Rab-Proteine kontrollieren die Chlamydien-induzierte

RabProteinekontrollierendieChlamydieninduzierte
FragmentierungdesGolgiApparates
Dissertation
zurErlangungdesakademischenGrades
doctorrerumnaturalium
(Dr.rer.nat.)
imFachBiologie
eingereichtander
MathematischNaturwissenschaftlichenFakultätI
derHumboldtUniversitätzuBerlin
von
Dipl.Biol.AnetteRejmanLipinski
(geb.10.10.1977inPyskowice/Polen)
PräsidentderHumboldtUniversitätzuBerlin
Prof.Dr.Dr.h.c.ChristophMarkschies
DekanderMathematischNaturwissenschaftlichenFakultätI
Prof.Dr.LutzHelmutSchön
Gutachter/innen:
1.Prof.Dr.WolfgangUckert
2.Prof.Dr.ThomasF.Meyer
3.PDDr.AntjeFlieger
TagdermündlichenPrüfung:26.03.2009
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS................................................................................................1
ZUSAMMENFASSUNG(deutsch)...............................................................................................3
SUMMARY(englisch)...........................................................................................................4
I.EINLEITUNG.....................................................................................................................5
1.1 Chlamydien...................................................................................................................5
1.1.1 TaxonomiederChlamydien..................................................................................5
1.1.2 KlassifikationundklinischeBedeutungvonChlamydienInfektionen..................6
1.1.3 DerEntwicklungszyklusvonChlamydien..............................................................7
1.2 GrundzügedesintrazellulärenTransportesineukaryontischenZellen....................10
1.2.1 DerGolgiApparat...............................................................................................10
1.2.2 DieGolgiMatrix..................................................................................................11
1.2.3 BeförderungvonVesikelninnerhalbdessekretorischenTransportweges........12
1.2.3.1 FormationvonVesikeln.............................................................................13
1.2.3.2 RabProteinvermittelterVesikeltransport................................................15
1.2.3.3 VerankerungundFusionvonVesikelnanderZielmembran.....................18
1.2.4 TransportvonLipidenineukaryontischenZellen...............................................18
1.3 ChlamydialeInteraktionenmitdenTransportwegenderWirtszelle........................19
1.4 siRNATechnologie.....................................................................................................21
1.5 Fragestellung..............................................................................................................22
II.MATERIALUNDMETHODEN........................................................................................23
2.1 Chemikalien................................................................................................................23
2.2 Geräte.........................................................................................................................23
2.3 VerwendeteDatenbankenundProgramme..............................................................23
2.4 Zellkultur.....................................................................................................................24
2.5 InfektionenvonZellenmitC.trachomatis.................................................................24
2.6 HerstellungvonC.trachomatisStammlösungen......................................................25
2.7 BestimmungdesC.trachomatisTiters......................................................................26
2.8 QuantifizierungderprimärenInfektion.....................................................................28
2.9 BestimmungderInfektivitätvonChlamydien............................................................30
2.10 BestimmungderZellzahlmittelsdesLDHTests........................................................32
2.11 TransfektionvonsiRNA..............................................................................................32
2.12 QuantitativeRealTimePCR(qRTPCR)......................................................................35
2.13
2.14
2.15
2.16
2.17
2.18
2.19
HerstellungstabiltransduzierterZelllinien................................................................36
BestimmungderZellvitalitätmittelsdesWST1Proliferationstest..........................38
BestimmungderProteinkonzentrationundImmunodetektion................................39
ImmunfluoreszenzundkonfokaleLasermikroskopie................................................41
Lebendzellmikroskopie...............................................................................................43
Transmissionselektronenmikroskopie.......................................................................44
StatistischeDatenanalyse...........................................................................................45
III.ERGEBNISSE.................................................................................................................46
3.1 StrukturdesGolgiApparateswährendderInfektionmitC.trachomatis.................46
3.2 EinflussvonGolgiProteinenaufdieVermehrungvonChlamydien..........................47
3.2.1 ValidierungdessiRNAvermitteltenVerlustesvonGolginen.............................47
3.2.2 UntersuchungzytotoxischerEffektenachsiRNABehandlunggegen
GolgiProteine.....................................................................................................49
3.2.3 StrukturdesGolgiApparatesinsiRNAbehandeltenZellen...............................50
3.2.4 AuswirkungenderGolgiFragmentierungaufdiechlamydialeEntwicklung......51
3.3 DieRollevonRabProteineninderChlamydienInfektion........................................52
3.3.1 ValidierungdesVerlustesvonRabProteinenmittelsRNAi...............................52
3.3.2. UntersuchungzytotoxischerEffektenachsiRNABehandlunggegen
RabProteine........................................................................................................54
3.3.3 AuswirkungendesknockdownvonRabProteinenaufdieprimäreInfektion
unddiebakterielleInfektivität............................................................................54
3.3.4 HerunterregulationvonRabProteinenmittelsRNAiinanderenZelllinien.......56
3.3.5 HerstellungstabilerRab6undRab11knockdownZellen.................................57
3.3.6 UntersuchungderPrimärinfektioninshRNAvermitteltenknockdownZellen.59
3.3.7 UltrastrukturelleAnalysevonC.trachomatisinfiziertenknockdownZellen....60
3.3.8 MorphologischeErscheinungdesGolgiApparatesinnichtinfiziertenund
C.trachomatisinfiziertenRab6undRab11knockdownZellen........................62
3.3.9 SpaltungvonGolgin84instabilenknockdownZellen.......................................65
3.4 UntersuchungzumTransportvonSphingolipidenindieInklusionunterVerlust
vonRab6undRab11..................................................................................................66
3.5 UntersuchungenzumsimultanenVerlustvonRabProteinenundGolginen............69
3.5.1 AnalysederGolgiStrukturnachsimultanerHerunterregulationvonRab
ProteinenundGolginen......................................................................................69
3.5.2 UntersuchungderGolgiStrukturnachsimultanerHerunterregulationvon
RabProteinenundGolgineninChlamydieninfiziertenZellen..........................71
3.5.3 VergleichderInfektivitäteninGolgin84undp115siRNAbehandelten
stabilenRab6undRab11knockdownZellen....................................................74
IV.DISKUSSION................................................................................................................77
4.1 BedeutungderGolgiFragmentierungfürChlamydienInfektionen..........................78
4.1.1 C.trachomatisInfektionführtzurAuflösungderStrukturdes
GolgiApparates...................................................................................................78
4.1.2 RNAiinduzierteGolgiFragmentierungfördertdiechlamydialeVermehrung...79
4.2 RabProteinesindwichtigfürdiechlamydialeEntwicklung......................................80
4.2.1 ChlamydienkönneninRab6undRab11vermittelteTransportwege
eingreifen............................................................................................................82
4.2.2 Rab6undRab11dekorierteVesikelwerdenüberspezifischeIncProteine
anderInklusionsmembrangebunden................................................................84
4.2.3 BedeutungvonRabProteinenfüranderePathogene.......................................85
4.3 FunktionellerAusfallvonRab6undRab11verhindertdieGolgin84abhängige
FragmentierungdesGolgiApparates........................................................................86
4.4 RabProteinesindentscheidendfürdenTransportvonSphingolipidenindie
Inklusion.....................................................................................................................88
4.5 ModellzurRegulationderChlamydieninduziertenGolgiFragmentierungdurch
RabProteine...............................................................................................................91
4.6 Ausblick.......................................................................................................................93
V.LITERATURVERZEICHNIS..............................................................................................95
VI.DANKSAGUNG...........................................................................................................108
PUBLIKATIONSLISTE..............................................................................................................109
SELBSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG...........................................................................................110
Abkürzungsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AK
Abb. APS ATP BFA bp
BSA bzw. CERT COP DNA EK
EE
EDTA EtOH ER
ERGIC FKS g
GAP GDF GDI GEF GTPase
h
H2O Hsp HRP IFU KCl KD
kDa KH2PO4
LDH LDL LE
Min. Mio. mRNA MeOH
MOI MOMP
MTOC ml
aberranteKörperchen
Abbildung
Ammoniumperoxodisulfat
Adenosintriphosphat
BrefeldinA
Basenpaare
bovinesSerumalbumin
beziehungsweise
ceramidetransferprotein
coatproteincomplex
Deoxyribonucleicacid
Elementarkörperchen
earlyendosome
EthylenDiaminTetraessigsäure
Ethanol
EndoplasmatischenRetikulum
ERGolgiintermediatecompartment
fetalesKälberserum
Gramm
GTPaseaktivierendesProtein
GDIdisplacementfactor
guaninenucleotidedissociationinhibitor
guaninenucleotideexchangefactor
Guanosintriphosphatase
Stunden
Wasser
Hitzeschockprotein
horseradishperoxidase
inclusionformingunits
Kaliumchlorid
knockdown
Kilodalton
Kaliumhydrogenphospat
LactatDehydrogenase
lowdensitylipoprotein
lateendosome
Minuten
Millionen
messengerribonucleicacid
Methanol
multiplicityofinfection
majoroutermembraneprotein
MikrotubuliOrganisationszentrum
Milliliter
Seite1
Abkürzungsverzeichnis
μl
Na2HPO4
nM NP40 OAS PBS PKR PFA PMA PCR p.i. p.t. qRTPCR
RE
RK
RNAi RT
SDS Sek. siRNA shRNA
Tab. Tarp TEMED
TGN TRIS TritonX100
u.a. UpM z.B. Mikroliter
Dinatriumhydrogenphosphat
Nanomol
4NonylphenylPolyethylenGlycol
OligoadenylatSynthetase
PhosphatgepufferteSalzlösung
RNAabhängigeProteinkinaseR
Paraformaldehyd
Phorbol12Myristrat13Acetat
polymerasechainreaction
postinfectionem
posttransfectionem
quantitativeRealTimePCR
RecyclingEndosomen
Retikularkörperchen
RNAInterferenz
Raumtemperatur
Natriumdodecylsulfat
Sekunden
smallinterferingRNA
shorthairpinRNA
Tabelle
Translocatedactinrecruitingphosphoprotein
N,N,N’,N’Tetramethylethylendiamin
transGolgiNetzwerk
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
tOctylphenoxypolyethoxyethanol
unteranderem
UmdrehungenproMinute
zumBeispiel
Seite2
Zusammenfassung(deutsch)
Seite3
ZUSAMMENFASSUNG
Weltweit kommt es jährlich zu 90 Mio. Neuinfektionen mit Chlamydiatrachomatis.
InfektionenmitdiesensexuellübertragbarenErregernsindbeiFrauenderhäufigsteGrund
für Unfruchtbarkeit. Allerdings sind die Faktoren, die eine erfolgreiche bakterielle
Vermehrungermöglichen,weitgehendunbekannt.
Während ihrer obligat intrazellulären Entwicklung sind Chlamydien auf die Errichtung und
Erhaltung ihrer Nische, der Inklusion, angewiesen. Ihr Überleben in der Zelle sichern die
Bakterien unter anderem durch Interaktionen mit vesikulären Transportwegen der
Wirtszelle, wie z.B. der Fusion mit Vesikeln, die Sphingolipide aus dem GolgiApparat
transportieren. Der genaue Mechanismus der Lipidaufnahme ist noch nicht vollständig
aufgeklärt.
IndervorliegendenArbeitkonntegezeigtwerden,dassChlamydienwährendeinerInfektion
dieAuflösungderStrukturdesGolgiApparatesinduzieren.AllerdingsistüberdieKontrolle
und die Bedeutung der GolgiFragmentierung auf die Pathogenese des Bakteriums wenig
bekannt. Mit Hilfe der RNAInterferenzTechnik (RNAi) wurden in dieser Arbeit die
Auswirkungen des Verlustes von GolgiStrukturproteinen auf die bakterielle Vermehrung
untersucht.DerfunktionelleAusfallvonGolgin84,Giantin,p115undGpp130führtezueiner
Fragmentierung des GolgiApparates. Diese begünstigte die chlamydiale Entwicklung
gemessenaneinermehralsfünffachenSteigerungderProduktionneuerinfektiöserPartikel,
was eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen nahelegt. In vesikulären
Transportmechanismen von Nährstoffen übernehmen RabProteine eine Schlüsselrolle.
Interessanterweise konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der Verlust verschiedener
RabProteinedurchRNAidenEntwicklungszyklusderChlamydienspezifischbeeinflusste.Der
Verlust von Rab6 und Rab11 führte zu einer signifikanten Verringerung der Anzahl
infektiöser Nachkommen. Elektronenmikroskopische Analysen zeigten, dass der
Entwicklungszyklus nicht abgeschlossen werden konnte, was die Produktion infektiöser
Partikel stark herabsetzte. Des Weiteren wurde in Rab6 und Rab11herunterregulierten
Zellen der GolgiApparat nicht fragmentiert und der Transport von Sphingolipiden zu den
Bakterien stark vermindert. Untersuchungen nach simultaner Herunterregulation von
Golgin84 und Rab6 oder Rab11 demonstrierten abschließend, dass eine Kontrolle der
Golgin84induziertenGolgiFragmentierungüberRabProteinemöglichseinkönnte.
DieErgebnissedieserArbeitoffenbareneinenneuenZusammenhangzwischenderStruktur
desGolgiApparatesunddessenKontrolleüberRabProteineundermöglicheneinentieferen
Einblick in die Funktion des GolgiApparates während einer ChlamydienInfektion. Die
Regulation der GolgiStruktur durch RabProteine bietet als möglicher antichlamydialer
MechanismusneueAnsätzezurTherapievonChlamydienInfektionen.
Zusammenfassung(englisch)
Seite4
SUMMARY
Worldwide, approximately 90 mio. people are infected with the obligate intracellular
bacteriumChlamydiatrachomatis.Thisimportanthumanpathogenisthoughttobethe
leading cause of infertility and ectopic pregnancy in women; however the factors
involvedinitssuccessfulinfectionandreplicationremainunknown.
For successful development, the Chlamydia are dependent on the establishment and
maintenanceofaspecialniche,termedtheinclusion.Toensuresurvival,thechlamydial
inclusion exhibits a number of vesicular interactions, such as fusionwithexocyticGolgi
derivedvesiclesthattransportsphingolipidstotheplasmamembrane.However,theexact
mechanismsbywhichChlamydiaacquiretheselipidshavenotbeenelucidated.
The present work established that infection of host mammalian cells with C. trachomatis
inducedfragmentationoftheGolgiapparatus,butdetailsofthemechanismsunderlyingits
control and the relevance of Golgi fragmentation to the bacterium’s pathogenesis are still
required. Using RNAInterference (RNAi) mediated lossoffunction studies the role of
specific Golgiapparatus structural proteins in bacterial infectivity was investigated. Knock
down of Golgin84, giantin, p115 and Gpp130 in host cellsresulted ina fragmented Golgi
apparatus and an associated increase in chlamydial replication. Infectivity in knock down
cells was increased by five times compared to control cells, suggesting an enhanced
aquisition of nutrients. Since Rabproteins are known to coordinate the intracellular
vesicular transport of nutrients, their importance in chlamydial infectivity was also
investigated. Interestingly, knock down of Rabproteins influenced bacterial growth.
Depletion of Rab6 and Rab11 led to a significant reduction in infectious progeny. Electron
microscopy analysis revealed that the chlamydial developmental cycle was not fully
completed,resultinginadecreasedamountofinfectiousparticles.Surprisingly,uponknock
down of Rab6 or Rab11 the Golgiapparatus remained intact. In addition, sphingolipid
transportintotheinclusionwasseverelyperturbed.Finally,analysisofcellssimultaneously
depleted of golgin84 and Rab6 or Rab11 suggested a possible role of Rabproteins in the
controlofgolgin84inducedGolgifragmentation.
These data demonstrate a yet unknown relationship between the structure of the golgi
apparatusanditsregulationandcontrolbyRabproteins.Furthermore,thisworkcontributes
to the existing knowledge regarding the function of the Golgiapparatus during chlamydial
infections. The regulation of the Golgi structure as a possible antichlamydial
mechanism offers new strategies for the treatment of chlamydiainfections.
I.Einleitung
Seite5
I.EINLEITUNG
1.1
Chlamydien
DieerstenIndizienfürChlamydienInfektionenliefertenbereits1500vorChristusägyptische
BeschreibungenvonAugenkrankheiten,insbesonderedesTrachoms,imPapyrusEbers.1907
konnten Stanislaus von Prowazek und Ludwig Halberstaedter charakteristische
EinschlusskörpercheninTrachomennachweisen,diesiealsChlamydozoa(„klamys",griech.
Mantel)bezeichneten(HalberstaedterundVonProwazek,1907).Heuteweissman,dasses
sich bei dem verursachenden Erreger um ein Bakterium handelt; es trägt den Namen
Chlamydiatrachomatis.
ChlamydiensindweltweitverbreitetundkönneneineReiheunterschiedlichsterKrankheiten
hervorrufen.SieverursachenInfektionendesAuges,derLungeunddesGenitaltraktesund
werden auch mit chronischen Erkrankungen, wie z.B. koronaren Herzerkrankungen,
Arteriosklerose oder Asthma in Verbindung gebracht. Die Aufklärung ihrer pathogenen
EigenschaftenistdahervongroßemInteressefürdiebiologischmedizinischeWissenschaft.
1.1.1
TaxonomiederChlamydien
Chlamydien sind gramnegative Bakterien, die der Ordnung Chlamydiales angehören. Die
phylogenetische Analyse von Chlamydien, insbesondere der 16S und 23S rRNA führten zu
einerüberarbeitetenTaxonomie(Everettetal.,1999;BushundEverett,2001).DieOrdnung
Chlamydiales besteht nun aus den vier Familien Chlamydiaceae, Parachlamydiaceae,
Waddliaceae, und Simkaniaceae (Abb. 1.1). Die bekannten human und tierpathogenen
Chlamydien gehören zur Familie der Chlamydiaceae, in der die bisher einzige Gattung
ChlamydiaindiezweiGattungenChlamydophilaundChlamydiaunterteiltwurde(Everettet
al.,1999;BushundEverett,2001).ImGegensatzzudenChlamydiaceaelebendieVertreter
derParachlamydiaceae,WaddliaceaeundSimkaniaceaealsSymbionteninAmöben(Amann
etal.,1997;Hornetal.,2000;Fritscheetal.,2000).
I.Einleitung
Seite6
Abb.1.1NeueTaxonomiederChlamydiales(nachBuschundEverett,2001)
DieLängederLinienentsprichtnichtdertatsächlichenphylogenetischenDistanz.
1.1.2
KlassifikationundklinischeBedeutungvonChlamydienInfektionen
Die humanpathogenen Chlamydienspezies Chlamydia trachomatis (C.trachomatis),
Chlamydophila pneumoniae (Cp.pneumoniae) und Chlamydophila psittaci (Cp. psittaci)
verursachenverschiedeneInfektionskrankheitenbeimMenschen.
Bei C.trachomatis werden drei Gruppen von Serovarianten unterschieden, die
unterschiedliche Erkrankungen auslösen. Die Serotypen der ersten Gruppe, C.trachomatis
AC,verursachendasTrachom,eineEntzündungderBindehautundderHornhaut,dievor
allem in Entwicklungsländern endemisch auftritt und die häufigste vermeidbare
ErblindungsursacheindiesenRegionendarstellt(Gambhiretal.,2007).IneinigenGegenden
liegtdieInfektionsratederBevölkerungbeiüber90%.
InfektionenmitdenSerovarenderzweitenGruppe,C.trachomatisDK,verursachensexuell
übertragbare Krankheiten (STD). Sie zählen mit weltweit über 90 Mio. Neuinfektionen pro
Jahr zu den häufigsten Geschlechtskrankheiten (WHO, 2001). C.trachomatis DK infizieren
den urogenitalen Trakt. Viele dieser Infektionen verlaufen asymptomatisch, die Folgen
I.Einleitung
Seite7
unerkannter Infektionen sind aber vor allem bei Frauen gravierend. Unbehandelte
C.trachomatisInfektionen können zu ektopischer Eileiterschwangerschaft, Tuben
verschlüssenodersogarInfertilitätführen(Faro,1985).
Das Lymphogranuloma venereum hingegen ist eine Folge der Infektion lymphatischen
Gewebes der Genitorektalregion mit der dritten Gruppe von Serovarianten, C.trachomatis
L1L3.DiesesexuellübertragbareKrankheitistvoralleminEntwicklungsländernendemisch
und führt zu schmerzhaften Schwellungen der Lymphgefäße. Durch Vernarbung der
Lymphknoten und des umliegenden Gewebes kann es zum Rückstau der Lymphe und
EinengungdesEnddarmskommen(SchachterundOsoba,1983).
Die zur Gattung Chlamydophila gehörenden Cp.pneumoniae infizieren vornehmlich das
EpitheldesRespirationstraktes(Wreghitt,1993).InDeutschlandistüberdieVerbreitungvon
Cp.pneumoniaeInfektionenwenigbekannt.DieDurchseuchungsratewirdaufetwa60%der
20Jährigengeschätzt,wobeiderGroßteilderInfektionenasymptomatischverläuft(Robert
KochInstitut, 2001). Eine akute Infektion äußert sich in schweren Pneumonien und
Bronchitis, die sich als chronischobstruktive Lungenerkrankung (COPD) oder Asthma
bronchialemanifestierenkönnen.DesWeiterenwirdeineAssoziationdiesesPathogenesmit
der Entstehung von Arteriosklerose und der AlzheimerKrankheit diskutiert (Saikku et al.,
1988;Grayston,2000;Bellandetal.,2004).
DiebekanntesteChlamydiosebeiTieren,undunterallenVogelartenverbreitet,istdiedurch
Cp.psittaciverursachtePsittakose(PapageienKrankheit)oderauchOrnithose(Infektionvon
WildundNutzgeflügel)(Vanrompayetal.,1995).DieInfektionverläuftmitgrippeähnlichen
Symptomen,diebiszumTodedesTieresführenkönnen.
Die Chlamydiosen bei Schafen, Rindern, Schweinen, hervorgerufen durch Infektionen mit
Cp.abortus, Cp.pecorum und Cp.suis, sind eine bedeutende Ursache für durch Aborte
verursachteTierverluste(Stampetal.,1952;Seaman,1985;Wittenbrinketal.,1991;Borel
etal.,2006).
1.1.3
DerEntwicklungszyklusvonChlamydien
Die obligat intrazellulären Chlamydien vermehren sich in einem speziellen
membranumhülltenKompartiment,welchesalsInklusionbezeichnetwird.Innerhalbdieser
Inklusion durchlaufen alle Chlamydienspezies einen unter Bakterien einzigartigen
I.Einleitung
Seite8
Entwicklungszyklus (Abb.1.2). Charakteristisch hierbei ist das Auftreten zweier
unterschiedlicher morphologischer Formen, den Elementarkörperchen (EK) und den
Retikularkörperchen(RK).Dieetwa0,3μmgroßenEKrepräsentierendieelektronendichte,
infektiöse,abermetabolischinaktiveForm.Diemetabolischaktiven,abernichtinfektiösen
Partikel(11,5μmDurchmesser)bezeichnetmanalsRK(Moulder,1991).Siestellendiesich
replizierendeFormderBakteriendar.
Der Infektionsprozess beginnt mit der Adhäsion des EK an die Wirtszelle. Spezifische
Rezeptoren für die Aufnahme von EK konnten bisher nicht identifiziert werden. Die
BeteiligungvonHeparinundHeparansulfatundanderenProteinenanderAdhäsionvonEK
werden diskutiert (Zhang und Stephens, 1992; Wehrl et al., 2004). Die endo oder
phagozytotische Aufnahme kann je nach Spezies über Clathrinabhängige Wege, Caveolin
vermittelteRoutenoderauchüberLipidmikrodomänen, lipidrafts,verlaufen(Stuartetal.,
2003; Hybiske und Stephens, 2007a). Darüber hinaus wurde ein chlamydiales
TypIIISekretionssystem beschrieben, das durch die Translokation von chlamydialen
EffektorproteinenindieWirtszelledieAufnahmeeinleitet(Cliftonetal.,2004).
EinigeStundennachInternalisierungredifferenzierendieEKinRK,wassichimVerlustder
Infektivität,derDNADekondensation,derVergrößerungunddemEinsetzenderReplikation
zeigt. Zudem kommt es zu aktiven Modifikationen der Inklusionsmembran, die notwendig
sind,umdiesebakterielleNischevorderFusionunddemAbbauinLysosomenzuschützen
und eine Versorgung mit von der Wirtszelle stammenden Substanzen, wie z.B. Eisen zu
gewährleisten(Heinzenetal.,1996;Ojciusetal.,1997;vanOoijetal.,1997;AlYounesetal.,
1999).JenachChlamydienspeziesbeginnt20hbis48hnachderInfektiondieUmwandlung
derRKzurückininfektiöseEK(Hodinkaetal.,1988;Wolfetal.,2000).DieEntwicklungder
einzelnenChlamydienverläuftabdiesemZeitpunktasynchron.AmEndedesZykluswerden
dieneugebildeteninfektiösenBakterienindenextrazellulärenRaumfreigesetzt.
ZweiMechanismenzurFreisetzungwurdenvonHybiskeundStephensbeschrieben(Hybiske
und Stephens, 2007b; Hybiske und Stephens, 2008). Zum einen konnte eine Zelllyse des
Wirtes nachgewiesen werden und zum anderen ein als Inklusionssekretion bezeichneter
Mechanismusbeobachtetwerden.DabeiwirddiegesamteunbeschädigteInklusionausder
Wirtszelle in den extrazellulären Raum abgesondert. Die Wirtszelle verbleibt nach dem
Abschnüren der Inklusion intakt. Einige Bakterien können allerdings in der Zelle
zurückbleibenundsomiteinenneuenMechanismusfüreinepersistenteInfektiondarstellen.
I.Einleitung
Seite9
Ursachen einer persistenten Infektion können u.a. Nährstoffmangel, wie Eisenmangel oder
Tryptophanverarmung, oder weitere limitierende Bedingungen, wie z.B. eine Behandlung
mitPenicillinsein(Beattyetal.,1994;Mehtaetal.,1998).UnterdiesenUmständenkannder
Entwicklungszyklus nicht vollständig durchlaufen werden, was zum Entstehen sogenannter
aberranter Körperchen (AK) führt. Diese unterscheiden sich morphologisch von EK und RK
insbesondere in ihrer gesteigertenGröße. AK sind zwar metabolisch aktiv, redifferenzieren
allerdings nicht in EK und werden nicht aus der Wirtszelle freigesetzt. Auf diese Weise
können Chlamydien ihren Wirt langfristig infizieren. Durch Zuführung von Eisen oder dem
WegfalllimitierenderBedingungen„erwachen“dieBakterienausderPersistenzundkönnen
ihreEntwicklungwiederfortsetzen(Beattyetal.,1993;AlYounesetal.,2001).
Abb.1.2EntwicklungszyklusvonChlamydien
SieheTextfürErklärung.
EK=Elementarkörperchen,RK=Retikularkörperchen,AK=aberranteKörperchen
I.Einleitung
Seite10
DerchlamydialeEntwicklungszykluslässterkennen,dasseineerfolgreicheEntwicklungund
Vermehrung der Bakterien von ihrer Fähigkeit abhängt, mit der Wirtszelle in
Wechselwirkung zu treten. Bevor näher auf die chlamydialen Interaktionen mit der
Wirtszelle
eingegangen
wird,
sollen
zunächst
Grundzüge
intrazellulärer
Transportmechanismenerläutertwerden.
1.2
GrundzügedesintrazellulärenTransportesineukaryontischenZellen
Eukaryontische Zellen weisen eine komplexe Kompartimentierung auf. Die Zellphysiologie
wird durch intrazellulären Transport von Proteinen und Membranen aufrechterhalten,
wobeijedesOrganellinderLageseinmuss,seineIdentitätundFunktionzubewahren.
ManunterscheidetzweiwesentlichevesikuläreTransportrouteninderZelle:DieEndozytose
unddieExozytose(AllisonundDavies,1974).DieEndozytosedientderInternalisierungvon
Rezeptoren und der Aufnahme von Nährstoffen an der Plasmamembran. Proteine oder
Rezeptoren, die wieder zur Plasmamembran gebracht werden müssen, werden über die
RecyclingEndosomen zurückgewonnen. Dagegen werden Moleküle, die zur Degradation
bestimmtsind,überdasendosomaleSystemdenLysosomenzugeführt.
Der sekretorische Weg hingegen transportiert de novosynthetisierte Proteine und Lipide
vom endoplasmatischen Retikulum (ER) über den GolgiApparat zur Plasmamembran oder
ihrenjeweiligenBestimmungsortinnerhalbderZelle(z.B.Lysosomen).
1.2.1 DerGolgiApparat
DerGolgiApparatstelltdasHerzstückdersekretorischenTransportmaschinerieinderZelle
dar.ErbestehtauseinerVielzahlvonflachenZisternen(membranumschlossenenRäumen),
dieinStapelnmiteinanderverbundenvorliegen,ohnejedochzufusionieren(Palade,1975;
Farquhar und Palade, 1998). Diese GolgiStapel formen in Säugetieren das sogenannte
GolgiBand(BarrundWarren,1996).
DerGolgiApparatisteinpolaresOrganell.ManunterscheidetdiemitdemERinAustausch
stehende cisSeite, die medialSeite und die transSeite, die mit der Plasmamembran und
denendozytotischenKompartimenteninteragiert(GriffithsundSimons,1986;Schweizeret
al., 1988). De novosynthetisierte Proteine gelangen auf ihrem Weg aus dem ER in den
GolgiApparat,wosiebeimPassierenderunterschiedlichenZisternendurchAnhängenvon
I.Einleitung
Seite11
z.B.Zuckerresten,modifiziertwerden.AmtransGolgiNetzwerk(TGN)schließlicherfolgtdie
SortierungzumjeweiligenBestimmungsort(Palade,1975;Munro,2005).
1.2.2 DieGolgiMatrix
EinigeGolgilokalisierteEnzymesindanderBildungdersogenanntenGolgiMatrixbeteiligt,
die hilfreich für die Erhaltung der dynamischen Struktur des GolgiApparates ist. Die
proteinreiche Matrix bildet ein Detergenzunlösliches intrazelluläres Gerüst, an das
Glycosyltransferasen binden können und durch welches die Zisternen miteinander
verbundenwerden(Cluett und Brown, 1992; Slusarewicz et al., 1994). Entdeckt wurde die
GolgiMatrixdurchBehandlungvonZellenmitBrefeldinA(BFA).BFAführtzueinerBlockade
des ERGolgiTransportes. Dies hat zur Folge, dass die meisten Golgilokalisierten Proteine
zum ER relokalisieren, während eine Gruppe von Proteinen und tubulovesikulären
Membranenzurückbleibt(Seemannetal.,2000;Wardetal.,2001).
Diese MatrixProteine gehören zur Familie der Golgine und beinhalten alle ein coiledcoil
Proteinmotiv,welchesausgedehntestabförmigeStrukturenausbildenkann(BarrundShort,
2003;GillinghamundMunro,2003).UrsprünglichwurdenGolginealseineFamilievonGolgi
lokalisierendenAutoantigenenidentifiziert(Nozawaetal.,2002).
DieBindungseigenschaftenvonGolginenandieGolgiMembransindvielfältig(Shortetal.,
2005). Einige Golgine besitzen eine Cterminale Transmembrandomäne, die direkt an die
GolgiMembran bindet (Golgin84, Giantin, CASP), andere Golgine sind periphere
Membranproteine (Golgin45, GM130). Sie assoziieren mit dem GolgiApparat durch
Bindung an Adapterproteine aus der GRASPFamilie (Golgi reassembly stacking protein).
Diese wiederum binden über eine Nterminale Myristoylkette an die GolgiMembran.
Wieder andere Golgine werden durch kleine GTPasen der ARF, Rab oder ARLFamilie
(Bicaudal,p115,Golgin245,Golgin97)zumGolgiApparatrekrutiert.
