Nachweis, Vorkommen und Charakterisierung autoreaktiver
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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie und der Klinik für Kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover _____________________________________________________________________ Nachweis, Vorkommen und Charakterisierung autoreaktiver Antikörper bei neoplastischen Erkrankungen des Hundes INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Karen Rösner aus Nürtingen Hannover 2003 Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth Apl. Prof. Dr. med. vet. R. Mischke 1. Gutachter: PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth Apl. Prof. Dr. med. vet. R. Mischke 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. F.-J. Kaup Tag der mündlichen Prüfung: 28. November 2003 Gefördert durch ein Promotionsstipendium der H. WILHELM SCHAUMANN STIFTUNG Meinen Eltern in großer Dankbarkeit Inhaltsverzeichnis VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN UND TERMINI TECHNICI 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG....................................................................13 2 LITERATURÜBERSICHT...................................................................................15 2.1 Autoreaktive Antikörper und Autoaggression beim Menschen..............................15 2.2 Klinische Relevanz von antinukleären Antikörpern beim Hund ............................18 2.3 Nachweisverfahren antinukleärer und antizytoplasmatischer Antikörper ...........19 2.4 Autoreaktive Antikörper und neoplastische Erkrankungen des Menschen ..........23 2.4.1 Identifikation und klinische Relevanz einzelner Autoantikörper...............................24 2.4.1.1 Antinukleäre Antikörper .....................................................................................24 2.4.1.2 Autoantikörper gegen Onkoproteine...................................................................28 2.4.1.3 Anti-p53-Autoantikörper ....................................................................................30 2.4.1.4 Autoantikörper gegen Hitzeschockproteine........................................................31 2.4.1.5 Autoreaktive Antikörper gegen onkoneuronale Antigene ..................................31 2.4.2 Hypothesen zur pathophysiologischen Bedeutung autoreaktiver Antikörper............33 2.5 3 Autoreaktive Antikörper und neoplastische Erkrankungen des Hundes ..............35 MATERIAL UND METHODEN ...........................................................................36 3.1 Geräte und Materialien ...............................................................................................36 3.1.1 Geräte .........................................................................................................................36 3.1.2 Verbrauchsmaterialien ...............................................................................................37 3.1.3 Reagenzien .................................................................................................................38 3.1.4 Antikörper ..................................................................................................................40 3.1.4.1 Nachweisantikörper ............................................................................................40 3.1.4.2 Monoklonaler Antikörper gegen bovine Zelloberflächenstrukturen ..................41 3.1.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ..........................................................................41 3.1.5.1 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung...................................................................41 3.1.5.2 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, doppelt konzentriert ................................41 3.1.5.3 Lösungen für den fluoreszenzserologischen Nachweis autoreaktiver Antikörper . .............................................................................................................................41 3.1.5.4 Lösungen und Puffer für den indirekten Immunfluoreszenztest mit Hilfe der . .Durchflusszytometrie .........................................................................................41 3.1.5.5 Wasch- und Verdünnungspuffer für die indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer) .......................................................................................................42 3.1.5.6 Lösungen für die Durchflusszytometrie .............................................................42 3.1.5.7 Lösung zur Zählung von Leukozyten .................................................................43 3.1.5.8 Lösung für die Vitalitätsbestimmung und Zählung von HEp-2-Zellen..............43 3.1.5.9 Zellkulturmedien und Zusätze ............................................................................43 3.1.5.10 Puffer für die Immunglobulin G-Aufreinigung...............................................44 3.1.5.11 Puffer und Lösungen für die Gelelektrophorese .............................................44 3.1.5.12 Lösungen für den Methyl-Thiazol-Tetrazolium-Test .....................................47 3.1.5.13 Phorbol-Myristat-Acetat .................................................................................47 3.1.6 HEp-2-Western-Blot Testkit ......................................................................................47 3.1.7 Zelllinien ....................................................................................................................47 3.2 Tiere ..............................................................................................................................48 3.3 Methoden ......................................................................................................................52 3.3.1 Blutentnahme .............................................................................................................52 3.3.2 Serumgewinnung........................................................................................................52 3.3.3 Gewinnung vitaler Zellen aus dem peripheren Blut ..................................................52 3.3.3.1 Zellseparation über einen diskontinuierlichen Dichtegradienten .......................52 3.3.3.2 Erythrozytenlyse .................................................................................................53 3.3.4 Zellzählung caniner Leukozyten 53 3.3.5 Zellzählung vitaler HEp-2- und DH82-Zellen 53 3.3.6 Zellzählung von fixierten HEp-2-Zellen und fixierten caninen Leukämiezellen 53 3.3.7 Kultivierung und Trypsinierung von HEp-2- und DH82-Zellen 54 3.3.8 Fixation von Zellen 54 3.3.9 Indirekte Membranimmunfluoreszenz mit fixierten HEp-2-Zellen 54 3.3.10 Fluoreszenzserologischer mikroskopischer Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA)...................................................................................................................55 3.3.10.1 Vorbereiten der Objektträger ..........................................................................55 3.3.10.2 Versuchsdurchführung ....................................................................................56 3.3.10.3 Beurteilung......................................................................................................56 3.3.10.4 Versuchsansatz zum Einfluss des Untersuchers auf die mikroskopische Auswertung und zur Reproduzierbarkeit der Methode...................................57 3.3.11 Durchflusszytometrie .............................................................................................57 3.3.11.1 Der intrazelluläre Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) ..............................................................................................................58 3.3.11.2 Besonderheiten des durchflusszytometrischen Verfahrens (IIFD) zur Differenzierung der Immunglobulinisotypen IgG und IgM in autoantikörperpositiven Seren.........................................................................62 3.3.11.3 Besonderheiten des durchflusszytometrischen Verfahrens (IIFD) mit caninen Leukämiezellen als Substrat............................................................................62 3.3.11.4 Bestimmung der Zellvitalität mit Hilfe des Durchflusszytometers.................63 3.3.11.5 Durchflusszytometrische Auswertung der Lymphozytenstimulation: Bestimmung der Zahl vitaler Zellen über die Referenzzellmethode...............63 3.3.12 HEp-2-Western-Blot-Analysen ..............................................................................66 3.3.13 Zytotoxizitätsmessungen ........................................................................................68 3.3.14 Methyl-Thiazol-Tetrazolium-Test ..........................................................................68 3.3.14.1 Methyl-Thiazol-Tetrazolim-Test mit HEp-2- und DH82-Zellen unter Zugabe von Seren tumorerkrankter Hunde und gesunder Hunde zur Überprüfung eines zytotoxischen Effektes .............................................................................. ........................................................................................................................ 