Tierärztliche Hochschule Hannover Die Bedeutung der
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Tierärztliche Hochschule Hannover Die Bedeutung der Langerhanszell-Migration in der allergischen Kontaktdermatitis INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Nadine Andrick Iserlohn Hannover 2009 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer, Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie 1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer 2. Gutachter: Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2009 Meinen lieben Eltern gewidmet 1 EINLEITUNG........................................................................................................... 1 2 LITERATURÜBERSICHT ....................................................................................... 2 2.1 Antigenpräsentierende Zellen ........................................................................................................................ 2 2.1.1 Dendritische Zellen ................................................................................................................................... 2 2.1.2 Ontogenese ................................................................................................................................................ 3 2.1.3 Morphologie und Vorkommen dendritischer Zellen ................................................................................. 5 2.1.4 Vorkommen, Struktur und Entwicklung der Langerhanszelle .................................................................. 6 2.1.5 Migration und Reifung .............................................................................................................................. 8 2.1.6 Priming und Proliferation naiver T-Zellen ................................................................................................ 9 2.1.7 Regulation der Immunantwort................................................................................................................. 11 2.1.7.1 Th1/Th2-Immunantwort .................................................................................................................. 11 2.1.7.2 Toleranz........................................................................................................................................... 12 2.1.8 Rolle und Funktion regulatorischer T-Zellen .......................................................................................... 14 2.1.9 Abgrenzung der Langerhanszelle von der dermalen dendritischen Zelle................................................ 15 2.1.10 Die Rolle der Langerhanszelle in der allergischen Dermatitis .............................................................. 18 2.2 Aufnahme von Antigen ................................................................................................................................. 19 2.2.1 Rezeptorvermittelte Endozytose.............................................................................................................. 20 2.2.2 Langerin .................................................................................................................................................. 21 2.3 Die Haut als Immunorgan ............................................................................................................................ 23 2.3.1 Aufbau der Haut ...................................................................................................................................... 23 2.3.2 Die Epidermis.......................................................................................................................................... 23 2.3.3 Immunologische Grenzfläche Haut ......................................................................................................... 26 2.4 Die allergische Kontaktdermatitis ............................................................................................................... 26 2.4.1 Die Kontaktallergene............................................................................................................................... 27 2.4.2 Die Sensibilisierungsphase...................................................................................................................... 27 2.4.3 Die Auslösephase (Challenge) ................................................................................................................ 28 2.4.4 TDI-Kontaktallergiemodell ..................................................................................................................... 29 2.4.5 DNCB-Kontaktallergiemodell................................................................................................................. 30 2.5 Die irritative Kontaktdermatitis .................................................................................................................. 31 2.5.1 Sodiumdodecylsulfat (SDS) als Hautirritans........................................................................................... 32 3 MATERIAL UND METHODEN.............................................................................. 34 3.1 Geräte für Versuche in der Zellkultur ........................................................................................................ 34 3.2 Reagenzien für Versuche in der Zellkultur ................................................................................................ 34 3.3 Geräte/Reagenzien für Cytospin.................................................................................................................. 35 3.4 Geräte/Reagenzien für ELISA ..................................................................................................................... 35 3.5 Geräte für die FACS-Analyse ...................................................................................................................... 35 3.6 Reagenzien für die FACS-Analyse............................................................................................................... 36 3.7 Hergestellte Puffer und Lösungen ............................................................................................................... 36 3.8 Immunhistochemie........................................................................................................................................ 37 3.9 In-vivo-Versuche............................................................................................................................................ 38 3.10 Versuchstiere ............................................................................................................................................... 38 3.11 In-vivo-Versuche zur Kontaktdermatitis .................................................................................................. 39 3.11.1 Versuchsübersicht ................................................................................................................................. 39 3.11.2 Toluen-2,4-diisocyanat (TDI)-Kontaktallergiemodell........................................................................... 41 3.11.3 2,4-Dinitrochlorobenzol (DNCB)-Kontaktallergiemodell..................................................................... 42 3.11.4 Versuche zur Migration von Langerhanszellen in der Sensibilisierung ................................................ 43 3.11.5 Mouse Ear Swelling Test ....................................................................................................................... 44 3.11.6 Skin DC Migration Assay ...................................................................................................................... 44 3.11.7 Trypsinierung der Ohrepidermis ........................................................................................................... 45 3.11.8 Local Lymph Node Assay (LLNA) ........................................................................................................ 46 3.11.9 In-vitro-Stimulierung der LN-Zellen mit Concanavalin A.................................................................... 46 3.11.10 Bestimmung der IL-6-, IFN-γ-und IL-10-Konzentration mittels ELISA ............................................ 46 3.11.11 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)...................................................................................... 47 3.11.12 Cytospin .............................................................................................................................................. 48 3.11.13 Immunhistochemische Erfassung der Dichte der MHCII/Langerin+ -Zellen ...................................... 49 3.12 Statistische Auswertung.............................................................................................................................. 50 4 ERGEBNISSE ....................................................................................................... 51 4.1 In-vivo-Untersuchungen in der Sensibilisierung ........................................................................................ 51 4.1.1 Ergebnisse des Skin DC Migration Assays.............................................................................................. 51 4.1.2 Ergebnisse des Mouse Ear Swelling Tests............................................................................................... 52 4.1.3 Einfluss topisch verabreichter Haptene/Irritantien auf das Migrationsverhalten der Langerhanszellen.. 54 4.1.3.1 Ergebnisse der Trypsinierung der Ohrepidermis ............................................................................. 54 4.1.3.2 Ergebnisse des Local Lymph Node Assays ...................................................................................... 56 4.1.3.3 Langerin-positive-Zellen im regionalen Lymphknoten ................................................................... 58 4.1.4 Einfluss von DNCB, TDI und SDS auf die IL-6-, IFN-γ- und IL-10- Produktion .................................. 60 4.1.4.1 IL-6-Produktion ............................................................................................................................... 60 4.1.4.2 IFN-γ-Produktion............................................................................................................................. 62 4.1.4.3 IL-10-Produktion ............................................................................................................................. 63 4.1.5 Einfluss auf die CD4/CD25-positiven Zellen im Lymphknoten ............................................................. 65 4.2 In-vivo-Untersuchungen in der Challenge .................................................................................................. 67 4.2.1 Ergebnisse des Mouse Ear Swelling Tests............................................................................................... 67 4.2.2 Ergebnisse des Skin DC Migration Assays.............................................................................................. 69 4.2.3 Ergebnisse des Local Lymph Node Assays .............................................................................................. 70 4.2.4 Immunhistochemische Darstellung der MHCII/Langerin+-Zellen in der Epidermis............................... 72 4.3 Zusammenfassung der Ergebnisse .............................................................................................................. 73 5 DISKUSSION ........................................................................................................ 74 5.1 Beeinflussung der Langerhanszell-Funktion in der Sensibilisierung ....................................................... 74 5.2 Beeinflussung der Langerhanszell-Funktion in der Challenge ................................................................. 81 5.3 Schlussfolgerung und Ausblick .................................................................................................................... 83 6 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................ 85 7 SUMMARY ............................................................................................................ 87 8 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................. 89 9 ANHANG............................................................................................................. 113 10 DANKSAGUNG ................................................................................................ 127 Abkürzungsverzeichnis µl Mikroliter µg Mikrogramm Abb. Abbildung ACD Allergische Kontaktdermatitis Ag Antigen APC Antigenpräsentierende Zelle(n) cAMP Cyclic adenosine monophosphate CCR7 CC-Chemokinrezeptor 7 CD Cluster of Differentiation CLP Common lymphoid progenitor CMP Common myeloid progenitor DC Dendritische Zelle(n) DNCB 2,4-Dinitrochlorbenzol DNFB Dinitrofluorbenzen ELISA Enzyme-Linked-Immunsorbent-Assay et al. et alii, und andere FACS Flurescence Activated Cell Sorting FITC Fluorescein-Isothiocyanat FKS Fetales Kälberserum FLT-3 Fms-like-tyrosinkinase-3-Ligand g Gramm oder Erdschwerebeschleunigung ggr. Geringgradig GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor h Stunden hgr. Hochgradig ICAM Intercellular adhesion molecule IDEC Inflammatorische dendritische epidermale Zellen i.e. id est. lat.: das ist IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin imDC immature Dendritische Zelle(n) kg Kilogramm LC Langerhans Zelle(n) LFA Leukocyte function associated antigen LPS Lipopolysaccharid Ln./Lnn. Lymphonodus, Lymphknoten LLNA Local Lymph Node Assay MAP Mitogen activated protein mDC mature Dendritische Zelle(n) MEST Mouse Ear Swelling Test mg Milligramm MHC Major-Histocompatibility-Complex ml Milliliter MIP-3β Macrophage-inflammatory-protein-3-β MMP-9 Matrix Metalloproteinase-9 MoDC Monocyte derived dendritic cells MW Mittelwert n Anzahl der Versuche PBS Phosphate Buffered Saline PPARα Proliferator-activated receptor α S.D. Standardabweichung SDS Sodiumdodecylsulfat SLC Secondary lymphoid tissue chemokine Tab. Tabelle TCR T-Zell-Rezeptor TDI Toluene-2,4,-diisocyanate tgl. Täglich Th T-Helferzelle TLR Toll-like Receptor TMA Trimellitanhydrid TNCB Trinitrochlorobenzene TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-α 1 Einleitung Das Immunsystem hat die Aufgabe für den Körper ungefährliche sowie pathogene Bestandteile zu sammeln, zu bewerten und dementsprechend zu reagieren. Eine Allergie entsteht durch die pathologische Überreaktion des Immunsystems, oder durch mangelhafte Toleranzinduktion auf ungefährliche Antigene. Dendritische Zellen sind die Wächter des Immunsystems, sie bilden eine Schaltstelle zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem. Die Langerhanszellen werden als erste immunregulatorische Zellen der Haut, mit herausragender Rolle bezüglich der Antigenpräsentation zu den T-Zellen und folglich einer großen Aufgabe in der allergischen Kontaktallergie beschrieben (CUMBERBATCH et al. 2003). Die Kontaktallergie ist eine Immunreaktion vom verzögerten Typ und wird ausgelöst durch niedermolekulare Substanzen (Haptene). Das murine Modell der allergischen Kontaktdermatitis stellt schon seit Jahrzehnten eine sehr wichtige Grundlage zur Erforschung der Krankheitsentwicklung gegenüber Kontaktallergenen dar. Inwieweit die Langerhanszelle an der Entstehung der allergischen Kontaktdermatitis beteiligt ist, wird aktuell kontrovers diskutiert (BENNETT et al. 2005; KAPLAN et al. 2005; KISSENPFENNIG et al. 2005). Ziel dieser Arbeit ist es, die Beeinflussung der Migration seitens der Langerhanszelle durch verschiedene Allergene und Irritantien unterschiedlicher Konzentrationen zu untersuchen. Als Allergene werden Toluen-2,4diisocyanat (TDI) sowie 2,4-Dinitrochlorobenzol (DNCB) verwendet. Das verwendete Irritans ist Sodiumdodecylsulfat (SDS). Die Substanzen werden den Mäusen in unterschiedlichen Konzentrationen (0,5%; 1%; 2%) topisch auf die Ohren appliziert. Die Studien beziehen sich auf das Migrationsverhalten dendritischer Zellen und die T-Zellstimulation, untersucht anhand der Ohrschwellung, der Zahl ausgewanderter Zellen im regionalen Lymphknoten, der Anzahl an Langerhanszellen in der Ohrepidermis sowie der Induktion CD4/CD25+-T-Zellen und der Produktion verschiedener Zytokine. 1 2 Literaturübersicht 2.1 Antigenpräsentierende Zellen 2.1.1 Dendritische Zellen Die dendritischen Zellen fungieren mit Hilfe der Verbindung von Phagozytose und Antigenpräsentation als Schaltstelle zwischen dem angeborenen und erworbenen Immunsystem. Wissenschaftliche Auseinandersetzungen über ihre Identität und die Abgrenzung von anderen antigenpräsentierenden Zellen (Makrophagen, B-Zellen) bestanden lange Zeit. Heute ist klar, dass die dendritische Zelle fähig ist, Antigene aufzunehmen, sie zu prozessieren, den T-Zellen zu präsentieren und so die Immunantwort regulieren zu können (BANCHEREAU u. STEINMAN 1998; CAUX et al. 2000). Zuerst beschrieben wurde die dendritische Zelle, als letzte entdeckte Population von Immunzellen, von STEINMANN und COHN (1973) in der Milz einer Maus. Jedoch wurde die dendritische Zelle der Haut (Langerhanszelle) schon 100 Jahre früher von Paul Langerhans entdeckt. Ihre Zugehörigkeit zur Population der dendritischen Zellen wurde erst Jahrzehnte später entdeckt (SCHULER u. STEINMAN 1985). Die Rolle der Langerhanszelle hinsichtlich der allergischen Kontaktdermatitis wurde von SILBERBERG et al. (1976) erstmals diskutiert. Inwieweit die Langerhanszelle an der Entstehung einer allergischen Kontaktdermatitis beteiligt ist wird jedoch aktuell kontrovers diskutiert (BENNETT et al. 2005; KAPLAN et al. 2005; KISSENPFENNIG et al. 2005). Ein großer Teil der Erkenntnisse über die Biologie der dendritischen Zellen wurde durch die Erforschung der Langerhanszelle als Modellzelle aus der Epidermis von Maus und Mensch entdeckt (GIROLOMONI et al. 2002). 2 2.1.2 Ontogenese Bildungsort aller Subtypen der dendritischen Zellfamilie ist das Knochenmark. Dort werden von hämatopoetischen Stammzellen immature (unreife) dendritische Zellen produziert. Entscheidende Wachstumsfaktoren humaner dendritischer Zellen sind hierbei der fms-like-tyrosinkinase-3 Ligand (FLT-3) und der granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Durch den Einfluss dieser Faktoren differenzieren aus CD34+ hämatopoetischen Stammzellen lymphoide Vorläuferzellen (common lymphoid progenitors, CLP) und myeloide Vorläuferzellen (common myeloid progenitors, CMP) (LIU 2001). Noch im Knochenmark bilden sich in der humanen myeloiden Linie CLA+ (cutaneous lymphocyte associated antigen) und CLA- Vorläufer aus. Zellen der myeloiden Linie differenzieren sich in Abhängigkeit ihrer Oberflächenmoleküle zu CD11c+CD1a+ und CD11c+CD1a- immaturen dendritischen Zellen. Erstere wandern als Langerhanszellen in die Epidermis, die anderen besiedeln die Dermis und andere Gewebe und werden als interstitielle (dermale) dendritische Zellen bezeichnet (CAUX et al. 2000). Langerhanszellen und interstitielle dendritische Zellen besitzen beide den myeloiden Oberflächenmarker CD11c und können im unreifen Stadium Selbstantigene und apoptotische Zellen den T-Zellen im Lymphknoten präsentieren. Die CD34+ Stammzellen sind in der Lage, sich im Knochenmark zu zwei weiteren Vorläufer-Zellen zu differenzieren. Zum einen zu myeloiden (CD14+/CD11c+) Monozyten und zum anderen zu lymphoiden (präTα+), plasmazytoiden Vorläuferzellen. Monozyten sind in der Lage, im Blut Bakterien zu phagozytieren und differenzieren in Abhängigkeit von Lipopolysacchariden (LPS) aus der Bakterienzellwand zu Makrophagen. Bei der Präsenz von inflammatorischen Zytokinen wie GM-CSF differenzieren Monozyten bei Bakterienkontakt zu dendritischen Zellen vom DC1-Typ. Die plasmazytoiden Vorläuferzellen entwickeln sich unter Einfluß von IL-3 zu immaturen dendritischen Zellen vom DC2-Typ. Sie stellen das Bindeglied zwischen der unspezifischen und spezifischen Immunabwehr dar und spielen bei viralen Infektionen eine wichtige Rolle. So produzieren sie nach Kontakt mit Virusantigen antiviral wirksame Zytokine wie IFN-α und IFN-β. Schließlich verlassen die dendritischen Zell-Subtypen das Knochenmark und migrieren in die lymphatischen Organe (LIU 2001). 