Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors
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Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors Ziel des Versuchs ist die Charakterisierung des in Versuch II gereinigten Proteinkinaseinhibitors GST-PKI. Dazu soll zunächst die Inhibition der katalytischen (C) Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) durch GST-PKI untersucht werden. Am zweiten Versuchstag wird dann die Konzentration an aktivem GST-PKI durch Titration gegen die C-Untereinheit bestimmt. Hintergrund: Proteinkinasen als zentrale Schaltstellen der Signaltransduktion: Eukaryotische Zellen müssen ständig in der Lage sein, auf wechselnde Signale in ihrer Umgebung zu reagieren und ihren Metabolismus entsprechend anzupassen. Extrazelluläre Signale (z.B. Hormone, Neurotransmitter, Cytokine) müssen dabei in eine zelluläre Antwort umgewandelt werden (Übersichtsartikel: Hunter, 2002). Eine zentrale Rolle bei der Signalweiterleitung in der Zelle kommt den Proteinkinasen zu. Proteinkinasen stellen die zweitgrößte Proteinfamilie in Säugern dar, im menschlichen Genom wurden nach Vollendung des Humanen Genomprojekts 518 Kinasen identifiziert (Manning et al., 2002). Kinasen zeichnen sich dadurch aus, dass sie das γ-Phosphat eines ATP- (oder GTP-) Moleküls auf ihre Substrate übertragen und dadurch deren physikochemische Eigenschaften verändern, was im Allgemeinen funktionelle Konsequenzen hat (s.u.). Bei den Proteinkinasen unterscheidet man – nach dem Aminosäurerest, der phosphoryliert wird – zwischen Serin-/Threonin- und Tyrosinkinasen. Daneben gibt es auch die Gruppe der dualspezifischen Proteinkinasen, die beide Arten von Aminosäuren modifizieren können (Übersichtsartikel: Pawson and Scott, 2005). Die Phosphorylierung eines Proteins führt häufig zu dessen Aktivierung, kann jedoch in anderen Fällen auch inaktivierend wirken oder beispielsweise eine neue Bindungsstelle für andere Proteine generieren (Bsp.: SH2-Domänen). Proteinkinasen sind häufig selbst Ziel einer aktivierenden Phosphorylierung (s. Abb.1), d.h. die betreffende Proteinkinase ist dann das Substrat einer anderen, übergeordneten Proteinkinase. Dies führt dazu, dass die Signaltransduktion häufig in Form von hierarchisch strukturierten Proteinkinasekaskaden (Bsp.: Mitogen Aktivierte Protein (MAP) Kinasekaskade) erfolgt, bei denen eine einmal aktivierte Proteinkinase ihre Substratkinasen phosphoryliert, die ihrerseits wiederum eine 1 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors Insulinrezeptorkinase (IRK) aktiv Insulinrezeptorkinase (IRK) inaktiv Abb1: Aktivierende Phosphorylierung der Insulinrezeptorkinase (IRK) Im unphosphorylierten Zustand ist die IRK inaktiv (links). Durch Phosphorylierung von drei Tyr-Resten (links grün, rechts gelb) wird sie aktiviert und kann ATP (rot) im katalytischen Spalt binden Vielzahl von Substraten phosphorylieren können, usw. Der damit verbundene Verstärkungseffekt macht eine strikte Regulation der Kinaseaktivität innerhalb der Zelle notwendig. Dies kann durch verschiedenartige Mechanismen gewährleistet werden: Wie erwähnt, ist häufig zunächst eine Phosphorylierung notwendig, um Kinasen zu aktivieren. Diese Aktivierung kann von den Gegenspielern der Kinasen – den Phosphatasen – durch Abspaltung des Phosphatrestes rückgängig gemacht werden. Es handelt sich also um eine reversible Modifikation des Substratproteins – die ein schnelles An- und Abschalten eines Signalweges ermöglicht. Daneben gibt es häufig regulatorisch wirkende Proteine, die als