Bakterien sind überall Skriptum
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Bakterien sind überall Großes mikrobiologisches Praktikum Skriptum © Gläsernes Labor, Helmholtz Zentrum München – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt Skriptversion: 17.06.2008 Mikrobiologisches Praktikum Die Mikrobiologie ist ein Teilbereich der Biologie und beschäftigt sich mit Mikroorganismen. „Mikroorganismen“ sind mikroskopisch kleinen Organismen mit eigenem Stoffwechsel, deren Individuen man in der Regel nicht mit bloßem Auge erkennen kann. Mikrobiologische Arbeitsmethoden sind heute aus vielen naturwissenschaftlichen und medizinischen Forschungsgebieten nicht mehr wegzudenken. Auch verschiedenen Industriezweige wenden in Verfahren an in denen Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen eine wichtige Rolle spielen. Mikroorganismen finden sich aber auch überall in unserer Umwelt - sie beeinflussen unser Leben ständig. Sei es als Krankheitserreger, aber auch als Hersteller von Nahrungsmitteln oder als Müllverwerter. Im Großen Mikrobiologischen Praktikum sollen Schülerinnen und Schüler der Oberstufe selbständig den experimentellen Umgang mit Mikroorganismen im Labor erproben. Experimente aus unterschiedlichem Bereich der Mikrobiologie versuchen die erstaunliche Stoffwechselleistung der Bakterien darzustellen. Experimente 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Grundsätze für mikrobiologisches (steriles) Arbeiten Unterscheidung von Bakterien durch Färbung Färbung von Sporen Bakterien am Körper, Hygieneregeln, Abklatschplatten Genetische Transformation von Bakterienzellen Identifikation von Bakterien Wachstum von Bakterien Mikrobiologie 1- Grundsätze für mikrobiologisches Abreiten 1 - Grundsätze für mikrobiologisches (steriles) Arbeiten Mikroorganismen sind allgegenwärtig. Um Kulturen, sterile Lösungen und sterile Geräte vor Verunreinigungen (Kontaminationen) zu schützen, müssen einige Regeln beachtet werden. Nur so können korrekte mikrobiologische Ergebnisse gewährleistet werden. Unter Sterilität (v. lat. steril: keimfrei, unfruchtbar) versteht man den Zustand absoluter Keimfreiheit (= Nichtvorhandensein vermehrungsfähiger Mikroorganismen). Dazu bedient man sich physikalischer und chemischer Verfahren. In den nachfolgenden Arbeitsschritten führst Du verschiedene Sterilisationsverfahren durch. Als physikalisches Sterilisationsverfahren verwendet man z.B. das Autoklavieren. Diese Methode wird zur Sterilisation von hitzestabilen Kulturmedien, Lösungen und Gegenständen, die eine Temperatur über 130 °C nicht vertragen (z. B. Plastik), verwendet. Die zu sterilisierenden Gegenstände werden für mindestens 20 Minuten einer Wasserdampfatmosphäre (1 bar) von 121 °C ausgesetzt; vergleichbar ist dies mit einem Dampfdrucktopf. Bei der Desinfektion hingegen wird nicht immer ein vollständiges Abtöten pathogener (krankheitserregender) Keime erzielt, sondern oftmals nur eine Reduzierung (Verminderung) der Keimzahl erreicht. Material: Petrischalen, Impföse, Drygalskispatel, Reagenzgläser mit Sterilisierkappen, Bunsenbrenner, Pasteurpipetten Chemikalien: Desinfektionsmittel, Seife Versuchsablauf Bemerkungen 1. chemisches Verfahren: Händedesinfektion (nur wenn ohne Handschuhe gearbeitet wird): Vor und nach jedem mikrobiologischen Arbeiten sollten die Hände mit speziell dafür vorgesehenem Desinfektionsmittel desinfiziert werden. Dazu Hände erst mit Seife waschen (Waschbecken links), anschließend mit speziellem Desinfektionsmittel (am Tisch, Gebrauchsanleitung beachten!) 2. physikalisches Verfahren: Arbeitsmaterialdesinfektion. Beim mikrobiologischen Arbeiten müssen die verwendeten Arbeitsgeräte und -materialien jeweils vor und nach Gebrauch sterilisiert werden, so dass man keine Keime auf das zu untersuchende Objekt verschleppt. 3 Beispiele für andere chemische Sterilisationsmittel sind: Antibiotika, Chemotherapeutika etc… Wege der physikalischen Sterilisation: A. Temperatur: ausglühen, abflammen B. mechanisch: filtrieren C. Strahlung: radioaktiv, UV Bei direktem Kontakt mit dem Bunsenbrenner aus Sicherheitsgründen NIE Handschuhe anziehen! Mikrobiologie 1- Grundsätze für mikrobiologisches Abreiten 2 a) AUSGLÜHEN Sterilisation der Impföse durch Ausglühen in einer Flamme: - Entzünde den Bunsenbrenner (frage einen Kursbetreuer, wenn Du dem Bunsenbrenner hier zum ersten Mal begegnest). - Halte dann die Impföse schräg nach unten in den nicht leuchtenden Teil der Flamme, bis sie glüht. - Ziehe danach den Impfösenhals einige Male durch die Flamme. Anschließend lass die Impföse abkühlen, bevor du Material aufnimmst. 2 b) ABFLAMMEN - Stelle die Sparflamme am Bunsenbrenner ein. - Tauche den Drigalskispatel kurz in das abgedeckte Becherglas mit Alkohol. Verschließe das Becherglas wieder mit der Petrischale. - Halte den Drigalskispatel kurz an die Sparflamme des Bunsenbrenners, so dass sich der Alkohol entzündet. - Halte dabei den brennenden Drigalskispatel außerhalb der Flamme schräg nach unten bis die Flamme erlischt. - Nicht den Drigalskispatel in der Bunsenbrennerflamme abbrennen! 4 Impföse: Werkzeug zur Entnahme von kleinen Mengen Kulturmaterial, sowie zum Beimpfen von Kulturmedien. Drigalskispatel: Werkzeug zum Ausstreichen von Kulturmaterial auf Nährböden in Petrischalen. Glasgeräte können nicht ausglühen, sie können nur oberflächlich sterilisiert werden. Mikrobiologie 1- Grundsätze für mikrobiologisches Abreiten Biegen eines Drigalskispatels atels Drigalskispatel: Werkzeug zum Ausstreichen von Kulturmaterial auf Nährböden in Petrischalen. Drigalskispatel Du brauchst: Pasterpipetten lang, Bunsenbrenner Versuchsablauf Bemerkungen 1. Entzünden den Bunsenbrenner (frage einen Kursbetreuer, wenn Du dem Bunsenbrenner hier zum ersten Mal begegnest). Du benötigst nur die Sparflamme. Man kann den Spatel biegen ohne Handschuhe zu verwenden, wenn Dir das Glas zu heiß ist arbeite entweder schneller, oder nimm Pinzetten, bzw. Tiegelzangen zur Hilfe. 2. Erhitze eine Pasteurpipette ca. zwei Fingerbreit unter der Verjüngung (s. Abb. unten) und biege sie in einem leichten Winkel (ca. 30°) ab (A). 3. Auf dieselbe Weise knickst Du die Pipette wieder zwei Fingerbreit weiter so ab, dass die Spitze quer zum Griff steht (B). 