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Westfälische Wilhelms-Universität Münster Zentrum für Molekularbiologie der Entzündung Institut für Infektiologie Untersuchung und Charakterisierung der Typ-II-Sekretionssysteme von Yersinia enterocolitica Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften im Fachbereich Biologie der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster vorgelegt von Dominik von Tils geboren am 04.07.1981 in Münster - 2014 - Westfälische Wilhelms-Universität Münster Zentrum für Molekularbiologie der Entzündung Institut für Infektiologie Untersuchung und Charakterisierung der Typ-II-Sekretionssysteme von Yersinia enterocolitica Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften im Fachbereich Biologie der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster vorgelegt von Dominik von Tils geboren am 04.07.1981 in Münster - 2014 - Dekan: Herr Prof. Dr. Michael Weber Erster Gutachter: Herr Prof. Dr. M. Alexander Schmidt Zweiter Gutachter: Herr PD Dr. Gerhard Heusipp Tag der mündlichen Prüfung: 29.01.2015 Tag der Promotion: 06.02.2015 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis I Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis IX 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung 4 2.1 Bakterien - von Pionieren und Pathogenen 4 2.2 Die Gattung Yersinia 5 2.3 Entwicklung humanpathogener Yersinien 7 2.4 Charakterisierung von Y. enterocolitica 7 2.4.1 Pathogenese von Y. enterocolitica 8 2.4.2 Virulenzfaktoren Y. enterocolitica 10 2.4.3 Identifizierung neuer Virulenzgene und ihrer Regulation – das regulatorische 2.5 Pyp-Netzwerk 14 Sekretionssysteme 16 2.5.1 Sec-/Tat-abhängige Sekretionssysteme 17 2.5.2 Sec-/Tat-unabhängige Sekretionssysteme 19 2.6 Das Typ-II-Sekretionssystem 22 2.7 T2SS in Y. enterocolitica – ein zweischneidiges Schwert 24 2.7.1 Yts2 in Y. enterocolitica 25 2.7.2 Yts1 in Y. enterocolitica 28 2.7.2.1 2.8 3 Yts1 – Sekretionsprodukte Zielsetzung Material 31 34 35 3.1 Bakterienstämme 35 3.2 Eukaryotische Zelllinien 37 3.3 Verwendete Modellorganismen 37 3.4 Vektoren und rekombinante Plasmide 38 3.5 Oligonukleotide 39 3.6 Enzyme für die Molekularbiologie 40 3.7 Antikörper 41 3.8 Reagenziensysteme und Kits 42 3.9 Größenstandards 42 Inhaltsverzeichnis II 3.9.1 DNA-Größenstandards 42 3.9.2 Protein-Größenstandards 43 3.10 Kulturmedien 43 3.10.1 Kulturmedium und Kulturplatten zur Kultivierung von Bakterien 43 3.10.2 Kulturmedien und Reagenzien für die Kultivierung von C. elegans 44 3.10.3 Kulturmedien und Reagenzien für die Kultivierung und Infektion eukaryotischer Zelllinien 46 3.11 Lösungen und Puffer 47 3.12 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 49 3.13 Geräte 51 3.14 Programme 53 4 Methoden 4.1 Mikrobiologische Methoden 54 54 4.1.1 Anzucht und Stammhaltung von Bakterien 54 4.1.2 Anzucht von Yersinien und Induktion der Yts1-Sekretion 54 4.1.3 Bestimmung der optischen Dichte 55 4.1.4 Bestimmung der Bakterienzellzahl 55 4.2 Zellbiologische Methoden 4.2.1 56 Kultivierung von eukaryotischen Zellen 56 4.2.1.1 Kultivierung von Raji- und THP-1-Zellen 56 4.2.1.2 Kultivierung von T84-Zellen 56 4.2.2 Bestimmung der Zellzahl eukaryotischer Zellen 56 4.2.3 Inkubation eukaryotischer Zellen mit Y. enterocolitica 57 4.2.4 Durchflusszytometrie 58 4.3 Molekularbiologische Methoden 59 4.3.1 Präparation genomischer DNA aus Gram-negativen Bakterien 59 4.3.2 Isolierung von Plasmid-DNA 60 4.3.2.1 Plasmid-Minipräparation 60 4.3.2.2 Plasmid-Midipräparation 61 Inhaltsverzeichnis III 4.3.3 Polymerase-Kettenreaktion 61 4.3.4 Reinigung von DNA-Fragmenten aus Lösungen 63 4.3.5 Klonierung von PCR-Produkten über Restriktionsschnittstellen 64 4.3.6 Photometrische Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA 65 4.3.7 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse 65 4.3.8 Gelelektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten 65 4.3.9 Restriktion von DNA 67 4.3.10 Ligation von DNA-Fragmenten 68 4.3.11 Transformation von Bakterien durch Elektroporation 68 4.3.12 Herstellung elektrokompetenter Bakterien 69 4.3.13 Bakterielle Konjugation 69 4.3.14 Transkriptionsanalyse bakterieller Gene 70 4.4 4.3.14.1 Transkriptionsanalyse bakterieller Gene aus Kulturen pflanzlicher Extrakte 72 4.3.14.2 Transkriptionsanalyse bakterieller Gene aus Kulturen mit Blut und Blutplasma 72 4.3.14.3 Transkriptionsanalyse bakterieller Gene aus Infektion von eukaryotischen Zelllinien 73 Proteinbiochemische Methoden 74 4.4.1 Überexpression von rekombinanten Proteinen in E. coli 74 4.4.2 Reinigung von rekombinanten Proteinen durch Affinitätschromatographie 75 4.4.3 Dialyse und Konzentrierung von rekombinanten Proteinen 76 4.4.4 Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Bicinchoninsäure-Test 76 4.4.5 Herstellung von bakteriellen Gesamtzellextrakten 77 4.4.6 Gewinnung und Präparation bakteriellen Überstandes 77 4.4.7 Proteinfällung mit Trichloressigsäure 78 4.4.8 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 78 4.4.9 Färbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen 81 4.4.9.1 Coomassie-Brillant-Blau-Färbung 81 4.4.9.2 Negative Zink-Imidazol Färbung von Proteinen im SDS-Gel 82 4.4.10 Western Blot-Analyse 4.4.10.1 Semidry Blot-Verfahren 83 4.4.10.2 Proteinidentifizierung 83 4.4.10.3 Immunologischer Nachweis von immobilisierten Proteinen 84 4.4.10.4 Detektion von Y. enterocolitica Überständen durch Immunseren 85 4.4.11 Herstellung polyklonaler Antikörper gegen ChiY aus Y. enterocolitica 4.5 82 85 4.4.11.1 Elektroelution von gereinigtem ChiY 86 4.4.11.2 Immunisierung und Serumgewinnung 87 Infektion von pflanzlichen Proben 88 4.5.1 Stichinfektion von pflanzlichen Proben 88 4.5.2 Einbringung von Yersinien über mononaxenische Böden in Spinatpflanzen 88 Inhaltsverzeichnis 4.6 Infektion von Invertebraten 4.6.1 88 Haltung und Infektion von Galleria mellonella Larven 89 4.6.1.1 Auswertung der Überlebensrate 89 4.6.1.2 Bestimmung der Kolonisierungsintensität durch die Bakterien 90 4.6.2 Haltung und Infektion von Artemia salina 90 4.6.2.1 Auswertung der Überlebensrate 91 4.6.2.2 Bestimmung der Kolonisierungsintensität durch die Bakterien 91 4.6.3 5 IV Haltung und Infektion von C. elegans 92 4.6.3.1 Infektion von C. elegans mit Yersinia-Stämmen 92 4.6.3.2 Synchronisierung einer C. elegans Population durch bleaching 92 4.6.3.3 Vorbereitung der Infektionsplatten 93 4.6.3.4 Infektion der Nematoden durch transiente Exposition mit pathogenen Bakterien 93 4.6.3.5 Auswertung der Überlebensrate 94 4.6.3.6 Bestimmung der Kolonisierungsintensität durch die Bakterien 94 4.6.3.7 Immunfluoreszenzmikroskopie von C. elegans nach Yersinien-Infektion 94 Ergebnisse 5.1 96 Bedeutung des Yts1-Sekretionssystems bei der Infektion von Säugetieren 5.1.1 96 Detektion von Y. enterocolitica-Überständen durch Immunseren aus Kaninchen und Menschen 96 5.1.2 Zellkulturansatz zur Überprüfung der Transkription des Yts1-Systems in vitro 99 5.1.3 Transkription Yts1-assoziierter Gene in humanem Blut und Blutplasma 102 5.1.4 Sekretionsprodukte von Y. enterocolitica WA-314 103 5.2 Rolle des Yts1-Sekretionssystems bei der Verbreitung und dem Überleben des Bakteriums Y. enterocolitica in der Umwelt 106 5.2.1 BLAST-Analysen zur Untersuchung der Verbreitung Yts1-ähnlicher T2SS-Loci 5.2.2 In silico-Analysen zur Verbreitung von ChiY-, EngY- und YE3650-ähnlichen Proteinen 106 108 5.2.2.1 Ergebnisse von CDART- und BLAST-Analysen 108 5.2.2.2 3D-Strukturvorhersage für die Proteine ChiY, EngY und YE3650 113 2+ 116 5.3 Überprüfung der Interaktion von Pflanzen und Yersinien 118 5.4 Invertebraten als Modellorganismen für eine Yersinia-Infektion 121 5.2.3 5.4.1 5.4.1.1 Transkriptionsrate von chiY-lacZ in Abhängigkeit der Mg -Konzentration Infektion der Larven von Galleria mellonella mit Y. enterocolitica 121 Infektion der Larven von Galleria mellonella mit Y. enterocolitica JB580v (wt) und der Mutante des T2SS Yts1 (GHY474) 123 5.4.1.2 Quantifizierung von Y. enterocolitica nach der Infektion von G. mellonella-Larven 124 5.4.1.3 Transkriptionsrate Yts1-assoziierter Gene in infizierten G. mellonella-Larven 126 Inhaltsverzeichnis 5.4.2 V C. elegans als Invertebraten-Modell für eine Yersinia-Infektion 5.4.2.1 Fluoreszenzmikroskopische Analyse der Infektion von 128 C. elegans mit Y. enterocolitica-Stämmen 5.4.2.2 Kolonisierung von C. elegans durch die Yersinia-Stämme 133 5.4.2.3 Überlebensrate von C. elegans nach der Infektion mit Y. enterocolitica-Stämmen 134 5.4.3 6 130 Der Salinenkrebs Artemia salina als aquatisches Infektionsmodell 136 Diskussion 6.1 139 Rolle des Yts1-Sekretionssystems für die Virulenz des Bakteriums während humaner Infektionen 6.2 140 Rolle der Yts1-Sekretion bei der Verbreitung von Y. enterocolitica als Umweltkeim 6.2.1 143 Mögliche Bedeutung von Pflanzen als Nische für Y. enterocolitica und als Zielorganismen der Yts1-Sekretion 6.2.2 Invertebraten als denkbarer 145 evolutionärer Zwischenschritt zur Humanpathogenität 6.2.3 6.2.4 148 Adhärenz an Zooplankton als mögliche Funktion des Yts1-Sekretionssystems in aquatischer Umgebung 156 Ausblick 158 7 Literaturverzeichnis 162 8 Anhang 178 8.1 Transkription Yts1-assoziierter Gene in Fruchtextrakten 178 8.2 Plasmidkarten 179 8.3 Wissenschaftliche Beiträge 183 8.3.1 Publikationen 183 8.3.2 Vorträge 183 8.3.3 Poster 183 8.4 Lebenslauf 184 8.5 Danksagung 185 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VI Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abbildung Seite Abbildung 2-1: Die verschiedenen Infektionswege pathogener Yersinia-Arten. Abbildung 2-2: Schematischer Überblick über wichtige Virulenz- und Adhärenzfaktoren in der äußeren Membran der Yersinien während der Infektion. 12 Abbildung 2-3: Schematische Darstellung des regulatorischen Pyp-Netzwerkes. 15 Abbildung 2-4: Schematische Übersicht Sekretionsmechanismen. 18 der 9 Sec-/Tat-abhängigen Abbildung 2-5: Übersicht der Sec-/Tat-unabhängigen Sekretionssysteme. 20 Abbildung 2-6: Modell einer allgemeinen Typ-II-Sekretion nach Douzi et al., (2012). 23 Schematische Darstellung des yts2-Operons und angrenzender Gene in Y. enterocolitica. 27 Schematische Darstellung des yts1-Operons und angrenzender Gene in Y. enterocolitica. 29 Abbildung 2-9: Proteindomänen des Yts1-Sekretionsproduktes ChiY. 31 Abbildung 2-10: Proteindomänen des Yts1-Sekretionsproduktes EngY. 32 Abbildung 2-11: Proteindomänen des Yts1-Sekretionsproduktes YE3650. 33 Abbildung 5-1: Immunochemische Detektion von Proteinen aus Y. enterocoliticaÜberständen durch Immunseren von rekonvaleszenten Kaninchen und Menschen. 97 Abbildung 2-7: Abbildung 2-8: Abbildung 5-2: Transkriptionsanalyse Yts1-assoziierter Infektion von humanen Zellkulturlinien. Gene während der 100 Abbildung 5-3: Transkription Yts1-assoziierter Gene in Blut und Blutplasma. Abbildung 5-4: Proteinsekretion von den Stämmen Y. enterocolitica 8081 und Y. enterocolitica WA-314 bei 17°C und 20 mM MgCl2 in LBMedium. 105 Abbildung 5-5: Überblick der T2S-Systeme in Yersinia enterocolitica 8081 im Vergleich mit ähnlichen T2S-Loci in anderen Bakterienspezies. 107 Abbildung 5-6: CDART-Ergebnisse für ChiY und EngY. 110 Abbildung 5-7: 3D-Strukturvorhersagen der Proteine ChiY, EngY und YE3650. 114 Abbildung 5-8: Transkriptionsintensität des Reportergens ansteigenden Mg2+-Konzentrationen. 117 chiY-lacZ 103 bei Abbildung 5-9: Proteinsekretion von E. amylovora, E. pyrifoliae und verschiedener Yersinien-Spezies bei 17°C und 20 mM MgCl2 in LB-Medium. 119 Abbildung 5-10: Überlebensrate infizierter Galleria mellonella Larven. Abbildung 5-11: Überlebensrate infizierter G. mellonella-Larven nach Infektion mit Yersinia enterocolitica O:8 Wiltyp Stamm und Mutationsstamm mit deletiertem yts1E-Gen. 124 122 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VII Abbildung 5-12: Keimzahlbestimmung der G. mellonella-Larven drei Tage nach Infektion. 125 Abbildung 5-13: Transkriptionsrate Yts1-assoziierter Gene in den infizierten Larven von G. mellonella. 127 Abbildung 5-14: Lebenszyklus des Nematoden C. elegans. Abbildung 5-15: Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis von Y. enterocolitica 8081 im Verdauungstrakt von C. elegans. 131 Abbildung 5-16: Floureszenzmikroskopische Aufnahme von Bakterien an der Cuticula von C. elegans. 129 Y. enterocolitica132 Abbildung 5-17: Kolonisierung von C. elegans durch Y. enterocolitica. Abbildung 5-18: Lebensspanne von C. elegans Y. enterocolitica-Stämmen. nach der Infektion 133 mit 135 Abbildung 5-19: Infektion des Salinenkrebses Artemia salina mit Yersiniae. Abbildung 8-1: Transkription Yts1-assoziierter Gene in Kulturen mit den Extrakten von Apfel, Birne und Nektarine. 178 Tabelle Tab. 2-1: 137 Seite Auftreten des Yts1- und des Yts2-Sekretionssystems in der Gattung Yersinia. 25 Tab. 3-1: Verwendete Yersinia-Stämme. 35 Tab. 3-2: Verwendete Escherichia coli-Stämme. 35 Tab. 3-3: Verwendete Bakterienisolate. 36 Tab. 3-4: Verwendete Vektoren und rekombinante Plasmide. 38 Tab. 3-5: Eingesetzte Oligonukleotide bei Klonierungs- und PCR-Ansätzen. 39 Tab. 3-6: Enzyme für molekularbiologische Experimente. 40 Tab. 3-7: Verwendete primäre und sekundäre Antikörper (AK). 41 Tab. 3-8: Eingesetzte Reagenziensysteme und Kits unter Angabe des jeweiligen Herstellers. 42 Angewandter Protein-Größenstandard. 43 Tab. 3-9: Tab. 3-10: Verwendete Antibiotika unter Angabe der eingesetzten Konzentration in Yersinia- und E. coli-Kulturen. 44 Tab. 3-11: Eingesetzte Medien, Lösungen und Reagenzien bei der Kultivierung und Infektion von eukaryotischen Zelllinien. 46 Tab. 3-12: Standardmäßig verwendete Puffer und Lösungen. 47 Tab. 3-13: Verwendete Chemikalien und Verbrauchsmaterialien unter Angabe des Herstellers. 49 Tab. 3-14: Labortechnische Geräte und deren Hersteller. 51 Tab. 3-15: Verwendete Programme und ihre Anwendung. 53 Tab. 4-1: 63 Zusammensetzung eines Standard PCR-Ansatzes. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VIII Tab. 4-2: Reaktionsprotokoll für die Durchführung einer PCR. 63 Tab. 4-3: Zusammensetzung eines Restriktionsansatzes. 67 Tab. 4-4: Übersicht der Elektroporationsparameter für Y. enterocolitica und E. coli. 69 Zusammensetzung der Lösungen für die Präparation von 5 PAA-Gelen mit Angabe verschiedener Trenngel-Konzentrationen. 80 Tab. 4-6: Herstellung kolloidaler Coomassie-Brillant Blau G-250 Lösung. 81 Tab. 4-7: Immunisierungsprotokoll. 87 Tab. 4-5: Abkürzungsverzeichnis IX Abkürzungsverzeichnis Nach den International Codes of Nomenclature können Gattungsnamen nach der Einführung mit dem Anfangsbuchstaben des Gattungsnamens abgekürzt werden (z. B.: Yersinia enterocolitica Y. enterocolitica). Abkürzung Erklärung Abkürzung Erklärung % Prozent MMP Matrix-Metalloproteinase % (v/v) Volumenprozent MOI multiplicity of infection (Ratio % (w/v) Volumenbezogenes Massenprozent MS Massenspektrometrie °C Grad Celsius M-Zellen microfold Zellen 3D dreidimensional n nano (10 ) 6 x His sechsfaches Histidin Nal Nalidixinsäure Abb. Abbildung NCBI National Zell- zu Bakterienzahl) -9 Center for Biotechnology Information ABC ATP binding cassette ng Nanogramm ad bis zu/auf Ni-NTA Ni -Nitriloessigsäure ADP Adenosindiphosphat nm Nanometer Ail attachment and invasion locus Nr. Nummer AK Antikörper N-terminal Aminoterminal Amp Ampicilin OD optische Dichte AP alkalische Phosphatase OM äußere bakterielle Membran APS Ammoniumpersulfat OMP outer membrane protein AS Aminosäure ONPG ortho-Nitrophenyl-β-D- 2+ Galaktopyranosid ATP Adenosintriphosphat OP overproduction, Überproduktion BCA Bicinchoninsäure ori origin BLAST Basic Local Alignment Search Tools PAA Polyacrylamid bp Basenpaar PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese BSA Rinderserumalbumin PAMP pathogen-associated molecular patterns bzw. beziehungsweise PBS phosphate buffered saline ca. circa PclR PypC-like regulator Ca 2+ Calcium-Ionen PCR Polymerase-Kettenreaktion Cam Chloramphenicol Pen Penicillin CBPs chitin-binding proteins pH potentia hydrogenii (negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration) Abkürzungsverzeichnis CDART Conserved X Domain Architecture Phyre Retrieval Tool Protein Homology/analogY Recognition Engine CDD Conserved Domain Database PI Pathogenitätsinsel CFU colony forming units PM Plasmamembran ChiC Chitinase C PO Peroxidase ChiY chitin-binding protein of Yersinia PP Peyer-Plaques cm Zentimeter Psp phage shock protein C-terminal Carboxyterminal PVDF Polyvinylidenfluorid Da Dalton Pyp protein regulating expression of Yersinia hreP DMEM Dulbecco´s modified Eagle medium pYV plasmid of Yersinia virulence DNA Desoxyribonukleinsäure PZ plasticity zone dNTP 2‘-Desoxyribonukleosid-5‘- RACE rapid amplification of cDNAends triphosphat D-PBS Dulbecco´s phosphate buffered RNA Ribonukleinsäure saline ds doppelsträngig RovA regulator of virulence A DTT Dithiothreitol rpm rounds per minute EC50 effektive Konzentration halb- RT Raumtemperatur maximaler Dosis-Antwort EDTA Ethylendiamintetraessigsäure s. c. subkutan EngY enhancin-like N-acetylglucosamine- SDS sodium dodecylsulfate binding protein of Y. enterocolitica ETEC Enterotoxischer Escherichia coli Sec secretory pathway et al. et alii; und andere sek. Sekunde(n) µF Mikrofarad SPI Salmonella pathogenicity island FCS fötales Kälberserum ssp. Subspezies g Gramm STM signature tagged mutagenesis GALT gut associated lymphoid tissue Strep Streptomycin GAM goat anti mouse Syc specific Yop chaperone GAR goat anti rabbit T1SS – Typ-I-Sekretionssystem – T8SS Typ-VIII-Sekretionssystem T1S - T8S Typ-I-Sekretion – GbpA GlcNAc binding protein A Typ-VIII-Sekretion GFP green fluorescent protein T4P Typ-IV-Pili GHY Gerhard Heusipp Yersinia T7 Bakteriophage T7 N-Acetylglucosamin TAA Trimeres Autotransporter- GlcNAc Adhäsin Gsp general secretion pathway Tab. Tabelle h hour(s), Stunde(n) Tad tight adherence H2Odd Bidestilliertes Wasser TAE Tris-Acetat-EDTA Hcp hemolysin-coregulated protein Tat twin-arginine pathway H-NS TCA Trichloressigsäure HPI histone-like nucleoid structuring protein high pathogenicity island TE Tris-EDTA Hre host responsive element TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethyldiamin Abkürzungsverzeichnis XI iCFU Anzahl der CFU bei Infektion U Unit(s) IEP isoelektrischer Punkt u. a. unter anderem Ig Immunglobulin ÜN über Nacht in silico im Computer ÜS Überstand in vitro außerhalb des lebenden Organismus V Volt in vivo im lebenden Organismus verd. verdünnt Inv Invasin VgrG valine-glycine repeat G IPTG Isopropylthiogalactosid wt Wildtyp IVET in vivo expression technology x mal Kan Kanamycin xg g = 9,81 m/s ; Vielfaches der kb Kilobasenpaar(e) YadA Yersinia adhesion A kDa Kilodalton Yop Yersinia outer protein l Liter Ysa Yersinia secretion apparatus LB lysogeny broth Ysc Yersinia secretion component LPS Lipopolysaccharid Ysp Yersinia secreted proteins M Molar Yst Yersinia stable toxin Yts Yersinia T2SS YtxR Yersinia toxin regulator 2 Erdbeschleunigung -3 m Milli (10 ) MALDI-TOF Matrix-assisted Laser Desorp- tion/Ionization - time of flight MCS multiple cloning site z. B. zum Beispiel MFP Membranfusionsprotein z. T. zum Teil mg Milligramm ZMBE Zentrum für Molekularbiologie der Entzündung Mg 2+ Magnesium-Ionen Δ Delta, Deletion min Minute μ mikro (10 ) ml Milliliter μl Mikroliter mM Millimol Ohm mm Millimeter -6 Zusammenfassung 1 Das 1 Zusammenfassung als Yts1 bezeichnete Typ-II-Sekretionssystem des Enterobakteriums Yersinia enterocolitica wurde mit Hilfe von Genom-Vergleichsanalysen als Virulenzfaktor identifiziert und im Zuge von Mausinfektionen als solcher bestätigt (Iwobi et al., 2003). In nachfolgenden Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe wurden drei Sekretionsprodukte (ChiY, EngY, YE3650) des Yts1-Systems entdeckt (Shutinoski et al., 2010), welche jeweils als oligo- bzw. polysaccharidbindende Proteine annotiert sind. Für ChiY (chitin-binding protein of Yersinia) und EngY (enhancin-like Nacetylglucosamine-binding protein of Y. enterocolitica) wurden in anschließenden Versuchen chitinbindende Eigenschaften festgestellt. Eine aktive Sekretion dieser Proteine konnte in vitro nur bei niedrigen Temperaturen (17°C - 26°C) und bei höheren Mg2+-Konzentrationen (20 mM) nachgewiesen werden, nicht jedoch bei 37°C. In Anbetracht der Ergebnisse der beiden genannten Studien, lässt sich vermuten, dass das Yts1-System eine duale Funktion in den Yersinien übernimmt. Während des Infektionsprozesses in Säugetieren könnte das Yts1-System als Virulenzfaktor die Infektion begünstigen, während es außerhalb eines homoiothermen Wirtes bei der Umweltverbreitung von Y. enterocolitica eine Rolle spielen könnte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass das Immunsystem tierischer Wirte Antikörper gegen die Sekretionsprodukte des Yts1Systems bildet. Dies deutet auf eine Funktion der Proteine in vivo, also während der Infektion hin. Ob die Expression der Sekretionsprodukte bereits oder sogar ausschließlich außerhalb des homoiothermen Wirtes stattfindet oder auch nach oraler Aufnahme im Wirt, bleibt offen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Transkriptionsanalysen unter infektionsähnlichen Bedingungen weisen nicht darauf hin, dass das Yts1-System bei säugetiertypischen Temperaturen aktiv ist. Die Transkription Yts1assoziierter Gene könnte jedoch auch durch wirtsspezifische Faktoren, wie z. B. Zytokine oder antimikrobielle Peptide, induziert werden, welche in Laborexperimenten nur schwer zu erfassen sind. Die bisherigen Untersuchungen des Yts1-Systems (Iwobi et al., 2003; Shutinoski et al., 2010) beschreiben widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der Yts1Aktivität bei verschiedenen Temperaturen. In dieser Arbeit wurde überprüft, ob die dokumentierten Unterschiede auf stammspezifische genotypische Unterschiede der jeweils verwendeten O:8-Stämme (WA-314, 8081) zurückzuführen sind. In unseren Händen ähnelte sich das Sekretionsverhalten beider Stämme. Bei 17°C wurden Zusammenfassung 2 jeweils Sekretionsprodukte des Yts1-Systems detektiert, während diese bei 37°C nicht auftraten. Insofern bestätigte sich, dass die Aktivität des Yts1-Systems bei niedrigen Temperaturen kein stammspezifisches Phänomen ist, sondern auch stammübergreifend etabliert ist. Somit wurde die Hypothese unterstützt, dass das Yts1-System mit der Umweltverbreitung von Y. enterocolitica assoziiert sein könnte. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zu diesem Aspekt zunächst intensive in silico-Analysen durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, das Struktur- und Sequenz-Homologien des Yts1-Systems und seiner Sekretionsprodukte keine einheitlichen Indizien für eine bestimmte ökologische Nische liefern. Sowohl die Interaktion mit pflanzlichen Zellen als auch die Kolonisierung aquatischer und terrestrischer Invertebraten erscheinen aufgrund dieser Daten als mögliche Funktion des Yts1-Systems. Ein weiterer Bestandteil der in silicoAnalysen war die 3D-Modellierung der Sekretionsprodukte, wodurch ein erster Eindruck der Proteinstrukturen generiert werden konnte. Bei vorhergehenden Arbeiten wurde ein positiver Effekt höherer Mg2+-Konzentrationen auf die Expression des Yts1-Sekretionssystems sowie auf die Transkription und Sekretion von ChiY identifiziert (Shutinoski et al., 2010). Daran anknüpfend konnte in der vorliegenden Arbeit eine Assoziation dieses Phänomens mit spezifischen Umweltbedingungen gezeigt werden, wie sie in manchen ökologischen Nischen auftreten. Dazu wurde die Regulation der chiY-Transkription in Abhängigkeit zur Mg2+-Konzentration spezifiziert. Die bei maximaler chiY-Transkription gemessenen Magnesiumkonzentrationen entsprechen dem Magnesiumgehalt einiger natürlicher Systeme. Vor allem Pflanzen sind in der Lage, Magnesium in vergleichbaren Konzentrationen anzureichern. Durch den Verzehr pflanzlicher Nahrung kommen höhere Mg2+-Konzentrationen jedoch auch in herbivoren Insekten sowie im Verdauungstrakt pflanzenfressender Säugetiere vor. Auch Brack- und Meerwasser weisen mit Mg2+-Konzentration zwischen 20 mM und 50 mM ähnlich hohe Konzentrationen auf. Aufgrund der erhobenen in silico-Daten und der aufgezeigten chiY-Regulation wurden die in dieser Arbeit durchgeführten in vitro-Experimente und Infektionsversuche sowohl mit pflanzlichem Material als auch mit aquatischen und terrestrischen Invertebraten unternommen. Bezüglich der Interaktion von Y. enterocolitica mit Früchten und pflanzlichen Extrakten wurden verschiedene Ansätze getestet, die eine Aktivierung der Yts1-Sekretion oder eine Infektion pflanzlichen Gewebes initiieren könnten. Es konnte jedoch auf diese Zusammenfassung 3 Weise keine positive Reaktion der Bakterien oder des Yts1-Systems nachgewiesen werden. Daher vermuten wir, dass das Yts1-System bei der Kolonisierung und Infektion von Pflanzen keine Rolle spielt. Dagegen zeigten Infektionsversuche in zwei experimentellen Modellsystemen, mit Wachsmottenlarven (Galleria mellonella) und Nematoden (Caenorhabditis elegans), dass Y. enterocolitica diese Modellorganismen kolonisiert und deren Lebenserwartung jeweils negativ beeinflusst. Außerdem konnte eine leicht erhöhte Transkription von Yts1-assoziierten Genen während des Infektionsprozesses der Wachsmottenlarven festgestellt werden. Allerdings wird der Verlauf des Infektionsprozesses in beiden Invertebratenarten nicht vom Auftreten des Yts1-Systems beeinflusst. Wir vermuten auch aufgrund der in silico-Daten, dass eine Beteiligung des Yts1-Systems eher bei der Überwindung der gastrointestinalen Barriere von z. B. Lepidoptera-Arten auftritt und empfehlen für zukünftige Versuche, solche Versuchstiere über den peroralen Weg mit Y. enterocolitica zu infizieren. Außerdem wurde in dieser Arbeit der erste Ansatz zur Interaktion von Y. enterocolitica mit aquatischen Invertebraten (Artemia salina) unternommen. Auch wenn die bisherigen Versuche nicht auf eine Auswirkung des Yts1-Systems hindeuten, sind die hier erarbeiteten Ergebnisse ein Grundstein für weitere Untersuchungen und für Weiterentwicklungen im Versuchsablauf bei der Infektion von Y. enterocolitica mit möglichen aquatischen Wirten. Einleitung 2 4 Einleitung 2.1 Bakterien - von Pionieren und Pathogenen Seit Milliarden von Jahren bevölkern Prokaryoten unsere Erde und haben sich als Pioniere an nahezu jede ökologische Nische dieser Welt angepasst (Schopf, 2006). Sei es in der heißen und unter gewaltigem Druck stehenden Umgebung von hydrothermalen Quellen der Tiefsee, in hochsalinen Salzseen oder in den eisigen Permafrostböden der Tundra, Bakterien und Archaeen haben einen Weg gefunden fast jeden Ort dieser Erde zu besiedeln (Boyd & Boyd, 1964; Abyzov et al., 1979; Corliss et al., 1979; Imhoff, 1986; Schrenk et al., 2003; Zhou et al., 2009). Auch wenn die genannten Mikroben hochspezialisierte Extremisten sind und sich über Äonen an ihre natürlichen Habitate angepasst haben, sollte bedacht werden, dass auch Prokaryoten in scheinbar weniger exotischen Lebensräumen bemerkenswerte Überlebensstrategien benötigen, um dem Selektionsdruck ihrer Umgebung standzuhalten (Cases et al., 2003; Kotte et al., 2010). Im Vergleich zu den Extremophilen spielen bei den Mesophilen vor allem die Interaktion mit anderen Organismen und die schnelle Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen eine besonders wichtige Rolle. Um zu gewährleisten, dass sie die richtigen Werkzeuge zum angebrachten Zeitpunkt einsetzen, müssen zum Beispiel Bakterien die wesentlichen Faktoren ihrer Umwelt wahrnehmen und entsprechend auf Veränderungen reagieren können. So kann allein die Veränderung der Umgebungstemperatur die Transkription von hunderten Genen auslösen, welches es dem Bakterium erlaubt, sich an die neuen Bedingungen anzupassen (Hurme & Rhen, 1998; Herbst et al., 2009). Aber Bakterien reagieren nicht nur auf ihre Umwelt, sie sind auch in der Lage diese zu beeinflussen und gar ihren Lebensraum umzugestalten. Durch die Sekretion von Proteinen, wie Amylasen, Chitinasen, Proteasen oder oxidierenden und reduzierenden Molekülen manipulieren die Bakterien ihre Umgebung und sind in der Lage die vorhandenen Nährstoffe und Energieressourcen auszunutzen (Francetic et al., 2000; Ast et al., 2002; De Vrind et al., 2003; Lee et al., 2004). Die Wirkung der sezernierten Moleküle beschränkt sich jedoch nicht nur auf totes oder anorganisches Material, sondern schliesst auch die im Umfeld des Bakteriums vorkommenden Organismen ein. Besonders pathogene Bakterien, die sich durch einen Ressourcenerwerb auszeichnen, der andere Organismen schädigt, profitieren von der Fähigkeit der Sekretion. Der Vorgang der Sekretion ist im Bakterienreich so Einleitung 5 essentiell, dass sich eine Reihe von verschiedenen Sekretionssystemen entwickelt hat und die meisten Spezies die Information für mehrere dieser Systeme in ihrem Genom tragen. Besonders die Sekretionsmechanismen der Gram-negativen Bakterien haben sich zu hochkomplexen Maschinerien entwickelt. Da sich die Zellwand der Gram-negativen aus drei Schichten zusammensetzt, müssen die Sekretionsapparate der Bakterien zu exportierende Moleküle über die innere zytoplasmatische Membran, durch das periplasmatische Peptidoglycan und über die äußere Lipidmembranschicht transportieren. Für Gram-negative Bakterien wurden bisher sechs Sekretionssysteme (T1SST6SS) allgemein anerkannt und charakterisiert, während es bei der Zuordnung weiterer Sekretionsapparate (T7SS-T8SS) noch kontroverse Diskussionen gibt (Sandkvist, 2001a; Delepelaire, 2004; Henderson et al., 2004a; Filloux et al., 2008; Fronzes et al., 2009; Hauser, 2009). Die komplexesten unter diesen Systemen (T3SS, T4SS, T6SS) sind vor allem diejenigen, die noch eine weitere Membranschicht penetrieren können - nämlich die Lipidmembran eines Wirtes. Speziell pathogene Bakterien sind daher beim Angriff auf ihren Wirt mit einer raffinierten Waffe ausgestattet, die es ihnen erlaubt, Effektorproteine direkt in dessen Zellen zu applizieren. Auch das humanpathogene Enterobakterium Y. enterocolitica, welches in dieser Arbeit untersucht wird, verfügt über mehrere Versionen von Sekretionssystemen in seinem Genom. Das am vollständigsten charakterisierte und für die Infektion wohl wichtigste Sekretionssystem ist das Typ-III-Sekretionssystem Ysc (Yersinia secretion component) (Michiels et al., 1990). Weit weniger bekannt sind die Funktionen und Regulationsmechanismen der beiden Typ-II-Sekretionsapparate Yts1 und Yts2 (Yersinia type two secretion) des Bakteriums, die daher in dieser Arbeit untersucht werden sollen (Iwobi et al., 2003). 2.2 Die Gattung Yersinia Im Jahre 1894 gelang es Alexandre Émil Jean Yersin die Ursache der Pest zu identifizieren, die zu diesem Zeitpunkt in pandemischen Ausmaß Millionen von Menschenleben in Zentralasien forderte. Die entdeckte Bakterienspezies wurde 1944 in Anerkennung ihres Entdeckers Yersinia pestis genannt (Loghem, 1944; Bottone & Mollaret, 1977). Bis heute wurden 16 weitere Bakterienspezies definiert, die zusammen mit Yersinia pestis der Gattung Yersinia zugeordnet wurden. Sie gehören Einleitung 6 zur Familie der Enterobacteriaceae und sind nicht-sporenformende Gram-negative Stäbchenbakterien, die sich fakultativ anaerob vermehren. Yersiniae sind in der Lage auch bei niedrigen Temperaturen zu gedeihen und werden somit auch als psychrotolerant bezeichnet (Greenwood et al., 1975; Hanna et al., 1977). Durch die Temperaturtoleranz von etwa 0°C - 45°C und einer optimalen Wachstumstemperatur von 25°C - 28°C erstreckt sich das Verbreitungsgebiet der Bakterien von den gemäßigten bis zu den subtropischen Breiten. Bis auf Y. pestis sind alle Yersiniae bei Temperaturen um 22°C – 30°C peritrich begeißelt und damit mobil, während sie bei höheren Temperaturen (37°C) keine Begeißelung aufweisen (Bottone & Mollaret, 1977; Bottone, 1997, 1999). Yersinien konnten häufig aus aquatischen und terrestrischen Proben isoliert werden (Bercovier et al., 1978; Massa et al., 1988). Dieser Tatsache verdanken sie auch die generelle Einschätzung als Umweltkeime. Neben der Fähigkeit, als freilebende Organismen überleben zu können, nutzen einige Yersinia-Spezies vor allem Nagetiere, aber seltener auch Vögel, Fische, Amphibien, Insekten und Säugetiere als Reservoir (Mair, 1973; Carniel & Mollaret, 1990). Die stärkste Assoziation mit Säugetierinfektionen geht von den drei bekanntesten Vertretern der Gattung aus, den humanpathogenen Erregern Y. pestis, Y. pseudotuberculosis und Y. enterocolitica (Francis, 2013). Während diese drei Spezies aufgrund ihrer Pathogenität relativ gut charakterisiert wurden und weiterhin Teil der aktuellen Forschung sind, gibt es für die restlichen Vertreter der Yersinien nur wenige Studien und Untersuchungsergebnisse. Einige dieser Spezies (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. rohdei) werden jedoch als opportunistische Erreger eingestuft, da sie aus Proben von gesunden und kranken Menschen isoliert werden konnten (Bercovier et al., 1984; Wauters et al., 1988). Für die Branche der Fischzüchter ist außerdem Y. ruckeri als Verursacher der Rotmaulseuche bei Salmoniden, insbesondere der Regenbogenforelle, eine ernste Bedrohung (Rucker, 1966; Tobback et al., 2007). Bis auf die insektenpathogene Spezies Y. entomophaga gelten die fünf übrigen Yersiniae als apathogene Umweltkeime (Y. aleksiciae, Y. massiliensis, Y. nurmii, Y. pekanenii, Y. similis) (Willumsen, 1989; Ibrahim et al., 1993; Sulakvelidze, 2000; Sprague & Neubauer, 2005; Sprague et al., 2008; Chen et al., 2010; Hurst et al., 2011; MurrosKontiainen et al., 2011; Souza et al., 2011). Einleitung 2.3 Mit 7 Entwicklung humanpathogener Yersinien der fortschreitenden Sequenzierung ganzer Bakteriengenome reifte die Erkenntnis, dass das Genom vieler Bakterien höchstwahrscheinlich ein Mosaik aus horizontal erworbenen Genen und DNA-Fragmenten darstellt. Durch Aufnahme, Rekombination und Reduktion von Genen können sich somit für das Bakterium neue Überlebensstrategien eröffnen, die sich wesentlich von seinem Vorgänger unterscheiden (Wren, 2003). Der wohl wichtigste Faktor, der die humanpathogenen Yersiniae von einem gemeinsamen apathogenen Vorgänger unterscheidet, ist die Etablierung des Virulenzplasmids pYV (plasmid of Yersinia virulence) (Cornelis et al., 1987). Dieses Plasmid kodiert für ein ganzes Arsenal von Effektorproteinen (Yops, Yersinia outer proteins) und das bereits erwähnte Typ-III-Sekretionssystem Ysc, welches die Effektoren direkt in die Wirtszelle sezerniert. Damit ist das Plasmid pYV die Grundlage für den lymphatischen Tropismus der drei pathogenen Spezies, denn die sezernierten Yops erlauben es den pathogenen Yersiniae, die Immunzellen des Wirtes zu manipulieren und die Immunantwort abzuschwächen (Cornelis & Wolf-Watz, 1997). Ausgehend von diesem pathogenen Vorläufer haben sich vermutlich zunächst die Arten Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis entwickelt. Während sich der Y. enterocolitica-Vorläufer, wie im nächsten Abschnitt beschrieben, zu einer Fülle von Y. enterocolitica Subspezies differenzierte, konnte durch genetische Studien gezeigt werde, dass sich Y. pestis in relativ kurzer Zeit (1.500 - 20.0000 Jahre) aus Y. pseudotuberculosis entwickelte (Achtman et al., 1999). 2.4 Charakterisierung von Y. enterocolitica Die Spezies Y. enterocolitica lässt sich in eine heterogene Gruppe von Unterarten differenzieren, welche aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften in sechs Biogruppen (1A, 1B und 2 - 5) unterschieden werden (Wauters et al., 1987). Die Virulenz des jeweiligen Y. enterocolitica-Stammes hängt im Wesentlichen vom Auftreten zweier genetischer Elemente ab. Zum einen beruht die Virulenz der Y. enterocolitica Unterarten, wie bereits erwähnt, auf dem Auftreten des Plasmids pYV und zum anderen befähigt die Pathogenitätsinsel HPI (high pathogenicity island) die Bakterien zu einer Siderophor-vermittelten Eisenaufnahme, was essentiell für das Wachstum im Wirtsorganismus ist (Carniel, 2001). Biotyp 1A Stämme besitzen weder die Pathogenitätsinsel noch das pYV-Plasmid und sind apathogen im Mausmodell der Einleitung 8 Yersiniose (Tennant et al., 2003). Den Stämmen der schwach pathogenen Biotypen 2 - 5 fehlt die Pathogenitätsinsel, aber sie tragen das pYV-Plasmid und sind in der Lage, Mäuse zu infizieren, ohne die Tiere zu töten. Diese fünf Biotypen gehören zu der Y. enterocolitica subsp. palearctica und werden aufgrund ihrer vornehmlichen Verbreitung in Europa und Japan als „Alte Welt“-Stämme bezeichnet. Der hauptsächlich in Nordamerika vorkommende „Neue Welt“-Stamm mit dem Biotyp 1B (subsp. enterocolitica) trägt sowohl die Pathogenitätsinsel als auch das pYV-Plasmid und ist hochvirulent, so dass eine Mausinfektion in der Regel tödlich verläuft. Y. enterocolitica ist wie die meisten Yersinia-Arten in der Natur weit verbreitet und wurde aus diversen Reservoirs wie dem intestinalen Trakt von zahllosen Säugetieren, Vögeln, kaltblütigen Tieren und sogar aus terrestrischen und aquatischen Nischen isoliert (Mair, 1973; Bercovier et al., 1978; Massa et al., 1988). Während die Umweltisolate meist avirulent sind, werden in Zuchtschweinen oft humanpathogene Serogruppen gefunden. Aber auch wilde Nagetiere und Haustiere, wie Hunde und Schafe stehen im Verdacht, als Reservoir pathogener Y. enterocolitica-Stämme zu fungieren (Fredriksson-Ahomaa et al., 2001). 2.4.1 Pathogenese von Y. enterocolitica Während Y. pestis durch einen Flohbiss übertragen wird und sich bei der Manifestation der Beulen- und insbesondere der Lungenpest auch direkt von Mensch zu Mensch ausbreiten kann, erfolgt eine Infektion mit den enteropathogenen Y. pseudotuberculosis und Y. enterocolitica für gewöhnlich durch die Aufnahme von kontaminierten Nahrungsmittel oder Wasser (Bacot & Martin, 1914; Sharma et al., 2003; Jarrett et al., 2004; Fukushima et al., 2011). Nach der Passage des Magens besteht die erste Phase der Pathogenese in der Kolonisierung des Intestinaltraktes durch den Erreger. Besonders der distale Dünndarm (terminales Ileum) und der proximale Bereich des Kolons sind hier betroffen (Abbildung 2-1). Die Bakterien durchdringen die Schleimhautbarriere des Darms und adhärieren an die mukosalen Epithelzellen des Bürstensaums (Isberg, 1989; Paerregaard et al., 1991; Bottone, 1997). Die Anlagerung an die intestinalen Zellen und die Penetration der Epitheldecke erfolgt bevorzugt über sogenannte M-Zellen (microfold cells), in denen normalerweise Antigene aus dem intestinalen Lumen aufgenommen und den Immunzellen des darunterliegenden lymphatischen Gewebes präsentiert werden (Portnoy et al., 1984; Emody et al., 1989; Neutra et al., 1996; Siebers & Finlay, 1996). Die M-Zellen sind Einleitung 9 Teil einer kuppelartig in das Darmlumen ragenden Struktur, die auch Peyer-Plaques (PP) genannt werden und zum lymphatischen System des GALT (gut associated lymphoid tissue) zählen. Nachdem die Bakterien durch die M-Zellen in das lymphatische System eingedrungen sind, bilden sie Mikroabszesse und vermehren sich in den Peyer-Plaques (Hanski et al., 1989; Autenrieth & Firsching, 1996). Abbildung 2-1: Die verschiedenen Infektionswege pathogener Yersinia-Arten. Die enteropathogenen Erreger Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis werden meist durch kontaminierte Nahrung oder Wasser aufgenommen. Nach Passage des Magens, dringen die Bakterien im Dünndarm durch die M-Zellen oberhalb der Peyer-Plaques in das lymphatische System ein. Die Folge der Infektion ist in der Regel eine lokale Entzündung mit den Symptomen einer Gastroenteritis. In den seltenen Fällen einer systemischen Infektion können auch Leber, Milz und Niere kolonisiert werden. Der Erreger der Pest hingegen, wird meist durch Flohbisse übertragen und besiedelt das lymphatische Gewebe der Haut. Das Anschwellen kolonisierter Lymphknoten führt zum Krankheitsbild der Beulenpest, die sich in selteneren Fällen über das Blutsystem auch in der Lunge des Infizierten als sekundäre Lungenpest manifestieren kann. Über eine Tröpfcheninfektion können in der Folge weitere Personen an der Lungenpest erkranken. Sowohl Beulen- als auch Lungenpest können zu einer Blutvergiftung, der so genannten Pestsepsis, übergehen (Wren, 2003). Einleitung 10 Von dort verbreiten sie sich vermutlich durch Internalisierung in Phagozyten und besiedeln schließlich auch die mesenterialen Lymphknoten (MLN), was eine inflammatorische Reaktion und abdominale Schmerzen verursacht. Bei immunsupprimierten Personen kann jedoch auch eine systemische Erkrankung auftreten, bei der es zu einer Dissemination des Erregers in tiefer liegendes Gewebe wie Leber, Niere oder Milz kommen kann. Ein solcher Verlauf der Yersiniose ist für den Patienten kritisch und führt zu einer 50%igen Mortalitätsrate (Cover & Aber, 1989; Heesemann et al., 2006; Trülzsch et al., 2007). Ungeklärt ist bis heute die Frage, ob das Enteropathogen vom lymphatischen System auch in das Blutgefäßsystem gelangen kann. Die schwerwiegenden Komplikationen, die eine Einbringung des Bakteriums in den Blutkreislaufs hervorrufen kann, sind jedoch durch Fälle bekannt, in denen Patienten mit kontaminierten Bluttransfusionen infiziert wurden (Bjune et al., 1984; Guinet et al., 2011). Die Symptome der selbstlimitierenden Gastroenteritis klingen bei gesunden Menschen nach ein bis zwei Wochen wieder ab. In den meisten Fällen geht die Yersiniose einher mit Fieber, Erbrechen und blutigen Durchfällen. Ein weiteres Krankheitsbild der gastrointestinalen Yersiniose, welches vor allem bei Jugendlichen und Erwachsenen auftritt, ist die Pseudoappendizitis, die durch die Entzündungen in den mesenterialen Lymphknoten und dem terminalen Ileum hervorgerufen wird (Kohl, 1979). Außerdem können Folgeerkrankungen wie Arthritis, Myokarditis, Glomerulonephritis und Erythema nodosum auftreten, welche vornehmlich mit Personen assoziiert sind, in denen das HLA-B27-Antigen nachgewiesen werden konnte (Laitinen et al., 1977; Yu & Kuipers, 2003). 2.4.2 Virulenzfaktoren Y. enterocolitica Das humanpathogene Potenzial von Y. enterocolitica beruht auf einer Vielzahl von Virulenzfaktoren, welche sowohl chromosomal kodiert vorliegen, als auch durch das 70 kb große pYV-Plasmid beigesteuert werden (Fàbrega & Vila, 2012). Die hier aufgeführte Zusammenstellung soll einen Überblick über die bisher bekannten und wichtigsten Elemente der Virulenz geben. Die Effizienz der Infektion wird jedoch nicht nur von den Virulenzfaktoren an sich bestimmt, sondern hängt wesentlich von der Erfassung der Umweltbedingungen und einer koordinierten Expression spezifischer Effektoren ab (Miller et al., 1989; Galindo et al., 2011). Dazu müssen Sensor- und Regelkreise Kriterien wie pH-Wert, Temperatur, Kalzium- und Eisenkonzentration Einleitung 11 oder Wirtszellkontakt erfassen und entsprechend reagieren. Nach der peroralen Aufnahme der Bakterien stellt sich das saure Milieu des Magensaftes als ein erstes Hindernis für die Pathogenen dar. Y. enterocolitica und andere gastrointestinale Erreger können auf diese Bedrohung mit der Expression von Urease reagieren (de Koning-Ward & Robins-Browne, 1997). Dieses Enzym wandelt Harnstoff in Kohlenstoffdioxid und Ammoniak um, wobei Letzteres den pH-Wert der Lösung erhöht und somit auch die Überlebenschancen der Bakterien. Der Vergleich zwischen einer Urease-negativen Y. enterocolitica-Mutante (Serotyp O:9) und dem Wildtyp ergab eine stark verringerte Säureresistenz des Erregers, so dass die Viabilität nach der Passage des Magens um das 10-fache von 85% auf 8,5% reduziert worden ist (De Koning-Ward & Robins-Browne, 1995). Für die Invasion der intestinalen Mukosa ist insbesondere die Adhärenz der Bakterien an die epithelialen Zellen von Bedeutung (Abbildung 2-2) (Mikula et al., 2013). Invasin (Inv) gilt als wichtigster initialer Adhärenz- und Invasionsfaktor und vermittelt die Bindung an β1-Untereinheiten des Integrins intestinaler M-Zellen (Pepe & Miller, 1993; Pepe et al., 1994). Allerdings deuten einige Studien darauf hin, dass es noch einen alternativen Faktor geben muss, der durch einen weniger effektiven Invasionsmechanismus ebenfalls die Kolonisierung der Peyer-Plaques bewirken kann (Yang & Isberg, 1993). Das auf dem pYV-Plasmid kodierte Protein YadA (Yersinia adhesin A) ist ein multifunktionales Adhäsin und bindet mit seiner N-terminalen lollipop-förmigen Kopfregion an diverse Komponenten der extrazellulären Matrix, wie Kollagen, Fibronektin und Laminin. Neben der Adhärenz des Bakteriums an Epithelzellen, vermittelt YadA auch die Anlagerung an intestinalen Mucus und Granulozyten, wobei letzteres vermutlich wesentlich zur Serumresistenz von Y. enterocolitica beiträgt (Paerregaard, 1992; El Tahir & Skurnik, 2001). Der chromosomal kodierte Adhäsionsfaktor Ail (attachment and invasion locus) ist ebenfalls in der Lage, eine Bindung an Zelloberflächen zu vermitteln und spielt wie YadA eine wichtige Rolle bei der Serumresistenz des Enteropathogens (Portnoy & Falkow, 1981; Miller et al., 1989; Galindo et al., 2011). Neben den Adhäsionsproteinen scheinen auch Flagellen und die mit ihnen verbundene Motilität bei der initialen Zellinvasion des Bakteriums von Bedeutung zu sein. Die Inaktivierung von flagellenregulatorischen Genen, wie flhDC oder fliA wurde mit einer zur inv-Mutante vergleichbar verringerten Invasionsfähigkeit assoziiert (Fauconnier et al., 1997; Young et al., 1999). Einleitung 12 Abbildung 2-2: Schematischer Überblick über wichtige Virulenz- und Adhärenzfaktoren in der äußeren Membran der Yersinien während der Infektion. Äußere Bakterienmembran mit dem äußeren Kern (outer core: OC) des LPS-Moleküls (lila). Dargestellt sind außerdem die Adhesine Invasin (gelb), YadA (grün), Ail (rot) und die O-Antigene (hellgrau) von Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis (modifiziert nach Mikula et al., 2013). Auch das LPS (Lipopolysaccharid) wurde in Studien als Virulenzfaktor identifiziert (Zhang et al., 1996; Bengoechea et al., 2004). Dabei zeigte sich, dass LPS OAntigen-defiziente Stämme (Serotypen O:3 und O:8) nach oraler Infektion von Mäusen ein verringertes Potenzial bezüglich der Kolonisierungs- und Invasionsprozesse aufweisen. Diese Mutanten zeichneten sich durch eine ineffiziente Besiedelung von Peyer-Plaques im Vergleich zu Wildtypstämmen aus und vermehrten sich nicht in Milz, Leber und mesenterialen Lymphknoten. Interessanterweise konnten die Autoren zeigen, dass die Funktion von YadA gestört ist, Ail nicht exprimiert wird und Invasin herunterreguliert ist, wenn das O-Antigen nicht vorhanden ist. Daher geht man davon aus, dass das O-Antigen für eine korrekte Expression oder Funktionalität der in der äußeren Membran lokalisierten Virulenzfaktoren notwendig ist. Eine wesentliche Komponente der Yersinia-Pathogenität ist das pYV-Plasmid (Cornelis et al., 1987). Es kodiert neben dem Adhäsionsprotein YadA auch das Injektisom des T3SS Ysc, die Ysc-sezernierten Effektoren (Yops) und die für die Translokation notwendigen Chaperone (Syc: specific Yop chaperone) (Boyd et al., 2000). Das Sekretionssystem Ysc durchspannt die drei Membrankomponenten des Gram-negativen Bakteriums und bildet einen Nadelkomplex aus, der die Zellmembran Einleitung 13 von Wirtszellen durchdringen und mit Hilfe von Chaperonen die Yop-Effektoren direkt in das Zytosol der Zielzelle translozieren kann (Cornelis, 2002). Eine Expression des Yop-Virulons findet in vitro exklusiv bei 37°C und niedrigen Kalziumkonzentrationen statt (Straley et al., 1993; Straley & Perry, 1995). Unter diesen Bedingungen lässt sich auf der Oberfläche der Bakterien die Ausbildung der nadelförmigen Strukturen beobachten, welche jedoch erst bei Wirtszellkontakt damit beginnen, die Effektoren zu translozieren (Rosqvist et al., 1994). Die Yop-Effektoren manipulieren diverse Signalwege und die Zytoskellett-Dynamik der Zielzellen. Damit wirken die biochemischen und immunmodulatorischen Eigenschaften der Effektorproteine hemmend auf die Phagozytose der Makrophagen und Neutrophilen und verhindern außerdem die Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen und Sauerstoffradikalen (oxidativer burst) (Trosky et al., 2008). Neben dem plasmidgebundenem T3SS Ysc besitzen die hochpathogenen Y. enterocolitica 1B-Stämme auch das chromosomale Typ-III-Sekretionssystem Ysa (Yersinia secretion apparatus), welches namensgebend für die kodierende YsaPathogenitätsinsel (Ysa-PI) ist (Haller et al., 2000; Foultier et al., 2002). Der Ysa-T3SApparat ist nahe mit dem T3SS-1 von Salmonella enterica SPI-1 und dem Mxi-Spa T3SS von Shigella verwandt. In vitro zeigte sich eine funktionale Aktivität des YsaSekretionssystems bei 26°C und hohen Natriumchlorid-Konzentrationen. Bis jetzt wurden 16 Effektoren identifiziert, die durch Ysa sezerniert werden. Neben einigen der Yop-Proteine transportiert es vor allem die Ysp (Yersinia secreted protein) genannten Effektorproteine. Diese Moleküle scheinen für die volle Virulenz des Bakteriums während der frühen Phase der Infektion notwendig zu sein, da in vivo-Versuche (Mausinfektion) mit Ysp-Mutanten eine verringerte Kolonisierung des gastrointestinalen Gewebes aufwiesen (Venecia & Young, 2005; Matsumoto & Young, 2009). Allerdings könnte die Funktion des Ysa-Sekretionssystems noch bedeutender für die Infektion von Invertebratenzellen sein. Eine aktuelle Untersuchung von Walker et al. (2013) belegt, dass Ysa ein essentielle Rolle bei der Interaktion von Drosophila S2-Zellen mit Y. enterocolitica spielt und vor allem für die intrazelluläre Replikation in dieser Zelllinie wichtig ist (Walker et al., 2013). Da freie Eisenmoleküle nur zu einem geringen Anteil im Wirtsorganismus für die Yersiniae zur Verfügung stehen, ist auch die Ausbeutung der vorhandenen Eisenressourcen essentiell für die Pathogenität der Bakterien (Gehring et al., 1998). Die chromosomale, etwa 43 kb große Pathogenitätsinsel HPI (high pathogenicity island) kommt nur in hochvirulenten Y. enterocolitica 1B-Stämmen vor und kodiert die Einleitung 14 Gene des Yersiniabactin-Systems, welches für die Siderophor-vermittelte Eisenaufnahme zuständig ist (Heesemann, 1987; Carniel et al., 1996; Rakin et al., 1999). Dabei chelatiert das Siderophor auf Grund seiner hohen Affinität Eisenmoleküle, die an Wirtsproteine gebunden sind. Anschließend wird der Siderophor-Fe3+-Komplex aus der äußeren Bakterienmembran ins Zytosol transportiert, wo er dissoziiert und das freie Eisen für den Metabolismus des Bakteriums zur Verfügung stellt (Stojiljkovic & Hantke, 1992; Gehring et al., 1998). Kontrovers wird noch die Bedeutung des hitzestabilen Enterotoxins Yst (Yersinia stable toxin) diskutiert. Das chromosomal kodierte Protein ist nahe mit dem Toxin STI von E. coli-Stämmen verwandt und steht im Verdacht Durchfallerkrankungen auszulösen. Allerdings konnte Yst bisher nicht aus Stuhlproben infizierter Tiere isoliert werden, und nicht alle pathogenen Y. enterocolitica-Stämme scheinen das Protein zu exprimieren (Delor et al., 1990; Delor & Cornelis, 1992; Tennant et al., 2003; Fàbrega & Vila, 2012). 