Funktionelle Charakterisierung des Typ III
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Funktionelle Charakterisierung des Typ III-Effektors XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Verena Bartetzko aus Mannheim Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 28. September 2012 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: PD Dr. Frederik Börnke Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski Teile dieser Arbeit sind in folgenden Publikationen enthalten: Lee, A., Hurley, B., Felsensteiner, C., Yea, C., Ckurshumova, W., Bartetzko, V., Wang, P., Quach, V., Lewis, J., Liu, Y., Börnke, F., Angers, S., Wilde, A., Guttman, D., Desveaux, D. (2012). A bacterial acetyltransferase destroys plant microtubule networks and blocks secretion. PLoS Pathogens 8(2): e1002523, DOI:10.1371/journal.ppat.1002523. Bartetzko, V., Sonnewald, S., Vogel, F., Hartner, K., Stadler, R., Hammes, U. und Börnke, F. (2009). The Xanthomonas campestris pv. vesicatoria type III effector protein XopJ inhibits protein secretion: evidence for interference with cell wall-associated defense responses. Molecular PlantMicrobe Interactions 22(6): 655-664. Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis v Tabellenverzeichnis ix Abkürzungsverzeichnis xi 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung 2.1 Die Interaktion zwischen Pflanzen und Pathogenen . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1 Die basale Abwehr von Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1.1 Die Rolle des Vesikeltransportes während der Abwehr in Pflanzen 2.1.2 Virulenzfaktoren gramnegativer pflanzenpathogener Bakterien . . . . . . 2.1.2.1 Das Typ III-Sekretionssystem (TTSS) . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.3 Die Virulenzfunktionen einiger Typ III-Effektoren pflanzenpathogener Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.4 Die R-Protein-vermittelte Abwehr von Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.4.1 R-Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.4.2 Aktivierung der R-Protein-vermittelten Abwehr durch Effektoren 2.1.5 Zusammenfassung der pflanzlichen Abwehr . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Das Pflanzenpathogen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria . . . . . . . . . . . 2.3 Die YopJ-Familie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1 Der Typ III-Effektor XopJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4 Vorarbeiten zu dieser Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 Zielsetzungen dieser Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 5 6 7 9 9 . . . . . . . . . . 11 13 14 15 15 17 18 19 21 21 . . . . . . 23 23 23 23 24 26 27 3 Material und Methoden 3.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.1 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien 3.1.2 Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3 Oligonukleotide und Sequenzierungen . . . . . . 3.1.4 Vektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.5 Bakterienstämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ii INHALTSVERZEICHNIS 3.1.6 Hefestämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 3.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 3.2.1 Anzucht von Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 3.2.2 Pflanzentransformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.2.2.1 Transiente Transformation von Nicotiana benthamiana . . . . . . . 30 3.2.2.2 Stabile Transformation von Nicotiana benthamiana . . . . . . . . . 30 3.2.3 Mikrobiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.2.3.1 Anzucht von Bakterien 3.2.3.2 Anzucht und Transformation von Hefe (Saccharomyces cerevisiae) . 32 3.2.4 Molekularbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.2.4.1 Molekularbiologische Standardmethoden . . . . . . . . . . . . . . 33 3.2.4.2 Ortsgerichtete Mutagenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.2.4.3 Isolierung von Gesamt-DNA aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae) . 33 3.2.4.4 Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen nach Logemann et al. (1987) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 3.2.4.5 Reverse Transkription von RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 3.2.4.6 Quantitative Echtzeit-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.2.4.7 Triparentale Konjugation zur Herstellung einer Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ∆xopJ-Mutante . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.2.4.8 Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung zur Identifizierung von ProteinProtein-Interaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.2.5 Biochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.2.5.1 Induktion und Reinigung von affinitätsmarkierten Proteinen aus E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.2.5.2 Proteinaufreinigung über die GFP-Affinitätsmarkierung aus N. benthamiana für Koimmunpräzipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.2.5.3 Proteingelelektrophorese und Western Blot . . . . . . . . . . . . . 39 3.2.5.4 Western Blot Stripping . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.2.5.5 Subzelluläre Fraktionierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.2.5.6 Isolierung von Proteinen aus apoplastischer Flüssigkeit . . . . . . . 41 3.2.5.7 Säurefällung der apoplastischen Proteine . . . . . . . . . . . . . . 42 3.2.5.8 Proteasomaktivitätstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 3.2.5.9 In vitro-Acetylierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 3.2.5.10 Massenspektrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 3.2.5.11 Nachweis phosphorylierter MAP Kinasen . . . . . . . . . . . . . . 43 3.2.5.12 Anilin-Blau Färbung von Arabidopsis thaliana-Blättern . . . . . . . 44 3.2.6 Mikroskopische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.2.6.1 Fluoreszenzmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.2.6.2 Konfokale Laserscanning Mikroskopie (KLSM) . . . . . . . . . . . 44 INHALTSVERZEICHNIS 4 Ergebnisse iii 45 4.1 Lokalisierung von XopJ in Nicotiana benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 4.1.1 Kolokalisierungsstudien am Konfokalen Laserscanning Mikroskop (KLSM) mit Markerproteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 4.1.2 Subzelluläre Fraktionierung von XopJ-exprimierenden N. benthamiana-Blättern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 4.1.3 Lokalisationsstudien von XopJ C4A-GFP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 4.2 Untersuchungen zum Vesikeltransport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 4.2.1 Konfokal-mikroskopische Analyse zur Inhibierung des Vesikeltransportes in N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 4.2.2 Biochemischer Nachweis der Inhibierung des Vesikeltransports in N. benthamiana durch XopJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 4.2.3 Transgene xopJ-Expression in Arabidopsis unterdrückt die basale Abwehr der Wirtszelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 4.2.4 Signaltransduktionsanalysen während der basalen Abwehr in Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 4.2.5 Beeinflussung des Vesikeltransportes von XopJ-verwandten Effektoren aus Pseudomonas syringae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 4.3 Identifizierung von Interaktionspartnern des Effektors XopJ . . . . . . . . . . . . . 59 4.3.1 Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung zur Identifizierung von Interaktionspartnern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 4.3.2 Lokalisierung von RPT6 in N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 4.3.3 Nachweis der Interaktion zwischen XopJ und RPT6 in Pflanzenzellen . . . . 65 4.4 Analysen zum Einfluss von XopJ auf die Proteasomaktivität in N. benthamiana . . . 66 4.5 Analyse der Proteasomaktivität in transgenen Arabidopsis thaliana nach Expression von xopJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 4.6 Herstellung einer Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ∆xopJ-Mutante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4.7 Messung der Proteasomaktivität während der kompatiblen Interaktion von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mit Paprika (Capsicum annuum ECW) . . . . . . 71 4.8 Studien zur Acetylierung von XopJ und RPT6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 4.8.1 Aufreinigung der Proteine RPT6 und XopJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 4.8.1.1 Aufreinigung von XopJ über MBP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 4.8.1.2 Aufreinigung von RPT6 über GST . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 4.8.2 In vitro-Acetylierung von XopJ und RPT6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 4.8.3 Mutationsanalyse von XopJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 4.8.4 Mutationsanalyse von RPT6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 4.8.5 Aufreinigung von XopJ und RPT6 über GFP zur Identifizierung posttranslationaler Modifikationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4.8.5.1 Massenspektrometrische Analyse von RPT6 und XopJ . . . . . . . 81 iv INHALTSVERZEICHNIS 4.9 Ausschalten von RPT6 in N. benthamiana durch Virus-induzierte Gen-Stilllegung (VIGS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 4.10 Untersuchung der Avirulenzfunktion von XopJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 5 Diskussion 5.1 XopJ wird über eine Myristoylierung mit der Plasmamembran assoziiert . . . . . 5.2 XopJ inhibiert den Vesikeltransport in Nicotiana benthamiana . . . . . . . . . . . 5.3 Die Proteasomuntereinheit RPT6 ist ein mögliches Zielprotein von XopJ in Pflanzenzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4 Das Ubiquitin-Proteasom-System als Virulenzziel für Typ III-Effektoren . . . . . . 5.5 Die biochemische Funktion von XopJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.6 Die Inhibierung der Proteasomaktivität durch XopJ wirkt sich auf den Vesikeltransport aus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.7 Die Avirulenzfunktion von XopJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.8 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literaturverzeichnis 91 . 92 . 94 . 96 . 99 . 102 . 104 . 105 . 107 109 Abbildungsverzeichnis 2.1 Zusammenfassung der Ereignisse während der basalen Abwehr in Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Schematische Darstellung des Typ III-Sekretionssystems . . . . . . . . . . . . . . 2.3 Die zwei Klassen der R-Proteine lösen die Resistenz über unterschiedliche Signalwege aus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4 Zusammenfassung der pflanzlichen Abwehr. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 Proteinsequenzvergleich einiger Mitglieder der YopJ-Familie . . . . . . . . . . . . 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 4.18 4.19 . 8 . 10 . 14 . 16 . 19 Nachweis der Lokalisierung von XopJ an der Plasmamembran . . . . . . . . . . . . Subzelluläre Fraktionierung von XopJ, XopJ C235A und XopJ G2A in N. benthamiana Nachweis der Änderung der Lokalisation von XopJ nach Mutation des Cysteins 4 . Subzelluläre Fraktionierung von XopJ C4A-GFP in N. benthamiana . . . . . . . . . XopJ-GFP ist auch in vesikelähnlichen Aggregaten in N. benthamiana lokalisiert . . Studien zur Inhibierung der Proteinsekretion in N. benthamiana durch XopJ . . . . Konfokale Studien zur Beeinflussung des Proteintransports zur Vakuole durch XopJ. Biochemischer Nachweis der Inhibierung der Proteinsekretion in N. benthamiana . Studien zur Unterdrückung der basalen Abwehr in A. thaliana durch XopJ nach Infektion mit einem avirulenten Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 ∆hrcCStamm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XopJ inhibiert nicht die MAPK-Kaskade während der PAMP-Erkennung in A. thaliana. Expressionsnachweis von xopJ in transgenen Ethanol-induzierten A. thaliana. . . . Phylogenetischer Baum der Typ III-Effektoren der YopJ-Familie. . . . . . . . . . . . Auswirkung der HopZ1a-Expression auf die Proteinsekretion in N. benthamiana . . Test auf direkte Interaktion von potentiellen Interaktionspartnern mit XopJ G2A . . Sequenzvergleich zur Bestimmung der Übereinstimmung der Aminosäuresequenz von RPT6 aus verschiedenen Organismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Untersuchungen zur direkten Interaktion zwischen XopJ G2A und XopJ G2A C235A mit AtRPT6a, AtRPT6b, NtRPT6 und ScRPT6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kolokalisierung von RPT6 und XopJ in N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . Subzelluläre Fraktionierung von RPT6-myc-his-Strep mit und ohne XopJ-GFP in N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . In planta-Studien zur direkten Interaktion von XopJ mit RPT6 . . . . . . . . . . . . v 46 48 49 49 50 50 52 53 54 55 56 57 57 61 62 63 63 64 66 vi ABBILDUNGSVERZEICHNIS 4.20 Koimmunpräzipitation von XopJ mit RPT6 aus N. benthamiana . . . . . . . . . . . 4.21 Überprüfung der Menge an ubiquitinierten Proteinen nach XopJ-Expression in N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.22 Proteasomaktivitätsmessung nach Expression von XopJ und seiner Varianten in N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.23 Proteasomaktivitätsmessung nach Expression von XopJ mit und ohne Proteasominhibitor MG132 in N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.24 Proteasomaktivitätsmessung in EtOH-xopJ-exprimierenden A. thaliana . . . . . . . 4.25 Nachweis der xopJ-Expression in Ethanol-induzierbaren A. thaliana . . . . . . . . . 4.26 Schematische Darstellung der overlap extension-PCR zur Herstellung einer Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ∆xopJ-Mutante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.27 Ergebnis der Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) ∆xopJ-Klonierung . . . . 4.28 Messung der Proteasomaktivität während einer kompatiblen Interaktion zwischen Xcv und Paprika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.29 RPT6-Expression während einer kompatiblen Interaktion zwischen Xcv und Paprika 4.30 MBP-XopJ-Konstrukt zur Expression in E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.31 Ergebnis der Aufreinigung von MBP-markiertem XopJ aus E. coli . . . . . . . . . . . 4.32 Schematische Darstellung des GST-RPT6-Konstruktes zur Aufreinigung aus E. coli . 4.33 Ergebnis der Aufreinigung von GST-RPT6 aus E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.34 In vitro-Acetyltransferase-Test mit GST-RPT6 und MBP-XopJ . . . . . . . . . . . . . 4.35 Vergleich der Aminosäuresequenzen einiger Effektoren der YopJ-Familie . . . . . . 4.36 Test auf direkte Interaktion von XopJ G2A K300R mit RPT6 . . . . . . . . . . . . . 4.37 Proteasomaktivitätsmessung nach Expression von XopJ und XopJ K300R in N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.38 Vergleich der Aminosäuresequenzen von RPT6 aus Mensch, Maus, Ratte, Drosophila, Hefe, Arabidopsis und Tabak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.39 Test auf direkte Interaktion von XopJ G2A mit NtRPT6 S130D und NtRPT6 S130A . 4.40 Ergebnis der Aufreinigung von RPT6-GFP und XopJ-GFP aus N. benthamiana . . . . 4.41 Mascot-Ergebnis der Suchanfrage mit den variablen Modifikationen Oxidation und S-Acetylierung: Gefundene Peptide aus Probe 1 (RPT6-GFP) . . . . . . . . . . . . . 4.42 Mascot-Ergebnis der Suchanfrage mit den variablen Modifikationen K-Acetylierung, T-Acetylierung, S-Acetylierung und N-Acetylierung: Gefundene Peptide aus Probe 1 (RPT6-GFP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.43 Mascot-Ergebnis der Suchanfrage mit den variablen Modifikationen Oxidation und S-Acetylierung: Gefundene Peptide aus Probe 2 (RPT6-GFP koexprimiert mit XopJmyc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.44 Mascot-Ergebnis der Suchanfrage mit den variablen Modifikationen K-Acetylierung, T-Acetylierung, S-Acetylierung und N-Acetylierung: Gefundene Peptide aus Probe 2 (RPT6-GFP koexprimiert mit XopJ-myc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.45 Mascot-Ergebnis der Suchanfrage mit den variablen Modifikationen K-Acetylierung und Oxidation: Gefundene Peptide aus Probe 3 (XopJ-GFP) . . . . . . . . . . . . . 67 68 69 69 70 71 72 72 73 74 74 75 76 76 77 78 78 79 80 81 82 83 83 83 84 84 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 4.46 Virus-induzierte Gen-Stilllegung (VIGS) von RPT6 in N. benthamiana . . . . . . . 4.47 Studien zur Auslösung der hypersensitiven Reaktion nach Expression von XopJmyc in pTRV-NPR1-N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.48 Studien zur Auslösung der hypersensitiven Reaktion nach Expression von XopJmyc in pTRV-SGT1, pTRV-EDS1 und pTRV-RAR1-N. benthamiana . . . . . . . . . . 4.49 Ergebnis der semi-quantitativen RT-PCR Zur Überprüfung der Herunterregulierung von EDS1, SGT1, NPR1 und RAR1 in N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . 4.50 Expressionsnachweis von XopJ-myc, XopJ C235A-myc, XopJ G2A-myc und Sp2myc in pTRV-GFPsil-, pTRV-NPR1-, pTRV-SGT1-, pTRV-EDS1- und pTRV-RAR1-N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii . 87 . 88 . 89 . 90 . 90 5.1 Arbeitshypothese des Wirkmechanismus von XopJ auf das Proteasom . . . . . . . . 103 viii ABBILDUNGSVERZEICHNIS Tabellenverzeichnis 2.1 Übersicht über bekannte Typ III-Effektoren der YopJ-Familie und deren Funktionen 20 4.1 Beste blastx-Treffer der durch eine Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung identifizierten möglichen Interaktionspartner von XopJ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 4.2 Übersicht als acetyliert annotierter Peptide der Proben 1 und 2 (RPT6) . . . . . . . 85 4.3 Übersicht als acetyliert annotierter Peptide der Probe 3 (XopJ) . . . . . . . . . . . . 86 ix x TABELLENVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis A. thaliana Arabidopsis thaliana A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens bp Basenpaare bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius ca. circa CFU colony forming units; [dt.] Kolonien bildende Einheiten cm Zentimeter DEPC Diethylpyrocarbonate E. coli Escherichia coli ER endoplasmatisches Retikulum g Erdbeschleunigung g g Gramm GFP grün-fluoreszierendes Protein HR hypersensitive Reaktion INA 2,6-Dichloroisonikotinsäure kb Kilobasen kDa Kilodalton KLSM Konfokale Laserscanning Mikroskopie l Liter M Molar mA Milliampere mCi Millicurie mg Milligramm ml Milliliter mm Millimeter mM Millimolar mW Milliwatt µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer µM Mikromolar N Normal N. benthamiana Nicotiana benthamiana nm Nanometer nM Nanomolar N. tabacum Nicotiana tabacum oD600 optische Dichte bei 600 nm PCR Polymerase-Kettenreaktion Pst DC3000 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 pv. pathovar PVPP Polyvinylpyrrolidon S Svedberg; Sedimentationskoeffizient SA Salicylsäure S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SDS sodium dodecyl sulfate; [dt.] Natriumdodecylsulfat TCA trichloroacetic acid; [dt.] Trichloressigsäure UE Untereinheit Upm Umdrehungen pro Minute UTR untranslated region; [dt.] untranslatierter Bereich VIGS Virus-induzierte Gen-Stilllegung w/v Gewicht pro Volumen Xcv Xanthomonas campestris pv. vesicatoria xi 1 Zusammenfassung Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) ist der Erreger der bakteriellen Fleckenkrankheit in Tomaten (Solanum lycopersicum) und Paprika (Capsicum annuum). Bei Xanthomonas handelt es sich um ein biotrophes Pathogen, das auf lebende Wirtszellen angewiesen ist. Die Krankheit äußert sich in Blättern durch wassergefüllte Läsionen und Hypertrophie der Mesophyllzellen. Während der Besiedlung einer Pflanze injiziert Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mehr als 30 Effektorproteine über das Typ III-Sekretionssystem in das Zytosol der Pflanzenzelle. Dort können Effektoren die Krankheit fördern, indem sie einerseits den Stoffwechsel des Wirtes zu ihren Gunsten umlenken und andererseits indem sie die Abwehrantworten des Wirtes inhibieren. Hierbei spricht man von einer kompatiblen Interaktion. Allerdings können Pflanzen auch einige Effektoren durch spezialisierte Resistenzproteine erkennen und zur Eindämmung des Bakterienwachstums eine hypersensitive Reaktion (HR), gefolgt von lokalem Zelltod, induzieren. Hierbei handelt es sich um die Effektor-vermittelte Immunität (ETI: effector triggered immunity) und eine inkompatible Interaktion. Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Effektorprotein XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria funktionell weiter charakterisiert werden. Bei XopJ handelt es sich um einen Typ IIIEffektor der YopJ-Familie, die sowohl in tier- als auch in pflanzenpathogenen Bakterien verbreitet ist. Transiente Expression eines XopJ-GFP-Fusionsproteins zeigte eine Lokalisierung des Effektors an der Plasmamembran der Pflanzenzelle. Mutationsanalysen legten weiterhin nahe, dass diese Lokalisierung durch eine Myristoylierung und wahrscheinlich auch durch eine Palmitoylierung am N-Terminus des Proteins vermittelt wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass XopJ die Sekretion eines GFP-Reporterproteins (secGFP) in den Apoplasten hemmt und darüber hinaus 1 2 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG die durch PAMPs (pathogen-associated molecular pattern) ausgelöste Ablagerung von Kallose an der Zellwand unterdrückt. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass XopJ Teile der Zellwandassoziierten basalen Abwehr in Pflanzen unterdrücken kann. Diese Virulenzfunktionen waren sowohl von einer intakten katalytischen Triade des Effektors, als auch von einem funktionalen Myristoylierungssignal abhängig. Unter Einsatz des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems wurde RPT6 als ein möglicher Interaktionspartner von XopJ in Pflanzen identifiziert. Die Interaktion zwischen XopJ und RPT6 konnte auch in planta sowohl durch Koimmunpräzipitations- als auch durch Bimolekulare Fluoreszenzkomplementationsexperimente bestätigt werden. RPT6 ist Bestandteil der regulatorischen 19 S-Untereinheit des 26 S-Proteasoms in Eukaryoten. Die Messung der Proteasomaktivität in transient XopJ-exprimierenden Blättern zeigte, dass die Interaktion des Effektors mit RPT6 zu einer Hemmung der Proteasomaktivität und zur Akkumulation ubiquitinierter Proteine in der Pflanzenzelle führt. Dieser Effekt war wiederum abhängig von einer intakten katalytischen Triade und der Myristoylierung des Effektors. Durch Verwendung einer Xcv xopJ-Verlustmutante konnte gezeigt werden, dass XopJ wahrscheinlich für die Reduzierung der Proteasomaktivität während einer kompatiblen Interaktion mit Paprika verantwortlich ist. Diese Daten deuteten darauf hin, dass XopJ möglicherweise durch Verminderung der Proteasomaktivität Abwehrreaktionen der Pflanze unterdrückt und impliziert eine Rolle des Proteasoms in der basalen Abwehr von Pflanzen. Um die Wirkungsweise von XopJ biochemisch zu untersuchen, wurde in E. coli exprimiertes XopJ auf eine mögliche Acetyltransferaseaktivität hin getestet. Allerdings konnten diese Experimente eine enzymatische Aktivität von XopJ bisher nicht belegen, obwohl die Mutation eines in den möglichen katalytischen Mechanismus involvierten Lysinrestes im XopJ-Polypeptid die Interaktion mit RPT6 und auch den Hemmeffekt auf das Proteasom unterbindet. Insofern bleibt die biochemische Funktion von XopJ im Moment noch unklar. Die Behandlung von XopJ-exprimierenden Blättern von Nicotiana benthamiana mit Salicylsäure (SA) führte zur Auslösung einer HR. Herunterregulierung von Komponenten der R-Proteinvermittelten Reaktion mittels Virus-induzierter Gen-Stilllegung (VIGS) legen die Beteiligung eines R-Proteins an der Auslösung der HR nahe. Außerdem wurde die Rolle einiger Komponenten des SA-Signaltransduktionsweges bei der Auslösung der HR nach XopJ-Expression untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die HR unabhängig von NPR1, RAR1 und EDS1 war. In EDS1herunterregulierten Pflanzen wurde eine HR auch in Abwesenheit von SA ausgelöst. 1 Summary Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) is the causative agent of bacterial spot disease in tomato (Lycopersicum esculentum) and pepper (Capsicum annuum). Xanthomonas is a biotrophic pathogen and therefore it depends on living host cells. Water-soaked lesions and hypertrophy of mesophyll cells are the characteristics of this disease. During infection Xcv injects, via its type III secretion system, more than 30 effector proteins into the cytosol of plant cells. Once inside the cell, effectors can promote infection by redirecting the host’s metabolism to their own favour and by inhibiting the immune responses. This is called a compatible interaction. However, plants are able to recognize some effectors via specialised resistance proteins that leads to hypersensitive response (HR) and thus to the induction of a local cell death – consequently restricting bacterial growth. This effector-triggered immunity (ETI) is called an incompatible interaction. In this work, the effector protein XopJ from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria could be further functionally characterised. XopJ is a type III effector of the YopJ family. This family is prevalent in animal as well as in plant pathogenic bacteria. Transient expression of XopJ-GFP fusions showed a localisation of the effector at the plasma membrane of plant cells. Mutational analyses indicated that the localisation is mediated by myristoylation and, most likely, by palmitoylation at the N terminus of the protein. Furthermore, it could be shown that XopJ inhibits the secretion of a GFP reporter protein (secGFP) to the apoplast. In addition to that, the XopJ effector also suppressed PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced deposition of callose at the cell wall. These results suggested that XopJ can prevent cell wall-associated basal defence in plants. These virulence functions were dependent on an intact catalytic triad and on a functional myristoylation motif. Using the yeast-two hybrid system, RPT6 was identified as a putative interaction partner 3 4 KAPITEL 1. SUMMARY of XopJ in plants. This interaction could also be confirmed in planta by co-immunoprecipitations and bimolecular fluorescence complementation experiments. RPT6 is a component of the 19 S subunit of the 26 S proteasome in eukaryotes. Measurement of the proteasome activity in leaves that transiently expressed XopJ showed that the interaction between effector and RPT6 leads to an inhibition of the proteasome activity and accumulation of ubiquitinated proteins in plant cells. Again, this effect was dependent on the intact catalytic triad and the myristoylation of the effector. By using a Xcv xopJ deletion mutant, it was shown that XopJ is probably responsible for the attenuation of proteasome activity during compatible interaction with pepper. These data indicate that XopJ possibly suppresses the plant’s defence reactions by reduction of the proteasomal activity, implicating that the proteasome becomes important during basal defence of plants. In order to biochemically investigate the mode of action of XopJ, the effector was expressed in E. coli and tested for possible acetyltransferase activity. Although the mutation of a lysine residue, located in the XopJ polypeptide and possibly involved in a catalytic mechanism, eliminates the interaction of the effector with RPT6 and suppresses the inhibition of the proteasome activity, these experiments could not substantiate an enzymatic activity of XopJ. Thus, the biochemical activity still remains obscure. The treatment of XopJ-expressing Nicotiana benthamiana leaves with salicylic acid (SA) triggered a HR. Silencing components of the R protein-mediated reaction via virus induced gene silencing (VIGS) suggested that a R protein is involved in the HR activation. In addition, the role of some components of SA signalling were analysed in the activation of the HR subsequent to XopJ expression thereby showing the independence between HR and NPR1, RAR1, and EDS1. Even in the absence of SA, the HR was triggered in EDS1-silenced plants. 2 Einleitung 2.1 Die Interaktion zwischen Pflanzen und Pathogenen Aufgrund ihrer sessilen Lebensweise müssen sich Pflanzen an ihre Umgebung schnell anpassen können. Dazu zählt auch biotische Stressoren, wie z.B. Pathogene, abzuwehren. Zu den Pathogenen gehören sowohl Herbivoren, Nematoden und Pilze als auch Viren und Bakterien mit jeweils unterschiedlichen Spezies und Gruppen. Trotz dieser Vielzahl verschiedener Pathogene treten Krankheiten in der Natur relativ selten auf, denn die Pflanze verfügt über ein sehr effizientes Abwehrsystem, wodurch die Mehrzahl der Pathogenkontakte in einer dauerhaften Nicht-WirtResistenz mündet. Allerdings verfügen Pflanzen nicht über spezialisierte Immunzellen, sondern jede Zelle ist in der Lage, sich autonom zu verteidigen. Außerdem können Pathogene oft nicht direkt die Epidermis des Pflanzenblattes durchdringen, sondern benötigen natürliche Öffnungen, wie z.B. Stomata, Hydathoden oder Wunden. Löst ein Pathogen in der Pflanze eine Krankheit aus, so spricht man von einer kompatiblen Interaktion. Das Pathogen wird dann als virulent bezeichnet. Ist die Pflanze dagegen resistent, so handelt es sich um eine inkompatible Interaktion und das Pathogen ist avirulent. Im Allgemeinen gelingt es nur wenigen spezialisierten Pathogenen die Abwehr bestimmter Pflanzen zu durchbrechen und diese anschließend erfolgreich zu besiedeln. Die der pflanzlichen Abwehr zugrunde liegenden Mechanismen und die Strategien bakterieller Pathogene diese zu überwinden, sollen in den folgenden Abschnitten genauer beschrieben werden. 5 6 2.1.1 KAPITEL 2. EINLEITUNG Die basale Abwehr von Pflanzen Hat ein potentielles Pathogen die präformierten und physikalischen Barrieren der Pflanze, wie die Kutikula, die Zellwände und antimikrobielle Substanzen überwunden, kann im Gewebe durch eine Rezeptor-vermittelte Erkennung die sogenannte basale Abwehr ausgelöst und das Pathogen in den meisten Fällen abgewehrt werden. Zu den Auslösern der basalen Immunantwort in Pflanzen (PTI: PAMP-triggered immunity) zählen sogenannte PAMPs oder MAMPs (pathogenassociated molecular patterns oder microbe-associated molecular patterns). Dies sind in der Regel hoch-konservierte Moleküle mit essentieller Funktion, die in den meisten Mikroorganismen einer Gruppe vorkommen, aber in Pflanzen abwesend sind. Bekannte PAMPs aus Pilzen sind z.B. Chitin und Ergosterol. Oomyceten werden meist durch β-Glukane, Elicitine oder Transglutaminasen von den Pflanzen erkannt. Zu den bakteriellen PAMPs zählen Lipopolysaccharide, Kälte-SchockProteine, Flagellin und der Elongationsfaktor EF-Tu (Nürnberger et al., 2004). Erkannt werden PAMPs in Pflanzen durch spezielle Rezeptoren, sogenannte PRRs (pattern recognition receptors). Die Rezeptoren für PAMPs sind aus einer extrazellulären Leucin-reichen Domäne (LRR: leucine-rich repeat), einer Transmembrandomäne und einer Rezeptorkinase-Domäne (RLK: receptor-like kinase) aufgebaut (Segonzac und Zipfel, 2011; Nicaise et al., 2009). Ein gut untersuchtes Beispiel für einen PRR ist FLS2 (flagellin sensing 2) aus Arabidopsis, welcher das PAMP flg22, ein 15 bis 22 Aminosäure langes Peptid aus Flagellin (Felix et al., 1999) erkennt (Gómez-Gómez und Boller, 2000). Die acetylierten Peptide elf18 und elf26 des bakteriellen Elongationsfaktors EF-Tu, der in E. coli flic- -Mutanten erstmals entdeckt wurde, werden von Pflanzen durch die LRR-Rezeptorkinase EFR detektiert (Kunze et al., 2004; Zipfel et al., 2006). Ein großer Teil der PAMPs, wie z.B. flg22, sind in vielen Pflanzen wirksam. Der PRR EFR scheint jedoch nur in Brassicaceen vorhanden zu sein. Somit ist EF-Tu nur in dieser Familie fähig, eine Immunantwort auszulösen (Kunze et al., 2004; Lacombe et al., 2010). Bei Aktivierung mit dem entsprechenden PAMP assoziieren sowohl FLS2 als auch EFR mit BAK1 (BRI1-assoziierte Rezeptor-Kinase 1; Chinchilla et al. (2007)). BAK1 kodiert ebenfalls für ein LRR-RLK und reguliert in nicht-infizierten Zellen den Brassinosteroid-Rezeptor BRI1 (Li et al., 2002; Nam und Li, 2002). In bak1-Mutanten ist die frühe Immunantwort nach Aktivierung durch flg22 oder elf18/26 stark reduziert, was auf einen Beitrag zur Abwehr und zur Erkennung der PAMPs flg22 und elf18/26 hindeutet (Chinchilla et al., 2007). Eines der ersten Reaktionen nach PAMP-Erkennung durch die PRRs der Wirtszelle ist die Membrandepolarisation gefolgt von einer Ansäuerung des Zytosols, der Alkalinisierung des Apoplasten und der Steigerung der intrazellulären Calcium-Konzentration. Die Öffnung von Membrankanälen oder die Aktivierung von Calcium-abhängigen Proteinkinasen zählen zu den möglichen Folgen dieser Erhöhung (Mathieu et al., 1991; Blume et al., 2000; Lecourieux et al., 2002). Anschließend kommt es zur gesteigerten Produktion von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS: reactive oxygen species). Diese wirken antibiotisch und als sekundäre Stress-Signale, um weitere Abwehrantworten einzuleiten (Apel und Hirt, 2004). Außerdem wird eine MAP Kinase (Mitogen-aktivierte Protein Kinase)-Kaskade aktiviert. Zu den am besten untersuchten MAP Kinase-Kaskaden in Pflanzen zählt die aus Arabidopsis thaliana. 2.1. DIE INTERAKTION ZWISCHEN PFLANZEN UND PATHOGENEN 7 Eine Folge der FLS2-Aktivierung ist die Phosphorylierung der MAPKK Kinase (MAP Kinase Kinase Kinase) AtMEKK1. Diese wiederum aktiviert die MAPK Kinasen AtMKK4 und AtMKK5, welche das Signal an die MAP Kinasen AtMPK3 und AtMPK6 weiterleiten (Asai et al., 2002; Tena et al., 2011). Sowohl in Petersilie, in Arabidopsis thaliana als auch in Reis konnte gezeigt werden, dass aktivierte MAP Kinasen in den Kern transloziert werden können, wo sie ihrerseits Transkriptionsfaktoren durch Phosphorylierung aktivieren, die wiederum die Expression Abwehr-spezifischer Gene induzieren (Lee et al., 2004; Ahlfors et al., 2004; Cheong et al., 2003). In A. thaliana sind unter anderem die Transkriptionsfaktoren der WRKY-Familie für die Aktivierung von Abwehrgenen verantwortlich (Asai et al., 2002). Ein weiterer Effekt der basalen Abwehr ist die Produktion des Stresshormons Ethylen durch Erhöhung der Aktivität der ACC-Synthase (1-Aminocyclopropan-1-Carboxylat-Synthase; Spanu et al. (1994)). Nach Aktivierung der basalen Immunantwort durch flg22 oder elf26 in A. thaliana werden mehr als 1000 Gene induziert und einige 100 reprimiert. Interessanterweise werden auch einige PRRs induziert, was zu einer positiven Rückkopplung und damit zu einer verstärkten Immunantwort führt (Zipfel et al., 2006). Des Weiteren werden vor allem Pathogenese-bezogene Gene (PR: pathogenesis-related), wie z.B. PR-5, induziert. Auch die Expression des Salicylsäureinduzierten Gens PR-1 und des Jasmonat-induzierten Gens PDF1.2 ist nach flg22-Behandlung in A. thaliana erhöht. Des Weiteren erfolgt eine Zellwandverstärkung durch Kallose. Durch die PR-Protein-Produktion und Verstärkung der Zellwand kann die Ausbreitung der Bakterien limitiert werden (Gómez-Gómez et al., 1999). Die basale Abwehr von Pflanzen ist in Abbildung 2.1 zusammengefasst. 2.1.1.1 Die Rolle des Vesikeltransportes während der Abwehr in Pflanzen Die Translation der Proteine, die in den Apoplasten oder zur Plasmamembran transportiert werden sollen, erfolgt in das endoplasmatische Retikulum (ER). Anschließend werden sie in Vesikel verpackt, die sich dann vom ER abschnüren und über den Golgi-Apparat zu Plasmamembran transportiert werden. Dort verschmelzen die Vesikel mit der Plasmamembran und der Inhalt wird exozytiert. Zur Verschmelzung der Vesikel mit einer Membran benötigt die Zelle spezielle Proteine, die SNAREs (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor (NSF)- adapter protein (SNAPs)receptor (SNARE)), wobei sich an den Transportvesikeln die v-SNAREs (Vesikel-SNAREs) befinden und an der Zielmembran die t-SNAREs (target-SNAREs; Sanderfoot et al. (2000)). Alle SNAREs besitzen einen zytosolischen (löslichen) N-Terminus und einen membrandurchspannenden C-Terminus (Blatt et al., 1999). Zu den t-SNAREs gehören auch die Syntaxine und die SNAPProteine (NSF-sensitive Adapterproteine; Blatt et al. (1999)). In Arabidopsis gibt es 24 Syntaxine, die sich in acht Familien einteilen lassen. Die Syntaxine der Gruppe 1, z.B. AtSYP121 sind an der Plasmamembran von Schließzellen lokalisiert und von NtSYR1, dem Tabak-Homolog von AtSYP121, ist bereits bekannt, dass es eine Rolle beim Abscisinsäure-Signalweg spielt (Leyman et al., 1999; Sanderfoot et al., 2000). Für die Vesikelfusion an Membranen bilden vier Helices einen Komplex, bestehend aus drei t-SNAREs (ein Syntaxin und zwei weitere SNAREs) und einem v-SNARE. Damit verschmilzt der 8 KAPITEL 2. EINLEITUNG PAMPs PR-Proteine LRRRLK (PRR) Kalloseablagerungen BAK1 FLS2: Endozytose Positive Rückkopplung [Ca2+↑] MAPKKK MAPKK MAPK P P [ROS ↑] MAP Kinase-Kaskade P Nucleus WRKY EFR FLS2 PR-5 Apoplast Abbildung 2.1: Zusammenfassung der Ereignisse während der basalen Abwehr in Arabidopsis thaliana. Werden PAMPs wie z.B. flg22 oder EF-Tu von Rezeptoren (PRRs: pattern recognition receptors) an der Plasmamembran detektiert, kommt es zu einer Konformationsänderung des Rezeptors, zur Erhöhung der Calcium-Konzentration und von reaktiven SauerstoffIntermediaten (ROS) innerhalb der Zelle. Eine weitere Folge der PAMP-Bindung an PRRs ist die Aktivierung der MAP Kinase-Kaskade. Das führt wiederum zu einer Aktivierung von WRKYTranskriptionsfaktoren, welche die Expression von mehr als 1000 Genen induzieren, darunter auch PR-Proteine und PRRs. Die Aktivierung von PRRs führt zu einer positiven Rückkopplung und einer verstärkten Immunabwehr. Daraus resultiert eine eingeschränkte Ausbreitung der Pathogene. Zur mechanischen Verstärkung der Zellwand wird Kallose an die Peripherie der Zelle abgelagert. Vesikel mit der Membran und entlässt seinen Inhalt. Durch die ATPase-Funktion von NSF wird diese Formation wahrscheinlich wieder aufgelöst (Sanderfoot et al., 2000). Bei Pathogenbefall werden Hydrozimtsäureamide über Vesikel zur Plasmamembran befördert, um dort sogenannte Papillen zur Verstärkung der Zellwand zu bilden (Blatt et al., 1999). Die folgenden Beispiele sollen die entscheidende Rolle des sekretorischen Signalwegs während einer Infektion aufzeigen. Das SNAP-Protein aus A. thaliana, AtSNAP33, ist während einer Infektion induziert, und zwar nicht nur in direkt infizierten, sondern auch in systemischen Blättern (Wick et al., 2003). Allerdings ist die systemische Induktion von AtSNAP33 von Salicylsäure, ein essentieller Induktor der systemischen Resistenz (SAR: systemic acquired resistance), abhängig. Auch nach mechanischer Belastung und Verwundung ist die Expression dieses Proteins induziert (Wick et al., 2003). 