die gemischte Lymphozytenreaktion aus naiven T

Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
des St. Josef-Hospitals Bochum - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. C. Rieger
Optimierung eines In-vitro-Modells für die primäre Immunantwort:
Die gemischte Lymphozytenreaktion
aus naiven T-Zellen und dendritischen Zellen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Britta Klitzke
aus Hagen (Westfalen)
2004
I
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
PD Dr. med. U. Schauer
Korreferentin:
PD Dr. rer. nat. M. Raulf-Heimsoth
Tag der mündlichen Prüfung: 30. November 2004
II
Meinen Eltern.
III
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS ........................................................................................... IV
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN .................................................................... VII
1
EINLEITUNG .......................................................................................................1
1.1
Das Immunsystem des Neugeborenen........................................................................ 1
1.2
Ablauf einer primären Immunantwort in vivo............................................................ 2
1.2.1
Adhäsionsmoleküle fördern den ersten Antigenkontakt..................................... 2
1.2.2
Zur Aktivierung sind spezifisches und kostimulierendes Signal notwendig...... 3
1.2.3
Ausdifferenzierung zu T-Effektorzellen ............................................................. 4
1.3
Dendritische Zellen als antigenpräsentierende Zellen ................................................ 5
1.3.1
Die Familie der dendritischen Zellen.................................................................. 6
1.3.2
In-vitro-Erzeugung von dendritischen Zellen..................................................... 7
1.3.3
Funktion der DC und Expression spezifischer Moleküle in Abhängigkeit vom
Reifestadium ....................................................................................................... 8
1.3.4
1.4
Die Ausreifung der generierten dendritischen Zellen....................................... 10
Kokulturen naiver T-Zellen mit allogenen DC - als humanes In-vitro-Modell für die
primäre Immunantwort ............................................................................................. 11
1.4.1
Das Prinzip der gemischten Lymphozytenreaktion .......................................... 11
1.4.2
Gewinnung naiver T-Zellen für das In-vitro-Modell........................................ 12
1.5
Differenzierung naiver CD4-T-Zellen in Th1- und Th2-Zellen ............................... 13
1.5.1
Das Th1/Th2-Modell ........................................................................................ 13
1.5.2
Durchflusszytometrische Messung der Leitzytokine IFN-γ und IL-4 .............. 15
1.6
Die Regulation der T-Helferzell-Differenzierung .................................................... 16
1.6.1
Bedeutung ......................................................................................................... 16
1.6.2
Mechanismen .................................................................................................... 17
IV
1.7
1.7.1
Definition und Ablauf der Apoptose ................................................................ 21
1.7.2
Die Bedeutung der Apoptose im Immunsystem ............................................... 22
1.7.3
Mechanismen .................................................................................................... 23
1.8
2
Apoptose in den allogenen Kokulturen .................................................................... 21
Fragestellung............................................................................................................. 26
METHODIK .......................................................................................................27
2.1
Material..................................................................................................................... 27
2.1.1
Geräte und Hilfsmittel ...................................................................................... 27
2.1.2
Chemikalien, Pufferlösungen, Zellmedien ....................................................... 28
2.1.3
Stimulanzien ..................................................................................................... 30
2.1.4
Antikörper und Kits .......................................................................................... 31
2.2
Methoden .................................................................................................................. 32
2.2.1
Gewinnung von Blutproben als Ausgangsmaterial .......................................... 32
2.2.2
Isolierung der mononukleären Zellphase.......................................................... 33
2.2.3
Magnetassoziierte Zellsortierung (MACS)....................................................... 33
2.2.4
Zellkultur zur Anzucht dendritischer Zellen..................................................... 36
2.2.5
Einfrieren der gewonnenen Zellen.................................................................... 37
2.2.6
Kokulturen aus CD45RA+ Zellen mit allogenen DC - als In-vitro-Modell der
primären Immunantwort.................................................................................... 38
3
2.2.7
Zellzahlbestimmung nach Anfärbung mit Trypan Blau ................................... 39
2.2.8
Analytische Durchflusszytometrie.................................................................... 39
2.2.9
Statistische Auswertung.................................................................................... 51
ERGEBNISSE ...................................................................................................52
3.1
Zytokinproduktion und Th-Differenzierung in den allogenen Kokulturen .............. 52
3.1.1
Einfluss des DC:T-Verhältnisses auf die Th-Differenzierung.......................... 52
3.1.2
Kinetik der Zytokininduktion ........................................................................... 54
3.1.3
Vergleich verschiedener Hemmstoffe des Proteintransports............................ 55
V
3.1.4
Einfluss verschiedener Stimuli auf die Zytokinproduktion .............................. 57
3.1.5
Vergleich CD45RA+ Zellen Neugeborener und Erwachsener in Bezug auf ihre
Zytokinproduktion............................................................................................. 60
3.2
Vitalität und Apoptoseverhalter kokultivierten Zellen ............................................. 63
3.2.1
Absolute Zellzahlen im zeitlichen Verlauf und in Abhängigkeit vom DC:TVerhältnis .......................................................................................................... 63
3.2.2
Relative Anteile apoptotischer und nekrotischer Lymphozyten im zeitlichen
Verlauf und in Abhängigkeit vom DC:T-Verhältnis......................................... 66
4
DISKUSSION ....................................................................................................69
4.1
Die Th-Differenzierung ist abhängig vom DC:T-Verhältnis in den Kokulturen...... 70
4.2
Die IL-4-Produktion folgt einer Kinetik mit Höhepunkt am 7. Kulturtag................ 71
4.3
Vitalität und Apoptoseverhalten der kokultivierten Zellen ...................................... 73
4.4
Vergleich verschiedener Proteintransporthemmstoffe.............................................. 76
4.5
Einfluss verschiedener Stimuli auf die Zytokinproduktion ...................................... 76
4.6
Naive T-Zellen Erwachsener produzierten mehr IFN-γ als naive T-Zellen
Neugeborener............................................................................................................ 78
4.7
5
Abschließende Beurteilung des In-vitro-Modells..................................................... 79
ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................81
LITERATURVERZEICHNIS.......................................................................................82
DANKSAGUNG .......................................................................................................105
LEBENSLAUF .........................................................................................................106
VI
Verzeichnis der Abkürzungen
+
positiv
Abb.
Abbildung
+
adulte CD45RA
CD45RA-positive Zellen aus peripherem Blut Erwachsener
APC
antigenpräsentierende Zelle (engl.: antigen presenting cell)
AS
Aminosäure
BFA
Brefeldin A
BSA
bovines Serum-Albumin
CBMC
mononukleäre Nabelschnurblutzellen (engl.: cord blood mononuclear
cells)
CD
Differenzierungscluster (engl.: clusters of differentiation)
CO2
Kohlendioxid
CTL
zytotoxischer T-Lymphozyt (engl.: cytotoxic T-lymphocyte)
DC
dendritische Zelle (engl.: dendritic cell)
DC:T-Verhältnis
Mengenverhältnis dendritischer Zellen (DC) zu T-Zellen (T)
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure (engl.: desoxyribonucleid acid)
EDTA
Äthylendiamintetraessigsäure (engl.: ethylene diamine tetraacetic acid)
FACS
fluoreszenzaktivierter Zellsortierer (engl.: fluorescence-activated cell
sorter
Fc
konstantes Antikörperfragment (engl.: fragment crystallizable / frz.:
fragment crystalline)
FcR
Fc-Rezeptor (= Rezeptor für den Fc-Teil von Immunglobulinen)
FCS
fetales Kälberserum (engl.: fetal calf serum)
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
Fl
Fluoreszenz
FSC
Vorwärtsstreulicht (engl.: forward light scatter)
g
Fallbeschleunigung (9,807 ms-2)
GM-CSF
Granulozyten-Makrophagen-kolonie-stimulierender Faktor (engl.:
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)
VII
HBSS
Hanks’ balanced salts
HEPES
2-(N-Hydroxyethylpiperazin)-2’-Ethansulfonsäure
HIV
menschliches Immunschwächevirus (engl.: human immunodeficiency
virus)
HPC
hämatopoetische Stammzelle (engl.: hematopoietic progenitor cell)
ICAM
interzelluläres Adhäsionsmolekül (engl.: intercellular adhesion
molecule)
IFN-γ
Interferon-Gamma
IgE, IgG
Immunglobulin Typ E, Immunglobulin Typ G
IL
Interleukin
L
Ligand
LFA
lymphocyte function-associated antigen (engl.)
MACS
magnetassoziierte Zellsortierung
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex (engl.: major histocompatibility
complex)
MLR
gemischte Lymphozytenreaktion (engl.: mixed lymphocyte reaction)
+
Nabel-CD45RA
CD45RA-positive Zellen aus Nabelschnurblut
NK-Zellen
natürliche Killerzellen
PBMC
mononukläre Zellen des peripheren Blutes (engl.: peripheral blood
mononuclear cells)
PC
Personalcomputer
PE
Phycoerythrin
PFA
Paraformaldehyd
PI
Propidiumiodid
PKC
Proteinkinase C
PMA
Phorbol-12-Myristat-13-Acetat
PS
Phosphatidylserin
R
Region
RPMI
Rosswell Park Memorial Institute
SCF
Stammzellfaktor (engl.: stem cell factor)
SEM
mittlere Standardabweichung (engl.: standard error of the mean)
SSC
Rechtwinkelstreulicht (engl.: side scatter)
Tab.
Tabelle
VIII
TCR
T-Zell-Rezeptor (engl.: T cell receptor)
Th-Zelle
T-Helferzelle
TNF (-α)
Tumornekrosefaktor (-Alpha)
TNF-R
Tumornekrosefaktor-Rezeptor
IX
1 Einleitung
1.1 Das Immunsystem des Neugeborenen
Zum Zeitpunkt der Geburt befindet sich das menschliche Immunsystem noch in einem
unreifen Zustand, was sowohl die unspezifische als auch die spezifische Immunität betrifft
(Kovarik and Siegrist, 1998). Die vollständige Immunkompetenz entwickelt sich erst
postnatal, in etwa bis zum sechsten Lebensmonat.
Während
dieser
Phase
ist
das
Immunsystem
besonders
empfindlich
gegenüber
Umgebungseinflüssen. Wenn ein Säugling z.B. Zigarettenrauch ausgesetzt ist oder bestimmte
Infektionskrankheiten durchlebt, dann kann dies Funktionen seiner Immunabwehr
grundlegend beeinflussen. So wird auch bereits in den ersten Lebensmonaten eines Menschen
der Grundstein für bestimmte das Immunsystem betreffende Krankheiten, wie z.B. Allergien,
gelegt.
Wie solche initial prägenden Immunreaktionen im Detail ablaufen, ist noch unklar. Man geht
bislang von unspezifischen immunmodulierenden Einflüssen durch Umweltfaktoren aus.
Die T-Lymphozyten (oder T-Zellen) stehen im Zentrum der spezifischen Immunität, da TEffektorzellen sowohl die zellvermittelte Immunität ausüben als auch für die humorale
Immunität unentbehrlich sind, weil sie die B-Zellen zur Antikörperproduktion erst aktivieren
müssen (Helferfunktion). Beim Neugeborenen sind fast alle T-Zellen naiv (95-99 %), d.h. sie
hatten noch keinen Kontakt mit ihrem spezifischen Antigen. Durch Antigenexposition reifen
in den ersten Lebensmonaten die ersten, und im Laufe des Lebens dann immer mehr naive TZellen zu Effektor- und Gedächtnis-T-Zellen aus. Im peripheren Blut Erwachsener befinden
sich noch ca. 5 % naive T-Zellen.
Die antigenspezifische Aktivierung und Ausreifung naiver T-Zellen erfolgt im Rahmen
primärer spezifischer Immunantworten. Je nachdem, welche T-Effektorzellen als Ergebnis
solcher primärer Immunantworten aus naiven T-Zellen hervorgehen, wird die Immunantwort
bevorzugt Antikörper-vermittelt oder Zell-vermittelt ausfallen. Die Regulation der T-ZellDifferenzierung ist somit eine zentrale Schaltstelle im Immunsystem. Sie entscheidet darüber,
1
ob a) ein Pathogen erfolgreich bekämpft und aus dem Körper eliminiert wird oder im Körper
persistiert und sich vermehrt, b) durch die Entstehung spezifischer T-Gedächtniszellen
Immunität entsteht oder nicht, c) ein Transplantat abgestoßen oder toleriert wird, und ob d)
bezüglich harmloser bzw. körpereigener Antigene im Sinne einer Fehlsteuerung eine
allergische bzw. autoimmune Reaktionslage entsteht.
Wegen dieser zentralen Stellung im Immunsystem ist die primäre Immunantwort auch ein
Schwerpunktthema der Immunologie. Noch ungeklärt ist, ob, wie und auf welcher Ebene die
oben genannten prägenden Umweltreize die primäre Immunantwort des Neugeborenen
modulieren können. Zur Untersuchung derartiger Fragestellungen war im Labor der
Kinderklinik ein humanes In-vitro-Modellsystem entwickelt worden, welches aus Kokulturen
naiver T-Zellen mit allogenen antigenpräsentierenden Zellen besteht. Die Optimierung dieses
an gemischte Lymphozytenreaktionen angelehnten In-vitro-Modells war das Ziel der
vorliegenden Arbeit.
1.2 Ablauf einer primären Immunantwort in vivo
Das In-vitro-Modell simuliert die Entwicklung von naiven T-Zellen zu T-Effektorzellen in den
peripheren Lymphorganen. Der im Folgenden beschriebene Ablauf der primären
Immunantwort liegt demnach auch den In-vitro-Reaktionen zugrunde.
1.2.1 Adhäsionsmoleküle fördern den ersten Antigenkontakt
Alle T-Zellen sind naiv, wenn sie den Thymus verlassen (Janeway and Travers, 1997). Auf
der Suche nach ihrem spezifischen Antigen zirkulieren sie kontinuierlich vom Blut in die
peripheren lymphatischen Organe (wie Lymphknoten, Milz und mucosa-assoziiertes
lymphatisches Gewebe) und zurück. In den Lymphorganen binden die naiven T-Zellen
vorübergehend an jede antigenpräsentierende Zelle (APC), um die festgehaltenen Antigene zu
überprüfen. Diese „lockere“ Bindung und gleichzeitig erste Wechselwirkung zwischen T-Zelle
und APC wird durch Adhäsionsmoleküle herbeigeführt. Diese sind vor allem CD2, LFA-1
2
(CD11a) und ICAM-3 (CD50) auf der T-Zelle, welche jeweils mit LFA-3 (CD58), ICAM-1
(CD54) oder ICAM-2 (CD102) und LFA-1 auf der APC interagieren.
Erkennt die T-Zelle ihren spezifischen Peptid:MHC-Liganden, wird über den T-Zell-Rezeptor
(TCR) eine Konformationsänderung von LFA-1 induziert, wodurch dessen Affinität für
ICAM-1 und ICAM-2 steigt. Daraufhin erfolgt die feste Bindung des antigenspezifischen
TCRs und des entsprechenden Korezeptors (CD4 oder CD8), wobei CD8-T-Zellen bevorzugt
an Peptid:MHC-I-Komplexe und CD4-T-Zellen bevorzugt an Peptid:MHC-II-Komplexe
binden.
1.2.2 Zur
Aktivierung
sind
spezifisches
und
kostimulierendes
Signal
notwendig
Neben dem spezifischen Signal erfordert die Aktivierung eines naiven Lymphozyten noch ein
weiteres, sog. kostimulierendes, Signal. Eine Antigenbindung ohne kostimulierendes Signal
führt zur Anergie der T-Zellen (d.h. Resistenz gegen Aktivierung), was wesentlich zur
Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz im Immunsystem beiträgt. Naive CD8-T-Zellen
brauchen eine stärkere Kostimulierung als naive CD4-T-Zellen. Bei nur schwach
kostimulierenden APC kann die Aktivierung der CD8-T-Zellen von CD4-T-Zellen gefördert
werden, die mit derselben APC interagieren.
Die am besten untersuchten kostimulierenden Oberflächenmoleküle sind die B7-Moleküle
B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86) auf APC, die mit den Rezeptoren CD28 und CTLA-4 auf TZellen interagieren (Lenschow et al., 1996). Nach Erhalt des ersten (= spezifischen) Signals
induziert das zweite (= kostimulierende) Signal - nämlich die Bindung des CD28-Rezeptors an
ein B7-Molekül - die autokrine Produktion des T-Zell-Wachstumsfaktors Interleukin-2 (IL-2)
und dessen hochaffinen Rezeptors (Linsley and Ledbetter, 1993). Die Bindung von IL-2 an
den Rezeptor bewirkt eine autokrine Wachstumsförderung. Der aktivierte Lymphozyt
transformiert zum sog. Lymphoblasten. Dieser proliferiert mittels wiederholter Zellteilungen
(sog. klonale Expansion) über einen Zeitraum von 4-5 Tagen.
B7.2 (CD86) gilt bislang als das wichtigste Molekül für die Verstärkung von T-ZellAntworten (Caux et al., 1994; Inaba et al., 1995). Doch auch die akzessorischen Moleküle
3
CD40 und OX40 steigern die T-Zell-Antwort. Die Bindung von CD40 und OX40L auf der
APC an CD40L und OX40 auf der T-Zelle führt zu einer Intensivierung der Zellinteraktion
und einer Fokussierung der entscheidenden Signale auf den Kontakt zwischen APC und
antigenaktivierter T-Zelle.
Begrenzt wird die proliferative Immunantwort über CTLA-4, welches erst 48 Stunden nach TZell-Aktivierung exprimiert wird - im Gegenzug zu einer Herunterregulierung von CD28
(Lenschow et al., 1996). CTLA-4 hat im Vergleich zu CD28 eine 20fach höhere
Bindungsaffinität für B7. Über CTLA-4 wird den aktivierten T-Zellen ein hemmendes Signal
gesendet, wodurch die IL-2-Produktion und dadurch die T-Zell-Aktivierung limitiert wird
(Tivol et al., 1995; Waterhouse et al., 1995; Bluestone, 1995).
1.2.3 Ausdifferenzierung zu T-Effektorzellen
Die Tochterzellen des Lymphoblasten, die Rezeptoren derselben Spezifität wie die Mutterzelle
tragen, differenzieren schließlich zu T-Effektorzellen aus. Diese können sofort und ohne
vorherige Kostimulierung auf ein spezifisches Antigen reagieren. Bei Erkennen des Antigens
erfolgt der Immunangriff auf die Zielzellen. Die ersten Interaktionen zwischen T-Effektorzelle
und Zielzellen werden - ähnlich wie bei naiven T-Zellen und APC - durch Antigenunspezifische Zelladhäsionsmoleküle vermittelt. Dies sind vor allem LFA-1 und CD2 auf der
T-Zelle und ICAM’s sowie LFA-3 auf den Zielzellen.
Je nach Subtyp übernehmen die T-Zellen unterschiedliche Effektorfunktionen bei der
Erregerabwehr.
Diese
Funktionen
sind
abhängig
vom
Spektrum
an
erzeugten
Effektormolekülen. Naive CD4-T-Zellen differenzieren zu T-Helferzellen aus, welche die
Regulation der Immunantwort übernehmen. Die entscheidenden Mediatoren der T-HelferzellAktionen sind die jeweils de novo synthetisierten Zytokine. Naive CD8-T-Zellen entwickeln
sich nach Aktivierung zu zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL), welche in infizierten und
maligne entarteten Körperzellen die Apoptose einleiten. Ihre Haupteffektormoleküle sind
Cytotoxine (wie Perforin-1 und Granzyme), die in speziellen lytischen Granula gespeichert
werden. CTL produzieren aber auch Zytokine.
4
Nach Eliminierung des Erregers sterben die meisten Effektorzellen durch Apoptose, was ein
Abschalten der Immunantwort zur Folge hat. Es entstehen im Rahmen der Immunantwort aber
auch
einige
langlebige,
funktionell
inaktive
Gedächtniszellen.
Diese
sind
zur
Zytokinproduktion befähigt, können schneller als naive Zellen auf ein Antigen reagieren und
sind
verantwortlich
für
die
z.T.
lebenslange
Immunität
gegen
Krankheitserreger
(immunologisches Gedächtnis).
1.3 Dendritische Zellen als antigenpräsentierende Zellen
Zu den sog. antigenpräsentierenden Zellen zählt man dendritische Zellen, Makrophagen und
B-Zellen. T-Gedächtniszellen können durch jeden dieser Zelltypen aktiviert werden, nicht
jedoch naive T-Zellen. Es konnte vielmehr gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DC) als
einziger Zelltyp in der Lage sind, naive T-Zellen zu aktivieren (Steinman and Cohn, 1974;
Christinck et al., 1991; Croft et al., 1992). Da demnach DC für die Initiierung einer primären
Immunantwort unerlässlich sind, kamen sie auch im untersuchten In-vitro-Modell als APC
zum Einsatz.
Als In-vivo-Beweis für die entscheidende Rolle der DC bei der Auslösung von
Immunantworten wurden in sekundären Lymphorganen sowohl nach der Injektion von
allogenen Zellen (Kudo et al., 1997) als auch Superantigenen (Luther et al., 1997) oder
Proteinantigenen (Ingulli et al., 1997) proliferierende T-Zellen in Kontakt mit den DC der TZell-reichen Areale nachgewiesen.
Die Bedeutung der DC als den anderen überlegene APC zeigt sich in noch weiteren
Eigenschaften, die im Modellsystem zusätzlich von Nutzen waren:
-
DC sind als Stimulatorzellen in der gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) mindestens
30- bis 100fach effizienter als andere APC-Populationen (Steinman and Witmer, 1978;
Van Voorhis et al., 1983).
-
DC können in MLR nicht nur Lymphokin-sezernierende CD4-positive (CD4+) THelferzellen, sondern auch zytotoxische CD8+ T-Effektorlymphozyten direkt, d.h. ohne
die Hilfe von CD4+ T-Zellen, generieren. Man benötigt dazu aber höhere DC-Dosen
(Inaba et al., 1997; Young and Steinman, 1990).
5
-
DC sind ebenfalls 10- bis 50fach potenter als Monozyten oder B-Zellen darin, T-ZellAntworten auf fentomolare Konzentrationen von Superantigen auszulösen (Bhardwaj et
al., 1992, 1993).
-
Versuche an TCR-transgenen Mäusen haben gezeigt, dass die Fähigkeit der DC, eine
primäre antigenspezifische T-Zell-Antwort auf lösliche Antigene in vitro zu induzieren,
100- bis 300fach effizienter ist als die aller anderen APC (Croft et al., 1992; Macatonia et
al., 1995).
1.3.1 Die Familie der dendritischen Zellen
Die erste beschriebene dendritische Zelle war 1868 die Langerhans’sche Zelle in der
Epidermis. Das Vorkommen dendritischer Zellen in anderen Geweben wurde erst ein
Jahrhundert später von Ralph Steinman festgestellt (Steinman and Cohn, 1973). Der Name der
Zellen leitet sich von der charakteristischen, astartig verzweigten Form ab (griech. dendros:
Baum). Die DC strecken vom Zellkörper aus große segel- bzw. schleierförmige Ausläufer in
viele Richtungen (Winzler et al., 1997). Diese sternförmig verlaufenden Zellausläufer, die sog.
Dendriten, tragen wesentlich zur Ausübung der Zellfunktionen bei, da sie eine besonders enge
Zellbindung ermöglichen.
Inzwischen verbirgt sich hinter dem Begriff „Dendritische Zellen“ eine komplexe und
vielschichtige Zellfamilie, mit Vertretern hämatopoetischer und mesenchymaler Abstammung.
