Vesikulärer Transport
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Vorlesung Zellbiologie – KM 2 - 2011 Vesikulärer Transport Prof. Roland Lill Zytobiologie Endomembranen in eukaryotischen Zellen Wie entstehen sie ??? Pulse-chase Radiomarkierung + Elektronenmikroskopische Autoradiographie (G. Palade) • Radiomarkierung mit 3H Leucin für 3 min • EM und Autoradiographie A • „Chase“ mit kaltem Leucin 7 min Inkubation B 37 min Inkubation C 117 min Inkubation D B A C D Die Idee des vesikulären Transports Ein über Vesikel verbundenes Endomembransystem • • • • • • • Endoplasmatisches Retikulum Golgi Apparat Sekretorische Vesikel Plasmamembran Lysosomen Endosomen NICHT VERBUNDEN: – Mitochondrien – Peroxisomen – Zellkern Die Idee des vesikulären Transports Ein über Vesikel verbundenes Endomembransystem • • • • • • • Endoplasmatisches Retikulum Golgi Apparat Sekretorische Vesikel Plasmamembran Lysosomen Endosomen NICHT VERBUNDEN: – Mitochondrien – Peroxisomen – Zellkern Anterograder und retrograder Transport Vesikulärer Transport - Wie funktioniert das? • Prinzip des Vesikeltransports – – – – 1. Vesicle budding (Fission, Knospen) 2. Vesicle Transport (Zytoskelett Tubulin und Aktin) 3. Fusion mit Zielmembran 4. Membranorientierung (Asymmetrie, z.B Zuckerketten) -Z 2. -Z 1. 3. -Z -Z Plasmamembran (Zucker extrazellulär) Vesikulärer Transport - Wie kann man das verfolgen? Live cell imaging mit Fluoreszenzmikroskopie v17-04-Golgi_sorting_a.avi v17-04-Golgi_sorting_b.avi Vesikulärer Transport – Eine einfache Zusammenfassung Mcb0502n.Secretion.mpg Wie funktioniert der Vesikeltransport ??? • Wie testen wir den Prozess überhaupt? • Welche Moleküle nehmen an dem Prozess teil? • Was ist der molekulare Mechanismus, die Triebkraft? • Wie erklärt sich die Spezifität des Transports (Richtung, Cargo-Auswahl, Genauigkeit)? Klassischer Test zum Studium der Vesikelfusion Jim Rothman, ab 1988 Mutated in GlcNAc transferase VSV infected Wild-type in GlcNAc transferase not infected • NSF, NEM-sensitive factor (ATPase) • SNAP, soluble NSF attachment proteins () • SNARE, SNAP receptors (membrane proteins) Das V- und T-SNARE Konzept oder Wie wird der Vesikeltransport spezifisch? V-SNARE T-SNARE Vesikel Target Struktur eines SNARE Komplexes • • • Coiled-coil Struktur Verdrillt Membran-verankert • Jedes Kompartiment hat eigenes TSNARE (drei coiled-coils) • Jedes Vesikel bekommt spezifisches V-SNARE mit • Nur die korrekten V/T-Paare leiten Fusion ein (Vesikelfusionsassay) SNAREs als Ziele der Botulinum- and Tetanustoxine • • • • • Aus Clostridien (Bakterien) Extrem giftig (1 µg †) Hoch spezifisch Metalloproteasen Neurologische Symptome Botox als “Faltenlöser” Ohne Botox (keine Acetylcholin Ausschüttung, Doppelsehen, Atemstillstand) Mit Botox Die Rab Proteine, ein zweiter Garant für die Spezifität der Vesikelfusion • GTPase Zyklus (auch bei EF der Translation, Ras, SRP, SRP-Rez. etc.) • Lipidanker Viele verschiedene Rab Proteine für verschiedene Kompartimente Modell: Die drei Schritte der Vesikelfusion 3) Fusion V/T-SNARES V-SNARES 2) Docking (Rab) 1) Priming T- Wie erfolgt das vesicle budding ??? oder Vor dem Weggehen einen Mantel anziehen • Verschiedene coats für verschiedene Membranen Drei Arten der Vesikelbildung (Fission or budding of vesicles) • • • Clathrin coat (heavy chain and light chain) COP I coat (Coatamer, ARF1) COP II coat (Sec13/31, Sec23/24) Endocytosis, TGN-Lysos. Intra-Golgi, Endosomes ER - Golgi Bauprinzip des Clathrin Coats Hexagonales Fass: 36 Triskelions Triskelion Kombination von Pentagons und Hexagons Bauprinzip der Clathrin Coats Quick-freeze deep etching Methode der EM (J. Heuser) Coated pit (Stachelsaumgrübchen) Coated vesicle (Stachelsaumvesikel) Self assembly of clathrin Film: v17-04-clathrin.avi Starke Ähnlichkeiten zwischen Clathrin und COP II Coats Verschiedene COP II Strukturen im EM Vergleich: COP II Clathrin coat Clathrin-abhängiges Budding (Knospen) Adapterkomplexe arbeiten an unterschiedlichen Zellorten AP-1: TGN Endosome AP-2: Endocytosis (PM Endosome) AP-3: TGN or Endosome Lysosome AP-4: Lysosome GGAs: TGN Endosome Aufbau der Adapterkomplexe Cargo proteins NPXY YXXF (F : hydrophobic residue) Di-leucine Rolle des Dynamins beim budding • • Große Proteinfamilie Mitglieder beteiligt an Fissionsprozessen (Vesikel, Peroxisomen, Mitochondrien, Chloroplasten, Bakterien, ...) • • GTPase Polymerisiert zu Aggregaten Immun-EM Rolle des Dynamins beim budding • • Große Proteinfamilie Mitglieder beteiligt an Fissionsprozessen (Vesikel, Peroxisomen, Mitochondrien, Chloroplasten, Bakterien, ...) • • GTPase Polymerisiert zu Aggregaten Wie funktioniert das Dynamin? Pinchase Immun-EM Rolle des Dynamins beim budding • • Immun-EM Große Proteinfamilie Mitglieder beteiligt an Fissionsprozessen (Vesikel, Peroxisomen, Mitochondrien, Chloroplasten, Bakterien, ...) • • GTPase Polymerisiert zu Aggregaten Wie funktioniert das Dynamin? Pinchase Poppase Prinzipien des Vesicle buddings Durch coat-Bindung wird Membrankrümmung eingeführt z.B. Sar1 oder Arf Coat Coat Coat GTP Adapter Coat GTP Adapter SNAREs Coat SNAREs GEF SNAREs GDP Coat GTP Adapter Membran Lipid anchors Myristoyl, farnesyl, palmitoyl ... Cargo Signal für Bindung: z.B. Y-X-X-Y Cargo Cargo Budding Rapid uncoating (Hsp70) Welche Mechanismen garantieren den spezifischen Transport von Proteinen??? • Sortierungssignale in Membranproteinen – spezifisch für jeweiliges Kompartiment – oft nur 1-2 Aminosäurereste – oft noch unbekannt Beispiel: Sortierungssignale für COPI Vesikel: - Di-Lys motif KKXX - Di-Phe, di Lys motif (-FFXXKKXX) Rückführung von löslichen ER Proteinen durch KDEL-Rezeptor • KDEL = K = Lys D = Asp E = Glu L = Leu Prä KDEL Lösliches ER Protein Zusammenfassung des vesikulären Transports • Was haben wir hierzu gelernt ? Exzellenter Review mit guten Bildern:
