Multielement-Markierung von Antikörpern zur Detektion von Protei

Multielement-Markierung von Antikörpern zur Detektion von Proteinen in Western Blots
Antragsteller
Institut für Genetik
PD Dr. Petra Pfeiffer
Dr. Wolfgang Goedecke
Institut für Umweltanalytik und angewandte Geochemie
Dipl. Umweltwiss. Roland Diaz-Bone
Stand der Forschung
Die 2-D GE ermöglicht die hochauflösende Trennung komplexer Proteingemischen und ist
heute ein Standardverfahren der molekularbiologischen und biomedizinischen Proteomanalytik. Es können nicht nur Mischungen unterschiedlicher Proteine getrennt werden, sondern
auch Mischungen einer Proteinspecies, die sich durch den Status posttranslationaler Modifikationen (z.B. Phosphorylierung, Glycosylierung, Ubiquitinylierung etc.) unterscheiden. Der
spezifische Nachweis von Proteinen erfolgt üblicherweise nach Immobilisierung auf Membranen (Westernblots) mit Hilfe polyklonaler und monoklonaler Antikörpern (AK). Dieses
Verfahren nutzt die hohe Bindungsaffinität zwischen AK und deren Bindungsstellen (Epitope), die sich in Bindungskonstanten von bis zu 10-14 M widerspiegeln. Die eigentliche Detektion des Protein-gebundenen AK kann chemisch oder physikalisch erfolgen und erfordert je
nach Methode die Kopplung eines Enzyms, Fluorochroms oder radioaktiven Isotops an diesen
„primären“ oder einen „sekundären“ Antikörper. In der Regel wird für die Detektion ein sog.
Sandwich-Verfahren angewendet, in dem der primäre AK, der das gewünschte Protein erkennt, mit Hilfe eines sekundären AK, der seinerseits spezifisch den primären AK anhand
dessen konstanter Region (z.B. IgG) erkennt, sichtbar gemacht wird. Mit diesem sekundären
AK wird über das angekoppelte Enzym, Fluorochroms oder Isotops die eigentliche Farbreaktion durchgeführt wird.
Eine spezielle Anwendung ist die Kopplung von Metallkolloiden definierter Größe an Antikörper, die ebenfalls in der Elektronenmikroskopie erfolgreich eingesetzt werden. Der Nachweis auf dem Gelblot erfolgt durch die charakteristische Farbe der Kolloide und ist im Vergleich zu den oben genannten Nachweistechniken als wenig sensitiv einzustufen
Ziel des Projektes
In dem hier beantragten Projekt sollen metallgekoppelte Antikörper dazu benutzt werden,
spezielle Proteine nachzuweisen. Dabei wird ein Western Blot mittels Laserablation (LA)
räumlich hochaufgelöst abgerastert und die Metalle hochempfindlich über ein Induktiv Gekoppeltes Plasma Massenspektrometer (ICP-MS) detektiert. Die Vorteile dieser Methode gegenüber den herkömmlichen chemischen und physikalischen Nachweisverfahren bestehen in
• der Möglichkeit der Kopplung einer Vielzahl unterschiedlicher Metalle, was den
simultanen Nachweis mehrerer verschiedener AK in einem Western Blot mit Hilfe der ICP-MS erlaubt.
• der extreme Sensitivität bis hin zu der Möglichkeit, einzelne Moleküle nachzuweisen
• dem hohen linearen Bereich der Methode
• der Vermeidung des Einsatzes sekundärer AK (Sandwich-Verfahren s.o.), die bei
bestimmten Anwendungen zu Problemen aufgrund von Kreuzreaktionen führen
kann.
Diese Nachweismethode soll genutzt werden, um eine Methodik zu entwickeln, die zusätzlich
zum Proteinmuster in der Lage ist, alle bekannten posttranslatorischen Proteinmodifikationen
des Proteoms in einem Schritt darzustellen.
Prinzip der Methode
Zur Markierung von Antikörpern werden Metallionen oder –kolloide mit möglichst fest bindenden Liganden umgeben und über eine reaktive Gruppe kovalent an AK gebunden. Entsprechende Standardverfahren sind für AK, die in der Elektronenmikroskopie eingesetzt werden, bekannt (1). Durch Verwendung mehrwertiger Liganden wie z.B. EDTA können die Metallkomplexe kinetisch stabilisiert werden, um so den Austausch von Metallen zwischen unterschiedlich markierten AK zu minimieren. Die mit Metallen markierten AK binden an Proteine, die in einer zweidimensionalen Gelektrophorese (2-D GE) aufgetrennt und auf Nylonmembranen fixiert werden. Mit Hilfe des Lasers kann innerhalb kurzer Zeit die Oberfläche
der Membran in hoher räumlicher Auflösung voll automatisiert abgerastert werden. Über die
ICP-MS ist der simultane Nachweis von über 50 Elementen möglich, viele können im unteren
pg pro g-Bereich nachgewiesen werden. Zur Markierung können alle Metalle verwendet werden, die in der Probe und im Gel nur in einer geringen Konzentration vorkommen und möglichst störungsfrei und nachweisstark in der ICP-MS nachgewiesen werden können. Dazu
zählen die meisten schweren Elemente, insbesondere die seltenen Erden.
