglichkeit der Krebsprophylaxe. Nicht nur in Tumorzellen wird die Anzahl der Connexine nach oben reguliert, sondern auch in normalen Zellen. Während es in Tumorzellen dadurch zu einer erhöhten Apoptoserate kommt, bleibt diese Wirkung in normalen Zellen aus. Diese Eigenschaft in normalen, gesunden Zellen die interzelluläre Kommunikation über Gap-Junctions ohne schwerwiegende Nebenwirkungen zu induzieren, könnte für die Krebsprophylaxe nützlich sein (OGAWA et al. 2005). 17 Literatur 2.6 Zielsetzung der Arbeit Da die Therapiemöglichkeiten des Pankreaskarzinoms sowohl in der Human- als auch in der Tiermedizin nicht zufriedenstellend sind, liegt ein großes Interesse an der Erforschung neuer Therapieansätze. In dieser Arbeit soll die Wirkung des HDACInhibitors 4-Phenylbutyrat auf Pankreaskarzinomzellen untersucht werden. Neben dem Einfluss auf die Zellproliferation in-vitro, werden vor allem die Auswirkungen invivo untersucht. Hierzu wird im subkutanen und orthotopen Tumormodell der Einfluss von 4-PB auf Tumorwachstum, Zellproliferation, Nekroseausbreitung, Regulation des Connexin 43 und Histonacetylierung im Tumorgewebe untersucht. 18 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Geräte Analysewaage Mettler AM 100 Mettler Toledo, Gießen, Deutschland Autoklav Vakulab HP Medizin Mechanik GmbH München, Deutschland CO2 Inkubator Sanyo Scientific, Bensenville, IL, USA Eismaschine Scotsman, Kälte-ZUGCKKlima, Leimen, Deutschland Gefrierschrank -20°C Liebherr, Ochsenhausen, Deutschland Gefrierschrank -80°C Sanyo Ultra LowMS Laborgeräte Schroeder, Wiesloch, Deutschland Gewebeeinbettmaschine Leica, Bensheim, Deutschland Mikrotom Leica, Bensheim, Deutschland Kühlschrank 4°C Liebherr, Ochsenhausen, Deutschland Lichtmikroskop Leica DMLB Leica, Bensheim, Deutschland Lichtmikroskop Leica DMILLeica, Bensheim, Deutschland Magnetrührer Ika-Combimag RET Jahnke & Kunkel GmbH, Staufen i. B., Deutschland Microplatten ELISA-Lesegerät Thermo Electron GmbH, Karlsruhe, Deutschland Mikroskop Zeiss, Jena, Deutschland Mikrowellengerät Quelle, Fürth, Deutschland Neubauer-Zählkammer Assistant, Sondheim, Deutschland Pipetman® 1000µl, 20µl, 100µl, 20µl, 10µl, 2µl Gilson, Bad Camberg, Deutschland Pipettierhilfe Pipetus – Akku Hirschmann, Deutschland 19 Eberstadt, Material und Methoden Porzellanmörser, Porzellanpistill Schieblehre, elektronisch Sterilarbeitsbank Biowizard Kojair Koja, Uilppula, Finnland Stickstoffgefrierschrank Thermoform Thermoform, Dreieich, Deutschland Thermomixer Wesseling, Berzdorf, Deutschland Tischzentrifuge5415R Eppendorf, Hamburg, Deutschland Vortex – Mixer REAX Top Heidolph, Schwabach, Deutschland Wasserbad 37°C Köttermann, Uetze/Hänigsen, Deutschland Zentrifuge 5810R 3.1.2 Eppendorf, Hamburg, Deutschland Verbrauchsmaterialien 96–Lochplatte Falcon BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland 96-Lochplatte Half Area Microplatte Greiner, Frickenhausen, Deutschland Deckgläser Marienfeld, Lauda-Königshofen, Deutschland Einbettkassetten Neolab, Heidelberg, Deutschland Eppendorf® 1,5ml Tubes Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Falcon® Tubes 15ml pp-test tubes BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland Falcon® Tubes 50ml pp-test tubes BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland Kanülen 0,4 × 19mm BD Biosciences, Heidelberg, 0,6 × 25mm Deutschland 0,9 × 40mm Kunststoffpipetten 2, 5, 10, 25ml Costar® Corning Inc., Corning, NY, USA Mikro-Schraubröhre 2ml, PP Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Nahtmaterial Ethicon, St. Stevens, Deutschland 5-0 Prolene 7-0 Prolene Objektträger Menzel, Baunchweig, Deutschland 20 Material und Methoden Parafilm Pechiney plastic packaging, Chicago, USA Pipettenspitzen 10µl, 20µl, 100µl, CLP, San Diego, CA, USA 200µl, 1000µl Skalpell Feather, Fukushima, Japan Spritzen 1ml BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland Spritzenfilter 0,2mm Nalgene, Rochester, NY, USA Wattestäbchen NOBA, Wetter, Deutschland Wägepapier Neolab, Heidelberg, Deutschland Zellkulturflasche 75cm² BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland Zellkulturschale BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland 3.1.3 Chemikalien Aqua ad iniectabilia Braun, Melsungen, Deutschland Eosin Y Merck, Darmstadt, Deutschland Bovines Serum Albumin Roth, Karlsruhe, Deutschland Ethanol Roth, Karlsruhe, Deutschland Fetales Kälber Serum Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland Flüssiges DAB & Chromogensubstrat DAKO GmbH, Hamburg, Deutschland Flüssigstickstoff TMG Sol Group, Gersthofen, Deutschland Gemcitabinehydrochlorid Synchem OHG, Felsberg Deutschland Isopropanol Roth, Karlsruhe, Deutschland Ketamin, Ketanest S® Pfitzer, Berlin, Deutschland Mayers Haemalaunlösung Merck, Darmstadt, Deutschland Methanol Roth, Karlsruhe, Deutschland MTT (3-(4,5-methylthiazol-2yl)-2, Sigma, Taufkirchen, Deutschland 5-diphenyltetrazolium Bromid) 21 Material und Methoden Natriumchloridlösung, isoton Merck, Darmstadt, Deutschland Penicillin-Streptomycin Gibco, Auckland, Neuseeland Permount Mounting Medium Fischer Scientific, Kehl, Deutschland Phenylbutyrat acid Triple crown America, Perkasie, PA, USA Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland Proteaseinhibitor Cocktail Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland RPMI 1640 Medium Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland Roticlear® Roth, Karlsruhe, Deutschland Trypsin/EDTA Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland Trypanblau Lösung Sigma, Taufkirchen, Deutschland Tween 20 Merck, Darmstadt, Deutschland Verdünnungsmedium DAKO GmbH, Hamburg, Deutschland Wasserstoffperoxid Roth, Karlsruhe, Deutschland Xylazin, Rapinovet® 2% Bayer, Leverkusen, Deutschland 3.1.4 Antikörper Anti-Connexin 43 (monoclonal mouse) Zymed® Laboratories, San Francisco, CA, USA Anti Histone H4 (monoclonal rabbit) Millipore, Temecula, CA, USA Anti-Human Epithelial Membrane Antigen DAKO GmbH, Hamburg, (monoclonal mouse) Deutschland Anti-Human Ki-67 Antigen DAKO GmbH, Hamburg, (monoclonal mouse) Deutschland Anti-mouse Sekundär-Antikörper DAKO GmbH, Hamburg, Deutschland Anti-rabbit Sekundär-Antikörper DAKO GmbH, Hamburg Deutschland Negative Control Mouse IgG1 Serotec, Düsseldorf, Deutschland- Negative Control Mouse IgG2a DAKO GmbH, Hamburg, Deutschland 22 Material und Methoden 3.1.5 Puffer und Lösungen 10 × Tris gepufferte Salzlösung (10 × TBS) Tris Base 12,1 g NaCl 85 g H2 O 800 ml pH 7,4 mit 5M HCL H2 O ad 1000 ml Waschpuffer 10 × TBS 100 ml BSA 1g H2O auf 1000 ml (Tween-20 0,5 ml) Citratbuffer (10 mM) 200 mM Citratbuffer stocksolution 75 ml H2 O 1425 ml Eosin-Lösung Eosin-Y 0,5 g Ethanol 96% 100 ml Eisessig 2 Tropfen Thiazolyl Blue Tetrazolium 5 mg PBS 1000 µl MTT 4-Phenylbutyrat 0,1M Lösung 4-Phenylbutyrat 186 mg PBS 10 ml Gemcitabine Injektionslösung Gemcitabinehydrochlorid 150 mg PBS 20 ml 23 Material und Methoden 4-Phenylbutyrat Injektionslösung 4-Phenylbutyrat 2,25 g PBS 45 ml Zellkulturmedium RPMI 1640 450 ml Fetales Kälber Serum 50 ml Penicillin-Streptomycin 5 ml Narkoseinjektionslösung Xylazin2% Verdünnung 1:25 0,1 ml Xylazin 2% 2,4 ml NaCl 0,9% Narkoseinjektionslösung 0,45 ml Xylazin2% Verdünnung 1:25 0,55 ml Ketanest S® Narkose: 0,1ml Narkoseinjektionslösung pro 10 g KGW i.p. 3.1.6 Software Adobe Photoshop CS5.1 Adobe System Inc., Waltham, MA, USA CA, USA GraphPad Prism 4.0 GraphPad Software Inc. La Jolla, ImageJ NIH, Bethesda, MA, USA Microsoft Word 2007 Microsoft USA 24 Corporation, Redmond, Material und Methoden 3.2 Zelllinien Als Zelllinien wurden die humane Pankreaskarzinom-Zelllinien T3M4, Panc-1 und ASPC verwendet. Die T3M4 Zelllinie stammt aus der Duke Universitiy North Carolina, USA. Die ASPC und Panc-1 Zelllinie stammt von der American Type Culture Collection, Manassas,Virginia, USA. 3.3 Tiere Weibliche, circa 4 Wochen alte, athymische, immunsupprimierte Nacktmäuse vom Stamm „CD-1 ®nu BR“ wurden von der Firma Charles River bezogen. In Gruppen zu maximal 4 Tieren wurden sie in speziell für immunsupprimierte Tiere vorgesehenen Räumen der Interfakultären Biomedizinischen Forschungseinrichtung der Universität Heidelberg in Filterkäfigen bei 21 – 24 °C und 40 – 60 % Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Versorgung der Tiere mit Futter und Wasser erfolgte ad libitum. Die Versuchsbehandlung der Tiere sowie die operativen Eingriffe wurden an einem sterilen Arbeitsplatz für immunsupprimierte Tiere durchgeführt. Die Tötung der Tiere erfolgte in Vollnarkose durch CO2. Nach der Tötung wurden neben den Tumoren auch Leber, Milz und eventuell vorhandene Metastasen entnommen und für weitere Analysen konserviert. Insgesamt wurden 86 Tiere eingesetzt. In den subkutanen Versuchsgruppen wurden in der Kontrollgruppe 18 Tiere und in den Behandlungsgruppen je 12 Tiere verwendet. In den orthotopen Versuchsgruppen wurden je 8 Tiere eingesetzt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den jüngsten Tierschutzbestimmungen, die dem deutschen Tierschutzgesetz unterliegen, durchgeführt (BGBI. I S. 1105, 1818), AZ 35-9185.81/G-163/07, Regierungspräsidium Karlsruhe. 