Die Herabregulation des CD4-Rezeptors - OPARU

Universität Ulm
Institut für Virologie
Leiter: Prof. Dr. Thomas Mertens
Die Herabregulation des CD4-Rezeptors
schützt HIV-1 infizierte T-Zellen vor
Superinfektion und frühzeitiger Apoptose
Dissertation zur Erlangung
des Doktorgrades der Humanbiologie (Dr. biol. hum.)
der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
vorgelegt von
Steffen Wildum
aus Ulm
2006
Amtierender Dekan:
Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin
1. Berichterstatter:
Prof. Dr. Frank Kirchhoff
2. Berichterstatter:
PD Dr. Wolfgang Weidemann
Tag der Promotion:
17.11.2006
„Die Zeit wird kommen, wo unsere Nachkommen sich wundern, dass wir
so offenbare Dinge nicht gewusst haben.“
Lucius A. Seneca [4 v.Chr. – 65 n.Chr.]
Widmung
Meinen Eltern, die ihren Teil zu dieser Arbeit beigetragen haben.
1. INHALTSVERZEICHNIS
1
1. Inhaltsverzeichnis
1
2. Abkürzungsverzeichnis
3
3. Einleitung
6
3.1 Humane Immundefizienzviren: Entdeckung und Epidemiologie
6
3.2 Morphologie und Genomaufbau der Humanen Immundefizienzviren
7
3.3 CD4-Herabregulation durch HIV-1
8
3.6 Fragestellung
9
4. Material
10
4.1 Eukaryotische Zelllinien
10
4.2 Bakterien
10
4.3 Nukleinsäuren
10
4.4 Enzyme
11
4.5 Reagenzien und Laborhilfsmittel
12
4.6 Reagenzsysteme (Kits)
13
4.7 Medien
13
4.8. Lösungen und Puffer
14
4.9 Antikörper für die Durchflusszytometrie
14
5. Methoden
15
5.1 DNA-Methoden
15
5.2 Zellkultur
16
5.3 Bakterienkultur
16
5.4 Herstellung rekombinanter HIV-1 NL4-3 Viren
17
5.5 Isolierung primärer Lymphozyten aus Buffy Coat
18
5.6 Herstellung von Virusstocks und Infektionen
18
5.7 FACS-Analysen
20
5.8 Nachweis viraler Proteine durch Western Blot Analyse
20
5.9 Computerprogramme und Datenquellen
21
1. INHALTSVERZEICHNIS
6. Ergebnisse
2
23
6.1 Rekombinante HIV-1 NL4-3 Viren mit defekten vpu, env und nef Genen
23
6.2 CD4-Modulation in HIV-1 infizierten Zellen
24
6.3 Die Herabregulation von CD4 schützt HIV-1 infizierte T-Zellen
vor einer Superinfektion
29
6.4 Nef schützt infizierte Zellen durch die Modulation von CD4 und
mittels eines anderen Mechanismus vor einer Superinfektion
32
6.5 Auch die Nef-vermittelte CxCR4-Herabregulation trägt, neben
weiteren Faktoren, zur Superinfektionsresistenz bei
34
6.6 Die Resistenz gegen eine Superinfektion schützt HIV-1 infizierte
T-Zellen vor dem frühzeitigen Tod durch Apoptose
37
7. Diskussion
39
8. Zusammenfassung
44
9. Literaturverzeichnis
46
2. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
2. Abkürzungsverzeichnis
A
As
Abb
AIDS
APC
bp
BSA
°C
CII-TA
CD
CHO Zellen
cm
CMV
CTL
DMEM
DMSO
DTT
DNA
dNTP
E.coli
EDTA
eGFP
ELISA
engl.
env
EtOH
FACS
FKS
g
gag
Gp
h
HBS
HEPES
HIV
HLA
HRP
ID
Ig
Ii
IL
IRES
Ampere
Aminosäure
Abbildung
engl.: acquired immunodeficiency syndrome
engl.: antigen presenting cell
Basenpaar
Rinderserumalbumin
Grad Celsius
engl.: major histocompatibility complex class-II transactivator
engl.: cluster designation
Zellen aus den Ovarien chinesischer Hamster
Zentimeter
engl.: Cytomegalovirus
engl.: cytotoxic T-Lymphocyte
engl.: Dulbecco`s modified eagle medium
Dimethylsulfoxid
Dithiothreitol
Desoxyribonukleinsäure
Desoxynukleosidtriphosphate
Escherichia coli
Ethylendiamintetraacetat
engl.: enhanced green fluorescent protein
engl.: enzyme linked immunosorbent assay
englisch
engl.: envelope
Ethanol
engl.: fluorescence activated cell sorter
fötales Kälberserum
Gramm
engl.: group specific antigen
Glykoprotein
engl.: hour
engl.: HEPES buffered saline
Hydroxyethylpiperazinethansulfonsäure
Humanes Immundefizienzvirus
engl.: human leucozyte antigen
engl.: horse raddish peroxidase
Identifikation
Immunglobulin
engl.: invariant chain (CD74)
Interleukin
engl.: internal ribosomal entry site
3
2. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
kB
kg
kD
l
LB
LTR
m
µ
M
MFI
MHC
min
n
N
NaOH
nef
ORF
PBMC
PBS
PCR
PE
Pen/Strep
PFA
PHA
P
pol
PPT
PR
R5-tropes Virus
Rev
RNA
rpm
RT
s
SDS
SDS-PAGE
SIV
SOC
SOE-PCR
Stabw
SV40
tat
Tab.
TEMED
Kilobasen
Kilogramm
Kilo-Dalton
Liter
Luria Bertani
engl.: long terminal repeat
milli (10-3)
mikro (10-6)
Molar (mol/l)
mittlere Fluoreszenzintensität
engl.: major histocompatibility complex
Minute
nano (10-9)
Normal
Natronlauge
engl.: negative factor
engl.: open reading frame
engl.: peripheral blood mononuclear cell
engl.: phosphate buffered saline
engl.: polymerase chain reaction
Phycoerythrin
Penicillin/Streptomycin
Paraformaldehyd
Phytohämagglutinin
pico (10-12)
Polymerase
Polypurintrakt
Protease
Virus, das den CCR5-Rezeptor für die Infektion einer Zelle benötigt
engl.: regulator of expression of virion proteins
Ribonukleinsäure
engl:: rounds per minute
Reverse Transkriptase
engl.: second
Natriumdodecylsulfat
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
engl.: simian immunodeficiency virus
Salz-optimiertes Medium mit Glukose (salt-optimized + carbon)
engl.: splice overlap extension-PCR
Standardabweichung
engl.: simian virus 40
engl.: transactivator of transcription
Tabelle
Tetramethylendiamin
4
2. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Tris
TM
U
vif
Vol
vpr
vpu
VSV
VSV-G
(v/v)
wt
(w/v)
X4-tropes Virus
A
C
D
E
F
G
H
Ala
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
5
Trishydroxymethylaminomethan
Transmembranprotein
Unit
engl.: viral infectivity factor
Volumen
engl.: viral protein rapid
engl.: viral protein out
engl.: vesicular stomatitis virus
engl.: vesicular stomatitis virus glycoprotein
Volumenanteil am Gesamtvolumen (engl.: volume per volume)
Wildtyp
Masse pro Volumen (engl.: weight per volume)
Virus, das den CxCR4-Rezeptor für die Infektion einer Zelle benötigt
Alanin
Cystein
Asparaginsäure
Glutaminsäure
Phenylalanin
Glycin
Histidin
I
K
L
M
N
P
Q
Ile
Lys
Leu
Met
Ans
Pro
Gln
Isoleucin
Lysin
Leucin
Methionin
Asparagin
Prolin
Glutamin
R
S
T
V
W
Y
Arg
Ser
Thr
Val
Trp
Tyr
Arginin
Serin
Threonin
Valin
Tryptophan
Tyrosin
3. EINLEITUNG
6
3. Einleitung
3.1 Humane Immundefizienzviren: Entdeckung und Epidemiologie
Im Jahr 1981 traten in New York und Los Angeles mysteriöse Todesfälle von
jungen homosexuellen Männern auf, die häufig an einem seltenen Hauttumor, dem so
genannten Kaposi-Sarkom, erkrankt waren und schließlich an opportunistischen
Infektionen verstarben. Da die betroffenen Personen die Symptome eines defekten
Immunsystems
zeigten,
wurde
die
Erkrankung
als
AIDS
(engl.:
acquired
immunodeficiency syndrome) bezeichnet (Gottlieb et al., 1981). Zwei Jahre lang wurde
nach der Ursache der erworbenen Immunschwäche geforscht, bis 1983 von der
Arbeitsgruppe um Luc Montagnier ein Retrovirus als Erreger der Krankheit identifiziert
wurde (Barré-Sinoussi et al., 1983). Erst drei Jahre später wurde dieses Virus der Familie
der Lentiviren zugeordnet und als „Humanes Immundefizienzvirus Typ 1“ (HIV-1)
bezeichnet (Coffin et al., 1986). Im gleichen Jahr wurde aus Blutlymphozyten eines
afrikanischen AIDS-Patienten ein mit HIV-1 verwandtes Immundefizienzvirus isoliert und
als „Humanes Immundefizienzvirus Typ 2“ (HIV-2) bezeichnet (Clavel et al., 1986).
Ursprünglich entstand das HI-Virus durch die Übertragung von natürlich vorkommenden
Affen-Immundefizienzviren (engl.: simian immunodeficiency virus, SIV) auf den
Menschen. Das älteste bekannte HIV-1 positive menschliche Blutserum stammt aus dem
Jahr 1959 (Zhu et al., 1998).
Seitdem hat sich AIDS zu einer weltweiten Pandemie entwickelt. Wie aus dem
jährlichen UNAIDS-Report ersichtlich wird (www.unaids.org), waren 2005 weltweit etwa
38,6 Millionen Menschen mit HIV infiziert, wovon sich etwa 4,1 Millionen neu infiziert
hatten. Die Mehrheit der Infizierten (etwa 26 Millionen) lebt im südlichen Afrika, wo in
manchen Regionen bereits jeder fünfte Erwachsene HIV-positiv ist. AIDS gehört mit 2,8
Millionen Toten im Jahr 2005 weltweit zu einer der häufigsten Todesursachen. Dies liegt
auch daran, dass trotz intensiver Forschung noch immer kein Impfstoff oder heilendes
Medikament gegen das HI-Virus existiert. Seit wenigen Jahren steht zwar eine
Kombinationstherapie zur Verfügung (hoch aktive antiretrovirale Therapie, HAART), die
an verschiedenen Stellen im Replikationszyklus des Virus ansetzt und zu einer deutlich
gesteigerten Lebenserwartung der Patienten führt (Palella et al., 1998), aber die
Behandlung ist sehr kostenintensiv und die Nebenwirkungen sind beträchtlich. Eine
vollständige Heilung durch die Eliminierung des Virus aus dem Organismus scheint
3. EINLEITUNG
7
bislang nicht möglich, da das Virus sein Genom in das Wirtszellgenom integriert und in
langlebigen CD4+ Zellpopulationen persistiert (Ho et al., 1998). Die dringend notwendige
Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes ist nach heutigem Kenntnisstand selbst auf
lange Sicht nicht zu erwarten (McMichael u. Hanke, 2003).
3.2 Morphologie und Genomaufbau der Humanen Immundefizienzviren
HIV-Partikel haben einen Durchmesser von ca. 100 nm und sind von einer
Phospholipiddoppelmembran umgeben, die der zellulären Zytoplasmamembran entstammt.
In diese ist das virale Transmembranprotein gp41 eingelagert, an welches das externe
Hüllprotein gp120 als Trimer nicht kovalent gebunden ist. Mit der Membraninnenseite sind
die p17 Matrixproteine über Myristinsäurereste verbunden. Das virale Genom in Form
zweier einzelsträngiger ca. 9,2 kB großer RNA Moleküle in Plusstrangorientierung
befindet sich im aus p24 Kapsidproteinen aufgebauten konischen Kapsid, welches über p6Proteine
mit
der
Membran
verbunden
ist.
Das
RNA-Genom
ist
mit
den
Nukleokapsidproteinen p7 und p9 komplexiert und bildet zusammen mit den viralen
Enzymen Intergrase (IN), Reverse Transkriptase (RT) und Protease (PR) das Nukleokapsid
(DeVita et al., 1997). Neben den Strukturproteinen werden auch Nef, Vpr und Vif in das
Viruspartikel inkorporiert (Cohen et al., 1990; Liu et al., 1995; Welker et al., 1996). Das
provirale Genom von HIV wird von langen Sequenzwiederholungen, den so genannten 5´
und 3´ LTRs (engl.: long terminal repeat), flankiert (Abb. 1).
Abb. 1: Genomorganisation von HIV-1. Abkürzungen: LTR: long terminal repeat; gag: group specific
antigen; pol: polymerase, vif: viral infectivity factor; tat: transactivator of transcription; r: vpr, viral
protein r; u: vpu, viral protein u; env: envelope; rev: regulator of expression of viral proteins ; nef:
negative factor.
Die 5´ LTR dient als Promoter für die zelluläre RNA-Polymerase II. Neben den für
die Retroviren typischen Strukturgenen gag, pol und env kodiert das HIV-1 Genom noch
3. EINLEITUNG
8
sechs weitere Gene. Hierbei handelt es sich um die regulatorischen Gene tat und rev sowie
die akzessorischen Gene vif, vpr, vpu und nef. Diese akzessorischen Proteine sind für die
Replikation des Virus in vitro nicht essentiell.
3.3 CD4-Herabregulation durch HIV-1
HIV-1 verwendet drei seiner Proteine (Vpu, Env und Nef) zur CD4Herabregulation (Lama, 2003). Nef wird in einem sehr frühen Stadium der Infektion
gebildet und entfernt als einziges der drei Proteine CD4-Moleküle direkt von der
Zelloberfläche. Dabei wirkt Nef als Verbindung zwischen CD4 und dem Adaptorprotein
AP-2 und bewirkt die Endozytose von CD4 und seine Degradation in Lysosomen
(Mangasarian et al., 1997; Piguet et al., 1998). Env und Vpu werden dagegen erst später
synthetisiert und blockieren den Transport von neu gebildetem CD4 zur Zelloberfläche,
indem Env das CD4-Molekül im Endoplasmatischen Retikulum zurückhält und Vpu die
Ubiquitinilierung und damit den schnellen Abbau der Env-CD4-Komplexe durch das
Proteasom veranlasst (Levesque et al., 2004).