4. Schließlich die Spitze der Pipette am Ende zum Griff hin abbiegen und zuschmelzen (C). Das Zuschmelzen ist nötig, damit keine Flüssigkeiten in das Ende der verbogenen Pipette eintreten. Biegen eines Drigalskispatels aus einer langen Pasteurpipette aus Glas (A-C) 5 Mikrobiologie 1- Grundsätze für mikrobiologisches Abreiten Herstellung von Agarplatten Bakterien und andere Mikroorganismen brauchen zum Überleben Nährstoffe wie alle anderen Lebewesen auch. Um Mikroorganismen zu kultivieren und zu züchten verwendet man in der Mikrobiologie hauptsächlich zwei verschiedene Nährmedien: Flüssigkulturen und Agarplatten. Sie enthalten alle Stoffe, die für ein optimales Wachstum der Mikroorganismen wichtig ist. Du brauchst: Kulturmedium (Nähragar), Bunsenbrenner, Petrischalen, Arbeitshandschuhe Versuchsablauf Bemerkungen Das Kulturmedium (Nähragar) wurde von uns schon durch Autoklavieren sterilisiert und in Schraubverschlussflaschen vorbereitet. Besorge dir flüssigen Nähragar aus dem Wasserbad. Achtung: Der Nähragar ist 60° heiß – bitte mit Thermohandschuhen (grün-gelbes Strick) anfassen. Hier: Nähragar = enthält einen Fleischextrakt als Bakteriennahrung und Agar zum Festwerden des Nährbodens 1. Entzünde den Bunsenbrenner. Stelle ihn auf die rauschende Flamme ein. Arbeite beim Plattengießen immer in der Nähe des Bunsenbrenners! Arbeitshandschuhe tragen!!! 2. Stelle Dir sechs leere Petrischalen bereit (Achtung: noch nicht den Deckel entfernen!). Wenn ihr zu mehreren seid, teilt die Schalen unter euch auf. Die Wärme der Flamme lässt Luft aufsteigen und bewirkt, dass beim Eingießen des Kulturmediums keine Keime aus der Luft hineinfallen können. Das Abflammen dient der Sterilisation des Ausgusses. 3. Entferne vorsichtig den Verschluss der Schraubverschlussflasche und schwenke den Rand einige Male durch die rauschende Bunsenbrennerflamme. 4. Zum Gießen den Deckel einer Petrischale anheben und soviel Nähragar eingießen, dass der gesamte Boden vollständig bedeckt ist (ca. 30 ml). Während des Gießens den Deckel der Petrischale schräg über das Unterteil halten. Das Halten des Deckels während des Gießens soll verhindern, dass sich Keime aus der Luft in den Nährboden mischen. 5. Eventuell entstandene Luftbläschen durch kurzes Befächeln (von oben) mit der entleuchteten Bunsenbrennerflamme entfernen. 6. Deckel schräg auflegen und Nährmedium in waagrechter Position erstarren lassen. (ca. 5 min) 7. Nach Erkalten und Erstarren des Nährmediums (erkennbar an einer leichten Trübung des Nähragars) werden die Deckel auf die Petrischalen gelegt und die Petrischalen mit Deckel nach unten und Boden nach oben gelagert. 6 Dies soll verhindern, dass Kondenswasser vom Deckel in die Platten tropft und Bakterien wegschwemmt Die Petrischalen nicht mehr bewegen, da sonst der Nähragar nicht erstarrt. Mikrobiologie 1- Grundsätze für mikrobiologisches Abreiten Kultivierung von Bakterien Um mit Bakterien gut arbeiten zu können ist es oft wichtig sie von einem Medium ins andere zu überführen oder aus sehr dicht gewachsenen Bakterienkulturen weniger Bakterien zu isolieren. In der Mikrobiologie gibt es dazu viele verschiedene Arbeitstechniken, von denen ihr hier drei kennen lernen werdet und selber durchführen könnt. Du brauchst: Petrischalen, Impföse, Bunsenbrenner, Bakterienproben A) Flächenausstrich Versuchsablauf Bemerkungen 1. Besorge Dir eine Agarplatte (selbstverständlich kannst Du eine von deinen selbst gegossenen nehmen, wenn Sie schon fest sind, sonst nimm eine aus dem allgemeinen Vorrat). Besorge Dir eine Bakterienflüssigkultur (steht auf dem Tisch). 2. Beschrifte die Petrischale auf dem Boden Flächenausstrich). Immer am Rand beschriften! (V1-Datum- 3. Stelle Dir alle Materialien bereit, die Du braucht. Entzünde den Bunsenbrenner. Sterilisiere einen Drigalskispatel. 4. Tropfe mit einer Einmalpipette 100 µl Bakterienkultur (das sind 3 Tropfen) auf die Oberfläche. 5. Setze den sterilisierten Drigalskispatel auf der Plattenoberfläche auf und verteile die Flüssigkeit kreisförmig, bis die Flüssigkeit in den Agar eingezogen ist. 6. Drehe die Petrischale auf den Deckel und stelle sie in den Brutschrank. Besorge Dir eine Platte vom Vortag und schaue Dir an, wie ein bewachsener Flächenausstrich aussieht. Die bereits bewachsenen Platten liegen auf dem großen Lichttisch. B) Kreuzaustrich Diese Methode eignet sich um Mikroorganismen als Einzelkultur zu erhalten. Versuchsablauf Bemerkungen 1. Besorge Dir eine Agarplatte (selbstverständlich kannst Du eine von deinen selbst gegossenen nehmen, wenn Sie schon fest sind, sonst nimm eine aus dem allgemeinen Vorrat). 2. Beschriftet die Petrischale wie oben auf dem Boden (V1-DatumKreuzausstrich). 3. Stelle Dir alle Materialien bereit, die Du braucht. Entzünde den Bunsenbrenner. Sterilisiere eine Impföse. 7 Mikrobiologie 1- Grundsätze für mikrobiologisches Abreiten 4. Nimm etwas Bakterienkultur mit der Impföse auf (die Öse sollte innen benetzt sein) und verteile sie mit einem Strich in der Mitte der Platte (A). 5. Glühe die Impföse noch einmal aus und warte bis sie abgekühlt ist. 6. Bewege nun die Impföse, wie in der Abbildung rechts dargestellt (B), über die Platte 7. Schließe die Petrischale und drehe sie auf den Deckel - stelle sie in den Brutschrank. Besorge Dir eine Platte vom Vortag und schau Dir an, wie ein bewachsener Kreuzausstrich aussieht. C) Drei-Strich-Ausstrich (=Reinigungsausstrich) Dies ist eine häufig angewandte Methode um Einzelkolonien von Bakterien aus einer Mischkolonie zu isolieren. Versuchsablauf Bemerkungen 1. Besorge Dir eine Agarplatte (selbstverständlich kannst Du eine von deinen selbst gegossenen nehmen, wenn Sie schon fest sind, sonst nimm eine aus dem allgemeinen Vorrat). Besorge Dir eine Platte mit Bakterienkolonien (steht auf dem Tisch). 2. Beschriftet die Petrischale wie oben auf dem Boden. (V1-Datum-3-Strich-Ausstrich) 3. Stelle Dir alle Materialien bereit, die Du brauchst. Entzünde den Bunsenbrenner. Sterilisiere eine Impföse. 4. Nimm ein kleines Reaktionsgefäß und fülle mit der Pipette vier Tropfen 0,9%ige Kochsalzlösung hinein. 