3.4 Methoden 3.4.1 Zellbiologische Methoden 3.4.1.1 Kultivierung von Zellen Alle Arbeiten mit den Zellen wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Pankreaskarzinomzellen der Zelllinie T3M4, ASPC und Panc-1 wurden in 75 cm³ Kulturflaschen bei 37°C, 5 % CO2 und 90 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Als Kulturmedium wurde ein mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin versetztes RPMI-Medium verwendet. Je nach Wachstumsverhalten wurden die Zellen 1 – 2 mal 25 Material und Methoden wöchentlich passagiert. Dazu wurde das verbrauchte Medium aus den Kulturflaschen verworfen, die adhärenten Zellen mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und anschließend mit ca. 2 – 3 ml (T3M4, Panc-1) bzw. 5 ml (ASPC) Trypsin/EDTA zum Lösen überschichtet. Nach einer Inkubationszeit von 3 – 5 min bei 37°C wurde zur Inaktivierung des Trypsins 8 ml Medium dazugegeben. Von dieser Zellsuspension wurde eine gewünschte Menge entnommen, in neue Kulturflaschen überführt und mit Medium auf 15 ml aufgefüllt. 3.4.1.2 Vorbereiten von Zellen zur in vivo Injektion Um die Zellen zur in vivo Injektion verwenden zu können, wurde, wie zur Passagierung, zunächst das verbrauchte Medium verworfen, die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit Trypsin/EDTA vom Flaschenboden gelöst. Durch Abspülen des Flaschenbodens mit Hilfe des zugegebenen Mediums, lösten sich die restlich anhaftenden Zellen. Diese Zellsuspension wurde nun in ein 15 ml Falcon Tube überführt und bei Raumtemperatur mit 1000 rpm für 10 min zentrifugiert. Nach Absaugen und Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen in 5 ml 37°C warmer PBS resuspendiert, gezählt und anschließend auf die gewünschte Zellkonzentration von 4 × 106 Zellen / ml eingestellt. Zum Auszählen wurden 50 µl der Zellsuspension mit 50 µl Trypanblau gemischt und davon wenige µl in eine Neubauer-Zählkammer eingebracht. Durch das Trypanblau ist es möglich, tote Zellen zu erkennen, da es durch die zerstörte Plasmamembran in die Zelle eindringen kann und diese blau färbt. Nach Auszählen aller ungefärbten und somit lebenden Zellen in allen vier Quadranten der Neubauer-Zählkammer, konnte unter Verwendung des Mittelwertes und der folgenden Formel die Zellkonzentration ermittelt werden. D × Z × 104 = Zellzahl / ml D = Verdünnungsfaktor Z = Mittelwert der gezählten Zellen Nachdem die gewünschte Zellkonzentration eingestellt war, wurden jeweils 300 µl der Zellsuspension in Kryo-Tubes abgefüllt und bis zur in vivo Injektion im Zellkulturinkubator aufbewahrt. Dabei musste beachtet werden, dass bis zur Injektion nicht mehr als 1h verging, da sich danach die Lebensfähigkeit der Zellen reduzierte. 26 Material und Methoden 3.4.1.3 Untersuchung der Zellproliferation (MTT-Assay) Anhand des Tetrazoliumsalzes MTT, 3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,-5- diphenyltetrazoliumbromid, ist es möglich, eine Aussage über die Zellproliferation zu treffen, da lebende Zellen mit uneingeschränkter mitochondrialer Funktion in der Lage sind, das MTT in einen violetten, wasserunlöslichen Formazankomplex umzuwandeln. Eine Abnahme der Farbintensität bedeutet demnach eine Abnahme der Viabilität und somit auch der Proliferation der Zellen. Zunächst wurden die T3M4, ASPC und Panc-1 Zellen in einer Konzentration von 5000 Zellen pro 100 µl und pro Kammer in eine 96-Lochplatte ausgesät. Nach einer Inkubationszeit von 24h im Zellkulturinkubator wurde das Medium gewechselt und 4-Phenylbutyrat hinzugegeben und zwar in den Konzentrationen von 0,5 mmol, 1mmol, 2,5 mmol, 5 mmol und 10 mmol. Zu den Zellen, die als Kontrolle dienten, wurde 10 µl PBS hinzugegeben. Um auch eine Aktivitätsbestimmung zu dem Zeitpunkt T0 zu erhalten, wurde bei Kontrollplatten nach 24h in jede Kammer 10 µl MTT dazugegeben. Nach 4h Einwirkzeit im Zellkulturinkubator wurde der Inhalt der Kammern aspiriert und die Platten zum Trocknen bei Raumtemperatur aufgestellt. Nach etwa 15 min Trockenzeit wurden die Zellen durch Zugabe von 100 µl Isopropanol resuspendiert und die optische Dichte bei 570 nm auf dem ELISA-Plattenlesegerät gemessen. Da die Einwirkzeit des 4Phenylbutyrates auf 48h angesetzt wurde, wurde nach 48h 10 µl MTT in jede Kammer dazugegeben und, wie oben beschrieben, weiter vorgegangen. Nach Messung der optischen Dichte wurden die gemessenen Werte mit dem Kontrollwert ins Verhältnis gesetzt, wodurch man den prozentualen Anteil an der maximalen Proliferation, nämlich die der unbehandelten Zellen, erhält. Für jeden MTT-Assay wurden die einzelnen Experimente immer dreifach durchgeführt. Die mittlere effektive Konzentration (EC50) konnte mit folgender Formel berechnet werden: EC50 = (T48 – T0)/(C-T0)x100 T48: optische Dichte 48 Stunden nach Einbringung von 4-Phenylbutyrat T0: optische Dichte zum Zeitpunkt 0 C: optische Dichte der unbehandelten Kontrolle nach 48 Stunden 27 Material und Methoden 3.4.2 Tierexperimentelle Methoden 3.4.2.1 Subkutane Tumorinokulation (subkutanes Mausmodel) Die T3M4 Zellen wurden, wie oben beschrieben, zur in-vivo Injektion vorbereitet. Pro Maus wurden jeweils im Bereich der rechten Schulter und linksseitig der Lendenwirbelsäule 4 × 105 Zellen / 100 µl subkutan injiziert. Das Injektionsvolumen betrug pro Injektionsstelle 100 µl. Um die Schmerzeinwirkung durch die Injektion so gering wie möglich zu halten und um eine Fehlinjektion zu vermeiden, wurden die Mäuse zur Zellinjektion mit einem Gemisch aus Ketamin und Xylazin intraperitoneal narkotisiert (Mischung und Konzentration s. Kapitel 3.1.5, S. 24). Sechs Tage nach Zellinjektion begann die Behandlung mit dem für die einzelnen Versuchsgruppen vorgesehenem Medikament nach dem in Tabelle 1 aufgeführtem Schema. Gruppe Medikament Frequenz der Be- Dosierung handlung Kontrollgruppe PBS 2 × wöchentlich 20 µl / g Therapie-Gruppe 4-Phenylbutyrat 3 × wöchentlich 500 mg / kg Chemotherapie- Gemcitabine 2 × wöchentlich 150 mg / kg Kombinations- Gemcitabine 2 × wöchentlich 150 mg / kg Gruppe 4-Phenylbutyrat 3 × wöchentlich 500 mg / kg Gruppe Tabelle 1: Behandlungsschema der einzelnen Versuchsgruppen Die Applikation aller Medikamente erfolgte intraperitoneal. Jeweils an Tag 6, 11, 14, 18, 21 und 25 wurde das Tumorvolumen bestimmt, indem Länge, Breite und Höhe des gewachsenen Tumors mit Hilfe einer elektronischen Schieblehre gemessen wurde. Das Volumen des Tumors errechnete sich dann mit folgender Formel: Tumorvolumen V = Länge × Breite × Höhe × 0,5236 Am Tag 28 nach Zellimplantation wurden die Mäuse in Vollnarkose durch CO2 getötet und das gewachsene Tumorgewebe mit Hilfe einer Schere oder eines Skalpells entnommen. Ein Teil des entnommenen Tumors wurde in Formalin fixiert, um ihn 28 Material und Methoden anschließend in Paraffinblöcke einbetten zu können. Weitere Teile des Tumors wurden in Flüssigstickstoff schockgefroren und aufbewahrt. Ein weiteres etwa 1 mm³ großes Stück Tumor wurde benötigt, um es während einer Operation orthotop in den Pankreasschwanz einer Maus transplantieren zu können. Tiere, bei welchen die gewachsenen Tumoren eine Größe von 1,5 cm im Durchmesser überschritten oder Ulzerationen zeigten, wurden aus Tierschutzgründen vor Ablauf der 28 Tage getötet. Ebenso erfolgte ein vorzeitiger Versuchsabbruch, wenn es bei den Tieren zu einer Verschlechterung des Allgemeinzustandes und zu einer Gewichtsreduktion kam. 3.4.2.2 Orthotope Tumorimplantation Um die Auswirkungen des Tumorwachstums auf das Pankreas selbst beurteilen zu können, wurde eine orthotope Tumorimplantation in das Pankreas einer Maus durchgeführt. Hierzu wurde aus dem im Spendertier subkutan gewachsenen Tumorgewebe ein etwa 1-2 mm³ großes Stück entnommen und in den Pankreasschwanz des Empfängertiers orthotop transplantiert. Zur Operation wurde das Empfängertier mit einem Gemisch aus Ketamin und Xylazin intraperitoneal narkotisiert (Mischung und Konzentration s. Kapitel 3.1.5, S. 24). Nach Desinfektion des Operationsfeldes wurde durch einen medianen Schnitt im Sinne einer mittleren Laparotomie Haut, Muskulatur und Peritoneum durchtrennt und somit die Bauchhöhle eröffnet. Nach Aufsuchen und Vorverlagerung des intraperitoneal gelegenen Pankreasschwanzes, erfolgte die orthotope Implantation des Tumors in eine gebildete Gewebetasche, sowie dessen Fixierung mit einer feinen Naht (Monocryl 7-0) in mikrochirurgischer Technik. Der darauf folgende Verschluss der Bauchhöhle erfolgte schichtweise mit Einzelheften. Postoperativ erhielten die Versuchstiere zur Analgesie alle 6 Stunden subkutan 0,05 mg/kg Körpergewicht Buprenorphin sowie 200 mg/kg Körpergewicht Metamizol. Diese Schmerztherapie erfolgte bis zu 2 Tagen postoperativ. Die Gabe der vorgesehenen Medikamente begann 6 Tage nach Tumorimplantation mit dem gleichen Behandlungsschema wie bei der subkutanen Tumorinokulation (Tabelle 1, S. 28). 28 Tage nach der Operation wurden die Mäuse in Vollnarkose durch CO2 getötet und das gewachsene Tumorgewebe sowie die Leber, Milz und restliches Pankreasgewebe mit Hilfe einer Schere entnommen. Das Tumorgewebe wurde, wie beim subkutanen Wachstumsmodell, in Formalin fixiert und in Flüssigstickstoff 29 Material und Methoden schockgefroren und aufbewahrt. Die Organe wurden in Formalin fixiert. Direkt nach Entnahme des Tumors wurde dessen Länge, Breite und Höhe mit Hilfe einer elektronischen Schieblehre gemessen. Anschließend wurde das Volumen mit Hilfe der folgenden Formel berechnet. Tumorvolumen V = Länge × Breite × Höhe × 0,5236 Mäuse deren Allgemeinzustand sich vor Ablauf der 28 Tage verschlechterte, wurden vorzeitig aus Tierschutzgründen getötet. 