Untersuchungen über die Vermehrung des Virus der

ÜBER DIE VERMEHRUNG DES VIRUS DER KLASSISCHEN GEFLÜGELPEST
109
Untersuchungen über die V erm ehrung des Virus der Klassischen
Geflügelpest
D ie Synthese der virusspezifischen R ibonucleinsäure (R N S) in infizierten G ewebekulturen em bryonaler
Hühnerzellen
V on
C h r is t o p h S
c h o l t is s e k
und
R
udolf
R
ott
Aus dem M ax-Planck-Institut für Virusforschung, Tübingen
(Z. N aturforschg. 16 b , 109— 115 [1961] ; ein gegan gen am 8. Novem ber 1960)
By a newly developed enzym atical characterization method for ribonucleic acid (RNA) a virus
specific RNA can be detected with certainty not earlier than two hours after infection of monolayer
tissue cultures of embryonic chicken cells by fowl plague virus. Almost all of this RNA is bound to the
soluble antigen. A fter removal of the s-antigen the rem aining cell-RNA, which is newly synthesized
during the first three hours after infection, does not differ significantly from th at of the non-infected
cells.
D ie V erm ehrung des V irus der K lassischen Geflü­
gelpest (K P ), das den Influenzaviren n ah e steht,
w urde in den letzten Ja h re n eingehender s tu d ie r t1.
D abei w urde in erste r L inie das V erhalten d er v er­
schiedenen P ro tein an teile des V irus verfolgt. Im
H inblick auf die R ibonucleinsäure (R N S) konnte
durch Isotopen-E xperim ente gezeigt w erden, daß
die RNS bzw. das R N S -haltige s-A ntigen bei der In ­
fektion der Zelle aus den infizierenden Teilchen in
F reih eit gesetzt w ir d 2. Die V irus-R N S w ird w ah r­
scheinlich de novo sy nthetisiert und entsteht nicht
aus zelleigener RN S 3. U b er den Z eitpunkt und den
O rt der Synthese der V irus-R N S in der Zelle
herrscht noch keine K larheit. M it H ilfe fluoreszie­
ren d e r A ntikörper ließ sich das s-A ntigen, der
eigentliche T räg er d er V irus-R N S, erst 3 Stdn. nach
der Infektion im Z ellkern nachw eisen 4.
A n d e r s o n und M itarbb., die fü r den Nachweis
der RN S A crid in o ran g e verw endeten, zeigten, daß
nach der Infektion von G ew ebekulturzellen m it I n ­
fluenzaviren eine gesteigerte R N S-Synthese sow ohl
im Zellkern als auch im C ytoplasm a sta ttfin d e t5.
Versuche über RN S-StoffW echselveränderungen in
1 W . S c h ä f e r , in: Virus Growth and V ariation (eds. A . I s a a c s
and B . W. L a c e y ) University Press, Cam bridge 1959,
pp. 61.
2 E . W e c k e r u . W . S c h ä f e r , Z. Naturforschg. 12 b, 483
[1 9 5 7 ].
3 E . W e c k e r , Z. Naturforschg. 12 b, 208 [1 9 5 7 ].
4 P . M. B r e i t e n f e l d u. W . S c h ä f e r , V irology 4, 328 [1 9 5 7 ].
5 E . S . A n d e r s o n , J. A . A r m s t r o n g u . J . S . F . N i v e n , in: Virus
Growth and V ariation (eds. A . I s a a c s and B. W. L a c e y )
U niversity Press, Cam bridge 1959, pp. 224.
6 W . W . A c k e r m a n n , P . C. L o h u . F . E . P a y n e , V irology 7,
170 [19 5 9 ].
Gewebekulturen (H eL a), die mit Polioviren infiziert
waren, lieferten unterschiedliche E rgeb nisse6 -8 .
Beim KP-Virus war es bisher noch nicht möglich,
aus den intakten Teilchen oder aus infizierten Zel­
len mit Phenol eine infektiöse RNS zu iso lieren 9).
Deshalb konnte in dem vorliegenden System auch
nicht ein biologischer Test zur Charakterisierung der
Virus-RNS herangezogen werden, wie ein solcher
bei ähnlichen Versuchen mit anderen Viren an­
gewendet w urde10-12. Wir verwendeten daher eine
Charakterisierungs-Methode der RNS, die darauf
beruht, daß diese mit Pankreas-RNase spezifisch
zu Oligonucleotiden abgebaut und letztere quantita­
tiv miteinander verglichen werden. Bei dieser Me­
thode der Charakterisierung wird nicht nur die
quantitative Zusammensetzung der Bausteine der
RNS, sondern auch deren Reihenfolge in den Makro­
molekeln berücksichtigt. D ie Methode wurde bei
RNS-Proben aus Rattenleber-Fraktionen, die auf
Grund ihrer Basenzusammensetzung praktisch nicht
unterschieden werden konnten, mit Erfolg angewen­
det 13. R e d d i 14 benutzte sie etwa zur gleichen Zeit
zur Unterscheidung von RNS-Proben, die er aus ver7 N. P.
S a lz m a n , R .
Z.
L o c k a rt u . E .
D.
S e b r in g ,
Virology 9,
244 [1959].
8 E . L . R o th s te in u . L .
A.
M an so n ,
Virology 9, 141 [1959].
unver­
9 W . S c h ä f e r , E . W e c k e r , R. M . F r a n k l i n u . R. R o tt,
öffentlichte Versuche.