Am GolgiApparat führen Golgine unterschiedliche Funktionen aus. Den Membran
assoziierten Proteinen GRASP65 und GRASP55 wurde in einem zellfreien Ansatz eine Rolle
imAufbauvonGolgiStapelnzugewiesen(Barretal.,1997;Shorteretal.,1999).Fürdascis
GolgiGolginGM130konntegezeigtwerden,dassessowohlanderFusionvonVesikelnmit
der GolgiMembran beteiligt ist, als auch an der Verankerung benachbarter Zisternen
(Puthenveeduetal.,2006;Marraetal.,2007).
I.Einleitung
Seite12
DieambestenuntersuchteFunktionvonGolginenistdieBindungvonTransportvesikelnan
die GolgiMembranen. Ankommende Vesikel werden am GolgiApparat u.a. durch die
GolgineGM130undp115gebunden(BarrundWarren,1996;Nakamuraetal.,1997;Lesaet
al.,2000).DasperiphereMembranproteinp115lokalisiertzumcisGolgi,woesvonGM130
gebunden wird. Durch Bindung des z.B. auf COPIVesikeln enthaltenem Golgin Giantin an
p115undGM130entstehteinternärerKomplex,derdasVesikelamGolgiApparatverankert
(Sonnichsenetal.,1998).
VieleGolgineinteragierenaußerdemmitRabProteinen,allerdingsistdieWirkungsweiseder
Interaktionweitgehendunbekannt.DiebereitsgenanntenGolginep115,GM130undGiantin
sindbekannteInteraktionspartnerfürRab1dekorierteVesikel(Sonnichsenetal.,1998;Allan
etal.,2000;Moyeretal.,2001;Beardetal.,2005).ZusätzlichistGiantinaucheinEffektor
vonRab6(Rosingetal.,2007).FürRab6wurdeeineInteraktionmitdenGolginenBicaudal
D1undBicaudalD2amTGNgezeigt,wosiefürdieRegulationdesretrogradenTransportes
von den Endosomen zum GolgiApparat verantwortlich sind (Matanis et al., 2002; Short et
al.,2002).DasintegralecisGolgiProteinGolgin84kannebenfallsmitRab1transportierten
Vesikelninteragieren(Diaoetal.,2003;Satohetal.,2003).
1.2.3 BeförderungvonVesikelninnerhalbdessekretorischen
Transportweges
FürdenTransportvonVesikelnvonderciszurtransSeitedesGolgiApparateswurdenzwei
Modelle vorgeschlagen: (1) Das Modell des vesikulären Transports und (2) das Modell der
Zisternenreifung(Bonfantietal.,1998;PelhamundRothman,2000;MartinezMenarguezet
al.,2001;Mironovetal.,2001;BeznoussenkoundMironov,2002;Elsneretal.,2003;Losev
etal.,2006).ImerstenModellwerdendasERundderGolgiApparatalsstabile,stationäre
Strukturenangesehen.DerTransporterfolgtdurchAbschnürungvonVesikelnamERundam
GolgiApparat, die ihre Fracht durch Fusion mit ihrer Zielmembran entlassen. Der
Rücktransport von ERGolgiApparatstationären Enzymen erfolgt über einen retrograden
Vesikeltransport.
Diebereitsvorüber50JahrenformulierteZisternenreifungbasiertaufderAnnahme,dass
neu synthetisierte Proteine das ER in membranumgebenen Transportvehikeln verlassen
(Grasse, 1957). Am GolgiApparat erfolgt keine Entladung des Frachtmaterials, wie beim
I.Einleitung
Seite13
vesikulären Transport, sondern die gesamte Struktur reift graduell in eine GolgiZisterne.
Durch entgegengesetzten (retrograden) vesikulären Transport von Enzymen in die
nachrückenden Zisternen, können die einzelnen gesamten Zisternen von der cis auf die
transSeitedesGolgiApparatespassieren.
Einzelstehend liefern beide Modelle allerdings keine Erklärung für den Transport großer
Moleküle, wie z.B. Procollagen, die aufgrund ihrer Größe nicht von GolgiVesikeln
transportiert werden können oder das Fehlen von Enzymen in retrogradtransportierten
COPIVesikeln (Orci et al., 1997; Bonfanti et al., 1998). Eine Kombination beider Modelle
scheint die beobachteten Vorgängen am besten wiederzuspiegeln. Einen langsamen
Transportvonz.B.MakromolekülendurchZisternenreifungundeinen„schnellenWeg“über
verschiedenePopulationenvonCOPIVesikeln.
1.2.3.1 FormationvonVesikeln
DerVesikelvermittelteTransportverläuftgrundlegendinvierSchritten.(1)DasAbschnüren
desVesikelsvonderDonormembran,(2)denTransportinRichtungderZielmembran,(3)das
Verankern des Vesikels am Bestimmungsort und schließlich (4) die Fusion des Vesikels mit
derZielmembran(Rothman,1994).
DieVesikelformationwirddurchdieAggregationvonzytoplasmatischenProteinenzueiner
Hülleeingeleitet.DiedreibekanntestenFamilienvonHüllproteinensindCOPI(coatprotein
complex I), COPII (coatprotein complex II) und Clathrin mit den Adaptorproteinkomplexen
AP1 and AP2 (Schekman und Orci, 1996). Die COPHüllen werden vorrangig in der
Exozytose und im RecyclingTransport zwischen dem ER und dem GolgiApparat benutzt,
während Clathrinumhüllte Vesikel vor allem auf endozytotischen und RecyclingRouten
zwischenderPlasmamembranundLysosomenzufindensind.
COPIIVesikel schnüren sich am ER an spezifischen Stellen, den ER exit sites, ab. Die
Zusammensetzung derHülle erfolgt durch die sequenzielle Bindung der Sar1p GTPase, des
Sec23/24p Komplexes und des Sec13/31p Komplexes (Barlowe et al., 1994). Durch die
Polymerisierung der Hülle und Stimulierung der GTPase Aktivität kommt es zu einer
Membrankrümmung,ausdersichdasTransportvesikelabschnürenkannundinRichtungdes
GolgiApparatestransportiertwird(Barloweetal.,1994;Presleyetal.,1997;Pepperkoket
al., 2000; Antonny et al., 2001). Auf ihrem Weg zum GolgiApparat passieren die
I.Einleitung
Seite14
Transportvesikel das ERGIC (ERGolgi intermediate compartment) (Hauri und Schweizer,
1992;Haurietal.,2000).SowohlCOPIalsauchCOPIIVesikelassoziierenmitdemERGIC.Es
wird angenommen, dass das ERGIC als erste Instanz zwischen retrogradem und
anterogrademTransportunterscheidet(MartinezMenarguezetal.,1999;Haurietal.,2000)
Der anterograder Transport von Vesikeln vom ERGIC zum GolgiApparat erfolgt unter
anderemüberCOPInegativepreGolgiTransporter,diegrößeralseinVesikelsind(Presley
etal.,1997;MartinezMenarguezetal.,1999).
FürdieAufrechterhaltungderFunktiondesGolgiApparatesmüssenProteineundEnzyme,
diewährenddesTransportesinandereOrganellenoderGolgiZisternengelangen,wiederan
ihren ursprünglichen Zielort zurückgelangen. Die ProteinRückgewinnung aus dem ER oder
dem GolgiApparat ist ein spezifisch regulierter Prozess, der auf der Anwesenheit von
Sortierungssignalen, wie z.B. einer K/HDELSequenz oder einer KKXXSequenz (Dilysin), in
denRecyclingProteinenberuht(Pelham,1988;BarloweundSchekman,1993;Letourneuret
al.,1994).DieCOPIHülleinteragiertmitdemKKXXMotivvielerERstationärerEnzymeund
ist an deren Rücktransport aus dem GolgiApparat beteiligt (Letourneur etal., 1994). Über
denInhaltvonCOPIVesikelnistbisherallerdingswenigbekannt.2005zeigtenWarrenund
seineMitarbeiter,dasseineüberGolgin84undCASPgebundeneSubpopulationvonCOPI
Vesikeln keine Rezeptorproteine der p24Familie beinhalten (Malsam et al., 2005). Die
Identifizierung weiterer Vesikelpopulationen könnte zur Aufklärung von Transportrouten
von Organellstationären Molekülen, Transportgut und rückgewonnenen Proteinen und
Enzymenbeitragen.
DieAbschnürungvonClathrinumhülltenVesikelnerfolgtanderPlasmamembran,amTGN
und an den Endosomen. Die ClathrinHülle besteht aus einer als „Triskelion“ bezeichneten
trimeren Struktur (Crowther und Pearse, 1981). Wie bereits beim Aufbau der COPIIHülle
beschrieben, führt der Zusammenbau der ClathrinHülle zur Deformierung der Membran
undzurAblösungeinesVesikels(Fordetal.,2002;Peteretal.,2004;Yoshidaetal.,2004).
I.Einleitung
Seite15
1.2.3.2 RabProteinvermittelterVesikeltransport
Hat sich ein Vesikel erfolgreich gebildet und abgeschnürt, kann dieses zu seinem
Bestimmungsort transportiert werden. Kleine GTPasen der RabFamilie übernehmen eine
Schlüsselrolle in der Regulierung dieser Transportprozesse (Zerial und McBride, 2001). Sie
vermitteln nicht nur die Formation, sondern auch den Transport und die Fusion von
endozytotischen und exozytotischen Vesikeln. RabProteine (ras in brain) gehören zur
Gruppe der kleinen GTPasen aus der RasFamilie. Inzwischen sind im Menschen über 60
Vertreter bekannt (Schultz et al., 2000; PereiraLeal und Seabra, 2001). Die Expression der
unterschiedlichen Vertreter ist dabei sowohl gewebespezifisch, als auch zeitlich reguliert.
InnerhalbderZellelokalisierenRabProteinezuunterschiedlichenKompartimenten,wosie
durchInteraktionenmitanderenEffektorproteinenMembranMikrodomänenausbildenund
mannigfaltigeFunktioneninderSortierung,demTransport,derVerankerungundderFusion
vonVesikelnausüben(DiracSvejstrupetal.,1997;Sonnichsenetal.,2000;Grosshansetal.,
2006).
Für einige ausgewählte RabProteine sind hier die jeweiligen Zielkompartimente genannt:
Rab5lokalisiertzudenfrühenEndosomen,Rab7undRab9dekorierenspäteEndosomenund
Lysosomen,Rab1,Rab2,undRab6regulierendenTransportzwischenERundGolgi,während
Rab4undRab11ProzesseanRecyclingEndosomensteuern(Abb.1.3).
I.Einleitung
Seite16
Abb.1.3LokalisationvonRabProteineninnerhalbderZelle
SieheTextfürErklärung.
ER = endoplasmatisches Retikulum, TGN = transGolgi Netzwerk, EE =frühe Endosomen, RE = Recycling
Endosomen,LE=späteEndosomen,CV=coatedvesicles
RabProteine agieren als molekulare Schalter. Sie wechseln zwischen einer GDP
gebundenen,zytosolischenundeinerGTPgebundenen,membranständigenForm(Abb.1.4)
(ZerialundMcBride,2001).DabeibesitzensieallerdingsnureineschwacheintrinsischeGTP
Hydrolyse Aktivität. Diese wird durch Bindung von GTPaseaktivierenden Proteinen (GAPs)
katalysiert(Fukuietal.,1997;Cuifetal.,1999).AuchderNukleotidaustauscherfolgtdurch
Bindung von GuaninNukleotidaustauschFaktoren (guanine nucleotide exchange factors,
GEFs). In ihrem GDPgebundenen Zustand sind RabProteine löslich und befinden sich,
gebunden am GuaninNukleotidDissoziationsinhibitor (guanine nucleotide dissociation
inhibitor, GDI), im Zytosol (Soldati et al., 1993; Ullrich et al., 1993). An der Zielmembran
können sie über Interaktionen mit dem GDIVerdrängungsfaktor (GDI displacement factor,
I.Einleitung
Seite17
GDF) freigesetzt werden und mittels ihres Cterminalen GeranylgeranylLipidankers in die
Membraninserieren(DiracSvejstrupetal.,1997).
Abb.1.4RabProteinGTPaseZyklus
SieheTextfürErklärung.
GTP = GuanosinTriPhosphat, GDP = GuanosinDiPhosphat, GEF = GuaninNukleotidaustauschFaktor,
GAP= GTPaseaktivierendes Protein, GDI = GuaninNukleotidDissoziationsinhibitor, GDF = GDI
Verdrängungsfaktor
Der Transport von Vesikeln zu ihrer Zielmembran erfolgt auf Aktin oder Mikrotubuli
abhängigen Routen durch das Zytoplasma. Die Beförderung auf diesen Strecken erfordert
spezielle Motorproteine, die Myosine, Kinesine oder Dyneine (Mallik und Gross, 2004).
Kinesine transportieren Vesikel in Richtung des PlusEndes von Mikrotubuli zur
Zellperipherie, während Dyneine Minusmotoren sind und Vesikel zum Mikrotubuli
Organisationszentrum(MTOC)undNukleustransportieren(Paschaletal.,1987;Schroeret
al.,1989;Hirokawaetal.,1991).MotorproteinekönnendirektoderindirektanRabProteine
gebundensein.FürdasMotorproteinRabkinesin6konntegezeigtwerden,dassesdirektan
Rab6bindetunddamitdenVesikeltransportvomGolgiApparatzumERbegünstigt(Echard
I.Einleitung
Seite18
et al., 1998). Rab27apositive Melanosomen hingegen werden über den Effektor
MelanophilinandasAktinMotorproteinMyosinVagebunden(Strometal.,2002).
1.2.3.3 VerankerungundFusionvonVesikelnanderZielmembran
DieletztenwichtigenSchrittedesVesikelvermitteltenTransportessinddieVerankerungan
der Zielmembran und die Fusion, der in räumliche Nähe gebrachten Membranen. Die
Verankerung des Vesikels wird z.B. durch Interaktionen mit so genannten tether proteins,
wiep115erreicht(Sonnichsenetal.,1998).
ZurFusiondesVesikelmitderZielmembranmüssensichdiesogenanntenSNAREKomplexe
(soluble Nethylmaleimidesensitive factor attachment protein receptors) des Vesikels mit
denen
der
Zielmembran
paaren
(Rothman,
1994).
SNAREProteine
sind
Transmembranproteine, die eine Verwandtschaft zu den drei neuronalen Proteinen
Synaptobrevin, Syntaxin und SNAP25 aufzeigen. Alle SNAREProteine besitzen eine
konservierte 6070 Aminosäuren lange Domäne, das SNAREMotiv, dass in mehreren
Wiederholungenvorliegenkann(Bocketal.,2001).JedeintrazelluläreMembran,unddamit
auch jeder Vesikel, ist mit einem bestimmten Set an Membranfusionermöglichenden
SNAREProteinenausgestattet.EingeleitetwirddieFusioneinesVesikelsmitderBindungder
drei,aufeinemVesikelvorkommenden,helikalenvSNAREs(vesicleSNARE)aneinhelikales
tSNARE(targetSNARE)aufderZielmembran(Sollneretal.,1993b;Rothman,1994).Diese
KonstellationbildeteinstabilesVierHelixBündel,wessenAufbaugenugAktivierungsenergie
freisetzt, um den Fusionsprozess durchzuführen (Fasshauer et al., 1997; Yang und Huang,
2002).DerKomplexwirdnachderFusiondurchdieATPaseNSF(NethylmaleimideSensitive
Factor) und den Kofaktor SNAP (soluble NSF attachment proteins) aufgelöst (Sollner et al.,
1993a). Die einzelnen Komponenten werden anschließend neuen Transport und
Fusionszyklenzugeführt.
1.2.4 TransportvonLipidenineukaryontischenZellen
Für den Aufbau von Membranen sind nicht nur Proteine, sondern auch eine Vielzahl von
Lipiden notwendig. Die LipidBiosynthese erfolgt hauptsächlich im ER. Phospholipide,
Ceramide und Cholesterol werden hier synthetisiert (Kent, 1995; Chang et al., 2006). Der
TransportzumGolgiApparatverläuftoftanalogüberVesikel,allerdingswurdenauchnicht
I.Einleitung
Seite19
vesikuläre Transportmechanismen beschrieben. So konnte ein multifunktionelles Protein,
CERT,identifiziertwerden,dassfürdenTransportvonCeramidenvomERzumGolgiApparat
zuständig ist (Hanada et al., 2003). Im GolgiApparat können Ceramide durch die Enzyme
SphingomyelinSynthase,
UDPGal:Glucosylceramidbeta1,4Galactosyltransferase
und
GlucosylceramidSynthase in Sphingomyeline, Lactosylceramide oder Glycosphingolipide
konvertiertwerden(FutermanundRiezman,2005).
Cholesterol wird in eukaryontischen Zellen über zwei Wege akquiriert: Endogen, über
denovoSynthese oder exogen, über die Aufnahme aus der Umgebung durch LDL (low
density lipoprotein) und LDLRezeptoren. Die spezifische Lipid und ProteinKomposition
jedes Organells, vor allem der CholesterolLevel, unterliegt einer strengen Regulation.
Defekte im CholesterolMembrantransport können sich in der NiemannPick Typ C (NPC)
Krankheit manifestieren (Pentchev et al., 1985). Bei dieser autosomalrezessiv vererbten
neurodegenerativen Erkrankung kommt es im Zuge eines gestörten LDLabhängigen
CholesterolTransportes zu einer intrazellulären Anreicherung von Cholesterylestern in
endozytotischen Organellen. Durch Überexpression von Rab9, Rab8 und Rab7 konnte der
NPCPhänotypkomplementiertwerden(Choudhuryetal.,2002;Linderetal.,2007).
1.3
ChlamydialeInteraktionenmitdenTransportwegenderWirtszelle
Die obligat intrazelluläre Lebensweise zwingt die Chlamydien mit der Wirtszelle zu
interagieren. Diese Interaktionen sind vielfältig und beginnen bereits während der
AufnahmeindieZelle.
In die Wirtszelle transloziertes bakterielles Tarp (Translocated actin recruiting
phosphoprotein) wird dabei durch zelluläre Kinasen phosphoryliert und setzt eine
Signalkaskade in Gang, die eine Modulation des Zytoskeletts zur Folge hat (Clifton et al.,
2005). Nach dem Eintritt in die Zelle konnten in der sich gebildeten Inklusionsmembran
mehrere ChlamydienProteine nachgewiesen werden, die als inclusion membrane proteins
(IncProteine)bezeichnetwerden(Rockeyetal.,1995;Bannantineetal.,1998;Bannantine
undRockey,1999;ScidmoreCarlsonetal.,1999).DieFunktiondieserProteineistnochnicht
vollständig geklärt. Es wird angenommen, dass IncProteine unter anderem für die
homotypeFusionvonInklusionenwichtigsind(Hackstadtetal.,1999;Delevoyeetal.,2004;
Delevoyeetal.,2008).DesWeiterenkonntenkeinewirtszellspezifischenendosomalenoder
I.Einleitung
Seite20
lysosomalenMarkeraufderInklusionsmembrangefundenwerden,dieaufInteraktionenmit
endozytotischenRoutenschließenlassen(Friis,1972;Heinzenetal.,1996;Scidmoreetal.,
2003). Chlamydien konkurrieren allerdings mit der Wirtszelle um die Aufnahme von Eisen
aus den RecyclingEndosomen. Dies konnte durch Assoziation von Transferrin/Transferrin
RezeptorbeinhaltendenVesikelnanderInklusionsmembranbeobachtetwerden(Scidmore
etal.,1996b;vanOoijetal.,1997;AlYounesetal.,2001).
Über Mikrotubuliabhängige Routen gelangt die Inklusion zum MTOC. Dieser Transport
ähnelt der Beförderung von zellulären Vesikeln und ist Dyneinabhängig, jedoch p50
Dynamitinunabhängig (Grieshaber et al., 2003). Am periGolgiApparat angekommen,
beginnen Chlamydien Sphingolipide und Cholesterol aus dem GolgiApparat zu akquirieren
(Hackstadt et al., 1996; Scidmore et al., 1996a; Wylie et al., 1997; Carabeo et al., 2003).
Cholesterol, Glycerophospholipide und Glycerosphingolipide werden in der Regel nur von
eukaryontischen Zellen synthetisiert. Erstaunlicherweise können diese Lipide in der
bakteriellenZellwandaufgereinigterEKdetektiertwerden(HatchundMcClarty,1998).Wird
dieser Transport unterbrochen, wirkt sich dies negativ auf das Chlamydienwachstum aus.
Der molekulare Mechanismus der Lipidinkorporation in die Bakterien ist allerdings wenig
untersucht.
Der Transport von Lipiden und Membranen in Form von Vesikeln wird innerhalb der
Wirtszelle vorwiegend durch RabProteine reguliert. Für viele intrazelluläre Organismen
konnten Interaktionen mit RabProteinen gezeigt werden, die die bakterielle Entwicklung
sichern. Chlamydien sind in der Lage, selektiv RabProteine zu rekrutieren. C.trachomatis
rekrutiert Rab1, Rab4, Rab6 und Rab11, während Cp. pneumoniae Rab1, Rab4 und Rab11
heranzieht,abernichtmitRab6interagiert.ZusätzlichistdieInteraktionmitRab10spezifisch
für Cp. pneumoniae (Rzomp et al., 2003). Die Relevanz und funktionelle Bedeutung dieser
Beobachtung für eine erfolgreiche chlamydiale Vermehrung innerhalb der Wirtszelle ist
bislangungeklärt.
Kürzlichkonntezudemgezeigtwerden,dassdieIncProteineCT229vonC.trachomatisund
Cpn0585vonCp.pneumoniaemitzellulärenRabProteineninteragieren(Cortesetal.,2007).
Zusammenfassend zeigen die Untersuchungen, dass Chlamydien hauptsächlich mit
Organellen des sekretorischen Transportweges interagieren, während sie die Fusion mit
endozytotischenKompartimentenverhindern.
I.Einleitung
1.4
Seite21
siRNATechnologie
Die spezifische Herabregulation von Genen über den Mechanismus der RNAInterferenz
(RNAi) konnte erstmals von Andrew Fire und Craig Mello durch Injektion doppelsträngiger
RNAindenNematodenCaenorhabditiselegansgezeigtwerden.Dabeihandeltsichumeinen
posttranskriptionellen Prozess, bei dem die Expression eines Gens sequenzspezifisch
inhibiert werden kann (Fire et al., 1998). Die eingebrachten langen doppelsträngigen RNA
Moleküle werden über das RNAseIIIEnzym DICER in kleine Nukleotidfragmente, so
genannte siRNAs (shortinterfering RNAs), von 1921bp Länge geschnitten und in den
ProteinKomplex RISC (RNAinduced silencing complex) eingebaut. Im RISC wird die
doppelsträngigesiRNAaufgewundenundderAntisenseStrangalsMatrizefürdiespezifische
BindungderZielmRNAverwendet,welcheanschließenddurchArgonaut2geschnittenwird.
Nach vollständiger Degradation der mRNA durch weitere Nukleasen und einer von der
HalbwertszeitdesZielproteinsabhängigenKarenzzeitkommteszumVerlustdesZielproteins
inderZelle(Hannon,2002).
Auf Grundlage dieser Beobachtungen konnten Tuschl und seine Mitarbeiter durch das
Einbringen synthetischer 21 bp langer siRNAs auch in Säugerzellen spezifisch Proteine
ausschalten (Elbashir et al., 2001a; Elbashir et al., 2001b). Diese Weiterentwicklung
ermöglichte die gezielte Erzeugung von Proteinfunktionsverlusten und damit die
systematische Analyse von Proteinfunktionen, ohne dabei auf die ektopische Expression
rekombinanterProteineangewiesenzusein.
BeiAnwendungderRNAiistdasDesigndersiRNAvonbesondererBedeutung.Dabeimuss
besonders auf bestimmte Sequenzeigenschaften und die beste Zielregion in der mRNA
geachtet werden. Ungünstige Sekundärstrukturen durch Palindrome oder Wiederholungen
könnendieFunktionalitätbeeinträchtigen(Reynoldsetal.,2004).Zudemkannbereitseine
Homologie von 1115 aufeinander folgenden Nukleotiden zwischen verschiedenen Genen
ausreichen,umbeiVerwendungderkomplementärensiRNAZielgenunabhängigeSequenzen
spezifisch herab zu regulieren (Jackson et al., 2003). Um diese so genannten offtarget
EffektealsUrsachefüreinenPhänotypauszuschließen,solltenmöglichstmehreresiRNAsfür
die Herunterregulation eines Gens verwenden werden. Haben diese ähnliche Phänotypen
zur Folge und korreliert die Ausprägung der Phänotypen mit der Reduktion der
I.Einleitung
Seite22
Proteinmenge, beruhen diese mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit auf dem Verlust des
eigentlichenZielproteins.
Die Verwendung der RNAi bietet in der vorliegenden Arbeit die Möglichkeit spezifische
Wirtszellproteineherunterzuregulieren.DadurchkönnenAuswirkungenaufdiechlamydiale
Entwicklunguntersuchtwerden.
1.5
Fragestellung
In der vorliegenden Arbeit sollte die Bedeutung der Struktur des GolgiApparates in der
ChlamydienInfektionanalysiertwerden.
Zunächstsollteuntersuchtwerden,welcheAuswirkungenderRNAivermitteltefunktionelle
AusfallsbestimmterGolgiStrukturproteineaufdasWachstumderChlamydienhat.
Für mehrere GolgiStrukturproteine sind Wechselwirkungen mit RabProteinen aufgezeigt
worden,undeskonntenbereitsInteraktionenderInklusionmitRabProteinenbeschrieben
werden. Die Relevanz diese Interaktionen für eine erfolgreiche Infektion, blieb bisher
allerdingsungeklärt.DurchHerunterregulationunterschiedlicherRabProteinemittelsRNAi
sollte deren Bedeutung für die chlamydiale Vermehrung und Entwicklung und die Golgi
Strukturbestimmtwerden.
DiebakterielleVersorgungmitLipidenundanderenNährstoffenspielteinezentraleRollein
den Interaktionen von Chlamydien mit den Transportwegen der Wirtszelle. Über den
Mechanismus der Lipidinkorporation ist noch wenig bekannt. Untersuchungen zum
Transport von Sphingolipiden aus dem GolgiApparat in die Inklusion in knock downZellen
sollten Aufschluss darüber geben, ob RabProteine für die bakterielle Lipidzufuhr wichtig
sind.
Der simultane Verlust entscheidender Proteine aus dem RabProteinvermittelten
Transportweg und dem GolgiApparat sollte abschließend bisher nicht gekannte
AbhängigkeiteninderInfektionaufzeigen.
II.MaterialundMethoden
Seite23
II.MATERIALUNDMETHODEN
2.1
Chemikalien
AlleChemikalienwurden,soweitnichtandersangegeben,vonROTH,SIGMAALDRICHoder
MERCKbezogen.
2.2
Geräte
DieLaborausstattungentsprichtmodernenLaborstandards.
AutomatischesFluoreszenzmikroskopScanR
OLYMPUS
BioRobot®8000System
QIAGEN
ELISAPhotometerSpectraMax190 MOLECULARDEVICES
Fluoreszenzmikroskop
OLYMPUS
LaserScanningMikroskop(KrArLaser)TCSSP1 LEICA
LebendzellMikroskopTCSSP5
TransmissionselektronenmikroskopLeo906E
2.3
LEICA
CARLZEISS
VerwendeteDatenbankenundProgramme
AdobePhotoshop11.0Bildbearbeitungsprogramm
BCM search launcher http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/ BCM (Baylor College of
Medicine)searchlauncher
BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/BLAST/
BLOCKiTTMRNAiDesignerProgrammzurGenerierungvonshRNASequenzen
CorelDraw11.0Grafikprogramm
ImageJ Bildverarbeitungsprogramm zum Vermessen von Strukturen auf mikroskopischen
Aufnahmen
LAFliteSoftwareamLebendzellMikroskopTCSSP5
MetaMorphBildverarbeitungsprogrammfürdiekonfokaleLebendzellmikroskopie
NCBIHomepage:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
ScanRSoftwareSoftwarefürdasautomatischeMikroskop
II.MaterialundMethoden
2.4
Seite24
Zellkultur
Zelllinien
HeLa HEp2 ZervixepithelKarzinom(human) ATCC:CCL2
LarynxepithelKarzinom(human), ATCC:CCL23
HeLakontaminiert
WachstumsmediumfüralleverwendetenZelllinien
RPMI GIBCOBRL
10%FKS,hitzeinaktiviert
BIOCHROM
WeitereZellkulturmaterialien
OptiMEM
GIBCOBRL
PBS GIBCOBRL
Trypsin/EDTA GIBCOBRL
Zellkulturflaschen TPP
Methode
DieobligatintrazelluläreLebensweisevonChlamydienerforderteinebesonderssorgfältige
Zellkultivierung. Alle verwendeten Zelllinien wurden in 75 cm2 Zellkulturflaschen mit
WachstumsmediumvermehrtundinregelmäßigenAbständeninneueKultivierungsflaschen
passagiert.DasAblösenderZellenvonderMatrixerfolgtedurchInkubationmitTrypsinfür
25 Min. Routinemäßig erfolgte alle vier bis sechs Wochen eine PCRUntersuchung auf
Kontaminationen mit Mycoplasma spp. Nach der 12ten Passage wurden die Zellen
verworfen,umPassageabhängigeEffekteauszuschließen.
2.5
InfektionenvonZellenmitC.trachomatis
Zelllinien
HeLa ZervixepithelKarzinom(human)
HEp2 LarynxepithelKarzinom(human)
HeLakontaminiert
Bakterienstämme
ChlamydiatrachomatisL2 ATCC:CCL2
ATCC:CCL23
lymphatischesIsolat ATCC:VR902B
II.MaterialundMethoden
Infektionsmedium
RPMI 5%FKS,hitzeinaktiviert
Zellkulturmaterial
6und12KalottenMikrotiterplatten
Seite25
GIBCOBRL
BIOCHROM
TPP
Methode
Für die Infektion mit Chlamydien wurden die jeweiligen Zellen in 6 oder 12Kalotten
Mikrotiterplatten ausgesät. Die Zelldichte zum Zeitpunkt der Infektion betrug in jeder 6
oder12KalottenMikrotiterplatteungefähr80%.ZurVorbereitungderInfektionwurdendie
jeweiligen Zellen zweimal mit Infektionsmedium gewaschen. Die EK wurden in der jeweils
angegbenen MOI in Infektionsmedium verdünnt und 1 ml (pro Kalotte einer 6Kalotten
Mitrotiterplatte)bzw.500μl(proKalotteeiner12KalottenMikrotiterplatte)alsInokulum
auf den Zellen verteilt und zwei Stunden bei 35°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend
wurden die Zellen gewaschen, mit frischem Infektionsmedium überschichtet und den
jeweiligen Versuchsbedingungen entsprechend bis zu zwei Tage bei 35°C und 5% CO2 im
Brutschrankinkubiert.
2.6
HerstellungvonC.trachomatisStammlösungen
Zelllinie
HeLa ZervixepithelKarzinom(human)
ATCC:CCL2
Bakterienstämme
ChlamydiatrachomatisL2
lymphatischesIsolat ATCC:VR902B
Infektionsmedium
RPMI 5%FKS,hitzeinaktiviert
GIBCOBRL
BIOCHROM
SPGPuffer
PBS,0,25MSaccharose
WeiteresMaterial
Spritzemit26GKanüle
Glasperlen(2,2mmbis3,4mm)
II.MaterialundMethoden
Seite26
Methode
Konfluente HeLaZellen mehrerer 75 cm2 Zellkulturflaschen (510 Stück) wurden mit
C.trachomatis (MOI 3) infiziert und nach zwei Tagen mit Glasperlen (2,2 mm bis 3,4 mm)
mechanisch abgelöst. Das Lysat wurde in mit Glasperlen befüllte Röhrchen überführt und
drei Minuten gevortext. Dadurch wurden die Zellen aufgeschlossen und die infektiösen EK
freigesetzt. Zelltrümmer und Kerne wurde in einem anschließenden Zentrifugationsschritt
(500xg, 10 Min. bei 4°C) entfernt. Die Bakterien wurden in einem letzten
Zentrifugationsschritt(4800xg,60Min.bei4°C)pelletiert.DasPelletwurdeeinmalmitSPG
Puffer gewaschen und schließlich mit Hilfe einer Spritze (26G Kanüle) in SPGPuffer
resuspendiert und aliquotiert. Die Aliquots wurden erst drei bis vier Stunden bei 4°C und
anschließendbei80°CgelagertundfürjedesExperimentfrischaufgetaut.