2.1. DIE INTERAKTION ZWISCHEN PFLANZEN UND PATHOGENEN 9 Für die Ausbildung der SAR sind ebenfalls Proteine des sekretorischen Signalweges verantwortlich, die wiederum von NPR1 (nonexpresser of PR-1) kontrolliert werden. NPR1 kann allerdings die Expression dieser Gene nur in Anwesenheit von Salicylsäure induzieren (Wang et al., 2005). Studien zeigen, dass auch PEN1, ein Arabidopsis Syntaxin, an der Penetrationsstelle bei Pilzinfektion akkumuliert (Bhat et al., 2005). NbSYP132 ist ein t-SNARE aus Nicotiana benthamiana, das für die Exozytose von Vesikeln mit antimikrobiellen PR-Proteinen verantwortlich ist. Des Weiteren spielt NbSYP132 auch eine Rolle bei der SAR und der durch PAMPs ausgelösten basalen Abwehr (Kalde et al., 2007). Diese Beispiele lassen darauf schließen, dass die Induktion des sekretorischen Signalwegs nach Infektion dazu führt, die Zelle auf immunbasierte Exozytose vorzubereiten (Robatzek, 2007). 2.1.2 Virulenzfaktoren gramnegativer pflanzenpathogener Bakterien Um das Abwehrsystem der Pflanze zu unterdrücken und eine effiziente Besiedlung des Wirtes zu ermöglichen, haben gramnegative pflanzenpathogene Bakterien eine Reihe verschiedener Virulenzfaktoren entwickelt. Dazu gehören Toxine, Zellwand-lytische Enzyme, Proteasen, Lipasen, extrazelluläre Polysaccharide, sowie Proteinfaktoren, welche durch einen spezialisierten Sekretionsapparat direkt in das Zytosol der Wirtszelle injiziert werden und zum Vorteil des Bakteriums wirken oder dort auf Komponenten der Abwehr stoßen. Unter den Letzteren nehmen die sogenannten Typ III-Effektorproteine eine zentrale Stellung innerhalb der Virulenzfaktoren gramnegativer pflanzenpathogener Bakterien ein, da sie für die Pathogenität essentiell sind. 2.1.2.1 Das Typ III-Sekretionssystem (TTSS) Gramnegative pflanzenpathogene Bakterien translozieren Effektorproteine über das Typ III-Sekretionssystem in die Pflanzenzelle. Effektoren wurden ursprünglich wegen ihrer Fähigkeit einen Zelltod auslösen zu können, auch Avirulenzproteine genannt. Damit ein Effektorprotein transloziert werden kann, muss das entsprechende Protein ein Translokationssignal besitzen. Zunächst ging man davon aus, dass das Signal am N-Terminus der Aminosäuresequenz sitzen muss. Doch Mutationsstudien ergaben, dass es auch in der 5’-Region der mRNA-Sequenz kodiert sein kann. Dort bildet die mRNA eine Schleife, die dafür sorgt, dass der Effektor erst dann translatiert wird, wenn er mit Komponenten (Chaperone, ATPasen) des Sekretionskomplexes interagiert (Galán und Collmer, 1999). Werden die Proteine als zu translozierende Effektoren erkannt, werden diese in das Zytosol der Pflanze sekretiert und können von dort aus Veränderungen im Metabolismus des Wirtes bewirken. Die Sekretion dieser Proteine erfolgt über einen hochkonservierten Komplex. Dieser kommt sowohl in bakteriellen Tier- als auch in Pflanzenpathogenen vor. In den vier Hauptgattungen der gramnegativen Pflanzenpathogene, Erwinia, Pseudomonas, Ralstonia und Xanthomonas übernimmt diese Aufgabe das Typ III-Sekretionssystem (Bonas, 1994; Collmer und Bauer, 1994). Das Typ III-Sekretionssystem ist den bakteriellen Flagellen sehr ähnlich, weshalb diese als Vorläufer des Typ III-Sekretionsapparats diskutiert wurden (Macnab, 1999). Allerdings sind die Gene für den Typ III-Sekretionsapparat isoliert vom restlichen Bakteriengenom in einem sogenannten 10 KAPITEL 2. EINLEITUNG hrp (hypersensitive response and pathogenicity)-Gencluster innerhalb von Pathogenitätsinseln angeordnet, was darauf schließen lässt, dass das Sekretionssystem ursprünglich über horizontalen Gentransfer erworben wurde (Nguyen et al., 2000; Gophna et al., 2003). Das Typ III-Sekretionssystem ist aus über 20 Proteinen aufgebaut und besteht aus einem Komplex, der die innere Bakterienmembran, den periplasmatischen Raum, die Peptidoglykanschicht und die äußere Membran durchspannt (Abbildung 2.2). Daran schließt sich der sogenannte Nadelkomplex an. Dieser bildet eine Brücke zwischen Bakterium und Pflanzenzelle und durchspannt sowohl die innere als auch die äußere Bakterienmembran. Der Nadelkomplex ist z.B. in Salmonella typhimurium ca. 120 nm lang und ähnelt dem Basalkörper der Flagellen. Eine zylinderförmige Basis verankert die Nadel an der Bakterienmembran (Galán und Collmer, 1999). Es wird vermutet, dass eine Translokationspore in der Wirtsmembran gebildet wird und dadurch die Effektoren in das Wirtszytosol gelangen (Blocker et al., 1999; Tardy et al., 1999). Einige der Typ III-Effektoren besitzen am N-Terminus eine Typ III-Chaperonbindestelle. Typ III-Chaperone sorgen für die Entfaltung der Effektoren bevor sie durch das Typ III-Sekretionssystem in das Wirtszytosol transloziert werden und sich nicht schon im bakteriellen Zytosol falten und mit bakteriellen Proteinen assoziieren. Eine zu frühe Faltung würde zum Abbau des Effektors führen. Eine ATPase im Zytosol der Bakterien sorgt durch ATP-Hydrolyse für die Bereitstellung der für den Sekretionsprozess benötigten Energie (Galán und Collmer, 1999). Abbildung 2.2 verdeutlicht den schematischen Aufbau des TTSS. Vergleichende DNA-Analysen zeigen, dass neun der Typ III-Sekretionsgene zwischen Pflanzenund Tierpathogenen konserviert sind. Diese Gene kodieren für Proteine der äußeren Membran, fünf Proteine der inneren Membran sowie für zwei zytosolische Proteine, darunter auch die oben genannte ATPase. Diese Gene werden als hrc-Gene (HR conserved) bezeichnet. Acht von diesen sind auch zu den fli/flh-Genen aus E. coli homolog, die einen Sekretionsapparat bilden, der den Aufbau von Flagellen reguliert (Bogdanove et al., 1996). Das Typ III-Sekretionssystem ist allerdings nicht konstitutiv exprimiert, sondern streng reguliert, sowohl auf transkriptioneller als auch translationaler Ebene. So spielen z.B. der pH-Wert, die Osmolarität oder die CalciumKonzentration der Umgebung bei der Expression des TTSS eine entscheidende Rolle (Galán und Collmer, 1999). 2.1.3 Die Virulenzfunktionen einiger Typ III-Effektoren pflanzenpathogener Bakterien Eine der Hauptfunktionen von Typ III-Effektoren, neben der Umlenkung des Wirtsstoffwechsels zu Gunsten der Pathogene, ist die Unterdrückung der pflanzlichen Abwehr. Besonders effektive Ziele von Typ III-Effektoren sind z.B. die Signalweiterleitung nach PAMP-Perzeption, die Transkription immunspezifischer Gene oder die Sekretion von antimikrobiellen Proteinen in den Apoplasten. Neuere Studien zeigen auch die Interaktion von bakteriellen Proteinen mit dem Ubiquitin-Proteasom-Weg des Wirtes (Dong et al., 2006; Zeng et al., 2006; Vierstra, 2009; Schellenberg et al., 2010; Perrett et al., 2011). Die Signalkaskade der basalen Abwehr beginnt bereits bei den PRR-Rezeptoren. Einige Effektoren können z.B. direkt mit dem zytosolischen Teil der Immunrezeptoren interagieren. 11 2.1. DIE INTERAKTION ZWISCHEN PFLANZEN UND PATHOGENEN Effektoren Wirtsmembran äußere Bakterienmembran Peptidoglykanschicht innere Bakterienmembran Abbildung 2.2: Schematische Darstellung des Typ III-Sekretionssystems. Abbildung verändert nach Cambronne und Roy (2006). Effektoren Unter diesen Effektoren befindet sich auch AvrPto aus Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst). Dieses Bakterium ist der Erreger der bakteriellen Fleckenkrankheit in Tomaten. Obwohl AvrPto ursprünglich durch die Auslösung der ETI (effector-triggered immunity; Abschnitt 2.1.4) und die Auslösung einer hypersensitiven Reaktion (HR) in Tomaten identifiziert wurde, kann dieser Effektor in einigen Genotypen auch die basale Abwehr von Pflanzen durch die Interaktion mit den LRR-RLK-Rezeptoren FLS2 und EFR inhibieren (He et al., 2006; Xiang et al., 2008). Dabei unterdrückt AvrPto wahrscheinlich die Kinaseaktivität dieser Rezeptoren (Xiang et al., 2008). Durch seine N-Myristoylierungsstelle ist AvrPto an der Plasmamembran lokalisiert und damit im gleichen Kompartiment wie die Immunrezeptoren FLS2 und EFR (Shan et al., 2000). Der Effektor AvrPtoB aus Pseudomonas syringae besitzt E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität und vermittelt den Abbau von FLS2 durch das 26 S-Proteasom (Abramovitch et al., 2006; Göhre et al., 2008). XopN ist ein Typ III-Effektor aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), der sowohl mit einer LRR-Rezeptorkinase (TARK1) an der Plasmamembran von Tomatenzellen als auch mit dem 14-3-3-Protein TFT1 im Zytosol interagieren kann. Die Expression von XopN resultiert in einer verminderten PR-Gen-Expression und reduzierten Kalloseablagerungen, was auf eine Inhibierung der basalen Abwehr an einem frühen Schritt hinweist (Kim et al., 2009). In weiterführenden Untersuchungen konnte XopN als Gerüstprotein für die Interaktion mit TARK1 und TFT1 identifiziert werden. Bei TFT1 handelt es sich wahrscheinlich um einen positiven Regulator der PAMPvermittelten Abwehr, der das Xcv-Wachstum während der Infektion unterdrückt. Durch die Interaktion mit XopN könnte er inhibiert werden. Somit fördert die Translokation von XopN die Virulenz von Xcv (Taylor et al., 2012). 12 KAPITEL 2. EINLEITUNG Neben der Inhibierung der basalen Abwehr durch Beeinträchtigung der MAP Kinase-Kaskade, ist die Beeinflussung der transkriptionellen Aktivität ebenfalls ein Virulenzziel für Typ III-Effektoren. Der Effektor XopD aus Xcv ist im pflanzlichen Zellkern, in subnukleären Punkten, lokalisiert (Hotson et al., 2003). Diese Lokalisierung lässt darauf schließen, dass XopD an DNA bindet und die Transkription im Wirt reguliert (Hotson et al., 2003; Kim et al., 2008). Kim et al. (2008) konnten zeigen, dass XopD die Transkription von Seneszenz- und Abwehrgenen manipuliert. Des Weiteren verlangsamt der Effektor die Entwicklung von Krankheitssymptomen und den Chlorophyllabbau durch Verzögerung der Salicylsäure-induzierten Seneszenz in Tomaten, so dass sich Xcv besser vermehren kann. Die verzögerte Krankheitsentwicklung äußert sich in einer Reduzierung der Menge an Salicylsäure nach Infektion, was zu einer abgeschwächten Abwehr der Pflanze führt (Kim et al., 2008). Darüber hinaus interagiert der XopD-Effektor aus dem Xanthomonas campestris pv. campestris-Stamm B100 mit dem Transkriptionsfaktor MYB30 und reprimiert dessen Aktivität. MYB30 ist ein positiver Regulator, der die Etablierung von Zelltodsymptomen während einer Infektion sicherstellt (Vailleau et al., 2002; Canonne et al., 2011). Aus der Interaktion von XopD mit MYB30 resultiert die Einschränkung der pflanzlichen Abwehr(Canonne et al., 2011). XopD besitzt auch eine SUMO (small ubiquitin-like modifier)-Protease-Domäne und gehört damit der Familie der C48-Proteasen an (White et al., 2009). Er ist homolog zu Ulp1, einer Ubiquitinähnlichen Protease aus Hefe. XopD desumoyliert Proteine durch Spaltung der Isopeptidbindung. Allerdings ist er keine generelle SUMO-Protease, da XopD in tierischen Zellen keine Isopeptidaseaktivität aufweist (Hotson et al., 2003). Über die Desumoylierungsaktivität von XopD könnte beispielsweise die Transkription reguliert werden, indem mögliche Transkriptionsfaktoren posttranslational desumoyliert und so entweder aktiviert oder gehemmt werden (Kim et al., 2008; Canonne et al., 2011). Des Weiteren können TAL-Effektoren (transcription activator-like) die pflanzliche Transkription beeinflussen. Sie besitzen eukaryotische Sequenzmotive wie z.B. eine Kernlokalisierungssequenz (NLS) und eine Aktivierungsdomäne (Boch und Bonas, 2010). Dadurch gelangen sie nach Translokation über das Typ III-Sekretionssystem in den Zellkern der Pflanze und aktivieren durch Bindung an Promotorregionen die Transkription von Zielgenen (Kay et al., 2007; Römer et al., 2007). Die Bindung an die Promotorregionen der Zielgene beruht auf Tandemwiederholungen im Effektorprotein. Im Fall von AvrBs3 aus dem Xcv-Stamm 82-8 handelt es sich um 17,5 Tandemwiederholungen mit je 34 Aminosäuren. Dabei sind jeweils die Aminosäuren 12 und 13 variabel (Boch und Bonas, 2010). Diese variablen Aminosäuren bestimmen die Sequenz, an der der Effektor binden kann. So haben Effektoren, die z.B. Asparagin und Isoleucin an den Position 12 und 13 besitzen, eine hohe Affinität zu Adenin der Promotorregion des Zielgens. Befinden sich Asparaginsäure und Histidin an den variablen Positionen, so interagieren diese mit Cytosinen der DNA (Boch et al., 2009). Boch et al. (2009) identifizierten sieben weitere Aminosäurekombinationen, die spezifisch an bestimmte Promotor-Sequenzen binden und somit verschiedene Gene aktivieren. AvrBs3 aktiviert in suszeptiblen Paprikapflanzen die Transkriptionsmaschinerie des Wirts und fördert die Hypertrophie in Mesophyllzellen (Marois et al., 2002; Kay et al., 2007). In resistenten Kultivaren aktiviert der Effektor die Transkription des korrespondierenden Resistenzgens, Bs3, und begünstigt damit die Ausbildung der Resistenz gegen Xcv (Römer et al., 2007). 2.1. DIE INTERAKTION ZWISCHEN PFLANZEN UND PATHOGENEN 13 Nachdem der Kode für die DNA-Bindung der TAL-Effektoren entschlüsselt war, wurden viele neue Anwendungen für diese Effektoren erforscht. So ist es mittlerweile möglich die Tandemwiederholungen so zu entwickeln, dass bestimmte Zielgene aktiviert oder reprimiert werden, je nachdem ob eine Aktivierungsdomäne oder eine Repressordomäne an den Effektor fusioniert wird (Bogdanove und Voytas, 2011). Des Weiteren kann auch ein Genom editiert werden, indem eine Endonuklease (z.B. FokI) an einen Effektor fusioniert wird. FokI schneidet 9 bis 13 bp nach der Erkennungsstelle und generiert so Doppelstrangbrüche, die entweder über nicht-homologes Verbinden der Enden (NHEJ: nonhomologous end joining) oder über homologe Rekombination repariert werden. NHEJ führt oft zu Deletionen und Mutationen, die dem Verlust des Gens vorangehen. Durch homologe Rekombinationen können neue Sequenzstücke und gezielte Mutationen eingeführt werden. Somit sind TAL-Effektoren vielseitig in der Biologie und Medizin einsetzbar (Bogdanove und Voytas, 2011). HopM1 ist ebenfalls ein Typ III-Effektor aus Pseudomonas syringae. In einer Hefe-Zwei-HybridDurchmusterung konnte AtMIN7, einer von acht ARF-GEF-Proteinen (adenosine diphosphate ribosylation factor (ARF) guanine nucleotide exchange factor (GEF)) aus Arabidopsis als Interaktionspartner für HopM1 gefunden werden (Nomura et al., 2006). ARF-GEFs sind wichtige Komponenten für den Vesikeltransport in Eukaryoten, so dass die Aufgabe von HopM1 wahrscheinlich darin besteht, den Vesikeltransport in der Pflanze zu inhibieren. HopM1 rekrutiert AtMIN7 über seinen N-Terminus, was zu einer sofortigen Ubiquitinierung und damit zum Abbau von AtMIN7 über das 26 S-Proteasom führt (Nomura et al., 2006). Der Effektor trägt auch zur Virulenz von Pseudomonas syringae und zur Unterdrückung der basalen Abwehr bei, indem er Kalloseablagerungen an der Zellwand verhindert (Nomura et al., 2006). Neuere Studien zeigen, dass sowohl HopM1 als auch AtMIN7 im trans-Golgi-Netzwerk in der Pflanzenzelle lokalisiert sind (Nomura et al., 2011). Neben seiner Rolle während der basalen Abwehr, hat AtMIN7 auch einen entscheidenden Einfluss auf die R-Protein-vermittelte Immunantwort (ETI; Abschnitt 2.1.4). Während einer Infektion transloziert Pseudomonas syringae sowohl Effektoren, die eine ETI auslösen (AvrRpt2; Kunkel et al. (1993)), was zu einer Stabilisierung von AtMIN7 führt, als auch den Effektor HopM1, welcher AtMIN7 destabilisiert und somit zur Virulenz beiträgt. Dabei spielen sowohl die Zeitkinetik der Infektion, die Stärke der Pflanzenabwehr als auch die Menge an HopM1 für das Ausmaß der AtMIN7-Degradation eine große Rolle. An diesem Beispiel konnte erstmalig das „Wettrüsten“ zwischen Bakterien und Pflanzen gezeigt werden (Nomura et al., 2011). Alle hier aufgeführten Beispiele sollen verdeutlichen, dass bakterielle Effektorproteine eine Vielzahl von Funktionen aufweisen können, über die sie den Metabolismus von Pflanzen beeinflussen können. Im nächsten Abschnitt soll nun auf die Erkennung dieser Effektoren durch Resistenzproteine in der Pflanze eingegangen werden. 2.1.4 Die R-Protein-vermittelte Abwehr von Pflanzen Wie oben beschrieben, sind Typ III-Effektorproteine von zentraler Bedeutung für die Virulenz gramnegativer phytopathogener Bakterien, indem sie pflanzliche Abwehrreaktionen hemmen oder unterdrücken. Andererseits können diese Effektoren von der Pflanze als „fremd“ erkannt 14 KAPITEL 2. EINLEITUNG werden, was zur Auslösung der Effektor-vermittelten Immunität (ETI: effector-triggered immunity) führt. Im Rahmen eines evolutionären „Wettrüstens“ zwischen Bakterium und Pflanze hat diese Resistenzproteine (R-Proteine) hervorgebracht, welche in der Lage sind, spezifische Effektoren zu erkennen. In Folge dessen findet ein Anstieg der Menge an reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS, z.B. H2 O2 ) in der Zelle statt, eine massive und dauerhafte Aktivierung der induzierten Abwehr und häufig eine sogenannte hypersensitive Reaktion (HR), die zu lokalem Zelltod führt und so letztendlich Bakterienwachstum und -ausbreitung limitiert (Hammond-Kosack und Jones, 1996; Feys und Parker, 2000). Harold Flor stellte 1971 die Hypothese auf, dass bakterielle Proteine durch R-Proteine direkt erkannt werden können (Flor, 1971). Diese Hypothese beruht darauf, dass zwei Gene für die Resistenz benötigt werden, ein bakterielles Avirulenz-Gen (avr), das für Effektorproteine kodiert, und das dazugehörige Resistenzgen (R-Gen) der Pflanze. Flor ging davon aus, dass die beiden Proteine wie in einer Rezeptor-Liganden-Bindung miteinander interagieren. Allerdings konnte diese These experimentell nur in wenigen Fällen bestätigt werden (Deslandes et al., 2003). Eine mittlerweile weiter verbreitete Meinung zur Erkennung von Avirulenzproteinen ist die Guard-Hypothese, nach der ein R-Protein (guard) nicht direkt mit dem Effektor interagiert, sondern das Zielprotein (guardee) des Effektors überwacht und auf Veränderungen des Proteins hin aktiviert wird (Van Der Biezen und Jones, 1998). Diese Art der Erkennung würde es der Pflanze ermöglichen, Effektoren verschiedener Pathogene, die aber das gleiche zelluläre Zielprotein angreifen, mit Hilfe eines einzigen R-Proteins zu erkennen. 2.1.4.1 R-Proteine Die meisten Resistenzproteine (R-Proteine) besitzen konservierte Sequenzmotive, nämlich eine Nukleotidbindestelle (NBS) und eine C-terminale Leucin-reiche Region (LRR; Kobe und Deisenhofer (1995); Meyers et al. (1999); Dinesh-Kumar et al. (2000)). An die Nukleotidbindestelle können sowohl ATP als auch GTP binden (Traut, 1994). Leucin-reiche Regionen sind für die Interaktion zwischen verschiedenen Proteinen verantwortlich (Kobe und Deisenhofer, 1994). NBSLRR-Proteine können weiterhin je nach Aufbau ihres N-Terminus in zwei Unterklassen geteilt werden: Toll/Interleukin 1-Rezeptor-ähnliche NBS-LRR (TIR-NBS-LRR) und Coiled-coil-NBS-LRR (CC-NBS-LRR; Abbildung 2.3). TIR-NBS-LRR kodieren für eine große N-terminale Domäne, die zur zytoplasmatischen Domäne des Toll-Proteins aus Drosophila und dem Interleukin 1-Rezeptor in Säugetieren ähnlich ist (Whitham et al., 1994). Am N-Terminus der sogenannten Coiled-coil-NBS-LRR befindet sich das Motiv eines LeucinZippers, der die Eigenschaft besitzt, Protein-Protein-Interaktionen zu stabilisieren (Bent et al., 1994). Die verschiedenen Klassen von R-Proteinen induzieren unterschiedliche Signalwege nach deren Aktivierung. So aktivieren TIR-NBS-LRR-Proteine den EDS1 (enhanced disease susceptibility)/PAD4 (phytoalexin deficient)-abhängigen Weg, während CC-NBS-LRR-Proteine nach Erkennung von Avirulenzproteinen den NDR1 (nonrace-specific disease resistance)-Signalweg stimulieren (Abbildung 2.3; Glazebrook et al. (1996); Aarts et al. (1998)). Der N-Terminus von EDS1 ist 15 2.1. DIE INTERAKTION ZWISCHEN PFLANZEN UND PATHOGENEN Beispiele: R e s N CC C NBS RPS2, RPS5 NDR1 LRR-Domäne i s t N TIR C NBS RPP5, RPS4 LRR-Domäne EDS1/PAD4 e n z Abbildung 2.3: Die zwei Klassen der R-Proteine lösen die Resistenz über unterschiedliche Signalwege aus. Die Klasse der Coiled-coil-NBS-LRR-Proteine fördern den NDR1-abhängigen Signalweg, wohingegen die TIR-NBS-LRR-Proteine über die Aktivierung von EDS1 und PAD4 zur Resistenzantwort führen. CC: Coiled-coil, TIR: Toll/Interleukin 1-Rezeptor-ähnliche Domäne, NBS: Nukleotidbindestelle, LRR: Leucine-rich repeat, N: Aminoterminus, C: Carboxyterminus, EDS1: enhanced disease susceptibility, PAD4: phytoalexin-deficient, NDR1: nonrace-specific disease resistance. Abbildung verändert nach Glazebrook (2001) und McHale et al. (2006). dem katalytischen Teil von eukaryotischen Lipasen sehr ähnlich (Falk et al., 1999). EDS1 kann dimerisieren und mit PAD4 direkt interagieren (Feys et al., 2001). Sowohl EDS1- als auch PAD4mRNA akkumulieren bei erhöhter Salicylsäure-Konzentration (Jirage et al., 1999). Während der NDR1-Weg die reaktiven Sauerstoff-Intermediate erhöht und so direkt die HR fördert, führt der EDS1/PAD4-Weg über reaktive Sauerstoff-Spezies und Akkumulierung von Salicylsäure zu einer Verstärkung der EDS1/PAD4-Expression und zur HR (Loake, 2001). Es scheint auch Überschneidungen in den verschiedenen Wegen zu geben, wobei die meisten Signaltransduktionen der R-Protein-vermittelten Resistenz hauptsächlich über den EDS1-Weg funktionieren. Interessanterweise aktiviert RPP8 aus A. thaliana, ein R-Protein der CC-NBS-LRRKlasse, das die Resistenz gegen Peronospora parasitica vermittelt, weder den EDS1- noch den NDR1-Signalweg (Aarts et al., 1998). 2.1.4.2 Aktivierung der R-Protein-vermittelten Abwehr durch Effektoren Ein relativ gut untersuchtes Beispiel eines Typ III-Effektors ist AvrPto aus Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst). AvrPto gelangt über das Typ III-Sekretionssystem in die Pflanzenzelle und interagiert dort mit Pto (Ronald et al., 1992; Tang et al., 1996). Pto ist eine zytosolische Serin-/Threonin-Proteinkinase mit einer möglichen Myristoylierungsstelle am N-Terminus aber ohne die für R-Proteine typische LRR-Domäne (Abschnitt 2.1.3; Martin et al. (1993)). Durch die Bindung von AvrPto kommt es zu einer Konformationsänderung von Pto und zur Signalweiterleitung über die KinaseDomäne (Rathjen et al., 1999). Eine weitere Komponente, die für die Auslösung der HR durch AvrPto nötig ist, ist das R-Protein der CC-NBS-LRR-Klasse Prf. Dieses interagiert aber nicht direkt 16 KAPITEL 2. EINLEITUNG mit AvrPto, so dass man die Hypothese aufstellte, dass Prf im Signalweg hinter Pto liegt (Salmeron et al., 1994). Pto wiederum interagiert sowohl mit der Serin-/Threonin-Kinase Pti1 als auch mit den Transkriptionsfaktoren Pti4, 5 und 6. Diese werden über Phosphorylierung durch Pto aktiviert, so dass sie ihrerseits an Promotorelemente von PR-Genen binden können und die Transkription dieser induzieren (Zhou et al., 1995, 1997). Dabei ist die Interaktion zwischen Pti1 und Pto abhängig von der Kinasedomäne von Pto (Zhou et al., 1995). AvrRpt2 ist ein weiterer Effektor aus Pseudomonas syringae, der durch R-Proteine erkannt wird und dadurch eine hypersensitive Reaktion auslöst. AvrRpt2 ist als Cysteinprotease identifiziert worden (Axtell et al., 2003). Bei einer Pst-Infektion wird RIN4 aus Arabidopsis durch den Effektor AvrRpt2 abgebaut. Auf diese Veränderung hin wird das R-Protein RPS2 aktiviert, was zu einer HR führt (Mackey et al., 2003; Axtell und Staskawicz, 2003). Im Einklang mit der GuardHypothese scheint RIN4 (guardee) ein Virulenzziel für AvrRpt2 zu sein, das von RPS2 (guard) bewacht wird (Axtell und Staskawicz, 2003). Nachdem auch AvrRpm1 RIN4 in Arabidopsis durch Hyperphosphorylierung modifiziert, ist RIN4 ein allgemeiner negativer Regulator der Abwehr, der als Virulenzziel für drei Effektorproteine (AvrRpm1, AvrRpt2 und AvrB) aus Pseudomonas dient (Mackey et al., 2002, 2003; Axtell und Staskawicz, 2003). 2.1.5 Zusammenfassung der pflanzlichen Abwehr Fast jede Pflanze ist gegen fast alle Pathogene immun. Diese Tatsache kann mit der Fähigkeit der Pflanze erklärt werden, bestimmte molekulare Muster, wie z.B. Oberflächen-Polysaccharide, flg22 oder elf18/26 von pathogenen Bakterien, zu erkennen. Viele Pflanzen besitzen für diese PAMPs Rezeptoren, an die sie binden. Daraufhin folgt eine Signalkaskade, die letztlich die basale Abwehr (PTI) aktiviert und PR-Proteine zur gezielten Pathogenabwehr in den Apoplasten bzw. zur Zellwand sekretiert (Jones und Dangl, 2006). Im Laufe der Evolution brachten Bakterien Virulenzproteine hervor, die in der Pflanzenzelle nicht nur die Krankheit fördern, sondern auch die basale Abwehr z.B. durch Interaktion mit den Rezeptoren oder der Signaltransduktion unterdrücken (ETS: effector-triggered susceptibility; Jones und Dangl (2006)). Daraufhin können sich die Bakterien wieder vermehren und ausbreiten. Allerdings konnten sich Pflanzen auch an bakterielle Effektoren anpassen, indem sie Resistenzproteine (R-Proteine) gegen einige Effektoren entwickelten. Diese können Effektoren entweder direkt oder indirekt erkennen, was zur Auslösung einer hypersensitiven Reaktion, gefolgt von lokalem Zelltod, führt (ETI; Jones und Dangl (2006)). Eine hypersensitive Reaktion kann nicht nur während einer inkompatiblen Interaktion stattfinden, sondern auch im Rahmen der Nicht-Wirts-Resistenz (Klement, 1982). Würden die Pathogene diese von der Pflanze erkannten Effektorproteine wieder verlieren, würden die Bakterien wieder virulent werden und eine Krankheit auslösen können (Jones und Dangl, 2006). Oder sie entwickeln neue Effektorproteine, die wiederum R-Proteine oder andere Virulenzziele in der Pflanze deaktivieren. Zusammengefasst sind die Ereignisse während der Abwehr in Abbildung 2.4. Neben der basalen und R-Protein-vermittelten Abwehr existiert noch eine Form von systemischer Abwehr (SAR), wodurch nicht nur von Pathogenen infizierte Teile einer Pflanze, sondern die ganze Pflanze resistent wird. Dabei akkumuliert Salicylsäure (Feys und Parker, 2000), die den 17 2.2. DAS PFLANZENPATHOGEN XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. VESICATORIA hoch PTI ETS ETI ETS ETI Schwelle für HR Abwehr Effektorproteine Effektorproteine Avr-R Avr-R Schwelle für basale Abwehr gering PAMPs Abbildung 2.4: Zusammenfassung der pflanzlichen Abwehr. Die Detektion von PAMPs führt zur Aktivierung der basalen Abwehr in der Pflanze (PTI: PAMP-triggered immunity). Durch die Translokation von Effektorproteinen in das Pflanzenzytosol kann die basale Abwehr unterdrückt werden (ETS: effector-triggered susceptibility). Diese ETS kann wiederum von der Pflanze überwunden werden, wenn diese ein entsprechendes R-Protein besitzt, das die Effektoren des Pathogens erkennt (ETI: effector-triggered immunity). Dies führt zum lokalen Zelltod und zur Limitierung des Bakterienwachstums. Die Fähigkeit zur ETI kann die Pflanze wieder verlieren, wenn Bakterien neue Effektoren entwickeln, die nicht von der Pflanze erkannt werden können. Dies führt zu einem koevolutionären „Wettrüsten“ zwischen Pflanzen und Pathogenen. Abbildung wurde verändert nach Jones und Dangl (2006). Regulator für die Expression von PR-1, NPR1, aktiviert. Dieser wird in den Zellkern transloziert und bindet an Transkriptionsfaktoren, die wiederum die PR-1-Expression aktivieren (Cao et al., 1994; Zhang et al., 1999). 2.2 Das Pflanzenpathogen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Die Gattung Xanthomonas umfasst 27 Mitglieder, die insgesamt ca. 400 verschiedene Pflanzen infizieren können (Ryan et al., 2011). Unter diesen befindet sich Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), der Erreger der bakteriellen Fleckenkrankheit in Tomaten (Solanum lycopersicum) und Paprika (Capsicum annuum). Es handelt sich dabei um ein gramnegatives, stäbchenförmiges Bakterium mit einer Größe von ca. 1,5 bis 4 µm. Xcv besitzt eine polare Flagelle, mit der es sich fortbewegen kann und enthält gelbe Farbpigmente, die für Xanthomonas namensgebend sind (griechisch: xanthos = gelb und monas = Einheit; Yang und Tseng (1988); Ryan et al. (2011)). Die bakterielle Fleckenkrankheit äußert sich in kleinen (3 mm), unregelmäßigen, schwarzen, schmie- 18 KAPITEL 2. EINLEITUNG rigen und wassergefüllten Läsionen. Sind die Blätter stark befallen, werden sie oft gelb und fallen ab. Auf grünen Früchten können die Flecken bis zu 6 mm groß werden und mit grünlich-weißen Rändern versehen sein. Im späteren Krankheitsstadium werden die Flecken dunkelbraun, sind vertieft und haben eine schuppige Oberfläche. Verbreitet werden die Bakterien durch kontaminierte Samen und durch die Erde. Eine Ansteckung von Pflanze zu Pflanze erfolgt durch Regen und Wind (Agrios, 2005). Xcv hrp-Mutanten bilden kein Typ III-Sekretionssystem aus und sind daher nicht in der Lage, Krankheitssymptome in einer suszeptiblen Pflanze hervorzurufen. Sie können sich kaum noch in der Pflanze vermehren und lösen auch keine HR in einer resistenten Pflanze aus (Gijsegem et al., 1995). Hrp-Gene sind in einem 25 kb-Gencluster im Chromosom von Xcv angelegt und dieses Cluster enthält die 6 Transkriptionseinheiten hrpA bis hrpF (Bonas et al., 1991). Die Gattung Xanthomonas besitzt ungefähr 40 verschiedene Xop-Gruppen (Xanthomonas outer protein) von Typ III-Effektoren (White et al., 2009). Zur XopJ-Gruppe der Effektoren gehören neben XopJ auch AvrRxv, AvrBsT und AvrXv4. Die Proteinsequenzen der Effektoren dieser Gruppe haben insgesamt wenig Ähnlichkeit zueinander. Aufgrund ihrer Sequenzverschiedenheit haben die Effektoren der XopJ-Gruppe wahrscheinlich unterschiedliche biochemische Funktionen in der Wirtszelle (Mukherjee et al., 2007; White et al., 2009). Die Mitglieder der AvrBs3-Gruppe sind sich auf Sequenzebene dagegen sehr ähnlich (White et al., 2009). Über die Diversität im Effektorrepertoire einzelner Xanthomonas-Stämme hinaus zeichnen sich die meisten der bisher sequenzierten Xanthomonas-Arten durch einen Kernsatz von neun Typ III-Effektorgenen aus (xopR, avrBs2, xopK, xopL, xopN, xopP, xopQ, xopX und xopZ). Verliert ein Xanthomonas-Stamm einen dieser Haupteffektoren wirkt sich das unmittelbar auf dessen Virulenz und Fitness aus (Ryan et al., 2011). Die Identifizierung möglicher Effektorproteine erfolgte ursprünglich über in silico-Analysen und funktionellen Tests (Greenberg und Vinatzer, 2003). Funktionelle Untersuchungen beruhen vor allem auf einen Adenylatzyklaseaktivitätstest, bei dem ein vorhergesagtes Effektorprotein an die Adenylatzyklase aus Bordetella pertussis fusioniert wird. Nach Infektion eines Blattes wird die Adenylatzyklaseaktivität gemessen. Diese benötigt für ihre Aktivität Calmodulin, welches nur in der eukaryotischen Wirtszelle zur Verfügung steht (Greenberg und Vinatzer, 2003). Eine weitere Methode sind Minitransposons, die die Effektorregion von AvrRpt2 beinhalten. Dieser Effektor löst eine HR in RPS2-enthaltenden Arabidopsis aus. Inseriert das Transposon zufällig stromabwärts einer neuen Effektor-Signalsequenz, wird dieses sekretiert und löst eine hypersensitive Reaktion aus (Guttman et al., 2002). 2.3 Die YopJ-Familie Zu der YopJ-Familie der Typ III-Effektoren gehören sowohl Effektoren aus Tier- als auch aus Pflanzenpathogenen. Namensgebend für diese Familie ist YopJ (Yersinia outer protein J), einer der sechs translozierten Effektoren aus Yersinia pestis, dem Erreger der Schwarzen Pest (Ruckdeschel et al., 2006). 2.3. DIE YOPJ-FAMILIE 19 AvrBsT AvrRxv XopJ YopJ AvrA VopJ HopZ1a PopP2 consensus 141 164 159 94 108 90 133 241 241 ----AWRSIVRLS--PSSMHHAAIDVR-FKDGKRTMLVIEPA--LAYGMKDGEIKVMAGY --L-PLRAVVRLDEDPRRWHRVAFDVRNHESGHTTIIALEPA--SAYNP-----DHMPGF --V-SQRAVLRLE--RDGEHHVAADVRRRPNGEASVIVLEPARLLTF---------VTGH --VRSSRFIINMG--EGGIHFSVIDYK-HINGKTSLILFEPANFNSMGPAM-------LA --VESARFLVNMG--SSGIHISVVDFR-VMDGKTSVILFEPAACSAFGPA--------LA --DTTARFVVNMG--SGGIHCIAVDCA-IKNGKCSLIGIEPVTMNSLGAS--------ML --FRAIFPQTCPETGQTLKHHVMADVRLHQGGAPTIIITEPAVIVGARYQQ-----LQRH EFVASARPGRYRAVIDDGSHTRAADIR-KDASGTSVIVVDPLRKEKDES---------AY v s r iv lg gmHhvaiDvr h gktsmiviePa ayg m g AvrBsT AvrRxv XopJ YopJ AvrA VopJ HopZ1a PopP2 consensus 192 214 205 142 155 137 186 291 301 ETLGKNVQNCLGENGDMAVIQLGAQKSLFDCVIFSLNMALCAYQKDSVFDNLHDCLRR-VKMRENLTSQFGRKISFAVIEAEALKSIGGCVIFSLDYALAAYQERSTFDQWHKDLRKKG TQLRRQALSQLGENAKFAFIQVGAQKSAADCLMFDLHFALHAHQHSSLFDQWHDNMVNHG IRTKTAIERYQLPDCHFSMVEMDIQRSSSECGIFSFALAKKLYIERDSLLKIHEDNIK-LRTKAALEREQLPDCYFAMVELDIQRSSSECGIFSLALAKKLQLEFMNLVKIHEDNIC-AIRLQSVCKRELPETSLVIMETDMQRSQGECLMFSLFLVKKMHKECDEFQYLHDKNIN-NLTLEDLSESGVPLSQVAIIETQAQKTSDDCVMYSLNYAIKAHKNAAQFDDIHHGLQHGT VDYADNVNMEFGEHAKCAFIPVDIQKSFFDCRILSLSLALKMHDKDDAFAAFHETLRNGG v r nv gp favieldaqks dCvifsl lalkah e fd lHd lvr Abbildung 2.5: Proteinsequenzvergleich einiger Mitglieder der YopJ-Familie. Mitglieder der YopJ-Familie zeigen eine für Cysteinproteasen typische katalytische Triade bestehend aus einem Histidin, einer Glutaminsäure (PopP2 aus Ralstonia solanacearum besitzt hier eine Asparaginsäure) und einem Cystein, das essentiell für die katalytische Aktivität ist. NCBI-Accessions: AvrBsT: ADD71940.1, AvrRxv: Q08678.1, XopJ: CAJ23833, YopJ: NP_995342.1, AvrA: ADX18647.1, VopJ: AAT08443.1, HopZ1a: NP_940719 (Aminosäure 1 bis 220), PopP2: CAD14570.2. Die Sekundärstruktur von YopJ zeigt Ähnlichkeit mit der von Adenovirus-Proteasen (AVP), weshalb YopJ zunächst zu der Familie der CE C55-Proteasen gezählt wurde (Orth et al., 2000). Des Weiteren besitzt YopJ auch Ähnlichkeit zu Ulp1 aus Hefe (ubiquitin-like protease 1), weshalb YopJ Proteaseaktivität zugeschrieben wird, die spezifisch auf sumoylierte und ubiquitinierte Proteine wirkt. Außerdem wiesen Orth et al. (2000) eine Desumoylierungsaktivität von YopJ nach. Ein Sequenzvergleich von YopJ und anderen Mitgliedern der YopJ-Familie deutet darauf hin, dass es sich bei allen Familienmitgliedern um Cysteinproteasen handelt, für die eine katalytische Triade kennzeichnend ist (Abbildung 2.5; Orth (2002)). Neben seiner Proteasefunktion besitzt YopJ auch eine Acetyltransferaseaktivität. So unterdrückt YopJ die Zytokinproduktion und damit die Abwehr in Säugetieren durch die Acetylierung der MAPK Kinase MKK6 und IκB an Serin- bzw. Threoninresten und verhindert dadurch die Phosphorylierung dieser Aminosäuren, was zu einer Blockierung der MAP Kinase-Kaskade führt (Mukherjee et al., 2006). Da die MAP Kinase-Kaskade zwischen Säugetieren und Hefe konserviert ist, blockiert YopJ auch den MAPK-Weg in Hefe. Dieser Signalweg dient hier vor allem der Pheromonperzeption (Paarung) und dem Wachstum bei hoher Osmolarität (HOG-Weg: high osmolarity growth; Yoon et al. (2003)). 20 KAPITEL 2. EINLEITUNG Die Acetylierung der Substrate erfolgt wahrscheinlich über einen sogenannten Ping-Pong-Mechanismus. Dabei wird ein autoacetyliertes YopJ-Intermediat gebildet, bevor der Acetylrest durch einen nukleophilen Angriff auf das Substrat übertragen wird (Mukherjee et al., 2007). Eine solche Autoacetylierung von YopJ konnte von Rohit Mittal und Kollegen beobachtet werden. Weitere Untersuchungen zeigten, dass YopJ IP6 (Inositolhexakisphosphat) als Kofaktor für die Induktion der Acetyltransferaseaktivität benötigt (Mittal et al., 2010). Neben YopJ weisen auch andere Mitglieder der YopJ-Familie wie z.B. der Salmonella-Effektor AvrA (Mittal et al., 2010), PopP2 aus Ralstonia solanacearum (Tasset et al., 2010) und der Pseudomonas-Effektor HopZ1a (Lee et al., 2012) Acetyltransferaseaktivität und/oder ein autoacetyliertes Effektor-Intermediat auf, wobei das Zielprotein der Acetylierung nicht in allen Fällen bekannt ist. Vertreter der YopJ-Familie aus Tierpathogenen sind neben YopJ auch AvrA (Salmonella typhimurium), VopJ (Vibrio parahaemolyticus) und AopP (Aeromonas salmonicida). Phytopathogene Gattungen, die Effektoren aus der YopJ-Familie in die Pflanze translozieren können, sind Pseudomonas (HopZ-Familie), Xanthomonas (AvrRxv, AvrXv4, XopJ, AvrBsT), Ralstonia (PopP1, PopP2) und Erwinia (ORFB) (Lewis et al., 2011). Allen gemeinsam ist die katalytische Triade, die aus einem Histidin, einer Glutaminsäure/Asparaginsäure und einem Cystein besteht. Mutationen in der katalytischen Triade führen zu einem Aktivitätsverlust des Effektors im Wirt (Abbildung 2.5; Orth (2002)). Die Funktionen einiger Mitglieder der YopJ-Familie in der Wirtszelle sind in Tabelle 2.1 zusammengefasst. 