3.4.3 Immunhistochemische Methoden 3.4.3.1 Allgemeines Protokoll des verwendeten immunhistochemischen Verfahrens Für alle immunhistochemischen Nachweise wurden zunächst aus den in Paraffin eingebetteten Gewebeproben mittels Mikrotom 3-5 µm dicke Schnitte angefertigt und paarweise auf Objektträgern fixiert. Das folgende Protokoll wurde bei allen durchgeführten immunhistochemischen Versuchen angewendet und variiert nur hinsichtlich der Verdünnung der Antikörper, der verwendeten Negativkontrollen und der Reaktionszeit zur Visualisierung. Im ersten Schritt wurden die Schnitte nach folgendem Schema deparaffiniert und rehydriert: 3 × 10 min in Xylol 3 × 10 min Ethanol 100 % 10 min in Ethanol 95 % 10 min in Ethanol 70 % 10 min in Ethanol 50 % 5 min waschen in destilliertem Wasser Anschließend wurden die Schnitte 3 × 5 min in Citratpuffer (pH 6,0) in der Mikrowelle bei 500 W erhitzt. Nach einer Abkühlungszeit von 20 min bei Raumtemperatur wurden sie 10 min mit einer 1 × TBS / 0,1 % BSA-Lösung gewaschen. Um die endogene Peroxidaseaktivität des Gewebes zu hemmen, folgte eine 10 minütige Inkubation in 30 Material und Methoden einem 3 %igen Peroxidaseblock, bestehend aus Wasserstoffperoxid (30 %ig) und Methanol (100 %ig). Danach wurden die Präparate erneut mit 1 × TBS / 0,1 % BSA zunächst abgespült und dann 2 × 10 min gewaschen. Anschließend wurde der jeweilige Antikörper in der entsprechenden Verdünnung auf eines der beiden auf dem Objektträger befindlichen Präparate aufgebracht und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die zum Antikörper passende Negativkontrolle wurde in der gleichen Konzentration wie der Erstantikörper auf das zweite Präparat des Objektträgers aufgebracht. Am Folgetag wurden die Präparate zunächst mit 1 × TBS / 0,1 % BSA / 0,05 % Tween 20 abgespült und anschließend mit der gleichen Waschlösung für 3 × 10 min gewaschen. Darauf folgte eine nochmalige Waschung für 10 min mit der 1 × TBS / 0,1 % BSA-Lösung. Der danach aufgebrachte Anti-mouse Sekundär-Antikörper (DAKO Corporation) wurde nach 45 min Einwirkzeit wieder abgespült. Nach 5 × 10 min waschen mit 1 × TBS / 0,1 % BSA / 0,05 % Tween 20 und 2 × 10 min waschen mit 1 × TBS / 0,1 % BSA-Lösung erfolgte die Visualisierung mit dem DAKOEnvision® System. Je nach Antikörper dauerte die Reaktionszeit unterschiedlich lange. Nach Stoppen der Reaktion in destilliertem Wasser und Gegenfärbung für 10 Sekunden in Mayer´s Hämatoxilin, wurden die Präparate für 10 min unter fließendem Wasser abgespült. Die anschließende Dehydratation erfolgte nach folgendem Schema: 3 min Ethanol 70 % 3 min Ethanol 95 % 3 × 3 min Ethanol 100 % 3 × 5 min Xylol Zum Schluss erfolgte das Eindecken der Schnitte, wobei zum Schutz der Präparate ein Deckgläschen mit Permount®-Flüssigkeit aufgetragen wurde. Anschließend wurden die Präparate befundet und mit einer computerverbundenen Digitalkamera unter Verwendung des Axio Vision 3.1 Programmes von Zeiss fotografiert. 3.4.3.2 Immunhistochemie zum Nachweis proliferierender Zellen Zur immunhistochemischen Darstellung der proliferierenden Zellen wurde der monoklonale Primärantikörper Mouse-anti-human-Ki-67 von DAKO Corporation verwendet. Das Ki-67 Antigen wird in der Interphase des Zellzyklus im Nukleus exprimiert. Befin31 Material und Methoden det sich die Zelle im nicht proliferativen Zustand und während DNA- Reparaturprozesse findet keine Expression des Ki-67 Antigen statt. Mit dem DakoCytomation Antibody Diluent wurde der Antikörper auf die passende Verdünnung von 1:5 verdünnt. Als Negativkontrolle diente Mäuse-IgG1 von der Firma Serotec. Zur Visualisierung wurde eine Reaktionszeit von 8-12 Sekunden benötigt. Die Auswertung erfolgte am Lichtmikroskop mit 40 facher Vergrößerung. Als positiv bewertet wurden Zellen mit einem nukleären Färbemuster, welches in der Negativkontrolle nicht nachweisbar war. Je Gruppe des subkutanen und orthotopen Versuchsmodells wurde von 6 verschiedenen Mäusen ein Schnitt ausgewertet. Je Schnitt wurden 3 verschiedene Stellen mit Tumorgewebe ausgewählt, die Menge an proliferierenden und nicht proliferierenden Zellen gezählt und deren prozentualer Anteil bestimmt. Je Präparat wurden im subkutanen Modell im Schnitt 455 Zellen und im orthotopen Modell 528 Zellen ausgezählt. 3.4.3.3 Immunhistochemie zur Bestimmung des Histon H4 Da der Acetylierungszustand der im Zellkern exprimierten Histone ein Indikator dafür ist, ob das 4-PB tatsächlich zu einer Hemmung der Deacetylase führt, wurde eine Immunhistochemie zur Bestimmung des acetylierten H4 durchgeführt. Als Antikörper diente der monoclonale Kaninchen Anti-Histon H4 Antikörper von Millipore in einer Verdünnung von 1:200. Als Negativ Kontrolle diente die Universal Negativ Kontrolle von DAKO Corporation. Die Visualisierung der Histone war nach 80 Sekunden abgeschlossen. Als positiv bewertet wurden Zellen, die eine nukleäre Färbung zeigten. Die Auswertung der Immunhistochemie erfolgte am Lichtmikroskop mit 40 facher Vergrößerung. Je Gruppe des orthotopen Versuchsmodells wurde von 6 verschiedenen Mäusen ein Schnitt ausgewertet. Je Schnitt wurden 3 verschiedene Stellen mit Tumorgewebe ausgewählt, die Menge an acetylierten und deacetylierten Zellen gezählt und deren prozentualer Anteil bestimmt. Im Schnitt wurden pro Präparat 566 Zellen ausgezählt. 3.4.3.4 Immunhistochemie mit Anti-Human Epithelial Membrane Antigen Zum Nachweis des Vorhandenseins einer Pseudokapsel um das Tumorgewebe erfolgte eine Immunhistochemie von Paraffinschnitten der orthotop transplantierten Tumore mit dem monoklonalen Maus Antikörper Anti-Human Epithelial Membrane Antigen E29 von DAKO Corporation. Das epitheliale Membran-Antigen ist ein Pro32 Material und Methoden tein, welches im Zytoplasma und in der Zytoplasmamembran in diversen Epithelzellen vorhanden ist. In anormalem Gewebe markiert dieser Antiköper vielfältige neoplastische Epithel- und Mesothelzellen, unter anderem des Pankreaskarzinoms. Die optimale Verdünnung des Antikörpers lag bei 1:800. Als entsprechende Negativkontrolle wurde Mouse-IgG2α von DAKO Corporation verwendet. Die Farbreaktion war nach 40 Sekunden abgeschlossen. Als positiv gedeutet wurden Farbreaktionen im Zytoplasma und in der Zytoplasmamembran, welche in der Negativkontrolle nicht zu erkennen waren. Insgesamt wurde von sechs Mäusen pro Gruppe ein Präparat in 5 facher Vergrößerung beurteilt. 3.4.3.5 Immunhistochemie zum Nachweis von Connexin 43 Connexine durchziehen, als Bestandteil der Gap-Junction vom Zytoplasma bis in den Extrazellulärraum reichend, die Zellmembran. Der Nachweis des Connexin 43 erfolgte mit dem monoklonalen Mouse-anti-Connexin 43 Primärantikörper von Zymed® Laboratories, welcher mit dem Verdünnungsmedium von DAKO Corporation auf eine Konzentration von 1:600 verdünnt wurde. Als Negativkontrolle wurde das MouseIgG1 von Serotec verwendet. Die Farbreaktion zur Visualisierung der Connexine 43 wurde nach 3-5 Minuten gestoppt. Positiv gewertet wurden im Zytoplasma und in der Zytoplasmamembran liegende Reaktionsprodukte, die nach der Negativkontrolle nicht nachweisbar waren. Die Auswertung von je sechs Paraffinschnitten pro Gruppe der subkutanen und orthotop transplantierten Tumore erfolgte am Lichtmikroskop mit 20 und 40 facher Vergrößerung. In jedem Schnitt wurde die Menge an Connexin 43 zwischen den Tumorzellen, im Bereich des Stromas und der Gefäße und in Nekrosenähe semiquantitativ geschätzt. 3.4.4 Hämatoxylin-Eosin-Färbung: Quantifizierung der Nekrose Um das gewonnene Gewebe histopathologisch zu beurteilen, wurde von 3-5 µm dicken Paraffinschnitten eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung angefertigt. Dazu wurden die Schnitte zunächst nach folgendem Schema deparaffiniert: 3 × 10 min Xylol 3 × 3 min Ethanol 100 % 3 min Ethanol 95 % 33 Material und Methoden 10 min Ethanol 70 % 2 min Ethanol 50 % Nach Waschen der Paraffinschnitte für 2 min in destilliertem Wasser erfolgte das Färben in Mayers Hämatoxylin für 2 min und ein Waschgang für 15 min unter fließendem Wasser. Danach wurden die Präparate für je 2 sec in Eosin und 70 % Ethanol getaucht. Anschließend erfolgte die Dehydrierung nach folgendem Protokoll: 3 min Ethanol 95 % 2 × 3 min Ethanol 100 % 3 × 5 min Xylol Abschließend wurden die Präparate mit Deckgläschen versehen, befundet und der Nekroseanteil bestimmt. Hierzu wurde die Hämatoxylin-Eosin Färbung von jeweils 6 Mäusen pro Gruppe am Lichtmikroskop bei 10 facher Vergrößerung ausgewertet. An fünf zufällig gewählten Stellen wurde der Anteil des nekrotischen Gewebes im Bereich des Gesichtsfeldes semiquantitativ geschätzt. 