2.4.3 Identifizierung neuer Virulenzgene und ihrer Regulation – das regulatorische Pyp-Netzwerk Obwohl bereits eine Reihe von Virulenzfaktoren für Y. enterocolitica bekannt sind, schreitet die Entdeckung unbekannter Effektoren immer weiter voran. Neben den genomischen, transkriptomischen und proteomischen Analysen haben sich Screening-Methoden wie STM (signature tagged mutagenesis) und IVET (in vivo expression technology) bei der Suche nach neuen Virulenzgenen bewährt (Mahan et al., 1993, 1995, 2000; Wu et al., 2008). Die STM-Methode beruht auf der Inaktivierung eines Virulenzgens durch die zufällige Insertion eines Transposon-Elementes. Weist ein Pathogen nach der Transposon-Mutagenese einen Phänotyp mit veränderter Virulenz auf, wird das Genom des Erregers nach der Transposonsequenz gescreent und das inaktivierte Virulenzgen identifiziert (Weiss et al., 1983; Weiss & Falkow, 1983; Darwin & Miller, 1999). Die Regulation vieler Virulenzfaktoren ist derart auf wirtsspezifische Faktoren abgestimmt, dass ihre Aktivierung in in vitro-Experimenten kaum zu erreichen ist. Durch IVET verfolgt man einen methodischen Ansatz, der es ermöglicht die Promotoraktivität von Virulenzgenen im Wirtsorganismus zu detektieren (Slauch et al., 1994). Dazu wird in der Regel zunächst das Genom des Erregers restringiert. Anschließend werden promotortragende DNA-Fragmente des Restriktionsansatzes Einleitung 15 vor promotorlose Reportergene, wie beispielsweise Antibiotikaresistenzen, kloniert und über einen Suizidvektor in das Genom der Pathogene integriert. Die rekombinanten Bakterien werden zur Infektion des Wirtstieres eingesetzt, und unter dem Druck der entsprechend zugefügten Selektiva (z. B. Antibiotika) können nur solche Bakterien aus dem Wirt isoliert werden, deren Promotor aktiv ist und die Expression des Reportergens erlaubt. Ein für Y. enterocolitica durchgeführter IVET-screen im Mausmodell ermöglichte die Identifizierung von 45 so genannter hre-Loci (host responsive elements), die nicht in vitro, sondern in vivo bei der Kolonisierung der Peyer-Plaques des Wirtstieres exprimiert wurden (Young & Miller, 1997). Äußere Membran Periplasma PypA Innere Membran PypB RovA ? PypC hreP pypA pypB pypC yts2... homolog H-NS pclR yts1... Abbildung 2-3: Schematische Darstellung des regulatorischen Pyp-Netzwerkes. Die gestrichelten Pfeile geben die transkriptionsinduzierende Wirkung der Proteine an, während die grauen Linien von H-NS ausgehend die inhibitorische Funktion dieses Regulators darstellen. Das Fragezeichen weist auf den bisher unbekannten Mechanismus der PypA-Regulation des hrePPromotors hin. Stromabwärts von pypC ist das T2SS Yts2 angedeutet, das Homologien zu dem zweiten T2SS Yts1 aufweist (modifiziert nach Wagner et al, 2009). Einleitung 16 Einer dieser hre-Loci (hre-22) kodiert für die Protease HreP (host responsive element protease), die eine hohe Homologie zu der Familie der eukaryotischen Subtilisin/Kexin-ähnlichen Proteasen aufweist (Heusipp et al., 2001). Wagner et al. (2009) konnten in einem genetischen Screen drei vermeintliche hreP-Regulatoren identifizieren. Weiterführende Untersuchungen belegten, dass die als PypA, PypB und PypC (protein regulating expression of Yersinia hreP) benannten Proteine ein komplexes regulatorisches Netzwerk bilden, das die Transkription von hreP modulieren kann (Abbildung 2-3). Die Gene der Protease und ihrer Regulatoren weisen aufgrund ihres vom Genom abweichenden GC%-Gehalt auf eine Akquirierung durch horizontalen Gentransfer hin und werden durch einen negativen Regulator xenogenetischer DNA (H-NS: histonelike nucleoid structuring protein) reprimiert (Blädel et al., 2013). Die Untersuchungen ergaben, dass PypB und PypC sowohl autoinduzierend wirken können, als auch die Transkription von hreP und pypC beziehungsweise pypB positiv beeinflussen. Mit dem Virulenzregulator RovA (regulator of virulence A) wurde außerdem ein weiterer Induktor der pypC-Transkription identifiziert. Die Art und Weise wie das membranständige PypA die Transkription des hreP-Gens induziert, konnte bisher nicht eindeutig entschlüsselt werden (Blädel, 2012). Interessanterweise ist das pypC-Gen dem Yts2-Operon vorgeschaltet und wird aufgrund dessen mit der Regulation einer der beiden Typ-II-Sekretionssysteme assoziiert, die in dieser Arbeit analysiert werden (Shutinoski et al., 2010). 2.5 Sekretionssysteme Die Proteinsekretion ist ein wesentlicher Bestandteil der Interaktion von Bakterien mit ihrer Umwelt. Insbesonders heterotrophe Bakterien (kommensale, symbiontische, antagonistische), die mit einem größeren Wirtsorganismus wechselwirken, sind auf Sekretionssysteme angewiesen. Bei Gram-negativen Bakterien sind mindestens sechs verschiedene Sekretionssysteme nachgewiesen worden, die numerisch klassifiziert wurden (T1SS-T6SS) (Sandkvist, 2001b). Allerdings gibt es auch Vorschläge zur Einteilung und Benennung weiterer Systeme, deren Aufnahme in diese Klassifizierung jedoch noch kontrovers diskutiert wird (Abdallah et al., 2007; Fronzes et al., 2008; Bitter et al., 2009; Desvaux et al., 2009a, b). Generell lassen sich zwei Modi der Sekretion von Substraten in Gram-negativen Bakterien unterscheiden. Zum einen gibt es die Sekretionssysteme (T2SS, T4SS, Einleitung 17 T5SS), die die Substrate zunächst über die innere Membran ins Periplasma transportieren und in einem zweiten Schritt über die äußere Membran sezernieren können. Zum anderen gibt es die Sekretionsapparate (T1SS, T3SS, T4SS, T6SS), die Effektoren direkt aus dem Zytosol über die gesamte Hülle der Gram-negativen Bakterien befördern. Bei ersterem Modus wird der Transfer der Substrate über die innere Membran entweder durch den generellen Sekretionsweg (Sec: secretory pathway) oder durch den Tat-Weg (twin-arginine translocation pathway) durchgeführt. Der Sec-Weg transloziert die mit einer spezifischen N-terminalen Signalsequenz markierten Exportproteine in einer weitgehend ungefalteten Konformation über die Membran, so dass eine endgültige Faltung erst im periplasmatischen Raum stattfindet (de Keyzer et al., 2003). Der Tat-Weg hingegen ermöglicht den Export vollständig gefalteter Proteine. Die Spezifizität der Tat-Sekretion wird hier ebenfalls durch ein N-terminales Signalpeptid gewährleistet, das über ein namensgebendes hochkonserviertes Motiv gekennzeichnet ist, bei dem zwei dicht benachbarte Argininreste vorliegen (Palmer et al., 2005). Diese Arbeit konzentriert sich vor allem auf ein Typ-II-Sekretionssystem der Yersiniae, daher werden allgemeine Informationen zu diesem Typ im Abschnitt 2.6 genauer beschrieben, während hier zunächst als Einstieg ein Überblick über die restlichen bakteriellen Sekretionssysteme gegeben wird. 2.5.1 Sec-/Tat-abhängige Sekretionssysteme Die Sekretionskomplexe der Typ-II- und der Typ-V-Sekretion sind auf die Translokation der Substrate mittels des Sec-/Tat-pathways angewiesen, während das T4SS Proteine sowohl aus dem periplasmatischen Raum als auch direkt aus dem Zytoplasma sezernieren kann (Abbildung 2-4). Ähnlich wie bei dem unten beschriebenen T2SS handelt es sich beim Typ-IV-Sekretionsapparat um einen multimeren Proteinkomplex aus normalerweise 12 verschiedenen Komponenten (Cascales & Christie, 2003; Fronzes et al., 2009). Für das T4SS wurden neben der Proteinsekretion auch der konjugative Transfer von DNA in Bakterien-, Pilz- und Pflanzenzellen dokumentiert (Waters, 2001; Lawley et al., 2003; Ninio & Roy, 2007; Salgado-Pabón et al., 2007). Häufig bildet das T4SS für ein nadelförmiges Injektisom aus und sondert in diesem Falle die Substrate direkt aus dem Zytosol der Zelle in den Zielorganismus ab. Jedoch wurde auch eine Sec-/Tat-abhängige Sekretionsweise von Einleitung 18 Pertussis-Toxin durch Bordetella pertussis beschrieben (Verma & Burns, 2007). Das Toxin wird hierbei aus dem Periplasma des Bakteriums sezerniert und das T4SS weist auch nicht die Ausbildung eines Injektisoms auf. T2SS T5aSS T5bSS T5cSS T4SS Extrazellulär Äußere Membran Periplasma Innere Membran ATP ATP ADP+P Zytoplasma Sec-/TatSekretion ATP ADP+P ADP+P Abbildung 2-4: Schematische Übersicht der Sec-/Tat-abhängigen Sekretionsmechanismen. Die Substrate (rauten-förmig) des Typ-II- und des Typ-IV-Sekretionssystems werden zunächst mittels des Sec-/Tat-pathways in das Periplasma transloziert, durch Chaperone in eine endgültige Konformation gebracht und spezifisch durch eines der beiden Systeme sezerniert. Bei den T5SS faltet sich das β-Faltblatt-Motiv erst im Periplasma und bildet nach der Integration in die äußere Membran eine Pore. Je nach Subtypus wird entweder das separate Substrat sezerniert (T5bSS), oder das zunächst gebundene Substrat-Motiv proteolytisch abgespalten (T5aSS). Beim T5cSS bilden drei Autotransporter ein Trimer, dessen drei Substrat-Motive eine membranverankerte Oberflächenstruktur ausbilden (modifiziert nach Henderson et al., 2004b; Christie, 2009; Douzi et al., 2011). Der Mechanismus der Typ-V-Sekretion unterscheidet sich wesentlich von den restlichen Sekretionstypen und beschreibt ein so genanntes Autotransporter-System (Pohlner et al., 1987; Henderson et al., 2004b; Ackermann et al., 2008). Hierbei wird ein Protein zunächst über den Sec-pathway in den periplasmatischen Raum transloziert, wo der C-Terminus des Moleküls ein β-Fass bildet, das sich in die äußere Membran einlagert. Über diese porenbildende Struktur wird der N-terminale Teil des Proteins (passenger domain) nach außen transportiert und kann durch Proteolyse von der Membrandomäne abgespalten und freigesetzt werden (T5aSS). Im Falle von Einleitung 19 Proteinen wie den trimeren Autotransporter-Adhäsinen (TAAs) kann eine Proteolyse auch ausbleiben, so dass der oberflächengebundene N-Terminus dieser Proteine eine Adhärenz des Bakteriums an die extrazelluläre Matrix von Zielzellen vermittelt (T5cSS) (Hoiczyk et al., 2000; St Geme & Cutter, 2000; Surana et al., 2004; Yeo et al., 2004). Der Sekretionsvorgang des T5bSS ähnelt dem des T5aSS mit dem Unterschied, dass das membranständige β-Fass und der passenger zwei einzelne Proteineinheiten darstellen (Henderson et al., 2000; Jacob-Dubuisson et al., 2001). 2.5.2 Sec-/Tat-unabhängige Sekretionssysteme Das Typ-I-Sekretionssystem ist eine relativ simple Struktur, die alle drei Bestandteile der Hülle Gram-negativer Bakterien durchspannt und sich aus drei verschiedenen Proteinuntereinheiten zusammensetzt (Abbildung 2-5). Die in der inneren Membran lokalisierte ATP-binding cassette (ABC) stellt unter ATP-Verbrauch den aktiven Teil des Sekretionssystems dar und wird über das Membranfusionsprotein (MFP, membrane fusion protein) mit den porenformenden Proteinen (OMPs, outer membrane proteins) der äußeren Membran verbunden. Nach Bindung eines Substrats an den ABC-Komplex, assemblieren die MFP-Untereinheiten zu einem periplasmatischen Tunnel und ermöglichen nach Bindung der äußeren Membranproteine den direkten Transport des Substrats in das extrazelluläre Milieu. Neben der Translokation von Proteinen verschiedener Größenordnung (10 kDa - 900 kDa) nutzen Bakterien das T1SS zur Sekretion von Ionen und Molekülen wie zyklischen βGlukanen und Polysacchariden (Koronakis et al., 2000; Delepelaire, 2004; Holland et al., 2005). Sowohl das T3SS als auch das bereits beschriebene T4SS formen eine externe nadelähnliche Struktur mit der sie Sekretionsprodukte direkt aus dem Zytosol des Bakteriums in das Innere von Wirtszellen injizieren können. Die Länge der Nadelstruktur des T3SS kann je nach Bakterienspezies von 45 nm (S. flexneri) bis hin zu 150 nm (SPI-2 von S. typhimirium) variieren (Kubori et al., 1998; Chakravortty et al., 2005). Dabei wird die exakte Abmessung des Injektisoms durch Proteine, sogenannte molekulare Lineale, reguliert, welche die Polymerisation der Untereinheiten bei Erreichen der maximalen Länge stoppen (Journet et al., 2003; Wagner et al., 2009b). Neben dem Nadelkomplex und der Basisstruktur, letztere verankert die molekulare Spritze in den Membranen des Bakteriums, besitzt ein funktionales Typ-III-Sekretions- Einleitung 20 system in der Regel auch ein so genanntes Translokon. Dieser Komplex besteht aus drei Proteinen, die zunächst durch die Nadel sezerniert werden, sich in der Membran der Wirtszelle einlagern und eine porenförmige Struktur bilden. Über die direkte Verbindung des Translokons mit der Spitze der molekularen Spritze wird eine effektive, gezielte Translokation der Effektoren ermöglicht (Håkansson et al., 1993; Blocker et al., 1999). In der Regel werden Effektoren erst bei hergestelltem Kontakt sezerniert, allerdings kann die Sekretion für einige Spezies (Yersinia und Pseudomonas) auch ohne Wirtszellkontakt induziert werden, indem die Konzentration der Kalziumionen im Nährmedium erniedrigt wird (Straley et al., 1993). T1SS T3SS T4SS T6SS Wirtszellmembran Extrazellulär Äußere Membran Periplasma Innere Membran ATP ATP Zytoplasma ADP+P ADP+P ATP ATP ADP+P ADP+P Abbildung 2-5: Übersicht der Sec-/Tat-unabhängigen Sekretionssysteme. Die Substrate der Sekretionsmechanismen liegen im Zytosol des Bakteriums in linearisierter oder nur teilgefalteter Form vor und erlangen erst im Zielmedium ihre endgültige Konformation (hier vereinfacht dargestellt und modifiziert nach Koronakis et al., 2000; Backert & Selbach, 2008; Schraidt et al., 2010; Filloux, 2011). Einleitung 21 Das T3SS ist der wohl komplexeste Sekretionsmechanismus und kann je nach Spezies durch mehr als 30 Gene kodiert werden. Aber im Gegensatz zu dem T4SS scheint dieser Mechanismus ausschließlich auf die Sekretion von proteinogenen Substraten spezialisiert zu sein, die im Falle der humanpathogenen Bakterien im Wesentlichen mit dem Ablauf eines effektiven Infektionsprozesses oder mit der manipulativen Abminderung der Immunantwort des Wirtes assoziiert werden (Coburn et al., 2007). Aufgrund der Ähnlichkeit des T3S-Apparates zu Flagellensystemen wird vermutet, dass sich die beiden Strukturen aus einem gemeinsamen Vorläufer entwickelt haben (Abby & Rocha, 2012). Wie bereits angedeutet, ist auch die T4S im Regelfall unabhängig von der Translokation der Substrate in den periplasmatischen Raum. Neben dem Grundkörper, welcher innere Membran, Periplasma und äußere Membran durchspannt, liegt die Besonderheit des T4SS in der Ausbildung einer nadelförmigen, als Injektisom benannten Struktur an der Oberfläche des Bakteriums. Mit dieser molekularen Spritze kann das Bakterium unter ATP-Verbrauch eine große Bandbreite an Komponenten auch direkt durch die Membran einer Wirtszelle in dessen Zytosol applizieren. Über die Translokation von einzelnen Proteinen, bis über Protein-Protein und Protein-DNAKomplexen ist das System versatil einsetzbar und vermittelt beispielsweise die Verbreitung von Antibiotika-Resistenzgenen, die Induktion von Pflanzentumoren (Agrobacterium tumefaciens) und die Sekretion von proteinogenen Effektoren (Alvarez-Martinez & Christie, 2009). Über den supramolekularen Aufbau des Typ-VI-Sekretionssystems ist bisher relativ wenig bekannt. Nach bisherigen Informationen stellt es ein Multi-KomponentenSystem aus 12-25 verschiedenen Untereinheiten dar und ist im Genom vieler Gramnegativer Bakterien, darunter auch humanpathogene Vertreter, kodiert (Bingle et al., 2008; Boyer et al., 2009). Es wird vermutet, dass das T6SS strukturell und funktionell dem Schwanzrohr von Bakteriophagen ähnelt, da sezernierte Proteine wie Hcp (hemolysin-coregulated protein) und VgrG (valine-glycine repeat G) Homologien zu Proteinen (gp19, gp5, gp27) des T4-Phagen aufweisen (Mattinen et al., 2007; Pukatzki et al., 2007; Zheng & Leung, 2007). Demnach würden Hcp-Proteine zu Phagen-Schwanzrohr-ähnlichen Nanoröhren assemblieren, an deren Spitze VgrGMoleküle gebunden sind (Leiman et al., 2009; Pell et al., 2009). Der genaue Aufbau der membranständigen Basisstruktur, die Assemblierung der einzelnen Untereinheiten, sowie die Sekretionsweise und die Entdeckung weiterer Substrate des Systems sind jedoch noch Gegenstand aktueller Forschung. Einleitung 2.6 22 Das Typ-II-Sekretionssystem Alle Yersinia-Spezies, außer Y. pestis, scheinen in der Lage zu sein, als freilebende Organismen in der Umwelt zu überleben. Sogar die beiden anderen Humanpathogenen, Y. pseudotuberculosis und Y. enterocolitica, finden sich in einer Fülle von Habitaten und wurden aus Boden, Wasser, Pflanzen und sowohl aus tierischen als auch aus menschlichen Fäkalien isoliert (Massa et al., 1988; Merhej et al., 2008). Eines der Sekretionssysteme, das oftmals mit der Interaktion von freilebenden Bakterien mit ihrer Umwelt assoziiert wird, ist das Typ-II-Sekretionssystem (Abbildung 2-6). T2S-Systeme sind weit verbreitet unter Gram-negativen Bakterien, finden sich aber insbesonders in γ-Proteobakterien. Viele der sezernierten Substrate sind degradative Enzyme wie Proteasen, Phospholipasen und Chitinasen (Francetic et al., 2000; DebRoy et al., 2006). Aufgrund der bisherigen Erkenntnisse zu den T2S-Systemen diverser Bakterienspezies, wurde durch den Vergleich der Proteinhomologien ein allgemeines Modell einer Type-II-Sekretion erstellt (Abbildung 2-6), in der die im Normalfall auftretenden Untereinheiten als Gsp- (general secretory pathway) Proteine bezeichnet werden (GspC-M, GspO und GspS). Demzufolge ist ein T2S-Apparat ein MultiproteinKomplex und setzt sich aus 12-15 verschiedenen Proteinen zusammen, die als Einheit die Hülle der Gram-negativen Bakterien vollständig überbrücken. Der Transport von Sekretionssubstraten erfolgt in einem zweiphasigen Vorgang. Zunächst werden die Substrate durch den Sec- oder den Tat-Sekretionsmechanismus über die zytoplasmatische Membran in den periplasmatischen Raum transloziert. Dort werden die Proteine durch Chaperone in ihre korrekte Konformation gefaltet und anschließend durch das T2SS über die extrazelluläre Membran in das äußere Milieu transportiert (Douzi et al., 2012). Der aktive Vorgang der Proteintranslokation wird durch die Assemblierung von Pseudopili im periplasmatischen Teil des Apparates ausgeführt. Der Prozess der Assemblierung wird durch eine in der inneren Membran verankerten GTPase vollzogen, deren modus operandi ähnlich dem molekularen Mechanismus funktioniert, der an der Typ-IV-Pilus(T4P)-Biogenese beteiligt ist. Tatsächlich gehen Studien davon aus, dass das Typ-II-Sekretionssystem und die T4P-Synthese evolutionär einen gemeinsamen Ursprung besitzen (Hobbs & Mattick, 1993; Peabody et al., 2003; Filloux, 2004). Im Kolbenmodell der Typ-II-Sekretion stellen die Pseudopiline die kleinen Untereinheiten des Pseudopilus dar, der sich ausgehend von dem basalen Teil des Apparates assembliert. Der sich aufbauende Pilus schiebt die Sekretions- Einleitung 23 produkte somit aus dem periplasmatischen Raum durch eine in der äußeren Membran verankerte Pore, die sich aus Secretin (GspD)-Untereinheiten zusammensetzt (Reichow et al., 2010). Bis jetzt ist allerdings unklar, wie die Spezifizität der Sekretion gewährleistet wird. Es wird vermutet, dass die Identifizierung und Sortierung der zu sezernierenden Proteine eher auf deren Struktur beruht und nicht auf ihrer Aminosäuresequenz (Filloux, 2004; Forest, 2008; Douzi et al., 2012; Korotkov et al., 2012). Exoproteine Secretin (GspD) Extrazellulär Äußere Membran GspS Periplasma Pseudopilus GspC GspL GspM GspF Innere Membran NTPase (GspE) Sec-/TatSekretion Peptidase (GspO) Zytoplasma ATPHydrolyse Pseudopiline (GspG-GspK) Abbildung 2-6: Modell einer allgemeinen Typ-II-Sekretion nach Douzi et al., (2012). Die membranständige Prepilin-Peptidase GspO bereitet durch Proteolyse des Führungspeptids die Pseudopiline GspG-GspK für die weitere Prozessierung durch die zytosolische NTPase (GspE) vor. Diese assembliert unter ATP-Verbrauch aus den Untereinheiten einen Pseudopilus, der die Exoproteine (grau) wie ein Kolben durch die geformte Pore der Secretin Untereinheiten (GspD) in den extrazellulären Raum drückt. Die Proteine GspC, GspL und GspM stabilisieren die Komponenten der inneren Membran und verknüpfen diese mit der Sekretionspore in der äußeren Membran. Die spezifische Selektion der Sekretionsprodukte wird vermutlich durch eine Interaktion von GspC- und GspD-Untereinheiten gewährleistet. GspS vermittelt in einigen Bakterienspezies die Lokalisation der GspD-Komponenten in der äußeren Membran und verhindert deren Degradation. Die initiale Translokation der Exoproteine mittels des Sec-/Tat-pathways über die innere Membran ist hier schematisch nur mit einer Komponente angedeutet. Einleitung 24 Generell sind die Gene von T2SS in hochkonservierten Gruppen organisiert. Zumeist sind sie als einzelnes Operon angeordnet, wobei Variationen eher in terminalen 5´und 3´-Bereichen auftreten (Sandkvist, 2001c). Die Expression der T2S Gene ist in vielen Bakterien abhängig von Wachstumsphase und Umweltbedingungen, und auch durch quorum sensing kann die Transkription reguliert werden (Chapon-Hervé et al., 1997). 2.7 T2SS in Y. enterocolitica – ein zweischneidiges Schwert Im Jahr 2003 identifizierten Iwobi et al. den ersten Genkomplex eines Typ-IISekretionssystems (yts1C - S) in Y. enterocolitica mittels Genom-Vergleichsanalysen. Durch Northern Blots, PCRs und in silico Analysen wurde dieses Sekretionssystem auch in anderen Yersinia-Spezies detektiert und zusätzlich ein nahe verwandtes T2SS (Yts2) in einigen Bakterien dieser Gattung ermittelt (Tab. 2-1). Während die T2S-Gene des Yts1-Systems vor allem in hochpathogenen Spezies entdeckt wurden, scheint der zweite Typ-II-Sekretionsapparat (Yts2) in nahezu allen Yersiniae vorzukommen. Die weiteren Untersuchungen am Yts1-Sekretionssystem von Y. enterocolitica zeigten, dass dieses die Virulenz gegenüber Vertebraten beeinflusst. Mäuse, die mit einem yts1E (ATPase)-defizienten Stamm infiziert wurden, wiesen eine 100-fach verringerte Kolonisation von tieferem Gewebe, wie Leber und Milz, auf. Interessanterweise erzeugten nur perorale Applikationen der Bakterien diesen Effekt, während intravenös induzierte Infektionen mit diesem Stamm keinen Unterschied zu dem Wildtyp zeigten. Aufgrund der Tatsache, dass kein Unterschied in der Anzahl der Bakterien, die aus Intestinallavage-Proben und von den Peyer-Plaques isoliert wurden, auftrat, schlussfolgerten die Autoren, dass Yts1 erst nach dem Überwinden der gastrointestinalen Barriere eine wichtige Rolle bei der Infektion spielt. Der molekulare Mechanismus dieses Effekts sowie eventuell sezernierte Proteine konnten jedoch nicht identifiziert werden. Dass das Typ-II-Sekretionssystem in dieser Studie einen Einfluss auf die Säugetierinfektion hat, ist insofern bemerkenswert, als dass die meisten bis dahin untersuchten T2SS mit dem Überleben des jeweiligen Trägerbakteriums als freilebender Organismus assoziiert wurden. Einige Studien jedoch beschreiben eine mögliche duale Funktion der Typ-II-Sekretion, die pathogenen Bakterien sowohl eine erhöhte virulente Kapazität, als auch einen Überlebensvorteil als Umweltkeim verleiht. Einleitung 25 Zu diesen Kandidaten gehören auch die bekannten Erreger Legionella pneumophila (Söderberg et al., 2004; Cianciotto, 2009; McCoy-Simandle et al., 2011) und Vibrio cholerae (Kirn et al., 2005; Stauder et al., 2012; Wong et al., 2012). Tab. 2-1: Auftreten des Yts1- und des Yts2-Sekretionssystems in der Gattung Yersinia. Yts1 (exkl.) Yts2 (exkl.) Yts1 und Yts2 Y. enterocolitica O:8 (8081) Y. enterocolitica O:8 (WA-314) Y. enterocolitica O:13 Y. enterocolitica O:20 Y. enterocolitica O:21 Y. entorocoliticaSpezies Y. enterocolitica O:3 Y. enterocolitica O:5 Y. enterocolitica O:9 Weitere YersiniaSpezies Y. aldovae Y. mollaretii Y. pestis Y. pseudotuberculosis Y. bercovieri Y. frederiksenii Y. kristensenii Y. intermedia Y. rohdei Y. ruckeri In unserer Arbeitsgruppe wurde zu dem Yts1-System in Y. enterocolitica kürzlich eine Studie veröffentlicht, die neben der Bedeutung für die Virulenz in Mäusen, auch über eine Beteiligung an dem Überleben des Bakteriens in der Umwelt spekulieren lässt (Shutinoski et al., 2010). Die bisherigen Ergebnisse dieser Studie, in der auch auf das Yts2-Sekretionssystem eingegangen wird, werden in den nächsten Kapiteln zusammengefasst. 2.7.1 Yts2 in Y. enterocolitica Obwohl nur wenig über das Yts2-Sekretionssystem in Y. enterocolitica bekannt ist und noch keine Sekretionsprodukte identifiziert werden konnten, sollen hier die bisherigen Ergebnisse zusammengestellt werden. Die Entdeckung des Yts2 beruht auf in silicoAnalysen, welche den Yts2-Genkomplex durch die hohe Ähnlichkeit zum Yts1-System identifizierten (Iwobi et al., 2003). Generell folgt der Aufbau des Komplexes bis auf Einleitung 26 folgende Abweichungen dem gängigen T2SS-Modell (Abbildung 2-7). So fehlt in allen Yersinia-Spezies das Gen gspS, einige Spezies besitzen außerdem keine kodierenden Sequenzen für GspH und des Weiteren zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz von GspM-Proteinen eine unerwartet niedrige Homologie zu den Pendants anderer Typ-II-Sekretionssysteme. GspS unterstützt in einigen Bakterien die Inkorporation von den porenformenden Secretin Untereinheiten (GspD) in die äußere Membran und verhindert außerdem die Degradation der Moleküle (Hardie et al., 1996; Shevchik & Condemine, 1998). In manchen Spezies wird die Funktion von GspS jedoch von einem GspAB Komplex übernommen, der vermutlich die Multimerisierung von Secretin Untereinheiten vermittelt und den Transport dieser Multimere in die äußere Membran unterstützt (Ast et al., 2002). Weiterhin gibt es jedoch Bakterien, wie Pseudomonas aeruginosa, die auch ohne GspS/GspAB ein stabiles Porin in der äußeren Membran etablieren können, da sich ihre GspD-Untereinheit durch einen N-terminalen Lipidanker eigenständig in die Membran integriert und multimerisiert (Viarre et al., 2009). Ob die Funktion des GspS-Proteins auch in Yersiniae durch einen dieser Mechanismen ersetzt wird, lässt sich zu dem jetzigen Kenntnisstand nicht vorhersagen. Das GspH ist eines der fünf Pseudopiline, die vermutlich als Teil des Sekretionspilus fungieren (Yanez et al., 2008). Bis jetzt ist jedoch nicht klar, ob alle Pseudopiline für die Assemblierung eines funktionalen Pilus notwendig sind oder ob das Fehlen des GspH durch die anderen vier Pseudopiline kompensiert werden kann. Obwohl das GspM-Protein des Yts2-Systems geringe Homologien zu anderen T2SS aufweist, sprechen doch der berechnete isoelektrische Punkt (IEP) und die vorhergesagte Konformation als bitopisches Membranprotein für eine Funktionalität, wie sie für GspM-Proteine anderer Systeme bereits gezeigt wurde. Hier ist GspM unverzichtbar für den Sekretionsprozess, indem es die spezifische Lokalisation von GspL-Untereinheiten in der inneren Membran dirigiert (Michel et al., 1998). Auffallenderweise sind die beiden T2SS in Y. enterocolitica genetisch an einen putativen Regulator gekoppelt, der den Systemen jeweils vorgeschaltet ist. Im Falle von Yts2 wurde das entsprechende Gen pypC genannt. Analoge Gene finden sich in allen pathogenen und in den meisten opportunistisch pathogenen Yersiniae (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii). Allerdings ist es bis jetzt weder gelungen in vitro-Bedingungen zu identifizieren, die zu einer erhöhten Transkription der yts2-Gene oder des Regulators führen, noch konnten Proteine identifiziert werden, die durch Yts2 sezerniert werden. Einleitung 27 Y. enterocolitica 8081 Yts2 yts2C pypC yts2D bp 1 yts2E yts2F 2500 yts2J yts2I yts2K yts2G 5000 yts2L 7500 put. Regulatorgen put. Protein put. yts2M yts2O 10000 12000 Abbildung 2-7: Schematische Darstellung des yts2-Operons und angrenzender Gene in Y. enterocolitica. Die Größe des Genkomplexes wird in Basenpaaren (bp) angegeben. Die Genbezeichnung einer Y. enterocolitica 8081 Yts2-Untereinheit (yts2(X)) beruht auf dem T2SS-Standardmodell (gsp(X): general secretion yts1I Yts1 Die yts1C yts1Hder (putativen) yts1K yts1O der chiY pathway). Kolorierung der Gene entspricht Funktion kodierten Proteine: pclR yts1D yts1E yts1F yts1G yts1J yts1S Transkriptionsregulatoren (grün), Basiskomponenten des yts1L T2SS yts1M (blau), putative Proteine und Proteine mit unbekannter Funktion (grau) (von Tils et al., 2012). bp 1 2500 5000 7500 10000 12500 Lediglich durch gentechnische Eingriffe konnte eine Beeinflussung des Yts2-Systems beobachtet werden. Hierbei resultierte eine artifizielle Überproduktion von PypC und PypB in einen vierfachen Anstieg der Transkription des yts2C-Gens. Weitere Experimente ergaben, dass pypC Teil des stromabwärts lokalisierten yts2-Operons ist Erwinia amylovora CFBP1430; Erwinia tasmaniensis Et1/99; Erwinia pyrifolia Ep1/96; und dass sein synthetisiertes Protein sowohl als Autoregulator als auch als Regulator Serratia proteamaculans 568 gspI des pypCEAMY_2864/regulator nachgeschalteten yts2-Genkomplexes fungiert (Shutinoski et al., 2010). gspC gspH gspK gspO chb gspD gspE gspG gsp gspL gspM Neben dieser Bedeutung istgspFPypC zusammen mit PypA und gspS PypB jedoch auch J Teil eines komplexen regulatorischen Netzwerks, das die Transkription einer Protease 1 2500 element protease) 5000 7500 10000spezifisch12500 (hreP:bphost responsive kontrolliert, welche während des Pseudomonas aeruginosa PA7; Pseudomonas putida ND6 Infektionsprozesses exprimiert wird (Heusipp et al., 2001; Wagner et al., 2009a). b-type cytochrome putativevon outer membrane secretion proteinregulatorische gspH gspJ Pyp-Netzwerk wird auch Aufgrund der Integration PypC in dieses chbD gspD gspE gspF gspG gspI gspK gspL gspM die Yts2-Expression mit in vivo-Expression und Virulenz von Y. enterocolitica assoziiert. bp 1 2500 5000 7500 10000 Obwohl reverse Transkriptionsanalysen nur eine sehr schwache Transkription von Yts2-Genen bei säugetierspezifischen Temperaturen (37°C) zeigten, kann aufgrund der genannten Assoziation spekuliert werden, ob auch Yts2 von wirtsspezifischen Faktoren abhängig ist. Somit würden eine nachweisliche Aktivität und eine funktionelle Sekretion von Substraten exklusiv in der Mikroumgebung des Wirtes auftreten. Wenn man die Verteilung des Yts2-Sekretionssystems mit in silico-Analysen untersucht, zeigt sich, dass der yts2-Genkomplex in nahezu allen ausreichend sequenzierten Yersinia-Spezies vorhanden ist. Lediglich Y. aldovae und Y. mollaretii weisen keine Yts2-kodierenden Bereiche auf (Tab. 2-1). Einleitung 2.7.2 28 Yts1 in Y. enterocolitica Die chromosomal kodierten Gene des Yts1-Sekretionssystem befinden sich in einer sogenannten Plastizitätszone (PZ: plasticity zone) des Genoms, in der Gene von mehreren virulenzassoziierten Faktoren wie beispielsweise dem T3S-System Ysa beieinander liegen (Thomson et al., 2006; Young, 2007). Die 13 Kernkomponenten (yts1C - M, yts1O, yts1S) des Sekretionsapparates werden mit Ausnahme des auf dem Gegenstrang kodierten Yts1S als Operon transkribiert (Abbildung 2-8). Direkt stromabwärts des Yts1-Operons liegt das als chiY bezeichnete Gen, welches eines der durch Yts1 sezernierten Proteine kodiert. Wie bei Yts2 ist dem Yts1-Genkomplex ebenfalls ein Regulator vorgeschaltet, der aufgrund seiner Ähnlichkeit (44%) zu PypC als PypC-like regulator (PclR) bezeichnet wird (Shutinoski et al., 2010). Untersuchungen zu der Regulation des Yts1-Systems führten zu widersprüchlichen Ergebnissen. Während Iwobi et al. (2003) bei real-time-PCR-Experimenten feststellten, dass die in vitro-Transkription der Yts1-Gene in Übereinstimmung mit dem Mausmodell bei 37°C stärker ist als bei 27°C, wiesen die von Shutinoski et al. (2010) durchgeführten Versuche in eine gegensätzliche Richtung. Hier waren die Transkriptionsrate des Operons und die Sekretion von neu identifizierten Substraten bei niedrigen Temperaturen (17°C) erhöht und nahmen mit steigenden Temperaturen kontinuierlich ab bis bei Wirtstemperaturen (37°C) nahezu keine Aktivität detektiert werden konnte. Ein Grund für das Entstehen der unterschiedlichen Resultate könnte in der Nutzung von verschiedenen Y. enterocolitica 1B-Stämmen liegen. Während Iwobi et al. (2003) den Serotyp-O:8-Stamm WA-314 für ihre Versuche verwendeten, führten Shutinoski et al. (2010) ihre Experimente mit dem nah verwandten O:8-Isolat 8081 durch. Interessanterweise weist das WA-314-Genom stromaufwärts der Yts1Gengruppe ein neues IS-Element (IS1330) auf, welches im 8081-Stamm nicht in diesem Bereich zu finden ist. Ob diese Insertion die Ursache für die unterschiedlichen Ergebnisse ist, müssen zukünftige Untersuchungen noch beweisen. Neben der Temperaturabhängigkeit des Yts1-Systems konnten Shutinoski et al. noch einen weiteren Faktor identifizieren, der einen bedeutenden Einfluss auf die Expression von einem der sezernierten Proteine hat. Hohe Mg2+-Konzentrationen (20 mM) im Kulturmedium vervielfachen die Transkription des chiY-Gens und resultieren in einer erhöhten Konzentration des Proteins im Sekretionsüberstand der Bakterien. Ein Baustein in diesem Mechanismus der Mg2+-Sensitivität könnte der putative Regulator PclR darstellen, welcher nach 5´-RACE(rapid amplification of cDNA-ends)Experimenten als Teil des Yts1-Operons gilt. bp 1 2500 5000 7500 10000 12000 Einleitung 29 Y. enterocolitica 8081 yts1I yts1H yts1K yts1G yts1J Yts1 yts1C pclR yts1D bp 1 yts1E 2500 yts1F 5000 yts1L 7500 yts1O yts1M 10000 chiY yts1S 12500 Abbildung 2-8: Schematische Darstellung des yts1-Operons und angrenzender Gene in Y. enterocolitica. Die Größe des Genkomplexes wird in Basenpaaren (bp) angegeben. Die Genbezeichnung einer Yts1-Untereinheit (yts1(X)) beruht auf dem T2SS-Standardmodell (gsp(X): general secretion pathway). Die Kolorierung der Gene entspricht der (putativen) Funktion der kodierten Proteine: Transkriptionsregulatoren (grün), Basiskomponenten des T2SS (blau), putative Proteine und Erwinia amylovora CFBP1430; Erwinia tasmaniensis Et1/99; Erwinia pyrifolia Ep1/96; Proteine mit unbekannter (grau) und Sekretionssubstrat (orange). Serratia proteamaculansFunktion 568 EAMY_2864/regulator gspC gspD gspE gspI gspH gspK gspG gsp J gspF gspL gspO gspM chb gspS Um die Regulation der Yts1-Expression eingehender zu studieren, testeten Shutinoski et al. die Auswirkung des putativen Regulators PclR auf die yts1-Transkription. Dazu bp 1 2500 5000 7500 10000 12500 nutzten sie ein Plasmid mit induzierbarem Promotor, um eine PclR-Überproduktion Pseudomonas aeruginosa PA7; Pseudomonas putida ND6 (PclR-OP) zu generieren. Die hohen PclR-Konzentrationen führten weder zu einem b-type cytochrome putative outer membrane secretion protein gspH gspJ Anstieg der des nativengspE pclR noch gspL gspM der chbDTranskriptiongspD gspFzu einer gspG verstärkten gspI gspK Transkription yts1-Gene. Aber in Anwesenheit von Mg2+-Ionen bewirkte die PclR-OP eine vermehrte ChiY-Expression und -Sekretion. bp 1 2500 5000 7500 10000 Ob die Mg2+-Ionen direkt mit PclR interagieren und seine Affinität zu der Promotorregion chiYs verstärken, oder ob ein zwischengeschaltetes Sensorsystem die erhöhten Mg2+-Konzentrationen erfasst und die ChiY-Expression beeinflusst, ist bis jetzt noch nicht geklärt. In jedem Falle scheint PclR eine Schlüsselrolle bei der Koordination zwischen Umwelteinflüssen und der Expression des Yts1-Sekretionssystem sowie dem sezernierten Protein ChiY zu fungieren. Im Gegensatz zu der Bedeutung von hohen Mg2+-Konzentrationen auf die Yts1Sekretion, sind die Effekte niedriger Mg2+-Level in Gram-negativen Bakterien wohl bekannt (Stan-Lotter et al., 1979; Smith & Maguire, 1993, 1998). Mehrere Studien identifizierten ein Mg2+-sensitives PhoP/Q system, das einen Einfluss auf die regulatorischen Abläufe des Bakteriums nehmen kann (Wren et al., 1995; Oyston et al., 2000; Erickson et al., 2011). In Salmonella enterica konnte gezeigt werden, dass der membranständige Sensor PhoQ bei geringen Ionen-Konzentrationen das zytosolische PhoP Molekül aktiviert, welches dann wiederum als Transkriptionsfaktor (TF) agiert und die Expression einer Vielzahl von Genen kontrolliert (Shin & Groisman, 2005). Aufgrund dieser Ergebnisse, begann unsere Arbeitsgruppe den Einleitung 30 Effekt von einer PhoP Mutation in Yersinia enterocolitica auf die Yts1-vermittelte TypII-Sekretion zu untersuchen. Interessanterweise wies der PhoP-Deletionsstamm eine reduzierte Fähigkeit auf, die Transkription von chiY zu aktivieren. Daher wird vermutet, dass zumindest ein Teil der Mg2+-sensitiven ChiY Regulation von dem Zweikomponentensystem PhoP/Q beeinflusst wird (Seekircher, 2010). Zusätzlich müssen an der komplexen Regulation des Yts1-Systems noch andere Faktoren beteiligt sein, die zum Beispiel die Temperaturabhängigkeit erklären. In jedem Fall scheinen die Gene des Regulators PclR, des Yts1-Operons und des Sekretionssubstrates ChiY sowohl genetisch als auch funktional gekoppelt zu sein. In silico-Analysen zeigen, dass sie eine Einheit bilden, die wahrscheinlich über horizontalen Gentransfer ausgetauscht wird und homologe Konstellationen in einer Reihe anderer Bakterien gefunden werden können (von Tils et al., 2012). Neben dem erwähnten ChiY wurden noch zwei weitere Yts1-Sekretionsprodukte, die Proteine EngY und YE3650, identifiziert. Anders als bei ChiY scheint ihre Expression konstitutiv reguliert zu sein und wird nicht durch PclR- oder Mg2+Konzentrationen beeinflusst. Die Menge an sezerniertem EngY und YE3650 hängt also im Wesentlichen vom Vorhandensein eines funktionalen Yts1-T2SS ab (Shutinoski et al., 2010). In silico-Analysen gaben auch keinen Hinweis für eine genetische Kopplung von engY und ye3650 mit dem Yts1-System. Zusammengenommen konnten wesentlich mehr Informationen zu der Regulation und Funktion des Yts1 im Vergleich zum Yts2-Sekretionssystem gewonnen werden. Da beide Systeme auf Aminosäureebene eine hohe Ähnlichkeit aufweisen und jeweils einen homologen Regulator aufweisen, wurde auch die Möglichkeit einer Interaktion zwischen den beiden T2SS erwogen. Doch trotz der Ähnlichkeiten konnte bisher kein sogenannter cross talk zwischen Yts1 und Yts2 bestätigt werden. Beispielsweise erhöhte eine PclR-OP nicht die Transkription von Yts2-Genen und induzierte auch keine Sekretion über diese Maschinerie. Andersherum hatte auch eine PypCÜberproduktion keinen Einfluss auf das Yts1-System. Auch Yts1-aktivierende Konditionen wie niedrige Temperaturen (17°C) und hohe Mg2+-Level (20 mM) bewirkten keine Veränderung in der Yts2-Transkription. Einleitung 2.7.2.1 31 Yts1 – Sekretionsprodukte Die drei bisher bekannten sezernierten Proteine des Yts1-T2SS von Y. enterocolitica wurden durch Shutinoski et al. (2010) entdeckt. Sie verglichen die Kulturüberstände von wildtypischen Bakterien mit denen von yts1E-defizienten Stämmen und bestimmten per MALDI-TOF die spezifisch von Yts1 sezernierten Proteine ChiY (YE3576), EngY (YE2830) und YE3650. Außerdem bestätigten in silico-Analysen, dass alle drei Moleküle eine N-terminale Signalsequenz besitzen, die typisch für sezernierte Proteine ist. Das Sekretionssubstrat ChiY ist etwa 53 kDa groß (494 AS mit Signalpeptid) und wird als N-Acetylglucosamin(GlcNac)-bindendes Molekül vorhergesagt (Abbildung 2-9). Es besitzt zwei chitinbindende Domänen und adherierte in Versuchen an Chitinbeschichteten Oberflächen (Shutinoski et al., 2010). Abbildung 2-9: Proteindomänen des Yts1-Sekretionsproduktes ChiY. Die Größe des Proteins beträgt 494 Aminosäuren (AS) inklusive des Signalpeptids. Die in silico identifizierten Domänen werden als graue Rauten dargestellt, während die aromatische Chitin/Zellulose Bindungsstelle als dunklerer Balken angezeigt wird. NCBI Referenz Nr.: YP_001007736.1 ChiY ist nahe verwandt mit anderen N-Acetylglucosamin-bindenden Proteinen wie dem V. cholerae Kolonisationsfaktor GbpA (GlcNAc binding protein A, 40% Übereinstimmung auf AS-Ebene). Für GbpA wurde gezeigt, dass es notwendig für eine effiziente intestinale Kolonisierung ist und dass es die Adhärenz sowohl an humane Epithellzellen sowie an marines Zooplankton vermitteln kann (Stauder et al., 2012). Die Autoren der Studie vermuten, dass GbpA wichtig für das Überleben von Vibrio-Spezies in ihrem natürlichen aquatischen Reservoir ist. Sie spekulieren, dass die ursprüngliche Funktion von GbpA in der Adhärenzvermittlung an Zooplankton liegt und dass aufgrund ähnlicher exponierter Zuckerreste von Säugetierepithelzellen, GbpA auch ein Virulenzfaktor bei der Infektion von Säugetieren geworden ist. Einleitung 32 Wie ChiY wird auch GbpA durch ein T2SS in das extrazelluläre Milieu transportiert (Kirn et al., 2005). Bedenkt man weiterhin, dass auch Yersiniae in aquatischen Habitaten überleben und dass Yersiniae wie Vibrio cholerae ihren Wirt über den Magen-Darmtrakt infizieren, könnte spekuliert werden, ob ChiY nicht eine ähnliche Funktion für die Yersiniae einnimmt wie GbpA für Vibrio cholerae. Das zweite Yts1-Sekretionssubstrat EngY (100 kDa, 808 AS mit Signalpeptid) trägt ebenfalls eine chitinbindende und außerdem eine kohlenhydratbindende Domäne (Abbildung 2-10). Beide sind im C-terminalen Teil des Moleküls ausgeprägt, und eine Affinität zu Chitin-beads konnte nachgewiesen werden (Shutinoski et al., 2010). Außerdem beinhaltet die Aminosäuresequenz von EngY eine Domäne der M60-ähnlichen Superfamilie, deren Mitglieder verwandt sind mit den EnhancinPeptidasen. Die Familie der Enhancin-Peptidasen sind in Baculoviren beschriebene Zink-Metalloproteasen, die in Lepidoptera-Arten das insektoide Mucin des Mitteldarmepithels binden und degradieren können (Wang et al., 1994; Wang & Granados, 1997). Auf diese Weise unterstützen die Proteasen eine Desintegration des Epithels und verstärken die Baculovirus-Infektion von Insekten. Abbildung 2-10: Proteindomänen des Yts1-Sekretionsproduktes EngY. Die Größe des Proteins beträgt 808 Aminosäuren (AS) inklusive des Signalpeptids. Die in silico identifizierten Domänen werden als graue Rauten dargestellt, während die aromatische Chitin/Zellulose Bindungsstelle als dunklerer Balken angezeigt wird. Die Lokalisierung der kohlenhydratnbindenden Domäne wird durch die Beschriftung gekennzeichnet. NCBI Referenz Nr.: YP_001007019.1 Die Expression der nah verwandten M60-ähnlichen Protease in pathogenen und apathogenen Bakterien wurde kürzlich mit einem erfolgreichen Verlauf der Kolonisation von Magen-Darmtrakt und mukosalen Oberflächen in Invertebraten und Vertebraten assoziiert (Nakjang et al., 2012). Neueste Untersuchungen an Enterotoxischen E. coli (ETEC) belegen, dass die M60-ähnliche-Metalloprotease SslE (secreted and surface-associated lipoprotein from E. coli, ehemals YghJ) intestinale Mucine (MUC2, MUC3) degradiert und dadurch den Zugang zu den Enterozyten des Einleitung 33 Dünndarms und eine effiziente Übermittlung des hitzelabilen Enterotoxins LT (heatlabile toxin) gewährleistet (Luo et al., 2014a). Wie EngY wird auch diese Metalloprotease über ein Typ-II-Sekretionssystem sezerniert. Da im Tiermodell die Immunisierung mit SslE zu einer signifikant reduzierten Kolonisierung von Darm, Nieren und Milz während einer ETEC-Infektion führten, empfehlen neueste Studien den Einsatz von SslE als Antigen einer Impfung gegen pathogene E. coli (Nesta et al., 2014). Für EngY konnte bisher keine katalytische Aktivität nachgewiesen werden, und es wird noch zu untersuchen sein, ob das Protein nur an chitinhaltige Oberflächen binden kann, oder ob es auch wichtig für die Mucinbindung während der VertebratenInfektion ist. Abbildung 2-11: Proteindomänen des Yts1-Sekretionsproduktes YE3650. Die Größe des Proteins beträgt 679 Aminosäuren (AS) inklusive des Signalpeptids. Die in silico identifizierte partielle Domäne der Pektinase wird als graue Raute dargestellt, während das vorausgesagte Ende der partiellen Pektinase-3-Domäne durch ein Pfeilsymbol gekennzeichnet ist. NCBI Referenz Nr.: YP_001007806.1 Auch das dritte sezernierte Protein, YE3650, kann putativ mit der Bindung an Kohlenhydrate assoziiert werden (Abbildung 2-11). YE3650 hat eine molekulare Masse von etwa 72 kDa und enthält Teile einer Pektinasen-Domäne. Pektinasen sind pflanzenvirulente Faktoren, die typischerweise in pflanzenpathogenen Bakterien wie Erwinia chrysanthemi vorkommen (Tardy et al., 1997). Es handelt sich hierbei um depolimerisierende Enzyme, die die Pectinsäurebestandteile der Wirtspflanzen abbauen und zu Zelltod und zur Mazeration des Gewebes führen (Henrissat et al., 1995; Xie et al., 2012). Allerdings ist die putative Pektinase-Domäne von YE3650 eher kurz (79 AS) und wird annotiert als partiell kodierende Sequenz. Daher ist es fraglich, ob diese Sequenz Einleitung 34 eine funktionale katalytische Struktur formen kann. Auch für die kohlenhydratbindende Domäne des Proteins konnte noch kein spezifisches Substrat identifiziert werden. 2.8 Zielsetzung In vorangehenden Studien unserer Arbeitsgruppe wurden die Sekretionsprodukte ChiY, EngY und YE3650 des T2S-Systems Yts1 identifiziert (Shutinoski et al., 2010). Bei Untersuchungen zur Regulation des Sekretionssystems und seiner Produkte wurde deutlich, dass eine Aktivierung in vitro exklusiv bei niederen Temperaturen (17°C - 26°C) stattfindet und dass mit diesem Ergebnis eine Diskrepanz zu den in vivo-Versuchen der Mausexperimente von Iwobi et al. (2010) aufgeworfen wurde. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte daher zunächst die Bedeutung des Yts1Sekretionssystems bei der Infektion von Säugetieren näher untersucht werden. Dazu sollte in vivo die Expression der bisher entdeckten Sekretionssubstrate nachgewiesen werden (u. a. über spezifische Antikörper). Außerdem sollten Transkriptionsanalysen des Yts1-Systems unter infektionsnahen Bedingungen durchgeführt werden. Da die Arbeitsgruppen Iwobi et al. (2003) und Shutinoski et al. (2010) zwei verschiedene Yersinia O:8-Stämme verwendeten, bestand ein Aspekt darin, eventuelle Unterschiede dieser beiden Stämme zu untersuchen. Die chitinbindenden Eigenschaften von ChiY und EngY und die niedrigen Aktivierungstemperaturen deuten darauf hin, dass das Yts1-System auch bei der Verbreitung von Y. enterocolitica in der Umwelt eine Rolle spielen könnte. Aufgrund dieser Annahme ist der zweite Teil der Zielsetzung auf die Frage ausgerichtet, ob Yts1 bei der Infektion von Invertebraten zum Tragen kommt. Dazu sollten zunächst in silico-Analysen zu den putativen Funktionen der Sekretionssubstrate und des Sekretionssystems durchgeführt werden. Außerdem sollte die Transkription des Yts1Systems unter in vitro-Bedingungen genauer charakterisiert werden. Um schließlich die Funktion von Yts1 bei der Infektion von Invertebraten zu untersuchen, sollten alternative Tiermodelle etabliert werden. Material 3 35 Material 3.1 Bakterienstämme Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten hausinternen Yersinia- und E. coli-Stämme werden in den folgenden Tabellen (Tab. 3-1; Tab. 3-2) aufgeführt und näher gekennzeichnet. Die verwendeten Stämme, die als klinische Isolate oder als Umweltisolate von Kooperationspartnern zur Verfügung gestellt wurden, sind in Tabelle 3-3 aufgeführt. Tab. 3-1: Verwendete Yersinia-Stämme. Stamm Serotyp/Beschreibung JB580v ΔyenR (r m ) Nal , Serotyp O:8, Biotyp 1B (Kinder et al., 1993) GHY124 JB580v, pVLT::gfp (Shutinoski et al., 2010) GHY414 JB580v, yts1C-lacZYA (Shutinoski et al., 2010) GHY437 JB580v, pclR-lacZYA (Shutinoski et al., 2010) GHY474 JB580v, Δyts1E (Shutinoski et al., 2010) GHY494 JB580v, chiY-lacZYA (Shutinoski et al., 2010) GHY620 JB580v, Δyts1E, pVLT::gfp diese Arbeit - + r Referenz/Quelle Tab. 3-2: Verwendete Escherichia coli-Stämme. Stamm Serotyp/Beschreibung Referenz DH5α F-; endA1, recA1, hsdR17(rK- MK+), deoR, thi-1, supE44, (Hanahan, 1983) gyrA96, Δ(argF-lac) U169 (φ80dlacZΔM15) BL21 (DE3) F-, hsdSB (rB-mB-), dcm, gal, ompT, (λDE3) (Studier & Moffatt, 1986) OP50 OP50 ura (Brenner, 1974) Material 36 Tab. 3-3: Verwendete Bakterienisolate. Bakterien Isolat Biotyp Serotyp Referenz /Quelle Y. enterocolitica 5-CW 1A n.a. S. Fanning 1 Y. enterocolitica 5-152 3 O:9 S. Fanning 1 Y. enterocolitica 5-153 3 O:9 S. Fanning 1 Y. enterocolitica 5-160 3 O:9 S. Fanning 1 Y. enterocolitica 4-113 1A n. a. S. Fanning 1 Y. enterocolitica 4-113T 1A n. a. S. Fanning 1 Y. enterocolitica C65 1A n. a. S. Fanning 1 Y. enterocolitica 2-58 3 O:9 S. Fanning 1 Y. enterocolitica R-156 1A n. a. S. Fanning 1 Y. enterocolitica 5-LF 1A n. a. S. Fanning 1 Yersinia enterocolitica 10-02772 4 O:3 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 09-03424 3 O:9 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 09-03293 4 O:3 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 09-02690 4 O:3 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 09-02689 3 O:9 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 09-05838 4 O:3 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 10-01825 4 O:3 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 10-02723 4 O:3 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 10-01826 3 O:9 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 09-05837 3 O:9 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 09-03294 4 O:3 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 10-02773 4 O:3 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica WA-314 1B O:8 A. Flieger 2 Yersinia enterocolitica 10-02771 4 O:3 A. Flieger 2 Yersinia frederiksenii 09-03496 n. a. n. a. A. Flieger 2 Material Bakterien 37 Isolat Biotyp Serotyp Referenz /Quelle Yersinia frederiksenii 08-00044 n. a. n. a. A. Flieger 2 Yersinia intermedia 09-03820 n. a. n. a. A. Flieger 2 Yersinia intermedia 09-04560 n. a. n. a. A. Flieger 2 Yersinia kristensenii 10-01656 n. a. n. a. A. Flieger 2 Yersinia mollaretii 08-02785 n. a. n. a. A. Flieger 2 Yersinia mollaretii 08-07914 n. a. n. a. A. Flieger 2 Yersinia mollaretii 09-00773 n. a. n. a. A. Flieger 2 Erwinia amylovora CFBP1430 n. a. n. a. A. Wensing 3 EP1/96 n. a. n. a. A. Wensing 3 Erwinia pyrifoliae 1 Prof. Séamus Fannung (University College Dublin, Irland) Prof. Dr. Antje Flieger (Robert Koch-Insititut, Bereich Wernigerode, Deutschland) 3 Dr. Annette Wensing (Julius Kuehn Institut, Dossenheim, Deutschland) 2 3.2 Eukaryotische Zelllinien Für Transkriptionsanalysen bakterieller Gene und die Infektion eukaryotischer Zellen mit Y. enterocolitica wurden in dieser Arbeit drei verschiedene Zelllinien eingesetzt. Die verwendete T84-Zelllinie wurde aus einem humanen epithelialen Kolonkarzinom etabliert (ECACC-Nr. 88021101), während die THP-1 Zelllinie aus einer akuten humanen monozytischen Leukämie-Erkrankung hervorgeht (Murakami & Masui, 1980; Tsuchiya et al., 1980). Die Raji-Zellen werden als Lymphoblasten-ähnliche Zelllinie eingeordnet und stammen von einer B-Lymphozyte eines Patienten mit BurkittLymphom (Pulvertaft, 1964). 3.3 Verwendete Modellorganismen In dieser Arbeit wurden mit der Großen Wachsmotte (Galleria mellonella), dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans und dem Salinenkrebs (Artemia salina) drei Invertebraten-Arten als Modellorganismen einer Y. enterocolitica-Infektion verwendet. Die Larven der Großen Wachsmotte wurden im letzten Larvenstadium von einem Händler bezogen (HW-Terra KG, Aurachtal). Ein Grundstock des C. elegans-Wildtyps Material 38 wurde freundlicherweise von Frau Professor Eva Liebau (Institut für Zoophysiologie, Münster) bereitgestellt und die adulten Tiere des Salinenkrebses wurden wenige Tage vor den jeweiligen Infektionsversuchen von der Tierhandlung Kölle Zoo (Münster) erworben. 