su kanker biomedisch bekeken bw DEF.indb

Deel 1
Wat is kanker?
42
DEEL 1 WAT IS KANKER?
Hoofdstuk 1
Wat is kanker?
Karin Vanderkerken, Hendrik De Raeve, Peter Vandenberghe
1 Celdeling als motor van ontwikkeling,
groei en weefselhomeostase
Celdeling is de motor van de ontwikkeling, groei en
weefselhomeostase van multicellulaire organismen. In
een normaal weefsel interageren de cellen zoals in een
ecosysteem met cellen als individuen. Er zijn, net zoals
in een samenleving, regels en wetten i.v.m. geboorte,
sterfte, habitat, territoriale beperkingen (vooral de beperking van grootte van een bepaalde populatie). Om
deze homeostase te kunnen handhaven werken de
cellen nauw samen via een complexe signalisatie die
de cellen onderwerpt aan strikte groeiregulerende mechanismen: ze zorgen ervoor dat bij groei en ontwikkeling individuele organen tot hun normale afmetingen
groeien. Zodra die bereikt zijn, blijft er in de meeste
weefsels een zekere activiteit aan celdeling bestaan: die
staat in voor vervanging van afstervende cellen en verzekert dus het behoud van de weefselhomeostase. Het
dunnedarmepitheel en het hematopoëtische systeem
worden gekenmerkt door een extreem snelle turnover,
terwijl de celturnover in andere weefsels, zoals de nieren, de endocriene organen en het endotheel, veel
lager is. Zeer sterk gedifferentieerde weefsels, zoals
spiercellen of neuronen, verliezen zelfs het vermogen
om te delen. Bij een volgroeid organisme is er blijvende
nood aan aanpassing aan wisselende situaties, zoals
weefselschade. Spierweefsel dat zijn delingscapaciteit
verloren heeft, reageert op een verhoogde belasting
met hypertrofie. Dit betekent een toename van het
volume van de individuele spiercellen, bv. hartspierhypertrofie en skeletspierhypertrofie door toegenomen
fysieke inspanningen bij atleten of hartspierhypertrofie bij hypertensiepatiënten. Hyperplasie, een toename
van het aantal cellen in het betreffende orgaan, is
een andere manier om aan gewijzigde behoeften tegemoet te komen, bv. de neutrofiele leukocytose die
optreedt bij infecties, vooral van bacteriële oorsprong.
Als de beschadiging hersteld is of het uitlokkende fenomeen verdwenen is, komen deze adaptieve mechanismen opnieuw tot rust: hieruit blijken de adaptiviteit
en de reversibiliteit van zo'n proces. Weefsels bezitten
dus het vermogen zich op een flexibele en dynamische
manier aan te passen aan wisselende omstandigheden: dit berust op een delicate balans van groeistimulerende en groei-inhiberende signalen die vanuit het
extracellulaire milieu op de individuele cellen inwerken.
2 Neoplastische groei
Kankercellen en hun nakomelingen reproduceren
zich zonder de beperkingen van normaal weefsel. Ze
groeien onafhankelijk van de normale verankering
('anchorage-independent') en zijn ongevoelig voor beperkingen van populatiedensiteit. Men spreekt in dit
geval van een neoplasie. Neoplasieën ontstaan dus als
het aantal cellen in een weefsel op een onaangepaste
manier toeneemt: d.w.z. zonder dat dit tegemoetkomt
aan een fysiologische stimulus, zoals ontwikkeling, necrose, groei, infectie of belasting. In tegenstelling tot
hyperplasie of hypertrofie is een neoplastisch proces in
principe irreversibel: het is geen antwoord op, en dus
niet afhankelijk van, een uitlokkende stimulus, maar
berust daarentegen op verworven storingen in de
groeistimulerende of groeiremmende processen en de
daarmee verbonden cascades (zie ook hoofdstuk 3-6).
Figuur 1.1 illustreert hoe fouten in de regulatie van de
celdeling vanaf een stamcel aanleiding kunnen geven
tot tumoren. Figuur 1.2 illustreert hoe verstoring in de
celdeling in de basale laag van huidepitheel aanleiding
kan geven tot huidkanker.
A
Figuur 1.1
B
C
Normale en verstoorde controle van cellen
vanuit stamcellen
A Normale strategie voor het produceren van nieuw gedifferentieerde stamcellen
B Stamcellen falen bij het produceren van één niet-stamceldochter en vormen een ongedifferentieerde tumor.
C De dochterstamcellen slagen er niet in om normaal te differentiëren. Ze blijven prolifereren en vormen een tumor.