5. Nimm eine Kolonie mit der Impföse auf und verteile sie gründlich in dem Tropfen Kochsalzlösung im Reaktionsgefäß. Du hast jetzt eine Flüssigkultur hergestellt. 6. Nimm etwas Bakterienflüssigkultur mit der Impföse auf (die Öse sollte innen benetzt sein) und verteile sie wie in nebenstehender Abbildung dargestellt. 7. Beginne bei A und macht drei parallele Striche mit der Impföse 8. Sterilisiere anschließend die Impföse durch Ausglühen und warte bis sie abgekühlt ist. 9. Mache nun drei weitere parallele Striche (s. Abb.) – nehmt KEINE neue Kultur auf. Wichtig: achtet auf die Überlappung der einzelnen Striche (Abbildung!!) 10. Schließe die Petrischale. Drehe sie nach den Schritten A-D auf den Deckel und stelle sie in den Brutschrank. Besorge Dir eine Platte vom Vortag und schaue Dir an, wie ein bewachsener DreiStrich-Ausstrich aussieht. 8 Kontrolliere die Impföse auf Bakterienreste! Wenn noch welche zu sehen ist, drehe die Impföse weiter in der Flüssigkeit Mikrobiologie 1- Grundsätze für mikrobiologisches Abreiten Nachweis von Mikroorganismen in der Luft Die Luft die uns umgibt ist voller Mikroorganismen, auch wenn man einzelne Individuen mit bloßem Auge nicht sehen kann. Man kann aber Bakterien auch ohne Mikroskop sehen, wenn man ihnen einige Zeit zum Wachstum gibt. Sie bilden Kolonie, mit vielen Millionen von Einzelindividuen, die charakteristische Farben und Formen haben. Dadurch kann man viele Bakterien vorläufig identifizieren. Bakterien sind schwerer als Luft, das macht es sehr einfach sie zu „sammeln“ in dem man Nährboden an Stellen aufstellt, deren Bakterienvielfalt man kennen lernen möchte. Beimpfen der Platten Definitionen: Beimpfen: Behandeln einer Lösung durch Einbringen von Keimen Inkubation: [v. lat. incubare: in (oder auf) etwas liegen] die Bebrütung, entwicklungsfördernde Erwärmung v.a. von Zellen und Organismen Material: Agarplatten, Folienstifte, Stoppuhr Versuchsablauf Bemerkungen Vorarbeiten: Überlegt Euch einen Platz dessen Luft-Bakterien“belastung“ ihr untersuchen wollt (z.B. im Abzug, auf der Fensterbank (außen, innen), Arbeitstisch, etc. (eigene Ideen!)). z.B. Besorgt euch drei Agarplatten (selbstverständlich könnt ihr eure selbst gegossenen nehmen, wenn Sie schon fest sind, sonst nehmt welche aus dem allgemeinen Vorrat). Beschriftet drei Agarplatten auf der Unterseite der Petrischale mit einem Folienstift. Bitte immer am Rand beschriften!!! Zu notieren sind: - der Versuch (Nw von Luftkeimen) - das Datum, an dem die Platte beimpft worden ist - Standort (z.B. Tisch innen, Boden, Fensterbank,…) - Expositionszeit (30, 60 und 90 min, s. unten). 1. Stellt alle drei Agarplatten an dem ausgesuchten Platz auf. 2. Öffne die Agarplatten gleichzeitig und starte den Countdown auf der Stoppuhr. Verschließe nach 30, 60 und 90 min die jeweilige Agarplatte (Beschriftung!). Bereite die Stoppuhr vor! 3. Zum Abschluss drehe die Agarplatten um, mit Deckel nach unten und Boden nach oben. 4. Gib die fertig beschrifteten Agarplatten in den Brutschrank. Die Platten werden dann bei 30 °C für 2-3 Tage inkubiert (bebrütet). Stelle die drei Petrischalen in einem Stapel auf. Frage: 1. Wie entsteht eine Kolonie von Keimen auf der Agarplatte? Begründe! 9 Mikrobiologie 1- Grundsätze für mikrobiologisches Abreiten Auswertung inkubierter Platten Die von euch gesammelten Luftkeime müssen erst so wachsen, dass man sie in Form einer Kolonie mit dem Auge erkennen kann. Dazu werden die Platten im Brutschrank für min. 24 Stunden inkubiert. Das Wachstum von Keimen auf Agarplatten resultiert in der Bildung von Kolonien, die ein ganz verschiedenartiges Aussehen haben können. Diese Kolonien-Morphologie ist oft sehr charakteristisch für entsprechende Bakterien und kann zur groben Identifizierung einen ersten Anhaltspunkt bieten. ACHTUNG!!! Bitte achte darauf, dass du die inkubierten Agarplatten vor der Auswertung sorgfältig am Rand mit Tesafilm zuklebst. Es könnten sich eventuell pathogene Keime in größerer Menge gebildet haben und dich infizieren! Materialien: Tesafilm, bewachsene Platten der Vorgruppen, Farbatlas der Mikrobiologie Arbeitsgang Bemerkungen 1. Besorge dir einen bebrüteten Ansatz eines bestimmten Standortes und notiere Datum und Versuch. Verschließe die Platten bevor du sie auswertest, indem du den gesamten Rand mit Tesafilm umklebst, wenn das nicht schon geschehen ist. 2. Beurteile und beschreibe anhand der Tabelle auf der übernächsten Seite, die Morphologie der entstandenen Kolonien. Lege dazu die bewachsenen Platten auf den Leuchttisch. 3. Skizziere die verschiedenen Kolonien einer wenig bewachsenen Agarplatte und versuche mit Hilfe des Farbatlas die Bakterienkolonien zu benennen. Hilfestellung: Luftkeime können sein: Bakterien: Micrococcus luteus (goldgelb), M. roseus (rot) Bacillus myocides, Bacillacea Corynebacterium Mycobacterium Streptomyces Nocardia, Rhodococcus (rot) Pilze: Rhodotorula (roter Hefepilz) Aspergillus niger (Gießkannenschlimmel) Mucor mucedo (Köpfchenschimmel) Alternaria Penicillium sp. (Pinselschimmel) - Cladosporium Skizze: 4. Vervollständige einige Zeilen der Tabelle auf der nächsten Seite 10 Mikrobiologie 1- Grundsätze für mikrobiologisches Abreiten Beispiele für gebräuchliche Umschreibungen: Größe: nadelkopfgroß, pfenniggroß, klein, …. Rand: glatt, zackig, samtig, … Farbe: elfenbeinfarben, weiß, durchsichtig, gelb, … Form: rund, unregelmäßig, kugelig, flach,… Expositionszeit und Standort Anzahl Kolonien Größe Farbe 11 Verlauf des Randes Formen Mikrobiologie 2- Färbung von Bakterien 2 - Unterscheidung von Bakterien durch Färbung Neben vielen anderen Untersuchungsmethoden von Bakterien gibt es ein gängiges Färbeverfahren, mit dem es möglich ist, Bakterien unter dem Mikroskop zu unterscheiden. Die Gram-Färbung ist nach dem dänischen Arzt und Bakteriologen HANS CHRISTIAN GRAM benannt, der sie ca. Ende des 19. Jahrhunderts entwickelte. Verschiedene Bakterien reagieren auf diese Färbung unterschiedlich. So kann man eine Einteilung in so genannte Gram-positive Bakterien, die violett/blau erscheinen, und Gram-negative Bakterien, die rot gefärbt werden, ableiten. „Dies ist ein wichtiges Kriterium für die Unterscheidung verschiedener Bakterien z.B. bei der Diagnostik von Infektionskrankheiten. “Gram-positive" und "Gram-negative" Bakterien reagieren unterschiedlich auf Antibiotika. Mit dieser schnellen diagnostischen Methode kann man in kurzer Zeit (ca. 5 Minuten) anhand eines Abstriches das "Gramverhalten" der Bakterien bestimmen. Damit hat man die Möglichkeit, sofort mit einer antibiotischen Therapie zu beginnen bevor das Ergebnis der oft mehrere Tage dauernden definitiven Keimbestimmung vorliegt.