69 3.3.14.2 Methyl-Thiazol-Tetrazolium-Test und antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) .....................................................................................70 3.3.15 Lymphozytenstimulation ........................................................................................70 3.3.15.1 Durchführung der Lymphozytenproliferation zur Überprüfung eines zytotoxischen Effektes autoantikörperpositiver caniner Seren .......................71 3.3.16 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.......................................72 3.3.17 Immunglobulin G-Aufreinigung und Ultrafiltration ..............................................73 3.3.18 Protein-Bestimmung mit Hilfe des Bicinchoninsäure-Assays ...............................73 3.3.19 Datenverarbeitung und statistische Verfahren........................................................74 4 ERGEBNISSE ....................................................................................................75 4.1 Fluoreszenserologischer Nachweis antinukleärer Antikörper mit dem FARA .....75 4.1.1 Reproduzierbarkeit und Präzision des mikroskopischen Verfahrens zum Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA)..............................................................................77 4.2 Intrazellulärer Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) und HEp-2-Zellen als Substrat.....................................................................................79 4.2.1 Modifikation und Evaluierung der Methode..............................................................79 4.2.2 Durchflusszytometrische Untersuchung der Seren tumorerkrankter Hunde..............84 4.2.2.1 Inzidenz autoreaktiver Antikörper und Titerverteilung der positiven Seren ......84 4.2.2.2 Vergleich der Ergebnisse aus dem durchflusszytometrischen (IIFD) und fluoreszenzserologischen mikroskopischen Verfahren (FARA) zum Nachweis autoreaktiver Antikörper.....................................................................................85 4.2.2.3 Inzidenz positiver Autoantikörperbefunde bei den einzelnen Tumoren.............87 4.2.2.4 Einfluss des Geschlechtes der Tumorpatienten auf den Autoantikörperbefund.91 4.2.2.5 Einfluss des Alters der Tumorpatienten auf den Autoantikörperbefund ............92 4.2.2.6 Einfluss der Rassen der Tumorpatienten auf den Autoantikörperbefund...........93 4.2.2.7 Zusammenstellung der Daten zu den Seren, die ausschließlich antinukleäre Antikörper enthielten ..........................................................................................94 4.2.2.8 Identifikation von Seren mit antinukleären Antikörpern mittels durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) ..........................................................94 4.3 Differenzierung der Isotypen IgG und IgM in autoantikörperpositiven Seren.....96 4.4 Intrazellulärer Immunfluoreszenztest (IIFD) mit caninen Tumorzellen als Substrat .......................................................................................................................................97 4.4.1 Reaktivität caniner Seren mit allogenen Leukämie-Zellen........................................97 4.5 Spezifitäten der in caninen Seren nachgewiesenen Autoantikörper nach Immunoblot-Analysen mit HEp-2-Zellantigenen.....................................................100 4.5.1 Reaktivität caniner Seren mit HEp-2-Antigenen .....................................................100 4.5.2 Vergleich von kern-, zytoplasma- und gemischtpositiven Seren caniner Tumorpatienten ........................................................................................................101 4.5.3 Vergleich der Tumorpatienten mit den gesunden Kontrolltieren und der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen .......................................................102 4.5.4 Vergleich der einzelnen Tumoren............................................................................107 4.6 Funktionsanalysen zur pathophysiologischen Bedeutung der in caninen Seren nachgewiesenen Autoantikörper................................................................................110 4.6.1 Prüfung auf einen zytotoxischen Effekt...................................................................110 4.6.2 Prüfung auf antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität ........................................112 4.6.3 Prüfung auf einen zytotoxischen Effekt mit aufgereinigten Immunglobulin GFraktionen ................................................................................................................112 5 5.1 5.2 DISKUSSION ................................................................................................... 114 Methodische Ansätze .................................................................................................114 Inzidenz und Charakteristika autoreaktiver Antikörper bei den Tumorerkrankungen des Hundes..............................................................................119 5.3 6 Funktionsanalysen zum zytotoxischen Effekt autoantikörperpositiver Seren ....126 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................... 129 7 SUMMARY .......................................................................................................131 8 LITERATURVERZEICHNIS..............................................................................133 9 TABELLARISCHER ANHANG.........................................................................168 ERKLÄRUNG Verzeichnis der Abkürzungen und Termini technici AA/BA AFP α °C ADCC ALL ANA ANNA APS Aqua dest. Aqua tridest. ATCC BCA BSA bzw. CAR CD CEA CENP CLL CLP ConA d.h. DH82 DMSO DNA dsDNA EIA ELISA ENA FACScan® FARA Fas Acrylamid/Bisacrylamid Alpha-Fetoprotein anti Grad Celsius antibody dependent cellular cytotoxicity (Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität) akute lymphatische Leukämie antinukleäre Antikörper antineuronale nukleäre Antikörper Ammoniumpersulfat Aqua destillata (destilliertes Wasser) Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) American Type Culture Collection (Amerikanische Zellkultur Sammlung) bicinchoninic acid (Bicinchoninsäure) bovines Serum Albumin beziehungsweise carcinoma-associated retinopathy cluster of differentiation (System zur Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene) carcinoembryonic antigen (karzino-embryonales Antigen) centromeric protein (Zentromerprotein) chronische lymphatische Leukämie cytoplasmic linker protein Concanavalin A das heisst Progenitorzellen aus dem Knochenmark eines Hundes, der an maligner Histiozytose erkrankt war (Zelllinie) Dimethylsulfoxid Deoxyribonucleic acid double-stranded DNA (doppelsträngige DNA) enzyme-immunoassay enzyme-linked immunosorbant assay extractable nuclear antigens (extrahierbare Kernantigene: nichtHiston Proteine: Sm, SS-A/Ro, SS-B/La, RNP, Scl-70) fluorescence activated cell scanner (Fluoreszenz-aktiviertes Zellanalysegerät, Durchflusszytometer der Firma Becton Dickinson) Fluoreszenzserologischer mikroskopischer Nachweis autoreaktiver Antikörper Fibroblasten assoziiert Fc Fc- Rezeptor FCS FITC FL1 FL2 FL3 FSC HCC1 Hd HeLa HEp-2 HER-2 HIV H+L Hsp I10F+/Ig IgA IgG IgM IIFD Ka kDa Koc LE-Zellen mal. mAk Ma Max MCTD MDCK MHC MIF Min Fragment cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxyterminales Fragment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung) Rezeptor für den Fc-Teil eines Antikörpers fetal calf serum (fetales Kälberserum) Fluoreszeinisothiocyanat Fluoreszenzintensität (Grünfluoreszenz, Emissionsspektrum bei 530 ± 15 nm) Fluoreszenzintensität (Orangefluoreszenz, Emissionsspektrum bei 585 ± 21 nm) Fluoreszenzintensität (Rotfluoreszenz, Emissionsspektrum bei > 650 nm) forward scatter (Vorwärtsstreulicht) hepatocellular carcinoma antigen 1 Hund Henriette Lacks (Zelllinie aus dem Zervixkarzinom einer Frau Henriette Lacks gezüchtet) humanes (epitheliales) laryngeales Karzinom (Zelllinie) human epidermal growth factor receptor 2 Humanes Immundefizienz Virus heavy and light chain (schwere und leichte Kette) heat shock protein (Hitzeschock-Protein) Iscove-Zellkulturmedium mit 10% FCS und mit (+) oder ohne (-) Antibiotikazusatz (Penicillin/Streptomycin) Immunglobulin Immunglobulin A Immunglobulin G Immunglobulin M Intrazellulärer Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie Kaninchen kilo Dalton KH homology protein overexpressed in cancer Lupus-erythematodes-Zellen maligne/s monoklonale(r) Antikörper Maus Maximalwert mixed connective tissue disease Madin-Darby Canine Kidney (Zelllinie) Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) Membranimmunfluoreszenz Minimalwert MNC MW MWCO M2 NOR neg. Nr. OD od. o.g. PAGE PBS PCA PCNA PJ PMA PM-Scl pos. R10F+/- RNA m-RNA RNP RRM-KH RT s s. s.o. s.u. Scl-70 SDS-PAGE SEA SEREX SLE Sm sn-RNP sog. mononuclear cells (mononukleäre Zellen, v.a. Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen) Mittelwert molecular weight cut off mitochondriale Antigene (E2 und Protein X des PyruvatDehydrogenase-Komplexes nucleolus organizer region negativ Nummer optische Dichte oder oben genannt(e/n) Polyacrylamid-Gelelektrophorese phospate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) (2 x PBS = doppelt konzentriert) Purkinje-cell antigen (Purkinje-Zell-Antigen) proliferating cell nuclear antigen Propidiumjodid Phorbol-Myristat-Acetat Polymyositis-Scleroderma-Antigen positiv RPMI 1640-Zellkulturmedium mit L-Glutamin, HEPES-Puffer, NaHCO3, 10% FCS, mit (+) und ohne (-) Antibiotikazusatz (Penicillin/Streptomycin) Ribonucleic acid messenger-RNA ribonucleoproteins (Ribonukleoproteine) RNA recognition motif-hnRNP K homology Raumtemperatur Standardabweichung siehe siehe oben siehe unten Scleroderma-Antigen 70 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Staphylococcus aureus Enterotoxin A serological analysis of recombinant cDNA expression libraries of human tumours with autologous serum systemischer Lupus erythematodes Smith-Antigen small nuclear ribonucleoprotein (kleine nukleäre Ribonukleoproteine) sogenannt(e/en) SS-A/Ro SS-B/La SSC ssDNA TNF-α UL u.a. u. VGCC VK WinMDI® xg z.B. Zg Sjøgren`s Syndrom Antigen A Sjøgren`s Syndrom Antigen B side scatter (Seitwärtsstreulicht) single-stranded DNA (einzelsträngige DNA) Tumornekrosefaktor-α undifferenzierte Leukämie unter anderem und voltage gated calcium channel Variationskoeffizient Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²) zum Beispiel Ziege Einleitung und Zielsetzung 1 13 Einleitung und Zielsetzung Die Onkologie hat in der Veterinärmedizin während der letzten Jahre durch das stete Fortschreiten der Therapie- und Diagnostikmöglichkeiten und der zunehmenden Lebenserwartung der in der Obhut des Menschen lebenden Haustiere – insbesondere bei dem Hund – an großer Bedeutung gewonnen. Aufgrund der Tatsache, dass die initialen Stadien einer Tumorerkrankung zumeist mit wenig diagnostisch verwertbaren Symptomen einhergehen, hinsichtlich des Therapieerfolges ein frühstmöglicher Behandlungszeitpunkt jedoch entscheidend ist, erscheint es unerlässlich, zuverlässige Tumorindikatoren zu identifizieren, die insbesondere im Frühstadium der Erkrankung zu einer schnellen Diagnosefindung beitragen können. Hierzu bietet sich eine auf serologischen Parametern basierende Tumordiagnostik an, die sich beim Hund bis dato vornehmlich auf die Identifikation von Paraproteinen wie Hormonen und Enzymen sowie T-Zell-assoziierten Antigenen wie das Alpha-Fetoprotein (AFP) oder karzino-embryonale Antigen (CEA) konzentrierte (LOWSETH et al. 1991, YAMADA et al. 1999, GOBELLO 2002, LECHOWSKI et al. 2002). Beim Menschen wendete sich die Aufmerksamkeit hinsichtlich der Identifikation von Tumormarkern in den letzten Jahren zunehmend der humoralen Immunantwort zu. Es zeigte sich, dass autoreaktive Antikörper, die sich gegen nukleäre, zytoplasmatische aber auch Zelloberflächenstrukturen richten, bei einer Vielzahl von Tumoren – vornehmlich solchen hämatopoetischen und epithelialen Ursprungs – anzutreffen sind und dabei nur selten von einer klinisch manifesten Autoimmunerkrankung begleitet werden (LIVINGSTON et al. 2000, ABU-SHAKRA et al. 2001, REEVES 2001). Dieses Phänomen beschäftigt in gleicher Weise die klinische als auch grundlagenorientierte Forschung. Es wird vielfach postuliert, dass die humorale Immunantwort durch im Zuge der neoplastischen Transformation überexprimierte oder mutierte Proteine, die ihrerseits wichtige Zellfunktionen innehaben, stimuliert wird (NAFTGZER et al. 1996, OLD u. CHEN 1998, TORCHILIN et al. 2001, TOMKIEL et al. 2002). Die Identifikation der mit den Autoantikörpern assoziierten Antigene ermöglicht somit einerseits Einblicke in die Karzinogenese, zum anderen kann ein differenzierter Autoantikörpernachweis zur Früherkennung von Tumoren herangezogen werden. Des Weiteren wird häufig diskutiert, ob das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern Aussagen über den individuellen Krankheitsverlauf hinsichtlich der Prognose bis hin zur Ansprechbarkeit auf Therapeutika zulässt (BLAES et al. 2000, SYRIGOS et al. 2000, VOGL et al. 2000). Auf der anderen Seite wird die Frage nach der pathophysiologischen Bedeutung der Autoantikörper intensiv untersucht, da diesbezügliche Erkenntnisse nicht zuletzt zur Entwicklung gezielter Immuntherapien – im Sinne einer aktiven und passiven Immunisierung – herangezogen werden können. Im Hinblick auf die Etablierung neuer serologischer Diagnostik- und Therapieverfahren sind autoreaktive Antikörper somit seit einigen Jahren ein wichtiger Bestandteil in der Tumorforschung des Menschen. Für den Hund liegen bislang nur wenige publizierte Arbeiten vor, die die humorale Immunantwort und deren diagnostische Relevanz im Zusammenhang mit Neoplasien berücksichtigen (KROTJE et al. 1990, KANAYA et al. 2002, WAGNER 2002). Für die vorliegende Promotionsarbeit galt es somit zwei Grundhypothesen zu überprüfen: (1) Stellt das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern bei den neoplastischen Erkrankungen des Hundes ein in An- 14 Einleitung und Zielsetzung lehnung an den Menschen vergleichsweise häufiges Ereignis dar, und (2) besitzen diese Autoantikörper eine klinische Relevanz hinsichtlich der Diagnostik von Tumoren. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit sollte zunächst in der Evaluierung und Modifikation methodischer Ansätze zum Nachweis von autoreaktiven Antikörpern in caninen Patientenseren liegen, um anschließend unter Einbeziehung einer großen Zahl an Seren, die von Hunden mit neoplastischen und nicht-neoplastischen Erkrankungen stammten, das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern näher zu analysieren. Das Hauptaugenmerk sollte dabei zunächst auf antinukleäre Antikörper gerichtet werden, die beim Menschen und Hund ein wichtiges diagnostisches Kriterien systemischer Autoimmunerkrankungen darstellen (TAN 1986, TOTH u. REBAR 1987) und die Mehrheit der bei den neoplastischen Erkrankungen des Menschen angetroffenen Autoantikörper repräsentieren (COVINI et al. 1997, ABU-SHAKRA et al. 2001, NASCHITZ 2001). Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand in der Charakterisierung der Autoantikörperspezifitäten. Schließlich sollten in der Arbeit initiale Funktionsanalysen durchgeführt werden, die Aufschluss über die mögliche pathophysiologische Bedeutung der Autoantikörper liefern können. Literaturübersicht 2 15 Literaturübersicht 2.1 Autoreaktive Antikörper und Autoaggression beim Menschen Autoreaktive Antikörper sind gegen körpereigene Strukturen wie intrazelluläre Proteine, Nukleinsäuren und membrangebundene Komponenten gerichtet (TAN 1991, CALVANICO 1993). Das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern stellt per se keinen krankhaften Befund dar, da sie ebenfalls in gesunden Individuen anzutreffen sind und im Rahmen der immunologischen Homöostase Regulations- und Überwachungsaufgaben innehaben (UYTDEHAAG et al. 1991, LIVNEH et al. 1993, SINGH 1993). Diese so genannten „natürlichen Autoantikörper“ werden zumeist durch polyvalente Immunglobuline des Isotyps IgM mit geringer Affinität repräsentiert, die von end-differenzierten CD5+ B-Zellen gebildet werden (GUILBERT et al. 1982, CALVANICO 1993, ABU-SHAKRA et al. 2001). Pathologische Autoantikörper hingegen werden nach Bruch der Selbsttoleranz gebildet und stellen das Hauptmerkmal systemischer und organspezifischer Autoimmunerkrankungen dar (TAN 1991, TODD u. STEINMANN 1992). Sie gehören zumeist Immunglobulinen des Isotyps IgG an, sind in der Regel monospezifisch und hochaffin (CALVANICO 1993). Die Bildung solcher Autoantikörper wird unter anderem auf einen massiven Zelluntergang bzw. eine ektopische Expression oder Überexpression von Autoantigenen zurückgeführt, wobei die exakten Mechanismen, die zur Generierung autoreaktiver Antikörper führen, oft noch im Dunkeln liegen. Bei den Zielstrukturen der Autoantikörper handelt es sich häufig um phylogenetisch hochkonservierte Strukturen, die an wichtigen Zellfunktionen wie DNA-Replikation, Transkription, Translation, m-RNA-Splicing und dem Zellzyklus beteiligt sind (Tab. 1). Die Identifikation der Antigene ist von essentieller Bedeutung, da die Zielstrukturen der Autoantikörper vielfach spezifisch für die zugrunde liegende Erkrankung sind (TAN 1989, VAN VENROOIJ u. PUTTE 1991). Dies macht man sich insbesondere bei der Diagnostik systemischer Autoimmunerkrankungen zu Nutze, die sich hinsichtlich des klinischen Erscheinungsbildes oft sehr ähneln, zugleich aber durch das Auftreten spezifischer Autoantikörper gekennzeichnet sind. Dabei handelt es sich fast ausschließlich um solche, die gegen Zellkernstrukturen gerichtet sind, sogenannte antinukleäre Antikörper (ANA). Antinukleäre Antikörper Antinukleäre Antikörper gelten zum Teil als pathognostisch für die jeweilige Erkrankung. In Tab. 1 sind die Merkmale einiger charakteristischer ANA beim Menschen zusammengefasst. Auch wenn die Zielstrukturen der ANA weitestgehend identifiziert sind, so ist die pathogenetische Bedeutung dieser