Infomappe Pathologie

Leitfaden
für die ­T ier-Pathologie
Leitfaden für die Tier-Pathologie
Pathologie
Auf dem Gebiet der Pathologie spielen labordiagnostisch insbesondere die Zytologie und die Histologie
eine Rolle. Bei der zytologischen Untersuchung ­werden
in zytologischen Ausstrichen Einzelzellen beurteilt,
während bei der histologischen Untersuchung ganze
Gewebeproben beurteilt werden.
Auf den folgenden Seiten soll auf Vor- und Nachteile
der Zytologie und Histologie, die Probengewinnung,
Probenaufbereitung und Fixierung dieser beiden
­Untersuchungsmethoden eingegangen werden, um
Ihnen im täglichen Praxisalltag eine Hilfe zu geben.
Vor- und Nachteile
von Zytologie und Histologie
Probengewinnung
Die Zytologie bietet gegenüber der Histologie den
­Vorteil, dass die Probengewinnung schnell, minimal
invasiv und in der Regel ohne Narkose möglich ist. Die
Entnahme einer histologischen Gewebeprobe ist aufwändiger, es ist eine chirurgische Exzision oder Biopsie­
entnahme unter Vollnarkose oder lokaler Anästhesie
notwendig.
Dauer bis zur Beurteilung
Die zytologischen Präparate können direkt nach Anfertigung und Färbung in der Praxis beurteilt werden.
Bei Versand in ein Labor erfolgt die Beurteilung des
Präparates noch am Eingangstag der Probe.
Die histologische Gewebeprobe muss zunächst zugeschnitten und über Nacht eingebettet werden, bevor
am nächsten Tag die Beurteilung erfolgen kann. Daher
ist die Bearbeitungszeit für die Histologie einen Tag
länger als für die Zytologie.
Aussagekraft
Bei der zytologischen Untersuchung erfolgt eine Beurteilung von Einzelzellen hinsichtlich ihrer Morphologie,
Anzahl und Anordnung. Damit lassen sich Aussagen
treffen, ob ein entzündlicher oder tumoröser Prozess
vorliegt und ob es sich eher um einen benignen oder
malignen Tumorprozess handelt. Dabei ist allerdings
nur ein positiver, zytologischer Befund beweisend,
falsch negative Befunde sind z. B. dadurch möglich,
dass der Tumor oder die Entzündung bei der Punktion
nicht getroffen wurde oder nicht aspiriert werden
konnte. Ferner kann bei der zytologischen Untersuchung nicht beurteilt werden, ob invasives oder expansives Wachstum vorliegt oder ob sonstige Gewebeschädigungen vorliegen.
2
Da man bei der histologischen Untersuchung ganze
Gewebeverbände beurteilt, können mit dieser Methode sehr viel weitreichendere und genauere Aussagen
getroffen werden als bei der Zytologie. So kann man
histologisch z. B. das Wachstumsverhalten von Tumoren (expansiv, invasiv), Gewebeschädigungen (Begleitentzündungen, Nekrosen), Metastasierung in Lymphgefäße oder die vollständige oder unvollständige Beur­
teilung von Tumoren beurteilen. Ferner kann man nur
im histologischen Präparat das Fehlen von Strukturen
(z. B. fehlende Talgdrüsen bei Sebadenitis) beurteilen.
Die Zytologie bietet damit ein schnelles und einfaches
diagnostisches Werkzeug zur ersten Diagnosestellung,
das auch für das weitere diagnostische und therapeutische Vorgehen nützlich sein kann. Häufig muss aber
eine Zytologie im weiteren Verlauf durch eine Histologie ergänzt werden, um genauere Aussagen treffen
zu können.
Bitte beachten Sie, dass wir aus räumlichen
Gründen keine Sektionen von ganzen Tier­
körpern durchführen können.
Wenden Sie sich für Tierkörpersektionen
­daher bitte an das zuständige Veterinär­
untersuchungsamt oder das entsprechende
Institut für Pathologie der nächsten tier­
ärztlichen Hochschule.
