Immunologische Methoden und Enzymassays

Immunologische Methoden und Enzymassays
1. Antikörper (Ak)
Aufbau, Struktur
monoklonale und polyklonale Ak
2. Immunpräzipitation
3. Affinitätschromatographie
4. Immundetektion
5. Immunblot
6. Immunhistochemie
7. ELISA
Aufbau
Sandwich
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Antikörper - Struktur
Immunsystem
Angeborene oder unspezifische Abwehr (Innate Immunity)
• sehr früh in der Stammesgeschichte der Lebewesen
entwickelt
< anatomische und physiologische Barrieren
< Makrophagen, Natürliche Killerzellen, Neutrophile Zellen
< Antimikrobielle Peptide
< verhindert ca. 90% aller Infektionen
Erworbene, adaptive oder spezifische Abwehr
(adaptive Immunity)
• entwickelte sich bei Wirbeltieren
• passt sich neuen Krankheitserregern an
• erkennt spezifische, körperfremde Strukturen (Antigene)
• entwickelt zelluläre Abwehrmechanismen und molekulare
Antikörper
T-Lymphozyten (T-Zellen)
• entstehen im Knochenmark aus den Lymphoblasten und
reifen im Thymus aus
• tragen an ihrer Oberfläche einen T-Zell-Rezeptor (TCR), mit
dem jede T-Zelle jeweils ein spezifisches Antigen erkennen
kann (Schlüssel-Schloss-Prinzip).
• T-Zellen erkennen nur Antigene, die im Komplex mit MHCMolekülen auf der Oberfläche körpereigener Zellen
präsentiert werden.
B-Lymphozyten (B-Zellen)
•
entwickeln sich wie alle Abwehrzellen im Knochenmark
•
“erkennen” über Rezeptoren ihr Antigen und können dann
durch Lymphokine aktiviert werden
•
aktivierte B-Zellen entwickeln sich zu Antikörperproduzierenden Plasmazellen oder Gedächtniszellen
•
B-Zellen erkennen auch freie Antigene
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Antikörper
IgA (Dimer)
wird auf Schleimhäuten der Atemwege, der Augen, des
Magen-Darm-Trakts, des Urogenitaltrakts sowie über spezielle
Drüsen rund um die Brustwarze von Müttern sezerniert
IgE (Monomer)
Schützt vor Parasiten (z. B. Würmer)
Membrangebunden auf Mastzellen, in Blut kaum vorhanden
Quervernetzung bei Antigenkontakt
K Ausschüttung von Histaminen, Granzymen usw. durch
Mastzellen und Granulozyten (allergische Reaktion)
IgM (Pentamer)
wird bei Erst-Kontakt mit Antigenen gebildet
zeigt akute Infektionsphase einer Krankheit an (Zeichen einer
frischen Infektion)
10 Bindestellen für Antigene (starke Agglutination)
IgG (Monomer)
wird in verzögerter Abwehrphase gebildet (3 Wochen)
bleibt lange erhalten
zeigt durchgemachte Infektion oder Impfung an
plazentagängig
IgD (Monomer)
in geringen Mengen in Blut und Lymphe vorhanden
Funktion unbekannt
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Gewinnung von Antikörpern
Polyklonale Seren (polyklonale Antikörper)
•
Protein, Peptid oder andere Verbindung einem Tier
spritzen (Immunsystem)
•
Immunsystem erkennt Fremdstoff und produziert
Antikörper (zuerst IgM dann IgG)
•
Mischung verschiedener, gegen diverse Epitope/Antigene
gerichteter Antikörper
•
Serum direkt in Assays einsetzen oder Ak anreichern
Quelle
Serum
Typ
Menge
Polyklonal
IgG
IgA
IgM
IgD
IgE
IgY
•
•
•
•
8 - 16 mg/mL
1 - 4 mg/mL
0,5 - 2 mg/mL
bis 0,4 mg/mL
bis 4 :g/mL
Hybridoma
Monoklonal
bis 4 mg/mL
Eigelb
IgY
3 - 4 mg/mL
In vitro
Rekombinant
auch: Hühner IgG, Eigelb IgG oder 7S-IgG
Äquivalent zu IgG bei Hühnern; ähnliche Struktur
in hoher Konzentration in Eiern
bietet für bioanalytische Zwecke verschiedene Vorteile
gegenüber IgG
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Monoklonale Antikörper (mAk)
Immunisierung von Mäusen (Ratten)
Milz entnehmen
Milzzellen mit Krebszellen verschmelzen
K Hybridomzelllinie
•
können sich beliebig oft teilen (“unsterblich”)
•
produziert Antikörper (z.B. IgG)
Einzelne Klone der Hybridomzelllinie isolieren und vermehren
K monoklonal!