2.7
BestimmungdesC.trachomatisTiters
Zelllinie
HeLa ZervixepithelKarzinom(human)
ATCC:CCL2
Bakterienstämme
ChlamydiatrachomatisL2
lymphatischesIsolat ATCC:VR902B
Infektionsmedium
RPMI 5%FKS,hitzeinaktiviert
GIBCOBRL
BIOCHROM
Lösungen
Tab.2.1verwendeteLösungenfürdieImmunfluoreszenz
LÖSUNGEN
ZUSAMMENSETZUNG
Mowiol
4%Paraformaldehyd(PFA)
10xPBS
Permeabilisierungspuffer
2,4 g Mowiol 488, 6 g Glycerin, 6 ml H2O, über Nacht
quellenlassen,12ml0,2MTRISpH8,5,12ml0,2MTRIS
pH8,5
unterRührenauf60°Cerhitzen,
danachLösungbei4000UpMzentrifugieren
8 g PFA, 20 ml 10x PBS, 8 g Saccharose, ad 200 ml H2O,
pH7,4
0,2gKCl,0,2gKH2PO4,8gNaCl,2,16gNa2HPO4*7H2O,
ad1lH2O
0,2%BSAinPBS,0,2%TritonX100
II.MaterialundMethoden
Seite27
Antikörper
Tab.2.2PrimärantikörperfürdieBestimmungdesC.trachomatisTiters
ANTIKÖRPER
SPEZIES
HERSTELLER
Hsp60(A57E4)
Maus
ALEXIS
Tab.2.3SekundärantikörperfürdieBestimmungdesC.trachomatisTiters
ANTIKÖRPER
ANTIGEN
SPEZIES
HERSTELLER
Fluoreszierendesekundäre
CyAntikörper,Cy3konjugiert
Maus
Ziege
MOLECULAR
PROBES
WeiteresMaterial
12KalottenMikrotiterplatte
Deckgläschen Objektträger TPP
Marienfeld
Methode
Der Titer der Bakterienstammlösung wurde durch serielle Verdünnung bestimmt. Dazu
wurden HeLa Zellen in eine 24KalottenMikrotiterplatte mit Deckgläschen ausgesät. Diese
ZellenwurdenmitdenseriellenVerdünnungenderBakterienlösung(je250μlproKalotte)in
Infektionsmediuminfiziertund24hp.i.mit2%PFAfür30Min.beiRTfixiert.Anschließend
wurdendiefixiertenZellenfür30Min.mitPermeabilisierungspufferundfürjeeineweitere
Stunde mit einem spezifischen ChlamydienAntikörper (Primärantikörper) inkubiert. Dazu
wurde eine PrimärantikörperLösung in PBS/0,2% BSA hergestellt und 20 μl auf Parafilm
pipettiert.DieDeckgläschenwurdenmitderZellenbewachsenenSeitenachuntenaufden
Tropfen gelegt und eine Stunde bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Deckgläschen
wiederzurückindieMikrotiterplatteüberführtunddreimalfür10Min.mitPBSgewaschen.
Die Inkubation mit dem sekundären Cy3konjugierten Antikörper erfolgte wie für den
Erstantikörperbeschrieben,allerdingsunterLichtausschluss.DiefertigenPräperatewurden
abschließendmitMowiolaufeinemObjektträgereingedeckt.DieAuszählungdergefärbten
InklusionenerfolgteamFluoreszenzmikroskop(40xVergrößerung).ProVerdünnungwurden
zehnGesichtsfeldererfasst.TheoretischsolltejedeInklusionaufdieInfektionmiteinemEK
zurückzuführensein.DieIFU(inclusionformingunits)konntemitfolgenderFormelbestimmt
werden.
II.MaterialundMethoden
Seite28
IFU/ml=[Inklusionen/Sichtfeld]x2975,21[Flächenfaktor]xVerdünnungx
4(Infektionsvolumeninml)
Die verwendeten Bakterienstockswurden zusätzlich aufKontaminationen mit Mycoplasma
spp.untersucht(PolymeraseKettenReaktion).
2.8
QuantifizierungderprimärenInfektion
Zelllinien
HeLa ZervixepithelKarzinom(human)
LuciferaseHeLa
Rab6KDHeLa Rab11KDHeLa
ATCC:CCL2
hergestelltindieserArbeit
hergestelltindieserArbeit
hergestelltindieserArbeit
Bakterienstämme
ChlamydiatrachomatisL2
lymphatischesIsolat ATCC:VR902B
Infektionsmedium
RPMI 5%FKS,hitzeinaktiviert
GIBCOBRL
BIOCHROM
Fixierung
Methanol(MeOH)
Lösungen
Tab.2.4verwendeteLösungenfürdieQuantifizierungderprimärenInfektion
LÖSUNGEN
ZUSAMMENSETZUNG
Mowiol
10xPBS
Permeabilisierungspuffer
2,4 g Mowiol 488, 6 g Glycerin, 6 ml H2O, über Nacht
quellenlassen,12ml0,2MTRISpH8,5,12ml0,2MTRIS
pH8,5
unterRührenauf60°Cerhitzen,
danachLösungbei4000UpMzentrifugieren
0,2gKCl,0,2gKH2PO4,8gNaCl,2,16gNa2HPO4*7H2O,
ad1lH2O
0,2%BSAinPBS,0,2%TritonX100
II.MaterialundMethoden
Seite29
Antikörper
Tab.2.5PrimärantikörperfürdieQuantifizierungderprimärenInfektion
ANTIKÖRPER
SPEZIES
HERSTELLER
MOMP
Maus
HoechstReagenz
UNIVERSITY
OFWASHINGTON
SIGMA
Tab.2.6SekundärantikörperfürdieQuantifizierungderprimärenInfektion
ANTIKÖRPER
ANTIGEN
SPEZIES
HERSTELLER
Fluoreszierendesekundäre
CyAntikörper,Cy3konjugiert
WeiteresMaterial
24KalottenMikrotiterplatten
Maus
Ziege
MOLECULAR
PROBES
TPP
Methode
DiePrimärinfektionwurdedurchBestimmungdergebildetenInklusionenproZellemitdem
automatischen Mikroskop quantifiziert. Dazu wurden die stabil transduzierten Zelllinien
LuciferaseHeLa, Rab11KDHeLa und Rab6KDHeLa in 24KalottenPlatten ausgesät und für
24hmitC.trachomatisL2MOI1,MOI0,5,MOI0,25,MOI0,125infiziert.DieZellenwurden
dannmiteiskaltemMeOHfür5Min.fixiertundüberNachtin70%EtOHbei4°Cgelagert.
Am nächsten Tag erfolgte die Färbung der Proben mit dem spezifischen Antikörper gegen
chlamydialesMOMP.DazuwurdendieZellenzunächst30Min.mit0,2%BSAblockiertund
anschließend für eine Stunde mit dem Primärantikörper inkubiert. Als Sekundärantikörper
wurdeeinCy3konjugierterAntikörperverwendet.ZurDektektionderZellkernewurdeder
AntikörperLösungHOECHSTbeigefügt.AbschließendwurdendieZellengewaschenundmit
PBSüberschichtet.DieBildaufnahmenerfolgtenaneinemautomatischenScanRMikroskop.
In jeder Kalotte wurden 6 Bilder für die Kanäle Rot (Inklusion) und Blau (Zellkerne)
aufgenommen.DieAuswertungerfolgtemitderScanRSoftware.DieAnzahlderInklusionen
proAnzahlderZellkernewurdequantifiziertundalsDiagrammdargestellt.
II.MaterialundMethoden
2.9
Seite30
BestimmungderInfektivitätvonChlamydien
Zelllinien
HeLa ZervixepithelKarzinom(human)
HEp2 LarynxepithelKarzinom(human)
HeLakontaminiert
LuciferaseHeLa
Rab6KDHeLa Rab11KDHeLa
ATCC:CCL2
ATCC:CCL23
hergestelltindieserArbeit
hergestelltindieserArbeit
hergestelltindieserArbeit
Bakterienstämme
ChlamydiatrachomatisL2
lymphatischesIsolat ATCC:VR902B
Infektionsmedium
RPMI 5%FKS,hitzeinaktiviert
GIBCOBRL
BIOCHROM
Lösungen
Tab.2.7verwendeteLösungenfürdieImmunfluoreszenz
LÖSUNGEN
ZUSAMMENSETZUNG
Mowiol
4%Paraformaldehyd
(PFA)
10xPBS
2,4gMowiol488,6gGlycerin,6mlH2O,überNachtquellen
lassen,12ml0,2MTRISpH8,5,12ml0,2MTRISpH8,5
unterRührenauf60°Cerhitzen,
danachLösungbei4000UpMzentrifugieren
8gPFA,20ml10xPBS,8gSaccharose,ad200mlH2O,pH7,4
0,2gKCl,0,2gKH2PO4,8gNaCl,2,16gNa2HPO4*7H2O,
ad1lH2O
Permeabilisierungspuffer 0,2%BSAinPBS,0,2%TritonX100
Antikörper
Tab.2.8PrimärantikörperfürdieBestimmungderInfektivität
ANTIKÖRPER
SPEZIES
HERSTELLER
Hsp60(A57E4)
Maus
ALEXIS
MOMP
Maus
UNIVERSITY
OFWASHINGTON
Tab.2.9SekundärantikörperfürdieBestimmungderInfektivität
ANTIKÖRPER
ANTIGEN
SPEZIES
HERSTELLER
Fluoreszierendesekundäre
CyAntikörper,Cy3konjugiert
MOLECULAR
PROBES
Maus
Ziege
II.MaterialundMethoden
WeiteresMaterial
24KalottenMikrotiterplatten
Deckgläschen Objektträger Seite31
TPP
Marienfeld
Methode
Zur Bestimmung der Infektivität der chlamydialen Nachkommenschaft wurde eine
Sekundärinfektion durchgeführt. Dazu wurden siRNAtransfizierte Zellen oder stabil
transduzierteZellenfür48hmitC.trachomatisL2infiziert.AnschließendwurdendieZellen
mit Glasperlen lysiert, um die infektiösen EK frei zu setzen. HeLa Zellen wurden in 24
KalottenMikrotiterplatte auf Deckgläschen ausgesät und darauf die EBs in seriellen
Verdünnungentitriert.Nach24hwurdendieZellenmitfür30Min.mit2%Pfafixiertundfür
eine weitere halbe Stunde mit Permeabilisierungspuffer behandelt. Der Primärantikörper
wurde in einer PBS/0,2% BSA Lösung verdünnt und 20 μl dieser Lösung auf Parafilm
pipettiert.DieDeckgläschenwurdenmitderZellenbewachsenenSeitenachuntenaufden
Tropfen gelegt und eine Stunde bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Deckgläschen
wiederzurückindieMikrotiterplatteüberführtunddreimalfür10Min.mitPBSgewaschen.
Die Inkubation mit dem sekundären Fluoreszenzgekoppelten Antikörper erfolgte wie für
den Erstantikörper beschrieben, allerdings unter Lichtausschluss. Um die Infektivität der
Nachkommen zu bestimmen, wurden die Inklusionen in zehn Gesichtsfeldern pro
VerdünnunguntereinemFluoreszenzmikroskop(40x)gezähltunddieIFU/mlmitfolgender
Formelberechnet:
IFU/ml=[Inklusionen/Sichtfeld]x2975,21[Flächenfaktor]xVerdünnungx
4(Infektionsvolumeninml)
Letztlich wurden die ermittelten Werte mit Hilfe der LDHBestimmung auf die IFU pro 106
Zellennormalisiert(sieheAbschnitt2.10).
II.MaterialundMethoden
2.10
Seite32
BestimmungderZellzahlmittelsdesLDHTests
GebrauchsfertigeLösung
CytotoxicityDetektionKit(LDH)
ROCHE
WeiteresMaterial
96KalottenMikrotiterplatte
TPP
Methode
DieBehandlungvonZellenmitsiRNAszeigteineinigenFällenAuswirkungenaufdieDauer
der Zellteilung. Um die Daten aus der Infektivitätsuntersuchung normalisieren zu können,
wurdedieZellzahlimInfektionslysat/primärenInfektionmitHilfedesCytotoxicityDetektion
Kit nach Herstellerangaben bestimmt. Das Nachweissystem beruht auf der Freisetzung
zytoplasmatischer LactatDehydrogenase (LDH) in den Zellkulturüberstand durch
Beschädigung der Plasmamembran. Dies korreliert mit der Bildung eines Formazan
Farbstoffes, welcher proportional zur Anzahl der lysierten Zellen ist. Für die Durchführung
diesesTestswurden500μldesProbenlysatsderInfektivitätsbestimmungabgenommenund
durch Zentrifugation (10 Min. bei 270x g) von Zelltrümmern befreit. 100 μl einer 1:50
Verdünnung wurden auf eine Mikrotiterplatte übertragen und mit 100 μl Reaktionslösung
versetzt. Als Eichkurvedienten serielle Verdünnungen lysierter HeLaZellen. Die Inkubation
erfolgte bei RT unter Lichtausschluss und wurde nach 2030 Min. durch Zugabe von 50 μl
Stopsolutionabgestoppt.AbschließendwurdedieAbsorptionamELISAPhotometerbei450
nmausgelesenunddieZellzahlderProbebestimmt.
2.11
TransfektionvonsiRNA
GebrauchsfertigeLösungen
RNAiFectTransfection
Zelllinien
HeLa ZervixepithelKarzinom(human)
HEp2 LarynxepithelKarzinom(human)
HeLakontaminiert
QIAGEN
ATCC:CCL2
ATCC:CCL23
II.MaterialundMethoden
Zelllinien
LuciferaseHeLa
Rab6KDHeLa Rab11KDHeLa
Wachstumsmedium
RPMI 10%FKS,hitzeinaktiviert
hergestelltindieserArbeit
hergestelltindieserArbeit
hergestelltindieserArbeit
GIBCOBRL
BIOCHROM
TPP
WeiteresMaterial
12KalottenMikrotiterplatten
siRNA
Tab.2.10SequenzdatenderverwendetensiRNAs
BEZEICHNUNG
SEQUENZ(xyN19)
CAGCGCCTGCACGATATTGAA
CASP
AACTTCATGCGAAGGCCAAAT
Giantin
CAGGCTGGAGTTATACAAGAA
GM130
CTGAGTTTAGTGGTCCTAATA
Golgin84
CAGGAGGACAATGTTGATGAA
Gpp130
AACUUACGCUGAGUACUUCGA
Luciferase
AACCCACCAAGACCGGCAATT
p115
CAGGAAATACATGAAATCCAA
p230
GTCCAGCATGAATCCCGAATA
Rab1
GGCGACACAGGTGTTGGTAAA
Rab2
AAUGCAGGAACUGGCAAAUCU
Rab4
ATTCATGGAGACATCCGCTAA
Rab5
CAGATTCATGTATGACAGTTT
Rab6
ACCTGCGTCCTTTTTCGTTTT
Rab10
AAGAGUAAUCUCCUGUCUCGA
Rab11
AAGGCCAGGTTTCTGCCAAAA
Rabkinesin6
Seite33
HERSTELLER
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
Methode
DieHerunterregulationderendogenenGenexpressionerfolgtemitdenangegebenensmall
interfering RNA (siRNA) Oligonukleotiden. Für das Design der siRNAs wurde ein speziell
entwickelter Algorithmus von Qiagen verwendet (Huesken et al., 2005). Einen Tag vor der
Transfektion wurden die jeweiligen Zellen in 12KalottenPlatten ausgesät. Die Zelldichte
zum Zeitpunkt der Transfektion betrug etwa 70%. Alle verwendeten siRNAs wurden von
Qiagen hergestellt und nach Angaben des Herstellers mit dem QIAGEN RNAiFect
II.MaterialundMethoden
Seite34
Transfection Kit transfiziert. Für die Transfektion wurde 130 nM siRNA in ECR Puffer
aufgenommen und mit 6 μl RNAiFect gemischt. Zur Bildung der LiposomenRNA Komplexe
wurde die Transfektionslösung 15 Min. bei RT inkubiert. Die Zellen wurden mit 600 μl
Wachstumsmedium überschichtet, worauf anschließend die Transfektionslösung getröpfelt
wurde. Nach 24 h Inkubation bei 37°C und 5% CO2 wurden die Zellen entsprechend der
jeweiligen Experimentbedingungen in neue 6, 12 oder 24KalottenMikrotiterplatten
umgesetztund72hp.t.mitC.trachomatisinfiziert.
II.MaterialundMethoden
Seite35
2.12 QuantitativeRealTimePCR(qRTPCR)
Zelllinie
HeLa ZervixepithelKarzinom(human) ATCC:CCL2
GebrauchsfertigeLösungen
RNeasy®96BioRobot®8000Kit
QIAGEN
RNAiFectTransfection
QIAGEN
QuantitectTMSYBR®GreenRTPCRKit
QIAGEN
siRNAPrimer
Tab. 2.11 Sequenzdaten der verwendeten Primer für die qRTPCR siRNAbehandelter
Zellen
BEZEICHNUNG
SEQUENZ
HERSTELLER
vorwärts 5’-AAAGACCAGCCTGAAAGTCGG-3’
CASP
OPERON
GAPDH
Giantin
GM130
Golgin84
Gpp130
p115
p230
Rab1
Rab2
Rab4
Rab5
Rab6
Rab10
Rab11
Rabkinesin6
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
5’-CCAGGGATGAGCTGAAAAAGT-3’
5’-GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3’
5’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’
5’-CCCTAGACCCTGAATTACACCAA-3’
5’-GGCAGAACAGTCCCTCCTTG-3’
5’-AATATCAGCAGAGGAATAGCCCT-3’
5’-CAGCATTGTCCTTGGGTGTAT-3’
5’-AATGCACCACGACCAACCA-3’,
5’-AGGCAATTGGCCTTCTTGC-3’
5’-CCCTCTCCGCCCAGTTACA-3’
5’-CTCCTCGTGTTGGCTTTTCA-3’
5’-AATTCTGGCTGGTCTGCACAG-3’
5’-GCGCAAAACAAATGGCTGC-3’
5’-ATGTATATGCAACAACTGTGGGG-3’
5’-CGAGGTGAAGTAAACATCAGCC-3’
5’-TCCCGGAACAGCCTATCTCAT-3’
5’-TCCACACCAATTGTGCTGATG-3’
5’-TCATAATCGGCGACACAGGTG-3’
5’-AGGATTCTTGCCCTGCCGTAT-3’
5’-GTCGCAGACGGCCATGTC-3’
5’-TCGTCACGGACCTGAATCG-3’
5’-TGGTCAAGAACGATACCATAG-3’
5’-ATTGTCATCTGCATAGGACTG-3’
5’-CTCCTCTAGTTCCACAATGTC-3’
5’-TATCCCACAGCTGAAGCCTG-3’
5’-TGCTTTTCAAGCTGCTCCTGA-3’
5’-ATGATACCCATTGCGCCTCTG-3’
5’-ACGACGAGTACGACTACCTC-3’
5’-TTCCATCAACCTGGATGCTTC-3’
5’-CGTCAAGCCTTGACCACTTGT-3’
5’-TTGAGCTTTGGCAGGTTGG-3’
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
OPERON
II.MaterialundMethoden
WeiteresMaterial
96KalottenMikrotiterplatte
Seite36
TPP
Methode
Die Validierung der siRNA mittels qRTPCR erfolgte nach (Machuy et al., 2005). In drei
unabhängigen Ansätzen wurden mit dem BioRobot® 8000 System 0,15 μg siRNA
(Endkonzentration 115 nM) in Triplikaten mittels RNAiFect (1 μl) in 96Kalotten
Mikrotiterplatten transfiziert. Die Zellzahl der HeLaZellen betrug 3000 pro Kalotte. 48 h
später wurde die RNA mit dem RNeasy® 96 BioRobot® 8000 Kit isoliert und die relative
mRNAMenge via QuantitectTM SYBR® Green RTPCR Kit nach Herstellerangaben und
Primer, die die siRNA Bindungsseite flankierten, in der qRTPCR bestimmt. Das relative
Expressionslevel der mRNA wurde gegen Kontrolltransfizierte Zellen normalisiert. Als
internerStandardwurdeGAPDHverwendet.DieProbenaufarbeitungfürdieqRTPCRwurde
vondenMitarbeiternderabteilungsinternenRNAiGruppedurchgeführt.
2.13
HerstellungstabiltransduzierterZelllinien
Zelllinien
HeLa ZervixepithelKarzinom(human) ATCC:CCL2
293T embryonaleNierenzellen(human) ATCC:CRL11268
Wachstumsmedium
RPMI 10%FKS,hitzeinaktiviert
GIBCOBRL
BIOCHROM
shRNA
Tab.2.12SequenzdatenderverwendetenshRNAs
BEZEICHNUNG
SEQUENZ
shRNALuciferase
5´-AACTTACGCTGAGTACTTCGA-3´
shRNARab6
5´-TACGGTCTTCTTTGAGGTCAA-3´
shRNARab11
5´-GGTTTCAGTATGTCTGAAGAG-3´
HERSTELLER
METABION
METABION
METABION
II.MaterialundMethoden
Seite37
Tab.2.13SequenzdatenderverwendetenPrimerfürdieqRTPCRshRNAtransduzierter
Zellen
BEZEICHNUNG
SEQUENZ
HERSTELLER
vorwärts 5’-GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3’
OPERON
GAPDH
Rab6
Rab11
rückwärts
vorwärts
rückwärts
vorwärts
rückwärts
5’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’
5’-CTCCTCTAgTTCCACAATgTC-3’
5’-TATCCCACAGCTGAAGCCTG-3’
5’-ACGACGAGTACGACTACCTC-3’
5’-TTCCATCAACCTGGATGCTTC-3’
Tab.2.14IndieserArbeithergestelltestabileZelllinien(shRNA)
BEZEICHNUNG
EIGENSCHAFTEN
LuciferaseHeLa
pLVTHMVektor,EF1Promotor,GFP
Kassette,H1Promotor,Insertionvon
shRNALuciferase
Rab6KDHeLa
pLVTHMVektor,EF1Promotor,GFP
Kassette,H1Promotor,Insertionvon
shRNARab6
Rab11KDHeLa
pLVTHMVektor,EF1Promotor,GFP
Kassette,H1Promotor,Insertionvon
shRNARab11
LeervektorHeLa
pLVTHMVektor,EF1Promotor,GFP
Kassette
WeiteresMaterial
96KalottenMikrotiterplatte
TPP
OPERON
OPERON
STAMMSAMMLUNG
DHE002
DHE017
ARL02
pLVTHM
Methode
RNAi kann in Säugetierzellen auch durch stabile Insertion lentiviral eingebrachter short
hairpin RNAs (shRNA) ausgelöst werden. Dazu wurden mittels lentiviraler Vektorsysteme
shRNAExpressionskassettenstabilinsZellgenomintegriert(WiznerowiczundTrono,2003).
Die Transfektions und Infektionsrate konnte dabei über eine GFPKassette im Vektor
pLVTHM kontrolliert werden. Das Design der shRNA erfolgte mit dem BLOCKiTTM RNAi
DesignervonInvitrogen.DasVirusmitderjeweiligenshRNAwurdedurchCalciumPhosphat
Transfektion in Kombination mit den Verpackungsvektoren psPAX2 und pMD2G in 293T
Zellengeneriert(Sambrooketal.,1989).DieZellzahlzumZeitpunktderTransfektionbetrug
20000proMikrotiterkalotte.DasVirusimÜberstandwurdenach48habgenommenundzur
InfektionvonHeLaZelleninAnwesenheitvonPolybrene(5μg/ml)eingesetzt.SiebenTage
nach Transduktion wurden GFPexprimierende Zellen durchflusszytometrisch sortiert und
II.MaterialundMethoden
Seite38
Einzelklone hergestellt. Für die Analyse der mRNAHerunterregulation erfolgte die
Virusinfektion auf 3500 HeLaZellen pro Mikrotiterkalotte in Anwesenheit von Polybrene
(5μg/ml).FünfTagenachInfektionwurdediemRNAmitdemRNeasy®96BioRobot®8000
KitineinemautomatisiertenProzessisoliertunddierelativemRNAMengeviaQuantitectTM
SYBR® Green RTPCR Kit nach Herstellerangaben und Primer, die die siRNABindungsseite
flankierten, in der qRTPCR bestimmt. Als interner Standard wurde GAPDH verwendet und
das relative Expressionslevel der mRNA wurde gegen Kontrolltransfizierte Zellen
normalisiert. Die Infektion der lentiviralen Vektoren und die Validierung der
HerunterregulationdermRNAwurdenvondenMitarbeiternderabteilungsinternenshRNA
Gruppe durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen übergeben und die Effizienz des
knockdowninderImmunodetektionüberprüft.Zellen,diemitdemlentiviralenVektorohne
shRNAbzw.mitshRNALuciferasetransduziertwurden,dientenalsKontrolle.
2.14
BestimmungderZellvitalitätmittelsdesWST1Proliferationstest
GebrauchsfertigeLösungen
WST1ProliferationKit
Lösungen
20%TritonX100
PMA(Stocklösung:100mM)
ROCHE
Zelllinie
HeLa ZervixepithelKarzinom(human)
ATCC:CCL2
Wachstumsmedium
RPMI 10%FKS,hitzeinaktiviert
GIBCOBRL
BIOCHROM
WeiteresMaterial
96KalottenMikrotiterplatte
TPP
Methode
Zur Bestimmung möglicher zytotoxischer Effekte von transfizierten siRNAs auf die Zellen
wurde die Proliferation im WST1 Test ermittelt. Die siRNA Transfektion erfolgte dazu in
einer96KalottenMikrotiterplatteinTriplikaten.24hp.t.wurdendietransfiziertenZellenin
eine neue 96KalottenPlatte umgesetzt und für weitere 24 h inkubiert. Als Proliferations
II.MaterialundMethoden
Seite39
KontrollewurdeeinTriplikat48h p.tmitdemPhorbolester(Proliferationsstimulator)PMA
(100 nM) behandelt; als Negativkontrolle wurde ein Triplikat mit 10 μl 20% TritonX100
behandelt.72hp.t.wurden10μlWST1–Reagenzund40μlWachstumsmediumproKalotte
zugegeben.DieMessungerfolgteineinemELISAPhotometerbei450nm.
2.15
BestimmungderProteinkonzentrationundImmunodetektion
GebrauchsfertigeLösungenundMaterialien
BCAProteinAssayReagentKit
CompleteProteinaseinhibitor
EnhancedChemoluminescence(ECL)Lösung
Röntgenfilme PIERCE
ROCHE
ROCHE
KODAK
PufferfürdieGelelektrophorese
Tab.2.15verwendetePufferfürdieGelelektrophoreseunddenImmunoblot
PUFFER
ZUSAMMENSETZUNG
RIPAPuffer
Blockierungspuffer
10xSDS
Elektrophoresepuffer
Sammelgelpufferfür
SDSGelelektrophorese
StrippingPuffer
Transferpuffer
10xTBS
TrenngelpufferfürSDS
Gelelektrophorese
WeiteresMaterial
96KalottenMikrotiterplatte
20mMTRIS/HCl,pH7,5,150mMNaCl,0,5%NP40,
0,5%TritonX100
3%MilchpulverinTBS
1,92MGlycin,250mMTRIS,ad1lH2O
1MTRISpH6,8
62,5mMTRIS/HClpH6,7,100mMMercaptoethanol,2%
SDS
6gTRIS,28,8gGlycin,2gSDS,20%MeOH,ad2lH2O
20mMTRISpH7,5,140mMNaCl
FürTBSTZugabevon0,05%Tween20
1MTRISpH9,0
TPP
II.MaterialundMethoden
Seite40
Antikörper
Tab.2.16PrimärantikörperfürdenImmunoblot
ANTIKÖRPER
SPEZIES
Aktin
HERSTELLER
Maus
SIGMA
Giantin
Kaninchen
CRP
GM130
Maus
BD
Golgin84
Maus
BD
Kaninchen
CRP
Hsp60(A57E4)
Maus
ALEXIS
p230
Maus
BD
Rab4
Maus
TRANSDUCTION
Rab5
Kaninchen
SANTACRUZ
Rab6
Kaninchen
CALBIOCHEM
Rab11
Maus
TRANSDUCTION
Tubulin
Maus
SIGMA
Gpp130
Tab.2.17SekundärantikörperfürdenImmunoblot
ANTIKÖRPER
ANTIGEN
IgG,MeerrettichPeroxidase
(HRP)konjugiert
IgG,MeerrettichPeroxidase
(HRP)konjugiert
SPEZIES
HERSTELLER
Maus
Schaf
AMERSHAM
Kaninchen
Esel
AMERSHAM
Methode
Zur Herstellung eines Proteinlysats wurden 1x106 Zellen in 100 μl RIPAPuffer mit
ProteinaseinhibitorenMischung (Complete, Roche) für 30 Min. auf Eis lysiert. Das Lysat
wurdedannbei13000UpMund4°Cfür30Min.zentrifugiert,umZelldebriszuentfernen.
AnschließenderfolgtedieBestimmungderProteinkonzentrationmitdemBCAProteinAssay
ReagentKitnachAngabendesHerstellers.
Für die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen wurden denaturierende
PolyacrylamidGele zwischen 4% und 15% verwendet, auf die 1520 μg Proteinlysat
aufgetragen wurden (Sambrook et al., 1989). Nach der Auftrennung der Proteine wurden
diese mit Hilfe des Nassblotverfahrens auf eine PVDF Membran transferiert. Anschließend
wurde die Membran zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen eine Stunde mit 3%
Milchpulver in TBST blockiert und für eine weitere Stunde unter Schwenken mit dem
II.MaterialundMethoden
Seite41
primärenAntikörperinkubiert.NachdreimaligemWaschenmitTBSTerfolgtedieInkubation
mitdemHRPgekoppeltenSekundärantikörper,gefolgtvonwiederholtemWaschen.Mittels
der enhanced chemoluminescence (ECL)Lösung wurden die Antikörper auf einem
Röntgenfilmdetektiert.
2.16
ImmunfluoreszenzundkonfokaleLasermikroskopie
Lösungen
Tab.2.18verwendeteLösungenfürdieImmunfluoreszenz
LÖSUNGEN
ZUSAMMENSETZUNG
Mowiol
4%Paraformaldehyd(PFA)
10xPBS
Permeabilisierungspuffer
2,4 g Mowiol 488, 6 g Glycerin, 6 ml H2O, über Nacht
quellenlassen,12ml0,2MTRISpH8,5,12ml0,2MTRIS
pH8,5
unterRührenauf60°Cerhitzen,
danachLösungbei4000UpMzentrifugieren
8 g PFA, 20 ml 10x PBS, 8 g Saccharose, ad 200 ml H2O,
pH7,4
0,2gKCl,0,2gKH2PO4,8gNaCl,2,16gNa2HPO4*7H2O,
ad1lH2O
0,2%BSAinPBS,0,2%TritonX100
Antikörper
Tab.2.19PrimärantikörperfürdieImmunfluoreszenz
ANTIKÖRPER
ORGANISMUS
Giantin
Kaninchen
CRP
GM130
Maus
BD
Golgin84
Maus
BD
Kaninchen
CRP
Maus
ALEXIS
Kaninchen
MILANANALYTIKA
Maus
BD
Gpp130
Hsp60(A57E4)
LPS
p230
HERSTELLER
II.MaterialundMethoden
Seite42
Tab.2.20SekundärantikörperfürdieImmunfluoreszenz
ANTIKÖRPER
ANTIGEN
SPEZIES
Fluoreszierendesekundäre
CyAntikörper,
Cy2,Cy3oderCy5konjugiert
Fluoreszierendesekundäre
CyAntikörper,
Cy2,Cy3oderCy5konjugiert
HERSTELLER
Maus
Ziege
MOLECULAR
PROBES
Kaninchen
Ziege
MOLECULAR
PROBES
WeiteresMaterial
12KalottenMikrotiterplatten
Deckgläschen Objektträger TPP
Marienfeld
Methode
FürdieUntersuchungmittelskonfokalerLasermikroskopiewurdenZellenaufGlasplättchen
ausgesät und je nach Versuchsaufbau mit C.trachomatis infiziert. Nach unterschiedlichen
Zeitpunkten wurden diese Zellen zweimal mit PBS gewaschen und für 30 Min. mit 2% PFA
fixiert. Anschließend erfolgte für 30 Min. die Permeabilisierung mit dem angegebenen
Permeabilisierungspuffer. Für die Färbung wurde der spezifische Antikörper in einer
PBS/0,2%BSALösungverdünntund20μlaufParafilmpipettiert.DieDeckgläschenwurden
mitderZellenbewachsenenSeitenachuntenaufdenTropfengelegtundeineStundebeiRT
inkubiert. Anschließend wurden die Deckgläschen wieder zurück in die Mikrotiterplatte
überführtunddreimalfür10Min.mitPBSgewaschen.DieInkubationmitdemsekundären
Fluoreszenzgekoppelten Antikörper erfolgte wie für den Erstantikörper beschrieben,
allerdings unter Lichtausschluss. Nachfolgend wurden die Proben mit Mowiol auf einem
Objektträger eingedeckt. Die Aufnahme der Zellen erfolgte am konfokalen Laser Scanning
MikroskopLeicaTCSSP1.DieerhaltenenBilderwurdenanschließendmitAdobePhotoshop
11.0bearbeitet.