Man unterscheidet drei verschiedene DC-Populationen, die sich von CD34+ hämatopoetischen
Stammzellen (HPC) ableiten. Die pluripotente HPC differenziert sich zunächst in myeloide
und
lymphoide
Vorläuferzellen.
Aus
der
myeloiden
Zellreihe
entspringen
die
Langerhans’schen Zellen und die sog. interstitiellen DC. Aus den lymphoiden Vorläuferzellen
entwickeln sich sog. lymphoide (oder plasmazytoide) DC.
Mesenchymalen Ursprungs sind die fibroblastenartigen follikulären DC, die in den Follikeln
von Lymphknoten und Milz mit B-Lymphozyten interagieren (Matsumoto et al., 1997).
6
1.3.2 In-vitro-Erzeugung von dendritischen Zellen
DC lassen sich inzwischen in fast allen menschlichen Geweben nachweisen, allerdings in so
geringen Mengen, dass die Isolierung zu Forschungszwecken sehr schwierig ist. Sie machen
nur 0,4 % der Zellen des peripheren Blutes aus. Etwas reicher an DC ist z.B. das
Knochenmark mit 2 %.
Seit der Entwicklung spezieller Kulturtechniken in den frühen 90er Jahren ist jedoch die Invitro-Erzeugung ausreichend großer Mengen DC möglich. Es wurden verschiedene Verfahren
etabliert, in denen DC entweder aus Stammzellen (Caux et al., 1992, 1996; Flores-Romo et al.,
1997; Inaba et al., 1992a,b; Santiago-Schwarz et al., 1992; Strunk et al., 1996; Szabolcs et al.,
1995, 1996; Young et al., 1995) oder aus Monozyten (Bender et al., 1996; Peters et al., 1996;
Reddy et al., 1997; Romani et al., 1994, 1996; Sallusto and Lanzavecchia, 1994) generiert
werden.
Für den Einsatz im In-vitro-Modellsystem wurden DC, gemäß der Methode nach Caux, aus
Stammzellen angezüchtet (Caux et al., 1992). Dieses Verfahren war im Labor der
Kinderklinik bereits etabliert. CD34+ HPC wurden dabei mittels magnetischer Zellsortierung
aus mononukleären Nabelschnurblutzellen isoliert und anschließend gemeinsam mit den
Stimuli Stammzellfaktor (SCF), Granulozyten-Makrophagen-kolonie-stimulierender Faktor
(GM-CSF) und Tumornekrosefaktor-Alpha (TNF-α) kultiviert. In diesen Stammzellkulturen
reiften CD1a+ DC und CD14+ monozytäre Zellen aus. Obwohl es im Allgemeinen keinen
typischen Oberflächenmarker für DC gibt, dessen Expression die unzweifelhafte Zuordnung
einer Zelle zur DC-Familie zulassen würde (Bell et al., 1999), konnte in diesem speziellen Fall
die Expression des CD1a-Antigens zur Identifizierung der DC genutzt werden.
In Vorversuchen ließen sich die so generierten DC der myeloiden Zellreihe zuordnen. Sie
stellten eine Mischung aus Langerhans’schen Zellen und interstitiellen DC dar. Sowohl
Langerhans’schen Zellen als auch interstitiellen DC wird die ausgeprägte Fähigkeit
zugesprochen, naive CD45RA+ Nabelschnurblut-T-Zellen zu stimulieren (Caux et al., 1997).
Ebenfalls ließ sich für die angezüchteten DC die typische starke Stimulationsfähigkeit in der
MLR nachweisen.
7
1.3.3 Funktion der DC und Expression spezifischer Moleküle in Abhängigkeit
vom Reifestadium
Die beiden Schlüsselfunktionen antigenpräsentierender Zellen - die Antigenaufnahme und die
eigentliche Antigenpräsentation - werden in vivo von zwei voneinander abgrenzbaren
Reifestadien
der
DC
in
unterschiedlichen
Körperkompartimenten
wahrgenommen.
Entsprechend der jeweiligen Funktion verändert sich die Expression spezifischer Moleküle.
Unreife DC, zu denen auch Langerhans’sche Zellen und interstitielle DC zählen, sind in
nahezu allen peripheren Geweben ansässig und fungieren hier als „Wächter“ des
Immunsystems. Sie sind darauf spezialisiert, eingedrungene Antigene bzw. Pathogene über
verschiedene Mechanismen aufzunehmen. Exprimiert werden von unreifen DC daher vor
allem Rezeptoren für die Antigenaufnahme und Migrationsrezeptoren. Für die Verarbeitung
von Antigenen in Peptide sind sie mit lysosomalen Enzymen ausgestattet (Sallusto et al.,
1995). Ihre große Effizienz in der Antigenaufnahme zeigt sich darin, auch kleinste Mengen
löslichen Antigens durch Pinozytose noch zu „erwischen“. Des Weiteren können unreife DC
ein sehr breites Spektrum von Antigenen verinnerlichen. Diese Antigene umfassen nicht nur
Proteine, sondern auch große Partikel wie Viren, Bakterien, Mykobakterien, Parasiten und
apoptotische Zellkörper. Die von DC in großen Mengen synthetisierten MHC-II-Moleküle
(Kleijmeer et al., 1994, 1995; Young et al., 1992) liegen bei unreifen DC noch fast
ausschließlich in intrazellulären Vesikeln vor, um dort mit antigenen Peptiden beladen zu
werden.
Nach
dem
Antigenkontakt
werden
die
unreifen
DC
im
Zuge
einer
lokalen
Entzündungsreaktion aktiviert. Die beladenen Zellen verlassen die peripheren Gewebe und
wandern über Blut- oder Lymphgefäße in die nächstgelegenen sekundären Lymphorgane. Für
die Zeit der Wanderung nehmen sie vorübergehend eine zweckmäßig rundliche Form ohne die
typisch dendritischen Ausläufer an. Mit dem „Ortswechsel“ verlieren sie ihre phagozytotische
Aktivität (Cella et al., 1997a) und entwickeln sich zu reifen Zellen, die unter anderem eine
verstärkte Zytokinproduktion aufweisen. Zum umfangreichen Zytokinrepertoire der DC
gehören u.a. IL-12, IL-1, IL-6, TNF und verschiedene Chemokine (z.B. IL-15, DC-CK1).
8
Als Bestandteil des Reifungsprozesses wurde auch eine massive Verlagerung von MHC-IIMolekülen aus den intrazellulären Kompartimenten an die Zelloberfläche beschrieben
(Schuler and Steinman, 1985; Witmer-Pack et al., 1988). Die ausgeprägte Expression von
MHC-Klasse-II-Molekülen gilt als Charakteristikum für DC. Es werden aber auch MHC-Iund CD1-Moleküle (CD1a, CD1b, CD1c) als weitere antigenpräsentierende Moleküle
exprimiert. Letztere sind MHC-Klasse-B-Moleküle, die wegen ihrer strukturellen Ähnlichkeit
auch MHC-Klasse-I-ähnliche Moleküle genannt werden (Maher and Kronenberg, 1997;
Porcelli et al., 1992).
Weiterhin wird im Rahmen der DC-Reifung die Expression akzessorischer Moleküle
heraufreguliert (Cella et al., 1997b; Heufler et al., 1988; Pierre et al., 1997; Sallusto et al.,
1995; Witmer-Pack et al., 1987; Yamaguchi et al., 1997). Da DC während ihrer Wanderung
und
der
anschließenden
Interaktion
mit
den
T-Zellen
in
eine
Vielzahl
von
Adhäsionsgeschehen verwickelt sind, betrifft dies zum einen die Adhäsionsmoleküle, wie z.B.
ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102), LFA-1 (CD11a) und LFA-3 (CD58). Zum anderen
werden zur Verstärkung der T-Zell-stimulierenden Fähigkeiten die kostimulatorischen
Moleküle B7.1 (CD80) (Inaba and Steinman, 1984; Larsen et al., 1992; Lenz et al., 1993;
Young et al., 1992) und B7.2 (CD86) (Caux et al., 1994a; Inaba et al., 1995) sowie CD40 und
OX40L auf reifen DC stark exprimiert. Als einer der wertvollsten Marker zur Identifizierung
reifer DC gilt außerdem das CD83-Antigen (Zhou et al., 1992; Zhou and Tedder, 1995).
Die reifen DC siedeln sich in den T-Zell-Arealen der lymphatischen Gewebe an. Sie bilden
dort ein Netzwerk, durch das die T-Zellen kontinuierlich rezirkulieren. Daher werden sie nun
interdigitierende dendritische Retikulumzellen genannt. Sie präsentieren die zu Peptiden
verarbeiteten Antigene als Peptid:MHC-II-Komplexe auf ihrer Zelloberfläche, welche dort für
lange Zeit exprimiert bleiben. So wird die Selektion der seltenen antigenspezifischen T-Zellen
ermöglicht (Cella et al., 1997a; Pierre et al., 1997). Das hohe Level an Adhäsionsmolekülen
auf reifen DC verstärkt die Adhäsion und Signalgebung (Caux et al., 1994a; Freudenthal and
Steinman, 1990; Larsen et al., 1992; Lenz et al., 1993; Young et al., 1992). Erkennt ein
ruhender T-Lymphozyt „sein“ Antigen, so wird die primäre Immunantwort in Gang gesetzt (s.
1.2).
9
1.3.4 Die Ausreifung der generierten dendritischen Zellen
Nur reife DC sind also dazu in der Lage, naive T-Zellen zu aktivieren und eine primäre
Immunantwort auszulösen. Bei den aus Nabelschnurblut-Stammzellen angezüchteten Zellen
handelte es sich jedoch um noch unreife DC. Im Gegensatz zur traditionellen Auffassung von
der primären Immunantwort als einseitigem Prozess, in dem die DC die T-Zellen aktivieren,
geht man inzwischen von einer ausgeprägten wechselseitigen Beeinflussung von DC und TZellen aus, die u.a. auch die endgültige Ausreifung der DC zur Folge hat (Bell et al., 1999).
Daher ist davon auszugehen, dass die Ausreifung der angezüchteten DC im Zellkultursystem
selbst erfolgte, durch die Interaktion mit naiven T-Zellen. In vivo gehört neben den
Kontaktallergenen (Enk et al., 1993a,b; Silberberg-Sinakin et al., 1976) die Transplantation zu
den stärksten immunologischen Stimuli für die DC-Ausreifung (Larsen et al., 1990a,b, 1994),
und das In-vitro-Modell simuliert eine Transplantationssituation (vgl. 1.4.1).
Auf molekularer Ebene sind verschiedene Ausreifungsstimuli für DC beschrieben worden
(Bell et al., 1999). Von diesen spielt das T-Zell-spezifische Zytokin IL-2 eine Rolle. Die
Entzündungszytokine IL-1 und TNF-α können von DC im Sinne einer autokrinen Stimulation
selbst sezerniert oder von apoptotischen Zellen freigesetzt werden (Rovere et al., 1998). Auch
die Interaktion mit CD8+ T-Zellen kann via Freisetzung von Interferon-Gamma (IFN-γ) und
TNF-α den Reifungsprozess der DC fördern. Ebenso steigert die OX40/OX40L-Interaktion
laut Ohshima und Mitarbeitern merklich die Entwicklung von DC, die sich in einem
reversiblen Reifungs-Zwischenstadium befinden, in typische reife Zellen (Ohshima et al.,
1997). Durch die Bindung von CD40 auf DC soll die Lebensfähigkeit verbessert (Caux et al.,
1994b; Ludewig et al., 1995) und die Ausreifung induziert werden (Caux et al., 1994b;
Sallusto and Lanzavecchia, 1994).
10
1.4 Kokulturen naiver T-Zellen mit allogenen DC - als humanes In-vitroModell für die primäre Immunantwort
Bei einer primären Immunantwort werden naive T-Zellen von DC antigenspezifisch aktiviert
und differenzieren dann in der Interaktion mit DC zu T-Effektorzellen aus. Das im Rahmen
der vorliegenden Arbeit näher charakterisierte humane In-vitro-Modell simuliert den Ablauf
einer primären Immunantwort im Zellkultursystem. Es wurden dazu naive T-Zellen mit
allogenen, aus Nabelschnurblut-Stammzellen gemäß der Methode nach Caux gezüchteten, DC
(vgl. 1.3.2) kokultiviert.
1.4.1 Das Prinzip der gemischten Lymphozytenreaktion
Um in einem In-vitro-Modell eine messbare T-Zell-Reaktion durch eine primäre
Immunantwort zu erzeugen, wird ein sehr starker Reiz benötigt. Mit einem „normalen“
Antigen (d.h. Proteinantigen) würden in einem Zellkultursystem nur sehr wenige naive TZellen erreicht - entsprechend der geringen Anzahl antigenspezifischer naiver T-Zellen bereits
in vivo und erst recht in einem geschlossenen In-vitro-System. Daher fand das bewährte
Prinzip der MLR Anwendung.
Sehr viel mehr T-Zellen (ca. 1-10 %) sprechen nämlich auf Alloantigene an, d.h. auf fremde
an Fremd-MHC-Moleküle gebundene Proteine. Die Alloreaktivität kommt wahrscheinlich
durch eine Kreuzreaktion auf fremde an Selbst-MHC-Moleküle gebundene Proteine zustande
(Janeway and Travers, 1997). Alloreaktive T-Zellen - und damit die zellvermittelte Immunität
- sind die Ursache für Transplantatabstoßungen in vivo. Und verpflanzte Gewebe und Organe,
deren
MHC-Moleküle
sich
von
denen
des Empfängers unterscheiden
(was bei
nichtverwandten Spendern der Fall ist), werden immer abgestoßen. Sowohl CD8+ CTL als
auch CD4+ T-Helferzellen des Empfängers können durch APC im bzw. aus dem Transplantat
stimuliert werden.
Bei der gemischten Lymphozytenreaktion handelt es sich um ein In-vitro-Modell der
Gewebeabstoßung. Sie gilt nach wie vor als der verlässlichste Histokompatibilitätstest (Bell et
al., 1999). Es werden dabei T-Zellen als Reaktionszellen mit sog. stimulierenden Zellen
11
gemeinsam kultiviert. Bei den stimulierenden Zellen handelt es sich klassischerweise um
bestrahlte Lymphozyten („Nicht-T-Zellen“) und einige APC aus dem peripheren Blut einer
nichtverwandten Person. Auch in vitro reagieren die T-Lymphozyten stark auf die allogenen
MHC-Moleküle der fremden Zellen. Sie proliferieren daraufhin und differenzieren zu TEffektorzellen aus.
Bei dem vorgestellten In-vitro-Modell für die primäre Immunantwort handelt es sich um eine
Variante der MLR. Eingesetzt wurden hierbei die beiden zentralen Zelltypen der primären
Immunantwort: Speziell naive T-Zellen als Reaktionszellen und allogene DC als stimulierende
Zellen. Antigenbeladene DC und antigenspezifische T-Zellen sollen Aggregate bilden, die
eine optimale Mikroumgebung für die Entwicklung einer Immunantwort darstellen (Flechner
et al., 1988; Inaba and Steinman, 1984). Das Prinzip der MLR, die starke Reaktion der TLymphozyten auf das Erkennen von MHC-Polymorphismen, führte in den Kokulturen zu
einer messbaren T-Zell-Antwort.
1.4.2 Gewinnung naiver T-Zellen für das In-vitro-Modell
Naive T-Zellen lassen sich von aktivierten T-Zellen durch die Expression bestimmter
Oberflächenmoleküle unterscheiden. Unter anderem werden unterschiedliche Isoformen des
CD45R-Oberflächenantigens exprimiert. Aktivierte Zellen exprimieren CD45R0, während
CD45RA ein recht spezifischer Marker für naive Zellen ist (in Einzelfällen nehmen allerdings
auch Gedächtniszellen den Marker CD45RA wieder an). Das CD45RA-Antigen wurde
genutzt, um naive T-Zellen mittels magnetischer Zellsortierung einerseits aus Nabelschnurblut
und andererseits aus peripherem Blut erwachsener Probanden zu isolieren. Bei Einsatz von
CD45RA+ Zellen aus Nabelschnurblut wurde im Modellsystem die primäre Immunantwort des
Neugeborenen simuliert, bei Einsatz von CD45RA+ Zellen aus peripherem Blut Erwachsener
entsprechend die primäre Immunantwort des Erwachsenen. Auf diese Weise wurde nach
prinzipiellen Unterschieden naiver T-Zellen Neugeborener und Erwachsener gesucht.
CD45RA+ Zellen enthalten neben naiven T-Zellen allerdings auch B-Zellen und natürliche
Killerzellen (NK-Zellen) sowie vereinzelt DC (Galy et al., 1998). CD45RA ist somit nicht
spezifisch für T-Zellen. Die gewonnenen CD45RA+ T-Zellen teilten sich wiederum auf in ca.
12
60 % naive CD4-T-Zellen und 40 % naive CD8-T-Zellen. Für das In-vitro-Modellsystem
waren insbesondere die naiven CD4-T-Zellen von Interesse.
1.5 Differenzierung naiver CD4-T-Zellen in Th1- und Th2-Zellen
Naive CD4-T-Zellen differenzieren nach antigenspezifischer Aktivierung zu sog. THelferzellen (Th-Zellen) aus. Diese beeinflussen durch die Sekretion verschiedener Zytokine
das Verhalten anderer Zellen im Immunsystem und haben dadurch eine zentrale
Steuerfunktion inne. Innerhalb der Gruppe der CD4+ Th-Zellen gibt es komplexe Unterschiede
bezüglich der Interleukinproduktion und dementsprechend auch bezüglich der funktionellen
Fähigkeiten (Kim et al., 1985). Das vereinfachende Th1/Th2-Modell geht auf Mosmann und
Mitarbeiter zurück, die am murinen System die Th-Zellen nach dem Konzept des
dominierenden Zytokinmusters klassifizierten (Mosmann et al, 1986). Neben Th1- und Th2Zellen findet man beim Menschen häufig Th0-Zellen, welche ein weniger eingeschränktes
Zytokinmuster als Th1- und Th2-Zellen produzieren (Firestein et al., 1989; Paliard et al.,
1988) und demgemäß auch intermediäre Effekte vermitteln (Mosmann and Coffman, 1989;
Romagnani, 1994). Wahrscheinlich handelt es sich bei den Th0-Zellen um Vorläuferzellen, da
sie sich sowohl in die Th1- als auch in die Th2-Richtung weiter differenzieren können (Seder
and Paul, 1994). Insofern ist das Th1/Th2-Modell auch auf menschliche Th-Zellen anwendbar
und damit ebenfalls auf das humane In-vitro-Modell für die primäre Immunantwort.
1.5.1 Das Th1/Th2-Modell
Th1-Zellen, die auch inflammatorische CD4-T-Zellen genannt werden, sind für zytotoxische
und vielfältige zellvermittelte, in der Regel phagozytenabhängige (Romagnani, 1995),
Immunreaktionen verantwortlich (Cher and Mosmann, 1987). Ein vorherrschendes Th1Zytokinmilieu findet man vor allem bei bakteriellen Infektionen, in vitro ist es
dementsprechend reproduzierbar durch Stimulation mit Bakterienprodukten (Kapsenberg et
al., 1991; Parronchi et al., 1991). Th1-dominierte zellvermittelte Immunantworten sind sehr
effektiv im Eradizieren infektiöser inkl. intrazellulärer Agenzien.
13
Th1-Zellen sezernieren vorzugsweise IFN-γ und IL-2. Das Th1-Leitzytokin IFN-γ ist das
wichtigste makrophagen- bzw. monozytenaktivierende Zytokin. Durch die Aktivierung wird
die Phagozytoseaktivität der Makrophagen verstärkt, ebenso ihre bakteriziden Funktionen zur
Elimination der sich in Vesikeln befindlichen Erreger. Als Inhibitor des IL-4-abhängigen
Isotypwechsels zu Immunglobulin Typ E (IgE) fördert IFN-γ weiterhin die Entwicklung IgGproduzierender B-Zellen und hemmt die Synthese von IgE-Antikörpern (Lack et al., 1994).
Dadurch unterdrückt es allergische Reaktionen und wirkt chronischen Allergien in bestimmten
Phasen entgegen. IFN-γ wirkt außerdem antiviral. Und während IL-2 über die Induktion der TZell-Proliferation direkt die Zahl der Th1-Effektorzellen erhöht, unterdrückt IFN-γ die
Bildung von Th2-Zellen.
Wenn aus naiven CD4-T-Zellen Th2-Zellen hervorgehen, wird die Immunantwort bevorzugt
antikörpervermittelt und Phagozyten-unabhängig (Romagnani, 1995) ausfallen. Dadurch sind
Th2-Zellen gegenüber der Mehrzahl infektiöser Agenzien unwirksam. Sie vermitteln aber
eine, insbesondere gegenüber Wurminfektionen hochprotektive, antiparasitäre Antwort. In den
Industrienationen findet man ein vorherrschendes Th2-Zytokinmilieu jedoch vor allem bei
allergischen Entzündungsreaktionen und Erkrankungen (Kapsenberg et al., 1991; Parronchi et
al., 1991).
Charakteristisch für eine Th2-Zell-Antwort sind die Zytokine IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, und IL13. IL-4 und IL-13 steigern die IgE-Produktion, indem sie in B-Zellen einen Isotypwechsel zu
IgE bewirken. IL-10 und IL-3 regen die Mastzellvermehrung und -differenzierung an. Das
eosinophilotaktische Zytokin IL-5 (Walker et al., 1994) induziert die Bildung von
Eosinophilen und Basophilen im Knochenmark und aktiviert die Eosinophilen zu Wachstum
und Differenzierung. IL-4, IL-10 und IL-13 hemmen verschiedene Makrophagenfunktionen
(Mosmann and Coffman, 1989). IL-10 soll außerdem die Bildung von Th1-Zellen und damit
die γ-Interferonproduktion unterdrücken. IL-4 als wichtigstes Effektormolekül und Leitzytokin
der Th2-Zellen soll hingegen nicht nur die Ausreifung von IgE-produzierenden B-Zellen,
sondern auch das Wachstum und Überleben von Th2-Zellen selbst fördern.
14
1.5.2 Durchflusszytometrische Messung der Leitzytokine IFN-γ und IL-4
Generell können sich CD4-T-Zellen mit identischem TCR sowohl in den Th1- als auch in den
Th2-Phänotyp weiterentwickeln (Reiner et al., 1993). Die Entscheidung darüber fällt erst im
Rahmen der primären Immunantwort, welche ja im beschriebenen In-vitro-Modell simuliert
wurde.
Zentrale Frage der vorliegenden Arbeit war, welcher Th-Zell-Subtyp aus den naiven T-Zellen
im Zellkultursystem bevorzugt hervorging.
Die Untersuchung der T-Zell-Differenzierung erfolgte durchflusszytometrisch anhand der
beiden Leitzytokine für eine Th1- (IFN-γ) bzw. Th2-Immunantwort (IL-4). Anwendung fand
die im Labor der Kinderklinik von Jung optimierte Technik der intrazellulären Zytokinfärbung
(Jung et al., 1993).
Um Zytokine intrazellulär anfärben und durchflusszytometrisch erfassen zu können, muss
zuvor die normalerweise sehr geringe intrazellulär vorliegende Zytokinmenge vergrößert
werden. Man setzt aus diesem Grund den zu untersuchenden Zellen einen Hemmstoff des
Proteintransportes zu. Dieser verhindert den Zytokinexport aus den Zellen und führt zu einer
Akkumulation der Zytokine im Golgi-Apparat (Tartakoff, 1983). Durch die anschließende
Anfärbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff kann dann ein durchflusszytometrisch messbares
Signal auf Einzelzellniveau erzeugt werden.