10 R . E n g l e r u. G. S c h r a m m , Z. Naturforschg. 1 5 b , 38 [I960].
11 F . K. S a n d e r s , N ature [London] 185, 802 [I960].
12 P. H a u s e n u . W . S c h ä f e r , Z. Naturforschg. 16 b , 72 [1961].
13 C. S c h o l t is s e k , Biodiem. Z. 331, 138 [1959] ; 331, 365
[1959]; 332, 458 [I960].
14 K. K. R e d d i , Biochim. biophysica Acta [Am sterdam ] 32.
386 [1959].
Unauthenticated
Download Date | 8/19/17 8:28 PM
110
CHR. SCHOLTTSSEK UND R. ROTT
schiedenen Stämmen des Tabakmosaikvirus (TMV)
isolierte. R u s h i t z k y und K n i g h t 15 haben die Me­
thode dann noch weiter verfeinert.
Da die zu erwartende Menge an Virus-RNS in
infizierten Zellen im Vergleich zur Zell-RNS außer­
ordentlich klein ist, ist eine Suche danach lediglich
dann erfolgversprechend, wenn man nur die nach
der Infektion neu gebildete RNS untersucht und
dadurch die Hauptmenge der Zell-RNS ausscheidet.
Eine Möglichkeit, ausschließlich die neu syntheti­
sierte RNS zu erfassen, besteht darin, daß man diese
nach der Infektion mit einem radioaktiven Vorläu­
fer markiert. Wir verwendeten dazu 32P in der Form
von Orthophosphat. Eine Kombination der Markie­
rung mit der oben erwähnten chemischen Charakteri­
sierung der RNS hat außerdem den wesentlichen
Vorteil vor einem biologischen Test, daß sie Auf­
schluß geben kann über eventuelle Veränderungen
im RNS-StoffWechsel der infizierten Zelle, die nicht
unmittelbar mit der Neusynthese der virusspezifi­
schen RNS Zusammenhängen.
M aterial und M ethoden
1. V i r u s
Für die Untersuchungen wurde der Stamm „Rostock“
des KP-Virus verwendet, der in Hühnereiern passagiert
w u rd e16. Nur frisch gewonnene, infektiöse Allantoisflüssigkeit wurde benutzt.
2. A n t i g e n
und Antiserum
Das als Trägerantigen verwendete s-Antigen wurde
nach einer früher beschriebenen Methode hergestellt17.
Bei einem Stickstoffgehalt von 365 y/ml betrug der
Komplementbindungstiter 1 : 4000. Für die Präzipita­
tion benutzten wir ein Antiserum gegen s-Antigen, das
von Kaninchen nach der Methode cf. 4 gewonnen wurde.
3. G e w e b e k u l t u r
Zellkulturen aus 10 Tage alten Hühnerembryonen
wurden in Petrischalen von 9cm Durchmesser (5 -IO6
bis 1 • 107 Zellen pro P la tte 4) 48 Stdn. lang gezüchtet.
Vor der Infektion wurden die Zellen 2-mal mit je 10 ml
E a r l e ’ s Salzlösung, der 5 mMole Glucose und
2 mMole Glutamin zugesetzt und aus der das Phosphat
weggelassen war, gewaschen und mit je 8 ml dieser
Lösung überschichtet. Je 1 ml infektiöse Allantoisflüssigkeit mit einem Hämagglutinations (HA) -Titer von
2 ~ 7 bis 2 ~ s wurden aufgegeben und die Kulturen für
15 Min. bei 37 °C bebrütet. Es hatte sich gezeigt, daß
diese Viruskonzentration ausreicht, um nahezu sämt­
liche Zellen annähernd synchron zu infizieren 4.
15 G . W . R u s h i z k y u .
C.
Virology 1 1 , 2 3 6 [ I 9 6 0 ] .
Naturforschg. 5 b, 9 1 [ 1 9 5 0 ] .
M . M u s s g a y , Z . Naturforschg.
A . K n ig h t,
16 W . S c h ä f e r u . G . S c h r a m m , Z .
17 W . S c h ä f e r ,
11b.
330
K . M unk
[1 9 5 6 ],
u.
Den Kontrollen wurde statt infektiöser Allantoisflüssigkeit 1 ml normale, nicht-infektiöse Allantoisflüssigkeit gleichaltriger Embryonen zugesetzt.
Nach der Bebrütung wurde die Zellschicht wieder
2-mal wie oben gewaschen und 6 ml der Salzlösung
aufgegeben, die nun die gewünschte Menge an 32P als
Orthophosphat ** enthielt. Die infizierten bzw. Kontrollkulturen wurden bis zu 3 Stdn. nach 32P-Aufgabe
bei 37° bebrütet und dann aufgearbeitet.
Als Kontrolle für die Virusvermehrung wurde bei
jedem Versuch eine infizierte Platte 20 Stdn. bei 37 °C
gehalten und die Zellen danach im Inkubationsmedium
homogenisiert und zentrifugiert. Der HA-Titer im Über­
stand betrug durchschnittlich 2 ~ 6 bis 2 -7 .