2.3.1 Der Typ III-Effektor XopJ XopJ ist ein Typ III-Effektor aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), der aus 373 Aminosäuren besteht und bei Infektionen über das Typ III-Sekretionssystem in das Zytosol der Pflanzenzelle transloziert wird (Noël et al., 2003). XopJ gehört zu der YopJ-Familie der Effektoren und zählt damit zu der Familie der CE C55-Cysteinproteasen (Orth et al., 2000). Wie alle Mitglieder dieser Familie besitzt auch XopJ die charakteristische katalytische Triade bestehend aus einem Histidin (H174), einer Glutaminsäure (E193) und einem Cystein (C235). Am N-Terminus besitzt das Protein ein für Typ III-Effektoren typisches Translokationssignal. Der G + C-Gehalt in dem Gen, das für den Effektor kodiert, liegt bei 54 %. im Vergleich dazu liegt der G + C-Gehalt in den anderen genomischen Regionen von Xcv bei 64 %. Deshalb wurde angenommen, dass xopJ über horizontalen Gentransfer in das Xcv-Genom gelangt ist (Noël et al., 2001). Weitere genetische Analysen zeigen, dass XopJ konserviert für die Xcv-Stämme 753, 85-10, 82-8 und 81-23 ist. Bisher konnten keinerlei Homologe in anderen Xanthomonas-Arten identifiziert werden. Die Transkription von xopJ wird durch HrpG, ein Mitglied der OmpR-Familie der 2-Komponenten Regulatoren, kontrolliert (Noël et al., 2001). Genau wie in Pseudomonas syringae-Effektoren hat XopJ einen relativ hohen Seringehalt in den ersten 50 Aminosäuren (12 %). Wachstumsanalysen von xopJ-Verlustmutanten zeigen keinen Einfluss auf das bakterielle Wachstum in Paprika unter Laborbedingungen. Dies deutet möglicherweise auf eine redundante Funktion von XopJ mit anderen Effektoren für die Virulenz hin (Noël et al., 2003). Wenn XopJ transient über Agrobakterien in N. benthamiana exprimiert wird, konnten Thieme et al. (2007) XopJ-GFP an der Plasmamembran lokalisieren. Diese Lokalisierung beruht auf einer 21 2.3. DIE YOPJ-FAMILIE Effektor Accession YopJ Pathogen YP_001604500.1 Yersinia pestis Aktivität Referenz Inhibierung der MAPK-Kaskade und des NFκB-Signalwegs durch Acetyltransferaseaktivität; Desumoylierungsund Deubiquitinierungsaktivität Orth et al. (2000); Mukherjee et al. (2006, 2007); Mittal et al. (2010); Orth (2002); Zhou et al. (2005) VopJ/A AAT08443.1 Vibrio parahaemolyticus Inhibierung der MAPK-Kaskade in Säugetieren und Hefe Trosky et al. (2004) AvrA ADX18647.1 Salmonella typhimurium Inhibierung des NFκB-Signalwegs durch Acetyltransferaseaktivität Collier-Hyams et al. (2002); Mittal et al. (2010) AvrRxv CAJ22102.1 Xanthomonas campestris pv vesicatoria Cysteinprotease; Interaktion mit 14-33; Transkriptionsregulation in resistenten Tomatenpflanzen Bonshtien et al. (2005); Whalen et al. (2008) XopJ CAJ23833.1 Xanthomonas campestris pv vesicatoria Inhibierung des Vesikeltransports; Acetyltransferase? diese Arbeit und Bartetzko et al. (2009) AvrXv4 AAG39033.1 Xanthomonas campestris pv vesicatoria SUMO-Protease in Pflanzen Roden et al. (2004) AvrBsT ADD71940.1 Xanthomonas campestris pv vesicatoria Cysteinprotease (evtl.); Unterdrückung der HR ausgelöst durch AvrBs1 Szczesny et al. (2010) PopP1 CAD14528.1 Ralstonia solanacearum Auslösung der HR in Nicotiana glutinosa, N. tabacum und N. benthamiana Lavie et al. (2002); Poueymiro et al. (2009) PopP2 CAD14570.2 Ralstonia solanacearum Autoacetylierung über Lysin; Acetyltransferaseaktivität Tasset et al. (2010) AopP Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida Inhibierung des NFκB-Signalwegs durch Inhibierung der Translokation von NFκB in Nukleus; in Fischen Fehr et al. (2006) Pseudomonas syringae PsyA2 Effekt auf Vesikeltransport und Zytoskelett; Autoacetylierung und Acetyltransferaseaktivität; acetyliert Tubulin Lee et al. (2012) NP_710166.1 HopZ1a AAR02168.1 Tabelle 2.1: Übersicht über bekannte Typ III-Effektoren der YopJ-Familie und deren vielfältige Funktionen. 22 KAPITEL 2. EINLEITUNG Myristoylierung des Glycins an Position 2 der Aminosäuresequenz. Des Weiteren wurde beschrieben, dass XopJ nach Überexpression in N. benthamiana Zelltod auslösen kann. Diese Zelltodauslösende Funktion ist abhängig von der Myristoylierung und damit von der Lokalisierung des Effektors in der Pflanze (Thieme et al., 2007). Ob es sich bei diesem beobachteten Zelltod um eine R-Protein-vermittelte Resistenz oder um einen toxischen Effekt handelt, konnte bisher nicht aufgeklärt werden. 2.4 Vorarbeiten zu dieser Arbeit Der Effektor YopJ aus Yersinia pestis ist der namensgebende Effektor für die YopJ-Familie der C55-Proteasen. YopJ inhibiert die MAP Kinase-Kaskade der basalen Abwehr in Säugetierzellen durch Acetylierung der MAPK Kinase (Yoon et al., 2003; Mukherjee et al., 2006; Mittal et al., 2010; Lee et al., 2012). Daneben ist er aber auch dafür verantwortlich den HOG-Signalweg (high osmolarity growth), der ebenfalls über eine MAP Kinase-Kaskade führt, in Hefe zu blockieren, was zum Absterben dieser auf Nährmedium mit erhöhter Salzkonzentration führt (Yoon et al., 2003). Teile dieser Arbeit basieren auf einige bereits erarbeitete Studien zum Wachstum von Hefe durch XopJ. Dabei wurde untersucht, ob XopJ - genauso wie YopJ - den HOG-Signalweg in Hefe inhibiert (Yoon et al., 2003; Bartetzko, 2007). Jedoch konnte keine Beeinträchtigung des Hefewachstums nach xopJ-Expression beobachtet werden (Bartetzko, 2007; Salomon et al., 2011). Außerdem wurde in Lokalisationsstudien bereits nachgewiesen, dass XopJ-GFP in N. benthamiana an der Plasmamembran lokalisiert ist. Diese Lokalisierung wurde einer möglichen Myristoylierung des Glycins an Position 2 der Aminosäuresequenz von XopJ zugeschrieben (Bartetzko, 2007). Allerdings konnte in den Vorarbeiten keine hypersensitive Reaktion nach xopJ-Expression in N. benthamiana - wie Thieme et al. (2007) es postulieren - nachgewiesen werden, was durch Messungen der Ionen-Leckage nach Effektor-Expression bestätigt wurde (Bartetzko, 2007; Thieme et al., 2007). 2.5 Zielsetzungen dieser Arbeit Bakterien steuern während der Infektion zelluläre Prozesse in der Pflanze so um, dass pflanzliche Metabolite den Bakterien z.B. als Nahrungsquelle dienen können. Um dies zu erreichen, translozieren sie Typ III-Effektorproteine in das Zytosol der Pflanzenzelle. Dort können sie in verschiedene subzelluläre Kompartimente der Wirtszelle gelangen und mit Wirtsproteinen interagieren. Ziel dieser Arbeit war es, das bakterielle Effektorprotein XopJ aus Xcv funktionell zu charakterisieren. Dabei sollten vor allem folgende Fragestellungen bearbeitet werden: 1. In welchem subzellulären Kompartiment ist XopJ lokalisiert und wie erfolgt die Zielsteuerung des Proteins? 2. Welche Virulenzfunktion besitzt das Protein? 2.5. ZIELSETZUNGEN DIESER ARBEIT 23 3. Mit welchen Wirtsproteinen interagiert XopJ und sind diese möglicherweise Zielproteine für die Virulenz? 4. Welche biochemischen Eigenschaften bzw. enzymatischen Aktivitäten besitzt XopJ möglicherweise? 24 KAPITEL 2. EINLEITUNG 3 Material und Methoden 3.1 3.1.1 Material Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien Wenn nicht anders angegeben, wurden die verwendeten Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien von den Firmen Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe), Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), Applichem GmbH (Darmstadt), Fermentas GmbH (St. Leon-Rot), Roche Diagnostics GmbH (Mannheim), Invitrogen (Karlsruhe), New England Biolabs GmbH (Frankfurt am Main) und VWR International GmbH (Darmstadt) bezogen. Radioaktives Acetyl-CoA wurde von der Firma Hartmann Analytic GmbH (Braunschweig) erworben. Für die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien, die Aufreinigung von PCR-Produkten und für die Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurden Kits von der Firma Qiagen GmbH (Hilden) verwendet. 3.1.2 Antikörper Um verschiedene markierte Proteine im Western Blot nachweisen zu können, wurden folgende Antikörper eingesetzt: Antikörper Verdünnung anti-c-myc-Meerrettichperoxidase-Antikörper aus Maus (Klon 9E10) 1:1000 Hersteller / Referenz Roche, Mannheim Fortsetzung auf der nächsten Seite 25 26 KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN Antikörper Verdünnung Hersteller / Referenz anti-GFP-Antikörper aus Maus, monoklonal (Klone 7.1 und 13.1) 1:1000 Roche, Mannheim anti-Ubiquitin-Antikörper aus Kaninchen, polyklonal 1:7500 Agrisera, Vännäs, Schweden anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)-Antikörper aus Kaninchen, polyklonal 1:1000 Cell Sgnaling Technology, Inc., Danvers, USA anti-AtMPK6-Antikörper aus Kaninchen, polyklonal 1:5000 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA anti-H+ -ATPase-Antikörper (N. plumbaginifolia) aus Kaninchen 1:4000 Morsomme et al. (1998) anti-NtSPP2-Antikörper aus Kaninchen 1:1000 Chen et al. (2005) ImmunoPure Ziege-anti-Kaninchen-MeerrettichperoxidaseAntikörper 1:10000 Thermo Fischer Scientific, Bonn ImmunoPure® Ziege-anti-Maus-MeerrettichperoxidaseAntikörper 1:10000 Thermo Fischer Scientific, Bonn ® 3.1.3 Oligonukleotide und Sequenzierungen Oligonukleotide wurden von Metabion International AG (Martinsried) und Eurofins MWG Operon (Ebersberg) bezogen. Primer Sequenz (5’→3’) Verwendung VB07 (5’) CACCGTAACAATGGCTCTATGCGTTTCAAAG XopJ G2A VB10 (3’) GGATCCTGACTGGCGATCAGAGATAGC XopJ ohne Stopp mit BamHI VB11 (5’) CACCGTAACAATGGGTCTATGCGTTTCAAAG XopJ VB33 (5’) GGATCCGGTCTATGCGTTTCAAAGCCG XopJ mit BamHI ohne ATG für Nterminale MBP-Fusion VB34 (3’) GTCGACCTATGACTGGCGATCAGAGAT XopJ mit SalI mit Stopp für N-terminale MBP-Fusion und pGBT9Klonierung SB88 (5’) CAGAAGTCTGCAGCGGACGCCCTGATGTTCGATCTGCAT XopJ C235A VB35 (3’) ATGCAGATCGAACATCAGGGCGTCCGCTGCAGACTTCTG XopJ C235A VB36 (5’) CACCGTAACAATGGCTCTAGCCGTTTCAAAGCC XopJ G2A C4A VB37 (5’) CACCGTAACAATGGGTCTAGCCGTTTCAAAGCC XopJ C4A VB38 (5’) GCCCTATTGCTATTTTGGCAGCCC EDS1 für RT-PCR (VIGS) VB39 (3’) ATTCTCAACGACCACCAGTTTCCC EDS1 für RT-PCR (VIGS) VB40 (5’) CTGCTCTCATGTGGCTTGTAGGCC NPR1 für RT-PCR (VIGS) VB41 (3’) CAACATGCAGCACCGTGTATCCCC NPR1 für RT-PCR (VIGS) VB42 (5’) CAGGCATGAATTTTACCAGAAGCC SGT1 für RT-PCR (VIGS) Fortsetzung auf der nächsten Seite 27 3.1. MATERIAL Primer Sequenz (5’→3’) Verwendung VB43 (3’) TTTCTTCAGCTCCATGCCATCCGG SGT1 für RT-PCR (VIGS) VB44 (5’) ATGGAGAGACTTCATTGCCAGAGG RAR1 für RT-PCR (VIGS) VB45 (3’) GAAATAAACTGAAATCATGACTGC RAR1 für RT-PCR (VIGS) VB55 (5’) CACCGTAACAATGGGAAATGTATGCGTCGG HopZ1a VB56 (5’) CACCGTAACAATGGCAAATGTATGCGTCGG HopZ1a G2A VB57 (3’) GCGCTGCTCTTCGGCAAGTACTCG HopZ1a ohne Stopp VB60 (5’) GGATCCTGGCTCTATGCGTTTCAAAGCCG XopJ G2A mit BamHI ohne ATG für pGBT9-Klonierung VB68 (5’) CACCGAGGAAATGGCGTCAGCTGATG NtRPT6 VB70 (3’) CTTCCACAGCTTTCGCAGTGAC NtRPT6 ohne Stopp VB71 (5’) CCCGCCATCTTCTATAGGCACACGCACAGCAGC XopJ K300R VB72 (3’) GCTGCTGTGCGTGTGCCTATAGAAGATGGCGGG XopJ K300R VB73 (5’) GGATCCGGTGAGCCAGCGCGAATC Produkt 1 für Xcv ∆xopJ-Mutante mit BamHI VB74 (3’) GTAACCTCGATCTACGCGCAACGCTGGGTCAGTGGC Produkt 1 für Xcv ∆xopJ-Mutante VB75 (5’) GCCACTGACCCAGCGTTGCGCGTAGATCGAGGTTAC Produkt 2 für Xcv ∆xopJ-Mutante VB76 (3’) GTCGACCGTCGTCGCGGCAAAGAG Produkt 2 für Xcv ∆xopJ-Mutante mit SalI VB79 (5’) GGATCCGCGTCAGCTGATGTGGAGAAGAG RPT6 mit BamHI ohne ATG für N-terminale GST-Fusion VB80 (3’) GTCGACCTACTTCCACAGCTTTCGCAG RPT6 mit SalI mit Stopp für Nterminale GST-Fusion VB83 (5’) GAGGAATTACAATTGCTTCAG NtRPT6 für VIGS VB86 (5’) GCCCTGCGCAATGATGACTATGTCCTCCATCTAATTTTACC NtRPT6 S130D VB87 (3’) GGTAAAATTAGATGGAGGACATAGTCATCATTGCGCAGGGC NtRPT6 S130D VB88 (5’) GCCCTGCGCAATGATGCCTATGTCCTCCATCTAATTTTACC VB89 (3’) GGTAAAATTAGATGGAGGACATAGGCATCATTGCGCAGGGC NtRPT6 S130A VB91 (3’) CACCAGACTCAAACAATTCAGGGTG NtRPT6 für VIGS VB92 (5’) GGGATCCGTAGTGCGGCCGTAGGAGTAG AtRPT6a mit BamHI ohne ATG für pGAD424-Klonierung VB93 (3’) GTCGACCTACTTCCACAGCTTACGCAG AtRPT6a mit SalI mit Stopp für pGAD424-Klonierung VB106 (5’) TGCAGCATATCCACGATCTC qPCR Paprika RPT6 VB107 (3’) CAGGCTCCTGAAGCAACTGT qPCR Paprika RPT6 VB114 (5’) AGGGAGTGGCAATGGTGATA qPCR VIGS-N. benthamiana RPT6 NtRPT6 S130A Fortsetzung auf der nächsten Seite 28 KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN Primer Sequenz (5’→3’) Verwendung VB115 (3’) AATCAATCCCTCGCATCAAG qPCR VIGS-N. benthamiana RPT6 493 (5’) CACCAACAATGAACGATTTGTTTTCCAGC Sp2-Fragment 494 (3’) ACATGTCCATTTTCGCGTGTTC Sp2-Fragment ohne TM-Domäne 495 (5’) CACCAACAATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTC secGFP mit Chitinasesignalsequenz 496 (3’) TTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTG secGFP ohne HDEL Ubifor (5’) ATGCAGATYTTTGTGAAGAC Ubiquitin für RT-PCR (Expressionskontrolle) Ubirev (3’) ACCACCACGRAGACGGAG Ubiquitin für RT-PCR (Expressionskontrolle) Aktin2 (5’) GCCAACAGAGAGAAGATGACCCAGA Aktin für qPCR (Expressionskontrolle) Aktin2 (3’) ACACCATCACCAGAGTCCAACACAAT Aktin für qPCR (Expressionskontrolle) Primer mit CACC sind Gateway-kompatibel. Sequenzierungen wurden von der Firma GATC Biotech AG (Konstanz) durchgeführt. Dazu wurden 1,5 µg DNA in einem Gesamtvolumen von 30 µl verschickt. Die Auswertung der Daten erfolgte über den „GATCViewer“ (GATC Biotech AG, Konstanz) und über die Programme „Expasy Translate Tool“ (Schweizerisches Institut für Bioinformatik, Basel) und „DNAStar Lasergene“ (DNASTAR Inc., Madison, USA). 3.1.4 Vektoren Für Klonierungen und Expression in Bakterien bzw. in Pflanzen wurden folgende Vektoren verwendet: Vektor Resistenz in Bakterien Verwendung Hersteller / Referenz pENTR™ /D-TOPO® KanR Klonierungsvektor Invitrogen™ , Karlsruhe pCRBlunt KanR Klonierungsvektor Invitrogen™ , Karlsruhe pGEM® -TEasy AmpR Klonierungsvektor Promega GmbH, Mannheim pMAL-c2 AmpR N-terminaler MBP-tag; Aufreinigung Invitrogen™ , Karlsruhe pGEX-4T-1 AmpR N-terminaler GST-tag; Aufreinigung GE Healthcare, München binärer Vektor; C-terminaler 3-fach myc; konstitutive Expression in Pflanzen Bartetzko et al. (2009) pRB-35S-GW3xmyc R Spec , StrepR Fortsetzung auf der nächsten Seite 29 3.1. MATERIAL Vektor Resistenz in Bakterien Verwendung Hersteller / Referenz pBinar-3xmyc KanR binärer Vektor; C-terminaler 3-fach myc; konstitutive Expression in Pflanzen Höfgen und Willmitzer (1990) pHurley KanR binärer Vektor basierend auf pEarlyGate 100; C-terminaler TAP2-tag (3xmyc-6xhisStrep); konstitutive Expression in Pflanzen Earley et al. (2006), Christoph Rieck, FAU Erlangen pK7FWG2 SpecR , StrepR binärer Vektor; C-terminaler GFP-tag; konstitutive Expression in Pflanzen Karimi et al. (2002) pYL279 KanR binärer Vektor; VIGS-Konstrukt Liu et al. (2002) pTRV1 KanR binärer Vektor; VIGS-Helferplasmid Liu et al. (2002) pUCSPYCE Amp R pUC19-Derivat; Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation Walter et al. (2004) pUCSPYNE AmpR pUC19-Derivat; Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation Walter et al. (2004) pGBT9 AmpR N-terminale Bindedomäne; Köder-Plasmid für Hefe-Zwei-Hybrid-System Clontech, Mountain View, USA pGAD424 AmpR N-terminale Aktivierungsdomäne; BeutePlasmid für Hefe-Zwei-Hybrid-System Clontech, Mountain View, USA pOK SpecR , SucS Suizidvektor für die Herstellung einer Xcv Knock out Mutante Huguet et al. (1998) 3.1.5 Bakterienstämme Für Klonierungen, Herstellung von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria-Deletionsmutanten, Pflanzeninfektionsexperimente und die transiente Expression von Proteinen in N. benthamiana wurden folgende Bakterienstämme verwendet: Stamm Genotyp − Referenz E. coli DH5α F φ80lacZ∆M15 ∆.(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK − ,mk + ) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ− Invitrogen™ , Karlsruhe E. coli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’ proAB lacI q Z∆M15 Tn10 (TetR )] Bullock et al. (1987); Agilent, Waldbronn E. coli TOP10 F-(tetr) mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15 DlacX74 deoR recA1 araD139 D(ara-leu)7697 galU galK rspL (StrR) endA1 nupG Invitrogen™ , Karlsruhe E. coli KC 8 hsdR leuB600 trpC9830 pyrF::Tn5 hisB463 lac∆X74 strA galUK Clontech E. coli DH5αλ pir endA1 hsdR17 [rK − ,mk + ] supE44 thi-1 recA1 gyrA [Nalr ] reLA1 ∆[lacZYA-argF ] U169, F’[φ80dlac∆(lacZ ) M15] [λpir ] Ménard et al. (1993) Fortsetzung auf der nächsten Seite 30 KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN Stamm Genotyp Referenz E. coli K12 HB101 F− recA; Helfer pRK 2013 (KanR ) Boyer und RoullandDussoix (1969); Figurski und Helinski (1979); Ditta et al. (1980); Bonas et al. (1989) E. coli M15/pREP4 NalS StrS RifS Thi− Lac− Ara+ Gal+ Mtl− F− RecA+ Uvr+ Lon+ (KanR ) Villarejo und Zabin (1974) E. coli BL21 (DE3) GroEL/GroES F− ompT hsdSB(rB–, mB–) gal dcm (DE3) pREP4::groESL (KanR ) Amrein et al. (1995); Lehrstuhl für Biotechnik, FAU Erlangen E. coli BL21/Rosetta pRARE F− ompT hsdSB(rB – mB –) gal dcm pRARE2 (CamR ) Merck KGaA, Darmstadt Xcv 85-10 Wildtyp (RifR ) Bonas et al. (1989) R Xcv 85-10 ∆xopJ xopJ-Verlustmutante (Rif ) diese Arbeit R Xcv 85-10 ∆hrpB1 hrpB1-Verlustmutante (Rif ) Rossier et al. (2000) Pst DC3000 ∆hrcC Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 hrcC-Verlustmutante; kann kein Typ III-Sekretionssystem bilden (RifR ) Boch et al. (2002) A. tumefaciens C58C1 RifR mit Helferplasmid pGV2260 (AmpR ) Deblaere et al. (1985); Van Larebeke et al. (1974) Zur Selektion bestimmter Klone wurden die entsprechenden Antibiotika zu den Medien nach dem Autoklavieren zugegeben: Antibiotikum Lösungsmittel Endkonzentration 100 mg/ml H2 O 200 µg/ml Chloramphenicol 30 mg/ml Ethanol 30 µg/ml Kanamycin 50 mg/ml H2 O 50 µg/ml Rifampicin 50 mg/ml DMSO 50 µg/ml Spectinomycin 50 mg/ml H2 O 50 µg/ml Streptomycin 10 mg/ml H2 O 20 µg/ml Ampicillin 3.1.6 Stammlösung Hefestämme Für die Hefe-Zwei-Hybrid-Experimente wurden folgende Stämme verwendet: Stamm Genotyp Referenz Y187 MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4∆, met− ,gal80∆, URA::GAL1UAS -GAL1TATA -lacZ, MEL1 Wade Harper et al. (1993) Fortsetzung auf der nächsten Seite 31 3.2. METHODEN Stamm Genotyp Referenz AH109 MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4∆, gal80∆, LYS2::GAL1UAS -GAL1TATA -HIS3, GAL2UAS -GAL2TATA -ADE2, URA3::MEL1UAS -MEL1TATA -lacZ, MEL1 James et al. (1996) Y190 MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4∆, gal80∆, cyhr 2, LYS2::GAL1UAS -HIS3TATA -HIS3, URA3::GAL1uas GAL1TATA -lacZ Wade Harper et al. (1993); Flick und Johnston (1990) 3.2 3.2.1 Methoden Anzucht von Pflanzen Für die Anfertigung dieser Arbeit wurden Paprika- (Capsicum annuum), Nicotiana benthamiana-, Nicotiana tabacum- und transgene, induzierbar exprimierende xopJ-Arabidopsis thaliana-Pflanzen verwendet. Paprikapflanzen wurden unter Gewächshausbedingungen bei einer konstanten Luftfeuchtigkeit von 60 % und zusätzlicher Beleuchtung angezogen. Tagsüber wurde das Gewächshaus auf 26 °C und nachts auf 22 °C beheizt. Capsicum annuum-Anzucht Die beiden Tabak-Arten wurden bei 25 °C tags und 20 °C nachts bei einer konstanten Luftfeuchtigkeit von 40 % gezüchtet. Eine Zusatzbeleuchtung garantierte auch tagsüber eine konstante Lichtmenge. Nicotiana benthamiana- und Nicotiana tabacum-Anzucht Die Samen von Ethanol-induzierbaren xopJ-Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden auf MS-Platten (Murashige und Skoog), welche Kanamycin enthielten, ausgebracht. Nach zwei Tagen Stratifizierung im Dunkeln bei ca. 4 °C wurden die Platten in die Lichtkammer überführt und dort für ca. zwei Wochen bei einer konstanten Temperatur von 21 °C wachsen gelassen. Nachdem die Keimlinge ausreichend lange Wurzeln besaßen, wurden sie in Aussaat- und Pikiererde umgesetzt. Anschließend wurden sie im Percival-Klimaschrank (CU-36L; CLF PlantClimatics GmbH, Wertingen) unter Kurztagbedingungen (8 Stunden Licht) bei konstanten 22 °C am Tag und 19 °C in der Nacht angezogen. Zum Abreifen wurden die Pflanzen ins Gewächshaus gebracht, wo sie bei konstanten 21 °C und 50 % Luftfeuchtigkeit kultiviert wurden. Anzucht von transgenen Arabidopsis thaliana Murashige und Skoog-Medium 4,4 g/l Murashige und Skoog 0,5 g/l MES Fortsetzung auf der nächsten Seite 32 KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN Murashige und Skoog-Medium 2 % (w⁄v) 8,0 g/l Saccharose Phytoagar → pH 5,7 mit KOH 3.2.2 Pflanzentransformation 3.2.2.1 Transiente Transformation von Nicotiana benthamiana Um Proteine in Pflanzen transient zu exprimieren, wurde die Agrobakterien-vermittelte Transformation von N. benthamiana durchgeführt. Dazu wurden Agrobakterien (Stamm C58C1 mit dem Helferplasmid pGV2260; Deblaere et al. (1985); Höfgen und Willmitzer (1988)), die das entsprechende Plasmid mit dem gewünschten Gen enthielten, in 5 ml YEB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika bei 28 °C angezogen. Von dieser Vorkultur wurde 1 ml in 50 ml YEB-Medium mit Antibiotika umgeimpft. Diese Hauptkultur wurde erneut für eine Nacht bei 28 °C wachsen gelassen. Am dritten Tag wurde die Kultur für 20 Minuten bei 4500 Upm abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 ml Wasser gewaschen und erneut für 20 Minuten bei 4500 Upm zentrifugiert. Zum Schluss wurde das Pellet in 20 ml MilliQ-Wasser aufgenommen, die oD600 bestimmt und auf 1,0 eingestellt. Anschließend wurden die N. benthamiana-Blätter mit einer nadellosen Spritze auf der Blattunterseite mit der Bakteriensuspension infiltriert. 3.2.2.2 Stabile Transformation von Nicotiana benthamiana Die stabile Transformation von Nicotiana benthamiana wurde unter Verwendung des Agrobacterium-Stammes C58C1 mit dem Helferplasmid pGV2260 durchgeführt (Deblaere et al., 1985). Dazu wurden die entsprechenden Bakterien über Nacht bei 28 °C vermehrt. Die Kultur wurde bei 3500 Upm für 15 Minuten abzentrifugiert und anschließend in 10 ml YEB-Medium (siehe Abschnitt 3.2.3.1) resuspendiert. 1 cm2 große Nicotiana benthamiana-Blattstückchen wurden in der Bakteriensuspension für 5 Minuten gebadet. Nach 2 Tagen Lagerung auf MS-Platten im Dunkeln bei einer konstanten Temperatur von 21 °C wurden die Blattstücke auf Murashige und Skoog (MG1)-Medium mit 1,6 % Glukose [+ 1 mg / l 6-Benzylaminopurin, 0,2 mg / l Naphtylessigsäure, 500 mg / l Ticarcillin, 100 mg / l Kanamycin] umgesetzt. Wenn Sprosse entstanden sind, wurden diese abgeschnitten und auf MS-Medium mit 2 % Saccharose und 250 mg / l Ticarcillin umgesetzt. 3.2.3 Mikrobiologische Methoden 3.2.3.1 Anzucht von Bakterien Zur Anzucht von Bakterien wurden Fest- und Flüssigmedien verwendet. Zur Selektion eines bestimmten Stammes bzw. Plasmids wurden nach dem Autoklavieren und Abkühlen geeignete Antibiotika steril hinzugegeben. 33 3.2. METHODEN Escherichia coli DH5α, XL1 Blue, K12 HB101-, TOP10-, KC8-, M15 und BL21-Zellen wurden in LB-Medium angezogen. Die Bakterien wurden bei 37 °C kultiviert. Anzucht von verschiedenen Escherichia coli-Stämmen Luria-Bertani-Medium (LB-Medium): 10 g/l Bacto-Trypton 5 g/l Hefeextrakt 10 g/l Natriumchlorid Für LB-Festmedium wurden vor dem Autoklavieren noch 15 g / l Agar hinzugefügt. Um die Interaktionspartner nach erfolgreicher Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung zu identifizieren, wurde die DNA aus Hefe isoliert und in E. coli KC8-Zellen transformiert. Um das Köder- von dem Beute-Plasmid zu trennen, wurden die Bakterien auf M9-Medium mit den Auxotrophiemarkern -trp (Selektion auf Köderplasmid) bzw. -leu (Selektion auf Beuteplasmid) bei 37 °C inkubiert. M9-Minimalmedium: 20 g/l Glukose 0,67 g/l Aminosäuremix (-trp/-leu) Zur Herstellung von M9-Platten wurden vor dem Autoklavieren 16,7 g / l Agar hinzugefügt. Nach dem Autoklavieren wurde zu dem abgekühlten Medium Ampicillin (Endkonzentration 100 µg / ml), Thiamin (Endkonzentration 1 mM) und M9-Salze (Endkonzentration 1-fach) gegeben. M9-Salze (10-fach): 60 g/l Na2 HPO4 30 g/l KH2 PO4 5 g/l NaCl 10 g/l NH4 Cl Agrobakterien wurden in YEB-Festbzw. Flüssigmedium gezüchtet. Bebrütet wurden diese Bakterien bei 28 °C für 2-3 Tage. Um Agrobakterien zu transformieren, wurde nach Anleitung von Höfgen und Willmitzer (1988) vorgegangen. Anzucht und Transformation von Agrobacterium tumefaciens YEB-Medium: 5 g/l Bacto-Rinder-Extrakt Fortsetzung auf der nächsten Seite 34 KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN YEB-Medium: 1 g/l Hefeextrakt 5 g/l Bacto-Trypton 5 g/l Saccharose 2 mM Magnesiumsulfat Für YEB-Festmedium wurden vor dem Autoklavieren 15 g / l Agar hinzugefügt. Die Anzucht von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria erfolgte auf NYG-Medium bei 28 °C für 3 Tage oder bei 30 °C für 2 Tage. Anzucht von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria NYG-Medium: 5 g/l Pepton (aus Casein) 3 g/l Hefeextrakt 20 ml/l Glycerin Für das Festmedium wurden 15 g / l Agar hinzugefügt. 3.2.3.2 Anzucht und Transformation von Hefe (Saccharomyces cerevisiae) Die Hefestämme Y187, AH109 und Y190 wurden auf YPAD- (Vollmedium) bzw. SCAD-Medium (Selektionsmedium) angezogen. YPAD-Medium (Vollmedium): 10 g/l Hefeextrakt 20 g/l Pepton (aus Casein) 20 g/l Glukose 100 mg/l Adenin Für YPAD-Festmedium wurden vor dem Autoklavieren 15 g / l Agar hinzugefügt. Zur Selektion auf einen Stamm, der ein bestimmtes Plasmid enthält, wurde das Selektionsmedium SCAD mit dem entsprechenden Auxotrophiemarker im Aminosäure-Mix verwendet. SCAD-Medium: 20 g/l Glukose 6,7 g/l Yeast Nitrogen Base (ohne Aminosäuren) Fortsetzung auf der nächsten Seite 35 3.2. METHODEN SCAD-Medium: 0,67 g/l Aminosäure-Mix → pH wurde auf 5,8 eingestellt Für Festmedium wurden vor dem Autoklavieren 16,7 g / l Agar hinzugefügt. Sowohl YPAD als auch SCAD-Medium wurden nur für 10 Minuten autoklaviert. Der Aminosäuremix war folgendermaßen zusammengesetzt: Aminosäuremix: 2,0 g Adeninhemisulfat 2,0 g Methionin 0,2 g p-Aminobenzoesäure 3,0 g Phenylalanin 2,0 g Arginin-HCl 2,0 g Serin 2,0 g Histidin-HCl 2,0 g Threonin 2,0 g Isoleucin 3,0 g Tryptophan 2,0 g Myo-Inositol 2,0 g Tyrosin 4,0 g Leucin 1,2 g Uracil 2,0 g Lysin-HCl 9,0 g Valin Für ein Selektionsmedium wurde die Aminosäure, die als Auxotrophiemarker diente, aus dem Aminosäuremix weg gelassen. Für Hefen des Stammes Y190 wurden zum schon vorhandenen Adeninhemisulfat im Aminosäuremix noch zusätzlich 100 mg / l zum Medium hinzugefügt. Die Transformation von Hefe erfolgte nach Schiestl und Gietz (1989) und Gietz et al. (1992) . 3.2.4 Molekularbiologische Methoden 3.2.4.1 Molekularbiologische Standardmethoden Standardmethoden, wie PCR, Restriktionsverdau, Agarose-Gelelektrophorese, Ligation und E. coliTransformationen wurden wie in Sambrook und Russell (2001) beschrieben, durchgeführt. Bakterien-Plasmid-DNA wurde mit dem QiaPrep® Spin Miniprep Kit (Qiagen) isoliert. Für die Aufreinigung von PCR-Produkten wurde das QiaQuick® PCR Purification Kit (Qiagen) verwendet und die Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel erfolgte durch das QiaQuick® Gel Extraction Kit. Einige Konstrukte in dieser Arbeit wurden mit Hilfe der pENTR/D-TOPO® -Klonierung (Invitrogen™ ) angefertigt. Dabei wurde nach Protokoll des Herstellers vorgegangen. 36 3.2.4.2 KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN Ortsgerichtete Mutagenese Die Herstellung der XopJ-Varianten C235A und K300R sowie der RPT6-Varianten S130D und S130A erfolgte nach Protokoll des QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kits von Agilent Technologies (Waldbronn). 3.2.4.3 Isolierung von Gesamt-DNA aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae) Zur Identifizierung von Interaktionspartnern von XopJ wurde die DNA aus diploiden Hefekolonien nach der Methode von Hoffman und Winston (1987) isoliert. 3.2.4.4 Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen nach Logemann et al. (1987) Um die Expression von Proteinen aus Pflanzengeweben zu untersuchen, wurde die Gesamt-RNA aus Pflanzen isoliert und die mRNA in cDNA umgeschrieben. Dabei war die Menge an Pflanzenmaterial je nach Pflanzenart unterschiedlich. Während aus N. benthamiana standardmäßig ein Blatt verwendet wurde, wurde die RNA aus A. thaliana aus zwei Blättern bzw. 6 Keimlingen isoliert. Aus Paprikapflanzen wurden 8 Blattscheiben mit dem Stanzer #8 ausgestanzt und aufgearbeitet. Alle wässrigen Lösungen wurden mit DEPC (Diethylpyrocarbonat)-behandeltem MilliQ-Wasser angesetzt. Das in flüssigem Stickstoff gefrorene Pflanzenmaterial wurde unter Zugabe einer Spatelspitze PVPP (Polyvinylpyrrolidon; nur für Tabak) gemörsert bzw. mit Hilfe des Rotor-Stator-Homogenisators (Heidolph, Schwabach) fein pulverisiert. Nach Zugabe von 900 µl bis 1 ml Z6-Puffer [8 M Guanidiniumhydrochlorid, 20 mM Natrium-EDTA, 20 mM MES, 0,7 % (v/v) β-Mercaptoethanol, pH 7,0] und Auftauen wurde die Suspension in ein 2 ml-Eppendorfgefäß, in dem bereits 0,5 ml PCI (Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1)) vorgelegt waren, umgefüllt. Die Proben wurden für ca. 1 Minute gevortext und anschließend für 10 bis 15 Minuten bei 13000 Upm zentrifugiert. Die wässrige Oberphase wurde in ein frisches Eppendorf-Gefäß umpipettiert und pro 750 µl wurden 38 µl 1 N Essigsäure zugegeben und gut gemischt. Zu dieser Mischung wurden 500 µl 100 % Ethanol (pro 750 µl Oberphase) pipettiert und ebenfalls gevortext. Anschließend wurde für 10 bis 20 Minuten bei 13000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Auf das Pellet wurden 500 µl 3 N Natriumacetat (pH 5,2) gegeben und so lange gevortext bis sich das Pellet von der Wand des Reaktionsgefäßes gelöst hatte. Danach wurde erneut für 10 Minuten bei 13000 Upm zentrifugiert. Bei Paprikaproben wurde der Natriumacetat-Schritt wiederholt. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet mit je 500 µl bis 1 ml 70 bis 80 % Ethanol gewaschen. Nach erneutem Zentrifugieren für 10 Minuten bei 13000 Upm wurde das Pellet bei 60 bis 65 °C getrocknet. Zum Schluss wurde das Pellet in 30 (Arabidopsis) bis 50 µl (Tabak, Paprika) DEPC-Wasser bei 60 bis 65 °C unter Schütteln gelöst. Anschließend wurden die RNA-Proben am Nanodrop® -ND1000 (Peqlab, Erlangen) vermessen. 37 3.2. METHODEN 3.2.4.5 Reverse Transkription von RNA Zunächst erfolgte ein DNAse-Verdau. Dazu wurden jeweils 2 µg RNA eingesetzt. DNAse-Verdau: 2 µg variabel RNA DEPC-Wasser 1 µl DNAse-Puffer 1 µl DNAse → 10 µl Gesamtvolumen Der DNAse-Verdau erfolgte für 1 Stunde bei 37 °C. Um die Reaktion zu stoppen, wurde 1 µl EDTA (DNAse-Stopp; 25 mM) hinzupipettiert. Anschließend wurde die Temperatur für 10 Minuten auf 65 °C erhöht. Der DNAse-Verdau wurde dann in die reverse Transkription eingesetzt. Reverse Transkription: 11 µl 5 µl 2,5 µl 1 µl 3,5 µl DNAse-Verdau RT-Puffer dNTPs (je 2,5 mM) oligodT (50 µM) DEPC-Wasser Zunächst wurde der Ansatz für 5 Minuten bei 70 °C, dann für 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden jeweils 1 µl Revert Aid™ H-RT (M-MuLV Reverse Transkriptase (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase)) und 1 µl RiboLock™ zum Ansatz hinzugefügt. Die reverse Transkription wurde für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Inaktivierung wurde für 15 Minuten bei 70 °C durchgeführt. Mit der hergestellten cDNA konnte der Expressionsstatus eines Gens mittels PCR analysiert werden. Als Kontrolle wurde immer die Expression eines Haushaltsgens mit überprüft. 3.2.4.6 Quantitative Echtzeit-PCR Um die Expressionsmenge eines Gens quantifizieren zu können, wurde eine qPCR durchgeführt. Zur Bestimmung der Primereffizienz wurden verschiedene Verdünnungen der cDNA eingesetzt. Jeweils drei technische Replikate und zwei Wasserkontrollen pro Primerpaar wurden in 96-WellPlatten pipettiert. Nach der Infektion mit Xcv wurden RPT6-Transkriptmengen in Paprika relativ zu Aktin auf einem Mx3000P qPCR System (Agilent) mit dem Brilliant II SYBR® Green QPCR Master Mix (Agilent) den Herstellerangaben entsprechend bestimmt. Dabei wurde für die Amplifizierung von RPT6 aus Paprika das Primerpaar VB106 und VB107 verwendet. Um die relative Expressionshöhe 38 KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN von RPT6 in den VIGS-RPT6-Pflanzen zu bestimmen, wurde das Primerpaar VB114 und VB115 eingesetzt. 10 µl 1 µl ® SYBR Green Mix Primer 1 (1µM) PCR-Programm: ◦ 10 Minuten ◦ 30 Sekunden ◦ 95 C 95 C 1 µl Primer 2 (1µM) 52 C 30 Sekunden 7 µl Wasser 72 ◦C 30 Sekunden 1 µl cDNA ◦ 10 Minuten ◦ 1 Minute ◦ 30 Sekunden ◦ 30 Sekunden 72 C 95 C 55 C 95 C 3.2.4.7 45 Zyklen Ansatz für qPCR: Triparentale Konjugation zur Herstellung einer Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ∆xopJ-Mutante Um ein Gen in Xcv auszuschalten, musste man sich der Methode der Triparentalen Konjugation bedienen. Dazu wurde das zu deletierende Gen (xopJ) als verkürzte, zusammengesetzte Version (384 bp inklusive Fragmente der 3’ und 5’ UTR-Bereiche) über die BamHI und SalI-Schnittstellen in den pOK-Vektor kloniert und in E. coli DH5αλpir transformiert (Donor). Für die Transformation von einem Vektor in Xcv ist der E. coli-Stamm K12 HB101 mit pRK2013 als Helfer notwendig. Von jedem Stamm wurde ein 1 bis 2 cm langer und 5 mm breiter Streifen von einem Bakterienrasen von der Platte abgenommen und in je 500 µl NYG-Medium resuspendiert. Der Konjugationsmix setzte sich aus 10 µl Donor-Stamm (xopJ 384 bp-pOK in DH5αλpir), 10 µl des Helfer-Stammes und 50 µl des Rezipienten (Xcv-Wildtyp) zusammen. Dieser Konjugationsmix wurde mittig auf eine NYG-Platte aufgetropft und getrocknet. Anschließend wurde die Platte über Nacht bei 30 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde der Bakterienrasen von der Platte abgenommen und in 500 µl NYG/Rifampicin (Rif; 1:500) resuspendiert. Die Bakteriensuspension wurde für 30 Sekunden zentrifugiert und in 100 µl frischem NYG/Rif-Medium resuspendiert. Zweimal 50 µl dieser Mischung wurden auf NYG/Rif/Spectinomycin (Spec)-Platten so ausplattiert, dass Einzelkolonien entstanden sind. Diese Platte wurde 3 Tage bei 28 °C inkubiert. Konjuganden wurden parallel auf NYG/Rif/SpecPlatten und NYG/Rif/Spec + 5 % Saccharose-Platten ausgestrichen. Die Saccharose diente als negativer Selektionsmarker für Klone, die mit dem pOK-Vektor transformiert worden sind. Die Platten wurden über Nacht bei 30 °C bebrütet. Drei Klone, die sich als Spectinomycin-resistent, aber Saccharose-sensitiv herausstellten, wurden gepickt und in je 3 ml NYG/Rif-Medium überimpft. Die Kulturen wurden bei 28 °C und 200 Upm über Nacht geschüttelt. Je 30 µl der Übernachtkulturen wurden in je 3 ml frisches NYG/Rif-Medium überimpft und eine weitere Nacht 39 3.2. METHODEN schütteln gelassen. Von jeder Kultur wurden Verdünnungsreihen von 10-1 bis 10-3 angesetzt und auf NYG/Rif + 5 % Saccharose ausplattiert. Dabei wurde die Verdünnung 10-2 einmal und die Verdünnungsstufe 10-3 zweimal ausgestrichen. Die Platten wurden bei 28 °C inkubiert. Nach drei Tagen wurden pro vereinzeltem Klon 16 Kolonien gepickt und auf NYG/Rif/Spec und NYG/Rif + 5 % Saccharose ausplattiert. Für eine Überprüfung durch PCR wurden nach zwei Tagen bei 30 °C 14 Spectinomycin-sensitive und Saccharose-resistente Klone gepickt und in je 3 ml NYG/Rif-Medium angeimpft. Als Negativkontrolle für die PCR wurde auch der Xanthomonas campestris pv. vesicatoria-Wildtyp mit angeimpft. Die Kulturen wurden bei 28 °C über Nacht inkubiert. Um zu überprüfen, ob die Mutation erfolgreich war, wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt. Dazu wurden je 500 µl der Übernachtkulturen für 8 Minuten bei 13000 Upm abzentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden in je 500 µl 1 mM Magnesiumchlorid resuspendiert. Die Suspensionen wurden für 8 Minuten bei 95 °C gekocht und für weitere 8 Minuten bei 13000 Upm pelletiert. Die Überstände wurden in neue Eppendorfgefäße überführt und dienten als Matrizen für die PCR. 1 µl 5 µl 5 µl 2 µl DNA Suspension aus Xcv Primer VB73 (5 µM) Primer VB76 (5 µM) dNTPs (2,5 mM) PCR-Programm: Xcv 95 ◦C 5 Minuten ◦ 1 Minute ◦ 40 Sekunden ◦ 1,5 Minuten ◦ 95 C 56 C 72 C 2,5 µl 10 x Thermo Pol Puffer 72 C 10 Minuten 10 µl H2 O 10 ◦C Pause 0,5 µl Taq-Polymerase 32 Zyklen Ansatz für die PCR zur Überprüfung der Mutation: Von positiven Klonen wurden jeweils 2 Gefrierstocks angelegt. Dazu wurden 930 µl einer Übernachtkultur mit 70 µl sterilem DMSO versetzt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Anschließend wurden die Stämme bei -80 °C aufbewahrt. 