Die CD4-Herabregulation bringt für das Virus mehrer Vorteile mit sich. Sie
erleichtert die Partikelfreisetzung aus der infizierten Zelle, da knospende Partikel mit
geringerer Wahrscheinlichkeit mit ihren eingelagerten viralen Hüllproteinen mit den CD4Molekülen auf der Wirtszellmembran interagieren. Eine Bindung von Env an CD4 würde
zu einer Fusion der Wirtszellmembran mit der sich abschnürenden Virusmembran führen
und somit das Knospen des Partikels verhindern (Bour et al., 1999; Ross et al., 1999). Des
weiteren wird durch die CD4-Herabregulation in der Virus produzierenden Zelle die
Infektiosität der Nachkommenviren gesteigert, da diese weniger CD4 in ihrer Membran
eingelagert haben, das direkt mit den Env-Proteinen interagieren könnte (Cortes et al.,
2002; Levesque et al., 2003). Außerdem soll durch eine hohe CD4-Expression die
Einlagerung von Env in die Virusmembran vermindert werden, wodurch die Infektiosität
reifer Partikel sinken würde (Lama et al., 1999). Weiterhin verhindert die CD4-Modulation
die effektive Stimulation des Immunsystems und schwächt damit die antivirale
Immunantwort, da CD4 mit dem MHC-Klasse II Komplex (engl. major histocompatibility
complex) einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) interagiert und ein wichtiger
kostimulatorischer Faktor der T-Zell-Rezeptor vermittelten T-Zell-Aktivierung ist (Weiss
et al., 1994). Schließlich soll durch die CD4-Herabregulation eine Superinfektion der
Wirtszelle vermieden (Benson et al. 1993; Michel et al., 2005) und damit möglicherweise
3. EINLEITUNG
9
der vorzeitige Tod durch Apoptose, induziert durch zu große Mengen an viraler DNA oder
viralen Proteinen im Zytoplasma, verhindert werden.
3.4 Fragestellung
Das Humane Immundefizienzvirus Typ 1 verwendet drei seiner Proteine (Vpu, Env
und Nef) zur Herabregulation von CD4 von der Zelloberfläche (Lama, 2003). Da CD4 der
primäre Rezeptor von HIV-1 und notwendig für eine Infektion der Zelle ist, wird seit
langem postuliert, dass die HIV-1 vermittelte CD4 Modulation eine als Superinfektion
bezeichnete zweite Infektion bereits infizierter Zellen verhindert. In bislang erfolgten
Studien wurden zur experimentellen Untersuchung dieser Hypothese chronisch infizierte
Zellen oder transfizierte Zellen, die Env oder Nef von einem Expressionsplasmid
exprimieren, verwendet (LeGuern et al., 1992; Benson et al., 1993; Little et al., 1994;
Pham et al., 2004; Michel et al., 2005). Es wurde jedoch noch nie experimentell gezeigt,
dass die Herabregulation von CD4 in produktiv infizierten T-Zellen eine anschließende
Superinfektion verhindert.
In der vorliegenden Promotionsarbeit sollte deshalb unter Verwendung
rekombinanter Viren mit einzelnen oder kombinierten Defekten in vpu, env und/oder nef
zunächst der Beitrag dieser drei viralen Gene zur CD4 Herabregulation bestimmt werden.
Anschließend sollte untersucht werden, wie effektiv Vpu, Env und verschiedene HIV-1,
HIV-2 und SIV Nef-Proteine HIV-1 infizierte T-Zellen gegen eine Superinfektion schützen
und ob diese Resistenz gegen eine Superinfektion die Zellen möglicherweise vor dem
frühzeitigen Tod durch Apoptose bewahrt.
4. MATERIAL
10
4. Material
4.1 Eukaryote Zelllinien
Jurkat:
humane T Zelllinie
293T:
humane Nierenepithelzellen, die mit Adenovirus Typ 5 transformiert
wurden und das SV40 (simian virus 40) large T-Antigen exprimieren
(DuBridge et al., 1987).
HeLa CII-TA:
humane Krebszelllinie aus einem Gebärmutterhalskarzinom, die
stabil mit dem CII-TA Plasmid transfiziert ist und humanes MHCKlasse II auf der Zelloberfläche exprimiert (Stumptner-Cuvelette et
al., 2001).
4.2 Bakterien
Escherichia coli XL2-Blue TM:
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1
lac[F’ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]
(Bullock et al., 1987) (Stratagene; Heidelberg).
4.3 Nukleinsäuren
4.3.1 Oligonukleotide
Folgende Oligonukleotide wurden von Biomers Deutschland (Ulm) bezogen, wichtige
Schnittstellen sind kursiv gezeichnet:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
dsred2PspAI
dsred2NcoI
dsred2NcoIuni
dsred2NcoIrev
5pBRnef HpaI
3pBRNL43nef MluI
3pBRNA7nef MluI
5pBRenv-NdeI
3pBRenv-NdeI
NL43PflMI
NL43StuI
GTCCCGGGTTATCTCGATCCGGTGGATCCTGGGC
CACCATGGCCTCCTCCGAGAACGTC
GAAGAAGACAATGGGCTGGGAGGC
GCCTCCCAGCCCATTGTCTTCTTC
GCTGTTAACTTGCTCAATGCCACAGCC
CGACGCGTTCAGCAGTTCTTG
CGACGCGTTCAGCAGTCTTTG
GATGCTAAAGCATATATGATACAGAGG
CCTCTGTATCATATATGCTTTAGCATC
GTCTCCATAGAATGGAGGAAAAAG
CCTTTGGACAGGCCTGTGTAATG
4.3.2 Plasmide
Alle verwendeten Plasmide enthalten das Ampicillinresistenzgen zur Selektion in
Bakterienstämmen.
4. MATERIAL
pDSRed2-C1
11
Vektor zur Amplifikation des DsRed2-Gens von
Clontech (Mountain View, CA; USA).
PCR2.1-TOPO-TA Vektor:
Vektor zum Klonieren von PCR-Fragmenten von
Invitrogen (Karlsruhe).
pBR-NL4-3 vpu-:
pBR322 Vektor, der das HIV-1 NL4-3 Provirus
enthält. Das vpu-Gen ist durch eine 40 Aminosäuren
umfassende Deletion (von As 1 bis 40) zerstört
(Rücker et al., 2004).
pBR-NL4-3-IRES-eGFP:
pBR322 Vektor, der das HIV-1 NL4-3 Provirus
enthält. Dieses wurde so verändert, dass Nef und
eGFP
mittels
eines
IRES-Elements
von
einer
bicistronischen mRNA exprimiert werden (Schindler
et al., 2005).
pBR-NL4-3 nef- -IRES-eGFP:
pBR-NL43-IRES-eGFP Vektor mit einem defekten
nef-Gen (Schindler et al., 2005).
pHIT60:
Expressionsvektor,
der
das
Hüllprotein
des
Vesikulären Stomatitis Virus (VSV-G) exprimiert
(Hiebenthal-Millow u. Kirchhoff., 2002).
4.3.3 Längenstandard
″1-kb-Leiter″ Invitrogen/Gibco (Karlsruhe)
4.3.4 Nukleotide für die Polymerase-Ketten-Reaktion
dNTPs für die Polymerase-Ketten-Reaktion wurden von Invitrogen (Karlsruhe) bezogen.
4.4 Enzyme
4.4.1 Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonukleasen wurden von New England Biolabs (Schwalbach, Traunstein)
bezogen und in den vom Hersteller empfohlenen Puffersystemen verwendet.
4.4.2 Sonstige Enzyme
Taq-DNA-Polymerase
Stratagene Europe AG (Heidelberg)
T4-DNA-Ligase
Invitrogen/Gibco (Karlsruhe)
4. MATERIAL
12
RNAse A aus Rinderpankreas
Boehringer (Mannheim)
Trypsin aus Rinderpankreas
Stratagene Europe AG (Heidelberg)
Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm
Boehringer (Mannheim)
4.5 Reagenzien und Laborhilfsmittel
Agarose
Invitrogen/Gibco (Karlsruhe)
Ampicillin
Bayer (Leverkusen)
AnnexinV Binding Puffer
BD Biosciences
AnnexinV-APC
Caltag
BCIP/NBT Phosphatase Substrat
KPL
Biocoll Separating Solution
Biochrom (Berlin)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Fluka (Neu-Ulm)
DMRIE-C
Invitrogen/Gibco (Karlsruhe)
Dithiothreitol (DTT)
Amersham Pharmacia (Freiburg)
Ethidiumbromid (EtBr)
Sigma (München)
Ethylen-Diamin-Tetraacetat (EDTA)
Sigma (München)
Fötales Kälberserum (FKS)
Invitrogen/Gibco (Karlsruhe)
Glycerin
Merck (Darmstadt)
Interleukin-2 (IL-2)
Strathmann (Dengelsberg)
Isopropanol
Merck (Darmstadt)
L-Glutamin
Invitrogen/Gibco (Karlsruhe)
Natriumazid
Merck (Darmstadt)
Natriumchlorid
Sigma (München)
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Sigma (München)
Natriumfluorid
Sigma (München)
N, N’-Methylen-Bisacrylamid
Sigma (München)
N, N, N’, N’,-Tetramethylendiamin (TEMED)
Sigma (München)
Nonidet P 40 (NP40)
Sigma (München)
NuPAGE Novex Bis-Tris Gele
Invitrogen/Gibco (Karlsruhe)
NuPAGE LDS Sample Puffer
Invitrogen/Gibco (Karlsruhe)
NuPAGE Reducing Agent
Invitrogen/Gibco (Karlsruhe)
Paraformaldehyd (PFA)
Sigma (München)
Penicillin G
Sigma (München)
4. MATERIAL
13
Phosphat-Buffered-Saline (PBS)
Invitrogen/Gibco (Karlsruhe)
Phytohämaglutinin (PHA)
Remel (Lenexa,USA)
Reaktionsgefäße
Eppendorf (Hamburg)
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrat KPL
Triton X-100
Sigma (München)
Tween 20
Roth (Karlsruhe)
Whatman Papier
Whatman (Maidstone, Kent; England)
4.6 Reagenzsysteme (Kits)
RosetteSep Human CD4+ T Cell
Enrichment Cocktail
StemCell Technologies
TA Cloning Kit
Invitrogen/Gibco (Karlsruhe)
Takara DNA Ligationskit
Böhringer Ingelheim (Heidelberg)
Ultra CleanTM 15
Mobio Inc. (Solana, CA; USA)
WizardTM Plus Midipreps
Promega (Madison, WI; USA)
4.7 Medien
4.7.1 Zellkulturmedien
Adhärente Zellen:
DMEM
(Dulbecco’s
modified
Eagle
Medium;
Invitrogen/Gibco) mit 350µg/ml L-Glutamin, 120µg/ml
Streptomycinsulfat, 120µg/ml Penicillin und 10% (v/v)
hitzeinaktiviertem FKS.
Suspensionszellen:
RPMI-1640 Medium (Invitrogen/Gibco) mit 350µg/ml LGlutamin, 120µg/ml Streptomycinsulfat, 120µg/ml Penicillin
und 10% (v/v) hitzeinaktiviertem FKS.
4.7.2 Bakterienkulturmedien
LB-Medium:
10g/l Bacto-Trypton, 5g/l Hefeextrakt, 8g/l NaCl, 1g/l Glukose;
Zugabe von 100mg/l Ampicillin vor Gebrauch. Der pH-Wert wurde
mit NaOH auf 7,2 eingestellt
LBAMPAgar:
15g/l Agar und 100mg/l Ampicillin in LB-Medium;
SOC-Medium:
20g/l Bacto-Trypton, 5g/l Hefeextrakt, 2,5mM NaCl, 10mM MgCl2,
10mM, MgSO4, 20mM Glukose.
4. MATERIAL
14
4.8 Lösungen und Puffer
4.8.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien
Resuspensionspuffer (P1), Lysispuffer (P2), Neutralisationspuffer (P3) (Qiagen, Hilden),
70% EtOH, Isopropanol und LiChrosolv-H2O.
4.8.2 Calcium-Phosphat-Transfektion
2x HBS (10x Stock): 8,18% NaCl (w/v); 5,94% HEPES (w/v); 0,2% Na2HPO4 (w/v). Die
Lösung wurde sterilfiltriert und der pH-Wert mit 1M NaOH auf 7,12 eingestellt. 2M CaCl2
4.8.3 HIV p24 Kapsid-Antigen-ELISA
Lösung zur Lyse der Viruspartikel: 10ml Triton X-100 (Sigma, München), ad 100ml H2O
Waschpuffer:
25ml 20x Waschkonzentrat (KPL, Maryland), ad
500ml mQ-H2O;
Probenpuffer:
RPMI Medium plus 0,2% Tween 20
Substrat:
TMB Peroxidase Substrat System (KPL, Maryland);
Stoplösung:
4N H2SO4
4.8.4 Herstellung von Zelllysaten
Lysepuffer:
1% Triton X-100; 0,15 M NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7.4; 5 mM EDTA;
1 mM NaF; 1 mM Na2VO3
4.8.5 Sonstige Lösungen und Puffer
FACS-Puffer:
1*PBS, 1%FKS, 0,1%Na-Azid
PBS:
137mM NaCl; 7,3mM Na2HPO4; 1,47mM K2HPO4; 1mM CaCl2;
2mM MgCl2
50x TAE-Puffer:
500mM Tris, 250mM Natriumacetat, 50mM Na2EDTA.
4.9 Antikörper für die Durchflusszytometrie
Anti-CD4-PE
(Serotec, Düsseldorf)
Anti-CxCR4-PE
(BD Bioscience)
Anti-CCR5-PE
(BD Bioscience)
5. METHODEN
15
5. Methoden
5.1 DNA-Methoden
5.1.1 Standardmethoden
Folgende Methoden wurden nach Protokollen von Maniatis et al., 1989,
durchgeführt:
-
Plasmid-DNA-Isolierung nach alkalischer Lyse der Bakterien
-
Ethanol- und Isopropanolfällung der DNA
-
Konzentrationsbestimmung der Nukleinsäuren
-
Dephosphorylierung von DNA 5' Enden mit alkalischer Phosphatase
-
Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
-
Ligation von DNA-Fragmenten mit T4-DNA-Ligase
-
Auftrennung von Nukleinsäuren durch Gelelektrophorese
5.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien
Plasmid-DNA für Klonierungen wurde durch alkalische Lyse von Bakterien und
anschließende Isolierung und Reinigung der DNA gewonnen (Maniatis et al., 1989). Für
Sequenzierreaktionen oder die Transfektion eukaryoter Zellen wurden die Präparationen
mit dem WizardTM Plus Midipreps Kit (Promega; Madsion, WI, USA) oder dem QIAwell
8 Miniprep Kit (Qiagen; Hilden) nach Angaben der Hersteller durchgeführt. Die DNAKonzentrationen wurden in einem Spektralphotometer (Eppendorf) bestimmt.
