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Jahrbuch 2003/2004 | Schaible, Ulrich; W inau, Florian | Neue Moleküle und W ege der Antigenpräsentation bei der Tuberkulose Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der Tuberkulose Novel helper molecules and pathways of antigen presentation in tuberculosis Schaible, Ulrich; W inau, Florian Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Berlin Korrespondierender Autor E-Mail: [email protected] Zusammenfassung Tuberkulose ist die häufigste bakterielle Infektionskrankheit w eltw eit und w ird durch den Erreger Mycobacterium tuberculosis verursacht. Schützende Immunität gegen Tuberkulose w ird durch T-Lymphozyten vermittelt, w obei neben CD4-Helfer-T-Zellen zytotoxische CD8-T-Zellen und lipid-spezifische, CD1-reaktive TLymphozyten eine w esentliche Rolle spielen. Forscher der Abteilung Immunologie des Max-Planck-Instituts für Infektionsbiologie konnten nun einen neuen Weg der Präsentation mykobakterieller Antigene als Voraussetzung für die Aktivierung von CD8-T-Zellen beschreiben. Dieser Weg nimmt seinen Ursprung von mit M. tuberculosis infizierten Makrophagen, die den programmierten Zelltod (Apoptose) sterben. Dabei geben sie apoptotische Vesikel ab, die mykobakterielle Substanzen enthalten und von dendritischen Zellen aufgenommen w erden, um nach Prozessierung der Antigene, effektiv CD8-T-Zellen zu stimulieren. Weiterhin konnte mit den Saposinen eine neue Gruppe von Helfermolekülen entdeckt w erden, die die Antigenpräsentation von Lipiden über CD1-Moleküle überhaupt erst ermöglicht. Die Saposine überbrücken dabei die biophysikalische Kluft zw ischen membrangebundenem Fett und hydrophilem Präsentationsmolekül. Lipid-spezifische T-Lymphozyten treten im Rahmen der Tuberkulose auf, da M. tuberculosis über eine w achsartige, fettreiche Zellw and verfügt. Die Erkenntnisse zur Präsentation mykobakterieller Antigene sind die Grundlage für ein besseres Verständnis der T-Zell-Aktivierung und der erfolgreichen Impfstoffentw icklung gegen Tuberkulose. Summary Tuberculosis is the most prevalent bacterial infectious disease and is caused by Mycobacterium tuberculosis. Protective immunity is mediated by T-lymphocytes including CD4 helper T cells, cytotoxic CD8 T cells as w ell as lipid-specific, CD1-restricted T-lymphocytes. Scientists from the Department of Immunology of the Max-PlanckInstitute for Infection Biology now characterized a novel presentation pathw ay for mycobacterial antigens as prerequisite for effective CD8 T cell activation. This "detour pathw ay" originates from mycobacteria-infected macrophages undergoing programmed cell death (apoptosis). During apoptosis, infected macrophages release apoptotic vesicles containing mycobacterial material. Subsequently, these vesicles are taken up by dendritic cells, w hich process the engulfed antigens for presentation to CD8 T cells. Moreover, a new group of helper molecules named saposins w as identified w hich facilitates antigen presentation of lipids through CD1- © 2004 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 1/7 Jahrbuch 2003/2004 | Schaible, Ulrich; W inau, Florian | Neue Moleküle und W ege der Antigenpräsentation bei der Tuberkulose molecules. Saposins bridge the biophysical gap betw een membrane-bound lipids and hydrophilic presentation molecules. Lipid-specific T-lymphocytes play a role in tuberculosis since M. tuberculosis disposes of a w axy, lipid-rich cell w all. Insights into