Leitfaden für die Tier-Pathologie
Zytologie
Die Zytologie ist eine Untersuchung von Einzelzellen,
die an gefärbten Ausstrichen durchgeführt wird.
Wichtige Punkte, um ein gutes Ergebnis bei der
Zytologie zu gewährleisten
■■
Die Entnahmelokalisation und ein kurzer Vor­
bericht müssen angegeben werden, damit eine
aussagekräftige Beurteilung erfolgen kann!
■■
Bei der Anfertigung der Ausstriche dürfen die
­Präparate nicht gequetscht oder mit zu viel Druck
aufgebracht werden, da sonst die ­Zellen zerstört
werden!
■■
Die angefertigten Präparate sollten nur luft­
getrocknet werden, auf keinen Fall darf eine
­Hitzefixierung erfolgen, da dies zur Zerstörung
der Zellen führt!
■■
Die Objektträger sollten gut beschriftet sein, insbesondere bei mehreren Entnahmelokalisationen,
um Verwechslungen zu vermeiden!
Entnahme zytologischer Proben
und Herstellung von Präparaten
Feinnadelaspiration von Geweben
Bei der Feinnadelaspiration handelt es sich um die am
häufigsten angewandte Technik zur Gewinnung zytologischer Proben. Für eine Feinnadelaspiration eignen
sich besonders oberflächliche Umfangsvermehrungen
(Haut, Unterhaut), Lymphknoten, innere Organe sowie
intraabdominale oder intrathorakale Umfangsvermehrungen.
Technik
Das zu punktierende Gewebe (z. B. Hauttumor) wird
nach Rasur und Desinfektion mit einer Hand fixiert, bei
der Punktion von inneren Organen oder Umfangs­
vermehrungen muss die Kontrolle der Punktion über
Ultraschall erfolgen.
Mit der anderen Hand wird die Spritze mit aufgesetzter Kanüle in das zu punktierende Gewebe gestochen.
Dann wird unter stetiger Aspiration die Kanüle einige
Male in verschiedene Richtungen vor- und zurück­
bewegt, um möglichst viel Material zu sammeln. Bevor
man die Kanüle herauszieht, lässt man den Stempel
der Spritze wieder vorsichtig zurückgleiten oder setzt
die Kanüle von der Spritze ab, damit beim Herausziehen der Kanüle das gesammelte Material nicht in den
Spritzenkonus gesaugt wird.
Nach Herausziehen der Kanüle wird diese von der
Spritze abgesetzt. In die Spritze wird Luft aufgezogen
bevor die Kanüle wieder aufgesetzt und das gesammelte Material aus der Kanüle mit der Luft aus der
Spritze auf einen Objektträger ausgeblasen wird (­siehe
Abb. 1 auf der nächsten Seite).
Wenn viel Material gesammelt wurde, sollte man es
auf mehrere Objektträger verteilen, damit die Aus­
striche nicht zu dick werden.
Um das Material auszustreichen, legt man vorsichtig
einen zweiten Objektträger auf den Objektträger mit
dem Material und wartet, bis sich das Material durch
die Kapillarkräfte zwischen den beiden Objektträger
verteilt. Dann zieht man die beiden Objektträger –
­ohne Druck aufzuwenden – in Längsrichtung auseinander (­siehe Abb. 2 auf der nächsten Seite).
Material
Alternativ kann man den Ausstrich auch mit einem
aufgesetzten, zweiten Objektträger, wie bei einem
Blutausstrich, anfertigen.
Für die Entnahme von Feinnadelaspirationen verwendet man eine sterile Einwegspritze mit Volumina von
2 – 10 ml. Je derber das zu aspirierende Gewebe ist,
desto größer sollte das Spritzenvolumen sein, um genügend Unterdruck aufbauen zu können.
Im Idealfall stellt man mit dieser Technik mehrere, dünne Ausstriche her. Die Ausstriche lässt man nun an der
Luft trocknen (nicht hitzefixieren!) und schickt die luftgetrockneten Ausstriche in einer Objektträgerversandhülle in das Labor.