1
Kenmerk
Benigne
tumor
Maligne
tumor
begrenzing
scherp
onregelmatig
frequent
zelden
niet-invasief
invasief
laag
hoog
necrose
zelden
frequent
differentiatie
goed
slecht
mitotische activiteit
laag
hoog
metastasering
niet
wel
kapsel
groeiwijze
groeisnelheid
Tabel 1.1
Figuur 1.2 Normale en maligne groei van huidepitheel
Bij normale epitheliale groei (links) is er proliferatie in de basale
laag van het epitheel. Naarmate de onderste lagen van de endotheelcellen opschuiven, veranderen de cellen van vorm en verliezen
ze de capaciteit om te delen. Bij tumorgroei (rechts) is dit proces
verstoord en behouden sommige cellen hun delingscapaciteit. De
celdeling is niet in evenwicht met de celdifferentiatie waardoor er
een progressieve stijging is van het aantal delende cellen.
3 Invasief en metastatisch gedrag
Het is de combinatie van twee belangrijke eigenschappen, nl. onbeperkte groei en irreversibiliteit, die kankercellen zo gevaarlijk maakt. Als de proliferatie niet
meer gecontroleerd is, wordt een tumor gevormd en
spreekt men van een neoplasma. Goedaardige tumoren vertonen geen invasief gedrag, in tegenstelling tot
maligne tumoren. Een chirurgische ingreep kan in dit
stadium voor een volledige verwijdering van de tumor
zorgen. Als de cellen het omliggende weefsel echter
invaderen, spreekt men van een kwaadaardig of maligne letsel (zie tabel 1.1).
Wat is kanker?
Onderscheid tussen benigne en maligne
tumoren
Gewoonlijk impliceert metastase ook dat de cellen loskomen van de initiële tumor; ze groeien door de basale membraan of het orgaankapsel heen om andere
weefsels te invaderen. Ze zaaien via het lymfestelsel of
de bloedbaan uit naar andere weefsels waar ze nieuwe gezwellen vormen en nieuwe symptomen kunnen
veroorzaken. Metastaserende kankercellen verspreiden
zich over het hele lichaam en zijn hierdoor moeilijk te
verwijderen. Metastase is een multistappenproces dat
verschillende moleculaire interacties vereist (zie figuur
1.3). Longen, lever en bot zijn frequente sites voor metastatische letsels, terwijl metastasen in spierweefsel en
miltweefsel zeldzaam zijn. Goedaardige gezwellen zijn
goed omkapseld: ze invaderen de omliggende weefsels niet en zaaien niet uit naar weefsels op afstand. Dit
aspect zal verder behandeld worden in hoofdstuk 9.
Benigne tumoren kunnen onderscheiden worden van
maligne tumoren op basis van een aantal verschillen
(zie ook tabel 1.1).
De meeste van deze verschillen zijn relatief, afhankelijk
van het weefseltype, en soms is het moeilijk te differentiëren tussen benigne en maligne groei.
Figuur 1.3 Metastaseproces
Slechts een klein percentage van de kankercellen kan de verschillende stadia van het metastaseproces succesvol doorlopen.
43
44
DEEL 1 WAT IS KANKeR?
De mogelijkheid van kankercellen om zich te verspreiden is gebaseerd op twee verschillende mechanismen:
invasie en metastasering. Invasie is de directe migratie
en penetratie van kankercellen in naburige weefsels,
terwijl metastase de mogelijkheid is van kankercellen
om in de bloedstroom te geraken, naar ver gelegen
weefsels te migreren en daar metastasen te vormen
die fysisch niet verbonden zijn met de primaire tumor
(figuur 1.3). Paget (figuur 1.4) was de eerste om aan
te tonen dat tumorcellen niet random metastaseren,
maar naar zeer specifieke sites.
Bij invasie hebben verschillende mechanismen een
belangrijke rol: de cel-celinteractie tussen de kankercellen vermindert. Een cruciale molecule hiervoor is Ecadherine (sterk invasieve kankers hebben gewoonlijk
minder E-cadherine dan normale cellen). Bovendien
moet er een verhoogde gerichte motiliteit van de cellen zijn. Chemoattractanten zijn belangrijke moleculen
die de kankercellen kunnen aantrekken. De kankercellen zullen ook proteasen aanmaken die extracellulaire
matrix kunnen afbreken. Een kritische barrière waar de
tumorcellen meestal door moeten, is de lamina basalis,
die de epitheliale lagen scheidt van andere, onderliggende weefsels (zie ook hoofdstuk 9).
4 Selectie van de tumorcellen
Figuur 1.4
Paget (The Lancet, 1889) was de eerste om aan te tonen dat kankercellen niet random metastaseren, maar naar preferentiële sites
gaan. Hij noemde dit de ‘seed and soil’ hypothese
(zie ook hoofdstuk 9).