Autoantikörper noch nicht hinreichend geklärt. Klassischerweise wird eine gewebsschädigende Wirkung auf die Bildung und Ablagerung von Immunkomplexen (Arthus-Phänomen) zurückgeführt (KOFFLER et al. 1967, LAMBERT u. DIXON et al. 1968). In Arbeiten neueren Datums wird ebenso ein direkter zellschädigender Effekt der ANA diskutiert. So wird das Kardinalsymptom der systemischen Autoaggressionserkrankungen, die Glomerulonephritis, von einigen Autoren mehr auf eine direkte Autoantikörperwirkung als auf den inflammatorischen Insult durch Immunkomplexe zurückgeführt 16 Literaturübersicht (CHETRIT et al. 1985, TSAI et al. 1992, YU et al. 1998). Dies wiederum setzt die Bindung solcher Autoantikörper an die Zellmembran voraus, die einerseits durch eine Kreuzreaktivität mit Membranproteinen zum anderen durch membrangebundende intrazelluläre Antigene wie Nukleosomen induziert werden soll (JACOB et al. 1989, RAZ et al. 1993, KOUTOUZOV et al. 1996, KOZYR et al. 2000). Tab. 1 Auswahl diagnostisch relevanter antinukleärer Antikörper bei systemischen Autoimmunerkrankungen des Menschen Autoantikörper 1) Funktion des Antigens Autoimmunerkrankung Zitat anti-ds DNA1) Genetischer Code SLE TAN 1989, VENROOIJ u. PUTTE 1991 anti-Histon (H1, H2A, H2B od. H3, H4) Kondensation der DNA SLE TAN 1989, VENROOIJ u. PUTTE 1991 anti-Sm1) Splicing der Vorläufer-m-RNA SLE YANG et al. 1981, PADGETT et al. 1983 anti-Ku Regulation des T-Zell-Rezeptorgens SLE CHOU et al. 1992, MESSIER et al. 1993 anti-Topoisomerase I (Scl-70)4) Lockerung der DNA-Superhelix Sclerodermie MAUL et al. 1986, SHERO et al. 1986, TAN 1989 anti-SS-B/La Enzymregulation der RNA-Polymerase I Sjøgren Syndrom, SLE TAN 1989, BINI et al. 1990 anti-SS-A/Ro2) Komplex mit Y1-Y5 RNAs, Funktion unbekannt Sjøgren Syndrom, SLE VENROOIJ u. PUTTE 1991, LEE et al. 1993 anti-RNP3) Splicing der Vorläufer m-RNA MCTD VENROOIJ u. PUTTE 1991, TAN 1989 anti-Zentromer4) Zellteilung und Spindelausbildung progressive Systemsklerose TAN 1989, VENROOIJ u. PUTTE 1991 2) Diese Autoantikörper werden als pathognostisch für den SLE angesehen. SLE-Patienten generieren Autoantikörper gegen die 52 kDa und 60 kDa oder gegen die 60 kDA Untereinheit des SS-A/Ro Proteins. Das Auftreten dieser Autoantikörper wird vor allem bei der kutanen Form des SLE beobachtet. Patienten mit Sjøgren Syndrom produzieren Autoantikörper gegen beide Untereinheiten oder die 52 kDa Untereinheit. 3) Autoantikörper gegen RNP treten auch bei anderen Erkrankungen auf. Das typische für die MCTD ist, dass 4) keine weiteren Autoantikörper angetroffen werden. Diese Autoantikörper gelten als pathognostisch für die Sclerodermie. Literaturübersicht 17 Antizytoplasmatische Autoantikörper Neben ANA werden auch solche Antikörper angetroffen, die gegen zytoplasmatische Strukturen gerichtet sind. Diesen Autoantikörpern wurde erst in den letzten Jahren eine zunehmende Aufmerksamkeit geschenkt, wobei sie mit Ausnahme der anti-mitochondrialen Antikörper und anti-Jo-1-Antikörper bislang keine klinische Anwendung gefunden haben (ROSSIE et al. 1992, GRIFFITH et al. 2002). Dies ist einerseits in den zum Teil sehr niedrigen Inzidenzen, zum anderen in der mangelnden Spezifität begründet. In Tab. 2 sind die am häufigsten anzutreffenden antizytoplasmatischen Antikörper beim Menschen aufgeführt. Anti-mitochondriale Antikörper werden als sensitive und spezifische diagnostische Marker für die primär biliäre Leberzirrhose angesehen, da sie bei über 96% der Patienten anzutreffen sind (KAPLAN 1996, OMAGARI et al. 1996, LEUNG et al. 1997). Sie können darüber hinaus – vorwiegend in niedrigen Titern – bei weiteren chronischen Lebererkrankungen, der progressiven Systemsklerose und verschiedenen Karzinomen nachgewiesen werden (ZUBER u. RECKTENWALD 2003). Tab. 2 Antizytoplasmatische Antikörper bei Autoimmerkrankungen des Menschen Antikörper anti-mitochondrial anti-ribosomal P Protein anti-Jo-1 anti-CLP-1703) anti-Golgi4) 1) Charakteristik des assoziierte Antigens Erkrankung Enzyme der inneren primär biliäre MitochondrienLeberzirrhose 1) membran PO (38 kDa), P1 (16 kDa), P2 (15 kDa) histidyl-tRNASynthetase 170 kDa, erleichtert die Interaktion von Zellorganellen mit Mikrotubuli 123, 72, 46 kDa u. Makrogolgin (376 kDa) Zitat SLE, Sclerodermie, Glioblastom LEUNG et al. 1997, MATTALIA et al. 1998, ZUBER u. RECKTENWALD 2003 TAKEHARA et al. 1990, AGIUS et al. 1997, YOSHIO et al. 1998 VENROOIJ u. PUTTE 1991, COOK 1998 PIERRE et al. 1992, GRIFFITH et al. 2002 SLE, Sjøgren Syndrom, Sclerodermie, virale Infektionen (u.a. HIV) ROSSIE et al. 1992, SEELIG et al. 1994, BIZZARO et al. 1999 SLE2) Myositis E2 Untereinheit des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (74 kDa), Protein X des Pyruvat-DehydrogenaseKomplexes (55 kDa), E2 Untereinheit des alpha-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes (51 kDa), E2 Unter2) einheit des verzweigtkettigen-alpha-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexes (51 kDa). Anti-ribosomale Antikörper werden in manchen Publikationen mit einer Sonderform des SLE – der Lupus Psychose – in Zusam3) menhang gebracht (BONFA et al. 1987, AGIUS et al. 1997, MASSARDO et al. 2002). Das Auftreten von anti4) CLP-170-Antikörpern ist als Einzelfall bei den genannten Erkrankungen beschrieben. Die Prävalenz von antiGolgi-Antikörpern wird auf 0,1-0,07% geschätzt. 18 Literaturübersicht Autoreaktive Antikörper und insbesondere ANA sind somit wichtige serologische Indikatoren, die einen breiten Einsatz in der Diagnostik von systemischen und organspezifischen Autoimmunerkrankungen des Menschen haben. 2.2 Klinische Relevanz von antinukleären Antikörpern beim Hund Der Nachweis von ANA wird beim Hund vornehmlich zur Diagnostik des systemischen Lupus erythematodes (SLE) herangezogen (LEWIS et al. 1965, COSTA et al. 1984, BENNETT u. KIRKHAM 1987). Die Diagnose des SLE wird aufgrund klinischer Befunde, dem Ansprechen auf immunsuppressive Therapie und dem Vorhandensein serologischer Paramater wie ANA und/oder Lupus erythematodes (LE)-Zellen gestellt (SHULL et al. 1983, TOTH u. REBAR 1987, JONES 1993). Die klinische Manifestation des SLE kann sehr vielseitig sein, weshalb in Anlehnung an den Menschen mehrere Diagnostikschemata entwickelt wurden, von denen in Tab. 3 das nach GRINDEM u. JOHNSON (1983) dargestellt ist. Tab. 3 Klinische Kriterien zur Diagnose des systemischen Lupus erythematodes (SLE) des Hundes nach GRINDEM und JOHNSON (1983)* nicht-erosive Polyarthritis Nephropathie (Proteinurie, Azetonämie) autoimmunhämolytische Anämie schmetterlingsförmige Hautveränderungen oder Photosensibilität Pleuritis, Pericarditis, Pneumonie od. Myokarditis Petechien (Thrombozytopenie) * Die Diagnose des SLE kann bei mindestens zwei dieser klinischen Befunde in Zusammenhang mit ANA oder LE-Zellen gestellt werden. Die Spezifität des ANA-Nachweises beim SLE des Hundes wird jedoch sehr kontrovers diskutiert, da ANA auch bei anderen Erkrankungen, die mit inflammatorischen Prozessen und massivem Zelluntergang einhergehen, angetroffen werden (SHULL et al. 1983, KASS et al. 1985, TOTH u. REBAR 1987). Klassische Beispiele sind die autoimmunhämolytische Anämie, autoimmunbedingte Thrombozytopenie, die rheumatoide Arthritis, Nephritis, Endokarditis und systemische Infektionserkrankungen wie die Ehrlichiose, Leishmaniose, Demodekose und Dirofilariose (SHULL et al. 1983, DAY u. PENHALE 1992, BREITENSCHWERDT et al. 1995, LUCENA u. GINEL 1998). Zudem ist bekannt, dass die Applikation bestimmter Medikamente wie Griseofulvin, Sulfonamide, Tetrazykline, Procainamid und Sulfasalazin mit dem Aufreten von ANA einhergeht (BALAZS u. ROBINSON 1983, MIELKE et al. 1993). Aufgrund der mangelnden Spezifität eines undifferenzierten ANA-Nachweises wurde von vielen Autoren versucht, die Spezifitäten der mit dem SLE des Hundes einhergehenden ANA zu identifizieren (BRINET et al. 1988, SOULARD et al. 1991, WHITE et al. 1992, BELL et al. 1997, HENRIKSSON et al. 1998). Literaturübersicht 19 Spezifitäten der ANA bei dem systemischen Lupus erythematodes des Hundes Für den Menschen ist bekannt, dass über 90% der SLE-Patienten ANA entwickeln, die gegen ein großes Spektrum nukleärer Proteine gerichtet sind. Antikörper gegen ds-DNA, die bei 77% aller SLE-Patienten nachgewiesen werden, und anti-Smith (Sm)-Antikörper, die 25-30% der Patienten aufweisen, werden als pathognostisch für den SLE des Menschen angesehen (Tab. 1). Bei dem SLE des Hundes scheinen Autoantikörper gegen native DNA nur sehr selten vorzukommen (MONIER et al. 1980 u. 1992, BRINET et al. 1988, MONESTIER et al. 1995). Dieses Phänomen wird darauf zurückgeführt, dass in caninem Serum regelmäßig DNA-bindende Proteine nachzuweisen sind, die keine Immunglobuline darstellen und möglicherweise zu einer Reduktion der zur Stimulation der humoralen Immunantwort zur Verfügung stehenden zirkulierenden DNA führen (THOBURN et al. 1972, MONIER et al. 1980, ZEROMSKI et al. 1984). Demgegenüber entwickeln 60-80% der caninen SLEPatienten Autoantikörper gegen Histone, die jedoch ein anderes Spektrum an Histonen, als das für den SLE des Menschen bekannte, erkennen (COSTA et al. 1984, COSTA u. MONIER 1986, BRINET et al. 1988). Zudem sind bei dem Hund Autoantikörper gegen extrahierbare Kernantigene (ENA, nicht-Histonproteine) wie das Smith-Antigen (Sm-Antigen) und Ribonukleoproteine (RNP) beschrieben, die bei dem SLE des Menschen ebenfalls angetroffen werden (MONIER et al. 1980, COSTA et al. 1984, WHITE et al. 1992). Das Hauptantigen der RNP stellt für beide Spezies übereinstimmend das U1-70 K Protein (U1 RNP) dar (GULDNER 1992, HENRIKSSON et al. 1998, HANSSON 1999). Zudem werden von caninen ANA Antigene wie das hnRNP G (43 kDa) und weitere bislang nicht charakterisierte Antigene erkannt, die bei dem SLE des Menschen keine Rolle zu spielen scheinen (MONIER et al. 1980, COSTA et al. 1984, SOULARD et al. 1991, HENRIKSSON et al. 1998). Im Gegensatz zum menschlichen SLE generieren canine Lupus-Patienten hingegen nur in Ausnahmefällen Autoantikörper gegen das Sjøgren´s Syndrom Antigen A (SS-A/Ro) und Sjøgren´s Syndrom Antigen B (SS-B/La), die ebenfalls der Gruppe der ENA angehören (COSTA et al. 1984, BRINET et al. 1988, WHITE et al. 1992). Somit stellen Histone, das Sm und anti-U1 70 K Protein, die wichtigsten Zielstrukturen für die beim caninen SLE gebildeten Autoantikörper dar. Viele Autoren propagieren, dass mit Hilfe eines differenzierten Autoantikörpernachweises die Spezifität des ANA-Nachweises für den SLE deutlich erhöht wird. Trotzdem hat ein spezifischer Autoantikörpernachweis bis dato keinen Eingang in die Routinediagnostik des caninen SLE gefunden, und bleibt somit wissenschaftlichen Intentionen vorbehalten (BELL et al. 1997, HENRIKSSON et al. 1998). 2.3 Nachweisverfahren antinukleärer und antizytoplasmatischer Antikörper Zum Nachweis antinukleärer und antizytoplasmatischer Antikörper stehen reine „Suchtests“ zur Verfügung, in denen üblicherweise native Zellen, Zellkerne, Gewebeschnitte oder Organextrakte als Antigensubstrat dienen und der Autoantikörpergehalt semiquantitativ bestimmt wird (MOLDEN et al. 1984, TOTH u. REBAR 1987). Dem reinen Screeningverfahren folgt üblicherweise ein differenzierter Autoantikörpernachweis unter Einsatz definierter Antigene, die entweder in aufgereinigter Form oder als rekombinante Proteine vorliegen (COOK 1998, PEENE et al. 2001). Einige Untersuchungsmethoden sind sowohl als reines Screeningverfahren als auch zum Nachweis einzelner Autoantikörperspezifitäten geeignet (COOK 1998). 20 Literaturübersicht In Tab. 4 sind die wichtigsten Verfahren aufgeführt. In der Routinediagnostik des caninen SLE wird bislang ausschließlich der fluoreszenzserologische mikroskopische Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA, s.u.) eingesetzt (TOTH u. REBAR 1987, HANSSON et al. 1996). Die genannten Verfahren zum differenzierten Autoantikörpernachweis finden beim Hund zu wissenschaftlichen Zwecken Anwendung (BELL et al. 1997, HENRIKSSON et al. 1998). Tab. 4 Verfahren zum Nachweis antinukleärer und antizytoplasmatischer Antikörper beim Menschen und Hund Methoden FARA Antigenquelle Zitat Gewebeschnitte, FRIOU 1957, KOZEN et al. humane Kulturzelllinien, 1980, HARMON et al. 1984, Protozoen MOLDEN et al. 1984 Immundiffusion Kalbsthymus- o. humanes Milzextrakt, SHARP et al. 1972, ENA, SOULARD et al. 1991, Sm, SS-A/Ro, SS-B/La, RNP CHARLES et al. 1992, GONZALEZ et al. 1993 ds-DNA, ss-DNA KREDICH et al. 1973 Kaninchen-Thymus-Extrakt, WOLLERSHEIM et al. 1989, ENA, SOULARD et al. 1991, SS-A/Ro, SS-B/La MANOUSSAKIS et al. 1993 Enzyme- Zellextrakte humaner Kulturzelllinien, JASKOWSKY et al. 1996, Immunoassay ENA, EMLEN u. O`NEILL 1997, Radio-ImmunoAssay Elektrophorese ds-DNA, ss-DNA, Histone, Sm, CENP HANSSON 1999, BOSSUYT Immunoblot SS-A/Ro, SS-B/La, RNP, Scl-70, Jo-1 2000, HAYASHI et al. 2001 Kaninchen-Thymus- o. humanes Milz- ELKON u. JANKOWSKY Extrakt, Erythrozytenextrakt, 1985, COSTA u, MONIER HEp-2- u. HeLa-Zellextrakt, 1986, WESTGEEST et al. ds-DNA, Histone, Sm, SS-A/Ro, Ku 1988, SOULARD et al. 1991, SS-B/La, RNP, Scl-70, Jo-1, CENP DELPECH et al. 1993 Literaturübersicht 21 Fluoreszenzserologischer mikroskopischer Nachweis (FARA) Der FARA – ein indirekter Immunfluoreszenztest mit mikroskopischer Auswertung, der vorrangig zum Nachweis von ANA eingesetzt wird – wurde 1957 von FRIOU erstmalig beschrieben. In der langen Geschichte des FARA fanden unterschiedlichste Gewebe bzw. Kulturzelllinien bis hin zu Protozoen (Kinetoblasten von Crithidia lucilia) als Antigensubstrat Anwendung (KOZEN et al. 1980, MOLDEN 1984). Ursprünglich dienten vornehmlich Gewebeschnitte aus Maus- und Rattenleber bzw. -niere als Antigenquelle (KOZEN et al. 1980). Diese wurden seit den 80er Jahren jedoch zunehmend durch humane, permanent wachsende, epitheliale Tumorzelllinien wie die HEp-2- und HeLa-Zelllinie ersetzt (KOZEN et al. 1980, TOTH u. REBAR 1987, TAN 1989). Die allogenen Zellsubstrate haben sich als sensitiver zum Nachweis autoreaktiver Antikörper erwiesen, da bestimmte Antigene wie zellzyklusabhängig exprimierte Proteine oder Zentromerproteine vornehmlich in proliferierenden Zellen anzutreffen sind. Weiterhin ist bekannt, dass humane Autoantikörper teils speziesspezifische Antigene markieren, die meist erst in phylogenetisch höher entwickelten Säugetieren bzw. Primaten anzutreffen sind (KOZEN et al. 1980, HARMON et al. 1984, MOLDEN et al. 1984). In den letzten Jahren finden zudem transfizierte Zelllinien ihren Einsatz, wie die mit Ro60-cDNA transfizierte HEp-2000. In dieser Zelllinie wird das Ro60Antigen überexprimiert, welches in HEp-2-Zellen üblicherweise in relativ geringer Menge vorliegt und zudem durch Fixationsvorgänge leicht gelöst wird (KEECH et al. 1993, PEENE et al. 2000). Zum Nachweis caniner ANA wird ebenso vorrangig die HEp-2-Zelle als Substrat eingesetzt (TOTH u. REBAR 1987). HANSSON et al. (1996) konnten zeigen, dass bei Einsatz muriner Gewebeschnitte mit falsch-positiven Ergebnissen gerechnet werden muss. In einer Studie von GROSSJUNG (1996) unter Einbeziehung mehrerer allogener und xenogener Zellsubstrate hat sich zum Nachweis caniner ANA ebenfalls die HEp-2-Zelllinie als am besten geeignet herausgestellt. Auch wenn der FARA als initiales Screeningverfahren einen breiten Einsatz in der Routinediagnostik zum ANA-Nachweis findet, wurde vielfach kritisiert, dass er hinsichtlich der Standardisierung und der Spezifität große Mängel aufweist. So schwankten die Angaben über die Inzidenz positiver ANA-Befunde in einer Population gesunder Menschen, die von insgesamt 15 Laboren eingeholt wurden, in einer internationalen Studie von TAN et al. (1997) zwischen 5% und 32%. McVEY u. SHUMAN (1991) konnten für canine ANA zeigen, dass der Variationskoeffizent für die Titerbestimmung innerhalb eines Labores für stark-positive Seren 26% und für schwach-positive Seren 72% betrug. Die Ursache für die mangelnde Standardisierbarkeit des FARA wird in dem Einsatz unterschiedlicher Zellsubstrate, unterschiedlichen Fixationsmethoden, Sekundärantikörpern, variierenden Testbedingungen und der individuellen Auswertung gesehen (MOLDEN et al. 1984, TOTH u. REBAR 1987). Zudem wird von einigen Autoren berichtet, dass aufgrund der hohen Sensitivität humaner Zellsubstrate bei dem ANA-Nachweis beim Menschen mit falschpositiven Ergebnissen gerechnet werden muss (MOLDEN et al. 1984, TOTH u. REBAR 1987, EMLEN u. O`NEILL 1997). Aufgrund dieser Problematik, die es für den Kliniker bei der Interpretation ANA-positiver Befunde zu berücksichtigen gilt, wurde versucht, alternative Testmethoden wie den Enzyme-Immunoassay oder den Immunoblot zu entwickeln bzw. vorgeschlagen, den FARA mit Hilfe von Referenzseren zu standardisieren (MOLDEN et al. 1984). 22 Literaturübersicht Enzyme-Immunoassay Insgesamt wurden drei Generationen des Enzyme-Immunoassay (EIA), der im Prinzip einen ELISA darstellt, zum ANA-Nachweis beim Menschen entwickelt (COOK 1998). Anfänglich wurden komplette HEp-2-Zellextrakte an die Mikrotiterplatte „gecoated“. Dies hatte den Nachteil, dass bestimmte Antigene, wie nukleoläre Proteine, die in nativer Form auf bestimmte Zellkompartimente beschränkt sind, in diesen Präparationen in vergleichsweise geringer Konzentration vorlagen. Zudem banden die einzelnen Antigene mit unterschiedlicher Affinität an die feste Phase, und es musste ein Verlust der Tertiärstruktur in Kauf genommen werden, was für Komformationsepitope von Bedeutung war (EMLEN u. O`NEILL 1997, BOSSUYT 2000). Bei der zweiten Generation kamen Gemische aus aufgereinigten oder rekombinanten Antigenen zum Einsatz. Dadurch war die klinische Aussagekraft und Sensitivität zwar erhöht, gleichzeitig stand jedoch nur eine begrenzte Anzahl an Antigenen, die nur einen kleinen Ausschnitt des gesamten Antigenspektrums der HEp-2-Zelle repräsentierten, zur Verfügung (JASKOWSKY et al. 1996). Die größte Sensitivität für bestimmte Antigene wurde erreicht, indem einzelne aufgereinigte oder rekombinante Antigene „gecoated“ wurden (3. Generation, BLOMBERG et al. 2000, HAYASHI et al. 2001). Mittlerweile ist von allen drei Varianten eine breite Auswahl an Testkits kommerziell erhältlich, deren klinische Aussagekraft hinsichtlich der Diagnostik systemischer