3 Abb.1: Entwicklung der humanen dendritischen Zellen nach LIU (2001). 4 2.1.3 Morphologie und Vorkommen dendritischer Zellen Ihren Namen tragen die dendritischen Zellen aufgrund ihres Aussehens, das geprägt ist von einem sternförmigen Körper und dünnen, baumartig verzweigten zytoplasmatischen Zellfortsätzen (gr. dendron = der Baum). Sie bieten mit ihren langen dünnen oder astartig verdickten Zytoplasmaprotrusionen eine größere Kontaktoberfläche zur Antigenaufnahme und Adhäsion an naive Lymphozyten (BANCHEREAU et al. 2000). Ihre Gewebeverteilung ist für die Maus und den Menschen gut beschrieben. So sind in der Haut Langerhanszellen und dermale dendritische Zellen vorhanden (ROMANI et al. 2003; VALLADEAU u. SAELAND 2005). Intestinale dendritische Zellen induzieren im Darm in den Peyerschen Platten, den mesenterialen Lymphknoten und der Lamina propria der intestinalen Villi Immunantworten. Im respiratorischen Trakt, der in besonders hohem Maß Luftkeimen ausgesetzt ist, nehmen dendritische Zellen Antigen auf und transportieren es zu den T-Zellen des zentralen Immunsystems. Auch im zentralen Nervensystem und der Kornea sind dendritische Zellen zu finden (MCMENAMIN 1999). In der Medulla des Thymus eliminieren lymphoide dendritische Zellen autoreaktive, reife Thymozyten durch Apoptose (zentrale Toleranz, BROCKER (1997)). Dendritische Zellen von myeloider Herkunft erreichen über das Blut die TZell-Areale der weißen Milz-Pulpa. Dort werden sie durch Adhäsion an naive TZellen vital zurückgehalten (AUSTYN 1999). Die lymphoiden dendritischen Zellen haben eine geringere Stimulationskomptetenz gegenüber T-Zellen und haben mittels der Expression von FasL eine regulatorische Funktion inne. Plasmazytoide dendritische Zellen findet man vorwiegend in der T-Zellzone der lymphoiden Organe, im Thymus und im Blut. Bei viralen Infektionen sind sie in der Lage, große Mengen an IFN-α (Interferon) zu produzieren. Sie erhielten ihren Namen aufgrund ihrer ultrastrukturellen Ähnlichkeit zu Plasmazellen. Sie besitzen, auch wie andere dendritische Zellen, die Fähigkeit CD4+- und CD8+-T-Zellen zu aktivieren und IL-12 zu produzieren (LIPSCOMB u. MASTEN 2002). 5 Abb.2: Dendritische Zellen (www.igb.fraunhofer.de) 2.1.4 Vorkommen, Struktur und Entwicklung der Langerhanszelle Bereits 1868 entdeckte der deutsche Anatom Paul Langerhans einen Zelltyp, den er aufgrund seines Färbeverhaltens (Goldchloridanfärbbarkeit) zu den Zellen des Nervensystems zählte (LANGERHANS 1868). Wie STEINMANN und COHN (1973) herausfanden, handelte es sich hierbei um Zellen, die Teil des Immunsystems sind, da sie diesen Zelltyp in der Milz einer Maus fanden. Epidermale Langerhanszellen stellen den Prototyp der dendritischen Zellen dar. Sie sind im immaturen Zustand in der Suprabasalmembran der Epidermis lokalisiert und exprimieren E-Cadherin und MHCII-Moleküle. Insgesamt machen sie 2-3% der epidermalen Zellpopulation aus und ihre Dichte variiert von 200-1000 Zellen/mm2. Als einzige Zellen besitzen sie sogenannte Birbeck Granula (BG) (BIRBECK et al. 1961) (s. Abb. 5). BG kommen im Zytoplasma oft als Stapel vor, haben eine trilaminäre Struktur, Tennisschläger- oder Stabform. Wahrscheinlich stellen sie eine Art Phagosom dar, jedoch ist ihre Funktion bis heute nur andeutungsweise aufgeklärt. Mit den BG assoziiert ist der Rezeptor Langerin. VALLADEAU et al. (2000) entdeckten mit dem Langerin-Molekül einen spezifischen Antigen-Rezeptor von Langerhanszellen. Die Identifizierung von Langerin/CD207 hat es möglich gemacht, epidermale Langerhanszellen von dermalen dendritischen Zellen zu unterscheiden (STOITZNER et al. 2003). In der normalen Haut existieren zwei Hauptgruppen von dendritischen Zellen, zum einen die epidermalen Langerhanszellen, zum anderen die dermalen dendritischen Zellen 6 (VALLADEAU u. SAELAND 2005). In chronisch entzündeter humaner Haut werden zudem inflammatorische dendritische epidermale Zellen (IDEC) beschrieben, die keine Birbeck Granula und Langerinrezeptoren besitzen (WOLLENBERG et al. 1996). Auf den Unterschied dieser beiden Gruppen wird später genauer eingegangen. Epidermale Langerhanszellen leiten sich von hämatopoetischen Zellen aus dem Knochenmark ab (KATZ et al. 1979). Trotz der Expression des lymphoiden CD8α-Markers bei murinen Langerhanszellen (MERAD et al. 2000; MERAD et al. 2008) und der Differenzierung von Langerhanszellen aus lymphoiden Vorläufern (ANJUERE et al. 2000) wurde die Zugehörigkeit zur myeloiden Linie postuliert. Beginnend mit CD34+ hämatopoetischen Zellen erfolgt die weitere Entwicklung zweigeteilt. Es entstehen die common lymphoid progenitors sowie die common myeloid progenitors. Myeloide CD34+-Vorläufer differenzieren zum einen in CD14+CD11c+CD1a--Zellen, die sich unter Einfluss von GM-CSF und IL-4 zu immaturen interstitiellen DC und sich unter Einfluss von M-CSF zu interstitiellen Makrophagen entwickeln. Zum anderen differenzieren die myeloiden CD34+ Vorläufer in CD14-CD11c+CD1a+-Zellen, welche sich mit Hilfe von GM-CSF, IL-4 und TGF-β zu immaturen Langerhanszellen entwickeln (BANCHEREAU et al. 2000). Der Transkriptionsfaktor TGF-β1 scheint für die Entwicklung der Langerhanszelle eine große Rolle zu spielen. So konnte gezeigt werden, dass Mäusen mit ausgeschaltetem TGF-β1-Gen die Langerhanszellen in der Epidermis fehlten (BORKOWSKI et al. 1996). Unter steady state-Bedingungen findet ein geringer turnover statt und die sich teilenden Langerhanszellen stammen aus einem dermalen oder epidermalen Vorläuferpool. Beim Auftreten von Entzündungen werden Zellen aus dem Blut in die Epidermis rekrutiert (MERAD et al. 2002). 7 2.1.5 Migration und Reifung Nach Kontakt mit dem Antigen werden Langerhanszellen mobilisiert, emigrieren aus der Epidermis und wandern zu den regionalen Lymphknoten, um dort in den T-Zellarealen die T-Zellen zu aktivieren und eine Immunantwort zu initiieren (s. Abb. 3) (AIBA 1998; LANZAVECCHIA u. SALLUSTO 2000). Während ihrer Wanderung durchläuft die dendritische Zelle eine Veränderung vom ruhenden zum aktivierten Phänotyp. Ruhende, unreife dendritische Zellen sind vor allem in der Lage, Antigen aufzunehmen und zu prozessieren, während aktivierte dendritische Zellen vor allem zur Antigenpräsentation fähig sind (CAUX et al. 2000; RIEMANN et al. 2003). Die Einleitung der Migration wird auf der einen Seite durch die Langerhanszelle selbst, andererseits durch die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine aus Keratinozyten (vor allem IL-1β, TNF-α) reguliert (WANG et al. 1997; CAUX 1998). Durch die Herabregulation des Moleküls E-Cadherin durch IL-1α, IL-1β und TNF-α wird die Adhäsion der Langerhanszelle von den Keratinozyten gelöst. Es wurde festgestellt, dass bei Mäusen nach intradermaler Applikation von IL-1β und TNF-α die Langerhanszellen die Epidermis verlassen und in den regionalen Lymphknoten wiederzufinden sind (CUMBERBATCH et al. 1997). Bei Verwendung von Kontaktallergenen wurde herausgefunden, dass parallel zu diesen inflammatorischen Zytokinen auch IL-10, welches antagonistisch gegenüber IL-1β und TNF-α wirkt, eine Rolle spielt (ENK u. KATZ 1992). Weiterhin unterstützt wird die Migration durch die Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) seitens der Langerhanszelle und Keratinozyten (KOBAYASHI 1997). Der Oberflächenmarker CCR7 (Chemokinrezeptor) von reifenden dendritischen Zellen wird während der Migration hochreguliert. Der Ligand secondary lymphoid tissue chemokine (SLC/CCL2) wird von Endothelzellen freigesetzt und führt zur Wanderung der Langerhanszellen in die afferenten Lymphgefäße und anschließend in die T-Zellareale der drainierenden Lymphknoten. Neben CCL21-CCR7-Signalen können Langerhanszellen auch über MIP-3β/CCL19, produziert von dendritischen Zellen in den T-Zellarealen, dirigiert werden (GUNN et al. 1998; KELLERMANN et al. 1999). 8 Abb.3: Lebenszyklus dendritischer Zellen nach (BANCHEREAU et al. 2000). 2.1.6 Priming und Proliferation naiver T-Zellen Im drainierenden Lymphknoten angekommen, präsentieren die Langerhanszellen in der paracortikalen Region den naiven T-Zellen das Antigen. Es folgt eine Interaktion zwischen dem T-Zell-Rezeptor (TCR) der CD4+- und CD8+-T-Zelle und dem Antigen, welches von der Langerhanszelle prozessiert wurde und via MHC-Molekül präsentiert wird. Erst wenn die naiven T-Zellen Kontakt mit ihrem Antigen haben (priming), differenzieren sie zu T-Effektorzellen. Zwei voneinander unhabhängige Signale sind nötig, um die T-Zelle erfolgreich zu aktivieren. Zum einen die schon beschriebene Interaktion des T-Zell-Rezeptors mit den Peptiden des Antigens gekoppelt an MHC-I oder MHC-II-Moleküle, zum anderen costimulatorische 9 Oberflächenmoleküle wie B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) seitens der dendritische Zelle, sowie CD28 und CTLA-4 seitens der T-Zellen. Diese beiden Signale aktivieren die T-Zellen, indem sie die Freisetzung des Zytokins IL-2 und gleichzeitig die Expression des hochaffinen IL-2-Rezeptors induzieren (KRAMER et al. 1997). Das Zytokin kann in autokriner und parakriner Weise an seinen Rezeptor binden. In der Folge tritt die T-Zelle in den Zellzyklus ein und proliferiert. Aktivierte T-Zellen differenzieren zu verschiedenen T-Zellpopulationen. Zum einen werden T-Effektorzellen, zum anderen Gedächtniszellen gebildet. Die antigenspezifischen T-Zellen verlassen den Lymphknoten und treten in den Blutstrom ein. Die Gedächtniszellen bilden die Grundlage der zellulären Sekundärantwort. Nach erneutem Antigenkontakt sind sie in der Lage, sich schnell zu teilen und effektiv auf Erreger zu reagieren. Neben B-Gedächtniszellen, existieren MHCI induzierte CD8+-T-Gedächtniszellen und CD4+T-Gedächtniszellen, denen Peptide auf MHCII-Molekülen präsentiert werden. Ist die Signalstärke, die auf die T-Zelle wirkt, geringer, so werden wenige Moleküle von Peptid:MHC-Komplexen und B7-1 sowie B7-2 von dendritischen Zellen gezeigt. Sind die Interaktionen der dendritischen Zellen mit T-Zellen von kurzer Dauer, so werden aus dem Pool naiver- T-Zellen zentrale CD4+- und CD8+-T-Gedächtniszellen (TCM) gebildet (SALLUSTO u. LANZAVECCHIA 2002). Bleibt eines der erforderlichen Signale aus, so kommt es zu T-Zell-Inaktivität (Anergie). Dieser Zustand der Anergie bildet in der Peripherie gemeinsam mit der Selektion von T-Zellen die Toleranz-Mechanismen gegenüber körpereigenem Antigen, sowie gegenüber fremdem, aber nicht gefährlichem Antigen aus. Dendritische Zellen können auch direkt, ohne Hilfe von Seiten der T-Zelle, naive B-Zellen aktivieren und einen Isotypenwechsel sowie Proliferation induzieren (WYKES u. MACPHERSON 2000; LITINSKIY et al. 2002). 10 2.1.7 Regulation der Immunantwort Es bestehen für das Immunsystem verschiedene Möglichkeiten auf ein Antigen zu reagieren. Die Form der Antigenpräsentation, die Menge des Antigens, die Örtlichkeit der Antigenaufnahme und die Art der antigenpräsentierenden Zellen sowie das jeweilig vorherrschende Zytokinmilieu beeinflussen die Polarisierung der Immunantwort. 2.1.7.1 Th1/Th2-Immunantwort Wird ein Antigen gemeinsam mit MHCI- oder MHCII-Molekülen präsentiert, so kommt es zu einer Aktivierung von CD4- sowie CD8-T-Zellen. Aus den naiven CD4-Zellen können zwei Subtypen von T-Helferzellen entstehen. Zum einen die Th1-Zellen und zum anderen die Th2-Zellen. Eine Th1-Immunantwort wird in der Regel durch das Signalzytokin IL-12 von dendritischen Zellen hervorgerufen. Dies hat eine Differenzierung der T-Zellen zur Folge, die bei der zellulären Immunantwort helfen sollen. Von den Th1-Zellen wird vor allem IFN-γ gebildet, welches unter anderem zu einer zellulären Immunität durch Makrophagenaktivierung führt. Nach neueren Untersuchungen sind auch IL-23 oder IL-27 an der Differenzierung von Th1-Zellen beteiligt (TRINCHIERI et al. 2003). Die Haptene DNCB oder DNFB führen zu einer Th1-dominierten Antwort mit typischem Zytokinmilieu, wohingegen Kontaktallergene wie TDI, TMA oder FITC zu einer Th2-Antwort mit der Bildung von haptenspezifischen IgE-Antikörpern führen (CUMBERBATCH et al. 2003; BÄUMER et al. 2004; CUMBERBATCH et al. 2005; DEARMAN et al. 2005). Die T-Zellpolarisierung scheint ausserdem gekoppelt an die Migrationsgeschwindigkeit der dendritischen Zellen, hervorgerufen durch unterschiedliche Haptene. So führt das Kontaktallergen DNCB zu einer schnelleren Migration der Langerhanszelle zum regionalen Lymphknoten und in Folge dessen zu einer Th1-Immunantwort (CUMBERBATCH et al. 2005). Th2-Zellen sind die Aktivatoren der B-Zellen und sind in der Lage, bei Parasiten- und Pilzinfektionen wirksam zu sein. Das Zytokinmilieu wird während der Antigenpräsentation via MHCII–Molekül von Histamin, PGE2 und 11 IL-4 dominiert, so dass CD4-Zellen geprimt und eine Th2-Immunantwort eingeleitet wird (KAPSENBERG et al. 1998). Th2-Zellen liefern wichtige Signale an die B-Zellen wie zum Beispiel über CD40/CD40L Interaktionen, welche die Vorraussetzung für deren Aktivierung sind. Die Interaktion der Th2-Effektorzellen mit den B-Zellen führen unter dem Einfluß von IL-4 und CD40/CD40L zur Produktion von IgE seitens der B-Zellen. Differenzierte Th2-Zellen produzieren hauptsächlich IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13. 2.1.7.2 Toleranz Unter Toleranz versteht man in der Immunologie sämtliche Mechanismen, die eine Reaktion gegen körpereigene Strukturen, sogenannte Autoantigene aktiv oder passiv verhindern. Für die Homöostase des Immunsystems sind Toleranzprozesse gegen Autoantigene und unschädliche Umwelteinflüsse essentiell. Man unterscheidet die zentrale von der peripheren Toleranz, wobei die zentrale Toleranz im Thymus und Knochenmark entsteht und die periphere Toleranz durch verschiedene Mechanismen in peripheren Geweben erzeugt wird. Von zentraler Toleranz spricht man bei der Selektion der entstehenden T-Zellen auf Selbstreaktivität (KYEWSKI u. KLEIN 2006). Die entstehenden T-Zellen werden im Thymus positiv und negativ selektiert. Bei der Selektion von T-Zellen im Thymus geht man davon aus, dass T-Zellen, die eine hohe Affinität bzw. Avidität gegen das präsentierte Autoantigen aufweisen, deletiert werden. T-Zellen mit geringerer Affinität/Avidität entkommen dieser Depletion und verlassen als potentielle Effektor-T-Zellen den Thymus. Die zentrale Toleranz stellt nur einen Teil des Mechanismus dar, welcher Autoimmunreaktionen verhindert. Die ergänzenden Mechanismen werden unter dem Begriff der peripheren Toleranz zusammengefasst. Man unterscheidet zwischen intrinsischen und durch andere Zellen vermittelte extrinsische Mechanismen (TARBELL et al. 2006). 12 Tabelle 1: Mechanismen peripherer Toleranz. Mechanismus Wirkung Deletion AICD = activation induced cell death d.h. Apoptose nach Aktivierung Anergie Zustand fehlender Reaktivität der T-Zellen nach Stimulation Suppression/Regulation Hemmung autoagressiver T-Zellen durch regulatorische T-Zellen Zu den intrinsischen (passiven) Toleranzmechanismen gehören die Deletion, die immunologische Ignoranz sowie die Anergie, zu den extrinsischen (aktiven) Toleranzmechanismen zählen die regulatorischen T-Zellen. Der rigoroseste Mechanismus der peripheren Toleranz ist die Eliminierung autoreaktiver T-Zellen in der Peripherie durch activation induced cell death (AICD).Es kommt zur Apoptose überstimulierter Zellen und folglich zur Begrenzung der Immunantwort. Schlüsselmechanismus der AICD ist die Interaktion von Fas (CD95) auf den T-Zellen und dem Ligand FasL (CD95L) auf der antigenpräsentierenden Zelle. Die Induktion von T-Zell Apoptose über den Fas/FasL- Signalweg ist vor allem in den peripheren Organen zu beobachten. Anergie kann entstehen, wenn T-Zellen kein ausreichendes Signal zur Aktivierung erhalten. Es kommt zu einer unzureichenden Reaktion der T-Zellen auf ein Antigen. Dendritische Zellen, die zwar Antigene präsentieren, jedoch kein costimulatorisches Molekül tragen, sind nicht in der Lage T-Zellen ausreichend zu aktivieren. Wenn es zu einer unvollständigen Aktivierung über den T-Zellrezeptor kommt, wird über den Transkriptionsfaktor N-FAT das Molekül Cytotoxic T-Lymphocyte–associated antigen-4 (CTLA-4) auf den T-Zellen hochreguliert. CTLA-4 besitzt inhibitorische Eigenschaften, die unter anderem die IL-2 Produktion verringern (GREENWALD et al. 2001). Viele der anergischen T-Zellen werden anschliessend durch Apoptose 13 entfernt, wenige von ihnen bleiben länger im Körper (LECHLER et al. 2001; APPLEMAN u. BOUSSIOTIS 2003). 2.1.8 Rolle und Funktion regulatorischer T-Zellen Regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine zentrale Rolle bei der Verhinderung von Autoimmunität und bei der Kontrolle von überschießenden oder unangemessenen Immunantworten. Dies kann durch adaptive wie durch natürlich vorkommende Treg und myeloische Suppressorzellen erfolgen (ROSSNER et al. 2005). Es werden unterschiedliche Arten von Treg unterschieden. Zum einen die im Thymus entstehenden natürlichen CD4+CD25+FoxP3+-Treg (nTreg), zum anderen die in der Peripherie entstehenden adaptiven/induzierten Treg (iTreg), wie IL-10-sezernierende Tr1- oder TGF-β-sezernierende Th3-Zellen. Bevor regulatorische T-Zellen erstmals in der Literatur beschrieben wurden, konnten NISHIZUKA u. SAKAKURA (1969) zeigen, dass die Thymektomie von drei Tage alten Mäusen zur Entwicklung verschiedenster Autoimmunerkrankungen führt. Charakterisiert wurde diese Zellpopulation erst Mitte der neunziger Jahre. Es konnte gezeigt werden, dass nach Thymektomie der Mäuse eine stark reduzierte Menge an CD4+CD25+ T-Zellen zu finden waren (ASANO et al. 1996). Die Treg sind in der Lage, die Aktivierung, die Proliferation bzw. die Reifung von CD4+-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und dendritischen Zellen in vitro zu inhibieren. Des Weiteren wirken sie suppressiv auf CD8+ zytotoxische T-Zellen (MEMPEL et al. 2006; BAYRY et al. 2007). Reife dendritische Zellen, die entsprechendes Antigen tragen, können Treg zur Proliferation anregen (YAMAZAKI et al. 2003). Im Mausmodell der allergischen Kontaktdermatitis konnte gezeigt werden, dass nTreg in vivo mittels haptenspezifischer Toleranz durch die Produktion von IL-10 zur Kontrolle der Effektor-T-Zellen und folglich zur Inhibition der allergischen Dermatitis beitragen (SCHWARZ et al. 1994). Die adaptiven/induzierbaren Tregs wie T regulatory type 1 (Tr1-) und Th3-Zellen vermitteln ihre suppressiven Eigenschaften in erster Linie über lösliche Faktoren. Tr1-Zellen produzieren nach Aktivierung IL-10, wohingegen Th3-Zellen ihre regulatorischen Eigenschaften über TGF-β vermitteln (TAYLOR et al. 2006). Es 14 konnte gezeigt werden, dass tolerogene dendritische Zellen die Bildung von Tr1Zellen induzieren können (SMITS et al. 2005). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass auch unreife dendritische Zellen die Bildung von Tr1-Zellen induzieren können. Dendritische Zellen, die nicht vollständig ausgereift sind (semi-maturiert), sind nach Aufnahme von Selbstantigen oder apoptotischem Zellmaterial in der Lage, im Lymphknoten über dort ansässige T-Zellen eine Toleranz zu vermitteln (LUTZ u. SCHULER 2002). Es wurden unreife dendritische Zellen, generiert aus humanen Monozyten, mehrfach mit naiven T-Zellen inkubiert. Als Folge konnte die Differenzierung eines IL-10 und TGF-β produzierenden T-Zelltyps beobachtet werden (LEVINGS et al. 2005). An der Regulation der Immunatwort (Th1-/Th2Immunantwort) scheinen die Tr1-Zellen beteiligt zu sein (XU et al. 2003). 2.1.9 Abgrenzung der Langerhanszelle von der dermalen dendritischen Zelle Zu der Population der kutanen dendritischen Zellen gehören die epidermalen Langerhanszellen (LC), die dermalen dendritischen Zellen (DDC), sowie die plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC). Die zwei Hauptgruppen, die in gesunder Haut zu finden sind, sind a) die Langerhanszellen (LC) und b) die dermalen dendritischen Zellen (DDC) (VALLADEAU u. SAELAND 2005). Die Langerhanszellen stellen den Prototyp der dendritischen Zellen der Haut dar. Sie wurden vor 140 Jahren das erste Mal beschrieben (LANGERHANS 1868), wohingegen die dermalen dendritischen Zellen erst Jahre später identifiziert wurden. Unterschieden werden können die Zelltypen beispielsweise anhand verschiedener Färbemethoden bezüglich ihrer Oberflächenmarker. Die für die Langerhanszelle typischen Birbeck Granula sind im Elektronenmikroskop zu sehen. Es existiert kein typischer Marker für dermale dendritischen Zellen, wie Langerin/CD207 oder die Birbeck Granula der Langerhanszelle. Dermale dendritische Zellen exprimieren zwar MHCII-Moleküle, den Scavenger receptor CD36 (human), und den Koagulationsfaktor XIIIa, jedoch sind diese Marker nicht charakteristisch, da sie auch auf anderen Makrophagen zu finden sind (VALLADEAU u. SAELAND 2005). Die Langerhanszelle exprimiert den 15 peroxisome proliferator-activated receptor (PPARα) im immaturen Zustand und wird in der maturen Langerhanszelle herunterreguliert. Die Aktivierung des PPARα inhibiert die Maturation der Langerhanszelle und verhindert außerdem deren Migration (DUBRAC et al. 2007). Das Lektin DC-SIGN/CD209 macht es möglich, in der humanen Haut die dermalen dendritischen Zellen von anderen dermalen Zellpopulationen zu unterscheiden. Die unterschiedlichen Oberflächenmarker lassen darauf schließen, dass Langerhanszellen und dermale dendritische Zellen unterschiedliche Pathogene erkennen und darauf aktiviert werden (Abb. 4). Beispielsweise ist das Molekül CD1a, welches involviert ist in die Präsentation von mikrobiellem Antigen, auf humanen Langerhanszellen reichlich aber auf dermalen dendritischen Zellen wenig oder gar nicht zu finden. Ein weiterer Hinweis auf die Spezialisierung der Langerhanszellen und dermalen dendritischen Zellen, ist die unterschiedliche Anhäufung der Zellen in verschiedenen Regionen des Lymphknotens nach Behandlung von Mäusen mit dem Kontaktallergen DNFB. Während Langerhanszellen nach Kontakt mit DNFB im inneren Paracortex des Lymphknotens zu finden sind, befinden sich dermale dendritische Zellen im äußeren Paracortex unter den B-Zellfollikeln (KISSENPFENNIG et al. 2005). Plasmazytoide dendritische Zellen sind lymphoiden Ursprungs und vornehmlich zu finden bei atopischer Dermatitis, Kontaktdermatitis und Psoriasis (WOLLENBERG et al. 2002; NOVAK et al. 2004). Welche Rolle genau die dermalen dendritischen Zellen und Langerhanszellen im Rahmen der Immunregulation spielen, ist bis heute nicht geklärt und steht weiterhin im Fokus dermatologischer Forschung. 16 Abb.4: Oberflächenmarker der Langerhanszelle und dermalen dendritischen Zelle nach VALLADEAU u. SEALAND (2005) 17 2.1.10 Die Rolle der Langerhanszelle in der allergischen Dermatitis Die Langerhanszellen werden als erste immunregulatorische Zellen der Haut bezeichnet, die eine herausragende Aufgabe hinsichtlich der Antigenpräsentation zu den T-Zellen und somit eine wichtige Rolle in der allergischen Kontaktdermatitis inne haben (CUMBERBATCH et al. 2003; ROMANI et al. 2003). Dieser Umstand macht die Langerhanszellen zu einem sehr wichtigen Gegenstand in der dermatologischen Forschung. Ihre Rolle, Funktion und Stellung im Immunsystem wird bis heute kontrovers diskutiert. Mit dem Erscheinen von Knock-out-Mäusen und der Entwicklung neuer Untersuchungsmodelle kommen Fragen auf, inwieweit die Langerhanszelle eine potente immunstimulierende Rolle besitzt (ROMANI et al. 2006). KAPLAN et al. (2005) haben herausgefunden, dass es bei der Abwesenheit von Langerhanszellen zu einer verstärkten Kontakthypersensitivität kommt und sie in der Phase des priming, nicht aber in der Effektorphase eine Rolle spielen. Sie beobachteten weiterhin eine gesteigerte Ohrschwellung der Mäuse bei Fehlen von Langerhanszellen. BENNETT et al. (2005) hingegen stellten fest, dass in Mäusen mit depletierten Langerhanszellen die Kontakthypersensitivität erheblich abnimmt. In ihren Versuchen wurden Knock-in-Mäuse generiert, die den diphteria toxin receptor unter der Kontrolle des Langerin-Gens exprimieren. Des Weiteren konnten sie zeigen, dass dermale dendritische Zellen die allergische Kontaktdermatitis auslösen können, jedoch das Ausmaß der allergischen Reaktion durch Langerhanszellen reguliert wird. KISSENPFENNING et al. (2005) arbeiteten ebenfalls mit Hilfe des diphteria toxin receptors (DTR), jedoch gekoppelt an das enhanced green fluorescent protein (EGFP). So war es ihnen möglich, dermale dendritische Zellen von Langerhanszellen zu unterscheiden. Anders als BENNETT et al. (2005) und KAPLAN et al. (2005) kamen KISSENPFENNIG et al. (2005) zu dem Ergebnis, dass die Langerhanszellen entbehrlich sind für die Entstehung einer allergischen Kontaktdermatitis. Sie konnten zeigen, dass durch das Fehlen von Langerhanszellen weder die Intensität noch die Kinetik der allergischen Kontaktdermatitis beeinflusst wurde. Weiterhin konnten sie zeigen, dass Langerhanszellen sowohl für das priming der T-Zellen als auch für die Aktivierung von haptenspezifischen Effektorzellen entbehrlich sind. Nach KISSENPFENNIG et al. (2005) ist es durchaus möglich, dass 18 dermale dendritische Zellen, die mit Hapten beladen sind, verantwortlich sind für die Entstehung einer allergischen Kontaktdermatitis. Gründe für diese unterschiedlichen Ergebnisse bezüglich Kontaktdermatitis der können Rolle der Langerhanszelle unterschiedliche in der Methodenprotokolle, allergischen verschiedene Kontaktallergene, verschiedene Allergen-Dosen oder unterschiedliche Mausstämme sein. Fest steht, dass die Langerhanszelle zwar entbehrlich ist für die Induktion der Kontaktallergie jedoch durchaus eine regulatorische Funktion besitzt (ROMANI et al. 2006). Die großen Fragen, die immer noch zu klären sind, sind: welche Rolle spielt die Langerhanszelle in der kutanen Immunprotektion? Wie wird sie durch andere immunkompetente Zellen beeinflusst und wo besteht der Unterschied zwischen der dermalen dendritischen Zelle und der Langerhanszelle? 2.2 Aufnahme von Antigen In der Haut erfolgt die Antigenaufnahme nachdem das Antigen die äußere Barriere der Haut penetriert hat. In den meisten Geweben kommen die dendritischen Zellen in ihrer unreifen (immaturen) Form vor, in der sie zwar keine T-Zellen-stimulatorische Fähigkeit aufweisen, jedoch effizient Antigene aufnehmen können. Antigene können durch Makropinozytose, Phagozytose oder rezeptorvermittelte Endozytose aufgenommen werden. Bei der Makropinozytose werden durch Aktinfilamente des Zytoskeletts größere Vesikel (0,5-3 µm) aufgenommen. An unreifen dendritischen Zellen, aus Monozyten durch Kultur gewonnen, konnte gezeigt werden, dass binnen einer Stunde Volumina der Zelle selbst entsprechend in die Zelle gelangen können (SALLUSTO et al. 1995). Auf der Zelloberfläche dendritischer unreifer Zellen werden wenige antigenpräsentierende MHC-Moleküle, wenige Adhäsionsmoleküle wie CD54 und CD58, sowie wenige T-Zellen kostimulierende Moleküle wie CD40,CD80,CD86 und kein CD83 exprimiert (BANCHEREAU u. STEINMAN 1998). Jedoch exprimieren immature dendritische Zellen Rezeptoren zur Antigennaufnahme wie z.B. den Mannose-Rezeptor. Apoptotisches und nekrotisches Zellmaterial wird von den dendritischen Zellen mittels Phagozytose aufgenommen, indem sie das Material mit pseudopodienähnlichen Ausläufern aufnehmen. Präsentierende dendritische Zellen 19 selbst können von anderen dendritischen Zellen phagozytiert werden. Im Unterschied zu anderen Phagozyten reichen den dendritischen Zellen nano- und picomolare Antigenkonzentrationen für eine effiziente T-Zellpräsentation aus (SALLUSTO et al. 1995). Jedoch konnte gezeigt werden, dass eine epikutane Applikation niedriger, subimmunogener Dosen eines Kontaktallergens eine antigenspezifische Toleranz erzeugt, die durch CD8+-Suppressor-Zellen vermittelt wird. Man spricht von der sogenannten Induktion der low zone tolerance durch Kontaktallergene (STEINBRINK et al. 1996). 2.2.1 Rezeptorvermittelte Endozytose Bei der rezeptorvermittelten Endozytose gelangen je nach Funktion der betreffenden Zelle, Moleküle und Partikel gebunden an bestimmte Rezeptoren in die Zelle. Dieser Mechanismus ist effektiver als die Pinozytose, bei der alle Partikel unselektiv in die Zelle aufgenommen werden, da Antigene schneller internalisiert und in der Zelle konzentriert werden können. Außerdem können Antigene in wesentlich größeren Mengen aufgenommen werden und den T-Zellen ausreichend für eine Immunantwort präsentiert werden. Die rezeptorvermittelte Endozytose erfordert die Bindung eines Antigens an einen Rezeptor auf den dendritischen Zellen. Die immaturen dendritischen Zellen exprimieren zahlreiche Rezeptoren zur Antigennaufnahme, z.B. Endozytoserezeptoren wie FcγR und FcεR und eine Reihe von Toll-like-Rezeptoren (MEDZHITOV 2001). Die Toll-like-Rezeptoren TLR-2 und -4 gehören zu der Familie der Transmembranrezeptoren TypI. Wenn dendritische Zellen beispielsweise über den TLR-4 aktiviert werden, so kommt es zu einer Th1 polarisierten Immunantwort mit typischem Zytokinmilieu (IL-12, IFN-γ) (MEDZHITOV 2001). Langerhanszellen exprimieren Rezeptoren zur Antigenaufnahme wie Fcγ und Fcε sowie DEC205 (JIANG et al. 1995) und das C-Typ Lektin Langerin/CD207. Langerin wird sowohl oberflächlich als auch intrazellulär in den Birbeck Granula exprimiert (VALLADEAU et al. 2000). Langerhanszellen exprimieren jedoch keinen Makrophagen- Mannoserezeptor (LINEHAN et al. 1999; MOMMAAS et al. 1999) wie andere Subtypen der dendritischen Zellen (SALLUSTO et al. 1995). Auf den Rezeptor 20 Langerin soll an späterer Stelle genauer eingegangen werden. Mittels der FcRezeptoren werden an Antikörper gekoppelte Antigene aufgenommen, wobei der Rezeptor den Fc-Teil des Antikörpers erkennt. Abb.5: Birbeck Granula einer humanen Langerhanszelle (ROMANI et al. 2006). 2.2.2 Langerin Langerin ist ein Typ-II-Transmembranprotein, ein Lektin vom C-Typ mit einem Molekulargewicht von 4800 g/mol und wird von der Langerhanszelle sowohl auf der Zelloberfläche als auch innerhalb der Birbeck Granula exprimiert (VALLADEAU et al. 2000; VALLADEAU et al. 2002). Langerin erkennt Mannose, n-Acetylglucosamine, Fucose und sulfatierte Zucker (TAKAHARA et al. 2002; GALUSTIAN et al. 2004). Das Maus-Langerin (m-Langerin) ist zu 66% homolog zum humanen Langerin (hLangerin) und besitzt eine ähnliche Genstruktur (VALLADEAU et al. 2002). Das mLangerin liegt auf Chromosom 6D, das hLangerin auf Chromosom 2p13. Das mLangerin wird reichlich von epidermalen Langerhanszellen der Maus sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene exprimiert. Ausserdem konnten mLangerinpositive Zellen im Thymus, Lymphknoten sowie in Lunge, Leber und Herz gefunden werden (VALLADEAU et al. 2002). Langerin wird nach Kreuzbindung durch einen spezifischen Antikörper in die Zelle internalisiert. Dieser Vorgang weist auf die Funktion als Endozytoserezeptor für Antigene und Pathogene hin (FIGDOR et al. 21 2002). Weiterhin wird in humanen epidermalen Langerhanszellen auch ein Transfer der Birbeck Granula zwischen recycling Endosomen und der Zellmembran beschrieben (MCDERMOTT et al. 2004). Wie genau durch Langerin Antigen aufgenommen wird und inwiefern es bei der Antigenpräsentation eine Rolle spielt, ist bis heute nicht ausreichend geklärt (IDOYAGA et al. 2008). Durch Kennzeichnung der extrazellulären Domäne des Langerinrezeptors konnten IDOYAGA et al. (2008) zeigen, dass Antigene mittels Langerin sowohl den CD4+- als auch CD8+-Zellen mehrere Tage lang präsentiert werden. Langerin wird erst ab dem dritten Tag nach der Geburt exprimiert im Gegensatz zu MHCII, welches schon fetal zu finden ist (TRIPP et al. 2004). Es scheint eine Korrelation zwischen der Expression von Langerin und der Anwesenheit von Birbeck Granula zugeben, die vier Tage postnatal zu finden sind (KOBAYASHI et al. 1987; TRIPP et al. 2004). Langerin ist ein ausgesprochen nützlicher molekularer Marker für die Identifikation und für funktionelle Studien der Langerhanszelle der Maus. In der vorliegenden Arbeit diente der Langerinantikörper, der zu diesem Zeitpunkt erst kommerziell erhältlich war dazu, die Migration der Langerhanszelle in der allergischen Kontaktdermatitis zu untersuchen. 22 2.3 Die Haut als Immunorgan 2.3.1 Aufbau der Haut Die Haut (lat.:Cutis) ist das flächenmäßig größte Organ des Organismus. Sie bedeckt bei einem erwachsenen Menschen eine Fläche von 2 m² (HADGRAFT 2001). Sie schützt den Körper vor chemischen, mechanischen und thermischen Schäden sowie vor Krankheitserregern und Strahlen. Des Weiteren übernimmt sie eine wichtige Rolle in der Immunüberwachung des Organismus. Sie ist ebenso wichtig bei der Temperaturregulation und Kontrolle des Wasserhaushaltes des Organismus. Mit Hilfe von Rezeptoren können über die Haut thermische, mechanische sowie Schmerzreize wahrgenommen werden (SCHIEBLER et al. 1997). Die Haut besteht aus mehreren Schichten, die sich gut gegeneinander abgrenzen lassen. Oberflächlich liegt die Epidermis (Oberhaut), darauf folgt die Dermis (Lederhaut) und schließlich die Hypodermis (Unterhaut). 2.3.2 Die Epidermis In der Epidermis, einem Plattenepithel, findet der Prozess der Verhornung statt, in dessen Folge Keratinozyten eine Hornschicht als Barriere zur Außenwelt bilden. Sie unterliegt einer ständigen Erneuerung (FRITSCH 2004). Die Dicke der humanen Epidermis beträgt ca.100 µm (FRITSCH 2004). Sie besteht zu etwa 90% aus Keratinozyten, die der Basalmembran aufliegen. Desweiteren enthält sie Langerhanszellen, Merkelzellen und Melanozyten. Die Keratinozyten unterliegen einem Differenzierungsgang. Sie entstehen aus Stammzellen der Basalmembran, durchwandern die Epidermis und enden in der Apoptose der Keratinozyten. Die Epidermis lässt sich abhängig vom Grad der Keratinozytendifferenzierung in folgende Schichten unterteilen: Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulosum, Stratum corneum. Die Versorgung der Epidermis erfolgt durch Diffusion der gefäßreichen Dermis. 23 Im Stratum basale befindet sich die basale Keimschicht, die aus teilungsfähigen Keratinoblasten besteht und im Dienste ständiger Erneuerung der Keratinozyten steht. Untereinander haben die Keratinozyten über Desmosomen Verbindung zueinander, mit der Basalmembran sind sie durch Hemidesmosomen fest verbunden. Somit entsteht eine stabile Verankerung der Epidermis mit der Dermis (LIEBICH et al. 1999). Suprabasal finden sich hier ausserdem Langerhanszellen. Sie bilden über dendritische Ausläufer im Interzellularraum Kontakte mit den Keratinozyten aus. Die funktionelle Adhäsion zwischen Langerhanszellen und Keratinozyten wird durch die Ca²-abhängige Bindung des Moleküls E-Cadherin hergestellt. Langerhanszellen Zellpopulation aus machen (LAMBRECHT 1-3% 2001). der Durch gesamten mitotische epidermalen Zellteilung der Keratinozyten wandern die Zellen von der basalen Membran in apikale Richtung zum Stratum spinosum. Das Stratum spinosum ist durch typische Stachelzellform gekennzeichnet. Intermediäre Filamentbündel erhöhen die Elastizität der Epidermis. Oberfächlich flachen die Zellen des Stratum spinosum ab und gehen über in das Stratum granulosum. Dort bilden die Keratinozyten besondere zytoplasmatische Einschlüsse und vorhandene Organellen degenerieren. Es werden basische Keratohyalingranula synthetisiert, in denen sich Profilaggrin und Keratinfilamente anreichern. Durch Dehydrierung und Vernetzung der Keratinbündel entstehen dichte, zusammenhängende Schichten. Das Stratum corneum besteht aus abgestorbenen, dehydrierten Zellen. Ihre Schichtdicke ist abhängig vom Grad der mechanischen Beanspruchung. 24 Abb.6 Aufbau der Haut nach SCHIEBLER (1997) 25 2.3.3 Immunologische Grenzfläche Haut Die Haut besitzt neben ihrer Funktion als passive, physikalische Barriere zwischen Organismus und Umgebung verschiedene aktive Verteidigungsmechanismen gegen pathogene Einflüsse. Sie ist neben dem respiratorischen System und dem Verdauungstrakt das Organ, welches sehr großflächig und intensiv mit der Umwelt in Kontakt steht. Oberflächlich bildet die Haut einen mechanischen Schutz gegen Pathogene durch tight junctions der Epithelzellen, des Weiteren bildet sie eine chemische Barriere durch Fettsäuren (JANEWAY u. TRAVERS 1997). Suprabasal liegen die Langerhanszellen, fungieren als Wächter des Immunsystems und stellen eine Verbindung zwischen angeborenem und erworbenem Immunsystem her (CAUX et al. 2000). Bei Überreaktionen, erworbenen oder angeborenen Ausfällen der Immunüberwachung kommt es in verschiedener Weise zu entzündlichen Hautreaktionen. Dazu zählen unter anderem die atopische Dermatitis, Vitiligo, Schuppenflechte und die allergische Kontaktdermatitis. 2.4 Die allergische Kontaktdermatitis Die allergische Kontaktdermatitis ist eine durch T-Zellen vermittelte entzündliche Reaktion auf wiederholten Kontakt mit Allergenen, bei deren Entstehung vor allem dendritische Zellen eine wichtige Rolle spielen (BENNETT et al. 2005). Abhängig vom Allergen wird die allergische Kontaktdermatitis als eine Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I (IgE-vermittelt), oder nach COOMBS und GELL (1968) vom verzögerten Typ, Typ IV (zellvermittelt) klassifiziert. Letztere wird auch als “delayed-type-hypersensitivity“ (DTH) bezeichnet, da es erst 24-72 Stunden nach Allergenkontakt zu maximaler Ausprägung der Reaktion kommt. Bei der Hypersensibilitätsreaktion der Haut sind zwei immunologische Schritte von Bedeutung: 1. die Sensibilisierungsphase, 2. die Auslösephase (Challenge). Während die Sensibilisierungsphase in der Regel asymptomatisch verläuft, kennzeichnet sich die Auslösephase durch klinisch manifeste Erscheinungen wie deutlich sichtbare Entzündungsreaktionen z.B. Rötungen, Papeln, Pusteln und Schuppungen. 