II.MaterialundMethoden
2.17
Seite43
Lebendzellmikroskopie
Zelllinien
LuciferaseHeLa
Rab6KDHeLa Rab11KDHeLa
hergestelltindieserArbeit
hergestelltindieserArbeit
hergestelltindieserArbeit
Bakterienstämme
ChlamydiatrachomatisL2
lymphatischesIsolat ATCC:VR902B
Infektionsmedium
RPMI 5%FKS,hitzeinaktiviert
GIBCOBRL
BIOCHROM
MOLECULARPROBES
IBIDI
FluoreszenzmarkiertesCeramid
BODIPYFLCeramid (komplexiertanBSA)
WeiteresMaterial
Glasbodenkulturschalen3,5cm
Methode
Die Zellen wurden in 3,5 cm Glasbodenkulturschalen ausgesät und mit der jeweils
angegebenen MOI mitC.trachomatis infiziert.Zur Untersuchung des Sphingolipid/Ceramid
TransportesinEchtzeitwurden300nMBODIPYFLCeramidLösungvorsichtigaufdieZellen
getröpfelt. Die Visualisierung erfolgte an einem Leica TCS SP5 Mikroskop. Über einen
Zeitraum von 30 Min. wurden unter identischen Bedingungen alle 30Sek. ZStapelbilder
aufgenommen. Der Abstand der optischen Schnitte der Bilder betrug jeweils 1 μm.
Insgesamtwurden7Stapelaufgenommen.
II.MaterialundMethoden
2.18
Seite44
Transmissionselektronenmikroskopie
Zelllinien
LuciferaseHeLa
Rab6KDHeLa Rab11KDHeLa
hergestelltindieserArbeit
hergestelltindieserArbeit
hergestelltindieserArbeit
Bakterienstämme
ChlamydiatrachomatisL2
lymphatischesIsolat ATCC:VR902B
Infektionsmedium
RPMI 5%FKS,hitzeinaktiviert
GIBCOBRL
BIOCHROM
Lösungen
Tab.2.21verwendeteLösungenfürdieTransmissionselektronenmikroskopie
LÖSUNGEN
ZUSAMMENSETZUNG
10xPBS
2,5%Glutaraldehyd
0,5%Osmiumtetroxid
2%Uranylacetat
0,1%Tanninsäure
EpoxidharzPolyBed
WeiteresMaterial
6KalottenMikrotiterplatten
0,2gKCl,0,2gKH2PO4,8gNaCl,2,16gNa2HPO4*7H2O,
ad1lH2O
2,4 g Mowiol 488, 6 g Glycerin, 6 ml H2O, über Nacht
quellenlassen,12ml0,2MTRISpH8,5,12ml0,2MTRIS
pH8,5
unterRührenauf60°Cerhitzen,
danachLösungbei4000UpMzentrifugieren
gebrauchsfertig
gebrauchsfertig
gebrauchsfertig
gebrauchsfertig(POLYSCIENCE)
TPP
Methode
Zur ultrastrukturellen Analyse der chlamydialen Formen in der Inklusion wurden die stabil
transduzierten Zelllinien in 6KalottenMitrotierplatten ausgesät und mit C.trachomatis für
24hund42hinfiziert(MOI1).ZurProbenaufbereitungwurdendieinfiziertenZelleneinmal
mitPBSgewaschenundmit2,5%Glutaraldehydfixiert.DanachwurdendieAnsätzemit0,5%
Osmiumtetroxid inkubiert und mit 0,1% Tanninsäure und 2% Uranylacetat kontrastiert.
II.MaterialundMethoden
Seite45
AbschließendwurdendiederProbendurcheineaufsteigendeAlkoholreihedehydriertund
in Epoxidharz eingebettet. Die Analyse erfolgte an einem Leo 906E Transmissions
elektronenmikroskop.DieBilderwurdenmiteinerMoradaDigitalkameraaufgenommen.
Die
Probenaufarbeitung
und
die
Aufnahme
der
Bilder
am
Transmissions
elektronenmikroskop wurden von den Mitarbeitern der Core Facility Mikroskopie
durchgeführt.
2.19 StatistischeDatenanalyse
Im Allgemeinen zeigen die dargestellten Diagramme die Daten aus drei unabhängigen
Untersuchungen. Dargestellt sind der Mittelwert und die Standardabweichung. Die
statistischeSignifikanzwurdemitHilfedesStudent´schentTestszweiseitigermitteltundist
durch*gekennzeichnet(*UWert<0,05;**UWert<0,01).
III.Ergebnisse
Seite46
III.ERGEBNISSE
3.1
StrukturdesGolgiApparateswährendderInfektionmit
C.trachomatis
InderArbeitsgruppekonntebereitsdemonstriertwerden,dassChlamydienmitdemGolgi
Apparat in Wechselwirkung treten. Eine Infektion führte zur Auflösung der Struktur des
typischen GolgiBandes. Diese Fragmentierung ging mit einer Spaltung des Golgi
Strukturproteins Golgin84 einher. Die ChlamydienInfektion führte zur Prozessierung von
Golgin84inzweiFragmente:Einemca.78kDaundeinemca.65kDagroßenSpaltprodukt
(Heuer et al., 2008). Die Spaltfragmente waren ab 16 h nach Infektion im Immunoblot
sichtbar.AnhandvonImmunfluoreszenzanalysensollteuntersuchtwerden,obderZeitpunkt
derFragmentierungdesGolgiApparatesmitderSpaltungvonGolgin84korrelierte.
Der GolgiKomplex besteht aus einer Anordnung von bis zu 100 dicht gepackten
Membranstapeln, den sogenannten Zisternen, die über tubuläre Verbindungen die
charakteristische Bänderstruktur des GolgiApparates ausbilden. Dabei unterscheidet man
den cisGolgi, den medialGolgi und das transGolgiNetzwerk (TGN), welche durch
spezifischeMarkeranalysiertwerdenkönnen.
In Abb.3.1 ist deutlich erkennbar, dass es im Zuge einer C.trachomatisInfektion zu einer
auffälligenStreuungdescisGolgiProteinsGM130innerhalbderZellekam.DieseVerteilung
istbereits16hnachInfektionsichtbarundnimmtimweiterenVerlaufzu.
Abb.3.1InfektionmitC.trachomatisführtzurFragmentierungdesGolgiApparatesinHeLaZellen
HeLaZellen wurden für die jeweils angegebene Dauer mit C.trachomatis infiziert (MOI 1). Für die
ImmunfluoreszenzwurdendascisGolgiProteinGM130(roterKanal)undchlamydialesLPS(blauerKanal)
mittels spezifischer Antikörper angefärbt und in einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop visualisiert.
Dargestellt ist die Überlagerung des roten und blauen Kanals mit dem Phasenkontrast. Messbalken
entsprechen10μm.
III.Ergebnisse
3.2
Seite47
EinflussvonGolgiProteinenaufdieVermehrungvonChlamydien
3.2.1 ValidierungdessiRNAvermitteltenVerlustesvonGolginen
Die vorherige Untersuchung in Chlamydieninfizierten Zellen zeigte, dass es während der
Infektion zu einem Aufbrechen der GolgiStruktur kam. Um die Bedeutung der
Fragmentierung auf die chlamydiale Entwicklung zu untersuchen, wurden RNAiAnalysen
durchgeführt. Dazu wurden spezifische siRNAs erzeugt, die sich gegen ausgewählte
Strukturproteine des GolgiApparates richteten. Das Design erfolgte mit einem speziellen
Algorithmus von Qiagen (Huesken et al., 2005). Eine siRNA gegen Luciferase wurde als
Kontrolleverwendet.HumaneZellenbesitzenkeinLuciferaseGen;somitistdiesiRNAgegen
Luciferasefunktionslos.DieTransfektionwurdemitHilfedesRNAiFectTransfektionsreagenz
inHeLaZellendurchgeführt,ausdenendreiTagep.t.mRNAfürdieÜberprüfungdersiRNA
vermittelten Reduktion der mRNAMenge isoliert wurde. Die Validierung der
Herabregulation auf mRNAEbene erfolgte mittels quantitativer RealTimePCR (qRTPCR).
Abb.3.2 zeigt, dass alle verwendeten siRNAs einen knock down von mindestens 70% in
HeLaZellenerzeugten.
DasEinbringenvonRNAOligonukleotidenindieZellekannallerdingsdieInterferonAntwort
induzieren und zur Aktivierung der RNAabhängigen ProteinkinaseR (PKR) und
OligoadenylatSynthetase(OAS)führen.DadurchwirddieProteinsynthesegestopptundes
kommtzuunspezifischerDegradationvonmRNA.UmeinetransfektionsbedingteInduktion
der Interferonantwort auszuschließen, wurde eine PCRAmplifikation der aktivierten OAS
und der PKR durch die abteilungsinterne RNAiGruppe durchgeführt. Keine der in dieser
ArbeitbenutztensiRNAsaktiviertedasInterferonsystemindenverwendetenZellen.
III.Ergebnisse
Seite48
Abb.3.2ValidierungderverwendetensiRNAgegenGolgiStrukturproteinemittelsqRTPCR
HeLaZellenwurdenmitsiRNAsgegendieangegebenenZielgenetransfiziert.48hp.t.wurdemRNAisoliert
undmittelsspezifischerPrimereineqRTPCRdurchgeführt.DargestelltistdiesiRNAvermittelteknockdown
(KD)EffizienzinProzent+StandardabweichungausdreiunabhängigdurchgeführtenVersuchen.
In weiterer Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen der qRTPCR konnte der siRNA
vermittelte knock down von Zielproteinen ebenfalls im Immunoblot gezeigt werden
(Abb.3.3).DerProteingehaltvonGolgin84,GM130,Giantin,p230undGpp130nachsiRNA
Behandlungwarstarkreduziertbishinzunichtnachweisbar.FürdieanderenProteinelagen
keinespezifischenAntikörperzurImmunodetektionvor.
Abb.3.3ValidierungderverwendetensiRNAsgegenGolgiProteineimImmunoblot
Lysate von siRNAbehandelten Zellen wurden drei Tage p.t. in der Immunodetektion über spezifische
Antikörper auf ihre knock down (KD) Effizienz untersucht. Der Nachweis von Tubulin diente als
Ladekontrolle.
III.Ergebnisse
Seite49
3.2.2 UntersuchungzytotoxischerEffektenachsiRNABehandlunggegen
GolgiProteine
Sowohl die Transfektionsbedingungen, als auch die Herunterregulation spezifischer
ZielproteinekönnensichunterUmständenzellschädigendauswirken.Untersuchungen,wie
z.B. die chlamydiale Vermehrung, könnten in diesem Fall nicht ausgeführt werden oder
wären stark beeinträchtigt, da Chlamydien auf ihre Wirtszelle angewiesen sind. Deshalb
wurden alle generierten siRNAs vor Verwendung in weiterführenden Experimenten
zusätzlichaufmöglichezytotoxischeEffekte,gemessenanhanddermetabolischenAktivität
der Zellen, mittels des WST1 Tests untersucht. Dieser kolorimetrische, nichtradioaktive
Test basiert auf der Spaltung eines TetrazoliumSalzes in Formazan durch zelluläre NAD+
Hydrogenasen in metabolisch aktiven Zellen. Zur Kontrolle wurden einige Zellen mit
zellschädigendem Triton X100 behandelt. Die Ergebnisse des WST1 Tests zeigten, dass
unter diesen Bedingungen keine zytotoxischen Auswirkungen beobachtet werden konnten
unddiesesiRNAsinweiterenStudienverwendetwerdenkönnen(Abb.3.4).
Abb.3.4ZellvitalitätnachHerunterregulationderExpressionvonGolgiProteinenmittelsRNAiinHeLa
Zellen
HeLaZellen wurden mit der jeweiligen siRNA behandelt. 72 h p.t. wurde die Proliferation der Zellen mit
HilfedesWST1Testsbestimmt.AlsNegativkontrolledientenmitTritonX100behandelteZellen.DerWert
derLuciferasebehandeltenProbewurdeauf100%gesetzt.DasDiagrammzeigtdieZellvitalitätinProzent
ausdreiunabhängigdurchgeführtenExperimenteninTriplikaten+Standardabweichung.KD,knockdown
III.Ergebnisse
Seite50
3.2.3 StrukturdesGolgiApparatesinsiRNAbehandeltenZellen
Eine Immunfluoreszenzfärbung sollte Aufschluss über die morphologische Erscheinung des
GolgiApparatesinsiRNAbehandeltennichtinfiziertenundC.trachomatisinfiziertenZellen
geben. Dazu wurden die Zellen mit Antikörpern gegen die cisGolgiProteine GM130 und
Giantin angefärbt. Die Auswertung mit dem konfokalen Laser Scanning Mikroskop ergab,
dassderknockdownvonGolgin84,Giantin,p115,undGpp130einestarkeFragmentierung
des GolgiApparates in nichtinfizierten Zellen induzierte (Abb.3.5). In CASP, GM130 und
p230knock down Zellen war kein Unterschied zu der GolgiStruktur der Luciferase
Kontrollzellenfestzustellen.
In C.trachomatisinfizierten Zellen zeigte sich unter Verlust von Golgin84, Giantin, p115,
und Gpp130 eine vesikuläre Struktur von GolgiElementen, die um die Inklusion lokalisiert
waren. Die morphologische Erscheinung des GolgiApparates in CASP, GM130 und p230
herunterreguliertenZellenhingegenentsprachdemPhänotypderKontrolle(Abb.3.6).
Abb.3.5GolgiFragmentierunginGolgiProteinknockdown(KD)Zellen
siRNAtransfizierte Zellen wurden vier Tage p.t. zur Untersuchung der GolgiStruktur in der
ImmunfluoreszenzmitspezifischenAntikörperngegendascisGolgiProteinGM130(roterKanal)angefärbt
undaneinemkonfokalenLaserScanningMikroskopvisualisiert.InGM130siRNAbehandeltenZellenwurde
spezifisch das cisGolgiProtein Giantin nachgewiesen. Dargestellt ist die Überlagerung mit dem
Phasenkontrast.Messbalkenentsprechen10μm.
III.Ergebnisse
Seite51
Abb.3.6GolgiFragmentierunginC.trachomatisinfiziertenGolgiProteinknockdown(KD)Zellen
siRNAtransfizierte Zellen wurden drei Tage p.t. für 24 h mit C. trachomatis (MOI 1) infiziert und
anschließend für die Immunfluoreszenz angefärbt. CisGolgiStrukturen wurden mittels des spezifischen
AntikörpersGM130(roterKanal)unddieInklusionenmiteinemAntikörpergegenchlamydialesLPS(grüner
Kanal) detektiert und an einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop visualisiert. In GM130siRNA
behandelten Zellen wurde spezifisch das cisGolgiProtein Giantin nachgewiesen. Dargestellt ist die
ÜberlagerungmitdemPhasenkontrast.Messbalkenentsprechen10 μm.
3.2.4 AuswirkungenderGolgiFragmentierungaufdiechlamydiale
Entwicklung
Eine Fragmentierung des GolgiApparates kann durch Herunterregulation der Zielgene
Golgin84,p115,GiantinoderGpp130ausgelöstwerden.ImnächstenSchrittsollteermittelt
werden,obdiesesiRNAvermittelteGolgiFragmentierungeinenEinflussaufdiebakterielle
Infektivitäthatte.ZurBestimmungderInfektivität(AnzahlinfektiöserNachkommen)wurden
dieC.trachomatisinfiziertenZellennach48hmitGlaskugelnlysiertunddiefreigesetztenEK
in einer seriellen Verdünnungsreihe auf frischen HeLaZellen titriert. Die Behandlung der
ZellenmitLuciferasesiRNAwurdealsKontrolleverwendetunddieInfektivitätdieserProbe
auf100%gesetzt.
Der knock down von CASP und p230 hatte keinen Einfluss auf die Anzahl infektiöser
Nachkommen (Abb.3.7). Die Herunterregulation von GM130 hatte eine leichte, aber
signifikante Steigerung der Infektivität auf 161% zur Folge. Im Gegensatz dazu führte die
Herunterregulation der Proteine Golgin84, p115, Gpp130, und Giantin signifikant zu einer
III.Ergebnisse
Seite52
mindestens vierfachen Erhöhung der Infektivität. Daraus lässt sich schließen, dass die
vorzeitige GolgiFragmentierung durch siRNABehandlung von Vorteil für die chlamydiale
Entwicklungist.
Abb.3.7EinflussderHerunterregulationvonGolginenaufdieAnzahlinfektiöserNachkommen
HeLaZellen wurden mit den angegebenen siRNAs transfiziert und mit C.trachomatis (MOI 3) für 48 h
infiziert.AnschließendwurdendieZellenlysiertunddieAnzahlinfektiöserNachkommendurchTitrationauf
neueHeLaZellenbestimmt.DieAnzahlinfektiöserBakterieninLuciferasebehandeltenZellenwurdenauf
100%gesetzt.DasDiagrammzeigtdieMittelwerte+StandardabweichungderrelativenIFU/mlinProzent
ausdreiunabhängigenExperimenten.*UWert<0,05,**UWert<0,01.KD,knockdown
3.3
DieRollevonRabProteineninderChlamydienInfektion
3.3.1 ValidierungdesVerlustesvonRabProteinenmittelsRNAi
WieimvorangegangenenAbschnittgezeigt,hattesowohldieInfektionmitChlamydien,als
auch der Verlust von GolgiStrukturproteinen mittels RNAi die Auflösung des Golgi
Apparates zur Folge. Dabei akkumulierten vesikuläre Strukturen im Zytoplasma nicht
infizierter Zellen und an der Inklusionsmembran in infizierten Zellen. Der intrazelluläre
TransportvonVesikelnunterliegtderRegulationvonRabProteinen.Diesekönntenfürdie
RekrutierungGolgiabgeleiteterVesikelandieInklusionverantwortlichsein.
Mittels RNAi sollte die Bedeutung von RabProteinen während einer ChlamydienInfektion
untersuchtwerden.DieEffizienzdesknockdownaufmRNAEbeneerfolgtemittelsqRTPCR.
InAbb.3.8istdieVerminderungderspezifischenmRNAinProzentnachsiRNABehandlung
dargestellt. Damit die hergestellte siRNA in nachfolgende Untersuchungen einbezogen
werden konnte, sollte die Reduktion der mRNA mindestens 70% betragen. Die Validierung
ergab,dassalleverwendetensiRNAseinemehrals80%igeReduktionderspezifischenmRNA
vermittelten. Eine Aktivierung der zellulären Interferonantwort nach siRNABehandlung
III.Ergebnisse
Seite53
gegen RabProteine konnte, wie bereits im Abschnitt 3.2.1 beschrieben, durch die
abteilungsinterneRNAiGruppeausgeschlossenwerden.KeinederindieserArbeitbenutzten
siRNAsgegenRabProteineaktiviertedasInterferonsystemderZelle.
DieAnalyseeinigerausgewählterLysateimImmunoblotgabAufschlussüberdieReduktion
derProteinexpressionnachsiRNABehandlung(Abb.3.9).72hp.t.wurdenRab4,Rab6und
Rab11 im Zelllysat nicht mehr detektiert, und auch die Rab5Proteinmenge war deutlich
verringert. Für die anderen Proteine lagen keine spezifischen Antikörper zur
Immunodetektionvor.DieseErgebnisseverdeutlichen,dassdiegeneriertensiRNAszueinem
effektivenVerlustspezifischerRabProteineinderWirtszelleführten.
Abb.3.8ValidierungderverwendetensiRNAsgegenRabProteinemittelsqRTPCR
HeLaZellen wurden mit siRNAs gegen die angegebenen Zielgene transfiziert. 48 h später wurde mRNA
isoliertundeineqRTPCRmitspezifischenPrimerndurchgeführt.DargestelltistdiesiRNAvermittelteknock
down(KD)EffizienzinProzent+StandardabweichungausdreiunabhängigdurchgeführtenVersuchen.
Abb.3.9ValidierungderverwendetensiRNAsgegenRabProteineimImmunoblot
Lysate von siRNAbehandelten Zellen wurden im Immunblot mittels spezifischer Rab Antikörper auf die
knockdown(KD)Effizienzuntersucht.DerNachweisvonAktinoderTubulindientealsLadekontrolle.
III.Ergebnisse
Seite54
3.3.2 UntersuchungzytotoxischerEffektenachsiRNABehandlunggegen
RabProteine
Um mögliche zytotoxische Effekte der Versuchsbedingungen und des knock down auf die
ZelleninnachfolgendenExperimentenauszuschließen,wurde,wiebereitsimAbschnitt3.2
erläutert, die Zellvitalität nach siRNABehandlung im WST1 Test ermittelt. Als Kontrolle
wurden einige Zellen zum einen mit dem Phorbolester PMA (Phorbol12 Myristrat13
Acetat) zur Proliferation stimuliert oder zum anderen mit zellschädigendem Triton X100
behandelt.Abb.3.10zeigt,dasskeinederverwendetensiRNAseinennegativenEinflussauf
dieZellvitalitätausübte.EinemikroskopischeUntersuchungzeigteimknockdownvonRab4
keineauffälligentoxischenEffekte.
Abb.3.10ZellvitalitätnachsiRNABehandlunggegenRabProteineinHeLaZellen
HeLaZellen wurden mit der jeweiligen siRNA behandelt. 72 h p.t. wurde die metabolische Aktivität der
ZellenmitHilfedesWST1Testsbestimmt.AlsNegativkontrolledientenmitTritonX100behandelteZellen,
während die Behandlung der Zellen mit PMA die Positivkontrolle darstellt. Der Wert der Luciferase
behandelten Probe wurde auf 100% gesetzt. Das Diagramm zeigt die Zellvitalität in Prozent aus drei
unabhängigdurchgeführtenExperimenteninTriplikaten+Standardabweichung.KD,knockdown
3.3.3 AuswirkungendesknockdownvonRabProteinenaufdieprimäre
InfektionunddiebakterielleInfektivität
Nachdemdemonstriertwerdenkonnte,dassallehergestelltensiRNAsdieZielgenExpression
sowohl auf mRNA, als auch auf ProteinEbene herunterregulierten, wurde anschließend
III.Ergebnisse
Seite55
geprüft,welcheAuswirkungenderVerlustdieserProteineaufdiechlamydialeVermehrung
hatte. Für diese Untersuchung wurden HeLaZellen mit je130 nM der angegebenen siRNA
transfiziertund72hp.t.mitC.trachomatisinfiziert.24hnachInfektionwurdendieZellen
fixiert
und
mit
spezifischen
Antikörpern
gegen
chlamydiales
Hsp60
für
Immunfluoreszenzanalysen angefärbt, um Aussagen über mögliche Unterschiede in der
primärenInfektionnachsiRNABehandlungzuerhalten,wiez.B.UnterschiedeinderAnzahl
gebildeter Inklusionen durch eine schlechtere Aufnahme der infektiösen Partikel. Die
konfokalen Aufnahmen in Abb.3.11 zeigen siRNAbehandelte Zellen, die für 24 h mit
C.trachomatisinfiziertwurden.Dabeiwirddeutlich,dassderVerlusteinzelnerRabProteine
keine Auswirkung auf die primäre Infektion besitzt. Die Inklusionen in Rab5 und Rab11
herunterreguliertenZellenerscheinenvergrößert,allerdingshattedieskeinensignifikanten
EinflussaufdieAnzahlangebildetenInklusionen.
Abb.3.11C.trachomatisInfektioninRabProteinknockdown(KD)Zellen
HeLaZellenwurdenmitdenangegebenensiRNAstransfiziertundanschließendmitC.trachomatis(MOI1)
infiziert. 24 h p.i. erfolgte der Nachweis chlamydialen Hsp60 Proteins durch Verwendung spezifischer
AntikörperinderImmunfluoreszenz(grünerKanal).DieAufnahmederBildererfolgteaneinemkonfokalen
Laser Scanning Mikroskop. Dargestellt ist die Überlagerung mit dem Phasenkontrast. Messbalken
entsprechen10μm.
Im Gegensatz zu den Primärinfektionen zeigte die Analyse der Infektivitäten nach
funktionellem Ausfall von RabProteinen signifikante Unterschiede (Abb.3.12). Die
Behandlung der Zellen mit LuciferasesiRNA wurde als Kontrolle verwendet und die
InfektivitätdieserProbeauf100%gesetzt.DerknockdownvonRab1undRabkinesin6hatte
einemehralsdoppelteErhöhungderInfektivitätzurFolge,währenddieHerunterregulation
vonRab6undRab11dieInfektivitätsignifikantreduzierten(60%beiRab6,57%beiRab11).
III.Ergebnisse
Seite56
Alle weiteren untersuchten siRNAs hatten keinen signifikanten Einfluss auf die Infektivität
der Chlamydien. Dies bedeutet, dass nach knock down von Rab6 oder Rab11 die
Vermehrung inhibiert wird, wohingegen der knock down von Rab1 und Rabkinesin6 die
Vermehrungpositivbeeinflusst,ohnedasssignifikanteUnterschiedeinderPrimärinfektion
zubeobachtensind.
Abb. 3.12 Knock down (KD) von RabProteinen hat unterschiedliche Auswirkungen auf die bakterielle
Infektivität
HeLaZellen wurden mit den angegebenen siRNAs transfiziert und mit C.trachomatis (MOI 3) für 48 h
infiziert.AnschließendwurdendieZellenlysiertunddieAnzahlinfektiöserNachkommendurchTitrationauf
neueHeLaZellenbestimmt.LuciferasesiRNAbehandelteZellenwurdenauf100%gesetzt.DasDiagramm
zeigt die Mittelwerte + Standardabweichung der relativen IFU/ml in Prozent aus drei unabhängigen
Experimenten.*UWert<0,05,**UWert<0,01.
3.3.4 HerunterregulationvonRabProteinenmittelsRNAiinanderen
Zelllinien
Ist die niedrigere Infektivität der Chlamydien spezifisch für HeLaZellen, oder führt der
VerlustvonRab6undRab11auchinanderenZelllinienzueinervermindertenInfektivitätder
Nachkommenschaft?UmdieseFragezubeantworten,wurdenRab6undRab11mittelsRNAi
zusätzlich in der Larynxkarzinomzelllinie HEp2 ausgeschaltet und anschließend mit
C.trachomatis infiziert. Die Bestimmung der Infektivität zeigte, dass auch in diesen Zellen
der Verlust von Rab11 zu einer Reduktion der bakteriellen Vermehrung führte (Abb.3.13).
Rab6knock down reduzierte die chlamydiale Infektivität auf 46% in HEp2Zellen. Die
Infektivität der Chlamydien unter Ausfall von Rab11 lag bei 61%. Immunoblotanalysen
bestätigten die Reduktion der Menge des jeweiligen RabProteins nach Transfektion der
spezifischensiRNAs(Abb.3.14).
III.Ergebnisse
Seite57
Dieszeigt,dasssichdiebeobachtetenAuswirkungendesVerlustesvonRab6undRab11auf
dieChlamydieninHeLaZellenauchgenerellaufandereZelltypenübertragenlassen,undes
sichnichtumeinenHeLaspezifischenEffekthandelt.
Abb.3.13InfektivitätnachHerunterregulationvonRab6undRab11inderZelllinieHEp2
HEp2 Zellen wurden mit siRNAs gegen Rab6 und Rab11 behandelt und anschließend mit C.trachomatis
(MOI3)für48hinfiziert.AnschließendwurdendieZellenlysiertunddieAnzahlinfektiöserNachkommen
durch Titration auf neue HEp2Zellen bestimmt. LuciferasesiRNAbehandelte Zellen wurden auf 100%
gesetzt. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte + Standardabweichung der relativen IFU/ml in Prozent aus
zweiunabhängigenExperimenten.*UWert<0,05,**UWert<0,01.KD,knockdown
Abb.3.14ImmunoblotanalysenderHerunterregulationvonRab6undRab11inderZelllinieHEp2
Zelllysate aus siRNAtransfizierten HEp2Zellen wurden im Immunoblot mittels spezifischer Antikörper
analysiert.DerNachweisvonAktindientealsLadekontrolle.KD,knockdown
3.3.5 HerstellungstabilerRab6undRab11knockdownZellen
Für weiterführende Analysen wurden shRNAs (short hairpin RNA) gegen Rab11 und Rab6
generiert. Durch stabile Insertion in das zelluläre Genom lentiviral eingebrachter shRNAs
wirdeinepermanenteExpressiondershRNAundsomiteinekontinuierlicheSuppressionder
Expression des Zielproteines erreicht. shRNAs produzieren einen Einzelstrang von 5070 nt
Länge, der eine StammSchleifenStruktur ausbildet. Diese Struktur wird durch die Enzyme
DROSHAundDICERprozessiertundalssiRNAindenKomplexRISCeingebaut.
III.Ergebnisse
Seite58
Mittels einer GFPKassette im Vektor pLVTHM wurde durch Koexpression von GFP die
Infektionsrate der generierten shRNAs kontrolliert (Wiznerowicz und Trono, 2003). Zellen,
diemitdemlentiviralenLeervektorbzw.mitshRNALuciferasetransduziertwurden,dienten
als Kontrolle (LeervektorHeLa und LuciferaseHeLa). Die Zelllinien mit der stabilen Rab
Protein shRNAInsertion wurden als Rab6KDHeLa und Rab11KDHeLa bezeichnet.
ImmunoblotanalysenzeigteneinendeutlichenVerlustderjeweiligenZielproteineRab6und
Rab11indenhergestelltenZelllinien(Abb.3.15).
Abb. 3.15 Immunoblotanalyse der Validierung der stabil transduzierten Zelllinien Rab6KDHeLa und
Rab11KDHeLa
ZelllysatelentiviralstabiltransduzierterZelllinienwurdenimImmunoblotaufdieEffizienzdesknockdown
untersucht. Die Detektion erfolgte mit spezifischen Antikörpern und der Nachweis von Aktin diente als
Ladekontrolle. Eine stabil transduzierte Zelllinie mit dem Leervektor und die LuciferaseHeLaZelllinie
dientenalsKontrolle.
Als nächstes wurde die Infektivität in den stabilen knock down Zelllinien verifiziert.
Entsprechend den vorangegangenen siRNAVersuchen zur Infektivität wurden die shRNA
ZellenmitC.trachomatisinfiziertund48hp.i.aufneueHeLaZellentitriert(Abb.3.16).Die
Analyse der Infektivitäten in den stabilen knock down Zellen bestätigte die Daten aus den
siRNAvermittelten Versuchen. Die Expression der shRNAs führte ebenfalls zu einer
Reduktion in der chlamydialen Vermehrung, mit einer Verminderung von 67% in Rab6KD
HeLaund93%inRab11KDHeLa.HierwardieVermehrungsratesogarstärkergestört,alsin
denvergleichbarensiRNAExperimenten.