Autoimmunerkrankungen anhand wissenschaftlicher Studien evaluiert wurde. So wird bei der Mehrheit der Untersuchungen berichtet, dass die Sensitivitäten bzw. Spezifitäten der Testkits mit Werten zwischen 80% und 98% diejenigen anderer Testverfahren überbieten (JASKOSWKY et al. 1996, OLAUSSEN u. REKVIG 1999, HAYASHI et al. 2001), während einige Autoren von einer begrenzten Eignung bestimmter EIA-Verfahren berichten (EMLEN u. O`NEILL 1997, TAN et al. 1999, BUSSUYT 2000). Der Vorteil des EIA wird darin gesehen, dass er eine schnelle, automatisierte und quantifizierbare ANA-Bestimmung ermöglicht und dabei eine subjektive Testauswertung überflüssig macht (COOK 1998). Als Screeningverfahren ist diese Methode aufgrund der geringen Sensitivität für bestimmte Antigene jedoch wenig geeignet, weshalb sie ihren Einsatz vorrangig zum Nachweis spezifischer Autoantikörper findet (COOK 1998). Immunoblot In Immunoblot-Analysen werden komplette Zellextrakte oder einzelne aufgereinigte rekombinante Antigene eingesetzt (COOK 1998). Diese Methode findet aufgrund der hohen Sensitivität vor allem zum differenzierten Autoantikörpernachweis Anwendung. Als Screeningverfahren hat sie sich aufgrund der geringen Spezifität als wenig geeignet erwiesen (PAXTON et al. 1990, ERMENS et al. 1997). Des Weiteren muss bei Einsatz dieses Verfahrens im Hinblick auf Konformationsepitope mit falsch-negativen Ergebnissen gerechnet werden, und es erlaubt zudem keine quantitative Bestimmung des Autoantikörpergehaltes. ImmunoblotAnalysen wurden beim Menschen daher bislang vornehmlich zu wissenschaftlichen Zwecken oder zum spezifischen Autoantikörpernachweis eingesetzt (ELKON u. JANKOWSKY 1985, COSTA u. MONIER 1986). Literaturübersicht 23 Immundiffusion Die Doppelimmundiffusion nach Ouchterlony wurde zum Nachweis von extrahierbaren Kernantigenen (ENA) etabliert. Sie besitzt jedoch eine relativ geringe Sensitivität und wurde daher beim Menschen weitestgehend durch den EIA abgelöst (MERRYMAN u. LOUIE 1991, JAMES u. MEEK 1992). Diese Auflistung verdeutlicht, dass hinsichtlich der Etablierung geeigneter Nachweisverfahren für antinukleäre bzw. autoreaktive Antikörper noch immer ein großer wissenschaftlicher Handlungsbedarf besteht, da keine der bislang eingesetzten Methoden die allgemeinen Anforderungen an ein diagnostisches Testverfahren zur vollen Zufriedenheit erfüllen konnte. Ein Zitat von EMLEN u. O`NEILL (1997) soll den gegenwärtigen Stand verdeutlichen: „Measurement of ANA is still an imperfect science“. 2.4 Autoreaktive Antikörper und neoplastische Erkrankungen des Menschen Während des letzten Jahrzehnts wurde das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern bei neoplastischen Erkrankungen des Menschen intensiv untersucht. Die klinische Relevanz dieser Autoantikörper wird dabei immer noch sehr kontrovers diskutiert. So werden autoreaktive Antikörper, die bei einer Vielzahl von Tumoren in den entsprechenden Patientenseren angetroffen werden, von einigen Autoren als Ausdruck einer allgemeinen Dysregulation des Immunsystems im Zuge einer Tumorerkrankung angesehen (TOMER et al. 1998) oder aber auf das meist fortgeschrittene Alter dieser Patienten zurückgeführt (HUMINER et al. 1990, SWISSA et al. 1990). Diesen provokativ anmutenden Hypothesen widersprechen jedoch die meisten Autoren, da sich durch die Identifikation der assoziierten Antigene die Hinweise verdichten, dass die besagte humorale Immunantwort auf eine spezifische Stimulation durch „tumorassoziierte“ Antigene zurückzuführen ist und nicht auf unspezifischen Toleranzdurchbrüchen beruht (IMAI et al. 1992, 1993a,b, CASIANO et al. 1993, YAMAMOTO et al. 1996, DISIS et al. 1997 u. 2000, FERNÁNDEZ-MADRID et al. 1999, ZHANG et al. 1999 u. 2001b, BLAES et al. 2000, KORNEEVA et al. 2000, TOMKIEL et al. 2002). So gelang es mit Hilfe der SEREX-Analyse („serological analysis of recombinant cDNA expression libraries of human tumours with autologous serum“, SAHIN et al. 1995 u. 1997, OLD u. CHEN 1998) etwa 400 Antigene zu identifizieren, die sich im Zellkern oder Zytoplasma von Tumorzellen befinden bzw. Bestandteile der Zellmembran darstellen. Viele der bisher identifizierten Antigene repräsentieren so genannte Differenzierungsantigene, die zu bestimmten Entwicklungsstadien ebenso in normalen Zellen exprimiert werden und wichtige Zellfunktionen ausfüllen (HOUGHTON 1994, ZHANG et al. 1999). Der zugrunde liegende Mechanismus, der zu einem Durchbruch der Selbsttoleranz gegenüber solchen Autoantigenen führt, wird auf eine Überexpression oder Mutation dieser Proteine in tumorös entarteten Zellen und die massive Freisetzung durch den nekrotischen Zerfall von Tumorgewebe zurückgeführt (DISIS et al. 1994, JALBOUT et al. 2002). Aufgrund der Tatsache, dass autoreaktive Antikörper zumeist im Frühstadium der Erkrankung auftreten, wo ein Nachweis des Tumors auf konventionellem Wege noch nicht möglich ist, und ein autoantikörperpositiver Befund Aussagen über die Prognose des Patienten zulässt, werden sie von vielen Autoren als eine neue Generation von Tumormarkern diskutiert (s.u.). Zum anderen sind sie für die grundlagenorientierte Forschung 24 Literaturübersicht von großem Interesse, da sie mit Hilfe der SEREX-Analyse zur Identifikation von Proteinen geführt haben, die wichtige Zellfunktionen ausfüllen und deren Dysregulation eine Karzinogenese favorisiert (SAHIN et al. 1995 u. 1997, OLD u. CHEN 1998). Erkenntnisse über das Auftreten und die Spezifität dieser Autoantikörper kann zudem zur Entwicklung gezielter Therapeutika wie Impfstoffen herangezogen werden (DISIS et al. 1994, HARRIES u. SMITH 2002). 2.4.1 Identifikation und klinische Relevanz einzelner Autoantikörper Das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern wurde beim Menschen am detailliertesten bei dem kleinzelligen Lungenkarzinom (FERNÀNDEZ-MADRID et al. 1999, INUZUKA 2000), dem hepatozellulären Karzinom, das aufgrund seiner Ätiologie ein sehr gutes Studienobjekt darstellt (IMAI et al. 1993a,b) und dem Mammakarzinom, für das bereits ein Therapeutikum auf Grundlage monoklonaler Antikörper entwickelt wurde (MEHIGAN u. KERN 1999), untersucht. Generell werden autoreaktive Antikörper vornehmlich bei hämatopoetischen und epithelialen Tumoren angetroffen (TOMER et al. 1998, ABU-SHAKRA et al. 2001). Neoplasien mesenchymalen Ursprungs finden mit Ausnahme des Osteosarkoms (TRIEB et al. 2000) in der zugänglichen Literatur beim Menschen keine Erwähnung. In Tab. 5 ist eine Auswahl der wichtigsten Autoantikörper, die anhand der assoziierten Antigene charakterisiert und unterteilt wurden, dargestellt. Die meisten bisher identifizierten Antigene sind dabei im Zellkern lokalisiert, es handelt sich somit bei einem Großteil der vorgefundenen Autoantikörper um ANA. 2.4.1.1 Antinukleäre Antikörper Das Auftreten von antinukleären Antikörpern ist beim Menschen für hämatopoetische Tumoren wie das maligne Lymphom (Hodgkin und non-Hodgkin Lymphom), die lymphatische Leukämie, das multiple Myelom und für eine Reihe epithelialer maligner Tumoren wie das hepatozelluläre Karzinom, kleinzellige Lungenkarzinom, nicht-kleinzellige Lungenkarzinom (Adenokarzinom, großzelliges Lungenkarzinom, Plattenepithelkarzinom und andere), maligne Melanom, Magen-, kolorektale, Mamma-, Uterus-, Ovar-, Prostata-, Blasenund nasopharyngeale Karzinom beschrieben (Tab. 6). Die Angaben über die Inzidenzen positiver Befunde variieren für gemischte Patientenkollektive je nach Publikation zwischen 2,8% (ARMAS et al. 2000), 10,4% (IMAI et al. 1992), 18,8% (KIYOSAWA et al. 1985) und 42% (IDEL et al. 1978). Eine Erklärung dafür ist einerseits in dem Einsatz unterschiedlicher Zellsubstrate im FARA zu sehen (MOLDEN et al. 1984). Zum anderen wird der sogenannte „cut-off“-Titer bei den einzelnen Autoren unterschiedlich definiert (MOLDEN et al. 1984). Ein weiterer Grund für die differierenden Angaben ist in der heterogenen Zusammensetzung der einzelnen Untersuchungsgruppen zu sehen. Die Angaben für die gesunden Kontrollgruppen variieren in den jeweiligen Publikationen zwischen 1,3% (ARMAS et al. 2000), 1,8% (IDEL et al. 1978), 3,7% (KIYOSAWA et al. 1985) und 5% (IMAI et al. 1992). Die Inzidenzen, die für einzelne Tumoren beschrieben sind, können Tab. 6 entnommen werden. Literaturübersicht Tab. 5 25 Auswahl autoreaktiver Antikörper bei Neoplasien des Menschen Antigen Autoantikörper Zitat Nukleäre anti-DNA, anti-Sm, IMAI et al. 1992, SWISSA et al. 1992, Proteine und anti-RNP KONSTANDOULAKIS et al. 1998, SYRIGOS et Nukleinsäuren al. 2000, TIMURAGAOGLU et al. 2000 anti-NOR-90 IMAI et al. 1992, COVINI et al. 1997 anti-fibrillarin IMAI et al. 1992 anti-B23 IMAI et al. 1993b anti-HCC1 CASIANO et al. 1993 u. 1995 anti-p330d/CENP-F ZHANG et al. 2001b anti-x1) McCORMICK et al. 1976, NELSON 1977, IDEL et al. 1978, SCHATTNER et al. 1983, THOMAS et al. 1983, TAKIMOTO et al. 1989, BLAES et al. 1999, FERNÁNDEZ-MADRID et al. 1999, ARMAS et al. 2000, JALBOUT et al. 2002 m-RNA bin- anti-p62, anti-Koc ZHANG et al. 1999, 2001a,b anti-HER-2/neu DISIS et al. 1994 u. 1997 dende Proteine Onkoproteine (-erbB-2) Tumorsuppres- anti-L-myc YAMAMOTO et al. 1996 anti-c-myb SOROKINE et al. 1991 anti-c-myc BEN-MAHREZ et al. 1990 anti-p53 LUBIN et al. 1995a, ZALCMAN et al. 1998, LENNER et al. 1999, SOUSSI 2000, VOGL et al. sorgenprodukte 2000, TANG et al. 2001 Hitzeschock- anti-Hsp27 CONROY et al. 1998a, KORNEEVA et al. 2000 proteine anti-Hsp90 CONROY u. LATCHMAN 1996, CONROY 1998b, TRIEB et al. 2000 Onkoneurale anti-Hu (ANNA-1) Antigene 1) ANDERSON et al. 1988, DALMAU et al. 1990, GRAUS et al. 1997 anti-Yo (PCA-1) TANAKA et al. 1995, INUZUKA 2000, anti-Ri (ANNA-2) SUTTON 2002, PITTOCK et al. 2003 In den entsprechenden Arbeiten wurde kein differenzierter Autoantikörpernachweis durchgeführt. 