26 2.4.1 Die Kontaktallergene Typische Kontaktallergene sind hochreaktive, lipophile, kleine Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht (unter 1kD), sogenannte Haptene, die in der Lage sind, durch die Hornhautbarriere in die Epidermis einzudringen. Durch Bindung an körpereigene Proteine (BASKETTER et al. 1995), auch als Carrier bezeichnet, werden sie in körperfremde Moleküle umgewandelt („altered self“), wodurch ein Immunogen entsteht. Diese Protein-Hapten-Komplexe werden von den Langerhanszellen internalisiert, prozessiert und über MHCII-Moleküle auf der Zelloberfläche präsentiert. Durch den Kontakt mit den Kontaktallergenen werden die antigenpräsentierenden Zellen und T-Lymphozyten aktiviert und die Produktion von inflammatorischen Zytokinen wie IL-1β und TNFα induziert (ENK u. KATZ 1992). Man unterscheidet zwischen stark und schwach wirksamen Substanzen je nach Immunogenität eines Haptens. Experimentell werden als Kontaktallergene z.B. TDI (Toluendiisocyanat), DNCB (Dinitrochlorbenzol), TNCB (Trinitrochlorbenzol) und DNFB (Dinitrofluorbenzol) eingesetzt. Gegensätzlich zu den klinisch relevanten Kontaktallergenen ist das Sensibilisierungspotential der experimentellen Kontaktallergene wesentlich höher. Haptene besitzen vermutlich proinflammatorische Eigenschaften und können abhängig von der Dosis subklinische Entzündungen auslösen (RIEMANN et al. 2003). 2.4.2 Die Sensibilisierungsphase Während dieser ersten Phase wird ein durch die Epidermis tretendes Hapten von den Langerhanszellen aufgenommen und über afferente Lymphgefäße in die parakortikalen Regionen der regionalen Lymphknoten transportiert (SILBERBERG et al. 1974). Während dieser Wanderung reifen sie zu potenten antigenpräsentierenden Zellen aus (WANG et al. 1997; WEINLICH et al. 1998). Im Lymphknoten angekommen, wird das Antigen via MHC-Moleküle den naiven T-Zellen präsentiert. Diese naiven T-Zellen werden aktiviert (priming), sofern sie den passenden T-ZellRezeptor tragen. Aktivierte T-Lymphozyten werden dazu stimuliert, das „cutaneous lymphocyte antigenʺ (CLA) als sogenannten Homingfaktor zu exprimieren und ins 27 Gewebe, vor allem der Haut, zu migrieren. Entscheidendes Ereignis der Sensibilisierung ist die Aktivierung und klonale Expansion der Hapten-spezifischen T-Lymphozyten (KIMBER u. DEARMAN 2002). Die Aktivierung der T-Zellen durch Langerhanszellen ist abhängig von zwei Signalen, die miteinander agieren müssen. Sowohl MHCI- oder MHCII-Moleküle als auch kostimulatorische Moleküle wie B7.1, B7.2 und ICAM-1 müssen exprimiert werden. Beide Signale zusammen führen zur Aktivierung und klonalen Expansion der Hapten-spezifischen T-Zellen. 2.4.3 Die Auslösephase (Challenge) Während der Auslösephase werden durch erneute Exposition mit dem Kontaktallergen Antigen-spezifische T-Zellen zum Ort des Geschehens, also dem Ort des Antigen-Kontakts, rekrutiert. In der Auslösephase überschneiden sich zwei Phasen, zum einen eine Antigen-unspezifische Phase zum anderen eine Antigenspezifische Phase. In der Antigen-unspezifischen Phase werden entzündliche Mediatoren aus Keratinozyten freigesetzt, die ihrerseits Endothelzellen aktivieren, so dass aktivierte T-Zellen die Gefäße verlassen und in das Gewebe migrieren können. Während dieser Phase werden Thrombozyten, Granulozyten, Makrophagen sowie dendritische Zellen aktiviert. In der Antigen-spezifischen Phase sezernieren aktivierte T-Zellen proinflammatorische Zytokine, vor allem IFN-γ und TNF-α (STEINMANN et al. 1993). Es folgt eine Entzündungsreaktion, die geprägt ist von unspezifischen Infiltraten aus mononukleären Zellen. Eine unspezifische irritative Aktivität des Haptens ist Voraussetzung, um eine allergische Kontaktallergie auszulösen (GRABBE u. SCHWARZ 1996). Neben Chemokinen spielt auch eine Expression der Adhäsionsmoleküle und eine gesteigerte Aktivierung des Gefäßendothels eine wichtige Rolle in der Auslösephase. Durch die gesteigerte Permeabilität des Gefäßendothels werden die charakteristischen Merkmale der Auslösephase der Kontaktdermatitis, wie Papeln, Pusteln, Ödeme und Erytheme der Haut sichtbar (GOEBELER et al. 2001). 28 2.4.4 TDI-Kontaktallergiemodell Toluen-2,4-diisocyanat Kunststoffindustrie (TDI) und wird ist ein wichtiges außerdem als Zwischenprodukt experimentelles in der Kontaktallergen verwendet. Es handelt sich um ein sogenanntes chemical respiratory allergen. Das Sensibilisierungspotential dieses Allergens ist hoch und löst eine allergische Reaktion aus, die gekennzeichnet ist durch Th2-typische Zytokine wie IL-4 und IL-10 in Lymphknotenzellen sensibilisierter Mäuse (DEARMAN et al. 1996). Im TDI-Modell bilden vor allem CD4+-Zellen das Bild der Entzündungsreaktion und ein Anstieg von IL-4 im Gewebe ist zu verzeichnen (BÄUMER et al. 2004). CUMBERBATCH et al. (2005) untersuchten die Rolle der Langerhanszelle in der Initiation der Immunantwort mittels TMA und DNCB. Bei TMA (trimellitic anhydride) handelt es sich, wie bei TDI, um ein chemical respiratory allergen. Es wurden Mäuse mit 25% TMA bzw. 1% DNCB auf der Dorsalseite der Ohren behandelt. Anschließend wurden die Zytokine unter anderem IL-10 und IL-1β gemessen. Sie fanden heraus, dass die Polarisierung der Immunantwort schon wenige Stunden (30 min. bis 4 Stunden) nach Allergenexposition beginnt und abhängig ist vom vorhandenen Zytokinmuster. So ist bei vorherrschender IL-10-Produktion nach Behandlung mit TMA die Immunantwort Th2 polarisiert. Der Effekt von TDI auf die LangerhanszellDichte wurde von BÄUMER et al. (2006) gezeigt. Hierbei wurde Mäusen wiederholt 5% TDI auf die enthaarte Bauchhaut topisch appliziert und 21 Tage später 0,5% TDI auf Dorsal- wie Ventralseite der Ohren appliziert. Anschliessend wurden die Ventralseiten der Ohren immunhistochemisch angefärbt und die LangerhanszellDichte, welche der MHCII-Dichte entspricht, bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die Langerhanszell-Dichte der Epidermis signifikant nach der TDI-Challenge reduziert wurde. BÄUMER et al. (2006) untersuchten außerdem den Effekt von Acetylsalicylsäure, Kontaktallergiemodell. Indomethacin Hierbei und zeigte sich Diflorasondiacetat bei systemisch im TDI- verabreichter Acetylsalicylsäure eine reduzierte Migration der DC zum Lymphknoten. Bei topisch verabreichtem Indomethacin kam es zu einer Reduktion der Entzündungsreaktion (entzündlichen Ohrschwellung). Zu einer Reduktion der Entzündung und Migration der DC kam es bei Diflorasondiacetat im TDI-Modell. 29 2.4.5 DNCB-Kontaktallergiemodell Ein weiteres experimentelles Kontaktallergen ist das 2,4-Dinitrochlorobenzol. Es handelt sich um ein sogennantes strong hapten, da es eine Sensibilisierungsstärke von nahezu 100% besitzt (KRASTEVA et al. 1999). Im Gegensatz zum TDI-Modell kommt es bei der Sensibilisierung mit DNCB zu einer Th1-Immunantwort des Organismus mit typischem Zytokinmuster (CUMBERBATCH et al. 2003; CUMBERBATCH et al. 2005). In der Auslösephase sind bei Behandlung mit DNCB vor allem CD8+-Zellen vorherrschend, während bei Verwendung von TDI CD4+Zellen das Bild der Entzündung dominieren (BÄUMER et al. 2004). In verschiedenen Untersuchungen wurde herausgefunden, dass bei der Th1-Antwort des Immunsystems die zytotoxischen CD8+-Zellen überwiegen, jedoch CD4+-Zellen nicht unbeteiligt sind (KRASTEVA et al. 1999; RIEMANN et al. 2003; KIMBER et al. 2000b). Nach KIMBER u. DEARMAN (2002) sind sowohl CD8+-Zellen als auch CD4+-Zellen abhängig vom Allergen für die vollständige Ausprägung einer allergischen Kontaktdermatitis erforderlich. Es wird angenommen, dass CD4+-Zellen die Haupteffektorzellen darstellen. Tabelle 2: Immunantwort der Kontaktallergiemodelle Kontaktallergiemodell Immunantwort Zytokine im Lymphknoten TDI Th2 IL-4 IL-10 DNCB Th1 IFN-γ IL-12 30 regionalen 2.5 Die irritative Kontaktdermatitis Die irritative Kontaktdermatitis wird definiert als nicht-immunologische Entzündungsreaktion der Haut auf bestimmte äußere Reize. Die irritative Kontaktdermatitis kommt vermutlich wesentlich häufiger vor als die allergische Kontaktdermatitis. Allerdings wird sie aufgrund von diagnostischen Schwierigkeiten oftmals unterbewertet. Die Manifestation der Reaktion kann sich als akute Dermatitis oder chronisch irritatives Kontaktekzem manifestieren. Bei der akut irritativen Kontaktdermatitis handelt es sich um eine akut toxische Reaktion, die sich nach äußerlichem Kontakt mit exogenen Noxen bei einer normalen Hautsensibilität entwickelt (BRAUN-FALCO et al. 1995). Meistens ist sie durch einen einzelnen Auslöser bedingt und manifestiert sich in wenigen Stunden oder Minuten. Das klinische Bild ist gekennzeichnet von Rötungen, Pusteln, Austrocknung, Blasen- und Gewebsnekrosen. Die chronisch irritative Kontaktdermatitis hingegen ist multifaktoriell bedingt. Sie tritt auf nach wiederholter Einwirkung mit primär nicht obligat-toxischen Stoffen in geringen Konzentrationen und über einen längeren Zeitraum hinweg. Auch die individuelle Bereitschaft der Haut Ekzeme auszubilden spielt hier eine entscheidende Rolle (BRAUN-FALCO et al. 1995). Oft gibt es Mischformen der allergischen und irritativen Kontaktdermatitis aufgrund von fließenden Übergängen der einzelnen Ekzemformen (LÖFFLER et al. 2000). Abhängig vom Irritans kommt es zu Schädigungen der Epidermis und Dermis. In den mittleren und oberen Schichten der Dermis kommt es zu leichten Entzündungsreaktionen. Histologisch ist die irritative Kontaktdermatitis nicht eindeutig von der allergischen Kontaktdermatitis abgrenzbar. In beiden Fällen sind Infiltrate von aktivierten T-Lymphozyten und anderen Leukozyten zu finden (BRASCH u. STERRY 1992). Irritantien scheinen bei der Beschleunigung der allergischen Reaktion eine wichtige Rolle zu spielen (JACOBS et al. 2006). Nach WANNER und SCHREINER (2008) hat das Irritans Sodiumdodecylsulfat allein kein Potential eine allergische Kontaktdermatitis zu induzieren. Entzündungsmediatoren, Wachstumsfaktoren und Zytokine spielen bei der irritativen Kontaktdermatitis wie bei der allergischen Kontaktdermatitis eine Rolle. So sind alle Zytokine, die bei der 31 allergischen Kontaktdermatitis Kontaktdermatitis präsent zu (BRAND finden et sind, al. auch 1996). bei Eine der irritativen akute irritative Kontaktdermatitis ist morphologisch der allergischen Kontaktdermatitis ähnlich. Unterscheidungsmöglichkeiten liegen in der Heilungsphase der Erkrankung. Man spricht von einem decrescendo Phänomen bei der irritativen Kontaktdermatitis, bei dem es sehr schnell zum Höhepunkt der Hautreaktion kommt, jedoch nach Entfernung des Irritans sofort zu heilen beginnt. Während bei der allergischen Kontaktdermatitis ein crescendo Phänomen beobachtet wird, bei dem selbst nach Entfernung des Allergens eine Zunahme der allergischen Reaktion auftritt (LEVIN u. MAIBACH 2002). Th1- und Th2-Helferzellen sowie deren Zytokine sind bei der Entstehung einer irritativen Kontaktdermatitis beteiligt (EFFENDY et al. 2000). Bei den Zytokinen handelt es sich vor allem um Produkte der Keratinozyten, Melanozyten und Langerhanszellen. Proinflammatorische Zytokine wie IL-6, IL-8, IL1β, IL-2 und IL-10 konnten gemessen werden (LINDBERG et al. 1991; BRAND et al. 1996). Die Rolle von IFN-γ und IL-4 bei der irritativen Kontaktdermatitis konnte bisher nicht geklärt werden (ASADA et al. 1997). Nach wiederholter Schädigung der Haut durch Tape-stripping sind in der Epidermis TNF-α, IL-8, IL-10, IFN-γ und ICAM-1 sowie in der Dermis IL-2, IL-4, IFN-γ, ICAM-1 und TGF-β zu finden (NICKOLOFF et al. 1994). 2.5.1 Sodiumdodecylsulfat (SDS) als Hautirritans Sodiumdodecylsulfat (syn.: Natriumlaurylsulfat) ist ein anionisches Detergenz mit einem Molekulargewicht von 288,4 g/mol, welches sich zusammensetzt aus zwölf Kohlenstoffketten (TUPKER et al. 1997). Sodiumdodecylsulfat wird in der Kosmetikindustrie z.B. als reinigende Komponente bzw. Emulgator in Shampoos, Duschgelen oder Zahnpasta verwendet. Es wird außerdem als experimentelles Irritans zur Testung der irritativen Kontaktdermatitis eingesetzt. Es ist das häufigst verwandte Irritans zur Untersuchung irritativer Reaktionen (LEE u. MAIBACH 1995). Sodiumdodecylsulfat wirkt auf verschiedene Hautstrukturen und schädigt in geringen Konzentrationen vor allem das Stratum corneum. Es penetriert sehr gut durch die 32 Hautbarriere in die Epidermis und ist in geringen Mengen auch in der Dermis zu finden. Bei längerer Einwirkzeit kann eine chronische Entzündung entstehen. Epidermale Keratinozyten scheinen durch Sodiumdodecylsulfat aktiviert bzw. stimuliert zu werden (VARANI et al. 1991; WILLIS et al. 1992). Bei hohen Konzentrationen des Irritans kommt es zu einer zytotoxischen Nekrose mit resultierendem Zelltod der Keratinozyten. Die Langerhanszellen werden durch Sodiumdodecylsulfat zur Maturation und Migration zum regionalen Lymphknoten angeregt (BRAND et al. 1993) und scheinen die Entzündungsreaktion zu stimulieren (JACOBS et al. 2006). Eine Verringerung der epidermalen Zelldichte sowie eine Zellaktivierung und/ oder – Degeneration sind außerdem gelegentlich zu sehen (FERGUSON et al. 1985; WILLIS et al. 1990). Weiterhin sind Schwellungen der Mitochondrien und Zytoplasmavakuolen sowie Membranrisse und zunehmende Zelldesorganisation zu finden (KOLDE u. KNOP 1987). Sowohl die Epidermis als auch Dermis sind nach Behandlung mit Sodiumdodecylsulfat infiltriert von Leukozyten. Vor allem CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten werden angelockt (BRASCH u. STERRY 1992). Eine direkte chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten konnte nachgewiesen werden (FROSCH u. CZARNETZKI 1987). Auch eine gesteigerte Expression von humanem CCL21 in Lymphgefäßen nach wiederholter Behandlung mit Sodiumdodecylsulfat konnte beobachtet werden (EBERHARD et al. 2004). 33 3 Material und Methoden 3.1 Geräte für Versuche in der Zellkultur Kühlzentrifuge Zentrifuge 5804 R, Eppendorf, Hamburg Brutschrank US AutoFlow, Zapf, Sarstedt Mikroskop Axiovert 25, Zeiss, Jena Neubauer-Zählkammer Albert, Sass Sterilfilter Minisart, Sartorius, Göttingen Polypropylen-Röhrchen, 15 ml/50 ml Greiner, Frickenhausen Petrischalen Tissue culture dish cell+, Sarstedt, USA 6-,12-,24,-96-well-plates Greiner, Frickenhausen Pipettenspitzen, 10 ml Greiner, Frickenhausen 96-well-plates, round-bottom Greiner, Frickenhausen Feinwaage Kern & Sohn GmbH, Balingen 3.2 Reagenzien für Versuche in der Zellkultur RPMI-1640-Medium Biochrom, Berlin, Deutschland Penicillin Invitrogen GmbH, Karlsruhe Streptomycin Invitrogen GmbH, Karlsruhe Amphotericin B Invitrogen GmbH, Karlsruhe Fetales Kälberserum (10%) Biochrom, Berlin Polyvidon-Iod-Lösung Braunol, Braun, Melsungen Trypan-Blau Sigma, Steinheim Ethanol Sigma, Steinheim 34 Lypopolysaccharid (LPS) E.coli O127 B8, Sigma, Steinheim Concanavalin A (ConA) Sigma-Aldrich Chemie, Deisenhofen Trypsin/EDTA (0,05 %/ 0,02 %) Biochrom, Berlin Trypsin (Trockensubstanz) Sigma-Aldrich Chemie, Deisenhofen 3.3 Geräte/Reagenzien für Cytospin Cytospin 3 Shanndon, Pennsylvania Filtercards Shanndon, Pennsylvania Entellan Merck, Darmstadt Pipetten Eppendorf, Frickenhausen Pipettenspitzen Eppendorf, Frickenhausen 3.4 Geräte/Reagenzien für ELISA DuoSet Mouse IL-6-ELISA R&D Systems, Wiesbaden DuoSet Mouse IL-10-ELISA R&D Systems, Wiesbaden DuoSet Mouse IFN-γ-ELISA R&D Systems, Wiesbaden Polystyrol-Nunc-Immuno-Platte Nunc GmbH, Wiesbaden Photometer Microplate Reader MRX, Dynatech Pipetten Eppendorf, Frickenhausen Pipettenspitzen Eppendorf, Frickenhausen Tween® 20 Sigma, Steinheim 3,3`, 5,5`-Tetramethylbenzidine (TMB) Sigma, Steinheim Stop-Puffer (2N H2SO4) Merck, Darmstadt 3.5 Geräte für die FACS-Analyse 96-Well-Kulturplatten, round bottom Greiner, Frickenhausen Coulter Epics XL Beckmann Coulter Compa ny, EXPO 32 ADC Software Miami, USA 35 3.6 Reagenzien für die FACS-Analyse MHCII-Antikörper Pharmin.gen, Hamburg, Red 670-Streptavidin Gibco, Gaitherburg, MD, USA CD25-Antikörper EuroBioScience GmbH CD4-Antikörper EuroBioScience GmbH CD207/Langerin AbCys., Paris 3.7 Hergestellte Puffer und Lösungen PBS-Puffer: • 8g NaCl • 0,2 g KCl • 1,44 g Na2PO4 • 0,2 g • aqua bidest. ad 1000 ml • pH 7,2 mit 1M HCl/1 M NaOH KH2PO4 TBS-Puffer: • 9 g NaCl • 6,057 g Tris Base • aqua bidest ad 1000 ml • pH 7,4 mit 1N HCL/1N NaOH RPMI-Medium für LLNA: • Dem Basismedium RPMI wurde hinzugefügt: • 10 % Fetales Kälberserum • 1 % Penicillin/ Streptomycin Gewebekultur-Medium (GK) 36 • Dem Basismedium (DMEM-Medium) wurde hinzugefügt: • 10 % Fetales Kälberserum • 1 % Penicillin/ Streptomycin • 1 % Amphotericin B 3.8 Immunhistochemie Adhäsionsbjektträger (75 X 25 X 1 mm) Histobond Superior, Marienfeld Deckgläser (24 X 60 mm) Roth, Karlsruhe Fluoreszenzmikroskop Axioskop, Zeiss, Jena Tischschüttler Vibra, Ika, Staufen Pasteurpipette Brand GmbH, Wertheim Biotin conjugated Rat Anti Mouse I-A/I-E Monoclonal Antibody Pharmingen International Cy3 Streptavidin Sigma, Steinheim Triton X 100 Serva Feinbiochemica, Heidelberg Ammoniumthiocyanat Riedl de Haen, Hannover Entellan Merck, Darmstadt Toluol AppliChem GmbH, Darmstadt 37 3.9 In-vivo-Versuche Ethanol Sigma, Steinheim DMSO Merck, Darmstadt TDI Sigma, Steinheim DNCB Sigma, Steinheim SDS Sigma, Steinheim Aceton Sigma, Steinheim Pipette 20µl Eppendorf, Frickenhausen Pipettenspitzen 20µl Eppendorf, Frickenhausen Kutimeter Mitutoyo, Neuss Enthaarungscreme Veet –Creme, Reckitt Benckiser Mannheim Tesafilm Beiersdorf, Hamburg Homogenisator, Duall Omnilab, Gehrden 3.10 Versuchstiere Der Tierversuch ist unter dem Aktenzeichen AZ: 509.6-42502-03/711 bei dem Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) genehmigt worden. Für die Versuche kamen klinisch gesunde, weibliche BALB/c, CD1 sowie NMRI Mäuse im Alter von acht Wochen mit einem Gewicht von ca. 20 g bzw. 26 g zum Einsatz. Die Tiere wurden in Käfigen mit je sechs Mäusen in einem zwölf Stunden Hell/Dunkel-Lichtzyklus gehalten. Wasser sowie Futter (Altrumin. 1324) standen ad libitum zu Verfügung. 38 3.11 In-vivo-Versuche zur Kontaktdermatitis 3.11.1 Versuchsübersicht Die Langerhanszellen nehmen eine wichtige Position im Rahmen des Immungeschehens ein. Da ihre Rolle in der allergischen Kontaktdermatitis bis heute nicht geklärt ist, liegt der Schwerpunkt dieser Arbeit auf dem Verhalten und der Beeinflussung der Langerhanszellen durch verschiedene Allergene sowie Irritantien in unterschiedlichen Konzentrationen. In vivo wurde im TDI- und DNCBKontaktallergiemodell sowie durch die Behandlung mit dem Irritans SDS die Beeinflussung von Langerhanszellen hinsichtlich ihres Migrationsverhaltens und ihrer Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren, untersucht. Hierfür wurden die verschiedenen Substanzen in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt. Das Ausmaß der Ohrschwellung als funktioneller Entzündungsparameter wurde per Kutimeter bestimmt und die Migrationsbereitschaft der Langerhanszelle mit Hilfe des Skin DC Migration Assays ermittelt. Als Parameter der T-Zellstimulation durch die Langerhanszelle und dermale dendritische Zelle, wurde das Gewicht sowie die Zellzahl der sensibilisierten Mäuse im Local Lymph Node Assay bestimmt. Weiterhin ist anhand dieser Zellen eine Kultur hergestellt worden und der Gehalt von IL-6, IL-10 sowie IFN-γ mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt worden. Außerdem wurde die Anzahl der Langerhanszellen im Lymphknoten mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskops und Cytospin ermittelt. Durch das Anfärben der Ohrepidermis mit Langerin und MHCII konnte dargestellt werden, dass die Population der MHCII+-Zellen identisch ist mit den Langerin+-Zellen der Epidermis. Mittels Durchflußzytometrie wurden die Lymphknotenzellen der Lnn. auriculares auf die Oberflächenmoleküle CD4/CD25 in der Sensibilisierung untersucht. Eine Übersicht der Versuche ist in Tabelle 3 dargestellt. 