3.2.4.8 Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen Um die möglichen Interaktionspartner eines Proteins zu finden, wurde das Hefe-Zwei-HybridSystem angewandt (Fields und Song, 1989). Der mit dem Köderprotein, das in den Vektor pGBT9 kloniert wurde, transformierte Y187-Hefestamm wurde in 5 ml SCAD-trp-Medium angeimpft und über Nacht bei 28 bis 30 °C inkubiert. Anschließend wurden von der Vorkultur je 1 ml in 150 ml SCAD-trp überimpft und erneut bis zum nächsten Tag wachsen gelassen. Nach Messung der optischen Dichte bei 600 nm (zwischen 0,5 und 1,0) wurden 100 oD-Einheiten der Hauptkultur bei 4000 Upm für 5 Minuten pelletiert. Währenddessen wurden AH109-Hefezellen, welche die Genbank enthielten, aufgetaut und in 20 ml YPAD überführt. Die Suspension wurde für 10 Minuten im Wasserbad bei 30 °C inkubiert. Die 40 KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN AH109-Zellen wurden auf das Y187-Pellet gegeben und resuspendiert. Nach Abzentrifugieren für 5 Minuten bei 4000 Upm wurde der Überstand verworfen und das Pellet im Rückfluss resuspendiert. Diese dickflüssige Suspension wurde auf 5 YPAD-Platten verteilt und bei 30 °C inkubiert. Nach ca. 5 Stunden wurden die Zellen mit Hilfe von je 2 mal 3 ml flüssigem YPAD-Medium von den Platten gespült und in einem 50 ml-Reaktionsgefäß vereinigt. Nach erneutem Zentrifugieren bei 4000 Upm für 5 Minuten wurde das Pellet in 15 ml Wasser aufgenommen. Sieben mal 1 ml wurden auf große SCAD-leu-trp-his + 3-Aminotriazol (3-AT) ausplattiert. Aminotriazol ist ein kompetitiver Inhibitor des HIS3-Genprodukts und verhindert so das Wachstum falschpositiver Klone auf -his-Medium (Klopotowski und Wiater, 1965; Struhl und Davis, 1977). Für die Tests auf direkte Interaktion im Hefe-Stamm Y190 wurden 25 mM 3-AT verwendet, während für die Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung nur 4 mM 3-AT eingesetzt wurden. Um die Paarungseffizienz bestimmen zu können, wurde eine Verdünnungsreihe von 10-2 bis -4 10 angelegt und je 100 µl auf kleinen SCAD-leu-trp-Platten ausgestrichen. Alle Platten wurden bei 30 °C inkubiert. Hefekolonien, welche auf den großen Platten gewachsen sind, wurden gepickt und auf SCADleu-trp-his + 3-AT einmal mit und einmal ohne Genescreen-Membran (PerkinElmer, Rodgau) übertragen. Nach erneuter Inkubation bei 30 °C wurde zur Überprüfung der Interaktion ein LacZFilter-Test durchgeführt. Dazu wurde Whatman-Papier in LacZ-Puffer [Z-Puffer (60 mM Na2 HPO4 , 40 mM NaH2 PO4 , 10 mM KCl, 1 mM MgSO4 , pH7,0), 0,064 % X-Gal (w/v; gelöst in Dimethylformamid), 0,26 % β-Mercaptoethanol (v/v)] getränkt und in eine leere Petrischale gelegt. Die Genescreen-Membran mit den Hefezellen wurde in flüssigen Stickstoff getaucht und anschließend auf das getränkte Whatman-Papier gelegt. Die Schale wurde bei 30 °C inkubiert. Eine Blaufärbung der Hefekolonien zeigte die Interaktion der Proteine an. 3.2.5 Biochemische Methoden 3.2.5.1 Induktion und Reinigung von affinitätsmarkierten Proteinen aus E. coli Für die Aufreinigung von markierten Proteinen, wurden die entsprechenden Vektoren in E. coliZellen transformiert. Mit diesen Bakterien (M15, BL21) wurde zunächst eine Vorkultur in LBMedium mit adäquaten Antibiotika mit einem Volumen von 5 ml angesetzt. Diese wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert. 3 ml dieser Vorkultur wurden in 100 ml frisches Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpft. Die Hauptkultur wurde ebenfalls bei 37 °C geschüttelt. Bei Erreichen einer oD600 von 0,6 wurde 1 mM IPTG hinzugegeben und somit die Proteinexpression induziert. Daraufhin wurde die Kultur für 24 Stunden bei 18 °C weiter geschüttelt. Die Ernte der Zellen erfolgte für 20 Minuten bei 4000 Upm. Das jeweilige Protein wurde aus 50 bis 100 ml E. coli-Kultur isoliert und gereinigt. Dazu wurde das Zell-Pellet mit 1 ml Säulenpuffer [20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA] für die Reinigung eines MBP-Fusionsproteins und mit 1,5 bis 3 ml IPP150-Puffer [10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1 % NP40] für die Reinigung eines GST-Fusionsproteins versetzt. Die Ansätze wurden für 30 Minuten auf Eis gestellt. Um die Bakterienzellen aufzuschließen, wurde die Suspension in ein 2 ml-Eppendorf-Gefäß überführt und 4 mal 30 Sekunden lang sonifiziert. 41 3.2. METHODEN Anschließend wurde die Suspension für 15 Minuten bei 13000 Upm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand enthielt die löslichen Proteine und wurde weiterverarbeitet. 1 ml des Überstandes wurde auf 300 µl mit Puffer äquilibriertes Amylose-Harz (MBP) oder 700 µl äquilibrierte Glutathion-Sepharose gegeben. Die Suspension wurde in ein 15 ml-Reaktionsgefäß umpipettiert und mit Säulenpuffer bzw. IPP150 auf 10 ml aufgefüllt. Die Adsorption an die Matrix erfolgte für ca. 2 Stunden bei 4 °C auf einem Überkopfroller (10 Upm). Nach Zentrifugation für 1 Minute bei 4000 Upm und 4 °C wurde vom Überstand nach Adsorption eine Probe fürs Gel genommen und der Rest verworfen. Anschließend wurde die Matrix 4 mal mit je 500 µl Säulenpuffer bzw. 5 mal mit je 1,5 ml IPP150 gewaschen. Für die Elution wurden 2 mal 300 µl Elutionspuffer [Säulenpuffer mit 10 mM Maltose bzw. 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 mg / ml reduziertes Glutathion] auf die Matrix gegeben, in ein 2 ml-Eppendorf-Gefäß überführt und auf dem Überkopfroller bei 4 °C und 10 Upm inkubiert. Nach jeweils 30 Minuten wurde die Matrix für 1 Minute bei 13000 Upm und 4 °C zentrifugiert. Aliquots der Überstände wurden mit 4-fach Lämmli-Puffer versetzt und bei 95 °C für 10 Minuten gekocht. Anschließend wurden alle Proben zur Überprüfung auf ein Gel aufgetragen. 4-fach Lämmli-Puffer: 200 mM 18 % β-Mercaptoethanol (v/v) 40 % Glycerin (v/v) 0,01 % 8% 3.2.5.2 Tris-HCl, pH 6,8 Bromphenolblau (w/v) SDS (w/v) Proteinaufreinigung über die GFP-Affinitätsmarkierung aus N. benthamiana für Koimmunpräzipitation Die im Folgenden beschriebene Methode wurde verändert nach Schwessinger et al. (2011). Jeweils 1 bis 2 g Blattmaterial, die das aufzureinigende Protein exprimierten, wurden in flüssigem Stickstoff gemörsert. Zum gefrorenen Blattpulver wurden je 2 ml Lysispuffer [50 mM TrisHCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 % (v/v) Glycerin, 10 mM DTT, 10 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM Na2 MoO4 × 2 H2 O, 1-fach Complete Proteaseinhibitor, EDTA-frei, 1 % NP40] und eine Spatelspitze PVPP (Polyvinylpyrrolidon) gegeben. Nach Auftauen der Suspension wurden die Proben für 15 Minuten bei 12000 Upm und 4 °C zentrifugiert. Vom Überstand wurde die Proteinkonzentration nach Bradford bestimmt (Bradford, 1976) und jeweils 3 mg Gesamtproteinextrakt auf eine magnetische Matrix (GFP-Trap® _M, Chromotek GmbH, Planegg-Martinsried) gegeben. Diese Matrix war mit sogenannten Nanobodies gekoppelt und wurde vor Gebrauch 3 bis 4 mal mit Lysispuffer ohne NP 40 äquilibriert. Die GFP-markierten Proteine wurden für 3 bis 4 Stunden bei 4 °C und 10 Upm auf einem Überkopfroller an die Matrix adsorbiert. Nach der Adsorption wurde der Überstand entfernt und die Matrix wurde 5 mal mit je 1 ml TBS (siehe Abschnitt 3.2.5.3) mit 0,5 % NP 40 gewaschen. 42 KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN Für die Koimmunpräzipitation wurden die Proteine mit 2-fach Lämmli-Puffer für 10 Minuten bei 70 °C eluiert. Die Proben wurden auf ein Proteingel aufgetragen und Western Blots mit GFPAntikörper bzw. myc-Antikörper (Detektion des Interaktionspartners) durchgeführt. 3.2.5.3 Proteingelelektrophorese und Western Blot Für die Western Blots in dieser Arbeit wurden sowohl BisTris- als auch Lämmli-Gele in verschiedenen Konzentrationen verwendet. Lämmli-Gele: 10 % Trenngel 12,5 % Trenngel 1,125 ml 3 M Tris-HCl, pH 8,8 1,125 ml 3 ml Sammelgel 3 M Tris-HCl, pH 8,8 0,625 ml 3 M Tris-HCl, pH 6,8 Acrylamid (37,5:1) 0,625 ml Acrylamid (37,5:1) 3,75 ml Acrylamid (37,5:1) 0,09 ml 10 % SDS 3,95 ml Wasser 4,7 ml Wasser 1,8 ml Wasser 0,0045 ml TEMED 0,0045 ml TEMED 0,0025 ml TEMED 0,0675 ml 10 % APS 0,0675 ml 10 % APS 0,09 ml 10 % SDS 0,05 ml 0,025 ml 10 % SDS 10 % APS BisTris-Gele: Trenngel 1,43 ml Sammelgel 3,5-fach BisTris 0,71 ml 3,5-fach BisTris Acrylamid (37,5:1) 0,35 ml Acrylamid (37,5:1) 1,57 ml Wasser 1,44 ml Wasser 0,002 ml TEMED 0,004 ml TEMED 10 % APS 0,025 ml 10 % APS 2 ml 0,02 ml Für die Analyse von Gesamtproteinextrakten aus Pflanzen wurden Blattscheiben mit Hilfe des Rotor-Stator-Homogenisators (Heidolph, Schwabach) aufgeschlossen und mit Lämmli-Puffer versetzt. Nach Abkochen für 10 Minuten bei 95 °C wurden die Proben kurz abzentrifugiert und der Überstand wurde auf ein Gel aufgetragen. Nach dem Gellauf wurden die der Größe nach aufgetrennten Proteine auf eine NitrozelluloseMembran (Porablot, Macherey-Nagel, Düren) transferiert. Dazu wurde die Membran in Transferpuffer [39 mM Glycin, 48 mM Tris, 0,0375 % SDS, 20 % Methanol, pH 8,2 (HCl)] äquilibriert. Die Proteine im Gel wurden dann auf die Nitrozellulosemembran bei 1 mA / cm2 für 1,5 Stunden geblottet. Anschließend wurde die Membran in Blockierlösung (TBS-T [20 mM Tris, 500 mM NaCl, 0,1 % Tween-20] mit 5 % Magermilchpulver (w/v)) für mindestens eine Stunde inkubiert. Nach der Blockierung wurde die Membran für 1 Stunde in Antikörper-Lösung geschüttelt. Dabei wurde der Antikörper in 1 % Magermilch-TBS-T verdünnt. Danach wurde die Membran dreimal für 5 Minuten in TBS-T gewaschen. Im Anschluss daran erfolgte die Inkubation mit dem zweiten Anti- 43 3.2. METHODEN körper, an dem die Meerrettichperoxidase gekoppelt war. Der zweite Antikörper wurde ebenfalls vor Gebrauch in 1 % Magermilch-TBS-T verdünnt. Vor der Entwicklung mit Cumarinsäure, Luminol und H2 O2 wurde der Blot wieder dreimal für je 5 bis 10 Minuten in TBS-T gewaschen. Die Inkubation in den Entwicklerlösungen 1 und 2 erfolgte für 1 Minute unter ständigem Schwenken. Antikörper-spezifische Signale wurden auf Röntgenfilmen detektiert. Entwicklerlösungen: Lösung 1 Culu: Lösung 2 5 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,5 5 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,5 72 µl Culu 3 µl H2 O2 3.2.5.4 250 mM 90 mM Luminol Cumarinsäure Western Blot Stripping Um die Antikörper von der Nitrozellulosemembran zu entfernen, wurde die Membran in 25 ml 50 °C warmem Puffer [25 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2 % SDS] für 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 253 µl β-Mercaptoethanol dazu pipettiert und für 15 Minuten inkubiert. Nach dreimal 5minütigem Waschen der Membran in MilliQ-Wasser konnte diese wieder blockiert und mit neuen Antikörpern dekoriert werden. 3.2.5.5 Subzelluläre Fraktionierung Um die Lokalisierung von Proteinen entweder der löslichen oder der Membranfraktion zuordnen zu können, wurden Gesamtproteinextrakte aus Nicotiana benthamiana subzellulär fraktioniert. Dazu wurden ca. je 1 g Blattmaterial in einem mit flüssigem Stickstoff vorgekühlten Mörser mit 3 ml kaltem Puffer [20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 , 1 mM DTT, 1-fach Complete Proteaseinhibitor, EDTA-frei] pulverisiert. Die Suspension wurde nach dem Auftauen in geeignete Eppendorf-Gefäße überführt und für 5 Minuten bei 5000 Upm zentrifugiert. Vom Gesamtprotein-Extrakt wurden 200 µl mit 67 µl 4-fach Lämmli-Puffer versetzt. Je 1 ml dieses Extraktes wurde anschließend in Beckmann TL-100-Röhrchen für eine Stunde bei 32000 Upm (Rotor AH-650; entsprach 100000 g) zentrifugiert. Vom erhaltenen Überstand (lösliche Fraktion) wurden ebenfalls 200 µl mit 67 µl 4-fach Lämmli gemischt. Das Pellet (Membranfraktion) wurde mit 500 µl 4-fach Lämmli-Puffer resuspendiert. Alle Proben wurden für 10 Minuten bei 95 °C gekocht. Anschließend wurde ein Western Blot mit den entsprechenden Antikörpern durchgeführt. Als Kontrollen für die korrekte Trennung der Fraktionen dienten der anti-NtSPP2-Antikörper (lösliche Fraktion) und der anti-H+ -ATPase-Antikörper (Membranfraktion). 3.2.5.6 Isolierung von Proteinen aus apoplastischer Flüssigkeit Um das Reporterprotein secGFP unter dem Einfluss von bakteriellen Effektoren im Apoplasten zu untersuchen, wurden transgene N. benthamiana-Pflanzen hergestellt, die das secGFP-Konstrukt 44 KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN konstitutiv exprimierten. Zur Isolierung der apoplastischen Flüssigkeit wurden die entsprechenden Blätter von der Pflanze abgetrennt. Anschließend wurde die Mittelrippe entfernt. Die beiden Blatthälften wurden gewogen und in Leitungswasser mit ein paar Tropfen Triton X-100 gewaschen. Nach Trockentupfen der Blätter mit Whatman-Papier, wurden die Schnittkanten der beiden Hälften übereinander gelegt und so gerollt, dass die Blattunterseite nach außen zeigte. Die Blattrolle wurde mit den Schnittkanten nach unten in ein 50 ml-Reaktionsgefäß gesteckt. Es wurde so viel Puffer [50 mM KPi , pH 7,0, 150 mM NaCl, 100 µg/ml Pefabloc] eingefüllt, dass die Blattrolle komplett mit Flüssigkeit bedeckt war. Das Gefäß wurde mit einem Deckel, der durchlöchert war, verschlossen und in den Exsikkator gestellt. Daraufhin wurde der Exsikkator zweimal für fünf Minuten evakuiert. Zwischen den Evakuierungen wurde belüftet. Nach der Vakuum-Infiltration wurde der Puffer mitsamt den Blättern aus dem Gefäß geschleudert. Die Blätter wurden getrocknet und in Alufolie gerollt, so dass die Schnittkanten zur gleichen Seite zeigten. Die AlufolieRöllchen wurden in ein Gefäß mit abgeschnittenem Boden gelegt und in ein Zentrifugenbecher gesteckt. Danach wurde für zehn Minuten bei 1400 Upm und 4 °C zentrifugiert. Dabei wurde die apoplastische Flüssigkeit aus den Blättern geschleudert und im Zentrifugenbecher aufgefangen. Anschließend wurde die Flüssigkeit aus dem Becher in Eppendorf-Gefäße überführt und die Menge in Mikroliter bestimmt. 3.2.5.7 Säurefällung der apoplastischen Proteine Die folgende Methode wurde nach Coachman et al. (2002) verändert. Zu der apoplastischen Flüssigkeit wurde 100 % TCA (w/v) zugegeben, so dass die Endkonzentration an TCA 25 % betrug. Der Ansatz wurde für mindestens 15 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurde für 15 Minuten bei 14000 Upm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde mit 300 µl Aceton gewaschen. Danach wurde erneut bei 14000 Upm und 4 °C für sieben Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde nun restlos abgezogen und das Pellet für einige Minuten in der Speed-vac getrocknet. Die getrockneten Pellets wurden in 20 µl 2-fach Lämmli-Puffer aufgenommen und für zehn Minuten bei 95 °C gekocht. Anschließend wurden die Proben über Western Blot analysiert. 3.2.5.8 Proteasomaktivitätstest Die im Folgenden beschriebene Methode wurde verändert nach Reinheckel et al. (2000) und Jacob-Wilk et al. (2006). Von den infiltrierten N. benthamiana wurden jeweils vier Blattscheiben mit dem Stanzer #5 geerntet. Diese wurden mit dem Rotor-Stator-Homogenisator (Heidolph, Schwabach) in je 200 µl Extraktionspuffer [50 mM HEPES-KOH, pH 7,2, 2 mM ATP, 2 mM DTT, 250 mM Saccharose] aufgeschlossen. Danach wurden die Proben bei 11000 Upm und 4 °C zentrifugiert. Vom Überstand wurde die Proteinkonzentration mit Hilfe der Bradford-Methode bestimmt (Bradford, 1976). Alle Proben wurden mit Extraktionspuffer auf eine Konzentration von 1 mg/ ml eingestellt. Je 50 µg-Aliquots bei Nicotiana benthamiana und Capsicum annuum und 20 µg bei Arabidopsis thaliana wurden auf je 270 µl mit Proteolyse-Puffer [100 mM HEPESKOH, pH 7,8, 5 mM MgCl2 , 10 mM KCl, 2 mM ATP] aufgefüllt und für 5 Minuten bei 30 °C inku- 3.2. METHODEN 45 biert. Nach kurzem Zentrifugieren wurden die Proben in weiße, gut reflektierende, aber nichtfluoreszierende 96-Well-Platten (Nunc GmbH & Co.KG, Langenselbold) umpipettiert. Um die Reaktion zu starten, wurden 0,2 mM des Substrates Succinyl-LLVY-Amidomethylcumarin zugegeben. Die Messkinetik wurde 2 bis 3 Stunden durchgeführt. Dabei wurden die Proben mit Licht der Wellenlänge 360 + / - 40 nm angeregt und die Emission bei 460 + / - 40 nm gemessen. Jede Probe wurde einmal pro Minute angeregt. 3.2.5.9 In vitro-Acetylierung Diese Methode wurde verändert nach Mukherjee et al. (2006). Je 1 µg aufgereinigtes MBP-XopJ, GST-HopZ1a (Positivkontrolle) und GST-RPT6 wurden in die in vitro-Acetylierung eingesetzt. Die jeweiligen Proteine wurden mit je 4 µl 5-fach Acetylierungspuffer [50 mM HEPES-KOH, pH 8,0, 10 % Glycerin, 1 mM DTT, 1 mM PMSF], 100 nM Inositolhexakisphosphat (IP6 ) und 2 µl C14 Acetyl-CoA (55 mCi/mmol; 0,1 mCi/ml) in einem Gesamtvolumen von 20 µl versetzt. Die Ansätze wurden für eine Stunde bei 30 °C inkubiert. Anschließend wurden jeweils 7 µl 4-fach LämmliPuffer zugegeben und für 5 Minuten bei 95 °C gekocht. Anschließend wurden die Proben auf ein BisTris-Gel aufgetragen und der Größe nach aufgetrennt. Danach wurde das Gel für eine halbe Stunde in 50 % Methanol, 10 % Essigsäure fixiert und für 15 Minuten in „Amplify“-Lösung (GE Healthcare, München) inkubiert. Anschließend wurde das Gel getrocknet und zur Detektion der radioaktiven Banden ein Phosphorimager für ca. 3 Wochen aufgelegt. 3.2.5.10 Massenspektrometrie Um posttranslationale Modifikationen von Proteinen zu analysieren, wurden Proteingele der aufgereinigten Proteine mit kolloidalem Coomassie nach Herstellerangaben (Sigma-Aldrich) gefärbt. Die zu analysierenden Proteinbanden wurden ausgeschnitten und zur massenspektrometrischen Analyse an die Firma Toplab GmbH nach Martinsried geschickt. 3.2.5.11 Nachweis phosphorylierter MAP Kinasen Diese Methode wurde verändert nach Schwessinger et al. (2011). Um phosphorylierte MAP Kinasen nachweisen zu können, wurden 14 Tage alte Arabidopsis thaliana-Keimlinge verwendet. Es wurden ca. 6 Keimlinge pro Ansatz geerntet. Diese wurden vorsichtig in 3 ml MS-Medium (siehe Abschnitt 3.2.1) gelegt und über Nacht im Lichtraum geschüttelt. Um die Expression von xopJ zu induzieren, wurden transgene Keimlinge mit 0,1 % Ethanol behandelt. Nach weiteren 24 Stunden Schütteln in Dunkelheit wurden die Pflanzen mit 1 µM flg22 behandelt. Die Keimlinge wurden 0, 15 und 30 Minuten nach Zugabe des Flagellins geerntet, trocken getupft und in Eppendorfgefäße überführt. Anschließend wurden sie in flüssigem Stickstoff gefroren. Eine Kontrollgruppe der Pflanzen wurde nur mit Wasser behandelt. Die Keimlinge wurden mit jeweils 100 µl Better Lacus-Puffer [50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 15 mM EGTA, 10 mM MgCl2 , 1 mM NaF, 1 mM Na2 O4 Mo × 2 H2 O, 0,5 mM NaVO3 , 30 mM 46 KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN β-Glycerophosphat, 0,1 % Nonidet 40, 0,5 mM PMSF, 1-fach Complete (EDTA-frei), 1 Tablette/10 ml Phosphatase Inhibitor Cocktail] mit Hilfe des Rotor-Stator-Homogenisators (Heidolph, Schwabach) aufgeschlossen. Nach einem Zentrifugationsschritt von 30 Minuten bei 13000 Upm und 4 °C wurden die Proteingehalte der Überstände nach der Bradford-Methode bestimmt (Bradford, 1976). Anschließend wurden pro Probe 30 µg Gesamtprotein auf 10 %ige Lämmli-Gele aufgetragen und ein Western Blot mit anti-phospho-p44/42 MAPK-Antikörper und anti-MPK6Antikörper durchgeführt. 3.2.5.12 Anilin-Blau Färbung von Arabidopsis thaliana-Blättern Diese Methode wurde verändert nach Ton et al. (2005). Um Kallose-Ablagerungen in Arabidopsis thaliana-Blättern zu detektieren, wurden die Blätter mit Anilin-Blau gefärbt. Dazu wurden die Blätter in warmem 80 %igen Ethanol entfärbt. Nach 30 Minuten Inkubation in 0,07 M Natriumphosphatpuffer (pH9), wurden die Blätter für eine Stunde in 0,005 % Anilin-Blau-Lösung [0,05 % in MilliQ, 1:10 mit 0,07 M NaPi , pH 9] gefärbt. Danach wurden die Blätter dreimal je zehn Minuten mit Wasser gewaschen und anschließend mikroskopiert. 3.2.6 Mikroskopische Methoden 3.2.6.1 Fluoreszenzmikroskopie Für die Analyse der Kalloseablagerungen in Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurde ein Leica DMRFluoreszenzmikroskop verwendet. Anilin-Blau gefärbte Blätter wurden auf ein Objektträger gelegt und mit Wasser benetzt. Anschließend wurde ein Deckgläschen aufgelegt und mit Fluoreszenzlicht mikroskopiert. Dazu wurde die UV-Filter-Anordnung, bestehend aus einem 340 nm Bandpass-Filter und einem 425 nm Langpass-Filter, von Leica verwendet. Zur Aufbewahrung der Präparate über mehrere Stunden wurden sie im Dunkeln gelagert. 3.2.6.2 Konfokale Laserscanning Mikroskopie (KLSM) Es wurden ca. 3 mal 3 mm große Blattstücke von einem infiltrierten Blatt ausgeschnitten und mit der Unterseite nach oben auf einen mit doppelseitigem Tesa-Film beklebten Objektträger gelegt. Die Blattstückchen wurden mit je einem Tropfen Leitungswasser benetzt. Anschließend wurde ein Deckgläschen auf die Blattstücke gesetzt und vorsichtig angedrückt. Für konfokale Analysen wurde ein Leica TCS SP5 II (AOBS) Laserscanning Mikroskop (KLSM; Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH, Wetzlar) eingesetzt. Dabei erfolgte die Anregung von GFP und YFP mit einem 65 mW Argon-Laser bei 488 nm/514 nm und von mCherry mit einem 20 mW DPSS-Laser bei 561 nm. GFP wurde in einem Detektionsbereich von ca. 497 bis 526 nm aufgenommen, YFP bei ca. 527 bis 561 nm, tdTomato bei ca. 581 nm und mCherry bei ca. 610 nm. Zusätzlich konnte noch die Autofluoreszenz des Chlorophylls - nach Anregung mit Licht der Wellenlänge 488 nm - bei 680 bis 730 nm detektiert werden. Die erhaltenen Datensätze wurden mit der Leica-Software LAS_AF (Version 2.3.5_build_5379) und Adobe Photoshop CS3 bearbeitet. 4 Ergebnisse Bakterien gelangen über Wunden oder Stomata in den Apoplasten einer Pflanze. Dort können sie sich vermehren und eine Krankheit auslösen. Bei vielen gramnegativen Bakterien werden während einer Infektion Effektorproteine in die Pflanzenzelle transloziert, die den zellulären Metabolismus zu Gunsten des Pathogens umsteuern können. Von diesen Effektoren hängt es oft ab, ob eine Pflanze krank wird oder resistent ist. Andererseits können die Effektoren durch die Abwehr der Pflanze erkannt werden, was wiederum Resistenz auslöst. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Typ III-Effektor XopJ aus dem Xanthomonas campestris pv. vesicatoria-Stamm 85-10 funktionell charakterisiert. Dazu wurden einerseits Lokalisierungsstudien betrieben und die Virulenzfunktion des Effektors untersucht. In Hefe-ZweiHybrid-Durchmusterungen mit verschiedenen Pflanzen-Genbanken wurden Interaktionspartner und damit mögliche Zielproteine von XopJ in Pflanzen identifiziert. Außerdem wurde mittels biochemischer Ansätze eine mögliche enzymatische Aktivität des Effektors untersucht. 4.1 4.1.1 Lokalisierung von XopJ in Nicotiana benthamiana Kolokalisierungsstudien am Konfokalen Laserscanning Mikroskop (KLSM) mit Markerproteinen Um einen Überblick über die Wirkweise von XopJ zu erhalten, wurde zunächst dessen subzelluläre Lokalisierung analysiert. Dazu wurde das grün-fluoreszierende Protein (GFP) an den CTerminus von XopJ fusioniert und das Fusionsprotein mittels Agrobakterien-Infiltration transient 47 48 KAPITEL 4. ERGEBNISSE GFP mCherry Überlagerung a XopJ-GFP AtPIP2A-mCherry (PM) b XopJ-GFP GmMan1-mCherry (Golgi) c XopJ C235A-GFP AtPIP2A-mCherry (PM) d XopJ C235A-GFP GmMan1-mCherry (Golgi) e XopJ G2A-GFP AtPIP2A-mCherry (PM) f Lösliches GFP Abbildung 4.1: Nachweis der Lokalisierung von XopJ an der Plasmamembran. XopJ-GFP wurde über Agrobakterien-vermittelte Transformation in N. benthamiana zusammen mit den Markerprotein-mCherry-Fusionen exprimiert. a: XopJ kolokalisiert mit dem Plasmamembranmarker AtPIP2A-mCherry, b: Teilweise überschneidet sich die Lokalisierung von XopJ auch mit dem Golgimarker GmMan1-mCherry, c: Die katalytische Mutante XopJ C235A befindet sich ebenfalls an der Plasmamembran, d: Kolokalisierung von XopJ C235A-GFP mit dem Golgi-Marker, e: Lokalisierung der Myristoylierungsmutante XopJ G2A, f: lösliches GFP dient als Kontrolle für die Lokalisierung. Grün: GFP-Fluoreszenz, rot: mCherry-Fluoreszenz, blau: Autofluoreszenz der Chloroplasten. Die Abbildungen b, c, d und e wurden als z-Stapel aufgenommen. Die Länge der Standards entspricht jeweils 15 µm. 4.1. LOKALISIERUNG VON XOPJ IN NICOTIANA BENTHAMIANA 49 in Blättern von Nicotiana benthamiana exprimiert. Um die Zuordnung des Fluoreszenzmusters zu einem zellulären Kompartiment zu erleichtern, wurde das XopJ-GFP-Fusionsprotein mit mCherrymarkierten kompartimentspezifischen Markerproteinen koexprimiert (Nelson et al., 2007). Da sich in den Vorarbeiten bereits gezeigt hatte, dass XopJ an der Plasmamembran zu finden war, wurde der Plasmamembranmarker „pm-rk CD3-1007“ (AtPIP2A, ein Plasmamembran-Aquaporin; Cutler et al. (2000); Nelson et al. (2007)) getestet. Des Weiteren wurde bereits gezeigt, dass XopJGFP an vesikelartigen Strukturen assoziiert war. Deshalb wurde ebenfalls die Kolokalisation mit dem Golgimarker „G-rk CD3-967“ (zytosolischer Teil und Transmembrandomäne von GmMan1, einer α-1,2-Mannosidase; Saint-Jore-Dupas et al. (2006); Nelson et al. (2007)) untersucht. Abbildung 4.1 zeigt das Ergebnis der Kolokalisierungen von XopJ-GFP mit den MarkerproteinmCherry-Fusionen für verschiedene Kompartimente (Nelson et al., 2007). Dabei war XopJ-GFP eindeutig an der Plasmamembran lokalisiert, was an der einseitigen Verteilung des GFP-Signals an der Plasmamembran-zugewandten Seite der Chloroplasten und der Überlagerung mit dem Markerprotein für Plasmamembranen (AtPIP2A) zu erkennen war (Abbildung 4.1 a). In Abbildung 4.1 b war auch eine teilweise Kolokalisierung mit den Golgi-Vesikeln zu erkennen, wohingegen die katalytische Mutante XopJ C235A-GFP nur an der Plasmamembran zu finden war (Abbildungen 4.1 c und d). Um herauszufinden, wie das Effektorprotein an bzw. in die Plasmamembran gelangt, wurden in silico-Analysen mit dem Programm TMHMM (TMHMM Server v. 2.0; http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/; zuletzt abgerufen im Dezember 2011; Krogh et al. (2001); Sonnhammer et al. (1998)) durchgeführt. Diese deuteten nicht darauf hin, dass XopJ Transmembrandomänen enthält. Thieme et al. (2007) konnten bereits zeigen, dass zahlreiche Effektorproteine aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) am Glycin an Position 2 der Aminosäuresequenz posttranslational myristoyliert werden und dadurch an der Plasmamembran verankert sein können. Zu diesen myristoylierten Effektoren zählt auch XopJ. Abbildung 4.1 e zeigt eine zumindest teilweise Umverteilung von XopJ-GFP von der Plasmamembran ins Zytosol, wenn das Glycin an Position 2 in ein Alanin mutiert wurde (XopJ G2A). Im Vergleich dazu ist in Abbildung 4.1 f die typische Verteilung von löslichem GFP im Zytosol und im Zellkern gezeigt. 4.1.2 Subzelluläre Fraktionierung von XopJ-exprimierenden N. benthamiana-Blättern Um die Beobachtungen am KLSM zu untermauern, wurde auf ein biochemisches Nachweisverfahren der Proteinlokalisierung in der Pflanzenzelle, die subzelluläre Fraktionierung, zurückgegriffen. Dazu wurde XopJ-GFP, seine Mutanten XopJ C235A-GFP und XopJ G2A-GFP in N. benthamiana für zwei Tage transient exprimiert. Nach der Ernte und dem Aufschluss der Blätter in flüssigem Stickstoff wurden die Membranfraktionen von der löslichen Proteinfraktion durch differentielle Zentrifugation getrennt. Für die Zuordnung des Effektors und seiner Mutanten zu einer bestimmten Fraktion wurden die so erhaltenen Proteinfraktionen auf ein Gel aufgetragen und Western Blots mit Antikörpern gegen fraktionsspezifische Markerproteine (anti-NtSPP2-Antikörper für die lösliche Fraktion (hauptsächlich Zytosol) und anti-H+ -ATPase für die Membranfraktion) durch- 50 KAPITEL 4. ERGEBNISSE a b XopJ-GFP G M L c XopJ C235A-GFP XopJ G2A-GFP G M L 70 kDa > 55 kDa > 100 kDa > G M L anti-GFP anti-NtSPP2 anti-H+-ATPase Abbildung 4.2: Subzelluläre Fraktionierung von XopJ, XopJ C235A und XopJ G2A in N. benthamiana. Die Proteine wurden für zwei Tage in N. benthamiana exprimiert. Nach Ernte und Aufschluss der Blätter wurde die Membran- von der löslichen Fraktion durch differentielle Zentrifugation getrennt. a: XopJ-GFP, b: XopJ C235A-GFP, c: XopJ G2A-GFP. G: Gesamtproteine, M: Membranfraktion, L: Fraktion der löslichen Proteine. Mit dem anti-GFP-Antikörper wurde XopJ detektiert, der anti-NtSPP2-Antikörper und der anti-H+ -ATPase-Antikörper zeigt die Trennung von löslicher und Membranfraktion an. geführt. Dabei wurde der anti-GFP-Antikörper zur Detektion des Effektors und seiner Varianten eingesetzt. Die subzelluläre Fraktionierung des Effektors und seiner Mutanten konnte die Ergebnisse der Mikroskopie bestätigen. Das Wildtyp-Protein XopJ und die katalytische Mutante waren jeweils in der Membranfraktion zu finden. Mit der subzellulären Fraktionierung in dieser Form konnte allerdings nicht zwischen Endomembranen und der Plasmamembran unterschieden werden. In Abbildung 4.2 c zeigt sich, dass XopJ G2A-GFP sowohl in der zytosolischen Fraktion als auch an der Membran vorhanden war. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Lokalisierung von XopJ an der Plasmamembran nicht nur von der Myristoylierung, sondern auch von einer weiteren posttranslationalen Modifikation abhängt. Bei in silico-Analysen mit dem Programm CSSPalm (http://csspalm.biocuckoo.org/prediction.php; abgerufen im Mai 2007; Zhou et al. (2006); Xue et al. (2011); Ren et al. (2008)) zeigte sich, dass XopJ möglicherweise am Cystein an Position 4 palmitoyliert wird. 4.1.3 Lokalisationsstudien von XopJ C4A-GFP Um die These einer zusätzlichen Palmitoylierung von XopJ zu überprüfen, wurde zunächst das Cystein an Position 4 in ein Alanin mutiert. Dadurch entstand die neue XopJ-Mutante XopJ C4A. Diese wurde dann erneut als C-terminales GFP-Konstrukt transient über Agrobakterien in N. benthamiana exprimiert. Zwei Tage nach Infiltration wurde am KLSM die Lokalisierung dieser XopJ-Variante analysiert. Obwohl die Myristoylierungsstelle in der XopJ C4A-Variante noch intakt war, lokalisierte diese ähnlich wie die Myristoylierungsmutante (XopJ G2A) im Zytosol und an der Plasmamembran (Abbildung 4.3). Eine zytosolische Lokalisierung war anhand der Zytoplasmastreifen zu erkennen. 51 4.1. LOKALISIERUNG VON XOPJ IN NICOTIANA BENTHAMIANA XopJ C4A-GFP a Autofluoreszenz b Zytoplasmastreifen Überlagerung c Zytoplasmastreifen vesikelartige Aggregate vesikelartige Aggregate Abbildung 4.3: Nachweis der Änderung der Lokalisation von XopJ nach Mutation des Cysteins 4. Das Konstrukt wurde in N. benthamiana über Agrobakterien-vermittelte Transformation exprimiert. Zwei Tage nach Infiltration wurden die Blätter geerntet und Mikroskopie-Präparate angefertigt. a: XopJ C4A-GFP, b: Autofluoreszenz von Chlorophyll, c: die Überlagerung von a und b. Die Bilder wurden als z-Stapel aufgenommen. Die Länge der Standards entspricht jeweils 15 µm. Interessanterweise waren hier ebenfalls leuchtende, vesikelartige Strukturen zu sehen. Um zu überprüfen, ob auch XopJ C4A noch teilweise in der Plasmamembran verblieb, wurde zusätzlich eine subzelluläre Fraktionierung durchgeführt. Dazu wurde das Konstrukt über Agrobakterienvermittelte Transformation in N. benthamiana exprimiert. Nach zwei Tagen wurde ein XopJ C4AGFP-exprimierendes Blatt geerntet und in flüssigem Stickstoff aufgeschlossen. Nach differentiellen Zentrifugationsschritten wurden die Fraktionen auf ein Gel aufgetragen und Western Blots mit den verschiedenen Antikörpern (Abschnitt 4.1.2) durchgeführt. Abbildung 4.4 zeigt die Detektion der Palmitoylierungsmutante XopJ C4A-GFP genauso wie die der Myristoylierungsmutante XopJ G2A-GFP sowohl in der Membranfraktion als auch in der löslichen Proteinfraktion. Eine Doppelmutante XopJ G2A C4A sollte im nächsten Schritt darüber Aufschluss geben, ob es noch zusätzliche posttranslationale Modifikationen gibt oder ob diese G M L anti-GFP < < anti-NtSPP2 < anti-H+-ATPase < Abbildung 4.4: Subzelluläre Fraktionierung von XopJ C4A-GFP in N. benthamiana. XopJ C4A-GFP wurde transient in N. benthamiana exprimiert. Zwei Tage nach AgrobakterienInfiltration wurde der Pflanzenextrakt subzellulär fraktioniert. Die verschiedenen Fraktio70 kDa nen wurden auf ein Proteingel aufgetragen 55 kDa und Western Blots mit verschiedenen Antikörpern durchgeführt. Die Detektion von XopJ C4A erfolgte mit dem anti-GFP-Antikörper. 55 kDa Als Kontrollen für die korrekte Trennung von Membran- und löslicher Fraktion wurden der anti-H+ -ATPase-Antikörper bzw. der antiNtSPP2-Antikörper eingesetzt. G: Gesamtpro250 kDa teine, M: Membranfraktion, L: Fraktion der löslichen Proteine. 52 KAPITEL 4. ERGEBNISSE Abbildung 4.5: XopJ-GFP ist auch in vesikelähnlichen Aggregaten in N. benthamiana lokalisiert (Pfeil). Das XopJGFP-Fusionsprotein wurde mittels Agrobakterien-Infiltration in Blättern von N. benthamiana exprimiert und die GFPFluoreszenz 48 Stunden nach Infiltration untersucht. Die Länge des Standardbalkens entspricht 15 µm. XopJ-GFP beiden allein verantwortlich für die Lokalisierung des Effektors an der Plasmamembran in der Pflanze waren. Wenn XopJ nur durch die Myristoylierung und die Palmitoylierung modifiziert wäre, sollte die Doppelmutante lediglich im Zytosol zu finden sein. Allerdings ließ sich diese Mutante in N. benthamiana nicht exprimieren, was möglicherweise auf eine Instabilität des zweifach mutierten Proteins in vivo hindeutet. 4.2 4.2.1 Untersuchungen zum Vesikeltransport Konfokal-mikroskopische Analyse zur Inhibierung des Vesikeltransportes in N. benthamiana Durch die Kolokalisierungen des Wildtyp-Effektors mit Golgi-Vesikeln wurde vermutet, dass XopJ mit dem Vesikeltransport in Zellen interagiert (Abbildungen 4.1 b und 4.5). In ca. 38 % aller XopJ-GFP-exprimierenden Zellen konnte das Effektor-GFP-Konstrukt in vesikelähnlichen Strukturen beobachtet werden (Pfeil in Abbildung 4.5; Bartetzko et al. (2009)). In der Literatur ist beschrieben, dass der Vesikeltransport eine entscheidende Rolle bei der pflanzlichen Abwehr gegen Pathogene spielt (Kalde et al., 2007; Robatzek, 2007). Außerdem konnte in den vergangenen Jahren gezeigt werden, dass bakterielle Effektoren auf den Vesikeltransport störend einwirken und somit die Sekretion wichtiger Abwehrproteine verhindern können (Nomura et al., 2006). Um den Einfluss des Typ III-Effektors XopJ auf den Vesikeltransport in der Zelle zu untersuchen, wurde ein sekretierbares GFP-Protein (nachfolgend als secGFP bezeichnet) konstruiert, das in der Pflanze konstitutiv exprimiert und in den Apoplasten sekretiert wird (Abbildung 4.6 a; Batoko et al. (2000); Tyrrell et al. (2007)). Aufgrund seiner chemischen Beschaffenheit kann GFP im sauren Milieu des Apoplasten nicht fluoreszieren und somit ist das GFP-Signal nur detektierbar, wenn das Protein durch eine Blockierung der Sekretion im endoplasmatischen Retikulum (ER) zurückgehalten wird (Bokman und Ward, 1981; Kneen et al., 1998). XopJ-myc wurde über Agrobakterien-vermittelte Transformation zusammen mit secGFP in N. benthamiana koexprimiert. Zwei Tage nach Agrobakterien-Infiltration wurden die Blätter am KLSM analysiert. 53 4.2. UNTERSUCHUNGEN ZUM VESIKELTRANSPORT Die Koexpression von XopJ mit dem sekretierbaren GFP, das sich unter normalen Gegebenheiten im Apoplasten befand (Abbildung 4.6 a), bewirkte eine Rückhaltung des secGFPs in einem ER-ähnlichen Netzwerk (Pfeil in Abbildung 4.6 b). Brefeldin A ist ein Pilztoxin, das den Transport von Proteinen vom ER zum Golgi inhibiert (Fujiwara et al., 1988). Durch die Hemmung der Abschnürung von Vesikeln am ER hielt Brefeldin A das Reporterprotein ebenfalls in einem Netzwerk innerhalb der Zelle zurück und machte es damit sichtbar (Abbildung 4.6 f). Die dominant-negative, zytosolische Mutante des Arabidopsis thaliana-Syntaxins 121 (das so genannte Sp2Fragment) eignet sich als Positivkontrolle für die Inhibierung des Vesikeltransports. Aufgrund des Fehlens der Transmembrandomäne ist das SYP121 Sp2-Fragment löslich im Gegensatz zur membrangebundenen Wildtyp-Form. Diese Mutante wirkt kompetitiv zum in der Pflanze vorhandenen Wildtyp AtSYP121-Homolog für Tabak NtSyr1 (Geelen et al., 2002) und inhibiert die Vesikelfusion an der Plasmamembran und damit die Proteinsekretion (Abbildung 4.6 c; Leyman et al. (1999); Geelen et al. (2002); Tyrrell et al. (2007)). Die Expression der katalytischen Mutante von XopJ (XopJ C235A) hatte keine Auswirkung auf die Sekretion des Reporterproteins in den Apoplasten (Abbildung 4.6 d). a b c d e f Abbildung 4.6: Studien zur Inhibierung der Proteinsekretion in N. benthamiana durch XopJ. a: Expression von secGFP in N. benthamiana, b: secGFP koexprimiert mit XopJ-myc, c: secGFP koexprimiert mit AtSYP121∆TM-myc (Sp2-myc), d: secGFP koexprimiert mit XopJ C235A-myc, e: secGFP-infiltrierte Pflanze mit DMSO infiltriert, f: secGFP-infiltrierte Pflanze mit 10 µg/ml Brefeldin A infiltriert. Die Pfeile in b und c zeigen auf ein ER-ähnliches Netzwerk. Bei Abbildungen a, b, d, e und f handelt es sich um zusammengesetzte zStapel. Die Länge der Standardbalken entspricht jeweils 15 µm. Um zu untersuchen, ob XopJ spezifisch den Transport zur Plasmamembran inhibiert oder ob auch der Transport zum Tonoplasten beeinträchtigt wird, wurde XopJ zusammen mit dem kationischen Aminosäuretransporter 2 (CAT2) aus Arabidopsis (Su et al., 2004), der mit dem rotfluoreszierenden Protein tdTomato fusioniert war (zur Verfügung gestellt von Ulrich Hammes, Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie, Erlangen), in N. benthamiana exprimiert. Nach 48 Stunden wurden Mikroskopie-Präparate angefertigt und am KLSM analysiert. 54 KAPITEL 4. ERGEBNISSE b a Tonoplast Chloroplasten Chloroplasten Zytoplasmastreifen Tonoplast Abbildung 4.7: Konfokale Studien zur Beeinflussung des Proteintransports zur Vakuole durch XopJ. a: Expression von CAT2-tdTomato in N. benthamiana, b: CAT2-tdTomato koexprimiert mit XopJ-myc. Rot: Cat2-tdTomato, blau: Autofluoreszenz der Chloroplasten. Die Länge der Standardbalken entspricht jeweils 15 µm. Wie Abbildung 4.7 b zeigt, hatte XopJ keinen Einfluss auf den Proteintransport zur Vakuole. Die Lokalisierung des Aminosäuretransporters CAT2 blieb auch nach der Expression des Effektors XopJ unverändert im Tonoplasten. Zusammengefasst deuteten diese Daten darauf hin, dass XopJ spezifisch den Vesikeltransport zur Plasmamembran und zum Apoplasten inhibierte. 