26 Tab. 6 Literaturübersicht Literaturangaben zum Auftreten antinukleärer Antikörper bei einzelnen Tumoren des Menschen Tumor malignes Melanom kleinzelliges Lungenkarzinom klein- u. nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom hepatozelluläres Karzinom gastrointestinale Karzinome nasopharyngeale Karzinome malignes Lymphom ANA-positiv1) 90% 33% 40% 31% 32% 22% 24% Zitat THOMAS et al. 1983 BLAES et al. 2000 YAMAMOTO et al. 1996 IMAI et al. 1992 u. 1993 SCHATTNER et al. 1983 JALBOUT et al. 20022) SWISSA et al. 19923) 1) Die Angaben beziehen sich auf die Ergebnisse aus dem Screeningverfahren - einem indirekten Immun2) fluoreszenztest mit HEp-2- oder HeLa-Zellen als Antigensubstrat (FARA). In dieser Arbeit dienten Ratten3) leberschnitte als Zellsubstrat. Die Angaben beziehen sich in dieser Publikation auf anti-ss-DNA, anti-Sm und anti-RNP-Antikörper, die mit Hilfe eines ELISA quantifiziert wurden. Die detailliertesten Untersuchungen über das Auftreten und die klinische Relevanz antinukleärer Antikörper widmeten sich den verschiedenen Formen des Lungenkarzinoms und dem hepatozellulären Karzinom. Lungenkarzinom Unter Einsatz der HeLa- und mehrerer Lungenzelllinien gelang es FERNÁNDEZ-MADRID et al. (1999) beim Menschen eine Vielzahl von ANA-Spezifitäten zu identifizieren, die nach „classification of regression trees“ („CART“)-Analyse die Diagnose eines Lungentumors mit einer Genauigkeit von 73% und den Lungentumorzelltyp mit einer Präsizion von 50% voraussagten. Sie postulierten auf Grundlage dieser Ergebnisse, dass die Klonierung solcher Antigene ein wertvolles diagnostisches Hilfsmittel darstellen könnte. In den Untersuchungen von BLAES et al. (2000) zeigten Lungenkarzinom-Patienten mit einem ANA-positiven Befund im Vergleich zu seronegativen Probanden eine signifikant längere Überlebenszeit. Dass ein ANA-positiver Befund mit einer günstigeren Prognose einhergeht, wurde auch von Patienten, die an einem kolorektalen Karzinom erkrankt waren, berichtet (SYRIGOS et al. 2000). Dies steht jedoch im Kontrast zu den Beobachtungen von KONSTANDOULAKIS et al. (1998), wonach Patienten, die anti-ss-DNA Antikörper entwickelten und an einem Magenkarzinom erkrankt waren, eine schlechtere Überlebenschance hatten, als solche, die seronegativ waren. Literaturübersicht 27 Hepatozelluläres Karzinom Das hepatozelluläre Karzinom ist aufgrund der Tatsache, dass es sich oft erst nach Jahren aus einer Hepatitis bzw. Leberzirrhose entwickelt, die bei 60-80% der Patienten die klinischen Vorstadien des hepatozellulären Karzinoms darstellen (KEW u. POPPER 1984, POPPER et al. 1987), besonders geeignet, den Charakter der humoralen Immunantwort im Zuge einer malignen Entartung zu untersuchen. So wurden in den letzten 12 Jahren eine Reihe von Antigenen identifiziert und charakterisiert, die durch autoreaktive Antikörper von Patienten mit einem hepatozellulären Karzinom markiert wurden (CHAN et al. 1991, IMAI et al. 1992, COVINI et al. 1997, ZHANG et al. 1999, 2001a,b). Tab. 7 zeigt eine Auswahl dieser Antigene, die fast ausschließlich Kernstrukturen darstellen. Die Arbeiten erbrachten den entscheidenden Hinweis, dass die Autoantikörperantwort bei Neoplasien tatsächlich durch Proteine stimuliert wird, die im direkten Zusammenhang mit der Karzinogenese stehen. Dies begründet sich darin, dass Patienten, die über Jahre hinweg beobachtet wurden und an einer chronischen prämalignen Lebererkrankung litten, eine Spezifitätsänderung der ANA, einen rapiden Titeranstieg oder gar eine Serokonversion von negativ nach positiv zum Zeitpunkt oder bis zu 12 Monate vor der Diagnose eines hepatozellulären Karzinoms zeigten (IMAI et al. 1993a,b, ZHANG et al. 2001b). Da die initialen Stadien eines hepatozellulären Karzinoms oft sehr schwierig zu diagnostizieren sind, und die Entwicklung eines Tumors bei Risikopatienten oft mehrere Jahrzehnte in Anspruch nimmt, könnten die serologischen Veränderungen bezüglich der ANA zur Diagnostik herangezogen werden. Allerdings fehlen bis dato umfassende Studien, die dies bestätigen würden. Die Spezifitätsänderungen bzw. Serokonversion während des Überganges einer Hepatitis bzw. Leberzirrhose in ein hepatozelluläres Karzinom sind somit bislang vor allem von wissenschaftlichem Interesse. Mit Hilfe der in den Patientenseren vorgefundenen Autoantikörper können zelluläre Proteine identifiziert werden, die einerseits wichtige Zellfunktionen ausfüllen und zum anderen in die Karzinogenese involviert sind (Tab. 7). So konnten die beiden Proteine p62, das ein zytoplasmatisches Antigen darstellt, und HCC1 erstmalig mit Hilfe von Seren, die von Patienten mit einem hepatozellulärem Karzinom stammten, identifiziert werden (IMAI et al. 1993b, ZHANG et al. 1999). Diese beiden Antigene gehören mit dem Zentromerprotein CENP-F zu denjenigen Antigenen, die von Autoantikörpern markiert werden, die zum Zeitpunkt der malignen Entartung auftreten (IMAI et al. 1993b, ZHANG et al. 1999 u. 2001b). Autoantikörper, die eine Spezifität für das Antigen p62 bzw. „KH homology protein overexpressed in cancer“ (Koc) besitzen, wurden neben dem hepatozellulären Karzinom in einem gemischten Patientenkollektiv mit weiteren Tumoren (Mammakarzinom, kolorektales Karzinom, Magenkarzinom, malignes Lymphom, Lungenkarzinom) mit einer Inzidenz von 11,6% (p62) bzw. 12,2% (Koc) angetroffen (ZHANG et al. 2001a). Das Zentromerprotein CENP-F wurde zudem von Antikörpern markiert, die von Patienten mit einem Mamma-, kolorektalen, nasopharyngealen, Magenoder Lungenkarzinom stammten (CASIANO et al. 1995, RATTNER et al. 1997). Die Bildung von anti-CENP-F-, anti-NOR-90- und anti-Fibrillarin-Antikörpern (Tab. 7) ist nicht allein auf Tumorpatienten beschränkt, da das Auftreten dieser Antikörper – wenn auch mit geringerer Inzidenz – ebenso für systemische Autoimmunerkrankungen beschrieben wurde (TAN 1991, VENROOIJ u. PUTTE 1991, RATTNER et al. 1997). 28 Literaturübersicht Tab. 7 Nukleäre Antigene (Ausnahme p62), die von den beim hepatozellulären Karzinom des Menschen nachzuweisenden autoreaktiven Antikörpern erkannt werden Antigen NOR-90 Fibrillarin Eigenschaften Funktion Zitat 89 u. 93 kDa, „nucleolus Aktivierung der RNA- CHAN et al. 1991, organizer region” Polymerase I IMAI et al. 1992 Bestandteil von U3 RNP Splicing der Vorläufer KASS et al. 1990, IMAI m-RNA et al. 1992, COVINI et al. 1997 B23 Nucleophosmin involviert in Zellakti- FEUERSTEIN et al. vierung , -proliferation 1988, IMAI et al. 1992 HCC1 * 64 kDa, Bestandteil von Splicing der Vorläufer non-sn-RNP Splicing- m-RNA IMAI et al. 1993b Faktoren p330d/ 330 kDa, Funktion im G2/M- CASIANO et al. 1993 u. CENP-F Zentromerprotein Übergang des Zell- 1995, ZHANG et al. zyklus 2001b 62 kDa, zytoplasmatisch, bindet an „insulin-like ZHANG et al. 1999 u. RRM-KH m-RNA growth factor II-m- 2001a,b Bindungsprotein RNA” RRM-KH m-RNA bindet an m-RNA p62* Koc Bindungsprotein MUELLER-PILLASCH et al. 1997, ZHANG et al. 1999 u. 2001a * Diese Antigene wurden mit Hilfe von Seren, die von Patienten mit einem hepatozellulären Karzinom stammten, erstmalig identifiziert (SEREX). 