“ ACHTUNG!!!! Beim Färben Handschuhe tragen, um Kontakt mit den Farbsubstanzen zu vermeiden. Farbspritzer auf den Tischen bitte sofort mit einem feuchten Papiertuch abwischen!!! Material: Objektträger, Deckgläser, Pinzette, Tropfpipette, Impföse, Bunsenbrenner, bewachsene Agarplatte mit apathogenen Bakterienstämmen (z.B. E. coli K12 , B-Staphylokokken, etc.), Färbelösungen Chemikalien: dest. Wasser Versuchsablauf Bemerkungen 1. Reinige die Objektträger mit Alkohol (Entfetten). 2. Ziehe den entfetteten Objektträger 2-3-mal kurz durch die Flamme des Bunsenbrenners. Achtung! Entfettete Schichtseite beachten 3. Lege den Objektträger über die Färbeschale und gib einen Tropfen Wasser darauf (dafür gibt es eine spezielle Tropfflasche!!) Die Färbeschale ist grau mit Glasstangen auf die die Objektträger gelegt werden können. 4. Entnimm mit der ausgeglühten Impföse etwas Material einer Bakterienkultur (von einer Kolonienplatte) und vermische das Material mit dem Wassertropfen auf dem Objektträger. 5. Verteile den Wassertropfen auf eine größere Fläche (ca. 10 x 20 mm) und erwärme den Objektträger vorsichtig an der Rückseite, damit das Wasser schneller verdampft. Nicht zu stark erhitzen!!! Wedeln beschleunigt das Eintrocknen! Dabei immer aus der Flamme rein und raus nehmen! 6. Ziehe den Objektträger mit der Schichtseite nach oben einige Male SCHNELL durch die Bunsenbrennerflamme. Das Glas darf nur handwarm werden, ansonsten ist das Präparat beschädigt und nicht mehr brauchbar!) 7. Lege die hitzefixierten Präparate über die Färbeschale. Behandelte Seite nach oben! 8. Gib nur zwei Tropfen Kristallviolett-Lösung auf die Oberfläche und betätige die Stoppuhr. Bereite die Stoppuhr vor! 9. Spüle die Kristallviolett-Lösung nach einer Minute mit LugolscherLösung ab und warte zwei Minuten. 10. Tropfe anschließend Alkohol langsam auf den gefärbten Ausstrich, lass den Alkohol einwirken und kipp den Alkohol ab. Dies wird solange wiederholt, bis keine Farbwolken mehr vom Präparat abgehen. 12 ACHTUNG: beim Abwaschen, nie die Spitze der Tropfflasche in die Flüssigkeit eintauchen – Verschmutzungsgefahr! Mikrobiologie 2- Färbung von Bakterien 11. Gib jetzt 3-4 Tropfen Safranin-Lösung hinzu und spüle nach einer Minute mit dest. Wasser. 12. Trockne die Rückseite des Objektträgers. Überschüssiges Wasser auf der Schichtseite wird vorher durch Absaugen mit Papier entfernt! 13. Untersuche die gefärbten Bakterien unter dem Mikroskop auf ihr Farbverhalten und vergleiche sie mit den Abbildungen von Bakterien im Farbatlas der Mikrobiologie (s. Seite 78!). Hole Dir am Mikroskop das erste Mal einen Kursbetreuer zur Hilfe. Auswertung: Beschreibe die Form und die Gram-Färbung deiner Präparate! 13 Mikrobiologie 3- Färbung von Sporen 3 - Färbung von Sporen Manche Bakterienarten sind in der Lage Sporen zu bilden, d.h. es entsteht ein Entwicklungsstadium, das der Verbreitung, der ungeschlechtlichen Vermehrung oder der Überdauerung dient. Material: Objektträger, Deckgläser, Pinzette, Tropfpipette, Impföse, Bunsenbrenner, bewachsene Agarplatte mit apathogenen Bakterienstämmen (z.B. E. coli K12 , B-Staphylokokken, etc.) Chemikalien: dest. Wasser Versuchsablauf Bemerkungen Es ist schon folgendes vorbereitet: 1. Eine Färbeküvette in einer Schale mit Glasstücken, die bereits auf ca. 90°C erhitzt ist. Die Küvette ist mit Malachitgrün gefüllt, der Farbstoff, der für die Sporenfärbung dient.. 2. Reinige einen Objektträger mit Alkohol (Entfetten). 3. Ziehe den entfetteten Objektträger 2-3-mal kurz durch die Flamme des Bunsenbrenners. Achtung! Entfettete Schichtseite beachten 4. Besorge Dir eine Bakterienflüssigkultur. 5. Verteile mit der ausgeglühten Impföse Material einer dichten Bakterienflüssigkultur. Markiere die Oberseite mit einem Bleistift auf dem Schliff. Markiere am besten so, dass Du erkennen kannst wo oben und unten ist… 6. Verteile den Wassertropfen auf eine größere Fläche (ca. 10 x 20 mm) und erwärme den Objektträger vorsichtig an der Rückseite, damit das Wasser schneller verdampft. Nicht zu stark erhitzen!!! Bewege den Objekträger immer wieder aus der Flamme, damit er nicht bricht! Wedeln beschleunigt das Eintrocknen! 7. Ziehe den Objektträger mit der Schichtseite nach oben einige Male SCHNELL durch die Bunsenbrennerflamme. Das Glas darf nur handwarm werden, ansonsten ist das Präparat beschädigt und nicht mehr brauchbar!) 8. Kontrolliere mit dem Thermometer die Temperatur der Malachitlösung. Sie soll bei mind. 85°C sein. Stelle den Objektträger mit Hilfe einer Pinzette in die Küvette. Inkubiere für 10-15 Minuten. FÄRBUNG 9. Nimm den Objektträger anschließend heraus und spüle ihn über der Wanne mit destilliertem Wasser ab. SPÜLEN 10. Lege das Präparate über eine Färbeschale / Petrischale. Gib 3-4 Tropfen Safranin-Lösung darauf, so dass das Präparat bedeckt ist. GEGENFÄRBUNG 11. Schütte die Färbelösung nach ca. 2 Min. ab und spüle kurz mit destilliertem Wasser nach. Wische die Unterseite des Präparats und die Ränder mit einem Tuch sauber. ACHTUNG: beim Abwaschen, nie die Spitze der Tropfflasche in die Flüssigkeit eintauchen – Verschmutzungsgefahr! 12. Untersuche das gefärbte Präparat unter dem Mikroskop. Sporen erkennst Du an einer grünen Färbung, vegetative Zellen dagegen sind rot gefärbt. < 14 Mikrobiologie 4- Bakterien am Körper, Hygieneregeln, Abklatschplatten 4- Nachweis von Keimen am Körper Material: sterile Wattestäbchen, drei Agarplatten Chemikalien: steriles Wasser Im folgenden Versuch geht es darum zu untersuchen, an welchen Körperstellen sich verschiedene Keime befinden. Zum Beispiel befinden sich auf der Haut je nach Region unterschiedlich viele Keime: So wachsen am Rücken etwa 1.000 Keime pro Quadratzentimeter, unter den Achseln dagegen, wo es viel feuchter ist, etwa 100.000. Auf jeden Fall wachsen die Keime unserer Hautflora so dicht, dass sie uns vor schädlichen Keimen wie zum Beispiel dem Eitererreger Streptococcus aureus schützen. Diese Keime sind zwar in geringer Anzahl auf der Haut vorhanden, haben aber keine Chance, sich zu vermehren. Versuchsablauf Bemerkungen 1. Besorge dir eine Agarplatte und teile sie auf der Unterseite mit dem Folienstift in drei gleich große Felder ein. Beschrifte sie am Rand mit Datum und Versuch. 