Inhibitoren auch aktivierte Proteinkinasen hemmen, wobei diese Hemmung wiederum durch Bindung von Effektormolekülen beeinflusst werden kann. Welche dramatischen Konsequenzen eine Deregulation dieses komplexen Netzwerks haben kann, zeigt die Tatsache, dass eine Vielzahl von Krankheiten, insbesondere Krebserkrankungen, auf fehlregulierte Kinasen zurückzuführen sind. 2 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors Die cAMP-abhängige Proteinkinase (Proteinkinase A, PKA): Eine der ersten Proteinkinasen überhaupt, die beschrieben und gereinigt wurden, ist die cAMP abhängige Proteinkinase (PKA, Walsh et al, 1968). Diese gut charakterisierte Kinase gilt als Prototyp und Modell für die gesamte Proteinfamilie. Das im Ruhezustand inaktive PKAHoloenzym setzt sich aus zwei regulatorischen (R) und zwei katalytischen (C) Untereinheiten zusammen, wobei die regulatorischen Untereinheiten die katalytischen mit hoher Affinität binden und dadurch hemmen. Wird in der Zelle aufgrund eines externen Stimulus der sekundäre Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) freigesetzt, binden die RUntereinheiten je zwei Moleküle cAMP, worauf das Holoenzym in ein Dimer aus regulatorischen und die beiden freien katalytischen Untereinheiten dissoziiert (vgl. Formel [1] und Abb.2]. R2C2 + 4 cAMP R2•(cAMP)4 + 2 C [1] Die freien C-Untereinheiten sind damit aktiv und können nun Substrate im Cytoplasma und im Zellkern phosphorylieren und dadurch eine Vielzahl zellulärer Prozesse, wie z.B. Zellstoffwechsel, Zellwachstum und –differenzierung oder Apoptose (gerichteter Zelltod) beeinflussen (Übersichtsartikel: Shabb, 2001). Wie alle Proteinkinasen unterliegt die PKA dabei einer strikten Regulation. Sinkt der cAMP-Spiegel in der Zelle - durch die Aktivität der cAMP spaltenden Phosphodiesterasen (PDE) - wieder ab, werden die C-Untereinheiten durch Bindung an die R-Untereinheiten wieder inaktiviert. Ein weiterer wichtiger physiologischer Inhibitor der PKA ist der hitzestabile Proteinkinaseinhibitor (PKI, Walsh et al., 1971), der im vorhergehenden Versuch als GST-Fusionsprotein (GST-PKI) gereinigt wurde. PKI reguliert die Aktivität der C-Untereinheiten im Zellkern, in den die R-Untereinheiten aufgrund ihrer Größe nicht gelangen können. Wenn das PKI-Protein die C-Untereinheit bindet, wird ein Kernexportsignal (NES = Nuclear Export Signal) in der Aminosäuresequenz des PKI freigelegt und der PKI-C Proteinkomplex wird ins Cytoplasma exportiert (Abb. 2). Im Gegensatz zur Inhibition durch die R-Untereinheiten kann die Inhibition durch PKI nicht mit cAMP aufgehoben werden. Im Cytoplasma wird der PKI-C Komplex auf noch ungeklärte Weise getrennt und die katalytischen Untereinheiten wieder an die regulatorischen gebunden. 3 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors R R PKI PKI PKI R R PKI cAMP R R +ATP +ATP Protein Protein Protein P Cytoplasma Protein P Zellkern Abb. 2: Regulationsmechanismus der PKA. Erläuterung im Text. C – katalytische Untereinheit, R – regulatorische Untereinheit der PKA; PKI - Proteinkinaseinhibitor Enzymaktivitätsbestimmung: Grundlage der im Praktikumsversuch durchzuführenden Messungen ist ein gekoppelter enzymatischer Test, in dem die Umsetzung des Substrates spektrophotometrisch verfolgt werden kann. Bei diesem Phosphorylierungsreaktion Enzymtest gekoppelt mit ist die von der von der Pyruvatkinase PKA (PK) katalysierte und der Lactatdehydrogenase (LDH) katalysierten enzymatischen Reaktionen (Abb. 3). Kemptide + ATP Proteinkinase A ADP + Kemptide- P ADP + Phosphoenolpyruvat