Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der
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Schaible, Ulrich et al. | Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der ... Tätigkeitsbericht 2004 Immun- und Infektionsbiologie/Medizin Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der Tuberkulose Schaible, Ulrich; Winau, Florian Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Berlin Korrespondierender Autor: Schaible, Ulrich E-Mail: [email protected] Zusammenfassung Tuberkulose ist die häufigste bakterielle Infektionskrankheit weltweit und wird durch den Erreger Mycobacterium tuberculosis verursacht. Schützende Immunität gegen Tuberkulose wird durch TLymphozyten vermittelt, wobei neben CD4-Helfer-T-Zellen zytotoxische CD8-T-Zellen und lipidspezifische, CD1-reaktive T-Lymphozyten eine wesentliche Rolle spielen. Forscher der Abteilung Immunologie des Max-Planck-Instituts für Infektionsbiologie konnten nun einen neuen Weg der Präsentation mykobakterieller Antigene als Voraussetzung für die Aktivierung von CD8-T-Zellen beschreiben. Dieser Weg nimmt seinen Ursprung von mit M. tuberculosis infizierten Makrophagen, die den programmierten Zelltod (Apoptose) sterben. Dabei geben sie apoptotische Vesikel ab, die mykobakterielle Substanzen enthalten und von dendritischen Zellen aufgenommen werden, um nach Prozessierung der Antigene, effektiv CD8-T-Zellen zu stimulieren. Weiterhin konnte mit den Saposinen eine neue Gruppe von Helfermolekülen entdeckt werden, die die Antigenpräsentation von Lipiden über CD1-Moleküle überhaupt erst ermöglicht. Die Saposine überbrücken dabei die biophysikalische Kluft zwischen membrangebundenem Fett und hydrophilem Präsentationsmolekül. Lipid-spezifische TLymphozyten treten im Rahmen der Tuberkulose auf, da M. tuberculosis über eine wachsartige, fettreiche Zellwand verfügt. Die Erkenntnisse zur Präsentation mykobakterieller Antigene sind die Grundlage für ein besseres Verständnis der T-Zell-Aktivierung und der erfolgreichen Impfstoffentwicklung gegen Tuberkulose. Abstract Tuberculosis is the most prevalent bacterial infectious disease and is caused by Mycobacterium tuberculosis. Protective immunity is mediated by T-lymphocytes including CD4 helper T cells, cytotoxic CD8 T cells as well as lipid-specific, CD1-restricted T-lymphocytes. Scientists from the Department of Immunology of the Max-Planck-Institute for Infection Biology now characterized a novel presentation pathway for mycobacterial antigens as prerequisite for effective CD8 T cell activation. This "detour pathway" originates from mycobacteria-infected macrophages undergoing programmed cell death (apoptosis). During apoptosis, infected macrophages release apoptotic vesicles containing mycobacterial material. Subsequently, these vesicles are taken up by dendritic cells, which process the engulfed antigens for presentation to CD8 T cells. Moreover, a new group of helper molecules named saposins was identified which facilitates antigen presentation of lipids through CD1-molecules. Saposins bridge the biophysical gap between membrane-bound lipids and hydrophilic presentation molecules. Lipid-specific T-lymphocytes play a role in tuberculosis since M. tuberculosis disposes of a waxy, lipidrich cell wall. Insights into fundamental aspects of presentation of mycobacterial antigens are the basis for a better understanding of T cell activation and rational vaccine design against tuberculosis. © 2004 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 3031 Tätigkeitsbericht 2004 Schaible, Ulrich et al. | Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der ... Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der Tuberkulose Tuberkulose stellt auch heute noch eine der bedrohlichsten Infektionskrankheiten weltweit dar. Ein Drittel der Weltbevölkerung ist mit dem bakteriellen Erreger Mycobacterium tuberculosis infiziert. Dies führt pro Jahr in 8-9 Millionen Fällen zur klinischen Manifestation der Tuberkulose, typischerweise in der Lunge, von denen etwa 2 Millionen tödlich enden. Diese Daten verdeutlichen eindringlich die Bedeutung der Tuberkulose für das Gesundheitswesen und den Bedarf für einen wirkungsvollen Impfstoff. Meist führt die Infektion mit dem Erreger jedoch nicht zur Erkrankung und der