1. Ausstrich 2. Ausstrich 2. Entscheide dich für drei Körperregionen deren Keimzahl du untersuchen willst. 3. Feuchte ein steriles Wattestäbchen mit sterilem Wasser an (nicht triefend nass machen!) und streiche über die entsprechenden Körperregionen. 3. Ausstrich 4. Berühre das entsprechende Drittel der Agarplatte mit dem beimpften Wattestäbchen und streiche in Zick-Zick-Linien über die Agaroberfläche ohne den Agar zu beschädigen (s. Skizze) 5. Wiederhole die Prozedur (3 und 4) für die beiden anderen Proben. 6. Verschließe die Petrischale anschließend und drehe sie auf den Deckel. 7. Bringe die fertig beschrifteten Agarplatten zum Brutschrank. Die Agarplatten werden dann 24 Stunden bei 37°C bebrütet. 8. Besorge dir die schon bereitgestellten, bebrüteten Versuchsansätze der Vorgruppen und verschließe sie, indem du den gesamten Rand mit Tesafilm umklebst, falls das noch nicht geschehen ist. Werte nach folgenden Gesichtspunkten aus! • Zähle die Anzahl der Kolonien. • Vergleiche die Anzahl in unterschiedlichen Körperregionen. • Schaue dir an wie die Kolonie aussehen (Kolonien-Morphologie). Fragen: 1. Nenne die Hauptfunktion, die Bakterien der menschlichen Haut verleihen! 2. Wovon ernähren sich die Bakterien auf der Hautoberfläche? 3. Die Hauptgruppe der auf der menschlichen Haut vorkommenden Bakterien sind Milchsäurebakterien. 3 a) Erläutere die Aufgabe und Wirkung der Milchsäurebakterien auf der Körperoberfläche! 3 b) Wie nennt sich der dünne, saure Film, der die Haut überzieht? Bitte umblättern! 15 Mikrobiologie 4- Bakterien am Körper, Hygieneregeln, Abklatschplatten Hygieneregeln Material: sterile Wattestäbchen, Agarplatte Chemikalien: steriles Wasser Versuchsablauf 1. Nimm dir eine Agarplatte und beschrifte sie am Rand mit Datum und Versuch. Zeichne auf der Rückseite mit dem Folienstift ein Kreuz, um die Platte in vier Bereiche einzuteilen. 2. Beschrifte die vier Bereiche mit den Versuchsparametern, die durchgeführt werden (siehe Punkt 3) 3. Führe vier Fingerabdrücke (vorsichtiges Berühren) in folgenden Zuständen durch: - ungewaschen - gewaschen, nicht getrocknet - abgetrocknet - anschließend desinfiziert Nimm dabei immer den selben Finger (z.B. rechter Daumen) 4. Bringe die fertig beschrifteten Agarplatten zum Brutschrank. Die Agarplatten werden dann von uns 24 Stunden bei 37 °C bebrütet. 5. Wasche dir nach dem Versuch die Hände! 6. Besorge dir die schon bereitgestellten, bebrüteten Agarplatten der Vorgruppen dieses Versuches und verschließe sie, indem du den gesamten Rand mit Tesafilm umklebst, wenn das noch nicht geschehen ist. Was fällt Dir auf der gewachsenen Bakterienplatte auf? Leite aus deinen Ergebnissen für den Alltag nützliche und sinnvolle Hygieneregeln ab! 16 Mikrobiologie 5 – Genetische Transformation von Bakterienzellen 5 - Genetische Transformation von Bakterienzellen Genetische Manipulation von Bakterienzellen Die Gentechnologie oder Gentechnik beschäftigt sich mit der im Reagenzglas durchgeführten Verknüpfung von NukleinsäureMolekülen zu neuen, vermehrbaren Molekülen, der Einführung solcher Moleküle in einen Empfängerorganismus mit Hilfe eines Vektors* und der Vermehrung der neukombinierten Moleküle in diesem Organismus. Etliche Produkte, die für den Menschen interessant sind (z.B. Insulin, Vitamine), werden von der einschlägigen Industrie mit Hilfe genmanipulierter Bakterien hergestellt. Für den medizinischen Bereich werden heute schon viele Medikamente gentechnisch produziert. In der Landwirtschaft werden Nutzpflanzen gentechnisch „optimiert“. Dabei werden z. B. Resistenzen gegen Pestizide oder Resistenzen gegen „Schädlinge“ eingebaut. Es gibt aber auch erste Ansätze Pflanzen mit verbesserten Ölen (z. B. Raps) oder erhöhten Vitaminkonzentrationen (beispielsweise der sog. „Golden Rice“) mit Hilfe der Gentechnik herzustellen. Mit Methoden der Gentechnik greift man auch seit einigen Jahren direkt in die Erbanlagen des Menschen ein mit dem Ziel, das Wirken krank machender Gene zu korrigieren (Gen-Therapie). Je nachdem, an welcher Art Zellen die Therapie durchgeführt wird, unterscheidet man „somatische Gen-Therapie“ (die „Reparatur“ erfolgt an Körperzellen [Körper = „soma“] eines bereits geborenen Menschen) und „Keimbahn-Gen-Therapie“ (hier wird das Erbgut von Ei- oder Samenzellen bzw. von Embryonen verändert). Es ist nüchtern festzustellen, dass trotz erheblicher Bemühungen in der Forschung bisher keine positiven Behandlungsergebnisse vorliegen, die eindeutig der Gentherapie zuzuordnen wären. *In der Gentechnologie versteht man unter einem Vektor ein Transportvehikel zur Übertragung einer Fremd-Nukleinsäure (oft DNA) in eine Empfängerzelle. Als Vektoren werden meist Plasmide verwendet. Plasmide sind kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die neben der DNA des "Bakterienchromosoms" innerhalb einer Bakterienzelle vorliegen können. Sie enthalten normalerweise ein oder zwei Gene, die für das Wirtsbakterium einen selektiven Vorteil (z.B. eine Antibiotika-Resistenz) bedeuten. Schematische Darstellung der somatischen Gentherapie Aus dem kranken Organ werden teilungsfähige Stammzellen entnommen. Im Zellkern dieser Zellen befindet sich die „fehlerhafte“ Erbsubstanz (siehe 1). Die gesunde Erbsubstanz, z.B. ein Gen, das den Organzellen zur ordnungsgemäßen Erfüllung ihrer Aufgaben fehlt, wird separat bereitgestellt (Entnahme aus gesunden Zellen eines anderen Menschen oder künstliches Zusammensetzen im Labor). Das gesunde Gen wird nun in einen Virus „eingepackt“ (siehe 2), bei dem die eigenen krankmachenden Eigenschaften entfernt wurden, das aber noch in menschliche Zellen eindringen und in ihrem Inneren sein mitgeführtes Erbgut abladen kann. Mit einem derart veränderten Virus infiziert