4.2.2 Biochemischer Nachweis der Inhibierung des Vesikeltransports in N. benthamiana durch XopJ Um die Daten der Mikroskopie zu stützen, wurde die Inhibierung des Vesikeltransportes zusätzlich mit Hilfe von biochemischen Methoden nachgewiesen. Dazu wurden transgene, konstitutiv secGFP-exprimierende N. benthamiana-Pflanzen hergestellt. Anschließend wurden jeweils XopJ und seine Varianten C235A und G2A über Agrobakterienvermittelte Transformation in N. benthamiana transient exprimiert. Als Positivkontrolle diente hier ebenfalls die Infiltration des Sp2-Fragments von AtSYP121 (Leyman et al., 1999; Geelen et al., 2002; Tyrrell et al., 2007). Nach zwei Tagen wurde aus den mit Agrobakterien-infiltrierten Blättern die apoplastische Flüssigkeit gewonnen. Nach Säurefällung der in der apoplastischen Flüssigkeit enthaltenen Proteine wurden Western Blots mit anti-GFP-Antikörper und anti-mycAntikörper durchgeführt. Durch Western Blot Analyse (Abbildung 4.6) konnte ebenfalls gezeigt werden, dass XopJ die Sekretion des Reporterproteins in den Apoplasten - abhängig von einer intakten katalytischen Triade (C235A) und Lokalisierung an der Plasmamembran (G2A) - verhindert. Dass dies nicht durch eine veränderte Proteinexpression ausgelöst wurde, konnte durch den Nachweis der Expression der Effektoren bei ca. 55 kDa und des Sp2-Fragmentes bei ca. 35 kDa in den Blattextrakten mit anti-myc-Antikörpern nachgewiesen werden (Abbildung 4.8). 55 4.2. UNTERSUCHUNGEN ZUM VESIKELTRANSPORT secGFP-myc XopJ-myc XopJ G2A-myc XopJ C235A-myc Sp2-myc + - + + - + + - + + - + + + - + + - + + - + + - + + < 27 kDa Effektoren-myc < 55 kDa Sp2-myc < 35 kDa anti-GFP-Antikörper anti-myc-Antikörper apoplastische Flüssigkeit Blattextrakte Abbildung 4.8: Biochemischer Nachweis der Inhibierung der Proteinsekretion in N. benthamiana. XopJ-myc, XopJ G2A-myc, XopJ C235A-myc und AtSYP121∆TM (Sp2)-myc wurden in secGFP-N. benthamiana exprimiert. Nach zwei Tagen wurde die apoplastische Flüssigkeit aus diesen Blättern isoliert. Nach Säurefällung der apoplastischen Proteine wurde auf das Vorhandensein von secGFP im Apoplasten mittels Western Blot getestet. 4.2.3 Transgene xopJ-Expression in Arabidopsis unterdrückt die basale Abwehr der Wirtszelle Die Fähigkeit von XopJ die Sekretion des Reporterproteins secGFP zu hemmen, deutete darauf hin, dass XopJ bei der Inhibierung des Vesikeltransports in der Wirtszelle beteiligt sein könnte. Ein erhöhter Vesikeltransport ist mit einer zielgerichteten Abwehr an der Infektionsstelle in Pflanzen verknüpft (Hückelhoven, 2007; Robatzek, 2007). Eine solche Abwehrantwort, die an der Zellwand stattfindet, ist die Ablagerung von Kallose in Papillen (Aist, 1976). Durch die Verstärkung der Zellwand mit Kallose kann auch die Translokation von Effektorproteinen in die Pflanzenzelle durch die Bakterien verhindert werden (Brown et al., 1995). Die Verstärkung der Zellwand kann auf der Erkennung von PAMPs (pathogen-associated molecular pattern) von virulenten und avirulenten Bakterien, wie zum Beispiel Typ III-defizienten Stämmen, die keine Effektoren mehr in die Pflanzenzelle übertragen können, beruhen. Deshalb wurde in einem Experiment analysiert, ob XopJ die Ablagerungen von Kallose unterdrücken kann und somit zur Virulenz von Xcv beiträgt. Kallose-Ablagerungen können in der Pflanze durch Anfärben mit Anilin-Blau sichtbar gemacht werden (Eschrich und Currier, 1964). Um zu untersuchen, ob XopJ eine Wirkung auf die basale Abwehr und in diesem Zusammenhang auf die Kallose-Ablagerung nach Infektion mit einem avirulenten Stamm hat, wurden transgene, EtOH-xopJ-Arabidopsis thaliana-Pflanzen (zur Verfügung gestellt von Sophia Sonnewald; Bartetzko et al. (2009)) mit einem avirulenten Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000-Stamm (Pst DC3000), der eine Mutation im hrcC-Gen trug und damit keine Effektoren mehr in die Pflanzenzelle translozieren konnte, infiziert (Roine et al., 1997; Boch et al., 2002). Da eine konstitutive 56 KAPITEL 4. ERGEBNISSE Transgene Linien Col-0 xopJ-4-3 xopJ-7-10 +Pst DC3000 ΔhrcC +Pst DC3000 ΔhrcC Abbildung 4.9: Studien zur Unterdrückung der basalen Abwehr in A. thaliana durch XopJ nach Infektion mit einem avirulenten Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 ∆hrcCStamm. 24 Stunden nach Induktion der xopJ-Expression wurden die A. thaliana-Pflanzen mit dem avirulenten Pst DC3000 ∆hrcC-Stamm infiziert. Weitere 24 Stunden später wurden die Blätter geerntet, entfärbt und die Kalloseablagerungen nach Anilin-Blau-Färbung am Fluoreszenzmikroskop detektiert. Als Kontrolle dienten sowohl induzierte als auch nicht-induzierte, aber infizierte A. thaliana Col-0-Wildtyp-Pflanzen. Expression von xopJ auf die Pflanze letal wirkt (Sophia Sonnewald, persönliche Mitteilung), wurde der Effektor unter einem Ethanol-induzierbaren Promotor exprimiert (EtOH-xopJ; Roslan et al. (2001)). 24 Stunden nach der Induktion der Pflanzen mit 1 % Ethanol wurden diese mit dem avirulenten Pst-Stamm infiziert. Die optische Dichte bei 600 nm der Bakteriensuspension betrug 0,2. Das entsprach einer Bakterienkonzentration von 108 CFU pro Milliliter. Weitere 24 Stunden nach Infiltration wurden die Blätter geerntet, entfärbt und schließlich mit 0,005 % Anilin-Blau-Lösung angefärbt. Die Anzahl der Kallose-Ablagerungen pro Ausschnitt wurde unter dem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. Um das Experiment statistisch auswerten zu können, wurden mindestens drei verschiedene Bildausschnitte analysiert. Als Kontrolle dienten einerseits Wildtyp-Pflanzen und andererseits nicht-induzierte, aber infizierte transgene Pflanzen. Nach Infektion mit Pst DC3000 ∆hrcC zeigten A. thaliana Col-0-Pflanzen die charakteristische Ablagerung von Kallose (Abbildung 4.9). Die beiden transgenen A. thaliana-Linien 4-3 und 7-10 dagegen ließen eine verminderte Kalloseeinlagerung nach Infektion mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 ∆hrcC erkennen. Dieser Effekt war abhängig von der Induktion der Pflanzen und damit von der Expression von xopJ. Die Behandlung mit Ethanol hingegen zeigte keine Wirkung auf die Ablagerung von Kallose. 57 4.2. UNTERSUCHUNGEN ZUM VESIKELTRANSPORT Col-0 EtOH flg22 '####'#####'###'####'#####'###+###+###+#######+####+####+# '####'#####'###+###+####+###'####'####'#######+####+####+# 0#####15####30###0####15####30#####0###15###30###########0#####15####30# 55#kD#># min anti-phosphop44/42-MAPK 35#kD#># 55#kD#># anti-AtMPK6 35#kD#># EtOH-xopJ 7-10 EtOH flg22 '####'####'####'####'####'#####+####+###+####+####+###+# '####'####'####+###+###+#####'#####'####'####+####+###+# 0####15###30#####0#####15###30#######0#####15####30####0#####15####30# 55#kD#># 35#kD#># min anti-phosphop44/42-MAPK 55#kD#># anti-AtMPK6 35#kD#># 4.2.4 Abbildung 4.10: XopJ inhibiert nicht die MAPK-Kaskade während der PAMP-Erkennung in A. thaliana. Die Expression von xopJ in den transgenen A. thaliana-Keimlingen (Linie 7-10) wurde durch Zugabe von 0,1 % Ethanol initiiert. Anschließend wurde die Signaltransduktion der basalen Abwehr in A. thaliana-Keimlingen mit flg22 ausgelöst. Zusätzlich wurden auch Wildtyp-ArabidopsisPflanzen sowohl mit Ethanol behandelt als auch mit flg22 induziert. Nach jeweils 0, 15 und 30 Minuten wurden die Keimlinge geerntet. Anschließend wurden Western Blots mit anti-phosphop44/42-MAPK-Antikörper und zur Expressionskontrolle mit antiMPK6-Antikörper durchgeführt. Signaltransduktionsanalysen während der basalen Abwehr in Arabidopsis thaliana Die bisherigen Daten deuteten darauf hin, dass XopJ die basale Abwehr der Pflanze unterdrückt, wobei unklar ist, an welchem zellulären Prozess XopJ angreift. Grundsätzlich ist vorstellbar, dass die PAMP-Signaltransduktion inhibiert wird und dadurch die Induktion der Abwehr unterdrückt wird. Eine weitere Möglichkeit wäre die Wirkung von XopJ auf einen späteren Schritt, z.B. direkt auf Komponenten des Vesikeltransports. Um zu überprüfen, ob XopJ die Signaltransduktion nach Erkennung des Pathogens und damit bereits die Transkription wichtiger PR-Gene blockiert, wurden jeweils fünf bis sechs Wildtypbzw. transgene EtOH-xopJ-A. thaliana-Keimlinge, die zwei Wochen alt und auf MS-Selektionsmedium gewachsen waren, geerntet, in flüssiges MS-Medium umgesetzt und die xopJ-Expression mit 0,1 % Ethanol induziert. Da die MAP Kinase-Kaskade der basalen Abwehr mit dem PAMP flg22, einem Peptid aus 22 Aminosäuren, welches ein Hauptbestandteil von bakteriellen Flagellen darstellt, aktiviert wird (Asai et al., 2002), wurden die Keimlinge 24 Stunden nach Ethanol-Induktion mit 1 µM flg22 behandelt (Felix et al., 1999). Die Keimlinge wurden 0, 15 bzw. 30 Minuten nach flg22-Behandlung in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Anschließend wurden die Pflanzen fein pulverisiert und je 30 µg Gesamtproteinextrakt auf ein 10 %iges Lämmli-Gel aufgetragen. Danach wurde ein Western Blot mit anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)-Antikörper durchgeführt, der den Phosphorylierungsstatus der MAP Kinasen anzeigt, indem er spezifisch die phosphorylierte 58 KAPITEL 4. ERGEBNISSE 7-1 0n ich t 7-1 ol-0 erk ont rol le WT C rt Wa ss ind uzi e 0 in duz ie 7-1 0n ich t 7-1 ol-0 WT C Abbildung 4.11: Expressionsnachweis von xopJ in transgenen Ethanolinduzierten A. thaliana. Durch Zugabe von 0,1 % Ethanol wurde die Expression von xopJ induziert. Als Negativkontrollen dienten sowohl transgene, nicht-induzierte Keimlinge als auch Wildtyp-A. thaliana. Das Ubiquitinbandenmuster zeigte die Qualität der cDNA. ind uzi ert 0 in duz iert Wa sse rko ntr olle Ubiquitin rt xopJ 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp und damit aktivierte Form der MAP Kinase erkennt. Als Positivkontrolle für die Expression der MAP Kinasen diente der anti-MPK6-Antikörper. Obwohl XopJ Einfluss auf die Kallose-Ablagerungen in A. thaliana hatte (Abbildung 4.9), zeigte der Effektor keine Inhibierung der Phosphorylierung der MAP Kinasen nach Auslösen der basalen Abwehr mit dem PAMP flg22 (Abbildung 4.10). Da auch Wildtyp Col-0-Pflanzen, die mit Ethanol behandelt wurden, sowohl phosphorylierte MAP Kinasen als auch eine intakte MPK6 aufwiesen, konnte eine Beeinflussung der basalen Abwehr durch die Zugabe von Ethanol ausgeschlossen werden. Die Expression von xopJ nach Induktion in der transgenen Linie 7-10 wurde durch RTPCR mit genspezifischen Primern nachgewiesen (Abbildung 4.11). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass eine Inhibierung der MAP Kinase-Signalkaskade durch XopJ nicht stattfindet. 4.2.5 Beeinflussung des Vesikeltransportes von XopJ-verwandten Effektoren aus Pseudomonas syringae Die Mitglieder der YopJ-Familie der Typ III-Effektoren sind sowohl in Pflanzen- als auch in Tierpathogenen weit verbreitet. Unter den Pflanzenpathogenen sind hauptsächlich Effektoren aus Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Erwinia sp. und Pseudomonas syringae zu nennen (Ma et al., 2006). Ein besonders intensiv untersuchter Effektor dieser Familie ist HopZ1a aus Pseudomonas syringae (Macho et al., 2010; Lewis et al., 2010; Lee et al., 2012). Obwohl XopJ und HopZ1a aus verschiedenen Bakterien stammen, sind sie phylogenetisch eng verwandt (siehe rote Kästen in Abbildung 4.12). Genauso wie XopJ besitzt HopZ1a ein Glycin an Position 2 der Aminosäuresequenz und muss sowohl für die Virulenz- als auch für die Avirulenzfunktion myristoyliert werden (Lewis et al., 2008). Aufgrund dieser Ähnlichkeiten zwischen XopJ und HopZ1a wurde getestet, 4.2. UNTERSUCHUNGEN ZUM VESIKELTRANSPORT 59 Abbildung 4.12: Phylogenetischer Baum der Typ III-Effektoren der YopJ-Familie. XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ist auf Aminosäuresequenzebene phylogenetisch eng verwandt mit HopZ1a aus Pseudomonas syringae. Bei dieser Abbildung handelt es sich um einen phylogenetischen Baum, der mit dem Neighbour-Joining-Algorithmus berechnet wurde. BootstrapWerte über 60 % sind angegeben. Die Accession-Nummer des jeweiligen Proteins ist in Klammern angeführt. Abbildung verändert nach Ma et al. (2006). ob auch HopZ1a die Sekretion von Proteinen aus der Pflanzenzelle inhibieren kann. Dazu wurden HopZ1a, die katalytische Mutante HopZ1a C216A und die Myristoylierungsmutante HopZ1a G2A jeweils am C-Terminus mit myc markiert und über Agrobakterien-vermittelte Transformation in transgenen secGFP-N. benthamiana-Pflanzen exprimiert. Da HopZ1a eine hypersensitive Reaktion (HR) in Tabak auslöst (Lewis et al., 2008), wurde die apoplastische Flüssigkeit bereits nach 24 Stunden isoliert. Die apoplastische Flüssigkeit wurde durch TCA-Säurefällung konzentriert und auf ein BisTris-Gel aufgetragen. Anschließend wurde ein Western Blot mit anti-GFP-Antikörper durchgeführt. Um die Expression der Effektoren nachzuweisen, wurde die Membran gestrippt und mit anti-myc-Antikörper dekoriert. Nach transienter Expression von HopZ1a und Sp2 in transgenen secGFP-Pflanzen zeigte sich eine Abschwächung des GFP-Signals in der apoplastischen Flüssigkeit. Anders als bei XopJ zeigte auch die Expression von HopZ1a G2A ein reduziertes secGFP-Signal in der apoplastischen Flüssigkeit. Nach Expression von HopZ1a C216A jedoch war das secGFP-Signal im Apoplasten so stark wie bei einer nicht infiltrierten transgenen secGFP-N. benthamiana-Pflanze (Abbildung 4.13). Um zu zeigen, dass die entsprechenden Effektor-Proteine exprimiert wurden, wurden auch GesamtBlattextrakte auf dem Western Blot mit anti-myc-Antikörpern analysiert (Abbildung 4.13 unterer Western Blot). Die Größe der Effektoren HopZ1a und seiner Mutanten als myc-Fusion lag bei ca. 50 kDa und die Größe von Sp2 bei ca. 36 kDa. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass HopZ1a, ähnlich wie XopJ, die Sekretion in Pflanzen inhibieren kann und damit Antworten der basalen Abwehr unterdrückt. 60 KAPITEL 4. ERGEBNISSE secGFP-myc HopZ1a-myc HopZ1a C216A-myc HopZ1a G2A-myc Sp2-myc + - + + - + + - + + - + + + - + + - + + - + + - + + < 28 kDa anti-GFP-Antikörper < 55 kDa anti-myc-Antikörper apoplastische Flüssigkeit Blattextrakte Abbildung 4.13: Auswirkung der HopZ1a-Expression auf die Proteinsekretion in N. benthamiana. HopZ1a, HopZ1a C216A, HopZ1a G2A und Sp2 wurden jeweils mit myc-tag in secGFP-exprimierenden N. benthamiana exprimiert. Die apoplastische Flüssigkeit aus diesen Blättern wurde isoliert und mittels Western Blot mit anti-GFP- und anti-myc-Antikörper analysiert. 4.3 4.3.1 Identifizierung von Interaktionspartnern des Effektors XopJ Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung zur Identifizierung von Interaktionspartnern Um einen Einblick in die Wirkweise von bakteriellen Effektoren zu bekommen, ist es essentiell, Interaktionspartner und damit mögliche Zielproteine dieser Effektoren aus der Pflanze zu ermitteln. Zur Identifizierung von XopJ-Interaktionspartnern wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System gewählt (Fields und Song, 1989). Zunächst wurde XopJ G2A in den offenen Leserahmen mit der Gal4-Bindungsdomäne (BD) des Vektors pGBT9 kloniert. Dieses Köder-Plasmid wurde zur Durchmusterung einer mit der Gal4Aktivierungsdomäne (AD) fusionierten cDNA-Bank aus Tabak und Arabidopsis verwendet. Dazu wurde das Köder-Plasmid in den Hefe-Stamm Y187 (Mat α) transformiert. Im Zuge der HefeZwei-Hybrid-Durchmusterung wurden diese dann mit dem Hefe-Stamm AH109 (Mat a), der die Genbanken enthielt, verpaart. Die Paarungseffizienz wurde durch eine Verdünnungsreihe der diploiden Hefen auf SCAD-leutrp-Platten bestimmt. Aus ungefähr 27,3 × 106 durchmusterten Hefe-Transformanden der Arabidopsis-Genbank CD4-30 und 21,9 × 106 durchmusterten Transformanden der Tabakbank wurden zwei bzw. 32 positive Klone identifiziert, die sowohl HIS3- als auch LacZ-positiv waren (Tabelle 4.1). Daraufhin wurden von allen positiven Hefeklonen beide Plasmide isoliert, in den E. coli KC8Stamm transformiert und die Transformanden über entsprechendes Selektionsmedium getrennt. Aus den Zellen, die das Beute-Plasmid enthielten, wurde die Plasmid-DNA isoliert und das Insert sequenziert. 61 4.3. IDENTIFIZIERUNG VON INTERAKTIONSPARTNERN DES EFFEKTORS XOPJ Klone Blastx-Treffer Accession E-Wert 1 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 2 vorhergesagtes Homolog der 26S-Protease regulatorischen Untereinheit 8 A [Vitis vinifera] XP_002285273.1 0,0 3 Insulin abbauendes Enzym [Solanum lycopersicum] NP_001233926.1 0,0 4 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 5 vorhergesagtes, mutmaßliches Arginin-N-Methyltransferase 1-ähnliches Protein [Glycine max] XP_003529075.1 0,0 6 vorhergesagtes, mutmaßliches Arginin-N-Methyltransferase 1-ähnliches Protein [Glycine max] XP_003529075.1 0,0 7 konserviertes hypothetisches Protein [Ricinus communis] XP_002530267.1 6 e−58 8 vorhergesagtes, mutmaßliches Arginin-N-Methyltransferase 1-ähnliches Protein [Glycine max] XP_003529075.1 0,0 9 vorhergesagtes, mutmaßliches Arginin-N-Methyltransferase 1-ähnliches Protein [Glycine max] XP_003529075.1 0,0 −174 10 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 8e 11 Insulin abbauendes Enzym [Solanum lycopersicum] NP_001233926.1 2 e−156 12 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 14 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 15 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 16 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 17 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 18 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 19 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 20 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 21 vorhergesagtes, mutmaßliches Arginin-N-Methyltransferase 1-ähnliches Protein [Glycine max] XP_003529075.1 0,0 22 vorhergesagtes Homolog der 26S-Protease regulatorischen Untereinheit 8 A [Vitis vinifera] XP_002284747.1 0,0 23 Insulin abbauendes Enzym [Solanum lycopersicum] NP_001233926.1 0,0 24 vorhergesagtes Homolog der 26S-Protease regulatorischen Untereinheit 8 A [Vitis vinifera] XP_002284747.1 0,0 25 vorhergesagtes Homolog der 26S-Protease regulatorischen Untereinheit 8 A [Vitis vinifera] XP_002284747.1 0,0 26 vorhergesagtes, mutmaßliches Arginin-N-Methyltransferase 1-ähnliches Protein XP_003578015.1 1 e−79 6 e−156 [Brachypodium distachyon] 28 vorhergesagtes Homolog der 26S-Protease regulatorischen Untereinheit 8 A [Vitis vinifera] XP_002284747.1 29 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 −103 30 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 5e 31 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 9 e−166 32 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 0,0 −122 33 vorhergesagtes Arginin-N-Methyltransferase 1.1-ähnliches Protein [Vitis vinifera] XP_002282760.1 35 vorhergesagtes Homolog der 26S-Protease regulatorischen Untereinheit 8 A [Vitis vinifera] XP_002284747.1 1e 0,0 Tabelle 4.1: Beste blastx-Treffer der durch eine Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung identifizierten möglichen Interaktionspartner von XopJ. Potentielle Klone, die die Interaktionspartner enthielten, konnten nach der Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung von SCAD-leu-trp-his-Platten mit 4 mM 3-Aminotriazol gepickt und mittels LacZ-Filter-Test auf Interaktion überprüft werden. Nach Isolierung des Beute-Plasmids und Sequenzierung konnten die Interaktionspartner mit Hilfe des Programms blastx identifiziert werden. 62 KAPITEL 4. ERGEBNISSE -LT pBD-SV40 + pAD-p53 pBD-XopJ G2A + pADGal4 pBD-XopJ G2A + pAD-RPT6 pBD-XopJ G2A + pAD-XIP1 pGBT9 + pAD-RPT6 -HLT LacZ -LT -HLT LacZ pGBT9 + pAD-XIP1 pBD-XopJ G2A + pAD-ArgininMethyltransferase 1b pBD-XopJ G2A + pAD-Insulinase pGBT9 + pAD-ArgininMethyltransferase 1b pGBT9 + pAD-Insulinase Abbildung 4.14: Test auf direkte Interaktion von potentiellen Interaktionspartnern mit XopJ G2A. pBD-XopJ G2A und jeweils ein bei der Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung gefundener, repräsentativer Interaktionspartner wurden in den Hefe-Stamm Y190 transformiert. Die Kotransformanden wurden auf geeignetes Selektivmedium gestempelt. Nach zwei bis drei Tagen Wachstum bei 30 °C wurde ein LacZ-Filter-Test durchgeführt. Positivkontrolle: SV40 (Simian-40-Virus) und p53, ein Tumorsuppressor aus Homo sapiens (Lane und Crawford, 1979). Negativkontrollen: Leervektoren pGBT9 mit den jeweiligen gefundenen Interaktionspartnern bzw. pADGal4 mit XopJ G2A, XIP1: XopJ-Interaktionspartner 1 (ein Protein mit unbekannter Funktion). Mit den erhaltenen Sequenzen wurde ein blastx (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov; Altschul et al. (1997)) durchgeführt. Die Ergebnisse der gefundenen möglichen Interaktionspartner aus der Tabakbank sind in Tabelle 4.1 aufgelistet. Bei beiden gefundenen XopJ-Interaktionspartnern aus der Arabidopsis-Genbank handelte es sich jeweils um RPT6, welches auch sechsmal in der Tabakbank gefunden werden konnte. RPT6 ist eine Komponente der 19 S-Untereinheit des 26 S-Proteasoms in Eukaryoten. Des Weiteren konnten Klone aus der Tabakbank identifiziert werden, welche Ähnlichkeiten zu Arginin-Methyltransferasen, einem Protein mit bisher unbekannter Funktion (XIP1 genannt) bzw. zu Insulinasen zeigten. Nach der Identifizierung der Interaktionspartner wurden diese auf die Spezifität der Interaktion mit XopJ überprüft. Dazu wurden XopJ G2A und jeweils ein repräsentatives Beispiel der im pAD enthaltenen Inserts der möglichen Interaktionspartner in den Hefe-Stamm Y190 kotransformiert. Als Kontrolle dienten die jeweiligen Leervektoren mit den identifizierten Interaktionspartnern bzw. XopJ G2A mit dem leeren pAD. Abbildung 4.14 zeigt die direkten Interaktionen von XopJ G2A und eines jeweils repräsentativen Beispiels der bei der Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung gefundenen möglichen Interaktionspartner. Blaue Farbe beim LacZ-Filter-Test und fehlendes Wachstum auf SCAD-trp-leu-his +25 mM 3-AT deutete auf eine Interaktion hin. XopJ interagierte in Hefe mit den gefundenen Proteinen XIP1 (At5g64180), Arginin-Methyltransferase 1b (At4g29510), Insulinase (At2g41790) und RPT6. Die Blaufärbung der Kolonien beim LacZ-Test, die die Interaktion von RPT6 mit XopJ G2A zeigte, schien allerdings deutlich schwächer zu sein als mit den anderen gefundenen Interak- 63 4.3. IDENTIFIZIERUNG VON INTERAKTIONSPARTNERN DES EFFEKTORS XOPJ % Identität Percent Identity 1 % Abweichung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 Human2 91.9 91.9 91.9 80.2 80.2 80.2 81.2 81.5 74.1 2 Drosophila 100.0 100.0 80.5 81.0 80.5 81.5 81.5 73.9 3 Human1 100.0 80.5 81.0 80.5 81.5 81.5 73.9 4 Maus 80.5 81.0 80.5 81.5 81.5 73.9 5 Ratte 91.7 90.1 91.3 90.6 68.9 6 Reis 96.7 93.1 91.9 70.4 7 RPT6a 91.2 90.5 69.9 8 RPT6b 97.6 71.0 9 Tabak 55.6 10 Tomate_133958F 11 YRPT6 2 6.8 3 0.0 8.4 4 0.0 8.4 0.0 5 0.0 8.4 0.0 0.0 6 21.1 23.0 22.6 22.6 22.6 7 20.1 23.0 21.9 21.9 21.9 7.5 8 20.4 23.0 22.6 22.6 22.6 9.4 3.4 9 19.1 21.7 21.3 21.3 21.3 7.6 6.8 8.9 10 19.1 21.3 21.3 21.3 21.3 8.4 8.1 9.7 11 28.5 30.2 30.7 30.7 30.7 34.9 33.7 34.5 33.4 33.7 1 11 93.5 100.0 100.0 100.0 81.7 82.4 82.2 83.2 83.2 75.4 2 3 4 5 6 7 8 2.4 9 10 11 Abbildung 4.15: Sequenzvergleich zur Bestimmung der Übereinstimmung der Aminosäuresequenz von RPT6 aus verschiedenen Organismen. Der Sequenzvergleich wurde mit dem Programm MegAlign von „DNAStar Lasergene“ durchgeführt. Human2: Homo sapiens 26 S-Protease regulatorische Untereinheit (UE) 8 Isoform 2 (NCBI: NP_001186092.1), Drosophila: Drosophila melanogaster Pros45 (NCBI: NP_608447.1), Human1: Homo sapiens 26 S-Protease regulatorische UE 8 Isoform 1 (NCBI: NP_002796.4), Maus: Mus musculus 26 S-Protease regulatorische UE 8 (NCBI: NP_032976.1), Ratte: Rattus norvegicus 26 S-Protease regulatorische UE 8 (NCBI: NP_112411.1), Reis: Oryza sativa Japonica cv. Nipponbare OsRPT6 26 S regulatorische Komponente triple A-ATPase-UE 6 (GenBank: AB033537), RPT6a: Arabidopsis thaliana 26 S-Proteasom AAA-ATPase-UE (TAIR: At5g19990), RPT6b: Arabidopsis thaliana AAA-Typ ATPase-Familie (TAIR: At5g20000), Tabak: nach Durchmusterung erhaltene Sequenz (2-pAD) auf Expasy (http://web.expasy.org/translate/) übersetzt, Tomate_133958F: Lycopersicon esculentum clone 133958F mRNA (GenBank: BT014543), YRPT6: Saccharomyces cerevisiae S288c (NCBI: NP_011467.1). tionspartnern. Da RPT6 als XopJ-Interaktionspartner sowohl in Arabidopsis als auch in Tabak identifiziert werden konnte, wurde es für eine detaillierte Charakterisierung ausgewählt. In einem Sequenzvergleich konnte gezeigt werden, dass das RPT6-Protein in verschiedenen Organismen hoch konserviert ist (Abbildung 4.15). So ergab sich eine Sequenzähnlichkeit von 55,6 % zwischen Tomate und Hefe und bis zu 100 % zwischen Mensch und Maus bzw. Mensch und Ratte. In Arabidopsis existieren zwei Isoformen von RPT6, die in direkter Nachbarschaft auf Chromosom 5 angeordnet sind (At5g19990 und At5g20000) und eine Sequenzidentität auf Aminosäureebene von 96,7 % besitzen (Abbildung 4.15). Bei diesen Isoformen handelt es sich um RPT6a und RPT6b, wobei bei der Durchmusterung der Genbanken lediglich RPT6a gefunden wurde. Nach der Sequenzierung des Klons Nummer 2 (2-pAD) aus der Tabakbank-Durchmusterung wurde eine zusammenhängende Gensequenz des Tabak-RPT6 (NtRPT6) erstellt. Das Tabakprotein war zwischen 91,2 und 93,1 % identisch mit den Arabidopsis-Isoformen. Zwischen Tabak- und TomatenRPT6 ergab sich eine Ähnlichkeit von 97,6 %. Die Sequenzen von Hefe-RPT6 und Tabak-RPT6 waren allerdings nur bis zu 71 % identisch (Abbildung 4.15). Um die Interaktionen zwischen 64 KAPITEL 4. ERGEBNISSE -LT pBD-SV40 + pAD-p53 pBD-XopJ G2A + pAD-NtRPT6 pBD-XopJ G2A C235A + pAD-NtRPT6 pBD-XopJ G2A + pAD-AtRPT6a pBD-XopJ G2A C235A + pAD-AtRPT6a pBD-XopJ G2A + pAD-AtRPT6b pBD-XopJ G2A C235A + pAD-AtRPT6b pBD-XopJ G2A + pAD-ScRPT6 -LTH LacZ Abbildung 4.16: Untersuchungen zur direkten Interaktion zwischen XopJ G2A und XopJ G2A C235A mit AtRPT6a, AtRPT6b, NtRPT6 und ScRPT6. XopJ G2A-pGBT9 bzw. XopJ G2A C235A-pGBT9 wurden zusammen mit dem jeweiligen RPT6 in den Hefe-Stamm Y190 transformiert und Kolonien, die auf SCAD-trpleu gewachsen waren auf SCAD-trpleu + 3-AT mit und ohne GenescreenMembran überstrichen. Anschließend wurde ein LacZ-Filter-Test durchgeführt. Als Positivkontrolle dienten das große T-Antigen aus SV40 (Simian-40Virus) und p53, ein Tumorsuppressor aus Homo sapiens (Lane und Crawford, 1979). At: Arabidopsis thaliana, Nt: Nicotiana tabacum, Sc: Saccharomyces cerevisiae. XopJ mit AtRPT6a, AtRPT6b und NtRPT6 zu testen, wurden direkte Interaktionstests im HefeStamm Y190 durchgeführt (Abbildung 4.16). Der Test auf direkte Interaktion zeigte, dass XopJ sowohl mit RPT6a und RPT6b aus A. thaliana als auch mit RPT6 aus Nicotiana tabacum interagieren konnte solange die katalytische Triade des Effektorproteins intakt war. Allerdings war XopJ nicht in der Lage mit dem RPT6-Protein aus Saccharomyces cerevisiae zu interagieren (Abbildung 4.16). 4.3.2 Lokalisierung von RPT6 in N. benthamiana Die Voraussetzung für eine Interaktion von RPT6 mit XopJ in planta ist eine zumindest überlappende Lokalisierung beider Proteine in der Zelle. Die SUBA-Datenbank (http://suba.plantenergy. uwa.edu.au; abgerufen im November 2010; Heazlewood et al. (2005, 2007)) zur Vorhersage der subzellulären Lokalisierung von Proteinen aus Arabidopsis sagt die Lokalisierung von RPT6 im Zytosol und im Zellkern voraus. Des Weiteren konnten ebenfalls Annotationen von MS/MSErgebnissen gefunden werden, die auch auf eine mögliche Plasmamembranlokalisation hindeuteten. Um die Lokalisierung von RPT6 in der Pflanze zu untersuchen, wurden N- und C-terminale GFP-Fusionskonstrukte von RPT6 hergestellt und mit XopJ-mCherry kolokalisiert. Nach Agrobakterien-vermittelter transienter Transformation von N. benthamiana, wurden die Blätter am KLSM analysiert. Die Verteilung des Fluoreszenzsignals von GFP-RPT6 deutete auf eine Lokalisierung des Fusionsproteins im Zytosol der Pflanzenzelle hin (Abbildung 4.17 a), wohingegen die subzelluläre GFP-RPT6+ 4.3. IDENTIFIZIERUNG VON INTERAKTIONSPARTNERN DES EFFEKTORS XOPJ XopJmCherry GFP mCherry Autofluoreszenz 65 Überlagerung a b Abbildung 4.17: Kolokalisierung von RPT6 und XopJ in N. benthamiana. Die Lokalisierung RPT6von RPT6 hängt von der Position der GFP-Fusion an RPT6 ab. a: N-terminale GFP-Fusion von GFP+XopJ -mCherry RPT6 und XopJ-mCherry, b: C-terminale GFP-Fusion von RPT6 und XopJ-mCherry. Grün: GFPRPT6 bzw. RPT6-GFP, rot: XopJ-mCherry, blau: Autofluoreszenz der Chloroplasten. Die Länge der Standardbalken entspricht jeweils 15 µm. Verteilung von RPT6-GFP eher auf eine Plasmamembranlokalisation hinwies (Abbildung 4.17 b). Aufgrund der Lokalisierung von RPT6 in Pflanzenzellen ist eine Interaktion zwischen dem Effektorprotein XopJ und der Proteasomuntereinheit RPT6 möglich. Eine weitere Möglichkeit ein Protein in der Pflanzenzelle zur Membran- oder zur löslichen Fraktion näher zuzuordnen, ist die Durchführung einer subzellulären Fraktionierung (siehe auch Abschnitt 4.1.2). Um zu untersuchen, ob die Expression von XopJ in der Pflanze die Lokalisierung von RPT6 verändert, wurde RPT6-myc-his-Strep alleine und zusammen mit XopJ-GFP in N. benthamiana exprimiert. Anschließende Aufarbeitung des Blattmaterials durch differentielle Zentrifugationsschritte ermöglichten eine Trennung von Membranen und Zytosol. Die Proben wurden auf Western Blots analysiert. Um die Lokalisierung von RPT6 zu überprüfen, wurde ein anti-myc-Antikörper verwendet. Die Lokalisierung von XopJ geschah mittels GFP-Antikörper. Die korrekte Trennung der Membran- und löslichen Fraktion konnte durch den Einsatz entsprechender Antikörper für lösliche Proteine (anti-NtSPP2-Antikörper) oder Membranproteine (anti-H+ -ATPase) sichergestellt werden. Abbildung 4.18 zeigt die Lokalisierung von RPT6 in der Membranfraktion und zwar unabhängig davon, ob XopJ koexprimiert wurde. XopJ konnte ebenfalls in der Membranfraktion detektiert werden (Abschnitt 4.1.2). 4.3.3 Nachweis der Interaktion zwischen XopJ und RPT6 in Pflanzenzellen Um die Interaktion zwischen RPT6 und XopJ in Pflanzenzellen zu visualisieren, wurden Bimolekulare Fluoreszenzkomplementations (BiFC)-Analysen durchgeführt (Walter et al., 2004). Dazu 66 KAPITEL 4. ERGEBNISSE RPT6-Strep-myc RPT6-Strep-myc + XopJ-GFP G M L G M L 70 kDa > 55 kDa > 100 kDa > 70 kDa > 55 kDa > 250 kDa > 100 kDa > anti-myc anti-GFP anti-NtSPP2 anti-H+-ATPase Abbildung 4.18: Subzelluläre Fraktionierung von RPT6-myc-his-Strep mit und ohne XopJGFP in N. benthamiana. Die Membran- und lösliche Fraktion wurde mit Hilfe von differentiellen Zentrifugationsschritten getrennt. Die erhaltenen Fraktionen wurden auf ein Proteingel aufgetragen und Western Blots mit verschiedenen Antikörpern durchgeführt. RPT6 wurde mit Hilfe des anti-myc-Antikörpers detektiert und die Detektion von XopJ erfolgte mit dem anti-GFPAntikörper. Als Kontrollen für die korrekte Trennung von Membran- und löslicher Fraktion wurden anti-H+ -ATPase-Antikörper bzw. anti-NtSPP2-Antikörper eingesetzt. G: Gesamtproteine, M: Membranfraktion, L: Fraktion der löslichen Proteine. wurden die C-terminalen 84 Aminosäuren von YFP an den C-Terminus von XopJ fusioniert und die N-terminalen 155 YFP-Aminosäuren an den C-Terminus von RPT6 und umgekehrt. Wenn die beiden Proteine interagieren, kommen auch die beiden YFP-Hälften in räumliche Nähe zueinander, so dass daraus ein gelb-fluoreszierendes Protein (YFP) resultiert. Sowohl XopJ-YFPn und RPT6-YFPc als auch XopJ-YFPc und RPT6-YFPn wurden in Tabakblattscheiben (Nicotiana tabacum) nach Partikelbeschuss exprimiert. Einen Tag nach Beschuss wurden Mikroskopie-Präparate angefertigt und mit dem KLSM analysiert (Abbildung 4.19). Die Untersuchungen deuteten darauf hin, dass die Interaktion zwischen XopJ und RPT6 in Pflanzenzellen an der Plasmamembran stattfand (Abbildung 4.19 a bis c). Die Plasmamembranlokalisation war an der Verteilung der Chloroplasten (rot) zur YFP-Fluoreszenz, die die Interaktion von XopJ und RPT6 anzeigte, zu erkennen. Abbildung 4.19 b zeigte keine umschlossenen Chloroplasten, was darauf hindeutete, dass die Interaktion nicht im Zytosol erfolgte (vergleiche Abbildung 4.19 g). Die Interaktion von XopJ C235A mit RPT6 ereignete sich ebenfalls an der Plasmamembran (Abbildung 4.19 d und e). Da in Abbildung 4.1 gezeigt werden konnte, dass die Myristoylierungsmutante XopJ G2A teilweise im Zytosol lokalisiert war, fand auch die Interaktion von XopJ G2A mit RPT6 im Zytoplasma statt (Abbildung 4.19 f und g). Hier zeigte sich die YFPFluoreszenz geschlossen um den Chloroplasten (rot) herum (Abbildung 4.19 g). Für die Interaktionsstudien der XopJ-Varianten mit RPT6 wurde jeweils der Effektor mit YFPc und RPT6 mit YFPn fusioniert. Die Multimerisierung der zytosolischen Fruktose-1,6-bisphosphatase (FBPase; 67 4.3. IDENTIFIZIERUNG VON INTERAKTIONSPARTNERN DES EFFEKTORS XOPJ a b c d e f g h 2,75 µm i 2,9 µm j 50,2 µm 50,2 µm Abbildung 4.19: In planta-Studien zur direkten Interaktion von XopJ mit RPT6. a bis c: Interaktion von XopJ mit RPT6 in N. tabacum-Blättern, d und e: Interaktion von RPT6 mit der katalytischen Mutante XopJ C235A, f und g: Interaktion zwischen XopJ G2A und RPT6, h: Kontrolle für die Interaktion: FBPase (Fruktose-1,6-bisphosphatase), die im Zytosol multimerisiert, i und j: Als Negativkontrollen wurde die FBPase jeweils mit RPT6 auf die Blätter geschossen. a und b: RPT6-YFPc und XopJ-YFPn, c: RPT6-YFPn und XopJ-YFPc, d: RPT6-YFPn und XopJ C235A-YFPc, e: Vergrößerung aus d, f: RPT6-YFPn und XopJ G2A-YFPc, g: Vergrößerung aus f, h: FBPase-YFPc und FBPase-YFPn, i: FBPase-YFPc und RPT6-YFPn, j: FBPase-YFPn und RPT6-YFPc. Gelb: Interaktion der beiden YFP-Hälften und somit der Interaktionspartner XopJ und RPT6, rot: Autofluoreszenz der Chloroplasten. Die Abbildungen a bis h wurden mit 63-facher Vergrößerung und die Bilder i und j mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Die Länge der Standardbalken entspricht soweit nicht anders angegeben - jeweils 15 µm. Abbildung 4.19 h) stellte die Positivkontrolle dar. Die fehlende Interaktion von der FBPase mit RPT6 fusioniert mit jeweils dem N- oder C-Terminus von YFP diente als Negativkontrolle (Abbildung 4.19 i und j). Die Koimmunpräzipitation ist eine weitere Möglichkeit die Interaktion zweier Proteine in Pflanzen direkt nachzuweisen. Dazu wurde RPT6-GFP zusammen mit XopJ-myc in N. benthamiana mittels Agrobakterien-Infiltration transient exprimiert. Nach 48 Stunden wurden die Blätter geerntet, aufgeschlossen und RPT6 wurde über seine GFP-Markierung aufgereinigt. Dabei wurde das mit RPT6 interagierende XopJ mit eluiert. Anschließend wurden mit den Pflanzenextrakten und den Eluaten Western Blots mit anti-GFP- und anti-myc-Antikörpern durchgeführt. 68 KAPITEL 4. ERGEBNISSE Ausgangsmaterial lösliches GFP RPT6-GFP XopJ-myc 70 kDa > + ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ + Gereinigte Proteine ‐ + + ‐ ‐ ‐ ‐ + ‐ + ‐ ‐ + + + RPT6-GFP 55 kDa > anti-GFP-Antikörper 25 kDa > GFP 70 kDa > 55 kDa > XopJ-myc anti-myc-Antikörper Abbildung 4.20: Koimmunpräzipitation von XopJ mit RPT6 aus N. benthamiana. Die Proteine XopJ-myc und RPT6-GFP wurden in N. benthamiana-Blättern koexprimiert. Nach der Ernte wurden die Blattzellen aufgeschlossen und RPT6-GFP wurde über magnetische Partikel, an die spezielle Antikörper gegen GFP gekoppelt waren, aufgereinigt. Sowohl die Pflanzenrohextrakte als auch die Eluate wurden auf Western Blots mit anti-GFP- und anti-myc-Antikörpern analysiert. Als Positivkontrolle für die Aufreinigung wurde freies GFP eingesetzt. Um zu untersuchen, ob die Aufreinigung spezifisch für GFP-markierte Proteine war, wurde auch XopJ-myc alleine aufgereinigt. Die Blots mit Ausgangsmaterial und gereinigten Proteinen wurden unterschiedlich lange belichtet. Deshalb konnte keine Aussage über die quantitative Verteilung der Proteine getroffen werden. Die Analysen zeigten, dass XopJ-myc durch RPT6-GFP kopräzipitiert wurde, was auf eine Interaktion der beiden Proteine in planta hindeutete. XopJ-myc schien selbst schon eine schwache Affinität zur GFP-Matrix zu besitzen. Allerdings war das daraus resultierende Signal deutlich schwächer als bei der Kopräzipitation mit RPT6-GFP (Abbildung 4.20). 4.4 Analysen zum Einfluss von XopJ auf die Proteasomaktivität in N. benthamiana Da RPT6 eine Untereinheit des 26 S-Proteasoms ist, stellte sich die Frage, ob die Expression von XopJ in N. benthamiana eine Auswirkung auf das Proteasom und den damit verbundenen Proteinabbau in der Zelle hat. Können Proteine nicht durch das Proteasom abgebaut werden, akkumulieren ubiquitinierte Proteine in der Zelle. Um zu untersuchen, ob die Expression von XopJ 69 4.4. ANALYSEN ZUM EINFLUSS VON XOPJ AUF DIE PROTEASOMAKTIVITÄT IN N. BENTHAMIANA 250 kDa > Abbildung 4.21: Überprüfung der Menge an ubiquitinierten Proteinen nach XopJExpression in N. benthamiana. Nach Expression von XopJ und seiner Varianten in N. benthamiana wurden 48 Stunden nach Infiltration Proben genommen und diese auf einem Western Blot mit dem anti-UbiquitinAntikörper analysiert. Anschließend wurde der gleiche Blot zur Analyse der Effektorexpression mit anti-myc-Antikörpern dekoriert. 