34 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 In vitro Untersuchungen: Einfluss des 4- Phenylbutyrat auf die Zellproliferation mittels MTT-Assay Um den Einfluss des 4-Phenylbutyrates auf die Zellproliferation untersuchen zu können, wurden die in eine 96-Lochplatte ausgesäten T3M4, ASPC und PANC-1 Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen des 4-PB über 48 Stunden behandelt. Als Kontrolle diente Standardkulturmedium. Anschließend wurde die Proliferation mittels MTT-Assay, wie in Kapitel 3.4.1.3, S. 27 beschrieben, bestimmt. Bereits bei einer geringen Dosierung des 4-PB ist eine signifikante Reduktion der Zellproliferation in allen drei Zelllinien zu erkennen, welche sich mit steigender Dosierung des 4-PB fortsetzt. Aus den erstellten Grafiken wurde für jede Zelllinie die mittlere effektive Konzentration (half maximal effective concentration = EC50), d.h. die Konzentration des Wirkstoffs, bei der ein halbmaximaler Effekt verursacht wird, berechnet. Die Zelllinie T3M4 (Abb. 7, S. 36) zeigt eine deutliche Hemmung der Zellproliferation ab 2,5mM. 0,5mM reduziert die Zellproliferation auf 84,0% ± 2,8 des Ausgangswertes, 1mM auf 60,5% ± 6,9, 2,5mM auf 30,9% ± 12,2 und 5mM auf 12,7% ± 15,4. Bei der ASPC Zelllinie (Abb. 7, S. 36) ist eine signifikante Hemmung der Zellproliferation ebenfalls ab einer 4-PB Konzentration von 2,5mM zu erkennen. Eine Konzentration von 1mM reduziert die Zellproliferation auf 82,5% ± 1,9, 2,5mM auf 31,8% ± 7,5 und 5mM auf 23,8% ± 8,4. Nach 48 Stunden Inkubation der Zelllinie Panc-1 (Abb. 7, S. 36) mit 4-PB zeigte sich eine signifikante Abnahme der Zellproliferation ab einer 4-PB Konzentration von 5mM. 1mM verursacht eine Hemmung auf 72,7% ± 4,2, 5mM auf 52,6% ± 7,4 und 10mM auf 14,5% ± 13,3. Die EC50 lag für 4-PB bei ~3,5mM (T3M4), ~1,9mM (ASPC) bzw. ~4,8mM (Panc-1). 35 Ergebnisse Abbildung 7: Zellproliferation von T3M4-­‐, ASPC und Panc-­‐1 Zellen nach 48-­‐stündiger Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von 4-­‐PB. Die Daten sind in Prozent zur Kontrolle (100%) angegeben und dargestellt als Mittelwerte ± SEM *p< 0,05 vs. Kontrolle aus drei voneinander unabhängigen Ver-­‐ suchen. 36 Ergebnisse 4.2 In vivo Untersuchungen: Phenylbutyrat auf das Einfluss von 4- Tumorwachstum im subkutanen und orthotopen Mausmodell Um die Wirkung von 4-Phenylbutyrat auf das Wachstum von Pankreaskarzinomzellen in-vivo zu untersuchen, wurde eine subkutane Tumorinokulation von T3M4 Zellen in Nacktmäuse und anschließend eine orthotope Tumorimplantation der Xenotransplantate in das Pankreas von Nacktmäusen durchgeführt. Für diesen Zweck wurden vier verschiedene Gruppen gebildet: 4-PB, Gemcitabine, Kombination der beiden Chemotherapeutika und PBS als Kontrollgruppe. Im subkutanen Modell wurden in der Kontrollgruppe insgesamt 18 Tiere eingesetzt und 12 Tiere ausgewertet. In den Behandlungsgruppen wurden je 12 Tiere verwendet und ausgewertet. Im orthotopen Versuchsmodell wurden je Gruppe 8 Tiere eingesetzt und ausgewertet. Allen Tieren wurden im subkutanen Modell im Schulter- und Lendenwirbelbereich Zellen injiziert (Abb.8, S. 38). Das Behandlungsschema war bei beiden Modellen identisch: Kontrollgruppe: PBS 2× wöchentlich intraperitoneal, 4-PB-Gruppe: 4-PB 3 × wöchentlich i.p., Gemcitabine-Gruppe: Gemcitabine 2× wöchentlich i.p., Kombinations-Gruppe: 4PB 3× wöchentlich i.p., Gemcitabine 2× wöchentlich i.p.. Im subkutanen Modell ist in der Kontrollgruppe 25 Tage nach erfolgter Tumorzellinjektion im Schulterbereich ein durchschnittliches Tumorvolumen von 503,2 mm3 ± 58,7 festzustellen. Bei der Versuchsgruppe, die mit 4-PB behandelt wurde, ist zu erkennen, dass es zu einer signifikanten Wachstumshemmung im Vergleich zur Kontrollgruppe gekommen ist. In dieser Gruppe ist am Tag 25 ein durchschnittliches Tumorvolumen von 317,0 mm3 ± 45,9 zu messen. In Abbildung 9, S. 38 ist zu erkennen, dass im Wachstumsverlauf das Tumorvolumen der 4-PB-Gruppe zu jedem Zeitpunkt deutlich unter dem der Kontrollgruppe liegt. Diese wachstumshemmende Wirkung des 4-PB ist mit der des etablierten Chemotherapeutikums Gemcitabine zu vergleichen, welches ebenfalls bis Tag 25 eine Wachstumshemmung zeigt (Tumorvolumen Schulterbereich am Tag 25: 206,1mm3 ± 65,8). Eine Kombination von 4-PB und Gemcitabine führte nicht zu einer stärkeren Inhibierung des Tumorwachstums. Die Kombinationsgruppe zeigte an Tag 25 im Schulterbereich ein Volumen von 418,6mm3 ± 97,8. Bei den im Lendenwirbelbereich injizierten Tumoren ist ein ähnliches Wachstumsverhalten in den Gruppen 37 Ergebnisse festzustellen. Die 4-PB-Gruppe zeigt im Vergleich zur Kontrollgruppe auch hier eine deutliche Wachstumshemmung. Abbildung 8: Tumor der T3M4 Zellen im subkutanen Mausmodell Abbildung 9: Subkutanes Tumorwachstum der T3M4 Pankreaskrebszellen in Nacktmäusen behan-­‐ delt mit PBS (Kontrollgruppe) und 4-­‐PB. Dargestellt sind die Mittelwerte der Tumorvolumina zu je-­‐ dem Messzeitpunkt. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM *p<0,05 vs. Kontrolle angegeben. 38 Ergebnisse Im orthotopen Modell (Abb. 10, S. 39) lassen sich die Ergebnisse des subkutanen Modells zum Teil widerspiegeln. Die Kontrollgruppe zeigt auch in diesem Modell ein sehr starkes Tumorwachstum. Ebenso ist in der Gemcitabine-Gruppe und in der Kombinationsgruppe eine deutliche Wachstumshemmung festzustellen. Bei einer Behandlung mit 4-PB kam es allerdings, abweichend vom subkutanen Modell, zu keiner Reduktion des Tumorvolumens. Der Versuch zeigt, dass eine Behandlung der Mäuse mit dem HDAC-Inhibitor 4Phenylbutyrat eine signifikante Hemmung des subkutan wachsenden T3M4-ZellTumors gegenüber der Kontrolle bewirkt. Eine Kombination mit dem etablierten Gemcitabine führt allerdings nicht zu einer Verstärkung der wachstumshemmenden Eigenschaften. Abbildung 10: Xenotransplantat im orthotopen Mausmodell 39 Ergebnisse 4.3 In vivo Untersuchungen: Auswirkung einer Behandlung mit 4-Phenylbutyrat auf die Ausbreitung der Nekrose im subkutan und orthotop gewachsenen Tumor Bei der histologischen Auswertung des Tumorgewebes hat es sich gezeigt, dass sowohl in den subkutanen als auch in den orthotop transplantierten Tumoren ein bedeutender Anteil des Gewebes aus nekrotischen Arealen besteht (Abb. 11 A, B, S. 41). Um festzustellen, welche Auswirkung eine Behandlung mit 4-PB auf die Nekroseausbreitung hat, wurde der Nekroseanteil in den einzelnen Gruppen bestimmt. Hierzu wurde von je sechs verschiedenen Mäusen pro Gruppe eine H-E-Färbung ausgewertet und der Nekroseanteil semiquantitativ geschätzt. In der Kontrollgruppe beträgt der Nekroseanteil im subkutanen Tumor 31% ± 3,9. Im orthotopen Modell ist ein Anteil von 47% ± 4,9 zu finden. Im subkutanen Modell kann man feststellen, dass in den Behandlungsgruppen mit 4-PB und Gemcitabine der Nekroseanteil leicht ansteigt (4-PB 41,3% ± 4,2, Gemcitabine 43,9% ± 5,5). Im orthotopen Modell ist dagegen bei diesen Behandlungsgruppen keine Veränderung beziehungsweise eine leichte Abnahme des Nekroseanteiles festzustellen (4-PB 31% ± 3,8, Gemcitabine 41,3% ± 4,2). Eine Behandlung mit 4-PB führt nach dieser Auswertung im subkutanen Modell zu einer Zunahme der nekrotischen Areale. Im orthotopen Modell lässt sich dieses Ergebnis aber nicht wiederholen. Eine Kombination der beiden Stoffe führt sowohl im subkutanen Modell als auch im orthotopen Modell nicht zu einem verstärkten Auftreten von nekrotischen Arealen. Hier ist im subkutanen Modell ein Anteil von 19,3% ± 3,4 der Nekrose und im orthotopen Modell ein Anteil von 18,6% ± 4,0 festzustellen. 40 Ergebnisse A B Abbildung 11 H-­‐E-­‐Färbung: A: Eosinophile nekrotische Bereiche (→) im subkuta-­‐ nen intakten Tumorgewebe (→ basophile Anteile) B: Eosinophile nekrotische Bereiche (→) im orthotop transplantierten intakten Tumor (→ basophile Antei-­‐ le). Gerätevergrößerung: x200. 41 Ergebnisse 4.4 In vivo Untersuchungen: Einfluss des 4- Phenylbutyrat auf die Zellproliferation im subkutanen und orthotopen Mausmodell Anhand einer immunhistochemischen Analyse der Paraffinschnitte mit dem Mouseanti-human-Ki-67 Antikörper, konnte die Zellproliferation in den subkutan gewachsenen Tumoren und in den orthotop transplantierten Tumoren untersucht werden. Sowohl im subkutanen als auch im orthotopen Versuchsmodell wurden je Gruppe sechs verschiedene histologische Schnitte ausgewertet. Es zeigte sich, dass nach einer Behandlung mit 4-PB der Anteil an proliferierenden Zellen signifikant niedriger ist als in der Kontrollgruppe. In der Kontrollgruppe des subkutanen Modells beträgt der Anteil von mitotischen Zellen 69,6% ± 1,6. Nach einer Behandlung mit 4-Phenylbutyrat sinkt der Anteil der proliferierenden Zellen auf 52,8% ± 1,5. Abbildung 12 S. 43 zeigt die prozentuale Verteilung dieser Zellen. Deutlich zu erkennen ist, dass der Anteil an proliferierenden Zellen in der Behandlungsgruppe niedriger ist als in der Kontrollgruppe. Dies ist vergleichbar mit der Wirkung des etablierten Chemotherapeutikums Gemcitabine. In dieser Gruppe ist ein Anteil von 58,1% ± 2,0 an proliferierenden Zellen festzustellen. Die Kombination beider Stoffe führt zu einem vergleichbaren Ergebnis. Der Anteil an proliferierenden Zellen in dieser Gruppe liegt bei 57,2% ± 1,9. Im orthotopen Versuchsmodell lässt sich die gleiche Zellverteilung wie im subkutanen Modell erkennen. Hier liegt in der Kontrollgruppe der Anteil an mitotischen Zellen bei 66,9% ± 2,2. In der Behandlungsgruppe mit 4-PB sinkt dieser Anteil auf 55,1% ± 2,9. In der Abbildung 13 S. 43 ist der geringere Anteil an proliferierenden Zellen in der Behandlungsgruppe dargestellt. Dieses Ergebnis ist, wie im subkutanen Versuchsmodell, mit dem des Gemcitabines zu vergleichen, bei dem der prozentuale Anteil an proliferierenden Zellen bei 54,5% ± 2,6 liegt. In der Kombinationsgruppe bleibt der Anteil an proliferierenden Zellen auf dieser Höhe (52,1% ± 3,0). Die Abbildung 14 S. 44 zeigt den Schnitt durch einen mit 4-PB behandelten (A) und unbehandelten (B) subkutanen Tumor und einen mit 4-PB behandelten (C) und unbehandelten (D) orthotop transplantierten Tumor in 40 facher Vergrößerung. Zu erkennen ist, dass in den mit 4-PB behandelten Tumoren wesentlich weniger Zellen durch den Antikörper Ki-67 angefärbt sind, so dass deutlich wird, dass 4-PB die Anzahl proliferierender Zellen reduziert. 