III.Ergebnisse
Seite59
Abb. 3.16 Infektivität in den hergestellten stabil transduzierten Zelllinien Rab6KDHeLa und Rab11KD
HeLa
StabiltransduzierteZellenwurdenmitC.trachomatis(MOI3)für48hinfiziert.Anschließendwurdendie
Zellen lysiert und die Anzahl infektiöser Nachkommen durch Titration auf frischen HeLaZellen bestimmt.
LuciferaseKontrollzellen wurden auf 100% gesetzt. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte +
StandardabweichungderrelativenIFU/mlinProzentausdreiunabhängigenExperimenten.**UWert<0,01
3.3.6 UntersuchungderPrimärinfektioninshRNAvermitteltenknockdown
Zellen
Um zu untersuchen, ob es in den Zelllinien Rab6KDHeLa und Rab11KDHeLa zu
UnterschiedeninderprimärenInfektionkommt,wurdeninImmunfluoreszenzanalysendie
Anzahl der gebildeten Inklusionen im Verhältnis zur Zellzahl bestimmt. Dazu wurden
C.trachomatisinfizierte Rab6KDHeLa und Rab11KDHeLa 24 h p.i. mit einem spezifischen
Antikörper gegen chlamydiales MOMP angefärbt. Zusätzlich wurde die bakterielle und
zelluläre DNA mit Hoechst gegengefärbt. Mittels automatisierter Mikroskopie (ScanR) und
anschließender Softwareanalyse konnte die Anzahl der Inklusionen pro Zelle bestimmt
werden. Als Kontrolle wurden Zellen verwendet, die eine Integration der shRNA gegen
Luciferase beinhalteten. Abb.3.17 zeigt deutlich, dass sich die Anzahl der ausgebildeten
Inklusionen zur Anzahl der Zellen in den untersuchten Zelllinen nicht unterscheidet und
somit ein Einfluss der Herunterregulation der RabProteine auf die Anzahl der gebildeten
Inklusionen,dieprimäreInfektion,ausgeschlossenwerdenkonnte.
III.Ergebnisse
Seite60
Abb.3.17VergleichderPrimärinfektioninRab6KDHeLaundRab11KDHeLa
Die Zelllinien wurden mit C.trachomatis mit der angegebenen MOI infiziert. Für die
Immunfluoreszenzanalysen wurden die Inklusionen 24 h p.i. mit einem spezifischen Antikörper gegen
chlamydiales MOMP angefärbt und die zelluläre und bakterielle DNA mit Hoechst gegengefärbt. Im
DiagrammdargestelltistdieAnzahldergebildetenInklusionenproNuclei+Standardabweichungausdrei
unabhängigdurchgeführtenVersuchen.
3.3.7 UltrastrukturelleAnalysevonC.trachomatisinfiziertenknockdown
Zellen
Der Verlust der Proteine Rab6 und Rab11 hatte keine Auswirkungen auf die Etablierung
einerInfektion.HierstelltsichdieFrage,obesimweiterenVerlaufdesInfektionszykluszu
BeeinträchtigungeninderAusbildunginfektiöserPartikel,densogenanntenEK,kommt.
Chlamydien besitzen zwei unterschiedliche Lebensformen, die wie bereits erläutert, als EK
undRKbezeichnetwerden.EKundRKunterscheidensichdeutlichinihrerElektronendichte.
InelektronenmikroskopischenBildernerscheinenEKalsca.300nmgroße,elektronendichte
Partikel,währendRKgrößer(ca.1μm)undwenigerelektronendichtsind.DieDurchführung
ultrastrukturellerAnalysensollteAufschlussdarübergeben,welchechlamydialenFormenin
welcher Anzahl in den C.trachomatisinfizierten stabil transduzierten Zelllinien vorlagen.
Abb.3.18 zeigt je eine repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahme einer
C.trachomatisinfizierten Zelle nach 42 h. In den infizierten Kontrollzellen hat der Großteil
derinderInklusionbefindlichenPartikelbereitsinEKrückdifferenziertundnurnochwenige
III.Ergebnisse
Seite61
RK sind erkennbar. Dies entspricht einem normalen chlamydialen Zyklus, bei dem sich 40
48hnachInfektionmetabolischaktiveRKininfektiöseEKrückdifferenzieren.ImGegensatz
dazu befinden sich in den C.trachomatisinfizierten Rab6KDHeLa und Rab11KDHeLa
signifikant weniger chlamydiale Partikel in der Inklusion, von denen die meisten als RK
identifiziert werden konnten. Interessanterweise konnten in Inklusionen der infizierten
Rab6KDHeLaZelllinie mehrere leere Bakterienhüllen, so genannte ghosts (chlamydiale
Geister)nachgewiesenwerden.
Abb.3.18ElektronenmikroskopischeAnalysevonInklusioneninknockdownZellen
42hnachInfektionmitC.trachomatis(MOI1)wurdenstabiltransduziertenknockdownZellenfixiertund
Ultradünnschnitte hergestellt. Bildgenerierung erfolgte an einem Transmissionselektronenmikroskop. Die
Ausschnittsvergrößerung veranschaulicht die beiden vorliegenden chlamydialen Formen innerhalb der
Inklusion, EK (ca. 300 nm) und RK (ca. 1 μm). Pfeile kennzeichnen leere Bakterienhüllen. Messbalken
entsprechen5μm.
DasVerhältnisvonEKzuRKindenjeweiligenZelllinienwurdeineinerquantitativenAnalyse
bestimmt und als Balkendiagramm in Abb.3.19 dargestellt. Die Inklusionen in je 30 Zellen
wurden24hund42hnachInfektionausgezähltunddieprozentualeMengeanEKundRK
bestimmt. 24 h nach Infektion war das prozentuale Verhältnis von RK und EK in allen drei
Probengleich.42hnachInfektionwurdeninKontrollzellenmehrEKalsRKnachgewiesen.
Dagegen lagen in den Rab6KDHeLa und Rab11KDHeLa prozentual mehr RK vor. Diese
Untersuchungen unterstützen die Daten aus der Infektivitätsbestimmung. Auch diese
zeigten, dass der funktionelle Ausfall von Rab6 und Rab11 die Umwandlung in infektiöse
Partikel
beeinträchtigte
Nachkommenschaftführte.
und
damit
zu
einer
verminderten
Infektivität
der
III.Ergebnisse
Seite62
Abb.3.19ProzentualeQuantifizierungderAnzahlvonEKundRKinknockdownZellen
QuantitativeAuswertungder vorher beschriebenen Ultradünnschnitte24hund 42h nachC.trachomatis
Infektion. Die Anzahl der in der Inklusion von jeweils 30 Zellen vorliegenden EK und RK (aus zwei
unabhängigen Experimenten) wurde ausgezählt und als Balkendiagramm in % zur gesamten Anzahl der
chlamydialenPartikeldargestellt.
3.3.8 MorphologischeErscheinungdesGolgiApparatesinnichtinfizierten
undC.trachomatisinfiziertenRab6undRab11knockdownZellen
Zur Untersuchung der GolgiStruktur in stabil transduzierten Zellen wurde ein Ansatz mit
C.trachomatis infiziert und ein zweiter Ansatz scheininfiziert. Anschließend erfolgte eine
Immunfluoreszenzanalyse. In den scheininfizierten Zellen hatte der knock down von Rab6
und Rab11 keine Auswirkung auf die Struktur des GolgiApparates (Abb.3.20 A).
Morphologischerschiendieserdichtgepackt,kompaktundproximalzumNukleuslokalisiert.
InteressanterweisekonnteininfiziertenZellenmitpermanentenknockdowneineInfektion
mitC.trachomatisnicht,wieimerstenTeilderArbeit(Abb.3.1undAbb.3.6)dargestellt,die
Struktur des GolgiApparates aufbrechen und zu einer Verteilung GM130positiver Signale
um die Inklusion führen (Abb.3.21 A). Die quantitative Auswertung der Golgipositiven
StruktureninscheininfiziertenundinfiziertenZellenunterstütztdieBeobachtungenausder
Immunfluoreszenz. In infizierten Kontrollzellen konnte eine deutlich erhöhte Anzahl an
GolgipositivenStrukturennachgewiesenwerden,währenddieAnzahlinRab6undRab11
knockdownZellennichtvariierte(Abb.3.20BundAbb.3.21B).
III.Ergebnisse
Seite63
Abb.3.20GolgiStrukturinscheininfiziertenRab6KDHeLaundRab11KDHeLa
(A) Stabil transduzierte Zellen (grüner Kanal) wurden für Immnuofluoreszenzanalysen der GolgiStruktur
angefärbt.DerNachweisvoncisGolgiStrukturenerfolgteüberdenspezifischenAntikörperGM130(roter
Kanal).Die Auswertung wurde an einem konfokalenLaser Scanning Mikroskopdurchgeführt. Messbalken
entsprechen10μm.(B)QuantitativeAnalysederrelativenAnzahlanGolgiElementenindenuntersuchten
Zelllinien.DazuwurdenausdervorherigenImmunfluoreszenzZellenmiteinemkonfokalenLaserScanning
MikroskopaufgenommenunddieAnzahlderrotenElemente(GolgiApparat)ausje30Zellennacheinem
festgelegten Grenzwert im Programm ImageJ ausgewertet. Fehlerbalken entsprechen der
Standardabweichung.
III.Ergebnisse
Seite64
Abb.3.21GolgiStrukturinC.trachomatisinfiziertenRab6KDHeLaundRab11KDHeLa
A) Stabil transduzierte Zellen (grüner Kanal) wurden für 24 h mit C. trachomatis (MOI 1) infiziert und
anschließend für die Immunfluoreszenzanalyse angefärbt. Der Nachweis von cisGolgiStrukturen und
Inklusionen erfolgte über die spezifischen Antikörper GM130 (roter Kanal) und LPS (blauer Kanal). Die
Auswertung wurde an einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop durchgeführt. Dargestellt sind die
Überlagerungen. Messbalken entsprechen 10 μm. (B) Quantitative Analyse der relativen Anzahl an Golgi
Elementen in den untersuchten Zelllinien. Dazu wurden aus der vorherige Immunfluoreszenz infizierte
ZellenmiteinemkonfokalenLaserScanningMikroskopaufgenommenunddieAnzahlderrotenElemente
(GolgiApparat) aus je 30 Zellen nach einem festgelegten Grenzwert im Programm ImageJ ausgewertet.
FehlerbalkenentsprechenderStandardabweichung **U Wert<0,01.
VergleichendeUntersuchungenderGolgiStrukturinsiRNAbehandeltenHeLaZellenzeigten
konsistent den gleichen Phänotyp wie im shRNAvermittelten knock down (Abb.3.22). Die
Infektion konnte unter Verlust der RabProteine den GolgiApparat nicht fragmentieren. In
diesen Versuchen konnte zusätzlich beobachtet werden, dass die Inklusionen in Rab11
siRNAbehandeltenZellengrößeralsindenKontrollzellenwaren.
Diese Ergebnisse belegen, dass die Chlamydieninduzierte GolgiFragmentierung durch den
AusfallderProteineRab6undRab11aufgehobenwerdenkann.
III.Ergebnisse
Seite65
Abb.3.22GolgiStrukturinRab6undRab11siRNAbehandeltenHeLaZellen
siRNAbehandelteZellenwurdenentwederfür24hscheininfiziert(obereReihe)odermitC.trachomatis
(MOI1)infiziert(untereReihe)undanschließendinderImmunfluoreszenzanalysiert.DerNachweisvoncis
GolgiStrukturen und der Inklusion erfolgte mit spezifischen Antikörpern gegen GM130 (roter Kanal) und
chlamydiales LPS (grüner Kanal) an einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop. Dargestellt sind die
Überlagerungen.Messbalkenentsprechen10μm.KD,knockdown
3.3.9 SpaltungvonGolgin84instabilenknockdownZellen
DieFragmentierungdesGolgiApparatesgehtmitderSpaltungdesGolgiProteinsGolgin84
einher (Heuer et al., 2008). Im nächsten Versuch sollte geklärt werden, ob Golgin84 trotz
derausbleibendenFragmentierunginRab6undRab11knockdownZellenprozessiertwird.
LysatederstabiltransfiziertenundinfiziertenZellenwurdenimImmunoblotuntersucht.Die
ErgebnissezeigteneineSpaltungvonGolgin84(Abb.3.23).DieSpaltungvonGolgin84lässt
sich demzufolge wahrscheinlich auf einen Rab6 und Rab11unabhängigen Mechanismus
zurückführen.
III.Ergebnisse
Seite66
Abb.3.23Golgin84SpaltungindenstabilenZelllinienRab6KDHeLaundRab11KDHeLa
Zellen wurden mit C. trachomatis (C.tr. L2) infiziert (MOI 2) und nach 26 h lysiert. Die Immunodetektion
erfolgte mit spezifischen Antikörpern gegen Golgin84 und Hsp60. Aktin wurden mit spezifischen
AntikörpernalsLadekontrollenachgewiesen.
3.4
UntersuchungenzumTransportvonSphingolipidenindieInklusion
unterVerlustvonRab6undRab11
Rab6 und Rab11 sind in Transportprozessen innerhalb des GolgiApparates, als auch auf
Routen zwischen dem endosomalen System und dem transGolgi Netzwerk (TGN) beteiligt
(ZerialundMcBride,2001).DieunterbundeneGolgiFragmentierungbeimVerlustvonRab6
und Rab11 könnte einen unzureichenden Transport von Sphingolipiden aus dem Golgi
Apparat in die Inklusion zur Folge haben. Diese Unterversorgung könnte zu der
beobachtetenVerminderungderAnzahlinfektiöserNachkommenführen.
Der Transport von Sphingolipiden in die Inklusionsmembran und die Bakterienmembran
wurde mittels Lebendzellmikroskopie beobachtet (Abb.3.24). Die stabilen knock down
Zelllinien wurden für 26 h mit C.trachomatis (MOI 1) infiziert. Die Zugabe des BODIPYFL
FluorophorgekoppeltenCeramideserfolgtedirektunterdemkonfokalenMikroskop,wobei
der intrazelluläre Transport der Fluoreszenzprobe über einen Zeitraum von 30Min.
detektiert wurde. Dargestellt sind repräsentative Standbilder dieser Aufnahmen. Die
Inklusionen erkennt man zu Beginn der Aufnahme als runde, dunkle Bereiche in den GFP
exprimierendenZellen(unterlegtistderPhasenkontrast).NachZugabedesFLgekopppelten
Ceramides insertiert dieses an die Plasmamembran. Nach ca. 10 Min. ist eine deutliche
ringförmige Färbung an den Inklusionsmembranen erkennbar. Im weiteren Verlauf färben
III.Ergebnisse
Seite67
sichdiegesamtenInklusionenindenLuciferaseKontrollzellendurchAufnahmedesLipides
indieBakteriengrünan.
ImGegensatzdazukannininfiziertenRab6KDHeLaundRab11KDHeLazwardieAufnahme
undderTransportdesfluoreszierendenCeramideszumGolgiApparatbeobachtetwerden,
allerdings wird dieses nur in sehr geringer Menge in die Inklusionen aufgenommen. Die
Inklusionenverbleibendunkel.InteressanterweisekanneinschwachesgrünesSignalumdie
Inklusionenbeobachtetwerden(gekennzeichnetdurchPfeileinAbb.3.24).
Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse vermuten, dass der funktionelle Ausfall von
Rab11undRab6dieAufnahmevonSphingolipidenindieBakterienblockiert.Dieseskönnte
eine Ursache für die massive Störung der Rückdifferenzierung in infektiöse Partikel
darstellen.
Abb.3.24TransportvonSphingolipidenindieInklusioninKontroll,Rab6KDHeLaundRab11KDHeLa
StandbilderdesSphingolipidtransportesausderLebendzellmikroskopie.StabiltransduzierteZellenwurdenfür26hmit
C.trachomatis(MOI1)infiziertundnachZugabevon30nMBODIPYFLmarkiertemCeramidübereineDauervon30min
an einem konfokalen Mikroskop beobachtet. Pfeile kennzeichnen Fluoreszenzmarkiertes Ceramid an der Inklusion.
Messbalkenentspricht10μm.
III.Ergebnisse
Seite68
III.Ergebnisse
3.5
Seite69
UntersuchungenzumsimultanenVerlustvonRabProteinenund
Golginen
3.5.1 AnalysederGolgiStrukturnachsimultanerHerunterregulationvon
RabProteinenundGolginen
In den vorangegangen Analysen konnte die Bedeutung des Verlustes von Golgi
StrukturproteinenundRabProteinenfürdiechlamydialenEntwicklunggezeigtwerden.Das
AusschaltenvonGolginen,wieGolgin84,Giantin,Gpp130undp115wirktesichpositivauf
diechlamydialeVermehrungaus,währendderVerlustderRabProteineRab6undRab11zu
einer stark beeinträchtigten bakteriellen Replikation führte. Für den strukturellen Aufbau
des GolgiApparates sind, wie bereits beschrieben, hauptsächlich Golgine verantwortlich
(Short et al., 2005) und diese können mit RabProteinen interagieren (Diao et al., 2003;
Rosingetal.,2007;Burgueteetal.,2008).
Im Folgenden sollte untersucht werden, wie sich die simultane Herunterregulation
infektivitätsfördernder und infektivitätshemmender Faktoren auswirkt. Dazu wurden die
Zelllinien Rab6KDHeLa und Rab11KDHeLa mit siRNAs gegen die Zielproteine p115 und
Golgin84 behandelt, mittels Immunfluoreszenz analysiert und die bakterielle
Vermehrungsratebestimmt.
Zunächst wurde die GolgiStruktur in den siRNAbehandelten stabilen knock down Zellen
mittels Immunfluoreszenz untersucht (Abb.3.25). Dazu wurde die Verteilung des cisGolgi
Markers Gpp130 bestimmt. Die nichtinfizierten LuciferaseKontrollzellen zeigten den
erwartetenPhänotypnachGolgin84undp115knockdown.DerGolgiApparatistdeutlich
fragmentiert. Hingegen hat der Verlust von Golgin84 und p115 in den stabilen Rab6 und
Rab11knock down Zellen unterschiedliche GolgiMorphologien zur Folge. p115Verlust
fragmentiertedenGolgiApparatvergleichbarzudenKontrollzellen,unabhängigvomVerlust
derbeidenRabProteine.ImGegensatzdazustabilisiertederVerlustvonRab6oderRab11
positiv die GolgiStruktur nach Herunterregulation von Golgin84. Der GolgiApparat zeigte
morphologischimmernocheinekompakteunddichteStruktur.QuantitativeAuswertungen
der relativen Anzahl an GolgiElementen in den Proben bestätigten die Ergebnisse aus der
Immunfluoreszenz(Abb.3.26).
III.Ergebnisse
Seite70
Abb. 3.25 GolgiStruktur in nichtinfizierten Rab6KDHeLa und Rab11KDHeLa nach simultaner
Herunterregulationvonp115oderGolgin84
StabiltransduzierteZellen(grünerKanal)wurdenmitsiRNAstransfiziert,diespezifischgegenGolgin84und
p115 gerichtet waren. Mittels spezifischer Antikörper gegen das cisGolgiProtein Gpp130 (roter Kanal)
wurden die Zellen für die Immunfluoreszenzanalyse angefärbt und an einem konfokalen Laser Scanning
Mikroskopanalysiert.DargestelltsinddieÜberlagerungen.Messbalkenentsprechen10μm.
DiesiRNAvermittelteFragmentierungindenKontrollzellenhatteeinehoheAnzahlpositiver
GolgiElemente zur Folge. Dagegen konnte die kompakte Struktur des GolgiApparates in
denZelllinenRab6KDHeLaundRab11KDHeLadurchVerlustvonGolgin84nichtaufgelöst
werden und die Anzahl positiver Strukturen lag deutlich unter denen der Kontrollzelllinie.
III.Ergebnisse
Seite71
DerVerlustvonp115inRab6KDHeLaundRab11KDHeLahingegenzeigteübereinstimmend
zurbeobachtetenGolgiFramentierung,dreimalmehrpositiveGolgiElemente.
Zusammenfassend ergeben die Untersuchungen, dass der Verlust der Proteine Rab6 und
Rab11dieGolgin84induzierte,nichtabereinep115abgeleiteteFragmentierungdesGolgi
Apparatesverhindern.
Abb.3.26QuantifizierungderGolgiFragmentierunginnichtinfiziertenRab6KDHeLaundRab11KDHeLa
nachsimultanerHerunterregulationvonp115oderGolgin84
FürdieQuantifizierungderGolgiFragmentierunginnichtinfiziertenZellen,wurdendiestabilenZelllinien
mit spezifischen siRNAs gegen Golgin84 und p115 transfiziert. Die Detektion des GolgiApparates mittels
ImmunfluoreszenzerfolgtemitdreispezifischenAntikörperngegendiecisGolgiProteineGpp130,Giantin
und GM130. Die Dokumentation erfolgte an einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop. Die Bilder
wurdenanschließendimProgrammImageJmittelseinesfestgelegtenGrenzwertesausgewertet.Dargestellt
istdierelativeAnzahlvonGolgiSignalen+Standardabweichungausje30Zellen.**UWert<0,01.KD,knock
down
3.5.2 UntersuchungderGolgiStrukturnachsimultanerHerunterregulation
vonRabProteinenundGolgineninChlamydieninfiziertenZellen
Parallel wurde die GolgiStruktur in C.trachomatisinfizierten und siRNAbehandelten
stabilen knock down Zellen untersucht (Abb.3.27). In infizierten Kontrollzellen war die
beschriebene Fragmentierung des GolgiApparates deutlich erkennbar. In den RabProtein
knock down Zellen hingegen konnte trotz Infektion und Verlust von Golgin84, eine
Auflösung der GolgiStruktur nicht nachgewiesen werden. Die Infektion in p115siRNA
behandelten Zellen führte zu einem stark fragmentierten GolgiApparat, unabhängig vom
Verlust von einem der beiden RabProteine. Unterstützt wurden die mikroskopischen
III.Ergebnisse
Seite72
Analysen durch die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung von Golgipositiven
Elementen. Abb.3.28 zeigt die Erhöhung an GolgiElementen im siRNAvermittelten p115
knock down. Interessanterweise beobachtet man im Gegensatz dazu in den RabProtein
knockdownZellennurhalbsovieleGolgiElementenachGolgin84siRNABehandlung,wie
indenKontrollzellen.
Insgesamt lassen diese Untersuchungen erkennen, dass die Chlamydieninduzierte
Fragmentierung des GolgiApparates unter Ausfall von Golgin84 vermutlich über die
ProteineRab6undRab11reguliertwerdenkann.Dagegenscheintdieüberp115siRNAund
C.trachomatisInfektion induzierte Auflösung des GolgiApparates unabhängig von Rab6
undRab11knockdownvermitteltenProzessenzusein.
III.Ergebnisse
Seite73
Abb. 3.27 GolgiStruktur in C.trachomatisinfizierten Rab6KDHeLa und Rab11KDHeLa nach simultaner
Herunterregulationvonp115oderGolgin84
Stabil transduzierte Zellen (grüner Kanal) wurden mit siRNAs gegen Golgin84 und p115 behandelt und
anschließend mit C.trachomatis (MOI 1) infiziert. Die Immunfluoreszenzfärbung erfolgte mittels
spezifischer Antikörper gegen das cisGolgiProtein Gpp130 (roter Kanal) und chlamydiales Hsp60 (blauer
Kanal) und wurde an einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop analysiert. Dargestellt sind die
ÜberlagerungendereinzelnenProben.Messbalkenentsprechen10μm.
III.Ergebnisse
Seite74
Abb. 3.28 Quantifizierung der GolgiFragmentierung in C.trachomatisinfizierten Rab6KDHeLa und
Rab11KDHeLanachsimultanerHerunterregulationvonp115oderGolgin84
Für die Analyse der GolgiFragmentierung, wurden die stabilen Zelllinien mit spezifischen siRNA gegen
Golgin84 und p115 transfiziert und anschließend mit C.trachomatis (MOI 1) infiziert. Die Detektion des
GolgiApparates mittels Immunfluoreszenz erfolgte mit drei spezifischen Antikörpern gegen die cisGolgi
Proteine Gpp130, Giantin und GM130. Von diesen Proben wurden je 30 infizierte Zellen an einem
konfokalenLaserScanningMikroskopdokumentiert.DieBilderwurdenanschließendimProgrammImageJ
mittelseinemfestgelegtenGrenzwertesausgewertet.DargestelltistdierelativeAnzahlvonGolgiSignalen+
Standardabweichung,**UWert<0,01.KD,knockdown
3.5.3 VergleichderInfektivitäteninGolgin84undp115siRNA
behandeltenstabilenRab6undRab11knockdownZellen
Der funktionelle Ausfall der in dieser Arbeit untersuchten Wirtszellproteine führte zu
verändertem
Vermehrungsverhalten
der
Chlamydien.
Die
vorangegangenen
Untersuchungen zeigten die Notwendigkeit von Rab6 und Rab11 für eine produktive
chlamydialeEntwicklung.ParallelkonnteeineBegünstigungderInfektiondurchAusschalten
von GolgiProteinen nachgewiesen werden. Sowohl Infektion, als auch RNAi gegen Golgi
Strukturproteine,hatteneineAuflösungderStrukturdesGolgiApparateszurFolge.Konnte
der GolgiApparat bereits vor der Infektion durch eine siRNABehandlung fragmentiert
werden,wardasvongroßemVorteilfürdieChlamydienVermehrung;dieInfektivitätstieg
starkan.DagegenführtederknockdownvonRab6undRab11zukeinemZerfalldesGolgi
Apparates und die Vermehrung der Chlamydien war negativ beeinträchtigt (Tab.3.1). Im
Folgenden sollte gezeigt werden, welche Folge diese Resultate auf die Entwicklung von
Chlamydienimsimultanenknockdownhatten.
III.Ergebnisse
Seite75
Tab.3.1VergleichderInfektivitätenundderStrukturdesGolgiApparatesinknockdownZellen
Vergleichende Zusammenfassung der Infektivitäten und der GolgiStruktur nach Verlust des jeweils
angegebenenProteins.PfeilekennzeichneneineErhöhungoderReduktionderInfektivität.(+)entsprichteiner
beobachtetenFragmentierungdesGolgiApparates.KD,knockdown
Infektivität
Golgi-Fragmentierung
Golgi-Fragmentierung
durch siRNA
durch C. trachomatis
Rab6 KD
-
-
Rab11 KD
-
-
Golgin-84 KD
+
+
p115 KD
+
+
Für die Bestimmung der Infektivitäten wurden stabil transduzierte und siRNAbehandelte
Zellen mit C.trachomatis infiziert und nach 48 h p.i. auf neue HeLaZellen titriert. Die
Auswertung der gebildeten Inklusionen in Abb.3.29 ergab,dass der Verlust von p115 eine
zehnfache Erhöhung der Infektivität bewirkte, unabhängig vom Verlust eines der beiden
untersuchten RabProteine. Dieses Ergebnis stimmte mit den Beobachtungen der Golgi
Struktur in der Immunfluoreszenz und den Daten der Infektivitäten in siRNAbehandelten
HeLaZellen überein, die zeigten, dass die Fragmentierung des GolgiApparates die
Infektivität der Bakterien förderte (Abb.3.9 und Abb.3.29). Ob es sich bei diesem
MechanismusumeinendirektenEffektaufdieBakterienoderindirekteEreignissedurchdie
UmkehrungderGolgiStrukturhandelt,bedarfweitererUntersuchungen.
Interessanterweise hatte dagegen der Verlust von Golgin84 unter Ausfall von Rab6 oder
Rab11 keine Erhöhung der Infektivität zur Folge, sondern beeinflusste die Infektivität im
Vergleich zu scheinbehandelten Zellen nicht. Rab6 und Rab11 scheinen in der Golgin84
abhängigenGolgiFragmentierungeineRollezuspielen.
III.Ergebnisse
Seite76
Abb. 3.29 Bestimmung der chlamydialen Infektivitäten in Zellen mit simultanem knock down (KD) von
GolgiProteinenundRabProteinen
StabiltransduzierteZellenwurdenzunächstmitsiRNAstransfiziert,diespezifischgegenGolgin84undp115
gerichtet waren und anschließend mit C.trachomatis (MOI 3) infiziert. 48 h nach Infektion wurden die
Zellen lysiert und die Anzahl inklusionsformender Partikel durch Titration auf frischen HeLaZellen
bestimmt.DasDiagrammstelltdieMittelwerte+StandardabweichungderrelativenIFU/mlinProzentaus
dreiunabhängigenExperimentendar.*UWert<0,05,**UWert<0,01.
IV.Diskussion
Seite77
IV.DISKUSSION
Das Überleben der obligat intrazellulären Chlamydien hängt von der Etablierung und
Aufrechterhaltung ihrer Nische, der Inklusion, ab. Hierfür müssen die Bakterien mit
verschiedenen Proteinen der Wirtszelle interagieren. Da es zurzeit nicht möglich ist
Chlamydiaceaegerichtetgenetischzumanipulieren,bietetdieRNAInterferenzTechnologie
(RNAi)eineeffektiveundspezifischeMethode,dieExpressionvonausgewähltenZielgenen
in der Wirtszelle zu supprimieren. Damit erlaubt diese Methode Auswirkungen des
ProteinverlustesaufdieChlamydienzuuntersuchen.
In dieser Arbeit konnte ein essentieller Beitrag zum Verständnis der Funktion des Golgi
Apparates während einer ChlamydienInfektion geleistet werden. Wechselwirkungen mit
GolgiStrukturproteinen scheinen eine wichtige Rolle in der Bereitstellung von Nährstoffen
undMolekülenzuspielen.ChlamydienbrechendieStrukturdesGolgiApparatesauf,waszu
einer Anlagerung von Golgipositiven Elementen geringer Größe um die Inklusion führt
(Heueretal.,2008).DerZerfallderGolgiStrukturkorreliertzeitlichmitderproteolytischen
Spaltung von Golgin84. Die Verwendung von RNAi gegen ausgewählte strukturelle Golgi
Proteine ergab, dass der Verlust dieser Proteine zur Fragmentierung des GolgiApparates
führte.DiesbegünstigtenachfolgenddenchlamydialenEntwicklungszyklusundresultiertein
einervermehrtenProduktioninfektiöserBakterien.
Die Auflösung der GolgiStruktur in vesikuläre Einheiten ließ auf eine mögliche Interaktion
mit RabProteinen schließen. Um die Bereitstellung von Nährstoffen vesikulärer Form zur
Inklusion genauer zu untersuchen, wurden verschiedene RabProteine, als entscheidende
Regulatoren für intrazellulären Vesikeltransport, mittels RNAi herunterreguliert. Der Effekt
des funktionellen Ausfalls wurde anhand der chlamydialen Vermehrungsrate bestimmt. Es
konnte gezeigt werden, dass einige RabProteine den Entwicklungszyklus spezifisch
beeinflussen, während andere keine Bedeutung hatten. Der Verlust von Rab6 und Rab11
führtezueinersignifikantenVerringerungderAnzahlinfektiöserNachkommen.DerGroßteil
der Bakterien konnte den Entwicklungszyklus nicht vollständig abschliessen und nur eine
geringeAnzahlinfektiöserPartikelausbilden.
Parallelkonntegezeigtwerden,dassunterFunktionsverlustvonRab6undRab11derGolgi
ApparatnichtmehrfragmentierteundderTransportvonGolgiabgeleitetenSphingolipiden
durchdieInklusionsmembranzudenBakterienherabgesetztwar(RejmanLipinskietal.).In
IV.Diskussion
Seite78
Golgin84defizienten Zellen konnte abschließend demonstriert werden, dass der Verlust
vonRab6oderRab11indiesenZellendieGolgiFragmentierungverhinderteunddieerhöhte
InfektivitätunterAusfallvonGolgin84wiederabsenkte.