Anwendung als Proteintransporthemmstoff findet in der einschlägigen Literatur entweder
Brefeldin A oder Monensin. Da es Hinweise auf qualitative Unterschiede zwischen diesen
beiden Substanzen gibt (Mareckova et al., 2002), wurde ihr Einsatz im In-vitro-Modell
miteinander verglichen.
Auch die Auswahl eines geeigneten Messzeitpunktes ist für die Maximierung der
intrazellulären Zytokinmenge von Bedeutung (Prussin and Metcalfe, 1995). Daher wurde die
Zytokinproduktion im Zellkultursystem im zeitlichen Verlauf verfolgt.
Zusätzlich kann die Zytokinproduktion der Zellen durch entsprechende Stimulanzien
gesteigert werden. Weite Verbreitung hat diesbezüglich die Chemikalienkombination Phorbol12-Myristat-13-Acetat (PMA) plus Ionomycin. Diese artifiziellen Stimuli greifen in die
15
Signalkaskade der Zytokininduktion ein. Während PMA direkt die Proteinkinase C (PKC)
aktiviert, erhöht Ionomycin die intrazelluläre Calciumkonzentration und verstärkt damit die
Wirkung der PKC als calciumabhängigem Enzym (Nishizuka, 1984).
Der Einfluss von PMA/Ionomycin auf die Zytokinproduktion im In-vitro-Modellsystem wurde
ebenfalls untersucht.
1.6 Die Regulation der T-Helferzell-Differenzierung
1.6.1 Bedeutung
Durch die produzierten Zytokine unterstützen Th-Zellen das Wachstum des eigenen Subtyps
(Th1 bzw. Th2) und wirken gleichzeitig der Bildung des anderen Subtyps entgegen. Obwohl
auch negative Rückkopplungsschleifen für IL-4 und IFN-γ beschrieben sind (Rissoan et al.,
1999), kommt es so im Laufe einer Immunantwort meist zur Dominanz einer der beiden ThZell-Subtypen. Je nachdem, welcher Th-Zell-Subtyp am Ende vorherrscht, wird eine
Immunantwort bevorzugt Zell-vermittelt (Th1) oder Antikörper-vermittelt (Th2) ausfallen und
somit zur Eradikation bestimmter Pathogene besser oder schlechter geeignet sein.
Neben dieser akuten Bedeutung kann die primäre Th-Zell-Differenzierung aber auch
langfristige Auswirkungen haben. Die beim Priming naiver T-Zellen entstehenden TGedächtniszellen können - außer bei sehr stark veränderten Umgebungsbedingungen - bei
erneuter Antigenexposition nur mit dem gleichen Effektorprogramm reagieren wie beim
Erstkontakt mit dem Antigen (Bradley et al., 1996; Maggi et al., 1992; Parronchi et al., 1992).
Ein durch die ersten Immunreaktionen im Leben eines Menschen entstehendes Th1/Th2Ungleichgewicht kann sich durch die selbstverstärkenden Effekte des jeweiligen
Zytokinmilieus etablieren, so dass es später möglicherweise nicht mehr umkehrbar ist. Ein
dauerhaft polarisiertes Zytokinmilieu kann dann wiederum Grundstein für bestimmte
Erkrankungen sein. Ein vorherrschendes Th2-Zytokinmilieu begünstigt beispielsweise die
Entstehung von Allergien.
Der selektiven Th-Zell-Differenzierung kommt also - generell und insbesondere in den ersten
Lebensmonaten - eine große Bedeutung zu. Als zentrale Schaltstelle im Immunsystem
16
unterliegt sie daher einer strikten Kontrolle. Da sie sich während der primären Immunantwort
manifestiert, also während der Interaktion mit DC, kommt diesen eine entscheidende Rolle in
der Regulation der Th-Zell-Differenzierung zu (Schon-Hegrad et al., 1991). Die Untersuchung
dieses regulatorischen Einflusses der DC anhand des In-vitro-Modells war Bestandteil der
vorliegenden Arbeit.
1.6.2 Mechanismen
In der Literatur werden zahlreiche Mechanismen beschrieben, die die Richtung der T-ZellDifferenzierung steuern sollen. Viele davon können durch DC geliefert werden. Fasst man die
Einzelmechanismen zu Gruppen zusammen, so scheinen folgende Einflussfaktoren wesentlich
zu sein:
1) Das Zytokinmilieu zum Zeitpunkt des Primings,
2) Art und Intensität des TCR-vermittelten Signals,
3) kostimulatorische Moleküle und
4) die genetische Prädisposition.
Diese Faktoren wurden in den durchgeführten Experimenten nicht im einzelnen überprüft. Es
wurde aber das Mengenverhältnis dendritischer Zellen zu naiven T-Zellen in den Kokulturen
variiert und dessen Einfluss auf die Th-Differenzierung untersucht. Und es ist davon
auszugehen, dass die Auswirkungen einer DC-Mengen-Veränderung im In-vitro-Modell über
die oben genannten Faktoren 1-3 vermittelt werden.
1.6.2.1 Das Zytokinmilieu zum Zeitpunkt des Primings
Das bei der T-Zell-Aktivierung bzw. während der ersten proliferativen Phase vorherrschende
Zytokinmilieu soll einen entscheidenden Effekt auf die Th-Differenzierung haben und wird
häufig als die Haupteinflussvariable angesehen (reviewed by Seder and Paul, 1994). Wegen
ihrer ausgeprägten Fähigkeit zur Zytokinproduktion und ihres unmittelbaren Kontakts zu den
differenzierenden T-Zellen sind DC wahrscheinlich auch in vivo wesentlich an der Entstehung
der ausschlaggebenden Zytokinumgebung beteiligt. In vitro, d.h. in Zellkultursystemen wie
dem beschriebenen, scheint das Verhältnis des von DC sezernierten IL-12 zum von den T-
17
Zellen produzierten IL-4 entscheidend für die Th-Differenzierung zu sein (Ohshima and
Delespesse, 1997; Macatonia et al., 1995; O’Garra et al., 1995).
IL-12 gilt als Schlüsselzytokin für die Generierung von Th1-Zellen (Cella et al., 1996;
Macatonia et al., 1995; Seder et al., 1993). Es übt seine Rolle als wichtigster natürlicher
Initiator von Th1-Antworten (Hsieh et al., 1993; Manetti et al., 1993; Manetti et al., 1994a)
entweder direkt oder indirekt via Induktion von IFN-γ aus (Chehimi and Trinchieri, 1994).
IFN-γ fördert wiederum die Th1-Differenzierung durch Hemmung der Entwicklung von Th2Zellen (Maggi et al., 1992). Im In-vitro-Modell kann IFN-γ außer von bereits differenzierten
T-Zellen auch von CD45RA+ NK-Zellen (Scott, 1993) stammen.
IL-4 gilt als essentieller Faktor für eine Th2-Differenzierung (Swain et al., 1990; LeGros et al.,
1990; Maggi et al., 1992). Eine erfolgreiche In-vitro-Generierung von Th2-Zellen schien
bislang vom Zufügen exogenen IL-4’s in hoher Konzentration und dem gleichzeitigen
Entfernen endogen produzierten IFN-γ’s abhängig zu sein (Seder and Paul, 1994). Heute weiß
man, dass die autokrine Produktion der T-Zellen selbst zur Th2-Differenzierung ausreicht und
kein exogenes IL-4 erforderlich ist. Auch in vivo scheint die autokrine Produktion die
Hauptquelle des IL-4’s, welches zur Th2-Antwort führt, zu sein (Maggi, 1998). Unklar ist
allerdings, welche Rolle dabei - in vivo und in vitro - die NK1.1-Zellen spielen. Diese kleine
Subpopulation von CD4+ T-Zellen soll nach Interaktion mit geeigneten CD1-exprimierenden
Zellen (wie z.B. DC) signifikante Spiegel an IL-4 freisetzen können (Scott et al., 1990;
Bendelac, 1995).
Neben IL-4 fördert auch das ebenfalls von T-Zellen selbst produzierte IL-10 die Entwicklung
von Th2-Zellen. IL-10 ist allerdings kein direkter IL-4-Induktor (im Gegensatz zum IL-4
selbst), sondern unterdrückt stattdessen die Bildung von Th1-Zellen und damit die IFN-γProduktion. Von untergeordneter Bedeutung für die Generierung von Th2-Zellen sind im
Vergleich die Zytokine IL-1 (Manetti et al., 1994b) und IL-6 (Rincon et al., 1997), welche
beide von DC produziert werden können.
18
1.6.2.2 Art und Intensität des TCR-vermittelten Signals
In diese Gruppe von Einflussfaktoren fallen die Antigendosis, die Affinität eines Antigens für
ein MHC-II-Molekül oder für den TCR, die Peptid:MHC-II-Ligandendichte auf der DCOberfläche und die Art des Antigens.
In Versuchen mit systematisch veränderten Peptidliganden führte eine zunehmende Affinität
für ein MHC-II-Molekül oder für den TCR zum verstärkten Priming von Th1-Zellen (Kumar
et al., 1995; Murray et al., 1992), eine abnehmende Affinität zum verstärkten Priming von
Th2-Zellen (Murray et al., 1992). Es wurde daraufhin vermutet, dass schwach bindende
Peptide lediglich eine partielle Aktivierung von T-Zellen und über ein insgesamt schwächeres,
wahrscheinlich auch qualitativ verändertes (Sloan-Lancaster and Allen, 1996; Constant and
Bottomly, 1997), Aktivierungssignal eine Th2-Differenzierung bewirken.
Dazu passend führen auch hohe Dichten von Peptid:MHC-II-Liganden auf der DC-Oberfläche
bevorzugt zur Th1-, eine niedrige Ligandendichte zur Th2-Antwort (Pfeiffer et al., 1995).
Die Daten zum Einfluss unterschiedlicher Antigendosen sind nicht so einheitlich. Ergebnisse
von In-vitro-Studien korrelieren aber noch recht gut mit den Studien zur Affinität, da bei
mittleren bzw. hohen Antigendosen Th1-Antworten induziert und übereinstimmend am
jeweils untersten Ende der Skala eine vorherrschende Th2-Antwort gefunden wurde (Constant
et al., 1995; Hosken et al., 1995). Teilweise erzeugten sehr hohe Dosen von Antigen jedoch
wieder Th2-Antworten (Hosken et al., 1995). In-vivo-Studien lieferten grundsätzlich
widersprüchliche Ergebnisse. Hier spielt offenbar die Art des eingesetzten Antigens eine
wichtige Rolle. In den meisten Studien, in denen niedrige Antigendosen Th1-Antworten
erzeugt hatten, waren Parasiten als Immunogene verwendet worden (Bretscher et al., 1992;
Bancroft et al., 1994; Sarzotti et al., 1996), während niedrig dosierte lösliche Proteine zur Th2Differenzierung geführt hatten. Offensichtlich hat also das Antigen selbst auch einen Einfluss
auf den Typus der initiierten Immunantwort. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit interessierte
die Frage, in welche Richtung Alloantigene die Th-Differenzierung in vitro lenken.
Zusammenfassend lässt sich hier festhalten, dass eine starke Interaktion zwischen TCR und
Peptid:MHC-Ligand in eine Th1-Antwort zu münden scheint, während ein schwaches
Bindungssignal zur Unterdrückung der Th1- und Generierung von Th2-Antworten führt. Es
19
wird daher davon ausgegangen, dass zur selektiven Generierung von Th1-Zellen eine
Aktivierungsschwelle auf Signaltransduktionsebene überschritten werden muss (Constant and
Bottomly, 1997), anderenfalls käme es zur Induktion von Th2-Zellen.
1.6.2.3 Kostimulatorische Moleküle
Verschiedene Studien mit Mäusen (Seder et al., 1994; Corry et al., 1994; Lu et al., 1994;
Shahinian et al., 1993) und Menschen (King et al., 1995; Webb and Feldmann, 1995) legen
eine Bedeutung von CD28 in der frühen Differenzierung von Th-Untereinheiten nahe. Die
Bindung von B7.1 (CD80) an CD28 führt wohl eher zur Th1-, die Bindung von B7.2 (CD86)
eher zur Th2-Antwort (Freeman et al.,1995; Kuchroo et al.,1995). Da die Expression von B7.2
auf DC 100fach höher ist als die von B7.1 (Inaba et al., 1994), und B7.2 außerdem wesentlich
eher exprimiert wird - 6 versus 24 Stunden nach Stimulation - (Hathcock et al., 1994), scheint
das CD28-B7-System über die vorherrschende B7.2-Gegenwart während des Primings vor
allem eine Rolle bezüglich Th2-Differenzierung zu spielen.
Neben den Molekülen der B7-Familie werden noch weitere Oberflächenmoleküle in
Zusammenhang mit der Th-Zell-Differenzierung gebracht. Beispielsweise soll die Blockade
der OX40/OX40L-Interaktion in Kulturen aus naiven T-Zellen und allogenen DC die
Entwicklung von IL-4/IL-5-sezernierenden Th2-Zellen hemmen (Ohshima et al., 1998). Die
CD40/CD40L-Interaktion gilt im Gegensatz dazu via Induktion der IL-12-Produktion in DC
Th1-fördernd (Hilkens et al., 1997). Ergebnisse im Maussystem (Yoshimoto et al., 1995) und
an Hautbiopsien von Leprakranken (Sieling et al., 1995) weisen wiederum auf eine Bedeutung
der Expression verschiedener CD1-Subtypen auf DC hin (Bendelac, 1995). Die Expression
von CD1b soll dabei die Ausdifferenzierung von Th1-Zellen begünstigen.
In der Literatur werden noch weitere Beispiele genannt. Durch die selektive Expression
bestimmter kostimulatorischer bzw. akzessorischer Moleküle auf DC ist eine Steuerung der TZell-Differenzierungs-Richtung gut vorstellbar.
20
1.6.2.4 Die genetische Prädisposition
Zum Teil sind individuelle Neigungen zur Th1- oder Th2-Antwort bereits genetisch veranlagt.
In Versuchen mit Inzuchtmäusen konnte beispielsweise gezeigt werden, dass das gleiche
Protein bzw. die gleiche immunogene Determinante in Abhängigkeit vom vorliegenden MHCII-Genotyp entweder eine Th1- oder Th2-Antwort induzierte (Murray et al., 1989; Murray et
al., 1992).
Damit in einem In-vitro-Modell extreme individuelle Prädispositionen der T-Zell- und DCDonoren nicht zu schwer ins Gewicht fallen, ist es notwendig, eine ausreichende Anzahl an
Versuchen unter gleichen Bedingungen durchzuführen (mindestens drei), um dann
aussagekräftige Mittelwerte bilden zu können.
Unabhängig von den vier genannten Einflussfaktoren heißt es, dass zur Stabilisierung eines
Th2-Musters eine wiederholte Stimulation erforderlich sei, was u.a. im Maussystem gezeigt
werden konnte (Murphy et al., 1996). In vitro würde sich das Th2-Muster erst nach einer
wiederholten Stimulation über den Antigen-Rezeptor-Komplex und über CD28 ausbilden. In
vivo sei manchmal eine wiederholte Exposition mit niedrigen Antigendosen erforderlich, um
eine optimale Th2-Differenzierung zu induzieren (Guery et al., 1996; Wang et al., 1996).
Im Modellsystem wurde sinngemäß der Einfluss einer Restimulation mit frischen DC auf die
Zytokinproduktion untersucht.
1.7 Apoptose in den allogenen Kokulturen
1.7.1 Definition und Ablauf der Apoptose
Apoptose ist die häufigste Form des Zelltodes im Organismus. Sie wird auch programmierter
Zelltod genannt, da sie auf der Aktivierung eines zellinternen Selbstzerstörungsprogramms
beruht, das in allen Körperzellen angelegt ist.
Im Rahmen dieser Kaskade kataboler Reaktionen erfährt die Zelle charakteristische
Veränderungen, wie z.B. die Fragmentierung der Kern-DNA zwischen den Nukleosomen, den
sog. DNA-Schutzproteinen (Trauth et al., 1989). Die Degenerierung des Zellkerns zeigt sich
21
morphologisch durch eine Kondensation des Chromatins und eine Karyopyknose. Es kommt
zur Zellschrumpfung und zum Abschnüren membranumschlossener Bläschen, den sog.
apoptotischen Körperchen (Blebbing). Die Zellreste werden abschließend schnell und ohne
begleitende Entzündungsreaktion phagozytiert.
Die Apoptose ist vom Zelltod durch Nekrose abzugrenzen. Letzterer wird durch äußere
Umstände verursacht, wie etwa Toxine oder Anoxie (Kerr et al., 1972). Bei der Nekrose
kommt es durch Wassereinströmung zum Anschwellen der Zelle (Oncose), zur Zerstörung der
Zellmembran und zur Freisetzung des Zytoplasmas in den interzellulären Raum - die Zellen
„zerplatzen“. Dies ruft eine Entzündungsreaktion mit einhergehender Gewebeschädigung
hervor.
Im Ablauf der Apoptose kommt es bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt zum Verlust der
Membranasymmetrie, was zur Exposition von Phosphatidylserin auf der Zelloberfläche führt.
Dieser Vorgang wurde in der vorliegenden Arbeit genutzt, um das Apoptoseverhalten in den
Kokulturen durchflusszytometrisch zu analysieren.
1.7.2 Die Bedeutung der Apoptose im Immunsystem
Für die Organisation multizellulärer Organismen ist Apoptose essentiell (Wyllie et al., 1980) sowohl bei der Gewebeumformung in der Entwicklung als auch zur Erhaltung der
Gewebehomöostase. Im Immunsystem ist die Apoptose sensitiver T-Lymphozyten von
entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen Immunität
und Selbsttoleranz. Eine pathologisch verminderte Apoptoserate führt zur Lymphozytose und
zur Autoimmunität.
Sich entwickelnde unreife T-Lymphozyten, auch Thymozyten genannt, durchlaufen die
Apoptose, wenn sie aufgrund fehlender MHC-Abhängigkeit die positive Selektion im Thymus
nicht bestehen oder im Rahmen der zentralen Toleranzentwicklung negativ selektiert werden
(Fowlkes et al., 1988; Jenkinson et al., 1989; Kisielow et al., 1988; Nossal, 1994; von
Boehmer, 1994).
22
Reife Lymphozyten können in vivo genauso wie im untersuchten In-vitro-Modell aufgrund
fehlender Aktivierung oder gerade durch Aktivierung in die Apoptose eintreten. Das heißt,
dass sie einerseits „zellulären Selbstmord“ begehen, wenn sie zu lange ihrem passenden
Antigen nicht begegnen (= fehlende Aktivierung). Andererseits wurde als Gegenstück auch
der sog. aktivierungsinduzierte Zelltod beschrieben (Combadiere et al., 1998; Dhein et al.,
1995; Peter et al., 1997). Die meisten aktivierten T-Zellen und T-Effektorzellen sterben normalerweise nach dem Verschwinden des Antigens - durch Apoptose, wodurch die
Immunantwort abgeschaltet bzw. unterdrückt wird. Für den von T-Zellen exprimierten CD28Rezeptor wurde übrigens postuliert, dass seine Involvierung Apoptose während der T-ZellAktivierung verhindern kann (Boise et al., 1995).
Des Weiteren ist die Apoptose neben der Anergie der zweite Mechanismus zur
Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz. Reife T-Lymphozyten können durch Apoptose
eliminiert werden, wenn sie als potentiell autoreaktiv erkannt werden. In Bezug auf das
Zellkultursystem könnte man die alloreaktiven T-Zellen auch als ‚autoreaktiv‘ ansehen, da sie
die ‚systemeigenen‘ DC als fremd erkennen. Insofern könnten auch die aus Stammzellen
angezüchteten myeloiden DC im Rahmen der peripheren Toleranzentwicklung in diesen TZellen die Apoptose induziert haben.
Auch CD8+ T-Effektorzellen üben ihre Zytotoxizität dadurch aus, dass sie den endogenen
apoptotischen Weg in ihren Zielzellen aktivieren (Janeway and Travers, 1997). Dendritische
Zellen in MLR sollen exzellente Ziele für CTL darstellen (Bell et al., 1999). Da das Überleben
reifer CD4+ T-Zellen wiederum abhängig von der Anwesenheit MHC-II-positiver DC ist
(Brocker, 1997), könnte das Vorhandensein von CD8-T-Zellen das Apoptoseverhalten in den
Kokulturen wesentlich beeinflussen.
1.7.3 Mechanismen
Die molekularen Mechanismen wurden im Rahmen der Apoptosemessungen am In-vitroModell nicht untersucht, sollen hier aber als Hintergrundinformation erläutert werden.
Zu nennen ist hier vor allem die Proteinfamilie der Tumornekrosefaktoren (TNF) und Rezeptoren (TNF-R) (Baker and Reddy, 1996; Smith et al., 1994). Eine Subfamilie der TNFR-Superfamilie bilden nämlich die sog. Todesrezeptoren, die bei Aktivierung Apoptose
23
auslösen. In vivo werden sie durch die Bindung spezifischer Liganden - die ihrerseits aus der
TNF-Familie stammen - aktiviert. Strukturell wichtig für die Initialzündung der Apoptose ist
die ungefähr 80 AS lange intrazellulär gelegene sog. Todesdomäne (Itoh et al., 1993; Tartaglia
et al., 1993). Diese Domäne zeigt eine hohe Homologie bei allen Todesrezeptoren.
Der zuerst beschriebene Todesrezeptor war CD95 (auch als APO-1 oder Fas bezeichnet) (Itoh
et al., 1991; Oehm et al., 1992; Trauth et al., 1989; Yonehara et al., 1989). Als System mit
seinem natürlichen Liganden CD95L (APO-1L/FasL) (Suda et al., 1993) ist er maßgeblich an
der Apoptose im Immunsystem beteiligt (Krammer, 2000). CD95 wird auf den meisten Zellen
unseres Körpers, einschließlich Lymphozyten und DC, tausendfach exprimiert (Leithäuser et
al., 1993). Das Transmembranprotein CD95L wird u.a. auch von Lymphozyten - aktivierten
T-, B- und NK-Zellen - und bestimmten DC exprimiert. Neben der Transmembranform sind
auch lösliche Formen (Splice-Varianten) beider Moleküle beschrieben. T-Lymphozyten und
DC können sich durch CD95/CD95L-Interaktion also sowohl selbst als auch gegenseitig töten.
Durch CD40-Bindung bedingt völlig ausgereifte DC sind allerdings absolut resistent
gegenüber CD95-vermittelter Apoptose (Bjorck et al., 1997).
Zu den weiteren Todesrezeptoren gehören auch Formen des eigentlichen TNF-Rezeptors
(TNF-RI, TNF-RII). Durch Bindung an diese Rezeptoren induziert das Zytokin TNF, welches
DC
in
der
Interaktion
mit
T-Zellen
nach
CD40/CD40L-Interaktion
sezernieren,
möglicherweise die Apoptose in unbeteiligten nichtspezifischen „bystander“ T- und B-Zellen.
An der Induktion der Apoptose durch CD8+ CTL sind neben der CD95/CD95L-Interaktion
(Rouvier et al., 1993) auch deren Haupteffektormoleküle beteiligt, die Zytotoxine. Diese
wirken Zielzell-unspezifisch. Durch die Perforine (z.B. Perforin-1) entstehen Poren in der
Zielzellmembran, durch die die Granzyme (z.B. Granzym B) in die Zellen eindringen und die
Apoptose einleiten können.