3.4 Vektoren und rekombinante Plasmide In der Tabelle (Tab. 3-4) sind die in dieser Arbeit verwendeten Vektoren, sowie die klonierten Plasmide aufgeführt. Tab. 3-4: Verwendete Vektoren und rekombinante Plasmide. Vektor/Plasmid Beschreibung pEP185.2 Cam ; mob (RP4); R6K ori (Suizidvektor) pET24b(+) Kan ; T7-Promotor Expressionsvektor; r Referenz + r (Kinder et al., 1993) Novagen C-terminaler His6-Tag pWSK129 pVLT33 r Kan , pSC101 ori, lacZα (low copy cloning (Wang & Kushner, vector) 1991) r + + pMMB207-Derivat; Kan ; rep ; mob ; Ptac- (de Lorenzo et al., Promotor 1993) r J. Gärtner r diese Arbeit pVLT-gfp Kan ; Derivat von pVLT33; gfp pET-pclR Kan ; Derivat von pET24b(+); pclR pEP-EngYflanks Cam ; Derivat von pEP185.2; engY mit je r diese Arbeit 500 bp flankierender Sequenzen pWSK-EngYHIS r Kan ; Derivat von pWSK129; engY inklusive diese Arbeit C-terminalem His6-Tag pWSK-Ye3650HIS r Kan ; Derivat von pWSK129; ye3650 inklusive C-terminalem His6-Tag diese Arbeit Material 3.5 39 Oligonukleotide In der Tabelle (Tab. 3-5) sind die in dieser Arbeit eingesetzten Oligonukleotide aufgeführt. Alle Primer wurden von der Firma MWG Biotech AG (Ebersberg) bezogen. Tab. 3-5: Eingesetzte Oligonukleotide bei Klonierungs- und PCR-Ansätzen. Die palindromischen Erkennungsequenzen der Endonukleasen sind unterstrichen dargestellt. Bezeichnung Sequenz (5´3´) Beschreibung Endonuklease Fw_pET-pclR Rv_pET-pclR Fw_pEP-engY Rv_pEP-engy Fw_ye3650his Rv_ye3650his GGAATTCCATATGAT- forward primer für pclR- GTTAAATAGGGAAGAATGC Klonierung in pET24b(+) CCGCTCGAGTGAAGATA- reverse primer für pclR- TAAATAATGAACG Klonierung in pET24b(+) GGGGTACCTAGTAATGTAT- forward primer für engY- GACGCCATGA Klonierung in pEP185.2 TGCTCTAGAGCACTGGAT- reverse primer für engY- GAGTCAGTGGAAA Klonierung in pEP185.2 GCTCTAGAGATTAACTAAT- forward primer für ye3650- GCCTGTAATGC Klonierung in pWSK129 CGGGATCCTTAGTGGTGGT- reverse primer für ye3650- GATGATGATGATTAATACT- Klonierung in pWSK129 Nde I Xho I Kpn I Xba I Xba I BamH I GATAGCTACTTTTGCCGA Fw_engYhis Rv_engYhis GCTCTAGAGTCATCTCA- forward primer für engY- CACTGCTGGATTT Klonierung in pWSK129 CGGGATCCTTAGTGGTGGT- reverse primer für engY- GATGATGATGGCAGGCGCCTT- Klonierung in pWSK129 TATCCTCCCAAACCTT Fw_chiYcs TGGGACGTATCTGATACT forward primer für Nachweis von chiY Rv_chiYcs Fw_engYcs AATCACCAGCGTATGTTTAC- reverse primer für CCGC Nachweis von chiY TTCGCCGAGTTGGTAGGT forward primer für Nachweis von engY Xba I BamH I Material 40 Bezeichnung Beschreibung Sequenz (5´3´) Endonuklease Rv_engYcs reverse primer für ATCACCGAGGCGTTGGTAGAA Nachweis von engY Fw_ye3650cs Rv_ye3650cs 3.6 GCAGGTTGGTATGCGACTGAT- forward primer für GGG Nachweis von ye3650 TAAGAATTCGCCGTGAG- reverse primer für TACTACG Nachweis von ye3650 Enzyme für die Molekularbiologie Für molekularbiologische Experimente wurden in dieser Arbeit folgende Enzyme eingesetzt (Tab. 3-6). Tab. 3-6: Enzyme für molekularbiologische Experimente. Enzym Funktion/Aktivität Phusion-DNA-Polymerase 5'3' DNA-Polymerase-Aktivität 3'5' Exonuklease-Aktivität; 2 U/µl Restriktionsendonukleasen ▼ BamH I - G GATTC ▼ Kpn I - GGTAC C ▼ Nde I - CA TATG Bezugsquelle Finnzymes (Espoo, Finnland) Fermentas (St. Leon-Roth)/ Segenetic (Borken) ▼ Xba I - T CTAGA ▼ Xho I - C TCGAG T4 DNA-Ligase Phosphodiesterbindungen zwischen 3'- und 5'- Termini; 1 U/Pl Taq-DNA-Polymerase 5'3' DNA-Polymerase-Aktivität; 5 U/µl Fermentas (St. Leon-Rot) Segenetic (Borken) Material 3.7 41 Antikörper Die in dieser Arbeit verwendeten Primär- und Sekundärantikorper, sowie die empfohlenen Verdünnungen sind aus der folgenden Tabelle (Tab. 3-7) zu entnehmen. Tab. 3-7: Verwendete primäre und sekundäre Antikörper (AK). Bezeichnung α-anti Histidin Verdünnung 1:10.000 Beschreibung polyklonaler AK aus der Maus Referenz Dianova (Hamburg) gegen Histidin-Epitope α-ChiY 1:7500 Polyklonaler AK aus Kaninchen diese Arbeit gegen ChiY GAM-PO 1:10.000 monoklonaler AK aus der Dianova (Hamburg) Ziege, konjugiert mit Peroxidase (PO) gegen MausIgG GAR-PO 1:7.500 monoklonaler AK aus der Ziege, konjugiert mit Peroxidase (PO) gegen Jackson Immuno-Research Europe Ltd. (Newmarket, UK) Kaninchen-IgG GAM-AP 1:10.000 monoklonaler AK aus der Dianova (Hamburg) Ziege, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (AP) gegen Maus-IgG GAR-AP 1:10.000 monoklonaler AK aus der Dianova (Hamburg) Ziege, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (AP) gegen Kaninchen-IgG GAHu-PO 1:10.000 monoklonaler AK aus der Ziege, konjugiert mit Peroxidase (PO) gegen Human-IgG Dianova (Hamburg) Material 3.8 42 Reagenziensysteme und Kits In Tabelle (Tab. 3-8) sind die in dieser Arbeit verwendeten, kommerziellen Reagenziensysteme und Kits aufgeführt. Tab. 3-8: Eingesetzte Reagenziensysteme und Kits unter Angabe des jeweiligen Herstellers. Bezeichnung Hersteller BCA™ Protein Assay Kit Pierce (Rockford, IL, USA) FavorPrep™ GEL/PCR Purification Kit Favorgen (Wien) FavorPrep™ Plasmid DNA Extraction Mini Kit Favorgen (Wien) NucleoBond Xtra® Midi Macherey-Nagel (Düren) The illustra™ Bacteria genomicPrep Mini Spin Kit GE Healthcare (München) Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Promega (Mannheim) Zyppy™ Plasmid Miniprep Kit Zymo Research (Freiburg) 3.9 Größenstandards 3.9.1 DNA-Größenstandards Für die Größenbestimmung von DNA-Fragmenten in einem Agarose-Gel wurden der „100 bp DNA Marker“ und der „1 kb DNA Marker“ von der Firma Segenetic (Borken) verwendet. Fragmentgrößen „100 bp DNA Marker“ (bp): 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100. Fragmentgrößen „1 kb DNA Marker“ (bp): 10.000, 8.000, 6.000, 5.000, 4.000, 3.000, 2.500, 2.000, 1.500, 750, 500, 250. Material 3.9.2 43 Protein-Größenstandards Die Bestimmung der molekularen Masse von Proteinen in einer SDS-PolyacrylamidGelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde durch die Verwendung des SeeBlue®Plus2 Prestained-Proteingrößenstandards (Tab. 3-9) der Firma Invitrogen (Darmstadt) vorgenommen. Tab. 3-9: Angewandter Protein-Größenstandard. Aufgelistet sind die als Standard verwendeten Proteine und deren molekulare Massen. Standardprotein Molekulare Masse [kDa] Myosin 250 Phosphorylase B 148 BSA 98 Glutamindehydrogenase 64 Alkoholdehydrogenase 50 Carbonanhydrase 36 Myoglobinrot 22 Lysozym 16 Aprotinin 6 Insulin, B-Kette 4 3.10 Kulturmedien 3.10.1 Kulturmedium und Kulturplatten zur Kultivierung von Bakterien Die Kultivierung von Bakterien erfolgte in LB-Medium (lysogeny broth) und auf LBKulturplatten (Bertani, 1951). Zur Herstellung dieses Komplexmediums wurden die in der Tabelle (siehe unten) angegebenen Inhaltsstoffe in 1 l H2Odd gelöst und autoklaviert. Anschließend wurde das Medium bei Raumtemperatur (RT) gelagert. Bei der Herstellung von LB-Kulturplatten wurden zusätzlich 12 g/l Bacto-Agar (Applichem, Darmstadt) eingewogen. Nach dem Abkühlen der autoklavierten Lösungen auf etwa Material 44 55°C wurden je nach Bedarf Antibiotika (Tab. 3-10) zugefügt und das AgargelKulturmedium unter sterilen Bedingungen in Petrischalen gegossen. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. LB-(lysogeny broth) Medium Bacto-Trypton Hefe-Extrakt 10 g 5g NaCl 10 g H2Odd ad 1 l Tab. 3-10: Verwendete Antibiotika unter Angabe der eingesetzten Konzentration in Yersinia- und E. coli-Kulturen. Antibiotikum Eingesetzte Konzentration [µg/ml] Y. enterocolitica E. coli 12,5 25 2,5 - 100 25 25 - Ampicillin (in H2Odd) Chloramphenicol (in 100% EtOH) Cycloserin (in H2Odd) Gentamycin (in H2Odd) Kanamycin (in H2Odd) Nalidixinsäure (in 0,5 M NaOH) 3.10.2 Kulturmedien und Reagenzien für die Kultivierung von C. elegans Zur Aufzucht und Infektion von C. elegans wurden die Tiere auf NGM(Nematode Growth Medium)-Agar gehalten. Als Nahrung dienten den Nematoden dabei E. coli OP50-Bakterien, die zuvor auf den Agarplatten ausgestrichen wurden. Für die Herstellung des NGM-Agars wurden die in der Tabelle (siehe unten) angegebenen Material 45 Komponenten ausgewogen, in einem 2 Liter Erlenmeyerkolben vermischt und autoklaviert. In der Abkühlphase der Lösung wurden bei ca. 55°C folgende sterile Lösungen hinzugefügt: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml Cholesterol (in Ethanol), 1 ml 1 M MgSO4 und 25 ml 1 M KPO4. Unter sterilen Bedingungen wurde der Agar anschließend in Petrischalen (Durchmesser: 3 cm und 10 cm) gefüllt und die Platten konnten nach dem Aushärten des Agars bei 4°C gelagert werden. Für die Infektionsversuche und für die Synchronisierung der C. elegans Populationen (siehe 4.6.3.2) wurde außerdem ein sogenanntes S-Medium sowie eine Bleichlösung benötigt. Das S-Medium wurde frisch hergestellt, indem zu 1 Liter autoklavierter SBasal-Lösung (siehe unten) folgende sterile Lösungen hinzugefügt wurden: 10 ml 1 M Kalimcitrat pH 6, 10 ml einer Spurenelementlösung (siehe unten), 3 ml 1 M CaCl2, 3 ml 1 M MgSO4. Die Bleichlösung wurde jeweils frisch angesetzt und enthielt 0,5 ml 5 N NaOH und 1 ml einer 5%igen NaClO-Lösung. S-Basal-Lösung NaCl Spurenelement-Lösung 5,85 g Na2EDTA 1,86 g K2HPO4 1g F2SO4 ∙ 7 H2O 0,69 g KH2PO4 6g MnCl ∙ 4 H2O 0,2 g Cholesterol 1 ml (5mg/ml in EtOH) H2Odd ad 1 l Autoklavieren NGM-Agar 3g 2,5 g Pepton 17 g H2Odd 0,29 g CuSO4 ∙ 5 H2O 0,025 g H2Odd Autoklavieren und dunkel lagern NaCl Agar ZnSO4 ∙ 7 H2O ad 1 l ad 1 l Material 46 3.10.3 Kulturmedien und Reagenzien für die Kultivierung und Infektion eukaryotischer Zelllinien Zur Kultivierung und Infektion eukaryotischer Zelllinien wurden die unten aufgelisteten Materialien eingesetzt (Tab. 3-11). Tab. 3-11: Eingesetzte Medien, Lösungen und Reagenzien bei der Kultivierung und Infektion von eukaryotischen Zelllinien. Bezeichnung Beschreibung DMEM/Ham´s F12 Dulbecco’s Minimal Eagle Medium und Ham´s F12- with L-Glutamine Medium; Komplexmedium (1:1) D-PBS mit/ohne Ca 2+ und Mg 2+ Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline mit und ohne 2+ Ca Mycoplex FBS und Mg 2+ Fötales Rinderserum, sterilfiltriert und UV-behandelt (Chargennr.: A10507-0361) Pen/Strep (100 x) Penicillin/Streptomycin Trypsin/EDTA (10 x) 0,5%/0,2% (w/v) in PBS Alle Zellkulturmedien und –Reagenzien wurden von der Firma PAA Laboratories GmbH (Cölbe) bezogen. Die Kultivierung der in dieser Arbeit verwendeten eukaryotischen Zelllinien erfolgte in den folgenden Kulturmedien. Kulturmedium für Raji- und THP1-Zellen RPMI 1640 Medium, mit L-Glutamin Mycoplex FBS Pen/Strep (100 x) 500 ml 10% (v/v) 1% (v/v) Kulturmedium für T84-Zellen DMEM/Ham´s F12, with L-Glutamine Mycoplex FBS Pen/Strep (100 x) 500 ml 10% (v/v) 1% (v/v) Material 47 3.11 Lösungen und Puffer Die im Folgenden aufgeführten Lösungen und Puffer (Tab. 3-12) stellen die Grundlage der täglichen Labortätigkeit dar und wurden in diversen Arbeitsabläufen eingesetzt. Soweit nicht anders angegeben wurden die Reagenzien bei RT gelagert. Die Zusammensetzung weiterer Lösungen und Puffer, die spezifisch für bestimmte Methoden eingesetzt wurden, findet sich im Zuge der Protokollbeschreibung im Methodenteil dieser Arbeit. Tab. 3-12: Standardmäßig verwendete Puffer und Lösungen. Angegeben sind die mengenmäßige Zusammensetzung und Hinweise zur Erstellung bzw. Handhabung. Lösung/Puffer Arabinose (20%) [w/v] Zusammensetzung/Handhabung Arabinose H2Odd Mengenangabe 20 g ad. 100 ml steril filtriert, Lagerung bei RT D-PBS (10 x) NaCl 80 g KCl 2g KH2PO4 2g Na2HPO4 x 2 H2O H2Odd 14,4 g ad 1 l pH 7,4 D-PBS-T (1 x) D-PBS (10 x) Tween-20 EDTA (0,5 M) 100 ml 1 ml H2Odd ad 1 l EDTA 46,53 g H2Odd ad 250 ml pH 8 Material Lösung/Puffer Glukose (20%) [w/v] 48 Zusammensetzung/Handhabung Glukose H2Odd Mengenangabe 20 g ad. 100 ml steril filtriert, Lagerung bei RT Kanamycin (1000 x) Kanamycin in H2Odd 50 mg/ml steril filtriert, Lagerung bei -20°C Nalidixinsäure (1000 x) Nalidixinsäure in H2Odd 25 mg/ml steril filtriert, Lagerung bei -20°C SDS (20% w/v) SDS H2Odd TAE-Puffer (50 x) Tris Eisessig 50 g ad 250 ml 242 g 57,1 ml EDTA 37,2 g H2Odd 1l pH 8,3 TE-Puffer 1 M Tris-HCl, pH 8 0,5 M EDTA Tris-HCl (1 M) 100 µl 20 µl H2Odd ad 10 ml Tris 30,275 g H2Odd pH nach Bedarf mit HCl eingestellt ad 250 ml Material 49 3.12 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien In nachfolgender Tabelle (Tab. 3-13) sind die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und Verbrauchsmaterialien aufgeführt. Alle Chemikalien wurden in analytischen Reinheitsgraden bezogen. Tab. 3-13: Verwendete Chemikalien und Verbrauchsmaterialien unter Angabe des Herstellers. Bezeichnung Hersteller -Mercaptoethanol Roth (Karlsruhe) 24- und 48-well Zellkulturschalen Nunc (Wiesbaden) Aceton Roth (Karlsruhe) Acrylamid, 30% AppliChem (Darmstadt) Agarose Sigma-Aldrich Chemie (Taufkirchen) Ammoniumpersulfat (APS) Sigma-Aldrich Chemie (Taufkirchen) ArtemioSal JBL (Neuhofen) Bacto-Agar BD Bioscience (Heidelberg) TM BCA Protein Assay Reagent Pierce (Rockford, IL, USA) Bromphenolblau Serva (Heidelberg) BSA Roth (Karlsruhe) Chloramphenicol Serva (Heidelberg) Deckgläser (ø 12 mm, ø 18 mm) Karl Hecht AG (Sondheim) Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) Merck (Darmstadt) Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich Chemie (Taufkirchen) Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck (Darmstadt) ECL Western Blotting Substrate Pierce (Rockford, IL, USA) Essigsäure Roth (Karlsruhe) Ethanol, 70% AppliChem (Darmstadt) Ethanol,100% Roth (Karlsruhe) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Roth (Karlsruhe) Material 50 Bezeichnung Hersteller Ethylenglycoltetraessigsäure (EGTA) Roth (Karlsruhe) Glycerin Roth (Karlsruhe) Glycin Roth (Karlsruhe) Hamiltonspritze 700, 701 N 10µLSYR Hamilton Bonaduz (Bonaduz,Schweiz) Harnstoff AppliChem (Darmstadt) Imidazol Sigma-Aldrich Chemie (Taufkirchen) Isopropanol Roth (Karlsruhe) Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG ) Roth (Karlsruhe) Kaliumchlorid (KCl) Merck (Darmstadt) Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) Merck (Darmstadt) Kanamycin Roth (Karlsruhe) Kanülen BD Microlance TM 3 BD Bioscience (Heidelberg) Küvetten (10 x 4 x 45 mm) Sarstedt (Nürnberg) Magermilchpulver Fluka (Neu-Ulm) Methanol AppliChem (Darmstadt) N, N, N´,N´- Tetramethylethylendiamin (TEMED) Biorad (München) Natriumazid (NaN3) Sigma-Aldrich Chemie (Taufkirchen) Natriumchlorid (NaCl) Roth (Karlsruhe) Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma-Aldrich Chemie (Taufkirchen) Natriumhydroxid (NaOH) AppliChem (Darmstadt) Neubauer Zählkammer W. Schreck (Hofheim) Nitrozellulose Membran PROTAN® Schleicher & Schuell (Dassel) Objektträger (76 x 26 cm) Engelbrecht (Edermünde) Palmitinsäure Sigma-Aldrich Chemie (Taufkirchen) PCR-Reaktionsgefäße (100 µl) Kisker (Steinfurt) Petrischalen Sarstedt (Nürnberg) Material 51 Bezeichnung Hersteller Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Immobilon-P Transfer Millipore (Schwalbach) Membran Protino Ni-NTA Agarose Macherey-Nagel (Düren) Quarzküvette (QS 10 mm) Hellma (Mühlheim) Reaktionsgefäße (1,5 ml) Sarstedt (Nürnberg) Reaktionsgefäße (2 ml) Eppendorf AG (Hamburg) Salzsäure (25%, 35%) Roth (Karlsruhe) Spritze BD Discardit TM II BD Bioscience (Heidelberg) Trichloressigsäure Roth (Karlsruhe) Tris-Base AppliChem (Darmstadt) Triton X-100 AppliChem (Darmstadt) Tween-20 AppliChem (Darmstadt) Whirlpak® Nasco (Fort Atkinson, Wisconsin USA) Zellkultur Plastikverbrauchsmaterialien Greiner bio-one (Essen) Zentrifugenröhrchen Beckmann Coulter (München) Zentrifugenröhrchen Falcon 15 ml, 50 ml BD Bioscience (Heidelberg) Zinksulfat Sigma-Aldrich Chemie (Taufkirchen) 3.13 Geräte In dieser Arbeit wurden folgende labortechnische Geräte verwendet (Tab. 3-14). Tab. 3-14: Labortechnische Geräte und deren Hersteller. Bezeichnung Hersteller/Bezugsquelle Autoklav Vaculab S 3000 und Vaculab HP MMM GmbH (München) BIOTRAP Starterkit Schleicher & Schuell (Dassel) Brutschrank Biocenter 2001 Integra Biosciences (Fernwald) Material 52 Bezeichnung Hersteller/Bezugsquelle Brutschrank Heracell Heraeus (Hanau) Elektrophoresekammer SDS-PAGE Hoefer Scientific Instruments (Freiburg) E-Max Precision Microplate Reader MWG (Ebersberg) Geltrockner Hoefer Scientific Instruments (Freiburg) Inkubator Minitron HT Infors (Bottmingen) Inversmikroskop Axiovert 100 Carl Zeiss (Oberkochen) Kippschüttler Duomax 1030 Heidolph (Nürnberg) Konfokal-Mikroskop CFSM LSM510 Carl Zeiss (Oberkochen) Lumi-Imager TMF1 Roche Applied Science (Mannheim) Magnetrührer Merck (Darmstadt) Phasenkontrastmikroskop BH-2 Olympus (Hamburg) Photomikroskop Axiophot Carl Zeiss (Oberkochen) Sterilbänke Tecnoflow Integra Biosciences (Fernwald) T1 Thermocycler Biometra (Göttingen) Transblot SD Semidry Transfer Cell Bio-Rad (München) Ultra-Kryomikrotom Leica (Wetzlar) Ultraschallgerät Modell 450/250 Sonifier G. Heinemann (Schwäbisch Gmünd) Vortex Bender & Hobein AG (Zürich, CH) Wasserbad GFL (Burgwedel) Zentrifuge Beckmann J2-MI Beckmann (München) Zentrifuge Eppendorf 5417R Eppendorf (Hanau) Zentrifuge Heraeus Sepatech Varifuge 3.OR Heraeus (Hanau) Zentrifuge Varifuge 3.0R Heraeus (Hanau) Material 53 3.14 Programme Die bei dieser Arbeit genutzten Programme und deren Anwendungen sind in der folgenden Tabelle (Tab. 3-15) aufgeführt. Tab. 3-15: Verwendete Programme und ihre Anwendung. Bezeichnung Anwendung Hersteller CellQuest™ Pro Aufnahme der Plots am BD Biosciences Durchflusszytometer (Heidelberg) Dokumentation und Quantifizierung Boehringer von HRP-Signalen im Western Blot (Ingelheim) Statistische Auswertung und GraphPad Software, Diagrammerstellung San Diego, California Lumi Analyst™ Software GraphPad Prism USA MacVector DNA-Sequenzanalysen Accelrys (Cambridge, UK) Methoden 4 54 Methoden 4.1 Mikrobiologische Methoden Die hier vorgenommenen mikrobiologischen Arbeiten wurden nach den Regeln der guten mikrobiologischen Laborpraxis (GMP-Regeln) und den Sicherheitsvorschriften der Stufe 2 (GenTG) durchgeführt. 4.1.1 Anzucht und Stammhaltung von Bakterien Die längerfristige Aufbewahrung von Bakterienstämmen erfolgte als Glycerinkultur. Dazu wurde 1 ml einer Bakteriensuspension bei 14000 g für 1 min zentrifugiert und das Pellet in LB-Medium und 15% Glycerin resuspendiert. Nach der Abkühlung in flüssigem Stickstoff wurden die Glycerinkulturen bei -70°C gelagert. Um Einzelkolonien eines Yersinia- oder E. coli-Stämmes zu erhalten, wurden die Bakterien mit einem sterilen Zahnstocher aus einer Glycerinkultur auf LB-Agarplatten mit entsprechender Antibiotika Supplementation übertragen und ein Vereinzelungsausstrich durchgeführt. Je nach Bakterienstamm wurden die LB-Agarplatten dann bei 26°C (Yersinia) bzw. 37°C (E. coli) für bis zu 48 Stunden inkubiert und konnten anschließend 2 - 4 Wochen bei 4°C gelagert werden. Die Anzucht einer Vorkultur erfolgte in LB-Medium, welches mit einer Einzelkolonie angeimpft wurde. Nach einer Übernacht-Inkubation der Bakterien auf dem Schüttler bei 180 U/min und 26°C bzw. 37°C, wurde morgens die optische Dichte der Kultur bestimmt und für eine Subkultivierung die gewünschte Verdünnung errechnet. 4.1.2 Anzucht von Yersinien und Induktion der Yts1-Sekretion Die stärkste Aktivität des Yts1-Sekretionssystem wurde in LB-Medium bei 17°C und erhöhter Mg2+-Konzentration ermittelt. Wenn die Induktion des Yts1-Sekretionssystems für den jeweiligen Versuchsablauf benötigt wurde, wurden daher die Übernacht(ÜN)-Kulturen des jeweiligen Yersinien-Stammes vor der Infektion in einer Induktionskultur mit LB und 20 mM Magnesiumchlorid auf eine optische Dichte OD600 von 0,2 eingestellt und für 3 Stunden bei 17°C und 180 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Methoden 4.1.3 55 Bestimmung der optischen Dichte Die Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600) diente als Nachweis der Bakterienkonzentration einer Kultur. Dafür wurde 1 ml der zu messenden Kultur in eine Einweg-Halbmikrometerküvette (Schichtdicke 1 cm) gefüllt und mittels eines Spektralphotometers die optische Dichte bestimmt. Als Referenz diente das sterile Ausgangsmedium der entsprechenden Bakterienkultur. 4.1.4 Bestimmung der Bakterienzellzahl Zur Bestimmung der Bakterienzellzahl einer Lösung wurde entweder eine Zählkammer angewandt oder es wurde das Spatelplattenverfahren eingesetzt. Bei der Bestimmung der Zellkonzentration von Flüssigkulturen mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer (Kammerfaktor 0,25 x 106) wurde die Bakteriensuspension zunächst mit H2O bidest. 1:200 verdünnt (Verdünnungsfaktor VF = 200) und die Bakterienzahl innerhalb von 4 diagonal verlaufenden Gruppenquadraten unter dem Mikroskop ausgezählt. Die Zellkonzentration wurde nach folgender Formel berechnet: Gesamtzellzahl/ml = Zellzahl x 6,25 x 104 VF Bei dem Spatelplattenverfahren wurde zunächst eine 1:10-Verdünnungsreihe der Ausgangslösung angefertigt. Jeweils 100 µl dieser Verdünnungen wurden auf entsprechend benötigten Kulturagarplatten gegeben und mit einem Drigalski-Spatel ausgestrichen. Je nach Bakterien-Art wurden die Platten für 24 - 48 Stunden bei 37°C bzw. 26°C inkubiert bis sich Einzelkolonien ausgebildet hatten. Platten, die zwischen 30 und 300 Kolonien aufwiesen, wurden ausgezählt und anhand der jeweiligen Verdünnungsstufe wurde auf die Bakterienzellzahl der Ausgangslösung hochgerechnet. Methoden 4.2 Zellbiologische Methoden 4.2.1 Kultivierung von eukaryotischen Zellen 56 Die verwendeten Zelllinien wurden bei 37°C in wasserdampfgesättigter Atmosphäre und 5% CO2 in einem Zellkulturbrutschrank kultiviert. Alle Arbeiten, wie das Wechseln des Kulturmediums und die Passagierung der Zellen, erfolgten in einer sterilen Werkbank der Klasse II. Alle 2 - 3 Tage wurde das Kulturmedium der Zellen durch frisches Medium ersetzt. Sobald adhärente Zelllinien eine Konfluenz von 80 - 90% erreichten, wurden die Zellen mittels eines Zellschabers vom Boden der Kulturflasche gelöst und anschließend genauso wie nicht adhärente Zellen in konische Zentrifugationsröhrchen überführt. Bei 800 U/min (Varifuge 3.OR, Heraeus Sepatech, Hanau) wurden die Zellen anschließend für 4 Minuten bei RT zentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden in frisches, auf 37°C erwärmtes Kulturmedium aufgenommen und in einer 1:10-Verdünnung in sterile Zellkulturflaschen passagiert. 4.2.1.1 Kultivierung von Raji- und THP-1-Zellen Die THP-1-Zelllinie ging aus einer akuten humanen monozytischen LeukämieErkrankung hervor. Die Raji-Zellen sind eine Lymphoblasten-ähnliche Zelllinie und stammen von B-Lymphozyten eines Patienten mit Burkitt-Lymphom. Beide Zelllinien wurden in RPMI 1640-Medium mit 2 mM Glutamin und dem Zusatz von 10% FCS (fötales Rinderserumalbumin) kultiviert. 4.2.1.2 Kultivierung von T84-Zellen Die T84-Zellline wurde aus den Epithelzellen eines humanen Kolonkarzinoms etabliert. Für die Kultivierung der T84-Zellen wurde DMEM/Ham´s F12-Kulturmedium mit Zusatz von 1% Pen/Strep und 10% FCS eingesetzt. 4.2.2 Bestimmung der Zellzahl eukaryotischer Zellen Zur Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen zunächst wie beschrieben (siehe 4.2.1) gelöst und zentrifugiert. Anschließend wurden die pelletierten Zellen in 1 ml Kulturmedium resuspendiert und mit einem Aliquot dieser Suspension wurde Methoden 57 eine Verdünnung (Verdünnungsfaktor) hergestellt, die sich für eine Auszählung mit der Neubauer-Zählkammer eignet. Pro Zählkammer wurden 10 µl der Zelllösung appliziert und die Gesamtzellzahl wurde durch das Auszählen von 5 diagonal verlaufenden Großquadraten (Zellzahl: Z) bestimmt. Nach Angaben des Herstellers wurde der folgende Kammerfaktor angewandt: Z x 5 x VF x 104 = Gesamtzellzahl/ml. 4.2.3 Inkubation eukaryotischer Zellen mit Y. enterocolitica Um die Bedeutung des Yts1-Systems bei der Infektion eukaryotischer Zellen zu untersuchen, wurden Raji-, THP-1- und T84-Zellen mit Yersinien-Stämmen infiziert. Dazu wurden die Zellen 24 Stunden vor der Infektion mit PBS gewaschen und je nach Zellart in geeignetes Zellkulturmedium ohne Zusatz von Antibiotika und FCS aufgenommen. Die Aussaat erfolgte in 24-well Platten mit je 5 x 104 Zellen pro well jeweils in 1 ml des Kulturmediums. Direkt vor der Infektion wurden jeweils 0,5 ml pro well entnommen und gesammelt. Die gesammelten Überstände wurden mit den Yersinien angeimpft, deren Yts1-Sekretion zuvor für 3 Stunden bei 17°C und 20 mM MgCl2 induziert wurde. Anschließend wurden jeweils 0,5 ml des inokulierten Mediums auf die einzelnen wells verteilt. Um die Anheftung der Bakterien zu vereinfachen, wurden die Kulturplatten bei 400 x g für 5 Minuten zentrifugiert. Die Anzahl Bakterien wurde für die Infektion so eingestellt, dass eine MOI (multiplicity of infection) von 20 erreicht wurde. Die Inkubationszeit der infizierten Zellen bei 37°C betrug 3 Stunden für die Transkriptionsanalyse bakterieller Gene. Für die Durchführung der Durchflusszytometrie (siehe 4.2.4Fehler! Verweisquelle konnte icht gefunden werden.) betrug die Infektionsphase 2 Stunden (Devenish & Schiemann, 1981; Ruckdeschel et al., 1997). Anschließend wurden adhärente Zellen (T84) 3-mal vorsichtig mit PBS gewaschen, um gelöste Zellen und Bakterien zu entfernen. Nicht-adhärente Zellen (THP-1, Raji) wurden zunächst bei 400 x g für 5 Minuten pelletiert und anschließend vorsichtig 3-mal mit PBS gewaschen. Die adhärenten oder pelletierten Zellen wurden daraufhin mit entsprechendem Zellkulturmedium unter Zugabe von 100 µg/ml Gentamycin für weitere 2 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die infizierten Zellen für die Durchflusszytometrie nach dem unten genannten Protokoll weiter verarbeitet. Methoden 4.2.4 58 Durchflusszytometrie Über die Durchflusszytometrie lassen sich fluoreszierende Zellen von der restlichen Zellpopulation einer Probe unterscheiden und gegebenenfalls trennen. Diese Art der Zytometrie erlaubt außerdem die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität der einzelnen Zelle (Bonner et al., 1972). Das Zytometer nimmt geringe Mengen der Zellsuspension auf und führt sie in dünnen Schläuchen an einer Laserapparatur vorbei. Der geringe Querschnitt des Flüssigkeitsstroms und eingesetzte Vibratoren führen dabei zu einem Tröpfchenstrom und der Vereinzelung der Zellen, deren Fluoreszenzfarbstoffe im Laserlicht entsprechender Wellenlänge angeregt wird. Die entstehende Lichtemission wird durch die Detektoren des Zytometers erfasst. Zusätzlich kann der sogenannte forward scatter (FSC) über die Dauer der Unterbrechung des Strahlenganges die Größe der Zellen bestimmen, während der side scatter (SSC) die Lichtbrechung der Zellen misst und damit die Dichte der Zellen anzeigt. Ist eine entsprechende Gerätespezifikation vorhanden, lassen sich gewünschte Zellpopulation vom Rest der Zellen trennen. In dieser Arbeit wurde die Zytometrie genutzt, um die Invasion von fluoreszenzmarkierten Yersinien (GHY124, GHY620) in die verwendeten Zellen zu verfolgen. Dabei steht die Anzahl internalisierter Bakterien in Relation zu der gemessenen Fluoreszenzintensität. Dazu wurden die Zelllinien zunächst wie in 4.2.3 beschrieben mit den Bakterien inkubiert. Anschließend wurden die adhärenten Zellen (T84) mit PBS gewaschen, trypsiniert und in ein Eppendorfgefäß überführt. Darin wurden die Zellen bei 2100 x g für 2 Minuten sedimentiert und mit PBS gewaschen. Dagegen wurden die nicht-adhärenten Zellen (THP-1, Raji) direkt pelletiert und mit PBS gewaschen. Anschließend wurde mit allen Zellarten gleich weiterverfahren indem sie zunächst erneut bei 2100 x g für 2 Minuten zentrifugiert und dann wieder mit PBS gewaschen wurden. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wurden die Zellen in 1 ml FACS Flow-Puffer (BD Biosciences, Heidelberg) aufgenommen und bis zur Messung auf Eis gelagert. Um verfälschende Signale von Zelltrümmern zu vermeiden, wurde eine Charge nicht infizierter Zellen gleichermaßen behandelt wie die übrigen Proben und zur Kalibrierung des Zytometers verwendet. Dabei lassen sich mit Hilfe des FSC und des SSC über Größe und Granularität zelluläre Bruchstücke und tote Zellen von intakten Zellen unterscheiden. Weiterhin wird über die Messung der Kontrollzellen die Autofluoreszenz der Zellen bestimmt und die Laserleistung so angepasst, dass eine akkurate Erfassung der Fluoreszenzintensität ermöglicht wird. Für die Auswertung Methoden 59 wurden in Dreifachmessungen jeweils 10.000 Zellen bezüglich ihrer Fluoreszenz analysiert und die Messdaten mit dem Programm CellQuestTM Pro (BD Biosciences, Heidelberg) ausgewertet. 4.3 Molekularbiologische Methoden 4.3.1 Präparation genomischer DNA aus Gram-negativen Bakterien Für die Präparation genomischer DNA aus Bakterien wurde das illustra bacteria genomic Prep Mini Spin Kit der Firma GE Healthcare (München) verwendet. Hierbei werden die Bakterien durch ein zweifaches Lyse-Puffersystem und die Anwendung des Enzyms Proteinase K lysiert und die gesamte DNA freigesetzt. Durch Zugabe von chaotropen Salzen wird die Bindung der DNA an eine Silikat-Matrix forciert (Vogelstein & Gillespie, 1979) und Verunreinigungen durch Proteinrückstände oder Salze können durch Ethanol-haltige Wasch-Lösungen entfernt werden. Die anschließende Elution der DNA geschieht über die Verwendung eines Puffers mit niedriger Ionenstärke. Zur Isolierung der genomischen DNA wurde 1 ml einer Übernachtkultur für 30 Sekunden bei 16000 x g zentrifugiert und das Bakterienpellet in 40 µl Lysis-Puffer Typ 2 resuspendiert. Nach Zugabe von 10 µl Proteinase K (20 mg/ml) wurden die Suspension gemischt und anschließend mit 10 µl Lysis-Puffer Typ 3 versetzt. Nach erneutem Mischen und kurzem Herunterzentrifugieren wurde die Suspension für 8 Minuten bei 55°C inkubiert, wiederum gemischt, herunterzentrifugiert und nochmals für 8 Minuten auf 55°C erwärmt. Zum Abbau der RNA wurden 5 µl RNase A (20 mg/ml) zugegeben und nach einer Inkubation von 15 Minuten bei RT und darauffolgender Zugabe von 500 µl des Lysis-Puffers Typ 4 wurde die Lösung erneut 10 Minuten bei RT inkubiert. Dann wurde die Probe auf eine Säule mit Silikat-Matrix gegeben, für 1 Minute bei 11000 x g zentrifugiert, und der Durchfluss verworfen. Um Proteinrückstände und RNA zu entfernen wurden zwei weitere Waschschritte mit zunächst 500 µl Lysis-Puffer Typ 4 und anschließend 500 µl Waschpuffer Typ 6 durchgeführt. Nach einem 3-minütigen Zentrifugationsschritt bei 16000 x g konnte die DNA durch Zugabe von 50 µl des erwärmten (70°C) Elutionspuffers Typ 5 und 1-minütiger Inkubation von der Säule durch einen letzten Zentrifugationsschritt (1 Minute, 11000 x g) eluiert werden. Die gewonnene genomische DNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert. Methoden 4.3.2 60 Isolierung von Plasmid-DNA Die Plasmid-DNA wurde nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (Birnboim und Doly, 1979) aus den Bakterien isoliert. Hierbei werden die Bakterien durch eine Kombination von Natriumdodecylsulfat (SDS) und einer stark alkalischen Lösung lysiert und die gesamte DNA denaturiert. Während die chromosomale DNA aufgrund von Scherkräften und ihrer Größe fragmentiert, bleiben die kleineren Plasmide auch durch ihre supercoiled-Konformation intakt. Bei der Zugabe eines pH-neutralisierenden Puffers bilden sich wieder DNA-Doppelstränge aus und die renaturierte Plasmid-DNA bleibt in Lösung. Die fragmentierte chromosomale DNA komplexiert unter diesen Bedingungen als ungerichtete Verbindung vieler DNA-Einzelstränge zu einer verworrenen DNA-Masse und fällt als Pellet zusammen mit Zellwandbestandteilen und Proteinen aus. Die in Lösung befindliche Plasmid-DNA kann weiter von Verunreinigungen befreit werden, indem die Plasmide nach dem Miniprep-Verfahren an eine DNA-bindende Matrix gebunden wird. Nach mehreren Waschschritten kann anschließend die Plasmid-DNA von der Matrix eluiert und für weiterführende Arbeiten verwendet werden. 4.3.2.1 Plasmid-Minipräparation Die Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen wurde nach Angaben des Herstellers mit dem Favor Prep™ Plasmid DNA Mini Extraction Kit (FAPD, Segenetic, Borken) durchgeführt. Dazu wurden 4 ml einer ÜN-Kultur bei 12000 x g für 1 min zentrifugiert und der Überstand (ÜS) verworfen. Das Pellet wurde in 200 µl RNasehaltigem FAPD1 Puffer resuspendiert, und mit der Zugabe von 200 µl FAPD2 Puffer wurde die alkalische Lyse der Bakterien initiert. Nach mehrmaligem Invertieren und einer 2-minütigen Inkubation bei RT wurde das Lysat anschließend durch die Zugabe von 300 µl FAPD3 Puffer neutralisiert. Unlösliche Bestandteile des Lysats wurden durch einen Zentrifugationsschritt (10000 x g, 10 min, RT) abgeschieden und der Überstand mit den in Lösung befindlichen Plasmiden wurde auf ein FAPD-Säulchen mit DNA-bindender Matrix pipettiert. Durch Zentrifugation (10000 x g, 1 min, RT) wurden nicht bindende Bestandteile der Lösung entfernt. Anschließend wurden in zwei Waschschritten weitere Verunreinigungen aus dem FAPD-Säulchen gespült. Dazu wurden zunächst 400 µl des Waschpuffers 1 auf die Matrix gegeben und nach einem Zentrifugationsschritt (10000 x g, 1 min, RT) die Prozedur mit 600 µl des Waschpuffers 2 wiederholt. Um verbleibende Reste der Waschpuffer zu entfernen Methoden 61 wurde abermals zentrifugiert (10000 x g, 1 min, RT). Die Elution der Plasmid-DNA in ein frisches Reaktionsgefäß erfolgte nach der Zugabe von 50 µl H2Odd und 5minütiger Inkubationszeit durch eine Zentrifugation bei 10000 x g für 2 min bei RT. 4.3.2.2 Plasmid-Midipräparation Um größere Mengen Plasmid-DNA zu gewinnen, wurde das QIAfilter Plasmid Purification Midikit (Qiagen, Hilden) verwendet. Dazu wurden 50 ml einer entsprechenden Bakterienkultur bei 6000 x g und 4°C für 15 min zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 4 ml RNase-haltigen P1 Puffer resuspendiert und anschließend mit weiteren 4 ml des P2 Puffers versetzt, womit die alkalische Lyse der Bakterien eingeleitet wurde. Nach 6-maligem Invertieren und 5 Minuten Inkubationszeit bei RT, wurde der pH-Wert des Lysat durch die Zugabe von 4 ml kaltem P3 Puffer und erneutem Invertieren (6 x) neutralisiert. Das Lysat wurde dann in den Qiafilter-Einsatz überführt und bei RT für 10 min inkubiert. Unterdessen wurde ein Qiagen-tip (100) mit 4 ml des QBT Puffers äquilibriert. Nach Öffnen der Verschlusskappe des Qiafilter-Einsatzes wurde das Lysat in den äquilibrierten Qiagen-tip gedrückt. Die an den Qiagen-tip bindende Plasmid-DNA wurde anschließend durch zwei Waschschritte mit jeweils 10 ml QC Puffer von Zellrückständen und Verunreinigungen befreit. Durch Zugabe von 5 ml QF Puffer wurde die DNA dann von dem Qiagen-tip eluiert. Um die Plasmid-DNA in höherer Konzentration zu erhalten, wurde diese mit 3,5 ml Isopropanol gefällt und für 30 min bei 15000 x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die präzipitierte DNA wurde anschließend mit 2 ml 70%igem Ethanol überschichtet. Nach einer weiteren Zentrifugation (15000 x g, 10 min, 4°C) wurde der Überstand dekantiert und das DNA-Pellet für 5 – 10 min an der Luft getrocknet. Abschließend wurde die Plasmid-DNA in H2Odd resuspendiert und die Konzentration der DNA gemessen (siehe 4.3.6). 4.3.3 Polymerase-Kettenreaktion Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase chain reaction, PCR) ist eine Methode, die eine exponentielle Vervielfältigung von spezifischen DNA-Fragmenten in vitro ermöglicht (Saiki et al., 1988; Erlich et al., 1991). Dabei nutzt man mit der DNAPolymerase ein hitzestabiles Enzym, das in der Lage ist monomere Desoxynukleosid- Methoden 62 triphospate (dNTPs) zu einem Polymer zu verknüpfen. Als Matrix nutzt die DNAPolymerase einen DNA-Einzelstrang an den sie durch komplementäre Basenpaarung einen komplementären DNA-Strang synthetisiert. Für die Anlagerung neuer dNTPs benötigt die DNA-Polymerase jedoch ein freies 3`-Hydroxyende eines Nukleotids. Daher nutzt man bei der PCR 15-20 Nukleotide lange, synthetische DNA-Einzelstränge (Primer), die sich an komplementäre Nukleotidsequenzen des MatrixStranges anlagern und mit ihren freien 3´-Hydroxyenden den Startpunkt für die DNAPolymerase darstellen. Die labortechnische Vervielfältigung eines DNA-Fragmentes erfolgt in mehreren temperaturabhängigen Schritten. Zunächst wird die DNA-Doppelhelix erhitzt und damit zu Einzelsträngen denaturiert. Anschließend wird die Temperatur auf eine für die primer spezifische Anlagerungs-Temperatur (annealing) gesenkt, die niedriger ist als die Schmelztemperatur (Tm) der primer. Dadurch lagern sich diese an die komplementären Sequenzen der Ausgangs-DNA (template) an und bilden den Startpunkt für die DNA-Polymerase. In einem weiteren Schritt wird die Temperatur soweit erhöht, dass die Aktivität der thermostabilen Polymerase ihr Maximum erreicht und ausgehend von den primern ein DNA-Doppelstrang synthetisiert wird (Elongation). Durch zyklische Wiederholung dieser Schritte wird eine exponentielle Vervielfältigung der gewünschten DNA-Abschnitte erreicht. In dieser Arbeit wurden zwei Arten von DNA-Polymerasen verwendet. Die hauptsächlich für analytische Zwecke eingesetzte taq-Polymerase (Segenetic, Borken) weist eine niedrigere 5´→3´ Polymerase-Aktivität (1000 bp/min) auf, als die für Klonierungen verwendete Phusion-DNA-Polymerase (3000 bp/min, Finnzymes, Keilaranta, Fl). Die Phusion-DNA-Polymerase besitzt außerdem eine 3´→5´ Exonuklease-Aktivität (Proofreading-Funktion) und eignet sich dadurch für eine zuverlässige Amplifikation großer DNA-Fragmente. Das verwendete Reaktionsvolumen eines PCR-Ansatzes zur präparativen Herstellung von spezifischen DNAFragmenten betrug 50 µl und die Zusammensetzung (Tab. 4-1) sowie das Reaktionsprotokoll (Tab. 4-2) wurden nach den Angaben der Hersteller gewählt. Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide wurden bereits weiter oben aufgelistet (siehe Tab. 3-5). Methoden 63 Tab. 4-1: Zusammensetzung eines Standard PCR-Ansatzes. Komponente Pro PCR-Ansatz Template 0,5 – 100 ng Polymerase-Reaktionspuffer 1x dNTP-Mischung 100 µM Oligonukleotide Je 0,5 µM TM Phusion -Polymerase/Taq-Polymerase 1U H2Odd ad 50 µl Tab. 4-2: Reaktionsprotokoll für die Durchführung einer PCR. Schritt Reaktionsstufe Temperatur Dauer 1. Initiale 98°C, Phusion 5 min Denaturierung (94°C, Taq) (1 min, Taq) Denaturierung 98°C, Phusion 10 sec, Phusion (94°C, Taq) (30 sec, Taq) Abhängig von Tm der 30 sec 2. Annealing Zyklen 1x 35 x verw. Oligo-nukleotide Elongation 72°C 15 - 30 sec/kb Phusion (1 min/kb, Taq) 3. Terminale 72°C 10 min 1x Elongation 4.3.4 Reinigung von DNA-Fragmenten aus Lösungen Um DNA-Fragmente aus Agarose-Gelen, PCR-Ansätzen oder anderen enzymatischen Reaktionen zu isolieren, wurde das Favor PrepTM Gel / PCR Purification Kit der Firma Segenetic (Borken) verwendet. Durch den Einsatz chaotroper Salze erreicht man die Auflösung von Agarose-Gelstücken sowie die Denaturierung der in der Lösung befindlichen Proteine. Außerdem bewirken die chaotropen Salze, dass sich Methoden 64 die DNA an die Glasfaser Matrix eines Bindesäulchens anlagern und so durch Waschschritte weiter gereinigt werden kann (Vogelstein & Gillespie, 1979). Nach Angaben des Herstellers wurden bis zu 300 mg große Agarose-Gelstücke zunächst in 500 µl FADF Puffer aufgenommen und bei gelegentlichem Vortexen für 10 - 15 min bei 55°C inkubiert. Dagegen wurden bis zu 100 µl große PCR-Ansätze direkt mit 5-fachem Volumen von FADF-Puffer versetzt und durch Vortexen gemischt. Anschließend wurden bis zu 800 µl der gelösten Agarose-Gele oder der PCR-Ansätze auf ein Bindesäulchen überführt und die DNA wurde durch Zentrifugation (10000 x g, 30 sec) an die Säulenmatrix gebunden. Durch die Zugabe von 750 µl Waschpuffer und erneuter Zentrifugation wurde die gebundene DNA gereinigt und das Bindesäulchen wurde daraufhin durch einen weiteren Zentrifugationsschritt (10000 x g, 3 min) getrocknet. Die Elution der DNA-Fragmente in ein steriles Reaktionsgefäß erfolgte durch die Zugabe von 40 µl H2Odd, einer 2-minütigen Einwirkzeit bei RT und einer Zentrifugation bei 10000 x g für 2 min. 4.3.5 Klonierung von PCR-Produkten über Restriktionsschnittstellen Bei der Klonierung von PCR-Produkten in Vektorsysteme macht man sich die Eigenschaften von Restriktionsendonukleasen zu Nutze. Diese Enzyme erkennen spezifische, oftmals palindromische Sequenzen in der DNA und „schneiden“ diese mittels ihrer Endonuklease-Aktivität (siehe 4.3.9). Die in der Gentechnik üblicherweise verwendeten Vektorsysteme enthalten daher eine sogenannte multiple cloning site (MCS), die einen DNA-Abschnitt darstellt, welche eine Vielzahl von Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen codiert. Schneidet man einen solchen Vektor mit einem Restriktionsenzym, entstehen spezifische offene 5`-Enden der DNA, an die sich zugegebene DNA-Fragmente mit gleicher Schnittstelle anlagern können. Über die Zugabe einer Ligase kann somit der zuvor linearisierte Vektor wieder zu einem Plasmid geschlossen werden, der nun das neu eingefügte DNA-Fragment enthält. Um DNA-Fragmente mit den gewünschten Restriktionsschnittstellen zu erhalten, wurde eine PCR mit primern durchgeführt, die am 5`-Ende zusätzlich zu der üblichen komplementären Sequenz eine Erkennungssequenz für die gewünschte Restriktionsendonuklease enthielten. Anschließend wurden die PCR-Produkte gereinigt (siehe 4.3.4) und vor der Verwendung für die Klonierung mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease restringiert. Methoden 4.3.6 65 Photometrische Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA RNA- und DNA-Konzentrationen einer Lösung lassen sich photometrisch bestimmen, da Nukleinsäuren aufgrund der Spektralcharakteristika ihrer Basen ein Absorptionsmaximum bei 260 nm aufweisen. Dabei steht die Konzentration der Nukleinsäuren im proportionalen Verhältnis zur Absorption der UV-Strahlung. Nach dem LambertBeer`schen Gesetz entspricht eine gemessene Extinktion von 1 einer RNA- bzw. DNA-Konzentration von 40 bzw. 50 µg/ml. Da insbesondere aromatische Strukturen, wie sie in einigen Aminosäuren auftreten, ein Absorptionsmaximum bei 280 nm aufweisen, lässt sich der Grad der Kontamination einer Nukleinsäure-Lösung mit Proteinen und anderen organischen Verbindungen bestimmen, indem man den Quotienten aus der Extinktion bei 260 nm und 280 nm berechnet. Bei einer reinen DNA-Lösung sollte dieser Wert bei etwa 1,8 liegen, während eine reine RNA-Lösung einen Quotienten von etwa 2,0 aufweisen sollte. Die Absorptionsmessungen der mit H2Odd verdünnten Nukleinsäure-Lösung wurde in Quarzküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm durchgeführt. Als Nullwert diente eine mit H2Odd gefüllte Quarzküvette. 4.3.7 DNA-Sequenzierung und Sequenzanalyse Für die DNA-Sequenzierung von Plasmiden und DNA-Fragmenten wurde die Firma Seqlab (Göttingen) beauftragt. Die Analyse der DNA-Sequenzen erfolgte mit der Software MacVector (Accelrys, Cambridge, UK) und den BLAST(Basic Local Alignment Tools)-Programmen des National Center for Biotechnology Information (NCBI; Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). 4.3.8 Gelelektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten Die Methode der Gelelektrophorese wird genutzt, um DNA-Moleküle mit unterschiedlicher Größe und Konfiguration für präparative oder analytische Zwecke zu trennen. Aufgrund der negativen Ladung der Phosphatreste der DNA, bewegen sich DNA-Moleküle im elektrischen Feld eines Elektrophoresepuffers von der Kathode zur Anode. Da die Ladungsdichte von DNA-Molekülen stets gleich ist, würden sich auch Moleküle unterschiedlicher Größe in freier Lösung gleich schnell bewegen. Erst durch die Verwendung einer porösen Matrix, die wie ein Molekularsieb funktioniert, können die Moleküle nach Größe oder Konfiguration getrennt werden. Methoden 66 Bei der Trennung von DNA verwendet man üblicherweise aus Rotalgen gewonnene Agarose als Grundlage der porösen Matrix. Die Polymere aus β-D-Galaktose und 3,6Anhydro-α-L-Galaktose (Agarobiose) der Agarose bilden Doppelhelizes aus, die sich zu Aggregaten zusammenlagern. Die Porengröße der Gele sinkt dabei mit zunehmender Konzentration der Agarose (0,3 – 2%). In dieser Arbeit wurde standardmäßig 1% Agarose in 1 x TAE-Puffer aufgekocht und in einer abgedichteten Horizontalkammer zu einem Gel gegossen. Die in noch flüssigem Zustand eingefügten Kämme erzeugten nach dem Erstarren der Agarose Geltaschen, die nach Füllung der Gelapparatur mit Elektrophorespuffer (1 x TAE, siehe Tab. 3-12), mit den DNA-Proben beladen werden konnten. Die DNA-Proben wurde vor dem Auftragen mit 1/6 Volumen eines 6 x Ladepuffers versetzt. Dieser Ladepuffer bewirkt eine Färbung der Laufmittelfront und erhöht die Dichte der Lösung, wodurch die Proben besser in die Geltaschen absinken. Die Gelelektrophorese erfolgte bei 15 V/cm 2 und nach ausreichender Trennung der DNAMoleküle wurde das Agarosegel für 10 - 20 min in einer Ethidiumbromidlösung (10 µg/ml) gefärbt. Das Ethidiumbromid interkaliert in die DNA-Moleküle und ermöglicht die Dokumentation und Auswertung des Agarosegels in einem UV-Transilluminator. Durch den Vergleich mit den Banden eines DNA-Größenmarker wurde die Länge der einzelnen DNA-Fragmente ermittelt. 1 kb DNA-Größenmarker Gel-Ladepuffer (6 x) 1 kb DNA-ladder Master-Mix 50 µl Bromphenolblau 0,25% TE-Puffer 17 µl Saccharose 40% Ladepuffer (6 x) 13 µl EDTA 20 mM H2Odd ad 100 µl Methoden 4.3.9 67 Restriktion von DNA Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die an spezifische Sequenzen doppelsträngiger DNA binden und die Phosphodiesterbindungen des Zucker-PhosphatRückrats hydrolysieren können. Dadurch fungieren die Restriktionsendonukleasen als molekulare Scheren, die DNA-Moleküle an definierten Stellen „schneiden“. In Bakterien und Archaeen dient dieser Mechanismus der Abwehr von Phagen-DNA. Je nach Eigenschaften unterscheidet man in vier Haupttypen der Restriktionsendonukleasen, wobei Typ-II-Enzyme am häufigsten in biotechnologischen Verfahren verwendet werden. Diese Gruppe von Restriktionsendonukleasen schneidet innerhalb oder nahe der Erkennungssequenz, benötigt kein ATP und besitzt keine Methyltransferase-Aktivität. Die dabei entstehenden Fragmente weisen je nach verwendeter Restriktionsendonuklease entweder glatte Enden (blunt ends) oder überstehende 5´bzw. 3´-Enden auf (sticky ends). Der Vorteil der sticky ends ist, dass Fragmente mit gleichen Überhängen durch die Basenkomplementation miteinander hybridisieren und sich dadurch effizienter ligieren lassen. Die optimale Reaktionsbedingung für das jeweils verwendete Restriktionsenzym wurde durch die Zugabe von entsprechenden Puffern des Five Buffer Plus System(s) der Firma MBI Fermentas (St. Leon-Roth) eingestellt. Für einen Doppelverdau mit zwei Restriktionsenzymen wurde der Puffer gewählt, der die größtmögliche Aktivität beider Moleküle sicherstellt. Für einen Verdau wurde in der Regel 1 Unit (U) Restriktionsendonuklease pro 1 µg DNA eingesetzt. Reaktionsansätze mit PlasmidDNA wurden für 3 h bei 37°C inkubiert, während chromosomale DNA über Nacht restringiert wurde. Tab. 4-3: Zusammensetzung eines Restriktionsansatzes. Komponente DNA Menge 0,1 – 1 µg Restriktionspuffer (10 x) 2 µl Restriktionsendonuklease (1 U/µl) 1 µl H2Odd ad 20 µl Methoden 68 4.3.10 Ligation von DNA-Fragmenten Die kovalente Verknüpfung von DNA-Enden erfolgte durch die Zugabe von T4-DNALigase. Dieses Enzym katalysiert die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen einem freiliegenden 5`-Phosphatrest und der 3´-Hydroxygruppe zweier Nukleotide. Ein Ligationsansatz bestand üblicherweise aus 17 μl eines Gemisches der zu ligierenden DNA-Fragmente, 2 μl des 10 × T4-DNA-Ligase Puffers und 1 μl der T4DNA-Ligase. Um eine effiziente Insertion eines DNA-Fragments in einen linearisierten Vektor zu erreichen, wurde das Verhältnis von Insert zu Plasmid auf etwa 3:1 eingestellt. Der Ansatz wurde über Nacht bei 4°C inkubiert und die Ligase wurde am nächsten Tag durch 15-minüte Inkubation bei 65°C deaktiviert. Anschließend wurde das ligierte Konstrukt entweder direkt für eine Transformation (siehe 4.3.11) eingesetzt oder bei -20°C gelagert. 4.3.11 Transformation von Bakterien durch Elektroporation Als Transformation bezeichnet man das Einbringen von DNA in einen zur DNAaufnahmefähigen (kompetenten) Empfängerorganismus (Reinhard, 1986). Neben der Transduktion und der Konjugation ist die Transformation eine der drei Möglichkeiten einen Gentransfer in Prokaryoten vorzunehmen. In dieser Arbeit wurde die Methode der Elektroporation gewählt (Calvin & Hanawalt, 1988; Dower et al., 1988), um DNA in Form von Plasmiden in elektrokompetente Bakterien (siehe 4.3.12) zu transformieren. Dazu wurden 50 µl elektrokompetenter Bakterien auf Eis aufgetaut und nach der Zugabe von bis zu 200 ng Plasmid-DNA für 2 min auf Eis inkubiert. Anschließend konnten die Bakterien in vorgekühlte Elektroporationsküvetten (Spaltbreite: 2 mm) gegeben und nach festgelegten Parametern (siehe Tab. 4-4) elektroporiert werden. Daraufhin wurden die Bakterien zügig in vorgewärmtes LB-Medium aufgenommen und für 1 Stunde bei 26°C (Y. enterocolitica) bzw. 37°C (E. coli) und 180 rpm kultiviert. Nach dem Ausplattieren auf selektiven LB-Agarplatten wurden die Bakterien bis zur Ausbildung von sichtbaren Kolonien bei 26°C bzw. 37°C inkubiert. Methoden 69 Tab. 4-4: Übersicht der Elektroporationsparameter für Y. enterocolitica und E. coli. Parameter Y. enterocolitica E. coli Kapazität 25 µF 25 µF Spannung 1800 V 1800 V Widerstand 200 Ω 200 Ω 5 ms 9 ms Zeit 4.3.12 Herstellung elektrokompetenter Bakterien Zur Herstellung elektrokompetenter Bakterien wurden 100 ml LB-Medium mit 1 ml einer ÜN-Kultur des gewünschten Bakterienstamms inokuliert und bis zu einer OD600 von 0,6-0,7 bei der jeweils optimalen Wachstumstemperatur (Y. enterocolitica: 26°C, E. coli: 37°C) im Schüttelinkubator kultiviert (180 U/min). Anschließend wurde die Bakteriensuspension für 10 min auf Eis heruntergekühlt, in 50 ml Zentrifugationsröhrchen überführt und bei 2100 x g und 4°C für 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde daraufhin gewaschen, indem es in 30 ml eiskaltem H2Odd resuspendiert und dann erneut zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch einmal mit H2Odd und zuletzt mit 10% (v/v) Glycerin wiederholt. Nach der letzten Zentrifugation wurden die Zellen auf Eis in 1 ml 10% (v/v) Glycerin aufgenommen und in 1,5-ml-Eppendorf-Reaktionsgefäßen zu je 100 μl aliquotiert. Die Elektroporation der kompetenten Bakterien erfolgte nach Möglichkeit direkt nach der Präparation. Für eine spätere Verwendung wurden die Aliquots bei -70°C gelagert. 4.3.13 Bakterielle Konjugation Als bakterielle Konjugation bezeichnet man die Übertragung von Teilen des Genoms einer Spenderzelle (Donor) auf eine Empfängerzelle (Rezipient). Dieser Vorgang wird vermittelt durch die Ausbildung eines direkten Zellkontakts zwischen den beiden Zellen. Bei Gram-negativen Bakterien befähigt eine Plasmid-codierte tra-Region (transfer) die Donorzellen (F+-Zelle) dazu, einen Sexpilus auszubilden, mit dem sie Kontakt zu Empfängerzellen (F--Zelle) aufnehmen kann. Beim Abbau des Sexpilus nähern sich die beiden Zellen an, berühren sich und bilden eine Konjugationsbrücke Methoden 70 aus. Durch die cytosolische Verbindung der beiden Bakterien können nun Teile des Genoms von der Donorzelle auf die Rezipientenzelle übertragen werden. Der in dieser Arbeit verwendete Suizidvektor pEP185.2 kodiert sowohl das Mobilitätsgen mob RP4, welches das Trägerbakterium zu einer Donorzelle macht, als auch den Replikationsstartpunkt (ori R6K). Damit ist der Vektor für eine selbständige Replikation auf den chromosomal kodierten Transkriptionsfaktor π angewiesen, welcher zum Beispiel in dem Laborstamm E. coli S17-1λpir vorhanden ist. Folglich kann in dem E. coli-Stamm S17-1λpir ein Grundstock an sich replizierenden Vektoren kultiviert werden, die dann auf beliebige Bakterien übertragen werden können. Der Vektor pEP185.2 eignet sich daher besonders für die Integration von DNAFragmenten mittels homologer Rekombination in das Chromosom von Empfängerbakterien, da diese nach einer Generation den Vektor nicht mehr tragen und über selektive Antibiotikaresistenzen nach erfolgreichen Rekombinationsvorgängen kultiviert werden können. In dieser Arbeit wurden für eine Konjugation 500 µl einer ÜN-Kultur der Vektortransformierten E. coli S17-1λpir mit 500 µl einer gewünschten Yersinien ÜN-Kultur vermischt und anschließend bei 13000 x g für 1 min zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 100 µl LB-Medium resuspendiert, auf antibiotikafreie LB-Agarplatten ausgestrichen und diese bei 26°C für 24 h inkubiert. Dann wurde der Bakterienrasen mit 5-10 ml LB-Medium abgeschwemmt und in mehreren Verdünnungen (10-2 - 10-4) auf LB-Agarplatten mit erforderlicher Antibiotikasupplementation kultiviert. Nach 48stündiger Inkubation bei 26°C konnten die gewachsenen Kolonien auf einen erfolgreichen Gentransfer analysiert werden. 4.3.14 Transkriptionsanalyse bakterieller Gene Die Transkription bakterieller Gene wurde mittels eines Reportergen-Assays untersucht. In dieser Arbeit wurde die β-Galaktosidase als Reportergen-System eingesetzt um quantitativ die Aktivität ausgewählter Promotorbereiche zu bestimmen (Miller, 1972). Dieses homotetramere Enzym wird vom E. coli lacZ-Gen codiert und katalysiert die Hydrolyse von β-Galaktosiden. Diese enzymatische Aktivität nutzt man durch den Einsatz des unphysiologischen Substrates ONPG (o-Nitro-phenyl-β-Dgalaktopyranosid), welches bei Hydrolyse durch die β-Galaktosidase eine Farbreaktion zeigt, die photometrisch gemessen werden kann. Für die vorgenommenen Transkriptionsanalysen wurden zu untersuchende Promotorbereiche 5´ vor das lacZ- Methoden 71 Operon (lacZYA) in einen geeigneten Vektor kloniert. Diese Konstrukte wurden entweder über Antibiotika-Resistenz-vermittelnde Plasmide in die Bakterien eingebracht oder über homologe Rekombination dauerhaft in das Chromosom der Bakterien integriert. Standardmäßig wurden die Transkriptionsanalysen an Bakterienkulturen durchgeführt, die in LB-Medium inkubiert wurden. Zur Messung der Promotoraktivität wurde zunächst eine ÜN-Kultur mit dem entsprechenden Bakterienstamm angesetzt. Daraus wurde eine 2 ml Hauptkultur auf eine OD600 von 0,15 angeimpft und für 3 Stunden bei den gewünschten Temperaturen auf einem Schüttelinkubator (180 U/min) kultiviert. Anschließend wurde mit einem Teil der Hauptkultur die Zelldichte durch die photometrische Messung der OD600 ermittelt. Von dem Rest der Hauptkultur wurde 1 ml der Bakteriensuspension entnommen bei 13000 x g und 4°C für 2 min zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde anschließend in 1 ml 0,85% NaCl resuspendiert und erneut durch Zentrifugation pelletiert. Das so gewaschene Pellet konnte dann entweder bis zur Messung der β-Galaktosidase-Aktivität eingefroren oder direkt zur Analyse eingesetzt werden. Dazu wurden die Bakterien in 1 ml Working Buffer resuspendiert. Für eine Dreifachbestimmung wurde aus dieser Suspension in sterilen Wassermannröhrchen Verdünnungsansätze (1:5, 1:10; 1:20) mit einem Endvolumen von 1 ml mit Working Buffer angefertigt. Durch die Vermischung der Proben mit 2 Tropfen Chloroform und 1 Tropfen 0,1% SDS pro Wassermannröhrchen, wurden die Bakterien permeabilisiert und die β-Galaktosidase frei gesetzt. Der Start der enzymatischen Reaktion erfolgte durch die Zugabe von 200 µl ONPG und einer kurzen Vermischung mittels des Vortexers. Bei erkennbarer Gelbfärbung der Proben, spätestens aber nach einer halben Stunde Inkubationszeit, wurde die Reaktion durch die Zugabe von 500 µl Natriumcarbonat (1 M) gestoppt. Die exakte Zeitdauer der Reaktion wurde notiert und mittels spektralphotometrischer Messung wurden der Substratumsatz (OD420) und die bakterielle Dichte (OD550) der einzelnen Proben gemessen.Zur Berechnung der βGalaktosidaseaktivität, die in Miller Units angegeben wird, wurde folgende Formel angewandt: 𝑀𝑖𝑙𝑙𝑒𝑟 𝑈𝑛𝑖𝑡𝑠 = 1.000 × [𝑂𝐷420 − (1,75 × 𝑂𝐷550 )] 𝑡 × 𝑉 × 𝑂𝐷600 t = Reaktionsdauer in Minuten V = eingesetztes Volumen an Bakteriensuspension in ml Methoden 72 1 M DTT (Dithiotheitol) Enzyme Assay Buffer Na2HPO4 61 mM DTT 3,1 g NaH2PO4 39 mM Natriumacetat (10 mM), pH 5,2 20 ml KCl 10 mM MgSO4 x 7 H2O 10 mM pH 7,0 0,1% SDS Working Buffer Enzyme Assay Buffer DTT (1 M) 100 ml 40 µl SDS (10%) H2Odd 0,1 ml ad 10 ml 4.3.14.1 Transkriptionsanalyse bakterieller Gene aus Kulturen pflanzlicher Extrakte Neben den standardmäßig durchgeführten Transkriptionsanalysen von Bakterienkulturen in LB-Medium wurden auch weitere Medien und Extrakte auf ihre Yts1aktivierende Wirkung getestet. In dieser Arbeit wurden pflanzliche Extrakte aus Birnen, Äpfeln und Nektarinen gewonnen, indem die Früchte zunächst püriert wurden und anschließend die unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugation getrennt wurden. Die wässrige Phase wurde daraufhin filtriert (Faltenfilter) und das Filtrat 1:4 mit PBS verdünnt. Die so gewonnene Lösung wurde dann mit den entsprechend induzierten Bakterienkulturen (siehe 4.1.2) angeimpft und für 3 Stunden bei 17°C inkubiert. Die Auswertung der Promotoraktivität bakterieller Gene erfolgte dann nach dem beschriebenen Standardprotokoll (siehe 4.3.14). Als Negativ-Kontrolle diente jeweils ein Aliquot des verdünnten Extraktes, das nicht infiziert wurde. 