Pyruvatkinase Pyruvat + ATP Pyruvat + NADH+H+ Lactatdehydrogenase Lactat + NAD+ Abb. 3: Reaktionsschema für den gekoppelten Enzym-Assay (Cook-Assay, nach Cook et al. 1982) Dabei wird zum einen das Kosubstrat ATP ständig regeneriert, zum anderen wird im letzten Reaktionsschritt NADH+H+ zu NAD+ oxidiert. Aufgrund der 1:1 Stöchiometrie der 4 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors gekoppelten Reaktionen ist der NADH-Verbrauch ein direktes Maß für die Zahl der übertragenen Phosphatgruppen. Die Entstehung von NAD+ kann über die Messung der Extinktion bei 340 nm verfolgt werden, da NADH+H+ bei dieser Wellenlänge ein Absorptionsmaximum aufweist, NAD+ dagegen bei 340 nm nicht absorbiert (Abb.4). Abb. 4: Vergleich der Absorptionsspektren und der Struktur von NAD+/NADH Als Substrat für die Phosphorylierungsreaktion wird im Versuch das Peptid Kemptide verwendet. Dieses Heptapeptid mit der Sequenz LRRASLG wird von der PKA unter ATPVerbrauch am Serinrest phosphoryliert. Wichtig für die Substraterkennung durch die PKA sind dabei die beiden basischen Argininreste an Position P–2 und P–3 (relativ zum phosphorylierenden Rest P-0), sowie ein hydrophober Rest an Position P+1 (Leucin). Auch die Inhibition durch PKI und die in diesem Versuch verwendete R-Untereinheit RIα beruht auf der Erkennung einer solchen Konsensussequenz. Bei diesen beiden Inhibitoren befindet sich jedoch anstelle eines phosphorylierbaren Serin- oder Threoninrestes ein Alaninrest (Abb. 5), so dass das Protein zwar wie ein Substrat gebunden wird, die Phosphatübertragung jedoch nicht stattfinden kann, daher spricht man auch von Pseudosubstratinhibitoren. Da beide Inhibitoren mit dem Substrat um die Bindungsstelle kompetieren, handelt es sich um eine kompetitive Hemmung. 5 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors LRRASLG Kemptide Substrat 92 RRRRGAISA RIα-Untereinheit (AS 92-100) 16 TGRRNAIHD PKI (AS 16-24) Pseudosubstratinhibitoren Abb. 5: Vergleich der Konsensussequenzen von Kemptide und den Pseudosubstratinhibitoren RIα und PKI. Die für die Substraterkennung durch die PKA relevanten Aminosäurereste sind durch Fettdruck hervorgehoben, die Phosphorylierungsstelle in Kemptide ist unterstrichen. Durchführung: Benötigte Lösungen und Reagenzien: Assay-Mix: 100 mM MOPS-Puffer, pH 7,0 Æ physiolog. Pufferbedingungen 10 mM MgCl2 Æ Mg++ nötig für ATP-Bindung 1 mM Phosphoenolpyruvat Æ Substrat für Pyruvatkinase 1 mM ATP Æ Kosubstrat der PKA 0,2 mM NADH Æ Kosubstrat der LDH 8,4 U/ml Pyruvatkinase Æ Katalyse der 1. gekoppelten Reaktion 15 U/ml Lactatdehydrogenase Æ Katalyse der 2. gekoppelten Reaktion 5 mM β-Mercaptoethanol Æ reduzierende Bedingungen Der Assay-Mix enthält zusätzlich 0,05% Tween-20. Dabei handelt es sich um eine oberflächenaktive Substanz, welche die Adsorption von Proteinen an Gefäßwände verhindert. Kemptide (6 mg/ml in H2O) katalytische Untereinheit der PKA (Cα): 0,06 mg/ml, ca. 30 U/mg regulatorische Untereinheit der PKA (RIα ∆1-911) GST-PKI Fusionsprotein aus Versuch II cAMP-Lösung: 10 mM Verdünnungspuffer: 20 mM MOPS pH 7, 150 mM NaCl 1 Bei dem RIα∆1-91 Protein handelt es sich um eine Deletionsmutante, der die ersten 91 Aminosäuren fehlen. Die Hemmung der C-UE und die Bindung von cAMP sind dadurch jedoch nicht beeinflusst. 