man nun die kranken Körperzellen des Patienten. Das „eingebaute“ gesunde menschliche Gen wird ins Innere der Zelle eingeschleust und kann dort die gewünschte Funktion aufnehmen (siehe 3). Die „reparierten“ Zellen mit dem „verbesserten“ Erbgut werden in das kranke Organ zurückgebracht. Dort können sie sich durch Zellteilung vermehren und die gewünschte Funktion ausüben (siehe 4). Es besteht eine weitere Möglichkeit der Gen-Übertragung – der Einbau erfolgt direkt im Körper: Nach diesem zweiten Wirkprinzip werden dem Körper des Patienten keine Zellen entnommen, sondern die gentechnische Veränderung findet gewissermaßen direkt „vor Ort“ in seinem Organismus statt. Man kann z.B. Viren, denen die gewünschte Erbanlage eingepflanzt wurde und die auch hier den Transport übernehmen, direkt in den Körper einbringen (z.B. über eine Injektion in die Blutbahn bzw. direkt in ein erkranktes Organ, oder Transport über ein AerosolSpray in die Atemwege). Durch Infektion einer ausreichenden Zahl kranker Zellen und eine Veränderung ihres Erbgutes könnte hier eine Verbesserung des Gesundheitszustandes eintreten. 17 Mikrobiologie 5 – Genetische Transformation von Bakterienzellen Versuch: Genetische Transformation von Bakterienzellen Genetische Transformation von Zellen wird in vielen verschiedenen Bereichen der Biotechnologie angewendet. Zum Beispiel werden in der Landwirtschaft anhand von genetischen Zelltransformationen die Eigenschaften der Pflanzen gegen Schädlinge, Frost oder Dürre verändert. Im Folgenden Versuch wird mittels des pGLO-Plasmids (Kartierung s. S. 31) das GFP-Gen (green fluorescent protein) in E. coli –Zellen eingebracht. Wenn Arabinose im Medium vorhanden ist wird das GFP-Gen exprimiert und es entsteht das GFP, welches unter UV-Licht grün fluoresziert. Zusätzlich trägt der pGLO-Plasmid noch ein Resistenz-Gen für Ampicillin ampr. Dies dient dazu die transformierten Bakterienzellen aus einer Milliardenpopulation auszusuchen, d.h. wenn ein Bakterium das Plasmid aufgenommen hat, dann besitzt es die Resistenz gegen Ampicillin und kann somit auf einem ampicillinhaltigen Nährboden wachsen (Selektion). Eine ausführliche Beschreibung des Veruchs befindet sich auf Seite 31! Definitionen: GT: Gentechnische Veränderung einer Zelle durch Aufnehmen oder Einschleusen einer fremden DNA. Gene können aus einer menschlichen, tierischen oder pflanzlichen DNA herausgeschnitten werden und zur Transformation in einer Bakterienzelle eingesetzt werden. Als Transformationszelle ist am Besten ein Einzellorganismus geeignet, da nur eine Zelle die neuen Gene aufnehmen muss. Eine erfolgreiche Transformation hat eine gentechnisch veränderte Zelle zum Ergebnis. Plasmid: In Bakterien vorkommenden ringförmige DNA-Moleküle. Plasmide existieren zusätzlich zur Erbinformation des Hauptchromosoms. Sie sind für die Zelle nicht unbedingt notwendig, enthalten aber Gene die für die Bakterien ein Vorteil darstellen können; z. B Gene für Antibiotika- Resistenz Tube: Eppendorf- Röhrchen Material: Agarplatten, Impföse, Drygalskispatel, sterile Pipetten, Eppendorf Röhrchen, UV-Lampe, Wasserbad, Eisbad Chemikalien: vorbereitete E.coli Platten, Transformationslösung oder steriles Wasser, Plasmid DNA Versuchsablauf Bemerkungen 1. Beschrifte zwei Reaktionsgefäße mit dem Folienstift jeweils mit „+Plasmid“ und „–Plasmid“ und Deinem Gruppennamen (auf dem Deckel und der Seite) und stelle sie in den Ständer. Eisbad zurechtstellen! 2. Mit einer Pipette wird 250 µl Transformationslösung (TL) zu beiden Reaktionsgefäßen hinzu pipettiert. Laß Dir von einem Betreuer die Pipetten erklären. 3. Nimm eine Impföse und flamme sie über dem Bunsenbrenner ab (s. Versuch 1) Entnehme nun mithilfe der Impföse eine Bakterienkolonie aus der E. coli – Platte und rühre sie in je ein Reaktionsgefäß ein. Dazu muss man die Impföse zwischen Zeigefinger und Daumen drehen. Anschließend gut durchmischen (Vortexer)!!! Vor Aufnehmen einer Bakterienkolonie aus der E.coli Platte hält man die Öse kurz in den Nährboden am inneren Rand der Platte um die Kolonien bei Abnahme nicht durch die noch glühende Öse zu zerstören. 4. Gib 4µl Plasmid-Lösung (vom Betreuer holen!) in das Reaktionsgefäß, das mit „+Plasmid“ beschriftet ist. Das Reaktionsgefäße „–Plasmid“ wird nicht mit Plasmid DNA bestückt. Anschließend gut durchmischen!!! 5. Die Reaktionsgefäße werden für 10 min auf Eis inkubiert. Stelle sicher, dass der Boden des Reaktionsgefäßes im Eis liegt/steht. Während ihr wartet könnt ihr versuchen die Fragen zwei, bzw. drei Seiten weiter zu beantworten. 18 Bei einer Temperatur von ca. 4°C kann sich die Plasmid DNA um die zu transformierenden Zellen anlagern. Mikrobiologie 5 – Genetische Transformation von Bakterienzellen 6. Während die Reaktionsgefäße auf Eis stehen, beschrifte die bereitgestellten Agarplatten auf der Unterseite wie folgt: Agarplatten: LB / amp LB/amp/ara Beschriftung: + Plasmid - Plasmid + Plasmid Bereite ein Wasserbad mit einer genauen Wassertemperatur von 42°C vor! amp = Ampicillin (Antibiotika) ara = Arabinose (Zuckerart) LB = Nähragar LB (Normale LB Agarplatte) - Plasmid Überlege dir den Sinn und Zweck der Auswahl von diesen Agarplatten! 7. Nach den 10 min werden die Reaktionsgefäße vom Eis für 50 Sekunden im Wasserbad bei 42 °C einem Hitzeschock ausgesetzt, um dann wieder für weitere 2 min. auf Eis platziert zu werden. Danach stelle die Reaktionsgefäße einfach in den Ständer am Arbeitstisch. 8. Pro Reaktionsgefäße 250 µl LB - Nährlösung zugeben, vortexen und 10 min bei Zimmertemperatur inkubieren. Während ihr wartet könnt ihr euch schon einmal die Platten der Vorgruppe anschauen!! Bitte UV-Brille aufsetzen! Durch den Hitzeschock erfolgt die eigentliche Transformation. Durch die abrupte Temperaturveränderung wird die Zellwand soweit gedehnt damit Plasmid-DNA ungehindert eindringen kann. Bei der Lagerung auf Eis zieht sich die Zellwand wieder zusammen. In der Nährlösung bei Zimmertemperatur können sich die Zellen regenerieren. 