39 Tabelle 3: Übersicht der In-vivo-Versuche Untersuchte Parameter Sensibilisierung Sensibilisierung 4 Challenge 1-3 TDI/DNCB/SDS TDI/DNCB Gewichtsbestimmung X X Zellzahlbestimmung X X Langerin +-Zellen X TDI/DNCB/SDS Lnn. auriculares Mittels Neubauerzählkammer Lymphozytenzellkultur Messung der Zytokine:IL-6, IL-10, IFN-γ Cytospin X FACS CD4/CD25Expression Ohren Ohrdickenmessung Skin DC Migration Assay X X X X Langerin+-Zellen X Mittels Neubauerzählkammer Immunhistochemische Darstellung X MHCII/ Langerin+-Zellen 40 3.11.2 Toluen-2,4-diisocyanat (TDI)-Kontaktallergiemodell Zur Vorbereitung wurde den Tieren (verwendete Mausstämme: CD1; NMRI; BALB/c) Veet-Enthaarungscreme auf die Bauchhaut aufgetragen und nach etwa 15 min. mit einem angefeuchteten Tuch sorgfältig entfernt. Zwischen den verschiedenen Mausstämmen bestehen keine immunologischen Unterschiede (EHLING et al. 2005). Am nächsten Tag wurde die Bauchhaut mit Tesafilmabrissen insgesamt zehnmal behandelt, um ein besseres Eindringen des Kontaktallergens durch die Epidermis zu gewährleisten. Darauf folgte die topische Applikation von 5%igem TDI (in Aceton gelöst) auf die Bauchhaut. An den drei folgenden Tagen wurde die Sensibilisierung wiederholt, mit zunächst 100µl der TDI-Lösung am ersten Tag und an Tag zwei, drei und vier mit nur 50µl der Lösung. An Tag 21 wurde den Tieren erneut TDI 0,5% topisch auf die Bauchhaut appliziert. An Tag 28 wurden die Ohrdicken der Mäuse gemessen und darauffolgend in Gruppen eingeteilt, von denen einer Gruppe 0,5%iges TDI, einer weiteren 1%iges TDI sowie einer Gruppe 2%iges TDI auf die Ohrinnen- wie Außenseite aufgetragen wurde, um die Challenge auszulösen. Die Challenge manifestierte sich am nächsten Tag als Ohrschwellung. Die Ohren wurden in eine dorsale und ventrale Hälfte getrennt. Die dorsalen Ohrhälften wurden drei Tage im Skin DC Migration Assay kultiviert. Die ventralen Hälften wurden bei –20°C aufbewahrt und anschließend eine immunhistochemische Darstellung der MHCII+Zellen durchgeführt. Mit den gewonnen Lnn. auriculares wurde der Local Lymphnode Assay durchgeführt. 41 3.11.3 2,4-Dinitrochlorobenzol (DNCB)-Kontaktallergiemodell Vorbereitet wurden die Tiere (Mausstämme: NMRI und BALB/c) wie im TDIKontaktallergiemodell, indem die Bauchhaut mit Veet-Enthaarungscreme entfernt wurde. Den Tieren wurde 100µl 1%iges DNCB in Freundschen Adjuvans gelöst intracutan appliziert. Am darauffolgenden Tag wurde die Behandlung mit 50µl der Lösung wiederholt. Sieben Tage später erfolgte die Challenge, indem die Tiere in Gruppen unterteilt wurden. Einer Gruppe wurde 0,5%iges DNCB, einer weiteren 1%iges sowie einer Gruppe 2%ige DNCB je 20µl topisch auf Ohrinnen- wie Außenseite appliziert. Wie im TDI-Versuch wurden die lokalen Lnn. auriculares für den Local Lymphnode Assay verwendet. Die Ohren wurden in eine dorsale und ventrale Hälfte getrennt. Die dorsalen Ohrhälften wurden drei Tage im Skin DC Migration Assay kultiviert. Die ventralen Hälften wurden bei –20°C aufbewahrt und anschließend eine immunhistochemische durchgeführt. 42 Darstellung der MHC-II+-Zellen 3.11.4 Versuche zur Migration von Langerhanszellen in der Sensibilisierung A) Skin DC Migration Assay: Im Sensibilisierungsversuch 1-3 wurden unbehandelte BALB/c Mäuse auf vier Gruppen verteilt. Je eine Gruppe erhielt TDI, DNCB und SDS in unterschiedlichen Konzentrationen (n=4-8). Den Tieren wurde in den Konzentrationen 0,5%, 1%, 2% des Allergens bzw. Irritans topisch jeweils auf die Innenseite, sowie Außenseite der Ohren aufgetragen. Eine unbehandelte Kontrollgruppe wurde als Negativkontrolle mitgeführt. Die Tiere wurden eine Stunde nach Behandlung der Ohren mittels zervikaler Dislokation getötet. Die behandelten Ohren wurden abgetrennt und anschließend in eine dorsale und ventrale Hälfte getrennt. Die dorsale Hälfte wurde für drei Tage im Skin DC Migration Assay kultiviert. B) Local Lymph Node Assay (LLNA): Im Sensibilisierungsversuch 4 wurden unbehandelte NMRI Mäuse auf vier Gruppen verteilt. Drei Tage in Folge wurde je eine Gruppe mit TDI, DNCB und SDS (0,5%; 1%; 2%) topisch auf der Innen- wie Außenseite der Ohren behandelt. Am vierten Tag wurden die Tiere nicht behandelt. Am fünften Tag wurden die Tiere mittels zervikaler Dislokation getötet. Die Ohrdicken wurden am ersten Tag vor der Behandlung sowie am fünften Tag nach der letzten Behandlung gemessen. Nach der Tötung der Tiere wurde ein Local Lymph Node Assay (LLNA) durchgeführt und die Anzahl der Langerin positiven Zellen mittels Neubauerzählkammer unter dem Fluoreszenzmikroskop ermittelt. Ein Teil der Zellsuspension wurde mit Concanavalin stimuliert und anschließend die Zytokine IL6, IL-10 und IFN-γ mittels ELISA gemessen. Ein Aliquot der Suspension wurde mittels FACS-Analyse auf die Oberflächenmarker CD4/CD25 untersucht. Die Ohrepidermis wurde trypsiniert und anschließend mit dem Langerin-Antikörper angefärbt. Hier wurde, wie bei den Zellen des Local Lymph Node Assay mit Hilfe der Neubauerzählkammer und dem Fluoreszenzmikroskop die Anzahl der Langerin positiven Zellen bestimmt. 43 3.11.5 Mouse Ear Swelling Test In Anlehnung an GAD et al. (1986); BÄUMER et al. (2004); BÄUMER et al. (2005) wurden die Ohrdicken der Mäuse vor und nach der Behandlung mit TDI, DNCB sowie SDS mittels eines Kutimeters (Mitutoyo, Neuss) gemessen. Durch die Schwellung der Ohren kann auf die durch die Allergene bzw. Irritantien ausgelöste Entzündungsreaktion rückgeschlossen werden. Die Ohrschwellung ergibt sich aus der Differenz der ersten und zweiten Messung. 3.11.6 Skin DC Migration Assay Das Prinzip des Skin DC Migration Assays ist es, die Auswanderung der Langerhanszellen und dermalen dendritischen Zellen aus der Maushaut zu bestimmen und ihr Migrationsverhalten unter Einfluss von immunogenen Substanzen zu untersuchen. Dieser Assay basiert auf der Methode von ORTNER et al. (1996). Nach Tötung der Mäuse wurden die Ohren mit einer Pinzette und Schere abgetrennt und für ca. 10 min. in 70% Ethanol-Lösung desinfiziert und nachfolgend luftgetrocknet. Die dorsale und ventrale Ohrhälfte wurde mit zwei Pinzetten voneinander getrennt. Die dorsale, knorpelfreie Ohrhälfte wurde mit der Dermis nach unten gerichtet auf ein dreibeiniges Gitternetz in eine 24-well-Platte mit Kulturmedium (GK mit FKS, Pen/Strep und Amphotericin B) überführt. Über 3 Tage wurde die Kultur im Brutschank bei 37°C inkubiert. Täglich erfolgte eine Umsetzung der Ohren mit Gitternetz in eine neue Platte mit frischem Kulturmedium. Die Medien von Tag 2 und 3 wurden gepoolt und zentrifugiert (1000g, 4°C, 10 min.), die Überstände verworfen und die ausgewanderten Zellen in der Neubauerzählkammer ausgezählt. Nachdem die Ohrhälften getrocknet und gewogen waren, wurden sie bei –80°C eingefroren. Die Zahl der migrierten Zellen wurde pro mg Ohrgewebe angegeben. 44 Formeln: Anzahl ausgewanderter Zellen = gez. Zellen x 3 x 10.000 x Restvolumen[ml] / 4 Anzahl ausgewanderter Zellen/mg Ohrgewebe = ausgewanderte Zellen/Ohrgewicht 3.11.7 Trypsinierung der Ohrepidermis Um den Einfluß der unterschiedlichen Konzentrationen der Allergene bzw. Irritantien auf das Migrationsverhalten der Langerhanszelle zu untersuchen, wurden die abgetrennten Mausohren mit Trypsin nach STOITZNER et al. (2003) behandelt. So erhielt man eine größere Zellausbeute als im Skin DC Migration Assay. Zur Aufbereitung der Proben wurden die Ohren mittels Pinzette zunächst in eine ventrale und dorsale Hälfte getrennt. Anschließend wurden die Ohrhälften in einer Trypsinlösung (10mg Trypsin/ml PBS) eine halbe Stunde bei 37°C inkubiert. Darauf folgte eine Abtrennung der Ohrepidermis. Die Epidermis wurde nun mit einer Schere in feine Stücke zerlegt. Danach wurden die Epidermisstücke in ein Becherglas mit 2 ml EDTA-Trypsin überführt und auf den Magnetrührer gestellt. Dort wurde die Probe solange gerührt bis eine homogene Lösung entstand. Danach wurde die Probe durch ein Sieb in ein Falconröhrchen überführt und anschließend zentrifugiert (400g, 5 Minuten, 4°C). Nach Dekantierung des Zellüberstandes wurde das Zellpellet im verbleibenden Restvolumen resuspendiert. Nach Aufnahme des Zellpellets in 200 µl 0,1% PBS/BSA-Lösung wurde die Zellsuspension in eine roundbottomMikrotiterplatte überführt, erneut zentrifugiert (400g, 5 Minuten, 4°C) und die Überstände abgeschüttet. Nach einem weiteren Waschvorgang wurden die Zellen mit der Permeabilisierungslösung (BD Cytofix/Cytoperm) für 10 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend folgten zwei weitere Waschschritte. Danach wurden die Zellen mit dem Antikörper (CD207/Langerin) für 30 Minuten bei 4°C inkubiert, gefolgt von zwei Waschschritten und der Aufnahme des Zellpellets in 300 µl PBS. Die Anzahl der Langerin positiven Zellen wurde mit Hilfe der Neubauerzählkammer unter dem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. Hierfür wurde die Gesamtzellzahl in Beziehung zu der Anzahl der Langerin positiven Zellen gesetzt. 45 3.11.8 Local Lymph Node Assay (LLNA) Die Proliferationsrate von T-Lymphozyten eines Lymphknotens nach Stimulation durch antigenpräsentierende Zellen lässt sich mit Hilfe des LLNA bestimmen. Die zu untersuchenden Lymphknoten (Lnn. auriculares) wurden post mortem entnommen, die Faszie entfernt und anschließend ihr Gewicht bestimmt. Das Gewicht des Lymphknotens spiegelt die stattgefundene T-Zellproliferation wider, die durch antigenpräsentierende dendritische Zellen nach Kontakt mit TDI- bzw. DNCB induziert wurde (EHLING et al. 2005). Die Zellen der Lymphknoten wurden in einem Zellsuspension–Trypan-Gemisch in einer Neubauerzählkammer bestimmt. Nachfolgend wurden die Zellen in der FACSAnalyse auf ihre Oberflächenmoleküle (CD4, CD25) untersucht. Die Methode erfolgte in Anlehnung an (EHLING et al. 2005). 3.11.9 In-vitro-Stimulierung der LN-Zellen mit Concanavalin A Von der durch den LLNA hergestellten Zellsuspension wurden von jeder Probe 5x105 Zellen entnommen. Diese wurden in jeweils ein Well einer 48-Well-Platte überführt und mit RPMI-Medium auf 500 µl aufgefüllt. ConA wurde in einer Konzentration von 2 µg/ml zu jeder Probe hinzugefügt und resuspendiert. ConA fungiert als Mitogen, welches die T-Lymphozyten stimuliert. Nach 48 Stunden der Stimulierung wurden die Überstände entnommen und bis zur Messung der Zytokine mittels ELISA bei -20°C gelagert. 3.11.10 Bestimmung der IL-6-, IFN-γγ- und IL-10-Konzentration mittels ELISA Zur Bestimmung der Konzentrationen von IL-6, IL-10 und IFN-γ nach Stimulierung der LN-Zellen mit ConA wurde ein enzymgebundener Immunadsorptionstest (ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) verwendet. Der ELISA wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt. 46 3.11.11 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Die Durchflusscytometrie (FACS®) ermöglicht es, Zellen zu identifizieren und anhand ihrer Oberflächenmoleküle zu sortieren. Grundlage der Analyse ist die AntigenAntikörper-Reaktion. Man verwendet spezifische, gegen Antigene der Zelloberfläche gerichtete fluoreszenzmarkierte Antikörper. Die Zellen werden durch eine Kapillare gedrückt, so entsteht ein Strom der einzelnen Zellen, der wiederum von einem gebündeltem Laserstrahl mit geeigneter Wellenlänge (Argonlaser, λ =588 nm) erfasst wird. Fotomultiplier messen die Lichtstreuung als Maß für die Größe und Granularität einer Zelle und die Emissionen der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe. Hierzu gibt es zwei Parameter: das Seitwärtsstreulicht (SSC=Side Scatter) als Maß für die Granularität und das Vorwärtsstreulicht (FSC=Forward Scatter) als Maß für die Zellgröße. Es ist möglich, Fluoreszenzfarbstoffen gleichzeitige durchzuführen, da Messungen der jeweilige mit verschiedenen Farbstoff über ein charakteristisches Emmissionsspektrum verfügt. Alle Farbstoffe lassen sich bei einer gemeinsamen Wellenlänge anregen. Die emittierte Photonenkonzentration verhält sich proportional zu der Menge der gebundenen Antikörper. Die in der Arbeit verwendeten Antikörper sind an fluoreszierende Farbstoffe (FITC, PE) gekoppelt und gegen bestimmte Oberflächenmoleküle der T-Zellen (CD4,CD25; Verdünnung 1:100) gerichtet. Die gewonnenen Zellsuspensionen aus dem Local Lymph Node Assay wurden in Roundbottom-wells überführt und zweimal mit PBS (0,1% bovines Serumalbumin und 0,1% Natriumnitrit enthaltend) gewaschen. Nachfolgend wurde die Mikrotiterplatte zentrifugiert (600g, 4°C, 5 min.) und die Überstände dekantiert. Nach einem weiteren Waschvorgang wurden die Zellen mit den Antikörpern für 30 Minuten bzw. für 10 Minuten mit Permeabilisierungslösung im Kühlschrank inkubiert. Danach erfolgten zwei weitere Waschschritte wie oben beschrieben und schließlich die Aufnahme des erhaltenen Zellpellets in 300 µl PBS. Abschließend erfolgte die Aufnahme in 300 µl PBS. 47 3.11.12 Cytospin Die Cytozentrifugation ist eine Methode, um eine Zellsuspension in bestimmter Konzentration auf einen Objektträger zu bringen, ohne dass sich Salzkristalle bilden. Dazu wurden 100µl Zellsuspension, die etwa 5000 Zellen enthielten, in einen Trichter gegeben und durch Cytozentrifugation in der Cytospinzentrifuge (600rpm, 5 min) auf einen Objektträger transferiert. Das Medium mit den zu untersuchenden Zellen wurde bei diesem Vorgang von Filterpapier aufgesogen. Die Objektträger mit den Zellen wurden über Nacht abgedunkelt getrocknet und anschliessend mit Entellan und einem Deckgläschen eingedeckt. Ausgewertet wurden die Langerin positiven Zellen der Epidermis mit einem Fluoreszenzmikroskop in Anlehnung an STOITZNER et al. (2003). Mittels der Cytospinzentrifugation sollte in dieser Arbeit die Anzahl der Langerin positiven Zellen des Skin DC Migration Assays der Mausepidermis ermittelt werden. Die Zellen wurden hierfür in Mikrotiterplatten mit PBS überführt. Anschliessend wurde die Mikrotiterplatte zentrifugiert (400g, 5 min.) und die Überstände abgenommen. Der Waschvorgang wurde zweimal wiederholt, bevor die Zellen mit dem Fixier- und Permeabilisierungskit von BD-Pharmingen fixiert und permeabilisiert wurden. Anschliessend wurden die Zellen mit dem Antikörper Langerin/CD207 (Verdünnung 1:500) gefärbt. Die Inkubationszeit betrug 30 Minuten bei 4°C. 48 3.11.13 Immunhistochemische Erfassung der Dichte der MHCII/Langerin+ -Zellen Für die Darstellung der MHCII/Langerin+-Zellen wurden sowohl die dorsalen Hälften der Ohren der Sensibilisierungsphase sowie die ventralen Hälften der Ohren aus der Challenge benötigt. Zunächst wurden die zuvor bei –80°C eingefrorenen Ohrhälften in 3,8% iger Ammoniumthiocyanatlösung (mit Aqua Dest.) für ca. 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden sie in TBS kurz geschwenkt und nachfolgend wurde die Epidermis mit Hilfe eines stumpfen Skalpells von der Dermis gelöst. Die Epidermis wurde daraufhin in eine 48 Well-Platte mit PBS überführt. Die Platte wurde dreimal hintereinander für fünf Minuten auf den Tischschüttler gestellt. Jedesmal wurde PBS abpipettiert und frisches PBS zugefügt. Nach dreimaligem Waschen wurde die Epidermis mit Antikörperlösung (MHCII in TBS mit 0,17% Triton X im Verhältnis 1:150) bedeckt. Die Ohren wurden über Nacht im Kühlschrank auf einem Schüttler inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Antikörperlösung abpipettiert und die Ohren wurden dreimal mit TBS gewaschen. Danach wurde für die Fluoreszenzfärbung der MHCII- bzw. Langerin+-Zellen Streptavidin Cy3 im Verhältnis 1:4000 auf die Ohrepidermis pipettiert und für neunzig Minuten abgedunkelt auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die Ohrepidermis nach letztmaligem Waschen in bidestilliertes Wasser gegeben und mit einem Pinsel auf Adhäsionsobjektträger überführt. Danach folgte für drei Tage ein Toluol-Bad. Zuletzt wurde die Epidermis mit Entellan® und einem Deckgläschen eingedeckt. Für unsere Arbeitgruppe war es vor allem von Bedeutung herauszustellen, dass es sich bei der Population der MHCII+-Zellen um eine mit den Langerin+-Zellen identische Population handelt. 49 3.12 Statistische Auswertung Alle Versuche wurden, für die meisten Endpunkte, in mindestens zwei unabhängigen Anläufen durchgeführt. Die Anzahl der Messwerte (n) im Ergebnisteil gibt den Stichprobenumfang identischer Versuche an. Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte unter Angabe der Mittelwerte (MW) ± Standardabweichung (S.D.) und bei starker Variation in Form von Medianboxen. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen und den Kontroll- bzw. Vehikelgruppen wurden anhand einer parametrischen Varianz-Analyse (One-way-Anova) und anschließendem post-hoc-Test (Dunnetts Test) überprüft. Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Programm GraphPadPrism 5. Dabei galt eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% als schwach signifikant, eine von 1% als signifikant und eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,1% als hoch signifikant. Den Anhangstabellen sind die Einzelwerte zu entnehmen. 50 4 Ergebnisse 4.1 In-vivo-Untersuchungen in der Sensibilisierung 4.1.1 Ergebnisse des Skin DC Migration Assays In diesem Versuch wurde der Einfluss verschiedener Konzentrationen der eingesetzten Substanzen auf das Auswanderverhalten der Zellen aus den Ohrexplantaten untersucht. Die Tiere wurden eine Stunde nach der topischen Behandlung mittels zervikaler Dislokation getötet. Die dorsalen Ohrhälften wurden drei Tage im Skin DC Migration Assay kultiviert. Man erkennt einen signifikanten Anstieg ausgewanderter dendritischer Zellen, abhängig von der Dosis des Allergens bzw. Irritans. Der Versuch wurde zweimal durchgeführt. Einzelwerte des zweiten 800 *** 600 * 400 * ** *** ** 200 O 0, N 5% C D B1 N C % B T D 2% I0 ,5 TD % I1 TD % SD I 2 S % 0, SD 5% S SD 1% S 2% 0 D D N C B K migrierte Zellen/mg Ohrgewebe Versuchs sind der Tabelle 9-1 im Anhang zu entnehmen. Abbildung 4-1 Abhängigkeit der DC-Migration von der Konzentration der Haptene/ des Irritans nach topischer Verabreichung,*p< 0,05; **p< 0,01; ***p< 0,001; n=4. 51 4.1.2 Ergebnisse des Mouse Ear Swelling Tests Abbildung 4-2 bis 4-4 zeigen die durch DNCB, TDI und SDS hervorgerufene Ohrschwellung der Tiere, welche sich aus der Differenz der Ohrdickenmessung vor der ersten topischen Applikation der Haptene bzw. des Irritans und 48 Stunden nach der letzten Verabreichung errechnet. Die durch die Kontaktallergene DNCB- sowie TDI-induzierte Ohrschwellung nimmt im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle dosisabhängig signifikant zu. Auch die zu beobachtende Schwellung der Ohren durch das Irritans SDS nimmt im Vergleich zur Kontrolle dosisabhängig zu, ist jedoch deutlich geringer als die durch die Kontaktallergene induzierte Ohrschwellung. Ear swelling (µm) 400 *** 300 * * 200 100 2% 1% D N C B B N C D D N C B K O 0, 5% 0 Abbildung 4-2 Steigerung der Ohrschwellung abhängig von der Konzentration des topisch verabreichten DNCB. Messung der Ohrschwellung (µm) 48 Stunden nach letzter Behandlung mit DNCB, *p< 0,05; ***p< 0,001; n=8. 52 *** Ear swelling (µm) 400 300 ** 200 100 % % TD I2 TD I1 0, 5% TD I K O 0 Abbildung 4-3 Steigerung der Ohrschwellung abhängig von der Konzentration des topisch verabreichten TDI. Messung der Ohrschwellung (µm) 48 Stunden nach letzter Behandlung mit TDI, **p< 0,01; ***p<0,001; n=8. Ear swelling (µm) 500 400 300 * * 200 100 2% SD S 1% SD S 0, 5% SD S K O 0 Abbildung 4-4 Steigerung der Ohrschwellung abhängig von der Konzentration des topisch verabreichten SDS. Messung der Ohrschwellung (µm) 48 Stunden nach letzter Behandlung mit SDS, *p< 0,05; n=8. 