4. G e w i n n u n g d e r Z e l l f r a k t i o n e n
Nach der Inkubation der K ulturen mit 32P wurde das
überstehende Medium abgegossen, die Zellschichten
2-mal mit je 10 ml eiskalter 0,25-m. Saccharose ge­
waschen, die Zellschicht in je 1 ml Saccharoselösung
zusammengeschabt, nach Vereinigung des M aterials von
mehreren Platten im Potter-Homogenisator homogeni­
siert und durch Zentrifugieren bei 700 g in eine Kernund Cytoplasmafraktion zerlegt. Die Kerne wurden
einmal durch kurzes Rehomogenisieren in 0,25-m. Sac­
charose, Unterschichten mit 0,34-m. Saccharose und
erneutes Zentrifugieren gewaschen und der Uberstand
mit der Cytoplasmafraktion vereinigt.
Unter dem Lichtmikroskop (Anfärbung mit K ristall­
violett) wurden in der Kernfraktion nur noch vereinzelt
ganze Zellen festgestellt. Sie war praktisch frei von
Mitochondrien, enthielt aber eine größere Menge Mem­
branmaterial.
5. A u f a r b e i t u n g d e r R N S a u s d e n
Zellfraktionen
Die Gewinnung der RNS und die Umsetzung zu den
Oligonucleotiden geschah folgendermaßen:
Die im Eisbad gekühlten Cytoplasmafraktionen wur­
den mit 60-proz. HC104 angesäuert (Endkonzentration
0,4-/z.) und zentrifugiert. Die Überstände wurden ver­
worfen. Die Sedimente und ebenso die gewaschenen
K ernfraktionen (s. unter 4) wurden in eiskalter 0,4-n.
HC104 im Potter-Homogenisator homogenisiert und
zentrifugiert. Das Waschen der Sedimente mit HC104
wurde noch einmal wiederholt. Danach wurden sie 2-mal
mit Methanol-Chloroform ( 2 : 1 ) , 2-mal mit n-Butanol
und 2-mal mit Ä ther gewaschen, getrocknet und in mf 15Phosphatpuffer, pH 7,2, aufgenommen (für M aterial von
5 Platten 2 m l). Dazu wurden 4 m g/Probe nicht-radioaktive RNS in wenig Phosphatpuffer gegeben und die
Proben für 10 Min. auf 100 °C erhitzt, um eventuell noch
vorhandene zelleigene Enzymaktivitäten zu zerstören.
Nach dem Abkühlen wurden je Probe 2 ml einer Lö­
sung von kristalliner, protease-freier RNase aus Pan­
kreas in H 20 zugesetzt (0,2 mg/ml Endkonzentration)
** Isotopenlaboratorium der K ernreaktor Bau- und Betriebs­
gesellschaft mbH, K arlsruhe.
18 R. M. F r a n k l in u . C. H e n r y , Virology 10. 4 0 6 [ I 9 6 0 ] .
19 T h . Z im m e r m a n n u . W. S c h ä f e r , Virology 11. 6 1 6 [ I 9 6 0 ] .
Unauthenticated
Download Date | 8/19/17 8:28 PM
ÜBER DIE V ERM EH RU N G DES V IRU S DER KLASSISCHEN GEFLÜ G ELPEST
und bei Raum tem peratur 30 —40 Stdn. stehen gelassen.
Danach wurden die Proben im Eisbad abgekühlt, mit
HC104 angesäuert und zentrifugiert. Die Sedimente
wurden nochmals in etwas Phosphatpuffer aufgenom­
men, mit je 1 ml eines verdauten, nicht radioaktiven
RNS-Ansatzes (Konzentration wie oben) kurz erhitzt
und nochmals mit HC104 in der K älte gefällt. Die ver­
einigten Überstände wurden gegen Phenolrot mit KOH
bei 0 °C neutralisiert und nach Entfernung des KC104
auf Dowex 1 x 2 Säulen gegeben (s. Abb. I ) 13. Die ein­
zelnen Fraktionen wurden in einem Flüssigkeitszähl­
rohr der Firm a Frieseke & Hoepfner, Erlangen-Bruck,
bei einer etwa 8-proz. Ansprediempfindlichkeit aus­
gezählt.
111
gerissene, nicht-virusspezifische RNS zu zerstören und
schließlich das Virus in der Spinco-Ultrazentrifuge bei
einem pi20 von 9 niedergeschlagen. Nach Zusatz von
nichtradioaktiver RNS erfolgte die Aufarbeitung der
RNS wie oben beschrieben.
Ergebnisse
A. G e w i n n u n g u n d B e d e u t u n g
d e r O 1i g o n u c 1 e o t i d - M u s t e r
Das in Abb. 1 wiedergegebene Diagramm zeigt
ein typisches Oligonucleotid-Muster einer RNS nach
RNase-Verdauung. Die Identifizierung der Oligo-
6.
F ä l l u n g des s - A n t i g e n s
aus H o m o g e n a t e n i n f i z i e r t e r Zel len
In den Experimenten, in denen das s-Antigen mit
Antiserum aus den Homogenaten der infizierten Zellen
ausgefällt werden sollte, wurden die mit 32P bebrüteten
Zellen anstatt mit 0,25-m. Saccharose mit einem NaClPhosphatpuffer, pn 7,2 (0,72% NaCl, m/50-Phosphatpuffer), gewaschen, die Zellschicht in 1 ml dieses P uf­
fers mechanisch abgelöst, im Bühler-Homogenisator
homogenisiert und außerdem noch einmal schnell ein­
gefroren und aufgetaut. Die gröberen Zellbestandteile
wurden bei 4000 Upm für 15 Min. in einer gekühlten
Laboratoriums-Zentrifuge abgeschleudert und verwor­
fen.