Sowohl für Todesrezeptoren wie CD95 als auch für das Effektormolekül Granzym B konnte
nachgewiesen werden, dass die Apoptosesignalkette über die Aktivierung bestimmter
eiweißspaltender Enzyme in den Zielzellen funktioniert, der sog. Caspasen (kurz für: CysteinAspartasen) (Froelich et al., 1998). Dabei aktiviert eine Initiatorcaspase, die Caspase-8
(ursprünglicher Name: FLICE), durch proteolytische Spaltung weitere Caspasen, die
24
Effektorcaspasen, so dass eine Caspasenkaskade in Gang kommt. Die Effektorcaspasen
spalten schließlich zelluläre Substrate (Todessubstrate), wodurch dann das morphologische
und biochemische Bild der Apoptose bestimmt wird (Krammer, 2000). - Neben diesem
Apoptosesignalweg sollen noch weitere existieren.
Die Auslösung von Apoptose wird streng reguliert, wobei das Prinzip der Mehrfachsicherung
auf verschiedenen Ebenen besteht. Direkt am Beginn der Apoptosesignalkaskade wirken z.B.
die sog. FLIP-Moleküle, welche die Rekrutierung von Caspase-8 verhindern sollen (FLIP =
FLICE Inhibitory Protein) (Krammer, 2000). Auf Ebene der Mitochondrien regulieren dann
Mitglieder der Bcl-2-Gen-Familie die Apoptose. Die Bcl-2-ähnlichen Proteine umfassen
antiapoptotische Moleküle (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl-1) und Moleküle, die die
Apoptose auslösen oder verstärken können (Bax, Bak, Bcl-xs, Bad, Bid, Bik, Bim, Hrk, Bok)
(Cory, 1995; Kroemer, 1997).
25
1.8 Fragestellung
Im Zentrum der vorliegenden Arbeit steht ein humanes In-vitro-Modell für die primäre
Immunantwort. Dieses im Labor der Kinderklinik bereits etablierte Modellsystem bestand in
Anlehnung an gemischte Lymphozytenkulturen aus Kokulturen naiver T-Zellen mit allogenen
dendritischen Zellen. Die naiven T-Zellen stammten entweder aus Nabelschnurblut oder aus
peripherem Blut Erwachsener, so dass entsprechend die primäre Immunantwort des
Neugeborenen oder des Erwachsenen simuliert werden konnte. Für die eingesetzten, aus
Nabelschnurblut-Stammzellen angezüchteten, dendritischen Zellen konnte bereits in früheren
Arbeiten gezeigt werden, dass sie in der Zellkultur die Ausdifferenzierung naiver CD4-TZellen in zytokinproduzierende T-Helfer-Zellen induzieren können. Die selektive THelferzell-Differenzierung in Th1- und Th2-Zellen wurde mittels durchflusszytometrischer
Messung der beiden Leitzytokine IFN-γ und IL-4 untersucht.
Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war eine systematische Analyse des Modellsystems unter
neutralen Bedingungen. Dazu wurden folgende Parameter überprüft:
-
Der Einfluss des Mengenverhältnisses dendritischer Zellen zu naiven T-Zellen (DC:TVerhältnis) auf die Th-Differenzierung und auf die Vitalität der kokultivierten Zellen
-
Die Kinetik der Zytokininduktion in naiven T-Zellen durch dendritische Zellen
-
Die Kinetik des Apoptoseverhaltens in den Kokulturen
-
Der Einfluss verschiedener Proteintransporthemmstoffe auf die Zytokinanalyse
-
Der Einfluss verschiedener Stimuli auf die Zytokinproduktion
-
Unterschiede naiver T-Zellen Neugeborener und Erwachsener in Bezug auf die
Zytokinproduktion
Aus der näheren Charakterisierung sollte dann abschließend eine Optimierung des
Modellsystems abgeleitet werden.
26
2
Methodik
2.1 Material
2.1.1 Geräte und Hilfsmittel
2.1.1.1 Geräte
− Auflichtmikroskop (Umkehrmikroskop) CK2: OLYMPUS, Japan
− Brutschrank (CO2-Inkubator): Heraeus, Düsseldorf
− Durchflusszytometer FACScan®: Becton Dickinson, Heidelberg
− Durchlichtmikroskop: Zeiss, Jena
− Kühlzentrifuge Omnifuge 2.0 RS: Heraeus, Düsseldorf
2.1.1.2 Hilfsmittel
− Cryoröhrchen (1,8 ml Arbeitsvolumen): Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Kat.-Nr.:
363401
− Fuchs-Rosenthal-Zählkammer
− Gewebekulturplatte (MULTIWELL™), 24 Vertiefungen, Flachboden, mit Deckel:
Falcon/BD 3047, Heidelberg
− 15 ml Konische Röhrchen (Blue Max™ Jr.): Falcon/BD 2096, Heidelberg
− 50 ml Konische Röhrchen (Blue Max™): Falcon/BD 2070, Heidelberg
− Neubauer-Zählkammer
− Polystyren Reagenzglas (mit Rundboden): Falcon/BD 2052, Heidelberg
− 10 ml Serologische Pipette, steril: Falcon/BD 7530, Heidelberg
− Zellkulturplatte (MICROTEST™), 96 Vertiefungen, Flachboden, mit Deckel:
Falcon/BD 3072, Heidelberg
27
2.1.1.3 Software
− PC-Software „GraphPad Prism“ (Version 2.01): GraphPad Software Incorporated, San
Diego, USA, Best.-Nr.: GPC-28078-627
− Lysis II-Softwarepaket: Becton Dickinson, Heidelberg (nicht mehr verfügbar)
2.1.1.4 Magnetsortierungssysteme
− MACS Multistand: Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Art.-Nr.: 423-03
− MACS-Separierungssäule Typ LS+: Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Art.Nr.: 424-01
− MACS-Separierungssäule Typ MS+: Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Art.Nr.: 422-01
− MidiMACS (Magnet): Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Art.-Nr.: 423-02
− MiniMACS (Magnet): Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Art.-Nr.: 421-02
2.1.2 Chemikalien, Pufferlösungen, Zellmedien
2.1.2.1 Chemikalien
− Brefeldin A: Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Best.Nr.: B 7651
− Dimethylsulfoxid (DMSO): Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Best.Nr.: D-5879
− Ethanol absolut: Merck, Darmstadt, K 23899383716
− Heparin-Natrium („Vetren 200“): Promonta, Hamburg, Reg.-Nr.: V 767
− Ionomycin: Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Best.Nr.: I 0643
− Monensin: Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Best.Nr.: M 5273
− PMA: Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Best.Nr.: P 8139
28
2.1.2.2 Puffer, Lösungen und Medien
− HANKS’-Salzlösung (steril): Biochrom KG, Berlin, Cat.-No. L 2045
− Hanks’ balanced salts (HBSS): Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Best.-Nr.: H-4891
− Ficoll-Trennlösung (Dichte 1,077 g/ml): Biochrom KG, Berlin, Best.-Nr.: L 6115
− RPMI 1640-Flüssigmedium: Biochrom KG, Berlin, Best.-Nr.: F 1215
− Trypan Blau: Fluka Chemie, Buchs, CH, Best.-Nr.: 93595
− Türksche Lösung: Fluka Chemie, Buchs, CH, Best.-Nr.: 93770
− Paraformaldehyd (PFA), Pulver: Riedel-de Haën AG, D-Seelze, Best.-Nr.: 16005; 4 %
PFA in HBSS unter Erwärmen lösen (nicht kochen), eiskalt einsetzen.
− Einfriermedium: RPMI 1640-Flüssigmedium mit
− 45 % FCS (Chargen-Nr.: 417L): Biochrom KG, Berlin, Best.-Nr.: S 0115
− 10 % DMSO: Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Best.Nr.: D-5879
− 1 % Penicillin 10.000 I.E. / Streptomycin 10.000 µg/ml: Biochrom KG, Berlin, Best.Nr.: A 2213
Eiskalt einsetzen.
− HANKS’-EDTA-BSA: HANKS’-Salzlösung mit
− 0,5 % BSA: Fluka Chemie, Buchs, CH, Best.-Nr.: 05480
− 2 mM EDTA: „Titriplex® III“, Merck KG, Darmstadt, Best.-Nr.: 108421
− HBSS+Azid: HBSS mit
− 0,1 % Natriumazid: Merck KG, Darmstadt, Best.-Nr.: 6688
29
− Kulturmedium: RPMI 1640-Flüssigmedium mit
− 10 % FCS (Chargen-Nr.: 417L): Biochrom KG, Berlin, Best.-Nr.: S 0115
− 1 % Natriumpyruvat (100 mM): Biochrom KG, Berlin, Best.-Nr.: L 0473
− 1 % L-Glutamin (200 mM): Biochrom KG, Berlin, Best.-Nr.: K 0282
− 1 % nicht-essentielle Aminosäuren: Biochrom KG, Berlin, Kat.-Nr.: K 0293
− 1 % Penicillin 10.000 I.E. / Streptomycin 10.000 µg/ml: Biochrom KG, Berlin, Best.Nr.: A 2213
− Saponin-Puffer: HBSS mit
− 0,01 M HEPES-Pufferlösung: Biochrom KG, Berlin, Best.-Nr.: L 1613
− 0,1 % Saponin: Riedel-de Haën AG, D-Seelze, Best.-Nr.: 16109
− Überführungsmedium: HANKS’-Salzlösung mit
− 0,01 M HEPES-Pufferlösung: Biochrom KG, Berlin, Best.-Nr.: L 1613
− 20 I.E./ml Heparin-Natrium („Vetren 200“): Promonta, Hamburg, Reg.-Nr.: V 767
− 1 % Penicillin 10.000 I.E. / Streptomycin 10.000 µg/ml: Biochrom KG, Berlin, Best.Nr.: A 2213
− 1 % Amphotericin B (250 µg/ml): Biochrom KG, Berlin, Best.-Nr.: A 2612
2.1.3 Stimulanzien
− GM-CSF: Leucomax, Novartis Pharma GmbH, Nürnberg, Best.-Nr.: 005282
− SCF: Genzyme Diagnostics, Rüsselsheim, (jetzt R und D Systems, Wiesbaden), Best.-Nr.:
G-1833-01
− TNF-α: Genzyme Diagnostics, Rüsselsheim, (jetzt R und D Systems, Wiesbaden), Best.Nr.: TNF-H
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2.1.4 Antikörper und Kits
2.1.4.1 MicroBead-konjugiert für MACS
− CD45RA-MicroBeads: Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Art.-Nr.: 459-01
− CD34 Progenitor Cell Isolation Kit: Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Art.Nr.: 567-01
2.1.4.2 Fluorochrom-konjugiert für Durchflusszytometrie
− Annexin V FITC Kit: Immunotech, F-13009 Marseille, Best.-Nr.: 2376
− Anti-CD1a-FITC: Ortho-(OKT 6)-mune-Reagents, Ortho Diagnostic Systems, Raritan,
USA, Best.-Nr.: 700610
− Anti-CD3-Tricolor: Medac, Hamburg, Best.-Nr.: MHCD0306
− Anti-CD14-PE: Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr.: 80220
− Anti-CD34-PE (QBEND10): Dianova, Hamburg, Best.-Nr.: CBL 496P
− Anti-IFN-γ-FITC (Maus IgG1): PharMingen, Hamburg, Best.-Nr.: 18904A
− Anti-IL-4-PE (Maus IgG1): PharMingen, Hamburg, Best.-Nr.: 18655A
− Isotypkontrolle FITC (Maus IgG1): Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr.: 349041
− Isotypkontrolle FITC (Maus IgG1): PharMingen, Hamburg, Best.-Nr.: 03214E
− Isotypkontrolle PE (Maus IgG1): Becton Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr.: 349043
− Isotypkontrolle PE (Maus IgG1): PharMingen, Hamburg, Best.-Nr.: 03215A
31
2.2 Methoden
2.2.1 Gewinnung von Blutproben als Ausgangsmaterial
2.2.1.1
Nabelschnurblut
Nabelschnurblut wurde zur Isolierung folgender Zellarten benötigt: CD45RA+ und CD34+
Zellen (HPC).
Die verwendeten Blutproben stammten von Neugeborenen, die in der Zeit vom 17.12.1997 bis
zum 15.10.1998 in den Augusta-Krankenanstalten und im St. Elisabeth-Hospital in Βochum
geboren
wurden.
Ausschlusskriterien
waren
Frühgeburtlichkeit,
Missbildungen,
Schwangerschafts- und Geburtskomplikationen sowie eine bekannte Hepatitis- oder HIVInfektion der Mutter. Hierdurch sollten Unreife, Defekte und Voraktivierung bzw.
Transformierung des Immunsystems weitestgehend ausgeschlossen werden.
Das Nabelschnurblut wurde unmittelbar nach Abnabelung der Kinder steril aus der Vena
umbilicalis der Plazenta entnommen und zu 10 ml eines gerinnungs- und keimhemmenden
Überführungsmediums in sterile 50 ml Röhrchen mit Schraubverschluss gegeben.
Zur Isolierung von CD34+ Zellen war das Blut vom Entnahmezeitpunkt bis zur Verarbeitung
nicht älter als 1h, zur CD45RA-Zell-Isolierung nicht älter als 6h.
2.2.1.2
Peripheres Blut Erwachsener
Aus peripherem adulten Blut wurden CD45RA+ Zellen isoliert.
Das verwendete Blut wurde in gängiger Venenpunktionstechnik von freiwilligen, gesunden,
erwachsenen Spendern entnommen, in Heparin aufgenommen und zur weiteren Verarbeitung
in sterile 50 ml Röhrchen mit Schraubverschluss überführt.
32
2.2.2 Isolierung der mononukleären Zellphase
Aus den gewonnenen Blutproben wurden zunächst die mononukleären Zellen (CBMC bzw.
PBMC) isoliert, welche vor allem aus Lymphozyten und Monozyten bestehen, aber auch HPC
enthalten.
Dazu wurden die Blutproben ungefähr im Verhältnis 1:2 mit HANKS'-Salzlösung verdünnt,
mit 15 ml Ficoll-Trennlösung (Dichte: 1.077 g/ml) unterschichtet und anschließend mit 660xg
für 20 min ohne Bremse zentrifugiert (sog. Dichte-Gradienten-Zentrifugation). Die dadurch
entstandene, mit mononukleären Zellen angereicherte, Interphase wurde vorsichtig abpipettiert
und zweimal mit gekühlter HANKS'-Salzlösung bei 300xg (10 min) bzw. 200xg (15 min),
anschließend noch einmal mit HANKS'-EDTA-BSA bei 300xg für 10 min, gewaschen.
2.2.3 Magnetassoziierte Zellsortierung (MACS)
Die Technik der magnetassoziierten Zellsortierung (Fa. Miltenyi Biotec) ermöglichte es, durch
magnetische Markierung von Zelloberflächen-Antigenen äußerst seltene Zellarten (s. 2.2.3.2
und 2.2.3.3) aus heterogenen Zellsuspensionen zu isolieren.
Die zur Markierung verwendeten sog. MACS MicroBeads sind paramagnetische Partikel, die
nur innerhalb eines starken Magnetfeldes selbst magnetisch sind, außerhalb diese Eigenschaft
jedoch sofort wieder verlieren. Sie ließen aufgrund ihrer geringen Größe (Durchmesser ca. 50
nm), ihrer biochemischen Zusammensetzung aus Eisenoxid und Polysacchariden und damit
biologischer Abbaubarkeit, sowohl die Lebensfähigkeit als auch die Funktion der sortierten
Zellen weitgehend unbeeinflusst.
2.2.3.1 Prinzip der MACS
Zur Isolierung der benötigten Zellarten fand das Prinzip der positiven Selektion Verwendung.
Dabei
wurden
in
der
Ausgangssuspension
die
Zielzellen
an
spezifischen
Oberflächenmolekülen mit den paramagnetischen MACS MicroBeads markiert. Anschließend
wurde die Zellsuspension über eine Separierungseinheit gegeben, bestehend aus einem an
33
einem Metallständer (MACS Multistand) haftenden, starken Dauermagneten mit einer
Einlassung für eine spezielle ferromagnetische Separierungssäule. Ein Einbringen der Säule in
das Magnetfeld des Dauermagneten erzeugte hohe magnetische Gradienten. Dadurch blieben
die paramagnetisch markierten Zielzellen in der Säule haften und wurden von den
unmarkierten Zellen getrennt, welche die Säule durchliefen. Abschließend wurde die
Separierungssäule aus dem Magnetfeld genommen, was eine rasche Demagnetisierung der
Säulenmatrix zur Folge hatte. Die gebundenen Zellen konnten jetzt nach Pufferzugabe leicht
unter Druck aus der Säule gespült und als positive Fraktion aufgefangen werden.
2.2.3.2 Isolierung CD45RA+ Zellen mittels MACS
CD45RA+ Zellen wurden durch positive MACS, basierend auf der Exprimierung des
CD45RA-Antigens, sowohl aus peripherem Blut Erwachsener als auch aus Nabelschnurblut
gewonnen.
Die magnetische Markierung erfolgte direkt, d.h. die MACS MicroBeads wurden direkt
gekoppelt an monoklonale Antikörper eingesetzt, welche hochspezifisch gegen den zu
erkennenden leukozytären Oberflächenmarker CD45RA gerichtet waren. Durch diese
Vereinigung zu sog. MACS antibody MicroBeads, hier: CD45RA-MicroBeads, war ein
Inkubationsschritt ausreichend.
Abhängig von der Zellzahl der CBMC bzw. PBMC wurde das gemäß 2.2.2 gewonnene
Zellpellet in einem bestimmten Volumen gekühlten und entgasten HANKS'-EDTA-BSA
resuspendiert. (Der Puffer wurde während der weiteren Prozedur beibehalten.) Laut
Herstellerangabe wurden bis zu 1 x 107 Zellen in 80 µl Puffer aufgenommen. Dazu wurden 20
µl CD45RA-MicroBeads-Suspension gegeben, so dass ein Gesamtvolumen von 100 µl
entstand. Bei Zellzahlen > 1 x 107 Zellen wurde die Menge des Puffers und der MicroBeads
proportional erhöht, wobei die Verdünnung der MicroBeads von 1:5 beibehalten wurde. Es
wurde sorgfältig gemischt und dann 15 min bei Kühlschranktemperatur inkubiert. Nach
Zugabe von 1-2 ml Puffer, bzw. des 10-20fachen Inkubationsvolumens an Puffer, wurde 10
min bei 300xg zentrifugiert.
Währenddessen wurde die Separierungseinheit vorbereitet: An einem MACS Multistand
wurde ein MidiMACS-Magnet angebracht. In den Permanentmagneten wurde eine
34
Separierungssäule vom Typ LS+ (für bis zu 108 positive Zellen) eingespannt und mit 3 ml
Puffer gespült.
Nach dem Waschgang wurde der Überstand vollständig entfernt, die Zellen in 1 ml Puffer
resuspendiert und auf die Säule gegeben. Ein weiterer Milliliter Puffer wurde zum
Zellröhrchen-Nachspülen verwendet und dann ebenfalls auf die Säule gegeben. Anschließend
wurde viermal mit 3 ml Puffer nachgespült, wobei immer darauf geachtet wurde, dass die
vorherige Pufferdosis vollständig eingesickert war. Abschließend wurde die Säule aus dem
Magnetfeld entfernt, auf ein 15 ml Röhrchen gesetzt und die Zellen mit 5 ml Puffer und mit
Hilfe eines zur Säule passenden Kolbens als positive Fraktion aus der Säule gespült.
Die Zellen wurden 10 min bei 300xg gewaschen.
2.2.3.3 Isolierung CD34+ Zellen (Hämatopoetischer Stammzellen)
HPC wurden aus Nabelschnurblut, worin sie einen Zellanteil von 0,1-0,5 % ausmachen, durch
positive MACS, basierend auf der Exprimierung des CD34-Oberflächenantigens, gewonnen.
Aus 10 ml Nabelschnurblut können so etwa 1 x 105 CD34+ HPC gewonnen werden (Caux et
al., 1992).
Die magnetische Markierung erfolgte indirekt, d.h. in zwei Inkubationsschritten. Zunächst
wurden hochspezifisch gegen die Zielstruktur (CD34) gerichtete, nicht-magnetische
monoklonale Antikörper verwendet, die mit einem Hapten konjugiert waren. Gegen dieses
Hapten wurden im zweiten Schritt mit magnetischen MACS MicroBeads markierte
Sekundärantikörper - „MACS Anti-Immunoglobulin MicroBeads" - eingesetzt. Verwendung
fand ein sog. „CD34 Progenitor Cell Isolation Kit" inkl. Primär- und Sekundärantikörper
sowie eines weiteren Immunglobulins als „FcR blocking reagent", das eine unspezifische
Bindung des primären CD34-Antikörpers an CBMC verhindern sollte. Das Kit wurde gemäß
Herstellerangabe angewendet.
Zu dem gemäß 2.2.2 gewonnenen Zellpellet CBMC (ca. 50 µl) wurden 250 µl gekühltes
HANKS'-EDTA-BSA pipettiert, so dass in einem Gesamtvolumen von 300 µl resuspendiert
wurde. Nach Zugabe und Mischen von zuerst 100 µl FcR blocking-Reagenz und dann 100 µl
Primärantikörper-Suspension folgte eine 15-minütige Inkubation bei Kühlschranktemperatur.
(Die Volumenangaben galten für bis zu 1 x 108 CBMC. Bei größeren Zellmengen wurde die
35
Menge des Puffers und der Antikörpersuspensionen proportional erhöht.) Danach wurden die
Zellen in 5 ml gekühltem HANKS'-EDTA-BSA aufgenommen und bei 300xg 10 min
gewaschen. Nach vollständiger Entfernung des Überstandes wurde das Zellpellet in 350 µl
gekühltem HANKS'-EDTA-BSA (Gesamtvolumen samt Pellet: 400 µl ) und 100 µl
Sekundärantikörper-Suspension aufgenommen. Nach einer weiteren Inkubation von 15 min im
Kühlschrank wurden die Zellen mit 5 ml entgastem gekühltem HANKS'-EDTA-BSA erneut
10 min bei 300xg zentrifugiert. (Der Puffer wurde bei der weiteren Prozedur beibehalten.)
Während des Waschganges wurde die Separierungseinheit vorbereitet, indem in das
MiniMACS-System eine MS+-Separierungssäule (Zellkapazität bis 107 zurückgehaltene
Zellen) eingespannt und mit 500 µl Puffer durchgespült wurde.
Der Überstand wurde vollständig abgegossen, die Zellen in 500 µl Puffer aufgenommen und
auf die Säule gegeben. Nach vollständigem Einsickern wurde die Säule dreimal mit jeweils
500 µl Puffer nachgespült, um die nicht markierten Zellen zu eliminieren. Die Säule wurde
aus dem Magnetfeld genommen und die an ihr haftengebliebenen magnetisch-markierten
Zellen mit 1000 µl Puffer in ein 15 ml Sammelgefäß gespült.
Um die Reinheit der gewonnenen Zellfraktion zu erhöhen, wurde die Zellsuspension auf eine
zweite, gespülte MiniMACS-Säule gegeben. Die neue Säule wurde wie die erste vorbereitet,
die Zellen wurden jetzt jedoch nur mit 500 µl Puffer in ein neues 15 ml Röhrchen mit
Schraubverschluss gespült.