130 kDa > ubiquitinierte Proteine 70 kDa > 55 kDa > anti-Ubiquitin-Antikörper 55 kDa > anti-myc-Antikörper sich auf die Menge an ubiquitinierten Proteinen auswirkt, wurden zunächst XopJ-exprimierende N. benthamiana-Blattscheiben über Western Blot mit anti-Ubiquitin-Antikörper analysiert. Für den Expressionsnachweis der Effektoren wurde der Blot mit anti-myc-Antikörpern dekoriert. Eine erhöhte Menge an ubiquitinierten Proteinen ist an dem hochmolekularen „Schmier“ oberhalb von 100 kDa zu erkennen. Abbildung 4.21 zeigt eine starke Akkumulation von ubiquitinierten Proteinen nach XopJ-Expression in der Pflanzenzelle. Der Expressionsnachweis der Effektoren zeigt, dass die XopJ G2A-Variante ein wenig niedriger im Gel läuft als der Wildtyp und die XopJ C235A-Mutante. Die fehlende posttranslationale Modifikation am Glycin 2 des Proteins könnte die Ursache dafür sein. Die Daten deuteten darauf hin, dass die Interaktion von XopJ mit RPT6 zu einer Inhibierung der Proteasomaktivität führen könnte. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden erneut XopJ und seine Varianten XopJ C235A und XopJ G2A in N. benthamiana exprimiert. 48 Stunden nach Infiltration wurde die Chymotrypsinaktivität des Proteasoms in Blattextrakten gemessen. Wie Abbildung 4.22 a zeigt, war in XopJ-exprimierenden Blättern die Proteasomaktivität um ca. 40 % geringer als bei der Leervektor-Kontrolle. Sowohl die Expression der nicht-myristoylierten XopJ G2A- als auch der katalytischen Mutante XopJ C235A hatte keinen Effekt auf die Proteasomaktivität. Die Hemmung der Proteasomaktivität war nicht auf unterschiedliche Expressionshöhen der Proteine zurückzuführen (Abbildung 4.22 b). Dass es sich tatsächlich bei der gemessenen proteolytischen Aktivität um die spezifische Chymotrypsin-Aktivität des Proteasoms handelte und nicht um eine unspezifische Proteaseaktivität, wurde mit dem Proteasominhibitor MG132 untersucht (Abbildung 4.23). Bei diesem Experiment konnte man beobachten, dass der Effektor XopJ die Proteasomaktivität nicht so stark beeinflusst wie der Inhibitor MG132. Die Funktion des Proteasoms war durch XopJ nur teilweise unterdrückt, aber nicht komplett inhibiert. 70 KAPITEL 4. ERGEBNISSE a b Proteasomaktivität 140 120 Prozent (%) 100 80 * 60 70 kDa > 40 55 kDa > 20 anti-mycAntikörper 0 pRB XopJ XopJ C235A XopJ G2A Abbildung 4.22: Proteasomaktivitätsmessung nach Expression von XopJ und seiner Varianten in N. benthamiana. Die Effektoren wurden in N. benthamiana-Blättern exprimiert. 48 Stunden nach Infiltration wurden Blattscheiben geerntet und aufgeschlossen. a: Anschließend wurde die Chymotrypsinaktivität des 26 S-Proteasoms mit Hilfe des Substrates Succinyl-LLVYAmidomethylcumarin gemessen. Biologische Replikate n = 3. Ein Student’scher t-Test wurde durchgeführt mit p < 0,05. Das Ergebnis der Proteasomaktivitätsmessung konnte mehrmals mit ähnlichen Ergebnissen reproduziert werden. b: Zur Überprüfung der Expression der Effektoren wurde ein Western Blot mit anti-myc-Antikörpern durchgeführt. a 140 b Proteasomaktivität 120 Prozent (%) 100 80 ohne MG132 60 mit MG132 anti-myc-Antikörper 55 kDa > 40 20 0 pRB XopJ Abbildung 4.23: a: Proteasomaktivitätsmessung nach Expression von XopJ mit und ohne Proteasominhibitor MG132 in N. benthamiana. Die Effektoren wurden für 72 Stunden in N. benthamiana-Blättern exprimiert. Anschließend wurden Blattscheiben geerntet und aufgeschlossen. Die Proteasomaktivität wurde mit Hilfe des Substrates Succinyl-LLVYAmidomethylcumarin gemessen. Biologische Replikate n = 3. b: Nachweis der XopJ-Expression. 4.5. ANALYSE DER PROTEASOMAKTIVITÄT IN TRANSGENEN ARABIDOPSIS THALIANA NACH EXPRESSION VON XOPJ 71 4.5 Analyse der Proteasomaktivität in transgenen Arabidopsis thaliana nach Expression von xopJ Parallel zur Untersuchung der Proteasomaktivität in transient XopJ-exprimierenden Blättern von N. benthamiana wurde auch untersucht, inwieweit sich die stabile Expression von xopJ in transgenen Pflanzen auf das Proteasom auswirkte. Dazu wurden transgene Arabidopsis-Pflanzen, die xopJ unter der Kontrolle des Ethanol-induzierbaren Promotors exprimierten auf Erde unter Kurztagbedingungen kultiviert und nach ca. drei Wochen auf die Induzierbarkeit des Transgens getestet. Dazu wurden zwei bis vier Blätter in 0,2 % Ethanol über Nacht im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde RNA isoliert und die xopJ-Expression mittels RT-PCR überprüft. Nach weiteren 12 Tagen wurde ein Teil der positiv getesteten Pflanzen mit 1 % Ethanol gegossen und somit die xopJ-Expression in der ganzen Pflanze induziert. 48 Stunden nach Induktion wurde die Proteasomaktivität in Blättern bestimmt. Wie in Abbildung 4.24 dargestellt, führte die Ethanol-induzierbare Expression von xopJ in den transgenen Arabidopsis-Pflanzen zu einer Reduktion der Proteasomaktivität um mehr als 50 % im Vergleich zur Wildtyp-Pflanze. Die Ethanol-Behandlung allein hatte keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität, da diese in den Ethanol-behandelten Wildtyp-Pflanzen nicht beeinflusst war. Die Expression von xopJ in den transgenen Pflanzen nach Ethanol-Induktion wurde mittels RT-PCR verifiziert (Abbildung 4.25). Dazu wurden Blätter geerntet und daraus die RNA isoliert. Anschließend erfolgte die cDNA-Synthese und die RT-PCR mit genspezifischen Primern. Proteasomaktivität Prozent (%) * 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Col-0 nicht Col‐0 nicht induziert induziert Col-0 induziert Col‐0 induziert ** EtOH-xopJ nicht EtOH‐xopJ nicht induziert induziert EtOH-xopJ EtOH‐xopJ induziert induziert Abbildung 4.24: Proteasomaktivitätsmessung in EtOH-xopJ-exprimierenden A. thaliana. Zwei Tage nach Induktion der Expression von xopJ wurden Proben für die Messung der Chymotrypsinaktivität des 26 S-Proteasoms geerntet. Die Proteasomaktivitätsmessung erfolgte mit Succinyl-LLVY-Amidomethylcumarin als Substrat. Biologische Replikate n = 4. Der Signifikanzwert wurde mit Hilfe des Student’schen t-Tests mit p < 0,05 (*) bzw. p < 0,01 (**) ermittelt. 72 KAPITEL 4. ERGEBNISSE Ubiquitin Co l-0 nic ht Co ind l-0 uzi ind ert uzi EtO ert H -x op Jn EtO ich t in H -x du op zie J in Wa rt du sse zie rko rt ntr Co olle l-0 nic ht Co i nd l-0 uzi ind ert uzi EtO ert H -x op Jn EtO ich H -x t in op du J in zie Wa rt sse du zie rko r t ntr olle xopJ 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp Abbildung 4.25: Nachweis der xopJ-Expression in Ethanol-induzierbaren A. thaliana. Durch Zugabe von 1 % Ethanol ins Gießwasser wurde die Expression von xopJ in den transgenen Arabidopsis-Pflanzen induziert. Als Kontrolle dienten sowohl Wildtyp-Pflanzen als auch nicht-induzierte, transgene Pflanzen. Zwei Tage später wurden Proben genommen. Nach RNAIsolierung erfolgte die cDNA-Synthese und RT-PCR mit Ubiquitin- und xopJ-spezifischen Primern. 4.6 Herstellung einer Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ∆xopJ-Mutante Um den Einfluss von XopJ auf die Proteasomaktivität während einer kompatiblen Interaktion von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) mit Paprika zu studieren, wurde eine Xcv xopJVerlustmutante hergestellt. Dazu wurde eine overlap-extension-PCR durchgeführt, bei der man jeweils die Primer so wählte, dass 67 bp der 5’ UTR (nicht-transkribierter Bereich) und 147 bp des kodierenden 5’ Bereichs und 96 bp des kodierenden 3’ Bereichs und 74 bp der 3’ UTR über PCR vervielfältigt wurden. In einer zweiten PCR wurden diese Teilstücke dann fusioniert (Abbildung 4.26). Dies führte zum Verlust von 879 bp des kodierenden Bereichs des xopJ-Gens. Das so entstandene verkürzte Gen wurde dann in den pOK-Vektor kloniert. Bei diesem Vektor handelt es sich um einen Suizidvektor, welcher eine Gegenselektion auf Saccharose-haltigem Medium erlaubt (Huguet et al., 1998). Dieser wurde über Triparentale Konjugation in den Wildtyp-XanthomonasStamm 85-10 transformiert. Dort wurde das vollständige Gen durch das verkürzte Fragment über homologe Rekombination ausgetauscht. Über verschiedene Selektionsmedien wurden positive Klone, die das verkürzte Gen enthielten, aber den pOK-Vektor verloren haben, ermittelt. Über eine PCR mit genspezifischen Primern konnte ein positiver Klon mit dem verkürzten, funktionslosen xopJ identifiziert werden (Abbildung 4.27). Mit dem so erhaltenen Xcv ∆xopJ-Stamm konnte die Proteasomaktivität während einer kompatiblen Interaktion untersucht und dabei die Rolle des Effektors XopJ studiert werden. 4.6. HERSTELLUNG EINER XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. VESICATORIA 73 ∆XOPJ-MUTANTE BamHI VB73 VB74 VB75 xopJ 5‘ UTR 3‘ UTR VB73 5‘ UTR BamHI VB76 SalI VB76 ΔxopJ 3‘ UTR 384 bp SalI Wa ss er J WT -xo p ver kür zte sx opJ Abbildung 4.26: Schematische Darstellung der overlap extension-PCR zur Herstellung einer Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ∆ xopJ-Mutante. Die Primer für die overlap extensionPCR wurden so gewählt, dass an den Enden des verkürzten xopJ-Gens zwei für den pOK-Vektor kompatible Restriktionsschnittstellen entstanden und dass die Enden der beiden inneren Primer (VB74 und VB75) zueinander komplementär waren. Diese komplementären Überhänge sollten sich in der Fusions-PCR (VB73 und VB76) aneinanderlagern. Dadurch entstand ein verkürztes xopJ-Fragment. 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp Abbildung 4.27: Ergebnis der Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ∆xopJ-Klonierung. Nach der overlap-extension-PCR zur Herstellung eines verkürzten und damit funktionslosen xopJGens, wurden mögliche positive Klone mit Hilfe von verschiedenen Selektionsmedien bestimmt. Anschließend wurde eine Kolonie-PCR der vorselektierten Xcv ∆xopJ-Klone mit den Primern VB73 und VB76 durchgeführt. War das xopJ-Gen deletiert, wurde nach der PCR ein verkürztes Fragment erhalten. 74 KAPITEL 4. ERGEBNISSE 4.7 Messung der Proteasomaktivität während der kompatiblen Interaktion von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mit Paprika (Capsicum annuum ECW) Mit der in Abschnitt 4.6 beschriebenen Xcv ∆xopJ-Mutante konnte die Proteasomaktivität während einer kompatiblen Pflanze-Pathogen-Interaktion untersucht werden. Dazu wurden ca. vier bis sechs Wochen alte Paprika-Pflanzen mit dem Wildtyp-Xcv, Xcv ∆xopJ und Xcv ∆hrpB1 (Rossier et al., 2000) bei einer oD600 von 0,2 (entspricht 108 CFU pro Milliliter) infiziert. Drei Tage nach Infektion wurde die Proteasomaktivität in den infizierten Blättern bestimmt. Die Daten zeigten, dass die Proteasomaktivität während der Infektion mit dem kompatiblen Wildtyp-Xcv-Stamm 85-10 stark zunahm. Bei einer Infektion mit einem Stamm, der im xopJ-Gen deletiert war, zeigte sich eine leichte zusätzliche Erhöhung der Aktivität. Eine ∆hrpB1-Mutante, die keine Effektoren mehr in das Pflanzenzytosol translozieren konnte, zeigte eine schwache, aber dennoch signifikante Erhöhung der Proteasomaktivität im Vergleich zur MgCl2 -Kontrolle. Der Unterschied zwischen Xcv und Xcv ∆xopJ war in einzelnen Experimenten nicht statistisch signifikant, konnte aber in vier unabhängigen Experimenten reproduziert werden. Abbildung 4.28 b zeigt die Krankheitssymptome vier Tage nach Infektion. Sowohl die mit MgCl2 als auch die mit Xcv ∆hrpB1-infizierten Blätter ließen zu diesem Zeitpunkt keine Symptome erkennen. Eine Infektion mit dem Wildtyp-Xcv- und dem Xcv ∆xopJ-Stamm führten zu Symptomentwicklung in Form von wassergefüllten Läsionen. Im nächsten Schritt sollte die Expression von RPT6 während der kompatiblen Interaktion von Xcv und Paprika überprüft werden. Dazu wurde RNA aus den infizierten Blättern isoliert. Die a 250 b Proteasomaktivität ** ** Prozent (%) 200 150 * 100 MgCl2 Xcv 50 Δxop: ΔhrpB1 0 0 Tage nach Infektion 3 Tage nach Infektion Abbildung 4.28: Messung der Proteasomaktivität während einer kompatiblen Interaktion zwischen Xcv und Paprika. a: Null und drei Tage nach Infektion von Paprika-Blättern wurden Proben für die Proteasomaktivitätsmessung genommen. Es wurden jeweils sechs biologische Replikate vermessen. Xcv: Wildtyp-Stamm 85-10, ∆xopJ: Xcv deletiert in xopJ, ∆hrpB1: Xcv deletiert in hrpB1; diese Mutante konnte keine Effektoren mehr in die Wirtszelle translozieren. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Student’schen t-Tests mit p < 0,05 (*) und p < 0,01 (**) ermittelt. Die Signifikanzwerte bezogen sich immer auf die MgCl2 -Kontrolle nach drei Tagen. b: Ausprägung der Krankheitssymptome auf Paprika-Blättern vier Tage nach Infektion. 75 4.8. STUDIEN ZUR ACETYLIERUNG VON XOPJ UND RPT6 Relative Änderung zu MgCl2 (Log Basis 2) (dR) 2,5 Relative Transkriptmenge RPT6 2 1,5 1 0,5 0 Xcv ΔxopJ ΔhrpB1 3 Tage nach Infektion Abbildung 4.29: RPT6-Expression während einer kompatiblen Interaktion zwischen Xcv und Paprika. Nach der Infektion von Paprika-Blättern wurden Proben für RNA-Extraktion mit anschließender quantitativer RT-PCR genommen. Die Expression von RPT6 wurde auf das Haushaltsgen Aktin normalisiert und mit der Expression nach MgCl2 -Behandlung verglichen (Expressionswert wurde auf 1 gesetzt). Bei Infektion mit Xcv ist die Expression von RPT6 bis zu 3,4-fach erhöht im Vergleich zur MgCl2 -Kontrolle. Die Auswertung wurde mit dem Programm MxPro_v4.10 von Agilent durchgeführt. Die Standardabweichung bezieht sich auf jeweils 3 technische Replikate. Xcv: Wildtyp-Stamm 85-10, ∆xopJ: Xcv deletiert in xopJ, ∆hrpB1: Xcv deletiert in hrpB1. erhaltene cDNA wurde in eine quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) eingesetzt. So konnte die RPT6mRNA-Menge quantifiziert werden. Abbildung 4.29 zeigt das Ergebnis der quantitativen RT-PCR von RPT6 während der kompatiblen Interaktion. Drei Tage nach Infektion mit Xcv ∆xopJ war eine bis zu 3,4-fach erhöhte Transkription von RPT6 im Vergleich zur MgCl2 -Kontrolle zu erkennen. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass RPT6 ein PAMP-induziertes Gen darstellt. 4.8 Studien zur Acetylierung von XopJ und RPT6 4.8.1 Aufreinigung der Proteine RPT6 und XopJ 4.8.1.1 Aufreinigung von XopJ über MBP Um die biologische Funktion von XopJ ermitteln zu können, wurde der Effektor als MBP-Fusion (Maltose-Bindeprotein) aus E. coli aufgereinigt. Dieses rekombinante Effektorprotein sollte in eine in vitro-Acetylierung eingesetzt werden. Zunächst wurde das xopJ-Gen über BamHI und SalI in den Vektor pMal-c2 kloniert (Abbildung 4.30) und anschließend in den Escherichia coli-Stamm M15 transformiert, der zusätzlich das pREP4-Plasmid trug (Villarejo und Zabin, 1974). Die Expression von XopJ erfolgte für 24 Stunden bei 18 °C. 76 KAPITEL 4. ERGEBNISSE BamHI Ptac SalI malE xopJ rrnB pMal-c2 Faktor Xa-Schnittstelle Abbildung 4.30: MBP-XopJ-Konstrukt zur Expression in E. coli. Die Aktivierung des Ptac Promotors und damit die Induktion von MBP-XopJ wurde über IPTG (Isopropyl β-D-1thiogalactopyranosid) initiiert. Eine Faktor Xa-Schnittstelle liegt zwischen dem malE-Gen, das für das Maltose-Bindeproteine (MBP) kodiert, und des kodierenden Bereichs von xopJ. Dem Konstrukt liegt der Vektor pMAL-c2 zugrunde. Die Aufreinigung erfolgte aus dem Zellpellet einer 50 ml-Kultur. Durch die Affinität des MaltoseBindeproteins zu Amylose konnte der Effektor angereichert werden. Das Ergebnis der Reinigung ist in Abbildung 4.31 zu sehen. Abbildung 4.31 zeigt das Ergebnis der MBP-XopJ-Reinigung aus E. coli. Das Fusionsprotein (83,1 kDa) lief etwas höher als berechnet und entsprach der Bande bei ca. 100 kDa. Die Einzelproteine haben ein theoretisches Molekulargewicht von 42,5 kDa (Maltose-Bindeprotein) und 40,6 kDa (XopJ). Neben der Bande in den Eluaten war auch in der Fraktion des „Überstands nach Adsorption“ noch ein deutliches Signal auf Höhe des Fusionsproteins zu erkennen. Das bedeutet, dass nicht das gesamte MBP-XopJ an die Matrix gebunden hatte. Die Banden knapp unter 55 kDa (mit * gekennzeichnet) waren bei jeder MBP-XopJ-Aufreinigung zu erkennen. Dadurch, dass sich diese Banden mit aufreinigen ließen, stellten diese unspezifischen Banden wahrscheinlich vorzeitige Kettenabbrüche bei der Translation dar. 100 kDa > MBP-XopJ 70 kDa > 55 kDa > 35 kDa > * Abbildung 4.31: Ergebnis der Aufreinigung von MBP-markiertem XopJ aus E. coli. Das Pellet aus 50 ml induzierter E. coli-Kultur wurde über Ultraschall aufgeschlossen und XopJ wurde über Amylose-Harz gereinigt. 77 4.8. STUDIEN ZUR ACETYLIERUNG VON XOPJ UND RPT6 BamHI Ptac GST SalI RPT6 Terminator pGEX-4T-1 Thrombin-Schnittstelle Abbildung 4.32: Schematische Darstellung des GST-RPT6-Konstruktes zur Aufreinigung aus E. coli. Zwischen dem GST-tag und RPT6 liegt im Vektor pGEX-4T-1 eine Thrombin-Schnittstelle. 4.8.1.2 Aufreinigung von RPT6 über GST Um die beiden Proteine RPT6 (47,2 kDa) und XopJ (40,6 kDa) voneinander gut unterscheiden zu können, wurde RPT6 über eine Glutathion-S-Transferase (GST)-Markierung aufgereinigt. Diese besitzt ein Molekulargewicht von 26 kDa und das Endkonstrukt GST-RPT6 entsprach somit 73,2 kDa. Das RPT6-Gen aus Tabak wurde über die Schnittstellen BamHI und SalI in den Vektor pGEX-4T-1 kloniert (Abbildung 4.32). Das Konstrukt wurde in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) GroEL/GroES transformiert (freundliche Überlassung durch den Lehrstuhl für Biotechnik; Amrein et al. (1995)). Die Induktion wurde analog zu Abschnitt 4.8.1.1 durchgeführt. Die Aufreinigung erfolgte aus dem Zellpellet einer 50 ml Kultur. Zur Anreicherung des Fusionsproteins GST-RPT6 wurde Glutathion-Sepharose verwendet, zu der die Glutathion-S-Transferase affin ist. Abbildung 4.33 zeigt das Ergebnis der Proteinreinigung von RPT6 über GST. In den Eluaten waren drei Hauptbanden zu erkennen. Bei 25 kDa war eine schwache, diffuse Bande zu sehen, die wahrscheinlich die Glutathion-S-Transferase (27 kDa) alleine darstellt. Da GST N-terminal an RPT6 fusioniert wurde, kam diese Bande wahrscheinlich durch vorzeitige Kettenabbrüche bei der Translation zustande. Die interessanten Banden lagen jedoch bei 70 kDa. Dort waren eine etwas größere, dünnere und eine dickere Bande knapp unter 70 kDa zu beobachten. Diese beiden stellten wahrscheinlich das Volllängen-Protein und ein am C-Terminus verkürztes Protein dar. 70 kDa > 55 kDa > Abbildung 4.33: Ergebnis der Aufreinigung von GST-markiertem RPT6 aus E. coli. Das Pellet aus 50 ml induzierter E. coli-Kultur wur- 35 kDa > de über Ultraschall aufgeschlossen. Die Aufrei- 25 kDa > nigung von GST-RPT6 erfolgte mit Hilfe von Glutathion-Sepharose. GST-RPT6 GST 78 KAPITEL 4. ERGEBNISSE IP6 GST-RPT6 GST-HopZ1a GST-HopZ1a C216A MBP-XopJ C235A MBP-XopJ GST MBP HopZ1a + + - + + - + + - + + - + + - + + + - + - + - + + + + + + - + + + - 70 kDa > 55 kDa > + + + - + + + - + + + - + + - + - < 70 kDa HopZ1a < 55 kDa Abbildung 4.34: In vitro-Acetyltransferase-Test mit GST-RPT6 und MBP-XopJ. Die aufgereinigten Proteine wurden in den in vitro-Test eingesetzt und mit 100 nM IP6 und 2 µl C14 -Acetyl-CoA (0,1 mCi/ml) versetzt. Nach einer Stunde bei 30 °C wurden die Proben mit Lämmli-Puffer aufgekocht. Anschließend wurden sie auf BisTris-Gele aufgetragen. Nach Beendigung des Gellaufs wurde das Gel fixiert, in „Amplify“-Lösung inkubiert und anschließend getrocknet. Zur Detektion der radioaktiven Banden wurde für zwei bis drei Wochen ein Phosphorimager aufgelegt. 4.8.2 In vitro-Acetylierung von XopJ und RPT6 Neben der Identifizierung einer möglichen Acetylierung sowohl an XopJ als auch an RPT6 über Massenspektrometrie (Abschnitt 4.8.5.1) sollte auch ein biochemischer Nachweis dieser posttranslationalen Modifikation erbracht werden. Dazu wurde MBP-XopJ in E. coli M15-Zellen und GST-RPT6 in E. coli BL21/GroEL/GroES überexprimiert. GST-HopZ1a, wofür bereits eine Acetyltransferaseaktivität gezeigt wurde (Lee et al., 2012), diente als Positivkontrolle und wurde in BL21/Rosetta-Zellen exprimiert. Die Proteine wurden über ihre jeweiligen Affinitätsmarkierungen aufgereinigt und je 1 µg der Effektoren bzw. von rekombinantem RPT6 wurden in die in vitro-Acetylierung eingesetzt. Inositolhexakisphosphat (IP6 ) ist ein Kofaktor, von dem bereits gezeigt werden konnte, dass er für die Acetyltransferaseaktivität von YopJ, AvrA und HopZ1a benötigt wird (Mittal et al., 2010; Lee et al., 2012). Die mit Acetyl-CoA behandelten Proteine wurden auf ein Gel aufgetragen. Nach Fixierung und Trocknen des Gels wurde zur Detektion des modifizierten Effektors/RPT6 ein Autoradiogramm mittels radioaktivem Acetyl-CoA erstellt. Abbildung 4.34 zeigt, dass XopJ, welches in E. coli exprimiert und anschließend über MBP aufgereinigt wurde, keine Autoacetylierung aufwies. Eine Übertragung des Acetylrestes an GST-RPT6 konnte ebenfalls nicht bestätigt werden. Die bereits publizierte Autoacetylierung von HopZ1a konnte hier gezeigt werden. Wie erwartet wurde HopZ1a nur in Gegenwart von IP6 und einer 4.8. STUDIEN ZUR ACETYLIERUNG VON XOPJ UND RPT6 AvrA YopJ VopA PopP2 XopJ consensus 227 213 208 276 288 301 79 K-ADRYLPVSFYKHTQGAQRLNEYVEANPAAGSSIVNKKNETLYERFDNNAV-------K-LDPYLPVTFYKHTQGKKRLNEYLNTNPQGVGTVVNKKNETIVNRFDNNKS-------KDADSLLPPSLMKHTQSPNRLQKYLEMRPEAMNCVVNKKGETLKTRQQRHIT-------LDGAPLVDARMMKHGQAASSVSRYLGNHPEQSTVPVNKRNETLGERTTRHLVKRKVRNRA MLGEQMLPAIFYKHTHSSGVVEEVDRSQPGSAYTDVSTSGRQQQHESLEQRV-------k ad llp sfyKHtqg rlneyl nP a siVnkknetl r n v Abbildung 4.35: Vergleich der Aminosäuresequenzen einiger Effektoren der YopJ-Familie. XopJ (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria; Accession: CAJ23833.1), AvrA (Salmonella typhimurium; Accession: ADX18647.1), PopP2 (Ralstonia solanacearum; Accession: CAD14570.2), YopJ (Yersinia pestis Angola; Accession: YP_001604500.1) und VopA (Vibrio parahaemolyticus; Accession: AAT08443.1) Der Sequenzvergleich zeigt ein konserviertes Lysin innerhalb der YopJFamilie der Typ III-Effektoren. In XopJ handelt es sich um das Lysin an Position 300. intakten katalytischen Triade (C216A) autoacetyliert (Lee et al., 2012). Als Negativkontrollen dienten jeweils MBP und GST allein. 4.8.3 Mutationsanalyse von XopJ In der Publikation von Tasset et al. (2010) ist ein konserviertes Lysin in Effektorproteinen aus der YopJ-Familie identifiziert worden. In PopP2 aus Ralstonia solanacearum ist dieses Lysin essentiell für die Autoacetylierung des Effektors. Lee et al. (2012) konnten ebenfalls ein für die Acetylierung wichtiges Lysin im Pseudomonas-Effektor HopZ1a ermitteln. Ein Sequenzvergleich von verschiedenen Typ III-Effektoren aus der YopJ-Familie zeigte, dass sich das in der YopJ-Familie konservierte Lysin an Position 300 von XopJ befand. Eine Mutation dieses Lysins zu Arginin sollte Aufschluss über die Bedeutsamkeit dieser Aminosäure für die Interaktion von XopJ G2A mit RPT6 und einer Beeinflussung der Proteasomaktivität geben. Die Mutation wurde durch ortsgerichtete Mutagenese eingeführt. Nach Klonierung von XopJ G2A K300R in den Vektor pGBT9 wurde die direkte Interaktion von XopJ G2A K300R mit RPT6 aus Arabidopsis und Tabak im Hefe-Stamm Y190 getestet. Die fehlende Blaufärbung in Abbildung 4.36 zeigte, dass keine Interaktion zwischen XopJ und RPT6 mehr nachgewiesen werden konnte, sobald das Lysin 300 zu Arginin in XopJ mutiert war. Deshalb wurde als nächstes getestet, ob auch die Proteasomaktivität in N. benthamiana von dieser Mutante unbeeinflusst blieb. Auch nach drei Tagen XopJ-Expression in N. benthamiana war die Proteasomaktivität - im Vergleich mit der Leervektor-Kontrolle - noch um ca. 20 % vermindert. Die XopJ K300R-Expression hatte hingegen keinen Einfluss auf die Proteasomaktivität (Abbildung 4.37 a). Des Weiteren war zu erkennen, dass die Menge an ubiquitinierten Proteinen nach XopJ-Expression deutlich erhöht war. Dies war nicht auf unterschiedliche Proteinmengen zurückzuführen, wie aus Abbildung 4.37 b hervorgeht. Die Bedeutung des Lysins an Position 300 des XopJ-Polypeptids für die Interaktion mit RPT6 in Hefe und die Hemmung des Proteasoms in planta könnte auf eine mögliche Acetyltransferaseaktivität des Effektors hindeuten. 80 KAPITEL 4. ERGEBNISSE -LT -HLT LacZ pBD-SV40 + pAD-p53 pBD-XopJ G2A K300R + pAD-NtRPT6 pBD-XopJ G2A K300R + pAD-AtRPT6 pBD-XopJ G2A K300R + pGAD424 pGBT9 + pAD-NtRPT6 pGBT9 + pAD-AtRPT6 Abbildung 4.36: Test auf direkte Interaktion von XopJ G2A K300R mit RPT6. Nach Einführung der Mutation am Lysin 300 von XopJ G2A, wurde dieses zusammen mit RPT6 in den Hefe-Stamm Y190 transformiert und nach Stempeln der Kolonien auf geeignetes Selektionsmedium einem LacZ-Filter-Test unterzogen. Proteasomaktivität a b 120 Prozent (%) 100 * 80 70 kDa > 55 kDa > 60 250 kDa > 130 kDa > 100 kDa > 70 kDa > 40 anti-myc-Antikörper anti-Ubiquitin-Antikörper 20 0 pRB XopJ XopJ K300R Abbildung 4.37: Proteasomaktivitätsmessung nach Expression von XopJ und XopJ K300R in N. benthamiana. Nach Expression von XopJ und XopJ K300R in N. benthamiana wurden drei Tage nach Infiltration Proben genommen. a: Ergebnis der Proteasomaktivitätsmessung mit SuccinylLLVY-Amidomethylcumarin als Substrat. Biologische Replikate n = 5. Der Signifikanzwert wurde mit Hilfe des Student’schen t-Tests mit p < 0,05 ermittelt. b: Anschließend wurden jeweils 25 µg Gesamtprotein mittels Western Blot sowohl mit anti-Ubiquitin-Antikörper als auch mit anti-mycAntikörper analysiert. 4.8. STUDIEN ZUR ACETYLIERUNG VON XOPJ UND RPT6 81 Abbildung 4.38: Vergleich der Aminosäuresequenzen von RPT6 aus Mensch, Maus, Ratte, Drosophila, Hefe, Arabidopsis und Tabak. Auch in Pflanzen existiert das in Säugetieren konservierte Serin 120. In Tabak liegt dieses Serin an Position 130 der Aminosäuresequenz. 4.8.4 Mutationsanalyse von RPT6 Zhang et al. (2007a) haben bereits beschrieben, dass ein konservierter Serinrest im RPT6-Protein von Drosophila, Hefe, Maus, Ratte und Mensch phosphoryliert wird. In Säugetieren handelt es sich dabei um das Serin an Position 120 der Aminosäuresequenz. Dieses Serin ist essentiell für die Phosphorylierung von RPT6 und damit für die Assemblierung des 26 S-Proteasoms (Satoh et al., 2001; Zhang et al., 2007a). In Pflanzen ist die Phosphorylierung von RPT6 bisher nicht gezeigt. Um aufzuklären, ob das entsprechende Serin auch in der RPT6-Aminosäuresequenz von Pflanzen konserviert ist, wurde ein Sequenzvergleich mit RPT6 aus verschiedenen Organismen durchgeführt. Das in Zhang et al. (2007a) beschriebene, konservierte Serin ist auch in Pflanzen vorhanden. In Tabak handelt es sich um das Serin an Position 130 (Abbildung 4.38). Ein möglicher Mechanismus über den XopJ die Funktion von RPT6 beeinflussen könnte, ist die Acetylierung von Serin 130. Damit könnte die Phosphorylierung dieses Aminosäurerestes blockiert werden. Deshalb wurde untersucht, ob das konservierte Serin 130 der RPT6-Untereinheit für die Interaktion mit XopJ essentiell ist. Dazu wurden sowohl eine phosphomimetische Mutante NtRPT6 S130D als auch eine Serin zu Alanin-Mutante (NtRPT6 S130A) mit XopJ G2A in den Hefe-Stamm Y190 kotransformiert und auf die Aktivierung der Reportergene untersucht. Sowohl die NtRPT6 S130D- als auch die NtRPT6 S130A-Mutante konnten noch mit XopJ G2A interagieren. Aufgrund der intensiveren Blaufärbung schienen diese Mutanten sogar stärker mit XopJ G2A wechselwirken zu können als das Wildtyp-Protein. Als Positivkontrolle wurden bei diesem Experiment die interagierenden Proteine Thioredoxin z (TRX-z) und Fruktokinase-ähnliches Protein 1 (FLN1) verwendet (Arsova et al., 2010). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass das Serin 130 in RPT6 aus Tabak für die Bindung von XopJ in Hefe keine Rolle spielt. 4.8.5 Aufreinigung von XopJ und RPT6 über GFP zur Identifizierung posttranslationaler Modifikationen Um eine mögliche Acetylierung an RPT6 oder XopJ identifizieren zu können, wurde nicht nur eine in vitro-Acetylierung durchgeführt, sondern auch eine Identifizierung von posttranslationalen Modifikationen über Massenspektrometrie angestrebt. Dazu wurden die Proteine mit C-terminaler 82 KAPITEL 4. ERGEBNISSE -LT -HLT LacZ pBD-TRX-z + pAD-FLN1 pBD-XopJ G2A + pAD pBD-XopJ G2A + pAD-NtRPT6 pBD-XopJ G2A + pAD-NtRPT6 S/D pBD-XopJ G2A + pAD-NtRPT6 S/A Abbildung 4.39: Test auf direkte Interaktion von XopJ G2A mit NtRPT6 S130D und NtRPT6 S130A. Nach Einführung der Mutationen in das RPT6-Protein, wurden die Varianten S130D und S130A zusammen mit XopJ G2A in den Hefestamm Y190 transformiert. Mit diesen Hefen wurde dann nach Stempeln auf Selektionsmedium ein LacZ-Filter-Test durchgeführt. Positivkontrolle: TRX-z (Thioredoxin z) und FLN 1 (Fruktokinase-ähnliches Protein 1; Arsova et al. (2010)). Negativkontrolle: XopJ G2A mit dem leeren Vektor pAD. GFP-Markierung in N. benthamiana überexprimiert. Die Koexpression von RPT6-GFP mit XopJmyc sollte Aufschluss über eine mögliche Änderung der posttranslationalen Modifikationen an RPT6 und XopJ geben. Zwei Tage nach Infiltration wurden die Blätter geerntet und die Proteine wurden über die GFP-Markierung der Proteine aufgereinigt. Die Eluate wurden auf ein BisTris-Gel aufgetragen, das mit kolloidalem Coomassie gefärbt wurde. Das Ergebnis der Aufreinigung über eine GFP-Markierung ist auf Abbildung 4.40 zu sehen. Die eingerahmten Banden entsprachen den GFP-Protein-Fusionen und wurden ausgeschnitten. Diese drei Proben wurden an die Firma Toplab GmbH (Martinsried) versendet. Die Bande, die auf Abbildung 4.40 mit dem Stern gekennzeichnet war, war nur in der Probe „XopJ-GFP“ zu sehen und wurde ebenfalls zur MS-Analyse geschickt. 4.8.5.1 Massenspektrometrische Analyse von RPT6 und XopJ Die zu analysierenden Proben wurden gewaschen, mit DTT reduziert, mit Iodacetamid alkyliert und die RPT6-GFP-Proben wurden mit Trypsin über Nacht verdaut. Da ein Trypsin-Verdau von XopJ-GFP keine gute Sequenzabdeckung lieferte, wurde diese Probe mit Asp-N behandelt. Anschließend wurde eine Peptidmassen-Fingerprint-Analyse mit Hilfe des Massenspektrometers des Typs 4800 Proteomics Analyzer von AB Sciex (Darmstadt) durchgeführt. 83 4.8. STUDIEN ZUR ACETYLIERUNG VON XOPJ UND RPT6 70 kDa > * 55 kDa > Abbildung 4.40: Ergebnis der Aufreinigung von RPT6-GFP und XopJ-GFP aus N. benthamiana. Nach zweitägiger Überexpression der Proteine in der Pflanze wurden diese über GFP-Trap® isoliert. Anschließend wurden die Proteine von der Matrix mit LämmliPuffer bei 70 °C eluiert und auf ein BisTris-Gel aufgetragen. Das Gel wurde mit kolloidalem Coomassie eingefärbt. Die detektierten Peptidmassen wurden zunächst in einer Datenbanksuche mit Mascot (www.matrixscience.com; Matrix Science Ltd., London) gegen die zur Verfügung gestellten Sequenzen verglichen. Die Grenze für eine Identifikation wurde auf p < 0.05 festgelegt. Probe 1: Bei einer ersten Datenbanksuche wurde mit 102 chromatographisch erhaltenen Massen und den variablen Modifikationen Oxidation (M) und Acetylierung (S) gesucht. Dabei wurden 58 Peptidmassenübereinstimmungen gefunden, was einer Sequenzabdeckung von 70 % entsprach (Abbildung 4.41). Eine Änderung der Abfrage mit den variablen Modifikationen Acetyl (K), Acetyl (S), Acetyl (T), N-Acetyl (Protein) ergab 41 übereinstimmende Peptidmassen und eine Abdeckung von 65 % (Abbildung 4.42). Probe 2: Bei der Datenbanksuche mit den variablen Modifikationen Oxidation (M) und Acetylierung (S) wurde mit 181 chromatographisch erhaltenen Massen gesucht. Dabei wurden 84 Peptidmassenübereinstimmungen gefunden, was einer Sequenzabdeckung von 81 % entsprach (Abbildung 4.43). Eine Änderung der Abfrage mit den variablen Modifikationen Acetyl (K), Acetyl (S), Acetyl (T), N-Acetyl (Protein) ergab 87 übereinstimmende Peptidmassen und eine Abdeckung von 77 % (Abbildung 4.44). Probe 3: Die Proteinbande der Probe 3 wurde mit Asp-N verdaut, da weder Trypsin noch Glu-C Peptidmassen-Fingerprint-Analyse 84 KAPITEL 4. ERGEBNISSE ein zufriedenstellendes Ergebnis lieferte. Bei der Datenbanksuche mit den variablen Modifikationen Oxidation (M) und Acetylierung (K) wurde mit 193 chromatographisch erhaltenen Massen gesucht. Dabei wurden 45 Peptidmassenübereinstimmungen gefunden, was einer Sequenzabdeckung von 71 % entsprach (Abbildung 4.45). Die in Abbildung 4.40 mit Sternchen markierte Bande wurde ebenfalls nach Trypsin-Verdau einer Peptidmassen-Fingerprint-Analyse unterzogen. Ein Sequenzvergleich gegen eine Nicotiana tabacum-Datenbank zeigte kein signifikantes Ergebnis. Die Wiederholung des Sequenzabgleichs gegen eine Datenbank ohne Taxonomiebeschränkung ergab eine signifikante Identifizierung von XopJ und GFP. Abbildung 4.41: Mascot-Ergebnis der Suchanfrage mit den variablen Modifikationen Oxidation und S-Acetylierung: Gefundene Peptide aus Probe 1 (RPT6-GFP). Anhand der Massenpeaks gefundene Peptide in der Sequenz RPT6-GFP sind in Rot dargestellt. Abbildung 4.42: Mascot-Ergebnis der Suchanfrage mit den variablen Modifikationen KAcetylierung, T-Acetylierung, S-Acetylierung und N-Acetylierung: Gefundene Peptide aus Probe 1 (RPT6-GFP). Anhand der Massenpeaks gefundene Peptide in der Sequenz RPT6-GFP sind in Rot dargestellt. 4.8. STUDIEN ZUR ACETYLIERUNG VON XOPJ UND RPT6 85 Abbildung 4.43: Mascot-Ergebnis der Suchanfrage mit den variablen Modifikationen Oxidation und S-Acetylierung: Gefundene Peptide aus Probe 2 (RPT6-GFP koexprimiert mit XopJ-myc). Anhand der Massenpeaks gefundene Peptide in der Sequenz RPT6-GFP sind in Rot dargestellt. Abbildung 4.44: Mascot-Ergebnis der Suchanfrage mit den variablen Modifikationen KAcetylierung, T-Acetylierung, S-Acetylierung und N-Acetylierung: Gefundene Peptide aus Probe 2 (RPT6-GFP koexprimiert mit XopJ-myc). Anhand der Massenpeaks gefundene Peptide in der Sequenz RPT6-GFP sind in Rot dargestellt. Abbildung 4.45: Mascot-Ergebnis der Suchanfrage mit den variablen Modifikationen KAcetylierung und Oxidation: Gefundene Peptide aus Probe 3 (XopJ-GFP). Anhand der Massenpeaks gefundene Peptide in der Sequenz XopJ-GFP sind in Rot dargestellt. 86 KAPITEL 4. ERGEBNISSE Position in Aminosäuresequenz Masse [m/z] Sequenz Modifikation R.NDSYVLHLILPSKVDPLVNLMK.V Oxidation (M), Acetyl (S) Ist Serin 130 acetyliert in Anwesenheit von XopJ? 128-149 2566,398 Weitere Peptide, die als acetyliert annotiert sind: 430-437 920,557 K.VVISMVSK.G Oxidation (M), Acetyl (K) 430-437 946,550 K.VVISMVSK.G Acetyl (K), Acetyl (S) 430-437 920,557 K.VVISMVSK.G Oxidation (M), Acetyl (S) 430-437 946,550 K.VVISMVSK.G 2 Acetyl (S) Tabelle 4.2: Übersicht als acetyliert annotierter Peptide der Proben 1 und 2 (RPT6). Diese Vorläufer-Peptide wurden in Fragmentionenspektren genauer analysiert. Da die Proteinabschnitte 128 - 149 mit der Masse 2566.3953 m/z und 430 - 437 mit 946.5563 m/z der Proben 1 und 2, sowie der Proteinabschnitt mit der Masse 920.5565 m/z bei Probe 2 als an Serin acetyliert annotiert waren (Tabelle 4.2), wurden von diesen Peptiden MS/MS-Fragmentionenspektren aufgenommen. Die Mascotsuche für die Masse 2566.3953 m/z ergab eine Zuordnung zu GFP DHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK. Die Acetylierung des Sequenzabschnittes 128 - 149 konnte somit nicht bestätigt werden. Die Mascotsuche für die Masse 946.5563 m/z ergab eine Zuordnung zu den Resten 224 - 232 VSGSELVQK. Die Acetylierung des Sequenzabschnittes 430 - 437 konnte ebenfalls nicht bestätigt werden. Die Mascotsuche für die Masse 920.5565 m/z ergab keine Zuordnung zu einer Sequenz. Mit den als acetyliert annotierten Massen der Probe 3 (XopJ-GFP) wurde eine Tandemmassenspektrometrie durchgeführt (Tabelle 4.3). Die Proteinabschnitte 606 - 628 mit der Masse 2640,385 m/z, 282 - 311 mit der Masse 3360,64 m/z, 405 - 425 mit der Masse 1732,854 m/z, 507 - 522 mit der Masse 1932,042 m/z, 580 -599 mit der Masse 2197,16 m/z und der Proteinabschnitt 545 -562 mit der Masse 2223,232 m/z waren als an Lysin acetyliert annotiert. Alle als acetyliert annotierten Proteinabschnitte konnten dem GFP-Protein zugeordnet werden – außer die Masse des Abschnitts 282 - 311. Dennoch konnte keine der annotierten Modifikationen bestätigt werden. Diese Daten deuteten darauf hin, dass unter den Bedingungen der hier angewandten Aufreinigung von RPT6-GFP weder RPT6 noch XopJ stabil acetyliert wurden. Identifizierung von Acetylierungen 4.9 Ausschalten von RPT6 in N. benthamiana durch Virus-induzierte Gen-Stilllegung (VIGS) Um weitere Experimente zur Charakterisierung von XopJ und dessen Interaktionspartner RPT6 durchführen zu können, sollte die RPT6-Expression in Pflanzen durch Gen-Stilllegung ausgeschaltet werden. Dazu wurde ein 351 bp langes Fragment aus dem kodierenden Bereich von RPT6 in 87 4.10. UNTERSUCHUNG DER AVIRULENZFUNKTION VON XOPJ Position in Aminosäuresequenz Masse [m/z] Sequenz Modifikation Ist Lysin 300 in XopJ acetyliert? 282-311 3302,643 E.DAGVELMLGEQMLPAIFYKHTHSSGVVEEV.D Oxidation (M) 282-311 3318,648 E.DAGVELMLGEQMLPAIFYKHTHSSGVVEEV.D 2 Oxidation (M) Weitere Peptide, die als acetyliert annotiert sind: 409-425 1732,854 L.DGDVNGHKFSVSGEGEG.D Acetyl (K) 507-522 1932,042 G.DTLVNRIELKGIDFKE.D Acetyl (K) 545-562 2223,232 A.DKQKNGIKVNFKIRHNIE.D Acetyl (K) 580-599 2197,160 G.DGPVLLPDNHYLSTQSALSK.D Acetyl (K) 606-628 2640,385 R.DHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK.- 2 Oxidation (M), Acetyl (K) Tabelle 4.3: Übersicht als acetyliert annotierter Peptide der Probe 3 (XopJ). Diese VorläuferPeptide wurden in Fragmentionenspektren genauer analysiert. den Vektor pYL279 in Antisense-Orientierung kloniert (Liu et al., 2002). Dieser Vektor und das Helferplasmid pTRV1 wurden jeweils in Agrobakterien transformiert. Die Agrobakterien-Kulturen wurden jeweils 1:1 gemischt und in N. benthamiana infiltriert. In den Pflanzen assembliert sich anschließend ein rekombinantes Viruspartikel, das sich systemisch in der Pflanze ausbreitet. Die Methode beruht auf der posttranskriptionellen Gen-Stilllegung des Ziel-RNA-Fragmentes durch die Einführung eines komplementären oder eines gleichartigen RNA-Fragmentes durch einen Virus (Waterhouse et al., 1998; Ratcliff et al., 2001). Nach etwa zwei Wochen konnte man einen deutlichen Phänotyp der RPT6-herunterregulierten Pflanze erkennen. Das Ausschalten von RPT6 führte zum Wachstumsstopp und letztendlich zum Tod der Pflanzen (Abbildung 4.46 a und b). Dieser Phänotyp war auf die Herunterregulierung von RPT6 zurückzuführen und nicht auf die Einführung eines Virus, was die Kontrolle pTRV-GFPsil sicherstellte. Das Ergebnis der quantitativen Echtzeit-PCR zeigte ein um 90 % herunterreguliertes RPT6-Gen 18 Tage nach Infiltration (Abbildung 4.46 c). Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass RPT6 für N. benthamiana eine essentielle Funktion hat. Aufgrund des letalen Phänotyps können mit diesen Pflanzen keine weiteren Untersuchungen zu eventuellen Einflüssen von RPT6 auf die basale Abwehr durchgeführt werden. 4.10 Untersuchung der Avirulenzfunktion von XopJ Neben ihrer Funktion zur Unterdrückung der basalen Abwehr der Pflanze, können Effektoren auch von resistenten Pflanzen über R-Proteine detektiert werden. Diese Erkennung der Effektorproteine führt zu einer hypersensitiven Reaktion (HR). Thieme et al. (2007) konnten bereits zeigen, dass XopJ eine HR in N. benthamiana auslösen kann. Unter den Wachstumsbedingungen wie unter Abschnitt 3.2.1 beschrieben, konnte dieser Effekt allerdings nur dann erzielt werden, wenn 88 KAPITEL 4. ERGEBNISSE a b c Relative Änderung zu GFPsil (Log Basis 2) (dR) Relative Transkriptmenge RPT6 pYL279-RPT6 nach 14 Tagen pYL279-RPT6 nach 18 Tagen 0 -0,5 -1 -1,5 -2 -2,5 -3 -3,5 -4 -4,5 Abbildung 4.46: Virus-induzierte Gen-Stilllegung (VIGS) von RPT6 in N. benthamiana. Das RPT6-Gen konnte durch VIGS in N. benthamiana herunterreguliert werden. Das führte zu einem Wachstumsstopp und letztendlich zum Tod der Pflanze. Als Kontrolle diente pTRV-GFPsil. a: Übersicht und Vergleich zwischen pTRV-GFPsil (linke Pflanze) und pYL279-RPT6 (rechte Pflanze). b: Vergrößerung von a pYL279-RPT6. c: Ergebnis der quantitativen Echtzeit-PCR nach Herunterregulierung von RPT6. Die Expressionshöhe von RPT6 wurde auf das Haushaltsgen Aktin normalisiert und jeweils mit der pTRV-GFPsil-Kontrolle verglichen. Die Auswertung wurde mit dem Programm MxPro_v4.10 von Agilent durchgeführt. Die Standardabweichung zeigt die Abweichung von 3 technischen Replikaten. man die XopJ-exprimierenden Pflanzen mit Salicylsäure (SA) oder dem nicht-metabolisierbaren SA-Analogon INA (2,6-Dichloroisonikotinsäure) besprühte (Abbildung 4.47). Ein Protein, das aufgrund einer erhöhten Salicylsäure-Konzentration in der Pflanzenzelle verändert wird, ist NPR1 (nonexpresser of PR-1 genes; Cao et al. (1994)). Dieses wird bei erhöhter SA-Konzentration in den Kern transloziert, wo es mit den Transkriptionsfaktoren AHBP-1b und TGA6 interagiert und die Expression von PR-1 fördert (Zhang et al., 1999). PR-Proteine sind Pathogenese-assoziierte Proteine, die bei Infektion exprimiert und meist in den Apoplasten sekretiert werden, um die Zelle gegen Pathogene schützen. Um die NPR1- und INA-Abhängigkeit der HR nach XopJ-Expression zu untersuchen, wurde NtNPR1 (Accession: AF480488) durch VIGS stillgelegt (Liu et al., 2002). Dazu wurden die jeweiligen VIGS-Konstrukte mit dem Helfer-Konstrukt (pTRV1) in Agrobakterien transformiert. Diese Kulturen wurden 1:1 gemischt in ca. 14 Tage alte N. benthamiana infiltriert. XopJ und seine 89 4.10. UNTERSUCHUNG DER AVIRULENZFUNKTION VON XOPJ XopJ-myc XopJ C235A-myc XopJ G2A-myc Sp2-myc pTRV-GFPsil pTRV-NPR1 +INA -INA +INA -INA +INA -INA +INA -INA Abbildung 4.47: Studien zur Auslösung der hypersensitiven Reaktion (HR) nach Expression von XopJ-myc in pTRV-NPR1-N. benthamiana. Nach Infiltration von ca. zwei Wochen alten N. benthamiana-Pflanzen mit Agrobakterien, die das pTRV-NtNPR1- bzw. pTRV-GFPsil-Konstrukt enthielten, konnte sich der Tabak-Rattle-Virus assemblieren und in der Pflanze ausbreiten. Nach weiteren zwei Wochen wurden die Pflanzen mit Agrobakterien infiltriert, die die Konstrukte der Effektoren bzw. des Sp2-Fragments trugen. 48 Stunden nach Infiltration wurden die Pflanzen mit 0,67 mM INA besprüht. Die HR-Symptome wurden nach einem weiteren Tag dokumentiert. Varianten sowie das Sp2-Fragment als Negativkontrolle wurden über Agrobakterien-vermittelte Transformation in den pTRV-NtNPR1-VIGS-Pflanzen exprimiert. Nach weiteren 48 Stunden wurden die Pflanzen mit 0,67 mM INA in 0,005 % Silwet besprüht. Abbildung 4.47 zeigt, dass XopJ in N. benthamiana eine hypersensitive Reaktion auslöste, wenn die Pflanzen mit INA behandelt wurden (obere Reihe: pTRV-GFPsil). Wurde das Protein NtNPR1 ausgeschaltet, löste XopJ eine HR aus, unabhängig davon ob die Pflanze mit INA behandelt worden war. Weder die katalytische noch die Myristoylierungsmutante von XopJ konnten den gleichen Effekt erzielen. Das Sp2-Fragment, die dominant-negative Mutante des A. thalianaSyntaxins 121, sollte keine HR auslösen und diente somit als Negativkontrolle für dieses Experiment (Leyman et al., 1999; Geelen et al., 2002; Tyrrell et al., 2007). Ein Auftreten der hypersensitiven Reaktion deutet meist auf das Vorhandensein eines Resistenz-Proteins (R-Protein) hin (Alfano und Collmer, 1997). Im Fall von XopJ wurde allerdings nur eine HR ausgelöst, wenn Salicylsäure bzw. INA auf die Pflanze appliziert wurde. Um die R-Protein-Abhängigkeit der HR näher zu untersuchen, wurden Komponenten der R-Protein-vermittelten HR über VIGS ausgeschaltet. SGT1 wurde ursprünglich als eine Untereinheit des SCF-Ubiquitin-Ligase-Komplexes in Hefe identifiziert (Kitagawa et al., 1999), der für die R-Protein-Stabilität benötigt wird (Azevedo et al., 2002). Außerdem konnte gezeigt werden, dass SGT1 mit RAR1 interagiert (Azevedo et al., 2002). Eine Mutation im EDS1-Gen (enhanced disease susceptibility) führt zu einem verstärkten Krankheitsbild (Parker et al., 1996). Im nächsten Schritt der Untersuchung zur Avirulenz von XopJ sollten sowohl NbSGT1 (Accession: AF494083) und NtRAR1 (Accession: AF480487) als auch NtEDS1 (Accession: AF480489) in N. benthamiana herunterreguliert werden (Liu et al., 2002). Dazu wurde erneut die Methode der 90 KAPITEL 4. ERGEBNISSE XopJ-myc XopJ C235A-myc XopJ G2A-myc Sp2-myc pTRV-SGT1 pTRV-EDS1 pTRV-RAR1 +INA -INA +INA -INA +INA -INA +INA -INA Abbildung 4.48: Studien zur Auslösung der hypersensitiven Reaktion (HR) nach Expression von XopJ-myc in pTRV-SGT1, pTRV-EDS1 und pTRV-RAR1-N. benthamiana. Nach Infiltration von ca. zwei Wochen alten N. benthamiana-Pflanzen mit Agrobakterien, die das jeweilige VIGS-Konstrukt enthielten, konnte sich der Tabak-Rattle-Virus assemblieren und in der Pflanze ausbreiten. Nach weiteren zwei Wochen wurden die Pflanzen mit Agrobakterien infiltriert, die die Konstrukte der Effektoren bzw. das Sp2-Fragment trugen. 48 Stunden nach Infiltration wurden die Pflanzen mit 67 mM INA behandelt. Nach einem weiteren Tag wurden die entstandenen HR-Symptome dokumentiert. Virus-induzierten Gen-Stilllegung angewandt. Anschließend wurden XopJ und seine Varianten sowie das Sp2-Fragment in den VIGS-Pflanzen exprimiert. Auf Abbildung 4.48 erkennt man, dass im Fall einer Herunterregulierung von SGT1 XopJ keine HR mehr auslösen konnte, unabhängig davon, ob die Pflanze mit INA behandelt wurde. Schaltete man dagegen RAR1 aus, reagierte die Pflanze auf XopJ, wenn diese mit INA besprüht wurde. Nach Herunterregulierung von EDS1 hingegen löste der Effektor, auch ohne INA-Behandlung, eine hypersensitive Reaktion aus. Um die Ausschaltung der Gene nachzuweisen, wurde RNA aus den VIGS-Pflanzen isoliert und diese in eine cDNA-Synthese mit anschließender RT-PCR eingesetzt (Abbildung 4.49). Abbildung 4.49 zeigt das Ergebnis der RT-PCR zur Untersuchung der VIGS-N. benthamianaPflanzen. Während die Gene in den jeweiligen VIGS-Pflanzen herunterreguliert waren, konnten diese in den pTRV-GFPsil-Kontroll-Pflanzen weiterhin über PCR mit genspezifischen Primern detektiert werden. Die gleichmäßigen Ubiquitinbanden zeigten sowohl gleiche cDNA-Mengen als auch eine sehr gute Qualität der cDNA an. 91 4.10. UNTERSUCHUNG DER AVIRULENZFUNKTION VON XOPJ EDS1 SGT1 RAR1 NPR1 750 bp 500 bp 250 bp Ubiquitin 750 bp 500 bp 250 bp Abbildung 4.49: Ergebnis der semi-quantitativen RT-PCR Zur Überprüfung der Herunterregulierung von EDS1, SGT1, NPR1 und RAR1 in N. benthamiana. Um die Herunterregulierung der Gene zu überprüfen, wurde RNA aus den Blättern isoliert, in cDNA umgeschrieben und mit den jeweiligen genspezifischen Primern eine RT-PCR durchgeführt. Zur Qualitätskontrolle wurden Ubiquitin-Primer eingesetzt. pTRV-SGT1 INA XopJ-myc XopJ C235A-myc XopJ G2A-myc Sp2-myc pTRV-GFPsil - - - - + +++ - - - - ++ + + + - + - + - + - + + - + - + - + + - - - +- -+ - -+ + - + - + - pTRV-RAR1 pTRV-RAR1 + + - + - + pTRV-EDS1 + + + - - + + + + - - - - INA XopJ-myc XopJ C235A-myc XopJ G2A-myc Sp2-myc + - + - + + - + - + - + - + - + + - + - + - + < 70 kDa < 70 kDa < 55 kDa < 55 kDa < 35 kDa < 35 kDa < 70 kDa < 55 kDa < 35 kDa pTRV-NPR1 Abbildung 4.50: Expressionsnachweis von XopJ-myc, XopJ C235A-myc, XopJ G2A-myc und Sp2-myc in pTRV-GFPsil-, pTRV-NPR1-, pTRV-SGT1-, pTRV-EDS1- und pTRV-RAR1N. benthamiana. Um die Expression der Effektoren und das Sp2-Fragment nachzuweisen, wurden Proben von den infiltrierten Blättern genommen und für eine Western Blot-Analyse aufbereitet. Der Blot erfolgte mit anti-myc-Antikörpern. 92 KAPITEL 4. ERGEBNISSE Zusammengefasst hing die Auslösung einer hypersensitiven Reaktion in N. benthamiana immer von einem katalytisch intakten XopJ und dessen Lokalisierung über den Myristinsäure-Rest ab. Des Weiteren war die beobachtete HR abhängig von SGT1, aber unabhängig von NPR1, RAR1 und EDS1. Dennoch war das Salicylsäure-Analogon INA oftmals nötig, um eine HR auszulösen. Im Fall von NPR1 und EDS1 war die HR sogar INA-unabhängig. Der Nachweis der Effektorbzw. Sp2-Expression erfolgte in einem Western Blot mit anti-myc-Antikörpern. Dazu wurden aus den infiltrierten VIGS-Blättern Proben entnommen. Diese wurden aufbereitet und auf ein Gel aufgetragen. Abbildung 4.50 zeigt, dass in allen infiltrierten pTRV-N. benthamiana-Pflanzen auch die Effektoren gleichmäßig exprimiert wurden. XopJ und seine Varianten zeigten sich bei über 55 kDa, wohingegen das Sp2-Fragment eine Größe von knapp über 35 kDa aufwies. 5 Diskussion Typ III-Sekretionssysteme (TTSS) sind zentral für die Virulenz vieler gramnegativer tier- und pflanzenpathogener Bakterien. Sie erlauben den direkten Transport bakterieller Proteine, der Typ III-Effektoren, in die eukaryotische Wirtszelle. Dort manipulieren die Effektoren zelluläre Prozesse und fördern so die Infektion und das Wachstum des Pathogens. Aufgrund ihrer funktionellen Redundanz ist der quantitative Beitrag einzelner Effektoren zur Virulenz eines Bakteriums relativ gering, was ihre funktionelle Analyse erschwert. Fortschritte beim Verständnis von Typ III-Effektorfunktionen von phytopathogenen Bakterien in den vergangenen Jahren zeigten, dass viele dieser Proteine enzymatische Aktivität besitzen. So wurden z.B. SUMO-Proteasen, CysteinProteasen, Phosphothreonin-Lyasen, E3-Ligasen, ADP-Ribosyltransferasen und Acetyltransferasen beschrieben (Shao et al., 2003; Mackey et al., 2003; Axtell und Staskawicz, 2003; Hotson et al., 2003; Roden et al., 2004; Abramovitch et al., 2006; Mukherjee et al., 2006; Fu et al., 2007; Rosebrock et al., 2007; Zhang et al., 2007b; Mittal et al., 2010; Tasset et al., 2010; Lee et al., 2012). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass viele dieser Proteine Komponenten des pflanzlichen Abwehrsystems zum Ziel haben und dadurch die Immunantwort abschwächen können. Aufgrund des evolutionären Drucks, sich gegen Pathogene zur Wehr zu setzen, sind in Pflanzen Resistenzproteine (R-Proteine) entstanden, welche bestimmte Typ III-Effektoren direkt oder indirekt erkennen können. In Folge dieser Erkennung wird eine hypersensitive Reaktion ausgelöst und dadurch eine verstärkte Immunantwort gegen ein bestimmtes Pathogen erzeugt (Jones und Dangl, 2006). Obwohl die Relevanz des Typ III-Sekretionssystems für die Virulenz offensichtlich ist und man im Moment davon ausgeht, dass die Mehrzahl der Typ III-Effektoren Komponenten der basalen Abwehr in Pflanzen zum Ziel hat, ist die Funktion einzelner Effektoren in vielen Fällen unklar. Ein 93 94 KAPITEL 5. DISKUSSION umfassendes Verständnis der Funktion einzelner Effektoren ist aber unerlässlich zum Verständnis sowohl von Virulenzmechanismen phytopathogener Bakterien als auch von Abwehrmechanismen der Pflanze. Diese neu gewonnenen Erkenntnisse können langfristig dazu beitragen, Strategien zur Erzeugung resistenterer Pflanzen zu entwickeln, eröffnet aber auch die Möglichkeit Typ IIIEffektorproteine als Werkzeuge zur Aufklärung und Umsteuerung zellulärer Prozesse in Pflanzen zu verwenden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Typ III-Effektor XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria umfassend funktionell charakterisiert. Dazu gehörten Untersuchungen zu seiner subzellulären Lokalisierung in Pflanzenzellen, die Identifikation möglicher Zielproteine in der Pflanze und die biochemische Charakterisierung seiner enzymatischen Aktivität. 5.1 XopJ wird über eine Myristoylierung mit der Plasmamembran assoziiert Nach der Translokation von Effektoren in das Zytosol der Pflanze kann das Zielkompartiment verschiedener Effektoren in der Wirtszelle sehr vielfältig sein. So konnten bereits einige Effektoren im Zellkern der Pflanzenzelle lokalisiert werden. Dazu zählen z.B. XopD und TAL (transcription activator-like)-Effektoren wie AvrBs3 aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) (Van den Ackerveken et al., 1996; Hotson et al., 2003). AvrXv4 aus Xcv ist im Zytoplasma der Pflanzenzelle lokalisiert (Roden et al., 2004), wohingegen HopI1 aus Pseudomonas syringae in der Wirtszelle zu den Chloroplasten dirigiert wird (Jelenska et al., 2007). Die Lokalisierung von HopM1 aus Pseudomonas syringae konnte bereits von Nomura et al. (2011) dem trans-Golgi-Netzwerk zugeordnet werden. Auch die Plasmamembran in Pflanzenzellen beherbergt während einer Infektion einige Effektoren, wie z.B. AvrPto, HopF2 und HopZ1a aus Pseudomonas syringae (Shan et al., 2000; Robert-Seilaniantz et al., 2006; Lewis et al., 2008). In Abschnitt 4.1 konnte nach transienter, Agrobakterien-vermittelter Expression von XopJ-GFP in Nicotiana benthamiana gezeigt werden, dass dieser Effektor in oder an der Plasmamembran lokalisiert ist (Abbildung 4.1). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit bereits publizierten Lokalisierungsstudien von Thieme et al. (2007), die ebenfalls zeigen konnten, dass XopJ an der Plasmamembran verankert ist. In silico-Analysen konnten keine Transmembrandomänen in der Aminosäuresequenz von XopJ aufdecken. Allerdings weist das Protein mehrere mögliche Myristoylierungsstellen auf, unter anderem am Glycin der Position 2 der Aminosäuresequenz (Thieme et al., 2007). Tatsächlich weisen die ersten sieben Aminosäuren (MGLCVSK) von XopJ die idealen theoretischen Voraussetzungen für eine Myristoylierung auf (Farazi et al., 2001). Myristoylierung ist nicht nur für die subzelluläre Lokalisierung eine wichtige posttranslationale Modifikation, sondern kann auch die Proteinstabilität beeinflussen (Kataoka et al., 1993; Resh, 1996). Üblicherweise werden bakterielle Proteine nicht myristoyliert, da Bakterien das Enzym N-Myristoyltransferase (NMT) fehlt (Maurer-Stroh und Eisenhaber, 2004). Das bedeutet, dass bakterielle Effektorproteine während einer Infektion von den N-Myristoyltransferasen des Wirtes modifiziert werden müssen. Typ III-Effektoren ah- 5.1. XOPJ WIRD ÜBER EINE MYRISTOYLIERUNG MIT DER PLASMAMEMBRAN ASSOZIIERT 95 men somit nicht nur eukaryotische Proteinfunktionen nach, sondern benötigen auch die zelluläre Maschinerie des Wirtes, um an den Wirkort zu gelangen. Myristoylierungen machen Proteine hydrophober und erhöhen damit die Wahrscheinlichkeit, dass Proteine mit der Plasmamembran oder mit Endomembranen in Interaktion treten. Dennoch sind Membranlokalisierungen von einfach modifizierten Proteinen sehr unspezifisch und instabil (Resh, 2006). Nach einer Mutation des Glycins an Position 2 zu Alanin, verlagerte sich die Lokalisierung von XopJ teilweise von der Plasmamembran in das Zytosol (Abbildung 4.1 e). Dieses Ergebnis konnte durch subzelluläre Fraktionierung der Pflanzenproteine mit anschließendem Western Blot bestätigt werden (Abbildung 4.2). Hier zeigte sich eine gleichmäßige Verteilung von XopJ G2A-GFP in der Membran- und Zytosolfraktion. Da einige Zielproteine für Pseudomonas syringaeEffektoren an bzw. in der Plasmamembran lokalisiert sind, wie z.B. der PAMP-Rezeptor FLS2 (Nimchuk et al., 2000; Shan et al., 2000; Xiang et al., 2008), könnte XopJ durch eine Interaktion mit einem plasmamembranständigen Protein teilweise in der Membranfraktion zurückgehalten werden. Interessanterweise trat XopJ auf den GFP-Western Blots der Fraktionierungen immer als Doppelbande auf, was wiederum auf posttranslationale Modifikationen des Effektors hinweisen könnte (Abbildungen 4.2 und 4.4). Neben einer Myristoylierung oder der Interaktion eines Membranproteins könnte eine zusätzliche posttranslationale Modifikation für die Verankerung von XopJ an der Membran verantwortlich sein. Oftmals reicht eine posttranslationale Modifizierung nicht aus, ein Protein stabil in der Plasmamembran zu halten. Deshalb sind myristoylierte oder prenylierte Proteine oft noch zusätzlich palmitoyliert (Resh, 2006). Palmitoyltransferasen (PAT) sind integrale Membranproteine der Plasmamembran und/oder Endomembranen (Hemsley und Grierson, 2008), die mit membranständigen, bereits myristoylierten Proteinen interagieren können. Durch eine Myristoylierung wird demnach die Wahrscheinlichkeit erhöht noch zusätzlich durch eine PAT palmitoyliert zu werden (Resh, 2006). Solch eine Modifizierung macht das Protein sehr hydrophob und die kinetische Dissoziationskonstante wird derart erniedrigt, dass eine Dissoziation von der Plasmamembran des doppelt-modifizierten Proteins sehr unwahrscheinlich ist (Resh, 2006). Hierbei spricht man von einer „kinetischen Falle“ (Resh, 2006). Thioesterbindungen, die bei Palmitoylierungen entstehen, können auch wieder gespalten werden, was Palmitoylierungen zu sehr dynamischen Modifikationen macht. Doppelt modifizierte Proteine sind oft in Lipid Rafts innerhalb von Membranen lokalisiert (Resh, 2006; Maurer-Stroh und Eisenhaber, 2004). Am Cystein der Position 4 zeigte sich nach in silico-Analysen mit der Internet-Datenbank CSSPalm (http://csspalm.biocuckoo.org/prediction.php; abgerufen im Mai 2007; Zhou et al. (2006); Xue et al. (2011); Ren et al. (2008)) eine mögliche Palmitoylierungsstelle für XopJ. Nach Mutation dieses Cysteins in Alanin änderte sich teilweise die Lokalisierung von der Plasmamembran in das Zytosol und in vesikelartige Strukturen (Abbildung 4.3). Diese lassen darauf schließen, dass die Palmitoylierung im Golgi-Apparat stattfinden könnte (Hemsley und Grierson, 2008), wenn die Palmitoylierungsstelle nicht inhibiert wäre. Somit würde XopJ nachdem es myristoyliert wurde noch zusätzlich im oder am Golgi-Apparat palmitoyliert werden (Hemsley und Grierson, 2008; Resh, 2006). Dies konnte bereits für einige Proteine aus Säugetieren, wie z.B. der Stickstoffmonoxid-Synthase, gezeigt werden (Resh, 2006). Gegen diese Hypothese spricht allerdings, dass von 96 KAPITEL 5. DISKUSSION Xanthomonas campestris pv. vesicatoria translozierte Effektoren in der Pflanze nicht über den sekretorischen Weg zur Plasmamembran transportiert werden, sondern die Proteine in das Zytosol transloziert werden. Von dort aus gelangen die Effektoren dann in die Zielkompartimente der Wirtszelle. Des Weiteren ist bisher nicht belegt worden, ob XopJ tatsächlich palmitoyliert wird. Neben XopJ besitzen viele weitere Typ III-Effektoren eine mögliche Myristoylierungsstelle. So konnten Thieme et al. (2007) zeigen, dass auch XopE1, XopE2 aus Xcv und HopZ2 aus Pseudomonas syringae eine Signalsequenz für eine Myristoylierung am Glycin der Position 2 tragen. Auch die Pseudomonas-Effektoren HopZ1a und HopF2 benötigen einen Myristat-Rest am Glycin 2, um an der Plasmamembran verankert zu werden (Robert-Seilaniantz et al., 2006; Lewis et al., 2008). Das deutet darauf hin, dass die Plasmamembran ein essentielles Ziel für Effektoren zu sein scheint. Xiang et al. (2008) konnten zeigen, dass der membranständige Immunrezeptor FLS2 das Virulenzziel des Typ III-Effektors AvrPto aus Pseudomonas syringae ist. Um eine Krankheit auslösen zu können, muss der Effektor zu seinem Virulenzziel gelangen. Eine Myristoylierung hilft, den Effektor an die Plasmamembran und zu seinem Virulenzziel zu dirigieren. Neben AvrPto ist FLS2 auch das Virulenzziel für AvrPtoB, das eine E3-Ligase darstellt und den Rezeptor für den proteasomalen Abbau markiert (Göhre et al., 2008). Auch einige R-Proteine, wie z.B. Pto aus Tomaten, gelten als myristoyliert (Vries et al., 2006). An den Beispielen der Myristoylierung von AvrPto und Pto zeigt sich das molekulare „Wettrüsten“ im Laufe der Evolution. Da der Effektor an der Plasmamembran lokalisiert ist, muss auch das R-Protein dorthin dirigiert werden. Die Plasmamembran ist nicht nur eine Schnittstelle und Berührungspunkt zwischen Pathogenen und Pflanze, sondern beherbergt auch die Proteine, die den ersten Kontakt zu den Pathogenen herstellen und die Signaltransduktion der Abwehr einleiten. Um die Erkennung und die Abwehr effektiv zu umgehen, müssen Pathogene wahrscheinlich eine Reihe membranständiger Effektoren bereit stellen, die an der Plasmamembran der Pflanze verankert werden können. Aber nicht nur die Erkennung von PAMPs ereignet sich an der Plasmamembran, sondern auch die Sekretion und Exozytose von antimikrobiellen Proteinen findet hier statt (Robatzek, 2007). Viele Proteine in Arabidopsis thaliana sind als myristoyliert identifiziert worden (Boisson et al., 2003). Unter ihnen befinden sich sowohl die Proteasomuntereinheit RPT2 (Kimura et al., 2003) als auch Komponenten der Abwehr, wie z.B. Resistenzproteine (R-Proteine) der NBS-LRR-Familie (Boisson et al., 2003). Neben der Plasmamembranlokalisierung von XopJ konnte auch eine teilweise Kolokalisierung mit einem Golgimarker gezeigt werden (Abbildung 4.1 b), was allerdings nicht auf eine katalytisch inaktive Mutante von XopJ zutraf (Abbildung 4.1 d). Das würde bedeuten, dass das Virulenzziel von XopJ entweder an der Plasmamembran oder in den Endomembranen der Pflanzenzelle lokalisiert ist. Aufgrund der vorliegenden Daten der Fraktionierungen kann bisher allerdings nicht klar zwischen einer Lokalisierung an der Plasma- und Endomembran unterschieden werden (Abbildung 4.2). 5.2. XOPJ INHIBIERT DEN VESIKELTRANSPORT IN NICOTIANA BENTHAMIANA 5.2 97 XopJ inhibiert den Vesikeltransport in Nicotiana benthamiana Ein Resultat der basalen Abwehr in Pflanzen gegen Pilze und Bakterien ist die Neusynthese und Ablagerung von Kallose zwischen Zellwand und Plasmamembran (Aist, 1976; Brown et al., 1995). Diese Verdickung der Zellwand setzt die Sekretion von Zellwandbausteinen und/oder Zellwandsyntheseenzymen voraus. Während einer Infektion mit Pilzen oder Oomyzeten konnte bereits eine Zellpolarisation zur Infektionsstelle hin beobachtet werden. Bei dieser wird das Aktinzytoskelett und Organellen, wie das ER, der Golgi-Apparat, der Zellkern, Peroxisomen und andere vesikelartige Strukturen zur Infektionsstelle dirigiert (Schmelzer, 2002; Takemoto et al., 2003; Koh et al., 2005). Die Inhibierung des Vesikeltransports durch XopJ war abhängig von einer intakten katalytischen Triade und eines funktionalen Myristoylierungsmotives. Dieser Effekt steht ebenfalls im Einklang mit der Beobachtung, dass XopJ mit seinem vermeintlichen Virulenzziel nur mit einer intakten katalytischen Triade interagieren kann (Abschnitt 5.3). In Pflanzenzellen wird der Vesikeltransport und die Exozytose des Vesikelinhalts über SNAREProteine (soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein (SNAP) receptor) gesteuert (Söllner et al., 1993; McNew et al., 2000). Dabei sind die t-SNAREs und Syntaxine an der Zielmembran lokalisiert und die v-SNAREs an den Transportvesikeln (McNew et al., 2000). Neben den t-SNAREs und Syntaxinen sind auch die SNAP-Proteine an der Zielmembran lokalisiert (Söllner et al., 1993). So konnte bereits gezeigt werden, dass das Arabidopsis Syntaxin PEN1 (SYP121) nach Infektion mit Mehltau an der Plasmamembran akkumuliert (Kwon et al., 2008). Kalde et al. (2007) konnten zeigen, dass das Syntaxin NbSYP132 sowohl zur basalen Abwehr, durch Sekretion von PR-1, und zur systemischen Resistenz als auch zur R-Protein-vermittelten Resistenz in N. benthamiana beiträgt (Kalde et al., 2007). Somit scheint der Vesikeltransport eine entscheidende Komponente der pflanzlichen Abwehr und damit ein geeignetes Ziel für Effektoren zu sein, um mit der Wirtsabwehr zu interagieren und diese zu unterdrücken (Nühse et al., 2003; Wang et al., 2005; Nomura et al., 2006; Kalde et al., 2007; Hückelhoven, 2007; Robatzek, 2007; Nomura et al., 2011). Tatsächlich konnte auch eine Inhibierung der Sekretion und Kalloseablagerungen durch einen Typ III-Effektor aus Pseudomonas syringae, HopM1, gezeigt werden. HopM1 interagiert mit dem ARF-GEF-Protein (ADP ribosylation factor guanine nucleotide exchange factor) AtMIN7 und leitet den proteasomalen Abbau dieses für die Sekretion wichtigen Proteins ein (Nomura et al., 2006, 2011). ARF-GEF-Proteine sind Regulatoren für den intrazellulären Vesikeltransport (Donaldson und Jackson, 2000). Des Weiteren zeigte sich, dass sowohl HopM1 als auch AtMIN7 im transGolgi-Netzwerk und in den Endosomen lokalisiert sind. Genau wie NbSYP132 spielt auch AtMIN7 während der basalen, der Salicylsäure-vermittelten und der Effektor-vermittelten Abwehr eine entscheidende Rolle (Nomura et al., 2011). Neben der Inhibierung des Vesikeltransports in N. benthamiana (Abschnitt 4.2), löste XopJ auch eine hypersensitive Reaktion (HR) in der Pflanze aus, wenn diese mit Salicylsäure behandelt wurde (Abschnitt 4.10). Wang et al. (2005) konnten zeigen, dass es nach Inhibierung des sekretorischen Signalwegs und Auslösen der Abwehr durch Salicylsäure bzw. durch das Salicylsäure- 98 KAPITEL 5. DISKUSSION Analogon INA zum Gewebekollaps kam. Durch Salicylsäure/INA wird die systemische Abwehr der Pflanze ausgelöst, was zur vermehrten Expression von PR-Proteinen führt. Diese können durch die Unterdrückung der Sekretion allerdings nicht mehr in den Apoplasten transportiert werden und akkumulieren im Zytosol. Deshalb kommt es zur einer HR-ähnlichen Reaktion (UPR: unfolded protein response), was zum Gewebekollaps führt (Wang et al., 2005). Durch die Inhibierung der Sekretion durch XopJ und nach Auslösung der systemischen Abwehr durch das Salicylsäureanalogon INA kam es ebenfalls zu HR-Symptomen. Diese Symptome könnten auch auf eine UPR zurückzuführen sein (Abbildung 4.47). Dagegen spricht allerdings der Verlust der HR-Symptome nach Herunterregulierung von SGT1 (Abbildung 4.48 und Abschnitt 5.7). Ist SGT1 in der Zelle nicht mehr vorhanden, kann keine HR mehr stattfinden, da dieses Protein eine essentielle Komponente der R-Protein-vermittelten hypersensitiven Reaktion darstellt (Azevedo et al., 2002; Zeng et al., 2006). Ob es sich bei den beobachteten Symptomen tatsächlich um eine hypersensitive Reaktion (HR) handelte, müssen zukünftige Experimente, wie z.B. eine qPCR auf HR-Markergene (Hsr201 (Üstün et al., 2012); HIN1 (Pontier et al., 1999)) zeigen. Die Inhibierung des Vesikeltransports durch XopJ war spezifisch für den Proteintransport zur Plasmamembran und in den Apoplasten. Der Transport zur Vakuole blieb dabei unbeeinträchtigt (Abbildung 4.7). Das Syntaxin PEN1 aus A. thaliana bildet zusammen mit AtSNAP33 und VAMP721/722 einen ternären SNARE-Komplex an der Penetrationsstelle. Daraus kann geschlossen werden, dass dieser Komplex für die Verstärkung der Zellwand an der Infektionsstelle maßgebend ist (Kwon et al., 2008; Yun et al., 2008). Damit zeigt sich auch, dass für jedes Kompartiment andere SNARE-Proteine für den Vesikeltransport verantwortlich sind. Diese Daten deuteten darauf hin, dass XopJ mit Proteinen interagieren könnte, die für den Vesikeltransport zur Plasmamembran verantwortlich sind. XopJ verhinderte während der Pathogenese die Bildung der zellwandverstärkenden Ablagerung von Kallose, was normalerweise ein essentieller Bestandteil der basalen Abwehr darstellt. Eine verminderte Kalloseablagerung nach Infektion konnte bereits dem Typ III-Effektor HopM1 aus Pst DC3000 zugeschrieben werden, der mit dem ARF-GEF-Protein AtMIN7 interagiert und ebenfalls die Sekretion der Pflanze hemmt (Nomura et al., 2006, 2011). Daraufhin stellte sich die Frage, ob die Reduktion der Kallosemenge auf die Inhibierung des Vesikeltransportes zurückzuführen ist oder ob XopJ auch die Signaltransduktion nach PAMP-Erkennung inhibieren kann, wie es z.B. bereits für HopAl1 aus Pseudomonas syringae, der die MAP Kinasen MPK3 und MPK6 dephosphoryliert, und AvrPto, der direkt den Rezeptor der PAMP-Erkennung inhibiert, gezeigt werden konnte (Zhang et al., 2007b; Xiang et al., 2008). In transgenen EtOH-xopJ-ArabidopsisPflanzen wirkte sich die Expression von XopJ nach Ethanol-Induktion nicht auf den Phosphorylierungsstatus der MAP Kinasen nach Elizitorbehandlung aus (Abbildung 4.10). Damit zeigte sich, dass XopJ wahrscheinlich keinen Einfluss auf die PAMP-vermittelte Signaltransduktion ausübt. Auch für den Pseudomonas syringae-Effektor HopZ1a konnte eine Inhibierung der Proteinsekretion in den Apoplasten nachgewiesen werden (siehe Abbildung 4.13). Da HopZ1a - genauso wie XopJ - zur YopJ-Familie der Typ III-Effektoren zählt, könnte die Inhibierung des Vesikeltransports ein in der Evolution konserviertes Virulenzziel von Typ III-Effektoren phytopathogener Bakterien darstellen. Lee et al. (2012) beschreiben, dass HopZ1a das Tubulinnetzwerk in der Wirtszelle 5.3. DIE PROTEASOMUNTEREINHEIT RPT6 IST EIN MÖGLICHES ZIELPROTEIN VON XOPJ IN PFLANZENZELLEN 99 zerstört. Somit nutzt dieser Effektor wahrscheinlich einen anderen Mechanismus um die Proteinsekretion zu inhibieren als XopJ (Lee et al., 2012). Auch bei HopZ1a war die Fähigkeit die Proteinsekretion zu stören abhängig von einer intakten katalytischen Triade. Anders als bei XopJ war hier allerdings die Inhibierung der Sekretion nicht abhängig vom Myristoylierungsstatus und damit von der Lokalisierung des Effektors. Diese Erkenntnis steht allerdings im Widerspruch zu Lewis et al. (2008), die eine Notwendigkeit der Myristoylierung von HopZ1a sowohl für die Virulenz- als auch für die Avirulenzfunktion postulieren. 5.3 Die Proteasomuntereinheit RPT6 ist ein mögliches Zielprotein von XopJ in Pflanzenzellen In Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterungen (Abschnitt 4.3.1) wurden vier verschiedene, mögliche Interaktionspartner identifiziert, darunter auch RPT6, das eine Untereinheit des regulatorischen Komplexes des 26 S-Proteasoms repräsentiert. Das 26 S-Proteasom aus Eukaryoten besteht aus einer 20 S- und zwei 19 S-Untereinheiten, die an den beiden Enden des 20 S-Partikels assemblieren. Der 20 S-Komplex ist die proteolytische Untereinheit und besteht aus 14 α- und 14 β-Untereinheiten, die jeweils in zwei Ringen mit je 7 Untereinheiten mit der Anordnung αββα arrangiert sind, so dass eine zylinderförmige Struktur entsteht (Coux et al., 1996). In der Hefe (Saccharomyces cerevisiae) bestehen die 19 SUntereinheiten aus jeweils mindestens 17 Proteinen, sechs davon sind AAA-ATPasen (RPT). Die anderen 11 Proteine haben keine ATPase-Aktivität und werden als RPN-Untereinheiten bezeichnet (Glickman et al., 1998). In Reis konnten ebenfalls 11 RPN- und 6 RPT-Proteine identifiziert werden (Shibahara et al., 2004). Unter Hydrolyse von ATP assemblieren die 19 S- und die 20 S-Untereinheiten zum 26 S-Proteasom (Coux et al., 1996). RPT6 ist eine der sechs AAA-ATPasen der 19 S-Untereinheit. Die Funktion der 19 S-Untereinheit besteht hauptsächlich in der ATP-Hydrolyse für die Assemblierung des 26 SProteasoms und die Regulierung der proteolytischen Aktivität des 26 S-Proteasoms. Des Weiteren wird den ATPasen eine Chaperon-ähnliche Funktion zugeschrieben, die Ubiquitin-markierte Proteine entfaltet, dabei die Ubiquitinkette abspaltet und die zum Abbau bestimmten Proteine durch einen Kanal zur 20 S-Untereinheit führt (Coux et al., 1996). Generell weisen alle AAA-ATPasen eine unterschiedliche Funktion auf (Latterich und Patel, 1998). Von einigen ATPase-Untereinheiten existieren sowohl in Arabidopsis als auch in Reis zwei Isoformen (RPT1, RPT2, RPT4 und RPT5). In Arabidopsis liegt auch RPT6 (AtRPT6a (At5g19990) und AtRPT6b (At5g20000)) in duplizierter Form vor (Shibahara et al., 2004). Die 19 S-Untereinheit kann noch weiter in einen Deckel und eine Basis unterteilt werden. RPT6 befindet sich, wie alle ATPase-Untereinheiten in der Basis der 19 S-Untereinheit (Shibahara et al., 2004). Basierend auf der Intensität der Blaufärbung im LacZ-Filter-Test scheint die Interaktion zwischen RPT6 und XopJ G2A wesentlich schwächer zu sein als die zwischen XopJ G2A und den anderen gefundenen Interaktionspartnern (Arginin-Methyltransferase, XIP1 und Insulinase; Ab- 100 KAPITEL 5. DISKUSSION bildung 4.14). Aufgrund der Tatsache, dass RPT6 als einziger möglicher Interaktionspartner sowohl aus der Tabakbank als auch aus der Arabidopsis cDNA-Bank identifiziert werden konnte, wurde die Interaktion zwischen XopJ G2A und RPT6 näher untersucht. XopJ G2A interagierte sowohl mit AtRPT6a und AtRPT6b als auch mit RPT6 aus Tabak (Abbildung 4.16). In Sequenzvergleichen wurde die Konservierung der RPT6-Sequenz zwischen den Spezies deutlich. Tatsächlich beschreiben Glickman et al. (1998), dass die AAA-ATPasen der 19 SUntereinheit zwischen den Spezies höher konserviert sind als die RPN-Untereinheiten. Obwohl die Homologie der RPT6-Proteine zwischen den Spezies sehr hoch ist, konnte keine Interaktion von XopJ mit dem RPT6-Protein aus Hefe festgestellt werden. Wahrscheinlich ist nur ein kleiner Abschnitt für die Interaktion zuständig, der im Hefe-Protein keine Ähnlichkeit zu den Tabak- oder Arabidopsis-Homologen aufweist. Im Rahmen einer Untersuchung zum Einfluss von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Typ III-Effektoren auf das Hefewachstum konnten Salomon et al. (2011) zeigen, dass sich die Expression von XopJ nicht auf die Überlebensfähigkeit und das Zellwachstum von Hefe auswirkt. Eine Verringerung der Proteasomaktivität in der Hefe durch XopJ war aufgrund der fehlenden Interaktion mit dem endogenen Hefe-RPT6 nicht zu erwarten, wodurch auch keine Auswirkungen auf das Zellwachstum zu vermuten waren. Die Interaktion zwischen XopJ G2A und RPT6 sowohl aus Tabak als auch aus Arabidopsis war in Hefe abhängig von einer intakten katalytischen Triade des Effektorproteins (Abbildung 4.16). Diese Daten deuteten darauf hin, dass der Effektor katalytisch aktiv sein muss, um stabil mit seinem Zielprotein zu interagieren. Um die Interaktion auch in der Pflanze zu untersuchen, wurde die Methode der Bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) angewandt. Dabei konnte gezeigt werden, dass XopJ mit RPT6 an der Plasmamembran interagierte (Abbildung 4.19 a bis c). Im Gegensatz zur Interaktion in Hefe war die Interaktion in Tabakblättern unabhängig von einer intakten katalytischen Triade. Auch XopJ C235A interagierte mit RPT6 an der Plasmamembran (Abbildung 4.19 d und e). Die Nachteile der Methode der Bimolekularen Fluoreszenzkomplementation sind durch die irreversible Stabilisierung von transienten Interaktionen allein durch die räumliche Nähe der Fluorophoren gekennzeichnet. Wenn die beiden YFP-Hälften einmal in direkter Nähe zueinander kommen, fluoresziert das YFP-Protein. Diese Interaktion ist dann so stabil, dass sie nicht mehr rückgängig gemacht werden kann (Kerppola, 2009). Andererseits könnte die Interaktion zwischen XopJ G2A C235A und RPT6 in der Hefe zwar vorhanden, aber so schwach gewesen sein, dass sie nicht mehr detektierbar war. Ob die katalytische Mutante von XopJ noch mit RPT6 interagieren kann, muss in Zukunft durch weitere Experimente, wie z.B. Koimmunpräzipitationen, geklärt werden. Die Interaktion der Myristoylierungsmutante XopJ G2A mit RPT6 fand im Zytosol statt (Abbildung 4.19 f und g). Die Interaktion von XopJ und RPT6 konnte auch in Koimmunpräzipitationsexperimenten bestätigt werden (Abbildung 4.20). Dennoch kann in Abbildung 4.20 (unterer Blot) beobachtet werden, dass während der Koimmunpräzipitation über eine GFP-gekoppelte Matrix auch XopJ-myc alleine eluiert werden konnte. Allerdings war die Affinität von XopJ-myc zur GFPgekoppelten Matrix viel geringer als die von XopJ-myc zu RPT6-GFP. Entgegen der Interaktionsstudien in Tabak, sagt die Internet-Plattform SUBA (http://suba.plantenergy.uwa.edu.au/flatfile.php?id=AT5G19990.1; abgerufen im Juni 2012; Heazlewood et al. 5.3. DIE PROTEASOMUNTEREINHEIT RPT6 IST EIN MÖGLICHES ZIELPROTEIN VON XOPJ IN PFLANZENZELLEN 101 (2005, 2007)) die Lokalisierung von RPT6, gemäß der Lokalisierung des Proteasoms (Coux et al., 1996) im Zytosol und im Zellkern voraus. Tatsächlich ergaben Lokalisierungsstudien mit GFPmarkiertem RPT6 eine zytosolische oder Plasmamembranlokalisation, je nachdem, ob das GFP N- oder C-terminal an RPT6 fusioniert wurde (Abbildung 4.17). Kolokalisierungsstudien von RPT6-GFP mit XopJ-mCherry zeigten eine eindeutige Kolokalisierung an der Plasmamembran (Abbildung 4.17). Einzelne Untereinheiten des 19 S-Komplexes haben neben der Regulierung des Proteinabbaus noch zusätzliche Funktionen in anderen zellulären Prozessen. Zum Beispiel können RPT3 und RPT6 nicht nur beim Proteinabbau im Proteasom mitwirken, sondern auch als Transkriptionsaktivatoren dienen (Gonzalez et al., 2002; von der Lehr et al., 2003). Somit wäre es vorstellbar, dass RPT6 noch eine nicht-proteasomale Funktion an der Plasmamembran ausüben könnte. Eine andere Hypothese schließt die Rekrutierung von RPT6 durch XopJ zur Plasmamembran ein. Um diese These zu überprüfen, wurde die Kolokalisierung von RPT6-GFP und XopJ-mCherry zusätzlich durch subzelluläre Fraktionierungen untersucht. Das Ergebnis der Fraktionierung deutete allerdings keinen Einfluss von XopJ auf die Lokalisierung von RPT6 an (Abbildung 4.18). So befand sich RPT6 jeweils in der Membranfraktion. Dies steht im Widerspruch zu der Lokalisierung einer anderen 19 S-Untereinheit, RPN1a, aber im Einklang mit den Kolokalisierungsstudien mit XopJ-mCherry. Die Lokalisierung von RPN1a konnte sowohl im Zytosol als auch im Zellkern detektiert werden (Yao et al., 2012). Dennoch konnte die Proteasomuntereinheit RPT2a sowohl in Hefe als auch in Reis als am N-Terminus myristoyliert identifiziert werden, was wiederum für die Möglichkeit einer Membranlokalisierung zumindest einer Subpopulation des Proteasoms spricht (Shibahara et al., 2002; Kimura et al., 2003). Neben RPT6 konnten noch drei weitere Proteine in der Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterung der Tabakbank identifiziert werden. Darunter befand sich ein Homolog der Arabidopsis ArgininMethyltransferase-Familie. Die Methyltransferase AtPRMT1b (At4g29510), die den höchsten Treffer nach einem Protein-Blast mit Hilfe der Arabidopsis-Datenbank (http://www.arabidopsis.org; abgerufen am 5. Juli 2012) ergab, ist im Zellkern und im Zytosol lokalisiert. Sie methyliert die Histone H4 und H2A in vitro und ist deshalb essentiell für die Transkriptionsaktivität. Des Weiteren interagiert dieses Enzym mit einer RNA-Methyltransferase (Yan et al., 2007). Unter den möglichen Interaktionspartnern befand sich auch ein Homolog zu einer Insulinase der PeptidaseFamilie M16. Diese zeichnet sich durch die Fähigkeit aus, Metallionen binden zu können. Wahrscheinlich ist dieses Protein an der Proteolyse beteiligt (http://www.arabidopsis.org/servlets/Tair Object?id=33669&type=locus; Lokus:At2g41790; abgerufen am 5. Juli 2012). Des Weiteren wurde noch ein Protein mit unbekannter Funktion gefunden. Der beste Blast-Treffer in der Arabidopsis-Datenbank (http://www.arabidopsis.org; abgerufen am 5. Juli 2012) ergab eine Zuordnung zum Lokus At5g64180. Von diesem Protein ist bisher nichts bekannt. Ob diese drei möglichen, gefundenen Interaktionspartner an Abwehrprozessen in Pflanzen beteiligt sind, müssen zukünftige Studien zeigen. 