9. Mit der Pipette 100 µl aus dem „+Plasmid“ – Reaktionsgefäß einmal auf die LB/amp-Platte und einmal auf die LB/amp/ara– Platte (achtet auf euere Beschriftung) pipettieren. Anschließend mit dem Drigalski-Spatel kreisförmig auf der Platte verteilen (falls Du Versuch 1 noch nicht gemacht hast, lies bei „Flächenausstrich nach, wie das geht). Genauso auch je 100 µl aus dem „–Plasmid“ – Reaktionsgefäße auf die beschrifteten Platten pipettieren. Wieder mit dem Drigalski-Spatel verteilen. 10. Platten mit Boden nach oben übereinander stapeln und bei 37 °C bis zum nächsten Tag inkubieren. 11. Hole Dir die bereits bebrüteten E.coli- und Plasmid-Platten vom Vortag und werte mit Hilfe der UV-Lampe unter dem Karton aus (falls Du es noch nicht getan hast). 12. Versuche die Fragen auf der folgende Seite zu beantworten (falls Du es noch nicht getan hast). 19 Nur mit Betreuer! Schutzbrille tragen! Mikrobiologie 5 – Genetische Transformation von Bakterienzellen Schematischer Überblick zur Transformation Kartierung des pGLO-Plasmids Quelle: Biotechnology Explorer, Bio-Rad AUSWERTUNG / Fragen: 1.a) Beschreibe die E.coli Kolonien auf der „Ausgangsplatte“: Anzahl Kolonien: Farbe Kolonien: Verteilung der Kolonien: 1.b) Beschreibe ob und warum ein unterschiedlicher Bewuchs der E.coli Zellen auf LB Platten im Vergleich zu den mit Antibiotika versetzten Platten stattfindet? 20 Mikrobiologie 5 – Genetische Transformation von Bakterienzellen 2. Welche der pGLO Platten sind bewachsen? Notiere in folgender Tabelle! Platten Kolonien (+/-) Farbe der Bakterien Fluoreszenz (+/-) +Plasmid, LB/amp + Plasmid, LB/amp/ara - Plasmid, LB/amp - Plasmid, LB 3. Beschreibe woran man erkennen kann, dass die genetische Transformation von Zellen erfolgreich war. 4. Welche Eigenschaften die Du bei E.coli Kolonien unter Frage 1 beobachtet hast haben sich durch die Transformation nicht verändert? Beobachte zur Beantwortung der Frage die +pGLO LB/amp/ara Platte. 5. Welche Eigenschaften der E.coli Bakterien haben sich nun nach der Transformation geändert? 6. Wie kann man feststellen, ob ein Bakterium Antibiotikaresistent ist oder nicht? 21 Mikrobiologie 6 – Identifikation von Bakterien 6 - Identifikation von Bakterien Individuen von Mikroorganismen sind mit bloßem Auge nicht sichtbar. Auch wenn Bakterien auf Agarplatten oder in Flüssigmedium gewachsen sind, kann man sie sehr nur ansatzweise identifizieren. Im Labor gibt es sehr viele Methoden, wie man Eigenschaften von Bakterien untersuchen und damit Rückschlüsse auf ihre Identität ziehen kann. Einige könnt hier selber durchführen. Nachweis von Cytrochromoxidase Cytochromoxidase ist in der Natur ein sehr weit verbreitetes Enzym. Enterobakterien (als z.B. E.coli) besitzen keine Cytocjromoxidase, viele andere Bakterien dagegen schon. Versuchsablauf Bemerkungen 1. Besorge Dir ein Platte mit E. coli Kolonien. Die Farbreaktion beruht auf einer Reaktion des Cytochromoxidase/Cytochrom-cSystems mit dem sog. NaDi-Reagenz, das das Kondensationsmolekül Inophenolblau bildet. 2. Entzünde den Bunsenbrenner (hole einen Kursbetreuer zur Hilfe, wenn Du hier dem Bunsenbrenner das erste Mal begegnest). 3. Fülle 1 ml 0,9%ige Kochsalzlösung in ein kleines Reaktionsgefäß. 4. Glühe die Impföse mit dem Glashalter aus, in dem Du sie mit der Spitze in die rauschende Flamme hältst (siehe Abbildung rechts). 5. Schabe mit der Impföse eine Kolonie ab und löse sie in der Kochsalzlösung auf, so das möglichst wenig Material an der Impföse zurückbleibt. 6. Entnimm ein Teststäbchen aus dem Röhrchen auf dem Oxidasetest steht. Achtung nicht die Reaktionsfläche berühren. 7. Tauche die Impföse in deine Bakteriensuspension und verreibe die Flüssigkeit auf der Reaktionsfläche. 8. Nach 20 bis 60 Sekunden verfärbt sich die Reaktionsfläche. Vergleiche das Ergebnis mit der Skala auf dem Röhrchen. Notiere Dein Ergebnis E. coli: 9. Besorge Dir nun eine Platte mit M. luteus und verfahre genau so. Notiere Dir wieder dein Ergebnis. M. luteus: Katalasetest Katalase spaltet toxisches Wasserstoffperoxid Das Enzym Katalase spaltet H2O2 zu H2O und O2. Es spielt eine wichtige Rolle in den Bakterienzellen, indem es das im Stoffwechsel angehäufte Wasserstoffperoxid "entgiftet". Der Test auf Katalase eignet sich besonders zur Differenzierung von gram-positiven Bakterien. Versuchsablauf 1. Besorge Dir eine Bakterienplatte mit Einzelkolonien aus dem Brutschrank. 2. Nimm einen Objektträger und tropfe darauf einen Tropfen Katalasetest-Lösung. 3. Entzünde den Bunsenbrenner und glühe eine normale Impföse (nicht die mit dem Glashalter) aus, in dem Du sie mit der Spitze in die rauschende Flamme hältst. 4. Schabe mit der Impföse eine Kolonie von der Agarplatte und verteile sie in dem Tropfen, so dass möglichst 22 Mikrobiologie 6 – Identifikation von Bakterien wenig Material an der Impföse zurückbleibt. 5. Beobachte den Tropfen, wenn Bläschen aufsteigen, ist die Bakterienkolonie Katalasepositiv. 6. Versuche den Test mit einer weiteren Bakterienplatte Indoltest Der IMViC-Test dient zur Unterscheidung der coliformen Keime E. coli und Enterobacter (Routinetest in der Praxis - nur E. coli ist der Indikator für Fäkalverunreinigungen; eine einwandfreie Unterscheidung beider Keime ist daher wichtig). Versuchsablauf 1. Besorge Dir eine Übernachtkultur von E. coli. 2. Fülle mit der Einmalpipette 1 ml E.coli Kultur in ein Reagenzglas (Achtung: den Kolben mit der Flüssigkultur vorher schütteln, Bakterien setzen sich unten in der Flasche ab). 3. Überschichte die Bakterienkultur mit 10 Tropfen Indolreagenz. 4. Innerhalb von 1-2 Minuten sollte eine Rotfärbung zu sehen sein. 5. Entsorge den Inhalt des Reagenzglases in die Abfallflasche. Bringe das Reagenzglas in den Waschkorb am Waschbecken. Hygienetest Hier wird eine Methode zur Überprüfung der allgemeinen Sauberkeit von Oberflächen vorgestellt. Auf sichtbaren sauberen Oberflächen kann der Test die Anwesenheit geringster Mengen an Mikroorganismen entdecken, die mit dem bloßen Auge nicht sichtbar sind. Dabei werden Inhaltsstoffe in Mikroorganismen nachgewiesen, die im Teststreifen eine Farbreaktion hervorrufen. Versuchsablauf 1. Nimm Dir einen Teststreifen und öffne die Verpackung an der farbigen Linie. Nie die Testzone berühren! Die Verpackung nicht wegschmeißen, sie wird noch gebraucht! 2. Tropfe einen Tropfen von Reagenz A auf die Testzone des Teststreifens. . Bitte Flasche A sofort wieder verschließen. Deckel gut zuschrauben. 