53 4.1.3 Einfluss topisch verabreichter Haptene/Irritantien auf das Migrationsverhalten der Langerhanszellen 4.1.3.1 Ergebnisse der Trypsinierung der Ohrepidermis In diesem Versuch wurden die zuvor mit DNCB, TDI und SDS behandelten Mausohren, 48 Stunden nach der letzten Behandlung, abgetrennt und mit Trypsin aufbereitet. Die so erhaltene Zellausbeute der Ohrepidermis wurde mit dem Antikörper CD207/Langerin angefärbt und schließlich die Anzahl der Langerhanszellen mittels Neubauerzählkammer und Fluoreszenzmikroskop ermittelt. Es ist eine leichte Abnahme der Langerhanszellen in der Ohrepidermis nach Behandlung mit den Kontaktallergen DNCB und TDI zu beobachten. Nach Behandlung mit dem Irritans SDS ist keine dosisabhängige Abnahme der 3 2 1 2% D N C B B C N D D N C B K 1% 0, 5% 0 O %Langerin positive Zellen Langerhanszellen zu sehen. Abbildung 4-5a Abnahme der Langerhanszellen in der Ohrepidermis in Abhängigkeit der aufgetragenen Konzentration von DNCB. Aufgrund einer zu geringen Zellzahl wurde die Probenzahl von n=8 gepoolt auf n=4. 54 2 1 % % TD I2 TD I0 TD I1 ,5 % 0 K O %Langerin positive Zellen 3 Abbildung 4-5b Abnahme der Langerhanszellen in der Ohrepidermis in Abhängigkeit der aufgetragenen Konzentration von TDI. Aufgrund einer zu geringen Zellzahl wurde die Probenzahl von 3 2 1 2% SD S 1% S SD SD S K 0, 5% 0 O %Langerin positive Zellen n=8 gepoolt auf n=2. Abbildung 4-5c Keine Abnahme der Langerhanszellen in der Ohrepidermis durch die aufgetragenen Konzentrationen von SDS. Aufgrund einer zu geringen Zellzahl wurde die Probenzahl von n=8 gepoolt auf n=2. 55 4.1.3.2 Ergebnisse des Local Lymph Node Assays Nachdem die Ohrdicke der Mäuse bestimmt wurde, wurden die Tiere mittels zervikaler Dislokation getötet und die regionalen Lnn. auriculares für den Local Lymph Node Assay entnommen. Von den Lymphknoten wurden das Gewicht und die Zellzahl bestimmt. Die Applikation von aufsteigenden Konzentrationen von DNCB und TDI an drei aufeinanderfolgenden Tagen bewirkt eine signifikante dosisabhängige Zunahme der Lymphknotengewichte und analog dazu auch eine signifikante Zunahme der Zellzahlen. Aufsteigende Konzentrationen des Irritans SDS ergeben hingegen nur moderate Zunahmen der Gewichte und Zellzahlen der regionalen Lymphknoten im Vergleich zur Kontrolle (siehe Abb. 4-6a-c). 0 D NC B B NC D B D NC 2% 1% K 2% B 1% B * 10 D N C B K D N C D N C 0, 5% 0 20 % 10 *** 0, 5 * 20 30 O *** Lymphknotenzellzahl (Mio) *** 30 O Lymphknotengewicht (mg) *** Abbildung 4-6a Lymphknotengewichte und Zellzahlen nach topischer Applikation von DNCB in aufsteigenden Konzentrationen. Die Behandlungsdauer betrug 3 Tage, die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung. Die durch DNCB induzierte T-Zellproliferation und damit das Gewicht und die Zellzahl nehmen dosisabhängig zu, *p< 0,05; ***p< 0,001; n=8. 56 10 0 % TD I0 K % 20 TD I2 ,5 TD I0 TD I1 % 0 *** TD I2 % 10 *** TD I1 % 20 30 ,5 % *** O *** *** Lymphknotenzellzahl (Mio) 30 K O Lympknotengewicht (mg) *** Abbildung 4-6b. Lymphknotengewichte und Zellzahlen nach topischer Applikation von TDI in aufsteigenden Konzentrationen. Die Behandlungsdauer betrug 3 Tage, die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung. Die durch TDI induzierte T-Zellproliferation und damit das 10 2% SD S SD S SD S K 2% 1% 0 SD S SD S 0, 5% SD S K 1% 0 20 0, 5% 10 30 O ** 20 Lymphknotenzellzahl (Mio) 30 O Lymphknotengewicht (mg) Gewicht und die Zellzahl nehmen zu, ***p< 0,001; n=8. Abbildung 4-6c Lymphknotengewichte und Zellzahlen nach topischer Applikation von SDS in aufsteigenden Konzentrationen. Die Behandlungsdauer betrug 3 Tage, die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung. Das Gewicht und die Zellzahl nehmen vergleichsweise leicht zu, **p< 0,01; n=8. 57 4.1.3.3 Langerin-positive-Zellen im regionalen Lymphknoten Im Anschluss an die Gewichts- und Zellzahlbestimmung der Lnn. auriculares wurden die Zellen mit dem Antikörper CD207/Langerin gefärbt und anschließend mittels Fluoreszenzmikroskop und Neubauerzählkammer die Anzahl der Langerhanszellen ermittelt. Sowohl DNCB als auch TDI induzieren in Abhängigkeit der Konzentration einen Anstieg der Langerhanszellen im Lymphknoten. Die mit dem Irritans SDS *** 200000 * 150000 100000 50000 D N C B 1% B D N C 0, 5% B D N C 2% 0 K O Langerin positive Zellen/Lymphknoten behandelte Gruppe zeigt keine Zunahme der Langerhanszellen im Lymphknoten. Abbildung 4-7a Die regionalen Lymphknoten der behandelten Ohrseiten wurden 48 Stunden nach der letzten DNCB-Applikation und nach Bestimmung von Gewicht und Zellzahl mit Langerin/CD207 angefärbt und anschließend mittels Fluoreszenzmikroskop und Neubauerzählkammer die Anzahl der Langerin-positiven Zellen bestimmt, n=8 *p< 0,05; ***<p 0,001; n=8. 58 150000 * * 100000 50000 % % TD I2 I0 TD TD I1 ,5 % O 0 K Langerin positive Zellen/Lymphknoten *** 200000 Abbildung 4-7b Die regionalen Lymphknoten der behandelten Ohrseiten wurden 48 Stunden nach der letzten TDI-Applikation und nach Bestimmung von Gewicht und Zellzahl mit Langerin/CD207 angefärbt und anschließend mittels Fluoreszenzmikroskop und Neubauerzählkammer die Anzahl der Langerin-positiven Zellen bestimmt, 200000 150000 100000 50000 2% SD S 1% SD S 0, 5% SD S O 0 K Langerin positive Zellen/Lymphknoten *p<0,05; ***p< 0,001; n=8. Abbildung 4-7c Die regionalen Lymphknoten der behandelten Ohrseiten wurden 48 Stunden nach der letzten SDS-Applikation und nach Bestimmung von Gewicht und Zellzahl mit Langerin/CD207 angefärbt und anschließend mittels Fluoreszenzmikroskop und Neubauerzählkammer die Anzahl der Langerin-positiven Zellen bestimmt, n=8. 59 4.1.4 Einfluss von DNCB, TDI und SDS auf die IL-6-, IFN-γγ- und IL-10Produktion Die aus den Lymphknoten gewonnenen Zellen wurden in vitro mit Concanavalin A stimuliert und anschließend der Gehalt an IL-6, IFN-γ und IL-10 gemessen. Die Skalierungen der einzelnen Messungen (IL-6, IFN-γ und IL-10) sind für den besseren Vergleich einheitlich dargestellt. 4.1.4.1 IL-6-Produktion 500 IL-6 (pg/ml) 400 300 200 * 100 D N C B 2% 1% N C B D D N C B K O 0, 5% 0 Abbildung 4-8a IL-6-Produktion in den Überständen der mit ConA stimulierten Lymphknotenzellen nach dreitägiger Behandlung mit DNCB in aufsteigenden Konzentrationen. Die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung mit DNCB. n=8; *p< 0,05. 60 500 IL-6 (pg/ml) 400 *** 300 200 100 I2 % TD I1 % TD TD I0 ,5 % K O 0 Abbildung 4-8b IL-6-Produktion in den Überständen der mit ConA stimulierten Lymphknotenzellen nach dreitägiger Behandlung mit TDI in aufsteigenden Konzentrationen. Die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung mit TDI. n=8; ***p< 0,001. ** 500 IL-6 (pg/ml) 400 ** 300 200 100 2% SD S 1% SD S 0, 5% SD S K O 0 Abbildung 4-8c IL-6-Produktion in den Überständen der mit ConA stimulierten Lymphknotenzellen nach dreitägiger Behandlung mit SDS in aufsteigenden Konzentrationen. Die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung mit SDS. n=8; **p< 0,01. 61 4.1.4.2 IFN-γγ-Produktion IFN-gamma(pg/ml) 4000 3000 ** ** 2000 1000 D N C B 2% 1% D NC B 0, 5% D NC B K O 0 Abbildung 4-9a IFN-γ-Produktion in den Überständen der mit ConA stimulierten Lymphknotenzellen nach dreitägiger Behandlung mit DNCB in aufsteigenden Konzentrationen. Die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung mit DNCB, n=8; **p< 0,01. * IFN-gamma(pg/ml) 4000 3000 2000 1000 % TD I2 % TD I1 ,5 % TD I0 K O 0 Abbildung 4-9b IFN-γ-Produktion in den Überständen der mit ConA stimulierten Lymphknotenzellen nach dreitägiger Behandlung mit TDI in aufsteigenden Konzentrationen. Die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung mit TDI, n=8; *p< 0,05. 62 IFN-gamma(pg/ml) 4000 3000 2000 1000 2% SD S 1% SD S SD S K 0, 5% O 0 Abbildung 4-9c IFN-γ-Produktion in den Überständen der mit ConA stimulierten Lymphknotenzellen nach dreitägiger Behandlung mit SDS in aufsteigenden Konzentrationen. Die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung mit SDS. n=8. 4.1.4.3 IL-10-Produktion IL-10 (pg/ml) 8000 6000 4000 *** 2000 2% D N C B 1% D NC B 0, 5% D NC B K O 0 Abbildung 4-10a IL-10-Produktion in den Überständen der mit ConA stimulierten Lymphknotenzellen nach dreitägiger Behandlung mit DNCB in aufsteigenden Konzentrationen. Die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung mit DNCB, n=8; ***p< 0,001. 63 IL-10 (pg/ml) *** *** 8000 6000 *** 4000 2000 % TD I2 % TD I1 ,5 % TD I0 K O 0 Abbildung 4-10b IL-10-Produktion in den Überständen der mit ConA stimulierten Lymphknotenzellen nach dreitägiger Behandlung mit TDI in aufsteigenden Konzentrationen. Die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung mit TDI, n=8; ***p< 0,001. IL-10 (pg/ml) 8000 6000 4000 2000 2% SD S 1% SD S 0, 5% SD S K O 0 Abbildung 4-10c IL-10-Produktion in den Überständen der mit ConA stimulierten Lymphknotenzellen nach dreitägiger Behandlung mit SDS in aufsteigenden Konzentrationen. Die Probenentnahme erfolgte 48 Stunden nach letzter Behandlung mit SDS, n=8. 64 4.1.5 Einfluss auf die CD4/CD25-positiven Zellen im Lymphknoten Ein Teil der im Local Lymph Node Assay gewonnenen Zellsuspension wurde auf die Oberflächenmarker CD4/CD25 untersucht. Die Menge der CD4/CD25-positiven Zellen wurde mittels FACS-Analyse ermittelt und auf die vorher bestimmte Zellzahl bezogen dargestellt. Es kommt sowohl bei der DNCB- als auch bei der TDI-Gruppe zu einer dosisabhängigen erhöhten Expression von CD4/CD25. In der SDS-Gruppe befindet sich die Expression auf dem Kontrollniveau. Abbildung 4-11 linkes Bild: ungefärbte Leerkontrolle, mittleres Bild: 0,5% DNCB, rechtes Bild: 1% DNCB. Es ist eine leichte Zunahme der CD4/CD25-positiven Zellen von 0,5% zu 1% DNCB zu erkennen. Auf der x-Achse ist CD25, auf der y-Achse CD4 aufgetragen. Die CD4/CD25-positiven Zellen befinden sich im rechten oberen Quadranten. 65 In der Abb. 4-11a sind die in der FACS-Analyse bestimmten CD4/CD25-positiven Zellen von DNCB und SDS dargestellt. Da für die TDI-Behandlungsgruppe die Probenzahl n=1 beträgt, liegt kein Diagramm vor. Innerhalb der DNCB- sowie TDIGruppe kommt es zu dosisabhängigen Zunahmen der CD4/CD25-positiven Zellen im regionalen Lymphknoten. Die Einzelwerte der Gruppen sind der Tabelle 9-6 im 200000 2% SD S SD S SD S 1% 0 5% B 2% 1% B D NC B C N D D NC O 0, 5% 0 400000 0, 200000 600000 O 400000 800000 K 600000 CD4/CD25-positive Zellen/Lymphknoten 800000 K CD4/CD25-positive Zellen/Lymphknoten Anhang zu entnehmen. Abbildung 4-11a Analyse der Lymphknotenzellen im Durchflußzytometer. Darstellung der CD4/CD25positiven Zellen nach topischer Verabreichung von DNCB und SDS in aufsteigenden Konzentrationen, gepoolte Probenzahl von n=8 auf n=2. 66 4.2 In-vivo-Untersuchungen in der Challenge In den beiden Kontaktallergiemodellen mit TDI und DNCB ist den Mäusen in verschiedenen Konzentrationen das jeweilige Kontaktallergen topisch auf die Ohren aufgetragen worden. Nachdem die Ohrschwellung der Mäuse gemessen wurde, erfolgte die Tötung der Tiere 24 Stunden nach letzter Behandlung mittels zervikaler Dislokation. Darauf folgte ein Skin DC Migration Assay, ein Local Lymph Node Assay, die Anfertigung eines Cytospin, sowie die immunhistochemische Darstelllung der MHCII/Langerin+-Zellen in der Ohrepidermis. 4.2.1 Ergebnisse des Mouse Ear Swelling Tests Abbildung 4-12a/b zeigen den Einfluss der Haptene TDI und DNCB in aufsteigenden Konzentrationen auf die Ohrschwellung der Tiere. Die Ohrschwellung ergibt sich aus der Differenz der Messungen vor der ersten Behandlung und 24 Stunden nach der letzten Behandlung. Die in diesem Versuch durch TDI- und DNCB- induzierte Ohrschwellung nimmt im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle dosisabhängig zu. Bei 2% TDI als auch bei 1% DNCB sowie 2% DNCB nimmt die Ohrschwellung signifikant zu. 67 *** Ear swelling (µm) 600 400 200 TD I2 % % TD I1 TD K O I0 ,5 % 0 Abbildung 4-12a Steigerung der Ohrschwellung abhängig von der Konzentration des topisch verabreichten TDI. Messung der Ohrschwellung 24 Stunden nach TDI-Challenge, ***p< 0,001; n=6. ** Ear swelling (µm) 600 * 400 200 NC D D N C B 0, B D NC B 1% 5% O K 2% 0 Abbildung 4-12b Steigerung der Ohrschwellung abhängig von der Konzentration des topisch verabreichten DNCB. Messung der Ohrschwellung 24Stunden nach DNCB-Challenge, *p< 0,05; **p< 0,01; n=4. 68 4.2.2 Ergebnisse des Skin DC Migration Assays Das Auswanderverhalten der Zellen aus den Ohrhälften der Versuchstiere wurde im DNCB- und TDI-Modell untersucht. Die Ohren wurden hierfür post mortem für 3 Tage kultiviert und die ausgewanderten Zellen ermittelt. In den Abb.4-13a/b erkennt man einen signifikanten Anstieg ausgewanderter dendritischer Zellen abhängig von der *** 800 600 ** 400 200 TD I2 % % TD I1 TD I0 ,5 % O 0 K migrierte Zellen/mg Ohrgewebe Dosis des Allergens, bei 1% TDI und 2% TDI, sowie bei 2% DNCB. Abbildung 4-13a Abhängigkeit der DC-Migration von der TDI-Konzentration nach topischer Verabreichung. 1% TDI und 2% TDI steigern signifikant die Auswanderung der DC aus den Hautexplantaten in das Medium, **p< 0,01; ***<p 0,001; n=6. 69 600 400 200 2% B D NC B N C D D N C B 0, 1% O 5% 0 K migrierte Zellen/mg Ohrgewebe ** 800 Abbildung 4-13b Abhängigkeit der DC-Migration von der DNCB-Konzentration nach topischer Verabreichung. 2% DNCB steigert signifikant die Auswanderung der DC aus den Hautexplantaten in das Medium, **p< 0,01; n=4. 4.2.3 Ergebnisse des Local Lymph Node Assays Post mortem wurden die regionalen Lymphknoten der Mäuse entnommen, gewogen und schließlich die Gesamtzellzahl bestimmt. In den Abb.4-14a/b sind das Lymphknotengewicht sowie die Gesamtzellzahl der Lnn. auriculares der Versuchtiere nach Behandlung mit TDI bzw. DNCB in der Challenge aufgeführt. Des Weiteren wurde von der MHCII/Langerin gefärbten Zellsuspension ein Cytospin angefertigt. Ergebnisse des Cytospins sind nicht aufgeführt, da aufgrund zu hoher Zellverluste keine auswertbaren Werte vorlagen. 70 ** 10 5 % TD I2 TD I0 TD I1 K O TD I2 % 0 % % TD I1 TD I0 ,5 % 0 15 ,5 % 5 Lymphknotenzellzahl (Mio) 10 K O Lymphknotengewichte (mg) *** 15 Abbildung 4-14a Lymphknotengewichte und Zellzahlen nach topischer Applikation von TDI in aufsteigenden Konzentrationen. Die Probenentnahme erfolgte 24 Stunden nach der letzten Behandlung. Die durch TDI- induzierte T-Zellproliferation und damit das Gewicht und die Zellzahl 2% B D N C B N C B N C D D 1% O K N C B B N C D D N C B 0, K 0 2% 5% 1% 0 5 D 5 10 5% 10 15 0, Lymphknotenzellzahl (Mio) 15 O Lymphknotengewichte (mg) nehmen dosisabhängig zu, **p< 0,01; ***p< 0,001; n=6. Abbildung 4-14b Lymphknotengewichte und Zellzahlen nach topischer Applikation von DNCB in aufsteigenden Konzentrationen. Die Probenentnahme erfolgte 24 Stunden nach der letzten Behandlung. Die durch DNCB induzierte T-Zellproliferation und damit das Gewicht und die Zellzahl nehmen dosisabhängig zu, n=4. 71 4.2.4 Immunhistochemische Darstellung der MHCII/Langerin+-Zellen in der Epidermis Mittels immunhistochemischer Färbung der MHCII+-Zellen konnte gezeigt werden, dass sich diese Population identisch zu der Langerin+-Population verhält. Dass die MHCII+-Zellen auch Langerin+-Zellen darstellen, konnten bereits VALLADEAU et al. (2000) darstellen. Für unsere Arbeitsgruppe war es von besonderer Bedeutung darzustellen, dass es sich um eine identische Zellpopulation handelt. + Abbildung 4-15 oberes Bild: MHCII -Zellen in der Ohrepidermis einer Maus. Unteres Bild: identische + Zellpopulation. Dargestellt sind Langerin -Zellen. 72 4.3 Zusammenfassung der Ergebnisse Tabelle 4a Signifikante Effekte der Haptene bzw. des Irritans in der Sensibilisierung ↑ signifikante Ergebnisse * keine signifikanten Ergebnisse, da die Proben gepoolt wurden. Jedoch eine deutliche dosisabhängige Abnahme der LC in der Ohrepidermis. Lnn. DNCB DNCB DNCB TDI auriculares TDI TDI SDS SDS 0,5% 1% 2% Gewicht ↑ ↑ ↑ 0,5% 1% 2% 0,5% 1% ↑ ↑ ↑ Zellzahl ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ IL-6 ↑ ↑ IL-10 ↑ ↑ Langerin+- SDS 2% ↑ Zellen IFN-γ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ Ohr MEST ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ Skin DC ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ * * * * * Migration Assay Langerin+Zellen * Tabelle 4b Signifikante Effekte der Haptene in der Challenge Lnn. DNCB DNCB DNCB TDI TDI TDI auriculares 0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% Gewicht ↑ Zellzahl ↑ Ohr MEST Skin DC ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ Migration 73 ↑ ↑ 5 Diskussion Ziel dieser Arbeit war es zum einen, die Rolle der Langerhanszelle in der allergischen Kontaktdermatitis, welche aktuell im Fokus kontroverser Diskussionen steht (BENNETT et al. 2005; KAPLAN et al. 2005; KISSENPFENNIG et al. 2005) näher zu charakterisieren. Bisher war es bei den in unserer Arbeitsgruppe etablierten Kontaktallergiemodellen nicht möglich, die Langerhanszelle von dermalen dendritischen Zellen zu unterscheiden. Mit Beginn dieser Arbeit stand uns der Langerin-Antikörper, der zu diesem Zeitpunkt erstmals kommerziell erhältlich war, zur Verfügung. So war es möglich, zu evaluieren, welche Rolle die Langerhanszelle in der allergischen Kontaktdermatitis spielt und inwiefern die Migration der Langerhanszelle durch verschiedene Allergene und Irritantien unterschiedlicher Konzentrationen beeinflusst wird. Als Allergene kamen das chemical respiratory allergen Toluen-2,4-diisocyanat (TDI) sowie das strong hapten 2,4- Dinitrochlorobenzol (DNCB) zum Einsatz. Sodiumdodecylsulfat (SDS) wurde als Hautirritans verwendet. Zum anderen sollten neue Erkenntnisse bezüglich des Local Lymph Node Assay sowie dem Zytokinprofil im regionalen Lymphknoten nach Verabreichung von Haptenen und Irritantien erlangt werden. Es sollte eine Aussage getroffen werden, ob Langerhanszellen durch topisch verabreichte Haptene und Irritantien vermehrt im regionalen Lymphknoten zu finden sind und ob die Parameter Lymphknotengewicht, Gesamtzellzahl sowie das Zytokinmuster durch Haptene und Irritantien unterschiedlicher Konzentrationen beeinflusst werden. Die Wirkung der verschiedenen Allergene bzw. des Irritans auf die Langerhanszellen wurde in vivo und ex vivo untersucht. 