42 Ergebnisse Abbildung 12: Quantifizierung der proliferierenden Zellen im subkutanen Modell nach im-­‐ munhistochemischer Analyse mit einem Ki-­‐67 Antikörper. Angegeben sind die Daten als Mit-­‐ telwerte ± SEM *p<0,05 vs. Kontrolle. Abbildung 13: Quantifizierung der proliferierenden Zellen im orthotopen Modell nach im-­‐ munhistochemischer Analyse mit einem Ki-­‐67 Antikörper. Angegeben sind die Daten als Mittelwerte ± SEM *p<0,05 vs. Kontrolle. 43 Ergebnisse A B C D Abbildung 14: Schnitt der Tumore nach immunhistochemischer Analyse mit einem Mouse-­‐anti-­‐human-­‐Ki-­‐ 67 Antikörper. Die Bilder zeigen bei einer Gerätevergrößerung von x400 eine Abnahme an proliferierenden Zellen in den mit 4-­‐PB behandelten Tumoren gegenüber d en unbehandelten Tumoren. A: mit 4-­‐PB behan-­‐ delter Tumor s.c., B: unbehandelter Tumor s.c., C: mit 4-­‐PB behandelter Tumor o.t., D: unbehandelter Tu-­‐ mor o.t. → proliferierende Zellen (braun gefärbt), → nicht proliferierende Zellen (ungefärbt) 44 Ergebnisse 4.5 In vivo Untersuchungen: Einfluss des 4- Phenylbutyrat auf den Acetylierungsstatus des Histon H4 Durch eine immunhistochemische Analyse von Paraffinschnitten der orthotop transplantierten Tumore mit dem Histon H4 Antikörper konnte der Einfluss des 4Phenylbutyrat auf die Acetylierung des Histon H4 untersucht und der Anteil an acetylierten und deacetylierten Zellen bestimmt werden. Je Gruppe wurden 6 verschiedene Schnitte ausgewertet. Es zeigte sich, dass durch die Behandlung mit 4-PB die Anzahl an acetylierten Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant zunimmt. In der Kontrollgruppe ist ein Anteil von 60,4% ± 1,1 an acetylierten Zellen festzustellen. Nach einer Behandlung mit 4-Phenylbutyrat steigt dieser Anteil auf 76,8% ± 1,2 an. In der Abbildung 15, S. 45 ist die prozentuale Zunahme der acetylierten Zellen in der Behandlungsgruppe dargestellt. Eine Behandlung der Mäuse mit 4-Phenylbutyrat führt folglich zu einer Hemmung der Deacetylase in den Tumorzellen. Die Abbildung 16, S. 46 zeigt den Schnitt durch einen Tumor der 4-PB-Gruppe (A) und der Kontrollgruppe (B). In ersterem sind wesentlich mehr Zellen durch den H4 Antikörper angefärbt, was verdeutlicht, dass eine Behandlung mit 4-PB die Anzahl an acetylierten Zellen steigert. Abbildung 15: Quantifizierung der acetylierten Zellen nach Färbung mit Histon H4 Anti-­‐ körper. Angegeben sind d ie Daten als Mittelwerte ± SEM *p<0,05 vs. Kontrolle. 45 Ergebnisse A B Abbildung 16: Schnitt der Tumore nach Immunhistochemischer Analyse mit einem Histon H4 Antikörper bei einer Gerätevergrößerung von x400. Zu erken-­‐ nen ist ein Anstieg der acetylierten Zellen in der 4-­‐PB-­‐Gruppe (A) im Vergleich zur Kontrollgruppe (B). → acetylierte Zellen (braun gefärbt), → nicht acetylier-­‐ te Zellen (ungefärbt) 46 Ergebnisse 4.6 In vivo Untersuchungen: Ausbildung einer Pseudokapsel bei Behandlung mit 4-PB im orthotopen Modell Bei der Auswertung der Immunhistochemie von sechs Schnitten pro Gruppe mit einem monoklonalen Mouse Anti-Human Epithelial Membrane Antigen, lässt sich feststellen, dass sich um das gewachsene Tumorgewebe eine pseudofibrotische Kapsel gebildet hat. Vor allem bei den Behandlungsgruppen ist diese Kapsel deutlich ausgebildet und verhindert einen direkten Kontakt zwischen Tumorzellen und normalem Pankreasgewebe der Maus (Abb. 17, S. 47, Abb. 18, S. 48). Bei der Kontrollgruppe ist diese Pseudokapsel ebenfalls ausgebildet, aber in diesem Fall kann man eine lokale Invasion der Tumorzellen durch die Kapsel in das umliegende Pankreasgewebe feststellen (Abb. 19, S. 48). Es ist demzufolge denkbar, dass eine Behandlung mit 4PB ein Übergreifen der Tumorzellen in das normale Pankreasgewebe vermindern oder sogar verhindern könnte. Abbildung 17: Schnitt des orthotop transplantierten Tumors der 4-­‐PB Grup-­‐ pe nach Immunhistochemie mit einem Anti-­‐Human Epithelial Membrane Antigen bei einer Gerätevergößerung von x100. Zwischen Tumorgewebe (X) und normalem Pankreasgewebe (→) befindet sich eine pseudofibrotische Kapsel (→). 47 Ergebnisse Abbildung 18: Schnitt des orthotop transplantierten Tumors der Kombinati-­‐ onsgruppe nach Immunhistochemie mit einem Anti-­‐Human Epithelial Memb-­‐ rane Antigen bei einer Gerätevergrößerung von x100. Zwischen Tumorgewebe (X) und normalem Pankreasgewebe (→) befindet sich eine pseudofibrotische Kapsel (→). Abbildung 19: Schnitt des orthotop transplantierten Tumors der Kontroll-­‐ gruppe nach immunhistochemischer Analyse mit einem Anti-­‐Human Epitheli-­‐ al Membrane Antigen bei einer Gerätevergrößerung von x200. Zu erkennen ist eine pseudofibrotische Kapsel, die in ihrem Verlauf von Tumorzellen durchbrochen wird (→). Tumorzellen (X) können somit in das normale Pan-­‐ kreasgewebe (→) eindringen. 48 Ergebnisse 4.7 In vivo Untersuchungen: Auswirkung des 4Phenylbutyrat auf die Verbreitung des Connexin43 Sowohl im subkutanen als auch im orthotopen Mausmodell soll mit Hilfe eines Mouse-anti-Connexin 43 Antikörpers die Menge des Connexin 43 festgestellt werden um zu bestimmen, ob es durch eine Behandlung mit 4-PB zu einer Veränderung der Connexindichte kommt. Je Gruppe wurden sechs Paraffinschnitte ausgewertet. Anhand der Auswertung lässt sich erkennen, dass die Verteilung der Connexine im subkutanen und im orthotopen Modell annähernd gleich ist. Bei beiden Versuchen ist in den Präparaten der 4-Phenylbutyrat- und der Kombinationsgruppe eine signifikant höhere Menge an Connexinen zwischen den Tumorzellen festzustellen. Ebenso ist die Menge an Connexinen in der 4-PB Gruppe in Nekrosenähe signifikant erhöht. Im Stromabereich und in der Nähe der Gefäße lassen sich zwischen den Gruppen keine Unterschiede feststellen. Anhand der Ergebnisse ist zu vermuten, dass durch die Behandlung mit 4-PB die Expression der Connexine hochreguliert wird. Die Abbildung 20, S. 50 zeigt im Vergleich die höhere Anzahl an Connexinen zwischen den Tumorzellen in der 4-PB-Gruppe (A) gegenüber der Kontrollgruppe (B), sowie die höhere Anzahl an Connexinen in Nekrosenähe nach Behandlung mit 4-PB (C) im Vergleich zur Kontrollgruppe (D). 49 Ergebnisse A B C D Abbildung 20: Schnitt der Tumore nach immunhistochemischer Analyse mit einem CX 43 Antikörper bei einer Gerätevergrößerung von x400. Zu erkennen sind vermehrt Connexine zwischen den Tumorzellen der 4-­‐PB-­‐ Gruppe (A) gegenüber der Kontrollgruppe (B), sowie vermehrt Connexine in Nekrosenähe nach Behandlung mit 4-­‐PB (C) im Vergleich zur Kontrollgruppe (D). → Connexine (braun gefärbt), → Tumorzelle, X nekrotischer Bereich 50 Diskussion 5 Diskussion Das Pankreaskarzinom ist eine der aggressivsten Tumorerkrankungen und hat mit einer mittleren Überlebensrate von etwa 4-6 Monaten nach Diagnosestellung eine äußerst schlechte Prognose (ARNOLD et al. 2007). Aufgrund der unspezifischen und vielfältigen Symptome wird die Diagnose meist erst in späteren Stadien gestellt und macht eine kurative Therapie weitgehend unmöglich (HAYCOX et al. 1998). Zurzeit gilt eine chirurgische Resektion mit nachfolgender Chemotherapie als wirksamste Therapiemöglichkeit um die Lebenserwartung zu verlängern. (WARSHAW u. FERNANDEZ-DEL CASTILLO 1992; LOOS et al. 2009). Dabei zeigte Gemcitabine die besten Ergebnisse gegenüber anderen chemotherapeutischen Mitteln. Auch in nicht operablen Stadien wird Gemcitabine im Rahmen der palliativen Chemotherapie verwendet, obwohl diese Behandlung zu keiner signifikanten Überlebenszeitverlängerung führt (BURRIS et al. 1997; BRUS u. SAIF 2010). Die Untersuchung neuer Therapieansätze beim Pankreaskarzinom ist demzufolge von großer Bedeutung. Ein derzeit intensiv untersuchter Ansatz ist die epigenetische Modifizierung der DNA. Zu solchen Substanzen gehört die Gruppe der Histondeacetylase-Inhibitoren (HDACi). Es zeigte sich, dass Histondeacetylase-Inhibitoren in malignen Zellen Wachstumsinhibierung, Apoptose und Differenzierung bewirken und dabei gesunde Zellen unbeeinflusst lassen. Für die Krebstherapie sind HDACi somit neue potentielle Kandidaten (MARKS et al. 2004). Obwohl der genaue molekulare Mechanismus ihrer Wirkung und ihre Spezifität gegenüber malignen Zellen noch nicht völlig klar sind, werden viele HDACi in klinischen Studien zum Teil erfolgreich getestet (PRINCE et al. 2009). Ein vielversprechender HDACi der schon erfolgreich in der Behandlung von rezidivierenden malignen Gliomen und dem myelodysplatischen Syndrom getestet wurde und als gut toleriertes Medikament mit geringen Nebenwirkungen gilt, ist das 4Phenylbutyrat (BHALLA u. LIST 2004, PHUPHANICH et al. 2005). In-vitro zeigt dieses Präparat gegenüber verschiedenen Pankreaskrebszelllinien gute inhibitorische Eigenschaften (AMMERPOHL et al. 2007). Der Effekt von 4-Phenylbutyrat auf in-vivo Pankreastumormodelle wurde noch nicht beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von 4-Phenylbutyrat auf PDAC-Zellen in-vivo untersucht. 