4.3.14.2 Transkriptionsanalyse bakterieller Gene aus Kulturen mit Blut und Blutplasma Um eine mögliche Aktivierung Yts1-assoziierter Gene bei der Interaktion der Yersinien mit Blut und Blutplasma zu untersuchen, wurde Vollblut vom Deutschen Roten Kreuz Methoden 73 (Münster) erworben. Für die Gerinnungshemmung wurde ACD (acid citrate dextrose) in einem Verhältnis von 1:10 zu der Blutprobe gegeben. Die Versuche wurden entweder mit Vollblut oder mit Blutplasma durchgeführt. Zum Erhalt des Blutplasmas wurde das Vollblut zweimal zentrifugiert (1.: 10 Minuten, 1000 x g, 15°C; 2.: 15 Minuten, 1500 x g, 15°C), und der gelbliche Überstand – das Blutplasma – wurde in ein steriles Reaktionsgefäß pipettiert. Vor der Infektion mit den entsprechenden Yersinia-Stämmen wurden das Blut und das Blutplasma 1:4 mit 0,9%iger Kochsalzlösung verdünnt. Auch die zuvor induzierten Bakterien-Stämme (siehe 4.1.2) wurden nach dem Pelletieren in isotoner Kochsalzlösung aufgenommen und anschließend äquivalent zu einer OD600 = 0,2 zu den Blutund Blutplasma-Lösungen pipettiert. Die Inkubation erfolgte dann bei 37°C (5% CO2) für 3 Stunden. Um danach die Zellbestandteile der Lösungen des Vollbluts abzuzentrifugieren wurden die Proben 10 Minuten bei 1000 x g zentrifugiert, der Überstand in neue Reaktionsröhrchen überführt und erneut für 15 Minuten bei 1500 x g (jeweils bei 15°C) zentrifugiert. Die bakterienhaltigen zellarmen Überstande der ehemals Blut- und Blutplasma-Lösungen wurden anschließend entsprechend dem Standardprotokoll (siehe 4.3.14) für die Messung der Promotoraktivität weiterbehandelt. Als Negativ-Kontrolle dienten jeweils Blut- und Plasma-Lösungen, die bis auf die Infektion gleich behandelt wurden, wie die infizierten Proben. 4.3.14.3 Transkriptionsanalyse bakterieller Gene aus Infektion von eukaryotischen Zelllinien Nach der beschriebenen Infektion eukaryotischer Zelllinien (siehe 4.2.3), wurden die bakteriellen Überstände vorsichtig abpipettiert, in Reaktionsgefäße (2 ml) überführt und bei 1500 x g für 15 Minuten (4°C) zentrifugiert. Die Überstände wurden dann entsprechend dem Standardprotokoll (siehe 4.3.14) weiterverarbeitet, um die βGalaktosidase-Aktivität der Bakterien bestimmen zu können. Als Negativ-Kontrolle dienten Zellkulturüberstände, die nicht infiziert wurden und ansonsten die gleiche Behandlung durchlaufen haben, wie die infizierten Proben. Methoden 74 4.4 Proteinbiochemische Methoden 4.4.1 Überexpression von rekombinanten Proteinen in E. coli Zur Herstellung größerer Mengen rekombinanter Proteine wurde das gewünschte Gen in den Expressionsvektor pET24b(+) kloniert und das Konstrukt in den Expressionsstamm E. coli BL21 transformiert. Je nach Insertionsstelle in die multiple cloning site des Vektors konnte auch eine C-terminale Markierung des Proteins mit einem 6 x Histag (siehe 8.2) gewählt werden, was bei der späteren Reinigung und der Detektion des Proteins nützlich sein kann. Um die Expression eines Zielgens kontrollieren zu können, nutzt man die Regulation eines Lactose-Operons durch den künstlichen Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG). Dazu wird das zu exprimierende Gen hinter einen T7lac Promotor kloniert. Dieser ermöglicht die Transkription des Zielgens durch die im BL21 chromosomal kodierte T7-RNA Polymerase. Diese Polymerase steht unter dem Einfluss eines lacUV5 Promotors und wird durch den auf dem pET24b(+)-Vektor kodierten lacI-Repressor negativ reguliert wird. Erst bei Zugabe des IPTGs, erfolgt durch die Bindung dieses Moleküls an lacI eine Konformationsänderung des Repressors, wodurch dieser den lacUV5Promotor nicht mehr inhibiert und die Transkription der Polymerase induziert wird. Diese wiederum bindet den T7lac Promotor und startet die Expression des Zielgens. Zur Expression eines Proteins wurde eine Übernachtkultur mit dem entsprechenden BL21-Stamm in einem Verhältnis 1:100 in 500 ml LB-Medium verdünnt und bei 37°C und 180 U/min auf einem Schüttelinkubator kultiviert. Sobald die Kultur eine optische Dichte OD600 von 0,6-0,7 erreicht hatte, wurde die Expression des Zielgens durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert und die Bakterien wurden für weitere 4 - 5 Stunden bei genannten Bedingungen inkubiert. Zur Isolierung des exprimierten Proteins wurde die Suspension zunächst bei 6000 x g und 4°C für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde entweder direkt für die Proteinisolation eingesetzt oder bei -20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. IPTG (1 M) IPTG 1,2 g H2Odd ad 5 ml sterilfiltriert, Lagerung bei -20°C Methoden 4.4.2 75 Reinigung von rekombinanten Proteinen durch Affinitätschromatographie An Metallchelat-Säulen können Proteine mit einer 6 x Histidin-Markierung (His6-tag) in einem Schritt affinitätschromatisch gereinigt werden. Dazu nutzt man die Eigenschaft der Histidine, deren Imidazolring bei neutralem bis basischen pH deprotoniert vorliegt und die dadurch mit dem freien Elektronenpaar koordinative Verbindungen zu Übergangsmetallkationen ausbilden können (Porath et al., 1975). In dieser Arbeit wurde das nickelhaltige Säulenmaterial Ni-NTA-Superflow der Firma Qiagen (Hilden) verwendet und die Reinigung der Proteine aus dem Expressionsstamm erfolgte nach Angaben des Herstellers. In der Regel wurden die Proteine in ihrem nativen Zustand gereinigt und daher wurden während des Prozesses alle Schritte mit gekühlten Reagenzien und Apparaturen durchgeführt und die Proben auf Eis verarbeitet. Dazu wurde zunächst das Bakterienpellet einer 500 ml Expressionskultur in 10 ml Lysepuffer resuspendiert und die Zellen durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen (3 x 30 Sekunden (sek.) mit 50% Intensität, 1 x 30 sek. mit 100% Intensität, jeweils 30 sek. Pause). Die Zelltrümmer wurden dann bei 12000 x g für 20 min bei 4°C abzentrifugiert und der Überstand wurde mit 500 µl ml Ni-NTA-Superflow inkubiert. Je nach zu reinigendem Protein wurde die Suspension 30 - 120 min bei 4°C auf einem Rollschüttler inkubiert und anschließend 3 x im batch Verfahren gewaschen. Dazu wurden die Ni-NTA-Partikel durch Zentrifugation bei 1500 x g sedimentiert und das Pellet in 15 ml frischem Waschpuffer I aufgenommen. Daraufhin wurde die Ni-NTA-Suspension in ein Polypropylen-Säulchen überführt und gewartet bis sich die Ni-NTA durch Gravitation absetzt. Das Säulchen wurde dann noch zweimal mit Waschpuffer I und weitere zweimal mit Waschpuffer II gespült. Anschließend konnte das an die Ni-NTA gebundene Protein durch die Zugabe von 5 ml Elutionspuffer von der Metallchelat-Matrix eluiert werden. Zur Bestimmung der erhaltenen Proteinkonzentration wurde ein BCA-Assay (siehe 4.4.4) mit der ProteinLösung durchgeführt. Eine kurzfristige Lagerung der Proteinisolationen geschah bei 4°C, während eine längerfristige Aufbewahrung bei -80°C stattfand. Methoden 76 Lysepuffer Waschpuffer I Tris-HCl, pH 8,0 NaCl 50 mM 500 mM Tris-HCl, pH 8,0 50 mM NaCl 300 mM Imidazol 10 mM Imidazol 20 mM Glycerin 10% (v/v) Glycerin 10% (v/v) Triton X-100 0,1% (v/v) Waschpuffer II Elutionspuffer Tris-HCl, pH 8,0 NaCl 50 mM 300 mM Tris-HCl, pH 8,0 50 mM NaCl 300 mM Imidazol 40 mM Imidazol 200 mM Glycerin 10% (v/v) Glycerin 10% (v/v) 4.4.3 Dialyse und Konzentrierung von rekombinanten Proteinen Nach Anwendung der Affinitätschromatographie wurden die Elutionsfraktionen durch Coomassie-Brilliant Blue gefärbte SDS-PAGE-Gele überprüft und die Fraktionen mit ausreichender Reinheit vereinigt. Die Proteinlösung wurde daraufhin in einen zuvor äquilibrierten Dialyseschlauch (Ausschlussgröße 12 - 14 kDa; Roth, Karlsruhe) pipettiert und unter langsamen Rühren bei 4°C über Nacht gegen PBS dialysiert. Eine weitere Konzentrierung der Proteinlösung wurde nach Bedarf durch den Einsatz von Centricon-Mikrokonzentratoren (Millipore, Schwalbach) bei 500 x g und 4°C erreicht. 4.4.4 Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Bicinchoninsäure-Test Um die Proteinkonzentration einer Lösung quantitativ zu bestimmen, wurde ein kolorimetrischer Bicinchoninsäure (BCA)-Assay durchgeführt. Bei dieser Methode reagieren zweiwertige Kupferionen in der Assay-Lösung mit dem Protein zu einwertigen Kupferionen. Die Bicinchoninsäure komplexiert mit den einwertigen Kupferionen zu einem violetten Farbstoff, dessen Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 562 nm liegt. Methoden 77 In dieser Arbeit wurde zur Bestimmung der Proteinkonzentration das BCA Protein Assay Reagent von der Firma Pierce (Rockford, IL, USA) genutzt. Dazu wurde zunächst ein BCA-Reagenz Gemisch vorbereitet, das fünfzig Teile der BCA-Reagenz A und einen Teil der BCA-Reagenz B versetzt. Parallel wurden die zu analysierenden Proteinlösungen 1:5 - 1:10, und zu bestimmende Zelllysate 1:4 in H2Odd verdünnt. Anschließend wurden jeweils 200 μl des BCA-Reagenz-Gemisches mit 25 μl der verdünnten Proteinlösung in eine Mikrotiterplatte pipettiert. Für die Ermittlung exakter Proteinkonzentrationen musste bei jedem Messvorgang auch eine Eichgerade erstellt werden. Dazu wurden 9 Standardproben mit ansteigenden BSA-Konzentrationen pipettiert und ebenfalls mit dem BCA-Reagenz-Gemisch versetzt. Dabei ist zu beachten, dass die Standards die gleiche Pufferzusammensetzung haben sollten, wie die zu messenden Proteinproben. Nach 30 min Inkubation bei 37°C wurde die Absorption der Standards und der zu bestimmenden Proteinlösungen bei 562 nm gemessen, eine Eichgerade errechnet und mittels dieser die Proteinkonzentration der Proben ermittelt. 4.4.5 Herstellung von bakteriellen Gesamtzellextrakten Bakterielle Gesamtzellextrakte, die zur Untersuchung durch eine SDS-PAGE (siehe 4.4.8) dienen sollten, wurden aus 1 ml einer Bakterienkultur gewonnen. Diese wurde bei 12000 x g für 5 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 200 µl 4 x SDS Probenpuffer resuspendiert. Anschließend wurde die Probe für 10 min bei 95°C erhitzt und konnte nach dem Abkühlen entweder verdünnt für eine SDS-PAGE verwendet oder bei -20°C gelagert werden. 4.4.6 Gewinnung und Präparation bakteriellen Überstandes Für die Präparation bakteriellen Überstandes wurden ÜN-Kulturen des jeweiligen Yersinia-Stammes in 40 ml LB-Medium mit einer OD600 = 0,2 subkultiviert. Je nach eingesetztem Bakterien-Stamm und Versuchsziel wurden die Induktionskulturen bei Temperaturen von 17°C, 26°C oder 37°C für 4 Stunden auf dem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und für 10 Minuten bei 3100 x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand von etwa 35 ml wurde vorsichtig in ein frisches Zentrifugenröhrchen überführt und erneut bei 3100 x g und 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Dann wurden vorsichtig die oberen 10 ml abpipettiert Methoden 78 und in Lösung verbliebene Bakterienzellen mittels eines 0,2 µm Filters (Millipore, low protein binding) extrahiert. Die gefilterte Proteinlösung wurde in Corex Glasröhrchen überführt und 10:1 mit Trichloressigsäure (siehe 4.4.7) versetzt. Bei 4°C präzipierten die Proteine für 1 bis 14 Stunden, bevor die ausgefallenen Proteine durch Zentrifugation (10000 x g, 4°C, 30 Minuten) sedimentiert wurden. Der Überstand wurde verworfen und das Proteinpellet wurde mit eiskaltem Aceton gewaschen und die Probe erneut zentrifugiert (10000 x g, 15 min, 4°C). Das Aceton wurde verworfen und das Pellet bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Anschließend konnte die Probe in einem berechneten Volumen von 4 x SDS Probenpuffer aufgenommen, so dass eine Proteinkonzentration von 2,5 µg/µl erhalten wurden. Nach einer 5-minütigen Inkubation der Proben bei 95°C wurde die Probe entweder direkt mittels einer SDS-PAGE (siehe 4.4.8) analysiert oder bei -20°C gelagert. 4.4.7 Proteinfällung mit Trichloressigsäure Durch die Ansäuerung einer Proteinlösung mit Trichloressigsäure (TCA) kann eine denaturierende Präzipitation der enthaltenen Proteine erreicht werden (Sivaraman et al., 1997). Dazu wurde in dieser Arbeit 100% (v/v) TCA im Verhältnis 1:10 (Endkonzentration TCA: 10%) zu einer Proteinlösung pipettiert, die Lösung gemischt und für mindestens 1 h bei 4°C inkubiert. Die präzipitierten Proteine konnten anschließend durch Zentrifugation sedimentiert und wie oben beschrieben (siehe 4.4.6) aufbereitet werden. 4.4.8 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ermöglicht eine analytische Trennung von Proteinen in Abhängigkeit ihrer Molekulargröße (Laemmli, 1970). Ähnlich wie bei der Agarose-Gelelektrophorese (siehe 4.3.8), wandern hierbei statt DNA-Molekülen standardmäßig Proteine über ein elektrisches Feld durch eine Gelmatrix zur Anode der Apparatur. Die Gelmatrix entsteht hier durch radikalische Polymerisation von linearem Polyacrylamid (PAA) und dem quervernetzenden N,N´-Methylenbisacrylamid. Je nach Größe der aufzutrennenden Proteine kann die Porengröße des Gels über die Konzentration des Polyacrylamids variiert werden (siehe Methoden 79 Tab. 4-5). Bei der diskontinuierlichen PAGE nutzt man zwei unterschiedliche Gelschichten, um eine optimale Trennung der Proteine zu erreichen. Die Schicht des Sammelgels, in deren Geltaschen die Proteinproben pipettiert werden, besitzt einen niedrigeren pH-Wert von 6,8 und führt zu einer Fokussierung der Proteine zu einer scharfen Bande. Somit wird garantiert, dass alle Proteine der Probe nahezu gleichzeitig in das Trenngel (pH-Wert 8,8) einlaufen und dort aufgrund ihrer Größe getrennt werden. In der Probenvorbereitung für die SDS-PAGE werden Disulfidbrücken der Proteine reduziert, da der Probenpuffer mit β-Mercaptoethanol versetzt ist. Außerdem erreicht man durch die Zugabe von SDS eine Unterbrechung der Wasserstoffbrücken, da das SDS sich gleichmäßig an das Protein anlagert und mit seiner negativen Ladung die intrinische Ladung der Aminosäuren überdeckt und zur gegenseitigen Abstoßung führt. Die Proteine liegen nach der Vorbereitung im Probenpuffer also in linearisierter Form vor und weisen eine konstante negative Ladungsverteilung auf. Dadurch können sie bei ihrer Bewegung zur Anode proportional zu ihrer Kettenlänge, also ihrer Molekülmasse, getrennt werden, da längere Proteine in der Gelmatrix stärker zurückgehalten werden als kürzere Proteine. Zur Herstellung einer SDS-PAGE wurden die verwendeten Glas- und Aluminaplatten (10 x 8 x 0,075 cm) sowie Kämme und Abstandshalter vor dem Gießen der Gele mit H2Odd und 70% Ethanol gereinigt. Jeweils fünf Sets wurden dann in eine Gelgießapparatur (Hoefer Scientific Instruments, Freiburg) eingespannt und anschließend wurde die Apparatur zu etwa ¾ mit der vorbereiteten Trenngel-Lösung gefüllt. Eine Überschichtung des Trenngels mit 96% (v/v) Isopropanol diente dem Luftabschluss und führte zu einer ebenen Grenzschicht. Nach der vollständigen Polymerisierung des Trenngels wurde das Isopropanol abgenommen, das vorbereitete Sammelgel appliziert und ein Kamm für die Formung von Geltaschen eingefügt. Nach dem Auspolymerisieren konnten die einsatzbereiten Gele aus der Apparatur entnommen und bis zur Verwendung bis zu drei Wochen unter Luftabschluss in feuchten Papiertüchern bei 4°C gelagert werden. Für den Einsatz in einer SDS-PAGE wurden die Gele in eine vertikale Elektrophoresekammer eingespannt und die Apparatur mit SDS-Laufpuffer gefüllt. Die zu trennenden Proteinlösungen wurden 4:1 mit SDS-Probenpuffer versetzt und zur vollständigen Denaturierung für 5 Minuten bei 96°C erhitzt. Nach dem Abkühlen konnten die Proben vorsichtig in die Geltaschen des SDS-Gels pipettiert und die Trennung der Proteine durch das Anlegen eines elektrischen Feldes gestartet werden. Methoden 80 Bei konstanten 115 Volt (V) wurde die SDS-PAGE beendet, wenn die Lauffront des Probenpuffers das untere Ende des SDS-Gels erreicht hatte. Mischung Trenngel Mischung Sammelgel Tris-HCl 1M, pH 8,8 1,5 M Tris-HCl 1 M, pH 6,8 EDTA 0,2 M 48 ml EDTA 0,2 M 48 ml SDS 10% (w/v) 48 ml SDS 10% (w/v) 48 ml H2Odd 4 ml 750 ml H2Odd SDS-Laufpuffer 4 ml SDS-Probenpuffer (4 x) Tris-Base 25 mM Glycin Tris-HCl, pH 6,8 192 mM SDS 62,5 mM Glycerin 0,1% (w/v) pH 8,8 10% SDS 3% -Mercaptoethanol 8% Bromphenolblau 1 Spatelspitze Tab. 4-5: Zusammensetzung der Lösungen für die Präparation von 5 PAA-Gelen mit Angabe verschiedener Trenngel-Konzentrationen. 30% Sammelgel (S)- H2Odd 10% Acrylamid /Trenngel (T)- [ml] APS [ml] Stammlösung [ml] TEMED [µl] [µl] 5% Sammelgel 1,5 3 7,2 150 9 10% Trenngel 10 7,5 (T) 12 300 20 12% Trenngel 12 7,5 (T) 10 300 20 15% Trenngel 15 7,5 (T) 7 300 20 18% Trenngel 18 7,5 (T) 4 300 20 Methoden 4.4.9 81 Färbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen Proteinbanden in SDS-PAGEs wurden standardmäßig durch Anwendung einer Coomassie-Brillant-Blau-Färbung nach Kang et al. (2002) sichtbar gemacht (siehe 4.4.9.1). Für die Präparation von Proteinen aus SDS-PAGEs wurde dagegen auf eine Zink-Imidazol-Färbung zurückgegriffen (siehe 4.4.9.2). 4.4.9.1 Coomassie-Brillant-Blau-Färbung Die Analyse getrennter Proteine in einem PAA-Gel erfolgte durch die Färbung mit kolloidalem Coomassie-Brillant Blau G-250 (Serva, Heidelberg). Diese modifizierte Coomassie-Färbung soll die Sensitivität der Färbung auf bis zu 1 ng pro Bande verbessern (Donghoon Kang, 2002). Beim Ansetzen der Lösung sollte darauf geachtet werden, dass die Reihenfolge der zuzugebenen Komponenten eingehalten und damit eine kolloidale Suspension der Farbpartikel erhalten wird (Tab. 4-6). Die PAA-Gele wurden nach der Elektrophorese für 10 Minuten in einer Fixierlösung aus 30% Ethanol und 2% (v/v) Phosphorsäure inkubiert und anschließend 2 x 10 Minuten mit H2Odd gewaschen, um SDS-Rückstände zu entfernen. Anschließend wurde die kolloidale Coomassie-Lösung auf das Gel gegeben und je nach gewünschter Bandenintensität für bis zu 12 Stunden inkubiert. Da das kolloidale Coomassie-Brillant Blau G-250 spezifisch die Proteinbanden färbt und somit kaum Hintergrundfärbung des PAA-Gels auftritt, reicht für die Entfärbung eine 20 – 60-minütige Inkubation in 30% Ethanol und 2% (v/v) Phosphorsäure. Eine anschließende Überführung des Gels in H2Odd verstärkt noch einmal die Intensität der blau gefärbten Banden. Tab. 4-6: Herstellung kolloidaler Coomassie-Brillant Blau G-250 Lösung. Schritt Komponente [Endkonzentration in %] Menge 1 H2Odd 200 ml 2 Aluminiumsulfat [5% (w/v)] 50 g 3 Ethanol (96%) [10% (v/v)] 100 ml 4 Coomassie Brillant Blau G-250 [0,02% (w/v)] 0,2 g 5 Phosphorsäure (85%), [2% (v/v)] 20 ml Methoden 4.4.9.2 82 Negative Zink-Imidazol Färbung von Proteinen im SDS-Gel Die Zink-Imidazol Färbung ist eine Methode zur negativen Färbung von Proteinen in PAA-Gelen (Fernandez-Patron et al., 1995). Dabei nutzt man die Tatsache, dass Imidazol an das freie SDS in einem PAA-Gel besser bindet, als an das an die Proteine angelagerte SDS. Durch Zugabe von Zink2+-Ionen können anschließend die ImidazolSDS-Komplexe präzipitiert werden. Dadurch erhält man einen milchig-weißen Niederschlag des Hintergrundes, während die Proteinbanden klar durchsichtig auftreten. Der Vorteil der Zink-Imidazol Färbung gegenüber der Coomassie Färbung liegt darin, dass die Proteine selbst nicht angefärbt und außerdem nicht im Gel fixiert werden. Damit bleiben die Proteine mobil und das Gel kann für einen Western Blot (siehe 0) oder für die Elektroelution (siehe 4.4.11.1) von Proteinen verwendet werden. In der Anwendung wurde zunächst das Gel der SDS-PAGE kurz (15 sek) mit H2Odd gespült und anschließend für 15 min auf einem Wipp-Schüttler in der ImidazolLösung inkubiert. Nach einer zweiten kurzen Behandlung des Gels mit H2Odd, wurde die Zink-Lösung appliziert und bis zur gewünschten Hintergrundfärbung etwa 15 - 60 sek. auf dem PAA-Gel belassen. Daraufhin wurde die Präzipitation der Salze durch mehrmaliges Spülen mit H2Odd gestoppt. Die Auswertung des Bandenmusters erfolgte über einem schwarzen, matten Hintergrund. Imidazol-Lösung Zinksulfat-Lösung Imidazol 0,2 M SDS 0,1% Zinksulfat 0,2 M 4.4.10 Western Blot-Analyse Für immunologische Nachweise von Proteinen hat sich die Methode des Western Blot bewährt (Burnette, 1981; Towbin et al., 1992). Durch elektrophoretischen Transfer der Proteine aus einem Polyacrylamid-Gel auf eine Trägermembran aus Nitrozellulose (NC) oder Polyvenylidenfluorid (PVDF) können die Moleküle immobilisiert werden. Damit sind sie zugänglich für eine anschließende immunologische Detektion durch spezifische Antiköper. Methoden 83 4.4.10.1 Semidry Blot-Verfahren Für den Transfer der Proteine aus dem Polyacrylamid-Gel auf eine Trägermembran wurden das Semidry Blot-Verfahren (Kyhse-Andersen, 1984) und ein KathodenAnoden Puffersystem gewählt. Dazu wurde das PAA-Gel direkt nach der Elektrophorese für 5 Minuten in Kathodenpuffer equilibriert, währende zeitgleich die Trägermembran in Methanol aktiviert und anschließend kurz in Anodenpuffer II inkubiert wurde. Für einen Blot wurden 6 dicke Whatman-Papiere (Dicke: 3 mm) und die Membran auf die Größe des Gels zugeschnitten. Ein Whatman-Papier wurde mit Anodenpuffer I getränkt und auf der Anodenfläche der Trans Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell (BioRad, München) positioniert. Darüber wurden zwei mit Anodenpuffer II angefeuchtete Papiere gelegt, auf die daraufhin die Trägermembran folgte. Das PAA-Gel wurde luftblasenfrei auf die Membran aufgebracht und mit drei Lagen kathodenpufferbehandeltem Whatman-Papier bedeckt. Die im Deckel befindliche Kathodenplatte wurde auf dem Blot-Aufbau befestigt und der Transfer der Proteine wurde durch eine 45-minütige Elektrophorese bei 20 Volt durchgeführt. Anodenpuffer Tris, pH 10,4 I II Kathodenpuffer 300 mM 25 mM 10% (v/v) 10% (v/v) Methanol Tris, pH 9,4 25 mM Glycin 40 mM Methanol 10% (v/v) 4.4.10.2 Proteinidentifizierung Mit Hilfe der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) kann der Versuch unternommen werden, erhaltene Proteinbanden einem bekannten Protein zuzuordnen. Über einen Peptid-Verdau entstehen dabei zunächst Fragmente, die durch einen Massenspektrometer analysiert werden. Durch einen Datenbank-Abgleich mit bekannten Proteinsequenzen wird dann die Wahrscheinlichkeit einer Übereinstimmung errechnet. In dieser Arbeit wurden die Proteinbanden verschiedener Yersinien-Überstände aus den Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Gelen geschnitten und zur externen Methoden 84 Proteinanalyse (MALDI MS/MS) zu der Firma Alphalyse (Odense, DK) versandt, die anschließend die Ergebnisse des Datenbank-Abgleichs per E-Mail mitteilte. 4.4.10.3 Immunologischer Nachweis von immobilisierten Proteinen Die auf der Trägermembran immobilisierten Proteine, können in einem ersten Schritt durch spezifische Primärantikörper gebunden und in einem zweiten Schritt durch die Anwendung von enzymgekoppelten Sekundärantiköpern detektiert werden. Dazu wurde die frisch geblottete Membran zunächst bei RT getrocknet, was die Bindung der Proteine an die Oberfläche der Membran erhöht. Anschließend wurde die Membran für 5 sek. in Methanol reaktiviert und in einer Blocking-Lösung (PBS-T mit 5% Milchpulver (w/v)) inkubiert. Die Proteine des Milchpulvers lagern sich dabei an freie Proteinbindestellen an und blockieren diese gegenüber einer unspezifischen Bindung durch die Antikörper. Daraufhin wurde der in PBS-T und 0,5% Milchpulver verdünnte Primärantikörper (siehe Tab. 3-7) für eine Stunde bei RT oder über Nacht bei 4°C auf den Blot gegeben. Um nicht gebundene Primärantikörper zu entfernen wurde die Membran dreimal mit PBS-T für je 5 min gewaschen und anschließend mit dem Sekundärantikörper inkubiert. Der ebenfalls in PBS-T und 0,5% Milchpulver verdünnte Sekundärantikörper wurde nach einer Stunde Einwirkzeit durch erneutes Waschen mit PBS-T vom Blot entfernt. Auf den dritten Waschschritt folgte dann die Entwicklung des Blots mittels einer detektierbaren Umsetzung eines Substrates. Da in dieser Arbeit hauptsächlich ein Peroxidase-gekoppelter (PO-) Sekundärantikörper verwendet wurde, kam ein Chemielumineszenz-Substrat der Firma Pierce (Rockford, IL, USA) zum Einsatz. Dieses Super Signal® Chemiluminescent Substrate besteht aus zwei Lösungen, die direkt vor der Anwendung im Verhältnis 1:1 miteinander vermischt und dann auf den Blot pipettiert wurden. Die PO des Sekundärantikörpers oxidiert das Substrat, das dadurch in einen angeregten Zustand versetzt wird. Bei dem Rückfall der angeregten Elektronen in den Grundzustand wird Licht der Wellenlänge 428 nm emittiert, welches dann mit Hilfe des LumiImagers quantitativ detektiert werden konnte. Je nach Signalstärke betrug die Expositionszeit zur Detektion der Lichtemission zwischen 20 Sekunden und 10 Minuten. Methoden 85 4.4.10.4 Detektion von Y. enterocolitica Überständen durch Immunseren Für die Detektion von Y. enterocolitica-Überständen durch Immunseren von Kaninchen und Menschen, die eine Yersinia-Infektion durchlaufen haben, wurde zunächst eine ÜN-Kultur des Wildtypstammes 8081 angesetzt. Anschließend wurde die Yts1-Sekretion für 4 Stunden bei 17°C und 180 rpm induziert. Die Proteine des Überstandes wurden nach oben beschriebenem Protokoll (siehe 4.4.6) präpariert und in SDS-PAGE-Gelen getrennt. Anschließend wurden die Proteine mittels des Semidry Blot-Verfahrens (siehe 4.4.10.1) auf eine PVDF-Membran transferiert. Die Immunseren wurden wie Primärantikörper eingesetzt (siehe 4.4.10.2) und mit einer Verdünnung von 1:7500 in 0,5% Milchpulver aufgenommen. Vor der Anwendung gegen die immobilisierten Überstände der Yts1-Sekretion, wurde die Serum-Lösung mit Proteinen eines Y. enterocolitica Stammes inkubiert, der keine Yts1-Sekretion aufweist. Dadurch sollten Antikörper gegen unspezifische Antigene adsorbiert werden. Hierfür wurden die aus dem Überstand präparierten Proteine des Y. enterocoliticaIsolats 5-152 (Serotyp O:9, Biotyp 3) ebenfalls auf eine PVDF-Membran transferiert und diese mit den in Milchlösung verdünnten Immunseren für eine Stunde bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde die Serum-Lösung auf die PVDF-Membran mit den immobilisierten Überständen der Yts1-Sekretion gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Als Zweitantikörper wurden Peroxidase-gekoppelte Antikörper aus der Ziege angewendet, die entweder gegen Kaninchen- oder Human-Immunglobuline gerichtet sind (siehe Tab. 3-7). Die Entwicklung und Dokumentation der blots erfolgte wie beschrieben (siehe 4.4.10.2). Verwendete Immunseren Laborbezeichnung/Versuchsbezeichnung Organismus 44/K1; K3/K2 Kaninchen 2033/H1; 2407/H2; 4407/H3; 5554/H4; 5579/H5; 6301/H6 Mensch 4.4.11 Herstellung polyklonaler Antikörper gegen ChiY aus Y. enterocolitica Um ChiY über spezifische Antikörper detektieren zu können, wurde ein Immunisierungsprotokoll mit Kaninchen durchgeführt (siehe 4.4.11.2). Für diese Anwendung ist es wichtig, eine besonders reine Proteinisolation einzusetzen. Dazu Methoden 86 wurde das durch Affinitätschromatographie (siehe 0) gewonnene ChiY zunächst durch ein SDS-PAGE-Gel von verunreinigenden Proteinbanden getrennt, ausgeschnitten und durch Elektroelution in konzentrierter Form wieder in Lösung gebracht (siehe 4.4.11.1). 4.4.11.1 Elektroelution von gereinigtem ChiY Für die Herstellung polyklonaler Antikörper wurde ein großes SDS-Gel mit durchgehender Sammelgeltasche zunächst mit dem Eluat einer ChiY-Proteinisolation (etwa 2 mg) beladen. Nach dem Lauf der SDS-PAGE wurden die Banden mit einer ZinkImidazol Färbung (siehe 4.4.9.2) sichtbar gemacht und die entsprechende ChiYBande mit einem frischen Einmalskalpell ausgeschnitten. Das Gelstück wurde in etwa 1 cm x 1 cm große Teile zerkleinert und durch zweimaliges Waschen in Mobilisierungspuffer wurde das Protein wieder mobilisiert sowie von überschüssigem Zink und Imidazol befreit. Die Elektroelution wurde in einer Apparatur der Firma Schleicher & Schuell (Dassel) durchgeführt und erfolgte für 24 Stunden bei einer Spannung von 120 V. Vor der Entnahme der angereicherten Proteinlösung wurde die Spannung für 30 Sekunden bei 200 V umgekehrt, um an die Anodenmembran angelagerte Proteine zurück in Lösung zu bringen. Diese Proteinlösung wurde anschließend in Dialyseschläuche (Ausschlussgröße 12 – 15 kDa) überführt und bei 4°C über Nacht gegen 2 Liter PBS dialysiert. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration mittels eines BCA-Assays (siehe 4.4.4) wurde durch den Einsatz von Centricon-Mikrokonzentratoren (Millipore, Schwalbach) bei 500 x g und 4°C die Konzentration der Proteinlösung auf etwa 1 mg/ml eingestellt und die Lösung bis zur Immunisierung bei -20°C gelagert. Mobilisierungspuffer Tris-HCl, pH 8,3 Glycin Elektroelutionspuffer (1:4 verd. SDS-Laufpuffer) 25 mM 192 mM Tris-HCl Glycin SDS 6,25 mM 48 mM 0,025% (w/v) Methoden 87 4.4.11.2 Immunisierung und Serumgewinnung Die Immunisierung der Kaninchen zur Herstellung der polyklonalen ChiY-Antikörper erfolgte durch Verena Humberg (Institut f. Infektiologie, ZMBE, Münster) in Zusammenarbeit mit der Zentralen Tierexperimentellen Einrichtung der Medizinischen Fakultät (Westfälische Wilhelms-Universität, Münster). Der Immunisierung vorangehend wurden Präimmunseren verschiedener Kaninchen auf mögliche Kreuzreaktionen gegen bakterielle und eukaryotische Zelllysate analysiert und das Tier mit geringster Reaktivität für die Immunisierung ausgewählt. Über die Zugabe eines Adjuvants (MPL® + TDM + CWS Adjuvant, Sigma-Aldrich) zu der Protein-Lösung (Verhältnis 1:1) sollte die Immunreaktion des Kaninchens gegen das Antigen verstärkt werden. Die Immunisierung erfolgte nach dem unten aufgeführten Immunisierungsprotokoll (Tab. 4-7) und startete mit der ersten subkutanen Injektion von 250 µg des Antigens in den Nacken des Tieres. Der Fortschritt der Immunisierung wurde durch Blutentnahmen und der Testung des daraus gewonnenen Serums zu verschiedenen Zeitpunkten überprüft. Nach der Entblutung der Tiere wurde die Gerinnung des Blutes abgewartet und durch Zentrifugation (1600 x g, 30 min, RT) die Zellbestandteile sedimentiert. Das Serum wurde anschließend in 2 ml-Aliquots aufgeteilt und bis zur weiteren Verwendung bei -70°C gelagert. Tab. 4-7: Immunisierungsprotokoll. Woche Schritt 0 1. Injektion (250 µg Antigen) 4 2. Injektion, Boost (150 µg Antigen) 6 Blutentnahme (2 ml) 8 3. Injektion, Boost (150 µg Antigen) 10 Blutentnahme (2 ml) 12 4. Injektion, Boost (250 µg Antigen) 14 Blutentnahme (2 ml) 16 Entblutung Methoden 88 4.5 Infektion von pflanzlichen Proben 4.5.1 Stichinfektion von pflanzlichen Proben Mittels Stichinfektionen wurden der Y. enterocolitica 8081-Wildtypstamm (GHY53) und die Yts1-Deletionsmutante (GHY474) in den Fruchtkörper von Kartoffeln, Birnen und Äpfeln eingebracht. Dazu wurden zunächst die ÜN-Kulturen der Bakterien in einer Yts1-Induktionskultur für 4 Stunden (siehe 4.1.2) subkultiviert. Anschließend wurde eine sterile Injektionsnadel in die Induktionskultur getaucht und dann in zuvor markierte Bereiche auf den pflanzlichen Proben bis zu 0,25 Zentimeter tief eingestochen. Die pflanzlichen Proben wurden bei 17°C gelagert und alle 2 Tage auf Verfärbungen und Gewebeveränderungen im Bereich der Einstichstellen untersucht. 4.5.2 Einbringung von Yersinien über mononaxenische Böden in Spinatpflanzen Im Rahmen einer Kooperation mit Dr. Michael Schmid vom Helmholtz-Zentrum München sollten Spinatpflanzen (Spinacia oleracea) auf monoaxenischem Boden angezogen werden, wobei entweder der Y. enterocolitica 8081-Wildtypstamm (GHY53) oder die Yts1-Deletionsmutante (GHY474) in das Bodenmaterial eingebracht wurden. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden bei dieser Methode dann Proben von Blatt, Stiel und Wurzeln der Pflanzen genommen und für eine PCR-Analyse aufbereitet. Mit Primern gegen das ail-Gen kann damit eine mögliche Invasion von Y. enterocolitica in pflanzliches Gewebe nachgewiesen werden. 4.6 Infektion von Invertebraten Um die Auswirkung der Sekretion von Proteinen des Yts1-Sekretionssystems auf Invertebraten zu überprüfen, wurden drei Infektionsmodelle etabliert. Neben den Larven der Wachsmotte Galleria mellonella, wurden auch die Nematoden Caenorhabditis elegans und die Arthropoden Artemia salina für Infektionsversuche herangezogen. Methoden 4.6.1 89 Haltung und Infektion von Galleria mellonella Larven Die Große Wachsmotte (Galleria mellonella) gehört zur Unterfamilie der Wachsmotten (Galleriinae) innerhalb der Familie der Zünsler (Pyralidae) in der Ordnung der Schmetterlinge (Lepidoptera). Die Falterweibchen legen ihre Eier in Bienenstöcken ab, wo sich die heranwachsenden Larven von Wachs und Pollenresten ernähren. Günstige Aufzuchtvorraussetzungen führten dazu, dass G. mellonella in der biologischen Forschung als Versuchstier etabliert wurde. Die Larven der Großen Wachsmotte entwickeln sich in sieben Stadien. In dieser Arbeit wurden Larven des letzten Larvenstadiums von einem Händler bezogen (HW-Terra KG, Aurachtal). Damit die Larven sich nicht innerhalb weniger Tage verpuppen, wurden sie bis zur Infektion bei 17°C gehalten. Für die Infektion wurden Induktionskulturen (siehe 4.1.2) der zu verwendenden Yersinien-Stämme auf eine OD600 von 0,2 verdünnt und die Bakterienzellzahl (siehe 4.1.4) bestimmt. Anhand dieser Information wurde in PBS eine Bakteriensuspension hergestellt, die 2,5 x 105 Bakterien pro µl enthielt und diese wurde dann in 1:10 Verdünnungen in PBS bis auf eine Konzentration 2,5 x 10 1 Bakterien pro µl weiter prozessiert. Die Infektion der Larven erfolgte mit jeweils 2 µl der erstellten Verdünnungen. Dabei wurde die Applikation der Bakteriensuspension mittels einer Hamilton-Spritze durch eine direkte Injektion in das Hämocoel der Larve durchgeführt. Dazu wird die Nadel im dorso-lateralen Bereich in Höhe des ersten Paares der Abdominalfüße (Pygopodien) angesetzt, die Cuticula durchstoßen und die Bakteriensuspension vorsichtig injiziert. Bei jedem Infektionsversuch wurden zusätzlich auch Larven mit nicht pathogenem E. coli DH5α inokuliert. 4.6.1.1 Auswertung der Überlebensrate Die infizierten Larven wurden zu je 10 Stück nach verabreichter Bakterienmenge gruppiert und in großen Petrischalen (10 cm Durchmesser) bei 17°C gehalten. Alle 24 Stunden erfolgte die Auszählung der Überlebenden Larven. Sterbende oder Tote Individuen sind durch die bräunlich, schwarze Färbung der ansonsten elfenbeinfarbenen Larven einfach zu identifizieren. Zeigten solche Tiere keine Reaktion auf eine Berührung, wurden sie aus den Petrischalen entfernt, als Tot verzeichnet und für die Bestimmung der Kolonisierungsintensität verwendet. Die Diagramme der Überlebensraten wurden mit der Software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego California USA) erstellt. Mit diesem Programm wurde auch die Auswertung Methoden 90 signifikanter Unterschiede zwischen den einzelnen Infektionsstämmen untersucht, wobei ein Log-rank- (Mantel-Cox)-Test durchgeführt wurde. 4.6.1.2 Bestimmung der Kolonisierungsintensität durch die Bakterien Um die Konzentration an Bakterien in den Larven zu bestimmen, wurden die Larven oder deren Überreste zunächst gewogen und in ein Whirlpak® (Nasco, Fort Atkinson, Wisconsin USA) gegeben. Außerdem wurde eine dem Körpergewicht entsprechende Menge an PBS hinzugefügt und das Whirlpack dicht verschlossen. Durch mehrmaliges Rollen mit einer Glaspipette über das Whirlpack wurde das Gewebe homogenisiert. Daraufhin wurden 100 µl des Homogenisats entnommen und in PBS eine 1:10 Verdünnungsreihe angefertigt. Jeweils 3 x 10 µl dieser Verdünnungen wurden nach dem Spatelplattenverfahren (siehe 4.1.4) auf eine mit entsprechenden Antibiotika supplementierte LB-Agarplatte aufgetragen und diese bei 26°C bzw. 37°C für 24 Stunden inkubiert. Dann erfolgte unter einem inversen Tischmikroskop die Auszählung der colony forming units (CFUs) und schließlich die Berechnung der Konzentration und der Gesamtzahl der Bakterien in jeder Larve. 4.6.2 Haltung und Infektion von Artemia salina Adulte Tiere des Salinenkrebses (Artemia salina) wurden wenige Tage vor den Infektionsversuchen von der Tierhandlung Kölle Zoo (Münster) erworben. Um die Tiere an die Laborbedingungen zu gewöhnen wurden sie für 3 - 4 Tage in einem artifiziellen Salzwassermedium (ArtemioSal) in einem 2 Liter Erlenmeyerkolben bei RT gehalten. Eine Aquariumpumpe sorgte für einen ausreichenden Gasaustausch in dem System. Für die Infektion wurden Induktionskulturen (siehe 4.1.2) der zu verwendenden Yersinien-Stämme auf eine OD600 von 0,5 verdünnt und die Bakterienzellzahl (siehe 4.1.4) bestimmt. Anschließend wurden die Bakterien dieser Verdünnung durch Zentrifugation bei 10000 x g für 2 Minuten pelletiert. Die Resuspension der Bakterien erfolgte in einem zuvor berechneten Volumen von artifiziellem Salzwasser, das dann eine Endkonzentration von 3,5 x 1010 Bakterien pro ml aufwies. Daraus wurden drei weitere Verdünnungen (1:100) wurden angestellt, so dass die niedrigste Lösung 3,5 x 104 Bakterien pro ml enthielt. Anschließend wurden 10 Salinenkrebse aus der Hauptzucht entnommen, abgesiebt und mehrfach mit sterilem Salzwasser abgespült, bevor sie in 50 ml Zentrifugationsröhrchen mit 34 ml des Methoden 91 artifiziellen Meerwassers aufgenommen wurden. Durch die Zugabe von 1 ml der erstellten Verdünnungen der Bakteriensuspension, wurden Infektionsansätze erhalten, die 1 x 107, und 1 x 109 Bakterien pro ml Salzwasser enthielten. Die Infektionsansätze wurden bei 17°C gelagert und 3-mal täglich wurden die Röhrchen mehrmals vorsichtig invertiert, um einen ausreichenden Sauerstoffaustausch zu garantieren. 4.6.2.1 Auswertung der Überlebensrate Alle 24 Stunden erfolgte die Auszählung der Überlebenden Artemia salina. Sterbende oder Tote Individuen sind durch Bewegungslosigkeit und Absinken auf den Boden des Infektionsröhrchens auszumachen. Zeigten solche Tiere keine Reaktion auf eine Berührung, wurden sie mit einer Pipette aus den Infektionsansätzen entfernt, als Tot verzeichnet und entsorgt. Die Diagramme der Überlebensraten wurden mit der Software GraphPad Prism erstellt. 4.6.2.2 Bestimmung der Kolonisierungsintensität durch die Bakterien Um die Anhaftung von Yersinien an das Chitin-Exoskelett und die Ingestion der Bakterien durch die Salinenkrebse zu bestimmen, wurden wie oben beschrieben Infektionsversuche durchgeführt. Die Inkubationszeit wurde bei diesem Versuchsteil jedoch auf 3 Tage beschränkt und nur lebende Tiere wurden für die Bestimmung der Kolonisierungsintensität verwendet. Die Tiere wurde aus der Infektionslösung genommen, 3 mal mit sterilem Salzwasser gespült und anschließend mit 1 ml PBS in einem Whirlpack homogenisiert. Daraufhin wurden 100 µl des Homogenisats entnommen und in PBS eine 1:10 Verdünnungsreihe angefertigt. Jeweils 3 x 10 µl dieser Verdünnungen wurden auf eine mit entsprechenden Antibiotika supplementierte LB-Agarplatte aufgetragen und diese bei 26°C bzw. 37°C für 24 Stunden inkubiert. Dann erfolgte unter einem Tischmikroskop die Auszählung der colony forming units und schließlich die Berechnung der Konzentration und der Gesamtzahl der Bakterien pro Salinenkrebs. Methoden 4.6.3 92 Haltung und Infektion von C. elegans Ein Grundstock des C. elegans-Wildtyps wurde freundlicherweise von Frau Professor Eva Liebau (Institut für Zoophysiologie, Münster) bereitgestellt und für die Infektionsversuche weiter gezüchtet. Die Tiere wurden auf 10 cm großen Petrischalen mit Nematode Growth Medium (NGM) Agar gehalten (siehe 3.10.2). Als Nahrung dienten den Nematoden E. coli OP 50-Bakterien, mit denen die Agarplatten zuvor angeimpft wurden. Dazu wurden die Bakterien in LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin (Amp) bei 37°C und 180 U/min in einem Schüttelinkubator angezogen und 100 µl dieser Suspension auf den Agarplatten, die ebenfalls mit Antibiotikum versetzt waren, ausgestrichen. Nach einer Inkubationszeit von 8 Stunden bei 37°C konnten die Platten für bis zu 6 Wochen bei 4°C gelagert werden. Der Grundstock der C. elegans Population wurde dadurch erhalten, dass wöchentlich ein etwa 1 cm 2 großes Stück einer besiedelten Agarplatte mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten und auf eine frische NGM-Agarplatte übertragen wurde. Sowohl der Grundstock als auch die Infektionsansätze der Nematoden wurden bei 17°C herangezogen. 4.6.3.1 Für die Infektion von C. elegans mit Yersinia-Stämmen Infekionsversuche wurden synchronisierte Nematodenpopulationen herangezogen, in denen sich alle Individuen im gleichen Entwicklungsstadium befanden. Da die Nematoden sich von der Aufnahme und dem Verdau von Bakterien ernähren, konnte über die transiente Fütterung der Tiere mit dem YersinienWildtypstamm und der Yts1-Deletionsmutante eine Infektion mit diesen Pathogenen realisiert werden. Nach der transienten Exposition mit den Pathogenen wurden die Nematoden auf den Futterbakterien E. coli OP50 weiter kultiviert. Anschließend konnten durch die Auswertung der Überlebensrate und der Kolonisierungsintensität die Auswirkungen der Infektion dokumentiert werden. 4.6.3.2 Synchronisierung einer C. elegans Population durch bleaching Um eine synchrone C. elegans Population für die Infektion zu erhalten, wurden juvenile und adulte Nematoden mittels des bleaching-Verfahrens getötet, so dass nur fertile Eier zur Anzucht übrig blieben. Dazu wurde eine etwa 5 Tage alte und gut bevölkerte NGM-Platte mit 3,5 ml sterilem H20 überschichtet. Durch leichtes Schwenken wurden die Eier und Nematoden von der Platte gelöst, von der Platte Methoden 93 abpipettiert und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Durch Zentrifugation bei 600 x g wurden die festen Bestandteile sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und durch eine 5-minütige Inkubation in 14 ml der Bleich-Lösung wurden die Nematoden abgetötet und die Eier freigesetzt. Durch abwechselnde Zentrifugation (600 x g, 1 min) und Aufnahme in sterilem H2O wurden die Eier und Nematodenüberreste anschließend drei Mal gewaschen. Abschließend wurde das Pellet in 200 µl sterilem H2O aufgenommen und jeweils 100 µl auf eine frische NGM-Platte mit E. coli OP50 pipettiert. Die Synchronisationsansätze der Nematoden wurden dann bei 25°C für 72 Stunden inkubiert, bis sich die Nematoden zu adulten L4 Stadien entwickelt haben und für eine Infektion mit den gewünschten Yersinien-Stämmen bereit waren. 4.6.3.3 Vorbereitung der Infektionsplatten Zwei Tage vor der Infektion wurde eine Übernachtkultur mit den Yersinien oder als Kontrolle dienenden E. coli OP50-Bakterien angesetzt. Am nächsten Tag wurden Induktionskulturen (siehe 4.1.2) aus den ÜN-Kulturen angeimpft und bei 17°C angezogen. 200 µl dieser Induktionskulturen wurden dann mit einem Drigalski-Spatel auf 10 cm großen NGM-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 26°C (Yersinia) bzw. 37°C (E. coli) inkubiert, so dass sich ein dichter Bakterienrasen bildete. 4.6.3.4 Infektion der Nematoden durch transiente Exposition mit pathogenen Bakterien Für die Infektion wurden die synchronisierten Nematoden in 5 ml S-Medium von der NGM-Platte gespült und durch abwechselnde Zentrifugation (600 x g) und Aufnahme in 10 ml S-Medium zwei Mal gewaschen. Anschließend wurden die Nematoden mit einer 2 ml Glaspipette in 500 µl S-Medium aufgenommen und vorsichtig auf die Infektionsplatten pipettiert. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei 17°C wurden jeweils 10 Nematoden einzeln mit einem Picker von den Infektionsplatten auf 6 cm große NGM-Platten mit E. coli OP50-Bakterien überführt. Um zu verhindern, dass die Nematoden nicht den Rand der NGM-Platten hochkriechen und austrocknen, wurde ein Ring aus Palmitinsäure um die E. coli-Bakterien und die darauf befindlichen Nematoden gelegt. Die Palmitinsäure wirkt als Repellent für die Nematoden, so dass sie weiter auf dem Bakterienrasen verbleiben. Methoden 4.6.3.5 94 Auswertung der Überlebensrate Die infizierten Nematoden wurden alle 24 Stunden mit einem Picker auf frische 6 cmNGM-Platten übertragen, damit infizierte Individuen nicht mit heranwachsenden Juvenilen verwechselt werden konnten. Neben der beginnenden Degradation des Körpers wurde auch das Ausbleiben einer sichtbaren Reaktion auf Berührung als sicheres Zeichen für das Ableben eines Tieres herangezogen. Nematoden, die aufgrund von mechanischer Verletzung durch das Übersetzen auf neue Nährplatten starben, wurden aus der Studie ausgeschlossen. 4.6.3.6 Bestimmung der Kolonisierungsintensität durch die Bakterien Um die Infektionsdauer und die Kolonisierungsintensität nach einer Infektion bestimmen zu können, wurden zu verschiedenen Zeitpunkten (Tag 1, 3 und 7 nach Infektion) jeweils 20 lebende Nematoden von den NGM-Platten entnommen und in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 20 µl PBS überführt. Daraufhin wurden die Tiere mit einem sterilen Pistill in dem Zentrifugenröhrchen homogenisiert und zwei Verdünnungen (1:10) der Lösung angestellt. Von diesen Verdünnungen wurden jeweils 10 µl auf eine mit entsprechenden Antibiotika supplementierten LB-Agarplatte aufgebracht. Nach 24 stündiger Inkubation bei 26°C (Yersinia) bzw. 37°C (E. coli) wurden die colony forming units gezählt und die Bakterienzahl pro Nematode ermittelt. 4.6.3.7 Immunfluoreszenzmikroskopie von C. elegans nach Yersinien- Infektion Um den Verlauf der Infektion von C. elegans mit Y. enterocolitica-Stämmen mikroskopisch untersuchen zu können, wurden die Nematoden nach oben beschriebenen Protokoll (siehe 4.6.3.1) mit GFP-markierten Yersinien-Stämmen infiziert. Verwendet wurden der Y. enterocolitica 8081-Wildtypstamm und die Yts1-Deletionsmutante (Δyts1D), die jeweils ein pVLT-Plasmid mit eingefügtem gfp-Gen tragen (GHY124 (wt), GHY620 (Δyts1E)). Der durch IPTG induzierbare Promotor 5´ des gfp führt auch unter nicht-induzierenden Bedingungen zu einer schwachen Transkription des Gens, so dass die Bakterien eine passende Fluoreszenzintensität für die mikroskopische Analyse aufweisen. Nach der Infektion der Fadenwürmer (siehe 4.6.3.4) wurden diese für 3, 6 oder 10 Tage bei 17°C auf NGM-Agarplatten mit OP50Bakterien gehalten. Anschließend wurden die Nematoden 2 mal mit PBS gewaschen Methoden 95 (Sedimentation der Würmer bei 600 x g für 1 Minute) und in einem Tropfen PBS mit 10 – 25 mM NaN3 resuspendiert und anästhesiert. Für die Mikroskopie wurden 2 – 3 µl der Lösung mit den Nematoden auf einen Objektträger übertragen, auf die zum Schutz der Integrität der Tiere eine Agarschicht aufgetragen wurde (Shaham, 2006). Nach vorsichtiger Applikation des Deckglases wurden die Tiere an einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit entsprechendem Filter analysiert. Ergebnisse 5 96 Ergebnisse 5.1 Bedeutung des Yts1-Sekretionssystems bei der Infektion von Säugetieren Über die Methode der suppressiven subtraktiven Hybridisierung (SSH) wurden durch Iwobi et al. (2003) bedeutende genomische Unterschiede zwischen apathogenen und hochpathogenen Yersinia-Stämmen identifiziert, und einer der Loci, welcher ausschließlich in den hochpathogenen Yersinien auftritt, stellte sich als eine Genanordnung eines T2SS heraus, das daraufhin als Yts1-Sekretionssystem bezeichnet wurde. Bei der anschließenden peroralen Infektion von Mäusen (IVET) erzielte ein yts1E-defizienter Stamm eine 100-fach niedrigere Kolonisierungszahl von Leber und Milz als der Wildtyp. Weiterhin zeigten Transkriptionsanalysen von in LBMedium inkubierten Y. enterocolitica-Kulturen, dass die Transkription von yts1D bei 37°C erhöht ist, während bei 26°C nur in geringer Menge yts1D mRNA nachgewiesen werden konnte. Aufgrund dieser beiden Ergebnisse vermuteten Iwobi et al., dass das Yts1-System erst zu einem späten Zeitpunkt der Infektion aktiv sei und bei der Verbreitung der Bakterien in tieferes Gewebe eine Rolle spiele. 5.1.1 Detektion von Y. enterocolitica-Überständen durch Immunseren aus Kaninchen und Menschen Interessanterweise konnte unsere Arbeitsgruppe bisher drei Proteine (ChiY, EngY, YE3650) sicher identifizieren, die durch das Yts1-System sezerniert werden (Shutinoski et al., 2010). Aufgrund der Vermutung, dass das Yts1-System während der späten Phase der Infektion von warmblütigen Tieren eine Rolle spielt, schlussfolgerten wir, dass ein zuvor infizierter Wirt Antikörper gegen die Yts1-sezernierten Proteine bilden würde. Daher verwendeten wir die Seren von Kaninchen und Menschen, die eine Y. enterocolitica-Infektion überwunden hatten, um möglicherweise spezifische Antikörper gegen die Sekretionsüberstände des Yts1-Systems immunochemisch nachweisen zu können. Die Herstellung der Sekretionsüberstände erfolgte mit dem Laborstamm von Y. enterocolitica 8081 (Serotyp: O:8), der in allen folgenden Beschreibungen auch als JB580v (Kinder et al., 1993) oder GHY53 (wt, Wildtyp) bezeichnet wird. Dazu wurde die Sekretion von Yts1 in dem Laborstamm JB580v Ergebnisse 97 nach den Angaben von Shutinoski et al. (17°C, 20 mM MgCl2) über drei Stunden induziert und der Überstand ohne Bakterien auf eine PVDF-Membran geblottet. Bei einer Verdünnung von 1:10000 wurden die Blots anschließend mit den Kaninchenund Human-Seren inkubiert und gebundene Proteinbanden mittels Peroxidasegekoppeltem Zweitantikörper detektiert. Parallel wurde als Vergleich der Überstand der Bakterienkultur auch über eine SDS-PAGE getrennt und das Polyacrylamid-Gel mit Coomassie-Blau gefärbt (Abbildung 5-1). Die Überstandsextraktion, die auch für die Blots des Versuches eingesetzt wurde, zeigt in der Coomassie-gefärbten SDSPAGE das bereits durch Shutinoski et al. (2003) beschriebene Bandenmuster. Die drei prominentesten Banden entsprechen den Proteinen EngY (100 kDa), YE3650 (72 kDa) und ChiY (berechnet: 51,2 kDa, Laufhöhe in der SDS-PAGE bei etwa 60 kDa), welche spezifische Sekretionsprodukte des Yts1-Systems darstellen. Abbildung 5-1: Immunochemische Detektion von Proteinen aus Y. enterocoliticaÜberständen durch Immunseren von rekonvaleszenten Kaninchen und Menschen. Dargestellt sind eine SDS-PAGE (ganz links) und acht Western-Blotstreifen, deren ProteinBandenmuster auf der Grundlage einer einzelnen Überstandsextraktion einer Y. enterocolitica 8081 Kultur basiert. Die jeweils linke Spur eines Blotstreifens stellt den Protein-Größenstandard dar. Die beiden Immunseren aus den Kaninchen (K1, K2) weisen die stärkste Reaktion der Antikörper mit den Proteinen des bakteriellen Überstandes auf und binden jeweils an mehrere Proteinbanden. Bei den menschlichen Seren (H1 - H6) zeigen die Streifen H4 und H6 eine deutliche immunochemische Bindung einzelner Proteinbanden, während die Seren von H1, H2 und H3 keine Banden detektierten und in Streifen H5 eine einzelne Proteinbande sichtbar ist. Buchstaben kennzeichnen die putativen ChiY- (C), EngY- (E), YE3650- (Y) und Flagellin- (F) Proteinbanden. Ergebnisse 98 Die Antikörper in den Immunseren der Kaninchen (K1, K2) binden jeweils mehrere Proteinbanden des Überstandes. Vor allem das starke Signal auf Höhe des sezernierten Proteins ChiY weist auf eine Bindungsreaktion der Serumproteine gegen das Yts1-sezernierte Protein hin. Bezüglich der Detektion von YE3650 durch die Kaninchen-Seren kann mit diesem Verfahren keine eindeutige Aussage getroffen werden, da in der SDS-PAGE mehrere Yts1-unabhängige Moleküle mit ähnlicher Proteinmenge auf Höhe von YE3650 vorhanden sind. Das Yts1-sezernierte Protein EngY wird anscheinend nicht durch das im Blot K1 verwendete Serum gebunden. Die in diesem kDa-Bereich sichtbare Bande weist eine zu geringe Größe auf. Beim Western Blot K2 allerdings sind drei Banden bei 100 kDa erkennbar, jedoch lässt sich nicht genau sagen, welche der Proteinbanden EngY darstellt. Alle weiteren Banden, die durch die Antikörper der Kaninchenseren detektiert wurden, sind nicht mit der Sekretion durch Yts1 assoziiert und stellen möglicherweise Oberflächen- oder Flagellenproteine der Yersinien-Zellwand dar. Beispielsweise deuten die Versuche einer Vesikelisolierung darauf hin, dass die 30 kDa große Bande im Blot K1 eine Form des Yersinia-Flagellins (FliC) anzeigt. Im Gegensatz zu den Kaninchenseren, binden die Antikörper der Humanseren H1, H2 und H3 an keines der Proteine im Überstand der Yersinia-Kultur. Das Serum H5 zeigt nur eine schwache Reaktion gegenüber den Proteinen des Kulturüberstands und erkennt im Western Blot eine einzelne Bande bei etwa 100 kDa. Diese Bande könnte allerdings das Yts1-sezernierte EngY sein. Die Antikörper der Seren H4 und H6 dagegen binden wiederum an drei bis vier der immobilisierten Proteine auf der PVDF-Membran. Aufgrund der Bandencharakteristik lässt sich die jeweils untere Bande dieser Blots als ChiY identifizieren. Eventuell werden auch YE3650 und EngY durch die Humanseren detektiert (besonders durch H6). Eine sichere Aussage lässt sich in diesem Fall anhand des Western Blots jedoch nicht treffen. Zusammenfassend zeigt die immunochemische Detektion der Yersinien-Überstände durch die Seren, dass in einigen Immunseren spezifische Antikörper gegen Proteine des von Bakterien sezernierten Überstands vorhanden sind und dass vor allem ChiY als Yts1-sezerniertes Substrat durch diese Antikörper gebunden wird. Ergebnisse 5.1.2 99 Zellkulturansatz zur Überprüfung der Transkription des Yts1-Systems in vitro Während sowohl der IVET-Screen (Young & Miller, 1997) und die Transkriptionsdaten von Iwobi et al. (2003) als auch der in dieser Arbeit vorgenommene Test der Immundetektion der Yts1-Substrate eine Rolle des Yts1-Systems während einer späteren Phase der Säugetierinfektion durch Y. enterocolitica wahrscheinlich machen, weisen die in vitro durchgeführten Transkriptionsanalysen von Shutinoski et al. (2010) in eine andere Richtung. Shutinoski et al. konnten zeigen, dass sowohl die Transkription als auch die tatsächliche Sekretion des Stammes Y. enterocolitica 8081 bei niedrigeren Temperaturen (17°C bzw. 26°C) stärker induziert wurden, als bei den säugetierüblichen 37°C. In LB-Medium verzeichnete man bei 37°C sogar die Inhibierung des Yts1-Systems auf ein basales Level (Dissertation Shutinoski (2009), Anhang dieser Arbeit). Eine mögliche Erklärung dieser Diskrepanz der Ergebnisse besteht darin, dass im LB-Medium möglicherweise ein Faktor fehlt, der das Yts1-System auch bei 37°C aktiviert und vielleicht erst in vivo durch die Zellen des Wirtsorganismus generiert werden könnte. Daher sollte die Transkription des Yts1-Systems in Zellkulturexperimenten in der Interaktion der Bakterien mit verschiedenen Zelltypen genauer untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden T84- (humane epitheliale Kolonkarzinom-), THP-1(humane monozytische Leukämie-) und Raji- (Burkitt-Lymphom-) Zelllinien nach dem jeweiligen Standardprotokoll (siehe 4.2.1) kultiviert. 