Die Durchmesser der aufgesetzten Kanülen sollten
zwischen 0,6 und 0,9 mm (23 – 20 G) liegen. Auch hier
gilt, je derber das Gewebe ist, desto größer sollte der
Kanülendurchmesser sein. Man kann zunächst mit
­einem kleinen Kanülendurchmesser beginnen und bei
schwer zu aspirierenden Geweben (z. B. Bindegewebe)
dann auf größere Kanülen ausweichen.
Ferner sollten drei bis fünf saubere Objektträger bereit­
liegen.
3
Leitfaden für die Tier-Pathologie
Feinnadelaspiration
1a)
Punktion mit aufgesetzter Spritze.
2a)
3a)
Aspiration von 3 bis 5 ml Vakuum.
Sammeln von Gewebe durch
­Vorwärts- und Zurückbewegen
­innerhalb der Läsion. Dazwischen
Läsion nicht verlassen und
­Vakuum aufrecht erhalten.
4a)
Absetzen der Kanüle von der Spritze.
5a)
Herausziehen der ­Kanüle aus der Läsion
Aufsetzen der Kanüle und
»Ausblasen« des Kanülen­
inhaltes auf Objektträger.
Alternative
1b)
Punktion mit aufgesetzter Spritze.
2b)
3b)
Aspiration von 3 bis 5 ml
­ akuum. Sammeln von
V
­Gewebe durch Vorwärts- und Zurückbewegen inner­
halb der Läsion. Dazwischen
Läsion nicht verlassen und
Vakuum aufrecht erhalten.
4b)
ufheben des
A
­Vakuums durch
Verbringen des
Spritzen­stempels
in »Nullposition«.
5b)
Herausziehen der
Kanüle mit auf­
gesetzter Spritze
aus der Läsion.
Abnahme der
­Kanüle und Füllen
der Spritze mit
Luft.
6b)
Aufsetzen der Kanüle
und »Ausblasen« des
Kanülen­inhaltes auf
Objektträger.
Abb. 1: Durchführung einer Feinnadelaspiration; nach: Reinhard Mischke, Zytologisches Praktikum für die Veterinärmedizin,
Schlütersche Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG, 2005
Zytologischer Ausstrich
B
A
A
A
B
A
1)
2)
3)
Auflegen eines zweiten Objekt­trägers
(B) auf den unten befindlichen
­Objektträger mit der Probe (A) in
Längsrichtung und ggf. Anwendung
­eines geringen Anpressdruckes bei
Gewebeproben.
Verteilung der Gewebeprobe auf dem
Objektträger durch Hinwegziehen des
aufliegenden zweiten Objektträgers
(B).
Zur Untersuchung kann insbesondere der unten liegende ­Objektträger (A) herangezogen werden.
Abb. 2: Anfertigung eines zytologischen Ausstrichs; nach: Reinhard Mischke, Zytologisches Praktikum für die Veterinärmedizin,
Schlütersche Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG, 2005
4
B
Leitfaden für die Tier-Pathologie
Tupftechnik
Abstrichtechnik
Die Tupftechnik eignet sich besonders für chirurgisch
entfernte Gewebe oder für oberflächlich zugängliche
Läsionen (z. B. ulzerierte Haut oder Tumoroberfläche).
Ein Abstrich kann mittels eines Tupfers oder einer kleinen Bürste erfolgen. Sie kommen vor allem bei der
Probenentnahme von der Konjunktive, der Nase oder
aus der Vagina zum Einsatz.
Material
Für die Tupftechnik benötigt man eine saubere Skalpellklinge, saugfähiges Papier und mehrere, saubere
Objektträger
Technik
Mit der Skalpellklinge wird eine frische Oberfläche
­geschaffen und diese mit dem saugfähigen Papier abgetupft. Bei in situ verbleibenden Hautläsionen wird
die Oberfläche gereinigt und abgetupft.
Material
Für die Entnahme benötigt man einen sauberen Tupfer
oder eine Kunststoff- oder Stahlbürste, ggf. sterile, isotone Kochsalzlösung sowie mehrere, saubere Objektträger.