Zoals hierboven vermeld, begint een tumor met één
cel. Deze cel heeft verschillende ronden van mutaties
en natuurlijke selectie ondergaan en resulteert vervolgens in een cel met verschillende fysiologische behoeften van een normale cel, zoals groeimogelijkheden in
hypoxische omstandigheden (zie ook hoofdstuk 9)
met weinig nutriënten en de mogelijkheid om de natuurlijke barrières van een normaal weefsel te doorbreken. Zo ontstaat een dominante kloon (figuur 1.5).
De snelheid van evolutie van een populatie hangt
van verschillende factoren af: de mutatiesnelheid (de
probabiliteit per gen en per tijdseenheid om een genetische verandering te ondergaan), het aantal individuen in de populatie, de snelheid van reproductie
(het aantal generaties nakomelingen per tijdseenheid),
het selectieve voordeel van de mutanten (de ratio van
het aantal overlevende fertiele nakomelingen van de
mutanten op het aantal overlevende fertiele nakomelingen van de non-mutanten). Deze kritische factoren
tellen zowel voor de evolutie van kankercellen in een
multicellulair organisme als voor alle levende organismen op aarde.
De meerderheid van de humane kankers heeft een verhoogde mutatiesnelheid (zie ook hoofdstuk 3, 4 en 7).
Deze instabiliteit kan verschillende vormen aannemen:
sommige kankercellen kunnen hun lokale DNA-schade
of hun replicatiefouten niet herstellen. Deze cellen accu-
1
muleren meer puntmutaties en kleine veranderingen in
DNA-sequenties dan normale cellen. Andere kankercellen hebben problemen met de integriteit van hun chromosomen en vertonen dan ook grote karyotypische
abnormaliteiten. Hoe groter de initiële kloon van gemuteerde cellen is, hoe meer kans er is dat een bijkomende
mutatie voor een meer aggressieve variant zal zorgen.
Wat is kanker?
De zes verworven eigenschappen die een cel tot een
kankercel transformeren, zijn:
1 De cellen negeren de externe en interne signalen
die celproliferatie reguleren.
2 De cellen vermijden apoptotische celdood.
3 De cellen omzeilen geprogrammeerde beperkingen van proliferatie en differentiatie.
4 De cellen zijn genetisch instabiel.
5 De cellen ontsnappen uit hun initiële weefsel (ze
zijn invasief).
6 De cellen overleven en delen in vreemde weefsels
(ze metastaseren).
5 Hoe manifesteert kanker zich in een
patiënt?
A Normale cellen
B Cellen met een optimale genetische instabiliteit
C Cellen met te veel genetische instabiliteit
Figuur 1.5 Genetische instabiliteit en tumorprogressie
Cellen met een optimaal niveau van genetische stabiliteit zijn het
meest succesvol om een tumor te vormen.
A In normale cellen is de intrinsieke genetische instabiliteit laag.
Als deze cellen een selectiebarrière tegenkomen, zoals lage
zuurstofconcentraties, is hun mutatieniveau te laag om een
cel te produceren die deze selectiebarrières kan overleven en
verder prolifereert.
B In tumorcelprecursoren zorgt een verhoogd niveau van
genetische instabiliteit voor een verhoogde kans dat er cellen
ontstaan die de nodige genetische veranderingen ondergaan
om de twee selectiebarrières te overleven. Deze genetische
instabiliteit blijft bewaard in de tumor.
C Bij een teveel aan genetische instabiliteit prolifereren de cellen
niet voldoende of worden ze veel gevoeliger voor celdood.
Deze verhoogde mutatiesnelheid kan dus leiden tot het verdwijnen van deze populatie cellen.
Mutaties kunnen een invloed hebben op het aantal
cellen. In normale weefsels is er een evenwicht tussen
celdeling en celdood (en dit laatste vooral door apoptose). Veranderingen die de normale maturatie van
cellen naar een niet-delende, terminaal gediffentieerde
staat blokkeren of die een normale, geprogrammeerde
celdood inhiberen, spelen een belangrijke rol bij heel
wat kankers (zie ook figuur 1.1 en hoofdstuk 6).
Normale cellen prolifereren onder invloed van groeifactoren. Kankercellen worden dikwijls onafhankelijk
van deze groeifactoren door defecten in de signaaltransductie waardoor er constante signalen zijn die de
celdeling stimuleren. Verstoringen in de controle van
de celcyclus dragen ook bij tot een ongelimiteerde
proliferatie van de kankercellen (zie ook hoofdstuk 3).