24 Stunden vor der Infektion mit den entsprechenden Y. enterocolitica-Stämmen wurden die Zellen gewaschen und je nach Zellart in geeignetes Zellkulturmedium ohne Zusatz von Antibiotika und FCS aufgenommen. Die Aussaat erfolgte in 24-well Platten mit je 5 x 104 Zellen pro well. Um während der Infektion der Zelllinien die Transkriptionsrate der Yts1-assoziierten Gene in Y. enterocolitica nachverfolgen zu können, wurden Reporterstämme eingesetzt, die ein Konstrukt aus Zielgen-Promoter und dem β-Galactosidase-Operon lacZYA (aus E. coli) im Genom trugen. Verwendet wurden hierbei die Stämme GHY414 (JB580v yts1C::lacZYA), GHY437 (JB580v pclR::lacZYA) und GHY494 (JB580v chiY::lacZYA). Die Stämme GHY414 und GHY437 zeigen dabei vor allem die Transkriptionsstärke des Yts1-Operons an, da sie 5´ des Genkomplexes kodiert sind. Die Transkription von pclR und yts1C wird laut vorangegangener in vitro-Studien unserer Arbeitsgruppe (Shutinoski et al., 2010) durch niedrige Temperaturen und hohe Mg2+-Konzentrationen angeregt, während bei 37°C die Transkription beider Ergebnisse 100 Gene unterdrückt ist. Zusätzlich ist PclR mitverantwortlich für die Regulation der chiYTranskription. Daher eignen sich die verwendeten Stämme, um eine positive Wirkung durch zellkulturspezifische Faktoren auf die Yts1-Aktivität bestimmen zu können. Die Induktionskulturen (17°C, LB-Medium, 20 mM MgCl2) dieser Stämme wurden dazu abzentrifugiert, in einem Aliquot PBS aufgenommen, gezählt und mit einer MOI von 20 zu den Zellen pipettiert. Nach 3-stündiger Inkubation bei 37°C wurde der Überstand abgenommen und für den Nachweis der β-Galactosidase-Aktivität der Bakterien vorbereitet (Abbildung 5-2). -Galactosidase-Aktivität [Miller Units] 10000 GHY414 yts1C::lacZYA GHY437 pclR::lacZYA GHY494 chiY::lacZYA 8000 100 75 50 25 G HY 4 G 14 HY 4 G 37 HY 49 4 G HY G 41 HY 4 G 437 HY 49 4 G HY 41 G HY 4 G 437 HY 49 4 G HY 4 G 14 HY G 437 HY 49 4 rl Kt Kt rl (n e g. ) (p os .) 0 LB Raji THP-1 T84 Abbildung 5-2: Transkriptionsanalyse Yts1-assoziierter Gene während der Infektion von humanen Zellkulturlinien. Die Reporterstämme GHY414 (yts1C::lacZYA), GHY437 (pclR::lacZYA) und GHY494 (chiY::lacZYA) wurden mit einer MOI = 20 zu den Zellen der Zelllinien Raji, THP-1 und T84 gegeben, für drei Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend die β-Galactosidase-Aktivität des Überstandes erfasst (Miller Units). Als Vergleich und Kontrolle wurden außerdem die Transkriptionsstärken der drei Reporterstämme in LB-Medium bei 37°C (LB), sowie von GHY494 in LB-Medium bei 17°C und 20 mM MgCl2 (int. Ktrl) bestimmt. Als Negativkontrolle (Ktrl (neg.)) diente die β-Galactosidase-Aktivität von dem Überstand nicht-infizierter Zellen (hier ist nur exemplarisch das Ergebnis der Raji-Zellen dargestellt). Die Daten stellen die Durchschnittswerte und Standardabweichungen von drei unabhängig durchgeführten Experimenten, jeweils in dreifacher Ausführung, dar. Ergebnisse 101 Die Auswertung der β-Galactosidase-Aktivitäten der einzelnen Ansätze weist bei der internen Kontrolle (int. Ktrl: GHY494 bei 17°C, 20 mM MgCl2 in LB-Medium) eine starke Transkription des Zielgens aus (8640 Miller Units). Dagegen liegen bei 37°C die β-Galactosidase-Aktivitäten aller drei Reporterstämme sowohl in LB-Medium, als auch in den Zellkulturansätzen (Raji, THP-1, T84) zwischen 13,4 (GHY414, THP-1) und 30,4 (GHY414, T84) Miller Units und zeigen damit nur geringe Abweichungen zu der negativen Kontrolle (Raji-Zellen ohne Infektion) mit 16,5 Miller Units. Insgesamt lässt sich mit dieser Versuchsanordnung kein Nachweis für eine erhöhte Transkription des Yts1-Systems und beteiligter Gene erbringen. Ein möglicherweise durch die Wirtszellen eingebrachter Faktor, der als eine Art Schalter die Transkription der Yts-1 assoziierten Gene hätte aktivieren können, wurde durch diese Versuche mit Raji-, THP-1- und T84-Zellen nicht entdeckt. Bei weiteren Zellkulturexperimenten wurden die oben genannten Zelllinien ebenfalls genutzt, um die Aufnahme und das Überleben der Bakterien in die Zellen in Abhängigkeit zu den Induktionsbedingungen (17°C oder 37°C) zu untersuchen. Da nach den bisherigen Ergebnissen mit den Zellkulturlinien bei 37°C keine Aktivität des Yts1-Systems gemessen wurde, sollte die Virulenz der Bakterien überprüft werden, wenn die Yts1-Sekretion vor der Infektion entweder bei 17°C induziert (LB-Medium, 20 mM MgCl2) oder bei 37°C (LB-Medium) inhibiert wurde. Möglicherweise beeinflussen die bereits bei 17°C synthetisierten Sekretionsprodukte die Adhärenz, Invasionsfähigkeit oder die intrazelluläre Etablierung der Bakterien bei der späteren Infektion der humanen Zelllinien. Verglichen wurden dabei sowohl die verschiedenen Induktionsbedingungen als auch der Y. enterocolitica 8081-Wildtypstamm mit dem yts1E-defizienten Stamm GHY474. Der Einsatz der yts1E-Mutante diente hierbei der Kontrolle einer eventuellen intrazellulären Aktivierung des Yts1-Systems, die möglicherweise im vorherigen Transkriptions-Assay aufgrund des geringen Anteils intrazellulärer Bakterien nicht detektiert worden wäre. Die Auswertung Durchflusszytometrie-Daten ergab jedoch keine signifikanten Abweichungen in der Invasions- beziehungsweise Überlebensfähigkeit der jeweiligen Bakterienkulturen während der Infektion humaner Zellen (Daten nicht gezeigt). Ergebnisse 5.1.3 102 Transkription Yts1-assoziierter Gene in humanem Blut und Blutplasma Da auch die Interaktion mit humanen Zellkulturlinien keine erhöhte Transkriptionsrate Yts1-assoziierter Gene in Y. enterocolitica 8081 induzieren konnte, wurde als nächster Schritt in Richtung in vivo-Simulation die Verwendung von Blut und Blutplasma in Betracht gezogen. Falls ein Yts1-aktivierender Faktor in der künstlichen Umgebung einer Zellkulturlinie fehlen sollte, könnte über die Verwendung von humanem Blut oder daraus generierter Plasmen die Bandbreite auftretender Moleküle und die Interaktion mit aktiven Plasmabestandteilen nochmals erweitert werden. Die Wahrscheinlichkeit, dadurch einen in vivo vorkommenden Faktor der Yts1-Aktivierung zu finden, dürfte somit höher sein. Außerdem entspricht dieser Versuchsansatz eher den von Iwobi et al. (2003) beobachteten Auswirkungen des Yts1-Sekretionssystems zu einem späteren Zeitpunkt der Mausinfektion. In dieser Phase der systemischen Verbreitung besiedelte der Wildtypstamm Leber und Milz der Tiere stärker als die Yts1-Mutante. Für die Nachstellung dieser Situation wurden daher im Versuchsablauf die Blutproben humaner Spender nach Zugabe eines Gerinnungshemmers entweder direkt 1:4 mit 0,9%iger Kochsalzlösung verdünnt und in Inkubationsröhrchen überführt oder zunächst durch Zentrifugieren das Blutplasma der Probe generiert, welches dann ebenfalls 1:4 mit isotonischer Kochsalzlösung versetzt wurde. Die Induktionskulturen (siehe 4.1.2) der Reporterstämme GHY414 (yts1C::lacZYA), GHY437 (pclR::lacZYA) und GHY494 (chiY::lacZYA) wurden zentrifugiert, in 0,9%iger Kochsalzlösung aufgenommen und mit einer OD von 0,2 in die Blut- oder Blutplasma-Lösung gegeben. Nach 3-stündiger Inkubationszeit auf 37°C wurden die koagulierten Bestandteile der Lösung durch Zentrifugation abgeschieden und der Überstand für die Auswertung der β-Galactosidase-Aktivität weiterverarbeitet (Abbildung 5-3). Die gemessenen Transkriptionswerte der drei Reporterstämme GHY414, GHY437 und GHY494 sind sowohl in der Blut- als auch in der Blutplasma-Lösung sehr niedrig. Da keiner der Werte über 12 Miller Units und somit über die βGalactosidase-Aktivität der Negativ-Kontrolle steigt, ist eine positive Stimulation durch die im Blut enthaltenen Faktoren auf die Transkription des Yts1-Systems nicht zu erkennen. Ergebnisse 103 -Galactosidase-Aktivität [Miller Units] 10000 8000 100 75 50 25 Blut G HY 41 4 G HY 43 7 G HY 49 4 in t. Kt rl G HY 41 4 G HY 43 7 G HY 49 4 Kt rl (n e g. ) 0 Blutplasma Abbildung 5-3: Transkription Yts1-assoziierter Gene in Blut und Blutplasma. Blut- oder Blutplasma-Lösungen wurden mit den Reporterstämmen GHY414 (yts1C-lacZYA), GHY437 (pclR-lacZYA) und GHY494 (chiY-lacZYA) mit einer OD600 = 0,2 inokuliert und für drei Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die β-Galactosidase-Aktivität des bakterienhaltigen Überstandes erfasst (Miller Units). Als interne Kontrolle (int. Ktrl) wurde die Transkriptionsstärke von GHY494 in LB-Medium bei 17°C und 20 mM MgCl2 bestimmt. Die Negativ-Kontrolle (Ktrl (neg.)) wurden aus der β-Galactosidase-Aktivität einer nicht-infizierten Blutprobe-Lösung generiert. Die Daten stellen die Durchschnittswerte und Standardabweichungen von drei unabhängig durchgeführten Experimenten, in jeweils dreifacher Ausführung, dar. 5.1.4 Sekretionsprodukte von Y. enterocolitica WA-314 Mit den Zellkulturexperimenten und den untersuchten Auswirkungen von Blut beziehungsweise Blutplasma auf die Induktion einer Yts1-Transkription bei 37°C waren wesentliche Punkte zum Nachweis eines aktiven Yts1-Systems bei Wirtszelltemperaturen ausgeschöpft. Der nächste Schritt wäre, die Transkription des Systems im Mausmodell zu erforschen. Da allerdings die Daten von Shutinoski et al. (2003) darauf hindeuten, dass das Yts1-System möglicherweise eher bei niedrigen Temperaturen eine Rolle für das Überleben der Yersinien spielt, verzichteten wir zunächst auf in vivo-Untersuchungen. Um zu klären, warum Yts1 besonders bei niedrigen Temperaturen aktiviert wird, sollte überprüft werden, inwiefern sich der von Shutinoski et al. (2009) verwendete Stamm Ergebnisse 104 Y. enterocolitica 8081 und der von Iwobi et al. (2003) eingesetzte Stamm Y. enterocolitica WA-314 bezüglich des Yts1-Systems unterscheiden. Auf genetischer Ebene, wie schon von Shutinoski et al. (2003) bemerkt, unterscheiden sich die beiden Stämme durch ein IS-Element (IS1330) stromaufwärts des Yts1-Systems im WA-314Stamm. Zunächst sollte jedoch überprüft werden, ob und gegebenenfalls welche Unterschiede sich auf Proteinebene zwischen diesen Stämmen bei niedrigen Umgebungstemperaturen identifizieren lassen (Abbildung 5-4). Dazu wurde eine Übernachtkultur beider Stämme genutzt, um eine Induktionskultur (LB-Medium, 20 mM MgCl2) mit einer OD600 von 0,2 anzuimpfen. Nach 3stündiger Inkubationszeit wurden die Bakterien durch Zentrifugation von den löslichen Bestandteilen des Überstands getrennt. Nach Fällung der Proteine im Überstand und anschließender Resuspension in SDS-Probenpuffer, wurden die Proben mit Hilfe der SDS-PAGE getrennt. Der Stamm Y. enterocolitica WA-314 weist ein ähnliches Bandenmuster auf wie der Stamm Y. enterocolitica 8081. Die prominenteste der Banden liegt mit knapp 60 kDa auf der Höhe des erwähnten Yts1-Sekretionsproduktes ChiY und ist auch hinsichtlich der Quantität der Sekretion vergleichbar. Bei ca. 100 kDa ist eine Bande zu sehen, die mit der Laufhöhe von EngY übereinstimmt. Die Proteinidentifikation mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie (Alphalyse) bestätigte die Identität von EngY und ChiY in dem Überstand des WA-314-Stammes. Das in Y. enterocolitica 8081 sezernierte Protein YE3650 ist dagegen im Überstand des WA-314-Stammes nicht zu erkennen. Des Weiteren weist der WA-314-Stamm eine Bande (*) bei etwa 58 kDa auf, die sich bei Y. enterocolitica 8081 nicht findet. Auch diese Bande wurde einer massenspektrometrischen Analyse unterzogen, welche ergab, dass es sich bei diesem Protein um ein putatives periplasmatisches Dipeptid-Transportprotein von Yersinia enterocolitica handelt (Mascot Score: 502; gi123444256). Während bei dem hier gezeigten Versuch die Induktion der Sekretion bei 17°C erfolgte, wurde auch die Proteinzusammensetzung des Überstandes beider Stämme bei höheren Temperaturen (37°C) verglichen (Daten nicht gezeigt). Hierbei ähneln sich zwar die Bandenmuster der beiden Stämme, jedoch konnten EngY, YE3650 und ChiY nicht identifiziert werden. Auch über die Verwendung eines ChiY-spezifischen Antikörpers (siehe 4.4.11) in einem Western Blot wurden keine Anzeichen für dieses Protein im Überstand der beiden Stämme gefunden. Ergebnisse 105 Abbildung 5-4: Proteinsekretion von den Stämmen Y. enterocolitica 8081 und Y. enterocolitica WA-314 bei 17°C und 20 mM MgCl2 in LB-Medium. Die Proteine in den Überständen von Y. enterocolitica 8081 und Y. enterocolitica WA-314 wurden nach 3-stündiger Inkubation in LB-Medium (+ 20 mM MgCl2) bei 17°C durch eine TCA-Fällung und Zentrifugation präzipitiert und in 150 µl SDS-Probenpuffer resuspendiert. Die Trennung der Proteine durch eine SDS-PAGE zeigt übereinstimmende Banden in Höhe von EngY und ChiY. Die entsprechenden Banden des Stammes Y. enterocolitica WA-314 wurden aus der SDS-PAGE ausgeschnitten und einer extern durchgeführten Proteinidentifikation mittels MALDI-TOF unterzogen. Die Identität der Proteine wurde durch diese Analyse als EngY und ChiY verifiziert. Im WA-314-Stamm wurde zudem eine Proteinbande als putatitives periplasmatiches DipeptidTransportprotein identifiziert ( * , 58 kDa). Es werden also bei niedrigen Temperaturen (17°C) zumindest zwei der von Yts1-sezernierten Proteine auch in dem Stamm Y. enterocolitica WA-314 exprimiert und auch im Überstand detektiert, während bei höheren Temperaturen kein Hinweis für Yts1-Aktivität gefunden wird. In unseren Experimenten widersprechen die Ergebnisse, die mit dem WA-314-Stamm erzielt wurden, den Aussagen (in LBMedium gewachsener Kulturen) der Arbeitsgruppe um Iwobi et al. (2003), die eine umgekehrte temperaturabhängige Aktivierung vermutet haben. Die in dieser Arbeit durchgeführte Analyse mit Hilfe der SDS-PAGE zeigt für die beiden getesteten Stämme ein ähnliches Sekretionsverhalten und unterstützt die Erkenntnisse von Shutinoski et al. (2010), die auf eine Aktivierung des Yts1-Systems bei niederen Temperaturen hindeuten. Ergebnisse 5.2 106 Rolle des Yts1-Sekretionssystems bei der Verbreitung und dem Überleben des Bakteriums Y. enterocolitica in der Umwelt Die ursprüngliche Vermutung, dass das Yts1-System hauptsächlich während der späten Phase der Säugetier-Infektion eine Rolle spielt, kann aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit und der Daten von Shutinoski et al. (2003) nicht unterstützt werden. Vielmehr deuteten die Transkriptionsanalysen und die Proteinuntersuchungen des Bakterienüberstandes an, dass aufgrund der Aktivität des Yts1-Systems ausschließlich bei niederen Temperaturen eine Hauptfunktion des Yts1-Systems wahrscheinlich außerhalb eines homoiothermen Lebewesens liegen könnte. Daher wurden aufgrund dieser Ergebnisse Infektionsversuche mit Invertebraten durchgeführt, die eine mögliche Funktion des Yts1-Systems bei der Infektion und Kolonisierung von Invertebraten wie Galleria mellonella, Caenorhabditis elegans und Artemia salina aufzeigen sollte. 5.2.1 BLAST-Analysen zur Untersuchung der Verbreitung Yts1-ähnlicher T2SS-Loci Eine Methode, um Hinweise für die Funktion bestimmter Gene oder Gen-Loci zu erlangen, ist der Vergleich mit ähnlich aufgebauten Gen-Loci in anderen Bakterienspezies. Um einen Überblick über T2S-Systeme zu bekommen, die eine ähnliche genomische Organisation aufweisen wie das Yts1-System von Y. enterocolitica, wurden BLAST (Basic Local Alignment Tools)-Analysen durchgeführt (Altschul et al., 1990). Insbesondere wurde dabei das Augenmerk auf das Vorkommen eines PclRähnlichen Regulators, sowie das Auftreten eines ChiY-ähnlichen Proteins in der genomischen Umgebung des T2SSs gerichtet (Abbildung 5-5). Die in silico-Analysen ergaben, dass auf Grundlage der bisher sequenzierten Genome vor allem Erwinia und Pseudomonas Spezies eine mit Yts1 vergleichbare Konstellation der T2S-Systeme zeigen. Erwinia amylovora CFBP1430, Erwinia tasmaniensis Et1/99, Erwinia pyrifolia EP1/96 und Serratia proteamaculans 568 weisen sowohl einen 5´-vorgelagerten Transkriptionsregulator, als auch ein 3´-lokalisiertes Chitin-bindendes Protein auf. Bei den beiden Pseudomonas Spezies fehlt der Transkriptionsregulator und ein chitinbindendes Protein befindet sich stromaufwärts des T2S-Genkomplexes. Ergebnisse 107 Abbildung 5-5: Überblick der T2S-Systeme in Yersinia enterocolitica 8081 im Vergleich mit ähnlichen T2S-Loci in anderen Bakterienspezies. Schematisch dargestellt sind das Yts1- und Yts2-Operon von Y. enterocolitica 8081 gegenüber den T2SS von Erwinia amylovora CFBP1430 und Pseudomonas aeruginosa PA7 (fett). Weiterhin sind Bakterienspezies aufgeführt, die die gleiche Gen-Loci Struktur zeigen wie E. amylovora oder P. aeruginosa. Die Größe des Genkomplexes wird durch die Basenpaarzahl (bp) angegeben. Die Kolorierung erfolgte nach der (putativen) Funktion der Genprodukte: Transkriptionsregulatoren (grün), T2S-Komponenten (blau), kohlenhydratbindende Moleküle (orange), putative und unbekannte Proteine (grau) (modifiziert nach von Tils et al., 2012). Da die analogen Systeme mit der größten Ähnlichkeit zu Yts1 in den pflanzenassoziierten Erwinia-Spezies vorkommen, könnte die Funktion von Yts1 für die Yersinien möglicherweise auch eine Bedeutung bei der direkten Interaktion mit Pflanzen oder zumindest in deren ökologischem Umfeld haben. Um diese Vermutung Ergebnisse 108 zu überprüfen, und um weitere Hinweise für die Funktion von Yts1 zu erhalten, wurden zusätzlich auch mit den Sekretionsprodukten ChiY, EngY und YE3650 in silico-Analysen durchgeführt, die das Auftreten analoger Proteine in anderen Bakterienspezies klären sollten. 5.2.2 In silico-Analysen zur Verbreitung von ChiY-, EngY- und YE3650ähnlichen Proteinen Neben der Verbreitung des Sekretionssystems in anderen Bakterienspezies und den Umweltbedingungen, die für die Aktivierung eines Sekretionssystems notwendig sind, geben vor allem die Eigenschaften der sezernierten Proteine einen Hinweis auf die möglichen Funktionen für die Bakterien. Daher sollten zunächst über in silicoAnalysen Domänen der Proteine bestimmt werden, denen möglicherweise bestimmte Funktionen zugeordnet werden könnten. Danach sollte über einen Protein-BLAST ein mögliches Auftreten homologer Proteine in anderen Spezies überprüft werden. Die Identifizierung konservierter Domänen wurde hierbei mit der Conserved Domain Database (CDD) durchgeführt (Marchler-Bauer et al., 2009, 2011). Darauf aufbauend wurde das Programm Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (CDART) verwendet, um Proteine anderer Bakterien mit ähnlichen Domänen oder ähnlichem Domänenprofil zu finden (Geer et al., 2002). Durch die Verwendung des Basic Local Alignment Tools (BLAST) wurden homologe Proteine auf der Grundlage ähnlicher Aminosäuresequenzen identifiziert. Zusätzlich lieferte die Nutzung des webbasierten Services Phyre2 (Protein Homology/analogY Recognition Engine V 2.0) Vorschläge für die dreidimensionale Proteinstruktur von jeweils ChiY, EngY und YE3650 (Kelley & Sternberg, 2009). 5.2.2.1 Ergebnisse von CDART- und BLAST-Analysen Die Conserved Domain Datenbank vergleicht die Aminosäuresequenz einer Suchsequenz mit den vorhandenen Sequenzen von bereits annotierten konservierten Domänen. Für ChiY wurden zwei chitinbindende Domänen der Chitin_bind_3 Superfamilie (Chitin_bind_3, ChiC) vorhergesagt (siehe Abbildung 2-9). Diese Chitin_bind_3 Domäne (cl03871) wird mit einer großen Vielfalt von zellulosebindenden Domänen assoziiert, ist aber im Falle von ChiY tatsächlich chitinbindend. Als isolierte Domäne kommt dieses Protein auch in baculoviralen Spheroidinen vor. Ergebnisse Die ChiC-Domäne 109 (cd12215) findet sich in einer Gruppe von chi- tin-/zellulosebindenden Proteinen, die eine Verwandschaft zu einer Domäne aufweisen, wie sie auch in der Chitinase C (ChiC) von Streptomyces griseus vorkommt. Eine CDART-Untersuchung identifizierte zwei Gruppen von Proteinen, die für beide Domänen ChiYs homologe Sequenzen aufweisen (Abbildung 5-6: A, B). Die erste Gruppe (A) umfasst 378 Proteine, welche jeweils nur die beiden in ChiY vorkommenden Domänen (Chitin_bind-3, ChiC) besitzen. Allerdings tritt die Cterminale ChiC-Domäne in manchen Proteinen auch doppelt auf. Die meisten dieser Proteine stammen aus der Familie der Vibrionaceae (158) und der Familie der Micromonosporaceae (78). Die zweite Gruppe (B) umfasst auch Proteine, die neben den in ChiY vorkommenden Domänen auch ein oder zwei fibronektinbindende Domänen enthalten. Von den 292 bisher identifizierten Proteinen stammen 179 aus der Familie der Bacillaceae und 51 aus der Familie der Paenibacillaceae. Sofern die Gene bisher annotiert wurden, wurden die gefundenen Sequenzen beider Gruppen (A, B) als Chitinasen, chitin- oder kohlenhydratbindende Proteine oder als Spheroidin-ähnliche Moleküle vorhergesagt. Für EngY wurden ebenfalls zwei konservierte Domänen vorhergesagt (siehe auch Abbildung 2-10). Die N-terminal gelegene Domäne gehört zu der Familie der M60ähnlichen Peptidasen (cl16269), welche wiederum mit der Familie der EnhancinPeptidasen verwandt sind. Die Enhancin-Peptidasen sind Metalloendopeptidasen und sind hauptsächlich von Baculoviren bekannt, die Lepidoptera-Arten infizieren (Tanada et al., 1975; Derksen & Granados, 1988). Hierbei verstärken diese Enzyme die virale Infektion, indem sie die Mucinschicht der insektoiden peritrophen Membran des Mitteldarms degradieren (Gallo et al., 1991; Wang et al., 1994; Wang & Granados, 1997). Die Mitglieder der M60-ähnlichen Proteine besitzen zwei metallbindende Strukturen und eine katalytische Domäne in einem HEXXH-Motiv. Enhancine finden sich häufig in viralen Okklusionskörperchen, die längere Zeit in der Umwelt überdauern können und nach oraler Aufnahme im Darm des Tieres aufgespalten werden, wodurch dann eine Freisetzung der Enhancine erfolgt (Slavicek, 2012). Die zweite konservierte Domäne CBM_5_12 (pfam02839) gehört zu der Superfamilie der Chitin_bind_3 Proteine und findet sich in einer Vielzahl von Glykosidasen. Es wird vermutet, dass diese Domäne die Bindung der Enzyme an Kohlenhydratsubstrate vermittelt (Tormo et al., 1996). Ergebnisse 110 Abbildung 5-6: CDART-Ergebnisse für ChiY und EngY. Die konservierten Domänen ChiYs und EngYs wurden als Grundlage für die Suche weiterer Proteine mit ähnlicher Domänenarchitektur genutzt. Die gezeigten Proteine sind Beispiele für Gruppen von Proteinen, die mindestens zwei der konservierten Domänen von ChiY (A, B) und EngY (C, D) enthalten. Die ChiY-ähnlichen Proteine der Gruppe A weisen die beiden chitinbindenden Domänen (Chitin_bind_3 und ChiC) auf, während in der Gruppe B zusätzlich auch fibronektinbindende Regionen (FN3) vorkommen. Die EngY-ähnlichen Proteine der Gruppe C und D besitzen eine Domäne (M60-ähnlich), die Homologien zu einer Peptidase der Enhancin-Familie aufweist. Außerdem verfügen diese Proteingruppen über C-terminale chitinbindende Domänen (CBM_5_12), und in Gruppe D sind dieser Region noch ein oder zwei fibronektinbindende Domänen (FN3) vorgelagert. Für die schematisch dargestellten Proteine wurden Trägerspezies, Proteinbezeichnung, die NCBI-Referenznummer und die Länge der Aminosäuresequenz (AS) angegeben. Die CDART-Analyse des Yts1-Substrates EngY ergab zwei Gruppen von Proteinen (Abbildung 5-6; C, D), die zwei der konservierten Domänen EngYs (M60-ähnlich, CBM_5_12) in ihrer Aminosäuresequenz kodieren. Von den 18 gefundenen Proteinen der ersten Gruppe (C) wurden neben den Yersinia-Spezies Y. enterocolitica, Ergebnisse 111 Y. aldovae und Y. ruckeri hauptsächlich verschiedene Stämme des Bakteriums Clostridium botulinum (7) als Träger ausgegeben. Generell werden die Proteine als enhancing factor annotiert, sie werden aber teilweise auch als Chitinase oder S-layerProtein bezeichnet. Die zweite Gruppe (D) der identifizierten Proteine besitzen außer den in EngY gefundenen Domänen auch noch eine fibronektinbindende Domäne (FN3). Von den 56 gefunden Proteinen kommt ein Großteil (50) in verschiedenen Isolaten der Bakterien Bacillus cereus und Bacillus thuringiensis vor. Die Funktion der Proteine wird als S-layer-Protein beziehungsweise als Zellwand-assoziiertes Protein vorhergesagt. Für das Yts1-Sekretionssubstrat YE3650 wurde über die CDD-Analyse bloß eine konservierte Domäne identifiziert, die allerdings nur partiell vorliegt. Diese als Pektinase-3-Domäne (pfam12708) annotierte Sequenz enthält eine β-Helix-Struktur, die so auch in Pektinasen von Pflanzen, Pilzen und Bakterien vorkommt. Bei der CDART-Suche nach Proteinen mit ähnlicher Domänenarchitektur konnten keine Übereinstimmungen gefunden werden, da die unvollständige Domäne von YE3650 nicht als Pektinase-Domäne erkannt wurde. Bei der Suche nach sequenzhomologen (AS) Proteinen über das Basic Local Alignment Tool zeigte sich, dass hauptsächlich Vertreter von zwei Bakteriengattungen die größten Homologien zu ChiY aufweisen. Die Alignments ergaben, dass unter den 100 Proteinen -162 1,51 mit der größten Homologie (Bitscore: 819 - 289, E-value: -88 - 7,93 ) die meisten aus den Gattungen Aeromonas und Vibrio stammen. EngY-Homologe (Bitscore: 1660 – 200, E-value: 5,13-78 - 1,08-52) fanden sich dagegen vor allem in verschieden Vertretern der Gattung Bacillus. Eine BLAST-Suche nach homologen Proteinen zu YE3650 ergab neben Treffern aus Yersinia aldovae und Yersinia ruckeri lediglich drei weitere Proteine mit einer relativ hohen Übereinstimmung. Das Homolog mit der größten Sequenzidentität (Bitscore: 292, Evalue: 1,26-87) stammt aus dem Gram-negativen Bakterium Providencia rettgeri Dmel1, welches in aquatischer sowie terrestrischer Umgebung mit einer Vielzahl von Tieren interagiert (Penner et al., 1975; Jackson et al., 1995; Galac & Lazzaro, 2011) und auch für nosokomiale Erkrankungen im Menschen verantwortlich sein kann (Lindsey et al., 1976; Broomfield et al., 2009). Hierbei wird es vornehmlich mit Durchfallerkrankungen und Infektionen der Harnröhre assoziiert. Proteine mit Ergebnisse 112 niedrigerer Sequenzidentität wurden außerdem in den Bakterien Pantoea stewartii und Enterococcus faecalis identifiziert. Während P. stewartii als Erreger der Maiswelke sowohl mit Pflanzen interagiert als auch Insekten als Vektor nutzt, gehört E. faecalis zu der kommensalen Bakteriengemeinschaft, die den Dickdarm von Menschen und Tieren besiedelt (Fisher & Phillips, 2009). Allerdings kann E. faecalis auch als Verursacher von Endokarditis sowie nosokomialer Harnwegsinfektionen auftreten (Guzmàn et al., 1989; Edmond et al., 1999). In der Natur ist E. faecalis vermutlich aufgrund fäkaler Ausscheidung relativ weit verbreitet (Franzetti et al., 2004; Graves & Weaver, 2010), die Bakterien können jedoch auch außerhalb eines homiothermen Wirtes lange Zeit überleben und besiedeln beispielsweise die chitinhaltigen Exoskelette von Copepoden (Signoretto et al., 2005). Insgesamt belegen die Daten der CDART-Analyse, dass die Funktion der gefundenen konservierten Domänen der sezernierten Proteine ursprünglich bei der Interaktion mit kohlenhydrathaltigen Oberflächen außerhalb eines warmblütigen Tieres liegt. In Anbetracht der BLAST-Analysen wird klar, dass homologe Proteine der Sekretionsprodukte in Bakteriengattungen vorkommen, die einerseits oftmals als Umweltkeime gelten, aber andererseits auch häufiger als opportunistische Erreger bekannt sind. CDART und BLAST-Analysen zusammengenommen sprechen für eine Bedeutung des Yts1-Sekretionssystems bei der Verbreitung von Y. enterocolitica in der Umwelt, wobei verschiedene ökologische Nischen in Frage kommen. Während vor allem ChiYHomologe in aquatischen Bakteriengattungen (Vibrio, Aeromonas) Verbreitung finden, sind EngY-Homologe eher im Genom insektenassoziierter (Bacillus) Bakterien kodiert. Die wenigen Homologe von YE3650 kommen in Bakterien vor, die sowohl mit Pflanzen als auch mit Insekten und Säugetieren interagieren. Letztendlich sind viele der identifizierten Bakterienspezies Umweltkeime, unter denen sich auffallend häufig auch opportunistisch humanpathogene Vertreter finden. Extrapoliert man diese Daten auf die Funktion des Yts1-Sekretionssystems, so könnten die Kohlenhydrat-bindenden und eventuell –degradierenden Eigenschaften der durch Yts1 sezernierten Proteine eine duale Rolle spielen, die sowohl beim Überleben der Bakterien in der Umwelt, als auch bei der Infektion homiothermer Tiere bedeutsam ist. Ergebnisse 5.2.2.2 113 3D-Strukturvorhersage für die Proteine ChiY, EngY und YE3650 Um einen Überblick über die möglichen dreidimensionalen Strukturen der Yts1Sekretionsprodukte ChiY, EngY und YE3650 zu erlangen, wurden mittels des internetbasierten Programms Phyre2 Strukturvorhersagen errechnet (Abbildung 5-7). Dabei nutzt diese engine sequenzhomologe Proteine, deren dreidimensionale Struktur bereits durch Proteinkristallographie entschlüsselt wurde, als Vorlage zur Berechnung der Struktur des Zielproteins. Für den N-terminalen Teil ChiYs wurde das Protein GbpA aus Vibrio cholerae als Vorlage genutzt, während der C-terminale Teil des Moleküls auf Grundlage der chitinbindenden Domäne der Chitinase C aus Streptomyces griseus erstellt wurde (Abbildung 5-7; A, B). Die Forschungsergebnisse der Arbeitsgruppe um Wong et al. (2012) belegen für GbpA einen modularen Aufbau aus vier Domänen, wovon jedoch nur die Domänen 1 bis 3 als kristalline Struktur erhalten und abgebildet werden konnten. Anschließende Untersuchungen ergaben, dass die Domänen 1 und 4 in vitro eine Bindung an Chitin ermöglichen. Außerdem zeigten in vivo-Studien an Mäusen eine Adhäsion der Domäne 1 an Mucin und eine Bedeutung dieser Struktur für eine intestinale Kolonisierung durch die Bakterien. Die Domänen 2 und 3 dagegen weisen nach diesen Ergebnissen eine Bindung zu der Oberfläche des Bakteriums Vibrio cholerae auf (Wong et al., 2012). Die Vorhersage des Strukturmodells für EngY beruht vor allem auf der Proteinkristallographie eines unbekannten Proteins aus Bacillus anthracis (Abbildung 5-7; D, C-terminal) und der Chitinase B (Abbildung 5-7; D, N-terminal) aus Serratia marescens. Während der N-terminale Teil laut Phyre2 auch Ähnlichkeiten zu verschiedenen Aminopeptidasen aufweist, scheint der C-terminale Bereich EngYs, wie auch durch die CDD-Untersuchung bestätigt, eine kohlenhydratbindende Domäne darzustellen. Der Bereich zwischen diesen beiden Hauptdomänen konnte nicht durch einen Bezug zu bereits bekannten 3D-Strukturen modelliert werden und wurde daher durch ab initio-Berechnungen generiert, die allerdings nur bedingt zuverlässige Vorhersagen liefern können. Ergebnisse A 114 ChiY B Strukturvorlage N-terminal Domäne 1 Domäne 2 Strukturvorlage C-terminal Domäne 3 C EngY D Strukturvorlage N-terminal Strukturvorlage C-terminal E YE3650 F Strukturvorlage N-terminal Abbildung 5-7: 3D-Strukturvorhersagen der Proteine ChiY, EngY und YE3650. Mögliche dreidimensionale Strukturen der Proteine ChiY (A), EngY (C) und YE3650 (E) wurden 2 durch das internetbasierte Programm Phyre vorhergesagt. Dabei werden Sequenzhomologien (AS-Ebene) zu bereits durch Proteinkristallographie in ihrer Struktur aufgeklärten Proteinen gesucht und anhand der homologen Bereiche mögliche 3D-Strukturen errechnet. Die Abbildungen unter B, D und F zeigen die Strukturen der am stärksten genutzten Proteinvorlagen für die Modellierung der Yts1-Sekretionsprodukte. Kolorierung: der N-Terminus der 3D-Modelle (außer B) ist blau dargestellt; mit zunehmender Proteinlänge nimmt auch die Wellenlänge der Kolorierung zu. Ergebnisse 115 Für YE3650 konnte ebenfalls nur ein Teil der Struktur durch bereits aufgeklärte Strukturen als Modell dienender Proteine errechnet werden. Während für den Cterminalen Teil des Proteins keine bisher bekannten Strukturen als Vorlage verwendet werden konnte und somit eine ab inito-Modellierung durchgeführt werden musste, kommen als Vorlage für den N-terminalen Bereich von YE3650 mehrere Proteine aus unterschiedlichen Organismen zum Einsatz. Die größte Übereinstimmung besteht zu einem Protein der Nackenregion des Bakteriophagen phi 29, welches vermutlich für Wirtszellerkennung und –eintritt verantwortlich ist (Xiang et al., 2011) (Abbildung 5-7; F, N-terminal). Eine nahezu ähnliche Struktur weisen jedoch auch ein Zellwandassoziiertes Oberflächenanker-Protein aus Streptococcus pneumoniae (Suits & Boraston, 2013) sowie eine Pektinase aus Yersinia enterocolitica auf (Abbott & Boraston, 2007). Zusammenfassend zeigen die in silico-Analysen, dass ChiY-ähnliche Proteine vor allem in der Familie der Vibronaceae und in Aeromonas-Spezies (ehemals auch unter der Familie der Vibrionaceae eingeordnet) vorkommen, und dass eine Funktion ChiYs vermutlich in der Adhäsion an Kohlenhydratsubstrate wie Chitin und Mucin liegt. Aufgrund der Ähnlichkeit zu GbpA könnte außerdem vermutet werden, dass einige Bereiche des Proteins für die Bindung an bakterielle Oberflächen zuständig sind. Verwandte EngYs finden sich vor allem in der Familie der Bacillaceae. Neben einer möglichen katalytischen Aktivität durch die Enhancin-ähnliche Domäne deutet der C-terminale Bereich auf die Adhärenzvermittlung an kohlenhydrathaltigen Oberflächen hin. Aufgrund der Annotation einiger Proteine aus der BacillaceaeFamilie erscheint auch eine Zellwandassoziation EngYs möglich. Für die Aminosäuresequenz von YE3650 finden sich außer in Yersinia aldovae und in Yersinia ruckeri kaum homologe Proteine und unter Berücksichtigung der unvollständigen Pektinase-Domäne sinkt die Wahrscheinlichkeit für eine katalytische Aktivität des Proteins. Die Ähnlichkeit zu dem Bakteriophagen-Protein und dem zellwandassoziierten Protein aus S. pneumoniae deuten also eher auf eine Adhärenzvermittlung zu bakteriellen Oberflächenstrukturen hin. Allerdings muss auch ein Funktionsverlust als Folge eines Rekombinationsereignisses für YE3650 in Betracht gezogen werden. Insgesamt zeigen die in silico-Daten, dass Proteine mit Ähnlichkeit zu den drei Sekretionsprodukten vor allem in Umweltkeimen vorkommen, die weit verbreitet Ergebnisse 116 auftreten und neben vielen apathogenen Spezies auch einige opportunistische sowie einige wenige humanpathogene Arten umfassen. Mögliche Funktionen der sezernierten Proteine liegen vor allem in der Wechselwirkung mit kohlenhydrathaltigen organischen Oberflächen wie sie in der Umwelt mannigfaltig vorliegen. Eine zwingende Assoziation mit Säugetierinfektionen lässt sich aus diesen Daten nicht schließen. Eher geben diese Ergebnisse Hinweise auf Interaktionen mit chitinsynthetisierenden Organismen, wie zum Beispiel Insekten, Pilzen und Pflanzen. 5.2.3 Transkriptionsrate von chiY-lacZ in Abhängigkeit der Mg2+-Konzentration Vorausgegangene Experimente hatten gezeigt, dass die Transkription chiYs von mindestens drei Faktoren abhängt. Neben dem Vorhandensein des Regulators PclR und einer niedrigen Temperatur (um 17°C) wirkt sich auch eine erhöhte Konzentration von Magnesium-Ionen (20 mM) positiv auf die Transkriptionsrate des Gens aus. Eine solch hohe Magnesiumkonzentration tritt in Säugetieren im Normalfall nicht auf. Im menschlichen Blut beispielsweise erreichen die MgCl2-Konzentrationen einen Maximalwert von 1,2 mM. Ansonsten sind die höchsten Konzentrationen an Magnesium-Ionen im Muskelgewebe (etwa 9 mM/kg Nassgewicht) oder in fixierter Form in der Knochenstruktur (etwa 43 mM/kg Nassgewicht) messbar (Wester, 1987; Jahnen-Dechent & Ketteler, 2012). Um detaillierte Kenntnisse über die Auswirkung der Mg2+-Ionen Konzentration auf die Expression von ChiY zu erlangen, wurde die Transkription des chiY::lacZYA Konstruktes bei ansteigenden Mengen von Mg2+-Ionen in der Nährlösung gemessen (Abbildung 5-8). Wie in bisherigen Experimenten zeigte sich, dass für chiY::lacZ bei 17°C auch ohne Zugabe von MgCl2 eine erhöhte Transkriptionsrate von etwa 2600 Miller Units vorliegt (Abbildung 5-8, A). Mit steigender Konzentration an Mg2+-Ionen in der Nährlösung erhöhte sich die β-Gal-Antwort nahezu linear, so dass bei einer Konzentration von 6 mM Mg2+-Ionen etwa 6800 Miller Units gemessen wurden. Ab diesem Punkt flachte die Dosis - Antwortkurve etwas ab und erreichte bei 20 mM ein Maximum mit einem Durschnittswert von 8528 Miller Units (± 430 Miller Units). Im weiteren Verlauf des Anstiegs der Magnesium-Ionenkonzentration nahm die gemessene β-Gal-Antwort ab 50 mM Mg2+ stetig ab, so dass ab 200 mM MgCl2 in etwa die gleiche Transkriptionsrate des Konstrukts auftrat, wie bei 1 - 2 mM MgCl2. Ergebnisse 117 Mg2+ -Konzentration [mM] EC50(2)=2,011 2, 5 0 2, 0 50 10 0 20 0 40 30 20 10 2000 1, 5 4000 EC50(1)=0,644 50 1, 0 6000 100 0, 5 8000 relative Transkriptionsrate [%] B 0 -Galaktosidase-Aktivität [Miller Units] A log10 Mg2+ -Konzentration [log 10 mM] Abbildung 5-8: Transkriptionsintensität des Reportergens chiY-lacZ bei ansteigenden 2+ Mg -Konzentrationen. Der Stamm GHY494 (chiY::lacZYA) wurde bei 17°C in LB-Kulturen kultiviert, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von MgCl2 (0, 1, 2, 6, 12, 20, 50, 100, 200 mM) supplementiert wurden. Mittels des β-Galaktosidase-Assays wurde die Transkriptionsintensität des Genkonstrukts chiY-lacZ quantifiziert. (A) Absolute Werte der Transkriptionsstärke angegeben in Miller-Units in 2+ Abhängigkeit von der im Medium befindlichen Mg -Konzentration. (B) Glockenförmige 2+Kurvenanpassung der relativen Transkriptionsrate bei logarithmisch (log10) angegebenen Mg 2+ Konzentrationen. EC50(1) und EC50(2) geben die mittlere effektive Konzentration von Mg -Ionen in logarithmischen Werten an. Insgesamt reagiert die Transkription des chiY::lacZ-Reportergens mit einer typischen Dosis – Wirkungskurve auf die ansteigenden Konzentrationen von Magnesium-Ionen. Die in Abbildung 5-8 (B) dargestellte Funktion zeigt eine solche glockenförmige Kurvenanpassung, mittels derer sich die mittlere effektive Konzentration (EC50) an Magnesium bestimmen lässt. Auf der Abszisse links des Maximums errechnete sich ein EC50(1)-Wert von 0,644 (= 4,4 mM) und im Bereich rechts des Maximums ein EC50(2)-Wert von 2,011 (= 102,6 mM). Damit ergibt sich eine Spanne von 4,4 - 102,6 mM Mg2+, in der die Transkription des Reportergens chiY::lacZ - und davon abgeleitet auch des nativen chiYs - mit mehr als der halbmaximalen Transkriptionsintensität erfolgt. Die Maximalaktivität der chiY-Transkription wird also bei relativ hohen MgCl2Konzentrationen gemessen, die eher unphysiologisch für Säugetiere ist. Von bestimmten Insekten und deren Larven ist jedoch bekannt, dass ihre Körperflüssigkeiten bis zu 60 mM Mg2+-Ionen enthält (Van Asperen & Van Esch, 1954; Wyatt, 1961). Auch Meerwasser (53 mM Mg2+) (Maguire & Cowan, 2002), Fäkalien von Nutztieren oder Menschen (48 mM – 400 mM Mg2+) (Graham et al., 1960; Wacker & Parisi, 1968a, b; Saunders & Wiggins, 1983; Schonewille et al., 2008; Luo et al., Ergebnisse 118 2014b), sowie Pflanzengewebe (z. B. Mais: 19,75 mM Mg2+) (Epstein, E., 1965; Barraclough, 1989; Dey & Harborne, 1997; Epstein & Bloom, 2005) weisen derart hohe Konzentrationen von Mg2+-Ionen auf. 5.3 Überprüfung der Interaktion von Pflanzen und Yersinien Nach den bisherigen Ergebnissen dieser Arbeit deuteten sowohl die Yts1-aktivierenden Kulturbedingungen (17°C, hohe MgCl2-Konzentrationen) als auch die in silico vorhergesagten sowie die in vitro bestimmten Funktionen der sezernierten Proteine auf eine Relevanz des Sekretionssystems für das Überleben von Y. enterocolitica außerhalb des Säugetierwirtes hin. Dabei bilden Pflanzen möglicherweise die Nische, in der das Yts1-System für die Yersinien wichtig wird. Speziell die hohe Übereinstimmung Yts1-ähnlicher Systeme in den pflanzenassoziierten Erwinia sowie die partielle Pektinasedomäne von YE3650 und die positive Promotoraktivität von pclR und chiY bei pflanzentypischen Magnesiumkonzentrationen unterstützen diese Vermutung. Daher wurden verschiedene Experimente durchgeführt, die eine mögliche Interaktion von Pflanzen und Yersinien untersuchen sollten. Zu diesem Zweck wurde eine Kooperation mit Dr. Michael Schmid vom Helmholtz-Zentrum München angestoßen, der in seiner Arbeitsgruppe Spinatpflanzen (Spinacia oleracea) auf monoaxenischem Boden heranzüchtet. Diese Pflanzen sollten dann mit verschiedenen YersiniaStämmen inkubiert und auf eine Kolonisierung mit den Bakterien untersucht werden. Ein Ergebnis zu diesen Experimenten liegt zu diesem Zeitpunkt noch nicht vor. In weiteren Versuchen wurden Stichinfektionen von Kartoffeln, Birnen und Äpfeln durchgeführt, um eine mögliche Degradation des Pflanzengewebes zu erkennen. Eine Infektion, Invasion oder ein Abbau der Pflanzenzellen konnte hier nicht beoabachtet werden (Daten nicht gezeigt). Ebenso zeigten die Promotoren von yts1C und assoziierten Genen (chiY, pclR) bei Inkubation der Bakterien in Extrakten von Birnen, Äpfeln und Nektarinen keine Induktion der Transkriptionsrate (siehe Abbildung 8-1). Aufgrund der hohen Ähnlichkeit des T2S-Systems der Erwinien zu Yts1 sollte auch die Sekretion von Erwinia-Stämmen bei 17°C und hoher MgCl2-Konzentration untersucht werden. Dazu wurde unserer Arbeitsgruppe dankenswerterweise jeweils ein Stamm von E. amylovora und E. pyrifoliae von Dr. Annette Wensing (Julius Kuehne Institut, Dossenheim) überlassen. Sowohl diese Erwinia-Stämme als auch einige klinische Isolate von Yersinien (Kooperation mit Prof. Dr. Antje Flieger, RKI Ergebnisse 119 Wernigerode und Prof. Séamus Fannung, University College Dublin, Irland) wurden daraufhin für 3 Stunden in LB-Medium bei 17°C und 20 mM MgCl2 inkubiert und die Überstände der Bakterien mittels TCA gefällt. Die resuspendierten Proteine wurden über eine SDS-PAGE getrennt, und das Proteinbandenmuster wurde mit der Yts1Sekretion des Stammes Y. enterocolitica 8081 verglichen (Abbildung 5-9). Von den untersuchten Stämmen zeigen weder die Erwinia-Isolate noch die Yersinien-Kulturen ein Yts-1 typisches Bandenmuster mit der verstärkten Sekretion von ChiY, EngY oder YE3650. Zwar kommen einige der Banden der YersinienStämme aufgrund ihrer Laufhöhe als Homologe der Yts1-Sekretionsprodukte in Frage (siehe Abbildung 5-9; YE3650 = „Y*“), aber die Expression dieser Proteine ist nicht stärker als die der restlichen sezernierten Proteine. 148 kDa 98 kDa E 64 kDa Y C Y* Y* Y* 50 kDa 36 kDa Abbildung 5-9: Proteinsekretion von E. amylovora, E. pyrifoliae und verschiedener Yersinien-Spezies bei 17°C und 20 mM MgCl2 in LB-Medium. Die Proteinsekretion von E. amylovora, E. pyrifoliae und verschiedener Yersinien-Isolate wurde nach 3-stündiger Inkubation bei 17°C und 20 mM MgCl2 in LB-Medium durch eine SDS-PAGE überprüft. Ganz links sind zum Vergleich der Größenmarker und die Coomassie-gefärbte SDSPAGE des hochpathogenen Stammes Y. enterocolitica 8081 dargestellt. In letzterem wurden die Sekretionsprodukte EngY (E), YE3650 (Y) und ChiY (C) durch Buchstaben markiert. Von links nach rechts schließen sich die SDS-PAGEs der nach Unterart oder Spezies gruppierten Isolate an (v. l. n. r. Isolat-Nummerierung: 09-03424, 09-05837, 10-01826, 10-02723, 09-03294, 09-03496, 08-00044, 09-00773, 08-07914). Banden, die möglicherweise auf die Sekretion eines homologen Proteins von YE3650 hinweisen sind durch „Y*“ gekennzeichnet. Die Bandenmuster innerhalb von Gruppierungen sind entsprechend der Verwandtschaftsverhältnisse nahezu identisch. Keines der untersuchten Isolate zeigte die für den hochpathogenen Y. enterocolitica-Stamm 8081 typische Ausprägung der Sekretion von ChiY, EngY und YE3650. Ergebnisse 120 Aufgrund der bisher bekannten in silico-Daten ist es jedenfalls unwahrscheinlich, dass die Banden der Yersinien-Überstände homologe Proteine zu den Yts1- Sekretionsprodukten darstellen, denn hinsichtlich der Gattung der Yersinia wurden ChiY-, EngY- und YE3650-Homologe durch Sequenzierung bisher nur in Y. enterocolitica Biotyp 0:8-Stämmen, Y. ruckeri, Y. mollaretii und Y. aldovae identifiziert. Das Auftreten eines Yts1-typischen Bandenmusters hätte aufgrund der in silicoDaten eigentlich nur in der SDS-PAGE von Y. mollaretii vermutet werden können. Allerdings zeigten die getesteten Y. mollaretii-Isolate bei den eingestellten Kulturbedingungen kaum eine Sekretion von Proteinen. Die einzig auffällige Proteinbande bei etwa 55 kDa entspricht einem Protein, das kleiner ist, als die Yts1-Sekretionsprodukte. Ansonsten zeigt die Zusammenstellung der SDS-PAGEs, dass die Bandenmuster sich innerhalb einzelner Isolat-Gruppen (z. B. Y. enterocolitica-Isolate mit Serotyp O:9 und Biotyp 3) stark ähneln. Das verifiziert zumindest die Typisierung der Isolate und belegt, dass das Sekretionsverhalten der einzelnen Isolate innerhalb einer Unterart stabil und reproduzierbar ist. Neben den proteinbiochemischen Versuchen wurden auch genomische Analysen vorgenommen, um die Genpräsenz der Yts1Sekretionsprodukte zu überprüfen. Dazu wurden mit der genomischen DNA der vorliegenden Erwinia- und Yersinia-Isolate (siehe Tab. 3-3) PCRs mit primern gegen chiY, engY und ye3650 durchgeführt. Bis auf den Y. enterocolitica WA-314-Stamm, der positiv für chiY und engY getestet wurde, wies keiner der Stämme ein entsprechendes PCR-Produkt auf. Alle Sequenzierungen von fraglichen Banden in den Agarosegelen erwiesen sich als unspezifisch amplifizierte DNA-Fragmente. Insgesamt konnten die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche keine experimentellen Belege für eine mögliche Bedeutung des Yts1-Systems bei der Interaktion mit Pflanzen erbringen. Sowohl die Stichinfektionen als auch die Promotoraktivität der Yts1-assoziierten Gene fielen in dieser Hinsicht negativ aus. Die Überlegung, dass die Kulturbedingungen, die eine Yts1-Sekretion induzieren, möglicherweise auch die Sekretion homologer Proteine in den pflanzenassoziierten Erwinia-Stämmen oder in anderen Yersinien hervorrufen, hat sich ebenfalls nicht bestätigt. Die beobachtete Sekretion von ChiY, EngY oder YE3650 bei 17°C und hohen MgCl2-Konzentrationen wurde bisher nur Y. enterocolitica-Stämmen 8081 und WA-314 festgestellt. bei den hochpathogenen Ergebnisse 5.4 121 Invertebraten als Modellorganismen für eine YersiniaInfektion Neben pflanzlichen Wirtsorganismen kommen vor allem Arthropoden wie Insekten oder Krebstiere als mögliche Vektoren des Bakteriums in Betracht. Aufgrund der Eigenschaften von zwei der drei bisher näher untersuchten sezernierten Proteine, die eine nachgewiesene Interaktion mit chitinhaltigen Oberflächen aufweisen, erscheint es plausibel, eine mögliche Bedeutung des Yts1-Sekretionssystems bei der Interaktion mit Tieren dieses Stammes zu erforschen. Daher wurden in dieser Arbeit mögliche terrestrische als auch aquatische Invertebraten ausgewählt, um eine Infektion dieser Tiere mit Yersinia enterocolitica zu dokumentieren und eine mögliche Auswirkung des Yts1-Systems auf den Verlauf einer Erkrankung zu analysieren. Als Modellorganismen dieser Infektionen sollten mit der Wachsmotte Galleria mellonella, dem Salinenkrebs Artemia salina und dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans Tiere eingesetzt werden, die relativ leicht zu halten sind und deren Verwendung bereits in anderen wissenschaftlichen Arbeiten beschrieben wurde (Kaletta & Hengartner, 2006; Bustos-Obregon & Vargas, 2010; Ramarao et al., 2012). 5.4.1 Infektion der Larven von Galleria mellonella mit Y. enterocolitica Die adulten Tiere der Großen Wachsmotte (Galleria mellonella) legen ihre Eier häufig in Bienenstöcken oder Hummelnestern ab, wo sich die entwickelnden Larven von Pollen– oder Brutrückständen in den Wachswaben ernähren. Aufgrund einfacher Zucht- und Haltungsbedingungen wurden die Larven der Großen Wachsmotte oftmals als Modellorganismus eingesetzt, um eine Interaktion von Insekten mit Insektiziden, Bakterien, Parasiten oder Pilzen zu erforschen (Ali et al., 1974; Brivio et al., 2002; Fallon et al., 2012; Ramarao et al., 2012). In dieser Arbeit sollten die Larven zunächst mit dem Wildtypstamm JB580v von Y. enterocolitica infiziert werden, um das Auftreten und den Verlauf einer Erkrankung mit der Inokulation von nicht-pathogenen Bakterien – hier E. coli DH5α – zu vergleichen. Da der Verlauf einer Infektion häufig von der Menge des eingebrachten Erregers abhängt, wurde die Auswirkung verschieden hoher Infektionsdosen (iCFU, Anzahl der colony forming units bei Infektion) auf die Pathogenese untersucht (Abbildung 5-10). Ergebnisse B relative Überlebensrate [%] A 122 iCFU/Larve: 100 5 x 103 (E. coli) 5 x 100 (GHY53) 75 5 x 101 (GHY53) 50 5 x 102 (GHY53) 5 x 103 (GHY53) 25 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Zeit nach Infektion [Tage] Abbildung 5-10: Überlebensrate infizierter Galleria mellonella Larven. Infektion von G. mellonella Larven mit Y. enterocolitica 8081 (O:8)-Wildtypstamm (GHY53). A) Exemplarische Fotografie zur Darstellung lebender (oben) und toter (unten) Larven bei dorsaler und ventraler Betrachtungsweise. B) Überlebensrate infizierter Larven in Abhängigkeit der Inkubationszeit bei 17°C. Die Wildtyp-Infektion mit dem Y. enterocolitica-Stamm GHY53 wurde mit unterschiedlichen Bakterienzahlen vorgenommen (5 bis 5000 colony forming units (iCFU)). Eine Kontrollpopulation wurde mit 5000 iCFU des apathogenen Laborstammes E. coli DH5α infiziert. Bei der höchsten verwendeten Infektionsdosis von 5000 iCFU sterben alle der mit dem Yersinia-Wildtyp infizierten Larven nach drei bis sechs Tagen, während 96,7% der mit E. coli infizierten Tiere überleben. Anhand der weiteren Infektionen mit Yersinia enterocolitica (500 iCFU bis 5 iCFU) wird ersichtlich, dass die Überlebensrate der Larven von der Infektionsdosis abhängt. Während bei 500 iCFU noch 97,1% der Tiere innerhalb von zehn Tagen sterben, sind es bei 5 iCFU nur noch 22,6%. Weiterhin verzögert sich das Auftreten der größten Sterbewelle unter den Tieren mit der Abnahme der Infektionsdosis. Die höchsten Sterberaten der mit 5000 iCFU infizierten Population sind an Tag drei (36%) und Tag vier (61,3%) zu verzeichnen, während bei 500 iCFU an Tag vier (60,9%) die meisten Tiere sterben. Bei 50 iCFU und 5 iCFU ist jeweils an Tag fünf die größte Anzahl der ablebenden Tiere zu beobachten (37,1%; 25,6%). Ab Tag sechs verlaufen die Sterberaten der unterschiedlich infizierten Populationen – mit Ausnahme der 5000 iCFU Larven – weitgehend synchron. Diese Versuche zeigen also, dass bereits eine geringe Anzahl der Yersinien zu einem letalen Infektionsverlauf führen, während eine Infektion mit E. coli-Bakterien keine messbaren Auswirkungen auf die Gesundheit der Wachsmottenlarven hat. Im Falle Ergebnisse 123 der Yersinien-Infektion verhält sich die Überlebenswahrscheinlichkeit der Tiere reziprok proportional zur Infektionsdosis (iCFU). 