4.1
BedeutungderGolgiFragmentierungfürChlamydienInfektionen
4.1.1 C.trachomatisInfektionführtzurAuflösungderStrukturdesGolgi
Apparates
Die intrazelluläre Lebensweise von Chlamydien erfordert zur Gewinnung von Nährstoffen
eineInteraktiondesBakteriumsmitdenTransportwegenderWirtszelle.Besonderswichtig
fürdaschlamydialeWachstumunddieVermehrungderBakterienistu.a.dieVersorgungmit
Lipiden(Hackstadtetal.,1995;Hackstadtetal.,1996;Scidmoreetal.,1996a;Wylieetal.,
1997;Carabeoetal.,2003).VorallemdieRekrutierungvonSphingolipidenausdemGolgi
Apparat zur Inklusion stellt eine entscheidende Wechselwirkung des Bakteriums mit der
Wirtszelledar(Hackstadtetal.,1995;Hackstadtetal.,1996).
IndervorliegendenArbeitkonntedemonstriertwerden,dassimVerlaufeinerInfektionmit
C.trachomatis der GolgiApparat in mehrere kleine Einheiten zerfiel und sich um die
Inklusionlagerte,wassichvorteilhaftaufdieChlamydienauswirkte(Heueretal.,2008).
Die Auflösung der GolgiStruktur nach ChlamydienInfektion zeigt eine einzigartige
Interaktion zwischen der Wirtszelle und einem intrazellulären Bakterium. Bisher wurde für
kein weiteres obligat intrazelluläres Bakterium eine ähnlich induzierte Fragmentierung des
GolgiApparates gezeigt. In einer Publikation mit Legionella pneumophila konnte gezeigt
werden,dassdieektopischeÜberexpressiondesvomBakteriumsekretiertenProteinsSidM
zu einer Fragmentierung des GolgiApparates führte. Ob allerdings eine Infektion mit
Legionella pneumophila ebenfalls zur Fragmentierung des GolgiApparates führen würde,
bliebindieserStudieungeklärt(MachnerundIsberg,2006).
GolgiFragmentierung ist zwar ein durchaus bekanntes Phänomen, allerdings sind die
Mechanismen bei weitem noch nicht endgültig entschlüsselt. Die beobachtete
Fragmentierung des GolgiApparates in der Infektion ähnelte dem Auflösen der Organell
Struktur nach Behandlung mit ZytoskelettToxinen ((Heuer et al., 2008), Daten der
Arbeitsgruppe).ZurAufrechterhaltungdernormalenMorphologieistderGolgiApparatauf
ein intaktes Mikrotubuli und AktinNetzwerk angewiesen. Toxine, wie Nocodazol oder
IV.Diskussion
Seite79
Cytochalasin, die das Zytoskelett schädigen, führen zur Formierung von GolgiMinistapeln,
diemitdenhierbeobachtetenFragmentenvergleichbarsind(Coleetal.,1996;Valderrama
etal.,1998).
Die Struktur des GolgiApparates kann durch verschiedene Modifikationen der Golgine
beeinflusst werden (Short et al., 2005). Nähere Untersuchungen mittels Immunodetektion
zeigtenindieserArbeit,dasseswährendderInfektionunddemZerfalldesGolgiApparates
zu einer proteolytischen Spaltung des Golgins Golgin84 kam. In infizierten Zellen konnte
eine sequentielle Prozessierung von Golgin84 in zwei Spaltfragmente nachgewiesen
werden;einca.78kDaundeinca.65kDagroßesFragment.DieDegradationunddamitdas
78kDagroßeFragmentwarbereits16hp.i.nachzuweisen,wohingegendas65kDagroße
SpaltprodukterstzuspäterenZeitpunktenakkumulierte.36hp.i.konntedieunprozessierte,
volleLängedesProteinsnichtmehrdetektiertwerden(Heueretal.,2008).
4.1.2 RNAiinduzierteGolgiFragmentierungfördertdiechlamydiale
Vermehrung
Die Integrität und Homöostase des GolgiApparates vermitteln unter anderem
strukturgebendeProteine,dieGolgine.MittelsderRNAiTechnikwurdenindieserArbeitdie
Folgen des funktionellen Ausfalls von GolgiStrukturproteinen analysiert. Die
ImmunfluorenszenzAuswertung zeigte, dass eine siRNABehandlung gegen die Golgi
ProteineGolgin84,Gpp130,Giantinoderp115denGolgiApparatfragmentierte,undzwar
vergleichbar zu der gezeigten Fragmentierung in infizierten Zellen. Dieser durch RNAi
erzeugte Strukturverlust des GolgiApparates ist konsistent zu bereits veröffentlichten
Beobachtungen. Für die Proteine Golgin84, GM130 und p115 wurde nach der siRNA
Behandlung die Bildung von vesikulären GolgiMinistapeln beschrieben (Diao et al., 2003;
Sohda et al., 2005; Puthenveedu et al., 2006). Golgin84 wird z.B. für die Ausbildung der
Verbindungen der einzelnen Zisternen benötigt (Satoh et al., 2003). p115 hingegen ist am
TransportvonCOPIIundderBindungvonCOPIVesikelnamcisGolgibeteiligt(Sonnichsen
et al., 1998; Allan et al., 2000). Es ist anzunehmen, dass die kontinuierliche Vesikelbildung
beigleichzeitigverhinderterBindungundFusionderVesikelandieGolgiMembraninp115
und Golgin84 knock downZellen letztendlich in der vesikulären Zerlegung des gesamten
Apparatesresultiert.
IV.Diskussion
Seite80
DiehieruntersuchtenProteineGolgin84,p115undGM130werdeninderMitosereguliert,
wodurch sie eine wichtige Rolle in der Aufteilung des GolgiApparates auf beide
Tochterzellen spielen (Lowe et al., 1998; Diao et al., 2003). Durch Phosphorylierung der
GolgineGM130undGolgin84undDephosphorylierungvonp115währendderMitose,wird
eineInteraktiondieserProteinemiteinanderverhindert,waseineFragmentierungdesGolgi
ApparatesunddamiteinegleichmäßigeVerteilungdiesesOrganellsaufbeideTochterzellen
zur Folge hat. Wie weit sich der hier beobachtete Mechanismus der GolgiFragmentierung
vondemderMitoseunterscheidet,bedarfallerdingsweitererUntersuchungen.
DievorteilhafteAuswirkungderGolgiFragmentierungwährendeinerChlamydienInfektion
demonstriertendieUntersuchungenderInfektivitätennachsiRNABehandlunggegenGolgi
Strukturproteine. Der funktionelle Ausfall der Golgine und Golgiassoziierten Proteine
Golgin84, Giantin, Gpp130 und p115 und die damit einhergehende Fragmentierung des
GolgiApparates, erhöhte die Infektivität der Nachkommenschaft mindestens fünffach. Die
vorzeitige Auflösung der GolgiStruktur durch Ausschalten von spezifischen Golginen ist
somit von großem Vorteil für eine effiziente bakterielle Entwicklung. Es ist anzunehmen,
dass unter Auflösung der GolgiStruktur die Bereitstellung von Nährstoffen, vermutlich
vorrangigdievonLipiden,verbessertwird.
4.2
RabProteinesindwichtigfürdiechlamydialeEntwicklung
DieGolgiFragmentierungresultierteinderZerlegungdesGolgiApparatesinvielevesikuläre
Strukturen.FürdieRegulationdesTransportesvonVesikelnsindinnerhalbderWirtszellevor
allemRabProteineverantwortlich.Umzuuntersuchen,obRabProteinedenTransportvon
Nährstoffen zur Inklusion und den Bakterien vermitteln und somit zur Vermehrung der
Chlamydien beitragen,wurde in der vorliegenden Arbeit die Expression von RabProteinen
aus den verschiedenen intrazellulären Transportrouten mittels RNAi herunterreguliert. Die
Auswirkungen des Verlustes dieser Proteine wurden anhand der chlamydialen
Vermehrungsrate untersucht. Die Ergebnisse konnten drei Gruppen zugeordnet werden:
RabProteinen,diezueinerErhöhungderInfektivitätführten(Rab1);RabProteinen,diedie
Infektivität über 50% reduzierten (Rab6 und Rab11) und RabProteinen, die die bakterielle
Vermehrung nach Proteinfunktionsverlust nicht signifikant beeinflussten (Rab4, Rab10 und
Rab2).
IV.Diskussion
Seite81
Eine größere, ebenfalls auf RNAi basierende Studie zur Aufklärung der Interaktionen von
ChlamydienmitderWirtszelle,wurdevonElwellundEngeldurchgeführt(ElwellundEngel,
2005; Elwell et al., 2008). Als Modelsystem wählten die Autoren Drosophila melanogaster
S2Zellen.DieseZellenlassensicheinfachundeffizientmitsiRNAtransfizierenundbesitzen,
im Gegensatz zu Säugetieren, ein nichtredundantes Genom. In der Arbeit konnte gezeigt
werden, dass S2Zellen als Modell für die frühe Infektion, den Aufbau und die
Aufrechterhaltung der Inklusion, sowie den Erwerb von Golgiabgeleiteten Sphingolipiden
geeignetsind.DabeiwurdediePrimärinfektionindenknockdownZellenanhandderAnzahl
gebildeter Inklusionen und der Morphologie der Inklusion untersucht. Die Analyse
identifizierte auch RabProteine, die die Primärinfektion beeinflussten (Rab1, Rab8, Rab14
und Rab39). Rab6 und Rab11 waren keine Treffer in dieser Studie, was konsistent zu den
Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist, denn die Primärinfektion nach Rab6 oder Rab11
knockdownwarnichtverändert.AllerdingskonntenspäteEreignissederInfektion,wiedie
RedifferenzierungvonRKinEKunddieGewinnunginfektiöserNachkommen,aufgrundder
limitierten Replikations und Überlebensrate von C.trachomatis in S2Zellen, nicht
rekonstruiertwerden.DieszeigtzumjetzigenZeitpunktdieGrenzendesDrosophilaSystems
auf. Die vorliegende Arbeit hingegen gibt Aufschlüsse über die notwendigen
Wirtszellproteine in der etablierten und späten Infektion von humanen Epithelzellen. Der
experimentelleAufbauermöglichtedieAnalysedererzeugteninfektiösenNachkommen,die
neueInfektionsrundeneinleitenkönnen.ImUnterschiedzuderinS2Zellendurchgeführten
Studie,wardievorliegendeArbeitnichtauffrüheInfektionsereignisse,wiedieAdhärenzund
dieAufnahmevonChlamydienindieZellebeschränkt,sondernkonntedenInfektionsverlauf
nachDurchlaufeneinesvollständigenZyklusauswerten.
InteressanterweisekonnteindieserArbeitbeobachtetwerden,dassdieInklusioneninden
Rab11siRNAbehandeltenZellengrößerwaren,alsindenstabilenRab11KDHeLaZellen.Die
nach transientem und konstitutiven Herunterregulieren beobachteten unterschiedlichen
Inklusionsgrößen können vielfältige, in der jeweiligen experimentellen Vorgehensweise zu
suchendeUrsachenhaben.EinerseitsstelltdiesiRNATransfektionderZelleneinengroßen
EingriffindieZelledar,dermitderAufnahmeundderVerarbeitungeinergroßenAnzahlvon
Fremdpartikeln
einhergeht.
Auf
der
anderen
Seite
kann
ein
permanenter
ProteinfunktionsverlustzelluläreAdaptationsprozesseinGangsetzen,inderenVerlaufsich
IV.Diskussion
Seite82
ein verändertes Proteinexpressionsmuster einstellt, das einen Einfluss auf die
Inklusionsgrößehabenkann.
4.2.1 Chlamydien können in Rab6 und Rab11vermittelte Transportwege
eingreifen
Rzomp und Mitarbeiter konnten zeigen, dass Chlamydien bestimmte RabProteine
rekrutieren. In infizierten Zellen lokalisierten EGFPmarkierte RabProteine zur Inklusion,
wobeidieRekrutierungspeziesspezifischundRabProteinspezifischerfolgte(Rzompetal.,
2003). Sowohl C.trachomatis als auch Cp.pneumoniae konnten Rab1, Rab4 und Rab11
rekrutieren. Im Gegensatz dazu wurde eine Assoziation von Rab6 mit Inklusionen nur in
C.trachomatisinfizierten Zellen und von Rab10 nur in Zellen infiziert mit Cp.pneumoniae
oder Cp.muridarum beobachtet. Diese Daten veranschaulichen sehr gut die selektive
Wechselwirkung zwischen der Wirtszelle und den Chlamydien. Die funktionelle Bedeutung
dieserBeobachtungfürdiechlamydialeEntwicklungblieballerdingsungeklärt.
Die Daten der hier untersuchten RabProteine decken sich mit den Beobachtungen von
Scidmore und Mitarbeitern. Rab10 assoziiert nicht mit der C.trachomatisInklusion und
scheintauchkeineBedeutungfürdieEntwicklungderBakterienzuhaben.Rab6undRab11
hingegen lokalisieren zur C.trachomatisInklusion und deren Verlust verringerte die
VermehrungderChlamydienumetwa50%.Interessanterweisekonnteauchgezeigtwerden,
dasssichdasRab6mRNALevelinHeLaZellennachInfektionmitC.trachomatiserhöht,was
dieBedeutungvonRab6inderchlamydialenEntwicklungbekräftigt(Xiaetal.,2003).
DieAuswirkungendesVerlustesvonRab6undRab11aufdiechlamydialeReplikationlassen
vermuten,dassdiesebeidenProteineeineSchlüsselrolleinderAkquisitionvonNährstoffen,
vermutlichvesikulärerForm,anderInklusionsmembranspielen.BeideRabProteinewurden
u.a.alsTransportregulatoreninderVerbindungderendozytotischenmitderexozytotischen
Route identifiziert (Wilcke et al., 2000; Mallard et al., 2002). Die Endozytose und die
ExozytosesinddurchdieBeförderungvonVesikelnzwischendenEndosomenunddemTGN
miteinander verbunden. So führt z.B. der Verlust oder die Überexpression dominant
negativerMutantenvonRab6undRab11zueinerBlockadedesTransportesdesShigaToxin
BFragmentes(STxB)vondenfrühenEndosomenzumTGN(Mallardetal.,2002).
IV.Diskussion
Seite83
Im Rab6vermittelten Transport wurden außerdem zwei Rab6Isoformen beschrieben, die
sichnurdurchdreiAminosäureninderGTPbindendenDomäneunterscheiden(Goudetal.,
1990;Antonyetal.,1992;Echardetal.,2000;Monieretal.,2002;DelNeryetal.,2006).Die
in dieser Arbeit verwendete siRNA gegen Rab6 erkennt eine Sequenz homolog zu beiden
FormenundführtsomitwahrscheinlichzumsimultanenknockdownbeiderIsoformen.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Rab6 über das Motorprotein Rabkinesin6 und
seine Effektoren Bicaudal1 und Bicaudal2 den Transport von Vesikeln entlang von
Mikrotubuli vermittelt (Echard et al., 1998; Matanis et al., 2002; Short et al., 2002;
Moorheadetal.,2007).FürdenRab6EffektorBicaudal1konnteebenfallseineAssoziation
mitderInklusionaufgezeigtwerden,wasmöglicheInteraktionenvonRab6mitChlamydien
unterstützenwürde(Moorheadetal.,2007).
Die Wechselwirkung von Chlamydien mit diesen beiden RabProteinen könnte einen
Mechanismus zur Bereitstellung von Vesikeln aus dem Transportweg von den Endosomen
zum TGN darstellen, während die Interaktion mit RabProteinen aus der
endosomalen/RecyclingRoute (Rab4 und Rab11) die Fusion mit Transferrin beladenen
Vesikeln fördert (van Ooij et al., 1997; Al Younes et al., 1999; Scidmore et al., 2003). Die
Wechselwirkung mit RabProteinen aus dem sekretorischen Transport (Rab1, Rab6)
hingegendientderBereitstellungvonexozytotischenVesikelnundLipiden(Hackstadtetal.,
1995;WolfundHackstadt,2001).
Kürzlichkonntegezeigtwerden,dassdieProteineRab6undRab11überdasRab6interacting
protein1(R6IP1)amTGNmiteinanderinteragierenkönnen(MisereyLenkeietal.,2007).Der
Komplex aus Rab6, R6IP1 und Rab11 ist in der Lage als Anker für Vesikel aus den frühen
Endosomen zu dienen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sowohl der funktionelle
Ausfall von Rab6, als auch der von Rab11, einen nachteiligen Effekt auf die erfolgreiche
Vermehrung der Chlamydien haben. Diese Beobachtung legen die Vermutung nahe, dass
beideRabProteinedurchgegenseitigeWechselwirkungunddieAusbildungeinesKomplexes
anderInklusionsmembraneineeffizienteVesikelrekrutierungermöglichenkönnten.
IV.Diskussion
Seite84
4.2.2 Rab6 und Rab11dekorierte Vesikel werden über spezifische Inc
ProteineanderInklusionsmembrangebunden
Wie bereits erwähnt, konnte die Rekrutierung GFPmarkierter RabProteine zur
Inklusionsmembran demonstriert werden, allerdings blieben die Mechanismen der
Rekrutierung dieser RabProteine bzw. Rabpositiver Vesikel an die Inklusionsmembran
bislang unverstanden. Es ist nicht bekannt, ob RabProteine in die Inklusionsmembran
eingebaut werden. Es wird vermutet, dass die Bindung z.B. an ein noch nicht
charakterisiertes IncProtein in der Inklusionsmembran erfolgen könnte. Einen
vermeintlichen Partner bzw. SNARE für Rab11markierte Vesikel stellt das IncProtein
Cpn0585ausCpn.pneumoniaedar.InHefe2HybridExperimentenkonntegezeigtwerden,
dassCpn0585mitRab1,Rab10,undRab11,nichtabermitRab4oderRab6interagierenkann
undsomitanderRekrutierungvonRabProteinenbzw.RabpositivenVesikelnbeteiligtsein
könnte(Cortesetal.,2007).DesWeiterenkonntendieAutorenzeigen,dassdieektopische
Expression der RabBindungsdomäne von Cpn0585, die Entwicklung der Inklusionen
inhibierte (Cortes et al., 2007). Dieser Effekt konnte durch Überexpression von Rab11
revertiert werden. Diese Ergebnisse sind konsistent zu den hier gezeigten
elektronenmikroskopischenDatendergestörtenEntwicklungneuerinfektiöserPartikelnach
funktionellemAusfallvonRab11.ZudembestärkensiedieAnnahme,dassdieRekrutierung
von RabProteinen bzw. RabProteinvermittelter Vesikeltransport zur Inklusion einen
entscheidendenEinflussaufdasWachstumunddieVermehrungvonChlamydienhat.
InImmunfluoreszenzanalysenkonntenRzompundMitarbeiteraußerdemzeigen,dassRab11
partiellmitdemIncGProteinausC.trachomatiskolokalisiertunddieGTPaseRab4mitdem
IncProteinCT229interagiert(Rzompetal.,2003;Rzompetal.,2006).
Für Rab6 wurden allerdings bisher keine Interaktionen mit chlamydialen IncProteinen
beschrieben. Diese Untersuchungen demonstrieren, dass Bindungen von zellulären Rab
ProteinenandieInklusionüberIncProteinemöglichundwichtigsind.Siebringenvesikuläre
TransportgüterzurInklusionundgreifenvermutlichregulierendindieFusionseigenschaften
desPhagosomsein.
IV.Diskussion
Seite85
4.2.3 BedeutungvonRabProteinenfüranderePathogene
Diese Arbeit zeigte, dass die chlamydiale Vermehrung auf Wechselwirkungen mit
spezifischen RabProteinen angewiesen ist. Aber auch für andere intrazelluläre Pathogene
habenInteraktionenmitbestimmtenRabProteineneinegroßeBedeutungfürihrÜberleben
inderZelle.DieInteraktionenunterscheidensichteilweisestarkvondenenderChlamydien.
Die meisten von Makrophagen phagozytierten Organismen werden durch schnellen
Transport von hydrolytischen Enzymen in das Phagosom eliminiert. Durch die gezielte
ManipulationderzellulärenRabProteinfunktionensindintrazellulärePathogeneinderLage,
sowohl dem Transport zu Lysosomen und einer dortigen Degradation zu entkommen, als
auchFaktorenfüreineproduktiveVermehrungabzufangen.
So wurden z.B. für Mycobacterium tuberculosis Interaktionen mit Rab5abhängigen
Transportwegen beschrieben. Durch die Blockade der Phagosomenmaturation im frühen,
Rab5positivenStadiumentgehtMycobacteriumtuberculosisderDegradationinLysosomen.
Des Weiteren erleichtert Rab5 die Versorgung mit Eisen (Kelley und Schorey, 2003).
Zusätzlich konnten den RabProteinen Rab22a und Rab14 eine Rolle in der Hemmung der
Phagosomenreifungzugeordnetwerden(Robertsetal.,2006;Kyeietal.,2006).
Auch die Reifung von Salmonella enterica ist durch Wechselwirkungen mit RabProteinen
reguliert.IneinerRastersuchemitSalmonellaentericaserovarTyphimuriumwurden48Rab
Proteine auf ihre Lokalisation getestet. 18 RabProteine konnten an der
Phagosomenmembran identifiziert werden, darunter die endozytotischen Regulatoren
Rab5A, 5B, 5C, 7A, 11A, und 11B (Smith et al., 2007). Zunächst interagiert die
SalmonellenbeinhaltendeVakuolemitRab5undRab4undzuspäterenZeitpunktenmitden
späten Endosomenmarkern Rab7 und Rab9, allerdings erfolgt keine Degradation in
Lysosomen.
Legionella pneumophila hingegen fängt Vesikel aus dem exozytotischen Transport vom ER
zumGolgiApparatab(KaganundRoy,2002).UntersuchungenzeigteneineRekrutierungder
GTPasenRab1undARF1(ADPribosylationfactor1)zurPhagosomenmembran.Rab1istam
Transport und der Fusion von Vesikeln aus dem ER mit dem ERGIC und cisGolgiApparat
Kompartimenten beteiligt (Allan et al., 2000; Moyer et al., 2001). Über das Typ IV
SekretionssystemvonLegionellapneumophilawirdderGuaninAustauschfaktor(GEF)DrrA
IV.Diskussion
Seite86
sekretiert, der zur Aktivierung von Rab1 an der Membran führt (Murata et al., 2006;
MachnerundIsberg,2006).
Diese Untersuchungen zeigen sehr deutlich, dass das Spezifitätsspektrum, in dem
intrazelluläre Pathogene über RabProteine mit der Wirtszelle kommunizieren und
interagieren sehr breit ist. Im Vergleich zu den oben beschriebenen Pathogenen wurde
interessanterweiseindervorliegendenArbeitkeinsignifikanterEinflussvonRab5undRab4
aufdieEntwicklungderChlamydieninEpithelzelllinienbeobachtet.WelcheBedeutungRab5
und
Rab4
in
Chlamydieninfizierten
Makrophagen
besitzen,
bedarf
weiterer
Untersuchungen. Für Rab6 wurden erstaunlicherweise bisher keine weiteren Interaktionen
mit anderen obligat intrazellulären Pathogenen, außer Chlamydien, beschrieben. Diese
Daten lassen vermuten, dass die Wechselwirkung mit diesem RabProtein auf einen
Chlamydienspezifischen Mechanismus zurück zu führen ist. Die Bestätigung bedarf
allerdings weiterer Analysen. Darüber hinaus könnte die Verwendung des hier
beschriebenen experimentellen Aufbaus eine Analyse zur Relevanz spezieller RabProteine
fürdiebakterielleEntwicklunginweiterenPathogenenermöglichen.
4.3
Funktioneller Ausfall von Rab6 und Rab11 verhindert die Golgin84
abhängigeFragmentierungdesGolgiApparates
ImGegensatzzurFragmentierungdesGolgiApparatesdurcheinechlamydialeInfektionoder
den Verlust von Golginen, hatte der funktionelle Ausfall von Rab6 oder Rab11 in dieser
ArbeiteinengegenteiligenEffektaufdieGolgiStrukturininfiziertenZellen.TrotzInfektion
wurde keine Fragmentierung und Umverteilung von Golgipositiven Elementen um die
Inklusionbeobachtet.UntersuchungenvonRab6inderZellteilungdemonstrierten,dassder
Verlust von Rab6 keinen Effekt auf die Morphologie des GolgiApparates hatte, was
konsistentzudenbeobachtenErgebnissendieserArbeitist(DelNeryetal.,2006;Sunetal.,
2007).
Entsprechend der Blockierung der Chlamydienförderlichen Fragmentierung des Golgi
ApparateshattederVerlustdieserRabProteineeinennegativenEinflussaufdiebakterielle
Replikation. Die Infektivität sank auf die Hälfte im Vergleich zu einer normalen Infektion,
währendderVerlustvonGolgiassoziiertenProteinendurchFragmentierungeineErhöhung
der Infektivität begünstigte. Für die GolgiApparatHomöostase sind beide Transportwege
IV.Diskussion
Seite87
vonentscheidenderBedeutung:Rab6vermitteltdenretrogradenTransportzumER,alsauch
denintraGolgiTransport,währendz.B.p115imanterogradenTransportagiert.DieBalance
beider Routen sichert die Integrität des GolgiBandes. Durch den funktionellen Ausfall von
Rab6 und Rab11 wird das Gleichgewicht des GolgiApparates zwischen Adhärenz und
FragmentierunginRichtungderStabilitätdesGolgiApparatesverschoben.DerVerlustvon
Golgin84,Giantin,oderp115hingegenwirktinRichtungderFragmentierung,wasmitder
Tatsache übereinstimmt, dass diese Proteine eine strukturbildende Funktion besitzen.
FunktionellesRab6undRab11ProteinwärenhingegenfüreineFragmentierungdesGolgi
Apparateserforderlich.
Wie bereits beschrieben, induziert die Infektion mit C.trachomatis die proteolytische
SpaltungdesGolginsGolgin84unddenZerfalldesGolgiApparates(Heueretal.,2008).Die
Analyse in Rab6 und Rab11knock down Zellen ergab keinen Einfluss des funktionellen
Ausfalls von Rab6 oder Rab11 auf das Spaltmuster des Golgins. Dieses Ergebnis legt die
Vermutungnahe,dassdieSpaltungvonGolgin84Rab6bzw.Rab11unabhängigerfolgt.
In der vorliegenden Arbeit wurden desweiteren die Auswirkungen einer simultanen
HerunterregulationinfektivitätsfördernderundhemmenderFaktorenaufdieGolgiStruktur
und die bakterielle Entwicklung untersucht. Dazu wurden stabile Rab6 und Rab11knock
down Zelllinien verwendet, die mittels siRNABehandlung zusätzlich entweder Golgin84
oderp115herunterregulierten.DieErgebnissezeigtenzweiunterschiedlichePhänotypen.Im
simultanen knock down von Rab6 oder Rab11 mit Golgin84 kam es zu keiner Golgi
Fragmentierung. Einheitlich dazu war die Infektivität vergleichbar zu einer normalen
Infektion. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass Rab6 und Rab11 an der Regulation der
Golgin84induzierten GolgiFragmentierung beteiligt sein könnten. Da Golgin84 unter
anderemdiekleineGTPaseRab1bindet,wäredurchausanzunehmen,dassGolgin84auch
mitanderenRabProteinen,wiez.B.Rab11undRab6,Wechselwirkungeneingehenkönnte
(Diao et al., 2003). Die Beteiligung von RabProteinen an der direkten Lokalisierung von
Golginen konnte erst kürzlich demonstriert werden (Burguete et al., 2008). Im speziellen
wurde gezeigt, dass Rab6 das Golgin GCC185 zum TGN rekrutiert. Die Kristallstruktur
offenbarte die Verankerung von Rab6 mittels der GeranylgeranylGruppen am Golgi
Apparat.DerLipidankererreichtedabeidieerstaunlicheReichweitevonbiszu10nm.Durch
Ausbildung eines heterohexamerischen Komplexes mit einer weiteren GTPase, Arl1,
entstandeinestabilePlattformfürdieLokalisierungvonGCC185zumTGNundermöglichte
IV.Diskussion
Seite88
eine Funktion als Anker für ankommende Vesikel. Diese Struktur könnte auch einen
möglichen Mechanismus der RabProteinvermittelten Vesikelbindung an der Golgi
Membran darstellen. Rab6 oder Rab11dekorierte Vesikel würden über Golgin84 zum
GolgiApparat rekrutiert werden und über SNAREPaarungen eine Fusion der Vesikel
einleiten. Der Verlust von Golgin84 durch RNAi entzieht den RabProteinmarkierten
Vesikeln ihren Bindungspartner und resultiert in der Akkumulation von Vesikeln und dem
AuflösenderStruktur.
DerDoppelknockdownmitp115hingegenliefertedenentgegengesetztenPhänotyp.Inder
ImmunfluoreszenzkonnteeindeutigeinfragmentierterGolgiApparatnachgewiesenwerden
und auch die chlamydiale Infektivität war erhöht. Die Erhöhung war vergleichbar mit dem
Einzelknock down von p115. Die p115induzierte Fragmentierung des GolgiApparates
konntenichtdurchdenfunktionellenAusfallvonRab6oderRab11verhindertwerden,was
konsistent zu den Beobachtungen von Sun und Mitarbeitern ist (Sun et al., 2007).
Darüberhinaus war die Erhöhung der chlamydialen Infektivität im simultanen knock down
von Rab6 oder Rab11 und p115 im Vergleich zum alleinigen p115 knock down nicht
beeinträchtigt. Zurzeit kann nicht ausgeschlossen werden, dass p115 einen Rab6 und
Rab11unabhängigenMechanismusderGolgiFragmentierungdarstellt.
4.4
RabProteinesindentscheidendfürdenTransportvonSphingolipiden
indieInklusion
FürdieeffizienteEntwicklungderBakterien,dieAufrechterhaltungunddasWachstumder
Inklusion, rekrutieren Chlamydien Sphingolipide aus dem GolgiApparat der Wirtszelle zur
Inklusion (Hackstadt et al., 1995; Hackstadt et al., 1996). Sphingolipide kommen in allen
Eukaryonten vor, allerdings in nur wenigen Bakterien. Genomanalysen zeigten, dass
ChlamydienGenemithoherHomologiezudenenbesitzen,diefürdieSynthesevonLipiden,
Phosphatidylglycerol und Phosphatidylethanolamin in anderen Organismen verantwortlich
sind (Wylie et al., 1997; Stephens et al., 1998). Allerdings sind sie nicht in der Lage,
Sphingomyelin selbstständig zu synthetisieren, das immerhin 4% der chlamydialen Lipide
ausmacht(Newhall,1988).
In der vorliegenden Arbeit durchgeführte mikroskopische Untersuchungen zum
LipidtransportinlebendenZellenzeigteneinedeutlicheFärbungderBakterieninnerhalbder
IV.Diskussion
Seite89
Inklusion von stabil transduzierten LuciferaseZellen mit dem fluoreszenzmarkierten
Ceramid. Diese Untersuchungen sind konsistent zu den veröffentlichten Daten des
SphingolipidtransportesindieBakterien(Hackstadtetal.,1995;Hackstadtetal.,1996).
Wie die Lipide zur Inklusion und schließlich in die Bakterien gelangen, ist bisher nicht
bekannt. Einerseits könnte die Versorgung durch vesikulären Transport erfolgen,
andererseitskönntenLipidTransferproteine,wiez.B.CERT(ceramidetransferprotein)einen
nichtvesikulärenLipidtransportvermitteln(LipskyundPagano,1985;Futermanetal.,1990;
Hanadaetal.,2003).CERTistfürdenTransportvonimERsynthetisiertenCeramidenzum
GolgiApparat verantwortlich (Hanada et al., 2003). Die CERT PHDomäne (pleckstrin
homology) und das FFAT Motiv (two phenylalanines in an acidic tract) binden in der
aktivierten Form an Phosphatidylinositol 4Phosphat (PI4P) im GolgiApparat und an VAP
(vesicleassociated membrane protein (VAMP)associated protein) im ER. Durch schwingen
der sogenannten START Domäne (steroidogenic acute regulatory proteinrelated lipid
transfer domain), die eine CeramidTransferAktivität besitzt, können Lipide vom ER zum
transGolgi transferiert werden (Hanada et al., 2003). CERT vermittelt allerdings nicht den
Transfer von Sphingosin, Sphingomyelin, Phosphatidylcholin, oder Cholesterol (Kumagai et
al.,2005).DafürsindandereLipidTransferproteinewiez.B.OSBP(oyxsterolbindingprotein),
PhosphoinositolTransferproteine(PITP)oderFAPP2verantwortlich(Wirtz,1991;Godietal.,
2004;Imetal.,2005;Raychaudhurietal.,2006;PerryundRidgway,2006).