5.1 Beeinflussung der Langerhanszell-Funktion in der Sensibilisierung Die Sensibilisierung Kontaktdermatitis ist für essentiell. die Nach spätere Manifestation klassischer der Auffassung allergischen nehmen die Langerhanszellen und dermalen dendritischen Zellen (DC) nach Antigen-Kontakt das 74 Antigen auf, verlassen die Epidermis und migrieren in den regionalen Lymphknoten, um dort die T-Zellen sowohl zur Proliferation als auch Differenzierung in Effektorzellen anzuregen (LANZAVECCHIA u. SALLUSTO 2000). Die Langerhanszelle spielt demnach in der allergischen Kontaktallergie eine wesentliche Rolle (CUMBERBATCH et al. 2003). Ihre Funktion und Stellung im Immunsystem wird jedoch bis heute kontrovers diskutiert (BENNETT et al. 2005; KAPLAN et al. 2005; KISSENPFENNIG et al. 2005). Um zu untersuchen, ob die LangerhanszellMigration in der allergischen Kontaktdermatitis stimulierende oder hemmende Signale der Immunantwort auslöst, wurden in der Sensibilisierungsphase der allergischen Kontaktallergie die Allergene TDI und DNCB sowie das Hautirritans SDS in unterschiedlichen Konzentrationen topisch auf die dorsale und ventrale Ohrhälfte der Mäuse appliziert. Zu den wichtigsten untersuchten Parametern gehörten die Migration der Zellen aus der Ohrepidermis, die Ohrschwellung, die Zahl der Langerhanszellen in der Ohrepidermis sowie im Ln. auricularis, die Bestimmung zentraler Zytokine (IL-6, IL-10, IFN-γ) und die Bestimmung der CD4/CD25-positiven Zellen im regionalen Lymphknoten (KONDO u. SAUDER 1995). Wie aus den Ergebnissen des Mouse Ear Swelling Tests ersichtlich, induzieren die Kontaktallergene DNCB und TDI in Abhängigkeit der verabreichten Dosis eine Ohrschwellung. In der Sensibilisierung tritt in der Regel keine Schwellung der Ohren auf. Es kommt zwar nach Antigenkontakt zur Migration in den regionalen Lymphknoten sowie zur Proliferation haptenspezifischer T-Zellen, jedoch bleibt eine klinische Erscheinung aus (KRASTEVA et al. 1999). Die Steigerung der Ohrschwellung in eigenen Messungen lassen sich auf das mit zunehmender Dosis steigende irritierende Potential der Allergene zurückführen (Abb. 4-2/4-3). Durch das Irritans SDS kommt es zu einer erwarteten Ohrschwellung aufgrund seiner irritierenden Wirkung. Um den Einfluss der Haptene und des Irritans in aufsteigenden Konzentrationen auf die Migration der Langerhanszellen zu untersuchen wurde ein Skin DC Migration 75 Assay durchgeführt und die Zahl der Langerhanszellen in der Ohrepidermis und im regionalen Lymphknoten bestimmt. Im Skin DC Migration Assay wird die Migration der Langerhanszelle nach Verabreichung von TDI und DNCB in Abhängigkeit der Dosis signifikant gesteigert (Abb. 4-1). Korrelierend zu diesem Ergebnis ist eine Abnahme der Langerhanszellen in der Epidermis ersichtlich (Abb. 4-5a/b). Nach Behandlung mit 2 % SDS kommt es zu einer signifikanten Steigerung der Migration im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Einerseits entsteht die Migration spontan durch die Trennung der Ohrhälften in eine ventrale und eine dorsale Hälfte. Es entstehen Scherkräfte, die wiederum eine Mikroinflammation verursachen. Die Folge ist die Aktivierung und Auswanderung der im Ohrgewebe vorhandenen Entzündungs- und Immunzellen (ORTNER et al. 1996). Andererseits wird die Migration durch die KontaktallergenApplikation induziert. Untersuchungen an humanen Hautexplantaten zeigen, dass vor allem Langerhanszellen und nicht dermale dendritische Zellen migrieren (RATZINGER et al. 2002). Eine andere Untersuchung an murinen Hautexplantaten zeigt jedoch, dass nach Identifizierung der Langerhanszellen mittels des LangerinAntikörpers sowohl Langerhanszellen als auch dermale dendritische Zellen in der Sensibilisierung gleichermaßen auswandern. Der Beginn der Migration aus der Epidermis wird sowohl durch die Langerhanszelle selbst, als auch durch proinflammatorische Zytokine seitens der Keratinozyten reguliert (WANG et al. 1997). Durch die Herabregulation des Moleküls E-Cadherin durch IL-1α, IL-1β und TNF-α wird die Adhäsion der Langerhanszelle von den Keratinozyten gelöst. Die Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) seitens der Langerhanszelle trägt ebenso zur Migration bei (KOBAYASHI 1997). Durch topische Applikation der Kontaktallergene DNCB und TDI in aufsteigenden Konzentrationen wird die Langerhanszell-Migration im Vergleich zur Kontrolle gesteigert. Es ist denkbar, dass mit Anstieg der Konzentration des eingesetzten Allergens die MMP-9-Expression im Gewebe ansteigt. In der Folge wandern vermehrt Langerhanszellen aus der Epidermis in den regionalen Lymphknoten. Die Expression und Aktivierung der MMP-9 wird unter Einfluss von IL-1β und TNF-α heraufreguliert. Topisch verabreichte Kontaktallergene und Irritantien stimulieren die Expression verschiedener epidermaler Zytokine wie IL- 76 1β, TNF-α, GM-CSF und MIP-2 (ENK u. KATZ 1992; KIMBER et al. 2000a). Die Zytokine IL-1β und TNF-α sind für die Langerhanszell-Migration unentbehrlich (CUMBERBATCH et al. 2003). Je höher konzentriert das Allergen verabreicht wird, desto höher also die IL-1β-Produktion und die MMP-9-Expression. In der Folge kommt es in einem naiven Organismus zur Aktivierung der Langerhanszelle und deren Migration aus der Haut in den regionalen Lymphknoten. Dies bestätigt, dass die Migration der dendritischen Zelle unter inflammatorischen Bedingungen deutlich heraufreguliert wird (KOBAYASHI 1997). Nach topischer Behandlung mit SDS verändert sich die Zahl der Langerhanszellen in der Epidermis nicht dosisabhängig. Dieses Ergebnis stellt außerdem einen zentralen Befund für den Local Lymph Node Assay dar; auch hier kommt es zu keiner dosisabhängigen Abnahme der Zellen. Vermutlich reicht die Stimulation durch SDS nicht aus, um die proinflammatorische Zytokin- oder MMP-9-Produktion anzuregen, die ihrerseits die Langerhanszellen zur Migration bewegen. Allerdings werden nach Untersuchungen von BRAND et al. (1993) die Langerhanszellen auch durch SDS zur Maturation und Migration zum regionalen Lymphknoten angeregt. Auch wenn keine Dosisabhängigkeit getestet wurde, konnte KREKELER (2005) zeigen, dass 0,5% TDI die MMP-9-Aktivität im Ohrgewebe deutlich im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle deutlich ansteigen lässt. Der Grund weshalb es durch SDS zu keiner dosisabhängigen Migration kommt, könnte auch die zu geringe bzw. fehlende immunogene Wirkung auf die Langerhanszellen sein. Der genaue Mechanismus in der irritativen Dermatitis ist bislang nicht geklärt. Es scheint eine immunologische Komponente zu geben (LEVIN u. MAIBACH 2002). Der Anstieg der IL-6-Produktion im regionalen Lymphknoten eigener Untersuchungen, nach Behandlung mit SDS, unterstreicht diese Vermutung. Im Local Lymph Node Assay nehmen das Lymphknotengewicht, die Gesamtzellzahl der Lymphknoten sowie die Anzahl der Langerhanszellen im regionalen Lymphknoten nach topischer Behandlung mit DNCB und TDI in Abhängigkeit der Dosis im Vergleich zur Kontrolle signifikant zu (Abb. 4-6a/b; 4-7a/b). Nach topischer Behandlung mit SDS sind keine dosisabhängigen Zunahmen der Gewichte, Gesamtzellzahlen sowie Langerhanszellen im regionalen Lymphknoten zu sehen. 77 Die Zunahme der Gewichte und Zellzahlen in Abhängigkeit der Dosis lassen darauf schließen, dass es durch höhere Konzentrationen der Allergene zu einer durch dendritische Zellen induzierten gesteigerten Proliferation der T-Lymphozyten im regionalen Lymphknoten kommt. In der FACS-Analyse konnte durch die Allergene DNCB und TDI ein Anstieg der CD4+/CD25+-Zellen (= aktivierte T-Zellen) beobachtet werden (4-11a). Auch nach Untersuchungen von STOITZNER et al. (2005) kommt es unter inflammatorischen Bedingungen zu einem Anstieg der CD4+- und CD25+-Zellen im regionalen Lymphknoten. Ob in dieser Zellpopulation die Subpopulation der regulatorischen T-Zellen (Treg) zu finden ist, muss durch den Marker FoxP3 bestimmt werden. Dieser Marker lag zum Zeitpunkt dieser Untersuchung noch nicht vor. Treg spielen eine zentrale Rolle bei der Verhinderung von Autoimmunität und bei der Kontrolle von überschießenden oder unangemessenen Immunantworten. Es konnte gezeigt werden, dass nach Thymektomie von Mäusen eine stark reduzierte Zahl an CD4+CD25+ T-Zellen zu finden ist (ASANO et al. 1996). Je höher die Konzentration des Allergens, desto stärker die T-Lymphozyten-Proliferation. Auch die Zunahme der Langerhanszellen im regionalen Lymphknoten korreliert (Abb. 4-7) mit der Dosis des verwendeten Allergens (DNCB, TDI). Je mehr Langerhanszellen im Lymphknoten vorhanden sind, desto mehr naive T-Lymphozyten können aktiviert und zur Proliferation angeregt werden. Nach Behandlung mit dem Irritans SDS kommt es zu keiner deutlichen dosisabhängigen Zunahme der Lymphknotengewichte und Zellzahlen sowie der Langerhanszellen im regionalen Lymphknoten. Es zeigt sich eine geringe Zunahme im Vergleich zur Kontrolle. Eine Erklärung hierfür ist, dass auch topisch verabreichte Irritantien fähig sind, die Expression epidermaler Zytokine (z.b. IL-1β, TNF-α, GM-CSF) heraufzuregulieren und somit Langerhanszellen zu mobilisieren (ENK u. KATZ 1992; KIMBER et al. 1995). Es existieren jedoch einige Unklarheiten über die Migration der Langerhanszelle. So zeigten KISSENPFENNIG et al. (2005), dass dermale dendritische Zellen schon 24 Stunden nach Behandlung mit Tertramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) im regionalen Lymphknoten zu finden sind, wohingegen Langerhanszellen erst nach 4 Tagen einwandern. In Untersuchungen von STOITZNER et al. (2003) stieg nach Behandlung mit TNCB die Anzahl der Langerhanszellen aber bereits schon nach 24 Stunden an. Eine Zunahme 78 der Langerhanszellen im regionalen Lymphnkoten konnte in den eigenen Untersuchungen nach 48 Stunden beobachtet werden. Die eigenen Ergebnisse zeigen, dass die Migrationskinetik der Langerhanszelle und in der Folge die Aktivierung der T-Lymphozyten (Priming) sowohl vom eingesetzten Allergen als auch der verwendeten Dosis des Allergens beeinflusst werden. Untersuchungen von KAPLAN et al. (2005) ergaben, dass Langerhanszellen eher in der Phase des Priming als in der Effektorphase eine Rolle spielen, außerdem sprechen sie den Langerhanszellen eine regulatorische Funktion in der Immunantwort zu. Auch das Zytokinmuster im regionalen Lymphknoten scheint durch die Langerhanszellen beeinflusst zu werden. Im inflammatorischen Geschehen (nach Behandlung mit TNCB) kommt es zu einer deutlichen Zunahme der IFN-γ-Produktion im regionalen Lymphknoten (STOITZNER et al. 2005) Produziert wird IFN-γ von aktivierten CD8+-T-Zellen sowie CD4+-T-Zellen. Die eigenen Ergebnisse zeigen eine deutliche Zunahme der IFN-γ-Produktion der ConA stimulierten Zellen der regionalen Lymphknoten nach Behandlung mit DNCB und TDI. Durch das Irritans SDS kommt es zu keinem deutlichen Anstieg des Gehaltes an IFN-γ im regionalen Lymphknoten. Hingegen zeigt sich ein Anstieg der IL-6-Sekretion im regionalen Lymphknoten nach Behandlung mit DNCB, TDI als auch SDS. Im Kontrast zu den eigenen Ergebnissen stehen Untersuchungen von DEARMAN et al. (1994). Nach Behandlung mit SDS konnte hier kein Anstieg von IL-6 beobachten werden, wobei in diesem Versuchsansatz die Zellen jedoch nicht mit ConA stimuliert wurden. Es gibt andere Untersuchungen, nach denen dendritische Zellen des Lymphknotens unter inflammatorischen Bedingungen die Hauptquelle der IL-6-Sekretion darstellen. Es wird vermutet, dass IL-6 als ein wichtiges Element in der Aktivierung und Proliferation der T-Lymphozyten und somit an der Induktion der kutanen Immunantwort beteiligt ist (HOPE et al. 1995). Diese Vermutung deckt sich mit den eigenen Untersuchungen. Die IL-10-Produktion im regionalen Lymphknoten wird durch TDI deutlich, durch DNCB moderat gesteigert. TDI führt zu einer Aktivierung von CD4+-TZellen, die ihrerseits unter anderem IL-10 sezernieren und dadurch eine Th2Immunantwort initiieren (BÄUMER et al. 2004; CUMBERBATCH et al. 2005). SDS 79 zeigt wie erwartet keinen Effekt auf den Gehalt an IL-10 im regionalen Lymphknoten. Im Mausmodell der allergischen Kontaktdermatitis konnte außerdem gezeigt werden, dass durch Produktion von IL-10 durch regulatorische T-Zellen die Effektor-T-Zellen kontrolliert und somit die allergische Dermatitis terminiert werden kann (SCHWARZ et al. 1994). Die Ergebnisse lassen den Schluß zu, dass die erhöhten Gehalte an IL10 durch CD4/CD25+-T-Zellen produziert werden können, die ihrerseits durch die Langerhanszellen im regionalen Lymphknoten zur Proliferation angeregt werden. Abschliessend lässt sich sagen, dass IL-10- und IFN-γ-Antwort eher eine Rolle bei Applikation durch Haptene spielen. Interessanterweise jedoch, wird durch das Irritans SDS eine IL-6-Antwort ausgelöst. Dies unterstreicht die These, dass es eine immunologische Komponente durch Irritantien zu geben scheint (LEVIN u. MAIBACH 2002). 80 5.2 Beeinflussung der Langerhanszell-Funktion in der Challenge Da für die Manifestation der allergischen Kontaktdermatitis zwei immunologisch unterschiedliche sowie aufeinanderfolgende Schritte nötig sind, ist neben der Sensibilisierungsphase auch die Challengephase bezüglich der Beeinflussung der Langerhanszelle untersucht worden. Über die Rolle der Langerhanszelle in der Challengephase ist bislang wenig bekannt (KRASTEVA et al. 1999; STOITZNER et al. 2003; STOITZNER et al. 2005). Zu den wichtigsten Untersuchungsparametern gehörten die Migration der Langerhanszellen, der Mouse Ear Swelling Test und der Local Lymph Node Assay. Sowohl nach topischer Behandlung mit TDI als auch mit DNCB ist im Mouse Ear Swelling Test eine deutliche Zunahme der Ohrschwellung in Abhängigkeit der Allergen-Dosis zu sehen. Diese Zunahme der Ohrschwellung ist ein Zeichen stattgefundener Stimulation dendritischer Zellen, die anschließend maturieren und mit den T-Zellen interagieren. Die Schwellung ist das Ergebnis einer allergischen Immunreaktion und irritativen Reaktion in der Challengephase. Die zunehmende Ohrschwellung nach Provokation entspricht den Ergebnissen einer typischen Kontaktallergie (BÄUMER et al. 2004). Nach Untersuchungen von GRABBE und SCHWARZ (1996) sind für die dosisabhängige antigenspezifische Immunantwort nach Behandlung mit TNCB in der Challengephase sowohl das spezifische Antigen als auch nicht definierte, nicht-spezifische proinflammatorische Signale nötig. Nach diesen Erkenntnissen ist für die Auslösung einer allergischen Kontaktallergie eine gewisse unspezifische irritative Aktivität des Haptens Voraussetzung. Neuere Untersuchungen ergaben, dass dermale dendritische Zellen allein fähig sind, die allergische Kontaktdermatitis auszulösen, jedoch die Langerhanszellen das Ausmaß der Reaktion regulieren können (BENNETT et al. 2005). Die dosisabhängige Zunahme der Ohrschwellung in eigenen Untersuchungen ist konform mit gesteigerter Migration der Langerhanszellen aus der Ohrepidermis, zunehmenden Lymphknotengewichten und der Gesamtzellzahl im regionalen Lymphknoten (Abb. 413a/b, 4-14a/b). 81 Im Skin DC Migration Assay wird die Migration der Langerhanszelle aus der Ohrepidermis nach Verabreichung von TDI und DNCB in Abhängigkeit von der Dosis signifikant gesteigert. Diese Zunahme der Migration steht im Einklang mit den Ergebnissen des Local Lymph Node Assays. Die allergeninduzierte Auswanderung der Langerhanszellen aus der Epidermis scheint durch steigende AllergenKonzentrationen beeinflussbar zu sein. Es gibt jedoch Untersuchungen, nach denen die dermale, mit Hapten beladene dendritische Zelle für die Entstehung der allergischen Kontaktdermatitis ausreichend zu sein scheint, so dass die Langerhanszelle sowohl für die Induktions- als auch Challengephase entbehrlich sein könnte (KISSENPFENNIG et al. 2005; KISSENPFENNIG u. MALISSEN 2006). Die eigenen Untersuchungen zeigen, dass die Migrationskinetik der Langerhanszelle sowohl vom Allergen, als auch von der topisch verabreichten Dosis abhängig ist. Diese Ergebnisse werden durch den Local Lymph Node Assay bestätigt. Es ist eine Zunahme der Gewichte sowie der Zellzahlen in den regionalen Lymphknoten in Abhängigkeit der Dosis 24 Stunden nach der Challenge zu sehen. Auch Untersuchungen von CUMBERBATCH et al. (2005) zeigten einen Zusammenhang zwischen dem verwendeten Hapten und der Migrationskinetik der Langerhanszelle. So konnte gezeigt werden, dass nach Behandlung mit DNCB, im Vergleich zu dem Hapten TMA, die Langerhanszell-Migration schneller vonstatten geht. 82 5.3 Schlussfolgerung und Ausblick Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass das Ausmaß der LangerhanszellMigration und somit die allergischen Kontaktdermatitis abhängig ist von dem verwendeten Hapten bzw. Irritans, dessen Immunogenität sowie der eingesetzten Konzentration. Es kann in der Sensibilisierung eine gesteigerte LangerhanszellMigration in Abhängigkeit der Dosis von DNCB sowie TDI beobachtet werden, die begleitet ist von gesteigerten Lymphknotenreaktionen und wie es scheint, von erhöhten CD4+CD25+ T-Zellzahlen. Ob es sich bei dieser Zellpopulation auch um regulatorische T-Zellen (Treg) handelt, muss durch den Marker FoxP3 (= Marker für Treg) näher bestimmt werden. Erst dann ist eine Aussage möglich, ob Langerhanszellen tatsächlich Einfluss auf regulatorische T-Zellen haben. Die Langerhanzell-Migration wird auch durch das Irritans SDS in 2 %-Konzentration im Vergleich zu Haptenen moderat gesteigert. Dies lässt vermuten, dass es eine immunogene Komponente proinflammatorische des Zytokine Irritans oder zu geben MMP-9-Produktion, scheint, die oder die ihrerseits die Langerhanszellen zur Migration bewegen, nur in höheren Konzentrationen stimuliert werden. Insgesamt lässt sich sagen, dass die Langerhanszell-Migration sowohl in der Sensibilisierung als auch in der Challenge beeinflusst wird durch das Hapten sowie dessen applizierte Dosis. Im regionalen Lymphknoten sind Langerhanszellen vermehrt nach Applikation durch Haptene als durch Irritantien zu finden. Dieses Ergebnis korreliert mit der gesteigerten Abnahme der Langerhanszellen in der Ohrepidermis durch Haptene. Des Weiteren scheint es ein für Haptene und Irritantien unterschiedliches typisches Zytokinmuster im regionalen Lymphknoten zu geben. Dieses Ergebnis muss durch weitere Studien untermauert werden. Zu diesem Zeitpunkt kann nur spekuliert werden, dass Langerhanszellen in der Sensibilisierung Einfluss auf die regulatorischen T-Zellen haben. Dies muss in weiteren Untersuchungen mit dem FoxP3-Marker näher untersucht werden. Die gegenwärtige Forschung der Langerhanszelle bewegt sich auf deskriptiver Ebene. Ein weiterer Untersuchungsschwerpunkt für die Zukunft könnte die Untersuchung funktioneller Parameter sein. Hierfür wären der FoxP3-Marker 83 für die Identifizierung regulatorischer T-Zellen und die MMP-9-Produktion im Gewebe nach Behandlung mit Irritantien von gesondertem Interesse. Auch die Untersuchung der Beeinflussung der Langerhanszell-Funktion durch verschiedene Immunsuppressiva interessantes Studienpotential für das Verständnis der Langerhanszellen. 84 bietet ein Immunbiologie der 6 Zusammenfassung Nadine Andrick Die Bedeutung der Langerhanszell-Migration in der allergischen Kontaktdermatitis In der vorliegenden Arbeit ist die Beeinflussung der Migration der Langerhanszelle in der allergischen Kontaktdermatitis durch verschiedene Allergene und ein Irritans in In-vivo-Modellen untersucht worden. Des Weiteren war die Beeinflussung der CD4/CD25+-T-Zellen durch Langerhanszellen in der Sensibilisierungsphase von besonderem Interesse. Als Allergene kamen Toluendiisocyanat (TDI) sowie 2,4Dinitrochlorobenzol (DNCB) und als Irritans Sodiumdodecylsulfat (SDS) in aufsteigenden Konzentrationen zum Einsatz. In vivo wurde in der Sensibilisierungsphase die Wirkung der verschiedenen Konzentrationen der Allergene bzw. des Irritans an BALB/c- sowie NMRI-Mäusen untersucht. Als funktionelle Parameter wurden die Ohrschwellung (Mouse Ear Swelling Test, MEST) und post mortem die Langerhanszell-Migration (Skin DC Migration Assay), die Anzahl der Langerhanszellen in der Ohrepidermis und im regionalen Lymphknoten, sowie die T-Zellproliferation im regionalen Lymphknoten induziert durch dendritische Zellen (Local Lymph Node Assay) verwendet. Die Proliferation der T-Lymphozyten spiegelt sich durch das Gewicht und die Gesamtzellzahl des Lymphknotens wider. Des Weiteren erfolgte post mortem die Untersuchung der Zytokine IL-6, IL-10 sowie IFN-γ aus den Überständen der Zellkulturen der Lymphknotenzellen sowie die Expression der Oberflächenmoleküle CD4 und CD25. In der Challengephase wurde die Wirkung der Allergene DNCB und TDI in aufsteigenden Konzentrationen an BALB/c sowie NMRI-Mäusen untersucht. Als funktionelle Parameter kamen hier die Ohrschwellung, der Skin DC Migration Assay, der Local Lymph Node Assay und als zusätzlicher Parameter die Expression der MHCII+- und Langerin+-Zellen der Lymphknotenzellen aus dem Local Lymph Node Assay zum Einsatz. Die Ergebnisse in der Sensibilisierungsphase zeigen, dass 85 die Migrationskinetik der Langerhanszelle sowohl von der Immunogenität des Allergens als auch von der Dosis des Allergens beeinflusst wird. Außerdem kommt es auch durch das Irritans SDS zu einer leichten Migrationszunahme der Langerhanszellen aus der Epidermis. Dies belegen die signifikanten Ergebnisse des Mouse Ear Swelling Tests, Skin DC Migration Assays, Local Lymph Node Assays sowie die Zunahme der Langerhanszellen im regionalen Lymphknoten. Die Zytokine IL-10 und IFN-γ werden nach Behandlung mit DNCB und TDI in Abhängigkeit der Dosis verstärkt produziert, wohingegen SDS grundsätzlich niedrigen Einfluß zeigt. In der FACS-Analyse wurde schließlich der Einfluß von DNCB, TDI sowie SDS auf die Expression der Oberflächenmoleküle CD4 und CD25 untersucht. Es zeigte sich eine dosisabhängige Zunahme der CD4/CD25-positiven Zellen nach Behandlung mit DNCB sowie TDI, SDS zeigte keinen Einfluß auf die Expression. In der Challengephase kommt es nach Behandlung mit DNCB und TDI zu einer dosisabhängigen Migration der Langerhanszellen. Dies belegen die Ergebnisse des Mouse Ear Swelling Tests, Skin DC Migration Assays und Local Lymph Node Assays. Abschließend lässt sich sagen, dass die Migrationskinetik der Langerhanszelle sowohl in der Sensibilisierungsphase als auch in der Challengephase durch das Allergen selbst und die verabreichte Dosis des Allergens beeinflusst wird. Auch Irritantien haben möglicherweise moderate Effekte auf die Migration der Langerhanszelle. So scheint der Typ IV der Allergie nicht nach dem Alles-oderNichts-Gesetz zu funktionieren, wie es für den Typ I der Allergie typisch ist. Außerdem scheinen Langerhanszellen in der Sensibilisierungsphase Einfluss auf die Zahl der CD4/CD25+-T-Zellen zu haben. Resultierend Langerhanszellen an der kutanen Immunregulation beteiligt. 