3. Zur Probenentnahme von der Oberfläche: Drücke die gesamte Testzone auf die Oberfläche auf und ziehe das Teststäbchen dann ca. 30 cm über die Testfläche. Bei rauen Oberflächen kannst Du die Testzone auch mehrmals aufdrücken. 4. Tropfe einen Tropfen von Reagenz B auf die Testzone des Teststreifens. Bitte Flasche B sofort wieder verschließen. Deckel gut zuschrauben. 5. Tropfe einen Tropfen von Reagenz C auf die Testzone des Teststreifens. Bitte Flasche C sofort wieder verschließen. Deckel gut zuschrauben 6. Stecke den Teststreifen mit der Testzone voran in die Folienverpackung. Lasse es so 4-5 Minuten im Dunklen liegen. 7. Nimm den Streifen aus der Folie: eine gelbe Farbe der Testzone zeigt einen sauberen Zustand an. Rosablauviolette Färbung deutet auf schmutzige Oberflächen hin. 23 Mikrobiologie 6 – Identifikation von Bakterien 8. Du kannst jetzt versuchen eine schmutzige Oberfläche mit Alkohol zu reinigen und den Test wiederholen. KOH Test (Gram) Das ist eine sehr schnelle Methode um zu entscheiden ob Bakterien gram-positiv oder –negativ sind, ohne sie zu färben (vergleiche Versuch 2). 1. Besorge Dir eine Bakterienplatte mit Einzelkolonien. 2. Nimm einen Objektträger und tropfe darauf einen Tropfen KOH-Lösung. 3. Entzünde den Bunsenbrenner und glühe eine Impföse (nicht die mit dem Glashalter) aus, in dem Du sie mit der Spitze in die rauschende Flamme hältst. 4. Schabe mit der Impföse eine Kolonie von der Agarplatte und verteile sie in dem Tropfen, so dass möglichst wenig Material an der Impföse zurückbleibt. 5. Versuche nun mit der Impföse Fäden zu ziehen. Wenn sich Fäden ziehen lassen ist das Bakterium gramnegativ. Keine Fadenbildung bedeutet grampositiv. (Hinweis: E.coli ist gram-negativ). 24 Mikrobiologie 7 – Wachstum von Bakterien 7 - Wachstum von Bakterien Die Vermehrung von Bakterien erfolgt über Zweiteilung und damit grundlegend anders als bei mehrzelligen Lebewesen. Material: Übernachtkultur von E. coli, Schikanekolben, Schüttler, Flüssigmedium, Mikroliterpipetten, Eppendorfgefäße, Kulturmedium in Petrischalen, Folienstifte, Drygalski-Spatel Dieses Experiment wird von allen gemeinsam durchgeführt. Wir bestimmen zu Kursanfang die Gruppen, die die Messungen durchführen. Bitte nicht vergessen die Uhrzeit der Messung zu notieren! Versuchsdauer: mindest. 4 Stunden! Versuchsablauf Bemerkungen Vorbereitung (wurde bereits durchgeführt!): Ein Schikanekolben mit 50ml Flüssigmedium wird mit 1,0ml einer Übernachtkultur von E. coli beimpft und im Brutschrank inkubiert. Alle 45 Minuten wird ein Punkt der Bakterienwachstumskurve gemessen. Protokoll: 1. Bereiten Sie sich drei Küvetten vor. In die erste Küvette füllen Sie nur Nährmedium. Eichen Sie damit das Photometer. Achtung: Küvetten nur auf den matten Flächen anlangen. 2. Holen Sie die beiden Erlenmeyerkolben mit der Bakteriensuspension (einmal mit, einmal ohne Antibiotikum) aus dem Brutschrank 3. Schütteln Sie die Bakteriensuspensionen gut durch und füllen Sie jeweils 2 ml in eine Küvette. 4. Messen Sie am Photometer die optische Dichte der beiden Bakteriensuspensionen (+ AB, -AB) 5. Notieren Sie die beiden Werte und tragen Sie sie auch in die Tabelle am Flipchart ein. Vergessen Sie nicht die Uhrzeit der Messung zu notieren. OD+AB= OD-AB= 6. Entsorgen Sie die Küvetten in den Tischabfall. Bringen Sie die Bakteriensuspensionen zurück in den Brutschrank. 7. Stellen Sie den Timer auf 30 Minuten und geben ihn der nächsten Gruppe, die mit messen dran ist. Am Ende des Versuchstages: Notiere Dir die Werte aller Gruppen. Trage die Werte in einem halblogarithmischen Papier auf. Wir rechnen dann zusammen die Generationszeit aus. Uhrzeit OD+AB OD-AB Uhrzeit Generationszeit g: g= lg2/Steigung der Eichgeraden Frage:Warum werden die Werte halblogarithmisch aufgetragen? 25 OD+AB OD-AB 7 – Wachstum von Bakterien Mikrobiologie 26 >Das Helmholtz-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Das Helmholtz-Zentrum konzentriert die Forschungsarbeiten auf eine der wichtigsten Fragen unserer Gesellschaft, die Gesundheit des Menschen in seiner Umwelt. Ziel ist es, Risiken für die menschliche Gesundheit durch Umweltfaktoren zu erkennen, Mechanismen der Krankheitsentstehung zu entschlüsseln sowie Konzepte zu entwickeln, um die Gesundheit des Menschen und seine natürlichen Lebensgrundlagen auch für die Zukunft zu schützen. Als Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, sind wir Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft, der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands. > Über das Gläserne Labor Das Gläserne Labor wurde speziell für Schülerinnen und Schüler eingerichtet. Hier sollen sie zu bestimmten naturwissenschaftlichen Themen möglichst eigenständig, aber natürlich nach Anleitung, experimentieren und dabei entdecken, wie faszinierend naturwissenschaftliche Phänomene sind und Spaß haben an der Experimentier- und Forschertätigkeit. Zusätzlich sollen die Schülerinnen und Schüler das Helmholtz-Zentrum als Forschungseinrichtung kennen lernen und verstehen, wie Grundlagenforschung funktioniert und warum sie wichtig bzw. nötig ist. Je nach Thema werden aktuelle Forschungsprojekte des Helmholtz-Zentrums vorgestellt. Das Helmholtz-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit übernimmt als Mitglied der HelmholtzGemeinschaft Verantwortung für die Qualität der naturwissenschaftlich-technischen Bildung unserer Kinder. Das Gläserne Labor dient als Institution, um dieser Anforderung durch unterrichtsergänzende Angebote gerecht zu werden. Es wurde am Helmholtz –Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit mit großzügiger finanzieller Unterstützung der Helmholtz-Gemeinschaft eingerichtet. > Weitere Informationen Besuchen Sie uns im Internet. Dort finden sie aktuelle Informationen und das Anmeldeformular: http://www.helmholtz-muenchen.de/schullabor/ Bei Fragen stehen wir telefonisch unter 089 3178 – 2725 zur Verfügung. Auf ein baldiges Wiedersehen freut sich ihr Team vom Gläsernen Labor! Gläsernes Labor Abteilung Öffentlichkeitsarbeit Helmholtz-Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Ingolstädter Landstrasse 1 85764 Neuherberg 27