DasAuflösenderGolgiStrukturkönntedieKontaktflächenderMembranenfürCERTander
Inklusionvergrößern,waseinengesteigertennichtvesikulärenLipidtransferindieInklusion
zur Folge hätte. Die Fragmentierung des GolgiApparates und das Anlegen von Golgi
Zisternen an die Inklusion könnten aber auch den Vesikeltransport durch
Oberflächenvergrößerung
erhöhen.
Unterstützt
wird
diese
Hypothese
durch
Untersuchungen zum Proteintransport in ungestapelten Zisternen (Wang et al., 2008). Im
GolgiStapel können sich Vesikel nur am Rand der Zisternen bilden. Unterbindet man
hingegendieStapelausbildungdurchInjektionvonAntikörperngegenGRASP65oderdurch
eine dominantaktive Mutante, so können sich mehrere Vesikel, durch die vergrößerte
Oberfläche,effizienterabschnürenunddenProteintransportzurPlasmamembranerhöhen.
Anhand mikroskopischer Analysen wurde die Bedeutung der Blockierung der Golgi
FragmentierungaufdenTransportvonLipidenzurInklusionsmembranuntersucht.Echtzeit
Aufnahmen lebender Rab6 und Rab11knock down Zellen zeigten eine Anreicherung von
IV.Diskussion
Seite90
markiertem Ceramid im GolgiApparat. Im Vergleich zu Kontrolltransfizierten Zellen fand
allerdingskeinTransportüberdieInklusionsmembranzudenBakterienstatt.
Einerseits könnte diese Beobachtung auf die verhinderte GolgiFragmentierung
zurückzuführensein.DieMembranoberflächewürdedadurchnichtvergrößertwerdenund
derbereitsbeschriebenegesteigerteTransfervonLipidenzwischenderGolgiMembranund
der Inklusionsmembran könnte nicht stattfinden. Eine hinreichende Versorgung der
Bakterien mit Lipiden wäre in diesem Fall nicht gewährleistet, was die beobachtete
verminderteAusbildunginfektiöserPartikelzurFolgehätte.
AnderseitskönntedervesikuläreLipidtransportindenRab6oderRab11knockdownZellen
gestörtsein.DasseinRabProteinreguliertervesikulärerLipidtransportdenkbarist,zeigten
UntersuchungenzurBeteiligungvonRabProteinenamTransportvonCholesterolinnerhalb
derZelle.DieCholesterolAufnahmeüberz.B.denLDLRezeptorweg(lowdensitylipoprotein)
unddieSpeicherunginderZellesindstrengüberwacht.StörungeninderFreisetzungführten
zu einer abnormen Ansammlung von Cholesterol in endosomalen Organellen und
resultierten in der vererbten Stoffwechselerkrankung NiemannPick Typ C Syndrom (NPC)
(Pentchevetal.,1994;Chenetal.,2005).DiehierbeibeobachtetehoheAkkumulationvon
Cholesterol in der Zelle konnte durch die Überexpression von Rab7 und Rab9 wieder
aufgelöst werden (Choudhury et al., 2002; Walter et al., 2003). Rab8 konnte zudem eine
Rolle in der Beseitigung von Cholesterol aus endosomalen Organellen zugewiesen werden
(Linderetal.,2007).CholesterolwirdaufseinemTransportweginnerhalbderZellezumER
gebracht, wo es über das Enzym ACAT (AcylCoenzymACholesterol Acyltransferase)
verestert und in Lipidtröpfchen gespeichert wird (Mukherjee et al., 1958; Goodman et al.,
1964;Brownetal.,1980).Rab11istfürdieAufnahmeunddenTransportvonCholesterolzu
den RecyclingEndosomen zuständig (HolttaVuori et al., 2002). Bei Überexpression von
Rab11kameszueinerRückhaltungvonCholesterolinRecyclingEndosomendurchStörung
des Transportes zurück an die Plasmamembran und einer Hemmung der Veresterung.
Gleichzeitig wurde gezeigt, dass die Expression von Rab6 die Cholesterolveresterung in
Zellen,dieinLipoproteindefizientenSerumkultiviertwurden,steigerte.DerRab6regulierte
retrogradeTransportwürdeCholesterolzumERbringen,woACATseineFunktionausführen
könnte(HolttaVuorietal.,2002).
Die Aufnahme von Cholesterol ist für den Aufbau der ChlamydienZellwand notwendig
(Carabeoetal.,2003).DabeisinddieBakterieninderLagesowohldenovosynthetisiertes,
IV.Diskussion
Seite91
alsauchüberLDLaufgenommenesCholesterolderWirtszellezubenutzen.Eswäredenkbar,
dass Rab6 und Rab11positive Vesikel Cholesterol, Sphingolipide und andere Lipide zur
Inklusionsmembran transportieren, die als Rohstofflager für den Aufbau von neuen
Membranen dienen. Der Verlust der untersuchten Proteine Rab6 und Rab11 könnte durch
Blockade der GolgiFragmentierung zu einem Rückhalten der Lipide im GolgiApparat und
somit einer Störung des Transportes in die Inklusion führen. Die resultierende
UnterversorgungmitnotwendigenLipidenwürdediebeobachteteEntwicklungsstörungder
BakterienindenelektronenmikroskopischenAufnahmenerklären.
4.5
ModellzurRegulationderChlamydieninduziertenGolgi
FragmentierungdurchRabProteine
DieErgebnissedieserArbeitlassensichinfolgendesModelleinordnen(Abb.4.1):
AmTGNdesGolgiApparateswerdennichtnurRab6undRab11dekorierteVesikelausder
endosomalen Route verankert, sondern können auch abgeschnürt werden. Die Balance
zwischen austretendem und ankommendem Transportgut, wird durch retrograden, Rab
ProteinvermitteltenVesikeltransportgewährleistet.DabeibindenRab6undRab11Vesikel
andasvolleLängecisGolgiProteinGolgin84.
Eine Infektion mit Chlamydien induziert die Fragmentierung des GolgiApparates durch
Spaltung des Strukturproteins Golgins84. An gespaltenes Golgin84 können Rab6 und
Rab11dekorierteVesikelnichtbindenundverlierendadurchihrenBindungspartneramcis
Golgi. Diese Vesikel werden nun an die Inklusionsmembran geführt, wo sie vermutlich an
IncProteinebindenundihrTransportgutundLipideindieInklusionentlassen.
EinähnlichesSzenarioerfolgtbeiderHerunterregulationvonGolgin84.DerVerlustentzieht
Rab6undRab11VesikelndenBindungspartner.BereitszumZeitpunktderInfektionliegen
eine Vielzahl von vesikulären GolgiStrukturen in der Zelle vor, die zur Inklusion rekrutiert
werden können. Die Vergrößerung der Oberfläche der GolgiMembranen (Vesikeln) an der
Inklusionsmembran erlaubt die effiziente und schnelle Übertragung von wichtigen
NährstoffenzudenBakterien;dieInfektivitätsteigt.
ImGegensatzdazublockiertderVerlustvonRab6oderRab11unddersimulanteVerlustvon
RabProteinen und Golgin84 die GolgiFragmentierung. Unter diesen Umständen können
Golgiabgeleitete RabVesikel nicht mehr gebildet werden. Der damit verbundene Verlust
IV.Diskussion
Seite92
von Rabpositiven Vesikeln an der Inklusionsmembran resultiert in einer Unterversorgung
der Bakterien mit wichtigen Sphingolipiden und anderen Nährstoffen und führt zu einer
gestörtenReplikationderChlamydien.
Abb.4.1ModellzurRollevonRab6,Rab11undGolgin84aufdieGolgiMorphologieunddiechlamydiale
Entwicklung
(A, B) Chlamydien induzieren eine Fragmentierung des GolgiApparates durch Spaltung von Golgin84.
Durch Blockierung der Bindung an gespaltenes Golgin84, bzw. bei Verlust von Golgin84, akkumulieren
Rab6 und Rab11Vesikel und werden zur Inklusion rekrutiert. Dieses hat einen positiven Effekt auf die
bakterielle Vermehrung. (C, D) Der funktionelle Ausfall von Rab6 oder Rab11, bzw. die simultane
HerunterrregulationvonRab6oderRab11undGolgin84stabilisiertdieGolgiStrukturdurchausbleibende
Vesikelbildung.DerTransportdieserVesikelzurInklusionbleibtaus;dieInfektivitätsinkt.
IV.Diskussion
4.6
Seite93
Ausblick
Die Ergebnisse dieser Arbeit beschreiben die Auswirkungen des Verlustes von spezifischen
Wirtszellproteinen auf die Entwicklung von Chlamydien. Die hier untersuchte Abhängigkeit
derchlamydialenVermehrungsratemitderRab6undRab11vermitteltenStrukturänderung
des GolgiApparates, sind ein weiterer Schritt hin zu einem tieferen Verständnis der Wirt
PathogenInteraktionen.
Ein großes Problem in der Behandlung von ChlamydienInfektionen mit Antibiotika ist der
mögliche Eintritt des Bakteriums in ein persistentes Stadium, indem es überlebensfähig
bleibt und nach Beenden der Therapie wieder in eine akute Infektion münden kann. Da
Chlamydienzurzeitnichtgenetischmanipuliertwerdenkönnen,bietetdieRNAInterferenz
eine gute Möglichkeit neue zelluläre Faktoren zu identifizieren, welche die chlamydiale
Entwicklung und Vermehrung wirkungsvoll schädigen. Die Blockierung der Golgi
Fragmentierung durch funktionellen Ausfall von Rab6 und Rab11 könnte als anti
chlamydialer Mechanismus genutzt werden, um eine Infektion und das Risiko einer
Chlamydienassoziierten Erkrankung zu mindern. In Kombination mit massen
spektrometrischen Untersuchungen könnten zusätzlich spezifische Bindungspaarungen
zwischen Wirt und Pathogen aufgedeckt werden, die für eine effiziente Versorgung der
InklusionmitnährstoffreichenVesikelnverantwortlichsind.DerenfunktionellesAusschalten
könnte einen Vorteil für die gezielte Behandlung bieten. Eine interessante Aufgabe für
weiterführende Experimente wäre somit die Identifizierung möglicher Rezeptoren oder
SNAREs auf der Oberfläche der Inklusion für die Bindung ankommender RabProtein
markierterVesikel.EineputativeRollevonIncGundCpn0585alsBindungspartnerfürRab11
Vesikelsollteunbedingteingehenderuntersuchtwerden.
In dieser Arbeit konnten nicht nur direkte Einflüsse auf die Chlamydien demonstriert
werden, sondern auch neue Erkenntnisse zur Funktion des GolgiApparates gewonnen
werden.DieErforschungderstrukturellenIntegritätdesGolgiApparatesunddieAufklärung
derMechanismenzurZerlegungdesGolgiApparatessindvonhohemklinischenInteresse.In
Patienten mit der neurodegenerativen Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS)
wurden fragmentierte GolgiApparate in den geschädigten Motorneuronen nachgewiesen
(Mourelatosetal.,1990;Gonatasetal.,2006).ÄhnlicheLäsionenwurdenaußerdemauchin
der AlzheimerKrankheit und CreutzfeldtJacobKrankheit beobachtet (Stieber et al., 1996;
IV.Diskussion
Seite94
Sakurai et al., 2000). Die Verhinderung der GolgiFragmentierung durch spezifisches
Ausschalten von zellulären RabProteinen, wie z.B. Rab6 und Rab11 könnte zu neuen
TherapieansätzenbeiderBehandlungdieserKrankheitenführen.
Die LipidUntersuchungen in Chlamydieninfizierten Zellen unterstrichen zudem die
Bedeutung des Transportes und der Transfermechanismen von Lipiden und
Sphingolipidvorläufern,wieCeramiden,durchdieInklusionsmembranzudenBakterien.Eine
Aufklärung dieser Wege könnte zur Entwicklung neuer antichlamydialer LipidDerivate
beitragen.DiesetherapeutischenAgenzienkönntengezieltdieInklusionerfassen,inbzw.an
dieserakkumulierenunddenSphingolipidTransportundMetabolismuseffektivstören.Die
Schädigung der chlamydialen Replikation und des Wachstum würden eine kontrollierte
BehandlungderInfektionermöglichen.
Zusammenfassend liefern die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit nicht nur neue
ErkenntnisseimVerständnisundderTherapievonChlamydienInfektionenundChlamydien
assoziierten Krankheiten, sondern können auch zu neuen Einsichten in der Strategie einer
erfolgreichenVermehrungandererintrazellulärerPathogenebeitragen.
V.Literaturverzeichnis
Seite95
V.LITERATURVERZEICHNIS
Al Younes, H.M., T.Rudel, V.Brinkmann, A.J.Szczepek und T.F.Meyer. 2001. Low iron availability
modulatesthecourseofChlamydiapneumoniaeinfection.CellMicrobiol.3:427437.
AlYounes,H.M.,T.RudelundT.F.Meyer.1999.Characterizationandintracellulartraffickingpattern
ofvacuolescontainingChlamydiapneumoniaeinhumanepithelialcells.CellMicrobiol.1:237247.
Allan, B.B., B.D.Moyer und W.E.Balch. 2000. Rab1 recruitment of p115 into a cisSNARE complex:
programmingbuddingCOPIIvesiclesforfusion.Science289:444448.
Allison,A.C.undP.Davies.1974.Mechanismsofendocytosisandexocytosis.Symp.Soc.Exp.Biol.419
446.
Amann, R., N.Springer, W.Schonhuber, W.Ludwig, E.N.Schmid, K.D.Muller und R.Michel. 1997.
ObligateintracellularbacterialparasitesofacanthamoebaerelatedtoChlamydiaspp.Appl.Environ.
Microbiol.63:115121.
Antonny,B.,D.Madden,S.Hamamoto,L.OrciundR.Schekman.2001.DynamicsoftheCOPIIcoatwith
GTPandstableanalogues.Nat.CellBiol.3:531537.
Antony, C., C.Cibert, G.Geraud, M.A.Santa, B.Maro, V.Mayau und B.Goud. 1992. The small GTP
bindingproteinrab6pisdistributedfrommedialGolgitothetransGolginetworkasdeterminedbya
confocalmicroscopicapproach.J.CellSci.103(Pt3):785796.
Bannantine, J.P. und D.D.Rockey. 1999. Use of primate model system to identify Chlamydia
trachomatisproteinantigensrecognizeduniquelyinthecontextofinfection.Microbiology145(Pt
8):20772085.
Bannantine, J.P., W.E.Stamm, R.J.Suchland und D.D.Rockey. 1998. Chlamydia trachomatis IncA is
localized to the inclusion membrane and is recognized by antisera from infected humans and
primates.Infect.Immun.66:60176021.
Barlowe, C., L.Orci, T.Yeung, M.Hosobuchi, S.Hamamoto, N.Salama, M.F.Rexach, M.Ravazzola,
M.Amherdt und R.Schekman. 1994. COPII: a membrane coat formed by Sec proteins that drive
vesiclebuddingfromtheendoplasmicreticulum.Cell77:895907.
Barlowe, C. und R.Schekman. 1993. SEC12 encodes a guaninenucleotideexchange factor essential
fortransportvesiclebuddingfromtheER.Nature365:347349.
Barr, F.A., M.Puype, J.Vandekerckhove und G.Warren. 1997. GRASP65, a protein involved in the
stackingofGolgicisternae.Cell91:253262.
Barr,F.A.undB.Short.2003.GolginsinthestructureanddynamicsoftheGolgiapparatus.Curr.Opin.
CellBiol.15:405413.
Barr,F.A.undG.Warren.1996.DisassemblyandreassemblyoftheGolgiapparatus.SeminarsinCell
&DevelopmentalBiology7:505510.
Beard,M.,A.Satoh,J.ShorterundG.Warren.2005.AcrypticRab1bindingsiteinthep115tethering
protein.J.Biol.Chem.280:2584025848.
V.Literaturverzeichnis
Seite96
Beatty, W.L., G.I.Byrne und R.P.Morrison. 1993. Morphologic and antigenic characterization of
interferongammamediatedpersistentChlamydiatrachomatisinfectioninvitro.Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A90:39984002.
Beatty, W.L., R.P.Morrison und G.I.Byrne. 1994. Persistent chlamydiae: from cell culture to a
paradigmforchlamydialpathogenesis.Microbiol.Rev.58:686699.
Belland, R.J., S.P.Ouellette, J.Gieffers und G.I.Byrne. 2004. Chlamydia pneumoniae and
atherosclerosis.CellMicrobiol.6:117127.
Beznoussenko, G.V. und A.A.Mironov. 2002. Models of intracellular transport and evolution of the
Golgicomplex.Anat.Rec.268:226238.
Bock, J.B., H.T.Matern, A.A.Peden und R.H.Scheller. 2001. A genomic perspective on membrane
compartmentorganization.Nature409:839841.
Bonfanti, L., A.A.Mironov, Jr., J.A.MartinezMenarguez, O.Martella, A.Fusella, M.Baldassarre,
R.Buccione,H.J.Geuze,A.A.MironovundA.Luini.1998.ProcollagentraversestheGolgistackwithout
leavingthelumenofcisternae:evidenceforcisternalmaturation.Cell95:9931003.
Borel, N., R.Thoma, P.Spaeni, R.Weilenmann, K.Teankum, E.Brugnera, D.R.Zimmermann, L.Vaughan
und A.Pospischil. 2006. Chlamydiarelated abortions in cattle from Graubunden, Switzerland. Vet.
Pathol.43:702708.
Brown, M.S., Y.K.Ho und J.L.Goldstein. 1980. The cholesteryl ester cycle in macrophage foam cells.
Continualhydrolysisandreesterificationofcytoplasmiccholesterylesters.J.Biol.Chem.255:9344
9352.
Burguete, A.S., T.D.Fenn, A.T.Brunger und S.R.Pfeffer. 2008. Rab and Arl GTPase family members
cooperateinthelocalizationofthegolginGCC185.Cell132:286298.
Bush, R.M. und K.D.Everett. 2001. Molecular evolution of the Chlamydiaceae. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol.51:203220.
Carabeo, R.A., D.J.Mead und T.Hackstadt. 2003. Golgidependent transport of cholesterol to the
Chlamydiatrachomatisinclusion.PNAS100:67716776.
Chang, T.Y., C.C.Chang, N.Ohgami und Y.Yamauchi. 2006. Cholesterol sensing, trafficking, and
esterification.Annu.Rev.CellDev.Biol.22:129157.
Chen,F.W.,R.E.GordonundY.A.Ioannou.2005.NPC1lateendosomescontainelevatedlevelsofnon
esterified ('free') fatty acids and an abnormally glycosylated form of the NPC2 protein. Biochem. J.
390:549561.
Choudhury,A.,M.Dominguez,V.Puri,D.K.Sharma,K.Narita,C.L.Wheatley,D.L.MarksundR.E.Pagano.
2002. Rab proteins mediate Golgi transport of caveolainternalized glycosphingolipids and correct
lipidtraffickinginNiemannPickCcells.J.Clin.Invest109:15411550.
Clifton, D.R., C.A.Dooley, S.S.Grieshaber, R.A.Carabeo, K.A.Fields und T.Hackstadt. 2005. Tyrosine
phosphorylation of the chlamydial effector protein Tarp is species specific and not required for
recruitmentofactin.Infect.Immun.73:38603868.
V.Literaturverzeichnis
Seite97
Clifton, D.R., K.A.Fields, S.S.Grieshaber, C.A.Dooley, E.R.Fischer, D.J.Mead, R.A.Carabeo und
T.Hackstadt.2004.AchlamydialtypeIIItranslocatedproteinistyrosinephosphorylatedatthesiteof
entryandassociatedwithrecruitmentofactin.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A101:1016610171.
Cluett, E.B. und W.J.Brown. 1992. Adhesion of Golgi cisternae by proteinaceous interactions:
intercisternalbridgesasputativeadhesivestructures.J.CellSci.103(Pt3):773784.
Cole, N.B., N.Sciaky, A.Marotta, J.Song und J.LippincottSchwartz. 1996. Golgi dispersal during
microtubuledisruption:regenerationofGolgistacksatperipheralendoplasmicreticulumexitsites.
Mol.Biol.Cell7:631650.
Cortes, C., K.A.Rzomp, A.Tvinnereim, M.A.Scidmore und B.Wizel. 2007. Chlamydia pneumoniae
inclusionmembraneproteinCpn0585interactswithmultipleRabGTPases.Infect.Immun.75:5586
5596.
Crowther,R.A.undB.M.Pearse.1981.Assemblyandpackingofclathrinintocoats.J.CellBiol.91:790
797.
Cuif, M.H., F.Possmayer, H.Zander, N.Bordes, F.Jollivet, CouedelCourt, I.JanoueixLerosey,
G.Langsley,M.BornensundB.Goud.1999.CharacterizationofGAPCenA,aGTPaseactivatingprotein
forRab6,partofwhichassociateswiththecentrosome.EMBOJ.18:17721782.
Del Nery, E., S.MisereyLenkei, T.Falguieres, C.Nizak, L.Johannes, F.Perez und B.Goud. 2006. Rab6A
andRab6A'GTPasesplaynonoverlappingrolesinmembranetrafficking.Traffic.7:394407.
Delevoye, C., M.Nilges, A.DautryVarsat und A.Subtil. 2004. Conservation of the biochemical
properties of IncA from Chlamydia trachomatis and Chlamydia caviae: oligomerization of IncA
mediatesinteractionbetweenfacingmembranes.J.Biol.Chem.279:4689646906.
Delevoye, C.+., M.Nilges, P.Dehoux, F.Paumet, S.p.Perrinet, A.DautryVarsat und A.Subtil. 2008.
SNAREProteinMimicrybyanIntracellularBacterium.PLoSPathog4:e1000022.
Diao, A., D.Rahman, D.J.Pappin, J.Lucocq und M.Lowe. 2003. The coiledcoil membrane protein
golgin84isanovelrabeffectorrequiredforGolgiribbonformation.J.CellBiol.160:201212.
DiracSvejstrup, A.B., T.Sumizawa und S.R.Pfeffer. 1997. Identification of a GDI displacement factor
thatreleasesendosomalRabGTPasesfromRabGDI.EMBOJ.16:465472.
Echard, A., F.Jollivet, O.Martinez, J.J.Lacapere, A.Rousselet, I.JanoueixLerosey und B.Goud. 1998.
InteractionofaGolgiassociatedkinesinlikeproteinwithRab6.Science279:580585.
Echard, A., F.J.Opdam, H.J.de Leeuw, F.Jollivet, P.Savelkoul, W.Hendriks, J.Voorberg, B.Goud und
J.A.Fransen.2000.AlternativesplicingofthehumanRab6Agenegeneratestwoclosebutfunctionally
differentisoforms.Mol.Biol.Cell11:38193833.
Elbashir, S.M., J.Harborth, W.Lendeckel, A.Yalcin, K.Weber und T.Tuschl. 2001a. Duplexes of 21
nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature411:494498.
Elbashir, S.M., W.Lendeckel und T.Tuschl. 2001b. RNA interference is mediated by 21 and 22
nucleotideRNAs.GenesDev.15:188200.
Elsner, M., H.Hashimoto und T.Nilsson. 2003. Cisternal maturation and vesicle transport: join the
bandwagon!(Review).Mol.Membr.Biol.20:221229.
V.Literaturverzeichnis
Seite98
Elwell,C.undJ.N.Engel.2005.DrosophilamelanogasterS2cells:amodelsystemtostudyChlamydia
interactionwithhostcells.CellMicrobiol.7:725739.
Elwell,C.A.,A.Ceesay,J.H.Kim,D.KalmanundJ.N.Engel.2008.RNAinterferencescreenidentifiesAbl
kinaseandPDGFRsignalinginChlamydiatrachomatisentry.PLoS.Pathog.4:e1000021.
Everett, K.D., R.M.Bush und A.A.Andersen. 1999. Emended description of the order Chlamydiales,
proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one
monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five
newspecies,andstandardsfortheidentificationoforganisms.Int.J.Syst.Bacteriol.49Pt2:415440.
Faro,S.1985.Chlamydiatrachomatisinfectioninwomen.J.Reprod.Med.30:273278.
Farquhar, M.G. und G.E.Palade. 1998. The Golgi apparatus: 100 years of progress and controversy.
TrendsCellBiol.8:210.
Fasshauer,D.,H.Otto,W.K.Eliason,R.JahnundA.T.Brunger.1997.Structuralchangesareassociated
with soluble Nethylmaleimidesensitive fusion protein attachment protein receptor complex
formation.J.Biol.Chem.272:2803628041.
Fire, A., S.Xu, M.K.Montgomery, S.A.Kostas, S.E.Driver und C.C.Mello. 1998. Potent and specific
geneticinterferencebydoublestrandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391:806811.
Ford, M.G.J., I.G.Mills, B.J.Peter, Y.Vallis, G.J.K.Praefcke, P.R.Evans und H.T.McMahon. 2002.
Curvatureofclathrincoatedpitsdrivenbyepsin.Nature419:361366.
Friis,R.R.1972.InteractionofLcellsandChlamydiapsittaci:entryoftheparasiteandhostresponses
toitsdevelopment.J.Bacteriol.110:706721.
Fritsche, T.R., M.Horn, M.Wagner, R.P.Herwig, K.H.Schleifer und R.K.Gautom. 2000. Phylogenetic
diversity among geographically dispersed Chlamydiales endosymbionts recovered from clinical and
environmentalisolatesofAcanthamoebaspp.Appl.Environ.Microbiol.66:26132619.
Fukui, K., T.Sasaki, K.Imazumi, Y.Matsuura, H.Nakanishi und Y.Takai. 1997. Isolation and
characterizationofaGTPaseactivatingproteinspecificfortheRab3subfamilyofsmallGproteins.J.
Biol.Chem.272:46554658.
Futerman, A.H. und H.Riezman. 2005. The ins and outs of sphingolipid synthesis. Trends Cell Biol.
15:312318.
Futerman, A.H., B.Stieger, A.L.Hubbard und R.E.Pagano. 1990. Sphingomyelin synthesis in rat liver
occurspredominantlyatthecisandmedialcisternaeoftheGolgiapparatus.J.Biol.Chem.265:8650
8657.
Gambhir, M., M.G.Basanez, F.Turner, J.Kumaresan und N.C.Grassly. 2007. Trachoma: transmission,
infection,andcontrol.LancetInfect.Dis.7:420427.
Gillingham, A.K. und S.Munro. 2003. Long coiledcoil proteins and membrane traffic. Biochim.
Biophys.Acta1641:7185.
Godi, A., A.Di Campli, A.Konstantakopoulos, G.Di Tullio, D.R.Alessi, G.S.Kular, T.Daniele, P.Marra,
J.M.Lucocq und M.A.De Matteis. 2004. FAPPs control Golgitocellsurface membrane traffic by
bindingtoARFandPtdIns(4)P.Nat.CellBiol.6:393404.
V.Literaturverzeichnis
Seite99
Gonatas, N.K., A.Stieber und J.O.Gonatas. 2006. Fragmentation of the Golgi apparatus in
neurodegenerativediseasesandcelldeath.J.Neurol.Sci.246:2130.
Goodman, D.S., D.Deykin und T.Shiratori. 1964. The formation of cholesterol esters with rat liver
enzymes.J.Biol.Chem.239:13351345.
Goud,B.,A.Zahraoui,A.TavitianundJ.Saraste.1990.SmallGTPbindingproteinassociatedwithGolgi
cisternae.Nature345:553556.
Grasse,P.P.1957.[Ultrastructure,polarityandreproductionofGolgiapparatus.].C.R.Hebd.Seances
Acad.Sci.245:12781281.
Grayston, J.T. 2000. Background and current knowledge of Chlamydia pneumoniae and
atherosclerosis.J.Infect.Dis.181Suppl3:S402S410.
Grieshaber,S.S.,N.A.GrieshaberundT.Hackstadt.2003.Chlamydiatrachomatisuseshostcelldynein
to traffic to the microtubuleorganizing center in a p50 dynamitinindependent process. J. Cell Sci.
116:37933802.
Griffiths, G. und K.Simons. 1986. The trans Golgi network: sorting at the exit site of the Golgi
complex.Science234:438443.
Grosshans, B.L., D.Ortiz und P.Novick. 2006. Rabs and their effectors: achieving specificity in
membranetraffic.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A103:1182111827.
Hackstadt, T., D.D.Rockey, R.A.Heinzen und M.A.Scidmore. 1996. Chlamydia trachomatis interrupts
an exocytic pathway to acquire endogenously synthesized sphingomyelin in transit from the Golgi
apparatustotheplasmamembrane.EMBOJ.15:964977.
Hackstadt, T., M.A.Scidmore und D.D.Rockey. 1995. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis
infected cells: directed trafficking of Golgiderived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A92:48774881.
Hackstadt, T., M.A.ScidmoreCarlson, E.I.Shaw und E.R.Fischer. 1999. The Chlamydia trachomatis
IncAproteinisrequiredforhomotypicvesiclefusion.CellMicrobiol.1:119130.
Halberstaedter,L.undS.VonProwazek.1907.ÜberZelleinschlüsseparasitärerNaturbeimTrachom.
ArbeitenausdemKaiserlichenGesundheitsamte26:4447.
Hanada,K.,K.Kumagai,S.Yasuda,Y.Miura,M.Kawano,M.FukasawaundM.Nishijima.2003.Molecular
machineryfornonvesiculartraffickingofceramide.Nature426:803809.
Hannon,G.J.2002.RNAinterference.Nature418:244251.
Hatch, G.M. und G.McClarty. 1998. Phospholipid composition of purified Chlamydia trachomatis
mimicsthatoftheeucaryotichostcell.Infect.Immun.66:37273735.
Hauri,H.P.,F.Kappeler,H.AnderssonundC.Appenzeller.2000.ERGIC53andtrafficinthesecretory
pathway.J.CellSci.113(Pt4):587596.
Hauri, H.P. und A.Schweizer. 1992. The endoplasmic reticulumGolgi intermediate compartment.
Curr.Opin.CellBiol.4:600608.
V.Literaturverzeichnis
Seite100
Heinzen, R.A., M.A.Scidmore, D.D.Rockey und T.Hackstadt. 1996. Differential interaction with
endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and
Chlamydiatrachomatis.Infect.Immun.64:796809.
Heuer,D.,A.RejmanLipinski,N.Machuy,A.Karlas,A.Wehrens,F.Siedler,V.BrinkmannundT.F.Meyer.
2008. Chlamydia causes fragmentation of the Golgi compartment to ensure reproduction. Nature
akzeptiert.
Hirokawa, N., R.SatoYoshitake, N.Kobayashi, K.K.Pfister, G.S.Bloom und S.T.Brady. 1991. Kinesin
associateswithanterogradelytransportedmembranousorganellesinvivo.J.CellBiol.114:295302.
Hodinka, R.L., C.H.Davis, J.Choong und P.B.Wyrick. 1988. Ultrastructural study of endocytosis of
ChlamydiatrachomatisbyMcCoycells.Infect.Immun.56:14561463.
HolttaVuori,M.,K.Tanhuanpaa,W.Mobius,P.SomerharjuundE.Ikonen.2002.Modulationofcellular
cholesteroltransportandhomeostasisbyRab11.MolBiolCell13:31073122.
Horn, M., M.Wagner, K.D.Muller, E.N.Schmid, T.R.Fritsche, K.H.Schleifer und R.Michel. 2000.
Neochlamydia hartmannellae gen. nov., sp. nov. (Parachlamydiaceae), an endoparasite of the
amoebaHartmannellavermiformis.Microbiology146(Pt5):12311239.
Huesken,D., J.Lange,C.Mickanin,J.Weiler,F.Asselbergs,J.Warner,B.Meloon,S.Engel,A.Rosenberg,
D.Cohen, M.Labow, M.Reinhardt, F.Natt und J.Hall. 2005. Design of a genomewide siRNA library
usinganartificialneuralnetwork.Nat.Biotechnol.23:9951001.