Infektionsverlauf wird durch das körpereigene Immunsystem wirkungsvoll kontrolliert. Diese immunologische Kontrolle bewirkt aber nur die "Einkapselung" der Erreger in Granulomen; die sterile Elimination der Keime gelingt nicht. Die Infektion bleibt daher lebenslang bestehen und kann auch nach Jahren eine Erkrankung auslösen. Im Zentrum der Infektabwehr stehen Fresszellen des angeborenen Abwehrsystems, die Makrophagen, die zwar einerseits durch Mykobakterien infiziert werden, aber andererseits durch das Zytokin Interferong aktivierbar sind und dann intrazelluläre Bakterien abtöten oder deren Wachstum hemmen. Die zweite Achse der Abwehr wird von T-Lymphozyten gebildet, die zum erworbenen Immunsystem gehören und spezifisch mykobakterielle Antigene erkennen, die ihnen von "professionellen" antigenpräsentierenden Zellen (wie dendritischen Zellen (DZ) und Makrophagen) angeboten werden. Dabei spielen sog. CD4T-Lymphozyten die entscheidende Rolle bei der T-Zell-Antwort, obwohl auch andere T-ZellPopulationen wesentlich zur Immunabwehr gegen Tuberkulose beitragen. Unsere hier vorgestellen Arbeiten konzentrieren sich auf CD8-T-Zellen, die wie CD4-T-Zellen Proteinantigene erkennen, sowie auf CD1-restringierte T-Lymphozyten, die antigenspezifisch auf Lipide reagieren. Das Problem der CD8-T-Zell-Aktivierung bei der Tuberkulose Obwohl CD8-T-Lymphozyten in erster Linie für die Virusabwehr zuständig sind, werden sie für die Abwehr bestimmter Bakterien, so auch M. tuberculosis, dringend benötigt. Mykobakterien-spezifische CD8-T-Zellen können aus dem Gewebe infizierter Patienten isoliert werden und Experimentaltiere, denen CD8 T-Zellen fehlen, zeigen einen deutlich verringerten Schutz gegen Tuberkulose. CD8-T-Zellen differenzieren nach Antigenerkennung und folgender Aktivierung zu zytotoxischen TLymphozyten (ZTL), die infizierte Zielzellen durch sezernierte Proteine wie Perforin lysieren können. Dadurch werden intrazelluläre Bakterien freigesetzt und für direkte Attacken durch ZTL angreifbar. Weiterhin produzieren ZTL Interferon-g, das wiederum infizierte Phagozyten zur potenten Keimabtötung mittels reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffmetabolite aktiviert. Die antigenspezifische Aktivierung der CD8-T-Zellen gab lange Zeit Rätsel auf. Unsere Untersuchungen zeigten, dass Mykobakterien nach Eintritt in den infizierten Makrophagen in einem abgeschlossenen Kompartiment, dem frühen Phagosom, verbleiben und daher zur Aktivierung von CD8-T-Zellen ungeeignet sind. Experimente mit markierten Erregern ergaben, dass das Mykobakterien-Phagosom nahezu hermetisch gegenüber dem Zytoplasma abgeriegelt ist. Da aber Antigene, die von CD8-T-Zellen erkannt werden, normalerweise im Zytoplasma vorliegen müssen, warf dies die Frage auf, wie die mykobakteriellen Antigene an ihren Bestimmungsort gelangen, um CD8-T-Zellen zu stimulieren. Das Phänomen, dass Antigene von der Zelle, in der sie primär anfallen, nicht präsentiert werden, sondern erst abgegeben und von einer zweiten Zelle, meist einer DZ, aufgenommen und präsentiert werden müssen, ist als "Cross- 2304 www.mpg.de © 2004 Max-Planck-Gesellschaft Schaible, Ulrich et al. | Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der ... Tätigkeitsbericht 2004 priming" bekannt. Aufzuklären, ob und ggf. über welchen Mechanismus "Cross-priming" bei Tuberkulose stattfindet, war das nächste Ziel unserer Experimente. Apoptotische Vesikel transportieren mykobakterielle Antigene zu DZ Unsere In-vitro-Versuche zeigten, dass die Infektion mit M. tuberculosis in Makrophagen einen programmierten Zelltod, die "Apoptose" auslöst. Dabei handelt es sich um den geordneten Prozess des Sterbens einzelner Zellen, der physiologisch in jedem Organismus die Zellzahl, trotz gleichzeitiger Neubildung von Zellen, konstant hält. Die herrschende Meinung ging bisher von einem nachteiligen Effekt der infektionsinduzierten Apoptose aus, da mit dem Makrophagen ein Hauptakteur der Abwehr beseitigt wird. Wir konnten zeigen, dass die infizierte Zelle während der Apoptose Vesikel abschnürt (Abb. 1a), die von umliegenden DZ aufgenommen werden. Genauere Untersuchungen der apoptotischen Vesikel (Abb. 1b) ergaben, dass sie zahlreiche dominante mykobakterielle Antigene wie z.B. das 19kDaLipoprotein und das sog. Antigen85 