Durch die Verwendung von Kolloiden kann eine Steigerung der Nachweisgrenze von bis zu
drei Größenordnungen erreicht werden. Am einfachsten sind Goldkolloide herzustellen, mit
Goldkolloiden markierte Antikörper sind kommerziell verfügbar und werden bereits mit vergleichsweise geringer Sensitivität zum optischen Nachweis von Antikörpern auf Gelblots eingesetzt. Des weiteren können Palladium-, Platin-, Ruthenium-, Rhodium-, Silber- sowie Iridiumkolloide eingesetzt werden.
Nachweisgrenze der Methode und Vergleich mit etablierten Nachweismethoden
Die relative Nachweisgrenze der ICP-MS liegt für viele Metalle im unteren pg pro g-Bereich.
Für die Laserablation wird weniger als ein Mikrogramm Probenmenge benötigt. Für eine
Markierung mit einzelnen Metallionen ergeben sich daraus theoretisch absolute Nachweisgrenzen im Zeptomolbereich (das entspricht wenigen tausend Atomen), bei Verwendung von
Kolloiden mit mehreren Tausend Metallatomen im Yoctomolbereich. Die insgesamt notwendige Probenmenge hängt von der Größe der Proteinspots, sowie die Eindringtiefe der Proteine
in die (Nylonmembran) ab. Mit Hilfe der beschriebenen Methodik sollte der simultane Nachweis von mehreren Dutzend individuell markierten Antikörper im Zepto- bis Yoctomolbereich möglich sein. Diese Methodik wäre somit den etablierten Detektionstechniken überlegen, da über Chemilumiszenz und Autoradiograhpie zwar ebenfalls geringste Nachweisgrenzen möglich sind, aber nur bis zu zwei Signale maximal detektierbar sind. Mit Hilfe von Fluoreszenz können zwar wenige Antikörper parallel nachwiesen werden, allerdings liegen die
Nachweisgrenzen durch die Methode bedingt deutlich höher; darüber hinaus sinkt die Sensitivität der Methode mit der Anzahl der nachgewiesenen Antikörper. Ein weiterer wesentlicher
Vorteil ist der hohe dynamische Bereich der ICP-MS, der typischerweise neun Größenordnungen umfasst. Dies ermöglicht die simultane Quantifizierung abundanter und seltener Proteine. Darüber hinaus ist über die LA-ICP-MS möglich, Schwefel, Phosphor sowie an Proteine gebundene Metalle direkt nachzuweisen. Die Untersuchung von MetallProteinassoziationen ist ein Gegenstand der DFG-Forschergruppe „Metal(oid)organische
Verbindungen in der Umwelt“ (FOR 415). Da durch die variable Spotgröße des Lasers (einstellbar zwischen 10-300 µm Durchmesser) nur ein kleiner Teil des Blots abliert werden
braucht, steht der Blot für weitere Analysen, wie z.B. massenspektrometrischen Proteinanalysen, zur Verfügung
Anwendung
Im Rahmen des Projektes soll die Multielementmarkierung von Antikörpern eingesetzt werden, um eine Methodik zu entwickeln, die zusätzlich zum Proteinmuster in der Lage ist, alle
bekannten posttranslatorischen Proteinmodifikationen des Proteoms in einem Schritt darzustellen. Die Analyse der Proteinmodifikation ist von elementarer Bedeutung für die Untersuchung der Zellregulation auf Proteinebene, die insbesondere eine wichtige Rolle bei der Differenzierung spielt. Hierfür sollen die Antikörper, die unabhängig vom Protein spezifisch auf
die einzelnen Proteinmodifikationen sind, mit jeweils unterschiedlichen Metallen markiert
werden. Derartige Antikörper sind in großer Zahl kommerziell zu beziehen, da sie zunehmend
an Bedeutung in der biomedizinischen Diagnostik gewinnen.
Das Anwendungspotential soll anhand des Proteins MRE11 untersucht werden, das seit einigen Jahren am untersucht wird (2). Dieses Protein spielt bei der Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen eine große Rolle. Ein angeborener Defekt dieses Gens führt beim Menschen zu
einer genetisch bedingten Krankheit, dem Ataxia telangiectasia like disease (AT-LD). Patienten die an dieser Krankheit leiden haben ein hohes Risiko an Tumoren des lymphatischen
Systems zu erkranken. Es wurde nachgewiesen, dass das MRE11 Protein posttranslational
modifiziert werden kann. Eine Phosphorylierung führt zu Proteinumlagerungen innerhalb der
Zelle. Des weiteren haben wir Hinweise auf weitere Modifikationen wie Ubiquitinylierung
und Sumoylierung, die schwer nachzuweisen sind, da nur ein geringer Prozentsatz des Gesamtproteins einer Zelle diese Modifikationen trägt.