Niet alle kwaadaardige aandoeningen groeien als ‘gezwellen’: bij leukemie worden de leukemische cellen in
het beenmerg gevormd en als individuele cellen in de
bloedbaan losgelaten, net zoals bij normale bloedcellen. Zeldzaam kunnen leukemische cellen evenwel ook
als een solide weefselmassa groeien (‘chloromen’ bij
chronische of acute myeloïde leukemie). Lymfomen,
tumoren van het lymfoïde systeem, kunnen zich voordoen als kliergezwellen of als leukemisch uitgezaaide
aandoeningen.
De klinische manifestaties van een gezwel op zich kunnen multipel zijn, afhankelijk van het orgaan/de organen en/of de locatie(s) waar ze zich voordoen. Al te vaak
blijven tumoren een lange tijd onopgemerkt aanwezig
(zie hoofdstuk 2 en 12). Een van de grote uitdagingen
voor de preventieve geneeskunde bestaat erin deze
asymptomatische gezwellen tijdig op te sporen zodat
ze nog met curatieve doeleinden behandeld kunnen
worden. Gezwellen van de huid en van onderhuidse
weefsels kunnen palpabel zijn (bv. het mammacarcinoom). Groei van een gezwel in een niet-expandeerbare ruimte, bv. de schedelholte of het spinale kanaal,
kan leiden tot overdruk (intracraniële overdruk: hoofdpijn, nausea, papiloedeem, eventuele neurologische
uitval) en compressiesymptomen (uitval van perifere
en centrale zenuwbanen met neurologische uitval). Tumoren in holle organen (respiratoire tractus, gastro-intestinale tractus, biliaire tractus, urogenitale tractus …)
kunnen de oorzaak zijn van abnormaal bloedverlies of
diverse obstructiefenomen. Ook kan door de aanwezigheid van een gezwel of maligniteit de functie van
een orgaan in het gedrang komen (bv. botpijnen of
pathologische fractuur bij skeletale aandoeningen;
pancytopenie met hypoxie, vatbaarheid voor infecties,
bloedingen bij acute leukemie; malabsorptie bij darmlymfomen; hypoxie bij longtumor; karakterstoornissen
bij intracraniële tumoren).
45
46
DEEL 1 WAT IS KANKER?
Benigne neoplasieën lijken in principe goed op het
weefsel waaruit ze ontstaan zijn: ze zijn goed gedifferentieerd. Maligne neoplasieën kunnen een breed
spectrum bestrijken van veeleer goed gedifferentieerd
naar matig gedifferentieerd tot ongedifferentieerd. In
de overgangszone tussen goed- en kwaadaardig bevinden zich de ‘dysplastische’ letsels. Het bestaan van
dysplasie in een weefsel is een uiting van bestaande
weefselbeschadiging, die weliswaar nog niet geleid
heeft tot tumorale transformatie, maar vaak ‘premaligne’ of ‘precancereus’ is: de kans dat zich uit een dergelijk letsel een maligne aandoening ontwikkelt, is duidelijk verhoogd (bv. actinische keratose van de huid,
dysplasie van bronchusepitheel, barrettmetaplasie van
de slokdarm). Soms is het door verregaande dedifferentiatie zelfs niet mogelijk uit een metastatisch letsel
de histologische aard van de primaire tumor te achterhalen. Niet-gedifferentieerde tumoren gedragen zich
meestal agressiever dan beter gedifferentieerde.
De differentiatiegraad van een weefsel wordt beoordeeld op grond van een aantal cytologische parameters: de verhouding tussen de grootte van nucleus
en cytoplasma, de zichtbaarheid van de nucleoli, de
densiteit van de nucleus, de mitosefiguren, de basofilie
van het cytoplasma, de aanwezigheid van weefselspecifieke granules, de variabiliteit van de celgrootte. Er is
een biologisch spectrum tussen goed- en kwaadaardig
en het is niet altijd eenvoudig de aard van een staal
exact te typeren. Dit kan geïllustreerd worden aan de
hand van het volgende voorbeeld. Bij de beoordeling
van uitstrijkjes van de baarmoederhals (screening naar
baarmoederhalskanker) (figuur 1.6) gebruikt men het
Bethesdasysteem (2001). Men onderscheidt hierin
enerzijds ‘negatief voor epitheliale laesies of maligniteiten’ en anderzijds ‘epitheelcelafwijkingen’. Hierin
zijn er squameuze epitheliale afwijkingen en glandulaire epitheliale afwijkingen (zie ook hoofdstuk 12).