Der Überstand der infizierten Zellen (M aterial von
15 Platten) wurde mit 0,4 ml s-Antigen als Trägerantigen versetzt, gut gemischt, dazu spezifisches Antiserum
gegen s-Antigen im Uberschuß gegeben und die Mi­
schung 16 Stdn. bei 4 °C stehen gelassen. Der N ieder­
schlag wurde abgeschleudert und mit NaCl-Phosphatpuffer gewaschen. Zum Überstand der nichtinfizierten
Kontrollzellen wurde ebenfalls Antiserum gegeben, aber
kein Niederschlag festgestellt. Nach Zusatz von 8 mg
nicht-radioaktiver RNS pro Probe wurde die RNS aus
den Fraktionen — wie oben beschrieben — auf gearbei­
tet.
7. M a r k i e r u n g d e r R N S d e s K P - V i r u s
m i t 32P
'
Für die M arkierung der V iruspartikel mit 32P wur­
den diese auf 30 Platten in einem Lactalbumin-Hydrolysat-Vitamin-B-Komplex-Medium **, aus dem das
nicht-radioaktive Phosphat fortgelassen und dem 2 mC
32P pro Platte zugefügt worden war, gezüchtet (24 Stdn.
bei 37 °C). Die Virusteilchen wurden dann aus dem
überstehenden Medium (HA-Titer von 2 ~ 8 bis 2 - 9 )
durch Adsorption an Hühnererythrocyten und Elution
mit 10 E/ml RDE (4 Stdn. bei 37 °C) isoliert. Sie wur­
den dabei theoretisch 10-fach angereichert. Die Ausbeute
betrug allerdings nur 25 Prozent. Die so gewonnene
Viruslösung wurde über Nacht mit 0,5 mg/ml RNase
bei Raumtemperatur stehen gelassen, um eventuell m it­
** Zusamm ensetzung: E a r l e ’ s Salzlösung, 0,5% Lactalbumin-Hydrolysat. P ro L iter: [in mg] 5 Thiam in-H Cl, 0,5
Riboflavin, 0,5 Pyridoxal-H Cl, 0,1 Folsäure, 0,1 Biotin.
20 P. G i e b l e r , Z. Naturforschg. 13 b, 238 [1958].
Fraktions-Nr.------- >Abb. 1. R eliefspektrum der nach RNase-Verdauung von Zellkem -RN S auf getrennten Oligonucleotide. 5 K ulturen aus
em bryonalen H ühnerzellen wurden m it KP-Virus infiziert,
3 Stdn. nach Aufgabe von 0,1 mC 32P /P la tte die Zellen homo­
genisiert, in eine Kern- und Cytoplasm a-Fraktion auf getrennt
und aus den Kernen die RNS aufgearbeitet. Chrom atographie
an Dowex 1 x 2-Ionenaustauschsäulen in der Form iatform .
Säulenhöhe 30 cm, Durchmesser 1 cm.
C = Cytidin-3-monophosphat (CMP)
U = Uridin-3-monophosphat (U M P ).
Die Oligonucleotide sind so bezeichnet, daß das rechtsste­
hende 3-Nucleotid immer über eine 5.3-PhosphorsäurediesterBindung m it dem linken Nucleotid verbunden ist.
A = A denylsäure; G = Guanylsäure.
Die m it römischen Ziffern bezeidm eten Gipfel stellen Gemi­
sche dar. Das Säuleneluat (große Buchstaben unter der A b­
szisse) wurde in 13-ml-Fraktionen aufgefangen.
A = 0,1-n. Ameisensäure (AS) ;
B = 0,l-7i. A S + 0,l-ra. Am m onium form iat (A F );
C = 0 ,l- 7 i. A S + 0,2-71. A F;
D = 0 ,l- 7 i. A S+ 0,3-71. A F ;
E = 0 ,1 - ti. A S + 0,4-71. A F;
F = l-7i. AS;
G = 2-71. AS;
H = 3-71. AS;
I
J
K
L
M
=
=
=
=
=
4-71.
4-7i.
4-71.
4-71.
4 - ti.
A S;
A S+
AS +
A S+
AS+
0,025-71. A F ;
0 ,l- 7 i. A F ;
0,2-71. A F ;
0,3-71. AF.
Unauthenticated
Download Date | 8/19/17 8:28 PM
112
CHR. SCHOLTISSEK UND R. ROTT
nucleotide erfolgte dabei auf G rund der q u a n tita ti­
ven B estim m ung ih re r Basenzusam m ensetzungen
nach H ydrolyse. D er GGC-Gipfel enthielt etwa 25%
V erunreinigungen in F orm von A- und U -haltigen
O ligonucleotiden. Im AAC-Gipfel w urde bei der Be­
stim m ung d er Basenzusam m ensetzung noch eine u n ­
bek annte Base als V erunreinigung festgestellt. Im
allgem einen zeigten diese beiden Gipfel auch eine
relativ gro ß e S treuung bei der A usw ertung der
R adioaktivitäts-V erhältnisse. Am besten re p ro d u ­
zierb ar w aren die W erte fü r die C- und U-Gipfel.
Als B eziehungsnucleotid w urde im m er das leicht b e­
stim m bare C ytidinm onophosphat verw endet. D ie
V erhältnisse C /O ligonucleotid sind fü r jede RNS
charakteristisch.