6 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors 1. Versuchstag: Qualitative Messung der Inhibition der C-Untereinheit durch GST-PKI Bevor die Inhibition der katalytischen Untereinheit durch GST-PKI im Vergleich mit einer regulatorischen Untereinheit untersucht wird, wird zunächst die spezifische Aktivität der CUntereinheit bestimmt, um einen Vergleichswert für die folgenden Messungen zu erhalten. Vor der eigentlichen Messung wird die Extinktion des Assay-Mix bei 340 nm (E340) überprüft. Die NADH-Konzentration im Assay-Mix ist so berechnet, dass die E340=1 sein sollte. In der Praxis liegt der Wert jedoch im Allgemeinen bei 0,7 bis 0,9. Da jedoch nur die Abnahme der Extinktion pro Zeiteinheit (∆E340/min) verfolgt werden soll, ist dies für unseren Versuch nicht weiter von Belang. - Messen Sie gegen H2Obidest als Referenz („Autozero“) - Geben Sie 700 µl Assay Mix + 50 µl H2Obidest in eine Einmalküvette und verfolgen Sie die E340 für eine Minute. Der Messwert sollte dabei nicht oder nur leicht absinken und nicht unter 0,7 fallen. - Die eigentlichen Messungen werden nach Pipettierschema A durchgeführt. - Verdünnen Sie das von Ihnen in Versuch III gereinigte GST-PKI Fusionsprotein dafür gegebenenfalls zunächst in Verdünnungspuffer auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml! Pipettierschema A: Messung Nr. 1 2 3 4 5 Assay-Mix 700 µl 700 µl +GST-PKI +cAMP 700 µl Cα 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl GST-PKI – 10 µl 10 µl – – RIα ∆1-91 – – – 10 µl 10 µl cAMP – – 10 µl – 10 µl ad* 740 µl ad 740 µl ad 740 µl ad 740 µl ad 740 µl mischen mischen mischen mischen mischen 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl mischen mischen mischen mischen mischen Spez. Akt. +GST-PKI H2Obidest START Kemptide 700 µl +R +cAMP 700 µl +R * = auffüllen auf!!! 7 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors Die einzelnen Komponenten werden bis auf das Kemptide in Einmalküvetten zusammenpipettiert, mit Parafilm abgedeckt und durch Wenden der Küvette durchmischt. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von Kemptide gestartet, wobei der Reaktionsansatz nochmals wie oben durchmischt wird (wichtig!!!). Danach wird die Küvette umgehend ins Photometer gestellt und die E340 für 2 min verfolgt. Lesen Sie dabei alle 15 s einen Messwert ab. Führen Sie für jede Messung eine Doppelbestimmung durch (Wertetabelle am Ende des Skripts)! Auswertung: Nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz [Formel 2] ist die Extinktion einer absorbierenden Lösung von der molaren Konzentration des gelösten Stoffes abhängig: E=ε·c·d Mit [2] ε = molarer Extinktionskoeffizient [L·mol-1·cm-1] c = molare Konzentration des gelösten Stoffes [mol·L-1] d = Schichtdicke [cm] Für die Änderung der NADH-Konzentration pro Zeiteinheit ergibt sich daraus: ∆E 340 ∆ c NADH = = v0 ∆t ε NADH · d · ∆t Sofern die Reaktion linear Reaktionsgeschwindigkeit v0. verläuft, Da entspricht wir in [3] dieser diesem Term Versuch [3] der unter initialen sättigenden Substratbedingungen messen, nähert sich v0 der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit vmax an. Setzt man diese in Bezug zur Enzymkonzentration, lässt sich daraus die spezifische Aktivität des Enzyms berechnen [Formel 4], in unserem Fall: Spez. Aktivität = (∆E 340 min )·(Vtotal V Cα ) [4] ε NADH ·c Cα ·d 8 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors ∆E340/min = ermittelte Steigung Vtotal = Gesamtvolumen VCα = Volumen Cα-UE Vtotal/VCα = Verdünnungsfaktor εNADH = molarer Extinktionskoeffizient NADH bei 340 nm (6,28·10³ L·mol-1cm-1) c = Konzentration der eingesetzten Cα-UE (0,06 mg/mL) d = Schichtdicke der Küvette (1 cm) Die Auftragung der gemessenen Extinktion gegen die Zeit ergibt eine Gerade. Bestimmen Sie die Steigung der Geraden (∆E340/min) für jede Messung