fundamental aspects of presentation of mycobacterial antigens are the basis for a better understanding of T cell activation and rational vaccine design against tuberculosis. Neue Moleküle und Wege der Antigenpräsentation bei der Tuberkulose Tuberkulose stellt auch heute noch eine der bedrohlichsten Infektionskrankheiten w eltw eit dar. Ein Drittel der W eltbevölkerung ist mit dem bakteriellen Erreger Mycobacterium tuberculosis infiziert. Dies führt pro Jahr in 8-9 Millionen Fällen zur klinischen Manifestation der Tuberkulose, typischerw eise in der Lunge, von denen etw a 2 Millionen tödlich enden. Diese Daten verdeutlichen eindringlich die Bedeutung der Tuberkulose für das Gesundheitsw esen und den Bedarf für einen w irkungsvollen Impfstoff. Meist führt die Infektion mit dem Erreger jedoch nicht zur Erkrankung und der Infektionsverlauf w ird durch das körpereigene Immunsystem w irkungsvoll kontrolliert. Diese immunologische Kontrolle bew irkt aber nur die "Einkapselung" der Erreger in Granulomen; die sterile Elimination der Keime gelingt nicht. Die Infektion bleibt daher lebenslang bestehen und kann auch nach Jahren eine Erkrankung auslösen. Im Zentrum der Infektabw ehr stehen Fresszellen des angeborenen Abw ehrsystems, die Makrophagen, die zw ar einerseits durch Mykobakterien infiziert w erden, aber andererseits durch das Zytokin Interferon-g aktivierbar sind und dann intrazelluläre Bakterien abtöten oder deren Wachstum hemmen. Die zw eite Achse der Abw ehr w ird von T-Lymphozyten gebildet, die zum erw orbenen Immunsystem gehören und spezifisch mykobakterielle Antigene erkennen, die ihnen von "professionellen" antigenpräsentierenden Zellen (w ie dendritischen Zellen (DZ) und Makrophagen) angeboten w erden. Dabei spielen sog. CD4-T-Lymphozyten die entscheidende Rolle bei der T-Zell-Antw ort, obw ohl auch andere T-Zell-Populationen w esentlich zur Immunabw ehr gegen Tuberkulose beitragen. Unsere hier vorgestellen Arbeiten konzentrieren sich auf CD8-TZellen, die w ie CD4-T-Zellen Proteinantigene erkennen, sow ie auf CD1-restringierte T-Lymphozyten, die antigenspezifisch auf Lipide reagieren. Das Problem der CD8-T-Zell-Aktivierung bei der Tuberkulose Obw ohl CD8-T-Lymphozyten in erster Linie für die Virusabw ehr zuständig sind, w erden sie für die Abw ehr bestimmter Bakterien, so auch M. tuberculosis, dringend benötigt. Mykobakterien-spezifische CD8-T-Zellen können aus dem Gew ebe infizierter Patienten isoliert w erden und Experimentaltiere, denen CD8 T-Zellen fehlen, zeigen einen deutlich verringerten Schutz gegen Tuberkulose. CD8-T-Zellen differenzieren nach Antigenerkennung und folgender Aktivierung zu zytotoxischen T- Lymphozyten (ZTL), die infizierte Zielzellen durch sezernierte Proteine w ie Perforin lysieren können. Dadurch w erden intrazelluläre Bakterien freigesetzt und für direkte Attacken durch ZTL angreifbar. Weiterhin produzieren ZTL Interferon-g, das w iederum infizierte Phagozyten zur potenten Keimabtötung mittels reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffmetabolite aktiviert. Die antigenspezifische Aktivierung der CD8-T-Zellen gab lange Zeit Rätsel auf. Unsere Untersuchungen zeigten, dass Mykobakterien nach Eintritt in den infizierten Makrophagen in einem abgeschlossenen Kompartiment, dem frühen Phagosom, verbleiben und daher zur Aktivierung von CD8-T-Zellen ungeeignet sind. Experimente mit markierten Erregern ergaben, dass das Mykobakterien-Phagosom nahezu hermetisch gegenüber dem Zytoplasma