Die wichtigste V oraussetzung fü r das A uf finden
von virusspezifischer RNS in Gemischen m it ZellRN S ist, daß die reine V irus-R N S sich wesentlich
von d er der Zelle unterscheidet. W ie die T ab. 1 bis
4 zeigen, ist dies in dem System K P-V irus —em bryo­
nale H ühnerzellen der F all. Da in allen E xperim en­
ten die C /U -V erhältnisse die geringste Streuung au f­
w iesen. w urden m eistens diese fü r die Berechnung
von G ehalten an virusspezifischer RNS in Gemischen
herangezogen.
In den T ab. 1 bis 3 ist jew eils ein E xperim ent je
Stu ndenw ert aus m ehreren herausgegriffen, die
u n te r sich alle ähnliche E rgebnisse zeigten. Die ein­
an d er entsprechenden O ligonucleotid-V erhältnisse
wichen von V ersuch zu V ersuch etwas voneinander
ab, stim m ten aber, wie z. B. der 1-Stdn.-W ert zeigt,
C /X
X =
u
AC
GC
AAC
(GA)C
AAU +
AU?
GGC
I
GU
II
III
recht gut überein, wenn die G ew ebekulturen aus ein
und dem selben E m b ry o an satz h ergestellt w urden.
E ine M ittelw ertbildung w u rd e deshalb n u r bei der
rein en V irus-R N S (3 E xperim ente) vorgenom m en.
B. A u f t r e t e n v o n v i r u s s p e z i f i s c h e r
RNS in K er n und C y t o p l a s m a
infizierter Zellen
Zunächst w urde die RN S von Zellen, die 1, 2 bzw.
3 S tdn. nach d er In fek tio n au fg earb eitet w urden, m it
R N ase v erd au t u n d in die O ligonucleotide zerlegt.
In T ab. 1 sin d E rg eb n isse der U ntersuchungen
w iedergegeben, bei denen die RN S 1 Stde. p. i. aus
dem infizierten bzw. nicht-infizierten System au f­
g earb eitet w urde. W ie aus ih r h ervorgeht, liegen die
O ligonucleotid-V erhältnisse bei den infizierten und
nicht-infizierten Z ellfraktionen recht n ah e b eiein an ­
der. D ie g erin g en U nterschiede, die besonders in
den K ern frak tio n en zum A usdruck kom m en, lassen
verm uten, daß die aus infizierten Zellen gew onnene
RN S eine kleine M enge virusspezifischer RNS ent­
hält. Jedoch sind diese A bw eichungen zu gering, um
signifikant zu sein.
Beim 2-Stdn.-W ert (T ab. 2) sind die U nterschiede
zwischen d er RN S d er infizierten Zellen u n d der
der K o n tro llen g rö ß er, w eisen ab e r besonders in den
C y to p lasm a-F raktionen g rö ß ere U nstim m igkeiten
auf.
Beim 3-Stdn.-W ert (T ab. 3) sieht m an — vor
allen D ingen in den K ern frak tio n en —, daß die
O ligonucleotid-V erhältnisse bei den infizierten Zel­
1 S tu n d e
R eine V irus R N S
KKo
K V ir
C yt K o
C y t V ir
RNS
G rö ß te
A bw eichung
vom
M itte lw e rt
1,18
2,50
1,96
3,70
1,66
1,16
2,56
1,95
3,90
1,72
1,14
2,58
1,97
3,55
1,66
1,15
2,62
1,99
4,20
1,78
0,86
2,60
2,08
5,40
3,75
0,015
0,05
0,03
0,40
0,15
2,20
2,32
2,86
1,91
1,85
2,64
2,19
2,49
2,92
2,03
2,22
2,54
2,20
2,65
2,60
1,73
2,26
2,54
2,18
2,80
2,66
1,79
2,20
2,62
1,98
3,25
8,00
1,40
3,55
2,50
0,08
0,40
0,3
0,10
0,25
0,25
Tab. 1. H iihnerfibroblasten-K ulturen wurden m it KP-Virus infiziert und m it 32P-haltigem M edium bebrütet. Je 5 K ulturen
w urden 1 Stde. nach 32P-A ufgabe geerntet, in K erne (K) und Cytoplasm a (Cyt) zerlegt und die RNS zu Oligonucleotiden ver­
daut. K o = K ontroll-K ulturen ohne KP-Virus. Vir = Mit KP-Virus infizierte K ulturen. In der T abelle sind die Verhältnisse
C/Oligonucleotid wiedergegeben. Bezeichnung der Oligonucleotide s. Abb. 1.
Unauthenticated
Download Date | 8/19/17 8:28 PM
ÜBER DIE VERM EHRUNG DES VIRUS DER KLASSISCHEN G E FL Ü G EL PE ST
c /x
2 S tu n d e n
R ein e V irus R N S
Cyt Ko
C y t V ir
RNS
G rößte
A bw eichung
vom
M ittelw ert
X =
KKo
K V ir
u
1,12
2,71
1,88
4,93
1,66
1,06
2,53
2,20
5,23
1,67
1,80
2,96
2,04
5,87
4,07
1,61
3,08
1,88
5,53
3,13
0,86
2,60
2,08
5,40
3,75
0,015
0,05
0,03
0,40
0,15
2,06
2,56
4,35
1,58
2,58
2,99
1,94
2,50
4,54
1,70
2,85
2,98
2,92
4,40
5,65
2,20
2,75
3,58
2,96
4,10
5,87
2,13
2,89
3,33
1,98
3,25
8,00
1,40
3,55
2,50
0,08
0,40
0,3
0,10
0,25
0,25
AC
GC
AAC
(GA)C
AAU +
AU?