Bij de squameuze epitheliale afwijkingen onderscheidt
men:
• atypische squameuze cellen van onbekende betekenis (ASC-US: ‘atypical squamous cells of undetermined significance’);
• atypische squameuze cellen waarbij een hooggradige squameuze intra-epitheliale laesie niet uitgesloten kan worden (ASC-H);
• laaggradige squameuze intra-epitheliale laesie (LSIL);
• hooggradige squameuze intra-epitheliale laesie
(HSIL);
• plaveiselcelcarcinoom.
Bij de glandulaire afwijkingen onderscheidt men:
• atypische endocervicale cellen niet anders gespecificeerd (NOS, ‘not otherwise specified’);
• atypische endometriale cellen NOS;
• atypische glandulaire cellen NOS;
• atypische endocervicale cellen met voorkeur voor
maligniteit;
• atypische glandulaire cellen met voorkeur voor maligniteit;
• endocervicaal adenocarcinoom in situ;
• endocervicaal adenocarcinoom;
• endometriaal adenocarcinoom;
• extra-uterien adenocarcinoom;
• adenocarcinoom NOS.
Figuur 1.6
Uitstrijkjes van baarmoederhals: links een
normale cytologie en rechts een zwaar
afwijkende cytologie
(Met dank aan de dienst Pathologische ontleedkunde Onze-LieveVrouwziekenhuis Aalst.)
De meeste kankercellen zijn afkomstig van één abnormale cel; zelfs als de kankercellen gemetastaseerd zijn,
blijken ze afkomstig van één tumor en zelfs van één
cel. Om na te gaan of verschillende kankercellen van
één tumor afkomstig zijn, kan men chromosomale afwijkingen gaan opsporen. Zo kan men bijvoorbeeld bij
patiënten met chronische myeloïde leukemie kwaadaardige lymfocyten van goedaardige onderscheiden
door een specifieke chromosomale afwijking, nl. het
philadelphiachromosoom, waarbij er een translocatie
is van chromosoom 9 → 22. (figuur 1.7).
Figuur 1.7
De translocatie tussen chromosoom 9 en 22 is verantwoordelijk voor chronische myeloïde leukemie. Het kleinste abnormale
chromosoom dat hier ontstaat, wordt philadelphiachromosoom
genoemd naar de stad waar deze abnormaliteit voor het eerst
beschreven is.
1
6Tumorclassificatie
Een correcte en bruikbare classificatie van tumoren
is van het allergrootste belang omdat op die manier
de aard van een ziekte benoemd wordt en op grond
hiervan ook de correcte behandeling gepland kan
worden. De syntaxis van de tumornomenclatuur codeert het oorspronkelijke weefseltype (mesenchymaal, epitheliaal, reticulo-endotheliaal), het karakter
van de tumor (benigne of maligne), het orgaan van
oorsprong, soms aangevuld met het groeipatroon.
Goedaardige tumoren van plaveiselepithelen zijn papillomen, van klierepithelen adenomen. Kwaadaardige
tumoren van epithelen zijn carcinomen: plaveiselcelcarcinomen, basaalcelcarcinomen, adenocarcinomen
(als het oorspronkelijke weefsel een exocriene klier of
een slijmnapepitheel is). Tumoren van mesenchymale
oorsprong worden benoemd naar het oorspronkelijke weefseltype gevolgd door ‘-oom’ voor goedaardige aandoeningen, ‘-sarcoom’ voor kwaadaardige
aandoeningen. In het zenuwstelsel kunnen eveneens
goedaardige en kwaadaardige tumoren voorkomen.
Tumoren van neuronen doen zich alleen bij het embryo of het jonge kind voor (als neuroblastomen of
retinoblastomen). Alle andere tumoren van het zenuwstelsel ontstaan uit niet-neuronale steunweefsels
van het hersenparenchym of de perifere zenuwen. Dit
impliceert dat bij volwassen patiënten hersentumoren
in principe uitgaan van steunweefsels (bv. acusticusneurinomen, glioblastomen) en niet van neuraal weefsel stricto sensu. Op jonge leeftijd blijven in zenuwweefsel of spierweefsel nog stamcellen bestaan, die
dus bij kinderen de oorsprong kunnen zijn van tumo-
Wat is kanker?
ren van het spierstelsel (rhabdomyosarcomen) of het
zenuwstelsel (medulloblastomen, neuroblastomen,
retinoblastomen).