5.1.3 Isolierung von DNA aus Agarosegelen
Die DNA-Fragmente wurden in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt,
unter Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht (366nm) sichtbar gemacht und die DNABanden mit einem Skalpell ausgeschnitten. Anschließend wurde die DNA mit dem
Geneclean® II Kit (Dianova, Hamburg) entsprechend den Anweisungen des Herstellers
isoliert.
5.1.4 Ligation von DNA
Ligationen wurden mit dem Takara DNA-Ligationskit (Boehringer Ingelheim,
Heidelberg) durchgeführt. Plasmid-DNA und Insert-DNA wurden im Verhältnis von 1:3
nach den Protokollen der Hersteller eingesetzt.
5. METHODEN
16
5.1.5 DNA-Sequenzierung
Sequenzierreaktionen wurden kommerziell bei der Firma MWG-Biotech AG in
Auftrag gegeben. 2µg DNA wurden bei 60°C eingedampft und eingeschickt.
5.1.6 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Alle PCR-Reaktionen wurden nach dem Protokoll von Saiki et al. (1988), in einem
Thermocycler (PTC-100TM, MJ Research) durchgeführt.
5.2 Zellkultur
5.2.1 Kultur adhärenter Zellen
Die adhärenten Zellen wurden in 25cm2 Zellkulturflaschen in DMEM bei 37°C und
5% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich 1:10 bis 1:20 gesplittet.
5.2.2 Kultur von Suspensionszellen
Die Suspensionszellen wurden in 25cm2 Zellkulturflaschen in RPMI-1640 bei 37°C
und 5% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich 1:10 bis 1:20 gesplittet.
5.3 Bakterienkultur
Alle verwendeten Plasmide enthalten ein Ampicillin-Resistenzgen. Transformierte
Bakterien wurden daher durch Zusatz von Ampicillin (100µg/ml) zum Kulturmedium
selektioniert. Verwendet wurde der Escherichia coli-Stamm XL2-BlueTM. Die Kulturen
wurden für mindestens 12h bei 37 °C in LBamp-Flüssigmedium geschüttelt oder auf LBampAgarplatten
inkubiert.
Bakterienstocks
wurden
durch
Vermischen
von
500µl
Bakterienkultur mit 500µl Glycerin erstellt und bei -80 °C eingefroren.
5.3.1 Transformation von Escherichia coli XL2TM-Blue
Nach dem Auftauen der kompetenten Zellen auf Eis wurden je 10µl davon zu 5µl
Ligationsansatz pipettiert und die Ansätze für 30min auf Eis inkubiert. Anschließend
erfolgte ein Hitzeschock der Bakterien für 30s bei 42°C im Wasserbad und eine 2 Minuten
dauernde Inkubation auf Eis. Nach Zugabe von 180µl SOC-Medium und einer Inkubation
von 30min bei 37°C wurde die Bakteriensuspension auf LBamp-Agarplatten ausplattiert und
bei 37°C über Nacht inkubiert.
5. METHODEN
17
5.4 Herstellung rekombinanter HIV-1 NL4-3 Viren
5.4.1 Herstellung rekombinanter HIV-1 NL4-3-IRES-eGFP Viren
Zur Herstellung der HIV-1 NL4-3-IRES-eGFP Viren, die in den Genen vpu, env
und nef einzeln oder kombiniert defekt sind, wurde zuerst aus dem bestehenden Vektor
pBR-NL4-3 vpu- der das vpu-Gen umfassende Bereich über PflMI und StuI in die
Vektoren pBR-NL4-3-IRES-eGFP und pBR-NL4-3 nef- -IRES-eGFP umkloniert.
Anschließend wurde mittels splice overlap extension (SOE)-PCR das env-Gen durch eine
Insertion von zwei Nukleotiden in die NdeI-Schnittstelle, durch die es zu einer
Verschiebung des env-Leserahmens und damit zu einem vorzeitigen Stoppcodon kommt,
mutiert (env-). Dazu wurden in zwei PCR-Ansätzen mit den Primerpaaren NL43PflMI /
3pBRenv-NdeI bzw. NL43StuI / 5pBRenv-NdeI (siehe 4.3.1) die DNA-Bereiche von der
PflMI- bis zur NdeI-Schnittstelle im env und von dort bis zur StuI-Schnittstelle im env aus
den entsprechenden rekombinanten pBR-NL4-3-IRES-eGFP Vektoren amplifiziert. Die
Produkte wurden über Agarosegelelektrophorese aufgereinigt, die DNA aus dem Gel
isoliert und beide Fragmente als „template“ in einer zweiten PCR mit den zugehörigen
Primern NL43PflMI und NL43StuI eingesetzt. Dieses Amplikon wurde wiederum
aufgereinigt, mit PflMI und StuI verdaut und in die ebenso präparierten rekombinanten
pBR-NL4-3-IRES-eGFP Vektoren kloniert.
Zur Herstellung von env-defekten HIV-1 NL4-3-IRES-eGFP Viren, die
unterschiedliche nef-Allele exprimieren, wurden die entsprechenden nef-Allele aus pBRNL4-3 Vektoren mit dem 5’ Primer 5pBRnef HpaI und dem nef-spezifischem 3’ Primer
3pBRNL43nef MluI bzw. 3pBRNA7nef MluI (siehe 4.3.1) in einer Standard-PCRReaktion amplifiziert und über HpaI und MluI in den pBR-NL4-3 env- -IRES-eGFP
Vektor kloniert.
5.4.2 Herstellung rekombinanter HIV-1-NL4-3-IRES-DsRed2 Viren
Als Ausgangskonstrukte wurden die unter 5.4.1 beschriebenen IRES-eGFP Viren
verwendet, bei denen das eGFP Gen durch das DsRed2 Gen ersetzt wurde. Dazu wurde
mittels SOE-PCR das DsRed2 Gen in zwei Schritten amplifiziert und dabei die enthaltene
interne NcoI-Schnittstelle still mutiert. Als erstes wurde das DsRed2-Gen aus dem Vektor
pDSRed2-C1 (Clontech) mit den Primerpaaren dsred2NcoI / dsred2NcoIrev bzw.
dsred2PspAI / dsred2NcoIuni (siehe 4.3.1) in zwei PCR-Ansätzen amplifiziert. Die
Produkte aus diesen PCR-Reaktionen wurden über Agarosegelelektrophorese aufgereinigt,
5. METHODEN
18
die DNA aus dem Gel isoliert und beide Fragmente als „template“ in einer zweiten PCR
mit den zugehörigen Primern dsred2NcoI und dsred2PspAI eingesetzt. Dieses Amplikon
wurde wiederum aufgereinigt, in den pCR2.1-TOPO-TA Vektor (Invitrogen) kloniert und
sequenziert. Anschließend erfolgte die Umklonierung des DsRed2-Gens über NcoI und
PspAI in die ebenso verdauten proviralen IRES-eGFP Vektoren.
5.5 Isolierung primärer Lymphozyten aus Buffy Coat
Zur Isolierung primärer Blutlymphozyten (PBMC „peripheral blood mononuclear
cells“) und CD4+-T-Zellen wurde Buffy Coat (Lymphozytenkonzentrat aus 500ml
Vollblut) von der Blutspendenzentrale Ulm bezogen und 1:3 in PBS verdünnt. Für die
Gewinnung von CD4+-T-Zellen wurde das verdünnte Blut außerdem mit einer
Antikörpermischung (RosetteSep von StemCell Technologies) vermengt und 30min bei
Raumtemperatur inkubiert, wobei alle CD4 negativen Zellen an die Erythrozyten gebunden
werden. Das verdünnte Buffy Coat wurde dann über Biocoll Separating Solution
(Biochrom) geschichtet und durch Dichtegradientenzentrifugation für 30min bei 2500rpm
aufgetrennt. Die angereicherten Lymphozyten wurden aus der Interphase abgenommen,
zweimal in PBS gewaschen und in RPMI1640 mit 10% FKS und 1% Pen/Strep in einer
Konzentration von 2*106 Zellen/ml aufgenommen. Zur Stimulation der Lymphozyten
erfolgte die Zugabe von 10ng/ml IL-2 und 3µg/ml PHA.
5.6 Herstellung von Virusstocks und Infektionen
5.6.1 Kalzium-Phosphat-Transfektion von 293T-Zellen
Die Transfektion der 293T-Zellen wurde nach der Kalzium-Phosphat-PräzipitatMethode durchgeführt. Am Tag vor der Transfektion wurden 0,2 x 106 Zellen in 6-WellPlatten ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5%igem CO2-Gehalt inkubiert. Die Zellen
waren zum Zeitpunkt der Transfektion zu 50-75% konfluent. Für die DNA-Arbeitslösung
wurden 5µg DNA mit 13µl 2M CaCl2 gemischt und mit H2O auf 100µl aufgefüllt. Diese
Lösung wurde tropfenweise zu 100µl 2 x HBS zugegeben. Nach 5min Inkubation bei
Raumtemperatur bildete sich ein milchiges Präzipitat. Der Transfektionscocktail wurde auf
das Medium der Zellkulturen getropft und die Zellen über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach
etwa 16h wurde das Medium (DMEM: 10% FKS, Glutamin, SP) erneuert. Die Virusstocks
wurden am dritten Tag abgenommen und 3min bei 2000rpm abzentrifugiert.
5. METHODEN
19
5.6.2 HIV p24 Kapsid Antigen-ELISA
Die Konzentration viralen Antigens in Virusüberständen wurde mittels HIV p24
Kapsid Antigen-ELISA (AIDS Repository; Frederick, MD; USA) bestimmt. Das durch
Lyse mit Triton X-100 freigesetzte HIV-Kapsidprotein p24 bindet an einen monoklonalen
Maus-Antikörper. Ungebundenes Material wurde durch Waschen entfernt. Die
Quantifizierung des Kapsidproteins erfolgt durch die sogenannte „sandwich“-ELISA
Methode. Zuerst wurde ein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen zugegeben, der an das
Kapsid-Protein p24 bindet. Der gebundene Antikörper wurde mit Anti-KaninchenAntikörper, der mit einer Peroxidase gekoppelt ist, inkubiert. Nach Zugabe des Substrates
(SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate, KPL) kommt es zu einer
Farbänderung der Lösung. Die enzymatische Reaktion wurde durch 1N Salzsäure gestoppt
und die photometrische Quantifizierung des gefärbten Produktes erfolgte bei den
Wellenlängen 450 und 650nm. Die gemessene Farbkonzentration ist proportional zu der
Menge an Kapsidprotein und wird in ng/ml p24 angegeben.
5.6.3 Infektion primärer Lymphozyten und Jurkat-Zellen,
Zur Infektion wurden 1 Million prästimulierter PBMCs oder Jurkat Zellen in 50ng
p24 Virusstock aufgenommen und für 4-6h bei 37°C inkubiert. Dann erfolgte die Zugabe
von 3ml RPMI 1640 mit 10% FKS und 1% Pen/Strep. PBMCs wurden zusätzlich mit
10ng/ml IL-2 stimuliert. Die FACS-Analysen erfolgten zu verschiedenen Zeitpunkten
innerhalb von 3 Tagen nach Infektion.
5.6.4 Superinfektion von T-Zellen
Jurkat T-Zellen wurden wie unter 5.6.3 beschrieben mit unterschiedlichen VSV-G
pseudotypisierten HIV-1 NL4-3-IRES-DsRed2 Viren infiziert. 3 Tage später wurden die
Zellen bei 1300rpm für 3 min zentrifugiert, in 300ng p24 HIV-1 NL4-3-IRES-eGFP
Virusstock resuspendiert und für 4-6h bei 37°C inkubiert. Dann erfolgte die Zugabe von
3ml RPMI 1640 mit 10% FKS und 1% Pen/Strep. Nach weiteren 2 Tagen wurden die
Zellen im FACS analysiert.
5. METHODEN
20
5.7 FACS-Analysen
5.7.1 Modulation von Oberfächenmarkern auf T-Zellen
Zur FACS-Färbung wurden Zellen einer Transfektion oder Infektion in die
entsprechende Zahl an Färbungen aufgeteilt und einmal mit 800µl FACS Puffer
gewaschen. Nach der Zentrifugation für 5min bei 1400rpm wurden die Zellen in 100µl
FACS-Puffer
+
5-10µl
PE
konjugiertem
Antikörper
(nach
Herstellerangaben)
aufgenommen und für 30min bei 4°C gefärbt. Nach einem Waschschritt mit 1ml FACSPuffer wurden die Zellen in 200µl FACS-Puffer mit 2% PFA für 15min bei 4°C fixiert und
im FACS (FACSCalibur, Becton-Dickinson) vermessen.
5.7.2 Apoptose superinfizierter T-Zellen
Jurkat oder CD4+-T-Zellen wurden wie in 5.6.4 beschrieben superinfiziert und die
Messung der Apoptoserate erfolgte über die Bindung von AnnexinV an apoptotische
Zellen. Dazu wurden Aliquots der infizierten Zellen in 800µl PBS gewaschen, in 100µl
AnnexinV Bindepuffer (Apoptosis Detection Kit, BD Bioscience) plus 5µl AnnexinVAPC (Caltag) aufgenommen und nach 15min Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln
in 200µl AnnexinV Bindepuffer plus 3% PFA fixiert. Anschließend wurde im FACS der
Anteil an apoptotischen Zellen (AnnexinV+) in den DsRed2+, eGFP+, DsRed2+/eGFP+ und
nicht infizierten Zellpopulationen bestimmt.
5.8 Nachweis viraler Proteine durch Western Blot Analyse
5.8.1 Herstellung von Zell- und Viruslysaten
Zur Herstellung von Zelllysaten wurden in 6-Well-Platten mit 5µg proviraler DNA
transfizierte 293T-Zellen oder mit VSV-G-Pseudotypen infizierte HeLa-Zellen verwendet.
1 Tag nach der Transfektion bzw. 3 Tage nach der Infektion wurde das Kulturmedium
abgenommen und die Zellen in 200µl Lysepuffer lysiert. Vorhandene Zellreste wurden
durch Zentrifugation für 5min bei 2000rpm pelletiert.
Zur Herstellung von Viruslysaten wurden Virusstocks, die 150ng p24 enthielten,
für 3h bei 14000rpm zentrifugiert und das Viruspellet anschließend in 80µl Lysepuffer
lysiert.