86 daraus sind die 7 Summary Nadine Andrick The role of Langerhans cell migration in contact dermatitis In this study the influence of different allergens and an irritant on the migration of Langerhans cells in allergic contact dermatitis was investigated in in vivo models. The haptens used were toluenediisocyanate (TDI) and 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB). The irritant used in increasing concentrations was sodiumdodecylsulfate (SDS). The effect of different concentrations of the irritant and the allergens during induction was studied in vivo on BALB/c mice and NMRI mice. As functional parameters we determined the ear swelling (Mouse Ear Swelling Test, MEST) and post mortem the migration of dendritic cells cells (Skin DC Migration Assay), the amount of Langerhans cells in the epidermis of the ear and in local lymph nodes and the proliferation of T-cells in local lymph nodes induced by dendritic cells (Local Lymph Node Assay). The proliferation of T-cells is represented by an increase of the weight and the total amount of cells of the lymph node. Furthermore, post mortem the cytokines IL-6, IL-10 and IFN-γ were examind and the expression of the surface molecules CD4 and CD25 of lymph node cells. During the elicitation phase we the effects of increasing concentrations of the allergens DNCB and TDI on BALB/c mice and NMRI mice were studied. Here, we used the ear swelling, the Skin DC Migration Assay, the Local Lymph Node Assay as functional parameters. The results during induction show that the Langerhans cell kinetics of migration is influenced by the immunogenicity of the allergen and by its dose. The irritant SDS also slightly increases the Langerhans cell migration out of the epidermis. This is corroborated by the significant effects on the Mouse Ear Swelling Test, the Skin DC Migration Assay, the Local Lymph Node Assay and the increased amount of Langerhans cells in the local lymph node. The treatment with 0,5 -2 % DNCB and 0,5 -2% TDI leads to a dose-dependent increase of the cytokines IL-10 87 and IFN-γ in supernatant of lymph node cell suspension whereas SDS does not seem to have a dose-related influence. The influence of DNCB, TDI and SDS on the expression of surface markers CD4 and CD25 was examined by FACS analysis. There was an increase in CD4/CD25 positive cells after treatment with DNCB and TDI. SDS revealed no influence on the expression. During the elicitation phase a treatment with DNCB and TDI again leads to a dose-related migration of Langerhans cells. This is accomponied by an increased ear swelling, skin DC migration and swollen lymph node. It can be concluded that the Langerhans cell kinetics of migration is influenced by the allergen itself and by its concentration during the induction phase as well as during elicitation phase. Irritants seem to have a moderate effect on the migration of Langerhans cells. It seems that in contrast to the allergy type 1, the allergy type 4 does not comply with an all-or-none-law. Furthermore, the Langerhans cells seem to have an influence on the amount of CD4/CD25 positive cells during the induction phase. 88 8 Literaturverzeichnis AIBA, S. (1998): Maturation of dendritic cells induced by cytokines and haptens. Tohoku J. Exp. Med. 184, 159-172 ANJUERE, F., G. MARTINEZ DEL HOYO, P. MARTIN u. C. 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Med. 198, 235-247 112 9 Anhang Tabelle 9-1: Ausgewanderte DC aus der Haut/mg Ohrgewicht in der Sensibilisierung Am dritten Tag der Gewebekultur wurde die Anzahl der aus den Ohren (BALB/c-Mäuse) in das Medium migrierten Zellen ermittelt und mit den Ohrgewichten ins Verhältnis gesetzt. n=4-8 Sensibilisierung Kontrolle 1 Ausgewanderte DNCB DNCB DNCB TDI TDI TDI SDS SDS SDS 0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 250,0 351,2 482,0 546,1 185,6 376,8 442,2 204,3 229,1 419,7 164,4 342,4 328,9 502,2 259,2 253,9 527,1 367,6 347,2 393,7 145,9 225,4 342,4 449,1 282,6 386,5 365,5 289,9 215,9 281,4 69,5 363,2 253,9 638,3 314,0 530,6 336,3 286,9 237,3 430,0 Zellen / mg Ohrgewicht Sensibilisierung Kontrolle 2 Ausgewanderte DNCB DNCB DNCB TDI TDI TDI SDS SDS SDS 0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 0,5% 1% 2% 120,3 197,3 210,2 494,5 - 412,8 1356,7 165,4 298,0 151,0 159,5 - 267,8 472,0 170,4 263,1 721,1 153,0 323,4 298,0 485,6 144,2 130,0 283,0 152,0 127,8 323,7 - 304,0 175,7 156,2 274,3 319,1 124,3 126,4 147,0 379,2 148,0 177,1 189,0 149,0 170,4 147,0 385,7 142,4 151,0 404,1 164,2 323,7 173,0 165,4 284,8 164,2 335,8 206,4 150,0 348,8 183,3 149,0 181,4 167,9 174,4 193,9 292,8 174,4 152,0 491,8 146,1 1359,0 159,5 330,8 154,1 394,7 323,7 163,0 535,7 261,6 163,0 340,9 175,7 Zellen / mg Ohrgewicht 113 Tabelle 9-2: Zunahme der Ohrschwellung [µm] in der Sensibilisierung Einzelwerte der Ohrschwellung (NMRI-Mäuse) gemessen an jeweils 8 Ohren pro Gruppe in der Sensibilisierung. Die Tiere wurden 3 Tage in Folge behandelt, es folgte ein Tag Pause, darauf erfolgte die 2. Messung. Die erste Messung wurde vor der ersten TDI/DNCB/SDS-Gabe und die zweite Messung 48 Stunden nach der letzten DNCB/TDI/SDS-Applikation durchgeführt. n=8 Kontrolle DNCB 0,5% 0 10 20 0 0 0 0 0 Ohrschwellung [µm] Kontrolle TDI 0,5% Kontrolle Ohrschwellung [µm] 60 10 80 90 40 50 70 70 0 10 0 0 10 10 0 10 Ohrschwellung [µm] DNCB 1% 70 30 80 70 30 40 40 130 TDI 1% 40 60 50 40 30 40 50 20 SDS 0,5% 0 10 0 0 10 10 0 10 90 90 60 100 140 240 180 100 TDI 2% 70 70 90 80 60 60 70 30 SDS 1% 10 0 30 20 10 10 50 40 114 DNCB 2% 120 160 130 240 310 240 170 60 SDS 2% 30 10 30 0 20 30 30 80 10 40 30 30 30 30 10 50 Tabelle 9-3a/b: Anzahl der Langerin-positiven Zellen in der Ohrepidermis in der Sensibilisierung [%] a) Nach Messung der Ohrschwellung wurde die Ohrepidermis trypsiniert und die Anzahl der Langerin-positiven Zellen mittels Fluoreszenzmikroskop und der Neubauerzählkammer bestimmt. Es wurden insgesamt 200 Zellen. Die Zellsuspension der DNCB-Gruppe wurde von n=8 auf n=4, aufgrund zu geringer Zellzahlen, gepoolt. %Langerin- Kontrolle positive DNCB 0,5% 3,0 2,0 2,5 2,0 Zellen DNCB 1% 2,0 2,0 2,0 1,5 DNCB 2% 2,0 1,5 1,5 2,0 1,0 2,0 2,5 1,5 b) Die Zellsuspension der TDI-und SDS-Gruppe wurde von n=8 auf n=2 gepoolt (aufgrund zu geringer Zellzahlen). Es wurden insgesamt 200 Zellen ausgezählt und mittels Fluoreszenzmikroskop die Anzahl der Langerin-positiven Zellen bestimmt. %Langerin- Kontrolle positive Zellen %Langerinpositive Zellen TDI 0,5% TDI 1% TDI 2% 2,5 2 2 1,5 2 2 1,5 1,5 Kontrolle SDS 0,5% SDS 1% SDS 2% 1,5 2 2 2 2 2 2,5 1,5 115 Tabelle 9-4a/b/c: Lymphknotengewicht [mg] und Zellzahl [Mio] in der Sensibilisierung a) Einzelwerte der Lymphknotengewichte und Zellzahlen. Die regionalen Lymphknoten der behandelten Ohrseiten wurden 48 Stunden nach der letzten DNCB-Gabe freipräpariert, gewogen sowie homogenisiert um die Zellzahl mittels Trypanblau-Färbung und der Neubauerzählkammer zu bestimmen. n=8 Kontrolle Gewicht [mg] DNCB 0,5% 0,9 3,9 4,1 7,9 6,6 3,3 3,6 3,3 Kontrolle Zellzahl [Mio] DNCB 1% 3,0 5,4 13,8 12,7 9,0 9,8 5,4 6,2 DNCB 0,5% 3,2 2,3 2,0 4,0 5,3 2,0 1,4 3,1 DNCB 2% 12,3 10,2 17,4 9,4 14,7 10,1 9,6 10,0 DNCB 1% 3,5 3,6 14,4 8,2 16,5 10,6 1,3 7,7 11,7 12,1 16,2 8,6 12,9 17,9 18,2 14,9 DNCB 2% 14,8 14,0 20,3 9,1 15,2 13,8 10,0 9,2 17,0 17,4 20,6 10,0 10,4 16,3 20,7 14,9 b) Einzelwerte der Lymphknotengewichte und Zellzahlen. Die regionalen Lymphknoten der behandelten Ohrseiten wurden 48 Stunden nach der letzten TDI-Gabe freipräpariert, gewogen sowie homogenisiert um die Zellzahl mittels Trypanblau-Färbung und der Neubauerzählkammer zu bestimmen. n=8 Kontrolle Gewicht [mg] TDI 0,5% 8,7 8,1 4,7 3,9 8,4 6,9 9,9 4,4 Kontrolle Zellzahl [Mio] TDI 1% 15,2 18,8 19,4 15,3 20,4 17,9 17,4 4,8 TDI 0,5% 6,3 9,1 3,8 2,5 5,8 7,2 8,2 4,0 18,4 16,8 23,6 18,5 14,8 16,8 13,6 9,4 TDI 1% 18,9 23,7 15,3 20,3 27,0 24,7 5,3 18,9 116 TDI 2% 20,2 20,1 21,2 17,1 15,4 29,0 9,8 17,0 TDI 2% 23,3 14,1 20,0 26,6 14,1 24,9 24,6 17,7 29,0 20,8 32,5 25,0 23,7 28,1 8,0 14,4 c) Einzelwerte der Lymphknotengewichte und Zellzahlen. Die regionalen Lymphknoten der behandelten Ohrseiten wurden 48 Stunden nach der letzten SDS-Gabe freipräpariert, gewogen sowie homogenisiert um die Zellzahl mittels Trypanblau-Färbung und der Neubauerzählkammer zu bestimmen. n=8 Kontrolle Gewicht [mg] SDS 0,5% 6,2 2,3 3,3 4,9 4,2 2,4 2,5 1,2 Kontrolle Zellzahl [Mio] SDS 1% 2,7 3,5 6,8 10,0 4,0 3,6 6,3 4,3 SDS 0,5% 10,9 5,1 6,0 1,9 11,5 7,1 5,5 0,0 6,6 3,2 4,4 3,4 4,1 5,0 3,8 5,0 SDS 1% 5,3 7,5 13,0 23,0 1,5 1,4 2,3 11,0 117 SDS 2% 4,4 6,6 4,3 6,0 7,5 9,8 8,7 4,7 SDS 2% 12,2 3,6 6,1 5,0 4,1 4,7 5,8 7,7 3,5 11,0 7,1 7,8 12,1 18,7 8,1 6,5 Tabelle 9-5: Anzahl der Langerin-positiven Zellen im regionalen Lymphknoten in der Sensibilisierung Die regionalen Lymphknoten der behandelten Ohrseiten wurden 48 Stunden nach der letzten DNCB/TDI/SDSGabe und nach Bestimmung von Gewicht und Zellzahl mit Langerin/CD207 angefärbt und anschließend mittels Fluoreszenzmikroskop und Neubauerzählkammer die Anzahl der Langerin-positiven Zellen bestimmt. n=8 Kontrolle Langerin-positive Zellen/Lymphknoten DNCB 0,5% 11200 24120 48960 28700 57750 69960 8450 51590 DNCB 1% 11520 0 0 0 20140 6400 0 11160 TDI 0,5% 122850 73470 48960 69020 81000 88920 18020 56700 TDI 1% 0 0 11400 0 0 21600 0 12800 SDS 0,5% SDS 1% Kontrolle Langerin-positive Zellen/Lymphknoten Kontrolle Langerin-positive Zellen/Lymphknoten 0 0 0 6460 0 0 0 0 + 99160 93800 131950 30033 53200 92460 6600 32200 DNCB 2% 170000 179220 140080 35000 65520 53790 196650 104300 TDI 2% 139800 42300 120000 0 43710 84660 147600 54870 0 0 39000 0 4950 0 0 37400 261000 124800 224250 80000 75840 174220 79200 46080 SDS 2% 0 0 0 17500 13940 15980 0 25410 11900 0 24140 0 0 0 27540 0 + Tabelle 9-6: CD 4 und CD 25 -Zellen in den Lnn. auriculares in der Sensibilisierung + Dieser Versuch stellt eine Pilotstudie auf den Effekt der LC auf die CD4/CD25 Zellen dar. Einzelwerte der CD 4 + und CD 25 -Zellen in den regionalen Lymphknoten nach Behandlung mit DNCB, TDI und SDS in der Sensibilisierung. n=1-2 Kontrolle DNCB 0,5% DNCB 1% DNCB 2% + + CD 4 und CD 25 - 7600 27600 Zellen Kontrolle + + 2600 36500 TDI 0,5% 66600 95000 TDI 1% 138000 611700 TDI 2% + CD 4 und CD 25 Zellen 6000 Kontrolle + SDS 0,5% 7000 SDS 1% 17000 SDS 2% + CD 4 und CD 25 Zellen 6000 64000 64000 42000 92000 118 38000 70000 32000 84000 Tabelle 9-7: IL-6-Sekretion der Lymphknotenzellen DNCB/TDI/SDS-behandelter Tiere nach ConA-Stimulation (Sensibilisierung) Einzelwerte der IL-6-Konzentrationen der Lymphknotenzellen nach Behandlung der Tiere mit DNCB/TDI/SDS und anschließender Stimulierung der Zellen mit ConA. n=8 Kontrolle IL-6 [pg/ml] DNCB 0,5% 3,7 1,8 3,1 0 9,3 4,3 4,3 0 Kontrolle IL-6 [pg/ml] TDI 0,5% 0,0 35,7 11,7 12,7 6,7 0,0 0,0 7,7 Kontrolle IL-6 [pg/ml] DNCB 1% 0,6 9,3 15,6 1,8 3,1 1,2 0 3,1 TDI 1% 48,7 91,7 50,7 245,7 165,7 52,7 149,7 87,7 SDS 0,5% 40,1 45,1 116,8 41,8 70,1 46,8 81,8 36,8 28,7 35,6 15,6 1,8 15,0 11,2 9,3 6,2 TDI 2% 10,7 35,7 17,7 46,7 48,7 81,7 25,7 35,7 SDS 1% 81,8 76,8 151,8 135,1 93,5 113,5 120,1 161,8 119 DNCB 2% 15,6 24,3 19,3 2,5 4,3 6,2 13,7 1,8 51,7 18,7 31,7 47,7 37,7 35,7 24,7 30,7 SDS 2% 80,1 176,8 201,8 223,5 251,8 290,1 218,5 135,1 81,8 38,5 221,8 153,5 166,8 220,1 230,1 406,8 Tabelle 9-8: IL-10-Sekretion der Lymphknotenzellen DNCB/TDI/SDS-behandelter Tiere nach ConA-Stimulation (Sensibilisierung) Einzelwerte der IL-10-Konzentrationen der Lymphknotenzellen nach Behandlung der Tiere mit DNCB/TDI/SDS und anschließender Stimulierung der Zellen mit ConA. n=8 Kontrolle IL-10 [pg/ml] DNCB 0,5% 332,3 65,6 59,0 92,3 172,3 82,3 72,3 42,3 Kontrolle IL-10 [pg/ml] 355,6 65,6 315,6 285,6 405,6 145,6 55,6 79,0 TDI 0,5% 235,5 50,3 186,9 247,8 139,6 108,7 141,9 1522,5 Kontrolle IL-10 [pg/ml] DNCB 1% DNCB 2% 449,0 172,3 225,6 322,3 225,6 152,3 249,0 189,0 TDI 1% 4231,7 2583,1 4411,2 3309,8 3906,5 1895,7 3223,4 1579,9 SDS 0,5% 466,6 416,6 283,3 0 300,0 483,3 350,0 733,3 120 TDI 2% 1890,1 5433,2 6734,2 4169,3 2425,1 2771,7 2597,4 1621,5 SDS 1% 616,6 66,6 150,0 233,3 116,6 166,6 133,3 250,0 495,6 219,0 889,0 159,0 375,6 572,3 359,0 675,6 3368,6 2837,9 4166,0 6629,5 3914,0 2321,4 2015,2 3082,3 SDS 2% 116,6 100,0 216,6 133,3 100,0 116,6 150,0 300,0 383,3 783,3 250,0 116,6 33,3 266,6 416,6 400,0 Tabelle 9-9: : IFN-γγ-Sekretion der Lymphknotenzellen DNCB/TDI/SDS-behandelter Tiere nach ConA-Stimulation (Sensibilisierung) Einzelwerte der IFN-γ-Konzentrationen der Lymphknotenzellen nach Behandlung der Tiere mit DNCB/TDI/SDS und anschließender Stimulierung der Zellen mit ConA. n=8 Kontrolle DNCB 0,5% 27,4 66,9 35,3 34,3 31,1 38,0 48,0 35,8 IFN-γ [pg/ml] Kontrolle TDI 0,5% Kontrolle IFN-γ [pg/ml] 87,4 51,6 35,3 24,3 50,1 144,3 101,6 224,8 363,2 29,7 244,4 96,2 62,2 234,1 127,7 131,3 IFN-γ [pg/ml] DNCB 1% DNCB 2% 190,1 23,2 88,5 242,2 144,8 185,8 495,3 437,4 TDI 1% 179,6 635,9 794,4 1291,5 407,9 786,4 1221,5 1035,1 SDS 0,5% 13,2 12,7 16,4 19,5 33,2 24,3 18,0 20,6 121 TDI 2% 234,0 1022,2 656,5 1054,1 215,0 446,4 1826,1 399,8 SDS 1% 22,2 18,0 31,6 22,7 46,4 49,0 51,1 34,3 283,7 112,2 148,0 276,9 263,7 504,3 464,8 114,8 312,8 998,1 824,1 1219,7 3622,8 1158,2 372,3 246,5 SDS 2% 30,6 24,3 31,6 507,4 206,9 45,8 38,5 23,2 30,6 21,6 52,7 25,3 44,8 87,4 155,8 48,5 Tabelle 9-10: Zunahme der Ohrschwellung [µm] in der Challengephase Einzelwerte der Ohrschwellung gemessen an jeweils 4-6 Ohren pro Gruppe. Die erste Messung wurde vor, die zweite Messung 24 Stunden nach der letzten DNCB- bzw. TDI-Applikation durchgeführt. Für die TDI-Challenge 1 und DNCB-Challenge sind die Mittelwerte der Ohrschwellung des rechten und linken Ohrs angegeben. n=4-6 TDI-Challenge 1 Kontrolle Ohrschwellung [µm] TDI 0,5% TDI 1% TDI 2% 5 5 0 5 20 65 15 25 35 245 220 265 0 70 60 200 TDI-Challenge 2 Kontrolle TDI 0,5% 30 0 10 0 20 30 Ohrschwellung [µm] TDI 1% 30 40 70 40 80 50 TDI 2% 50 30 30 60 100 60 90 20 180 180 130 220 DNCB-Challenge Kontrolle Ohrschwellung [µm] DNCB 0,5% DNCB 1% DNCB 2% 25 30 0 145 95 195 150 290 145 464 505 230 0 305 320 150 122 Tabelle 9-11: Ausgewanderte DC aus der Haut/mg Ohrgewicht in der Challengephase Am dritten Tag der Gewebekultur wurde die Anzahl der aus den Ohren in das Medium migrierten Zellen ermittelt und mit den Ohrgewichten ins Verhältnis gesetzt. n=3-6 TDI-Challenge 1 Ausgewanderte Zellen / mg Ohrgewicht Kontrolle TDI 0,5% 27,6 75,0 0 0 TDI 1% 90,5 79,5 122,5 41,8 TDI 2% 63,9 117,6 100,8 42,7 200,7 147,2 75,4 216,5 TDI-Challenge 2 Ausgewanderte Zellen / mg Ohrgewicht Kontrolle TDI 0,5% 108,7 88,7 37,7 37,3 117,2 36,9 TDI 1% 40,8 178,6 80,6 113,1 80,2 81,5 TDI 2% 174,4 188,4 126,4 192,3 146,3 149,3 149,3 235,6 182,9 376,9 297,0 390,2 DNCB-Challenge Ausgewanderte Zellen / mg Ohrgewicht Kontrolle DNCB 0,5% 163,6 109,7 74,8 DNCB 1% 164,6 129,1 413,8 263,9 123 DNCB 2% 308,6 253,3 304,7 1040,5 772,8 439,4 446,3 Tabelle 9-12: Lymphknotengewicht [mg] und Zellzahl [Mio] in der Challengephase Einzelwerte der Lymphknotengewichte und Zellzahlen. Die regionalen Lymphknoten der behandelten Ohrseiten wurden 24 Stunden nach der letzten DNCB- bzw. TDI-Gabe freipräpariert, gewogen sowie homogenisiert um die Zellzahl mittels Trypanblau-Färbung und der Neubauerzählkammer zu bestimmen. TDI-Challenge 1 Kontrolle Lymphknotengewicht TDI 0,5% 3,7 3,4 [mg] TDI 1% 3,7 2,0 5,1 1,6 3,2 9,9 8,3 5,3 7,8 4,8 Kontrolle Zellzahl [Mio] TDI 0,5% 1,2 1,6 TDI 2% 3,5 TDI 1% 5,6 TDI 2% 2,1 3,6 4,0 1,1 3,4 11,3 19,5 4,3 5,4 3,7 1,8 10,2 TDI-Challenge 2 Kontrolle Lymphknotengewicht TDI 0,5% 1,8 2,5 2,5 2,4 3,0 1,4 [mg] Kontrolle Zellzahl [Mio] TDI 1% 1,9 2,7 2,4 3,3 4,4 3,1 TDI 0,5% 1,3 2,0 2,1 3,7 3,1 1,0 3,2 3,3 1,6 4,3 3,7 3,8 TDI 1% 2,6 3,6 2,9 3,8 4,3 1,7 124 TDI 2% 3,7 4,4 4,5 4,4 3,9 5,0 TDI 2% 3,0 3,7 5,2 2,5 5,2 4,5 7,4 4,2 1,9 7,7 6,5 6,0 DNCB-Challenge Kontrolle Lymphknotengewicht DNCB 0,5% 3,5 2,6 9,3 [mg] DNCB 1% 4,5 9,1 6,0 4,8 11,4 7,2 Zellzahl [Mio] DNCB 0,5% 7,2 6,8 21,5 15,3 2,2 Kontrolle DNCB 2% DNCB 1% DNCB 2% 3,7 1,4 2,9 2,5 1,5 3,0 13,1 10,5 4,8 2,1 6,7 16,7 1,1 9,3 125 Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Die Bedeutung der LangerhanszellMigration in der allergischen Kontaktdermatitis“ selbständig verfasst habe. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder andere Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltlich Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation am folgenden Institut angefertigt: Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Bünteweg 17, 30559 Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder eine Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. 126 10 Danksagung Mein besonders herzlicher Dank gilt all denen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, insbesondere: § Herrn Prof. Dr. Wolfgang Bäumer für die Überlassung des interessanten Themas, die stets gewährte Unterstützung sowie für die konstruktiven Anregungen und die immerwährende Geduld, § Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für bereichernde Gespräche und die humorvolle Zusammenarbeit, § den stets hilfsbereiten und fröhlichen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe – Viki, Caro, Isa, Braunie, Frank und Hans-Herbert Bohr – für aufmunternde Gespräche und lebensrettende Speisen, § meinen Mitdoktoranden – Ilka, Jessi, Steffi, Klaas, Kristine und Helen – für jede Menge Spaß und Hilfsbereitschaft, § Ilka gebührt ein besonderer Dank für die Lösung mysteriöser Computerprobleme, § meinen Geschwistern und Freunden für stets gewährte Aufmunterungen und menschliche Unterstützung, § Gaby und Feu für die Rettung aus dem Rechtschreibungs-Dschungel bei Tag und Nacht, 127 § meinen lieben Eltern für die liebevolle Unterstützung und den Rückhalt, den sie mir all die Jahre boten, ohne die mir die Verwirklichung meines Traumes Tierärztin zu werden nicht möglich gewesen wäre. § und nicht zuletzt Lars Hendrik für stets gewährte Liebe und Unterstützung. 128