De classificatie van de tumoren van het hematopoëtische en lymfoïde systeem is uitermate gecompliceerd
en is onlangs herzien (WHO-classificatie 2008). Het
hematopoëtische en vooral het lymfoïde systeem bevatten cellen in diverse stadia van rijping, en aan veel
van deze rijpingsstadia beantwoordt een maligne tegenhanger, met een specifiek biologisch gedrag en
dus een specifieke naam. Er wordt een onderscheid
gemaakt tussen myeloïde neoplasmen (met acute en
chronische leukemieën als voornaamste groepen) en
lymfoïde neoplasmen. Deze laatste kan men onderverdelen volgens de cel van origine (T/B/NK) en volgens
het rijpingsstadium waaruit de aandoening ontstaan
is (precursor B- en T-neoplasmen (uit voorlopercellen)
versus mature B- en T-neoplasmen (uit mature cellen)).
Sommige van deze aandoeningen situeren zich in het
beenmerg om leukemisch uit te zaaien (‘leukemieën’),
sommige ontstaan in de perifere lymfoïde organen en
geven dan aanleiding tot klierzwellingen (‘lymfomen’),
weer andere vertonen beide groeipatronen. Omdat de
huidige WHO-classificatie vooral de nadruk op genetische of biologische entiteiten wil leggen, wordt nu
minder de nadruk gelegd op het onderscheid tussen
lymfoom en leukemie. Tumoren van het hematopoëtische stelsel zijn in principe altijd uitgezaaid en worden
daarom onder de maligne neoplasmen gerangschikt.
Er bestaat echter een breed spectrum van indolente
(traag evoluerende) tot zeer agressieve aandoeningen
(tabel 1.2).
47
48
DEEL 1 WAT IS KANKER?
Oorspronkelijk weefsel
Oorspronkelijke cel
Benigne tumor
Maligne tumor
plaveiselcelpapilloom
plaveiscelcarcinoom
Epitheel
plaveiselepitheel
Huid
Mond, tong, slokdarm
Maag, dunne darm, dikke
darm
basale cellen
basaalcelcarcinoom
melanocyt
naevus
maligne melanoom
plaveiselepitheel
papilloom
(plaveiselcel)carcinoom
papillair adenoom
(adeno)carcinoom
adenoom
(adeno)carcinoom
bindweefsel
fibroom
fibrosarcoom
vetweefsel
lipoom
liposarcoom
bot
osteoom
osteosarcoom
kraakbeen
chondroom
chondrosarcoom
gladde spier
leiomyoom
leiomyosarcoom
gestreepte spier
rhabdomyoom
rhabdomyosarcoom
bloedvatendotheel
hemangioom
hemangiosarcoom
slijmnapepitheel (in maag)
slijmbekercellen in dunne en
dikke darm
Lever, nier, prostaat, schildklier, pancreas
Mesenchym
Zenuwstelsel
neuronen
neuroblastoom
retinoblastoom
meningen*
meningeoom
zenuwschede*
neurofibroom
glia*
neurofibrosarcoom
glioblastoom
Hematopoëtisch stelsel
acute myeloïde leukemie
Myeloïd
chronische myeloïde leukemie
• B-lymfoblastische leukemie/
lymfoom
Lymfoïd
• T-lymfoblastische leukemie/
lymfoom
mature B-celneoplasmen
mature T-/NK-neoplasmen
* Qua oorsprong zijn dit mesenchymale weefsels.
Tabel 1.2
Nomenclatuur van enkele tumoren
1
Experimenteel luik
Het onderzoek naar de mechanismen die aan de basis liggen van de pathofysiologie van kanker eist cellulair materiaal, zowel om genetische analyses te doen als functionele experimenten met de kankercellen al dan niet
in cocultuur met andere cellen. Het grote voordeel van
deze in-vitro-experimenten is dat de omgeving (en vooral
de fysicochemische eigenschappen) goed gecontroleerd
zijn. Bovendien is er ook geen invloed meer van andere
lichaamscellen en wordt de studie van de celfunctie, het
metabolisme of het differentiatieproces vereenvoudigd.
In deze context wordt het ook eenvoudiger om de interactie tussen een bepaalde cel en een agens (bv. een
nieuw geneesmiddel) te bestuderen. Gezien de kleine volumes heeft men minder reagentia nodig dan bij in-vivoexperimenten. In vivo gaat er immers meer dan 90 % van
de toegediende stoffen verloren door distributie over de
weefsels en door secretie. Nadelen van in-vitroculturen
zijn dan dat men steriele kweekomstandigheden nodig
heeft (met uiteraard ook de nodige infrastructuur) met
complexe media. Finaal heeft men ook de extrapolatie
van in vitro naar in vivo. De cellen zijn immers van een
driedimensionaal in-vivosysteem naar een tweedimensionaal in-vitrosysteem gebracht. Hierbij zijn verschillende
celinteracties en micro-omgevingen verloren gegaan (en
zijn er ook geen neuro- of endocriene regulaties in vitro).