5. METHODEN
21
5.8.2 Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE und Nachweis im Western Blot
Je 20µl des jeweiligen Lysats wurden mit 5µl NuPAGE LDS Sample Puffer und
2µl NuPAGE Reducing Agent gemischt, für 10min bei 80°C inkubiert und mit Hilfe eines
NuPAGE Novex Bis-Tris Polyacrylamidgels in einer XCell SureLock Mini-Cell
Elektrophoresekammer aufgetrennt (Invitrogen). Nach dem Prinzip des Semi-Dry-Blots
wurden die aufgetrennten Proteine dann mit einem Trans-Blot SD Gerät (BioRad) auf eine
Immobilon PVDF Transfer Membran (Millipore) übertragen und diese in 25ml Detector
Block Solution (KPL) leicht geschwenkt. Nach 2h wurde der für das zu detektierende
Protein spezifische Antikörper entsprechend den Herstellerangaben zugesetzt und die
Membran für eine weitere Stunde geschwenkt, bevor die ungebundenen Antikörper in drei
Waschschritten a 5min mit Wash Solution (KPL) entfernt wurden. Durch Inkubation der
Membran für 1h mit einem spezifisch an den ersten Antikörper bindenden zweiten
Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase markiert war (KPL), wurden nach weiteren
drei Waschschritten die Proteine durch Zugabe von BCIP/NBT Substrat (KPL) in einer
enzymatischen Reaktion direkt auf der Membran nachgewiesen.
5.9 Computerprogramme und Datenquellen
5.9.1 Computerprogramme zur Sequenzanalyse
Für die Auswertung von Aminosäure und DNA-Sequenzen wurden folgende
Programme
aus
dem
Internet
benutzt:
Sequence
Reverse
Complementor
(http://bioinformatics.org/sms/rev_comp.html/), Sequenz-Alignment Programm MultAlin
V5.4.1
(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/)
und
das
DNA/Aminosäuresequenz
Programm Expasy-Tool (http://www.expasy.org/tools/dna.html). Außerdem wurden die
Programme Bioedit V5.0.9 von Tom Hall, Department of Microbiology, North Carolina
State University, Raleigh, NC, USA, und Gene Construction Kit V2.0 von Bob Gross und
Anders Putte zur Sequenzanalyse verwendet.
5.9.2 Computerprogramme zur FACS-Auswertung
Für die FACS-Auswertung wurde das Programm CellQuest-Pro von Becton
Dickinson benutzt, sowie Microsoft Excel Office XP zur Tabellenkalkulation.
5. METHODEN
22
5.9.3 Statistische Auswertungen und Korrelationsanalysen
Für alle statistischen Analysen wurde das GraphPad PRISM Programm Version 4.0
(Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA) benutzt. P-Werte wurden mit dem beidseitigen
Students-T-Test und Mann-Whitney–Test berechnet.
6. ERGEBNISSE
23
6. Ergebnisse
6.1 Rekombinante HIV-1 NL4-3 Viren mit defekten vpu, env und nef Genen
HIV-1 verwendet drei seiner Proteine zur Herabregulation von CD4 von der
Zelloberfläche, was unter anderem eine Superinfektion verhindern soll (Benson et al.,
1993). Um den Beitrag der drei viralen Proteine Vpu, Env und Nef zur CD4Herabregulation und der damit verbundenen Resistenz gegen eine Superinfektion zu
bestimmen, wurden rekombinante Humane Immundefizienzviren mit einzelnen und
kombinierten Defekten in den entsprechenden drei Genen hergestellt.
Dazu wurden diese Gene in dem proviralen Vektor pBR-NL4-3-IRES-eGFP wie
unter 5.4.1 beschrieben zerstört, wobei alle anderen viralen Proteine im natürlichen
Kontext unter Kontrolle des LTR-Promoters und der ursprünglichen Spleißstellen
exprimiert werden. Außerdem koexprimieren alle proviralen Konstrukte Nef und eGFP
von einer bicistronischen mRNA, wodurch die Unterscheidung von infizierten und nicht
infizierten Zellen ermöglicht wird (Abb. 2).
Abb. 2: Rekombinante provirale HIV-1 NL4-3 Konstrukte mit defekten vpu, env und nef Genen.
Es wurden sieben provirale Konstrukte mit einzelnen oder kombinierten Defekten in den Genen vpu, env
und nef hergestellt. Der schwarze Balken zeigt die Lage der Deletion im vpu-Gen und die Sterne geben
die Position der vorzeitigen Stopp-Codons im env- und nef-Gen wieder. Alle Konstrukte exprimieren
eGFP über ein IRES-Element. LTR, long terminal repeat; r, vpr; u, vpu; IRES, interne
Ribosomeneintrittstelle; FP, Fluoreszenzprotein.
Zur Kontrolle der viralen Genexpression wurden die proviralen Konstrukte in 293T
Zellen transfiziert und die Proteine Nef, p24 und eGFP sowie das zelluläre Protein ß-Actin
in den Zelllysaten durch Western Blot Analyse nachgewiesen (Abb. 3). Vpu konnte in den
293T-Lysaten aufgrund einer auf gleicher Höhe laufenden unspezifischen Bande nicht
6. ERGEBNISSE
24
detektiert werden, weshalb hierfür Zelllysate von mit VSV-G Pseudotypen infizierten
HeLa-Zellen verwendet wurden. Das virale Env Protein gp120 wurde in Viruslysaten
detektiert. Wie in Abbildung 3 dargestellt, zeigten die verschiedenen Konstrukte die
erwarteten Unterschiede in ihrer Fähigkeit zur Expression von Vpu, Env und Nef. p24 und
eGFP wurde von allen proviralen Konstrukten in ähnlichen Mengen exprimiert. eGFP
diente als Kontrolle für die Transfektionseffizienz und die ß-Actin Banden zeigen, dass
gleiche Zelllysatmengen verwendet wurden.
Abb.
3:
Proteinexpression
der
re-
kombinanten HIV-1 NL4-3 Konstrukte.
Nef, p24, eGFP und ß-Actin wurden in
Zelllysaten transfizierter 293T-Zellen und
Vpu in Lysaten infizierter HeLa-Zellen durch
Western
Blot
Analyse
detektiert.
Der
Nachweis des Env Proteins gp120 erfolgte in
Viruslysat. Mock, ohne provirale DNA.
6.2 CD4-Modulation in HIV-1 infizierten Zellen
Um den Beitrag der viralen Proteine Vpu, Env und Nef zur CD4-Modulation zu
ermitteln wurden unter Verwendung der Konstrukte mit einzelnen und kombinierten
Defekten in den entsprechenden Genen (Abb. 2) VSV-G pseudotypisierte Viren
hergestellt. Diese tragen das Hüllprotein des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) auf ihrer
Oberfläche, was den CD4-unabhängigen Eintritt des Partikels in die Zielzelle und somit
auch die Untersuchung der env-defekten Viren erlaubt. Außerdem können Zielzellen so
unter Umgehung der Nef-vermittelten Erhöhung der Partikelinfektiosität mit vergleichbar
hoher Effizienz transduziert werden (Lama, 2003). Mit den VSV-G pseudotypisierten
Viren wurden Jurkat T-Zellen infiziert, die nach der Markierung des CD4 auf der
6. ERGEBNISSE
25
Zelloberfläche mit Antikörpern im FACS zu unterschiedlichen Zeitpunkten analysiert
wurden (Abb. 4).
Abb. 4: Kinetik der CD4-Modulation in HIV-1 infizierten Jurkat T-Zellen. (A) FACS-Analyse (24
bzw. 48 Stunden nach der Infektion) von Jurkat T-Zellen, die mit rekombinanten HIV-1 NL4-3 Viren
transduziert wurden, die in den Genen vpu, env und nef einzeln und kombiniert defekt sind. Die Zahlen
geben die roten MFIs für den entsprechenden eGFP Bereich an. (B) Quantitative Auswertung der CD4Herabregulation. Erläuterung zur Berechnung der X-fachen CD4-Modulation im Text. Es wurde jeweils
die CD4-Modulation bei niedriger (links) und mittlerer (rechts) eGFP Expression (siehe A) zu den
angegebenen Zeitpunkten bestimmt. E, env; U, vpu; N, nef.
24 Stunden nach der Infektion konnten im FACS erstmals grüne (d.h. infizierte)
Zellen nachgewiesen werden. Ab diesem Zeitpunkt enthielten alle Zellen, die mit nefintakten Viren infiziert waren, reduzierte Mengen an CD4 auf der Zelloberfläche (Abb.
4A, Spalte 2 und 4 bis 6). Zellen, die das virale Env Protein exprimierten zeigten
unabhängig von Nef bei starker eGFP- und somit auch viraler Genexpression ebenfalls
verminderte CD4 Oberflächenlevel (Abb. 4A, Spalte 3 und 7), wogegen die Expression
von Vpu nur zu einer minimalen Abnahme von CD4 führte. Da infizierte Zellen Nef und
6. ERGEBNISSE
26
eGFP von einer bicistronischen mRNA in einem konstanten stöchiometrischen Verhältnis
koexprimieren, kann die Nef-Expression mit der Rezeptormodulation korreliert werden.
Zur
Kalkulation
der
X-fachen
CD4-Modulation
wurde
die
rote
mittlere
Fluoreszenzintensität (MFI) eines definierten Bereichs der eGFP Expression (s. Abb. 4A)
des vpu, env und nef defekten Kontrollkonstrukts (E-U-N-) durch die MFI des
entsprechenden Bereichs der Zellen geteilt, die unterschiedliche Kombinationen dieser drei
Gene exprimieren. Die quantitative Auswertung der CD4-Modulation durch die acht
untersuchten Viren ist in Abbildung 4B dargestellt. Es zeigte sich, dass bei niedrigen eGFP
Expressionsleveln Nef eine vier- bis fünffache Herabregulation von CD4 bewirkt,
wogegen Env und Vpu keinen nennenswerten Einfluss auf CD4 hatten (Abb. 4B, links).
Bei mittleren Expressionsleveln bewirkte Nef eine fünfzehnfache Reduktion von CD4 und
zusammen mit Env wurde die CD4-Menge sogar um das fünfundzwanzigfache verringert.
Die Expression von Env in Abwesenheit von Nef bewirkte eine sechsfache Verminderung
der CD4-Expression. Vpu hatte auch bei gesteigerter Proteinexpression keine signifikante
Wirkung (Abb. 4B, rechts). Nef regulierte CD4 somit in Jurkat Zellen effizient herab,
wogegen Env nur eine schwache Wirkung zeigte und Vpu keinen messbaren Effekt hatte.
Die Effizienz der CD4-Herabregulation durch Vpu, Env und Nef unterscheidet sich
möglicherweise in immortalisierten Zellen (wie z.B. Jurkat T-Zellen) und Primärzellen.
Deshalb wurden auch humane PBMCs (engl. peripheral blood mononuclear cell), die mit HIV1 infiziert wurden, zur Analyse der CD4-Modulation verwendet. Wie in Abbildung 5A
dargestellt, konnte nach Markierung der PBMCs mit anti-CD4-Antikörpern im FACS eine
CD4+ und eine CD4-/CD4niedrig Zellpopulation unterschieden werden. Beide PBMCPopulationen wurden mit den VSV-G pseudotypisierten HIV-1 Viren transduziert und 32
Stunden später konnten die ersten eGFP-positiven, infizierten Zellen detektiert werden.
PBMCs, die mit dem E-U-N--Kontrollkonstrukt infiziert waren, exprimierten auch bei
hoher viraler Proteinexpression konstante CD4-Mengen auf ihrer Zelloberfläche (Abb. 5A,
Spalte 1). Die Expression von Vpu oder Env in den Primärzellen reduzierte bei hohen
Expressionsleveln die CD4-Menge in etwa fünffach (Abb. 5A, Spalten 7 und 8; Abb. 5B,
rechts). Allerdings führte nur die Expression von Nef zum vollständigen Verschwinden der
CD4+ Zellpopulationen (Abb. 5A, Spalten 2 und 4 bis 6). Nef alleine bewirkte eine
6. ERGEBNISSE
27
vierzehnfache Reduktion der CD4-Menge (Abb. 5B, rechts) und war damit hauptsächlich
für die CD4-Modulation verantwortlich. Die Koexpression von Vpu und Nef verdoppelte
diesen Effekt schon zu frühen Zeitpunkten. In Gegenwart von Env und Nef zeigte Vpu
diese Steigerung der CD4-Herabregulation jedoch erst später – ca. 53 Stunden nach der
Infektion (Abb. 5B, rechts). Somit sind Nef und Env in Primärzellen ähnlich effektiv bei
der CD4-Herabregulation wie in immortalisierten Jurkat Zellen, wogegen Vpu in PBMCs
deutlich mehr zur CD4-Herabregulation beiträgt.
Abb. 5: Kinetik der CD4-Modulation in HIV-1 infizierten humanen PBMCs. (A) Prästimulierte
PBMCs wurden mit den verschiedenen HIV-1 NL4-3-IRES-eGFP Konstrukten transduziert und zu den
angegebenen Zeitpunkten im FACS analysiert. Die Zahlen geben die roten MFIs für den entsprechenden
eGFP Bereich an. (B) Quantitative Auswertung der CD4-Herabregulation. Erläuterung zur Berechnung
der X-fachen CD4-Modulation im Text. Es wurde jeweils die CD4-Modulation bei niedriger (links) und
mittlerer (rechts) eGFP Expression (siehe A) bestimmt. E, env; U, vpu; N, nef.
6. ERGEBNISSE
28
Nef entfernt als einziges der drei untersuchten Proteine CD4 direkt von der
Zelloberfläche und leitet es zum Abbau in Lysosomen, wogegen Env und Vpu den
Transport von neu synthetisiertem CD4 zur Zelloberfläche stören (Piguet et al., 1998;
Doms et al., 2000; Lama, 2003). Um den Effekt der drei Proteine auf den Transport von
neu synthetisiertem CD4 zur Zelloberfläche zu untersuchen, wurden 293T Zellen, die kein
CD4 exprimieren, mit den verschiedenen proviralen Konstrukten und einem CD4Expressionsplasmid kotransfiziert und im FACS analysiert (Abb. 6).