und bilden Sie den Mittelwert aus den Doppelbestimmungen. Aus der ermittelten Steigung lässt sich durch Einsetzen in Formel [4] die spezifische Aktivität der katalytischen Untereinheit berechnen. Fragen: - Welche Dimension hat die berechnete Größe? - Üblicherweise wird die spezifische Aktivität eines Enzyms in µmol des umgesetzten Substrates pro min (= 1 Unit [U]) und mg Enzym angegeben [µmol·min-1·mg-1] = Units/mg]. Geben Sie die spezifischen Aktivitäten in Units/mg an! - Die SI-Einheit für die Enzymaktivität ist 1 katal = 1 mol/s. Geben Sie die spezifischen Aktivitäten in nkatal/mg (= 10-9 katal/mg) an! - Stellen Sie die Enzymaktivität mit und ohne Inhibitoren sowie mit und ohne cAMP in einem Balkendiagramm gegenüber. Welcher grundlegende Unterschied besteht zwischen der Inhibition durch GST-PKI und der R-Untereinheit? - Zusatzfrage: Wie hoch ist die molare Konzentration der katalytischen Untereinheit in der Küvette, wenn ein Molekulargewicht von 40000 Da (=40000 g/mol) angenommen wird? 9 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors 2. Versuchstag: Titration von GST-PKI gegen die Cα-Untereinheit Im Versuch II haben Sie die Konzentration des gereinigten GST-PKI Fusionsproteins über einen Bradford-Assay bestimmt und mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese die Reinheit der Präparation überprüft. Beide Methoden geben jedoch keinen Aufschluss über die Konzentration an wirklich aktivem Protein in der Präparation, da sie nicht zwischen aktivem und inaktivem Protein diskriminieren können. Mit Hilfe des spektrophotometrischen Aktivitätsassays lässt sich jedoch - bei bekannter Konzentration der katalytischen Untereinheit - durch Titration des GST-PKI Fusionsproteins dessen aktive Konzentration bestimmen. Das Gleichgewicht der Bindung von GST-PKI an die C-Untereinheit liegt praktisch vollständig auf der Seite des GST-PKI – Cα Komplexes, d.h. fast das gesamte GST-PKI Protein liegt nach Zugabe in den Assay-Mix als GST-PKI Cα Komplex vor. Da die Inhibition der Cα-Untereinheit durch GST-PKI einer 1:1 Stöchiometrie folgt, ergibt die Auftragung der gemessenen Enzymaktivität in Abhängigkeit Enzymaktivität Units/mg von der Inhibitorkonzentration eine Gerade (Abb.6)2. 0 0 [GST-PKI] Abb. 6: Darstellung der Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Inhibitorkonzentration Am Schnittpunkt dieser Geraden mit der Abszisse muss daher das molare Verhältnis von CUntereinheit zu GST-PKI genau 1:1 betragen. Da die Konzentration der C-Untereinheit bekannt ist, lässt sich also daraus die Konzentration an aktivem GST-PKI-Protein berechnen. 2 Diese vereinfachende Annahme ist nicht allgemeingültig! Sie ist in diesem Fall jedoch zulässig, da aufgrund der hohen Affinität von PKI zur C-UE (KD=200pM!!) jedes zugegebene PKI-Molekül fast augenblicklich eine C-UE bindet. 10 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors Durchführung: Lösungen und Reagenzien wie am Vortag. - Verdünnen Sie das gereinigte GST-PKI-Fusionsprotein – ausgehend von der in Versuch II über den Bradford-Assay bestimmten Konzentration – in Verdünnungspuffer auf 10 µg/ml. Notieren Sie sich den Verdünnungsfaktor (VF)! - Die Durchführung des spektrophotometrischen Aktivitätsassays erfolgt wie am 1. Versuchstag, es werden jedoch gemäß Pipettierschema B steigende Inhibitorkonzentrationen eingesetzt: Pipettierschema B: Messung Nr. 1 2 3 4 5 6 Assay-Mix 650 µl 650 µl 650 µl 650 µl 650 µl 650 µl Cα 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl GST-PKI – 10 µl 20 µl 30 µl 40 µl 50 µl H2Obidest ad 740 µl ad 740 µl ad 740 µl ad 740 µl ad 740 µl ad 740 µl mischen mischen mischen mischen mischen mischen 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl mischen mischen mischen mischen mischen mischen START Kemptide Denken Sie daran, den Reaktionsansatz vor und nach der Zugabe von Kemptide zu mischen! Führen Sie für jede Messung eine Doppelbestimmung durch (siehe Wertetabelle am Ende des Skripts). 