In dit deel zal vooral aandacht gegeven worden aan de
methodes van isolatie en zuivering van cellen. Zodra deze
cellen in cultuur gebracht zijn, kunnen verdere experimenten uitgevoerd worden om proliferatie (hoofdstuk
4), apoptotische (hoofdstuk 6) en genetische eigenschappen (hoofdstuk 3 en 7), en de interacties met de microomgeving, zoals inductie van botziekte en angiogenese
(hoofdstuk 9), te bestuderen. Gevoeligheden voor therapieën, zoals radiotherapie en chemotherapie, worden
ook in een later hoofdstuk besproken (hoofdstuk 13).
In een tweede deel zal kort aangehaald worden welke
transplantatiemodellen beschikbaar zijn. Transgene modellen worden later behandeld (hoofdstuk 3).
Celisolatie
De celbiologische studie van de kankercel vereist de isolatie en zuivering van die kankercel. Kankercellen kunnen
uit een patiëntenstaal of uit een proefdiermodel geïsoleerd worden.
Naargelang van de opbouw kan men drie types weefsel
onderscheiden:
1 Weefsels waarin de cellen al loszitten, zoals bloed.
Dat is eigenlijk al een ‘single cell’ suspensie. Uit bloed
kan men met sedimentatie en gradiëntcentrifugatie
de verschillende celtypes isoleren.
Wat is kanker?
2 Cellen die georganiseerd zijn in een weefsel, zoals in
de lever, de pancreas en de nier. Deze isolatiemethodes zijn uiteraard ingewikkelder.
3 Cellen die min of meer vastzitten, zoals longmacrofagen, peritoneale macrofagen, beenmerg- en miltcellen, die met gewoon uitwassen met een isotone
oplossing vrijkomen.
Gezien de sterk verschillende architectuur en samenstelling van de verschillende organen is het niet mogelijk om
een standaardprocedure te ontwikkelen. Afhankelijk van
de cel-celinteracties en de interacties met de extracellulaire matrix, zoals collageen, kan men verschillende isolatiemethoden ontwikkelen. Algemeen kan men stellen
dat de eerste stap het afbreken is van de extracellulaire
matrix die de cellen bijeenhoudt. Hiervoor moeten de
nodige enzymen in voldoende hoeveelheden ter beschikking zijn. Voor een goede digestie moet het enzym in
het orgaan kunnen binnendringen. Men kan het orgaan
hiervoor in zo klein mogelijke stukken (1 tot 2 mm) verdelen voor men het met de enzymen incubeert. Een beter
alternatief is het enzym, indien mogelijk, in het orgaan
te brengen via de bloedbaan, dus door perfusie. Na de
enzymatische digestie wordt het weefsel verder gedissocieerd: ofwel mechanisch (homogeniseren, schudden,
vortexen, herhaaldelijk opzuigen en uitblazen met een
pasteurpipet of fijne naald), ofwel chemisch (door het
weglaten van divalente kationen (Ca2+, Mg2+) uit de oplossing, eventueel zelfs door het toevoegen van chelatoren, zoals ethyleendiaminotetra-acetaat (EDTA), die het
vrije Ca2+ binden (of cheleren)), ofwel enzymatisch (hierbij
wordt de extracellulaire matrix verteerd door enzymen,
zoals collagenase, pronase, trypsine (werd het eerst gebruikt), hyaluronidase, papaïne en DNase).
Gewoonlijk bestaat een celisolatieprocedure van een vast
weefsel uit:
1 het verwijderen van vet en necrotisch weefsel;
2 het in kleine stukjes knippen van het weefsel (of een
perfusiedigestie) en de incubatie met enzymen of
een combinatie van een enzymatische of chemische
behandeling om de intercellulaire verbindingen te
verzwakken gevolgd door een mechanische behandeling om de cellen los te maken uit de verzwakte
matrix. De enzymen worden dan verwijderd door de
cellen te centrifugeren en het bovenstaande medium
te verwijderen (‘wassen’). Na de isolatie moeten vrij
complexe media gebruikt worden die de samenstelling van bloedplasma nabootsen.
Celscheiding
Na isolatie moeten de cellen gescheiden worden. Afhankelijk van de eigenschappen van de cellen die je wilt isoleren en van de omliggende cellen kunnen verschillende
49
50
DEEL 1 WAT IS KANKER?
technieken gebruikt worden om cellen te scheiden. Dat
kan op basis van fysische, chemische (immunologische)
of morfologische eigenschappen.
Fysische methodes
Een van de parameters die gebruikt kan worden voor de
scheiding van cellen is de ‘densiteit’. De meest gebruikte
toepassing hiervan is centrifugatie, al dan niet op een
gradiënt. Een gewone centrifugatie met lage g (of zelfs
de gravitatiekracht (g = 1) ) kan op zich al cellen scheiden.