Nach Zugabe von 1 ml Puffer wurden die Zellen für 10 min bei 300xg zentrifugiert.
Die Reinheit der Sortierung (Anteil der CD34+ HPC) wurde durchflusszytometrisch vor und
nach der Sortierung überprüft (s. 2.2.8.1.1).
2.2.4 Zellkultur zur Anzucht dendritischer Zellen
Zur In-vitro-Anzucht dendritischer Zellen wurde gemäß der Methode nach Caux verfahren
(Caux et al., 1992). Dazu wurden die durch MACS aus Nabelschnurblut isolierten CD34+
HPC (s. 2.2.3.3) in einem mit 8 % CO2 begasten Brutschrank bei 37 °C kultiviert.
36
Mit Kulturmedium wurde eine Stammzellsuspension einer Konzentration von 1,5 x 105 Zellen
/ ml eingestellt, die zu 200 µl-Portionen in einer 96er-Zellkultur-Flachbodenplatte verteilt
wurde.
Zur Stimulation von Wachstum und Ausreifung wurden pro ml folgende Wachstumsfaktoren
zugefügt (Caux et al., 1992; Szabolcs et al., 1995):
• 100 ng SCF
• 100 ng GM-CSF
• 2,5 ng TNF-α.
Am Tag 8 der Zellkultur erfolgte eine Restimulation durch erneute Zugabe gleicher Mengen
GM-CSF und TNF-α wie bei der Erststimulation.
Die - in der Regel ausgeprägte - Proliferation der Zellen wurde im Auflichtmikroskop verfolgt.
Bei konfluentem Zellwachstum wurde der Inhalt einer Vertiefung aufgeteilt und die
entstehenden Anteile mit neuem Kulturmedium wieder auf 200 µl-Portionen aufgefüllt. Ab
dem 8. Kulturtag wurden Zellen auch auf 24er-Zellkulturplatten (Fassungsvolumen der
Vertiefungen: 1000 µl) überführt.
14 Tage nach Kulturansatz wurden die Zellen geerntet, wobei zuvor durch 15-minütige
Inkubation der Zellkulturplatten auf Eis die adhärierten Zellen gelöst worden waren. Die
Ausbeute an ausgereiften DC betrug zwischen 5 x 106 und 9 x 107 Zellen.
Der Anteil der zu DC ausdifferenzierten Zellen wurde als Anteil CD1a+ Zellen
durchflusszytometrisch ermittelt (s. 2.2.8.1.2) und vermerkt. Er lag bei etwa 10-40 %.
2.2.5 Einfrieren der gewonnenen Zellen
Die angezüchteten DC (s. 2.2.4) und die sortierten CD45RA+ Zellen (s. 2.2.3.2) wurden
zunächst in Einfriermedium aufgenommen, in einer speziellen Tiefkühltruhe auf -80 °C
abgekühlt und anschließend in -196 °C-kalten flüssigen Stickstoff überführt.
Die Zellkonzentration in den Einfriergefäßen (Cryoröhrchen) betrug 1-2 x 107 / ml
Einfriermedium.
37
Bei Bedarf wurden die Zellen wieder aufgetaut. Dies geschah durch zügiges Resuspendieren
in erwärmter HANKS'-Salzlösung. Anschließend folgten drei Waschgänge mit HANKS'Salzlösung - bei 300xg (10 min), 200xg (15 min) und 300xg (10 min).
Für den Ansatz der Kokulturen aus CD45RA+ Zellen mit allogenen DC (s. 2.2.6) wurden
ausnahmslos zuvor eingefrorene Zellen verwendet.
2.2.6 Kokulturen aus CD45RA+ Zellen mit allogenen DC - als In-vitro-Modell der
primären Immunantwort
Als In-vitro-Modell für die primäre Immunantwort wurden die angezüchteten DC (s. 2.2.4)
mit allogenen CD45RA+ Zellen (Sortierung: s. 2.2.3.2) gemeinsam kultiviert. Dazu wurden
jeweils 50.000 CD45RA+ Zellen zusammen mit 5.000, 500, 50 oder 0 aus NabelschnurblutStammzellen
generierten
CD1a+
DC
in
die
Vertiefungen
einer
96er-Zellkultur-
Flachbodenplatte eingebracht und jeweils mit 200 µl Kulturmedium versorgt. Die CD45RA+
Zellen stammten überwiegend aus Nabelschnurblut, es wurden aber auch CD45RA+ Zellen
aus peripherem Blut Erwachsener als Reaktionszellen eingesetzt. Die Kulturen wurden in
einem mit 8 % CO2 begasten Brutschrank bei 37 °C 1, 2, 4, 7 oder 10 Tage lang inkubiert.
Untersucht wurde zum einen die Zytokinproduktion und damit Zellausdifferenzierung der
CD45RA+ Zellen (durchflusszytometrische Messung von Zytokinen, s. 2.2.8.2), zum anderen
die Vitalität und das Apoptoseverhalten der kokultivierten Zellen (s. 2.2.7 und 2.2.8.3,
Zellzahlbestimmung nach Anfärbung mit Trypan Blau und durchflusszytometrische Messung
der Apoptose).
Um Zytokine durchflusszytometrisch messen zu können, musste den Kokulturen ein
Hemmstoff intrazellulärer Transportprozesse zugesetzt werden. Zur Anwendung kam hier
entweder Brefeldin A (BFA), welches in einer Konzentration von 10 µg/ml 18h lang
einwirkte, oder 2,5 µM Monensin für 5h - beides gelöst in 96 % Ethanol.
38
Einige Kokulturen wurden am Tag vor der Messung mit der Chemikalienkombination
PMA/Ionomycin stimuliert. Dazu erhielten die Ansätze 10 ng/ml PMA und 1 µM Ionomycin beides gelöst in DMSO. Diese artifiziellen Stimuli wirkten normalerweise 5h ein, in der
Kombination mit BFA vergleichsweise auch 18h.
Einige Kulturansätze wurden durch Zugabe frischer DC (desselben Spenders wie beim
Ansetzen der Kultur) am Tag vor der Messung restimuliert. Dazu wurden vorsichtig 100 µl
Kulturmedium über den am Boden der Vertiefungen adhärierten Zellen entfernt und 5.000,
500, 50 oder 0 aus Nabelschnurblut-Stammzellen generierte CD1a+ DC in 100 µl
Kulturmedium dazupipettiert.
Für Untersuchungen wurde am vorgesehenen Zeitpunkt die benötigte Menge an Zellen
geerntet.
2.2.7 Zellzahlbestimmung nach Anfärbung mit Trypan Blau
Die Zellzahlbestimmung unter dem Durchlichtmikroskop erfolgte nach Anfärbung mit dem
Farbstoff Trypan Blau in einer Neubauer-Zählkammer. Lebende Zellen hielten den Farbstoff
nicht im Zytoplasma, sie erschienen weiß und transparent. Daher ließen sie sich von den blau
angefärbten toten Zellen unterscheiden.
2.2.8 Analytische Durchflusszytometrie
Die durchflusszytometrische Analyse von Zellproben basierte auf der Markierung
interessierender Zelleigenschaften (z.B. Oberflächenantigenen) mit Fluoreszenzfarbstoffen.
Durch
die
kombinierte
Verwendung
von
Farbstoffen
mit
unterschiedlichen
Emmissionsmaxima - wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Tricolor
(Tandemkonjugat aus R-Phycoerythrin und Indodicarbocyanin) und Propidiumiodid - wurden
bis zu drei Parameter gleichzeitig angefärbt.
Die in einem Polystyren-Reagenzglas vorgegebenen Zellsuspensionen gelangten über eine
Stahlkapillare durch Überdruck in die Messküvette des verwendeten FACScan®
39
Durchflusszytometers.
In
der
Messkammer
wurden
Zellaggregate
durch
einen
Flüssigkeitsstrom aufgetrennt, und die Zellen passierten einzeln den Analysepunkt (Prinzip
der hydrodynamischen Fokussierung). Am Analysepunkt traf ein Lichtstrahl der Wellenlänge
488 nm (Lichtquelle: 15 mW Argonlaser) auf die Zellen. Dadurch wurden die gebundenen
Farbstoffmoleküle zur Fluoreszenzemission angeregt, wobei die gemessene Intensität der
Anzahl der gebundenen Fluorochrome direkt proportional war.
Außer den Fluoreszenzintensitäten wurde vom Durchflusszytometer gleichzeitig die an den
Zellen entstehende Lichtstreuung erfasst, die Aufschluss über die Morphologie der Zellen gab.
Das Vorwärtsstreulicht (FSC) entlang des einfallenden Lichtstrahles diente als Maß für die
relative Zellgröße. Das Rechtwinkelstreulicht (SSC) hing vor allem von der jeweiligen
Zelldichte und Granularität ab.
Von jeder Zellprobe wurden 10.000 Zellen analysiert. Die Messwerte für FSC, SSC,
Fluoreszenz-1 (Fl-1), Fl-2 und ggf. Fl-3 wurden für jede Zelle ermittelt, nacheinander notiert
und als Liste gespeichert (Fünf-Parameter LIST MODE Datenaufnahme). Zur Auswertung
wurden die gemessenen optischen Signale durch eine integrierte Datenverarbeitung in digitale,
computergerechte Signale umgewandelt.
Mit Hilfe der Software „Lysis II" ließen sich die so gewonnenen Daten in zwei verschiedenen
Arten präsentieren:
Zur Darstellung der Verteilung eines gemessenen Parameters, also einer Zelleigenschaft,
innerhalb einer Population (Intensitätsprofil) eignete sich am besten das HäufigkeitsHistogramm. Sollte ein Signalpaar gleichzeitig dargestellt werden, wurde die korrelierte
Zweiparameterdarstellung (Dot Plot) gewählt, in der die Intensitätsachsen der beiden
Parameter gegeneinander aufgetragen waren.
Zur gezielten Untersuchung bestimmter Untergruppen aus der Gesamtheit der analysierten
Zellen wurden durch die Vorgabe von Begrenzungen - typischerweise innerhalb eines Dot
Plots der Streulichteigenschaften - entsprechende Fenster gesetzt. In der weiteren Analyse
wurden nur noch die Zellen dieser Region angezeigt (sog. „Diskriminierung" oder „Gating").
Bereits während der Datenaufnahme wurde der Computer angewiesen, nur Zellen bzw.
40
Partikel zu berücksichtigen, die eine Mindestgröße (FSC) überschritten - es wurde ein sog.
Live-Gate gesetzt.
2.2.8.1 Darstellung von Zelloberflächen-Antigenen
Die Fluoreszenzmarkierung erfolgte hier durch bereits an Farbstoffe gekoppelte monoklonale
Antikörper, die spezifisch gegen die entsprechenden Leukozyten-Oberflächenmarker gerichtet
waren.
2.2.8.1.1
Überprüfung der Stammzellreinheit
Zur Reinheitsüberprüfung der HPC-Sortierung (s. 2.2.3.3) wurde jeweils vor und nach der
Sortierung
der
Anteil
der
den
Oberflächenmarker
CD34
exprimierenden
Zellen
durchflusszytometrisch bestimmt.
Zellfärbung
5
Für die Färbung vor der Sortierung wurden 1-2 x 10 Zellen entnommen. Für die Färbung
nach Sortierung standen insgesamt viel weniger Zellen zur Verfügung, so dass nur eine Probe
von ca. 1 x 10 Zellen entnommen werden konnte. Die Proben wurden jeweils in 100 µl HBSS
4
+ Azid aufgenommen und erhielten anschließend 20 µl PE-gekoppelten Anti-CD34Antikörper. Die Proben wurden für 15 min bei 4 °C unter Lichtabschluss inkubiert. Danach
wurde der Überschuss an nicht gebundenen Antikörpern mit 1 ml HBSS + Azid für 5 min bei
200xg ausgewaschen. Für die durchflusszytometrische Messung wurden die gefärbten
Zellpellets in 250 µl Puffer aufgenommen.
Durchflusszytometrische Analyse
Erfahrungsgemäß handelt es sich bei den Stammzellen um mononukleäre Zellen, die keine
Granularität
aufweisen.
Daher
wurde
in
der
korrelierten
Darstellung
der
Streulichteigenschaften auf einen Bereich mit geringem SSC und variablem FSC gegated (s.
Abb. 2.1).
41
SSC
FSC
Abb. 2.1: Durchflusszytometrische Darstellung der Streulichteigenschaften von CBMC mit Gating auf die
Stammzellregion (R1)
Die Zellen der Region 1 wurden in einer korrelierten Zweiparameterdarstellung FSC gegen Fl2: CD34-PE dargestellt. Daran wurde der Anteil der CD34+ Stammzellen ermittelt und die
CD34-PE
CD34-PE
Werte vor und nach der Sortierung miteinander verglichen (s. Abb. 2.2).
0,4 %
FSC
90,5 %
FSC
Abb. 2.2: Vergleich der Anteile CD34+ CBMC innerhalb der Stammzellregion vor (links) und nach der MACSortierung (rechts)
42
2.2.8.1.2
Erfassung der Ausdifferenzierung der Stammzellen
Nach Kultur der HPC (s. 2.2.4) wurde der Grad der Ausdifferenzierung zu DC ermittelt,
indem der Anteil der CD1a+ Zellen bestimmt wurde.
Zellfärbung
Nach der Ernte wurden zwei Proben á 1-2 x 105 Zellen entnommen und in je 100 µl HBSS +
Azid aufgenommen.
Eine Probe erhielt je einen fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen das DC-spezifische
Oberflächenantigen CD1a und das monozytenspezifische CD14.
Zur zweiten Zellprobe wurden unspezifische monoklonale Antikörper gegeben, die den
spezifischen Antikörpern der ersten Probe in Klasse, Subklasse und gekoppeltem
Fluoreszenzfarbstoff entsprachen (Isotypkontrollen). Die zweite Probe diente bei der
durchflusszytometrischen Analyse als „Negativ-Kontrolle“, um die Regionen der Fluoreszenzpositiven und -negativen Zellen daran festzulegen.
Tab. 2.1: Antikörperzugabe zu den Proben
Probe
Anti-CD1a-FITC; 10 µl
Anti-CD14-PE; 5 µl
Kontrolle
Isotypkontrolle FITC (BD); 5 µl
Isotypkontrolle PE (BD); 5 µl
Beide Ansätze wurden für 15 min bei 4 °C unter Lichtabschluss inkubiert, anschließend wurde
der Überschuss an nicht gebundenen Antikörpern mit je 1 ml HBSS + Azid für 5 min bei
200xg ausgewaschen. Die gefärbten Zellpellets wurden schließlich in 250 µl Puffer
aufgenommen und unter Lichtabschluss bei 4 °C bis zur durchflusszytometrischen Messung
aufbewahrt.
43
Durchflusszytometrische Analyse
Anhand der Streulichteigenschaften wurden Zelltrümmer und sonstige kleine Partikel
SSC
(„Debris") ausgeschlossen (s. Abb. 2.3).
FSC
Abb. 2.3: Durchflusszytometrische Darstellung der Streulichteigenschaften der geernteten Zellen und Ausschluss
von Debris durch Gating (R1)
Die in der Region 1 erfassten Zellen der Probe und der Kontrolle wurden in je einer
KO-PE
CD14-PE
korrelierten Zweifarben-Darstellung von Fl-1 gegen Fl-2 dargestellt (s. Abb. 2.4).
KO-FITC
CD1a-FITC
Abb. 2.4: Dot Plot Fl-1: FITC (horizontal) gegen Fl-2: PE (vertikal) der in R1 erfassten Zellen der Kontrolle
(links) und der Probe (rechts)
44
Die Hilfslinien wurden anhand der Kontrolle so gesetzt, dass die auf Autofluoreszenz und
unspezifischer Bindung des Fc-Teils der Kontrollantikörper beruhende Fluoreszenz als negativ
definiert wurde und nur im linken unteren Quadranten erschien. Messpunkte, deren
Fluoreszenzintensität über den Werten der Kontrollmessung lagen, galten somit als positiv.
Im Dot Plot der Probe ließen sich nun vier verschiedene Zellpopulationen differenzieren. Die
interessierenden CD1a+, und daher FITC-gefärbten, Zellen befanden sich in den beiden
rechten Quadranten. Der Anteil der DC wurde als Prozentwert aller gemessenen Zellen
angegeben (im Beispiel der Abb. 2.4: 9,6 % CD1a+).
2.2.8.2 Messung der Produktion von Zytokinen
Der intrazelluläre Nachweis der Zytokine IL-4 und IFN-γ wurde in Anlehnung an die von
Jung entwickelte Methode (Jung et al., 1993) ebenfalls durchflusszytometrisch mittels
fluoreszenzmarkierter monoklonaler Anti-Zytokin-Antikörper durchgeführt.
Zellfärbung
Probenmaterial für die Messung der Zytokine waren die unterschiedlich lange inkubierten und
z.T. stimulierten mit DC kokultivierten CD45RA+ Zellen (s. 2.2.6), die am entsprechenden
Tag nach ca. 10-minütiger Inkubation der Zellkulturplatten auf Eis geerntet wurden. Für jedes
Experiment wurde - in Abhängigkeit von der Dauer der Kultur - der Inhalt von 10 bis 24
Vertiefungen eingesetzt.
Die Zellen wurden mit HBSS bei 300xg für 10 min gewaschen und mit 1 ml eiskaltem 4%igen
PFA 10 min lang bei Raumtemperatur fixiert. Das PFA wurde gründlich mit HBSS
herausgewaschen und das verbleibende Zellpellet in ca. 400 µl Saponin-Puffer resuspendiert.
Das Saponin permeabilisierte die Zellmembran der Leukozyten, so dass die anschließend
zugegebenen spezifischen Antikörper an die intrazellulär gelegenen Zytokine binden konnten.
45
Zu 100 µl der Zellsuspension wurde ein Antikörper gegen das T-Zell-spezifische
Oberflächenprotein CD3 und Antikörper gegen die intrazellulären Zytokine IL-4 und IFN-γ
gegeben.
Weitere 100 µl erhielten außer dem Anti-CD3-Antikörper noch unspezifische monoklonale
Antikörper, die den spezifischen Anti-Zytokin-Antikörpern in Klasse, Subklasse und
gekoppeltem Fluoreszenzfarbstoff entsprachen (Isotypkontrollen). Diese „Negativ-Kontrolle“
diente bei der durchflusszytometrischen Analyse dazu, die Regionen der Fluoreszenzpositiven bzw. - negativen Zellen festzulegen.
Tab. 2.2: Antikörperzugabe zu den Proben
Probe
Anti-IFN-γ-FITC; 10 µl Anti-IL-4-PE; 10 µl Anti-CD3-Tricolor; 3,5 µl
(Vorverdünnung 1:100)
Kontrolle Isotypkontrolle
(PharMingen);
(Vorverdünnung 1:10)
FITC Isotypkontrolle
10
PE Anti-CD3-Tricolor; 3,5µl
µl (PharMingen); 10 µl
(Vorverdünnung 1:75)
(Vorverdünnung 1:30)
Beide Ansätze wurden für 15 min bei 4 °C unter Lichtabschluss inkubiert. Anschließend
wurde der Überschuss an nicht gebundenen Antikörpern mit je 1 ml Saponin-Puffer für 5 min
bei 200xg ausgewaschen. Die gefärbten Zellpellets wurden schließlich in ca. 200 µl HBSS
aufgenommen und unter Lichtabschluss bei 4 °C bis zur durchflusszytometrischen Messung
aufbewahrt. Die Messung musste am gleichen Tag vorgenommen werden, damit die
Fluoreszenzintensität erhalten blieb.
Durchflusszytometrische Analyse
Bei der Auswertung der gewonnenen Messergebnisse wurde speziell die Zytokinproduktion
der aus CD45RA+ Zellen hervorgegangenen T-Lymphozyten betrachtet. Um diese von
anderen Zellen zu unterscheiden und abzugrenzen, wurde in der korrelierten Darstellung der
46
Lichtstreueigenschaften zunächst ein Fenster um den Bereich der ruhenden und aktivierten
Lymphozyten gesetzt (s. Abb. 2.5).
Abb. 2.5: Durchflusszytometrische Darstellung der Streulichteigenschaften der mit DC kokultivierten CD45RA+
Zellen mit Gating auf die Lymphozytenregion (R1)
T-Lymphozyten, die sich innerhalb des markierten Gates befanden, wurden durch die
Markierung mit Anti-CD3-Tricolor identifiziert. Anschließend wurden nur Lymphozyten
betrachtet, die den T-Zell-Marker CD3 an ihrer Oberfläche trugen (R2) (s. Abb. 2.6).
Abb. 2.6: Häufigkeits-Histogramm der Fl-3: CD3-Tricolor innerhalb der Lymphozytenpopulation mit Gating auf
CD3+ T-Zellen (R2)
47
Die Kombination von Gate 1 (R1) und Gate 2 (R2) ermöglichte die Identifizierung der TZellen innerhalb des gesamten Zellsortiments. Von dieser selektierten Zellpopulation wurde
das Zytokinmuster mit Fl-1 und Fl-2 in je einem Dot Plot für Probe und Kontrolle dargestellt
(s. Abb. 2.7).
Abb. 2.7: Dot Plot Fl-1: FITC (horizontal) gegen Fl-2: PE (vertikal) der T-Lymphozyten der Kontrolle (links)
und der Probe (rechts)
Anhand der Kontrolle wurden die Hilfslinien so gesetzt, dass die auf Autofluoreszenz und
unspezifischer Bindung des Fc-Teils der Kontrollantikörper beruhende Fluoreszenzintensität
als negativ definiert wurde.
Im Dot Plot der Probe ließen sich nun sowohl die IFN-γ- (FITC-gefärbt) als auch die IL-4produzierenden Zellen (PE-gefärbt) erkennen. Als Ergebnis wurde der Prozentsatz der Zellen,
die mit Anti-IL-4- bzw. Anti-IFN-γ-Antikörper anfärbbar waren, als Anteil der TLymphozyten angegeben.
2.2.8.3 Messung der Apoptose
Für die durchflusszytometrische Analyse der Apoptose wurde ein „ANNEXIN V FITC Kit“
nach Herstellervorschrift eingesetzt, bestehend aus FITC-gekoppeltem Annexin V,
Propidiumiodid (PI) und einem speziellen Bindungspuffer.
Damit ließen sich in die Apoptose eingetretene Zellen bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt
identifizieren, lange bevor morphologische Veränderungen sichtbar wurden. Es wurde hierzu
48
die Phospholipid-Bindungsfähigkeit des Annexin V ausgenutzt, welches eine sehr hohe
Affinität für Phosphatidylserin (PS) aufweist. PS ist bei der lebensfähigen Zelle überwiegend
an der Innenseite der Plasmamembran lokalisiert, mit Beginn des apoptotischen Prozesses
wird es jedoch vermehrt an der Zelloberfläche exprimiert und ist bis zum Zelltod dort
nachweisbar.
In vitro wird in der Spätphase der Apoptose die Plasmamembran der nun sekundär nekrotisch
genannten Zellen durchlässig. Daher kann der Farbstoff PI in diese Zellen eindringen. Er
bindet dort an die DNA und gewinnt dadurch erst seine Fluoreszenzeigenschaft.