abgeriegelt ist. Da aber Antigene, die von CD8-T-Zellen erkannt w erden, normalerw eise im Zytoplasma vorliegen müssen, w arf dies die Frage auf, w ie die mykobakteriellen Antigene an ihren Bestimmungsort gelangen, um CD8-T-Zellen zu stimulieren. © 2004 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 2/7 Jahrbuch 2003/2004 | Schaible, Ulrich; W inau, Florian | Neue Moleküle und W ege der Antigenpräsentation bei der Tuberkulose Das Phänomen, dass Antigene von der Zelle, in der sie primär anfallen, nicht präsentiert w erden, sondern erst abgegeben und von einer zw eiten Zelle, meist einer DZ, aufgenommen und präsentiert w erden müssen, ist als "Cross-priming" bekannt. Aufzuklären, ob und ggf. über w elchen Mechanismus "Cross-priming" bei Tuberkulose stattfindet, w ar das nächste Ziel unserer Experimente. Apoptotische Vesikel transportieren mykobakterielle Antigene zu DZ Unsere In-vitro-Versuche zeigten, dass die Infektion mit M. tuberculosis in Makrophagen einen programmierten Zelltod, die "Apoptose" auslöst. Dabei handelt es sich um den geordneten Prozess des Sterbens einzelner Zellen, der physiologisch in jedem Organismus die Zellzahl, trotz gleichzeitiger Neubildung von Zellen, konstant hält. Die herrschende Meinung ging bisher von einem nachteiligen Effekt der infektionsinduzierten Apoptose aus, da mit dem Makrophagen ein Hauptakteur der Abw ehr beseitigt w ird. W ir konnten zeigen, dass die infizierte Zelle w ährend der Apoptose Vesikel abschnürt (Abb. 1a), die von umliegenden DZ aufgenommen w erden. Genauere Untersuchungen der apoptotischen Vesikel (Abb. 1b) ergaben, dass sie zahlreiche dominante mykobakterielle Antigene w ie z.B. das 19kDa-Lipoprotein und das sog. Antigen85 enthalten. Die von den DZ aufgenommenen apoptotischen Vesikel aktivierten mykobakterien-reaktive CD8-T-Zell. Dabei stand eine lysosomale Prozessierung der Vesikel in den DZ im Vordergrund, da die Behandlung mit Lysosomen-Inhibitoren w ie Bafilomycin die T-Zell-Aktivierung unterband, w ohingegen Proteasomen-Inhibitoren einen zu vernachlässigenden Effekt auf die T-Zell-Aktivierung hatten. W urde die Apoptose in den primär infizierten Makrophagen durch Zugabe eines globalen Kaspase-Inhibitors gehemmt, so w urden der Antigentransfer und die CD8-T-Zell-Aktivierung unterbunden. Da die mykobakteriellen Antigene von der Sackgasse im Phagosom des infizierten Makrophagen, über die apoptotischen Vesikel hin zur DZ mit erfolgreicher Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierung einen Umw eg nehmen müssen, um überhaupt CD8-TZellen stimulieren zu können, bezeichnen w ir diesen neuen Weg der Antigenpräsentation als "Detour pathw ay" (Abb. 1c). © 2004 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 3/7 Jahrbuch 2003/2004 | Schaible, Ulrich; W inau, Florian | Neue Moleküle und W ege der Antigenpräsentation bei der Tuberkulose Myk oba k te rie n induzie re n Apoptose in Ma k ropha ge n. © Detour pathway in v iv o Um zu untersuchen, ob "Cross-priming" über apoptotische Vesikel nicht nur ein lokales Geschehen der Antigenverteilung darstellt, w ie es im peripheren entzündeten Gew ebe, in dem gehäuft Zellen sterben, stattfindet, sondern tatsächlich einen genuin immunologischen Prozess repräsentiert, der das Immunsystem miteinschließt, dehnten w ir unsere Experimente auf ein In-vivo-Modell aus. Dabei transferierten w ir eine definierte Population von CD8-T-Zellen in Empfängermäuse und immunisierten diese Tiere mit apoptotischen