Zo kan men bijvoorbeeld de zware leverparenchymcellen
scheiden van de niet-parenchymale cellen door sedimentatie (g = 1). Meestal worden echter gradiënten gebruikt.
De cellen sedimenteren in een densiteitsgradiënt tot een
evenwichtspositie waarbij hun densiteit gelijk is aan die
van de gradiënt. Bij een bepaalde centrifugale kracht en
viscositeit van de gradiënt is de sedimentatiesnelheid dus
evenredig met de grootte van de partikels en met het
verschil in densiteit tussen die van het partikel en die van
het omringende medium. De gebruikte gradiënten moeten fysiologisch (iso-osmolair, ionensterkte en pH), niettoxisch (dus niet doordringbaar door de celmembraan)
en niet-visceus zijn bij hoge snelheden; verder moeten ze
ook steriliseerbaar zijn en gemakkelijk verwijderbaar na
de procedure.
Er zijn twee types gradiëntcentrifugatie:
1 Isopycnische centrifugatie. De dichtheidsrange van
de gradiënt bestrijkt hier het volledige gebied van
dichtheden van de te scheiden deeltjes. Elk deeltje
zal sedimenteren tot het in evenwicht is, dus tot de
plaats waar de dichtheid van het deeltje gelijk is aan
de dichtheid van het medium.
2 Zonale centrifugatie. Hier berust de scheiding op het
verschil in afmetingen en dichtheden tussen de deeltjes. De dichtheidsgradiënt wordt zodanig gekozen
dat de dichtheid van de deeltjes in elk punt van de
oplossing groter is dan die van het medium. De centrifugatie wordt dan gestopt voor de verschillende
zones de bodem bereiken.
Immunologische methodes
Een belangrijke eigenschap die voor de zuivering van cellen gebruikt kan worden, is de expressie van bepaalde
antigenen en de bindingseigenschappen van specifieke
antilichamen aan deze antigenen. Verschillende technieken die deze antigenexpressie gebruiken, zijn panning,
sefarosekolom en FACS.
Bij panning wordt de cultuurbodem met een bepaald antilichaam gecoat. Alle cellen die het antigen (dat specifiek
reageert met het antilichaam) uitdrukken, blijven hechten; de andere gaan eraf na het spoelen met een warm
medium. Bij een sefarosekolom wordt een analoge methodologie gebruikt; hier worden sefarosekorrels gecoat
met het antilichaam en worden de niet-hechtende cellen
uit de kolom geëlueerd.
Bij ‘magnetic beads’ worden magnetische bolletjes gecoat met een antistof (figuur 1.8). Als de reageerbuis
tegen de magneet gehouden wordt, migreren de cellen
met het bolletje naar de kant van de magneet. De andere
cellen worden weggewassen.
Figuur 1.8
Negatieve (links) en positieve (rechts)
selectie via microbeads
Bij negatieve selectie worden de niet-doelwitcellen gemerkt
met een specifiek antilichaam gekoppeld aan microbeads. Die
worden op de magneet tegengehouden en de doelwitcellen
lopen door de kolom en worden opgevangen. Bij positieve
selectie worden de doelwitcellen gemerkt met een specifiek
antilichaam gekoppeld aan microbeads. Die blijven op de kolom achter terwijl de ongemerkte cellen door de kolom lopen.
De kolom wordt vervolgens uit de magneet gehaald en de
doelwitcellen worden in een aparte fractie opgevangen.
(Naar brochure van Miltenyi.)
‘Fluorescence activated cell sorting’ (FACS) is een van
de meer gesofistikeerde technieken van celscheiding
die antilichamen gebruikt die gebonden zijn aan een
fluorochroom. De gemerkte cellen kunnen dan van de
niet-gemerkte cellen gescheiden worden met behulp van
een elektronische ‘fluorescence activated cell sorter’, afgekort FACS. Flowcytometrie kan gedefinieerd worden
als geautomatiseerde analyse van individuele cellen door
belichting in een vloeistofstroom. De gesofistikeerde en
multidisciplinaire apparatuur die hiervoor gebruikt wordt
(de FACS), bestaat o.a. uit een of meer lasers en staat in
voor de analyse van individuele cellen of partikels. Een
lichtbundel met sterke focus belicht de cellen die op hun
beurt in de vloeistofkolom gecentreerd worden. Simultaan worden verschillende fysicochemische eigenschappen van elke cel, zoals lichtverstrooiing, fluorescentie en
celvolume, gemeten. Dat gebeurt met een zeer hoge