enthalten. Die von den DZ aufgenommenen apoptotischen Vesikel aktivierten mykobakterien-reaktive CD8-T-Zell. Dabei stand eine lysosomale Prozessierung der Vesikel in den DZ im Vordergrund, da die Behandlung mit Lysosomen-Inhibitoren wie Bafilomycin die T-ZellAktivierung unterband, wohingegen Proteasomen-Inhibitoren einen zu vernachlässigenden Effekt auf die T-Zell-Aktivierung hatten. Wurde die Apoptose in den primär infizierten Makrophagen durch Zugabe eines globalen Kaspase-Inhibitors gehemmt, so wurden der Antigentransfer und die CD8-T-ZellAktivierung unterbunden. Da die mykobakteriellen Antigene von der Sackgasse im Phagosom des infizierten Makrophagen, über die apoptotischen Vesikel hin zur DZ mit erfolgreicher Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung einen Umweg nehmen müssen, um überhaupt CD8-TZellen stimulieren zu können, bezeichnen wir diesen neuen Weg der Antigenpräsentation als "Detour pathway" (Abb. 1c). Detour pathway in vivo Um zu untersuchen, ob "Cross-priming" über apoptotische Vesikel nicht nur ein lokales Geschehen der Antigenverteilung darstellt, wie es im peripheren entzündeten Gewebe, in dem gehäuft Zellen sterben, stattfindet, sondern tatsächlich einen genuin immunologischen Prozess repräsentiert, der das Immunsystem miteinschließt, dehnten wir unsere Experimente auf ein In-vivo-Modell aus. Dabei transferierten wir eine definierte Population von CD8-T-Zellen in Empfängermäuse und immunisierten diese Tiere mit apoptotischen Vesikeln von mykobakterien-infizierten Makrophagen. Bei den CD8-T- © 2004 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 3053 Tätigkeitsbericht 2004 Schaible, Ulrich et al. | Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der ... Zellen handelte es sich um Lymphozyten mit Spezifität für Ovalbumin (OVA). Wir infizierten Makrophagen für die Vesikelpräparation mit rekombinanten Mykobakterien, die OVA als SurrogatAntigen exprimieren. In diesem definierten System ließ sich nachweisen, dass apoptotische Vesikel von infizierten Zellen nach subkutaner Immunisierung in der Lage sind, CD8-T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten zu aktivieren (Abb. 2a). Nach subkutaner Gabe farbig-markierter Vesikel waren die apoptotischen Vesikel nur in den DZ der drainierenden Lymphknoten wiederzufinden. Wir schließen daraus, dass die DZVesikel in der Peripherie aufnehmen und anschließend in den drainierenden Lymphknoten transportieren (Abb. 2b). Diese Ergebnisse zeigen, dass der "Detour pathway" auch in vivo funktionsfähig ist und das klassische immunologische "Cross-priming" umfasst. Abb. 1a, 1b, 1c : Mykobakterien induzieren Apoptose in Makrophagen. - 4306 www.mpg.de © 2004 Max-Planck-Gesellschaft Schaible, Ulrich et al. | Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der ... Tätigkeitsbericht 2004 Abb. 2a, 2b : Apoptotische Vesikel aktivieren CD8 T-Zellen in vivo. Apoptotische Vesikel und Impfung gegen Tuberkulose Vakzinierung von Mäusen mit apoptotischen Vesikeln von infizierten Zellen und anschließende AerosolInfektion mit M. tuberculosis bewirkte einen Impfschutz vergleichbar dem einer BCG-Immunisierung. Obwohl der BCG-Impfstoff die wichtigsten Tuberkuloseformen nicht verhindern kann, stellt er bis heute den Goldstandard der Vakzinierung gegen Tuberkulose im Tiermodell dar. Damit ist der "Detour © 2004 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 3075 Tätigkeitsbericht 2004 Schaible, Ulrich et al. | Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der ... pathway" nicht nur biologisch relevant, sondern stellt auch einen weiteren Schritt hin zur rationalen Impfstoffentwicklung dar. Prima vista scheint die Immunogenität der apoptotischen Vesikel dem Konzept gegenläufig, dass apoptotische Vorgänge ohne Entzündung und ohne Aktivierung des Immunsystems ablaufen, da sonst der Organismus permanent auf endogenen Zelltod reagieren müsste und Apoptose damit eng mit Autoimmunität verbunden wäre. Wir müssen bei apoptotischen Vesikeln, die von infizierten Zellen abstammen, jedoch berücksichtigen, dass diese Vesikel per se nicht-entzündlich sind. Andererseits sind sie aber mit einer Vielzahl mykobakterieller Bestandteile ausgerüstet, die nicht nur antigene, sondern auch inflammatorische und adjuvante Eigenschaften vermitteln. Damit