Zellfärbung
Das Apoptoseverhalten der mit DC kokultivierten CD45RA+ Zellen (s. 2.2.6) wurde im
zeitlichen Verlauf durchflusszytometrisch verfolgt. Bereits von den gerade aus Stickstoff
aufgetauten CD45RA+ Zellen (s. 2.2.5) wurde vor dem 3. Waschschritt eine Probe von 5 x 105
Zellen zur frühesten Apoptosemessung entnommen. Diese Messung am Tag 0 der Kokulturen
diente später als Referenzwert für die Auswertung. Die anderen Zellproben wurden an den
entsprechenden Messtagen - Tage 1, 2, 4, 7 und 10 der Kokultur - durch Ernte von 5 (- 10)
Vertiefungen gewonnen.
Die Zellproben wurden mit eiskaltem HBSS bei 500xg für 5 min in einer auf 4 °C
vorgekühlten Zentrifuge gewaschen. Der Überstand wurde dekantiert und das verbleibende
Zellpellet in 490 µl eiskaltem 1:10 mit destilliertem Wasser verdünntem Bindungspuffer
aufgenommen.
Zu dieser Zellsuspension wurden 5 µl 1:10 mit Bindungspuffer vorverdünntes Annexin VFITC und 5 µl nach Herstellerangabe gelöstes PI gegeben. Bereits nach 10-minütiger
Inkubation
auf
Eis
und
unter
Lichtabschluss
konnte
die
angefärbte
Zellprobe
durchflusszytometrisch gemessen werden.
49
Durchflusszytometrische Analyse
Die Auswertung der Messergebnisse erfolgte selektiv für die Zellpopulation der
Lymphozyten. Das Gating auf die Gruppe der ruhenden und aktivierten Lymphozyten erfolgte
wie unter 2.2.8.2 („Messung der Produktion von Zytokinen“) beschrieben.
Von der Lymphozytenpopulation wurden korrelierte Zweifarbendarstellungen Fl-1 gegen Fl-2
angezeigt. Die Hilfslinien zur Festlegung der Regionen Fluoreszenz-positiver bzw. -negativer
Zellen wurden anhand der Apoptosemessung am Tag 0 in die Dot Plots gesetzt und für alle
weiteren Messtage des entsprechenden Kokultur-Ansatzes beibehalten.
So ließen sich drei Zellpopulationen unterscheiden und der jeweilige Anteil (in %) bestimmen
(s. Abb. 2.8): Die lebensfähigen Fluoreszenz-negativen Zellen (linker unterer Quadrant), die
apoptotischen FITC-gefärbten Zellen (rechts unten) und die sekundär nekrotischen PIgefärbten Zellen (oben).
Abb. 2.8: Dot Plot der Apoptosemessung in der Lymphozytenpopulation
50
2.2.9 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung gewonnener Daten erfolgte mit der PC-Software „GraphPad
Prism“. Mittelwerte, Standardabweichungen sowie die mittlere Standardabweichung wurden
mit „Column statistics“ ermittelt. Statistische Berechnungen auf signifikante Unterschiede
sind (bei den normal verteilten Daten) mit dem Mann-Whitney-Test berechnet worden. Bei
zweiseitiger Fragestellung wurde ein Signifikanzniveau von 0,05 gewählt (p < 0,05).
51
3 Ergebnisse
Die im Folgenden präsentierten Ergebnisse beruhen auf Experimenten zur näheren
Charakterisierung eines In-vitro-Modells für die primäre Immunantwort. In Anlehnung an
gemischte Lymphozytenkulturen wurden hierzu jeweils 50.000 CD45RA+ Zellen aus
Nabelschnurblut oder peripherem Blut Erwachsener mit verschiedenen Mengen allogener aus
Nabelschnurblut-Stammzellen
generierter
DC
kokultiviert. Es wurden verschiedene
Teilbereiche der Wechselwirkung zwischen DC und naiven T-Zellen (bzw. CD45RA+ Zellen)
untersucht.
3.1 Zytokinproduktion
und
Th-Differenzierung
in
den
allogenen
Kokulturen
Es wurden verschiedene Parameter der Kokulturen variiert und ihr Einfluss auf die
Zytokinproduktion und damit Ausdifferenzierung der naiven CD45RA+ Zellen untersucht.
Stellvertretend wurden die Leitzytokine für eine Th1- bzw. Th2-Antwort - IFN-γ und IL-4 intrazellulär durchflusszytometrisch nachgewiesen. Die Auswertung der Messergebnisse
erfolgte speziell für die aus CD45RA+ Zellen hervorgegangenen T-Lymphozyten (s. 2.8.3).
3.1.1 Einfluss des DC:T-Verhältnisses auf die Th-Differenzierung
Die Produktion von IFN-γ war am höchsten in Kokulturen mit hohem DC:T-Verhältnis, die
von IL-4 bei niedrigem DC:T-Verhältnis.
Untersucht und verglichen wurde die Zytokinproduktion in Kokulturen aus 50.000 CD45RA+
Nabelschnurblut-Zellen, denen entweder 5.000 (DC:T-Verhältnis 1:10), 500 (DC:T 1:100), 50
(DC:T 1:1.000) oder keine allogenen CD1a+ DC zugesetzt wurden. Die Messung der
intrazellulären Zytokine erfolgte jeweils am 7. Kulturtag nach 18-stündiger Inkubation mit
BFA.
52
Zunächst einmal fiel dabei auf, dass das Niveau der IL-4-Produktion in allen Kokulturen, d.h.
bei jedem DC:T-Verhältnis, signifikant höher war als das Niveau der IFN-γ-Produktion.
Am höchsten war der Anteil IL-4-produzierender T-Lymphozyten (Th2) bei niedrigem DC:TVerhältnis (1:1.000) bzw. wenn gar keine aus Nabelschnurblut-Stammzellen gezüchteten
allogenen DC in die Kultur gegeben wurden.
Die IFN-γ-Produktion hingegen wurde am effektivsten in den Kulturansätzen mit hohem
DC:T-Verhältnis induziert. Am höchsten war der Anteil IFN-γ-produzierender TLymphozyten (Th1) bei einem DC:T-Verhältnis von 1:100. Der Mittelwert von 4,5 % (± 4,6)
lag deutlich über dem der Kokulturen mit einem DC:T-Verhältnis von 1:10 (1,4 %; ± 1,6) und
1:1.000 (0,5 %; ± 0,7) und dem der Kulturen, denen keine allogenen DC zugesetzt wurden
(0,9 %; ± 0,6) (s. Abb. 3.1).
*
*
Zytokin-positive T-Zellen
(in %)
IL-4
50
IFN-γ
**
40
*
30
***
**
20
10
0
1:10
1:100
1:1.000
DC:T-Verhältnis
keine DC
Abb. 3.1: Anteile IL-4- bzw. IFN-γ-produzierender T-Lymphozyten (in %) am 7. Kulturtag in Kokulturen mit
unterschiedlichen DC:T-Verhältnissen. Mittelwerte, Standardabweichungen und p-Werte (*: p < 0,05, **: p <
0,01, ***: p < 0,001). Es gingen jeweils 5 oder 9 Messwerte ein.
53
3.1.2 Kinetik der Zytokininduktion
Die Produktion von IL-4 folgte einer Kinetik mit Höhepunkt am 7. Kulturtag.
Die Zytokinproduktion wurde in Kokulturen mit CD45RA+ Nabelschnurblut-Zellen und
DC:T-Verhältnissen von 1:10, 1:100 und 1:1.000 sowie in CD45RA-Zell-Kulturen ohne
allogene DC im zeitlichen Verlauf verfolgt. Die durchflusszytometrische Ermittlung des
Anteils der IL-4- bzw. IFN-γ-produzierenden T-Zellen erfolgte an den Kulturtagen 1, 2, 4, 7
und 10, jeweils nach 18-stündiger Inkubation mit BFA.
Während sich für die IFN-γ-Produktion keine Gesetzmäßigkeit in Abhängigkeit von der Dauer
der Kokulturen erkennen ließ (s. Abb. 3.2), folgte die IL-4-Produktion der T-Lymphozyten
eindeutig einer Kinetik mit Höhepunkt am 7. Kulturtag (s. Abb. 3.3). Dieser Verlauf ließ sich
in allen Kulturansätzen beobachten, unabhängig vom DC:T-Verhältnis. Dargestellt ist in den
Abbildungen beispielhaft der Verlauf für die Kokulturen mit einem DC:T-Verhältnis von 1:10
und 1:100.
Anteil IFN−γ−positiver
T-Zellen (in %)
50
DC:T 1:10
DC:T 1:100
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Kulturtag
Abb. 3.2: Anteil IFN-γ-produzierender T-Lymphozyten (in %) im zeitlichen Verlauf der Kokulturen mit DC:TVerhältnis von 1:10 und 1:100. Mittelwerte und mittlere Standardabweichungen (SEM). Es gingen jeweils 4
Messwerte ein.
54
Anteil IL-4-positiver
T-Zellen (in %)
50
DC:T 1:10
DC:T 1:100
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
Kulturtag
Abb. 3.3: Anteil IL-4-produzierender T-Lymphozyten (in %) im zeitlichen Verlauf der Kokulturen mit DC:TVerhältnis von 1:10 und 1:100. Mittelwerte und SEM. Es gingen jeweils 4 Messwerte ein.
3.1.3 Vergleich verschiedener Hemmstoffe des Proteintransports
Nach 18-stündiger Inkubation mit BFA lag der Anteil IL-4-produzierender T-Zellen signifikant
höher als nach 5 Stunden Monensin.
Die Zytokinproduktion in Kokulturen mit CD45RA+ Nabelschnurblut-Zellen und DC:TVerhältnissen
von
1:10
Proteintransporthemmstoff
und
1:100
untersucht.
wurde
Die
in
Abhängigkeit
vom
durchflusszytometrische
eingesetzten
Messung
der
intrazellulären Zytokine erfolgte am 7. Kulturtag entweder nach 18-stündiger Inkubation mit
10 µg/ml BFA oder nach 5-stündiger Inkubation mit 2,5 µM Monensin.
Während sich die Wahl des Hemmstoffs bei den ohnehin niedrigen Messwerten für IFN-γ
nicht bemerkbar machte (s. Tab. 3.1), zeigte sich ein erheblicher Unterschied beim IL-4.
Kam das 18 Stunden einwirkende BFA in den Kokulturen zum Einsatz, wurde der Anteil IL4-produzierender T-Zellen signifikant höher gemessen als nach 5-stündiger Inkubation mit
Monensin (s. Abb. 3.4).
55
Tab. 3.1: Anteil IFN-γ-produzierender T-Lymphozyten (in %) am 7. Kulturtag in Kokulturen mit einem DC:TVerhältnis von 1:10 bzw. 1:100 nach Einsatz zwei verschiedener Proteintransporthemmstoffe
Proteintransporthemmstoff:
Kokulturen mit DC:T 1:10
Kokulturen mit DC:T 1:100
10 µg/ml BFA, 18h
0,4
(± 0,2)
1,4
(± 1,4)
2,5 µM Monensin, 5h
0,4
(± 0,5)
0,6
(± 0,1)
Mittelwert (Standardabweichung). Es gingen jeweils 3 Messwerte ein.
**
30
Anteil IL-4-positiver
T-Zellen (in %)
**
*
BFA (18 h)
Monensin (5h)
20
10
0
1:10
1:1000
DC:T-Verhältnis
Abb. 3.4: Anteile IL-4-produzierender T-Lymphozyten (in %) am 7. Kulturtag in Kokulturen (DC:T-Verhältnis
1:10
und
1:100)
nach
Einsatz
zwei
verschiedener
Proteintransporthemmstoffe.
Mittelwerte,
Standardabweichungen und p-Werte (*: p < 0,05, **: p < 0,01). Es gingen jeweils 3 Messwerte ein.
56
3.1.4 Einfluss verschiedener Stimuli auf die Zytokinproduktion
In Kokulturen mit CD45RA+ Nabelschnurblut-Zellen und DC:T-Verhältnissen von 1:10 bzw.
1:100 wurde der Einfluss zwei verschiedenartiger Stimuli (s. 3.1.4.1 und 3.1.4.2) auf die
Zytokinproduktion untersucht.
3.1.4.1 Restimulation mit frischen DC
Erneute Zugabe von 5.000 DC am 6. Kulturtag steigerte die IFN-γ-Produktion.
Hier erfolgte am 6. Kulturtag die erneute Zugabe von DC desselben Spenders wie beim
Ansetzen der allogenen Kokultur, und zwar in den Mengen 5.000, 500, 50 und 0 (im letzten
Fall also nur frisches Kulturmedium). Die durchflusszytometrische Messung der
intrazellulären Zytokine erfolgte am 7. Kulturtag nach 18-stündiger Inkubation mit BFA.
Die IFN-γ-Produktion ließ sich durch diese physiologische Restimulation mit frischen DC
steigern. Insbesondere die Zugabe von 5.000 DC am 6. Kulturtag erhöhte deutlich den Anteil
IFN-γ-produzierender T-Zellen, während die Zugabe von 500 DC nur eine leichte Steigerung
bewirkte und die Zugabe von 50 DC ohne erkennbaren Effekt blieb (s. Tab. 3.2).
Tab. 3.2: Anteil IFN-γ-produzierender T-Zellen (in %) am Tag 7 in Kokulturen mit DC:T-Verhältnissen von
1:10 bzw. 1:100 nach Restimulation am Tag 6 durch Zugabe verschiedener Mengen frischer DC
Nachstimulation am Tag 6:
Kokulturen mit DC:T 1:10
Kokulturen mit DC:T 1:100
+ 5.000 DC
5,7 (± 2,9)
10,9 (± 3,8)
+ 500 DC
2,6 (± 0,9)
8,7 (± 3,8)
+ 50 DC
2,0 (± 0,6)
7,0 (± 4,9)
+ 0 DC
2,2 (± 1,0)
7,9 (± 5,7)
Mittelwert (Standardabweichung). Es gingen jeweils 4 Messwerte ein.
57
Die IL-4-Produktion wurde im Gegensatz zur IFN-γ-Produktion durch die erneute Zugabe von
DC nicht nennenswert beeinflusst (s. Tab. 3.3).
Tab. 3.3: Anteil IL-4-produzierender T-Zellen (in %) am Tag 7 in Kokulturen mit DC:T-Verhältnissen von 1:10
bzw. 1:100 nach Restimulation am Tag 6 durch Zugabe verschiedener Mengen frischer DC
Nachstimulation am Tag 6:
Kokulturen mit DC:T 1:10
Kokulturen mit DC:T 1:100
+ 5.000 DC
10,3 (± 5,2)
8,6 (± 3,9)
+ 500 DC
12,2 (± 4,6)
7,3 (± 5,6)
+ 50 DC
12,6 (± 5,6)
7,7 (± 5,8)
+ Kulturmedium
12,9 (± 6,4)
9,1 (± 6,6)
Mittelwert (Standardabweichung). Es gingen jeweils 4 Messwerte ein.
3.1.4.2 Stimulation mit PMA / Ionomycin
Zugabe der Stimulantien PMA / Ionomycin steigerte signifikant die IFN-γ-Produktion in den
Kokulturen, während es die IL-4-Produktion verringerte.
Hier erfolgte am 6. Kulturtag die Zugabe von 10 ng/ml PMA zusammen mit 1 µM Ionomycin.
Die durchflusszytometrische Messung der intrazellulären Zytokine erfolgte am 7. Kulturtag
entweder nach 5-stündiger Inkubation mit Monensin oder nach 18-stündiger Inkubation mit
BFA. In Kombination mit Monensin wirkte auch PMA/Ionomycin immer 5 Stunden ein, in
Kombination mit BFA wurde PMA/Ionomycin zum Vergleich 5 und 18 Stunden inkubiert.
Die Ergebnisse wurden verglichen mit den entsprechenden Zytokinmessungen ohne extra
Stimuli.
Im Vergleich zur physiologischen Restimulation mit dendritischen Zellen (s. 3.1.4.1) zeigte
sich hier ein deutlicherer Einfluss auf die Zytokinproduktion (s. Abb. 3.5 und Abb. 3.6).
58
**
*
**
unstimuliert
5h PMA / Ionomycin
Anteil IFN-γ-positiver
T-Zellen (in %)
30
18h PMA / Ionomycin
**
20
***
**
**
10
**
0
BFA
Monensin
DC:T 1:10
BFA
Monensin
DC:T 1:100
Abb. 3.5: Anteil IFN-γ-produzierender T-Lymphozyten (in %) am 7. Kulturtag in Kokulturen mit und ohne
Stimulation durch PMA/Ionomycin, unter Zugabe von BFA oder Monensin. Mittelwerte, Standardabweichungen
und p-Werte (**: p < 0,01, ***: p < 0,001). Es gingen jeweils 6 Messwerte ein.
Die ohne Nachstimulation stets sehr geringe Produktion von IFN-γ ließ sich durch die Zugabe
von PMA / Ionomycin um ein Vielfaches steigern. Zu diesem Ergebnis führten sowohl die
Ansätze, die BFA als Proteintransporthemmstoff erhielten, als auch die mit Monensin. Die
Unterschiede - unstimuliert / stimuliert - erwiesen sich in allen Fällen als signifikant. Der
Versuch, PMA / Ionomycin mit BFA zusammen 18 Stunden lang auf die Kokulturen
einwirken zu lassen, zeigte, dass durch längere Inkubationszeit (im Vergleich zu den 5
Stunden) die IFN-γ-Produktion weiter signifikant gesteigert werden konnte.
Die Steigerung der IFN-γ-Produktion durch PMA / Ionomycin war deutlich ausgeprägter als
die durch erneute Zugabe frischer DC hervorgerufene Steigerung.
Die Produktion von IL-4 ließ sich durch die Zugabe von PMA / Ionomycin zu den Kokulturen
hingegen nicht steigern. Bei Verwendung des Proteintransporthemmers BFA war das
Gegenteil der Fall: Der Anteil IL-4-positiver T-Zellen war signifikant größer, wenn nicht
stimuliert wurde. In den Kulturansätzen, die Monensin als Proteintransporthemmstoff
59
enthielten, war keine gesetzmäßige Veränderung der IL-4-Produktion nach Stimulation
festzustellen.
Anteil IL-4-positiver
T-Zellen (in %)
*
*
unstimuliert
30
**
5h PMA / Ionomycin
18h PMA / Ionomycin
*
20
10
0
BFA
Monensin
DC:T 1:10
BFA
Monensin
DC:T 1:100
Abb. 3.6: Anteil IL-4-produzierender T-Lymphozyten (in %) am 7. Kulturtag in Kokulturen mit und ohne
Stimulation durch PMA/Ionomycin, unter Zugabe von BFA oder Monensin. Mittelwerte, Standardabweichungen
und p-Werte (*: p < 0,05, **: p < 0,01). Es gingen jeweils 6 Messwerte ein.
3.1.5 Vergleich CD45RA+ Zellen Neugeborener und Erwachsener in Bezug auf
ihre Zytokinproduktion
Naive T-Zellen Erwachsener produzierten mehr IFN-γ als naive T-Zellen Neugeborener,
insbesondere nach Stimulation mit PMA/Ionomycin.
Es wurde die Zytokinproduktion von CD45RA+ Zellen aus Nabelschnurblut und aus
peripherem Blut Erwachsener als Responderzell-Typ in den Kokulturen (DC:T 1:10 bzw.
1:100) untersucht und miteinander verglichen. Die intrazellulären Zytokine wurden wieder am
7. Kulturtag durchflusszytometrisch gemessen, entweder nach 5-stündiger Inkubation mit
Monensin oder nach 18-stündiger Inkubation mit BFA. Ein Teil der Kulturansätze wurde mit
PMA / Ionomycin stimuliert.
60
Ein Unterschied in der Zytokinproduktion ließ sich nur hinsichtlich des IFN-γ feststellen.
Hier zeigte sich die Tendenz, dass T-Zellen, die aus peripheren CD45RA+ Zellen Erwachsener
hervorgegangen waren, mehr IFN-γ produzierten als T-Zellen aus CD45RA+ NabelschnurblutZellen. Dies galt einheitlich für alle Kokulturen mit einem DC:T-Verhältnis von 1:10 (s. Abb.
3.7), bei den Kokulturen mit einem DC:T-Verhältnis von 1:100 nur für die mit PMA und
Ionomycin stimulierten Ansätze (s. Tab. 3.4). In den unstimulierten Ansätzen der Kokulturen
mit DC:T 1:100 ließ sich diese Tendenz nicht nachweisen.
Anteil IFN-γ-positiver
T-Zellen (in %)
40
Nabel-CD45RA+
adulte CD45RA+
30
20
10
0
Monensin
BFA
BFA + 5h PMA
BFA + 18h PMA
Monensin + PMA
Abb. 3.7: Anteile IFN-γ-produzierender T-Lymphozyten (in %) am 7. Tag in Kokulturen mit CD45RA+ Zellen
aus peripherem Blut Erwachsener oder Nabelschnurblut (DC:T-Verhältnis 1:10). Mittelwerte und
Standardabweichungen. Es gingen jeweils 3 Messwerte ein.
61
Tab. 3.4: Anteile IFN-γ-produzierender T-Zellen (in %) am 7. Kulturtag in Kokulturen mit einem DC:TVerhältnis von 1:100 und entweder CD45RA+ Zellen aus peripherem Blut Erwachsener oder aus Nabelschnurblut
im Ansatz; weiter differenziert nach Proteintransporthemmstoff und Stimulation.
Kokulturen mit DC:T 1:100
Nabel-CD45RA+-Zellen
adulte CD45RA+ Zellen
BFA
1,4 (± 1,4)
0,7 (± 0,7)
BFA + 5h PMA/Ionomycin
2,0 (± 0,6)
12,2 (± 7,5)
BFA + 18h PMA/Ionomycin
10,1 (± 2,9)
19,5 (± 12,9)
Monensin
0,6 (± 0,2)
0,3 (± 0,4)
Monensin + PMA/Ionomycin
13,5 (± 3,0)
25,0 (± 18,8)
Mittelwert (Standardabweichung). Es gingen jeweils 3 Messwerte ein.
IL-4 wurde in Kokulturen mit CD45RA+ Zellen aus Nabelschnurblut bzw. peripherem Blut
Erwachsener in vergleichbarem Ausmaß produziert (s. Tab. 3.5).
Tab. 3.5: Anteile IL-4-produzierender T-Zellen (in %) am 7. Kulturtag in Kokulturen mit CD45RA+ Zellen aus
peripherem Blut Erwachsener und aus Nabelschnurblut; weiter differenziert nach Kokulturen mit DC:TVerhältnis von 1:10 bzw. 1:100, Proteintransporthemmstoff und Stimulation.
Kokulturen mit DC:T 1:10
Kokulturen mit DC:T 1:100
Nabel-CD45RA+ adulte CD45RA+ Nabel-CD45RA+ adulte CD45RA+
25,3 (± 5,8)
21,5 (± 14,4)
23,0 (± 6,1)
20,2 (± 15,5)
BFA + 5h PMA
5,2 (± 1,4)
10,9 (± 5,0)
8,2 (± 1,8)
7,2 (± 2,3)
BFA + 18h PMA
7,1 (± 1,5)
7,8 (± 6,8)
7,4 (± 0,5)
5,2 (± 2,8)
Monensin
3,7 (± 1,4)
7,0 (± 4,5)
3,6 (± 1,4)
5,6 (± 2,1)
Monensin + PMA
5,6 (± 0,7)
8,7 (± 9,7)
8,9 (± 5,4)
8,9 (± 4,8)
BFA
Mittelwert (Standardabweichung). Es gingen jeweils 3 Messwerte ein.