51 Diskussion 5.1 Einfluss von 4-Phenylbutyrat auf Pankreastumorzellen in vitro Zur Bestimmung der Proliferation der Pankreaskarzinomzelllinien T3M4, ASPC und Panc-1 unter 4-Phenylbutyrat-Einfluss wurde in-vitro ein MTT-Assay durchgeführt. Nach 48 Stunden Inkubationszeit mit Konzentrationen von 0,5 bis 10 mM 4-PB wurde eine signifikante konzentrationsabhängige Hemmung der Proliferation nachgewiesen. Eine deutliche Proliferationshemmung konnte bei den Zelllinien T3M4 und ASPC ab einer Konzentration von 2,5mM 4-PB und bei Panc-1 ab 5mM 4-PB festgestellt werden. Dies spiegelt das Ergebnis von AMMERPOHL et al. (2007) wider, die ebenfalls die Inhibierung des Wachstums von Pankreaskrebszelllinien in Zellkultur unter 4-PB Einfluss untersucht hatten. Der Einfluss weiterer HDACi auf die Proliferation von Pankreaskarzinomzellen wurde bereits in vorhergehenden Studien untersucht. So zeigten SAHA (KUMAGAI et al. 2007, CHEN et al. 2008), Trichostatin A (PIACENTINI et al. 2006, CECCONI et al. 2007, DONADELLI et al. 2007) und Valproinsäure (JONES et al. 2008) deutliche inhibitorische Effekte auf die Proliferation verschiedener Pankreaskarzinomzelllinien. Ein möglicher Mechanismus für die Wachstumshemmung durch 4-PB könnte die Induktion der Apoptose sein (AMMERPOHL et al. 2007). 5.2 Einfluss von 4-Phenylbutyrat auf das Pankreaskarzinom in vivo Mit Hilfe eines in-vivo Experimentes mit athymischen Nacktmäusen soll die Hypothese überprüft werden, dass eine HDAC-Inhibierung eine Reduktion des Tumorwachstums bewirken kann. Zudem sollen weitere Effekt des 4-PB in-vivo bewertet werden. Zu diesem Zweck wurden die mit 4-PB und/oder Gemcitabine behandelten Mäuse mit einer unbehandelten Kontrollgruppe verglichen. Die Bestimmung des Tumorwachstums erfolgte nach subkutaner Injektion von T3M4-Zellen und nach Implantation eines T3M4-Tumors in das Pankreas der Maus. Ab dem 6. Tag post injectionem bzw. post implantationem wurden die Mäuse mit 4-PB, Gemcitabine oder einer Kombination beider Stoffe therapiert. Der Kontrollgruppe wurde entsprechend dem Be52 Diskussion handlungsschema PBS-Puffer injiziert. Im subkutanen Modell wurde die Größe der gewachsenen Tumore regelmäßig mit Hilfe einer Schieblehre dokumentiert. An Tag 28 wurden die Mäuse schmerzlos getötet und die Tumore entnommen. Im orthotopen Modell wurden die Tiere nach 28 Tagen getötet und die Größe der Tumore bestimmt. Bei den subkutanen Tumoren ließ sich zwischen der Kontrollgruppe und den mit 4PB behandelten Tieren ein signifikanter Unterschied ab Tag 11 feststellen. Ab diesem Zeitpunkt kam es in der 4-PB Gruppe zu einer deutlichen Verlangsamung des Tumorwachstums. Das Ergebnis der 4-PB-Gruppe ist vergleichbar mit dem des etablierten Chemotherapeutikums Gemcitabine. In der Gemcitabine-Gruppe konnte ebenfalls eine deutliche Reduktion des Tumorwachstums festgestellt werden. Dies bestätigt die Ergebnisse anderer Studien (BECK et al. 2006, NEUREITER et al. 2007, BROCKSCHMIDT et al. 2008). Eine Kombination der beiden Stoffe führte jedoch nicht zu einem additiven Effekt. Eine Reduktion des Tumorwachstums in-vivo wurde auch bei anderen HDACi nachgewiesen. SAHA hemmte in-vivo das Wachstum des Prostatakarzinoms (BUTLER et al. 2000), der uterinen Sarkome (HRZENJAK et al. 2010), des Schilddrüsenkrebses (LUONG et al. 2006) und hatte auch hemmenden Effekt auf Blutkrebsarten wie die promyelozytische Leukämie (HE et al. 2001). Ein anderer HDACi, die Valproinsäure, hemmte das Wachstum des Leberkarzinoms (MACHADO et al. 2011), des Prostatakarzinoms (XIA et al. 2006) und des Gebärmutterkarzinoms (YI et al. 2012). Auch für MS-27-275 konnte bei einer Pankreaskarzinomzelllinie im Mausmodell ein wachstumshemmender Einfluss nachgewiesen werden (SAITO et al. 1999). Der wachstumshemmende Effekt des 4-PB in in-vivo Krebsmodellen konnte auch bei anderen Karzinomarten festgestellt werden. Im Lungenkarzinom konnte durch eine 4-PB Behandlung eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums erreicht werden (SCHNIEWIND et al. 2006) und beim Prostatakarzinom wurde ebenfalls eine Inhibierung des Tumorwachstums in-vivo erzielt (CARDUCCI et al. 1996, PILI et al. 2001). In Mausmodellen mit Zellen des Hepatokarzinoms, des Hepatoblastoms (SVECHNIKOVA et al. 2003) und der akuten myeloischen Leukämie (HAO et al. 2004) führte 4-PB ebenfalls zu einer Reduktion des Tumorwachstums. Im orthotopen Versuchsmodell unserer Studie führte 4-PB zu keiner eindeutigen Wirkung und es zeigten sich keine statistischen Unterschiede zur Kontrollgruppe. Eine Kombination von 4-PB und Gemcitabine führte, ebenso wie im subkutanen Modell, 53 Diskussion nicht zu einer Verstärkung der wachstumshemmenden Wirkung. Dieses Ergebnis widerspricht den Aussagen anderer Studien, bei welchen es gelang, die wachstumshemmende Wirkung von 4-Phenylbutyrat durch eine Kombination mit einem anderen chemotherapeutischen Medikament, wie z.B. Gemcitabine, zu verstärken. Bei einer Kombination von 4-PB und Gemcitabine zeigten Lungenkarzinomzellen ein geringeres Tumorwachstum im Vergleich zur Monotherapie (SCHNIEWIND et al. 2006) und eine Kombination von 4-PB mit Retinsäure oder Decitabine verstärkte die Wachstumshemmung beim Prostatakarzinom (PILI et al. 2001) beziehungsweise bei der myeloischen Leukämie (HAO et al. 2004). Auch die wachstumshemmende Wirkung des HDACi Trichostatin A auf Pankreaskarzinomzellen konnte durch eine Kombination mit Gemcitabine verstärkt werden (DONADELLI et al. 2007). Die hier vorgestellten Untersuchungsergebnisse bestätigen, dass 4-PB auch in-vivo einen hemmenden Einfluss auf das Wachstum von Pankreaskarzinomzellen hat und bekräftigen die Hypothese der wachstumshemmenden Wirkung von HDACInhibitoren. Um den Wirkmechanismus des 4-PB auf das Pankreaskarzinom zu untersuchen, wurden die Tumore histologisch und immunhistologisch auf Zellproliferation, Nekroseausbreitung, Connexinhochregulation, Histonacetylierung und Ausbildung einer fibrotischen Pseudokapsel untersucht. 4-PB ist ein bekannter Inhibitor der Zellproliferation in in-vivo Experimenten (KENNEDY et al. 2002, SCHNIEWIND et al. 2006). In unserer Studie wurde mit Hilfe einer Immunhistochemie mit dem Ki-67 Antikörper die Zellproliferation in den Tumoren bestimmt. Ki-67 findet sich in allen proliferierenden Zellen und ist ein genauer Marker für die Wachstumsfraktion einer Zellpopulation (SCHOLZEN u. GERDES 2000). Die Ergebnisse des MTT-Tests unterstützend, führte die 4-PB Behandlung invivo zu einer Reduktion der Proliferationsrate. Dieses Ergebnis spiegelt das Resultat anderer Studien wider, wo eine 4-PB-Behandlung in-vivo eine Hemmung der Zellproliferation induzierte. In der Studie von SCHNIEWIND et al. (2006) wurden Zellen des Bronchialkarzinoms in die Lunge von Mäuse orthotop transplantiert. Nach Behandlung mit 4-PB konnte durch die Ki-67 Färbung eine deutliche Proliferationshemmung der Tumorzellen nachgewiesen werden. Auch in einem subkutanen Mausmodell mit Prostatakarzinomzelllinien kam es nach Behandlung mit 4-PB zu einer Hemmung der Proliferation (PILI et al. 2001). KENNEDY et al. (2002) konnte 54 Diskussion des Weiteren bestätigen, dass eine 4-PB-Behandlung in der normalen Milchdrüse von Mäusen zu einer Reduktion der Proliferation der Drüsenzellen führte. Connexine sind wichtige Faktoren in der Wachstumsregulierung der Zelle (YAMASAKI et al. 1999, ASKLUND et al. 2003). Als Bestandteil der Gap-Junctions, aber auch eigenständig, sind sie für die interzelluläre Kommunikation verantwortlich (MOORBY u. PATEL 2001, JIANG u. GU 2005). In menschlichen Tumoren ist die Menge an Connexinen reduziert, weshalb auch die Kommunikation über GapJunctions herabgesetzt ist (YAMASAKI et al. 1999, VINE u. BERTRAM 2002). Eine Hochregulation der Connexine führte zu einem verminderten neoplastischen Potential, was folglich zu einem verminderten Wachstum der Tumorzellen führen könnte (YAMASAKI et al. 1999, KING u. BERTRAM 2005, MC LACHLAN et al. 2006). In der Studie von AMMERPOHL et al. (2007) wurde beschrieben, dass 4-PB die interzelluläre Kommunikation über Gap-Junctions zwischen Pankreaskarzinomzellen wiederherstellt. Bezüglich der Connexinexpression gibt es beim Pankreaskarzinom aber nur wenige Erkenntnisse. Es wurde zwar gezeigt, dass Pankreaskrebszelllinien Cx43 exprimieren können (MESNIL et al. 1994, KAWASAKI et al. 2002), inwieweit sich aber 4-PB darauf auswirkt, ist nicht bekannt. Mit der Fragestellung, ob eine 4-PB-Behandlung im Pankreaskarzinom die Anzahl der Connexine hochreguliert, wurde in unserer Studie eine Immunhistochemie mit einem Anti-CX-43 Antikörper durchgeführt. Sowohl im subkutanen als auch im orthotopen Modell konnten wir nachweisen, dass eine Behandlung mit 4-PB zu einer Hochregulation von Connexin 43 führt. Die fördernde Wirkung des 4-PB auf die Expression der Connexine wurde sowohl invitro als auch in-vivo von anderen Studien bestätigt. ASKLUND et al. (2004) stellte nach Behandlung von Glioblastomzellen mit 4-PB