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Immunpräzipitation
Antikörper erkennen Antigene in Lösung
Antikörper-Antigen-Komplex präzipitiert
insbesondere wenn mehrere Epitope an einem Protein
erkannt werden
Variante
Antikörper an Trägermaterial (Beads) immobilisieren und damit
Antigen herausfangen
Magnetische Beads: Mit Magnet abtrennen
K automatisierbar
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Affinitätschromatographie
•
Säule mit aktiviertem Trägermaterial
•
Antikörper chemisch an Trägermaterial koppeln
•
Antikörper immobilisiert
•
Proteinmischung auftragen
•
Antigen bindet spezifisch
•
Antigen eluieren (schwach sauer)
•
Antikörper wird nicht denaturiert, so dass Säule wieder
verwendet werden kann (bis 100x)
Falls ein spezifischer mAk zur Verfügung steht, kann jedes
Protein angereichert werden
z.B. modifizierte Proteine
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Immundetektion
Proteine spezifisch mit Antikörper nachweisen
meist Signalverstärkung über Amplifikation (A)
z.B. Enzyme (Peroxidase, Phosphatase), PCR
a: direkt: Ak markiert
b: indirekt: sek. Ak
markiert
c,d: indirekt, polyklonaler
Peroxidase-Komplex
e: Biotin-Avidin-System
f: Protein A
g: direkte Protein A Gold-Methode
h: indirekte Protein A Gold-Methode
j: Lektin
k: Antigen
l: Nachweis des Ak über
Antigen
m: Sandwich-Methode
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Immunoblot
Proteine nach gelelektrophoretischer Trennung auf eine
Membran transferieren (Westernblot)
Aktive Oberfläche der Membran blockieren (Milchpulver, BSA)
Mit Antikörper inkubieren und
1. Direkter Nachweis
Fluoreszenzfarbstoff
Enzym (z.B. Peroxidase K Farbreaktion)
2. Nachweis mit sek. Ak
z.B. Ziege anti-Maus IgG
sek. Ak mit Enzym markiert (Farbreaktion)
B
A
103 kDa
77 kDa
50 kDa
103 kDa
77 kDa
50 kDa
34 kDa
28 kDa
20 kDa
34 kDa
28 kDa
20 kDa
St
St
1 2
SDS-PAGE
3
10
zweidim.
Gelelektrohporese
Spezifischer Nachweis eines Proteins in Gegenwart großer
Mengen anderer Proteine
K Reinigung kontrollieren
Proteine/Modifikationen nachweisen (Identifizierung)
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Immun-Histochemie
Gewebeschnitt anfertigen
Antikörper-Lösung auftragen
Antikörper bindet im Gewebe an Antigen
Detektion: z.B. Fluoreszenzfarbstoffe
Drei Modifikationen des Tau-Proteins parallel nachweisen:
HPT-1
HPT-101
AT8
merge
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ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest
Direkter ELISA
Probe mit Antigen an fester Oberfläche adsorbieren (Well)
Aktive Oberfläche blockieren (BSA, Milchpulver)
Antikörper zugeben (direkte Detektion, z.B. über Fluoreszenz)
Sek. Ak zugeben (mit gekoppeltem Enzym)
Detektion über Enzymumsatz (z.B. Farbstoff bilden)
1,6
1,4
1,2
OD
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1:100
1:300
1:600 1:1200 1:2400 1:4800 1:9600 1:19200
Antigen dilution
Sandwich ELISA
Antikörper an Platte binden
Probe mit Antigen zugeben
Ak fängt Antigen (Fänger-Ak)
mit zweitem Ak Antigen detektieren (direkte Detektion)
mit sek. Ak nachweisen (Enzym - Farbstoff)
sek. Ak
Protein
POD
Detektor-Ak
Fänger-mAk
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