Technik
Schabetechnik
Zur Gewinnung von Material wird der Tupfer, bzw. das
Bürstchen (v. a. bei Konjunktivalabstrichen) vorsichtig
über die Läsion oder die Schleimhaut gerollt. Bei einer
relativ trockenen Oberfläche empfiehlt es sich, den
Tupfer vorher mit etwas Kochsalzlösung anzufeuchten.
Nachdem man die Abstrichprobe genommen hat, wird
der Tupfer, bzw. das Bürstchen vorsichtig und ohne
Druck auf einem oder mehreren Objektträgern abgerollt. Auf keinen Fall sollte man den Tupfer auf dem
Objektträger hin und her reiben, da dabei viele Zellen
zerstört werden.
Die Schabetechnik eignet sich besonders bei äußerlich
zugängliche Läsionen (oberflächliche Tumore, Ulzerationen) oder für chirurgisch entferntes Material. Sie
wird aber insgesamt seltener angewendet.
Gewinnung und Aufbereitung
von Flüssigkeiten
Material
Punktate
Für die Schabetechnik benötigt man eine saubere Skalpellklinge, saugfähiges Papier und mehrere, saubere
Objektträger.
Punktate aus Brusthöhlenflüssigkeit, Bauchhöhlen­
flüssigkeit oder Synovia werden direkt mittels Spritze
und Kanüle (0,7 – 0,9 mm Durchmesser) gewonnen.
Dann drückt man die frische Schnittfläche mehrmals
auf einen sauberen Objektträger, bzw. man drückt den
Objektträger auf die Hautläsion.
Die Objektträger lässt man lufttrocknen und versendet
sie in einer Objektträgerversandhülle.
Technik
Zunächst schafft man mit dem saugfähigen Papier ­eine
trockene und möglichst saubere Oberfläche auf dem
zu beprobenden Gewebe. Dann schabt man mit der
Skalpellklinge im 90°-Winkel mehrmals über das Gewebe, bis sich Material am Klingenrand angesammelt
hat. Das Material kann dann entweder direkt mit der
Skalpellklinge auf den Objektträgern ausgestrichen
werden, oder das Material wird auf einen Objektträger
verbracht und mit einem zweiten Objektträger, wie
zuvor beschrieben, ausgestrichen.
Dann lässt man die Ausstriche lufttrocknen und versendet sie in einer Objektträgerversandhülle.
Nach der Gewinnung sollte das Punktat in ein EDTARöhrchen überführt werden, um eine Gerinnselbildung
zu vermeiden. Für eventuelle, bakteriologische Untersuchungen sollte die gewonnene Flüssigkeit in ein
­steriles Röhrchen verbracht werden.
Tracheale oder bronchioalveoläre Lavage
Zur Gewinnung einer trachealen oder bronchioalveolären Lavage werden 0,5 – 1,0 ml/kg Körpermasse isotone Kochsalzlösung instilliert (perkutan, über einen
Tubus oder über ein Endoskop). Anschließend wird so
viel Flüssigkeit wie möglich wieder zurückgewonnen
und in ein EDTA-Röhrchen, bzw. in ein steriles Röhrchen verbracht.
5
Leitfaden für die Tier-Pathologie
Histologie
Harn
Harn sollte möglichst steril, z. B. über einen Katheter,
gewonnen werden. Da der pH-Wert im Harn eine
schnelle Autolyse der Zellen begünstigt, sollten noch
direkt in der Praxis Ausstriche angefertigt werden.
Liquor
Liquor sollte möglichst schnell nach der Entnahme aufgearbeitet werden, da die Zellen im Liquor bereits
4 Stunden nach Entnahme in Autolyse übergehen. Da
die für korrekte Ausstriche benötigte Liquorzentrifuge
in den meisten Praxen nicht vorhanden ist, empfiehlt
es sich, zumindest einen direkten Ausstrich aus dem
Liquor anzufertigen und den restlichen Liquor möglichst schnell in das Labor zu senden.
Aufbereitung der gewonnenen
Flüssigkeiten
Es sollten schon direkt in der Praxis 1 – 2 Ausstriche von
der gewonnen Flüssigkeit angefertigt werden, da die
Zellen in der Flüssigkeit häufig auf dem Transportweg
in das Labor in Autolyse übergehen.