nicht nur eine Proliferationshemmung fest, sondern gleichzeitig auch eine Hochregulation des Connexin 43. In-vivo bestätigte HATTORI et al. (2007) eine erhöhte Expression von Connexinen in Zellen des Nasen-Rachen-Karzinoms nach 4-PB Behandlung. In frühere Studien wurde auch bestätigt, dass die Hochregulation der Connexine mit einem verminderten Tumorwachstum verbunden war. In in-vivo Modellen mit Gehirntumoren resultierte eine induzierte CX-43 Expression in einer signifikanten Reduktion der Tumorgröße (NAUS et al. 1992; KING et al. 2000). Ebenso kam es beim Fibro- 55 Diskussion sarkom durch eine vermehrte CX-43 Expression zu einem Rückgang des Tumorvolumens (KING et al. 2002). Bestätigt durch die Ergebnisse unserer Studie führt eine Behandlung mit 4-PB zu einer erhöhten Expression von Connexinen im Pankreaskarzinom. Diese Hochregulation der Connexine könnte für die verminderte Zellproliferation und die Wachstumshemmung verantwortlich sein. Ein weiteres Merkmal humaner Tumore ist eine erhöhte Aktivität der HDAC-Enzyme, was folglich über die veränderte Genexpression zu einer gesteigerten Proliferation führt (GLOZAK et al. 2005, MINUCCI u. PELICCI 2006). Mit Hilfe HDACi ist es möglich, den gestörten Proliferationsmechanismus maligner Zellen wieder zu normalisieren (BOLDEN et al. 2006). Um die Wirkung von 4-PB auf die Histonacetylierung zu verifizieren, haben wir eine Immunhistochemie mit einem H4-Antikörper durchgeführt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe konnten wir nach einer Behandlung mit 4-PB einen Anstieg an acetylierten Zellen und somit eine Hemmung der Deacetylase nachweisen. Dies entspricht dem Ergebnis früherer Untersuchungen, wo nach einer Behandlung mit einem HDACi eine erhöhte Expression von acetylierten Histonen nachgewiesen werden konnte. EMONDS et al. (2010) zeigten nach Behandlung mit Trichostatin A eine erhöhte Expression von Histon H3 in Pankreaskarzinomzellen. In Zellen des Mammakarzinoms führte eine Behandlung mit TSA zu einem Anstieg von Histon H4 (VIGUSHIN et al. 2001). Der HDACi SAHA erzeugte in Pankreaskarzinomzellen (ARNOLD et al. 2007, KUMAGAI et al. 2007) und onkogen transformierten Leberepithelzellen (OGAWA et al. 2005) einen erhöhten Anteil an acetyliertem H3 und H4. In-vivo konnte im Prostatakarzinom (BUTLER et al. 2000) und bei der promyelozytischen Leukämie (HE et al. 2001) durch eine Behandlung mit SAHA die Menge an acetyliertem H3 und H4 gesteigert werden. Im Mammakarzinom (MARCHION et al. 2005), Prostatakarzinom (WEDEL et al. 2008) und Medulloblastom (LI et al. 2005) führte eine Behandlung mit Valproinsäure in-vivo zu einer gesteigerten Expression von H3 und H4. Für 4-PB konnten LI et al. (2004) in einem in-vitro Experiment nachweisen, dass eine Behandlung von Medulloblastom-Zellen zu einer Steigerung von acetyliertem H3 und H4 führt. SVECHNIKOVA et al. (2003) zeigten, dass 4-PB auch in-vivo im Hepato- 56 Diskussion karzinom und Hepatoblastom einen erhöhten Gehalt an acetyliertem H3 und H4 induziert. Eine 4-PB Behandlung führte in unserer Studie im Pankreaskarzinom zu einem Anstieg an acetyliertem Histon H4 und korrelierte somit mit der proliferationshemmenden Wirkung des 4-Phenylbutyrat. Bei Auswertung der HE-Schnitte zeigte sich, dass ein großer Anteil der Präparate aus nekrotischen Arealen besteht. Um zu überprüfen, ob eine Behandlung mit 4-PB zu einem erhöhten Anteil an nekrotischem Gewebe geführt hat, wurde der Nekroseanteil der einzelnen Gruppen bestimmt. Im subkutanen aber nicht im orthotopen Modell konnte ein tendenziell erhöhter aber statistisch nicht signifikanter Anteil an Nekrose in der Behandlungsgruppe mit 4-PB festgestellt werden. In der Kombinationsgruppe ließ sich sowohl im subkutanen als auch im orthotopen Modell keine vermehrte Nekrosetendenz feststellen. Zur Identifizierung der genaueren Grenze zwischen murinem Gewebe und Tumor aus humanen Pankreastumorzellen wurde eine Immunhistochemie mit einem Mouse Anti-Human Epithelial Membrane Antigen Antikörper durchgeführt. Bei Auswertung der Präparate konnte festgestellt werden, dass sich eine fibrotische Pseudokapsel um den Tumor gebildet hatte, welche in der 4-PB Gruppe verstärkt imponierte. In der Kontrollgruppe dagegen war die Pseudokapsel nur in abgeschwächter Form zu finden und wurde in ihrem Verlauf von Tumorzellen durchbrochen, welche an dieser Stelle in das Maus-Pankreasgewebe eindringen konnten. Eine Fremdkörperreaktion durch Einkapseln des „fremden Materials“ ist eine der ältesten Abwehrmechanismen des Organismus (QIN et al. 2002) und soll dessen Invasion in das umliegende Gewebe verhindern. Die Infiltration des gesunden Gewebes während des Tumorwachstums ist ein Merkmal der Bösartigkeit von Malignomen (HIDDEMANN u. BARTRAM 2010). Verschiedene Studien konnten eine Kapselbildung bei Tumorerkrankungen nachweisen. Am in-vivo Pankreaskarzinommodell der Maus wurde in unserem Labor eine ähnliche Pseudokapselbildung nach Hsulf-1Transfektion der Tumorzellen beschrieben (ABIATARI et al. 2006). Bei Vorliegen eines Fibrosarkom konnte eine entstandene fibrotische Kapsel eine weitere Tumorentwicklung behindern (QIN et al. 2002). Beim Leberkarzinom gilt eine fibrotische Kapsel um den Tumor als Indikator für eine gute Prognose und könnte eine mecha57 Diskussion nische und chemische Barriere gegen die lokalen Invasion des Tumors darstellen (LUNEVICIUS et al. 2001; GULUBOVA u. VLAYKOVA 2006). In unserer Studie führt 4-Phenylbutyrat zur Bildung einer pseudofibrotischen Kapsel, die im Vergleich zur Kontrollgruppe ausgeprägter war. Zusammenfassend hemmte 4-PB die Zellproliferation von humanen Pankreastumorzellen in-vitro und in-vivo und verlangsamte das Wachstum von Xenografttumoren. Diese Ereignisse wurden begleitet von einer erhöhten Expression des Connexin 43, einer Steigerung des acetylierten H4 und der Ausbildung einer Pseudokapsel. Außerdem veränderte 4-PB nicht die Ausbreitung der Nekrose. Aufgrund der oben genannten Ergebnisse zeigte sich 4-PB als potentiell wirksames Medikament bei der experimentellen Behandlung des Pankreaskarzinoms. 58 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Alexandra Friske Einfluss des Histondeacetylase-Inhibitors 4-Phenylbutyrat auf das Wachstum des experimentell-induzierten Pankreaskarzinoms Institut für Veterinär-Pathologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig und Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschirurgie, Universitätsklinikum Heidelberg, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Eingereicht im Oktober 2014 62 S., 20 Abb., 1 Tab., 144 Lit. Schlüsselwörter: Pankreaskarzinom, Histondeacetylase- Inhibitor, 4-Phenylbutyrat, Mäuse Das Pankreaskarzinom bleibt trotz verbesserter Diagnose- und Therapiemöglichkeiten weiterhin eine Krankheit mit einer sehr schlechten Prognose und Lebenserwartung nach Diagnosestellung. Eine innovative Therapiemöglichkeit stellt eine Gruppe von Histondeacetylase-Inhibitoren dar, die einen direkten Einfluss auf die Regulation der Genexpression in Tumorzellen haben. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Wirkung des HDAC-Inhibitors 4-Phenylbutyrat auf Pankreaskarzinomzellen in-vitro und vor allem in-vivo zu untersuchen. Neben dem Einfluss auf die Zellproliferation in-vitro und in-vivo wurde in-vivo im subkutanen und orthotopen Tumormodell der Einfluss auf Tumorwachstum, Zellproliferation, Nekroseausbreitung, Regulation des Connexin 43 und Histonacetylierung im Tumorgewebe untersucht. Zur Bestimmung der Zellproliferation in-vitro erfolgte eine MTT-Analyse mit T3M4, ASPC und Panc1 Zellen, welche mit unterschiedlichen Konzentrationen von 4-PB inkubiert wurden. Für jede Gruppe wurden drei unabhängige Analysen durchgeführt. Für die in-vivo Untersuchungen wurden athymische, immunsupprimierte Nacktmäuse verwendet, die im subkutanen Mausmodell T3M4 Zellen injiziert bekamen. Zur orthotopen Tumorimplantation wurden Teile des im Spendertier subkutan gewachsenen Tumorgewebes in den Pankreasschwanz des Empfängertiers orthotop transplantiert. Die Einteilung der Mäuse erfolgte in beiden Modellen in folgende Gruppen: Kontrollgruppe mit 18 Tieren im subkutanen und 8 im orthotopen Modell, 4-PB Gruppe, Gemcitabine Gruppe und 4-PB + Gemcitabine Gruppe mit jeweils 12 Tieren im sub59 Zusammenfassung kutanen und 8 im orthotopen Modell. Die Applikation aller Medikamente erfolgte intraperitoneal. Zur Erfassung des Tumorwachstums wurde im subkutanen Modell in regelmäßigen Abständen das Tumorvolumen bestimmt. Im orthotopen Modell geschah dies nach Entnahme des Tumorgewebes. Anschließend wurde aus dem gewonnenen Gewebe für die immunhistochemischen Versuche Paraffinschnitte angefertigt. Es folgten Immunhistochemien zum Nachweis proliferierender Zellen, zur Bestimmung des Histon H4, zum Nachweis einer fibrotischen Pseudokapsel und von Connexin 43. Zur Quantifizierung der Nekrose erfolgte eine Hämatoxylin-Eosin Färbung. Für jeden Versuch wurden pro Gruppe die Schnitte von je 6 verschiedenen Mäusen ausgewertet. Statistische Testverfahren und graphische Abbildungen wurden mit der Software GraphPad Prism (Version 5.0, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) angefertigt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler angeben. Als