102 5.4 KAPITEL 5. DISKUSSION Das Ubiquitin-Proteasom-System als Virulenzziel für Typ III-Effektoren Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist die Hauptkomponente einer eukaryotischen Zelle, um falsch gefaltete Proteine abzubauen. Darüber hinaus regelt die Proteasomaktivität unter anderem den Proteinabbau während des Zellzyklus, des Vesikeltransports und während der Signaltransduktion. Ein gleichartiges proteinabbauendes System konnte in Prokaryoten bisher nicht identifiziert werden (Perrett et al., 2011). Neben der Aufrechterhaltung der normalen Zellfunktionen sind einige Komponenten des UPS auch an der Abwehr beteiligt. So konnte gezeigt werden, dass nach Infektion von Paprika mit dem Xcv-Stamm 85-10 die Proteasomaktivität stark erhöht war. Für diese Beobachtung gibt es zwei Interpretationsmöglichkeiten. Entweder die Erhöhung der Proteasomaktivität stellt ein Abwehrmechanismus dar oder Xcv besitzt Effektoren, die die Proteasomaktivität erhöhen können. Die Ergebnisse auf Abbildung 4.28 deuteten darauf hin, dass es sich bei der Aktivierung des Proteasoms in erster Linie um ein Merkmal der basalen Abwehr handelte, da die Xcv ∆hrpB1-Mutante, welche nicht mehr in der Lage war, Effektoren in die Pflanze zu translozieren, ebenfalls die Aktivität des Proteasoms signifikant um 19 % erhöhte. Diese Beobachtung deckte sich mit der erhöhten Expression von einzelnen Proteasomuntereinheiten nach Induktion der basalen Abwehr durch Elizitorzugabe (Dahan et al., 2001; Suty et al., 2003). Fehlte dem Bakterium der Effektor XopJ, so war die Aktivität um ca. 10 % höher als nach Infektion mit dem Wildtyp-Bakterium. XopJ scheint also einer erhöhten Proteasomaktivität während der basalen Abwehr entgegenzuwirken. Der Unterschied der Proteasomaktivität zwischen Xcv- und Xcv ∆hrpB1-infizierten Blättern deutete darauf hin, dass die Erhöhung der Proteasomaktivität nicht nur ein Effekt der basalen Abwehr war, sondern, dass Xcv auch Effektoren besitzen muss, die die Proteasomaktivität erhöhen können, um mögliche positive Regulatoren der Abwehr abzubauen. Das qRT-PCR-Ergebnis verdeutlichte außerdem, dass das RPT6-Gen durch PAMPs induziert werden kann (Abbildung 4.29). Dadurch, dass die Proteasomaktivität während einer Infektion stark erhöht ist, besteht die Funktion von XopJ möglicherweise darin, den eigenen Abbau oder den Abbau anderer bakterieller Proteine durch das Proteasom zu verhindern. Der Yersinia enterocolitica-Effektor YopE wird durch das Wirts-UPS ubiquitiniert und vom Proteasom abgebaut (Ruckdeschel et al., 2006), was als Schutzmechanismus für den Wirt und als Erkennung durch eine sehr rudimentäre Form von Immunsensoren interpretiert werden kann (Vierstra, 2009). Außerdem trägt die Aktivierung des Proteasoms auch zur Wachstumshemmung von Salmonella enterica im Zytosol von infizierten Zellen bei (Perrin et al., 2004). Eine Erhöhung der Proteasomaktivität kann auch durch exogene Applikation von Benzothiadiazol (BTH), einem Salicylsäure-Analogon, auf Arabidopsis-Blätter erreicht werden. Das Besprühen der Pflanze mit BTH ahmt die systemische Resistenz nach, die wiederum abhängig von NPR1 ist, was darauf hindeutet, dass der Salicylsäure-abhängige Signalweg für eine Erhöhung der Proteasomaktivität verantwortlich ist (Gu et al., 2010). Neben dem Proteasom selbst, sind auch andere Komponenten des UPS an der Abwehr der Pflanzen beteiligt, unter anderem E3-Ubiquitin-Ligasen (Zeng et al., 2006). In Paprika werden bei inkompatiblen Interaktionen mit Xcv z.B. die RING-Finger-Ubiquitin-Ligase CaRING1 induziert. CaRING1 ist ein 5.4. DAS UBIQUITIN-PROTEASOM-SYSTEM ALS VIRULENZZIEL FÜR TYP III-EFFEKTOREN 103 membranständiges Protein und dessen Expression führt zu einer erhöhten Menge an ungebundener Salicylsäure verbunden mit einer erhöhten Transkription von PR-1 und hypersensitivem Zelltod. Somit scheint CaRING1 ein positiver Regulator des Zelltodes zu sein (Lee et al., 2011). Die U-Box E3-Ligasen PUB12 und PUB13 interagieren mit FLS2 nach Stimulierung mit flg22. Dies führt zum Abbau von FLS2 und mildert so die PAMP-vermittelte Abwehr in Pflanzen ab. Daraus lässt sich schließen, dass PUB12 und PUB13 negative Regulatoren der pflanzlichen Abwehr darstellen (Lu et al., 2011). Sind sowohl PUB22 und PUB23 als auch PUB24 in Arabidopsis ausgeschaltet, so können Pathogene sich nicht mehr vermehren, was auf eine erhöhte Transkription von unter anderem PR-1 zurückzuführen war. Somit handelt es sich bei den drei U-Box E3-Ligasen ebenfalls um negative Regulatoren der basalen Abwehr (Trujillo et al., 2008). Sowohl Xcv- als auch Xcv ∆xopJ-infizierte Blätter zeigten deutliche Krankheitssymptome. Diese Beobachtung steht im Einklang mit Noël et al. (2003), die bereits zeigen konnten, dass XopJ alleine keinen signifikanten Einfluss auf die Virulenz von Xcv hat. Da das UPS essentiell für die normale Zellfunktion ist, haben bakterielle Pathogene Effektoren entwickelt, die das UPS manipulieren können, um die zellulären Prozesse des Wirtes zu stören. Der Pseudomonas syringae-Effektor AvrPtoB besitzt an seinem C-Terminus E3-Ligase-Domäne, die zu eukaryotischen RING-Finger- und U-Box-Familie-Proteinen homolog ist. Diese Struktur soll die E3-Ligasen des Wirtes nachahmen (Abramovitch et al., 2006). So kann AvrPtoB einerseits den Abbau der Fen-Kinase, einem Mitglied der Pto-Familie, durch das Proteasom fördern und damit eine resistente Pflanze wieder suszeptibel werden lassen (Rosebrock et al., 2007). Andererseits ist dieser Effektor am Abbau der Rezeptor-ähnlichen Kinase FLS2 beteiligt (Göhre et al., 2008) und bringt die PAMP-Erkennung und damit die basale Abwehr zum Erliegen. Auch das bereits genannte HopM1 inhibiert den Vesikeltransport und damit die basale Abwehr, indem es den Abbau seines Zielproteins AtMIN7 durch das Proteasom fördert (Nomura et al., 2006). Ein bakterielles Protein, das zwar nicht zu den Typ III-Effektoren zählt, aber dennoch von Pseudomonas syringae in den Wirt übertragen wird, ist das nicht-ribosomale Peptid Syringolin A (SylA). Dieses Peptid inhibiert das Proteasom und die basale Abwehr der Stomata (Groll et al., 2008; Schellenberg et al., 2010). Somit ist die volle Funktion des Proteasoms für die basale Abwehr essentiell. Für diese These spricht auch die Entdeckung von deubiquitinierenden Enzymen aus A. thaliana, die als negative Regulatoren der Abwehr gehandelt werden. Wahrscheinlich wirken diese stabilisierend auf Substrate und agieren als Immunsuppressoren (Ewan et al., 2011). Diese Beispiele zeigen, dass einige Effektoren eine negative Wirkung auf das Gesamtproteasom oder die Proteasomaktivität haben können. Eine Inhibierung des gesamten Proteasoms wirkt jedoch letal auf die Wirtszelle. Für ein biotrophes Pathogen (wie z.B. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), das den Wirt normalerweise überleben lässt, würde sich das Absterben negativ auf seine Verbreitung und damit auf seine Pathogenität auswirken. Dennoch konnte bisher kein Effektor identifiziert werden, der nur eine Proteasomuntereinheit zum Ziel hat. Neuere Studien zeigen, dass die Herunterregulierung einzelner Proteasomuntereinheiten die Aktivität des Proteasoms beeinträchtigen können (Yao et al., 2012). Deshalb wäre die Translokation eines Effektors in die Pflanze sinnvoll, der proteasomale Untereinheiten, die für die Funktion des Proteasoms essentiell sind, inhibiert. 104 KAPITEL 5. DISKUSSION Die Expression von XopJ in N. benthamiana führte zur Akkumulierung von ubiquitinierten Proteinen (Abbildung 4.21), also eine Inhibierung der Deubiquitinierungsaktivität der 19 S-Untereinheit (Coux et al., 1996). Außerdem inhibierte XopJ auch die Chymotrypsin-Aktivität des Proteasoms sowohl in N. benthamiana als auch in A. thaliana (Abbildungen 4.22 und 4.24). Da es sich bei beiden Pflanzen nicht um den natürlichen Wirt von Xcv handelt, könnte man davon ausgehen, dass die enzymatische Funktion von XopJ auf konservierte Proteine und/oder Motive wirkt. Außerdem ist das Proteasom ein wichtiger Faktor für die Entstehung einer HR und der vollen Resistenz gegen avirulente Bakterien (Hatsugai et al., 2009). RPT2a ist ebenfalls eine AAA-ATPase der Basis der 19 S-Proteasomuntereinheit und interagiert direkt mit R-Proteinen in A. thaliana. Des Weiteren aktiviert diese Untereinheit die Salicylsäure-abhängige Genexpression und damit die basale Abwehr (Chung und Tasaka, 2011). Die Inhibierung der Chymotrypsinaktivität des Proteasoms war abhängig von einer intakten katalytischen Triade (XopJ C235A), dem konservierten Lysinrest an Position 300 (Abschnitt 5.5) und der korrekten Lokalisierung des Effektors (XopJ G2A) in N. benthamiana (Abbildungen 4.22 und 4.37). In Abbildung 4.19 f und g konnte bereits gezeigt werden, dass die Interaktion von XopJ G2A und RPT6 im Zytosol von N. benthamiana vorliegt. Nach Expression der Myristoylierungsmutante ist die Aktivität des Proteasoms jedoch nicht inhibiert. Möglicherweise kann XopJ die, für eine volle katalytische Aktivität benötigten, pflanzlichen Kofaktoren an der Plasmamembran durch seine geänderte Lokalisierung nicht mehr nutzen. Um eine Aussage über die Bedeutung von RPT6 für die Abwehr in N. benthamiana treffen zu können, wurde das Gen durch Virus-induzierte Gen-Stilllegung in N. benthamiana herunterreguliert. 14 Tage nach Infiltration und Assemblierung des Virus wurden die Blätter chlorotisch und die Pflanze starb ab (Abbildung 4.46). In Abschnitt 5.3 wurde bereits diskutiert, dass RPT6 sowohl in Reis (Oryza sativa) als auch in A. thaliana im Laufe der Evolution dupliziert wurde. Aus dieser Kenntnis ergaben sich zwei Interpretationsmöglichkeiten für das Absterben der VIGSRPT6-Pflanzen. Da sich die Proteine selbst zwischen den Spezies sehr ähneln, könnten mehrere Isoformen mit demselben VIGS-Konstrukt gleichzeitig herunterreguliert worden sein. Eine weitere Möglichkeit wäre die Existenz von einem einzelnen RPT6-Gen in Tabak. Durch das Absterben der Pflanze nach Herunterregulierung von RPT6 konnte gezeigt werden, dass RPT6 ein essentielles Protein in Tabak darstellt. Somit ist RPT6 ein lohnendes Ziel für bakterielle Effektoren, um die Abwehr der Pflanze während einer Infektion zu schwächen. Allerdings darf ein Effektor, der RPT6 als Ziel hat, das Protein nicht komplett inaktivieren, da dies sonst letal auf die Pflanze wirkt, sofern sie nur eine funktionelle Isoform besitzt. Dies könnte auch eine Erklärung dafür sein, warum XopJ die Proteasomaktivität nur um ca. 40 % reduziert. 5.5 Die biochemische Funktion von XopJ In Säugetieren konnte bereits gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von RPT6 für die Assemblierung des 26 S-Proteasoms benötigt wird (Satoh et al., 2001; Zhang et al., 2007a). Nach massenspektrometrischen Analysen von RPT6 und Markierungsexperimenten konnte die Phosphorylierung am Serin 120 von RPT6 aus Säugetieren festgestellt werden (Zhang et al., 2007a). 5.5. DIE BIOCHEMISCHE FUNKTION VON XOPJ 105 Vergleichende Sequenzanalysen zeigten, dass dieses Serin innerhalb der Klasse der Säugetiere, aber auch bei Drosophila melanogaster und in Hefe konserviert ist. Des Weiteren weist die Stelle in RPT6 die Erkennungssequenz der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) auf (R X X S/T). Bei Erhöhung der cAMP-Konzentration wird RPT6 durch diese Kinase phosphoryliert (Zhang et al., 2007a; Satoh et al., 2001). Dies führt zur Assemblierung des 26 S-Proteasoms durch die Verbindung von RPT6 und der anderen AAA-ATPasen mit den α-Untereinheiten des 20 S-Proteasoms (Satoh et al., 2001). Weitere Sequenzvergleiche zeigten, dass dieses Serin auch in A. thaliana und Tabak vorhanden war. In Tabak handelte es sich um das Serin an Position 130 (Abbildung 4.38). Zur Assemblierung des Proteasoms und ob dabei die Phosphorylierung eines Serins eine Rolle spielt, ist in Pflanzen allerdings bisher nichts bekannt. Untersuchungen zum Einfluss von Aminosäureaustauschen an dieser Position auf die Interaktion von XopJ und RPT6 im Hefe-ZweiHybrid-System ergaben dazu bisher kein klares Bild (Abbildung 4.39). Da XopJ ein Mitglied der YopJ-Familie ist und einige Effektoren dieser Familie bereits als Acetyltransferasen identifiziert wurden (Mukherjee et al., 2006; Mittal et al., 2006, 2010; Tasset et al., 2010; Lee et al., 2012), stellte sich die Frage, ob XopJ auch Acetyltransferaseaktivität besitzt. Ausgehend von der Funktion des Yersinia-Effektors YopJ, der die Phosphorylierung der MAPK Kinasen MKK6 und MEK1/2, aber auch IKKβ, in Säugetieren durch Acetylierung der normalerweise phosphorylierten Serin- und Threoninreste inhibiert (Mittal et al., 2006; Mukherjee et al., 2006) und der Tatsache, dass ein konservierter Lysinrest im Effektor PopP2 aus Ralstonia solanacearum acetyliert werden kann (Tasset et al., 2010), wurden in vitro-Acetylierungstests mit XopJ als mögliche Acetyltransferase durchgeführt. Dabei könnte ein autoacetyliertes EffektorIntermediat eine Rolle spielen bevor der Acetylrest auf ein Substrat übertragen wird (Mittal et al., 2010). Diese Autoacetylierung ist allerdings nicht essentiell für die Acetylierung der MAPK Kinasen (Mukherjee et al., 2007; Mittal et al., 2010). In Anlehnung an die enzymatische Funktion von YopJ, wäre ein möglicher Mechanismus für die biochemische Aktivität von XopJ demnach die Acetylierung des konservierten Serins in der proteasomalen 19 S-Untereinheit RPT6. Dadurch könnte das Proteasom der Wirtszelle nicht mehr assembliert werden. Als Folge davon würde die Proteasomaktivität in der Wirtszelle reduziert werden (Abbildung 5.1). Um die Acetylierung von XopJ bzw. seines möglichen Substrates RPT6 testen zu können, wurden die Proteine aus E. coli aufgereinigt und in einen in vitro-Acetyltransferasetest eingesetzt. Als Positivkontrolle für den Test wurde HopZ1a verwendet, von dem ebenfalls bekannt war, dass er eine Acetyltransferase darstellt und autoacetyliert wird (Lee et al., 2012). Während HopZ1a ein positives Signal auf den Autoradiogrammen zeigte, konnte weder die Autoacetylierung von XopJ noch die Acetylierung von RPT6 bestätigt werden. Auch der eukaryotische Kofaktor Inositolhexakisphosphat (IP6 ), der auch für die Acetylierung der MAPK Kinasen durch YopJ essentiell ist, hatte keinen Einfluss auf die Acetylierungsreaktion durch XopJ (Mittal et al., 2010). Wenn XopJ tatsächlich eine Acetyltransferase ist, benötigt dieser Effektor wahrscheinlich einen anderen Kofaktor um aktiviert zu werden als Effektoren, die human- bzw. säugetierpathogen sind. Dagegen spricht allerdings, dass auch HopZ1a, ebenfalls ein Effektor eines Pflanzenpathogens genauso durch den Kofaktor IP6 aktiviert werden konnte (Abbildung 4.34) wie auch YopJ oder AvrA (Mittal et al., 2010; Lee et al., 2012). 106 KAPITEL 5. DISKUSSION XopJ P? P? Ac? Ac? + + Untereinheiten des 19 S-Komplexes P: Phosphorylierung α-Untereinheiten des 20 S-Komplexes Ac: Acetylierung β-Untereinheiten des 20 S-Komplexes RPT6 (AAA-ATPase) Abbildung 5.1: Arbeitshypothese des Wirkmechanismus von XopJ auf das Proteasom. In Säugetieren wird RPT6 phosphoryliert und damit das 26 S-Proteasom assembliert. Gesetzt den Fall, dass in Pflanzen ein ähnlicher Mechanismus existiert, könnte XopJ die mögliche Funktion als Acetyltransferase nutzen und die Phosphorylierung durch Acetylierung der normalerweise phosphorylierten Aminosäure in RPT6 verhindern. Für die massenspektrometrische Analyse wurden sowohl RPT6-GFP als auch RPT6-GFP koexprimiert mit XopJ-myc und XopJ-GFP aus N. benthamiana aufgereinigt. Anschließend wurden die Proben massenspektrometrisch analysiert. Dabei konnte weder eine Acetylierung des Effektors selbst noch eine Acetylierung von RPT6 durch XopJ festgestellt werden. Da Acetylierungen reversibel sind (Glozak et al., 2005), könnte bei der Aufreinigung aus Pflanzenmaterial eine vorhandene Acetylierung wieder verloren gegangen sein. Neben HopZ1a, YopJ und AvrA zeigt auch PopP2, ein Effektor aus Ralstonia solanacearum, ein autoacetyliertes Intermediat (Tasset et al., 2010). Tasset et al. (2010) konnten zeigen, dass dieser Effektor an einem Lysin acetyliert wird, welches innerhalb der YopJ-Familie konserviert ist (Abbildung 4.35). Deshalb wurde das konservierte Lysin 300 in XopJ zu Arginin mutiert und die Interaktion mit RPT6 und die Proteasomaktivität in N. benthamiana getestet. Anders als die Autoacetylierungsmutante von PopP2 interagierte XopJ G2A K300R nicht mehr mit RPT6, was darauf hindeutete, dass dieses Lysin für die Funktion von XopJ essentiell sein könnte (Tasset et al., 2010). Auch die Proteasomaktivität ist von der XopJ K300R-Mutante nicht mehr beeinflusst, obwohl das katalytische Zentrum mit dem Cystein 235 intakt war. Auch die PopP2 K383RMutante verhindert die RRS1-vermittelte Abwehr und ist damit funktionslos (Tasset et al., 2010). Dies könnte darauf hindeuten, dass XopJ Acetyltransferaseaktivität besitzt, die von einem bisher unidentifizierten pflanzlichen Faktor aktiviert werden muss. 5.6. DIE INHIBIERUNG DER PROTEASOMAKTIVITÄT DURCH XOPJ WIRKT SICH AUF DEN VESIKELTRANSPORT AUS 5.6 107 Die Inhibierung der Proteasomaktivität durch XopJ wirkt sich auf den Vesikeltransport aus Das eukaryotische 26 S-Proteasom ist an zahlreichen zellulären Prozessen beteiligt. Dazu zählen z.B. die Beteiligung an der Hormonsignaltransduktion, eine schnelle Adaption auf verschiedene Stimuli aus der Umwelt und eine rasche Reaktion auf eine Infektion mit den verschiedensten Pathogenen. Das Ubiquitin-Proteasom-System gilt auch als eine rudimentäre Form der basalen Abwehr in Pflanzen (Vierstra, 2009). Auf der einen Seite erkennt XopJ das Proteasom als Teil der basalen Wirtsabwehr, interagiert mit RPT6 und beeinträchtigt die Chymotrypsinaktivität. Auf der anderen Seite inhibiert XopJ den Vesikeltransport zur Plasmamembran und in den Apoplasten. Dies deutet darauf hin, dass XopJ entweder unterschiedliche Virulenzziele in der Pflanze besitzt, oder das Proteasom an in die von XopJ beeinflussten Prozesse involviert ist. In Gehirnzellen von Säugetieren ist bereits bekannt, dass die Aktivität des Proteasoms benötigt wird, um die Vesikelfusion voranzutreiben und die Wiederverwertung der Komponenten aufrecht zu erhalten. Ist das Proteasom in präsynaptischen Neuronen inhibiert, so erhöht sich der VesikelRecycling-Vorrat um 76 % (Willeumier et al., 2006). Damit ist der Vesikelrückfluss gestoppt, sobald das Proteasom inhibiert wird. Des Weiteren bildet das vesikelständige Protein CSPα einen Komplex mit den E3-Ligase-Untereinheiten Hsc70 und SGT. Dieser bindet an SNAP-25 als Schutz für den vorzeitigen Abbau des ternären SNARE-Komplexes in präsynaptischen Neuronen (Sharma et al., 2010). Einen Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen der Inhibierung der Proteasomaktivität und des Vesikeltransports durch XopJ, lieferten bereits weitere Ergebnisse, bei denen der Proteasominhibitor MG132 eingesetzt wurde, um unter anderem den Vesikeltransport und die Proteinsekretion in den Apoplasten zu untersuchen (Abschnitt 4.2). Dabei konnte bereits festgestellt werden, dass MG132 genau wie XopJ das Reporterprotein secGFP im endoplasmatischen Retikulum oder einer ähnlichen netzartigen Struktur innerhalb der Zelle zurückhält. Auch die Kalloseablagerungen nach Infektion mit einem avirulenten Bakterium sind durch Infiltration von MG132 in Blättern reduziert (Suayib Üstün, persönliche Mitteilung). Dennoch könnten die beiden Ereignisse während der XopJ-Interaktion mit Pflanzenproteinen unabhängig voneinander geschehen. Wie schon in Abschnitt 5.4 diskutiert, gibt es bereits einige Beispiele von bakteriellen Virulenzfaktoren, wie z.B. YopE oder Syringolin A, die ebenfalls die Proteasomaktivität, zum Teil sogar irreversibel, wie im Fall von Syringolin A, hemmen (Ruckdeschel et al., 2006; Groll et al., 2008; Schellenberg et al., 2010). 5.7 Die Avirulenzfunktion von XopJ Thieme et al. (2007) zeigten, dass XopJ eine hypersensitive Reaktion (HR) in N. benthamiana verursacht und damit Avirulenzfunktion besitzt (Thieme et al., 2007). Dieses Ergebnis konnte im Rahmen dieser Arbeit allerdings nur dann bestätigt werden, wenn die Pflanzen nach Agrobakterien-vermittelter transienter Expression von XopJ mit Salicylsäure (SA) oder dem SA-Analogon 108 KAPITEL 5. DISKUSSION INA (2,6-Dichloroisonikotinsäure) behandelt wurden (Abbildung 4.47). Seit 1979 weiß man bereits, dass SA durch exogene Applikation auf Tabak die systemische Resistenz auslösen kann und damit die Pflanze widerstandsfähiger gegen Pathogene macht (White, 1979). Wenn in Pflanzen ein Resistenzprotein gegen einen Effektor existiert und diesen erkennt, dann wird in der Pflanze eine hypersensitive Reaktion, geprägt von lokalem Zelltod, eingeleitet (ETI: effector-triggered immunity; Jones und Dangl (2006)). In diesem Fall spricht man von der Avirulenzfunktion eines Effektors. Abgesehen von dem Effektor PopP2 aus Ralstonia solanacearum und einigen Pilz-Effektoren, darunter auch Avr-Pita aus Magnaporthe oryzae, konnte eine direkte Interaktion zwischen R-Protein und Effektor bisher nicht nachgewiesen werden (Jia et al., 2000; Deslandes et al., 2003). Vielmehr wird angenommen, dass das Virulenzziel eines Effektors von einem Resistenzprotein überwacht wird. Nach Veränderung eines pflanzlichen Proteins durch den Effektor wird eine hypersensitive Reaktion hervorgerufen (Van Der Biezen und Jones, 1998). Die E3-Ligase-Untereinheit SGT1 ist eine essentielle Komponente für die Auslösung einer HR. Wird dieses in der Pflanze nicht mehr exprimiert, kann ein avirulentes Pathogen keine HR mehr auslösen. Somit handelt es sich bei SGT1 um einen positiven Regulator der R-Protein-vermittelten Abwehr (Zeng et al., 2006). SGT1 ist wahrscheinlich als Co-Chaperon von HSP90 an der Ubiquitinierung von möglichen Regulatorproteinen der R-Protein-abhängigen HR beteiligt, die dann durch das 26 S-Proteasom abgebaut werden. Anschließend kann eine hypersensitive Reaktion ausgelöst werden (Azevedo et al., 2002; Bieri et al., 2004). Somit könnte es durch die Proteasominhibierende Funktion von XopJ zu einem verminderten Abbau eines Regulators der SGT1/RAR1vermittelten Resistenz kommen. Neben der R-Protein-vermittelten Abwehr spielen RAR1 und SGT1 auch eine Rolle bei der basalen PAMP-vermittelten Abwehr (Vierstra, 2009). Neben seiner Interaktion mit E3-Ubiquitin-Ligasen interagiert SGT1 aber auch mit RAR1. Des Weiteren stellt RAR1 in Gerste die Verbindung von SGT1 und den E3-Ligasen mit dem COP9Signalosom dar (Azevedo et al., 2002). Takahashi et al. (2003) konnten bereits beobachten, dass neben SGT1 auch RAR1 mit dem Hitzeschockprotein HSP90 interagiert. Die Autoren postulierten, dass HSP90 dafür verantwortlich ist, R-Proteine zu stabilisieren. In einigen Fällen soll dies zusammen mit RAR1 geschehen. Dieser Komplex rekrutiert dann SGT1, um die R-Proteinaktivität zu modulieren (Takahashi et al., 2003). Dennoch agieren RAR1 und SGT1 genetisch unabhängig voneinander (Austin et al., 2002). So ist auf Abbildung 4.48 zu erkennen, dass die HR durch XopJ abhängig von SGT1, aber unabhängig von RAR1 ausgelöst werden kann. Die HR schien sogar durch XopJ in RAR1-herunterregulierten Pflanzen ohne INA-Behandlung herbeigeführt worden zu sein. Diese Beobachtung könnte damit begründet werden, dass nicht jedes R-Protein RAR1 benötigt, um stabilisiert zu werden und um eine HR auszulösen (Azevedo et al., 2006; Shang et al., 2006). Muskett et al. (2002) zeigten, dass die HR-Symptome in einigen rar1-Mutanten verzögert, aber nicht komplett eliminiert sind. Ein mögliches Zielprotein von XopJ ist die Proteasomuntereinheit RPT6. Dieses könnte von einem R-Protein überwacht werden, das die Interaktion von XopJ mit RPT6 erkennt und somit die hypersensitive Reaktion auslöst. Gu et al. (2010) postulierten, dass durch Behandlung von Pflanzen mit Salicylsäure neben der Abwehr auch die Proteasomaktivität induziert wird. Die Expression von XopJ ohne die anschließende Behandlung mit INA löste keine HR-Symptome aus. Dennoch 5.7. DIE AVIRULENZFUNKTION VON XOPJ 109 wird die Proteasomaktivität um ca. 40 % reduziert. Wird die Proteasomaktivität allerdings nach XopJ-Expression durch INA induziert, ist der Unterschied zwischen der Proteasomaktivität nach INA-Induktion und XopJ-Expression zum normalen, nicht-infizierten Zustand wahrscheinlich größer als der Unterschied nach XopJ-Expression ohne INA-Behandlung (40 %). Somit könnte das R-Protein erst auf einen quantitativ erhöhten Unterschied des Proteasomaktivitätsstatus von mehr als 40 % reagieren. Des Weiteren wurde auch die Abhängigkeit der durch XopJ und INA ausgelösten hypersensitiven Reaktion von NPR1 und EDS1 getestet. Dabei konnte beobachtet werden, dass die Ausbildung der HR unabhängig von NPR1 war. Durch die exogene Applikation von SA oder INA auf Pflanzen kommt es zu einer globalen Veränderung der Transkriptionsaktivität (Durrant und Dong, 2004). Im nicht-infizierten Zustand liegt NPR1 als Oligomer im Zytosol vor. Die Oligomerisierung wird durch Disulfidbrücken erhalten, die bei SA-Applikation oder bei Infektion reduziert werden. NPR1 besitzt ein Kernlokalisationssignal, das nach Reduktion der Disulfidbrücken wieder frei liegt. Dadurch kann NPR1 als Monomer in den Zellkern gelangen (Kinkema et al., 2000; Mou et al., 2003) und die Transkription von PR-Genen und WRKY-Transkriptionsfaktoren initiieren (Wang et al., 2006). Da die Induktion der HR durch XopJ und INA NPR1-unabhängig ist, spielt der Prozess der systemischen Resistenz (SAR) und die Expression von PR-Proteinen voraussichtlich keine Rolle. Allerdings konnten Spoel et al. (2009) zeigen, dass die Proteasomaktivität bei der SAR entscheidend ist. Um die energieaufwändige Expression von Abwehr-assoziierten Genen im nichtinfizierten Zustand zu unterbinden, werden NPR1-Monomere im Zellkern durch das Proteasom abgebaut (Spoel et al., 2009). Während einer Infektion akkumuliert Salicylsäure, was einerseits zur Reduktion der Disulfidbrücken und Monomerisierung von NPR1 führt und andererseits die Phosphorylierung von zwei Serinen (Position 11 und 15) in NPR1 auslöst. Die Phosphorylierung dieser Aminosäuren stimuliert ebenfalls den Abbau des NPR1-Proteins. Wahrscheinlich dient dies dazu, die Entstehung im Allgemeinen und die Stärke der SAR im Besonderen zu regulieren (Spoel et al., 2009). Noch stärker als bei RAR1-herunterregulierten Pflanzen war die Antwort auf XopJ-Expression in pTRV-EDS1-N. benthamiana. EDS1 ist ein Regulator der R-Protein-vermittelten Antwort des TIR-NBS-LRR-Typs (Aarts et al., 1998). EDS1 gilt als Interaktionspartner von PAD4 (Feys et al., 2001) und hat Ähnlichkeit mit eukaryotischen Lipasen (Falk et al., 1999). EDS1 ist sowohl im Zytosol als auch im Zellkern lokalisiert. Nach Infektion einer Pflanze mit einem avirulenten Pathogen, das Effektorproteine gegen TIR-NB-LRR-Resistenzproteine trägt, erhöht sich die EDS1Menge im Zellkern. Anschließend wird die Transkription von Wirtsgenen durch EDS1 verändert. Ein Teil des EDS1-Vorrats bleibt jedoch im Zytosol zurück, um die komplette R-Protein-vermittelte Resistenz auslösen zu können (García et al., 2010). Außerdem ist EDS1 ein positiver Regulator der SA-abhängigen Resistenz (Falk et al., 1999; Brodersen et al., 2006). Da die zu beobachtende HR nach XopJ-Expression unabhängig von EDS1 auftrat, könnte man davon ausgehen, dass bei der Auslösung der HR durch XopJ R-Proteine des CC-NBS-LRR-Typs beteiligt sind. Des Weiteren war die HR auch in pTRV-EDS1-Pflanzen unabhängig von einer INABehandlung. Parker et al. (1996) zeigten bereits, dass bei eds1-Pflanzen die systemisch erworbe- 110 KAPITEL 5. DISKUSSION ne Antwort (SAR) nach INA-Behandlung noch intakt war, was auf die exogene Behandlung mit INA zurückzuführen war, die das Fehlen von EDS1 kompensieren kann (Parker et al., 1996; Falk et al., 1999). Nach Infektion der Pflanzen mit einem avirulenten Pathogen oder exogener SAApplikation erhöht sich normalerweise die Menge an EDS1 und damit auch der PR-1-Transkripte. Ist EDS1 herunterreguliert, kann auch kein PR-1-Protein mehr gebildet werden. Nicht nur die SAR, sondern auch die PR-1-Expression kann durch exogene SA/INA-Behandlung wiederhergestellt werden (Falk et al., 1999). Neben den aktivierenden Eigenschaften von EDS1 auf die SAvermittelte Abwehr, wirkt sich die Aktivität dieses Proteins negativ auf den Ethylen-/JasmonatSignalweg aus (Brodersen et al., 2006). Die beiden XopJ-Varianten C235A und G2A, genauso wie die Negativkontrolle Sp2, lösten keine HR aus. Das bedeutet, dass die hypersensitive Reaktion der Pflanzen auf XopJ prinzipiell abhängig von einer intakten katalytischen Triade und der korrekten Lokalisierung des Effektors war. Bei Sp2 handelte es sich um die dominant-negative Mutante des Syntaxins AtSYP121, das bereits in Abschnitt 4.2 beschrieben wurde (Leyman et al., 1999; Geelen et al., 2002; Tyrrell et al., 2007). Zusammengefasst ließen die Ergebnis darauf schließen, dass durch das Salicylsäure-Analogon INA die XopJ-vermittelte HR in der Pflanzenzelle und die Reaktion darauf eingeleitet und möglicherweise verstärkt wurden. 5.8 Ausblick Im Rahmen dieser Arbeit konnte die subzelluläre Lokalisierung des Typ III-Effektorproteins XopJ aus Xcv aufgeklärt werden. Des Weiteren konnte die Proteasomuntereinheit RPT6 als ein mögliches Virulenzziel von XopJ in der Pflanzenzelle identifiziert werden. Dabei ergab die Untersuchung auch, dass XopJ die Proteasomaktivität reduziert. Allerdings bleibt die Frage offen, auf welche Weise und mit welcher biochemischen Funktion XopJ in den Proteinabbau eingreift. Dadurch, dass eine Herunterregulierung von RPT6 in N. benthamiana letal wirkt (Abschnitt 5.4), kann man den Stellenwert von RPT6 bei der pflanzlichen Resistenz nicht so einfach in planta analysieren. In Arabidopsis gibt es zwei Isoformen für RPT6, RPT6a und b, die auf Chromosom 5 benachbart angeordnet sind. Wenn in Arabidopsis RPT6 herunterreguliert werden könnte ohne dass es letal für die Pflanze wäre, könnte man das Bakterienwachstum von virulenten und avirulenten Bakterien in Arabidopsis untersuchen und somit die Bedeutung von RPT6 während der basalen Abwehr und der R-Protein-vermittelten Abwehr analysieren. Zukünftige Experimente sollen auch eine mögliche Verknüpfung der Proteasomaktivität mit dem Vesikeltransport, der ein weiteres Ziel von XopJ darstellt, prüfen. Dabei könnte untersucht werden, ob es sich hierbei um zwei unabhängige Ereignisse handelt, oder ob die Inhibierung des Vesikeltransportes eine Folge der Reduktion der Proteasomaktivität darstellt. Da Salicylsäure die Aktivität des Proteasoms induziert (Gu et al., 2010) und XopJ die Aktivität reduziert, könnte XopJ auch einen Einfluss auf die Menge an Salicylsäure während einer Infektion haben, was in zukünftigen Experimenten überprüft werden könnte. 5.8. AUSBLICK 111 Die Tatsache, dass MG132 die gleiche Funktion in der Zelle auszuüben scheint wie XopJ (Abschnitt 5.6), bleibt weiterhin zu untersuchen. Dabei soll vor allem auf das Bakterienwachstum nach Behandlung der Pflanzen mit MG132 eingegangen werden. Da auch das Proteasom für die Akkumulierung von Salicylsäure eine entscheidende Rolle spielt, soll auch der Salicylsäure-Gehalt nach Infektion und Applikation von MG132 ermittelt werden. Die Bedeutung des katalytisch wirksamen Cysteins 235 für die Interaktion mit RPT6 soll durch eine Koimmunpräzipitation geklärt werden. Die biochemische Aktivität von XopJ konnte in dieser Arbeit nicht identifiziert werden. Enzymatische Tests könnten weiterhin Aufschluss über die Effektorfunktion geben. 112 KAPITEL 5. DISKUSSION Literaturverzeichnis Aarts, N., Metz, M., Holub, E., Staskawicz, B., Daniels, M. und Parker, J. (1998). Different requirements for EDS1 and NDR1 by disease resistance genes define at least two R genemediated signaling pathways in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences 95: 10306–10311. Abramovitch, R., Janjusevic, R., Stebbins, C. und Martin, G. (2006). Type III effector AvrPtoB requires intrinsic E3 ubiquitin ligase activity to suppress plant cell death and immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences 103: 2851–2856. Agrios, G.N. (2005). Plant pathology. Elsevier, New York, 5. Auflage, ISBN 978-0120445653. 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Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Type III Effector XopJ Inhibits Protein Secretion and Affects Host Cell Ubiquitination. First International SFB 796 Conference: Mechanisms of viral host cell manipulations: from plants to humans, Bamberg, Oktober 2011 137 138 LITERATURVERZEICHNIS Verena Bartetzko, Sophia Sonnewald und Frederik Börnke. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Type III Effector XopJ Inhibits Protein Secretion and Affects Host Cell Ubiquitination. Plant Biology 2011, Minneapolis, USA, August 2011 Verena Bartetzko, Sophia Sonnewald und Frederik Börnke. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Type III Effector XopJ Inhibits Protein Secretion and Affects Host Cell Ubiquitination. 3nd Annual Retreat „Erlangen School of Molecular Communication“, Kloster Banz, Bad Staffelstein, Juli 2011 Verena Bartetzko, Sophia Sonnewald und Frederik Börnke. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Type III Effector XopJ Inhibits Protein Secretion and Affects Host Cell Ubiquitination. International Meeting „Communication in Plants and their Responses to the Environment“, Collaborative Research Center SFB 648, Halle, Mai 2011 Verena Bartetzko, Sophia Sonnewald und Frederik Börnke. The Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Type III Effector Protein XopJ Inhibits Protein Secretion: Evidence for Interference with Cell Wall - Associated Defense Responses. Botanikertagung 2009 Plants for the future, Leipzig, September 2009