GGC
I
GU
II
III
113
T ab. 2. H ühnerfibroblasten-K ulturen wurden m it KP-Virus infiziert und m it 32P-haltigem M edium beb rü tet; 2-Stdn.-W ert.
Versuchsbedingungen wie in Tab. 1 angegeben.
C /X
X =
u
AC
GC
AAC
(GA)C
AAU +
AU?
GGC
I
GU
II
III
3 S tu n d en
R ein e V irus R N S
KKo
K V ir
C yt K o
C y t V ir
RNS
G rößte
A bw eichung
vom
M ittelw ert
1,08
3,03
1,86
4,14
2,90
0,97
2,80
1,94
4,20
3,18
1,45
2,98
1,84
4,45
3,14
1,28
2,75
1,97
4,03
3,04
0,86
2,60
2,08
5,40
3,75
0,015
0,05
0,03
0,40
0,15
2,48
2,80
4,49
1,86
2,01
2,68
2,02
2,03
5,24
1,44
2,56
2,54
3,23
3,16
5,28
2,32
2,26
2,63
2,46
3,10
4,93
2,18
2,10
2,54
1,98
3,25
8,00
1,40
3,55
2,50
0,08
0,40
0,3
0,10
0,25
0,25
Tab. 3. H ühnerfibroblasten-K ulturen w urden m it KP-Virus infiziert und m it 32P-haltigem M edium beb rü tet; 3-Stdn.-Wert.
Versuchsbedingungen wie in Tab. 1 angegeben.
len sich im Vergleich zu den nicht-infizierten Zel­
len ein deutig in R ichtung auf die der reinen
V irus-R N S verschieben. Lediglich der GGC-Gipfel,
d er im m er größeren Schw ankungen unterw orfen
u n d deshalb wenig charakteristisch ist, fällt aus der
R eihe. In der C ytoplasm a-Fraktion der infizierten
Zellen besteht wegen verschiedener kleiner A bw ei­
chungen eventuell noch die M öglichkeit, daß neben
d er V irus-R N S eine zusätzliche, nicht zellspezifische
R N S sy nthetisiert w ird.
W enn m an in der K ernfraktion in T ab. 3 auf
G ru n d d er V erschiebung in den O ligonucleotid-V er­
h ältn issen bei den ersten d rei G ipfeln (U, AC, GC)
den A nteil der in 3 S tdn. synthetisierten virusspe­
zifischen RN S berechnet, kom m t m an auf etwa 50%
d er in dieser Zeit im K ern neu synthetisierten und
d eshalb m it 32P m a rk ierten gesam ten RN S.
D ie R a d io a k tiv itä t d er gesam ten K ern-R N S bei
den infizierten Zellen ü b ersteig t die bei den nichtinfizierten Zellen bis zu 3 0 P rozent. D ie en tsp re­
chenden W erte in d er C ytoplasm a-F raktion schwan­
ken zu sehr, um gen au e A ngaben machen zu k ö n ­
nen. D er G ru n d d a fü r k ö n n te sein, daß ein Teil der
virusspezifischen u n d auch d er K ern-R N S w ährend
des H om ogenisierens den K ern v erläß t u n d d ann in
d er C y to plasm a-F raktion gefunden w ird. A rbeiten
d a rü b e r sin d noch im G ang. W ichtig ist, daß in der
K ern fra k tio n 3 S tdn. p. i. ein erheblicher P ro zen t­
satz d er neu g ebildeten RN S als V irus-R N S a n ­
gesprochen w erden kann.
Unauthenticated
Download Date | 8/19/17 8:28 PM
114
CHR. SCH OLTISSEK UND R. ROTT
C. B i n d u n g s z u s t a n d
der v i r u s s p e z i f i s c h e n RNS in den
infizierten Zellen
A usgehend von der V orstellung, daß die V irusRNS bald nach ih re r Synthese an das s-A ntigen ge­
bunden ist, w urde versucht, diese m it A ntiserum
gegen s-A ntigen aus den H om ogenaten infizierter
Zellen auszufällen. D a die A u ftrennung der infizier­
ten Zellen in eine K ern- und C ytoplasm a-F raktion
kein eindeutiges E rgebnis ü b er die L okalisie­
ru n g der virusspezifischen RN S (T ab. 3) ergeben
hatte, w urde in den folgenden E xperim enten auf
eine A uftrennung in diese F ra k tio n e n verzichtet.
In einem V orversuch w urde gefunden, daß die
aus den Z ellhom ogenaten abzen trifu g ierten g rö b e­
ren Bestandteile zw ar 45% der R a d io ak tiv ität der
gesam ten Zell-RNS aber kaum virusspezifische RN S
enthalten. In anderen E xperim enten konnte gezeigt
w erden 18, daß u n ter diesen B edingungen die v iru s­
spezifischen A ktivitäten wie h äm agglutinierend e,
k om plem entbindende und Infektions-A ktivität sich
im Ü berstand befinden. Die Z ellrückstände w urden
deshalb im folgenden nicht berücksichtigt.