62
3.2 Vitalität und Apoptoseverhalten der kokultivierten Zellen
In Kokulturen mit 50.000 CD45RA+ Nabelschnurblut-Zellen wurden die Vitalität und das
Apoptoseverhalten in Abhängigkeit vom DC:T-Verhältnis (1:10, 1:100, 1:1.000 und keine
allogenen DC) und im zeitlichen Verlauf verfolgt. An den Kulturtagen 1, 2, 4, 7 und 10
erfolgte jeweils die Ermittlung sowohl der absoluten Zahlen lebender und toter Zellen (s.
2.2.7, Zellzahlbestimmung nach Anfärbung mit Trypan Blau) als auch der relativen Anteile
apoptotischer und sekundär nekrotischer Lymphozyten (s. 2.2.8.2, durchflusszytometrische
Messung der Apoptose).
3.2.1 Absolute Zellzahlen im zeitlichen Verlauf und in Abhängigkeit vom DC:TVerhältnis
Nur in Kokulturen mit einem DC:T-Verhältnis von 1:10 überlebten die meisten Zellen eine
Dauer von 10 Tagen. In Kokulturen mit niedrigerem DC:T-Verhältnis nahm die Anzahl
lebender Zellen kontinuierlich ab. Je geringer die DC-Dichte, desto ausgeprägter der
Zellverlust.
In den Kokulturen mit einem DC:T-Verhältnis von 1:100, 1:1.000 und den Kulturen ohne
allogene DC nahm die Zahl der lebenden Zellen über die Zeit stark und kontinuierlich ab (s.
Tab. 3.6). Je niedriger das DC:T-Verhältnis, desto steiler die Abnahme – was besonders
deutlich wurde beim Vergleich der Zellzahlen an den Kulturtagen 7 und 10. In den Kulturen,
denen keine allogenen DC zugesetzt wurden, war die Abnahme also am gravierendsten. Am 7.
Kulturtag waren hier durchschnittlich noch 8,4 %, am 10. Kulturtag dann nur noch 2,8 % der
Ausgangszellmenge als lebende Zellen vorhanden. Demgegenüber vollzog sich der Zellverlust
in Kokulturen mit einem DC:T-Verhältnis von 1:100 in vergleichsweise mäßiger Ausprägung.
Am 10. Kulturtag waren hier noch knapp ein Viertel (24 %) lebende Zellen vorhanden.
63
Tab. 3.6: Anzahl lebender Zellen im zeitlichen Verlauf der Kokulturen mit einem DC:T-Verhältnis von 1:100
und 1:1.000 sowie Kulturen ohne allogene DC
DC:T 1:100
DC:T 1:1.000
ohne DC
Kulturtag 1
3,7 x 104 (± 1,0 x 104)
3,6 x 104 (± 1,2 x 104)
3,9 x 104 (± 7,4 x 103)
Kulturtag 2
3,6 x 104 (± 1,1 x 104)
2,9 x 104 (± 5,9 x 103)
2,6 x 104 (± 5,2 x 103)
Kulturtag 4
1,8 x 104 (± 5,0 x 103)
1,5 x 104 (± 5,8 x 103)
1,7 x 104 (± 3,8 x 103)
Kulturtag 7
1,2 x 104 (± 4,5 x 103)
7,9 x 103 (± 6,6 x 103)
4,2 x 103 (± 1,8 x 103)
Kulturtag 10
1,2 x 104 (± 9,8 x 103)
3,0 x 103 (± 2,1 x 103)
1,4 x 103 (± 1,1 x 103)
Mittelwert (Standardabweichung). Es gingen jeweils 6 bis 9 Messwerte ein.
Die Abnahme der lebenden Zellen ging zum einen mit einer stetigen Zunahme der toten Zellen
einher, durch die Auflösung abgestorbener Zellen aber auch mit einer Abnahme der GesamtZellzahl in den Kokulturen (nicht dargestellt).
Die Kokulturen mit einem DC:T-Verhältnis von 1:10 unterschieden sich signifikant von den
anderen Kokulturen (s. Abb. 3.8). An den ersten beiden Kulturtagen nahm die Anzahl
lebender Zellen hier zunächst noch ebenso deutlich ab. Ab dem vierten Kulturtag ließ sich
dann aber eine Vermehrung der Zellen in Kultur feststellen, die am siebten Tag ihren
Höhepunkt erreichte. Hier überschritt die Zahl lebender Zellen (Mittelwert: 5,8 x 104,
Standardabweichung: 5,0 x 104) sogar die Zahl der am Tag 0 in Kultur gegebenen Zellen. Bis
zum 10. Kulturtag nahm die Zahl lebender Zellen dann auch hier wieder ab. Ein Großteil der
Zellen überlebte aber die komplette Kulturdauer (Mittelwert am Tag 10: 4,1 x 104,
Standardabweichung: 3,3 x 104).
64
Anzahl lebender Zellen / 200 µl
*
*
70.000
*
60.000
50.000
*
40.000
DC:T 1:10
DC:T 1:100
***
30.000
0
20.000
10.000
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
Kulturtag
Abb. 3.8: Vergleich der Anzahl lebender Zellen im zeitlichen Verlauf in Kokulturen mit einem DC:T-Verhältnis
von 1:10 und beispielhaft von 1:100. Mittelwerte, SEM und p-Werte (*: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001).
Es gingen jeweils 6 bis 9 Messwerte ein.
Die in Abb. 3.8 dargestellten signifikanten Unterschiede in den Zellzahlen an den Kulturtagen
4, 7 und 10 galten auch bei Ersetzen der Kokulturen mit DC:T-Verhältnis von 1:100 durch die
mit 1:1.000 bzw. die ohne DC (nicht abgebildet).
65
3.2.2 Relative Anteile apoptotischer und nekrotischer Lymphozyten im
zeitlichen Verlauf und in Abhängigkeit vom DC:T-Verhältnis
Der Anteil apoptotischer Lymphozyten nahm bis zum 7. Kulturtag deutlich zu und danach ab.
Der Anteil nekrotischer Lymphozyten wuchs erst zum 7. und 10. Kulturtag nennenswert an,
besonders ausgeprägt in den Kulturen mit niedriger DC-Dichte.
Zusätzlich zu durchflusszytometrischen Messungen an den Kulturtagen 1, 2, 4, 7 und 10
wurde als Referenzmessung für die Auswertung das Apoptoseverhalten der gerade aus
Stickstoff aufgetauten CD45RA+ Zellen analysiert (Messung am Tag 0). Analog zu den
Auswertungen der durchflusszytometrischen Zytokinmessungen erfolgte die Auswertung der
Messergebnisse speziell für die Lymphozytenpopulation (mittels Gating anhand der
Streulichteigenschaften).
Es zeigte sich, dass der Anteil apoptotischer Lymphozyten von recht niedrigen
Ausgangswerten um 6 % am Tag 0 (Ansatz der Kokulturen) ausgehend bis zum 7. Kulturtag
deutlich zunahm (s. Abb. 3.9 und Tab. 3.7). Vom 7. auf den 10. Kulturtag nahm der Anteil der
Lymphozyten in Apoptose dann fast ebenso stark wieder ab. Am deutlichsten zeigte sich
dieser Verlauf in den Kulturen, denen keine DC zugesetzt wurden. In den Kokulturen mit
DC:T-Verhältnis von 1:1.000 war bereits vom 4. auf den 7. Kulturtag eine leichte Abnahme
des relativen Anteils apoptotischer Lymphozyten festzustellen.
Der Anteil sekundär nekrotischer Zellen an den gerade aufgetauten CD45RA+ Zellen
(Messung am Tag 0) war mit weniger als 1 % äußerst gering. Ab dem 1. bis zum 4. Kulturtag
waren die Werte zwar deutlich höher, aber immer noch recht niedrig. Erst zum 7. und dann
noch mal zum 10. Kulturtag waren deutliche Zunahmen der Anteile abgestorbener Zellen an
den Lymphozyten zu erkennen, besonders in den beiden Kulturansätzen mit den niedrigsten
DC-Dichten (s. Tab. 3.8). In den Kokulturen mit DC:T-Verhältnis von 1:10 und 1:100 blieb
der Anteil nekrotischer Lymphozyten mit unter 10 % hingegen immer noch niedrig (s. Abb.
3.9).
66
Tab. 3.7: Anteile apoptotischer Lymphozyten in den Kokulturen (in %) im zeitlichen Verlauf
Kokulturen mit DC:T-Verhältnis von
Tag der Messung
1:10
1:100
1:1.000
keine DC
Tag 0 (Ansatz)
6,7 (± 6,4)
6,2 (± 5,3)
6,3 (± 4,8)
6,4 (± 4,9)
Kulturtag 1
12,9 (± 9,9)
11,4 (± 9,7)
14,0 (± 8,3)
14,5 (± 7,3)
Kulturtag 2
16,7 (± 15,7)
13,9 (± 17,0)
19,4 (± 12,3)
21,1 (± 9,3)
Kulturtag 4
18,2 (± 20,9)
20,8 (± 28,7)
28,5 (± 24,6)
34,8 (± 21,6)
Kulturtag 7
25,9 (± 27,8)
23,2 (± 30,6)
26,1 (± 27,1)
35,2 (± 25,1)
Kulturtag 10
21,0 (± 25,8)
9,1 (± 10,1)
12,2 (± 8,8)
13,2 (± 7,8)
Mittelwert (Standardabweichung). Es gingen jeweils 3 bis 5 Messwerte ein.
Tab. 3.8: Anteile sekundär nekrotischer Lymphozyten in den Kokulturen (in %) im zeitlichen Verlauf
Kokulturen mit DC:T-Verhältnis von
Tag der Messung
1:10
1:100
1:1.000
Keine DC
Tag 0 (Ansatz)
0,7 (± 0,6)
0,2 (± 0,1)
0,2 (± 0,1)
0,2 (± 0,1)
Kulturtag 1
4,2 (± 2,9)
1,7 (± 1,1)
1,7 (± 1,1)
2,2 (± 0,9)
Kulturtag 2
3,5 (± 2,9)
1,8 (± 1,0)
2,1 (± 1,3)
2,6 (± 1,1)
Kulturtag 4
3,4 (± 3,7)
1,8 (± 1,1)
2,3 (± 1,4)
3,1 (± 1,3)
Kulturtag 7
8,7 (± 6,8)
4,7 (± 1,4)
6,9 (± 6,3)
11,7 (± 12,0)
Kulturtag 10
7,3 (± 4,6)
5,2 (± 1,3)
25,4 (± 23,9)
18,2 (± 32,3)
Mittelwert (Standardabweichung). Es gingen jeweils 3 bis 5 Messwerte ein.
67
50
Anteil apoptotischer
Lymphozyten (in %)
DC:T 1:10
DC:T 1:100
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4 5 6 7
Kulturtag
8
9 10 11
Anteil nekrotischer
Lymphozyten (in %)
50
DC:T 1:10
DC:T 1:100
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
Kulturtag
Abb. 3.9: Relative Anteile apoptotischer und sekundär nekrotischer Lymphozyten (in %) im zeitlichen Verlauf
der Kokulturen mit DC:T-Verhältnis von 1:10 und 1:100. Mittelwerte und SEM.
68
4 Diskussion
Zentrale Schaltstelle im Immunsystem ist die primäre spezifische Immunantwort auf
Antigene. Um derartig komplexe In-vivo-Vorgänge nachvollziehbar und verständlich zu
machen, hat sich der Einsatz von In-vitro-Modellen bewährt. Im Zentrum der vorliegenden
Arbeit stand ein humanes In-vitro-Modell für die primäre Immunantwort. Das bereits
etablierte Modellsystem bestand - in Anlehnung an gemischte Lymphozytenkulturen - aus
allogenen Kokulturen naiver CD45RA+ Nabelschnurblut-T-Zellen mit aus NabelschnurblutStammzellen generierten dendritischen Zellen - also den beiden zentralen Zelltypen der
primären Immunantwort beim Neugeborenen. An diesem Modellsystem ließ sich die durch
DC induzierte Ausdifferenzierung naiver CD4+ T-Helferzellen in Th1- und Th2-Zellen anhand
der durchflusszytometrischen intrazellulären Messung der Leitzytokine IFN-γ und IL-4
verfolgen.
Bevor an diesem Modell die Immunmodulation durch exogene Einflüsse simuliert werden
sollte, war es zunächst sinnvoll, die Wechselwirkungen zwischen DC und naiven T-Zellen
unter neutralen Bedingungen näher zu charakterisieren. Diese Charakterisierung und die
daraus abgeleitete Optimierung des Modellsystems war Zielsetzung der vorliegenden Arbeit.
Im Einklang mit Ergebnissen früherer Arbeiten im Labor der Kinderklinik zeigte sich unter
neutralen Bedingungen ein massiv vorherrschendes Th2-Zytokinmuster (IL-4) in den
Kokulturen. So lag der Anteil IL-4-produzierender T-Zellen in Abhängigkeit vom jeweiligen
Experiment bei ca. 20 bis 35 %, während weniger als 5 % der T-Zellen IFN-γ produzierten.
Offensichtlich lenkt also eine allogene Stimulation die Th-Differenzierung in vitro in die Th2Richtung. Da man vermutet, dass Alloreaktivität durch eine Kreuzreaktion entsteht (Janeway
and Travers, 1997), ist von einer niedrigen Affinität des Alloantigens für den TCR
auszugehen. Eine niedrige Affinität führt zum verstärkten Priming von Th2-Zellen (Murray et
al., 1992; Kumar et al., 1995).
69
Im Einzelnen wurde untersucht und im Folgenden wird diskutiert:
Der Einfluss des DC:T-Verhältnisses auf die Th-Differenzierung und die Vitalität der
kokultivierten Zellen, die Kinetik der Zytokininduktion und des Apoptoseverhaltens in den
Kokulturen, der Einfluss verschiedener Proteintransporthemmstoffe sowie Stimuli und zuletzt
Unterschiede naiver T-Zellen Neugeborener und Erwachsener in Bezug auf die
Zytokinproduktion.
4.1 Die Th-Differenzierung ist abhängig vom DC:T-Verhältnis in den
Kokulturen
Die Literatur legt nahe, dass der zytokinproduzierende Phänotyp der T-Zellen abhängig von
der Dichte der DC zum Zeitpunkt des Primings ist (Ohshima and Delespesse, 1997; Tanaka et
al., 2000). Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Auswirkung verschiedener DC:TVerhältnisse (1:10, 1:100, 1:1.000, keine allogenen DC) auf die Th-Differenzierung in vitro
untersucht. Die beschriebene Abhängigkeit der Th-Differenzierung von der Dichte der DC
konnte dabei bestätigt werden.
Der am 7. Kulturtag gemessene Anteil IL-4-produzierender CD3+ T-Zellen (Th2) war am
höchsten bei niedrigen DC:T-Verhältnissen (1:1.000) oder wenn gar keine aus
Nabelschnurblut-Stammzellen generierten allogenen DC in die Kultur gegeben wurden. IFN-γ
hingegen wurde am effektivsten in den Kultur-Ansätzen mit hohem DC:T-Verhältnis
induziert. Am höchsten war der Anteil IFN-γ-produzierender T-Zellen (Th1) jedoch nicht bei
einem DC:T-Verhältnis von 1:10, sondern mit einem Mittelwert von 4,5 % (± 4,6) bei einem
DC:T-Verhältnis von 1:100.
Abgesehen davon, dass sich also der IFN-γ-produzierende T-Zell-Anteil (Th1) durch weitere
Steigerung des DC:T-Verhältnisses über 1:100 hinaus nicht weiter steigern ließ, standen die
Ergebnisse in Einklang mit anderen Arbeiten, die mit ansteigender Stimulator-DC-Dichte eine
Verschiebung des Zytokinmusters von Th2 zu Th1 beobachteten (Ohshima and Delespesse,
1997; Tanaka et al., 2000). Möglicherweise ist im untersuchten In-vitro-Modell bezüglich der
IFN-γ-Produktion bereits sehr früh ein selbstregulierender Mechanismus induziert worden, der
70
die Abweichung zur Literatur erklärt. Negative Rückkopplungsschleifen durch reife THelferzellen, die eine prolongierte bzw. überschießende Th1- oder Th2-Antwort selektiv
verhindern sollen, wurden sowohl für IFN-γ als auch für IL-4 postuliert (Rissoan et al., 1999).
Interessanterweise kam es auch in den Kulturen, denen keine allogenen DC zugesetzt wurden
und die somit keinen antigenen Reiz enthielten, zu einer Ausdifferenzierung naiver
Nabelschnurblut-T-Zellen - im Sinne einer Spontanausreifung. Verschiedene In-vitro-Studien
haben gezeigt, dass eine abnehmende Antigendosis mit einer zunehmenden Th2Differenzierung korreliert und dass entsprechend am untersten Ende der Dosisskala die Th2Antwort vorherrscht (Constant et al., 1995; Hosken et al., 1995). Das vollständige Fehlen
antigener Reize entspricht quasi dem Extremfall einer niedrigen Antigendosis und somit auch
dem untersten Ende einer solchen Dosisskala. Folgerichtig kam es in den Kulturen, die keine
allogenen DC enthielten, zur Ausdifferenzierung naiver CD4-T-Zellen in Th2-Zellen.
Natürlich lässt sich anhand der durchgeführten Experimente nicht sagen, welcher
Mechanismus bzw. welche Mechanismen letztendlich in den untersuchten Kokulturen
ausschlaggebend für eine Th1- oder Th2-Differenzierung war bzw. waren. Von der Vielzahl
an Faktoren, welche einen Einfluss auf die T-Helferzell-Differenzierung haben sollen (s.
Einleitung), können viele durch DC geliefert werden. In der Literatur gibt es Hinweise dafür,
dass die Th1-Differenzierung bei hoher DC-Dichte eher durch die starke Interaktion zwischen
TCR und Peptid:MHC-II-Ligand (hohe Antigendosis und Ligandendichte) und ein durch IL12 dominiertes Zytokinmilieu bewirkt wird. Bei niedriger DC-Dichte sollen dagegen vor allem
kostimulatorische Oberflächenmoleküle, wie das B7-CD28-System und die OX40/OX40LInteraktion, zur Th2-Differenzierung führen (Constant and Bottomly, 1997; Freeman et al.,
1995; Ohshima et al., 1998; Tanaka et al., 2000).
4.2 Die IL-4-Produktion folgt einer Kinetik mit Höhepunkt am 7. Kulturtag
Nachdem der Einfluss des DC:T-Verhältnisses auf die Th-Differenzierung untersucht worden
war,
galt
es
nachzuprüfen,
ob
der
7.
Kulturtag
tatsächlich
geeignet
für
die
durchflusszytometrische Analyse der Zytokine war. Für ein gutes, aussagekräftiges
71
Messergebnis ist es wichtig, einen Zeitpunkt auszuwählen, der den Nachweis der
interessierenden Zytokine maximiert. Daher wurde die Zytokinproduktion in den Kokulturen
im zeitlichen Verlauf verfolgt, d.h. der Anteil IFN-γ- bzw. IL-4-produzierender CD3+ T-Zellen
am 1., 2., 4., 7. und 10. Kulturtag durchflusszytometrisch bestimmt.
In den untersuchten Kokulturen befanden sich zwei potentielle CD3+ IFN-γ-Produzenten:
CD4- und CD8-T-Zellen. Durch den Modus der Gewinnung naiver T-Zellen, nämlich die
Isolierung CD45RA+ Zellen aus CBMC bzw. PBMC, gelangten ca. 60 % naive CD4- und 40
%
naive
CD8-T-Zellen
in
die
Kokulturen.
Beide
Zellarten
wurden
bei
der
durchflusszytometrischen Zytokinmessung durch Gating auf CD3+ Lymphozyten erfasst.
Gemäß Arbeiten von Mailliard und Mitarbeitern produzieren naive CD4+ CD45RA+ T-Zellen
zu frühen Zeitpunkten ihres Primings keine messbaren Mengen IFN-γ’s und erwerben diese
Fähigkeit erst mit 72 Stunden Verspätung, während CD8+ CD45RA+ T-Zellen bereits
innerhalb der ersten 24 Stunden ihres Primings bedeutende Mengen IFN-γ’s bilden können
(Mailliard et al., 2002). Wegen dieser unterschiedlichen Kinetiken wäre ein zweigipfliger
Verlauf der IFN-γ-Produktion in den Kokulturen zu erwarten gewesen.
Es ließ sich jedoch weder ein zweigipfliger Verlauf noch eine andere Gesetzmäßigkeit in
Abhängigkeit von der Dauer der Kokulturen erkennen. Dies lag wohl vor allem an den
durchweg sehr niedrigen Anteilen IFN-γ-produzierender Zellen (Mittelwerte: 0,5 bis 3,9 %)
und der Tatsache, dass die durchflusszytometrische Analyse bei kleinen Messwerten nicht
ausreichend genau ist. Die Standardabweichungen waren im Verhältnis zu den Mittelwerten
z.T. unverhältnismäßig hoch (bis ± 3,7 %). Wahrscheinlich ließ die relativ hohe
Messungenauigkeit bei den niedrigen Messwerten eine Kinetik für die IFN-γ-Produktion nicht
erkennen.
Im Gegensatz zur IFN-γ-Produktion folgte die - insgesamt deutlich höhere - IL-4-Produktion
der T-Zellen - unabhängig vom DC:T-Verhältnis in den Kokulturen - eindeutig einer Kinetik
mit Höhepunkt am 7. Kulturtag. Es ist bekannt, dass naive CD4+ CD45RA+ T-Zellen in den
ersten Tagen ihres Primings noch schlechte IL-4-Produzenten sind (Kristensson et al., 1990;
Salmon et al., 1989; Kalinski et al., 1995). Der Anstieg der IL-4-Produktion bis zum 7. Tag
wird gefördert durch die sich selbst verstärkenden Mechanismen des IL-4 und entspricht der
bekannten Tatsache, dass es bis zum Einsetzen einer spezifischen Immunantwort, also bis zum
72
Entstehen zytokinproduzierender Effektorzellen, 4-7 Tage dauert (Janeway and Travers,
1997). Vom 7. bis zum 10. Kulturtag war wieder eine Abnahme des IL-4-produzierenden TZell-Anteils
zu
verzeichnen.
Dies
könnte
wieder
Ausdruck
einer
negativen
Rückkopplungsschleife durch die reifen T-Helferzellen sein, in der diesmal das IL-4 die Th2Entwicklung negativ reguliert, um eine prolongierte Th2-Entwicklung selektiv zu verhindern
(Rissoan et al., 1999).
Als Fazit der kinetischen Untersuchungen lässt sich festhalten, dass der 7. Kulturtag optimal
für die durchflusszytometrische Analyse der Zytokine scheint, da die IL-4-Produktion am 7.
Kulturtag maximal war und bezüglich des IFN-γ keine signifikanten Unterschiede an den
einzelnen Messtagen bestanden.
4.3 Vitalität und Apoptoseverhalten der kokultivierten Zellen
Bei der Auswertung der durchflusszytometrischen Zytokinanalysen war aufgefallen, dass sich
z.T. nur (noch) sehr wenige Zellen in der anhand der Streulichteigenschaften definierten
Lymphozytenregion befanden. Dies war insbesondere in den Kokulturen mit niedrigem DC:TVerhältnis der Fall, und mit Zunahme der Kulturdauer umso ausgeprägter. Und da CD45RA+
Nabelschnurblut-T-Zellen in Kultur eine hohe Empfänglichkeit für spontane Apoptose bzw.
eine mangelhafte Fähigkeit zu überleben haben sollen (Soares et al., 1998), wurde als nächstes
gezielt die Vitalität und das Apoptoseverhalten der kokultivierten Zellen untersucht.