Zellreiche oder zähflüssige Punktate (trüb) können dabei direkt ausgestrichen werden, bei zellarmen Punktaten (klar) empfiehlt es sich, die Proben schnell nach
Entnahme zu zentrifugieren (z. B. 5 Minuten bei 500 ×
g oder 3 Minuten bei 1500 × g). Der Überstand wird
abpipettiert und das Sediment nach Resuspension mit
einer geringen Menge Flüssigkeit (ca. 0,5 ml) ausgestrichen. Die angefertigten Ausstriche werden luftgetrocknet und in einer Objektträgerversandhülle in das
Labor geschickt. Zusätzlich kann auch die gewonnene
Flüssigkeit nativ mit in das Labor geschickt werden, um
dort weitere Ausstriche anzufertigen oder z. B. eine
bakteriologische Untersuchung einzuleiten.
Färbung
Wenn die angefertigten Präparate direkt in der Praxis
beurteilt werden sollen, kann man kommerziell verfügbare Färbungen, wie z. B. Diff-Quik® verwenden,
um die Ausstriche zu färben. Im Labor wird in der ­Regel
eine Pappenheim-Färbung als zytologische Färbung
verwendet.
Problemlos können auch bereits vorgefärbte ­Ausstriche
in unser Labor eingesandt werden.
6
Die Histologie ist eine Untersuchung von Gewebe­
proben, die durch Biopsieentnahme oder chirurgische
Exzision gewonnen werden.
Im Vergleich zur Zytologie dauert die histologische
­Beurteilung zwar einen Tag länger, bietet dafür aber
häufig präzisere und weitreichendere Aussagen.
Wichtige Punkte, um ein gutes Ergebnis bei der
Histologie zu gewährleisten
■■
Die Entnahmelokalisation und ein kurzer Vorbericht müssen angegeben werden, damit eine
­aussagekräftige Beurteilung erfolgen kann!
■■
Bei der Entnahme der histologischen Gewebe­
proben sollte das Gewebe nicht gequetscht oder
durch Elektrokoagulation versengt werden, da
dann das Gewebe stark geschädigt wird und
nicht mehr zu beurteilen ist. Auch das Einfrieren
von Gewebe führt zu einer starken Gewebe­
schädigung!
■■
Das Gewebe sollte direkt nach der Entnahme
in ausreichend 4 – 10 %-iges Formalin eingelegt
­werde, um eine Autolyse zu vermeiden!
Entnahme histologischer Proben
und Fixierung
Entnahme
Die Entnahme histologischer Proben erfolgt in der
­Regel in Narkose oder unter örtlicher Betäubung. Zum
einen können Gewebeproben, wie z. B. Hauttumore
partiell oder vollständig entnommen werden, zum
­anderen können Biopsien, wie z. B. Haut- oder Organbiopsien entnommen werden.
Bei der Entnahme von histologischen Proben ist darauf
zu achten, das Gewebe möglichst wenig zu beschädigen. Quetschung, Elektrokoagulation oder Einfrieren
führen zu starken Gewebeschäden, die zu einer starken Beeinträchtigung der Beurteilbarkeit führen.
Wahl der Entnahmelokalisation und Probengröße
Die Proben sollten aus repräsentativen Lokalisationen
entnommen werden, wobei je nach Fragestellung verschiedene Aspekte zu berücksichtigen sind.
Leitfaden für die Tier-Pathologie
Tumore
Organbiopsien
Tumore sollten, soweit möglich, vollständig entnommen und eingesandt werden, damit neben der Beurteilung des Tumors auch die Beurteilung der Entnahmeränder erfolgen kann. Sollte der Tumor nur partiell
entnommen oder eingesandt worden sein, geben Sie
dies bitte an, damit es bei der Beurteilung der Probenränder berücksichtigt werden kann.
Bei Organbiopsien sollten unter Ultraschallkontrolle
repräsentative Lokalisationen entnommen werden.