Vesikeln von mykobakterien-infizierten Makrophagen. Bei den CD8-T-Zellen handelte es sich um Lymphozyten mit Spezifität für Ovalbumin (OVA). W ir infizierten Makrophagen für die Vesikelpräparation mit rekombinanten Mykobakterien, die OVA als Surrogat-Antigen exprimieren. In diesem definierten System ließ sich nachw eisen, dass apoptotische Vesikel von infizierten Zellen nach subkutaner Immunisierung in der Lage sind, CD8-T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten zu aktivieren (Abb. 2a). Nach subkutaner Gabe farbig-markierter Vesikel w aren die apoptotischen Vesikel nur in den DZ der drainierenden Lymphknoten w iederzufinden. W ir schließen daraus, dass die DZVesikel in der Peripherie aufnehmen und anschließend in den drainierenden Lymphknoten transportieren (Abb. 2b). Diese Ergebnisse zeigen, dass der "Detour pathw ay" auch in vivo funktionsfähig ist und das klassische immunologische "Cross-priming" umfasst. © 2004 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 4/7 Jahrbuch 2003/2004 | Schaible, Ulrich; W inau, Florian | Neue Moleküle und W ege der Antigenpräsentation bei der Tuberkulose © Apoptotische Ve sik e l a k tivie re n C D8 T-Ze lle n in vivo. © Apoptotische Vesikel und Impfung gegen Tuberkulose Vakzinierung von Mäusen mit apoptotischen Vesikeln von infizierten Zellen und anschließende AerosolInfektion mit M. tuberculosis bew irkte einen Impfschutz vergleichbar dem einer BCG-Immunisierung. Obw ohl der BCG-Impfstoff die w ichtigsten Tuberkuloseformen nicht verhindern kann, stellt er bis heute den Goldstandard der Vakzinierung gegen Tuberkulose im Tiermodell dar. Damit ist der "Detour pathw ay" nicht nur biologisch relevant, sondern stellt auch einen w eiteren Schritt hin zur rationalen Impfstoffentw icklung dar. Prima vista scheint die Immunogenität der apoptotischen Vesikel dem Konzept gegenläufig, dass apoptotische Vorgänge ohne Entzündung und ohne Aktivierung des Immunsystems ablaufen, da sonst der Organismus © 2004 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 5/7 Jahrbuch 2003/2004 | Schaible, Ulrich; W inau, Florian | Neue Moleküle und W ege der Antigenpräsentation bei der Tuberkulose permanent auf endogenen Zelltod reagieren müsste und Apoptose damit eng mit Autoimmunität verbunden w äre. W ir müssen bei apoptotischen Vesikeln, die von infizierten Zellen abstammen, jedoch berücksichtigen, dass diese Vesikel per se nicht-entzündlich sind. Andererseits sind sie aber mit einer Vielzahl mykobakterieller Bestandteile ausgerüstet, die nicht nur antigene, sondern auch inflammatorische und adjuvante Eigenschaften vermitteln. Damit w erden sie für das Immunsystem als Träger von Fremdmaterialien erkennbar. So konnten w ir zeigen, dass apoptotische Vesikel von mykobakterien-infizierten Makrophagen W irtszellen über die Bindung von Toll-like Rezeptoren (TLR) stimulieren. TLR w erden u.a. von DZ exprimiert und dienen der Erkennung konservierter bakterieller Muster. TLR-Bindung induziert Reifung und potente Antigenpräsentation von DZ. W ir sehen diese apoptotischen Vesikel als Träger von Antigenen, antigen-präsentierenden Molekülen und Adjuvanzien, und sprechen ihnen daher eine autonome immunologische Entität zu. Lipid-spezifische T-Zellen Die CD1-Familie umfasst ungew öhnliche antigen-präsentierende Moleküle, die von DZ exprimiert w erden. Die CD1-Moleküle verfügen über eine antigen-bindende Tasche. Im Gegensatz zur peptidbindenden Grube der w ichtigsten antigen-präsentierenden Moleküle