Die Zellzahlbestimmungen nach Anfärbung mit dem Farbstoff Trypan Blau bestätigten den
Eindruck aus den Zytokinanalysen. Nur in den Kokulturen mit hohem DC:T-Verhältnis (1:10)
überlebte ein Grossteil der Zellen die gesamte Kulturdauer von 10 Tagen. Es kam sogar
vorübergehend zu einer deutlichen Zellvermehrung mit Erreichen einer maximalen Zellzahl
am 7. Kulturtag. Hingegen nahm in allen anderen Kokulturen, d.h. in Kulturen mit
niedrigerem DC:T-Verhältnis, die Anzahl lebender Zellen kontinuierlich ab. Je geringer die
DC-Dichte war, desto ausgeprägter war auch der Zellverlust über die Zeit. In den Kulturen, in
die keine aus Stammzellen gezüchteten allogenen DC gegeben wurden, war die Abnahme
demgemäß am gravierendsten. Am 7. Kulturtag waren hier bei der Zellzählung
73
durchschnittlich noch 8,4 %, am 10. Kulturtag dann nur noch 2,8 % der Ausgangszellmenge
als lebende Zellen vorhanden. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit Arbeiten von Soares und
Mitarbeitern, die in reinen CD45RA-Zell-Kulturen eine vergleichbar starke Abnahme
überlebender Zellen über die Zeit festgestellt hatten - an Tag 8 waren in ihren Versuchen
praktisch alle Zellen bei der Zellzählung tot (Soares et al., 1998).
Soares et al. konnten den Zellverlust mit einem signifikanten Anstieg der Apoptose in
Nabelschnurblut-T-Zellen vereinbaren (Soares et al., 1998). Auch die im Rahmen der
vorliegenden Arbeit durchgeführten durchflusszytometrischen Apoptosemessungen zeigten
eine starke Zunahme des Anteils apoptotischer Lymphozyten in Abhängigkeit von der
Kulturdauer - allerdings nur bis zum 7. Kulturtag. Die darauffolgende Abnahme des
apoptotischen Lymphozytenanteils ging aber einher mit einer deutlichen Zunahme des
sekundär nekrotischen Lymphozytenanteils, der besonders ausgeprägt in den Kulturen mit
geringer DC-Dichte war. Da Soares et al. die sekundär nekrotischen Zellen als Endstufe der
Apoptose nicht extra abgegrenzt hatten, sind die Ergebnisse also durchaus miteinander
vergleichbar.
Die Zunahme des relativen Anteils apoptotischer bzw. sekundär nekrotischer Lymphozyten
über die Zeit passt gut zur kontinuierlichen Abnahme der lebenden Zellen in den Kokulturen
mit niedriger DC-Dichte. Sie scheint jedoch auf den ersten Blick nicht mit der deutlich
abweichenden Zellzahl-Kurve der Kulturen mit DC:T-Verhältnis von 1:10 vereinbar. Die hier
bei der Zellzählung beobachtete vorübergehende Vermehrung der Zellen muss einer
ausgeprägten Proliferation entsprechen, welche im Vergleich zur Apoptose deutlich überwog.
Generell sind die Verläufe der absoluten Zellzahlen in den Kulturen gleichsam das Ergebnis
aus der stattfindenden Proliferation abzüglich der ablaufenden Apoptose. Da die Proliferation
als Gegenspieler der Apoptose im Rahmen der vorliegenden Arbeit aber nicht gemessen
wurde (z.B. ebenfalls durchflusszytometrisch möglich), geben die Ergebnisse aus den
Apoptosemessungen zwar Hinweise und lassen Tendenzen vermuten. Sie lassen sich aber
nicht direkt auf die Ergebnisse aus der Zellzahlbestimmung und die entsprechenden
Verlaufskurven übertragen.
Wie in der Einleitung beschrieben, gibt es verschiedene Auslöser für den programmierten
Zelltod. In den untersuchten Kokulturen überwog offensichtlich der Mechanismus der
Apoptose aufgrund fehlender Aktivierung. Je höher die DC-Dichte in den Kokulturen war,
74
desto höher war auch die Chance, dass T-Zellen ihrem passenden Antigen begegneten und
aktiviert wurden - dementsprechend war hier die Apoptoserate niedrig. In den Kokulturen mit
niedrigem DC:T-Verhältnis und besonders in den Kulturen ohne allogene DC war die
Apoptoserate und der Zellverlust dementsprechend hoch. Wie bereits diskutiert, war genau in
diesen Kulturen auch der Anteil IL-4-produzierender T-Zellen am höchsten. Das heißt
demnach, dass unter suboptimalen Bedingungen - wie bei schwachem bis nicht vorhandenem
Antigenreiz - die meisten Zellen absterben und die wenigen überlebenden Zellen spontan zu
Th2-Zellen ausreifen. Nur unter optimalen Bedingungen wird auch IFN-γ (Th1) produziert.
Für das Immunsystem dürfte diese Spontanausreifung naiver CD4-T-Zellen zu Th2-Zellen bei
fehlendem Antigenreiz nicht sonderlich relevant sein - eben wegen der äußerst geringen Zahl
betroffener Zellen.
Eine mögliche Erklärung für das generell vorherrschende Th2-Zytokinmuster in allen
Kokulturen ist die höhere Empfänglichkeit von Th1-Zellen für den aktivierungsinduzierten
Zelltod (Ramsdell et al., 1994; Zhang et al., 1997; Varadhachary et al., 1997, Constant and
Bottomly, 1997). Es wurde weiterhin mehrfach ein Co-Priming für Apoptose und IFN-γProduktion bzw. eine Verbindung zwischen Apoptose und IFN-γ beschrieben (Lerner et al.,
1996; Groux et al., 1993; Oyaizu et al., 1996; Liu and Janeway 1990; Novelli et al., 1997;
Ghayur et al., 1997).
Zusammenfassend stellte sich bezüglich der Vitalität der kokultivierten Zellen das DC:TVerhältnis von 1:10 am günstigsten dar. Die nach deutlicher Proliferation maximale Zellzahl
am 7. Kulturtag stellt ausreichend Zellmaterial für eine aussagekräftige Zytokinanalyse sicher.
Die extremen Zellverluste in den Zellkulturen mit niedrigerem DC:T-Verhältnis machen diese
für das In-vitro-Modell ungeeignet.
75
4.4 Vergleich verschiedener Proteintransporthemmstoffe
Die durchflusszytometrische Analyse intrazellulärer Zytokine erfordert den Einsatz eines
Proteintransporthemmstoffs. Eingesetzt werden in der einschlägigen Literatur entweder BFA
oder Monensin, deren Einfluss auf die Messergebnisse am untersuchten In-vitro-Modell
verglichen wurde.
Während sich die Wahl des Hemmstoffes bei wieder sehr niedrigen Messwerten für IFN-γ
nicht bemerkbar machte, zeigte sich doch ein erheblicher Unterschied beim IL-4. Nach 18stündiger Inkubation mit BFA wurde der Anteil IL-4-produzierender Zellen signifikant höher
gemessen als nach 5 Stunden Monensin. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit
Untersuchungen von Mareckova und Mitarbeitern, die dem BFA im Vergleich zum Monensin
eine viel größere Fähigkeit zuschreiben, neu gebildete Zytokine in der Zelle zurückzuhalten
(Mareckova et al., 2002). Es ist aber gut möglich, dass der beobachtete Unterschied nicht in
der Substanz selbst begründet liegt, sondern in der deutlich längeren Inkubationszeit des BFA.
Wegen seiner hohen Toxizität in Zellkulturen bei längerer Einwirkzeit darf das Monensin
nicht vergleichbar lange einwirken (Jung et al., 1993).
Fazit: Da der Einsatz von BFA (18 Stunden) den Nachweis des IL-4 maximiert (und des IFNγ‘s nicht beeinflusst), ist er im untersuchten In-vitro-Modell dem Einsatz von Monensin (5
Stunden) überlegen.
4.5 Einfluss verschiedener Stimuli auf die Zytokinproduktion
Als nächstes wurde die Reaktionsfähigkeit des Modellsystems auf verschiedene Stimuli
überprüft.
Bislang ging man davon aus, dass zur Stabilisierung eines Th2-Musters eine wiederholte
Stimulation erforderlich sei - was in vitro für eine wiederholte Stimulation über den AntigenRezeptor-Komplex und CD28 und in vivo für eine wiederholte Exposition mit niedrigen
Antigendosen gezeigt wurde (Murphy et al., 1996; Guery et al., 1996; Wang et al., 1996). Da
76
DC sowohl das antigenspezifische Signal über den TCR als auch das kostimulatorische Signal
über CD28 liefern können, wurde am Modellsystem die wiederholte Stimulation in Form einer
erneuten Zugabe von DC am 6. Kulturtag (einen Tag vor der Zytokinanalyse) ausgeübt. Im Invitro-Modell herrschte allerdings bereits unter neutralen Bedingungen ein Th2-Zytokinmuster
vor. Die Restimulation mit frischen DC konnte die IL-4-Produktion nicht weiter steigern, die
relativen Anteile IL-4-produzierender T-Zellen blieben weitgehend unverändert.
Stattdessen hatte die physiologische Restimulation einen günstigen, wenn auch nicht
besonders stark ausgeprägten, Effekt auf die IFN-γ-Produktion der T-Zellen. Insbesondere die
erneute Zugabe großer DC-Mengen (5.000 DC) am 6. Kulturtag bewirkte eine Steigerung des
Anteils IFN-γ-produzierender T-Zellen. Vermittelt wurde dieser Effekt möglicherweise analog den Th1-polarisierenden Effekten einer hohen DC-Dichte im Kulturansatz - durch ein
verstärktes TCR-vermitteltes Signal und eine gesteigerte IL-12-Sekretion (Constant and
Bottomly, 1997; Freeman et al., 1995; Ohshima et al., 1998; Tanaka et al., 2000).
Zusätzlich zu dem physiologischen Stimulus durch frische DC wurde der artifizielle Stimulus
PMA plus Ionomycin am 6. Kulturtag (einen Tag vor der Zytokinanalyse) eingesetzt. Es ist
soweit bekannt, dass das Zusetzen von Phorbolester und Ionomycin eine maximale
Zellantwort auslöst. Auch CD45RA+ T-Zellen sollen nach PMA/Ionomycin-Aktivierung eine
signifikante Fähigkeit haben, verschiedene Zytokine zu sezernieren (Picker et al., 1995;
Conlon et al., 1995). Die Chemikalienkombination wird daher in vielen Studien zur
Steigerung
von
IL-4-
und
IFN-γ-Produktion
eingesetzt.
Ziel
ist,
dadurch
die
Nachweismöglichkeiten für diese Zytokine in der Immunfluoreszenz-Mikroskopie und Durchflusszytometrie zu optimieren.
In der Tat ließ sich durch Zusatz von PMA/Ionomycin die unter neutralen Bedingungen sehr
niedrige IFN-γ-Produktion in den untersuchten Kokulturen um ein Vielfaches steigern.
PMA/Ionomycin machte damit eine deutlich ausgeprägtere IFN-γ-Steigerung als die
physiologische Stimulation mit frischen DC. Allerdings ließ sich auch hier der Anteil IL-4produzierender T-Zellen nicht steigern, z.T. kam es sogar zu einer signifikanten Abnahme (bei
gleichzeitigem Einsatz von BFA als Proteintransporthemmstoff). Auch in anderen
Untersuchungen hatte eine Stimulation mit PMA/Ionomycin vor allem eine deutliche
Zunahme der IFN-γ-produzierenden Zellen bewirkt, während nur sehr niedrige Anteile IL-4produzierender CD3+ T-Zellen gemessen worden waren (Sander et al., 1991; Ledru et al.,
77
1998). Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass PMA/Ionomycin keine neutrale
Steigerung der Zytokinproduktion bewirken, sondern selektiv eine Th1-Antwort verstärken
oder sogar selbst induzieren.
Wegen dieser Th1-polarisierenden Eigenschaft ist der generelle Einsatz von PMA/Ionomycin
zur Steigerung der Zellantwort im beschriebenen Modellsystem ungeeignet. Es konnte
dadurch aber gezeigt werden, dass sich in den Kokulturen durch entsprechende Stimulation
auch ein Th1-Zytokinmuster induzieren lässt. Da die physiologische Restimulation durch
Zugabe von 5.000 DC den Nachweis des IFN-γ verbessert und des IL-4 dabei nicht
verschlechtert, ist ein Einsatz im Modellsystem prinzipiell denkbar. Allerdings scheint der
erzielte Nutzen zu gering, um den relativ hohen Arbeitsaufwand zu rechtfertigen.
Durch die systematischen Untersuchungen lassen sich als optimale Modellbedingungen
inzwischen folgende zusammenfassen:
Aus Nabelschnurblut-Stammzellen generierte DC sollten mit naiven Nabelschnurblut-TZellen im Verhältnis 1:10 gemeinsam kultiviert werden. Als Analysetag für intrazelluläre
Zytokine eignet sich der 7. Kulturtag. Die 18-stündige Inkubation mit BFA ist der 5-stündigen
mit Monensin vorzuziehen. Da das Ziel war, neutrale Bedingungen herzustellen, ist auf eine
Stimulation mit PMA/Ionomycin zu verzichten. Auch die Restimulation mit frischen DC sollte
nicht zum Standard werden.
4.6 Naive T-Zellen Erwachsener produzierten mehr IFN-γ als naive TZellen Neugeborener
Im bisher charakterisierten Modellsystem wurden naive CD45RA+ T-Zellen
aus
Nabelschnurblut als Responderzellen eingesetzt. Durch Aktivierung dieser Zellen durch DC
wird die Reaktionslage des neonatalen Immunsystems simuliert. Um die primäre
Immunantwort des Erwachsenen zu simulieren, müssen die naiven Nabelschnurblut-T-Zellen
entsprechend durch naive T-Zellen aus dem peripheren Blut Erwachsener ersetzt werden. Auf
diese Weise wurde zum Abschluss nach prinzipiellen Unterschieden naiver T-Zellen
Neugeborener und Erwachsener in Bezug auf die Zytokinproduktion gesucht.
78
Hierbei fiel auf, dass CD45RA+ T-Zellen aus dem peripheren Blut Erwachsener mehr IFN-γ
produzierten als CD45RA+ T-Zellen aus Nabelschnurblut. Der Unterschied wurde nach
Stimulation mit PMA/Ionomycin besonders deutlich. Ohne Stimulation lag auch bei
Erwachsenen der IFN-γ-produzierende T-Zell-Anteil deutlich unter 5 %. Dieses Ergebnis
deckt sich mit anderen Untersuchungen, in denen PMA/Ionomycin-stimulierte CD4+ CD45R0neonatale T-Zellen 5- bis 10fach niedrigere IFN-γ-Spiegel produzierten als ihre CD4+
CD45R0- Gegenstücke aus Erwachsenenblut (White et al., 2002; Wilson et al., 1986). Als
mögliche Ursache postulierten White et al. empfindliche Kontrollmechanismen auf der
Trankriptionsebene des IFN-γ-Gens neonataler T-Zellen. Des weiteren könnte eine Rolle
gespielt haben, dass sich unter den sortierten CD45RA+ T-Zellen Erwachsener auch einige TGedächtniszellen befunden haben könnten, die den CD45RA-Marker wieder angenommen
hatten. CD4+ T-Gedächtniszellen sind wie CD4+ T-Effektorzellen dafür bekannt, dass sie
beträchtliche Mengen IFN-γ’s und IL-4’s produzieren können (Mailliard et al., 2002). IL-4
wurde von CD45RA+ T-Zellen Neugeborener und Erwachsener in vergleichbarem Ausmaß
produziert.
4.7 Abschließende Beurteilung des In-vitro-Modells
Das im Rahmen der vorliegenden Arbeit näher charakterisierte und optimierte In-vitro-Modell
sollte die primäre Immunantwort des Neugeborenen simulieren (bzw. bei Ersetzen der
Responderzellen durch naive T-Zellen Erwachsener entsprechend die primäre Immunantwort
des Erwachsenen). Zielsetzung war hierbei natürlich, möglichst nah an die Verhältnisse in
vivo heranzukommen.
Kritisiert werden muss daher das unphysiologische Prinzip des Modells: Das Erzeugen einer
Immunantwort
durch
allogene
Stimulierung,
im
Sinne
einer
gemischten
Lymphozytenreaktion. Dass DC und T-Zellen zweier verschiedener Spender miteinander
reagieren, kommt in vivo ja nur im Rahmen von Transplantationen vor. Die Grundidee des
Modells war aber, dass ein sehr starker Reiz gebraucht wird, um in vitro überhaupt eine TZell-Reaktion messen zu können - und fremde MHC-Moleküle stellen einen ausreichend
starken Reiz dar.
79
Die Wahl eines allogenen Modells schränkt außerdem die Anwendung im klinischen Bereich
ein. Ein Einzelpatient bzw. Proband kann damit hinsichtlich Immunkompetenz oder
Atopieneigung nur unzureichend charakterisiert werden, da DC und T-Zellen eines Spenders
nicht gemeinsam eingebracht werden können. Natürlich lassen sich DC- oder TZellfunktionen getrennt überprüfen.
Ein weiterer Nachteil ist, dass die Stärke des Reizes auf die T-Zelle nicht - bzw. nur indirekt:
durch Variation der DC-Dichte - variabel ist.
Eine große Stärke des untersuchten In-vitro-Modells ist aber, dass es die Reaktionsweise des
neonatalen Immunsystems korrekt abbildet. Unter neutralen Bedingungen, d.h. ohne
zusätzliche Reize, dominierte in den Kokulturen ein Th2-Zytokinmilieu (IL-4). Durch eine
entsprechende Stimulation, demonstriert für PMA / Ionomycin sowie die erneute Zugabe
frischer DC, ließ sich aber auch eine Th1-Antwort induzieren. Damit haben die naiven ThZellen im untersuchten Modellsystem genauso reagiert, wie in der Literatur für das neonatale
Immunsystem beschrieben. Neugeborene haben demnach nämlich eine starke Neigung zur
Th2-Polarisierung (Adkins, 1999). Ihre naiven CD4-T-Zellen seien gewissermaßen
vorprogrammiert auf Th2. Als Antwort auf eine Antigenexposition würden prinzipiell
Antikörperbildungen
bevorzugt, während
zellvermittelte Immunreaktionen
schlechter
ausgeprägt seien (Ridge et al., 1996; Forsthuber et al., 1996; Sarzotti et al., 1996). Durch
adäquate Reizung ließen sich aber auch beim Neugeborenen voll funktionstüchtige Th1-Zellen
induzieren (Miller et al., 1994; Strobel and Ferguson, 1984).
Zusammenfassend handelt es sich bei dem beschriebenen Zellkultursystem um ein inzwischen
bewährtes und im weiteren ausbaufähiges In-vitro-Modell für die primäre Immunantwort. Das
System bietet die Möglichkeit, daran verschiedene Pathogene und Substanzen in Hinblick auf
ihre immunmodulierenden Fähigkeiten zu untersuchen. Da das Modell die Reaktionsweise des
neonatalen Immunsystems korrekt abbildet, scheint es auch gut dafür geeignet zu sein, den
prägenden Einfluss von Umweltreizen auf das kindliche Immunsystem zu simulieren.
80
5 Zusammenfassung
Die ersten Immunreaktionen im Leben eines Menschen können über selbstverstärkende
Mechanismen der primären T-Zell-Differenzierung bereits prägenden Charakter haben. Um
die Funktionsweise des unreifen Immunsystems von Neugeborenen auf zellulärer Ebene
nachvollziehen zu können, war ein humanes In-vitro-Modell für die primäre Immunantwort
entwickelt worden. Dieses bestand, in Anlehnung an gemischte Lymphozytenreaktionen, aus
allogenen Kokulturen naiver T-Zellen mit dendritischen Zellen. In der vorliegenden Arbeit
sollten die Wechselwirkungen zwischen dendritischen Zellen und naiven T-Zellen im
Zellkultursystem unter neutralen Bedingungen näher charakterisiert und daraus eine
Optimierung des Modells abgeleitet werden.
Dazu wurden folgende Modellparameter variiert und ihr Einfluss auf die Zytokinproduktion
und T-Helferzell-Differenzierung sowie die Vitalität der kokultivierten Zellen untersucht: Das
Mengenverhältnis dendritischer Zellen zu naiven T-Zellen, die Kulturdauer, der eingesetzte
Proteintransporthemmstoff (Brefeldin A oder Monensin) und die Stimulation (keine,
PMA/Ionomycin oder Zugabe frischer dendritischer Zellen). Ziel war dabei herauszufinden,
unter welchen Bedingungen die Zytokinproduktion gleichmäßig maximiert (ohne Th1- oder
Th2-Polarisierung) und das Absterben der kokultivierten Zellen minimiert wird.
Folgende Modellbedingungen erfüllten die oben genannten Kriterien und wurden daher als
Standard für weitere Untersuchungen etabliert: Dendritische Zellen und naive T-Zellen sind
im Verhältnis 1:10 für sieben Tage gemeinsam zu kultivieren und nicht mit PMA/Ionomycin
oder frischen dendritischen Zellen zu restimulieren. Die 18-stündige Inkubation mit Brefeldin
A vor der intrazellulären Zytokinanalyse ist der 5-stündigen Inkubation mit Monensin
vorzuziehen.
Unter Einhaltung dieser Parameter ist die In-vitro-Simulation von Immunmodulationen durch
exogene Einflüsse am besten möglich.
81
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Danksagung
Mein herzlichster Dank gilt meinem Doktorvater und Betreuer, Herrn PD Dr. med. U.
Schauer, für seine bereitwillige engagierte und intensive Unterstützung - von der Planung und
Durchführung der Versuche bis zur endgültigen Fertigstellung der Arbeit.
Den Mitarbeiterinnen des immunologischen Labors der Kinderklinik, Frau Veronika
Baumeister und Frau Angelika Michel, danke ich für die Einweisung in die angewandten
Methoden und ihre Hilfe bei den praktischen Tätigkeiten.
Frau Alexandra Overbeck und meiner Mutter, Ingrid Klitzke, danke ich für die Durchsicht der
Arbeit und ihre wertvollen Anmerkungen.
Zu guter Letzt danke ich meinem Freund, Markus Mansour, für so vieles - hier aber
insbesondere für seine Geduld und die EDV-Unterstützung.
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Lebenslauf
Persönliche Angaben
Name:
Britta Klitzke
Geburtsdatum:
15. September 1974
Geburtsort:
Hagen
Familienstand:
ledig
Schulbildung
1981 - 1985
Robert-Bonnermann-Grundschule, Herdecke
1985 - 1994
Friedrich-Harkort-Gymnasium, Herdecke
1994
Abitur
Studium
10/1994 - 05/2001
Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum
09/1996
Ärztliche Vorprüfung
08/1997
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
03/2000
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
04/2000 - 03/2001
Praktisches Jahr
05/2001
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Bisheriger beruflicher Werdegang
08/2001 - 01/2003
Tätigkeit als Ärztin im Praktikum und
02/2003 - 07/2003
als Assistenzärztin in der Inneren Abteilung des Städtischen
Klinikums
Braunschweig
(Chefarzt:
Prof.
Dr.
med.
B.
Wörmann)
Seit 02/2004
Assistenzärztin
am
Institut
für
Laboratoriums-
und
Transfusionsmedizin des Herz- und Diabeteszentrums NRW in
Bad
Oeynhausen,
Universitätsklinik
der
Ruhr-Universität
Bochum (Direktor: Prof. Dr. med. K. Kleesiek)
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