Gerade bei Biopsien aus dem Magen-Darm-Trakt oder
der Nasenschleimhaut sollte nicht nur die oberfläch­
liche Schleimhaut, sondern auch die Submucosa mit
entnommen werden, da sich dort häufig die meisten
Entzündungszellen finden.
Falls nur ein Teil des Tumors oder Biopsien aus dem
Tumor entnommen werden können, ist es wichtig, dass
insbesondere Lokalisationen aus dem Randbereich oder
vom Übergang in das gesunde Gewebe genommen
werden, damit das Wachstumsverhalten zum gesunden Gewebe beurteilt werden kann. Es macht häufig
keinen Sinn, bei großen Tumoren Material aus dem
Tumorzentrum zu entnehmen, da dort zumeist große
Nekrosen vorliegen und das Gewebe daher dort nicht
beurteilbar ist.
Ein Probendurchmesser von 0,2 cm sollte dabei nicht
unterschritten werden, um eine aussagekräftige Beurteilung zu gewährleisten.
Sollten Lymphknoten im Bereich des Tumors vergrößert sein, empfiehlt es sich, auch diese zu entnehmen
und einzusenden, um sie in Bezug auf eine Metastasierung zu untersuchen.
Wenn es sich um sehr große Umfangsvermehrungen
handelt, sollten diese vor der Fixierung geteilt werden,
damit sie vollständig durchfixieren.
Hautbiopsien
Für die Interpretation von Hautbiopsien ist ein ausführlicher Vorbericht sehr wichtig. Ferner sollten die Hautbiopsien aus repräsentativen Lokalisationen mit typischen Läsionen entnommen werden. Wenn ein Tier
verschiedene, klinische Ausprägungen einer Haut­
erkrankung zeigt sollten mehrere Hautbiopsien aus
verschiedenen Lokalisationen entnommen werden und
diese in verschiedenen, entsprechend gekennzeichneten Behältern eingesandt werden.
Fixierung
Direkt nach der Entnahme sollten die entnommenen
Gewebeproben in 4 – 10 %-iges Formalin verbracht
werden. Dabei ist darauf zu achten, dass das Verhältnis von Formalin zu Gewebe ausreichend ist, im Idealfall beträgt das Verhältnis von Formalin zu Gewebe
10:1. Da die Fixationsgeschwindigkeit des Gewebes
ca. 1 cm pro Stunde beträgt, ist eine ausreichend lange Fixationsdauer des Gewebes notwendig.
Bei einer Einsendung von unfixiertem Gewebe kommt
es zur Autolyse, die wiederum die histologische Beurteilung deutlich einschränkt. Auch eine Fixierung in
Alkohol führt zu Artefakten und eingeschränkter Beur­
teilbarkeit.
Wenn zusätzlich zu der histologischen Untersuchung
auch noch eine andere, weiterführende Untersuchung
erfolgen soll (z. B. Bakteriologie, PCR), muss ein Teil der
Probe separat und unfixiert mit eingesandt werden.
Vor der Biopsieentnahme sollte die Haut nicht gereinigt und desinfiziert werden, da dadurch eventuell
oberflächliche Erreger (Pilze, Parasiten) entfernt werden.
Die Hautbiopsien sollten einen Mindestdurchmesser
von 0,4 cm, besser 0,6 cm haben, um eine aussagekräftige Beurteilung zu gewährleisten.
Quellen
Literatur Zytologie: Reinhard Mischke,
­Zytologisches ­Praktikum für die ­Veterinärmedizin,
­Schlütersche ­Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG, 2005
7
Kontaktadresse Labor
MVZ Diamedis Diagnostische Medizin
Sennestadt GmbH
Dunlopstraße 50, 33689 Bielefeld
Telefon05205.729 90
Telefax 05205.729 91 15
E-Mail [email protected]
Ansprechpartnerin Pathologie
Dr. med. vet. Stefanie Deppenmeier
Fachtierärztin für Pathologie
MVZ Diamedis Diagnostische Medizin
Sennestadt GmbH
Dunlopstraße 50, 33689 Bielefeld
Telefon0 52 05.729 92 24
Telefax 0 52 05.729 92 55
E-Mail [email protected]