5.4.1.1 Infektion der Larven von Galleria mellonella mit Y. enterocolitica JB580v (wt) und der Mutante des T2SS Yts1 (GHY474) Um die mögliche Auswirkung des T2SS Yts1 und insbesondere der sezernierten Proteine auf die Pathogenese während der Infektion von G. mellonella-Larven zu untersuchen, wurden die Larven mit dem Y. enterocolitica-Wildtypstamm GHY53 und einem Stamm mit deletiertem yts1E-Gen (GHY474) infiziert. Auf Grundlage der zuvor angestellten Untersuchung wurden Infektionsdosen von 500, 50 und 5 iCFU ausgewählt, um die Überlebensraten der Larvenpopulationen zu dokumentieren (Abbildung 5-11, A-C). Wie auch zuvor steigt die Überlebensrate der infizierten Larven am Ende der 10-tägigen Inkubationszeit mit verringerter Infektionsdosis an. Bei einer Infektion mit 500 iCFU zeigt der Vergleich von Y. enterocolitica GHY53 mit der Deletionsmutante einen nahezu synchronen Verlauf der Überlebensraten. Die größte Abweichung ist an Tag drei zu verzeichnen an dem nur 3,8% der wildtyp-infizierten Tiere gestorben sind, während in der Gruppe der Larven, die mit der Mutante des Yts1-Systems infiziert wurden, 18,8% der Tiere verstarben. Der statistische Vergleich der beiden Kurven mittels des Mantel-CoxTests (Log-Rank-Test) ergab jedoch keinen signifikanten Unterschied (p = 0,1862). Ähnlich übereinstimmend verliefen auch die Überlebensraten bei einer Infektionsdosis von 50 iCFU und 5 iCFU (Abbildung 5-11, B und C). Auch wenn in diesen beiden Experimenten ab Tag fünf die Überlebensrate der Wildtyp-infizierten Larven etwas niedriger liegt, gibt es statistisch keinen Unterschied zur Überlebensrate der Larven, die mit dem Δyts1E-Stamm infiziert wurden. Die p-Werte des Mantel-CoxTests lagen bei 0,199 (50 iCFU) und 0,227 (5 iCFU). Die als Kontrolle mit E. coli DH5α infizierte Gruppe von Larven wies eine Überlebensrate von 98,1% auf. Ergebnisse B iCFU = 5 x 10 2 100 relative Überlebensrate [%] relative Überlebensrate [%] A 124 75 50 25 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 iCFU = 5 x 10 1 100 75 50 25 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Zeit nach Infektion [Tage] relative Überlebensrate [%] C Zeit nach Infektion [Tage] iCFU = 5 x 10 0 100 75 Legende: 50 GHY53 (wt) GHY474 (yts1E) 25 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Zeit nach Infektion [Tage] Abbildung 5-11: Überlebensrate infizierter G. mellonella-Larven nach Infektion mit Yersinia enterocolitica O:8 Wiltyp Stamm und Mutationsstamm mit deletiertem yts1E-Gen. Angegeben ist die Überlebensrate infizierter Larven in Abhängigkeit der Inkubationszeit bei 17°C. A) Infektion mit 500 iCFU B) Infektion mit 50 iCFU C) Infektion mit 5 iCFU; Als Kontrolle dienten Larven, die mit 5000 iCFU des apathogenen Laborstammes E. coli DH5α infiziert wurden (hier nicht dargestellt). 5.4.1.2 Quantifizierung von Y. enterocolitica nach der Infektion von G. mellonella-Larven Nachdem eine Infektion der G. mellonella-Larven mit Y. enterocolitica schon bei niedrigen Infektionsdosen innerhalb weniger Tage zu einer erhöhten Sterblichkeit der Tiere führte, sollte die Bestimmung der colony forming units die Keimzahlbelastung nach dreitägiger Inkubationszeit wiedergeben. Um die Auswirkungen des T2SS Yts1 Ergebnisse 125 auf die Keimzahlentwicklung in den Larven zu untersuchen, wurden die Wachsmottenlarven entweder mit dem Y. enterocolitica-Wildtypstamm GHY53 oder mit der Deletionsmutante des T2SS – dem Stamm GHY474 - infiziert. Da in vorherigen Experimenten ein Unterschied zwischen den beiden Stämmen vor allem bei niedrigeren Infektionsdosen aufzutreten schien, wurden für diesen Versuch entweder 500, 50 oder 5 iCFU in den Mitteldarm der Tiere injiziert. Nach dreitägiger Inkubation bei 17°C wurden die Larven homogenisiert und die Keimzahl des Homogenisats durch Bakterienanzahl pro ml Larvenvolumen (3 Tage n. Infektion) [CFUs] den Ausstrich auf LB-Agar Platten bestimmt (Abbildung 5-12). 1.5×10 7 GHY53 (wt) GHY474 (yts1E) 1.0×10 7 5.0×10 6 0 500 50 5 Bakterienanzahl bei Infektion [iCFUs] Abbildung 5-12: Keimzahlbestimmung der G. mellonella-Larven drei Tage nach Infektion. Die Larven der Wachsmotte wurden mit verschiedenen Dosen (500, 50, 5 iCFU) des Y. enterocolitica Wildtyps und der yts1E-Mutante infiziert und drei Tage (Inkubation bei 17°C) nach der Infektion homogenisiert. Das Homogenisat der Larven wurde in mehreren Verdünnungen auf LB-Agar Platten mit entsprechenden Antibiotika ausgestrichen und nach einer Inkubation bei 26°C wurden die colony forming units pro Milliliter Larvenvolumen bestimmt. Im Mittel lagen die Keimzahlen bei 4 - 7,8 x 106 pro Milliliter Larvenvolumen. Die niedrigsten Werte wurden für die Gruppen der Tiere ermittelt, die mit lediglich 5 iCFU infiziert wurden. Hier wiesen die mit GHY474 infizierten Wachsmottenlarven im Mittel 4,02 x 106 Bakterien pro Milliliter Larvenvolumen auf, während die Tiere, die mit GHY53 infiziert wurden, im Mittel 5,23 x 106 Bakterien pro Milliliter in sich trugen. Bei den mit 50 iCFU infizierten Larven wurde eine Keimbelastung von 8,7 x 106/ml Ergebnisse 126 (JB580v) bzw. 7,8 x 106/ml (GHY474) festgestellt, womit diese überraschend höher liegt als die Mittelwerte der CFUs, die aus den Infektionen der mit 500 iCFU behandelten Larven (JB580v: 6,8 x 106/ml; GHY474: 6,4 x 106/ml). Eine statistische Analyse ergab für keine der getesteten Infektionsdosen einen signifikanten Unterschied zwischen der Wildtyp Infektion und der Behandlung mit dem yts1Edefizienten Stamm von Y. enterocolitica. Festzuhalten bleibt, dass sich die Yersinien in den Larven massiv vermehren, so dass beispielsweise die Bakterienzahlen bei der Infektion mit 5 colony forming units nach drei Tagen um nahezu den Faktor 1 x 106 höher liegt als zu Beginn des Experiments. Interessanterweise ist damit, bezogen auf die ursprüngliche Infektionsdosis, die Zahl der Bakterien an Tag 3 in allen Testpopulationen nahezu gleich hoch. Dennoch spiegelt die Überlebensrate der Larven (siehe Abbildung 5-10) dieses Verhältnis nicht wieder, sondern zeigt im weiteren Verlauf der Infektion eine klare Korrelation zwischen Infektionsdosis und Überlebensrate der Larven. 5.4.1.3 Transkriptionsrate Yts1-assoziierter Gene in infizierten G. mellonellaLarven Um zu überprüfen, ob die Transkription Yts1-assoziierter Gene auch innerhalb infizierter Wachsmotten Larven stattfindet, wurden die Promotorbereiche der Gene yts1C, pclR und chiY vor ein lacZ-Gen kloniert und diese Konstrukte in das Genom des Y. enterocolitica-Wildtypstamms JB580v eingebracht. Das lacZ-Reportergen erlaubt es anschließend die von den Promotorbereichen induzierte Transkriptionsrate mittels des β-Galaktosidase-Assays quantitativ zu evaluieren. Dazu wurden zunächst die Larven der Wachsmotte mit jeweils einem der modifizierten Y. enterocoliticaStämme infiziert und für zwei Tage bei 17°C inkubiert. Das homogenisierte Gewebe der Larven wurde anschließend soweit präpariert, dass der β-Galaktosidase-Test durchgeführt werden konnte. Über die photometrische Messung des Farbumschlags wurde die Transkriptionsrate in Miller Units bestimmt (Abbildung 5-13). Zur Überprüfung einer endogenen Umsetzung des β-Gal Substrats durch das Larvengewebe wurde eine Negativkontrolle verwendet, die aus nicht infizierten Wachsmottenlarven generiert wurde. Die Versuchsergebnisse zeigen, dass das Regulatorgen pclR des Yts1-Systems über seinen Promotor in den Wachsmottenlarven transkribiert wird. Mit 340,7 Miller- Ergebnisse 127 Units zeigt das Gen eine Transkriptionsrate, die etwa 18-fach höher liegt als die verwendete Negativ-Kontrolle. Dieser Faktor entspricht in etwa vorherigen Versuchen, in denen die Transkription von pclR in vitro in LB-Medium mit einer Negativ-Kontrolle verglichen wurde (Faktor: 20,3; Daten hier nicht angegeben). Die Umsatzrate des βGal Substrates von yts1C::lacZ ist im Larvengewebe mit 27,7 Miller Units sehr schwach und indiziert damit eine kaum vorhandene Aktivierung von yts1C durch seinen Promotorbereich. Eine etwas höhere Transkriptionsrate lässt sich aus den Daten des Genkonstruktes chiY::lacZ ablesen. Mit etwa 66,5 Miller Units ist die Aktivierung des Promotorbereichs von chiY allerdings immer noch relativ schwach. -Galaktosidase Aktivität [Miller Units] 500 400 300 200 100 .) tr l( ne g K YA ch iY -la cZ YA pc lR -la cZ yt s1 C -la cZ YA 0 Abbildung 5-13: Transkriptionsrate Yts1-assoziierter Gene in den infizierten Larven von G. mellonella. Die Transkription der Gene yts1C, pclR und chiY wurde durch die Fusion der Promotorbereiche (ca. -500 kb) dieser Gene mit dem Reporteroperon lacZYA überprüft. G. mellonella-Larven wurden mit Y. enterocolitica-Stämmen infiziert, die eines der Fusionsgene in ihr Chromosom integriert hatten. Nach zweitägiger Inkubation der Tiere bei 17°C wurden diese homogenisiert und die Transkriptionsrate der Zielgene mittels β-Galaktosidase-Assay bestimmt. Ergebnisse 128 Zusammengefasst zeigen die Daten, dass im Vergleich zur Negativkontrolle die Transkriptionsrate von pclR in den Larven erhöht ist, während sich die Bedingungen in den Tieren auf die Transkription von chiY und yts1C nur durch eine schwache Transkriptionssteigerung auswirken. Die geringe Transkription von yts1C bedeutet hier allerdings nicht, dass das ganze Yts1-System nicht exprimiert wird. Da Shutinoski et al. (2003) in einer 5´-RACE zeigen konnten, dass pclR und yts1C zusammen in Form eines Operons transkribiert werden, das sich vermutlich über die Gesamtheit des Yts1-Genkomplexes erstreckt, ist anzunehmen, dass sich die gesteigerte Transkription von pclR auch positiv auf die Expression der anderen Yts1-Gene auswirkt. Nur wird anscheinend die yts1C-Transkription in vivo nicht zusätzlich induziert. Für chiY ist die Kotranskription mit anderen Yts1-Genen eher unwahrscheinlich und der Unterschied zwischen der Promotoraktivität in LB-Medium (17°C, 20 mM MgCl2), in dem über 8000 Miller Units Transkriptionsaktivität gemessen wurden (siehe Abbildung 5-8), und der Transkription in den Larven (66,5 Miller Units) ist eklatant. Da der positive chiY-Regulator pclR offensichtlich exprimiert wird, ist möglicherweise der andere Hauptfaktor der chiY-Transkription, also die Magnesiumkonzentration, limitierend. Ein Wert für die Magnesiumkonzentration im Gewebe der verwendeten Wachsmottenlarven ist allerdings nicht bekannt. Der Versuch, eine mögliche ChiYSekretion im Hämocoel von G. mellonella über Western Blot nachzuweisen, war nicht erfolgreich, da unspezifische Bindungen des zur Verfügung stehenden Antikörpers eine sichere Identifizierung verhinderten. Insgesamt lieferten die Untersuchungen zur Bedeutung des Yts1-Sekretionssystems und der dadurch sezernierten Proteine für die Pathogenität von Y. enterocolitica im Modell der Wachsmotten keine zufriedenstellende Grundlage um dieses Infektionsmodell für weitere Untersuchungen heranzuziehen. 5.4.2 C. elegans als Invertebraten-Modell für eine Yersinia-Infektion Als weiteres Invertebraten-Modell wurden Nematoden der Art Caenorhabditis elegans für Infektionsversuche mit Yersinia enterocolitica eingesetzt. Mehrere Eigenschaften machen diesen Fadenwurm zu einem der am häufigsten verwendeten Versuchstiere in der biologischen Forschung und zu einem der am besten erforschten Organismen der Welt. Vor allem die Eutelie, also die Zellkonstanz von genau 959 Zellen des Ergebnisse 129 adultem Hermaphrodit (1031 somatische Zellen im Männchen), die einfache Strukturbildung, die Durchsichtigkeit des Tieres und die einfache Haltung auf bakterienbewachsenen Agarplatten sind Aspekte für die große Zahl von Forschungsgruppen, die auf C. elegans zurückgreifen (Kaletta & Hengartner, 2006). Außerdem wurde im Jahr 1998 mit C. elegans die erste vollständige Sequenzierung eines Vielzellers (Metazoon) abgeschlossen (C. elegans Sequencing Consortium, 1998). Das adulte Tier wird etwa 1 Millimeter lang und besitzt einen Durchmesser von etwa 65 µm. C. elegans finden sich vorwiegend in Böden der gemäßigten Klimazonen. Sie ernähren sich von Bakterien, die ihrerseits totes organisches Material abauen. Die natürliche orale Aufnahme von Bakterien war neben der einfachen Etablierung des C. elegans-Modells ein Hauptgrund für den Versuch, diese Tiere mit Y. enterocolitica-Stämmen zu infizieren. Abbildung 5-14: Lebenszyklus des Nematoden C. elegans. Von der Embryonalentwicklung und nach dem Durchlaufen von mehreren Larvenstadien (L1 - L3) entwickelt sich das adulte Tier bei optimalen Bedingungen (22°C) innerhalb von etwa 51 Stunden nach der Befruchtung der Eizelle. Die Nematoden prägen zwei Geschlechter aus. Entweder entwickelt sich ein Hermaphrodit oder ein männliches Tier. Sofern der Wurm nicht im L2-Stadium die Form eine Dauer-Larve annimmt, die mehr als drei Monate auch bei ungünstigen Bedingungen bestehen kann, leben die adulten Tiere etwa zwei bis drei Wochen (Jorgensen & Mango, 2002). Ergebnisse 130 Untersuchungen zu dem Auftreten von Chitin in den Nematoden, in deren Exoskelett das Polysaccharid normalerweise nicht vorkommt, belegen, dass vor allem der Pharynx der Tiere durch chitinhaltige Zellschichten gekennzeichnet ist (Heustis et al., 2012). Ein möglicher Ansatzpunkt für die Yts1-sezernierten Proteine ChiY, EngY und YE3650 könnte daher im Verdauungstrakt der Tiere liegen. Aus der Literatur war bekannt, dass schon eine relativ kurze Inkubationszeit (15 Minuten) auf Y. enterocolitica bewachsenen Agarplatten genügt, um eine Kolonisierung der Tiere mit den Bakterien herbeizuführen und die Folgen einer solchen Infektion zu verzeichnen (Spanier et al., 2010). 5.4.2.1 Fluoreszenzmikroskopische Analyse der Infektion von C. elegans mit Y. enterocolitica-Stämmen Um eine Infektion der Nematoden auch mikroskopisch untersuchen zu können, wurden Y. enterocolitica-Stämme (GH124, GHY620) verwendet, die über ein eingebrachtes pVLT-Plasmid GFP exprimierten. Die Infektion der adulten Nematoden erfolgte über die Inkubation der Tiere für eine Stunde auf Agarplatten, die entweder mit dem wildtypischen Y. enterocolitica-Stamm 8081 (GHY124, JB580v, pVLT-GFP) oder mit einem yts1E-defizienten Stamm (GHY620, JB580v Δyts1E, pVLT-GFP) bewachsen waren. Anschließend wurden die Würmer für weitere drei Tage auf NGMAgarplatten (siehe 3.10.2) gehalten und dann für die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung vorbereitet (Abbildung 5-15). Die Aufnahmen zeigen bei beiden Infektionsstämmen ein deutliches, gleichmäßiges GFP-Signal entlang des kompletten Verdauungstraktes der Tiere (Abbildung 5-15; D, E, J) und besonders intensiv ist die Emission im Bereich des Pharynx zu beobachten (Abbildung 5-15; D, J). Weiterhin sind auch punktförmige Akkumulationen der grünen Fluoreszenz im Darm sowie in angrenzendem Gewebe sichtbar (Abbildung 5-15; E, F, K, L; siehe Pfeile). Diese distinkten Signale treten vor allem im Bereich des Mitteldarmes der Würmer auf. Dass auch drei Tage nach der kurzen Inkubation mit den Yersinien ein so deutliches GFP-Signal im Darm der Tiere auftritt, deutet auf eine dauerhafte Kolonisierung der Nematoden durch die Bakterien hin. Tatsächlich entsprachen weitere Aufnahmen, die 10 Tage nach dem Infektionsereignis durchgeführt wurden, den hier gezeigten Fluoreszenzbildern. Ergebnisse 131 Abbildung 5-15: Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis von Y. enterocolitica 8081 im Verdauungstrakt von C. elegans. Synchronisierte C. elegans Populationen wurden bis zum L4-Stadium gezüchtet und anschließend für eine Stunde auf NGM-Agarplatten mit Y. enterocolitica 8081 pVLT-GFP (GHY124) oder mit Y. enterocolitica Δyts1E pVLT-GFP (GHY620) transferiert. Nach Waschen und dreitägiger Inkubation bei 17°C auf NGM-Agar mit E. coli OP50-Bakterien wurden die Nematoden sediert und für die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen präpariert. Den repräsentativen lichtmikroskopischen Aufnahmen (A-C: GHY124; G-I: GHY620) werden die entsprechenden Fluoreszenzaufnahmen (D-F: GHY124; J-L: GHY620) des spezifischen Gewebes gegenübergestellt. Die Aufnahmen, die mit einem 40-er Objektiv (400-fache Vergrößerung) gemacht wurden (B, C, E, F, H, I, K, L), stellen Ausschnitte aus den Übersichtsaufnahmen (A, D, G, J) dar, die mit einem 10-er Objektiv (100-fache Vergrößerung) erstellt wurden. Punktförmige Akkumulationen des GFP-Signals wurden durch Pfeile gekennzeichnet. Das GFP-Signal wurde vornehmlich im Verdauungstrakt der Nematoden und in angrenzendem Gewebe detektiert. Des Weiteren implizieren die punktförmigen Akkumulationen der Fluoreszenz, dass die Bakterien auch in angrenzendes Gewebe eingedrungen sind und dort entweder interzelluläre Mikroabszesse bilden, oder aber intrazellulär in den Immunzellen der Tiere fortbestehen. Ergebnisse 132 In etwa 5% der Aufnahmen fanden sich auch GFP-Signale auf der cutikulären Außenhaut der infizierten C. elegans (siehe Abbildung 5-16). Somit besteht die Möglichkeit, dass die Bakterien ebenfalls in der Lage sind an die Cuticula der Nematoden zu adhärieren, und somit auch auf diese Weise die Nematoden als Vektor nutzen. Nach den bisherigen Ergebnissen besteht allerdings zwischen dem Y. enterocolitica-Wildtypstamm und dem Δyts1E-Stamm kein Unterschied in der quantitativen Ausprägung dieser Adhärenz. Insgesamt ließen sich aufgrund der mikroskopischen Untersuchung weder qualitative noch quantitative Unterschiede in der Kolonisierung der Würmer oder der Adhärenz zu deren Oberfläche feststellen, die auf eine abweichende Virulenz der beiden verwendeten Y. enterocolitica-Stämme hinweisen würden. Abbildung 5-16: Floureszenzmikroskopische Aufnahme von Y. enterocolitica-Bakterien an der Cuticula von C. elegans. Repräsentative mikroskopische Aufnahmen der Fadenwürmer bei 10-facher (A, C) und 40-facher (B, D) Vergrößerung. Die grün fluoreszierenden Bereiche (C, D) kennzeichnen das Vorkommen von GFP-markierten Y. enterocolitica. Unabhängig vom Bakterienstamm (GHY124 oder GHY620) wiesen etwa 5% der Nematoden neben den im Verdauungstrakt auftretenden Bakterien auch an die Cuticula anheftende Bakterienkolonien auf (siehe Pfeile). Ergebnisse 5.4.2.2 133 Kolonisierung von C. elegans durch die Yersinia-Stämme Um die Kolonisierungsintensität der Nematoden durch die Yersinia-Stämme nicht nur mikroskopisch nachzuvollziehen, wurden an Tag 1, Tag 3 und Tag 7 nach der Infektion, die Anzahl der colony forming units pro Tier bestimmt. Dazu wurden jeweils 20 der Nematoden, die nach oben beschriebenem Vorgehen mit den Stämmen GHY53 (Y. e. 8081 wt) oder GHY474 (Y. e. 8081 ∆yts1E) infiziert wurden, homogenisiert, die Überstände in mehreren Verdünnungen auf LB-Agarplatten mit entsprechenden Antibiotika ausplattiert und anhand der gezählten Kolonien die Bakterienanzahl pro Nematode berechnet (Abbildung 5-17). Bakterienanzahl pro Wurm [CFU] 6000 GHY53 (wt) GHY474 (yts1E) 4000 2000 0 Tag 1 Tag 3 Tag 7 Tag nach Infektion Abbildung 5-17: Kolonisierung von C. elegans durch Y. enterocolitica. Mit Y. enterocolitica 8081 (GHY53, kariert) und dem yts1E-defizienten Stamm GHY474 (gepunktet) infizierte C. elegans wurden an Tag 1, Tag 3 und Tag 7 nach der Infektion auf Konzentration der bakteriellen Erreger pro Tier überprüft. Die höchste Anzahl Bakterien findet sich in den Nematoden an Tag 1 nach der Infektion. Nach Halbierung der Erregerzahl an Tag 3, bleibt die Kolonisierungsintensität bis Tag 7 annähernd stabil. Pro Yersinia-Stamm und Infektionstag wurden jeweils 3 x 20 Tiere verwendet, und die Zahl der colony forming units wurde pro Homogenisierungsansatz anhand von jeweils dreifacher Ausplattierung bestimmt. Einen Tag nach der Fütterung der Nematoden mit den Yersinia-Stämmen wurde eine Kolonisierung von 4697 CFU (SD: 817 CFU) pro Tier durch Y. enterocolitica 8081 (GHY53) festgestellt, während die mit dem yts1E-defizienten Stamm infizierten Tiere eine CFU von 4180 (SD: 1070 CFU) aufwiesen. An Tag 3 nach der Infektion gingen die Bakterienzahlen auf etwa 2000 CFU (GHY53: 2126 CFU, SD: 719 CFU, GHY474: Ergebnisse 134 2052 CFU, SD: 972 CFU) pro Wurm zurück. Während zwischen Tag 1 und Tag 3 nach Infektion ein signifikanter Unterschied der Erregerzahl (GHY53: p = 0,007; GHY474: p = 0,031) besteht, ändert sich die Kolonisierung an Tag 7 im Vergleich zu Tag 3 nicht mehr signifikant. Zwar liegt der Mittelwert der Erregeranzahl der mit Y. enterocolitica 8081-infizierten C. elegans mit durchschnittlich 2854 CFU höher, als bei dem Versuch mit dem yts1E-defizientem Stamm (1910 CFU), der Unterschied ist jedoch aufgrund der Standardabweichungen (SD (GHY53): 1787 CFU; SD (GHY474): 505 CFU) nicht signifikant. Insgesamt nimmt damit die Kolonisierung nach der Infektion ab, jedoch stabilisiert sich die Zahl der Bakterien in den Nematoden bei etwa 2000 CFU pro Tier. Zwischen den beiden verwendeten Yersinia-Stämmen lässt sich jedoch in diesem Versuch kein signifikanter Unterschied in der Besiedelung der C. elegans-Populationen feststellen. 5.4.2.3 Überlebensrate von C. elegans nach der Infektion mit Y. enterocoliticaStämmen Die Ergebnisse der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung und der Kolonisierungsintensität belegen zwar eine Besiedlung von C. elegans durch Y. enterocolitica, aber einen möglichen Unterschied der Virulenz der verwendeten Bakterienstämme ist nicht ersichtlich geworden. Daher sollten bei weiteren Infektionsversuchen die Überlebensraten der Nematoden aufgezeichnet werden, um die Auswirkung des Yts1-Systems auf eventuelle Differenzen in der Lebensspanne zu analysieren. Wie auch bei den vorangegangenen Versuchen wurden adulte C. elegans für eine Stunde auf NGM-Agarplatten mit dem Y. enterocolitica-Stamm 8081 (GHY53) oder einem yts1E-defizienten Stamm (GHY474) inkubiert und anschließend bei 17°C auf OP50-Bakterien gehalten. Alle 24 Stunden wurden daraufhin die Bestände auf tote und lebende Tiere untersucht und der Verlauf der Überlebensrate dokumentiert (Abbildung 5-18). Die Überlebensrate aller drei C. elegans-Gruppen verläuft über die ersten sechs Tage nach der Infektion parallel und liegt zu diesem Zeitpunkt bei etwa 90% der Ausgangspopulation. Von Tag 7 bis Tag 13 nach dem Infektionsereignis weisen die mit Y. enterocolitica kolonisierten Gruppen eine höhere Sterberate auf, als die C. elegans Tiere, die lediglich mit dem apathogenen Futterstamm E. coli OP50 in Kontakt gekommen waren. relative Überlebensrate [%] Ergebnisse 135 GHY53 (wt) 100 GHY474 (yts1E) E. coli OP50 75 50 25 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Zeit nach Infektion [Tage] Abbildung 5-18: Lebensspanne von C. elegans nach der Infektion mit Y. enterocoliticaStämmen. Die Infektion adulter Nematoden mit Y. enterocolitica-Stämmen wurde durch eine einstündige Umsiedlung der Tiere auf entsprechend bewachsene Agarplatten vollzogen, wobei das Fressverhalten der Würmer zu einer oralen Aufnahme der Bakterien führte. Die Anzahl lebender Versuchstiere, die im weiteren Verlauf auf OP50-Agarplatten gehalten wurden, wurde täglich evaluiert. Neben dem Y. enterocolitica-Wildtypstamm GHY53 (schwarze Linie; n = 96) und dem yts1E-defizienten Stamm GHY474 (graue Linie; n = 88), wurde auch eine Kontrollgruppe (graue unterbrochene Linie; n = 77) von Tieren ausgewertet, die lediglich E. coli OP50-Bakterien ausgesetzt waren. Die Nematoden, die mit einem der beiden Y. enterocolitica-Stämmen in Kontakt kamen, weisen jeweils eine signifikant unterschiedliche Überlebenskurve im Vergleich zu der Kontrollgruppe auf (Mantel-Cox Test: p<0,0001). Ab Tag 14 verlaufen die drei Kurven der Überlebensrate wieder weitgehend synchron, wobei bis hierhin weniger als 15% der Tiere mit Y. enterocolitica-Infektion (GHY53: 14,6%; GHY474: 12,4%) und 37,6% der OP50-Gruppe überlebt haben. Mittels eines Mantel-Cox-Tests (Log-Rank-Test) wurden die Kurven auf signifikante Unterschiede überprüft. Es zeigte sich, dass beide mit Yersinia infizierten C. elegans-Populationen im Vergleich zu der Kontrollgruppe eine signifikant abweichende Entwicklung der Überlebensrate aufweisen (p<0,0001). Zwischen dem Y. enterocolitica-Wildtypstamm (GHY53) und der yts1E-defizienten Mutante (GHY474) wurde jedoch kein signifikanter Unterschied festgestellt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieses Versuches, dass eine Kolonisierung der Nematoden mit Y. enterocolitica zu einer um ein 20% verkürzten Lebensspanne der Tiere führt. Eine schädigende Wirkung der Bakterien auf C. elegans ist damit Ergebnisse 136 jedoch nicht so unmittelbar, wie es bei der Infektion von Galleria mellonell-Larven beobachtet wurde. Des Weiteren lieferten die Daten keinen Beleg für eine Rolle des Yts1-Systems bezüglich der Dynamik einer Infektion in C. elegans. 5.4.3 Der Salinenkrebs Artemia salina als aquatisches Infektionsmodell Die Infektionsversuche mit G. mellonella und C. elegans zeigten zwar, dass Yersinia enterocolitica die Versuchstiere besiedelt und bei den Wachsmotten eine hohe Letalität verursacht, jedoch konnte keine Assoziation mit dem Yts1-Sekretionssystem beobachtet werden. In Anbetracht bisheriger Ergebnisse, wie der chitinbindenden beziehungsweise kohlenhydratbindenden Eigenschaften der sezernierten Proteine, dem Vorkommen von homologen Proteinen in häufig aquatischen Bakterien (z. B. Vibrio cholerae) oder der Aktivität des Systems bei hohen MgCl2-Konzentrationen, wurde der Salinenkrebs Artemia salina als weiteres mögliches Infektionsmodell ausgewählt. Diese im ausgewachsen Zustand etwa 1 - 1,5 Zentimeter großen Tiere gehören zu der Ordnung der Kiemenfüßer (Anostraca) und besitzen ein stark gegliedertes Exoskelett aus Chitin und verstärkenden Proteinkomplexen. Die Larven benötigen etwa 12 - 36 Stunden, um aus in Salzwasser gelegten Eiern zu schlüpfen und erreichen nach etwa einem Monat eine Größe von 1 cm. Die Tiere ernähren sich filtrierend von Algen und Nanoplankton und bei ausreichender Nahrungs- und Sauerstoffversorgung können sie mehrere Monate alt werden. Die Salinenkrebse sind weit verbreitet und besiedeln salzhaltige Binnengewässer, die teilweise weit höhere Salzkonzentrationen aufweisen als das Meerwasser. Die einfache Herstellung und Lagerung der Dauereier sowie die unkomplizierte Aufzucht der Artemia-Larven machen diese Tiere zu einem bedeutenden Futtermittel in der Aquakultur und Aquaristik (Sorgeloos et al., 2001). Auch in der Forschung hat sich Artemia salina als Standardorganismus etabliert und wird beispielsweise zur Bestimmung von Umweltverschmutzungen in diversen Toxizitätsexperimenten eingesetzt (Michael et al., 1956; Bustos-Obregon & Vargas, 2010; Gambardella et al., 2014). Um in ersten Experimenten zu evaluieren, ob eine Verwendung der Salinenkrebse als Infektionsmodell zielführend ist, wurde zunächst die Überlebensrate der Tiere bei einer Infektion mit dem wildtypischen Stamm Y. enterocolitica 8081 (GHY53) und dem yts1E-defizienten Stamm GHY474 dokumentiert. Pro Versuchsansatz wurden 10 adulte Artemia in eine artifizielle Meerwasser-Lösung überführt, in die Ergebnisse 137 jeweils einer der Yersinia-Stämme oder als Kontrolle der E. coli-Stamm OP50 in verschiedenen Konzentrationen (1 x 106/ml; 1 x 107/ml; 1 x 109/ml) hinzugefügt wurden. Die Überlebenskurven der Infektionen mit 1 x 106 und 1 x 107 Bakterien pro Milliliter Meerwasser zeigten bei diesen Versuchen einen ähnlichen Verlauf wie die der Infektionen mit 1 x 109 Bakterien pro Milliliter. Allerdings sterben die Artemia in den Versuchen mit niedrigerer Infektionsdosis durchschnittlich zwei bis drei Tage früher als bei den Inkubationen mit höherer Bakterienkonzentration (Daten hier nicht gezeigt). Diese Tatsache spricht gegen eine relative Überlebensrate [%] Rolle der Bakterien als Ursache der beobachteten Letalität unter den Artemia. GHY53 (wt) 100 GHY474 (yts1E) 75 E. coli OP50 50 25 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Zeit nach Infektion [Tage] Abbildung 5-19: Infektion des Salinenkrebses Artemia salina mit Yersiniae. Linke Abbildung: Fotografie eines weiblichen (oberes Tier) und männlichen (unteres Tier) Salinenkrebses (Hillewaert, 2010). Rechte Abbildung: Die Salinenkrebse wurden in artifiziellem Meerwasser gehalten, dem entweder der Y. enterocolitica-Stamm 8081 (GHY53, schwarze Linie), die yts1E-defiziente Mutante (GHY474, grau gestrichelte Linie) oder zur Kontrolle ein apathogener 9 E. coli OP50-Stamm (schwarz gestrichelte Linie) mit einer Konzentration von 1 x 10 Bakterien pro Milliliter hinzugegeben wurde. Während der Inkubation der Versuchsansätze bei 17°C wurde alle 24 Stunden die Anzahl lebendiger Tiere dokumentiert. Die Kontrollgruppe weist eine signifikant niedrigere Überlebenskurve im Vergleich zu den Yersinia-Infektionen auf (Mantel-Cox: p = 0,0362). Bei den Infektionen mit 1 x 109 Bakterien pro Milliliter (Abbildung 5-19) weisen die Kurven der Überlebensraten eine lineare Abnahme der lebenden Tiere über 9-10 Tage auf, bis alle Versuchstiere verstorben sind. Unerwarteterweise sterben auch die Tiere der Kontrollgruppe mit den E. coli-Bakterien mit einer ähnlichen Rate, wie sie Ergebnisse 138 auch in den Yersinia-Infektionen beobachtet wurde. Tatsächlich ergab ein MantelCox-Test, dass die Artemia der E. coli OP50-Inkubation signifikant eher sterben (p = 0,0362) als die Yersinia-Stämme, während zwischen Wildtyp und Mutante kein signifikanter Unterschied festgestellt werden konnte. Auch die Tatsache, dass kein Salinenkrebs in den Infektionsversuchen länger als 10 Tage überlebt, ist unerwartet und wirft Fragen zu der Verwertbarkeit der Ergebnisse auf. Da Artemia salina im Normalfall mehrere Monate alt werden können, sollten zumindest die mit E. coli OP50-Bakterien inkubierten Salinenkrebse im Durchschnitt wesentlich länger leben. Daher ist es wahrscheinlich, dass hier die Haltungsbedingungen (Sauerstoff-, Nährstoffversorgung) für die Tiere während der Infektion nicht ausreichen, um eine normale Entwicklung der Artemia zu gewährleisten. Da raum- und gerätetechnische Beschränkungen sowie einzuhaltende S2-Sicherheitsvorschriften eine entscheidende Verbesserung der Infektionsbedingungen verhinderten, konnten bis zum jetzigen Zeitpunkt keine weiteren Infektionsversuche mit Artemia salina unternommen werden. Diskussion 6 139 Diskussion Sekretionssysteme sind sowohl für pathogene als auch für apathogene Bakterien ein bedeutender Faktor, um mit ihrer Umgebung zu interagieren, vorhandene Energieressourcen auszunutzen oder sich einen kompetitiven Vorteil gegenüber anderen Organismen zu sichern. Die Entdeckung zweier Typ-II-Sekretionssysteme in Y. enterocolitica warf daher die Frage auf, inwieweit diese Maschinerien in den Bakterien funktional sind und welcher Nutzen den Prokaryoten daraus entsteht. Während für das Yts2-Sekretionssystem bis heute weder aktivierende Bedingungen noch mögliche Sekretionsprodukte entdeckt werden konnten, vermutete die Arbeitsgruppe um Iwobi et al. (2003) aufgrund von Versuchen im Mausmodell, dass das Yts1-Sekretionssystem bei der Besiedelung tieferen Gewebes in Säugetieren eine wichtige Rolle spielt. Anschließende Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe (Shutinoski et al., 2010) wiesen jedoch darauf hin, dass das Yts1-Sekretionssystem in vitro vornehmlich bei niedrigeren Umgebungstemperaturen um 17°C aktiv ist. Auch die identifizierten sezernierten Proteine ChiY, EngY und YE3650 weisen Charakteristika auf, die für eine Interaktion dieser Proteine mit Polysacchariden wie Chitin sprechen. Chitin ist zwar eines der am häufigsten vorkommenden Biopolymere des Planeten, wird aber von Säugetieren nicht synthetisiert. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, auf der einen Seite weitere Indizien für die Bedeutung des Yts1-Systems bei der Infektion von Säugetieren zu sammeln und auf der anderen Seite eine mögliche Rolle dieses Typ-II-Sekretionssystems bei der Verbreitung und dem Überleben von Yersinia enterocolitica in der Umwelt zu evaluieren. Für den ersten Teil dieser Aufgabe wurden Experimente mit humanen Zellkulturlinien sowie mit Blut- und Serumproben durchgeführt. Für den zweiten Teil dieser Zielsetzung wurden neben eingehenden in silico-Analysen verschiedene Invertebraten-Modelle für Infektionsstudien etabliert und auf eine mögliche Funktion als Vektor für Y. enterocolitica untersucht. Diskussion 6.1 140 Rolle des Yts1-Sekretionssystems für die Virulenz des Bakteriums während humaner Infektionen Im ersten Teil dieser Arbeit sollte die mögliche Bedeutung des Yts1-Sekretionssystems als Virulenzfaktor bei Säugetierinfektionen analysiert werden. Da die Arbeitsgruppe um Iwobi et al. (2003) durch Genomvergleichsanalysen für das yts1Operon einen möglichen Einfluss auf die Infektionsfähigkeit des Bakteriums Y. enterocolitica WA-314 vermutet und durch Versuche im Mausmodell spezifiziert hatte, nahmen wir an, dass Patienten mit überstandener Yersiniose Antikörper gegen die von Shutinoski et al. (2010) entdeckten Sekretionsprodukte ChiY, EngY und YE3650 bilden könnten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass einige der Seren aus rekonvaleszenten Personen beziehungsweise aus infizierten Kaninchen die genannten Proteine in immunohistochemischen Reaktionen detektieren. Vor allem die Antikörper der Kaninchenseren zeigten eine starke Bindung an die Proteinbande ChiYs. Die Immunzellen der Tiere oder Patienten, welche eine positive Reaktion gegen die sezernierten Proteine aufwiesen, müssen also im Zuge der Infektion mit diesen Proteinen in Kontakt gekommen sein und die Bildung von Antikörpern veranlasst haben. Unklar bleibt jedoch, ob die Antigene schon im Darm durch dendritische Zellen aufgenommen wurden, oder ob die Interaktion zwischen den Immunzellen und den Yts1-Sekreten erst zu einem späteren Zeitpunkt der Yersiniose, wie z. B. während der Verbreitung der Bakterien im lymphatischen System, zustande gekommen ist. Möglich ist eine Antigendetektion auch schon im Bereich der Mundhöhle, wo die Gaumenmandeln das erste lymphatische Organ bilden, das oral aufgenommene Pathogene detektiert. Bei Schweinen zum Beispiel werden Y. enterocolitica-Stämme mit großer Häufigkeit aus den Gaumenmandeln isoliert. Die Produktion der sezernierten Proteine könnte dementsprechend auch außerhalb des warmblütigen Wirtes stattgefunden haben und lediglich über die perorale Aufnahme zu einer Immunreaktion und einer Antikörperbildung geführt haben. Ein Nachweis auf eine Synthese der Proteine ChiY, EngY und YE3650 direkt im Wirtsorganismus lässt sich aus den immunohistochemischen Daten nicht schlüssig ableiten. Andererseits ist eine Expression während einer (humanen) Infektion allerdings auch keinesfalls ausgeschlossen. Nicht alle getesteten Humanseren zeigten eine immunohistochemische Reaktion gegen die Banden der Yts1-Sekretionsprodukte, was möglicherweise auch mit den Eigenschaften des jeweiligen Infektionsstamms zusammenhängt. Da es unklar ist, Diskussion 141 durch welchen Y. enterocolitica-Stamm die Individuen infiziert wurden, aus denen die Seren gewonnen wurden, könnten im Fall der negativen Seren die Infektionen auch durch Yts1-negative Stämme verursacht worden sein. So zeigten die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen der Sekretionsüberstände verschiedener Yersinia-Spezies (siehe 5.3), dass lediglich die 0:8Stämme Y. enterocolitica 8081 und WA-314 die Proteine ChiY und EngY (YE3650 nur in Y. enterocolitica 8081) synthetisieren und exportieren. Damit bestätigten sich auch die in silico-Daten sowie die PCR- und Southern-Blot-Ergebnisse der Arbeitsgruppe Iwobi et al. (2003), die das Auftreten eines Yts1-Systems nur im Genom der Y. enterocolitica-Stämme der Serotypen O:8 (WA-314, 8081), O:13, O:20 und O:21 nachweisen konnten. Mit den immunhistochemischen Daten konnte also noch kein eindeutiger Beleg für die Expression und Sekretion des Yts1-Systems während einer Säugetierinfektion gewonnen werden, und der Widerspruch zwischen dem Versuch im Mausmodell durch die Arbeitsgruppe Iwobi et al. und dem nur bei niedrigen Temperaturen (17°C) aktiven Yts1 in den in vitro-Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe blieb bestehen. Da trotz der Überprüfung verschiedener Kulturbedingungen in vitro keine spezifischen Faktoren identifiziert werden konnten, welche die Transkription der yts1-Gene und ihrer Substrate bei 37°C über die basalen Werte hinaus induzierten, vermuteten wir, dass es wirtszellspezifischer Faktoren bedürfen könnte, um über einen bisher unbekannten Signalweg die Transkription zu induzieren. Die in dieser Arbeit vorgenommenen Infektionen der Zellkulturlinien Raji, THP-1 und T84 zielten daher darauf ab, Reporterstämme (chiY::lacZYA, pclR::lacZYA, yts1C::lacZYA) mit aktiven Zellen und deren Überständen interagieren zu lassen, um die mögliche Auswirkung eines Wirtszellfaktors auf eine erhöhte Transkriptionsrate detektieren zu können. Die verwendeten Reporterstämme repräsentieren mit dem Regulatorgen pclR und dem nachgeschalteten ersten Gen der Yts1-Gengruppe (yts1C) die wichtigsten Marker der Transkriptionsaktivität des Yts1-Operons, dessen Reaktion auf beschriebene Kulturbedingungen in vitro nachgewiesen werden konnten. Ebenso bedeutend ist die Überprüfung der chiY-Transkription, die in vitro die stärkste Veränderung in Bezug auf die Kulturbedingugen erfährt und durch mehrere Faktoren (PclR und Mg2+-Konzentration) beeinflusst wird. Jedoch zeigte keiner der Versuchsansätze eine Stimulation der yts1-Expression. Es wurden in diesem Versuch ganz bewusst verschiedene Zelllinien eingesetzt, die Diskussion 142 mit den Kolonepithel-ähnlichen T84-Zellen, den Lymphoblast-ähnlichen Raji-Zellen und den Monozyten-ähnlichen THP-1-Zellen die verschiedenen Stationen der Yersinia-Infektion simulieren sollten. Allerdings muss bedacht werden, dass Zelllinien immer entartete Zellen darstellen, die oftmals einen Teil ihrer natürlichen Genexpression und Funktionen verloren haben. Desweiteren ist besonders das Immunsystem durch komplexe Zusammenspiele von einer Vielzahl an Faktoren und Zellen charakterisiert, die in der labortechnischen Zellkultur nur bedingt nachzustellen sind. So ist es möglich, dass auch in diesem Fall die limitierten Bedingungen der Zellkultur nicht ausgereicht haben, um einen eventuellen Signalweg zur Steuerung der Yts1-Sekretion bei 37°C zu aktivieren. Um dennoch eine Fülle verschiedener Zellen, Proteine und Hormone mit den Reporterstämmen interagieren zu lassen, wurden humane Blut- und Serumproben mit den jeweiligen Stämmen bei 37°C inkubiert und die Transkription der Reportergene ausgelesen. Auch in dieser Untersuchung hatten die getesteten Bedingungen keinen positiven Effekt auf die Aktivität der Promotorregionen von chiY, pclR und yts1C. Dieses Ergebnis geht mit den Versuchen im Mausmodell insofern konform, als dass Iwobi et al. bei intravenöser Inokulation, im Gegensatz zur peroralen Applikation, keinen Unterschied in der Kolonisierung von tieferem Gewebe zwischen dem Y. enterocolitica WA-314-Wildtypstamm und dem yts1E-defizienten Stamm verzeichnet haben. Auch mit den in dieser Arbeit vorgenommen in vitro-Versuchen, die darauf abzielten natürliche Faktoren weitgehend zu simulieren, war es nicht möglich, eine Expression des Yts1-Sekretionssystems bei 37°C nachzuweisen. Ohne die Versuche auf ein Säugetiermodell auszuweiten, bleibt es ungeklärt, ob das Yts1Sekretionssystem tatsächlich im warmblütigen Wirt aktiv ist, und welche Faktoren es in diesem Falle exportiert. Ein Erklärungsansatz für die widersprüchlichen Ergebnisse der Untersuchungen von Iwobi et al. und Shutinoski et al. beruht auf der Verwendung unterschiedlicher O:8 Stämme. Während der für die Mausinfektionen verwendete Y. enterocolitica WA-314Stamm ein IS-Element (IS1330) stromaufwärts des Yts1-Genkomplexes besitzt, fehlt dieses Transposon-Element im Stamm 8081, welcher sowohl in Shutinoskis als auch in den Versuchen dieser Arbeit verwendet wurde. Laut den Ergebnissen einer reversen Transkription (Iwobi et al., 2003) zeigt der WA-314-Stamm bei niedrigeren Diskussion 143 Temperaturen (27°C) eine deutlich schwächere cDNA-Konzentration der yts1DTranskripte im Vergleich zu 37°C. Die in dieser Arbeit durchgeführten Vergleiche der Proteinsekretion zwischen dem Y. enterocolitica-Stamm 8081 und WA-314 belegen jedoch für beide Stämme eine deutliche Sekretion von ChiY und EngY bei 17°C. Bei 37°C sind die Proteine in den Überständen der beiden Stämme dagegen nicht zu erkennen. Unter der Annahme, dass die beiden Proteine auch im Stamm WA-314 durch das Yts1-System sezerniert werden, reagiert dieser Stamm in unseren Händen gegensätzlich zu den beschriebenen Ergebnissen der Arbeitsgruppe um Iwobi et al.. Zusätzlich konnte damit gezeigt werden, dass das IS-Element keinen Einfluss auf die Yts1-Aktivität bzw. die ChiYSekretion hat. Außerdem wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal belegt, dass auch der Stamm WA-314 die Proteine ChiY und EngY exprimiert und sezerniert. 6.2 Rolle der Yts1-Sekretion bei der Verbreitung von Y. enterocolitica als Umweltkeim Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte die Bedeutung der Yts1-Sekretion für Y. enterocolitica in freier Umwelt evaluiert werden. Tatsächlich gelten eine ganze Reihe der opportunistischen und humanpathogenen Bakterien als Umweltkeime, die einerseits eine längere Zeit außerhalb des Säugetierwirtes überleben können aber andererseits auch über die nötigen Voraussetzungen für eine Infektion des Menschen verfügen. Pseudomonas aeruginosa zum Beispiel ist ubiquitär in der Umwelt zu finden und ist auch hinsichtlich der Wirtsorganismen äußerst variabel. So infiziert oder kolonisiert P. aeruginosa neben dem Menschen und Säugetieren auch Pflanzen, Nematoden und Insekten (Rahme et al., 1997; Mahajan-Miklos et al., 1999; Goldberg, 2000; Lyczak et al., 2000, 2002; Pukatzki et al., 2002; Irazoqui et al., 2010). Auch von EHEC O157:7, dem Erreger der enterohämorrhagischen Colitis, ist bekannt, dass er außer in den Säugetieren zumindest transient auch in Amphibien, Fischen, Insekten, Mollusken und auf Pflanzen überleben kann (Kobayashi et al., 1999; Xu et al., 2003; Sproston et al., 2006; Tuyet et al., 2006; Gray et al., 2007; Talley et al., 2009; Xicohtencatl-Cortes et al., 2009). Zum größten Teil nutzen die Bakterien spezifische Virulenzfaktoren, die für den jeweiligen Wirtsorganismus maßgeschneidert sind. Es sind jedoch auch Virulenzfaktoren bekannt, deren Funktionalität nicht nur auf einen Wirt beschränkt ist. Bei Diskussion 144 Pseudomonas aeruginosa wurden mit dem Exotoxin A (ToxA), der Phospholipase S (PclS) und dem Transkriptionsregulator GacA Proteine identifiziert, die sowohl in der Pflanze Arabidopsis thaliana als auch im Mausmodell die Pathogenität des Bakteriums fördern (Rahme et al., 1995, 1997). Ein weiteres Beispiel stellt die Metalloprotease Serralysin von Serratia marescens dar. Als adhäsionsinhibierender Faktor verringert Serralysin die Anheftung von Immunzellen an die Bakterien und schwächt damit sowohl in der Seidenraupe als auch im Mausmodell die Immunantwort (Ishii et al., 2014). Auf der Ebene der Sekretionssysteme sind bisher fast nur Sekretionsmaschinerien beschrieben worden, die auf eine spezifische Funktion beziehungsweise einen bestimmten Wirtsorganismus ausgerichtet sind. Obwohl vermutet wird, dass ein Teil der Sekretionssysteme multiple Einsatzmöglichkeiten für ein Bakterium aufweisen kann, sind solche Eigenschaften erst für wenige Sekretionssysteme beschrieben und belegt worden. Eine dieser Ausnahmen ist das T2SS von Burkholderia cenocepacia AU1054, das bei einer Mutation der T2S-Komponente gspJ eine verminderte Pathogenität gegenüber Zwiebeln und den Nematoden C. elegans aufweist. Außerdem zeigte das T2SS im Sputum von Patienten mit einer zystischen Fibrose eine erhöhte Transkriptionsrate, weswegen über eine Funktion dieses T2SS bei der Infektion humaner Wirte spekuliert wird (Somvanshi et al., 2010). Y. enterocolitica wurde aus unterschiedlichen aquatischen und terrestrischen Proben isoliert und gilt wie P. aeruginosa, S. marescens oder B. cenocepacia dementsprechend als ubiquitär verbreiteter Umweltkeim. Eine aktive Interaktion mit nichtsäugetierartigen Wirtsorganismen in der freien Umwelt scheint vor diesem Hintergrund als sehr wahrscheinlich. Aufgrund der vorangegangenen Studien von Iwobi et al. (2003) und Shutinoski et al. (2010) deutet sich an, dass das T2SS Yts1 von Y. enterocolitica sowohl für das Überleben in der Umwelt als auch für eine Infektion im Säugetier wichtig sein und damit eine duale Anwendungsmöglichkeit für das Bakterium aufweisen könnte. Um mögliche Interaktionsnischen mit der Umwelt bestimmen zu können, wurden in dieser Arbeit zunächst in silico-Analysen durchgeführt, die einen Überblick über die Verbreitung dieses T2S-Systems und seiner sezernierten Proteine in anderen Bakterien-Spezies geben sollten. Aufgrund der erhaltenen Informationen wurden weitere Experimente durchgeführt und mehrere Invertebratenmodelle etabliert. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen, sowie die Daten der in silico-Analysen sollten hier genutzt werden, um die mögliche Bedeutung Diskussion 145 des T2SS Yts1 für die Interaktion des Bakteriums Y. enterocolitica mit verschiedenen Nischenbedingungen aufzuzeigen. 6.2.1 Mögliche Bedeutung von Pflanzen als Nische für Y. enterocolitica und als Zielorganismen der Yts1-Sekretion Die Interaktion von potenziell humanpathogenen Umweltkeimen mit Pflanzen ist bereits in zahlreichen Publikationen beschrieben worden (Plotnikova et al., 2000; Prithiviraj et al., 2005; Milillo et al., 2008; Haapalainen et al., 2009; Holden et al., 2009; Barak et al., 2011). Viele dieser Erreger stammen wie die Yersinien aus der Familie der Enterobacteriaceae, welcher auch eine Reihe von Bakteriengattungen angehören, die Pflanzen als primären Wirt besiedeln und als Epiphyten, Endophyten oder Pathogene mit der Flora interagieren. Zu diesen pflanzenassoziierten Bakterien gehören zum Beispiel die Gattungen Erwinia, Pectobacterium, Dickeya, Pantoea, Enterobacter und Brenneria (Hauben et al., 1998; Samson et al., 2005). Die in dieser Arbeit vorgenommenen BLAST-Analysen identifizierten in verschiedenen Erwinia-Spezies und in S. proteamaculans ein T2SS, welches große Übereinstimmungen mit Yts1 aufweist. Aufgrund der relativ nahen Verwandschaft zwischen Erwinia, Serratia und Yersinia kann vermutet werden, dass die gesamte Operonstruktur von einem gemeinsamen Vorläufer übernommen worden ist. Ebenso könnte die Etablierung dieses Genkomplexes über den horizontalen Gentransfer abgelaufen sein, zumal Yts1 in der sogenannten Plastizitätszone des Yersinia Genoms liegt, die für die Aufnahme fremder DNA durch Transposon-Elemente bekannt ist (Thomson et al., 2006). In jedem Fall ist es auffällig, dass die hier festgestellte Zusammenstellung polysaccharidbindenden Protein des vor Typ-II-Sekretionssystems allem in mit pflanzenassoziierten einem Bakterien vorkommt. Dieser Umstand könnte darauf hindeuten, dass das T2SS bei der Interaktion mit Pflanzen eine Rolle spielt. So gehört die Gattung der Erwinia ebenso wie die Yersiniae zu den Enterobakterien und viele der zugeordneten Bakterien sind als Pflanzenschädlinge bekannt (Hauben et al., 1998). So befällt zum Beispiel Erwinia amylovora vor allem Kernobstgewächse und verursacht eine Erkrankung, die als Feuerbrand bezeichnet wird (Martinec & Kocur, 1964; Zhao et al., 2005; Vrancken et al., 2013). Auch aus tierischen sowie humanen Präparaten wurden Erwinia-Spezies Diskussion 146 isoliert, allerdings wurden sie hier selten als Krankheitserreger charakterisiert (MEYERS et al., 1972; Starr & Chatterjee, 1972; Hueck, 1998). Die Typ-II-Sekretionssysteme von Bakterien mit primär pflanzlichen Wirten sezernieren laut bisheriger Kenntnisse vor allem Pflanzenzellwand-degradierende Enzyme (Pektinasen, Cellulasen), (Metallo-) Proteasen und Polysaccharide (Furutani et al., 2004; Cianciotto, 2005). Die Sekretionssysteme und ihre Substrate wirken in diesen Fällen häufig als Virulenzfaktoren, die die Infektion oder Besiedelung der Pflanzen unterstützen. So zeigen beispielsweise die Untersuchungen von Zhao et al. (2005), dass während der Infektion von unreifen Birnen mit E. amylovora die Transkription von Genen eines Yts1-ähnlichen Sekretionssystems induziert wird. Gleichzeitig erhöht sich auch die Expression einer T2S-sezernierten Pektinase (Peh), die möglicherweise durch Pektinabbau den Infektionsprozess begünstigt. Interessanterweise sagen die in dieser Arbeit durchgeführten CDD-Analysen für das von Yts1 sezernierte Protein YE3650 eine konservierte Pektinase-Domäne vorher. Aufgrund der Unvollständigkeit dieser Domäne scheint es jedoch wahrscheinlich, dass das Protein keine katalytische Aktivität mehr besitzt. Pektindegradationsassays, die in dieser Arbeit durchgeführt wurden, zeigten jedenfalls keinen Abbau dieses pflanzlichen Polysaccharids durch den Überstand induzierter Y. enterocoliticaKulturen (Daten nicht gezeigt). Die BLAST-Analysen zu YE3650-Homologen lieferten nur wenige aussagekräftige Treffer. Die größte Übereinstimmung besitzt YE3650 mit Proteinen aus Providencia rettgeri, Enterococcus faecalis und Pantoea stewartii. Während P. rettgeri und E. faecalis Umweltkeime sind, die zum Teil als opportunistische Erreger zu Infektionen des menschlichen Darms und des Urinaltrakts führen können, ist P. stewartii (auch als Xanthomonas oder Erwinia stewartii bezeichnet) als Verursacher der Maiswelke bekannt und wird nicht mit humanen Krankheiten assoziiert. Auch wenn es bisher nur wenige Studien gibt, die sich mit diesem Thema beschäftigt haben, gibt es jedoch Hinweise darauf, dass P. rettgeri und E. faecalis ebenfalls gegenüber Pflanzen virulent sein können (Spiteller et al., 2000; Jha et al., 2005). Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch die Transkriptionsrate von Genen des yts1Operons bei verschiedenen Mg2+-Konzentrationen untersucht. Das Maximum dieser Aktivität lag zwischen 20 mM und 80 mM Mg2+-Konzentrationen im Kulturmedium. Die Mg2+- Konzentrationen im Inneren vieler Pflanzen liegen sogar noch etwas höher. Sie beinhalten durchschnittlich etwa 80 mM/kg Mg2+ pro Kilogramm Trockengewicht und Diskussion 147 erreichen diese Konzentrationen, indem sie die aus dem Boden aufgenommenen Magnesium-Ionen (34-490 µM pro kg) anreichern (Epstein, E., 1965; Epstein & Bloom, 2005). Während die Transkriptionsanalyse darauf hindeutet, dass die mRNAProduktion von pclR, yts1C und chiY bei der Besiedelung von Pflanzenteilen erhöht sein könnte, erscheint nach den bisherigen Erkenntnissen eine Bedeutung des Yts1Systems in Böden mit normaler Magnesiumkonzentration unwahrscheinlich. Auf Basis der beschriebenen Ergebnisse und der verfügbaren Literatur wurde also in Betracht gezogen, dass das Yts1-T2SS seinen Ursprung und seine festgestellte Aktivität in pflanzenassoziierter Umgebung hat. Daher wurden im Rahmen dieses Projekts in einer Kooperation mit Dr. Michael Schmid vom Helmholtz-Zentrum München, Versuche mit Spinatpflanzen angestoßen, die auf monoaxenischem Boden mit verschiedenen Yersinia-Stämmen inkubiert und auf eine Kolonisierung mit den Bakterien untersucht werden sollten. Ein Ergebnis zu diesen Experimenten liegt zu diesem Zeitpunkt noch nicht vor. Bei den durchgeführten Stichinfektionen von Kartoffeln, Birnen und Äpfeln wurden keine Hinweise für eine Infektion, Invasion oder einen Abbau der Pflanzenzellen entdeckt. Weiterhin wurde auch keine erhöhte Promotoraktivität von yts1C und assoziierten Genen (chiY, pclR) während der Inkubation der Bakterien mit den Extrakten von Birnen, Äpfeln und Nektarinen festgestellt (siehe Anhang, Abbildung 8-1). Die Überlegung, dass die Kulturbedingungen, die eine Yts1-Sekretion in Y. enterocolitica induzieren, möglicherweise auch die Sekretion homologer Proteine in den pflanzenassoziierten Erwinia-Stämmen oder in anderen Yersinien hervorrufen, hat sich nicht bestätigt. Die beobachtete Sekretion von ChiY, EngY oder YE3650 bei 17°C und hohen MgCl2-Konzentrationen wurde bisher nur bei den hochpathogenen Y. enterocolitica-Stämmen 8081 und WA-314 festgestellt. Zusammengefasst konnten in dieser Arbeit zwar Hinweise für eine mögliche Verwandtschaft zu pflanzenassoziierten Bakterien gefunden werden und somit über mögliche Funktion des T2S-Systems Yts1 in dieser Nische diskutiert werden, allerdings konnte bisher kein direkter Beleg für die Funktion des T2SS bei der Infektion, der Kolonisierung oder dem Abbau von Pflanzen erhalten werden. Möglicherweise liegt die Ursache hier in der nur partiell vorliegenden PektinaseDomäne von YE3650. Denkbar wäre auch eine nicht-katalytische Funktion von YE3650, die durch die bisherigen Versuche noch nicht identifiziert werden konnte. Diskussion 148 Beispielsweise könnte YE3650 auch als adhäsionsvermittelndes Molekül die Bindung an polysaccharidhaltige Oberflächen vermitteln. Interessanterweise liegt das Gen von YE3650 nur etwa 5 kbp stromabwärts des Tad-Lokus (tight adherence), der eine neuartige Form von TypIVb-Pili kodiert (Tomich et al., 2007), welche in anderen Bakterienspezies unspezifische Bindungen an feste Oberflächen vermitteln und Mikrokolonie- und Biofilmbildung fördern können (Planet et al., 2003; Schreiner et al., 2003). Ob eine transkriptionelle Korrelation des Tad-Lokus und YE3650 vorliegt, ist allerdings noch nicht bekannt. 