Abb. 6: Blockierung der CD4-Expression in transfizierten 293T Zellen. (A) 293T Zellen wurden mit
den angegebenen
proviralen HIV-1 NL4-3-IRES-eGFP Konstrukten und 1 µg eines CD4-
Expressionsplasmids kotransfiziert und 48 h später im FACS analysiert. Die Zahlen geben die roten
MFIs innerhalb der gezeigten eGFP Bereiche an. (B) X-fache Blockierung (Mittelwert +/- Stabw., n=3)
der CD4-Expression durch die angegebenen proviralen Konstrukte. Zur Berechnung wurde die MFI des
E-U-N--Konstruktes durch die entsprechenden MFIs der anderen Konstrukte geteilt. (C) Korrelation
zwischen CD4-Herabregulation in infizierten Jurkat Zellen (gemessen 48 h nach Infektion bei mittlerer
eGFP Expression, Abb.3A) und Blockierung der CD4-Expression in transfizierten 293T Zellen. (D)
CD4-Modulation durch Vpu, Env und Nef bei unterschiedlichen CD4-Mengen. 293T Zellen wurden mit
4µg proviraler DNA und 0,1, 0,5 bzw. 1 µg CD4-Expressionsplasmid kotransfiziert. Mock, nicht
transfiziert; E, env; U, vpu; N, nef.
6. ERGEBNISSE
29
In Abwesenheit von Vpu, Env und Nef exprimierten die transfizierten 293T Zellen
große Mengen an CD4 auf der Oberfläche (Abb. 6A, Spalte 1). Zellen, die mit dem
Wildtyp-Konstrukt (E+U+N+) transfiziert wurden zeigten dagegen eine fünffache
Verminderung der CD4-Menge. Die Expression von Vpu oder Nef reduzierte CD4 um das
Zwei- bis Dreifache, wogegen Env keine Wirkung hatte (Abb. 6B). Da Vpu, Env und Nef
wie beschrieben unterschiedliche Mechanismen zur CD4-Modulation verwenden,
überrascht es nicht, dass die Effizienzen, mit denen die proviralen Konstrukte CD4 in
infizierten Jurkat Zellen herabregulieren und in transfizierten 293T Zellen die CD4Expression blockieren, nicht korrelieren (Abb. 6C). Unerwartet war jedoch die
Beobachtung, dass Env keinen Effekt auf CD4 zeigte, obwohl es den Transport von CD4
zur Zelloberfläche behindern soll (Lama et al., 1999). Da unter diesen experimentellen
Bedingungen die CD4-Expressionslevel möglicherweise höher sind als in Jurkat oder
Primärzellen, wurden in einem weiteren Experiment 293T Zellen mit unterschiedlichen
Mengen des CD4-Expressionsplasmids kotransfiziert. Wie in Abbildung 6D gezeigt,
reduzierten Vpu und Nef die CD4-Expression bei der Kotransfektion von sowohl 0,1 als
auch 0,5 µg CD4-Plasmid. Dagegen zeigte Env nur bei der Kotransfektion von 0,1 µg
CD4-Plasmid einen deutlichen Effekt. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die drei
untersuchten viralen Proteine CD4 unabhängig voneinander herabregulieren (Chen et al.,
1996). Außerdem scheint der Mechanismus mit dem Env die CD4-Expression blockiert bei
niedrigeren CD4-Mengen gesättigt zu sein, als dies bei Nef oder Vpu der Fall ist.
6.3 Die Herabregulation von CD4 schützt HIV-1 infizierte T-Zellen vor einer
Superinfektion
Da CD4 der primäre Rezeptor von HIV-1 ist, dient die CD4-Herabregulation
möglicherweise auch dem Schutz einer HIV-1 infizierten Zelle vor einer erneuten
Infektion – der so genannten Superinfektion (Benson et al., 1993; Michel et al., 2005). Da
ein experimenteller Nachweis dieser Hypothese in infizierten Zellen bislang fehlte, wurde
im folgenden Experiment untersucht, ob die durch Vpu, Env und Nef vermittelte CD4-
6. ERGEBNISSE
30
Herabregulation eine Superinfektion infizierter Zellen verhindert und welchen Anteil an
diesem Effekt die einzelnen Proteine dabei besitzen.
Dazu wurde in den in Abschnitt 6.1 beschriebenen (Abb. 2) proviralen Konstrukten
das eGFP- durch das DsRed2-Reportergen ersetzt (5.4.2). Diese Konstrukte dienten
anschließend zur Herstellung von VSV-G pseudotypisierten Viren mit denen Jurkat TZellen transduziert wurden. Drei Tage nach dieser Infektion wurden die Zellen mit
Wildtyp HIV-1-IRES-eGFP Viren inkubiert und zwei Tage später erfolgte die Auswertung
am FACS. Zellen, die nur initial transduziert wurden, leuchteten rot und Zellen, die erst
durch die zweite Infektion nach drei Tagen infiziert wurden, leuchteten grün.
Superinfizierte
Zellen
wurden
anhand
ihrer
roten
und
grünen
Fluoreszenz
(DsRed2+/eGFP+) detektiert. Abbildung 7 zeigt den Versuchsaufbau.
Abb. 7: Messung der Superinfektion.
Jurkat Zellen wurden mit den VSV-G
pseudotypisierten HIV-1 NL4-3-IRESDsRed2 vpu, env und nef
Mutanten
transduziert und 3 Tage später mit
eGFP exprimierenden HIV-1 NL4-3
Wildtypviren infiziert. 2 Tage später
erfolgte
die
Analyse
der
super-
infizierten Zellen im FACS.
Das DsRed2 Protein wurde für die initiale Infektion verwendet, da es als Tetramer
aktiv ist und mehr Zeit für die Reifung benötigt als das eGFP Protein. Andere rote
Fluoreszenzproteine die ebenfalls getestet wurden, wie z.B. ein Monomer (Campbell et al.,
2002), konnten im FACS nicht detektiert werden oder zeigten eine zu geringe
Fluoreszenzintensität.
Wie in Abbildung 8A gezeigt, wurden fünf Tage nach der initialen Infektion etwa 3
% rote Zellen detektiert. Die Inkubation der Zellen mit hohen Dosen des X4-tropen HIV-1
NL4-3-IRES-eGFP Viruses führte zwei Tage später ebenfalls zu einer Infektionsrate von 3
%. Zellen, die initial mit dem vpu, env und nef intakten Virus infiziert wurden, waren
6. ERGEBNISSE
31
effizient gegen eine Superinfektion durch das HIV-1 Wildtypvirus, nicht jedoch durch
VSV-G pseudotypisierte Viren geschützt (Abb. 8A). Die Expression von Nef in infizierten
Zellen verringerte die Zahl an superinfizierten Zellen sechsfach, wogegen Vpu und Env die
Superinfektion in Abwesenheit von Nef nur etwa zweifach reduzierten (Abb. 8B). In
Gegenwart von Nef zeigten Vpu und Env keine zusätzliche Wirkung. Übereinstimmend
mit seiner starken Aktivität bei der Modulation von CD4 (Abschnitt 6.2) spielte Nef somit
auch bei der Verhinderung der Superinfektion die wichtigste Rolle.
Abb. 8: Beitrag von Vpu, Env und Nef zur Verhinderung der Superinfektion. (A) Jurkat T-Zellen
wurden initial mit den verschiedenen DsRed2 exprimierenden vpu, env und/oder nef defekten Viren
infiziert, 3 Tage später mit eGFP exprimierendem HIV-1 Wildtypvirus (HIV) oder VSV-G
Pseudopartikeln (VSV) inkubiert und 2 Tage danach im FACS analysiert. Zur Berechnung der Anzahl an
superinfizierten Zellen (in Prozent) wurde die Anzahl der DsRed2+/eGFP+ Zellen (Bereich R3) durch die
Anzahl aller zumindest DsRed2+ Zellen (Bereich R2+R3) geteilt. (B) Quantitative Auswertung der
Anzahl an superinfizierten Jurkat Zellen (DsRed2+/eGFP+), die initial mit den angegebenen Vpu, Env
und Nef Mutanten transduziert und anschließend mit HIV-1 Wildtypviren infiziert wurden. Die Zahlen
(Mittelwerte +/- Stabw.; n=3) geben die X-fache Reduktion der Superinfektion im Vergleich zur
Kontrolle (E-U-N-) an. Mock, nicht infiziert; DsRed2 und eGFP, Zellen infiziert mit VSV-G
pseudotypisierten HIV-1 NL4-3-IRES-DsRed2 oder Wildtyp eGFP Viren; E, env; U, vpu; N, nef.
6. ERGEBNISSE
32
6.4 Nef schützt infizierte Zellen durch die Modulation von CD4 und mittels eines
anderen Mechanismus vor einer Superinfektion
Nef entfernt effizient CD4 von der Zelloberfläche und schützt infizierte Zellen
somit effektiv vor einer Superinfektion (Abschnitt 6.2 und 6.3). Zur Korrelation der Nefvermittelten CD4-Herabregulation mit der Resistenz gegen eine Superinfektion wurden in
einem weiteren Experiment zehn HIV-1 nef-Allele untersucht, die sich in ihrer Aktivität
bezüglich
der
CD4-Modulation
unterscheiden.
Dies
waren
das
effektiv
CD4
herabregulierende NA7 Nef (Schindler et al., 2003) sowie Mutanten, die schwächer (85A,
105A) oder nicht (174AA) aktiv sind. Weiter das primäre nef-Allel LTNP4-1 von einem
Langzeitüberlebenden welches CD4 nicht moduliert und die Mutante LTNP4-8 (D56A
K174E), die schwach aktiv ist (Mariani et al., 1996). Außerdem nef-Allele, die aus einem
HIV-1-Infizierten mit schnell voranschreitender Krankheit vor (P2-87) und nach (P2-93)
dem Ausbruch von AIDS isoliert wurden und CD4 effektiv herabregulieren (Schindler et
al., 2003). Und schließlich die Allele NPex und Pex, die die Konsensussequenzen einer
großen Anzahl von HIV-1 Subtyp B Sequenzen repräsentieren, hoch aktiv CD4
herabregulieren und sich durch die Aminosäurenaustausche T15A, K39R, N51T, H102Y,
N157T, S163C, S169N, L170Q und E182M unterscheiden, die mit unterschiedlichen
Stadien des Krankheitsverlaufs assoziiert sind (Carl et al., 2001; Kirchhoff et al., 1999).
Diese nef-Allele wurden zuerst mittels PCR amplifiziert, sequenziert und in die
env-defekten proviralen Vektoren pBR-HIV-1 NL4-3-IRES-eGFP bzw. DsRed2 kloniert.
Da zu den verwendeten Allelen bis zu diesem Zeitpunkt nur Daten aus Experimenten mit
Nef Expressionsplasmiden vorlagen (Mariani et al., 1996; Greenberg et al., 1998; Carl et
al., 2001; Schindler et al., 2003), wurden diese Allele zunächst auf ihre Aktivität im
proviralen Kontext untersucht. Zu diesem Zweck wurden Jurkat T-Zellen mit den eGFP
exprimierenden VSV-G pseudotypisierten Viren infiziert und die CD4-Modulation durch
die verschiedenen nef-Allele im FACS bestimmt (Abb. 9A, obere Reihe). Am effektivsten
entfernten die NL4-3, NA7, NA7-82A, P2-93 und Pex nef-Gene CD4 von der
6. ERGEBNISSE
33
Zelloberfläche, die NA7-105, P2-87 und NPex nef-Allele waren ein wenig schwächer aktiv
und die NA-174AA und LTNP4-1 Nefs hatten praktisch keine Wirkung auf CD4.
Abb. 9: Nef-vermittelte CD4-Herabregulation und die damit verbundene Resistenz gegen eine
Superinfektion. (A) CD4-Herabregulation (obere Reihe) und superinfizierte Jurkat Zellen (untere
Reihe), die die angegebenen nef-Allele exprimieren. Die Zahlen geben die rote MFI (obere Reihe) und
den Prozentsatz an superinfizierten Zellen (untere Reihe) an. Die Kontrollen zeigen nicht (oben) und nur
mit dem HIV-1 NL4-3-IRES-DsRed2 Konstrukt infizierte (unten) Zellen. (B) Anteil superinfizierter
Zellen (in %), die initial mit den angegebenen HIV-1 nef-Varianten infiziert wurden (Mittelwert +/Stabw.; n=3). Die Zahlen geben die X-fache Reduktion der Superinfektion im Vergleich zur nef-defekten
Kontrolle an. LTNP, „long-term nonprogressor“; Pr, HIV-1 infizierter Progressor; Cons., Konsensus nefAllele. (C) Korrelation zwischen CD4-Herabregulation und Superinfektion. Das offene Symbol zeigt die
Anzahl an superinfizierten Zellen, die initial mit dem nef-defekten Virus infiziert wurden. Das kleine
Diagramm zeigt die Korrelation zwischen Superinfektion und CD4-Herabregulation für die
rekombinanten Viren mit intakten nef-Genen.
Unter Verwendung der DsRed2 exprimierenden Viren wurden diese nef-Allele
anschließend auf ihren Beitrag zur Verhinderung der Superinfektion infizierter Jurkat T-
6. ERGEBNISSE
34
Zellen untersucht (Abb. 9A, untere Reihe). Alle zehn nef-Allele machten die infizierten
Zellen, wenn auch unterschiedlich effizient, resistent gegen eine Superinfektion. Die NL43, NA7, NA7-82A, NA7-105A, P2-87, P2-93, NPex und Pex Nef Proteine waren sehr
effektiv und reduzierten die Zahl an superinfizierten Zellen um das Zehn- bis
Zwanzigfache (Abb. 9B). Die NA7 Mutanten 82A und 105A waren dabei etwas schwächer
aktiv als das wildtyp NA7 Nef und auch das P2-87 Nef, das in der chronischen Phase der
Infektion isoliert wurde, zeigte im Vergleich zu dem nach Ausbruch von AIDS isolierten
P2-93 Nef eine etwas verringerte Aktivität. Die Expression der nef-Allele, die aus dem
HIV-1 Infizierten mit rascher Progression zu AIDS stammten (P2), schützte infizierte
Zellen dreimal so gut vor anschließender Superinfektion wie die der nef-Gene des HIV-1
infizierten Langzeitüberlebenden (LTNP4). Obwohl die NA7-174AA und LTNP4-1 Nef
Proteine praktisch keine Wirkung auf CD4 zeigten (Abb. 9A, obere Reihe), schützten auch
sie infizierte Zellen vor einer anschließenden Superinfektion (Abb. 9B). Die Anwesenheit
von Nef in infizierten Zellen reduzierte somit unabhängig von der CD4-Modulation die
Superinfektionshäufigkeit um etwa den Faktor drei (Abb. 9C). Dies bedeutet, dass an der
Nef-vermittelten Resistenz gegen eine Superinfektion neben dem CD4-abhängigen auch
ein CD4-unabhängiger Mechanismus beteiligt ist.