11 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors Auswertung: - Tragen Sie die gemessene Extinktion gegen die Zeit auf. - Ermitteln Sie aus den erhaltenen Geraden die jeweilige Steigung (∆E340/min) und bilden Sie den Mittelwert aus den Doppelbestimmungen. Berechnen Sie daraus nach Formel [4] die jeweiligen spezifischen Aktivitäten. - Tragen Sie die spezifischen Aktivitäten gegen das eingesetzte Volumen an GST-PKI auf. Legen Sie durch den linearen Bereich eine Gerade und ermitteln Sie den Schnittpunkt dieser Geraden mit der Abszisse (≡ VPKI). Dieser Wert gibt Ihnen an, welches Volumen Ihrer GST-PKI-Verdünnung nötig ist, um ein molares Verhältnis GST-PKI : C-Untereinheit von 1:1 zu erreichen (vgl. Abb. 6). - Berechnen Sie daraus die GST-PKI Konzentration wie folgt: Berechnen Sie die Stoffmenge der C-Untereinheit in der Küvette in mol (MWCα = 40000 Da = 40000 g/mol). Dieselbe Stoffmenge GST-PKI ist auch im ermittelten Volumen VPKI enthalten. Berechnen Sie die molare Konzentration (mol/l) Ihrer GSTPKI Verdünnung und multiplizieren Sie diese mit dem Verdünnungsfaktor (VF), um die molare Konzentration der Stocklösung zu erhalten. - Das Molekulargewicht von GST-PKI beträgt etwa 35000 Da (35000 g/mol). Geben Sie die Massenkonzentration an aktivem GST-PKI in mg/ml an. 12 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors Literatur: Lehrbücher der Biochemie, Kapitel über Signaltransduktion Weiterführende Literatur: Übersichtsartikel: T. Hunter, Signaling—2000 and Beyond, Cell, 100 (2000), 113-127. G. Manning, D.B. Whyte, R. Martinez, T. Hunter, S. Sudarsanam, The protein kinase complement of the human genome. Science 298 (2002) 1912–1934. T. Pawson and J.D. Scott, Protein phosphorylation in signaling – 50 years and counting, Trends Biochem Sci. 30 (2005) 286-90. J.B. Shabb, Physiological substrates of cAMP-dependent protein kinase, Chem Rev. 101 (2001) 2381-411. Originalartikel: D.A. Walsh, J.P. Perkins, E.G. Krebs, An adenosine 3′,5′-monophosphate-dependent protein kinase from rabbit skeletal muscle, J. Biol. Chem. 243 (1968) 3763–3765. D.A. Walsh, C.D. Ashby, C. Gonzalez, D. Calkins, E.H. Fischer, and E.G. Krebs, Purification and Characterization of a Protein Inhibitor of Adenosine 3’, 5’-Monophosphatedependent Protein Kinases, J Biol Chem. 246 (1971) 1977-85. P.F. Cook, M.E.Neville Jr., K.E. Vrana, F.T. Hartl, R. Roskoski Jr., Adenosine cyclic 3’ ,5’ - monophosphate dependent protein kinase: kinetic mechanism for the bovine skeletal muscle catalytic subunit. Biochemistry 21 (1982) 5794–5799. 13 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors Messergebnisse 1. Versuchstag (Pipettierplan A): Messung Nr. Zeit 1 2 3 4 5 spez. Akt. Cα + GST-PKI +GST-PKI +cAMP + R-UE +R-UE +cAMP A A A B A B A B B B 15’’ 30’’ 45’’ 1’ 1’15’’ 1’30’’ 1’45’’ 2’ 14 Biochemisches Grundpraktikum, Versuch III: Funktionelle Charakterisierung eines Proteininhibitors Messergebnisse 2. Versuchstag (Pipettierplan B): Messung Nr. Zeit 1 2 3 4 5 6 Ø GST-PKI 10 µl GST-PKI 20 µl GST-PKI 30 µl GST-PKI 40 µl GST-PKI 50 µl GST-PKI A B A B A B A B A B A B 15’’ 30’’ 45’’ 1’ 1’15’’ 1’30’’ 1’45’’ 2’ 15