6.2.2 Invertebraten als denkbarer evolutionärer Zwischenschritt zur Humanpathogenität Obwohl Umweltkeime ständig mit der Pflanzenwelt in Kontakt kommen und zum Teil mit dieser wechselwirken, gelten für die Gruppe der opportunistischen und humanpathogenen Erreger eher verschiedene Invertebraten als wichtiger Interaktionspartner auf dem Weg zur Virulenz (Waterfield et al., 2004). Phytophage Insekten könnten dabei eine Brücke zwischen der immobilen, pflanzlichen Umgebung und carnivoren, homiothermen Tieren wie Vögeln und Nagern darstellen (Nadarasah & Stavrinides, 2011). Außerdem bedeutet die pure Anzahl der Invertebraten und deren Mobilität eine erhöhte Verbreitungsmöglichkeit für die Bakterien. Auch Pflanzenschädlinge, wie beispielsweise Pantoea stewartii nutzen Insekten als alternativen Wirt. So kann das die Maiswelke verursachende Bakterium im Maisfloh überwintern und während der Sommermonate durch den Maiswurzelbohrer auf die Maisplanzen übertragen werden (Cook et al., 2005; Correa et al., 2012; Flavia Dematheis, 2012). Im Zusammenhang mit Invertebraten-Infektionen wurde schon mehrmals gezeigt, dass die Expression von Typ-II-Sekretionssystemen heraufreguliert wird. Eine Studie zur Transkriptomanalyse des Pflanzenpathogens Dickeya dadantii zeigte beispielsweise, dass die Transkription eines der beiden T2SS (Stt) bei der Infektion von Erbsenläusen (Acyrthosipho pisum) induziert wird. Bislang wurde allerdings noch nicht herausgefunden, welche Proteine in den Insekten durch die T2SS abgesondert werden. Dass Y. enterocolitica tatsächlich Insekten als möglichen Zwischenwirt nutzen könnte, zeigt die Studie von Walker et al. (2013), die für das T3SS Ysa eine Bedeutung bei der Invasion von Schneider-Zellen der Fruchtfliege Droso- phila melanogaster ausmachen konnten. Das Ysa-Sekretionssystem war bisher dafür bekannt, dass es bei frühen Stadien der Mausinfektion eine Rolle spielt (Venecia & Diskussion 149 Young, 2005; Young, 2007). In der Untersuchung von Walker et al. zeigte sich nun, dass eine Ysa-Mutante des Bakteriums nicht in der Lage ist, sich mit gleicher Effektivität innerhalb der Schneider-Zellen zu replizieren wie der Wildtyp (Bent et al., 2013; Walker et al., 2013). Erwähnenswert ist dabei die Tatsache, dass Ysa in vitro nur aktiv ist, wenn die Bakterien bei niedrigeren Temperaturen (26°C) kultiviert werden, was im Einklang mit den niedrigen Zellkultur-Temperaturen der Insektenzellen steht. Interessant ist auch die genomische Lokalisation dieses T3SS. Es befindet sich wie Yts1 ebenfalls in der Plastizitätszone und nur wenige kbp stromaufwärts des Yts1Operons. Auch wenn die Nähe der Genomplexe keinen zwingenden Hinweis auf eine ähnliche Anwendungsrichtung der beiden Sekretionssysteme bedeutet, könnte eine Untersuchung zur Korrelation der Genloci lohnenswert sein. Berücksichtigt man die in dieser Arbeit gemessenen hohen Mg2+-Konzentrationen bei denen die Yts1-Transkription und Sekretion aktiviert wird und vergleicht diese mit Werten aus Literaturangaben, in denen ähnlich hohe Magnesium-Werte in der Natur dokumentiert sind, erscheinen nicht nur Pflanzen, sondern auch Insekten als mögliche Wirtsorganismen in denen Yts1 aktiv sein könnte. Besonders für die phytophagen Insekten wurde vermutlich aufgrund der Mg2+-reichen, pflanzlichen Nahrung eine hohe Konzentration dieser Ionen in ihrem Körperinneren gemessen. So belegen Studien für phytophage Insekten eine hämolymphische Mg2+-Konzentration zwischen 12,5 mmol/l (Orthoptera) bis zu 73,5 mmol/l (Coleoptera) (Chapman, 1998). Da Insekten für die Synthese und Exposition von Chitin in ihrem Exoskelett, in der peritrophischen Membran des Mitteldarms und in Hämozyten bekannt sind (Richards & Richards, 1977; Merzendorfer & Zimoch, 2003; Heath-Heckman & McFall-Ngai, 2011), würden die chitinbindenden Sekretionsprodukte ChiY und EngY für eine mögliche Anwendung des T2SS Yts1 bei dem Zusammenspiel mit dieser artenreichsten Klasse an Tieren sprechen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Recherchen zur Domänenstruktur von EngY weisen außer den chitinbindenden Domänen für das Protein eine M60-Domäne aus, die mit der Familie der Enhancine verwandt ist. Diese Metalloproteasen sind ursprünglich von Baculoviren bekannt, die mit Hilfe dieser Enzyme die Integrität der Mitteldarm-Epithelschicht von Lepidoptera-Arten angreifen und somit eine verstärkte Infektionsfähigkeit erlangen (Tanada et al., 1973, 1975, 1980; Hara et al., 1976; Derksen & Granados, 1988; Gallo et al., 1991; Slavicek, 2012). Die Sekretion eines Diskussion 150 solchen Enzyms könnte auch für Y. enterocolitica eine Virulenzsteigerung nach oraler Aufnahme durch Insekten bewirken. Die BLAST- und CDART-Analysen ergaben jedenfalls auch das Auftreten ähnlicher Peptidasen in Clostridium botulinum, sowie verschiedenen Bacillus-Vertretern wie B. cereus und B. thuringiensis. Die Lebensweise von C. botulinum wird weitgehend als saprophytisch umschrieben, und es findet sich vorwiegend in Böden und aquatischen Sedimenten. Allerdings wurde im Genom des Bakteriums auch ein ganzes System von chitinabbauenden Enzymen gefunden (Sebaihia et al., 2007). Tatsächlich deuteten Untersuchungen einer Botulismuserkrankung von Seevögeln darauf hin, dass Invertebraten-Vektoren wie marines Zooplankton möglicherweise zu einer Übertragung des Bakteriums führten (Hubálek & Halouzka, 1991; Sebaihia et al., 2007). Während von C. botulinum ansonsten wenig über die Interaktion mit Invertebraten bekannt ist, gelten viele der Bacillus-Spezies, unter anderem auch der Milzbrand-Erreger B. anthracis, als Insektensymbionten oder Pathogene (Krinsky, 1976; Turell & Knudson, 1987; Van Rie et al., 1990; Lambert et al., 1996; Feinberg et al., 1999; Damgaard, 2000; Wenzel et al., 2002). Dass Metalloproteasen bei der Infektion von Invertebraten in Bacillus eine bedeutende Rolle spielen können, zeigte eine Studie von Guillemet et al. (2010). Eine Deletion der drei im Genom kodierten Metalloproteasen InhA1, InhA2 und InhA3 führte bei der Injektion der Bakterien in das Hämocoel von Galleria mellonella zu einer deutlich verringerten Sterblichkeitsrate der Tiere (Guillemet et al., 2010). Eine mögliche Funktion von EngY bei der Infektion von Invertebraten scheint somit aufgrund der beschriebenen Eigenschaften und Homologien als wahrscheinlich. In dieses Konzept würde auch die Charakterisierung von ChiY als chitinbindendes Molekül passen. Die CDART-Analyse für ChiY belegt, dass ähnliche Proteine auch in der Familie der Bacillaceae vorkommen. Außerdem ist das Biopolymer Chitin eines der Hauptbestandteile des Exoskelettes der Insekten. Da ChiY keine katalytische Domäne besitzt, könnte es vor allem bei der Adhärenzvermittlung an chitinhaltige Oberflächen vermitteln. Studien zur Kombination von chitinbindenden Proteinen (CBPs) und Chitinasen zeigen aber auch, dass die CBPs beim Abbau von Chitin eine bedeutende Rolle spielen können, indem sie die Chitinstruktur auflockern und für den Abbau durch die Chitinasen vorbereiten. In der Untersuchung von Manjeet et al. (2013) funktionierte diese Art der Kooperation auch über Artgrenzen hinweg, so dass beispielsweise CBPs von S. proteamaculans und Diskussion 151 Chitinasen aus B. thuringiensis durch einen synergistischen Effekt die Chitinkatalyse verstärkten (Manjeet et al., 2013). Auch wenn also bisher keine Chitinase im Genom von Y. enterocolitica identifiziert wurde, könnte Y. enterocolitica durch die Sekretion von ChiY den Chitinabbau in seinem Umfeld im Zusammenspiel mit Chitinasesezernierenden Bakterienarten unterstützen und von der zusätzlichen Nährstoffquelle profitieren. Erwähnenswert ist die Tatsache, dass EngY und ChiY bei der CDART-Analyse mit baculoviralen Proteinen assoziiert werden konnten. Die N-terminale chitinbindende Domäne von ChiY kommt als isolierte Domäne in Form von Spheroidinen genauso in Baculoviren vor wie die Enhancin-Domäne (M60-Domäne) von EngY. Im Gegensatz zu der beschriebenen virulenzverstärkenden Funktion der Enhancine, sind Spheroidine in Baculoviren nicht direkt am Infektionsprozess beteiligt, sondern bilden eine feste, schützende Proteinmatrix um die Virionen (Ackermann & Smirnoff, 1983). Diese sogenannten Einschlusskörperchen lösen sich erst im basischen Milieu des Insektendarms auf und geben die Virionen frei. Von Enhancinen ist bekannt, dass sie über horizontalen Gentransfer in das Genom insektenpathogener Bakterien, wie B. thuringiensis oder auch das Pestbakterium Y. pestis, aufgenommen wurden (Ivanova et al., 2003; Read et al., 2003; Galloway et al., 2005). Möglicherweise wurden auf diesem Wege auch Gene von Spheroidinen übertragen, die in den Bakterien bei der Infektion der Insekten zum Tragen kommen. So gesehen könnte ChiY sich evolutionär aus den Spheroidinen der Baculoviren entwickelt haben. Eine Bedeutung von ChiY für die Infektion von Insekten erscheint bei Berücksichtigung dieser Argumentationskette als wahrscheinlich. Auf Grundlage dieser Analysen wurde mit Galleria mellonella ein Tier-Modell etabliert, das Aufschluss über die Bedeutung von Yts1 bei der Infektion und Kolonisierung dieser Tiere geben sollte. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass Y. enterocolitica 8081 gegenüber den Wachsmotten eine stark insektizide Wirkung entfaltet. Selbst eine Infektionsdosis von lediglich 50 Bakterien pro Tier führte innerhalb von 5 Tagen zu einer Sterberate von über 50 Prozent. Die Erreger proliferieren in den Larven bis zu einer Gesamtzahl von über 5 Millionen pro Wirtstier, wobei jedoch überraschend weder Sterberate noch Kolonisierung mit dem Yts1-Sekretionssystem assoziiert werden konnten. Diskussion 152 Die Messungen zu den Transkriptionsraten der wichtigsten Yts1-assoziierten Gene pclR, yts1C und chiY zeigten in den Larven eine mittlere Erhöhung der pclRPromotoraktivität auf etwa 340 Miller Units. Da vermutlich die mit pclR im Operon transkribierten Yts1-Gene damit ebenfalls exprimiert wurden, scheint zumindest das Yts1-Sekretionssystem der Bakterien in den Larven auch auf Proteinebene vorhanden zu sein. Im Gegensatz dazu wird chiY in G. mellonella kaum transkribiert. Möglicherweise ist die Magnesiumkonzentration in den Larven zu gering, um die Transkription zu induzieren. Die verwendeten Wachsmotten-Larven nehmen keine Nahrung mehr zu sich, so dass auch eine Magnesiumaufnahme, zum Beispiel über pflanzliches Futter, nicht mehr stattfindet. Auch wenn also das T2SS Yts1 in den Larven aktiv sein sollte, wird vermutlich in den Larven kaum ChiY sezerniert. Eine direkte Auswirkung des Yts1-Sekretionssystems auf den Infektionsprozess oder auf die Letalität der infizierten Wachsmottenlarven scheint aufgrund der oben genannten Ergebnisse unwahrscheinlich. Die hohe Letalität der Larven beruht somit entweder schlicht auf der hohen Anzahl der Bakterien oder wird durch ein bisher nicht identifiziertes toxisches Ausscheidungsprodukt der Prokaryoten verstärkt. Generell ist davon auszugehen, dass der Organismus der Wachsmottenlarven allein durch die Menge an Bakterien schon weitgehend geschädigt wird. Eine erliegende Mikro- und Makrozirkulation sollte die Versorgung von Zellen und Organen des Tieres beeinträchtigen, und mögliche Stoffwechselabfälle der Bakterien könnten die Wirtszellen zusätzlich belasten. Ob Toxine hierbei eine weitere Rolle spielen, kann aufgrund der vorliegenden Daten nicht beurteilt werden. Die Toxin-Komplex(Tc)-Proteine TcaABC, TcdAB und TccAB, welche in anderen Yersinia-Stämmen einen verstärkenden Einfluss auf die Letalität von infizierten Lepidoptera-Larven (M. sexta, G. mellonella) aufwiesen, sind jedenfalls im Genom der O:8-Serotypen von Y. enterocolitica nicht vorhanden (Fuchs et al., 2008; Heermann & Fuchs, 2008; Spanier et al., 2010). Neben der Tatsache, dass keine Bedeutung für das Yts1-Sekretionssystem bei der Infektion der Wachsmotten ersichtlich war, überraschte auch das Ergebnis der Bakterienzahl in den Larven am dritten Tag nach der Infektion (siehe Abbildung 5-12). Denn die Zahl der isolierten Bakterien war hier trotz der unterschiedlichen Infektionsdosen (500 iCFU, 50 iCFU, 5 iCFU) in allen Populationen nahezu gleich, was aufgrund der signifikant gesteigerten Überlebensraten bei abnehmender Infektionsdosis (siehe Abbildung 5-10) nicht zu erwarten war. Diskussion 153 Eine mögliche Erklärung für dieses paradoxe Ergebnis liefert die Einsicht aktueller Literatur zu dem priming von Immunsystemen in Invertebraten. So beschreiben Mukherjee et al. (2010) eine deutlich verminderte Sterberate von G. mellonella Larven nach einer Infektion mit Listeria, wenn die Tiere 24 Stunden zuvor durch die Injektion von LPS oder hitzeinaktivierter Bakterien immunisiert worden waren. Eine weitere Studie belegt den gleichen Effekt bei der Infektion von Wachsmotten-Larven mit P. luminescens (Wu et al., 2014). In beiden Arbeiten führte das priming der Tiere zu einer erhöhten Konzentration von Hämozyten und von verschiedenen antimikrobiellen Peptiden in der Hämolymphe der Larven (Mukherjee et al., 2010; Wu et al., 2014). Dementsprechend lässt sich vermuten, dass in unseren Experimenten eine niedrigere Infektionsdosis den Wachsmotten-Larven mehr Zeit lassen könnte, ihre Immunabwehr anzuregen und auf die bakterielle Bedrohung zu reagieren. Ginge man davon aus, dass sich am dritten Tag nach der Infektion die Bakterienkulturen mit der Infektionsdosis von 5 iCFU am Ende der exponentiellen Wachstumsphase oder zu Beginn der stationären Phase befinden würden (siehe Abbildung 5-12), ergäbe sich eine Verdopplungszeit von ca. 3,6 Stunden. In diesem Fall würde dem Immunsystem der Galleria beim Vergleich von einer Infektionsdosis zur Nächsthöheren etwa 11,7 Stunden mehr Zeit zustehen, um die Immunabwehr zu organisieren. Trotz dieses Zeitvorteils steigt die Zahl der Yersinien jedoch auch in den Larven mit niedriger Infektionsdosis stark an. Vermutlich befindet sich aber ein Großteil der Bakterien im Darmlumen der Tiere, wo eine ungehinderte Proliferation stattfinden kann. Möglicherweise kann ein aktiviertes Immunsystem jedoch die Invasion der Yersinien durch das Darmepithel in das Hämocoel und die Vermehrung der Bakterien in diesem Gewebe effektiver abwehren, so dass Hämolymphe und Organe nicht geschädigt werden. Im Gegensatz dazu bliebe nach dieser Vermutung den Invertebraten bei höheren Infektionsdosen keine Zeit, das Immunsystem schnell genug hochzufahren, um der großen Zahl der Bakterien und der dadurch gestiegenen Wahrscheinlichkeit von Invasionsvorgängen entgegenzuwirken. Beim Vergleich der Überlebensrate der Wachsmotten-Gruppen, die entweder mit dem Yersinien-Wildtypstamm oder der Yts1E-Mutante infiziert wurden (siehe Abbildung 5-11), stellte sich die hohe Virulenz der Bakterien als problematisch dar. So zeigten die Versuche, dass eine Infektionsdosis von lediglich 50 iCFU optimal wäre, um positive oder negative Auswirkungen unterschiedlicher Bakterienstämme auf die Überlebensrate der Tiere zu verzeichnen. Da es methodisch kaum möglich ist, eine so Diskussion 154 geringe Anzahl an Bakterien in die Larven zu applizieren und statistisch eine nur geringe Abweichung der gewünschten Infektionsdosis zu garantieren, muss das Infektionsmodell Galleria mellonella als zu sensitiv für die verwendeten YersiniaStämme und die angewandte Methode der hämocoelen Injektion eingeordnet werden. Im Übrigen wird durch diese Infektionsmethode das Darmepithel der Tiere verletzt, womit dessen Barrierefunktion an der punktierten Stelle herabgesetzt wird. Außerdem könnten schon bei der Durchquerung der Injektionsnadel durch das Hämocoel der Larven eine nicht vorhersehbare Zahl von Bakterien in die Hämolymphe der Tiere gelangen. Bemühungen über eine perorale nicht-invasive Methode eine definierte Zahl von Yersinien in den Darm der Larven einzubringen, scheiterten aufgrund der lediglich sporadischen Nahrungsaufnahme von G. mellonella in dem vorliegenden Larvenstadium. Die seltene Nahrungsaufnahme ist auch insofern ein kritischer Punkt bei der Verwendung der G. mellonella-Larven, als dass dadurch die Magnesiumkonzentration im Darm vemutlich nicht in einem Bereich liegt, in dem die chiYTranskription induziert wird. Hingegen dürfte bei phytophagen Insekten, die magnesiumreiche pflanzliche Nährstoffe fressen, die Magnesiumkonzentration höher sein. Daher sollten für zukünftige Studien derartige Invertebraten-Modelle in Betracht gezogen werden. In weiteren Versuchen dieser Arbeit wurden die Auswirkungen cuticulär applizierter Yersinien auf die Versuchstiere untersucht. Allerdings konnte keine Veränderung der Vitalität der Tiere oder der Beschaffenheit ihrer Cuticula beobachtet werden. Aus Letzterem lässt sich zumindest ableiten, dass die Yersinien unter den getesteten Bedingungen keine Cuticula-degradierenden Enzyme sezernieren und nicht in der Lage sind, das Exoskelett der Tiere auf diese Weise zu durchdringen oder zu kolonisieren. In natürlicher Umgebung ist es wahrscheinlich, dass die Bakterien über eine orale Aufnahme in den Verdauungstrakt von Invertebraten gelangen. Daher wurde für weitere Versuche in dieser Arbeit ein Invertebraten-Modell gewählt, mit dem Infektionen auch über die Fütterung vollzogen werden konnten. Die Fluoreszenzaufnahmen der mit Yersinien gefütterten C. elegans zeigen, dass die Nematoden die Bakterien in ihren Verdauungstrakt aufnehmen. Des Weiteren dringen die Prokaryoten auch in umliegendes Gewebe ein und bilden dort Mikrokolonien. Die Proliferation der Yersinien ist in den Nematoden aber bei weitem nicht so stark ausgeprägt wie in den Wachsmottenlarven. Während die Bakterienzahlen kurz nach der Infektion bei über Diskussion 155 4000 Bakterien pro Wurm liegen, verringert sich die Zahl im Verlaufe der Infektion und stabilisiert sich auf etwa 2000 Bakterien pro Tier. Da Bakterien die Hauptnahrungsquelle der Nematoden darstellen, ist es wahrscheinlich, dass auch ein großer Teil der Yersinien durch die Tiere verdaut wird. Offensichtlich halten sich hierbei Verdau und Proliferation der Bakterien in etwa die Waage. Dennoch sterben die infizierten Tiere im Durchschnitt 3-4 Tage früher als die mit E. coli OP50 gefütterten Nematoden. Die größte Abweichung zwischen den Gruppen Yersinien-infizierter C. elegans und der Kontrollgruppe ist von Tag 8 bis Tag 13 nach der Infektion zu beobachten. In dieser Zeit nimmt die Population der infizierten Tiere signifikant stärker ab. Da in den Fluoreszenzaufnahmen zu erkennen ist, dass die Yersinien in das Hämocoel der Nematoden eingewandert sind, ist zu vermuten, dass eine fortlaufende Entwicklung dieses Prozesses letztendlich zu der höheren Sterberate in diesem Zeitraum führen könnte. Der moderate Verlauf im Vergleich zu der Infektion der Wachsmottenlarven deutet darauf hin, dass die Yersinien im Hämocoel von C. elegans entweder eine weniger günstige Nährstoffversorgung vorfinden oder aber durch das angeborene Immunsystem der Nematoden effektiver abgewehrt werden. Zusammengenommen zeigen diese Versuche im Nematoden-Modell, dass die Yersinien in der Lage sind, nicht nur im Verdauungstrakt von C. elegans zu überleben, sondern auch invasiv in das Hämocoel der Tiere zu gelangen. Außerdem könnte die relativ niedrige Sterberate der infizierten Nematoden für die Yersinien von Vorteil sein, um C. elegans als Vektor nutzen zu können. Von Photorhabdus luminescens wurde gezeigt, dass die Bakterien über einen längeren Zeitraum in den Nematoden Heterorhabditis bacteriophora persistieren können. Wenn die Nematoden dann einen Insektenwirt parasitieren, würgen sie die Bakterien direkt in das Hämocoel der Insekten, wo sich P. luminescens stark vermehrt und über Toxine und Virulenzfaktoren den Tod des Insekts herbeiführt. Der Insektenkadaver dient dann als Nahrungsquelle für die Nematoden und die Bakterien (Ciche & Ensign, 2003; Singh et al., 2012). Unabhängig von diesen Erkenntnissen konnte im Hinblick auf die Wirkung des T2SS bei diesen Versuchen keine signifikante Auswirkung von Yts1 auf die Überlebensrate oder die Kolonisierung der Nematoden durch Y. enterocolitica beobachtet werden. Sowohl von den Enhancinen als auch von den Baculoviren selbst ist allerdings Diskussion 156 bekannt, dass sie auf relativ eng gefasste Wirtsspektren ausgelegt sind (Doyle et al., 1990; Ishikawa et al., 2004; Toprak et al., 2012). Falls die durch Yts1 sezernierten Proteine, allen voran EngY, also eine degradierende Wirkung auf die peritrophe Membran des Mitteldarmepithels von Invertebraten haben sollte, könnte es sein, dass aufgrund einer möglichen Spezifität, die in dieser Arbeit verwendeten Tiermodelle nicht die nötigen Zielsysteme aufweisen, bei denen die durch Yts1 sezernierten Proteine in der freien Umwelt zum Einsatz kommen. 6.2.3 Adhärenz an Zooplankton als mögliche Funktion des Yts1- Sekretionssystems in aquatischer Umgebung Neben den in dieser Arbeit verwendeten terrestrischen Invertebraten-Modellen wurde auch die Möglichkeit der Wirkung von Yts1 in aquatischen Habitaten in Betracht gezogen. Y. enterocolitica ist bereits in einer Fülle von Gewässern nachgewiesen worden. Neben Isolationen aus Frischwasserflüssen und –seen sind auch Funde in Brackwasser- und Meerwassersystemen bekannt (Peixotto et al., 1979; Karapinar & Gönül, 1991; Davies et al., 2001; Falcão et al., 2004). Die in dieser Arbeit vorgenommenen in silico-Analysen und der Nachweis der Mg2+-Sensitivität des Yts1Systems schließen eine Bedeutung für die Yts1-Sekretion in aquatischer Umgebung nicht aus. So zeigen die BLAST-Analysen, dass ChiY-homologe Proteine auch in großem Maße in den Gattungen Vibrio und Aeromonas vorkommen. Beide Bakteriengattungen sind für ihre Verbreitung im aquatischen Milieu bekannt. Viele der VibrioArten gehen symbiotische Verbindungen mit Meerestieren ein: mit V. cholerae und V. parahaemolyticus sind jedoch auch humanpathogene Vertreter dieser Gattungen bekannt. Auch einige der Aeromonas-Spezies sind als Krankenhauskeime mit humanen Erkrankungen assoziiert, können aber ebenso bei aquatischen Tieren zu Infektionskrankheiten führen. Die Furunkulose bei Forellenfischen, die Fleckenseuche bei Süßwasserfischen, die Aalrotseuche bei Flussaalen und einige Erkrankungen von Fröschen werden von Aeromonas-Bakterien ausgelöst. Eine Verbreitung von ChiY-Homologen in diesen beiden Bakteriengattungen könnte darauf hindeuten, dass dieses Protein beim Überleben im Wasser für diese Bakterien nützlich sein könnte. Die Tatsache, dass viele der Tierarten des Zooplanktons über ein chitinhaltiges Exoskelett verfügen, lässt die chitinbindenden Eigenschaften von ChiY und EngY auch in dieser Umgebung als sinnvoll erscheinen. Diskussion 157 Interessanterweise wurde mit dem Protein GbpA von V. cholerae ein ChiY-Homolog identifiziert, dass einerseits mit der intestinalen Kolonisierung im Menschen und andererseits mit dem Überleben der Bakterien in aquatischer Umgebung assoziiert wird (Zampini et al., 2005; Bhowmick et al., 2008; Pruzzo et al., 2008; Vezzulli et al., 2008; Stauder et al., 2012). Dabei gründet die duale Funktion von GbpA auf der Adhärenzvermittlung zu Kohlenhydratstrukturen, die sowohl im Exoskelett von Zooplankton als auch in der extrazellulären Matrix von humanen Epithelzellen vorkommen (Kirn et al., 2005). Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zum Ansprechverhalten des Yts1-Systems bei verschiedenen Mg2+-Konzentrationen zeigten, dass die stärkste Transkription des chiY-Gens zwischen 20 mM und 80 mM Mg2+ zu verzeichnen ist. Meerwasser liegt mit etwa 50 mM genau in diesem Fenster und eine gewisse Brackwasserzone fällt je nach Mischungsverhältnis mit dem Süßwasser ebenfalls in diesen Bereich. Aufgrund der pflanzenreichen Kost sind auch die aufgefangenen Exkremente von Nutztieren wie Schweinen, Rindern und Geflügel durch Magnesiumkonzentrationen zwischen 14 mM (Milchvieh), 34 mM (Schwein) und 40 mM (Geflügel) gekennzeichnet (Chastain et al., 1999). Über die exzessive Düngung von gewässernahen Feldern mit Jauche oder die Haltung von Nutztierherden im Zulaufbereich natürlicher Gewässer, treten erhöhte Magnesiumkonzentrationen zum Teil auch in verunreinigten Süßwasser-Vorkommen auf. Um eine mögliche Wirkung des T2SS Yts1 in aquatischer Umgebung zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit erste Versuche mit den Salinenkrebsen Artemia salina durchgeführt. In diesen Experimenten sollte die Überlebensrate der Krebstiere in Abhänigkeit der zugeführten Bakterienspezies analysiert werden. Sowohl die Artemia Kontrollpopulationen, die mit E. coli OP50 inkubiert wurden, als auch die Tiere, die mit den Yersinia-Stämmen GHY53 und GHY474 inkubiert wurden, wiesen allerdings einen nahezu identischen Kurvenverlauf der Überlebensrate auf. Da die Salinenkrebse im Normalfall mehrere Monate überleben, hier jedoch innerhalb von 10 Tagen verstarben, muss davon ausgegangen werden, dass die Versuchsbedingungen nicht ausreichend den natürlichen Bedürfnissen der Tiere angepasst waren. Aufgrund der Gentechniksicherheitsverordnung der Stufe S2 und damit verbundenen Auflagen, war es in unseren Räumlichkeiten nicht möglich, weitere Verbesserungen bei der Haltung der Artemia während der Infektionsphase einzuführen, so dass fortführende Untersuchungen an den Artemia entweder in einer externen Kooperation verwirklicht Diskussion 158 werden könnten, oder aber andere Zooplankton-Spezies für die Infektionsversuche etabliert werden sollten. Zusammgefasst geben die hier diskutierten Ergebnisse einige Hinweise darauf, dass das Yts1-Sekretionssystem möglicherweise in aquatischer Umgebung für Y. enterocolitica zum Einsatz kommt und dort die Adhärenz an chitinhaltige Wassertiere oder auch die Infektion dieser Organismen unterstützt. 6.2.4 Ausblick Für weiterführende Arbeiten können mehrere Ansatzpunkte gewählt werden, die sich z. B. auf die in vivo-Expression von Yts1, auf die Funktion der Sekretionsprodukte, auf die Regulation des Sekretionssystems oder auf dessen Virulenz gegenüber Invertebraten konzentrieren sollten. Bezüglich der in vivo-Expression deuten die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen an zuvor infizierten Kaninchen und Menschen darauf hin, dass zum Teil Sekretionsprodukte des Yts1-Systems durch das Immunsystem des jeweiligen Wirtes detektiert werden und dass sie in Folge dessen eine Antikörperreaktion induzieren können. Unklar ist in diesem Zusammenhang, ob die Sekretion von ChiY, EngY und YE3650 außerhalb des Wirtes stattgefunden hat, oder ob eine Yts1Aktivierung auch im gastrointestinalen bzw. im lymphatischen System erfolgte. Da bisherige in vitro-Versuche keine Yts1-Aktivierung bei 37°C zeigten, sprechen diese Ergebnisse entweder für eine Yts1-Aktivierung exklusiv bei niedrigen Temperaturen außerhalb des Wirtes oder für bis jetzt nicht identifizierte in vivo-Faktoren, die das Yts1-Sekretionssystem der Bakterien auch bei 37°C induzieren können. Zur Lösung dieser Fragestellung könnten unterschiedliche Methoden zur Analyse der in vivo-Expression (z. B. IVET) angewendet werden, die es ermöglichen, die Expression von Proteinen oder Markern auch in lebenden Säugetieren zu detektieren (Nham et al., 2012; Progatzky et al., 2013; Weigert et al., 2013). Speziell die Methode der Intravital-Mikroskopie (auch: in vivo imaging) erlaubt es, kontinuierlich die Expression von Reportergenen während der Yersinien-Infektion zu verfolgen. Damit könnte die Expression Yts1-assoziierter Gene im Versuchstier sowohl in zeitlicher als auch in räumlicher Auflösung analysiert werden. Durch die Intravital-Mikroskopie ließe sich einerseits die Frage klären, ob die Sekretion in vivo tatsächlich stattfindet, und Diskussion 159 andererseits könnte die Lokalisation einer Proteinsekretion auch Hinweise auf die Funktion der Sekretionsprodukte liefern. Da diese Art der Bildgebung mindestens eine Auflösung bis in den Submillimeterbereich zulässt, kann möglicherweise der gewebetechnische Angriffspunkt der Yts1-Sekretion bestimmt werden. Eine Aussage zu molekularen Bindungspartnern von ChiY, EngY und YE3650 lässt sich mit dieser Methode allerdings nicht gewinnen. Zur Klärung der Funktion der Sekretionsprodukte und zur Identifizierung molekularer Bindungspartner sollten in weiterführenden Arbeiten zunächst Pull-Down Versuche mit solchen Geweben durchgeführt werden, die durch die Intravital-Mikroskopie als Ort erhöhter Yts1-Expression identifiziert wurden. Nach den CDART-Analysen, die in dieser Arbeit durchgeführt wurden, besitzen ChiY und EngY kohlenhydratbindende, und besonders chitinbindende Eigenschaften. Tatsächlich wurde die Affinität von ChiY und EngY zu Chitin in den Untersuchungen von Shutinoski et al. (2010) nachgewiesen. Da Säugetiere jedoch kein Chitin synthetisieren, stellt sich die Frage, ob die Sekretionsprodukte auch eine Bindung zu anderen Polysacchariden, wie zum Beispiel zu den Glykanen der Mucine oder anderer Glykoproteine, aufweisen. Da bisherige Versuche in unserem Institut keine positiven Resultate bezüglich der Bindung der Sekretionsprodukte an Mucinen der Kolon-Adenokarzinom-Zelllinie HT29-18N2 (Seekircher, 2010) ergeben hatten, könnte ein Glycan-Array Screen eingesetzt werden, um die Affinität der Sekretionsprodukte zu weiteren Glykanen oder glykosylierten Proteinen zu untersuchen. Eine solche Untersuchung ergab beispielsweise für das ChiY-Homolog GbpA neben der Affinität zu N-Acetylglucosaminen auch eine Affinität zu den eisentransportierenden Glykoproteinen Ceruloplasmin und Transferrin (Wong et al., 2012). Anhand der gewonnenen Daten eines Glycan-Array Screens lassen sich möglicherweise auch weitere Bindungspartner der Sekretionsprodukte ableiten, die außerhalb eines homiothermen Tieres vorkommen. Bezüglich der Interaktion von ChiY und EngY mit Chitin konnte bisher lediglich die Bindung der Proteine festgestellt werden. Ein Abbau des Chitins, z. B. als möglicher Energielieferant, wurde nicht beobachtet. In der Literatur finden sich allerdings Hinweise, dass ein Zusammenspiel chitinbindender Proteine (CBPs) einer Bakterienart mit den Chitinasen anderer Bakterienspezies durch einen synergistischen Effekt eine Verstärkung der Abbaurate von Chitin bewirken können (Purushotham et al., 2012). Um diese Möglichkeit einer synergistischen Interaktion der CBPs ChiY und EngY mit Diskussion 160 katalytisch aktiven Proteinen anderer Bakterien zu untersuchen, können Experimente nach dem Beispiel von Purushotham et al. (2012) durchgeführt werden. Anhand der in dieser Arbeit vorgenommenen in silico-Analyse zeigte sich, dass EngY über eine M60-ähnliche Domäne verfügt und möglicherweise zu einem katalytischen Abbau von Mucin fähig ist. Allerdings konnte eine enzymatische Aktivität z. B. als Matrix-Metalloprotease bisher nicht nachgewiesen werden. Mit Zymogrammen auf Basis verschiedener Glykoproteine der extrazellulären Matrix (z. B. Mucine) sollten die Bemühungen auf diesem Gebiet intensiviert werden. Dabei könnten die Ergebnisse des angesprochenen Glycan-Array Screens eventuell Hinweise zur Auswahl eines geeigneten, durch EngY abbaubaren Substrates liefern. Die in dieser Arbeit vorgenommenen Untersuchungen zur Regulation von Yts1 bestätigten, dass die Transkription des Systems von Temperatur und Mg2+Konzentration abhängig ist. Dabei zeigte insbesondere die chiY-Regulation, dass relativ hohe Mg2+-Konzentrationen (20 - 50 mM) nötig sind, um die maximale Transkriptionsrate des Gens zu erreichen. Der wahrscheinlichste Mechanismus zur Regulation von chiY beinhaltet die Auslösung einer Signalkaskade über ein Zweikomponenten-Rezeptorsystem. Da das als Mg2+-Sensor bekannte PhoP/PhoQSystem in unseren Untersuchungen (Seekircher, 2010) bisher keinen eindeutig belegten Einfluss auf die Regulation von chiY zeigte, sollten auch Deletionsmutanten weiterer Zweikomponenten-Rezeptorsysteme untersucht werden. So befindet sich 2 kbp stromabwärts von chiY ein Genpaar (YE3578, YE3579), welches als Zweikomponenten-Rezeptorsystem annotiert wird. Um einen möglichen regulativen Einfluss auf das Yts1-System zu evaluieren, könnte daher die Auswirkung von Deletionsmutanten dieser Gene auf die Mg2+-abhängige chiY-Regulation mittels Transkriptionsanalysen untersucht werden. Weiterhin könnten zusätzliche in vitro-Versuche zur Bestimmung Yts1-aktivierender Bedingungen getestet werden. Bei niedrigen Temperaturen wären zum Beispiel Extrakte von Pflanzen sowie Hämolymphe und Verdauungssäfte von Invertebraten in den Bakterienkulturen für eine Transkriptionsanalyse von Interesse. Bei Säugetiertemperaturen könnten antimikrobielle Peptide sowie Zytokine hinsichtlich einer positiven Reaktion der Yts1-Expression untersucht werden. Bezüglich der Virulenz von Yts1 gegenüber Invertebraten zeigten die in dieser Arbeit durchgeführten Infektionen mit Y. enterocolitica 8081 insbesondere bei den Diskussion 161 Wachsmottenlarven einen schweren Infektionsverlauf mit oftmals letalem Ausgang. In C. elegans besiedelten die Yersinien den Verdauungstrakt der Tiere und drangen auch in das umliegende Gewebe ein. Das Yts1-System trat bei diesen Vorgängen jedoch nicht als Virulenzfaktor in Erscheinung. Aufgrund der starken Homologie von ChiY und EngY mit Baculoviren-Proteinen, die in Form von Okklusionskörperchen über eine orale Aufnahme in den Verdauungstrakt von Lepidoptera-Larven gelangen, sollten für die weitere Untersuchung des Yts1-Systems entsprechende Tiermodelle etabliert werden, die unter Laborbedingungen gefüttert und damit einer definierten Erregerzahl ausgesetzt werden können. Literaturverzeichnis 7 162 Literaturverzeichnis Abbott, D. W. & Boraston, A. B. (2007). The Structural Basis for Exopolygalacturonase Activity in a Family 28 Glycoside Hydrolase. JMolBiol 368, 1215–null. Abby, S. S. & Rocha, E. P. C. (2012). The non-flagellar type III secretion system evolved from the bacterial flagellum and diversified into host-cell adapted systems. PLoS Genet 8, e1002983. Abdallah, A. M., Gey van Pittius, N. C., Champion, P. A. D., Cox, J., Luirink, J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Appelmelk, B. J. & Bitter, W. (2007). Type VII secretionmycobacteria show the way. Nat Rev Microbiol 5, 883–891. Abyzov, S. S., Bobin, N. E. & Koudriashov, B. B. (1979). Microbiological flora as a function of ice depth in central Antarctica. Life Sci Space Res 17, 99–103. Achtman, M., Zurth, K., Morelli, G., Torrea, G., Guiyoule, A. & Carniel, E. (1999). Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc Natl Acad Sci 96, 14043–14048. Ackermann, H.-W. & Smirnoff, W. A. (1983). A morphological investigation of 23 baculoviruses. J Invertebr Pathol 41, 269–280. Ackermann, N., Tiller, M., Anding, G., Roggenkamp, A. & Heesemann, J. (2008). Contribution of trimeric autotransporter C-terminal domains of oligomeric coiled-coil adhesin (Oca) family members YadA, UspA1, EibA, and Hia to translocation of the YadA passenger domain and virulence of Yersinia enterocolitica. J Bacteriol 190, 5031–5043. Ali, A. D., Bakry, N. M., Abdellatif, M. A. & El-Sawaf, S. K. (1974). The control of greater wax moth, Galleria mellonella L., by chemicals. Z Für Angew Entomol 75, 322–326. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403–410. Alvarez-Martinez, C. E. & Christie, P. J. (2009). Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev MMBR 73, 775–808. Van Asperen, K. & Van Esch, I. (1954). A Simple Microtitration Method for the Determination of Calcium and Magnesium in the Haemolymph of Insects. Nature 174, 927–927. Ast, V. M., Schoenhofen, I. C., Langen, G. R., Stratilo, C. W., Chamberlain, M. D. & Howard, S. P. (2002). Expression of the ExeAB complex of Aeromonas hydrophila is required for the localization and assembly of the ExeD secretion port multimer. Mol Microbiol 44, 217–231. Autenrieth, I. B. & Firsching, R. (1996). Penetration of M cells and destruction of Peyer’s patches by Yersinia enterocolitica: an ultrastructural and histological study. J Med Microbiol 44, 285–294. Backert, S. & Selbach, M. (2008). Role of type IV secretion in Helicobacter pylori pathogenesis. Cell Microbiol 10, 1573–1581. Bacot, A. W. & Martin, C. J. (1914). LXVII. Observations on the mechanism of the transmission of plague by fleas. J Hyg (Lond) 13, 423–439. Barak, J. D., Kramer, L. C. & Hao, L. (2011). Colonization of tomato plants by Salmonella enterica is cultivar dependent, and type 1 trichomes are preferred colonization sites. Appl Environ Microbiol 77, 498–504. Barraclough, P. B. (1989). Root growth, macro-nutrient uptake dynamics and soil fertility requirements of a high-yielding winter oilseed rape crop. Plant Soil 119, 59–70. Bengoechea, J. A., Najdenski, H. & Skurnik, M. (2004). Lipopolysaccharide O antigen status of Yersinia enterocolitica O:8 is essential for virulence and absence of O antigen affects the expression of other Yersinia virulence factors. Mol Microbiol 52, 451–469. Bent, Z. W., Branda, S. S. & Young, G. M. (2013). The Yersinia enterocolitica Ysa type III secretion system is expressed during infections both in vitro and in vivo. MicrobiologyOpen 2, 962–975. Bercovier, H., Brault, J., Barré, N., Treignier, M., Alonso, J. M. & Mollaret, H. H. (1978). Biochemical, serological, and phage typing characteristics of 459 Yersinia strains isolated from a terrestrial ecosystem. Curr Microbiol 1, 353–357. Bercovier, H., Steigerwalt, A. G., Guiyoule, A., Huntley-Carter, G. & Brenner, D. J. (1984). Yersinia Aldovae (formerly Yersinia Enterocolitica-like group X2): A new species of Enterobacteriaceae isolated from aquatic ecosystems. Int J Syst Bacteriol 34, 166–172. Bertani, G. (1951). STUDIES ON LYSOGENESIS I. J Bacteriol 62, 293–300. Bhowmick, R., Ghosal, A., Das, B., Koley, H., Saha, D. R., Ganguly, S., Nandy, R. K., Bhadra, R. K. & Chatterjee, N. S. (2008). Intestinal Adherence of Vibrio Cholerae Involves a Coor- Literaturverzeichnis 163 dinated Interaction Between Colonization Factor GbpA and Mucin. Infect Immun 76, 4968– 4977. Bingle, L. E., Bailey, C. M. & Pallen, M. J. (2008). Type VI secretion: a beginner’s guide. Curr Opin Microbiol 11, 3–8. Bitter, W., Houben, E. N. G., Luirink, J. & Appelmelk, B. J. (2009). Type VII secretion in mycobacteria: classification in line with cell envelope structure. Trends Microbiol 17, 337– 338. Bjune, G., Ruud, T. E. & Eng, J. (1984). Bacterial shock due to transfusion with Yersinia enterocolitica infected blood. Scand J Infect Dis 16, 411–412. Blädel, I. (2012). Charakterisierung des regulatorischen Pyp-Netzwerkes in Yersinia enterocolitica. Dissertation, Westfälische Wilhelms-Universität Münster, Zentrum für Molekularbiologie der Entzündung, Institut für Infektiologie. Blädel, I., Wagner, K., Beck, A., Schilling, J., Alexander Schmidt, M. & Heusipp, G. (2013). The H-NS protein silences the pyp regulatory network of Yersinia enterocolitica and is involved in controlling biofilm formation. FEMS Microbiol Lett 340, 41–48. Blocker, A., Gounon, P., Larquet, E., Niebuhr, K., Cabiaux, V., Parsot, C. & Sansonetti, P. (1999). The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes. J Cell Biol 147, 683–693. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G. & Herzenberg, L. A. (1972). Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum 43, 404–409. Bottone, E. J. (1999). Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates. Microbes Infect 1, 323–333. Bottone, E. J. & Mollaret, H.-H. (1977). Yersinia Enterocolitica: A Panoramic View of a Charismatic Microorganism. Crit Rev Microbiol 5, 211–241. Bottone, E. J. (1997). Yersinia enterocolitica: the charisma continues. Clin Microbiol Rev 10, 257. Boyd, A. P., Lambermont, I. & Cornelis, G. R. (2000). Competition between the Yops of Yersinia enterocolitica for delivery into eukaryotic cells: role of the SycE chaperone binding domain of YopE. J Bacteriol 182, 4811–4821. Boyd, W. L. & Boyd, J. W. (1964). The presence of bacteria in permafrost of the alaskan arctic. Can J Microbiol 10, 917–919. Boyer, F., Fichant, G., Berthod, J., Vandenbrouck, Y. & Attree, I. (2009). Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources? BMC Genomics 10, 104. Brenner, S. (1974). The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics 77, 71–94. Brivio, M. F., Pagani, M. & Restelli, S. (2002). Immune suppression of Galleria mellonella (Insecta, Lepidoptera) humoral defenses induced by Steinernema feltiae (Nematoda, Rhabditida): involvement of the parasite cuticle. Exp Parasitol 101, 149–156. Broomfield, R. J., Morgan, S. D., Khan, A. & Stickler, D. J. (2009). Crystalline bacterial biofilm formation on urinary catheters by urease-producing urinary tract pathogens: a simple method of control. J Med Microbiol 58, 1367–1375. Burnette, W. N. (1981). ‘Western blotting’: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem 112, 195–203. Bustos-Obregon, E. & Vargas, A. (2010). Chronic toxicity bioassay with populations of the crustacean Artemia salina exposed to the organophosphate diazinon. Biol Res 43, 357– 362. Calvin, N. M. & Hanawalt, P. C. (1988). High-efficiency transformation of bacterial cells by electroporation. J Bacteriol 170, 2796–2801. Carniel, E. (2001). The Yersinia high-pathogenicity island: an iron-uptake island. Microbes Infect 3, 561–569. Carniel, E. & Mollaret, H. H. (1990). Yersiniosis. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 13, 51–58. Carniel, E., Guilvout, I. & Prentice, M. (1996). Characterization of a Large Chromosomal ‘highPathogenicity Island’ in Biotype 1B Yersinia Enterocolitica. J Bacteriol 178, 6743–6751. Cascales, E. & Christie, P. J. (2003). The versatile bacterial type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol 1, 137–149. Cases, I., de Lorenzo, V. & Ouzounis, C. A. (2003). Transcription regulation and environmental adaptation in bacteria. Trends Microbiol 11, 248–253. C. elegans Sequencing Consortium. (1998). Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science 282, 2012–2018. Chakravortty, D., Rohde, M., Jäger, L., Deiwick, J. & Hensel, M. (2005). Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella Pathogenicity Island 2. EMBO J 24, 2043–2052. Literaturverzeichnis 164 Chapman, R. F. (1998). The Insects: Structure and Function. Cambridge University Press. Chapon-Hervé, V., Akrim, M., Latifi, A., Williams, P., Lazdunski, A. & Bally, M. (1997). Regulation of the xcp secretion pathway by multiple quorum-sensing modulons in Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol 24, 1169–1178. Chastain, J. P., Camberato, J. J., Albrecht, J. E. & Adams, J. (1999). Swine manure production and nutrient content. S C Confin Anim Manure Manag Certif Program 127. Chen, P. E., Cook, C., Stewart, A. C., Nagarajan, N., Sommer, D. D., Pop, M., Thomason, B., Thomason, M., Lentz, S. & other authors. (2010). Genomic characterization of the Yersinia genus. Genome Biol 11, R1. Christie, P. J. (2009). Structural biology: Translocation chamber’s secrets. Nature 462, 992–994. Cianciotto, N. P. (2005). Type II secretion: a protein secretion system for all seasons. Trends Microbiol 13, 581–588. Cianciotto, N. P. (2009). Many substrates and functions of type II secretion: lessons learned from Legionella pneumophila. Future Microbiol 4, 797–805. Ciche, T. A. & Ensign, J. C. (2003). For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out? Appl Environ Microbiol 69, 1890–1897. Coburn, B., Sekirov, I. & Finlay, B. B. (2007). Type III secretion systems and disease. Clin Microbiol Rev 20, 535–549. Cook, K. A., Weinzierl, R. A., Pataky, J. K., Esker, P. D. & Nutter, F. W., Jr. (2005). Population densities of corn flea beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) and incidence of Stewart’s wilt in sweet corn. J Econ Entomol 98, 673–682. Corliss, J. B., Dymond, J., Gordon, L. I., Edmond, J. M., von Herzen, R. P., Ballard, R. D., Green, K., Williams, D., Bainbridge, A. & other authors. (1979). Submarine thermal sprirngs on the galapagos rift. Science 203, 1073–1083. Cornelis, G., Vanootegem, J.-C. & Sluiters, C. (1987). Transcription of the yop regulon from Y. enterocolitica requires trans acting pYV and chromosomal genes. Microb Pathog 2, 367– 379. Cornelis, G. R. (2002). The Yersinia Ysc–Yop ‘Type III’ weaponry. Nat Rev Mol Cell Biol 3, 742– 754. Cornelis, G. R. & Wolf‐Watz, H. (1997). The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for subverting eukaryotic cells. Mol Microbiol 23, 861–867. Correa, V. R., Majerczak, D. R., Ammar, E.-D., Merighi, M., Pratt, R. C., Hogenhout, S. A., Coplin, D. L. & Redinbaugh, M. G. (2012). The bacterium Pantoea stewartii uses two different type III secretion systems to colonize its plant host and insect vector. Appl Environ Microbiol 78, 6327–6336. Cover, T. L. & Aber, R. C. (1989). Yersinia enterocolitica. N Engl J Med 321, 16–24. Damgaard, P. H. (2000). Natural occurrence and dispersal of Bacillus thuringiensis in the environment. In Entomopathog Bact Lab Field Appl, pp. 23–40. Edited by J.-F. Charles, A. Delécluse & C. N.-L. Roux. Springer Netherlands. Darwin, A. J. & Miller, V. L. (1999). Identification of Yersinia enterocolitica genes affecting survival in an animal host using signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol 32, 51– 62. Davies, A. R., Capell, C., Jehanno, D., Nychas, G. J. E. & Kirby, R. M. (2001). Incidence of foodborne pathogens on European fish. Food Control 12, 67–71. DebRoy, S., Dao, J., Söderberg, M., Rossier, O. & Cianciotto, N. P. (2006). Legionella pneumophila type II secretome reveals unique exoproteins and a chitinase that promotes bacterial persistence in the lung. Proc Natl Acad Sci 103, 19146–19151. Delepelaire, P. (2004). Type I secretion in gram-negative bacteria. Biochim Biophys Acta BBA Mol Cell Res 1694, 149–161. Delor, I. & Cornelis, G. R. (1992). Role of Yersinia enterocolitica Yst toxin in experimental infection of young rabbits. Infect Immun 60, 4269–4277. Delor, I., Kaeckenbeeck, A., Wauters, G. & Cornelis, G. R. (1990). Nucleotide sequence of yst, the Yersinia enterocolitica gene encoding the heat-stable enterotoxin, and prevalence of the gene among pathogenic and nonpathogenic yersiniae. Infect Immun 58, 2983–2988. Derksen, A. C. & Granados, R. R. (1988). Alteration of a lepidopteran peritrophic membrane by baculoviruses and enhancement of viral infectivity. Virology 167, 242–250. Desvaux, M., Hébraud, M., Talon, R. & Henderson, I. R. (2009a). Secretion and subcellular localizations of bacterial proteins: a semantic awareness issue. Trends Microbiol 17, 139– 145. Literaturverzeichnis 165 Desvaux, M., Hébraud, M., Talon, R. & Henderson, I. R. (2009b). Outer membrane translocation: numerical protein secretion nomenclature in question in mycobacteria. Trends Microbiol 17, 338–340. Devenish, J. A. & Schiemann, D. A. (1981). HeLa cell infection by Yersinia enterocolitica: evidence for lack of intracellular multiplication and development of a new procedure for quantitative expression of infectivity. Infect Immun 32, 48–55. Dey, P. M. & Harborne, J. B. (1997). Plant Biochemistry. Academic Press. Donghoon Kang, Y. S. G. (2002). Highly sensitive and fast protein detection with coomassie brilliant blue in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Commun Ed Bull Korean Chem Soc 23. Douzi, B., Ball, G., Cambillau, C., Tegoni, M. & Voulhoux, R. (2011). Deciphering the Xcp Pseudomonas aeruginosa Type II Secretion Machinery through Multiple Interactions with Substrates. J Biol Chem 286, 40792–40801. Douzi, B., Filloux, A. & Voulhoux, R. (2012). On the path to uncover the bacterial type II secretion system. Philos Trans R Soc B Biol Sci 367, 1059–1072. Dower, W. J., Miller, J. F. & Ragsdale, C. W. (1988). High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res 16, 6127–6145. Doyle, C. J., Hirst, M. L., Cory, J. S. & Entwistle, P. F. (1990). Risk Assessment Studies: Detailed Host Range Testing of Wild-Type Cabbage Moth, Mamestra brassicae (Lepidoptera: Noctuidae), Nuclear Polyhedrosis Virus. Appl Environ Microbiol 56, 2704–2710. Edmond, M. B., Wallace, S. E., McClish, D. K., Pfaller, M. A., Jones, R. N. & Wenzel, R. P. (1999). Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am 29, 239–244. El Tahir, Y. & Skurnik, M. (2001). YadA, the multifaceted Yersinia adhesin. Int J Med Microbiol IJMM 291, 209–218. Emody, L., Heesemann, J., Wolf-Watz, H., Skurnik, M., Kapperud, G., O’Toole, P. & Wadstrom, T. (1989). Binding to collagen by Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis: evidence for yopA-mediated and chromosomally encoded mechanisms. J Bacteriol 171, 6674–6679. Epstein, E. (1965). Mineral metabolism 438-466. In: Plant Biochemistry (J. Bonner and J.E. Varner, eds.) Academic Press, London. Epstein, E. & Bloom, A. A. J. (2005). Mineral Nutrition Of Plants: Principles And Perspectives. Sinauer Associates, Incorporated. Erickson, D. L., Russell, C. W., Johnson, K. L., Hileman, T. & Stewart, R. M. (2011). PhoP and OxyR transcriptional regulators contribute to Yersinia pestis virulence and survival within Galleria mellonella. Microb Pathog 51, 389–395. Erlich, H. A., Gelfand, D. & Sninsky, J. J. (1991). Recent advances in the polymerase chain reaction. Science 252, 1643–1651. Fàbrega, A. & Vila, J. (2012). Yersinia enterocolitica: pathogenesis, virulence and antimicrobial resistance. Enfermedades Infecc Microbiol Clínica 30, 24–32. Falcão, J. P., Brocchi, M., Proença-Módena, J. L., Acrani, G. O., Corrêa, E. F. & Falcão, D. P. (2004). Virulence characteristics and epidemiology of Yersinia enterocolitica and Yersiniae other than Y. pseudotuberculosis and Y. pestis isolated from water and sewage. J Appl Microbiol 96, 1230–1236. Fallon, J., Kelly, J. & Kavanagh, K. (2012). Galleria mellonella as a model for fungal pathogenicity testing. Methods Mol Biol Clifton NJ 845, 469–485. Fauconnier, A., Allaoui, A., Campos, A., Van Elsen, A., Cornelis, G. R. & Bollen, A. (1997). Flagellar flhA, flhB and flhE Genes, Organized in an Operon, Cluster Upstream from the Inv Locus in Yersinia Enterocolitica. Microbiology 143, 3461–3471. Feinberg, L., Jorgensen, J., Haselton, A., Pitt, A., Rudner, R. & Margulis, L. (1999). Arthromitus (Bacillus cereus) symbionts in the cockroach Blaberus giganteus: dietary influences on bacterial development and population density. Symbiosis Phila Pa 27, 109– 123. Fernandez-Patron, C., Calero, M., Collazo, P. R., Garcia, J. R., Madrazo, J., Musacchio, A., Soriano, F., Estrada, R., Frank, R. & Castellanos-Serra, L. R. (1995). Protein reverse staining: high-efficiency microanalysis of unmodified proteins detected on electrophoresis gels. Anal Biochem 224, 203–211. Filloux, A., Hachani, A. & Bleves, S. (2008). The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes. Microbiology 154, 1570–1583. Filloux, A. (2004). The underlying mechanisms of type II protein secretion. Biochim Biophys Acta 1694, 163–179. Literaturverzeichnis 166 Filloux, A. (2011). Protein Secretion Systems in Pseudomonas aeruginosa: An Essay on Diversity, Evolution, and Function. Front Microbiol 2, 155. Fisher, K. & Phillips, C. (2009). The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus. Microbiol Read Engl 155, 1749–1757. Flavia Dematheis, B. K. (2012). Microbial communities associated with the larval gut and eggs of the Western corn rootworm. PloS One 7, e44685. Forest, K. T. (2008). The type II secretion arrowhead: the structure of GspI–GspJ–GspK. Nat Struct Mol Biol 15, 428–430. Foultier, B., Troisfontaines, P., Müller, S., Opperdoes, F. R. & Cornelis, G. R. (2002). Characterization of the ysa Pathogenicity Locus in the Chromosome of Yersinia enterocolitica and Phylogeny Analysis of Type III Secretion Systems. J Mol Evol 55, 37–51. Francetic, O., Belin, D., Badaut, C. & Pugsley, A. P. (2000). Expression of the endogenous type II secretion pathway in Escherichia coli leads to chitinase secretion. EMBO J 19, 6697– 6703. Francis, M. S. (2013). The pathogenic Yersiniae—advances in the understanding of physiology and virulence. Front Cell Infect Microbiol 3, 51. Franzetti, L., Pompei, M., Scarpellini, M. & Galli, A. (2004). Phenotypic and genotypic characterization of Enterococcus spp. of different origins. Curr Microbiol 49, 255–260. Fredriksson-Ahomaa, M., Korte, T. & Korkeala, H. (2001). Transmission of Yersinia enterocolitica 4/O:3 to pets via contaminated pork. Lett Appl Microbiol 32, 375–378. Fronzes, R., Remaut, H. & Waksman, G. (2008). Architectures and biogenesis of non-flagellar protein appendages in Gram-negative bacteria. EMBO J 27, 2271–2280. Fronzes, R., Christie, P. J. & Waksman, G. (2009). The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol 7, 703–714. Fuchs, T. M., Bresolin, G., Marcinowski, L., Schachtner, J. & Scherer, S. (2008). Insecticidal genes of Yersinia spp.: taxonomical distribution, contribution to toxicity towards Manduca sexta and Galleria mellonella, and evolution. BMC Microbiol 8, 214. Fukushima, H., Shimizu, S. & Inatsu, Y. (2011). Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis Detection in Foods. J Pathog 2011. Furutani, A., Tsuge, S., Ohnishi, K., Hikichi, Y., Oku, T., Tsuno, K., Inoue, Y., Ochiai, H., Kaku, H. & Kubo, Y. (2004). Evidence for HrpXo-Dependent Expression of Type II Secretory Proteins in Xanthomonas oryzae pv. oryzae. J Bacteriol 186, 1374–1380. Galac, M. R. & Lazzaro, B. P. (2011). Comparative pathology of bacteria in the genus Providencia to a natural host, Drosophila melanogaster. Microbes Infect Inst Pasteur 13, 673–683. Galindo, C. L., Rosenzweig, J. A., Kirtley, M. L. & Chopra, A. K. (2011). Pathogenesis of Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis in Human Yersiniosis. J Pathog 2011. Gallo, L. G., Corsaro, B. G., Hughes, P. R. & Granados, R. R. (1991). In vivo enhancement of baculovirus infection by the viral enhancing factor of a granulosis virus of the cabbage looper, Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae). J Invertebr Pathol 58, 203–210. Galloway, C. S., Wang, P., Winstanley, D. & Jones, I. M. (2005). Comparison of the bacterial Enhancin-like proteins from Yersinia and Bacillus spp. with a baculovirus Enhancin. J Invertebr Pathol 90, 134–137. Gambardella, C., Mesarič, T., Milivojević, T., Sepčić, K., Gallus, L., Carbone, S., Ferrando, S. & Faimali, M. (2014). Effects of selected metal oxide nanoparticles on Artemia salina larvae: evaluation of mortality and behavioural and biochemical responses. Environ Monit Assess. Geer, L. Y., Domrachev, M., Lipman, D. J. & Bryant, S. H. (2002). CDART: protein homology by domain architecture. Genome Res 12, 1619–1623. Gehring, A. M., DeMoll, E., Fetherston, J. D., Mori, I., Mayhew, G. F., Blattner, F. R., Walsh, C. T. & Perry, R. D. (1998). Iron acquisition in plague: modular logic in enzymatic biogenesis of yersiniabactin by Yersinia pestis. Chem Biol 5, 573–586. Goldberg, J. B. (2000). Pseudomonas: global bacteria. Trends Microbiol 8, 55–57. Graham LA, Caesar JJ & Burgen AS (1960). Gastrointestinal absorption and excretion of Mg 28 in man. Metabolism. 9: 646–659 Graves, A. K. & Weaver, R. W. (2010). Characterization of enterococci populations collected from a subsurface flow constructed wetland. J Appl Microbiol 108, 1226–1234. Gray, M. J., Rajeev, S., Miller, D. L., Schmutzer, A. C., Burton, E. C., Rogers, E. D. & Hickling, G. J. (2007). Preliminary evidence that American bullfrogs (Rana catesbeiana) are suitable hosts for Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol 73, 4066–4068. Greenwood, J. R., Flanigan, S. M., Pickett, M. J. & Martin, W. J. (1975). Clinical Isolation of Yersinia enterocolitica: Cold Temperature Enrichment. J Clin Microbiol 2, 559–560. Literaturverzeichnis 167 Guillemet, E., Cadot, C., Tran, S.-L., Guinebretiere, M.-H., Lereclus, D. & Ramarao, N. (2010). The InhA Metalloproteases of Bacillus cereus Contribute Concomitantly to Virulence. J Bacteriol 192, 286–294. Guinet, F., Carniel, E. & Leclercq, A. (2011). Transfusion-transmitted Yersinia enterocolitica sepsis. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am 53, 583–591. Guzmàn, C. A., Pruzzo, C., LiPira, G. & Calegari, L. (1989). Role of adherence in pathogenesis of Enterococcus faecalis urinary tract infection and endocarditis. Infect Immun 57, 1834– 1838. Haapalainen, M., van Gestel, K., Pirhonen, M. & Taira, S. (2009). Soluble plant cell signals induce the expression of the type III secretion system of Pseudomonas syringae and upregulate the production of pilus protein HrpA. Mol Plant-Microbe Interact MPMI 22, 282–290. Håkansson, S., Bergman, T., Vanooteghem, J. C., Cornelis, G. & Wolf-Watz, H. (1993). YopB and YopD constitute a novel class of Yersinia Yop proteins. Infect Immun 61, 71–80. Haller, J. C., Carlson, S., Pederson, K. J. & Pierson, D. E. (2000). A chromosomally encoded type III secretion pathway in Yersinia enterocolitica is important in virulence. Mol Microbiol 36, 1436–1446. Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol 166, 557–580. Hanna, M. o., Stewart, J. C., Zink, D. L., Carpenter, Z. L. & Vanderzant, C. (1977). Development of Yersinia enterocolitica on raw and cooked beef and pork at different temperatures. J Food Sci 42, 1180–1184. Hanski, C., Naumann, M., Hahn, H. & Riecken, E. O. (1989). Determinants of invasion and survival of Yersinia enterocolitica in intestinal tissue. An in vivo study. Med Microbiol Immunol (Berl) 178, 289–296. Hara, S., Tanada, Y. & Omi, E. M. (1976). Isolation and characterization of a synergistic enzyme from the capsule of a granulosis virus of the armyworm, Pseudaletia unipuncta. J Invertebr Pathol 27, 115–124. Hardie, K. R., Lory, S. & Pugsley, A. P. (1996). Insertion of an outer membrane protein in Escherichia coli requires a chaperone-like protein. EMBO J 15, 978–988. Hauben, L., Moore, E. R., Vauterin, L., Steenackers, M., Mergaert, J., Verdonck, L. & Swings, J. (1998). Phylogenetic position of phytopathogens within the Enterobacteriaceae. Syst Appl Microbiol 21, 384–397. Hauser, A. R. (2009). The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nat Rev Microbiol 7, 654–665. Heath-Heckman, E. A. C. & McFall-Ngai, M. J. (2011). The occurrence of chitin in the hemocytes of invertebrates. Zool Jena Ger 114, 191–198. Heermann, R. & Fuchs, T. M. (2008). Comparative analysis of the Photorhabdus luminescens and the Yersinia enterocolitica genomes: uncovering candidate genes involved in insect pathogenicity. BMC Genomics 9, 40. Heesemann, J. (1987). Chromosomal-encoded siderophores are required for mouse virulence of enteropathogenic Yersinia species. FEMS Microbiol Lett 48, 229–233. Heesemann, J., Sing, A. & Trülzsch, K. (2006). Yersinia’s stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol 9, 55–61. Henderson, I. R., Navarro-Garcia, F., Desvaux, M., Fernandez, R. C. & Ala’Aldeen, D. (2004a). Type V protein secretion pathway: the autotransporter story. Microbiol Mol Biol Rev MMBR 68, 692–744. Henderson, I. R., Navarro-Garcia, F., Desvaux, M., Fernandez, R. C. & Ala’Aldeen, D. (2004b). Type V protein secretion pathway: the autotransporter story. Microbiol Mol Biol Rev MMBR 68, 692–744. Henderson, I. R., Cappello, R. & Nataro, J. P. (2000). Autotransporter proteins, evolution and redefining protein secretion. Trends Microbiol 8, 529–532. Henrissat, B., Heffron, S. E., Yoder, M. D., Lietzke, S. E. & Jurnak, F. (1995). Functional Implications of Structure-Based Sequence Alignment of Proteins in the Extracellular Pectate Lyase Superfamily. Plant Physiol 107, 963–976. Herbst, K., Bujara, M., Heroven, A. K., Opitz, W., Weichert, M., Zimmermann, A. & Dersch, P. (2009). Intrinsic thermal sensing controls proteolysis of Yersinia virulence regulator RovA. PLoS Pathog 5, e1000435. Heusipp, G., Young, G. M. & Miller, V. L. (2001). HreP, an in vivo-expressed protease of Yersinia enterocolitica, is a new member of the family of subtilisin/kexin-like proteases. J Bacteriol 183, 3556–3563. Literaturverzeichnis 168 Heustis, R. J., Ng, H. K., Brand, K. J., Rogers, M. C., Le, L. T., Specht, C. A. & Fuhrman, J. A. (2012). Pharyngeal Polysaccharide Deacetylases Affect Development in the Nematode C. elegans and Deacetylate Chitin In Vitro. PLoS ONE 7. Hillewaert, H. (2010). Artemia salina (Linnaeus, 1758). Hobbs, M. & Mattick, J. S. (1993). Common components in the assembly of type 4 fimbriae, DNA transfer systems, filamentous phage and protein-secretion apparatus: a general system for the formation of surface-associated protein complexes. Mol Microbiol 10, 233–243. Hoiczyk, E., Roggenkamp, A., Reichenbecher, M., Lupas, A. & Heesemann, J. (2000). Structure and sequence analysis of Yersinia YadA and Moraxella UspAs reveal a novel class of adhesins. EMBO J 19, 5989–5999. Holden, N., Pritchard, L. & Toth, I. (2009). Colonization outwith the colon: plants as an alternative environmental reservoir for human pathogenic enterobacteria. FEMS Microbiol Rev 33, 689–703. Holland, I. B., Schmitt, L. & Young, J. (2005). Type 1 protein secretion in bacteria, the ABCtransporter dependent pathway (Review). Mol Membr Biol 22, 29–39. Hubálek, Z. & Halouzka, J. (1991). Persistence of Clostridium botulinum type C toxin in blow fly (Calliphoridae) larvae as a possible cause of avian botulism in spring. J Wildl Dis 27, 81– 85. Hueck, C. J. (1998). Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiol Mol Biol Rev MMBR 62, 379–433. Hurme, R. & Rhen, M. (1998). Temperature sensing in bacterial gene regulation--what it all boils down to. Mol Microbiol 30, 1–6. Hurst, M. R. H., Becher, S. A., Young, S. D., Nelson, T. L. & Glare, T. R. (2011). Yersinia entomophaga sp. nov., Isolated from the New Zealand grass grub Costelytra zealandica. Int J Syst Evol Microbiol 61, 844–849. Ibrahim, A., Goebel, B. M., Liesack, W., Griffiths, M. & Stackebrandt, E. (1993). The phylogeny of the genus Yersinia based on 16S rDNA sequences. FEMS Microbiol Lett 114, 173–177. Imhoff, J. F. (1986). Survival strategies of microorganisms in extreme saline environments. Adv Space Res Off J Comm Space Res COSPAR 6, 299–306. Irazoqui, J. E., Troemel, E. R., Feinbaum, R. L., Luhachack, L. G., Cezairliyan, B. O. & Ausubel, F. M. (2010). Distinct Pathogenesis and Host Responses during Infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog 6, e1000982. Isberg, R. R. (1989). Mammalian cell adhesion functions and cellular penetration of enteropathogenic Yersinia species. Mol Microbiol 3, 1449–1453. Ishii, K., Adachi, T., Hamamoto, H. & Sekimizu, K. (2014). Serratia marcescens Suppresses Host Cellular Immunity via the Production of an Adhesion-inhibitory Factor against Immunosurveillance Cells. J Biol Chem 289, 5876–5888. Ishikawa, H., Ikeda, M., Alves, C. A. F., Thiem, S. M. & Kobayashi, M. (2004). Host range factor 1 from Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus (NPV) is an essential viral factor required for productive infection of NPVs in IPLB-Ld652Y cells derived from L. dispar. J Virol 78, 12703–12708. Ivanova, N., Sorokin, A., Anderson, I., Galleron, N., Candelon, B., Kapatral, V., Bhattacharyya, A., Reznik, G., Mikhailova, N. & other authors. (2003). Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature 423, 87–91. Iwobi, A., Heesemann, J., Garcia, E., Igwe, E., Noelting, C. & Rakin, A. (2003). Novel VirulenceAssociated Type II Secretion System Unique to High-Pathogenicity Yersinia Enterocolitica. Infect Immun 71, 1872–1879. Jackson, T. j., Wang, H., Nugent, M. J., Griffin, C. T., Burnell, A. M. & Dowds, B. C. A. (1995). Isolation of insect pathogenic bacteria, Providencia rettgeri, from Heterorhabditis spp. J Appl Bacteriol 78, 237–244. Jacob-Dubuisson, F., Locht, C. & Antoine, R. (2001). Two-partner secretion in Gram-negative bacteria: a thrifty, specific pathway for large virulence proteins. Mol Microbiol 40, 306–313. Jahnen-Dechent, W. & Ketteler, M. (2012). Magnesium basics. Clin Kidney J 5, i3–i14. Jarrett, C. O., Deak, E., Isherwood, K. E., Oyston, P. C., Fischer, E. R., Whitney, A. R., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. & Hinnebusch, B. J. (2004). Transmission of Yersinia pestis from an infectious biofilm in the flea vector. J Infect Dis 190, 783–792. Jha, A. K., Bais, H. P. & Vivanco, J. M. (2005). Enterococcus faecalis Mammalian VirulenceRelated Factors Exhibit Potent Pathogenicity in the Arabidopsis thaliana Plant Model. Infect Immun 73, 464–475. Jorgensen, E. M. & Mango, S. E. (2002). The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet 3, 356–369. Literaturverzeichnis 169 Journet, L., Agrain, C., Broz, P. & Cornelis, G. R. (2003). The needle length of bacterial injectisomes is determined by a molecular ruler. Science 302, 1757–1760. Kaletta, T. & Hengartner, M. O. (2006). Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov 5, 387–399. Karapinar, M. & Gönül, S. A. (1991). Survival of Yersinia enterocolitica and Escherichia coli in spring water. Int J Food Microbiol 13, 315–319. Kelley, L. A. & Sternberg, M. J. E. (2009). Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server. Nat Protoc 4, 363–371. De Keyzer, J., van der Does, C. & Driessen, A. J. M. (2003). The bacterial translocase: a dynamic protein channel complex. Cell Mol Life Sci CMLS 60, 2034–2052. Kinder, S. A., Badger, J. L., Bryant, G. O., Pepe, J. C. & Miller, V. L. (1993). Cloning of the YenI restriction endonuclease and methyltransferase from Yersinia enterocolitica serotype O8 and construction of a transformable R−M+ mutant. Gene 136, 271–275. Kirn, T. J., Jude, B. A. & Taylor, R. K. (2005). A colonization factor links Vibrio cholerae environmental survival and human infection. Nature 438, 863–866. Kobayashi, M., Sasaki, T., Saito, N., Tamura, K., Suzuki, K., Watanabe, H. & Agui, N. (1999). Houseflies: not simple mechanical vectors of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Am J Trop Med Hyg 61, 625–629. Kohl, S. (1979). Yersinia enterocolitica infections in children. Pediatr Clin North Am 26, 433–443. De Koning-Ward, T. F. & Robins-Browne, R. M. (1997). A novel mechanism of urease regulation in Yersinia enterocolitica. FEMS Microbiol Lett 147, 221–226. De Koning-Ward, T. F. & Robins-Browne, R. M. (1995). Contribution of urease to acid tolerance in Yersinia enterocolitica. Infect Immun 63, 3790–3795. Koronakis, V., Sharff, A., Koronakis, E., Luisi, B. & Hughes, C. (2000). Crystal structure of the bacterial membrane protein TolC central to multidrug efflux and protein export. Nature 405, 914–919. Korotkov, K. V., Sandkvist, M. & Hol, W. G. J. (2012). The type II secretion system: biogenesis, molecular architecture and mechanism. Nat Rev Microbiol 10, 336–351. Kotte, O., Zaugg, J. B. & Heinemann, M. (2010). Bacterial adaptation through distributed sensing of metabolic fluxes. Mol Syst Biol 6. Krinsky, W. L. (1976). Animal disease agents transmitted by horse flies and deer flies (Diptera: Tabanidae). J Med Entomol 13, 225–275. Kubori, T., Matsushima, Y., Nakamura, D., Uralil, J., Lara-Tejero, M., Sukhan, A., Galán, J. E. & Aizawa, S. I. (1998). Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science 280, 602–605. Kyhse-Andersen, J. (1984). Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. J Biochem Biophys Methods 10, 203–209. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–685. Laitinen, O., Leirisalo, M. & Skylv, G. (1977). Relation between HLA-B27 and clinical features in patients with yersinia arthritis. Arthritis Rheum 20, 1121–1124. Lambert, B., Buysse, L., Decock, C., Jansens, S., Piens, C., Saey, B., Seurinck, J., Van Audenhove, K., Van Rie, J. & other authors. (1996). A Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein with a high activity against members of the family Noctuidae. Appl Environ Microbiol 62, 80–86. Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J. & Frost, L. S. (2003). F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett 224, 1–15. Lee, H.-M., Chen, J.-R., Lee, H.-L., Leu, W.-M., Chen, L.-Y. & Hu, N.-T. (2004). Functional dissection of the XpsN (GspC) protein of the Xanthomonas campestris pv. campestris type II secretion machinery. J Bacteriol 186, 2946–2955. Leiman, P. G., Basler, M., Ramagopal, U. A., Bonanno, J. B., Sauder, J. M., Pukatzki, S., Burley, S. K., Almo, S. C. & Mekalanos, J. J. (2009). Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4154–4159. Lindsey, J. O., Martin, W. T., Sonnenwirth, A. C. & Bennett, J. V. (1976). An outbreak of nosocomial Proteus rettgeri urinary tract infection. Am J Epidemiol 103, 2461–2469. Loghem, J. J. van. (1944). The classification of the plague-bacillus. Antonie Van Leeuwenhoek 10, 15–16. Literaturverzeichnis 170 De Lorenzo, V., Eltis, L., Kessler, B. & Timmis, K. N. (1993). Analysis of Pseudomonas gene products using lacIq/Ptrp-lac plasmids and transposons that confer conditional phenotypes. Gene 123, 17–24. Luo, Q., Kumar, P., Vickers, T. J., Sheikh, A., Lewis, W. G., Rasko, D. A., Sistrunk, J. & Fleckenstein, J. M. (2014a). Enterotoxigenic Escherichia coli Secretes a Highly Conserved Mucin-Degrading Metalloprotease To Effectively Engage Intestinal Epithelial Cells. Infect Immun 82, 509–521. Luo, Y., Stichnothe, H., Schuchardt, F., Li, G., Huaitalla, R. M. & Xu, W. (2014b). Life cycle assessment of manure management and nutrient recycling from a Chinese pig farm. Waste Manag Res J Int Solid Wastes Public Clean Assoc ISWA 32, 4–12. Lyczak, J. B., Cannon, C. L. & Pier, G. B. (2000). Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: lessons from a versatile opportunist. Microbes Infect Inst Pasteur 2, 1051–1060. Lyczak, J. B., Cannon, C. L. & Pier, G. B. (2002). Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin Microbiol Rev 15, 194–222. Maguire, M. E. & Cowan, J. A. (2002). Magnesium chemistry and biochemistry. Biometals Int J Role Met Ions Biol Biochem Med 15, 203–210. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G. & Ausubel, F. M. (1999). Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell 96, 47–56. Mahan, M. J., Slauch, J. M. & Mekalanos, J. J. (1993). Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science 259, 686–688. Mahan, M. J., Tobias, J. W., Slauch, J. M., Hanna, P. C., Collier, R. J. & Mekalanos, J. J. (1995). Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 669–673. Mahan, M. J., Heithoff, D. M., Sinsheimer, R. L. & Low, D. A. (2000). Assessment of bacterial pathogenesis by analysis of gene expression in the host. Annu Rev Genet 34, 139–164. Mair, N. S. (1973). Yersiniosis in wildlife and its public health implications. J Wildl Dis 9, 64–71. Manjeet, K., Purushotham, P., Neeraja, C. & Podile, A. R. (2013). Bacterial chitin binding proteins show differential substrate binding and synergy with chitinases. Microbiol Res 168, 461–468. Marchler-Bauer, A., Anderson, J. B., Chitsaz, F., Derbyshire, M. K., DeWeese-Scott, C., Fong, J. H., Geer, L. Y., Geer, R. C., Gonzales, N. R. & other authors. (2009). CDD: specific functional annotation with the Conserved Domain Database. Nucleic Acids Res 37, D205– 210. Marchler-Bauer, A., Lu, S., Anderson, J. B., Chitsaz, F., Derbyshire, M. K., DeWeese-Scott, C., Fong, J. H., Geer, L. Y., Geer, R. C. & other authors. (2011). CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins. Nucleic Acids Res 39, D225– 229. Martinec, T. & Kocur, M. (1964). A taxonomic study of Erwinia amylovora (Burrill 1882) Winslow et al. 1920. Int Bull Bacteriol Nomencl Taxon 14, 5–14. Massa, S., Cesaroni, D., Poda, G. & Trovatelli, L. D. (1988). Isolation of Yersinia enterocolitica and related species from river water. Zentralblatt Für Mikrobiol 143, 575–581. Matsumoto, H. & Young, G. M. (2009). Translocated effectors of Yersinia. Curr Opin Microbiol 12, 94–100. Mattinen, L., Nissinen, R., Riipi, T., Kalkkinen, N. & Pirhonen, M. (2007). Host-extract induced changes in the secretome of the plant pathogenic bacterium Pectobacterium atrosepticum. Proteomics 7, 3527–3537. McCoy-Simandle, K., Stewart, C. R., Dao, J., DebRoy, S., Rossier, O., Bryce, P. J. & Cianciotto, N. P. (2011). Legionella pneumophila Type II Secretion Dampens the Cytokine Response of Infected Macrophages and Epithelia. Infect Immun 79, 1984–1997. Merhej, V., Adékambi, T., Pagnier, I., Raoult, D. & Drancourt, M. (2008). Yersinia Massiliensis Sp. Nov., Isolated from Fresh Water. Int J Syst Evol Microbiol 58, 779–784. Merzendorfer, H. & Zimoch, L. (2003). Chitin metabolism in insects: structure, function and regulation of chitin synthases and chitinases. J Exp Biol 206, 4393–4412. MEYERS, B. R., BOTTONE, E., HIRSCHMAN, S. Z. & SCHNEIERSON, S. S. (1972). Infections Caused by Microorganisms of the Genus Erwinia. Ann Intern Med 76, 9–14. Michael, A. S., Thompson, C. G. & Abramovitz, M. (1956). Artemia salina as a Test Organism for Bioassay. Science 123, 464. Michel, G., Bleves, S., Ball, G., Lazdunski, A. & Filloux, A. (1998). Mutual stabilization of the XcpZ and XcpY components of the secretory apparatus in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology 144, 3379–3386. Literaturverzeichnis 171 Michiels, T., Wattiau, P., Brasseur, R., Ruysschaert, J. M. & Cornelis, G. (1990). Secretion of Yop proteins by Yersiniae. Infect Immun 58, 2840–2849. Mikula, K. M., Kolodziejczyk, R. & Goldman, A. (2013). Yersinia infection tools--characterization of structure and function of adhesins. Front Cell Infect Microbiol 2. Milillo, S. R., Badamo, J. M., Boor, K. J. & Wiedmann, M. (2008). Growth and persistence of Listeria monocytogenes isolates on the plant model Arabidopsis thaliana. Food Microbiol 25, 698–704. Miller, J. H. (1972). Experiments in molecular genetics. [Cold Spring Harbor, N.Y.]: Cold Spring Harbor Laboratory. Miller, V. L., Farmer, J. J., Hill, W. E. & Falkow, S. (1989). The Ail Locus Is Found Uniquely in Yersinia Enterocolitica Serotypes Commonly Associated with Disease. Infect Immun 57, 121–131. Mukherjee, K., Altincicek, B., Hain, T., Domann, E., Vilcinskas, A. & Chakraborty, T. (2010). Galleria mellonella as a Model System for Studying Listeria Pathogenesis. Appl Environ Microbiol 76, 310–317. Murakami, H. & Masui, H. (1980). Hormonal control of human colon carcinoma cell growth in serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A 77, 3464–3468. Murros-Kontiainen, A., Johansson, P., Niskanen, T., Fredriksson-Ahomaa, M., Korkeala, H. & Björkroth, J. (2011). Yersinia Pekkanenii Sp. Nov. Int J Syst Evol Microbiol 61, 2363– 2367. Nadarasah, G. & Stavrinides, J. (2011). Insects as alternative hosts for phytopathogenic bacteria. FEMS Microbiol Rev 35, 555–575. Nakjang, S., Ndeh, D. A., Wipat, A., Bolam, D. N. & Hirt, R. P. (2012). A Novel Extracellular Metallopeptidase Domain Shared by Animal Host-Associated Mutualistic and Pathogenic Microbes. PLoS ONE 7. Nesta, B., Valeri, M., Spagnuolo, A., Rosini, R., Mora, M., Donato, P., Alteri, C. J., Del Vecchio, M., Buccato, S. & other authors. (2014). SslE Elicits Functional Antibodies That Impair In Vitro Mucinase Activity and In Vivo Colonization by Both Intestinal and Extraintestinal Escherichia coli Strains. PLoS Pathog 10. Neutra, M. R., Pringault, E. & Kraehenbuhl, J. P. (1996). Antigen sampling across epithelial barriers and induction of mucosal immune responses. Annu Rev Immunol 14, 275–300. Nham, T., Filali, S., Danne, C., Derbise, A. & Carniel, E. (2012). Imaging of Bubonic Plague Dynamics by In Vivo Tracking of Bioluminescent Yersinia pestis. PLoS ONE 7, e34714. Ninio, S. & Roy, C. R. (2007). Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends Microbiol 15, 372–380. Oyston, P. C., Dorrell, N., Williams, K., Li, S. R., Green, M., Titball, R. W. & Wren, B. W. (2000). The response regulator PhoP is important for survival under conditions of macrophageinduced stress and virulence in Yersinia pestis. Infect Immun 68, 3419–3425. Paerregaard, A. (1992). Interactions between Yersinia enterocolitica and the host with special reference to virulence plasmid encoded adhesion and humoral immunity. Dan Med Bull 39, 155–172. Paerregaard, A., Espersen, F., Jensen, O. M. & Skurnik, M. (1991). Interactions between Yersinia enterocolitica and rabbit ileal mucus: growth, adhesion, penetration, and subsequent changes in surface hydrophobicity and ability to adhere to ileal brush border membrane vesicles. Infect Immun 59, 253–260. Palmer, T., Sargent, F. & Berks, B. C. (2005). Export of complex cofactor-containing proteins by the bacterial Tat pathway. Trends Microbiol 13, 175–180. Peabody, C. R., Chung, Y. J., Yen, M.-R., Vidal-Ingigliardi, D., Pugsley, A. P. & Saier, M. H. (2003). Type II protein secretion and its relationship to bacterial type IV pili and archaeal flagella. Microbiology 149, 3051–3072. Peixotto, S. S., Finne, G., Hanna, M. O. & Vanderzant, C. (1979). Presence, Growth and Survival of Yersinia enterocolitica in Oysters, Shrimp and Crab. J Food Prot 42, 974–981. Pell, L. G., Kanelis, V., Donaldson, L. W., Howell, P. L. & Davidson, A. R. (2009). The phage lambda major tail protein structure reveals a common evolution for long-tailed phages and the type VI bacterial secretion system. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4160–4165. Penner, J. L., Hinton, N. A. & Hennessy, J. (1975). Biotypes of Proteus rettgeri. J Clin Microbiol 1, 136–142. Pepe, J. C. & Miller, V. L. (1993). Yersinia enterocolitica invasin: a primary role in the initiation of infection. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 6473–6477. Pepe, J. C., Badger, J. L. & Miller, V. L. (1994). Growth phase and low pH affect the thermal regulation of the Yersinia enterocolitica inv gene. Mol Microbiol 11, 123–135. Literaturverzeichnis 172 Planet, P. J., Kachlany, S. C., Fine, D. H., DeSalle, R. & Figurski, D. H. (2003). The Widespread Colonization Island of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Nat Genet 34, 193–198. Plotnikova, J. M., Rahme, L. G. & Ausubel, F. M. (2000). Pathogenesis of the human opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa PA14 in Arabidopsis. Plant Physiol 124, 1766–1774. Pohlner, J., Halter, R., Beyreuther, K. & Meyer, T. F. (1987). Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease. Nature 325, 458–462. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I. & Belfrage, G. (1975). Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 258, 598–599. Portnoy, D. A. & Falkow, S. (1981). Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis. J Bacteriol 148, 877–883. Portnoy, D. A., Wolf-Watz, H., Bolin, I., Beeder, A. B. & Falkow, S. (1984). Characterization of common virulence plasmids in Yersinia species and their role in the expression of outer membrane proteins. Infect Immun 43, 108–114. Prithiviraj, B., Bais, H. P., Jha, A. K. & Vivanco, J. M. (2005). Staphylococcus aureus pathogenicity on Arabidopsis thaliana is mediated either by a direct effect of salicylic acid on the pathogen or by SA-dependent, NPR1-independent host responses. Plant J Cell Mol Biol 42, 417–432. Progatzky, F., Dallman, M. J. & Celso, C. L. (2013). From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus 3, 20130001. Pruzzo, C., Vezzulli, L. & Colwell, R. R. (2008). Global impact of Vibrio cholerae interactions with chitin. Environ Microbiol 10, 1400–1410. Pukatzki, S., Kessin, R. H. & Mekalanos, J. J. (2002). The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 3159–3164. Pukatzki, S., Ma, A. T., Revel, A. T., Sturtevant, D. & Mekalanos, J. J. (2007). Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 15508–15513. Pulvertaft, J. V. (1964). CYTOLOGY OF BURKITT’S TUMOUR (AFRICAN LYMPHOMA). Lancet 1, 238–240. Purushotham, P., Arun, P. V. P. S., Prakash, J. S. S. & Podile, A. R. (2012). Chitin binding proteins act synergistically with chitinases in Serratia proteamaculans 568. PloS One 7, e36714. Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G. & Ausubel, F. M. (1995). Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science 268, 1899–1902. Rahme, L. G., Tan, M. W., Le, L., Wong, S. M., Tompkins, R. G., Calderwood, S. B. & Ausubel, F. M. (1997). Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 13245–13250. Rakin, A., Noelting, C., Schubert, S. & Heesemann, J. (1999). Common and Specific Characteristics of the High-Pathogenicity Island of Yersinia Enterocolitica. Infect Immun 67, 5265–5274. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C. & Lereclus, D. (2012). The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp JoVE e4392. Read, T. D., Peterson, S. N., Tourasse, N., Baillie, L. W., Paulsen, I. T., Nelson, K. E., Tettelin, H., Fouts, D. E., Eisen, J. A. & other authors. (2003). The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria. Nature 423, 81–86. Reichow, S. L., Korotkov, K. V., Hol, W. G. J. & Gonen, T. (2010). Structure of the cholera toxin secretion channel in its closed state. Nat Struct Mol Biol 17, 1226–1232. Reinhard, E. (1986). Gene und Klone. Eine Einführung in die Gentechnologie. Von E.-L. Winnacker, Verlag Chemie Weinheim 1984. XII, 454 S., 306 Abb., 31 Tab., geb. DM 70,–. Pharm Unserer Zeit 15, 28–28. Richards, A. G. & Richards, P. A. (1977). The Peritrophic Membranes of Insects. Annu Rev Entomol 22, 219–240. Van Rie, J., McGaughey, W. H., Johnson, D. E., Barnett, B. D. & Van Mellaert, H. (1990). Mechanism of insect resistance to the microbial insecticide Bacillus thuringiensis. Science 247, 72–74. Rosqvist, R., Magnusson, K. E. & Wolf-Watz, H. (1994). Target cell contact triggers expression and polarized transfer of Yersinia YopE cytotoxin into mammalian cells. EMBO J 13, 964– 972. Literaturverzeichnis 173 Ruckdeschel, K., Roggenkamp, A., Lafont, V., Mangeat, P., Heesemann, J. & Rouot, B. (1997). Interaction of Yersinia enterocolitica with macrophages leads to macrophage cell death through apoptosis. Infect Immun 65, 4813–4821. Rucker, R. R. (1966). Redmouth disease of rainbow trout (Salmo gairdneri). Bull - Off Int Épizooties 65, 825–830. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. & Erlich, H. A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487–491. Salgado-Pabón, W., Jain, S., Turner, N., van der Does, C. & Dillard, J. P. (2007). A novel relaxase homologue is involved in chromosomal DNA processing for type IV secretion in Neisseria gonorrhoeae. Mol Microbiol 66, 930–947. Samson, R., Legendre, J. B., Christen, R., Fischer-Le Saux, M., Achouak, W. & Gardan, L. (2005). Transfer of Pectobacterium chrysanthemi (Burkholder et al. 1953) Brenner et al. 1973 and Brenneria paradisiaca to the genus Dickeya gen. nov. as Dickeya chrysanthemi comb. nov. and Dickeya paradisiaca comb. nov. and delineation of four novel species, Dickeya dadantii sp. nov., Dickeya dianthicola sp. nov., Dickeya dieffenbachiae sp. nov. and Dickeya zeae sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 55, 1415–1427. Sandkvist, M. (2001a). Biology of type II secretion. Mol Microbiol 40, 271–283. Sandkvist, M. (2001b). Classification of Secretion Pathways. Infect Immun 69, 3523–3535. Sandkvist, M. (2001c). Type II secretion and pathogenesis. Infect Immun 69, 3523. Saunders, D. R. & Wiggins, H. S. (1983). Fecal Excretion of Soluble Magnesium by Humans. West J Med 139, 655–656. Schonewille, J. T., Everts, H., Jittakhot, S. & Beynen, A. C. (2008). Quantitative prediction of magnesium absorption in dairy cows. J Dairy Sci 91, 271–278. Schopf, J. W. (2006). Fossil evidence of Archaean life. Philos Trans R Soc B Biol Sci 361, 869– 885. Schraidt, O., Lefebre, M. D., Brunner, M. J., Schmied, W. H., Schmidt, A., Radics, J., Mechtler, K., Galán, J. E. & Marlovits, T. C. (2010). Topology and organization of the Salmonella typhimurium type III secretion needle complex components. PLoS Pathog 6, e1000824. Schreiner, H. C., Sinatra, K., Kaplan, J. B., Furgang, D., Kachlany, S. C., Planet, P. J., Perez, B. A., Figurski, D. H. & Fine, D. H. (2003). Tight-adherence genes of Actinobacillus actinomycetemcomitans are required for virulence in a rat model. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 7295–7300. Schrenk, M. O., Kelley, D. S., Delaney, J. R. & Baross, J. A. (2003). Incidence and diversity of microorganisms within the walls of an active deep-sea sulfide chimney. Appl Environ Microbiol 69, 3580–3592. Sebaihia, M., Peck, M. W., Minton, N. P., Thomson, N. R., Holden, M. T. G., Mitchell, W. J., Carter, A. T., Bentley, S. D., Mason, D. R. & other authors. (2007). Genome sequence of a proteolytic (Group I) Clostridium botulinum strain Hall A and comparative analysis of the clostridial genomes. Genome Res 17, 1082–1092. Seekircher, S. (2010). Regulation of the Yts1 Type Two Secretion System (T2SS) in Yersinia enterocolitica and its Role in Bacterial Adhesion to Cellular Surfaces. Shaham, S. (2006). Methods in cell biology. WormBook. Sharma, S., Sachdeva, P. & Virdi, J. S. (2003). Emerging water-borne pathogens. Appl Microbiol Biotechnol 61, 424–428. Shevchik, V. E. & Condemine, G. (1998). Functional characterization of the Erwinia chrysanthemi OutS protein, an element of a type II secretion system. Microbiol Read Engl 144 ( Pt 11), 3219–3228. Shin, D. & Groisman, E. A. (2005). Signal-dependent Binding of the Response Regulators PhoP and PmrA to Their Target Promoters in Vivo. J Biol Chem 280, 4089–4094. Shutinoski, B., Schmidt, M. A. & Heusipp, G. (2010). Transcriptional regulation of the Yts1 type II secretion system of Yersinia enterocolitica and identification of secretion substrates. Mol Microbiol 75, 676–691. Siebers, A. & Finlay, B. B. (1996). M cells and the pathogenesis of mucosal and systemic infections. Trends Microbiol 4, 22–29. Signoretto, C., Burlacchini, G., Pruzzo, C. & Canepari, P. (2005). Persistence of Enterococcus faecalis in Aquatic Environments via Surface Interactions with Copepods. Appl Environ Microbiol 71, 2756–2761. Literaturverzeichnis 174 Singh, S., Eric, M., Floyd, I. & Leonard, H. D. (2012). Characterization of Photorhabdus luminescens Growth for the Rearing of the Beneficial Nematode Heterorhabditis bacteriophora. Indian J Microbiol 52, 325–331. Sivaraman, T., Kumar, T. K., Jayaraman, G. & Yu, C. (1997). The mechanism of 2,2,2trichloroacetic acid-induced protein precipitation. J Protein Chem 16, 291–297. Slauch, J. M., Mahan, M. J. & Mekalanos, J. J. (1994). In vivo expression technology for selection of bacterial genes specifically induced in host tissues. Methods Enzymol 235, 481–492. Slavicek, J. M. (2012). Baculovirus Enhancins and Their Role in Viral Pathogenicity. 2+ Smith, D. L. & Maguire, M. E. (1993). Molecular aspects of Mg transport systems. Miner Electrolyte Metab 19, 266–276. Smith, R. L. & Maguire, M. E. (1998). Microbial magnesium transport: unusual transporters searching for identity. Mol Microbiol 28, 217–226. Söderberg, M. A., Rossier, O. & Cianciotto, N. P. (2004). The type II protein secretion system of Legionella pneumophila promotes growth at low temperatures. J Bacteriol 186, 3712– 3720. Somvanshi, V. S., Viswanathan, P., Jacobs, J. L., Mulks, M. H., Sundin, G. W. & Ciche, T. A. (2010). The Type 2 Secretion Pseudopilin, gspJ, Is Required for Multihost Pathogenicity of Burkholderia cenocepacia AU1054. Infect Immun 78, 4110–4121. Sorgeloos, P., Dhert, P. & Candreva, P. (2001). Use of the brine shrimp, Artemia spp., in marine fish larviculture. Aquaculture, Advanced Biotechnology in Hatchery Production 200, 147– 159. Souza, R. A., Falcão, D. P. & Falcão, J. P. (2011). Emended Description of Yersinia Massiliensis. Int J Syst Evol Microbiol 61, 1094–1097. Spanier, B., Starke, M., Higel, F., Scherer, S. & Fuchs, T. M. (2010). Yersinia enterocolitica Infection and tcaA-Dependent Killing of Caenorhabditis elegans. Appl Environ Microbiol 76, 6277–6285. Spiteller, D., Dettner, K. & Boland, W. (2000). Gut Bacteria May Be Involved in Interactions between Plants, Herbivores and Their Predators: Microbial Biosynthesis of N-Acylglutamine Surfactants as Elicitors of Plant Volatiles. Biol Chem 381, 755–762. Sprague, L. D. & Neubauer, H. (2005). Yersinia aleksiciae sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 55, 831–835. Sprague, L. D., Scholz, H. C., Amann, S., Busse, H.-J. & Neubauer, H. (2008). Yersinia similis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 58, 952–958. Sproston, E. L., Macrae, M., Ogden, I. D., Wilson, M. J. & Strachan, N. J. C. (2006). Slugs: potential novel vectors of Escherichia coli O157. Appl Environ Microbiol 72, 144–149. Stan-Lotter, H., Gupta, M. & Sanderson, K. E. (1979). The influence of cations on the permeability of the outer membrane of Salmonella typhimurium and other gram-negative bacteria. Can J Microbiol 25, 475–485. Starr, M. P. & Chatterjee, A. K. (1972). The Genus Erwinia: Enterobacteria Pathogenic to Plants and Animals. Annu Rev Microbiol 26, 389–426. Stauder, M., Huq, A., Pezzati, E., Grim, C. J., Ramoino, P., Pane, L., Colwell, R. R., Pruzzo, C. & Vezzulli, L. (2012). Role of GbpA protein, an important virulence-related colonization factor, for Vibrio cholerae’s survival in the aquatic environment. Environ Microbiol Rep 4, 439–445. St Geme, J. W., 3rd & Cutter, D. (2000). The Haemophilus influenzae Hia adhesin is an autotransporter protein that remains uncleaved at the C terminus and fully cell associated. J Bacteriol 182, 6005–6013. Stojiljkovic, I. & Hantke, K. (1992). Hemin uptake system of Yersinia enterocolitica: similarities with other TonB-dependent systems in gram-negative bacteria. EMBO J 11, 4359–4367. Straley, S. C. & Perry, R. D. (1995). Environmental modulation of gene expression and pathogenesis in Yersinia. Trends Microbiol 3, 310–317. Straley, S. C., Plano, G. V., Skrzypek, E., Haddix, P. L. & Fields, K. A. (1993). Regulation by 2+ 2+ Ca in the Yersinia low-Ca response. Mol Microbiol 8, 1005–1010. Studier, F. W. & Moffatt, B. A. (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189, 113–130. Suits, M. D. & Boraston, A. B. (2013). Structure of the Streptococcus Pneumoniae Surface Protein and Adhesin Pfba. Plos One 8, 67190–null. Sulakvelidze, A. (2000). Yersiniae other thanY. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, and Y. pestis: the ignored species. Microbes Infect 2, 497–513. Literaturverzeichnis 175 Surana, N. K., Cutter, D., Barenkamp, S. J. & St Geme, J. W., 3rd. (2004). The Haemophilus influenzae Hia autotransporter contains an unusually short trimeric translocator domain. J Biol Chem 279, 14679–14685. Talley, J. L., Wayadande, A. C., Wasala, L. P., Gerry, A. C., Fletcher, J., DeSilva, U. & Gilliland, S. E. (2009). Association of Escherichia coli O157:H7 with filth flies (Muscidae and Calliphoridae) captured in leafy greens fields and experimental transmission of E. coli O157:H7 to spinach leaves by house flies (Diptera: Muscidae). J Food Prot 72, 1547– 1552. Tanada, Y., Himeno, M. & Omi, E. M. (1973). Isolation of a factor, from the capsule of a granulosis virus, synergistic for a nuclear-polyhedrosis virus of the armyworm. J Invertebr Pathol 21, 31–40. Tanada, Y., Hess, R. T. & Omi, E. M. (1975). Invasion of a nuclear polyhedrosis virus in midgut of the armyworm, Pseudaletia unipuncta, and the enhancement of a synergistic enzyme. J Invertebr Pathol 26, 99–104. Tanada, Y., Inoue, H., Hess, R. T. & Omi, E. M. (1980). Site of action of a synergistic factor of a granulosis virus of the armyworm, Pseudaletia unipuncta. J Invertebr Pathol 35, 249–255. Tardy, F., Nasser, W., Robert-Baudouy, J. & Hugouvieux-Cotte-Pattat, N. (1997). Comparative analysis of the five major Erwinia chrysanthemi pectate lyases: enzyme characteristics and potential inhibitors. J Bacteriol 179, 2503–2511. Tennant, S. M., Grant, T. H. & Robins-Browne, R. M. (2003). Pathogenicity of Yersinia enterocolitica biotype 1A. FEMS Immunol Med Microbiol 38, 127–137. Thomson, N. R., Howard, S., Wren, B. W., Holden, M. T. G., Crossman, L., Challis, G. L., Churcher, C., Mungall, K., Brooks, K. & other authors. (2006). The Complete Genome Sequence and Comparative Genome Analysis of the High Pathogenicity Yersinia enterocolitica Strain 8081. PLoS Genet 2, e206. Von Tils, D., Bladel, I., Schmidt, M. A. & Heusipp, G. (2012). Type II secretion in Yersinia--a secretion system for pathogenicity and environmental fitness. Front Cell Infect Microbiol 2. Tobback, E., Decostere, A., Hermans, K., Haesebrouck, F. & Chiers, K. (2007). Yersinia ruckeri infections in salmonid fish. J Fish Dis 30, 257–268. Tomich, M., Planet, P. J. & Figurski, D. H. (2007). The tad locus: postcards from the widespread colonization island. Nat Rev Microbiol 5, 363–375. Toprak, U., Harris, S., Baldwin, D., Theilmann, D., Gillott, C., Hegedus, D. D. & Erlandson, M. A. (2012). Role of enhancin in Mamestra configurata nucleopolyhedrovirus virulence: selective degradation of host peritrophic matrix proteins. J Gen Virol 93, 744–753. Tormo, J., Lamed, R., Chirino, A. J., Morag, E., Bayer, E. A., Shoham, Y. & Steitz, T. A. (1996). Crystal structure of a bacterial family-III cellulose-binding domain: a general mechanism for attachment to cellulose. EMBO J 15, 5739–5751. Towbin, H., Staehelin, T. & Gordon, J. (1992). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnol Read Mass 24, 145–149. Trosky, J. E., Liverman, A. D. B. & Orth, K. (2008). Yersinia outer proteins: Yops. Cell Microbiol 10, 557–565. Trülzsch, K., Oellerich, M. F. & Heesemann, J. (2007). Invasion and dissemination of Yersinia enterocolitica in the mouse infection model. Adv Exp Med Biol 603, 279–285. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T. & Tada, K. (1980). Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP1). Int J Cancer J Int Cancer 26, 171–176. Turell, M. J. & Knudson, G. B. (1987). Mechanical transmission of Bacillus anthracis by stable flies (Stomoxys calcitrans) and mosquitoes (Aedes aegypti and Aedes taeniorhynchus). Infect Immun 55, 1859–1861. Tuyet, D. T. N., Yassibanda, S., Nguyen Thi, P. L., Koyenede, M. R., Gouali, M., Békondi, C., Mazzi, J. & Germani, Y. (2006). Enteropathogenic Escherichia coli o157 in Bangui and N’Goila, Central African Republic: A brief report. Am J Trop Med Hyg 75, 513–515. Venecia, K. & Young, G. M. (2005). Environmental Regulation and Virulence Attributes of the Ysa Type III Secretion System of Yersinia Enterocolitica Biovar 1B. Infect Immun 73, 5961– 5977. Verma, A. & Burns, D. L. (2007). Requirements for assembly of PtlH with the pertussis toxin transporter apparatus of Bordetella pertussis. Infect Immun 75, 2297–2306. Vezzulli, L., Guzmán, C. A., Colwell, R. R. & Pruzzo, C. (2008). Dual role colonization factors connecting Vibrio cholerae’s lifestyles in human and aquatic environments open new perspectives for combating infectious diseases. Curr Opin Biotechnol 19, 254–259. Literaturverzeichnis 176 Viarre, V., Cascales, E., Ball, G., Michel, G. P. F., Filloux, A. & Voulhoux, R. (2009). HxcQ liposecretin is self-piloted to the outer membrane by its N-terminal lipid anchor. J Biol Chem 284, 33815–33823. Vogelstein, B. & Gillespie, D. (1979). Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc Natl Acad Sci U S A 76, 615–619. Vrancken, K., Holtappels, M., Schoofs, H., Deckers, T. & Valcke, R. (2013). Pathogenicity and infection strategies of the fire blight pathogen Erwinia amylovora in Rosaceae: state of the art. Microbiol Read Engl 159, 823–832. De Vrind, J., De Groot, A., Brouwers, G. J., Tommassen, J. & De Vrind-de Jong, E. (2003). Identification of a novel Gsp-related pathway required for secretion of the manganeseoxidizing factor of Pseudomonas putida strain GB-1. Mol Microbiol 47, 993–1006. Wacker, W. E. & Parisi, A. F. (1968a). Magnesium metabolism. N Engl J Med 278, 712–717. Wacker, W. E. & Parisi, A. F. (1968b). Magnesium metabolism. N Engl J Med 278, 658–663. Wagner, K., Schilling, J., Fälker, S., Schmidt, M. A. & Heusipp, G. (2009a). A Regulatory Network Controls Expression of the In Vivo-Expressed HreP Protease of Yersinia enterocolitica. J Bacteriol 191, 1666–1676. Wagner, S., Sorg, I., Degiacomi, M., Journet, L., Dal Peraro, M. & Cornelis, G. R. (2009b). The helical content of the YscP molecular ruler determines the length of the Yersinia injectisome. Mol Microbiol 71, 692–701. Walker, K. A., Maltez, V., Hall, J. D., Vitko, N. P. & Miller, V. L. (2013). A Phenotype at Last: Essential Role for the Yersinia enterocolitica Ysa Type III Secretion System in a Drosophila S2 cell model. Infect Immun. Wang, P. & Granados, R. R. (1997). An intestinal mucin is the target substrate for a baculovirus enhancin. Proc Natl Acad Sci 94, 6977–6982. Wang, P., Hammer, D. A. & Granados, R. R. (1994). Interaction of Trichoplusia ni granulosis virus-encoded enhancin with the midgut epithelium and peritrophic membrane of four lepidopteran insects. J Gen Virol 75, 1961–1967. Wang, R. F. & Kushner, S. R. (1991). Construction of versatile low-copy-number vectors for cloning, sequencing and gene expression in Escherichia coli. Gene 100, 195–199. Waterfield, N. R., Wren, B. W. & ffrench-Constant, R. H. (2004). Invertebrates as a source of emerging human pathogens. Nat Rev Microbiol 2, 833–841. Waters, V. L. (2001). Conjugation between bacterial and mammalian cells. Nat Genet 29, 375– 376. Wauters, G., Kandolo, K. & Janssens, M. (1987). Revised biogrouping scheme of Yersinia enterocolitica. Contrib Microbiol Immunol 9, 14–21. Wauters, G., Janssens, M., Steigerwalt, A. G. & Brenner, D. J. (1988). Yersinia mollaretii sp. nov. and Yersinia bercovieri sp. nov., formerly called Yersinia enterocolitica biogroups 3A and 3B. Int J Syst Bacteriol 38, 424–429. Weigert, R., Porat-Shliom, N. & Amornphimoltham, P. (2013). Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol 201, 969–979. Weiss, A. A. & Falkow, S. (1983). Transposon insertion and subsequent donor formation promoted by Tn501 in Bordetella pertussis. J Bacteriol 153, 304–309. Weiss, A. A., Hewlett, E. L., Myers, G. A. & Falkow, S. (1983). Tn5-induced mutations affecting virulence factors of Bordetella pertussis. Infect Immun 42, 33–41. Wenzel, M., Schönig, I., Berchtold, M., Kämpfer, P. & König, H. (2002). Aerobic and facultatively anaerobic cellulolytic bacteria from the gut of the termite Zootermopsis angusticollis. J Appl Microbiol 92, 32–40. Wester, P. O. (1987). Magnesium. Am J Clin Nutr 45, 1305–1312. Willumsen, B. (1989). Birds and wild fish as potential vectors of Yersinia ruckeri. J Fish Dis 12, 275–277. Wong, E., Vaaje-Kolstad, G., Ghosh, A., Hurtado-Guerrero, R., Konarev, P. V., Ibrahim, A. F. M., Svergun, D. I., Eijsink, V. G. H., Chatterjee, N. S. & van Aalten, D. M. F. (2012). The Vibrio cholerae Colonization Factor GbpA Possesses a Modular Structure that Governs Binding to Different Host Surfaces. PLoS Pathog 8, e1002373. Wren, B. W. (2003). The Yersiniae — a model genus to study the rapid evolution of bacterial pathogens. Nat Rev Microbiol 1, 55–64. Wren, B. W., Olsen, A. L., Stabler, R. & Li, S. R. (1995). Genetic analysis of phoP and ompR from Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis. Contrib Microbiol Immunol 13, 318–320. Wu, G., Zhao, Z., Liu, C. & Qiu, L. (2014). Priming Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) Larvae with Heat-Killed Bacterial Cells Induced an Enhanced Immune Protection Against Literaturverzeichnis 177 Photorhabdus luminescens TT01 and the Role of Innate Immunity in the Process. J Econ Entomol 107, 559–569. Wu, H.-J., Wang, A. H.-J. & Jennings, M. P. (2008). Discovery of virulence factors of pathogenic bacteria. Curr Opin Chem Biol 12, 93–101. Wyatt, G. R. (1961). The biochemistry of insect hemolymph. Annu Rev Entomol 6, 75–102. Xiang, Y., G Leiman, P., Li, L., Grimes, S., Anderson, D. L. & Rossmann, M. G. (2011). Crystallographic Insights Into the Autocatalytic Assembly Mechanism of a Bacteriophage Tail Spike. MolCell 34, 375–386. Xicohtencatl-Cortes, J., Sánchez Chacón, E., Saldaña, Z., Freer, E. & Girón, J. A. (2009). Interaction of Escherichia coli O157:H7 with leafy green produce. J Food Prot 72, 1531– 1537. Xie, F., Murray, J. D., Kim, J., Heckmann, A. B., Edwards, A., Oldroyd, G. E. D. & Downie, J. A. (2012). Legume pectate lyase required for root infection by rhizobia. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 633–638. Xu, J., Liu, Q., Jing, H., Pang, B., Yang, J., Zhao, G. & Li, H. (2003). Isolation of Escherichia coli O157:H7 from dung beetles Catharsius molossus. Microbiol Immunol 47, 45–49. Yanez, M. E., Korotkov, K. V., Abendroth, J. & Hol, W. G. J. (2008). Structure of the minor pseudopilin EpsH from the type 2 secretion system of Vibrio cholerae. J Mol Biol 377, 91– 103. Yang, Y. & Isberg, R. R. (1993). Cellular internalization in the absence of invasin expression is promoted by the Yersinia pseudotuberculosis yadA product. Infect Immun 61, 3907–3913. Yeo, H.-J., Cotter, S. E., Laarmann, S., Juehne, T., St Geme, J. W., 3rd & Waksman, G. (2004). Structural basis for host recognition by the Haemophilus influenzae Hia autotransporter. EMBO J 23, 1245–1256. Young, G. M. (2007). The Ysa type 3 secretion system of Yersinia enterocolitica biovar 1B. Adv Exp Med Biol 603, 286–297. Young, G. M., Schmiel, D. H. & Miller, V. L. (1999). A New Pathway for the Secretion of Virulence Factors by Bacteria: The Flagellar Export Apparatus Functions as a Protein-Secretion System. Proc Natl Acad Sci 96, 6456–6461. Young, G. M. & Miller, V. L. (1997). Identification of novel chromosomal loci affecting Yersinia enterocolitica pathogenesis. Mol Microbiol 25, 319–328. Yu, D. & Kuipers, J. G. (2003). Role of bacteria and HLA-B27 in the pathogenesis of reactive arthritis. Rheum Dis Clin North Am 29, 21–36, v–vi. Zampini, M., Pruzzo, C., Bondre, V. P., Tarsi, R., Cosmo, M., Bacciaglia, A., Chhabra, A., Srivastava, R. & Srivastava, B. S. (2005). Vibrio cholerae persistence in aquatic environments and colonization of intestinal cells: involvement of a common adhesion mechanism. FEMS Microbiol Lett 244, 267–273. Zhang, L., Toivanen, P. & Skurnik, M. (1996). The gene cluster directing O-antigen biosynthesis in Yersinia enterocolitica serotype 0:8: identification of the genes for mannose and galactose biosynthesis and the gene for the O-antigen polymerase. Microbiol Read Engl 142 ( Pt 2), 277–288. Zhao, Y., Blumer, S. E. & Sundin, G. W. (2005). Identification of Erwinia amylovora Genes Induced during Infection of Immature Pear Tissue. J Bacteriol 187, 8088–8103. Zheng, J. & Leung, K. Y. (2007). Dissection of a type VI secretion system in Edwardsiella tarda. Mol Microbiol 66, 1192–1206. Zhou, H., Li, J., Peng, X., Meng, J., Wang, F. & Ai, Y. (2009). Microbial diversity of a sulfide black smoker in main endeavour hydrothermal vent field, Juan de Fuca Ridge. J Microbiol Seoul Korea 47, 235–247. Anhang 8 178 Anhang 8.1 Transkription Yts1-assoziierter Gene in Fruchtextrakten 10000 GHY414 yts1C::lacZYA GHY437 pclR::lacZYA GHY494 chiY::lacZYA -Galactosidase-Aktivität [Miller Units] 8000 6000 75 50 25 Apfel Birne G HY 4 G 14 HY 43 7 G HY 49 4 G HY 4 G 14 HY 43 7 G HY 49 4 G HY 4 G 14 HY 43 7 G HY 49 4 Kt rl (n e g. ) Kt rl (in t.) 0 Nektarine Abbildung 8-1: Transkription Yts1-assoziierter Gene in Kulturen mit den Extrakten von Apfel, Birne und Nektarine. LB-Medium versetzt mit den Extrakten von Apfel, Birne und Nektarine wurde mit den Reporterstämmen GHY414 (yts1C-lacZYA), GHY437 (pclR-lacZYA) und GHY494 (chiY-lacZYA) mit einer OD600 = 0,2 angeimpft und für drei Stunden bei 17°C inkubiert. Anschließend wurde die βGalactosidase-Aktivität des bakteriellen Überstandes erfasst (Miller Units). Als interne Kontrolle (Ktrl int.) wurde die Transkriptionsstärke von GHY494 in LB-Medium bei 17°C und 20 mM MgCl2 bestimmt. Die Negativ-Kontrolle (Ktrl (neg.)) wurde aus der β-Galactosidase-Aktivität des Stammes GHY53 generiert, der keine lacZYA-Gene besitzt. Die Daten stellen die Durchschnittswerte und Standardabweichungen von drei unabhängig durchgeführten Experimenten, in jeweils dreifacher Ausführung, dar. Anhang 8.2 179 Plasmidkarten pEP185.2 (Kinder et al., 1993) Anhang 180 pET24b(+) (Novagen) Anhang 181 pVLT33 (de Lorenzo et al., 1993) Anhang 182 pWSK129 (Wang & Kushner, 1991) Anhang 183 8.3 Wissenschaftliche Beiträge 8.3.1 Publikationen von Tils, D., Blädel, I., Schmidt, M. A. and Heusipp, G. (2012) Type-II-secretion in Yersinia - a secretion system for pathogenicity and environmental fitness. Front Cell Infect Microbiol 2 8.3.2 Vorträge von Tils, D., Shutinoski, B., Schmidt, M. A. and Heusipp, G. Yts1 and Yts2, the Type-Two-Secretion Systems of Yersinia enterocolitica. 2. Nationales YersiniaMeeting. Herrsching, 2011 8.3.3 Poster von Tils, D., Shutinoski, B., Seekircher, S., Schmidt, M. A. and Heusipp, G. The Yersinia enterocolitica Yts1 Type-II-Secretion System: Transcriptional Regulation and Functional Characterization. 2nd Summer School Pathogen - Host Interactions, The International Graduate School (GRK 1409). Münster, 2011 von Tils, D., Shutinoski, B., Seekircher, S., Schmidt, M. A. and Heusipp, G. Yts1: A type-II-secretion system of Yersinia enterocolitica associated with environmental survival. 112th General Meeting of the American Society for Microbiology. San Francisco, CA, USA, 2012 Anhang 8.4 184 Lebenslauf Anhang 8.5 185 Danksagung