T ab. 4 zeigt, daß m it s-A ntigen-A ntiserum die
virusspezifische RN S aus den Ü b erständen der
hom ogenisierten Zellen, die 3 Stdn. p. i. geerntet
w urden, w eitgehend ausgefällt w erden kann, und
daß die zurückbleibende RN S m it der der K ontrollzellen fast übereinstim m t. In dem hier w iedergege­
benen Versuch fällt lediglich der (G A )C -G ipfel aus
der Reihe. W ie m an aus T ab. 4 ersieht, ist ein k lei­
n er Teil der virusspezifischen RN S nicht m it dem
A ntiserum entfernt w orden. Aus d er V erschiebung
im C /U -V erhältnis berechnet sich dieser A nteil in
dem in Tab. 4 angegebenen B eispiel zu etwa 5 P ro ­
zent. E r steigt aber in m anchen E xperim enten bis zu
14% an. Obwohl diese W erte von V ersuch zu V er­
such ziemlichen Schw ankungen u nterw orfen sind,
sind sie besonders hoch bei k ü rzeren In k u b atio n s­
zeiten p. i. m it 32P (z .B . 2 S td n .). Ob dabei diese
virusspezifische RN S, die sich nicht m it dem A n ti­
serum ausfällen läßt, in freier F o rm vorliegt oder
ob die antigene S tru k tu r des R ibonucleoproteid s
noch nicht völlig ausgebildet ist, k an n nicht gesagt
w erden.
Die V erunreinigung des ausgefällten s-A ntigens
m it zelleigener RNS läßt sich im oben angegebenen
Beispiel aus der Abw eichung des C /U -V erhältnisses
von dem der reinen V irus-R N S zu 20% der gesam ­
ten ausgefällten RNS berechnen. D abei w urde die
C /X
K o n tro llZellen
Infizierte
Zellen,
s-A ntigen
e n tfe rn t
a u s­
gefälltes
V irus
s-A ntigen
1,47
3,40
1,75
3,14
1,43
3,16
1,75
2,66
0,94
2,59
1,86
2,74
0,86
2,60
2,08
3,75
2,90
2,22
2,99
2,20
1,86
1,71
1.98
1,40
u
AC
GC
(GA) C
AA U +
AU?
GU
V irus-
RNS
Tab. 4. W achstumsbedingungen der Gewebekultur (infiziert
m it KP-Virus) s. Tab. 1. 15 infizierte K ulturen bzw. 10 Kontrollkulturen wurden 3 Stdn. nach Aufgabe von 0,1 mC 32P
pro P latte geerntet, nach Homogenisieren und A btrennung
der Z elltrüm m er das s-Antigen aus dem U berstand der infi­
zierten Zellen ausgefällt und die RNS aus den aufgeführten
Fraktionen aufgearbeitet. Bestimmung der OligonucleotidVerhältnisse wie in Tab. 1. Die wenig charakteristischen G ip­
fel sind der Übersichtlichkeit halber weggelassen worden.
beim A usfällen m itgerissene Zell-RNS als hom ogen
angesehen, was nicht unbedingt der Fall sein m uß.
D iese V erunreinigungen, die das ausgefällte s-Antigen begleiten, können bis zu 35% ansteigen.
A us Tab. 5 geht hervor, daß 3 Stdn. nach der I n ­
fektion m it dem s-A ntigen-A ntiserum etwa ein D rit­
tel der rad io ak tiv en RNS aus dem Ü berstand d er
infizierten u n d hom ogenisierten Zellen ausgefällt
w erden kann. D ie nicht ausfällbare radioaktive RNS
entspricht m engenm äßig etwa der im Ü berstand der
nicht infizierten Zellen gefundenen RN S.
G esam te
RNS
Infizierte
Zellen,
s-A ntigen
e n tfe rn t
A usgefälltes
V iruss-A ntigen
K ontrollZellen
Im p ./M in ./
P la tte
11870
5240
11700
Tab. 5. Verteilung der Radioaktivität in der RNS aus dem
Ü berstand infizierter Zellen, aus dem das s-Antigen aus­
gefällt wurde, dem ausgefällten s-Antigen und dem Ü berstand
nicht-infizierter Zellen. Experim ent wie in Tab. 4. Die W erte
w urden aus der Summe der gemessenen Oligonucleotide der
verdauten RNS errechnet.
A ber auch 2 Stdn. p. i. w urde m it dem A ntiserum
b ereits ein R ibonucleoproteid ausgefällt, welches
in der R N S-K om ponente das charakteristische Oligonucleotid-S pektrum der V irus-RN S zeigte und zwi­
schen 10 und 25% der gesam ten radioaktiven RN S
des Ü berstan d es d er infizierten Zellen ausmachte.
D iese letzteren W erte laufen p arallel m it den in den
V erm eh ru n g sk o n tro llen gefundenen H A -Titern, die
bis zu 50% schwanken können.