der Haupthistokompatibilitätsfamilie dient die CD1-Tasche jedoch der Bindung von Lipiden. Die verschiedenen Mitglieder der CD1-Familie binden unterschiedliche Liganden, u.a. Fettsäuren, Glyzerinester und Sphingolipide. Diese Fette können von CD1-restringierten TLymphozyten erkannt w erden, die dann als Effektoren ähnliche funktionelle Eigenschaften aufw eisen w ie konventionelle T-Zellen. Das CD1b-Molekül findet sich primär beim Menschen und bindet vor allem Fette aus der Zellw and von M. tuberculosis w ie Mykolsäure, Lipoarabinomannan (LAM) und Glukose-monomykolat (GMM). Anders als beim konventionellen Weg der Antigenpräsentation von Peptiden durch Genprodukte der Haupthistokompatibilitätsfamilie w aren die Mitspieler der CD1-Antigenpräsentation bisher unbekannt. Uns gelang die Entdeckung von Saposinen als erste Gruppe von Helfermolekülen bei der Antigenpräsentation über CD1b. Saposine als fehlendes Bindeglied der Lipid-Präsentation durch CD1 Die w esentliche Frage, die uns zur Suche nach Helfermolekülen bei der Lipidpräsentation trieb, w ar, w ie die biophysikalische Kluft zw ischen der hydrophoben Phase der Lipidantigene, die membranorganisiert in der Zelle vorliegen, und der w ässrigen Phase, in der die CD1-Proteine exponiert sind, überbrückt w erden kann, um die Beladung der CD1-Tasche mit dem Lipid zu gew ährleisten. Da bekannt w ar, dass CD1b und mykobakterielle Antigene w ie LAM im Lysosom der Zelle aufeinandertreffen, w ählten w ir als Kandidaten für unsere Untersuchungen die Sphingolipid Aktivator Proteine (SAP oder Saposine). SAP sind am Abbau und Transport von Fetten im Lysosom beteiligt. W ir untersuchten, ob sie auch bei der Antigenpräsentation eine Rolle spielen. Hierzu transfizierten w ir SAP-defiziente Fibroblasten mit CD1b, um die so generierten Zellen als antigenpräsentierende Zellen (APZ) einzusetzen. SAP-defiziente APZ w aren nach Inkubation mit Lipidantigen nicht in der Lage, antigen-spezifische, CD1b-restringierte T-Zellen zu stimulieren. Durch Rekonstitution der APZ mit Saposin C und Inkubation mit Lipidantigen w urde die T-Zell-Aktivierung w iederhergestellt (Abb. 3a). Damit w ar die essentielle Funktion von SAP-C für die Lipid-Präsentation über CD1b belegt. Darüber hinaus konnten w ir den dualen Charakter von SAP-C bei der Interaktion mit Lipiden und CD1b aufklären. In Versuchen mit Liposomen erw ies sich SAP-C in der Extraktion von Lipidantigen aus Membranen als überaus w irksam. Bindungsstudien mit markierten Saposinen zeigten schießlich, dass SAP-C mit CD1b in der Zelle direkt interagiert (Abb. 3b). Daraus ergibt sich eine Dreiecksbeziehung bei der Lipidantigenpräsentation aus SAP-C, Lipid und CD1b. Unserem Konzept folgend gräbt sich SAP-C in intralysosomale Membranen, destabilisiert deren Membrankomposition, exponiert dabei Lipidantigene und führt sie dem CD1b-Molekül zu, das es gleichzeitig © 2004 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 6/7 Jahrbuch 2003/2004 | Schaible, Ulrich; W inau, Florian | Neue Moleküle und W ege der Antigenpräsentation bei der Tuberkulose bindet (Abb. 4). Dies zeichnet SAP-C als zentralen Angelpunkt der Lipid-Präsentation und der folgenden Aktivierung CD1b-restringierter T-Lymphozyten aus. Sa posin C ist für die Antige nprä se nta tion von Lipide n durch DC 1b e sse ntie ll. © Me cha nistische s Mode ll de r Sa posin-Funk tion be i de r Lipida ntige n-P rä se nta tion durch C D1-Mole k üle . © © 2004 Max-Planck-Gesellschaft w w w .mpg.de 7/7