statistische Testmethode wurde der ungepaarte t-Test angewandt. Unterschiede wurden bei einem p-Wert von <0,05 als statistisch signifikant bezeichnet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten in-vitro eine dosisabhängige Proliferationshemmung bei allen drei Pankreaskarzinomzelllinien sowie eine Reduzierung des Wachstums der s.c. Xenografttumoren in den in-vivo Untersuchungen nach Behandlung mit 4-PB. Im orthotopen Versuchsmodell führte 4-PB zu keiner eindeutigen Wachstumshemmung im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die immunhistochemische Untersuchung des Tumorgewebes mit einem Antikörper gegen Ki-67 wiesen eine Proliferationshemmung auch in den in-vivo Tumoren nach. Diese Proliferationshemmung korrelierte mit einer verstärkten Expression des Connexin 43 und einem erhöhten Anteil an acetylierten Histon H4 in den Tumorzellen. Bei der immunhistochemischen Analyse mit einem Antikörper gegen Anti-Human-Epithelial-Membran-Antigen konnte eine verstärkte fibrotische Pseudokapsel festgestellt werden, welche vermutlich eine Invasion von Tumorzellen in das umliegende Gewebe vermindern kann. Bezüglich der Wirkung des 4-PB auf die Nekroseausbreitung konnte kein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe festgestellt werden. Die Beobachtungen der Studie an drei PDAC-Zelllinien und den in-vivo Versuchen zeigen, dass 4-PB durch seinen hemmenden Effekt auf das Wachstum von Xenografttumoren und auf die Proliferation von Pankreastumorzellen sowie durch seine fördernde Wirkung auf die Expression von Connexin 43, Acetylierung von H4 und Bildung einer Pseudokapsel, ein potentiell wirksames Medikament bei der experimentellen Behandlung des Pankreaskarzinoms ist. 60 Summary 7 Summary Alexandra Friske Influence of the histone-deacetylase-inhibitor 4-phenylbutyrat on the growth of the experimental-induced pancreatic cancer Institute of Pathology of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig and Department of General Surgery, University Hospital of Heidelberg, Ruprecht-KarlsUniversity of Heidelberg Submitted in October 2014 62 pages, 20 figures, 1 table, 144 references Keywords: pancreatic cancer, histon-deacetylase-inhibitors, 4-phenylbutyrat, mice Despite improved diagnostic and therapeutic options, pancreatic carcinoma remains a disease with very poor prognosis and life expectancy after diagnosis. A new therapeutic option is presented by a group of histone deacetylase inhibitors which directly influence the regulation of gene expression in tumor cells. The aim of this study was to investigate the effect of the HDAC inhibitor 4-phenylbutyrate on pancreatic cancer cells in-vitro and above all in-vivo. In addition to the effect on cell proliferation in-vitro and in-vivo, the effect on tumour growth, cell proliferation, necrosis propagation, regulation of connexin 43 and histone acetylation in the tumour tissue was studied in-vivo in subcutaneous and orthotopic tumour models. To determine cell proliferation in vitro, an MTT analysis was carried out with T3M4, ASPC und Panc1 cells incubated at different concentrations of 4-PB. For each group three independent analyses were performed. For the in-vivo studies, athymic, immunosuppressed nude mice were used which were injected in the subcutaneous mouse model with T3M4 cells. For orthotopic tumour implantation, parts of the tumour tissue grown subcutaneously in the donor animal were transplanted orthotopically in the pancreas tail of the recipient animal. The mice in both models were divided into the following groups: control group with 18 animals in the subcutaneous model and 8 animals in the orthotopic model, 4-PB group, gemcitabine group and 4-PB + gemcitabine group with 12 animals each in the subcutaneous model and 8 animals in the orthotopic model. All medication was administered intraperitoneally. To determine 61 Summary tumour growth, in the subcutaneous model the volume of the tumour was measured at regular intervals. In the orthotopic model this was preformed after removal of the tumour tissue. Subsequently, paraffin sections were prepared from the tissue collected for immunohistochemical tests. Immunohistochemical tests were then performed for the detection of proliferating cells, for the determination of histone H4, for detecting fibrotic pseudocapsules and for connexin 43. To quantify the extent of necrosis, haematoxylin-eosin staining was carried out. For each experiment, the sections of six different mice per group were analysed. Statistical methods and figures were created under the use of GraphPad Prism (Version 5.0, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). The results were illustrated as arithmetic mean ± standard error of the mean. The unpaired t-test was used as statistical test method. Differences were classified as statistically significant at a 5% significance level. The results of this study showed in-vitro a dose-dependent inhibition of proliferation in all three pancreatic-carcinoma cell-lines and a growth reduction of the subcutaneous Xenograft-tumours in the in-vivo studies after treatment with 4-PB. In the orthotopic experimental model, PB-4 revealed no clear growth inhibition when compared to the control group. The immunohistochemical studies of tumours with an antibody against Ki-67 showed a proliferation inhibition of the in-vivo tumours, as well. This inhibition of proliferation correlated with increased expression of connexin 43 and elevated levels of acetylated histone H4 in the tumour cells. In the immunohistochemical assay of an antibody against anti-human-epithelial-membrane-antigen an increased fibrotic pseudocapsule could be identified, which can probably reduce the invasion of tumour cells into the surrounding tissue. Regarding the effect on necrosis expansion no significant difference to the control group could be detected. The results of the in-vitro experiments with three PDAC cell lines and the in-vivo experiments demonstrate, that 4-PB through its inhibitory effect on the growth of xenograft tumours and on the proliferation of pancreatic tumour cells as well as its beneficial effect on the expression of connexin 43, acetylation of H4 and the formation of pseudocapsules, is a potentially effective drug for the experimental treatment of pancreatic carcinoma. 62 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis Abiatari I, Kleeff J, Li J, Felix K, Buchler MW, Friess H. Hsulf-1 regulates growth and invasion of pancreatic cancer cells. J Clin Pathol. 2006;59:1052-8. Ammerpohl O, Trauzold A, Schniewind B, Griep U, Pilarsky C, Grutzmann R et al. Complementary effects of HDAC inhibitor 4-PB on gap junction communication and cellular export mechanisms support restoration of chemosensitivity of PDAC cells. Br J Cancer. 2007;96:73-81. Arnold NB, Arkus N, Gunn J, Korc M. 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Heinz-Adolf Schoon für sein Interesse an dieser Arbeit und die Vertretung an der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig. Herrn Prof. Dr. Jens Werner für die Überlassung des Themas und die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe. Herrn Dr. Dmitry Dovzhanskiy für die geduldige Betreuung, sein Engagement und seine stetige Hilfsbereitschaft. Frau Dr. Natalia Giese, Herrn Dr. Klaus Felix und Frau Dr. Anette Heller für wertvolle Tipps zu allen praktischen und theoretischen Aspekten der Arbeit. Herrn Dr. Frederik Fackelmann, der bei allen Problemen aufopferungsvoll mit Rat und Tat beiseite stand. Ganz besonderer Dank gilt auch Bruni (Brunhilde Bentzinger). Ohne die gute Seele des Labors hätte das alles nicht funktioniert. Vielen Dank auch für Deine mentale und psychische Stütze. Das werde ich Dir nie vergessen. Danke auch an Esther Soyka und Karin Ruf für die gute Einweisung in den verschiedenen wissenschaftlichen Methoden. Allen anderen Mitarbeitern des Europäischen Pankreasforschungszentrum danke ich für das tolle Arbeitsklima. Meine Zeit in Heidelberg wird mir unvergessen bleiben. Danke auch an die Tierpfleger der Interdisziplinären Biomedizinischen Forschungseinrichtung für die zuverlässige Versorgung meiner Mäuse. Danke auch an Dres. Eberhard und Claudia Adamo, die es mir ermöglichten, trotz des stressigen Arbeitsalltags diese Arbeit fertigzustellen. Besonderen Dank gilt auch Frau Dr. Rena Ruhl und Frau Dr. Niky Ryba. Danke für Eure Tipps und Hilfe bei der Korrektur. Zum Schluss möchte ich herzlich meiner Familie danken. Meinen Eltern und meiner Schwester danke ich, dass sie mir alles ermöglicht haben und mir beigebracht haben, nie aufzugeben. Ihr wart immer für mich da und habt mir unglaublichen familiären Rückhalt gegeben. Petra und Klaus: ohne Euch wäre sowohl Studium, als auch 74 Danksagung diese Arbeit nie zustande gekommen. Selbstlos habt Ihr nicht nur mir geholfen. Dafür habt Ihr immer einen ganz besonderen Platz verdient und ich danke Euch von ganzem Herzen. Der letzte Dank gilt einer ganz besonderen Person. Meinem Ehemann Christian, danke, dass es Dich gibt und dass Du mich durch das alles begleitest hast. Auch wenn es nicht immer einfach war und ich sicher oft genervt habe, hast Du mich immer unterstützt und hast immer an mich geglaubt. Vielen Dank 75