Unauthenticated
Download Date | 8/19/17 8:28 PM
AU FBAU UND VERM EHRU NGSM ÖG LICH KEITEN VON STÄBCH EN FÖRM IGEN IN SEK TEN -V IR EN
Diskussion
Da ein biologischer Nachweis von virusspezifi­
scher R N S bei dem K P-V irus nicht möglich ist,
w u rd e versucht, die E ntstehung dieser RNS w ährend
des V erm ehrungszyklus in Gew ebekulturzellen auf
chemischem W ege zu verfolgen. H ierfü r stand eine
genügend em pfindliche und hochgradig spezifische
C harakterisierungs-M öglichkeit der RNS durch enzy­
m atischen A bbau zur V e rfü g u n g 13-15. A ußerdem
k o n n te m it dieser M ethode verfolgt w erden, inw ie­
w eit durch die Infektion der zelleigene RNS-Stoffwechsel g estö rt w ird. In dem gew ählten System b e­
stan d au ß erd em die M öglichkeit, durch H om ogeni­
sieren d er infizierten Zellen und A uftrennung in eine
K ern- u n d C ytoplasm a-Fraktion eine grobe L okali­
sieru n g d er Synthese der virusspezifischen RN S zu
versuchen. U nter Z uhilfenahm e serologischer M etho­
den k o n nte w eiterhin die B indung der neugebilde­
ten V irus-R N S an P rotein-U ntereinheiten des K PV irus untersucht w erden.
D ie h ie r auf geführten V ersuchsergebnisse be­
sagen, daß erst 2 Stdn. nach der Infektion von
em b ry o n alen H ühnerzellen in vitro m it K P-V irus
virusspezifische RNS in nachw eisbaren M engen auftritt u n d diese sogleich zum größten Teil an das
s-A ntigen gebunden ist. V on diesem Z eitpunkt an
läß t sich die Synthese des s-A ntigens m it p-Fluorph en y lalan in auch nicht m ehr h em m en 19, obw ohl
115
m it fluoreszierenden A n tik ö rp ern das A ntigen erst
3 S tdn. p. i. im Z ellkern nachzuw eisen i s t 4. Nach
A usfällen des s-A ntigens m it spezifischem A ntiserum
aus den H om ogenaten der infizierten Zellen gleicht
die zurückbleibende, neusy n th etisierte RN S d erje n i­
gen nichtinfizierter Zellen sow ohl in ih re r Z usam ­
m ensetzung als auch in ih re r M enge. D er übrige
RNS-StoffWechsel d er Zelle w ird dem nach offenbar
u n ter den oben angegebenen W achstum sbedingun­
gen durch die In fek tio n — zum indest in den ersten
d rei Stdn. p. i. — nicht wesentlich gestört. Die S yn­
these d er virusspezifischen RN S ist in dem h ier b e­
schriebenen System also lediglich eine zusätzliche
L eistung d er Zelle nach ih re r Infektion. D er O rt der
virusspezifischen R N S-Synthese liegt w ahrscheinlich
im K ern. F ü r diese A nschauung sprechen außerdem
die cytologischen U n tersu c h u n g en 4, bei denen drei
Stdn. nach d er In fek tio n m it H ilfe von fluoreszie­
rendem A n tik ö rp er das s-A ntigen, d. h. der RNST rä g er des V irus, n u r im K ern gefunden w urde.
V ersuche ü b er die V erän d eru n g en des RNS-Stoff Wechsels d er infizierten Zellen zu sp äteren Z eitpunk­
ten nach d er In fek tio n sin d im G ang.
H errn Professor Dr. W. S c h ä f e r danken wir für an­
regende Diskussion und Förderung der Arbeit, Frau
U. S c h ä f e r - F u h r danken wir für ihre wertvolle Mithilfe.
Die A rbeit wurde mit M itteln der D e u t s c h e n F o r ­
s c h u n g s g e m e i n s c h a f t durchgeführt.
Uber den Aufbau und die Vermehrungsmöglichkeiten
von stäbchenförmigen Insekten-Viren II
V on A loysius K rieg
Aus der Biologischen B undesanstalt für Land- und Forstw irtschaft,
Institut für biologische Schädlingsbekäm pfung, D arm stadt
(Z. Naturforschg. 16 b, 115— 117 [1961] ; ein gegan gen am 26. Septem ber 1960)
Electron-m icrographs of whole virus-rods show a helix structure and confirm results published by
K. M. S m i t h . Basing on former observations of a hole in the centre of sub-units a new model of rod­
shaped insect-viruses is proposed. This model is sim ilar to th at of TMV. In view of the new observa­
tions on the structure and of the eclipse of these viruses, no confirmation for the hypothesis of a “life
cycle” as suggested by B e r g o l d and B ir d was obtained. Sub-units do not represent virus developmen­
tal stages but artifacts of alkaline degradation.
In ein er ersten M itteilung (K rieg 1957) w urden
die E rg ebnisse von Spaltungsversuchen an K ern ­
P o ly ed erv iren aus A p o ria cra ta eg i (L.) ( B o rre lin a v iru s a p o ria e K r i e g et L a n g e n b u c h ) m it­
geteilt. A us ihnen konnte auf einen polym eren A uf­
b au d er V irusstäbchen geschlossen w erden, wie er
fü r eine V irussynthese ü ber D issozianten-B ildung
vorausgesetzt w erden m uß. D ie M orphologie der
U nter-E inheiten (sub-units) m achte au ßerdem einen
dem M a rm o rv iru s ta b a c i H o l m e s ( = TM V) ä h n ­
lichen A ufbau der V iru sm atrix w ahrscheinlich.
Zu dieser T h eo rie w erden heute einige neue Be­
fu n d e vorgelegt u n d im Z usam m enhang m it eigenen
E rg eb n issen sow ie denen an d e rer A utoren disku-
Unauthenticated
Download Date | 8/19/17 8:28 PM