6.5 Auch die Nef-vermittelte CxCR4-Herabregulation trägt, neben weiteren
Faktoren, zur Superinfektionsresistenz bei
HIV-1 benötigt für eine effiziente Infektion von Zellen neben dem primären
Rezeptor CD4 zusätzlich einen der beiden Chemokinrezeptoren CCR5 oder CxCR4 als
Korezeptor. In zwei kürzlich erschienen Veröffentlichungen wurde beschrieben, dass Nef
beide Rezeptoren von der Zelloberfläche entfernt (Michel et al., 2005; Hrecka et al., 2005).
Da es sich bei den für die vorhergehenden Experimente verwendeten HIV-1 NL4-3
Konstrukten um X4-trope Viren handelt, könnte auch die Modulation von CxCR4 in
infizierten Zellen eine Superinfektion verhindern und den beobachteten CD4unabhängigen Effekt von Nef erklären. Zur Überprüfung dieser Möglichkeit wurde ein
6. ERGEBNISSE
35
weiteres Superinfektionsexperiment mit nef-Allelen durchgeführt, die unterschiedliche
Effekte auf CD4 und CxCR4 zeigen (Tab.1).
Die entsprechenden nef-Allele wurden zuerst aus schon bestehenden proviralen
pBR-NL4-3-IRES-eGFP Vektoren in die env-defekten Vektoren pBR-HIV-1 NL4-3-IRESeGFP bzw. DsRed2 umkloniert. Mit den eGFP exprimierenden Viren wurden anschließend
Jurkat Zellen infiziert und im FACS analysiert. Wie schon in Hrecka et al. beschrieben,
entfernte das NA7 Nef CD4 effizient von der Zelloberfläche, wogegen CxCR4 nur
schwach herunterreguliert wurde (Abb. 10A und B). Die Mutante 174AA hingegen war in
beiden Funktionen inaktiv. Eine starke Wirkung auf beide Rezeptoren zeigte das
SIVmac239 Nef, wogegen das SIVcol Nef nur CxCR4 sehr effizient herunterregulierte.
Das NA7 Nef reduzierte die Superinfektion in Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus
Abschnitt 6.4 um das Zwölf- und die 174AA Mutante um das Dreifache (Abb. 10C). Da
die 174AA Mutante weder den CD4 noch den CxCR4 Rezeptor herunterreguliert, muss
noch ein weiterer, bis jetzt noch unbekannter Mechanismus zur maximalen Nefvermittelten Superinfektionsresistenz beitragen. Die Expression des SIVcol Nefs schützte
infizierte Zellen unabhängig von einer Wirkung auf CD4 effizient vor einer
Superinfektion. Da HIV-1 nef-Allele verglichen mit HIV-2 oder SIV Nefs den CxCR4
Rezeptor jedoch nur schwach herunterregulieren (Hrecka et al., 2005), spielt diese
6. ERGEBNISSE
36
Funktion für die Resistenz von HIV-1 infizierten Zellen gegen Superinfektion
wahrscheinlich nur eine untergeordnete Rolle.
Abb. 10: Beitrag der nef-vermittelten Modulation von CxCR4 zum Schutz vor Superinfektion.
FACS-Analyse (A) und quantitative Wirkung (B) von verschiedenen nef-Allelen auf die CD4 und
CxCR4 Zelloberflächenexpression von Jurkat Zellen. Legende:
NA7;
174AA;
mac239 und
col
Nef. Die Bereiche für keine (N), niedrige (L), mittlere (M) und hohe (H) eGFP Expression sind aus
Abbildung A ersichtlich. (C) Anzahl superinfizierter Zellen (in %), die initial mit den angegebenen HIV1 nef Varianten infiziert wurden. Die Zahlen geben die Reduktion der Superinfektion (X-fach) im
Vergleich zur nef-defekten Kontrolle an. Ein unabhängiges Experiment lieferte ähnliche Ergebnisse.
In mehreren Veröffentlichungen wurde eine Koinfektion von Zellen mit HIV-1 und
HIV-2 beschrieben (Blackard et al., 2002; Allen et al., 2003; Gross et al., 2004; Nethe et
al., 2005; Smith et al., 2005), weshalb auch der Effekt eines HIV-2 und eines SIV nef-
6. ERGEBNISSE
37
Allels auf die Superinfektion untersucht wurde. Das HIV-2 Ben und das SIVagm tan1 Nef
entfernten sowohl den CD4 als auch den CxCR4 Rezeptor mit hoher Effizienz von der
Zelloberfläche und schützten damit auch wie erwartet infizierte Zellen vor einer
Superinfektion (Tab.1 und Abb. 10C). Dies zeigt, dass mit HIV-2 oder anderen
Primatenlentiviren infizierte T-Zellen möglicherweise gegen eine zweite Infektion durch
HIV-1 geschützt sind.
6.6 Die Resistenz gegen eine Superinfektion schützt HIV-1 infizierte T-Zellen vor dem
vorzeitigen Tod durch Apoptose
Bei der Infektion einer Zelle durch HIV-1 wird zunächst das RNA-Genom des
Virus in doppelsträngige DNA umgeschrieben und diese anschließend in das
Wirtszellgenom integriert. Nicht integrierte provirale DNA wird möglicherweise durch die
Zelle als DNA-Schädigung erkannt, die letztlich zur Induktion der Apoptose führt (Daniel
et al., 1999). Durch eine zweite Infektion einer bereits infizierten Zelle akkumuliert sich
möglicherweise nicht integrierte DNA in der Zelle und steigert die Apoptosewahrscheinlichkeit. Somit könnte die Verhinderung einer Superinfektion eine bereits
infizierte Zelle vor dem vorzeitigen Tod durch Apoptose schützen und damit eine längere
Partikelfreisetzung aus der infizierten Zelle und eine effiziente Vermehrung des Virus
gewährleisten.
Um diese Hypothese erstmalig zu überprüfen, wurden Jurkat und primäre CD4+ TZellen mit nef-defekten VSV-G pseudotypisierten HIV-1 NL4-3-IRES-DsRed2 Viren
transduziert, drei Tage später mit dem eGFP exprimierenden NL4-3 Wildtypvirus infiziert
und nach weiteren zwei Tagen im FACS analysiert. 35 % der nur DsRed2+ Jurkat Zellen
waren apoptotisch und zeigten damit eine etwa zweifach höhere Apoptoserate als nicht
infizierte Zellen (15,9 %). In der superinfizierten Zellpopulation war etwa die Hälfte (52
%) der Zellen apoptotisch (Abb. 11A). Diese Unterschiede der Apoptoserate zwischen
nicht, einfach und doppelt infizierten Zellen waren in primären CD4+ T-Zellen noch
einmal deutlich gesteigert (Abb. 11B). Dort bewirkte eine initiale HIV-1 Infektion der
Zellen einen fünffachen Anstieg der Apoptoserate (nicht infiziert: 4,5 %; einfach infiziert:
6. ERGEBNISSE
38
24,8 % (DsRed2) bzw. 29,9 % (eGFP)) und eine anschließende Superinfektion erhöhte
diesen Effekt noch einmal um etwa den Faktor drei auf 81,4 %. Diese Ergebnisse zeigen
direkt, dass die Verhinderung einer Superinfektion infizierte Zellen vor dem vorzeitigen
Tod durch Apoptose schützt.
Abb. 11: Superinfizierte T-Zellen
induzieren vermehrt Apoptose. (A)
Jurkat Zellen und (B) primäre CD4+ TZellen wurden mit nef-defekten VSVG pseudotypisierten HIV-1 NL4-3IRES-DsRed2 Viren transduziert und
drei Tage später mit wildtyp HIV-1
NL4-3-IRES-eGFP
Viren
infiziert.
Zwei Tage später wurde die Anzahl an
apoptotischen Zellen in der eGFP+,
DsRed2+
und
doppelt-positiven
Zellpopulation im FACS bestimmt. In
der quantitativen Auswertung (rechts)
sind die Mittelwerte (+/- Stabw.) von je
drei Infektionen gezeigt.
7. DISKUSSION
39
7. Diskussion
Der CD4-Rezeptor spielt im Replikationszyklus von HIV-1 eine bedeutende Rolle,
da er einerseits essentiell für die Infektion des Virus ist, aber andererseits die
Virusfreisetzung beinträchtigen kann. Schon bald nachdem HIV-1 als Ursache von AIDS
entdeckt worden war, wurde das CD4-Protein als der primäre Rezeptor von HIV-1
identifiziert (Dalgleish et al., 1984; Klatzmann et al., 1984). Zwei Jahre später wurde
jedoch gezeigt, dass in HIV-1 infizierten Zellen die CD4-Expression blockiert ist (Hoxie et
al., 1986). Inzwischen weiß man, dass HIV-1 drei virale Proteine (Vpu, Env und Nef) zur
CD4-Herabregulation verwendet (Chen et al., 1996) und dies für das Virus große Vorteile
hat. Die CD4-Modulation erleichtert einerseits die Partikelfreisetzung aus der infizierten
Zelle (Bour et al., 1999; Ross et al., 1999). Andererseits können hohe CD4Expressionslevel die Infektiosität der Nachkommenviren beeinträchtigen, da hierdurch viel
CD4 in die Virusmembran eingelagert wird und dort mit dem viralen Hüllprotein Env
interagiert (Lama et al., 1999; Cortes et al., 2002; Levesque et al., 2003). Da CD4 auch
eine wichtige Rolle bei der Aktivierung des Immunsystems durch T-Zellen spielt (Weiss et
al., 1994), wird durch die CD4-Modulation möglicherweise auch die antivirale
Immunantwort geschwächt. Schließlich soll die verminderte CD4-Expression auch eine
Superinfektion blockieren (Benson et al., 1993) und die HIV-1 infizierten Zellen vor einer
dadurch induzierten frühzeitigen Apoptose schützen. Da für diese Hypothesen bislang nur
Daten von chronisch infizierten Zellen oder transfizierten Zellen, die Env oder Nef von
einem Expressionsplasmid exprimieren, existierten (LeGuern et al., 1992; Benson et al.,
1993; Little et al., 1994; Pham et al., 2004; Michel et al., 2005), war das Ziel dieser
Doktorarbeit, den Beitrag der drei viralen Proteine Vpu, Env und Nef zur CD4Herabregulation und Superinfektionsresistenz in produktiv infizierten T-Zellen zu
untersuchen.
Zur Analyse der CD4-Herabregulation wurden zunächst rekombinante HIV-1 NL43-IRES-eGFP Viren mit einzelnen und kombinierten Defekten in vpu, env und nef
hergestellt. Das Virusisolat NL4-3 ist X4-trop, gut charakterisiert und wird weltweit als
Standard zur Infektion von T-Zelllinien und Primärzellen mit HIV-1 genutzt. Über ein
einkloniertes IRES-Element wird eGFP zusammen mit Nef von einer bicistronischen
mRNA koexprimiert. Dieses System ermöglicht die einfache Identifikation infizierter
Zellen anhand ihrer grünen Fluoreszenz und die Korrelation der viralen Protein-Expression
mit der CD4-Modulation (Schindler et al., 2005). Zur Standardisierung der Infektion und
7. DISKUSSION
40
zur Analyse der env-defekten Viren wurden Viruspartikel mit dem Hüllprotein des
Vesikulären Stomatitisvirus pseudotypisiert. Dies erlaubt die vergleichbare Infektion von
Zielzellen unter Umgehung des Nef-vermittelten Einflusses auf die Infektiosität (Chazal et
al., 2001).
Nef trug in allen untersuchten Zellarten hauptsächlich zur CD4-Herabregulation bei
und führte schon in der frühen Phase der Infektion (24 bis 32 Stunden nach der Infektion)
zu einer verminderten CD4-Expression. Der Effekt von Env und Vpu auf CD4 war
insgesamt deutlich schwächer. Dies bestätigt die Ergebnisse einer früheren Studie, in der
alkalische Phosphatase exprimierende Reporterviren zur Analyse der vpu-, env- und nefvermittelten CD4-Herabregulation verwendet wurden (Chen et al., 1996). Allerdings war
in dieser Studie die CD4-Modulation in Jurkat Zellen stärker als in PBMCs, was nicht mit
den Ergebnissen dieser Doktorarbeit übereinstimmt. Bis zur maximalen CD4Herabregulation dauerte es in PBMCs zwar einen Tag länger als in Jurkat Zellen, aber drei
Tage nach der Infektion wurden vergleichbare Level der CD4-Herabregulation erreicht.
Passend dazu wurde in einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung gezeigt, dass Nef die
CD4-Expression in primären CD4+-T-Zellen drastisch reduziert (Keppler et al., 2006).
Auch war in Experimenten dieser Doktorarbeit im Gegensatz zu früheren Ergebnissen der
Effekt von Vpu auf CD4 in PBMCs stärker als in Jurkat Zellen (Abb. 4 und 5). Diese
Unterschiede könnten sich durch die verschiedenen verwendeten experimentellen Systeme
einschließlich der proviralen Konstrukte erklären lassen. So wird z.B. bei den von Chen et
al. verwendeten Viren Nef über ein IRES-Element exprimiert, wogegen bei den in dieser
Arbeit hergestellten Konstrukten (Abb. 2) alle viralen Proteine im physiologischen Kontext
unter Kontrolle des LTR-Promoters und der natürlichen Spleißstellen exprimiert werden.
In den mit dem CD4-Expressionsplasmid kotransfizierten 293T Zellen, die
normalerweise kein CD4 exprimieren, konnte der Effekt der viralen Proteine auf den
Transport von neu synthetisiertem CD4 zur Zelloberfläche untersucht werden. In
Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass Env und Vpu CD4 im Endoplasmatischen
Retikulum zurückhalten und dadurch diesen Transport hemmen (Levesque et al., 2004),
waren in diesem System bei niedrigen CD4-Mengen Env und Vpu in etwa so aktiv in der
Blockierung der CD4-Expression wie Nef. Der Mechanismus, mit dem Env die CD4Expression blockiert, scheint allerdings durch größere CD4-Mengen schnell gesättigt zu
werden (Abb. 6).