Die Empfindlichkeit der oben beschriebenen Methode soll dazu verwendet werden, derartige
Modifikationen nachzuweisen. Dazu soll ein Western Blot nach 2-D GE mit an Metalle gekoppelte Antikörper versetzt werden, die zum einen das MRE11 Protein zum anderen verschiedene posttranslationale Modifikationen erkennen. Die modifizierte Form erkennt man
dann als einen Spot, der zwei Metalle aufweist und damit die durch Bindung zweier Antikörper anzeigt.
Als Positivkontrollen können Proteine dienen, von denen entsprechende Modifikationen
schon nachgewiesen wurden. Da sind weitere DNA Reparaturproteine wie z.B. das RAD52
Protein zu nennen, gegen das wir ebenfalls Antikörper im Labor haben. Es gibt eine Reihe
von weiteren Proteinen, die sich als Referenz oder Positivkontrolle eignen und für die Antikörper kommerziell erhältlich sind.
Geplanter Umfang des ZLV-Antrags
Im Rahmen des ZLV soll mit Hilfe der kommerziell verfügbaren Goldclustern-gekoppelter
Antikörpern den grundlegende Nachweis der Funktionsfähigkeit der Methode erbracht werden. Als System für die Optimierung der LA-ICP-MS Analyse von Bottingmembranen wird
mit Hilfe von goldmarkierten Antikörpern eine Verdünnungsreihe erstellt und in definierten
Konzentrationen und Spotgrößen auf den Blot aufgetragen, um die Geräteparameter der Laser
Ablation und der ICP-MS-Detektion zu optimieren. In einem zweiten Schritt wird ein am Institut für Genetik vorhandenes aufgereinigtes Protein bekannter Konzentration in Verdünnungsreihen gelelektrophoretisch aufgetrennt und geblottet, um die Nachweisgrenze der Methode bei Verwendung sowohl primärer als auf sekundärer Antikörper zu ermitteln.
Um die simultane Detektion mehrerer Antikörper zu ermöglichen soll untersucht werden,
welche Metalle bzw. Metallkolloide für den Nachweis über LA-ICP-MS am besten geeignet
sind, sowie welches Verfahren der Kopplung von Metallen an Antikörper optimal ist.
Darüber hinaus soll an ausgewählten Beispielen (p53, MRE 11) die Anwendbarkeit der Methodik auf die Analyse posttranslationaler Modifikationen untersucht werden. Im Rahmen des
Projekts soll eine Diplomarbeit vergeben werden, für die eine SHW-Stelle über 19 Wochenstunden für 6 Monate beantragt wird.
Bemerkungen
LA-ICP-MS wird seit ca. 5 Jahren für die Analyse von Metallproteinen auf Gelblots verwendet (3). Die Anwendung der LA-ICP-MS als Detektor für Metall-gelabelte Antikörper ist bisher noch nicht beschrieben worden. Aufgrund der geringen Zahl der Anwender von LA-ICPMS von Gelblots ist eine baldige Veröffentlichung dieses Konzepts nicht zu erwarten.
Perspektive
Mittelfristiges Ziel, das innerhalb von ca. 9 Monaten erreicht werden soll, ist die Beantragung
eines Einzelprojekt bei der DFG zur Etablierung der Technik. Langfristiges Ziel ist die Integration in das Essener oder Bochumer Proteomicscenter. Hierbei sollen alle Potentiale der LAICP-MS für die Analyse von Proteinen genutzt werden. Hierzu zählen außer dem Labeling
von Antikörpern der direkte Nachweis von Phosphorilierungen sowie insbesondere der
Nachweis von Metall-Proteinassoziationen, der im Rahmen der DFG-Forschergruppe „Metal(oid)organische Verbindungen in der Umwelt“ intensiv untersucht wird.
Darüber hinaus soll die kommerzielle Nutzung für spezielle Fragestellungen, die eine hohe
Zahl von unterschiedlich markierten Antikörpern voraussetzen, untersucht werden.
Beantragte Mittel:
Studentische Hilfskraft: 6 Monate 4500,00 Euro
Verbrauchsmaterialien für 2-D GE
Immobilon-P Membranen zur Immobilisation von Proteinen
Gold gekoppelte sekundäre Antikörper
primäre Antikörper
Literatur
(1) Immunochemistry, A.C. Cuello, ed., John Wiley & Sons (Chichester, England, 1983),
pp. 353-358.
(2) Goedecke et al., Nature Genetics (1999) 23: pp. 194
(3) Mitchel et al. (1989)