werden sie für das Immunsystem als Träger von Fremdmaterialien erkennbar. So konnten wir zeigen, dass apoptotische Vesikel von mykobakterien-infizierten Makrophagen Wirtszellen über die Bindung von Toll-like Rezeptoren (TLR) stimulieren. TLR werden u.a. von DZ exprimiert und dienen der Erkennung konservierter bakterieller Muster. TLR-Bindung induziert Reifung und potente Antigenpräsentation von DZ. Wir sehen diese apoptotischen Vesikel als Träger von Antigenen, antigen-präsentierenden Molekülen und Adjuvanzien, und sprechen ihnen daher eine autonome immunologische Entität zu. Lipid-spezifische T-Zellen Die CD1-Familie umfasst ungewöhnliche antigen-präsentierende Moleküle, die von DZ exprimiert werden. Die CD1-Moleküle verfügen über eine antigen-bindende Tasche. Im Gegensatz zur peptidbindenden Grube der wichtigsten antigen-präsentierenden Moleküle der Haupthistokompatibilitätsfamilie dient die CD1-Tasche jedoch der Bindung von Lipiden. Die verschiedenen Mitglieder der CD1-Familie binden unterschiedliche Liganden, u.a. Fettsäuren, Glyzerinester und Sphingolipide. Diese Fette können von CD1-restringierten T-Lymphozyten erkannt werden, die dann als Effektoren ähnliche funktionelle Eigenschaften aufweisen wie konventionelle TZellen. Das CD1b-Molekül findet sich primär beim Menschen und bindet vor allem Fette aus der Zellwand von M. tuberculosis wie Mykolsäure, Lipoarabinomannan (LAM) und Glukose-monomykolat (GMM). Anders als beim konventionellen Weg der Antigenpräsentation von Peptiden durch Genprodukte der Haupthistokompatibilitätsfamilie waren die Mitspieler der CD1-Antigenpräsentation bisher unbekannt. Uns gelang die Entdeckung von Saposinen als erste Gruppe von Helfermolekülen bei der Antigenpräsentation über CD1b. Saposine als fehlendes Bindeglied der Lipid-Präsentation durch CD1 Die wesentliche Frage, die uns zur Suche nach Helfermolekülen bei der Lipidpräsentation trieb, war, wie die biophysikalische Kluft zwischen der hydrophoben Phase der Lipidantigene, die membranorganisiert in der Zelle vorliegen, und der wässrigen Phase, in der die CD1-Proteine exponiert sind, überbrückt werden kann, um die Beladung der CD1-Tasche mit dem Lipid zu gewährleisten. Da bekannt war, dass CD1b und mykobakterielle Antigene wie LAM im Lysosom der Zelle aufeinandertreffen, wählten wir als Kandidaten für unsere Untersuchungen die Sphingolipid Aktivator Proteine (SAP oder Saposine). SAP sind am Abbau und Transport von Fetten im Lysosom beteiligt. Wir untersuchten, ob sie auch bei der Antigenpräsentation eine Rolle spielen. Hierzu transfizierten wir SAP-defiziente Fibroblasten mit CD1b, um die so generierten Zellen als antigenpräsentierende Zellen (APZ) einzusetzen. SAP-defiziente APZ waren nach Inkubation mit Lipidantigen nicht in der Lage, antigen-spezifische, CD1b-restringierte T-Zellen zu stimulieren. Durch Rekonstitution der APZ mit Saposin C und Inkubation mit Lipidantigen wurde die T-Zell-Aktivierung wiederhergestellt (Abb. 3a). Damit war die essentielle Funktion von SAPC für die Lipid-Präsentation über CD1b belegt. Darüber hinaus konnten wir den dualen Charakter von SAP-C bei der Interaktion mit Lipiden und CD1b aufklären. In Versuchen mit Liposomen erwies sich SAP-C in der Extraktion von Lipidantigen aus Membranen als überaus wirksam. Bindungsstudien mit 6308 www.mpg.de © 2004 Max-Planck-Gesellschaft Schaible, Ulrich et al. | Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der ... Tätigkeitsbericht 2004 markierten Saposinen zeigten schießlich, dass SAP-C mit CD1b in der Zelle direkt interagiert (Abb. 3b). Daraus ergibt sich eine Dreiecksbeziehung bei der Lipidantigenpräsentation aus SAP-C, Lipid und CD1b. Unserem Konzept folgend gräbt sich SAP-C in intralysosomale Membranen, destabilisiert deren Membrankomposition, exponiert dabei Lipidantigene und führt sie dem CD1b-Molekül zu, das es gleichzeitig bindet (Abb. 4). Dies zeichnet SAP-C als zentralen Angelpunkt der Lipid-Präsentation und der folgenden Aktivierung CD1b-restringierter T-Lymphozyten aus. Abb. 3a, 3b : Saposin C ist für die Antigenpräsentation von Lipiden durch DC1b essentiell. Abb. 4 : Mechanistisches Modell der Saposin-Funktion bei der Lipidantigen-Präsentation durch CD1-Moleküle. © 2004 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 3097