Hybiske, K. und R.S.Stephens. 2007a. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into
nonphagocyticcells.Infect.Immun.75:39253934.
Hybiske, K. und R.S.Stephens. 2007b. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium
Chlamydia.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A104:1143011435.
Hybiske, K. und R.S.Stephens. 2008. Exit strategies of intracellular pathogens. Nat Rev Micro 6:99
110.
Im,Y.J.,S.Raychaudhuri,W.A.PrinzundJ.H.Hurley.2005.Structuralmechanismforsterolsensingand
transportbyOSBPrelatedproteins.Nature437:154158.
Jackson, A.L., S.R.Bartz, J.Schelter, S.V.Kobayashi, J.Burchard, M.Mao, B.Li, G.Cavet und P.S.Linsley.
2003.ExpressionprofilingrevealsofftargetgeneregulationbyRNAi.Nat.Biotechnol.21:635637.
Kagan, J.C. und C.R.Roy. 2002. Legionella phagosomes intercept vesicular traffic from endoplasmic
reticulumexitsites.Nat.CellBiol.4:945954.
Kelley, V.A. und J.S.Schorey. 2003. Mycobacterium's arrest of phagosome maturation in
macrophagesrequiresRab5activityandaccessibilitytoiron.Mol.Biol.Cell14:33663377.
Kent,C.1995.Eukaryoticphospholipidbiosynthesis.Annu.Rev.Biochem.64:315343.
Kumagai, K., S.Yasuda, K.Okemoto, M.Nishijima, S.Kobayashi und K.Hanada. 2005. CERT mediates
intermembranetransferofvariousmolecularspeciesofceramides.J.Biol.Chem.280:64886495.
Kyei,G.B.,I.Vergne,J.Chua,E.Roberts,J.Harris,J.R.JunutulaundV.Deretic.2006.Rab14iscriticalfor
maintenanceofMycobacteriumtuberculosisphagosomematurationarrest.EMBOJ.25:52505259.
V.Literaturverzeichnis
Seite101
Lesa, G.M., J.Seemann, J.Shorter, J.Vandekerckhove und G.Warren. 2000. The aminoterminal
domainofthegolgiproteingiantininteractsdirectlywiththevesicletetheringproteinp115.J.Biol.
Chem.275:28312836.
Letourneur, F., E.C.Gaynor, S.Hennecke, C.Demolliere, R.Duden, S.D.Emr, H.Riezman und P.Cosson.
1994. Coatomer is essential for retrieval of dilysinetagged proteins to the endoplasmic reticulum.
Cell79:11991207.
Linder, M.D., R.L.Uronen, M.HolttaVuori, P.van der Sluijs, J.Peranen und E.Ikonen. 2007. Rab8
dependentrecyclingpromotesendosomalcholesterolremovalinnormalandsphingolipidosiscells.
MolBiolCell18:4756.
Lipsky,N.G.undR.E.Pagano.1985.Intracellulartranslocationoffluorescentsphingolipidsincultured
fibroblasts: endogenously synthesized sphingomyelin and glucocerebroside analogues passthrough
theGolgiapparatusenroutetotheplasmamembrane.J.CellBiol.100:2734.
Losev,E.,C.A.Reinke,J.Jellen,D.E.Strongin,B.J.BevisundB.S.Glick.2006.Golgimaturationvisualized
inlivingyeast.Nature441:10021006.
Lowe, M., C.Rabouille, N.Nakamura, R.Watson, M.Jackman, E.Jamsa, D.Rahman, D.J.Pappin und
G.Warren. 1998. Cdc2 kinase directly phosphorylates the cisGolgi matrix protein GM130 and is
requiredforGolgifragmentationinmitosis.Cell94:783793.
Machner, M.P. und R.R.Isberg. 2006. Targeting of host Rab GTPase function by the intravacuolar
pathogenLegionellapneumophila.Dev.Cell11:4756.
Machuy, N., B.Thiede, K.Rajalingam, C.Dimmler, O.Thieck, T.F.Meyer und T.Rudel. 2005. A Global
Approach Combining Proteome Analysis and Phenotypic Screening with RNA Interference Yields
NovelApoptosisRegulators.MolCellProteomics4:4455.
Mallard,F.,B.L.Tang,T.Galli,D.Tenza,A.SaintPol,X.Yue,C.Antony,W.Hong,B.GoudundL.Johannes.
2002. Early/recycling endosomestoTGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6
isoform.J.CellBiol.156:653664.
Mallik,R.undS.P.Gross.2004.Molecularmotors:strategiestogetalong.Curr.Biol.14:R971R982.
Malsam, J., A.Satoh, L.Pelletier und G.Warren. 2005. Golgin tethers define subpopulations of COPI
vesicles.Science307:10951098.
Marra,P.,L.Salvatore,A.Mironov,Jr.,A.DiCampli,G.DiTullio,A.Trucco,G.Beznoussenko,A.Mironov
undM.A.DeMatteis.2007.ThebiogenesisoftheGolgiribbon:therolesofmembraneinputfromthe
ERandofGM130.Mol.Biol.Cell18:15951608.
MartinezMenarguez, J.A., H.J.Geuze, J.W.Slot und J.Klumperman. 1999. Vesicular tubular clusters
between the ER and Golgi mediate concentration of soluble secretory proteins by exclusion from
COPIcoatedvesicles.Cell98:8190.
MartinezMenarguez, J.A., R.Prekeris, V.M.Oorschot, R.Scheller, J.W.Slot, H.J.Geuze und
J.Klumperman.2001.PeriGolgivesiclescontainretrogradebutnotanterogradeproteinsconsistent
withthecisternalprogressionmodelofintraGolgitransport.J.CellBiol.155:12131224.
V.Literaturverzeichnis
Seite102
Matanis,T.,A.Akhmanova,P.Wulf,E.DelNery,T.Weide,T.Stepanova,N.Galjart,F.Grosveld,B.Goud,
C.I.DeZeeuw,A.BarnekowundC.C.Hoogenraad.2002.BicaudalDregulatesCOPIindependentGolgi
ERtransportbyrecruitingthedyneindynactinmotorcomplex.Nat.CellBiol.4:986992.
Mehta, S.J., R.D.Miller, J.A.Ramirez und J.T.Summersgill. 1998. Inhibition ofChlamydia pneumoniae
replication in HEp2 cells by interferongamma: role of tryptophan catabolism. J. Infect. Dis.
177:13261331.
Mironov,A.A.,G.V.Beznoussenko,P.Nicoziani,O.Martella,A.Trucco,H.S.Kweon,D.DiGiandomenico,
R.S.Polishchuk,A.Fusella,P.Lupetti,E.G.Berger,W.J.Geerts,A.J.Koster,K.N.BurgerundA.Luini.2001.
SmallcargoproteinsandlargeaggregatescantraversetheGolgibyacommonmechanismwithout
leavingthelumenofcisternae.J.CellBiol.155:12251238.
MisereyLenkei, S., F.Waharte, A.Boulet, M.H.Cuif, D.Tenza, A.El Marjou, G.Raposo, J.Salamero,
L.Heliot, B.Goud und S.Monier. 2007. Rab6interacting protein 1 links Rab6 and Rab11 function.
Traffic.8:13851403.
Monier, S., F.Jollivet, I.JanoueixLerosey, L.Johannes und B.Goud. 2002. Characterization of novel
Rab6interactingproteinsinvolvedinendosometoTGNtransport.Traffic.3:289297.
Moorhead,A.R.,K.A.RzompundM.A.Scidmore.2007.TheRab6effectorBicaudalD1associateswith
Chlamydiatrachomatisinclusionsinabiovarspecificmanner.InfectImmun.
Moulder,J.W.1991.Interactionofchlamydiaeandhostcellsinvitro.Microbiol.Rev.55:143190.
Mourelatos,Z.,H.Adler,A.Hirano,H.Donnenfeld,J.O.GonatasundN.K.Gonatas.1990.Fragmentation
of the Golgi apparatus of motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis revealed by organelle
specificantibodies.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A87:43934395.
Moyer, B.D., B.B.Allan und W.E.Balch. 2001. Rab1 interaction with a GM130 effector complex
regulatesCOPIIvesiclecisGolgitethering.Traffic.2:268276.
Mukherjee, S., G.Kunitake und R.B.Alfinslater. 1958. The esterification of cholesterol with palmitic
acidbyratliverhomogenates.J.Biol.Chem.230:9196.
Munro,S.2005.TheGolgiapparatus:definingtheidentityofGolgimembranes.Curr.Opin.CellBiol.
17:395401.
Murata,T.,A.Delprato,A.Ingmundson,D.K.Toomre,D.G.LambrightundC.R.Roy.2006.TheLegionella
pneumophila effector protein DrrA is a Rab1 guanine nucleotideexchange factor. Nat. Cell Biol.
8:971977.
Nakamura, N., M.Lowe, T.P.Levine, C.Rabouille und G.Warren. 1997. The Vesicle Docking Protein
p115BindsGM130,acisGolgiMatrixProtein,inaMitoticallyRegulatedManner.Cell89:445455.
Newhall, W.J.1988. Macromolecular and antigenic composition of chlamydiae. Microbiology of
Chlamydia4870.
Nozawa, K., C.A.Casiano, J.C.Hamel, C.Molinaro, M.J.Fritzler und E.K.Chan. 2002. Fragmentation of
GolgicomplexandGolgiautoantigensduringapoptosisandnecrosis.ArthritisRes.4:R3.
V.Literaturverzeichnis
Seite103
Ojcius, D.M., R.Hellio und A.DautryVarsat. 1997. Distribution of endosomal, lysosomal, and major
histocompatabilitycomplexmarkersinamonocyticcelllineinfectedwithChlamydiapsittaci.Infect.
Immun.65:24372442.
Orci, L., M.Stamnes, M.Ravazzola, M.Amherdt, A.Perrelet, T.H.Sollner und J.E.Rothman. 1997.
BidirectionaltransportbydistinctpopulationsofCOPIcoatedvesicles.Cell90:335349.
Palade,G.1975.Intracellularaspectsoftheprocessofproteinsynthesis.Science189:347358.
Paschal,B.M.,H.S.ShpetnerundR.B.Vallee.1987.MAP1CisamicrotubuleactivatedATPasewhich
translocatesmicrotubulesinvitroandhasdyneinlikeproperties.J.CellBiol.105:12731282.
Pelham,H.R.1988.EvidencethatluminalERproteinsaresortedfromsecretedproteinsinapostER
compartment.EMBOJ.7:913918.
Pelham,H.R.undJ.E.Rothman.2000.ThedebateabouttransportintheGolgitwosidesofthesame
coin?Cell102:713719.
Pentchev, P.G., R.O.Brady, E.J.BlanchetteMackie, M.T.Vanier, E.D.Carstea, C.C.Parker, E.Goldin und
C.F.Roff. 1994. The NiemannPick C lesion and its relationship to the intracellular distribution and
utilizationofLDLcholesterol.Biochim.Biophys.Acta1225:235243.
Pentchev,P.G.,M.E.Comly,H.S.Kruth,M.T.Vanier,D.A.Wenger,S.PatelundR.O.Brady.1985.Adefect
incholesterolesterificationinNiemannPick disease(typeC) patients. Proc. Natl.Acad.Sci. U.S.A
82:82478251.
Pepperkok, R., J.A.Whitney, M.Gomez und T.E.Kreis. 2000. COPI vesicles accumulating in the
presenceofaGTPrestrictedarf1mutantaredepletedofanterogradeandretrogradecargo.J.Cell
Sci.113(Pt1):135144.
PereiraLeal,J.B.undM.C.Seabra.2001.EvolutionoftheRabfamilyofsmallGTPbindingproteins.J.
Mol.Biol.313:889901.
Perry, R.J. und N.D.Ridgway. 2006. Oxysterolbinding protein and vesicleassociated membrane
proteinassociated protein are required for steroldependent activation of the ceramide transport
protein.Mol.Biol.Cell17:26042616.
Peter,B.J.,H.M.Kent,I.G.Mills,Y.Vallis,P.J.Butler,P.R.EvansundH.T.McMahon.2004.BARDomains
asSensorsofMembraneCurvature:TheAmphiphysinBARStructure.Science303:495499.
Presley, J.F., N.B.Cole, T.A.Schroer, K.Hirschberg, K.J.M.Zaal und J.LippincottSchwartz. 1997. ERto
Golgitransportvisualizedinlivingcells.Nature389:8185.
Puthenveedu, M.A., C.Bachert, S.Puri, F.Lanni und A.D.Linstedt. 2006. GM130 and GRASP65
dependentlateralcisternalfusionallowsuniformGolgienzymedistribution.Nat.CellBiol.8:238248.
Raychaudhuri,S.,Y.J.Im,J.H.HurleyundW.A.Prinz.2006.Nonvesicularsterolmovementfromplasma
membrane to ER requires oxysterolbinding proteinrelated proteins and phosphoinositides. J. Cell
Biol.173:107119.
Rejman Lipinski, A., Meissner, C., Meyer, T.F. und Heuer, D.Rab6 and Rab11 regulate chlamydia
inducedGolgifragmentation.InVorbereitung.
V.Literaturverzeichnis
Seite104
Reynolds, A., D.Leake, Q.Boese, S.Scaringe, W.S.Marshall und A.Khvorova. 2004. Rational siRNA
designforRNAinterference.Nat.Biotechnol.22:326330.
RobertKochInstitut.2001.EpidemiologischesBulletin.14:96100.
Roberts,E.A.,J.Chua,G.B.KyeiundV.Deretic.2006.HigherorderRabprogramminginphagolysosome
biogenesis.J.CellBiol.174:923929.
Rockey, D.D., R.A.Heinzen und T.Hackstadt. 1995. Cloning and characterization of a Chlamydia
psittaci gene coding for a protein localized in the inclusion membrane of infected cells. Mol.
Microbiol.15:617626.
Rosing,M.,E.Ossendorf,A.RakundA.Barnekow.2007.GiantininteractswithboththesmallGTPase
Rab6andRab1.Exp.CellRes.313:23182325.
Rothman,J.E.1994.Mechanismsofintracellularproteintransport.Nature372:5563.
Rzomp, K.A., A.R.Moorhead und M.A.Scidmore. 2006. The GTPase Rab4 interacts with Chlamydia
trachomatisinclusionmembraneproteinCT229.Infect.Immun.74:53625373.
Rzomp, K.A., L.D.Scholtes, B.J.Briggs, G.R.Whittaker und M.A.Scidmore. 2003. Rab GTPases are
recruited to chlamydial inclusions in both a speciesdependent and speciesindependent manner.
Infect.Immun.71:58555870.
Saikku, P., M.Leinonen, K.Mattila, M.R.Ekman, M.S.Nieminen, P.H.Makela, J.K.Huttunen und
V.Valtonen. 1988.SerologicalevidenceofanassociationofanovelChlamydia,TWAR,withchronic
coronaryheartdiseaseandacutemyocardialinfarction.Lancet2:983986.
Sakurai, A., K.Okamoto, Y.Fujita, Y.Nakazato, K.Wakabayashi, H.Takahashi und N.K.Gonatas. 2000.
Fragmentation of the Golgi apparatus of the ballooned neurons in patients with corticobasal
degenerationandCreutzfeldtJakobdisease.ActaNeuropathol.100:270274.
Sambrook,J.,E.F.FritschundT.Maniatis.1989.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2ndEdition.
ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork.
Satoh, A., Y.Wang, J.Malsam, M.B.Beard und G.Warren. 2003. Golgin84 is a rab1 binding partner
involvedinGolgistructure.Traffic.4:153161.
Schachter,J.undA.O.Osoba.1983.Lymphogranulomavenereum.Br.Med.Bull.39:151154.
Schekman,R.undL.Orci.1996.Coatproteinsandvesiclebudding.Science271:15261533.
Schroer, T.A., E.R.Steuer und M.P.Sheetz. 1989. Cytoplasmic dynein is a minus enddirected motor
formembranousorganelles.Cell56:937946.
Schultz,J.,T.Doerks,C.P.Ponting,R.R.CopleyundP.Bork.2000.Morethan1,000putativenewhuman
signallingproteinsrevealedbyESTdatamining.Nat.Genet.25:201204.
Schweizer, A., J.A.Fransen, T.Bachi, L.Ginsel und H.P.Hauri. 1988. Identification, by a monoclonal
antibody, of a 53kD protein associated with a tubulovesicular compartment at the cisside of the
Golgiapparatus.J.CellBiol.107:16431653.
V.Literaturverzeichnis
Seite105
Scidmore,M.A.,E.R.FischerundT.Hackstadt.1996a.Sphingolipidsandglycoproteinsaredifferentially
traffickedtotheChlamydiatrachomatisinclusion.J.CellBiol.134:363374.
Scidmore, M.A., E.R.Fischer und T.Hackstadt. 2003. Restricted fusion of Chlamydia trachomatis
vesicles with endocytic compartments during the initial stages of infection. Infect. Immun. 71:973
984.
Scidmore,M.A.,D.D.Rockey,E.R.Fischer,R.A.HeinzenundT.Hackstadt.1996b.Vesicularinteractions
oftheChlamydiatrachomatisinclusionaredeterminedbychlamydialearlyproteinsynthesisrather
thanrouteofentry.Infect.Immun.64:53665372.
ScidmoreCarlson, M.A., E.I.Shaw, C.A.Dooley, E.R.Fischer und T.Hackstadt. 1999. Identification and
characterizationofaChlamydiatrachomatisearlyoperonencodingfournovelinclusionmembrane
proteins.Mol.Microbiol.33:753765.
Seaman,J.T.1985.Chlamydiaisolatedfromabortioninsheep.Aust.Vet.J.62:436.
Seemann, J., E.Jokitalo, M.Pypaert und G.Warren. 2000. Matrix proteins can generate the higher
orderarchitectureoftheGolgiapparatus.Nature407:10221026.
Short,B.,A.HaasundF.A.Barr.2005.GolginsandGTPases,givingidentityandstructuretotheGolgi
apparatus.Biochim.Biophys.Acta1744:383395.
Short, B., C.Preisinger, J.Schaletzky, R.Kopajtich und F.A.Barr. 2002. The Rab6 GTPase regulates
recruitmentofthedynactincomplextoGolgimembranes.Curr.Biol.12:17921795.
Shorter, J., R.Watson, M.E.Giannakou, M.Clarke, G.Warren und F.A.Barr. 1999. GRASP55, a second
mammalianGRASPproteininvolvedinthestackingofGolgicisternaeinacellfreesystem.EMBOJ.
18:49494960.
Slusarewicz, P., T.Nilsson, N.Hui, R.Watson und G.Warren. 1994. Isolation of a matrix that binds
medialGolgienzymes.J.CellBiol.124:405413.
Smith,A.C.,W.D.Heo,V.Braun,X.Jiang,C.Macrae,J.E.Casanova,M.A.Scidmore,S.Grinstein,T.Meyer
undJ.H.Brumell.2007.AnetworkofRabGTPasescontrolsphagosomematurationandismodulated
bySalmonellaentericaserovarTyphimurium.J.CellBiol.176:263268.
Sohda, M., Y.Misumi, S.Yoshimura, N.Nakamura, T.Fusano, S.Sakisaka, S.Ogata, J.Fujimoto,
N.KiyokawaundY.Ikehara.2005.Depletionofvesicletetheringfactorp115causesministackedGolgi
fragmentswithdelayedproteintransport.Biochem.Biophys.Res.Commun.338:12681274.
Soldati,T.,M.A.RiedererundS.R.Pfeffer.1993.Rab GDI:asolubilizingandrecyclingfactor forrab9
protein.Mol.Biol.Cell4:425434.
Sollner,T.,M.K.Bennett,S.W.Whiteheart,R.H.SchellerundJ.E.Rothman.1993a.Aproteinassembly
disassembly pathway in vitro that may correspond to sequential steps of synaptic vesicle docking,
activation,andfusion.Cell75:409418.
Sollner, T., S.W.Whiteheart, M.Brunner, H.ErdjumentBromage, S.Geromanos, P.Tempst und
J.E.Rothman.1993b.SNAPreceptorsimplicatedinvesicletargetingandfusion.Nature362:318324.
V.Literaturverzeichnis
Seite106
Sonnichsen,B.,S.DeRenzis,E.Nielsen,J.RietdorfundM.Zerial.2000.Distinctmembranedomainson
endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J.
CellBiol.149:901914.
Sonnichsen,B.,M.Lowe,T.Levine,E.Jamsa,B.DiracSvejstrupundG.Warren.1998.Aroleforgiantin
indockingCOPIvesiclestoGolgimembranes.J.CellBiol.140:10131021.
Stamp,J.T.,J.A.WattundR.B.Cockburn.1952.Enzooticabortioninewes;complementfixationtest.J.
CompPathol.62:93101.
Stephens,R.S.,S.Kalman,C.Lammel,J.Fan,R.Marathe,L.Aravind,W.Mitchell,L.Olinger,R.L.Tatusov,
Q.Zhao,E.V.KooninundR.W.Davis.1998.Genomesequenceofanobligateintracellularpathogenof
humans:Chlamydiatrachomatis.Science282:754759.
Stieber, A., Z.Mourelatos und N.K.Gonatas. 1996. In Alzheimer's disease the Golgi apparatus of a
population of neurons without neurofibrillary tangles is fragmented and atrophic. Am. J. Pathol.
148:415426.
Strom,M.,A.N.Hume,A.K.Tarafder,E.BarkagianniundM.C.Seabra.2002.AfamilyofRab27binding
proteins.MelanophilinlinksRab27aandmyosinVafunctioninmelanosometransport.J.Biol.Chem.
277:2542325430.
Stuart, E.S., W.C.Webley und L.C.Norkin. 2003. Lipid rafts, caveolae, caveolin1, and entry by
Chlamydiaeintohostcells.Exp.CellRes.287:6778.
Sun, Y., A.Shestakova, L.Hunt, S.Sehgal, V.Lupashin und B.Storrie. 2007. Rab6 regulates both
ZW10/RINT1andconservedoligomericGolgicomplexdependentGolgitraffickingandhomeostasis.
Mol.Biol.Cell18:41294142.
Ullrich, O., H.Stenmark, K.Alexandrov, L.A.Huber, K.Kaibuchi, T.Sasaki, Y.Takai und M.Zerial. 1993.
RabGDPdissociationinhibitorasageneralregulatorforthemembraneassociationofrabproteins.J.
Biol.Chem.268:1814318150.
Valderrama, F., T.Babia, I.Ayala, J.W.Kok, J.RenauPiqueras und G.Egea. 1998. Actin microfilaments
are essential for the cytological positioning and morphology of the Golgi complex. Eur. J. Cell Biol.
76:917.
van Ooij, C., G.Apodaca und J.Engel. 1997. Characterization of the Chlamydia trachomatis vacuole
anditsinteractionwiththehostendocyticpathwayinHeLacells.Infect.Immun.65:758766.
Vanrompay, D., R.Ducatelle und F.Haesebrouck. 1995. Chlamydia psittaci infections: a review with
emphasisonavianchlamydiosis.Vet.Microbiol.45:93119.
Walter, M., J.P.Davies und Y.A.Ioannou. 2003. Telomerase immortalization upregulates Rab9
expressionandrestoresLDLcholesterolegressfromNiemannPickC1lateendosomes.J.LipidRes.
44:243253.
Wang, Y., J.H.Wei, B.Bisel, D.Tang und J.Seemann. 2008. Golgi cisternal unstacking stimulates COPI
vesiclebuddingandproteintransport.PLoS.ONE.3:e1647.
Ward, T.H., R.S.Polishchuk, S.Caplan, K.Hirschberg und J.LippincottSchwartz. 2001. Maintenance of
GolgistructureandfunctiondependsontheintegrityofERexport.J.CellBiol.155:557570.
V.Literaturverzeichnis
Seite107
Wehrl, W., V.Brinkmann, P.R.Jungblut, T.F.Meyer und A.J.Szczepek. 2004. From the inside out
processingoftheChlamydialautotransporterPmpDanditsroleinbacterialadhesionandactivation
ofhumanhostcells.Mol.Microbiol.51:319334.
WHO. 2001. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections:
overviewandestimates.WorldHealthOrganization,Geneva.
Wilcke, M., L.Johannes, T.Galli, V.Mayau, B.Goud und J.Salamero. 2000. Rab11 regulates the
compartmentalizationofearlyendosomesrequiredforefficienttransportfromearlyendosomesto
thetransgolginetwork.J.CellBiol.151:12071220.
Wirtz,K.W.1991.Phospholipidtransferproteins.Annu.Rev.Biochem.60:7399.
Wittenbrink,M.M.,X.Wen,N.Bohmer,G.AmtsbergundA.Binder.1991.[Bacteriologicstudiesofthe
occurrence of Chlamydia psittaci in organs of swine and in aborted swine fetuses]. Zentralbl.
Veterinarmed.B38:411420.
Wiznerowicz, M. und D.Trono. 2003. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector
mediateddruginducibleRNAinterference.JVirol77:89578961.
Wolf, K., E.Fischer und T.Hackstadt. 2000. Ultrastructural analysis of developmental events in
Chlamydiapneumoniaeinfectedcells.Infect.Immun.68:23792385.
Wolf, K. und T.Hackstadt. 2001. Sphingomyelin trafficking in Chlamydia pneumoniaeinfected cells.
CellMicrobiol.3:145152.
Wreghitt,T.1993.Chlamydialinfectionoftherespiratorytract.Commun.Dis.Rep.CDRRev.3:R119
R124.
Wylie, J.L., G.M.Hatch und G.McClarty. 1997. Host cell phospholipids are trafficked to and then
modifiedbyChlamydiatrachomatis.J.Bacteriol.179:72337242.
Xia, M., R.E.Bumgarner, M.F.Lampe und W.E.Stamm. 2003. Chlamydia trachomatis infection alters
hostcelltranscriptionindiversecellularpathways.J.Infect.Dis.187:424434.
Yang, L. und H.W.Huang. 2002. Observation of a membrane fusion intermediate structure. Science
297:18771879.
Yoshida, Y., M.Kinuta, T.Abe, S.Liang, K.Araki, O.Cremona, G.Di Paolo, Y.Moriyama, T.Yasuda, P.De
CamilliundK.Takei.2004.Thestimulatoryactionofamphiphysinondynaminfunctionisdependent
onlipidbilayercurvature.EMBOJ.23:34833491.
Zerial, M. und H.McBride. 2001. Rab proteins as membrane organizers. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
2:107117.
Zhang, J.P. und R.S.Stephens. 1992. Mechanism of C. trachomatis attachment to eukaryotic host
cells.Cell69:861869.
VI.Danksagung
Seite108
VI.DANKSAGUNG
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Thomas F. Meyer für die
Überlassung des Dissertationsthemas, die wissenschaftliche Unterstützung und die
vielenmotivierendenundhilfreichenVorschlägebedanken.
MeinganzbesondererDankgiltHerrnProf.Dr.WolfgangUckertfürdieÜbernahmeder
BetreuunganderHumboldtUniversität,seinstetesInteresseandieserArbeitundseine
Diskussionsbereitschaft.
FrauDr.AntjeFliegerdankeichfürdieBereitschaftdieseArbeitzubegutachten.
Dr.DagmarHeuerdankeichherzlichstfürdietolleBetreuungaufderSuchenachdem
chlamydialen RabGral, ihr offenes Ohr in allen „Labor“lagen, die vielen motivierenden
und anregenden Gespräche und ihre unendliche Geduld beim Korrekturlesen dieser
Arbeit.
Herrn Dr. Volker Brinkmann, Britta Laube, Christian Goosmann und Dr. Hans Thorn
dankeichfürdasEntfachenmeinerBegeisterungfürdieMikroskopie.
Ebenso danke ich Dr. Nikolaus Machuy, Dr. Alexander Karlas und dem gesamten RNAi
TeamfürdasLaufenlernenindergroßenWeltdesSilencing.
DemgesamtenChlamydienlaborundallenMitarbeiternderAbteilungdankeichfürden
SpaßunddieguteLaunesowohlinnerhalbalsauchaußerhalbdesLabors.
BeiDr.MarionRother,Dr.NikolausMachuyundAlexanderRathgebmöchteichmichfür
die konstruktiven Korrekturen und den akribischen Kampf gegen meine
Schusseligkeitsfehlär bedanken. Ein Dankeschön auch an Bianca Bauer für die
spitzenmäßigeHilfebeidergrafischenGestaltung.
GanzbesonderesmöchteichmichbeimeinenMädelzbaldDr.BiancaBauer,Dr.Dagmar
Heuer, Dr. Andrea Wehrens und Dr. Martin Beisiegel für die unzähligen Käffchen,
Diskussionen, den Riesenspaß in allen Situationen und den herrlichen Trashtalk
bedanken.Mädelz,ihrseiddieBesten!!!
MeintiefsterDankgiltmeinerFamiliefürIhrabsolutes Vertrauen und IhreGeduldmit
meinemTemperament,vorallemwährendderFertigstellungderArbeit.
Von Herzen danke ich meinem Freund Christian Hennings für die aufgebrachte Geduld
unddieliebevolleUnterstützungwährenddergesamtenZeit.*kyuss*
Publikationsliste
Seite109
PUBLIKATIONSLISTE
TEILEDIESERARBEITWURDENBZW.WERDENWIEFOLGTVERÖFFENTLICHT:
Dagmar Heuer, Anette Rejman Lipinski, Nikolaus Machuy, Alexander Karlas, Andrea
Wehrens, Frank Siedler, Volker Brinkmann, and Thomas F. Meyer. Chlamydia causes
fragmentationoftheGolgicompartmenttoensurereproduction.AkzeptiertbeiNature.
AnetteRejmanLipinski,CharlotteMeissner,ThomasF.MeyerandDagmarHeuer.Rab6and
Rab11regulatechlamydiainducedGolgifragmentation.InVorbereitung.
ThomasF.Meyer,TrentFowler,AnetteRejmanLipinski,DagmarHeuer,ElkeMüller,Thomas
Rudel, Nikolaus Machuy, Stephan Becker und Ute Krüger. 2005. RNA interference and
infectiousagents.NovaActaLeopoldinaNF92:199205.
BEITRÄGEAUFKONFERENZEN:
2004 5thmeetingEuropeanSocietyforChlamydiaresearch
AnetteRejmanLipinski,ThomasF.Meyer,AgnesSzczepekandDagmarHeuer.2004.
InteractionofChlamydiatrachomatiswiththehostcelltraffickingpathwaysstudies
with use of RNA interference (siRNAapproach). 5th meeting European Society for
Chlamydiaresearch,Budapest(Vortrag).
2005 3.DeutscherChlamydienWorkshop
AnetteRejmanLipinski,ThomasF.Meyer,AgnesSzczepekundDagmarHeuer.2005.
Bedeutung intrazellulärer Transportwege für eine produktive Vermehrung von
Chlamydiatrachomatis.3.DeutscherChlamydienWorkshop,Jena(Vortrag).
2005 ZIBIForschungswochenende
DagmarHeuer,AnetteRejmanLipinskiandThomasF.Meyer.2005.Lossofcellular
proteinsinvolvedinthesecretorypathwayenhanceChlamydiatrachomatisgrowths.
ZIBIForschungswochenende,TeikyoUniversityBerlinCampus,Zeuthen(Vortrag).
2006 58.MosbacherKolloquium"Proteinandlipidsortinginhealthanddisease",
AnetteRejmanLipinski,DagmarHeuer,NikolausMachuy,HansThornandThomasF.
Meyer. 2007. Interactions of Chlamydia trachomatis with host cell trafficking
pathways(siRNAapproach).58.MosbacherKolloquium“Proteinandlipidsortingin
healthanddisease”.Mosbach(Poster).
2008 6thmeetingEuropeanSocietyforChlamydiaresearch
Anette Rejman Lipinski, Charlotte Meissner, Thomas F. Meyer and Dagmar Heuer.
2008.Whichwaytogo?RabProteinsregulateChlamydiatrachomatisinfection.6th
meetingEuropeanSocietyforChlamydiaresearch,Aarhus(Poster).
Berlin,den
Selbständigkeitserklärung
Seite110
SELBSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter
VerwendungderangegebenenHilfsmittelangefertigthabe.
Berlin,den
AnetteRejmanLipinski