7. DISKUSSION
41
Durch die Verwendung von Viren, die grüne (eGFP) und rote (DsRed2)
Fluoreszenzproteine exprimieren, konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit gezeigt werden,
dass die CD4-Herabregulation HIV-1 infizierte Zellen vor einer Superinfektion schützt
(Abb. 7). Dies bestätigt die Daten aus früheren Studien, die allerdings mit chronisch
infizierten Zellen oder transfizierten Zellen durchgeführt wurden (LeGuern et al., 1992;
Benson et al., 1993; Little et al., 1994; Pham et al., 2004; Michel et al., 2005). Nach der
initialen Infektion dauert es etwa 16 bis 24 Stunden, bis die CD4-Modulation in Jurkat
Zellen erstmals nachweisbar ist (Abb.4 und Lama et al., 2003). In PBMCs dauert es noch
etwas länger (Abb.5). Die durchschnittliche Lebenserwartung einer produktiv HIV-1
infizierten primären CD4+-T-Zelle wird in vivo auf etwa 2,2 Tage geschätzt, wobei die
Zeit, nach der die Hälfte aller infizierten Zellen gestorben sind, etwa 1 bis 2 Tage beträgt
(Perelson et al., 1996; Cavert et al., 1997). Da die Zeitspanne, in der die CD4Herabregulation vor einer Superinfektion schützt, somit nur sehr kurz ist bevor die
infizierten Zellen sterben, stellt sich die Frage, ob dieser Effekt physiologisch von
Bedeutung ist (Lama et al., 2003). Für das Virus kann eine Superinfektion sowohl vor- als
auch nachteilig sein. Wird eine bereits infizierte Zelle ein zweites Mal durch ein Virus
eines anderen HIV-Stammes infiziert, so ermöglicht dies die genetische Rekombination
und erleichtert dem Virus die Anpassung an veränderte Umweltbedingungen. Die
Nachkommenviren können so z.B. schnell eine Resistenz gegen antivirale Medikamente
entwickeln oder besser der Immunantwort entgehen. HIV-1 zeigt eine hohe
Rekombinationsrate (Levy et al., 2004) und es sind viele Rekombinationsereignisse
zwischen den verschiedenen HIV-Stämmen beschrieben (Blackard et al., 2002). So
entstand wahrscheinlich sogar der Vorläufer von HIV-1, das Immundefizienvirus der
Schimpansen (SIVcpz), durch eine Rekombination von zwei SIV-Stämmen von kleineren
Affen (Bailes et al., 2003). Allerdings kann eine Superinfektion zu einem späten Zeitpunkt
im Replikationszyklus des Virus dazu führen, dass die Zelle abstirbt bevor die
Virusproduktion und die Freisetzung der Nachkommenviren beendet sind. Die Blockierung
der Superinfektion in einer späten Phase des Replikationszyklus ist somit vorteilhaft für
das Virus, da sie die Zellen vor dem vorzeitigen Tod durch Apoptose schützt (Abb. 11)
und eine effektive Replikation ermöglicht.
In infizierten Zellen mit einer kurzen Lebensdauer beeinflusst die CD4Herabregulation die Rekombinationsrate wahrscheinlich wenig. Diese Situation ändert sich
allerdings wahrscheinlich, wenn das Virus in Zellen mit einer langen Lebensdauer (z.B.
7. DISKUSSION
42
Makrophagen oder ruhende T-Zellen) persistiert, wie es in Patienten der Fall ist, die mit
der hoch-aktiven antiretroviralen Therapie (HAART) behandelt werden (Stevenson, 2003).
Wenn die Virusreplikation durch die HAART in langlebige Makrophagen oder T-Zellen
verlagert wird und die CD4-Herabregulation dort effizient eine Superinfektion verhindert,
erschwert dies die Entstehung von resistenten Virusvarianten. Dass Nef CD4 auch in
ruhenden T-Zellen effektiv von der Zelloberfläche entfernt, wurde erst kürzlich gezeigt
(Keppler et al., 2006).
Die
CD4-Herabregulation
und
die
dadurch
erreichte
Blockierung
einer
Superinfektion wird hauptsächlich von Nef bewirkt (Abb. 8). Die Analyse verschiedener
nef-Allele mit unterschiedlicher CD4-Modulationsaktivität ergab, dass der Anteil an
superinfizierten Zellen umso kleiner war, je mehr CD4 die jeweiligen Nef-Proteine von der
Zelloberfläche
entfernten
normalerweise
effizient
(Abb.
CD4
9).
Nef-Allele
herab,
von
wogegen
Nefs
AIDS-Patienten
aus
HIV-1
regulieren
infizierten
Langzeitüberlebenden in dieser Funktion inaktiv sind (Mariani et al., 1996; Carl et al.,
2001; Tobiume et al., 2002; Arganaraz et al., 2003). Dementsprechend wurde von den
Allelen NA7 und P2 aus AIDS-Patienten auch die Superinfektion um das Drei- bis
Siebenfache stärker blockiert als von denen, die aus einem Langzeitüberlebenden (LTNP4)
stammten (Abb. 9). In AIDS-Patienten ist die Zahl an nicht infizierten CD4+-T-Zellen
gering, weshalb es für das Virus in dieser Umgebung von Vorteil sein kann, eine
Superinfektion verstärkt zu verhindern. Dagegen wird in Langzeitüberlebenden die HIVInfektion durch das Immunsystem effizient kontrolliert. Unter diesen Bedingungen scheint
für das Virus eine Superinfektion vorteilhaft zu sein, da durch die gesteigerte
Rekombinationsrate
vermehrt
neue
HIV-Varianten
entstehen,
die
leichter
der
Immunantwort entgehen können.
Auch nef-Allele die kaum CD4 von der Zelloberfläche entfernen, reduzierten die
Superinfektion um etwa den Faktor drei (Abb. 9, NA7-174AA und LTNP4-1). Daraus lässt
sich schließen, dass neben der CD4-Herabregulation mindestens ein weiterer Mechanismus
zur Nef-vermittelten Superinfektionsresistenz beiträgt. Das in diesem Experiment
verwendete X4-trope HI-Virus NL4-3 benötigt neben CD4 noch den CxCR4 Korezeptor
zur Infektion einer Zelle, der auch durch Nef moduliert wird (Hrecka et al., 2005; Michel
et al., 2005). Wie man anhand des SIVcol Nefs sieht (das nur CxCR4, nicht aber CD4
moduliert), kann die CxCR4-Herabregulation ebenfalls eine Superinfektion verhindern
(Abb.10). Dies wird durch eine kürzlich veröffentlichte Studie bestätigt, in der ein FACS-
7. DISKUSSION
43
basierendes Virus-Zell-Fusionsexperiment zeigt, dass SIVCol Nef exprimierende T-Zellen
deutlich seltener mit HIV-Reporterviren fusionieren als die entsprechenden Kontrollzellen
(Venzke et al., 2006). Die Allele NA7-174AA und LTNP4-1 modulieren allerdings weder
CD4 noch CxCR4. Es kann zwar nicht vollständig ausgeschlossen werden, dass die
minimalen Effekte von NA7-174AA und LTNP4-1 auf CD4 oder CxCR4 zur
Verhinderung einer Superinfektion beitragen, aber es scheint unwahrscheinlich, dass sie
maßgeblich für die Superinfektionsresistenz verantwortlich sind. Dazu trägt wohl eher eine
der vielen bekannten Rezeptor-unabhängigen Funktionen von Nef bei, wie z.B. die
Modifikation des Zytoskeletts (Fackler et al., 1999; Campbell et al., 2004), die
Veränderung der Zellmembranbeschaffenheit (Zheng et al., 2003; van’t Wout et al., 2005)
oder die Beeinflussung von intrazellulären Signal- und Reaktionswegen (Doms et al.,
2000; Lama et al., 2003).
Der CxCR4-Rezeptor wird von HIV-1 Nefs nur schwach herabreguliert, wogegen
HIV-2 und SIV Nefs in dieser Funktion stark aktiv sind (Hrecka et al., 2005). Die
Ergebnisse mit dem SIVcol Nef zeigen, dass die CxCR4-Herabregulation signifikant die
Superinfektion reduziert (Abb. 10). Allerdings verwenden die Affen-Immundefizienzviren
(SIV), von denen die in dieser Funktion stark aktiven nef-Allele kodiert werden, CxCR4
normalerweise nicht als Korezeptor. Die physiologische Bedeutung der CxCR4Herabregulation scheint somit nicht die Verhinderung der Superinfektion zu sein, sondern
z.B. wie erst kürzlich beschrieben die Blockierung der T-Zell-Migration (Hrecka et al.,
2005). Da auch CCR5 von Nef moduliert werden soll (Michel et al., 2005), wurde im
Rahmen dieser Doktorarbeit auch versucht, die Auswirkung der CCR5-Herabregulation
auf die Superinfektion zu bestimmen. Dabei konnte die Nef-vermittelte CCR5-Modulation
in stabil transfizierten CHO Zellen, die diesen Rezeptor überexprimieren, bestätigt werden.
Da die CCR5-Herabregulation in anderen Zelllinien oder primären Zellen allerdings nur
schwach ist (Michel et al., 2005), spielt sie bei der Superinfektionsresistenz, wenn
überhaupt, wahrscheinlich nur eine sehr geringe Rolle.
Zusammenfassend zeigen die Daten dieser Doktorarbeit, dass Nef HIV-1 infizierte
Zellen effektiv vor einer Superinfektion schützt. Dazu trägt sowohl die CD4Herabregulation als auch ein bislang unbekannter CD4-unabhängiger Mechanismus bei.
Die Blockierung einer Superinfektion schützt die Zellen vor dem vorzeitigen Tod durch
Apoptose, verlängert dadurch die Zeitspanne in der die Nachkommenviren freigesetzt
werden können und ermöglicht dem Virus somit eine effektive Replikation.
8.ZUSAMMENFASSUNG
44
8. Zusammenfassung
Das Humane Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) verwendet drei seiner Proteine
(Vpu, Env und Nef) zur Herabregulation von CD4 von der Zelloberfläche. Dies führt zu
einer verstärkten Freisetzung von Viren und einer erhöhten Infektiosität der Partikel. Da
CD4 der primäre Rezeptor von HIV-1 und neben den Korezeptoren CxCR4 oder CCR5
notwendig für eine Infektion der Zelle ist, wird seit langem postuliert, dass die HIV-1
vermittelte CD4-Modulation eine als Superinfektion bezeichnete zweite Infektion bereits
infizierter Zellen verhindert. In der vorliegenden Promotionsarbeit sollte der Beitrag der
viralen Proteine Vpu, Env und Nef zur CD4-Herabregulation und die daraus resultierende
Resistenz von HIV-1 infizierten T-Zellen gegen eine Superinfektion untersucht werden.
Hierzu wurden Viren mit einzelnen und kombinierten Defekten in den vpu, env und
nef Genen hergestellt, die das grüne Fluoreszenzprotein (eGFP) über eine interne
Ribosomeneintrittsstelle (IRES) exprimieren. FACS Analysen infizierter Jurkat T-Zellen,
primärer Blutlymphozyten (PBMC) und mit CD4 kotransfizierter 293T Zellen zeigten,
dass alle drei Proteine zur effektiven Entfernung von CD4 von der Zelloberfläche
beitragen. Nef entfernte CD4 dabei immer sehr effektiv von der Zelloberfläche, wogegen
Env eine schwächere Wirkung hatte. Vpu war in Jurkat Zellen nicht und in PBMCs
schwach aktiv. In 293T Zellen blockierte es dagegen effizient den Transport von neu
synthetisiertem CD4 zur Zelloberfläche.
Zur Untersuchung der Superinfektion wurde eine auf zwei unterschiedlichen
Fluoreszenzproteinen basierende FACS-Analyse verwendet. Dazu wurden Jurkat T-Zellen
initial mit rekombinanten DsRed2 exprimierenden HIV-1 Viren transduziert, drei Tage
später mit eGFP exprimierenden Wildtyp-HIV-1-Viren infiziert und nach weiteren zwei
Tagen im FACS analysiert. Nef schützte in Übereinstimmung mit seiner starken CD4Modulationsaktivität HIV-1 infizierte Zellen effektiv vor einer Superinfektion, wogegen
Vpu und Env nur eine geringe schützende Wirkung zeigten. Die Analyse von zehn
verschiedenen nef-Allelen, die CD4 unterschiedlich stark herabregulieren, ergab, dass die
nef-vermittelte CD4-Herabregulation mit der Resistenz gegen eine Superinfektion
korreliert. Des Weiteren zeigte die Untersuchung von nef-Allelen mit unterschiedlicher
Wirkung auf CD4 und CxCR4, dass auch die Herabregulation von CxCR4 Zellen vor einer
Superinfektion mit HI-Viren schützt, die diesen Korezeptor verwenden (X4-trope Viren).
Diese Analysen ergaben außerdem, dass zusätzlich zu den rezeptorabhängigen
Mechanismen ein bislang unbekannter rezeptorunabhängiger Mechanismus an der Nef-
8.ZUSAMMENFASSUNG
45
vermittelten Resistenz gegen eine Superinfektion beteiligt ist, da auch nef-Allele, die
weder CD4 noch CxCR4 von der Zelloberfläche entfernten, den Anteil an superinfizierten
Zellen reduzierten. Weitere Untersuchungen zeigten, dass superinfizierte T-Zellen deutlich
häufiger apoptotisch sind und durch den programmierten Zelltod sterben als einfach oder
nicht infizierte Zellen.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Promotionsarbeit, dass Nef im
Vergleich zu Vpu und Env den primären viralen Rezeptor CD4 am effektivsten von der
Zelloberfläche entfernt und damit HIV-infizierte Zellen vor einer Superinfektion und dem
vorzeitigen Tod durch Apoptose schützt. Dies verlängert die Zeitspanne der
Partikelfreisetzung aus der infizierten Zelle und ermöglicht damit eine effiziente
Vermehrung des Virus.
9. LITERATURVERZEICHNIS
46
9. Literaturverzeichnis
Allen, T. M., and M. Altfeld. 2003. HIV-1 superinfection. J. Allergy Clin. Immunol.
112:829-835.
Argañaraz, E. R., M. Schindler, F. Kirchhoff, and J. Lama. 2003. Enhanced CD4
down-modulation by late-stage HIV-1 nef alleles is associated with increased Env
incorporation and viral replication. J. Biol. Chem. 36:33912-33919.
Bailes, E., F. Gao, F. Bibollet-Ruche, V. Courgnaud, M. Peeters, P. A. Marx, B. H.
Hahn, and P. M. Sharp. 2003. Hybrid origin of SIV in chimpanzees. Science 300:1713.
Benson, R. E., A. Sanfridson, J. S. Ottinger, C. Doyle, and B. R. Cullen. 1993.
Downregulation of cell surface CD4 expression by simian immunodeficiency virus Nef
prevents viral super infection. J. Exp. Med. 177:1561-1566.
Barré-Sinoussi, F., J. C. Chermann, F. Rey, M. T. Nugeyre, S. Chamaret, J. Gruest,
C. Dauget, C. Axler-Blin, F. Vezinét-Brun, C. Rouzioux, W. Rozenbaum, and L.
Montagnier. 1983. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus form a patient at risk for
AIDS. Science 220: 868-871.
Blackard, J. T., D. E. Cohen, and K. H. Mayer. 2002. Human immunodeficiency virus
superinfection and recombination: current state of knowledge and potential clinical
consequences. Clin. Infect. Dis. 34:1108-1114.
Bour, S., C. Perrin, and K. Strebel. 1999. Cell surface CD4 inhibits HIV-1 particle
release by interfering with Vpu activity. J. Biol. Chem. 274:33800-33806.
Campbell, E. M., R. Nunez, and T. J. Hope. 2004. Disruption of the actin cytoskeleton
can complement the ability of Nef to enhance human immunodeficiency virus type 1
infectivity. J. Virol. 78:5745-5755.
Campbell, R. E., O. Tour, A. E. Palmer, P. A. Steinbach, G. S. Baird, D. A. Zacharias,
and R. Y. Tsien. 2002. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.99:7877-7882.
Carl, S., T. C. Greenough, M. Krumbiegel, M. Greenberg, J. Skowronski, J. L.
Sullivan, and F. Kirchhoff. 2001. Modulation of different human immunodeficiency virus
type 1 Nef functions during progression to AIDS. J. Virol. 75:3657-3665.
9. LITERATURVERZEICHNIS
47
Cavert, W., D. W. Notermans, K. Staskus, S. W. Wietgrefe, M. Zupancic, K.
Gebhard, K. Henry, Z. Q. Zhang, R. Mills, H. McDade, J. Goudsmit, S. A. Danner,
and A. T. Haase. 1997. Kinetics of response in lymphoid tissues to antiretroviral therapy
of HIV-1 infection. Science 276:960-964.
Chazal, N., G. Singer, C. Aiken, M. L. Hammarskjold, and D. Rekosh. 2001. Human
immunodeficiency virus type 1 particles pseudotyped with envelope proteins that fuse at
low pH no longer require Nef for optimal infectivity. J Virol. 75:4014-8.
Chen, B. K., R. T. Gandhi, and D. Baltimore. 1996. CD4 down-modulation during
infection of human T cells with human immunodeficiency virus type 1 involves
independent activities of vpu, env, and nef. J. Virol. 70:6044-6053.
Clavel, F., M. Guyader, D. Guetard, M. Salle, L. Montagnier, and M. Alizon. 1986.
Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2.
Nature 324(6098):691-5.
Coffin, J., A. Haase, J. A. Levy, L. Montagnier, S. Oroszlan, N. Teich, H. Temin, K.
Toyoshima, H. Varmus, and P. L. Vogt. 1986. What to call the AIDS virus? Nature
321:10.
Cohen, E. A., G. Dehni, J. G. Sodroski, and W. A. Haseltine. 1990. Human
immunodeficiency virus vpr product is a virion-associated regulatory protein. J Virol.
64(6):3097-9.
Cortes, M. J., F. Wong-Staal, and J. Lama. 2002. Cell surface CD4 interferes with the
infectivity of HIV-1 particles released from T cells. J. Biol. Chem. 277:1770-1779.
Dalgleish, A. G., P. C. Beverley, P. R. Clapham, D. H. Crawford, M. F. Greaves, and
R. A. Weiss. 1984. The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the
AIDS retrovirus. Nature 312(5996):763-7.
Daniel, R., R. A. Katz, and A. M. Skalka. 1999. A role for DNA-PK in retroviral DNA
integration. Science 284:644-647.
DeVita, V.T., S. Hellmann and S. Rosenberg. 1997. AIDS. Lipincott-Raven Publishers,
Philadelphia, New York.
Doms, R. D., and D. Trono. 2000. The plasma membrane as a combat zone in the HIV
battlefield. Genes Dev. 14:2677-2688.
9. LITERATURVERZEICHNIS
48
DuBridge, R. B., P. Tang, H. C. Hsia, P. M. Leong, J. H. Miller, and M. P. Calos.
1987. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.
Mol.Cell Biol., 7, 379-387.
Fackler, O. T., W. Luo, M. Geyer, A. S. Alberts, and P. M. Peterlin. 1999. Activation
of Vav by Nef induces cytoskeletal rearrangements and downstream effector functions.
Mol. Cell. 3:729-739.
Gottlieb, M. S., R. Schroff, H. M. Schanler, J. D. Weisman, P. T. Fan, R. A. Wolf, and
A. Sanyon. 1981. Pneumocystis carinii pneumonia and mucosal candidiasis in previously
healthy homosexuall men: evidence of a new acquired cellular immunodeficiency. N. Engl.
J. Med. 305: 1426-1431.
Greenberg, M. E., A. J. Iafrate, and J. Skowronski. 1998. The SH3 domain-binding
surface and an acidic motif in HIV-1 Nef regulate trafficking of class I MHC complexes.
EMBO J. 17:2777-2789.
Greenberg, M. E., L. DeTulleo, I. Rapoport, J. Skowronski, and T. Kirchhausen.
1998. A dileucine motif in HIV-1 Nef is essential for sorting into clathrin-coated pits and
for downregulation of CD4. Curr. Biol. 8:1239-1242.
Gross, K. L., T. C. Porco, and R. M. Grant. 2004. HIV-1 superinfection and viral
diversity. AIDS 18:1513-1520.
Hiebenthal-Millow, K., and F. Kirchhoff. 2002. The most frequent naturally occurring
length polymorphism in the HIV-1 LTR has little effect on proviral transcription and viral
replication. Virol. 292(1):169-75.
Ho, D. D. 1998. Toward HIV eradication or remission: the tasks ahead.
Science 280(5371):1866-7.
Hoxie, J. A., J. D. Alpers, J. L. Rackowski, K. Huebner, B. S. Haggarty, A. J.
Cedarbaum, and J. C. Reed. 1986. Alterations in T4 (CD4) protein and mRNA synthesis
in cells infected with HIV. Science 234(4780):1123-7.
Hrecka, K., T. Swigut, M. Schindler, F. Kirchhoff, and J. Skowronski. 2005. Nef
proteins from diverse groups of primate lentiviruses downmodulate CXCR4 to inhibit
migration to SDF-1 chemokine. J. Virol. 79:10650-10659.
9. LITERATURVERZEICHNIS
49
Keppler, O. T. , N. Tibroni, S. Venzke, S. Rauch, and O. T. Fackler. 2006. Modulation
of specific surface receptors and activation sensitization in primary resting CD4+ T
lymphocytes by the Nef protein of HIV-1. J. Leukoc. Biol. 79(3):616-27.
Kirchhoff, F., P. J. Easterbrook, N. Douglas, M. Troop, T. C. Greenough, J. Weber,
S. Carl, J. L. Sullivan, and R. S. Daniels. 1999. Sequence variations in human
immunodeficiency virus type 1 Nef are associated with different stages of disease. J. Virol.
73:5497-5508.
Klatzmann, D., E. Champagne, S. Chamaret, J. Gruest, D. Guetard, T. Hercend, J. C.
Gluckman, and L. Montagnier. 1984. T-lymphocyte T4 molecule behaves as the receptor
for human retrovirus LAV. Nature 312(5996):767-8.
Lama, J. 2003. The physiological relevance of CD4 receptor down-modulation during
HIV infection. Curr. HIV Res. 1:167-184.
Lama, J., A. Mangasarian, and D. Trono. 1999. Cell-surface expression of CD4 reduces
HIV-1 infectivity by blocking Env incorporation in a Nef- and Vpu-inhibitable manner.
Curr. Biol. 9:622-631.
LeGuern, M., and J. Levy. 1992. Human immunodeficiency virus (HIV) type 1 can
superinfect HIV-2-infected cells: pseudotype virions produced with expanded cellular host
range. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:363-367.
Levesque, K., Y. S. Zhao, and E. A. Cohen. 2003. Vpu exerts a positive effect on HIV-1
infectivity by down-modulating CD4 receptor molecules at the surface of HIV-1-producing
cells. J. Biol. Chem. 278:28346-28353.
Levesque, K., A. Finzi, J. Binette, and E. A. Cohen. 2004 Role of CD4 receptor downmodulation during HIV-1 infection. Curr HIV Res. 2(1):51-9.
Levy, D. N., G. M. Aldrovandi, O. Kutsch, and G. M. Shaw. 2004. Dynamics of HIV-1
recombination in its natural target cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:4204-4209.
Little, S. J., N. L. Riggs, M. Y. Chowers, N. J. Fitch, D. D. Richman, C. A. Spina, and
J. C. Guatelli. 1994. Cell surface CD4 downregulation and resistance to superinfection
induced by a defective provirus of HIV-1. Virology 205:578-582.
9. LITERATURVERZEICHNIS
50
Liu, H., X. Wu, M. Newman, G. M. Shaw, B. H. Hahn, and J. C. Kappes. 1995. The
Vif protein of human and simian immunodeficiency viruses is packaged into virions and
associates with viral core structures. J Virol. 69, 7630-7638
Mangasarian, A., M. Foti, C. Aiken, D. Chin, J.-L. Carpentier, and D. Trono. 1997.
The HIV-1 Nef protein acts as a connector with sorting pathways in the Golgi and at the
plasma membrane. Immunity 6:67-77.
Maniatis, T., J. Sambrook and E. F. Fritsch. 1989. Molecular cloning. Cold Spring
Harbor laboratory Press, New York.
Mariani, R., F. Kirchhoff, T. C. Greenough, J. L. Sullivan, R. C. Desrosiers, and J.
Skowronski. 1996. High frequency of defective nef alleles in a long-term survivor with
nonprogressive human immunodeficiency virus type 1 infection. J. Virol.70:7752–7764.
McMichael, A. J., and T. Hanke. 2003. HIV vaccines 1983-2003. Nat Med.; 9(7):874-80
Michel, N., I. Allespach, S. Venzke, O. T. Fackler, and O. T. Keppler. 2005. The Nef
protein of human immunodeficiency virus establishes superinfection immunity by a dual
strategy to downregulate cell-surface CCR5 and CD4. Curr Biol. 15:714-723.
Nethe, M., B. Berkhout, and A. C. van der Kuyl. 2005. Retroviral superinfection
resistance. Retrovirology 2:52-65.
Palella, F. J. Jr., K. M. Delaney, A. C. Moorman, M. O. Loveless, J. Fuhrer, G. A.
Satten, D. J. Aschman, and S. D. Holmberg. 1998. Declining morbidity and mortality
among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV Outpatient
Study Investigators. N. Engl. J. Med., 338, 853-860.
Perelson, A. S., P. Essunger, Y. Cao, M. Vesanen, A. Hurley, K. Saksela, M.
Markowitz, and D. D. Ho. 1997. Decay characteristics of HIV-1-infected compartments
during combination therapy. Nature 387:188-191.
Perelson, A. S., A. U. Neumann, M. Markowitz, J. M. Leonard, and D. D. Ho. 1996.
HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation
time. Science 271:1582-1586.
Pham, H. M., E. R. Arganaraz, B. Groschel, D. Trono, and J. Lama. 2004. Lentiviral
vectors interfering with virus-induced CD4 down-modulation potently block human
9. LITERATURVERZEICHNIS
51
immunodeficiency virus type 1 replication in primary lymphocytes. J Virol. 78:1307213081.
Piguet, V., Y.-L. Chen, A. Mangasarian, M. Foti, J.-L. Carpentier, and D. Trono.
1998. Mechanism of Nef-induced CD4 endocytosis: Nef connects CD4 with the µ chain of
adaptor complexes. EMBO J. 17:2472-2481.
Ross, T. M., A. E. Oran, and B. R. Cullen. 1999. Inhibition of HIV-1 progeny virion
release by cell-surface CD4 is relieved by expression of the viral Nef protein. Curr. Biol.
9:613-621.
Rücker, E., J. Münch, J. C. Grivel, F. Kirchhoff, and L. Margolis. 2004. Vpr and Vpu
are important for efficient HIV-1 replication and CD4+ T cell depletion in human
lymphoid tissue ex vivo. J. Virol. 78:12689-12693.
Schindler, M., S. Wuerfl, P. Benaroch, T. C. Greenough, R. Daniels, P. Easterbrook,
M. Brenner, J. Münch, and F. Kirchhoff. 2003. Down-modulation of mature MHC class
II and up-regulation of invariant chain cell surface expression are well conserved functions
of human and simian immunodeficiency virus nef alleles. J. Virol. 77:10548-10556.
Schindler, M., J. Münch, and F. Kirchhoff. 2005. HIV-1 inhibits DNA damage triggered
apoptosis by a Nef-independent mechanism. J. Virol. 79:5489-5498.
Smith, D. M., D. D. Richman, and S. J. Little. 2005. HIV superinfection. J. Infect. Dis.
192:438-444.
Stevenson, M. 2003. HIV-1 pathogenesis. Nat. Med. 9:853-860.
Tobiume, M., M. Takahoko, T. Yamada, M. Tatsumi, A. Iwamoto, and M. Matsuda.
2002. Inefficient enhancement of viral infectivity and CD4 downregulation by human
immunodeficiency virus type 1 Nef from Japanese long-term nonprogressors. J. Virol.
76:5959-5965.
Stumptner-Cuvelette, P., S. Morchoisne, M. Dugast, S. Le Gall, G. Raposo, O.
Schwartz, and P. Benaroch. 2001. HIV-1 Nef impairs MHC class II antigen presentation
and surface expression. Proc Natl Acad Sci. 98(21):12144-9.
van 't Wout, A.B., J. V. Swain, M. Schindler, U. Rao, M. S. Pathmajeyan, J. I.
Mullins, and F. Kirchhoff. 2005. Nef induces multiple genes involved in cholesterol
9. LITERATURVERZEICHNIS
52
synthesis and uptake in human immunodeficiency virus type 1-infected T cells. J. Virol.
79:10053-10058.
Ventzke S., N. Michel, I. Allespach, O.T. Fackler, and O. T. Keppler. 2006. Expression
of Nef downregulates CXCR4, the major coreceptor of human immunodeficiency virus,
from the surface of target cells and therby enhances resistance to superinfection. J. Virol.
Aug 23 [Epub ahead of print].
Weiss, A., and D. R. Littman. 1994. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors.
Cell. 76:263-274.
Welker, R., H. Kottler, H. R. Kalbitzer, and H. G. Kräusslich. 1996. Human
immunodeficiency virus type 1 Nef is incorporated into virus particles and specifically
cleaved by the viral proteinase. Virol. 219, 228-236.
Zheng, Y. H., A. Plemenitas, C. J. Fielding, and B. M. Peterlin. 2003. Nef increases the
synthesis of and transports cholesterol to lipid rafts and HIV-1 progeny virions. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 100:8460-8465.
Zhu, T., B. T. Korber, A. J. Nahmias, E. Hooper, P. M. Sharp, and D. D. Ho. 1998. An
African HIV-1 sequence from 1959 and implications for the origin of the epidemic.
Nature, 391: 594-597.