2.4.1.2 Autoantikörper gegen Onkoproteine Onkoproteine werden durch Onkogene kodiert und nehmen eine wichtige Funktion in der Regulation von Zellwachstum und -differenzierung ein. In den entarteten Zellen einer Reihe von Tumoren werden Onkogene nachweislich amplifiziert, was in einer Überexpression der korrespondierenden Proteine resultiert und üblicherweise mit einer schlechten Prognose des Patienten einhergeht (GUERIN et al. 1988, SESHADRI et al. 1993, KERSEMAEKERS et al. 1999, PAGNANO et al. 2001). So wird das Onkoprotein HER-2/neu (ein Transmembranprotein), das zur Familie der „tyrosine-kinase epidermal growth factor receptors“ gehört und auch als c-erbB bekannt ist, bei 30-40% der Brustkrebspatientinnen in den malignen Zellen überexprimiert. Dieser Befund weist üblicherweise auf ein ausgesprochen aggressives Wachstumsverhalten des Tumors mit starker Metastasierungstendenz hin und geht mit ausgeprägten histologischen Malignitätskriterien einher (SLAMON et a. 1987 u. 1989, SESHADRI et al. Literaturübersicht 29 1993). Etwa 20% der Patientinnen, bei denen eine Überexpression des Onkoproteins nachweisbar ist, produzieren zirkulierende Autoantikörper gegen HER-2/neu, die bereits zum Frühstadium der malignen Entartung auftreten (PUPA et al. 1993, DISIS et al. 1994, 1997 u. 2000). Dies ist einerseits von diagnostischem Interesse, da anti-HER-2/neu-Autoantikörper auf eine zugrunde liegende Überexpression des korrespondierenden Onkoproteins schließen lassen, andererseits konnte das Wissen über eine bestehende humorale Immunantwort gegen c-erbB zur Entwicklung des Medikamentes Herceptin® beitragen. Der Wirkstoff dieses Therapeutikums besteht aus einem monoklonalen Antikörper gegen HER-2/neu und konnte bereits erfolgreich bei Brustkrebspatientinnen mit HER-2/neu-Überexpression in Form einer passiven Immunisierung eingesetzt werden (MEHIGAN u. KERIN 1999, HARRIES u. SMITH 2002). Bei vielen Patientinnen besteht bereits eine natürliche humorale Immunantwort gegen dieses Onkoprotein. Eine paraneoplastische autoimmune Manifestation ist dabei jedoch nicht zu beobachten, obgleich HER-2/neu als Differenzierungsantigen in geringer Menge ebenso in normalen Geweben exprimiert wird (HOUGHTON 1994). Dies verdeutlicht einerseits, dass das Risiko einer autoimmunen Nebenwirkung bei Applikation des Medikamentes kalkulierbar ist. Zum anderen ist aufgrund der zirkulierenden Autoantikörper ersichtlich, dass es sich bei HER-2/neu im Gegensatz zu vielen anderen tumorassoziierten Antigenen um ein immunogenes Protein handelt, so dass die Möglichkeit besteht, die vorhandene natürliche Immunantwort mit HER-2/neu-Impfstoffen zu boostern. Somit scheint die Gratwanderung zwischen dem Toleranzdurchbruch gegenüber Autoantigenen, was oft den limitierenden Faktor bei der Vakzinierung mit allogenen Antigenen darstellt, und pathologischen Effekten der Autoantikörper in Form von autoimmunen Nebenwirkungen im Falle des Onkoproteins HER-2/neu möglich (DISIS et al. 1994). Dies hat bereits den Anstoß für erste klinische Untersuchungen zur aktiven Immunisierung mit HER-2/neu-spezifischen Antigenen gegeben (BERNHARD et al. 2002). Die Mängel, die bei einer passiven Immunisierung grundsätzlich in Kauf genommen werden müssen, können somit umgangen werden. Diese schließen die kurze Halbwertszeit der monoklonalen Antikörper, das Auftreten von anti-Idiotyp Antikörpern, die fehlende T-Zell-Aktivierung und fehlende Generierung von Gedächtniszellen ein. L-myc stellt ein weiteres Onkogen dar, das einerseits in Tumorzellen, und zwar des kleinzelligen und nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms, amplifiziert wird (NAU et al. 1985, SHIRAISHI et al. 1989) und andererseits bei 10% der Patienten mit dem Auftreten von autoreaktiven Antikörpern einhergeht (YAMAMOTO et al. 1996). Zirkulierende Autoantikörper gegen c-myc wurden bei Menschen, die an einem kolorektalen Karzinom erkrankt waren, mit einer Inzidenz von 57% nachgewiesen (BEN-MAHREZ et al. 1990). SOROKINE et al. (1991) konnten zeigen, dass Brustkrebspatientinnen Autoantikörper gegen das Onkoprotein cmyb generieren. Die Korrelation zwischen der Überexpression dieser Onkogene und dem Auftreten autoreaktiver Antikörper ist bislang nicht ausreichend geklärt, so dass sich zukünftig zeigen wird, ob eine therapeutische Applikation nach Vorbild des Onkoproteins HER2/neu möglich ist. 30 Literaturübersicht 2.4.1.3 Anti-p53-Autoantikörper Das Differenzierungsantigen p53 (HOUGHTON 1994), das stark immunogene Eigenschaften besitzt und in zelluläre Prozesse wie Zellwachstum und -differenzierung regulatorisch eingreift, um einer malignen Transformation von Zellen entgegenzuwirken, stellt das derzeit am besten untersuchte Tumorsuppressorgen beim Menschen dar (HALL u. LANE 1997). Mutationen im p53-Gen sind die häufigsten genetischen Veränderungen, die in tumorös entarteten Zellen anzutreffen sind (HOLLSTEIN et al. 1991). Dabei handelt es sich zumeist um Missense-Mutationen, die zum Teil mit einem Verlust des Wildtyp-Allels einhergehen („loss of heterozygosity“, NIGRO et al. 1989, MARKS et al. 1991, WINTER et al. 1992). Anti-p53Antikörper werden mit einer Spezifität von 96% und einer Inzidenz von 3-65% in den Seren unterschiedlichster Tumorpatienten nachgewiesen (LUBIN et al. 1995a, SOUSSI 2000). So wurde über das Auftreten von anti-p53-Antikörpern bereits 1979 von DELEO et al. bei Mäusen berichtet. Mittlerweile wurde die Ätiologie und klinische Relevanz von anti-p53Antikörpern beim Menschen intensiv untersucht. Sie wurden unter anderem bei dem Mammakarzinom, kolorektalen Karzinom, oralen Plattenepithelkarzinom, verschiedenen gynäkologischen und urologischen Karzinomen, kleinzelligen und nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom, dem hepatozellulären Karzinom und dem malignen Lymphom beschrieben (CRAWFORD et al. 1982, WINTER et al. 1992, LANG et al. 1998, ZALCMAN et al. 1998, VOGL et al. 2000, WARNAKULASURIYA et al. 2000, TANG et al. 2001, VOLKMANN et al. 2002). Die Generierung dieser Autoantikörper scheint im direkten Zusammenhang mit p53-Mutationen zu stehen. Diese führen in Form von Missense-Mutationen zu einer Stabilitätserhöhung des p53-Proteins, wodurch es im Gegensatz zum „Wildtypprodukt“, das bei einer Halbwertszeit von 20 Minuten rasch abgebaut wird (REICH et al. 1983, FINLAY et al. 1988), in der Zelle akkumuliert und somit zu einem starken immunogenen Stimulus führt (DAVIDOFF et al. 1991, HOUBIERS et al. 1995, LUBIN et al. 1995a). Dabei konnte übereinstimmend gezeigt werden, dass sich die Autoantikörper nur zum Teil direkt gegen die mutierten Epitope des p53-Proteins richten (SCHLICHTHOLZ et al. 1992, WINTER et al. 1992, LABRECQUE et al. 1993, WILD et al. 1995, VON BREVERN et al. 1996). DAVIDOFF et al. (1992) postulierten, dass bei dem Mammakarzinom ein immunogener Stimulus auf einer Komplexierung von p53-Proteinen, die von mutierten Genen kodiert werden, mit dem Hitzeschockprotein 70 beruht. Aufgrund der Tatsache, dass anti-p53-Antikörper oft schon Monate vor einer malignen Entartung bzw. einem Tumorrückfall generiert werden und dabei einen spezifischen Indikator für Mutationen im p53-Tumorsuppressorgen darstellen, können sie zur Überwachung von Risikopatienten bzw. posttherapeutischen Beobachtung von Patienten herangezogen werden (LANE u. BENCHIMOL 1990, LENNER et al. 1999, CASTELLI et al. 2001). So traten bei Rauchern, die an einem Lungenkarzinom erkrankten, schon Monate vor der Diagnose zirkulierende anti-p53-Autoantikörper auf (LUBIN et al. 1995b). CASTELLI et al. (2001) konnten zeigen, dass 69% der Patienten, die ein orales Plattenepithelkarzinom entwickelten, bereits im prämalignen Stadium anti-p53Antikörper generierten. Des Weiteren wurde an Arbeitern, die über Jahre Vinylchlorid ausgesetzt waren, beobachtet, dass bereits vor der Entwicklung eines Hämangiosarkoms antip53-Antikörper zu detektieren waren (TRIVERS et al. 1995). ZALCMAN et al. (1998) haben an Lungenkrebspatienten festgestellt, dass der anti-p53-Autoantikörper-Titer während einer Literaturübersicht 31 erfolgreichen Chemotherapie rapide abnimmt. Des Weiteren wurde von vielen Autoren postuliert, dass das Auftreten von anti-p53-Autoantikörpern bei neoplastischen Erkrankungen mit einer schlechten Prognose für den Patienten einhergeht (LUBIN et al. 1995a, LENNER et al. 1999, TANG et al. 2001, HOFELE et al. 2002). 2.4.1.4 Autoantikörper gegen Hitzeschockproteine Hitzeschockproteine (Hsp) stellen stark immunogene, phylogenetisch hochkonservierte Proteine dar, die nach der Exposition verschiedener Stressfaktoren wie Wärme, Oxidantien, Schwermetalle, Bakterien und Viren im Rahmen zellulärer Schutzmechanismen zytoplasmatisch exprimiert werden (LINDQUIST 1986, LATCHMAN 1991). In malignen Zellen sind diese Proteine regelmäßig überexprimiert, was vereinzelt mit der Produktion von anti-HspAutoantikörpern korreliert. So konnten OKA et al. (2001) zeigen, dass Patienten, die an einem Lungenkarzinom erkrankt waren, anti-Hsp40-Autoantikörper produzierten und im korrespondierenden Tumorgewebe eine Überexpression von Hsp40 vorlag. Autoantikörper gegen Hsp90 wurden bei Patienten angetroffen, die an einem Osteosarkom (Inzidenz: 40%) bzw. Mammakarzinom (Inzidenz: 37%) erkrankt waren (CONROY u. LATCHMAN 1996, TRIEB et al. 2000). Bei den letztgenannten korrelierte die Produktion der Autoantikörper mit der Überexpression von Hsp90 im Tumorgewebe (CONROY et al. 1995). Brustkrebspatientinnen und Patientinnen mit gynäkologischen Tumoren generierten zudem anti-Hsp27-Autoantikörper (FANELLI et al. 1998, KORNEEVA et al. 2000) mit Inzidenzen zwischen 38% und 50%. Das Auftreten dieser Autoantikörper korrelierte bei dem Mammakarzinom mit einer verlängerten Überlebensrate (CONROY et al. 1998a), wobei ein positiver Befund für antiHsp90-Autoantikörper mit einer schlechten Prognose einherging (CONROY et al. 1998b). 2.4.1.5 Autoreaktive Antikörper gegen onkoneuronale Antigene Bei etwa 1% aller Tumorpatienten führt die ektopische Expression neuronaler Antigene in malignen Zellen zu einer starken Stimulation der humoralen Immunantwort (INUZUKA 2000). Die Produktion sogenannter anti-onkoneuronaler Autoantikörper geht dabei meist mit der Ausprägung paraneoplastischer neurologischer Symptome einher (POSNER u. DALMAU 2000, SUTTON 2002). Diese treten zumeist vor der Detektion des zugrunde liegenden Tumors auf, so dass ein positiver Autoantikörpernachweis den entscheidenden Hinweis auf ein neoplastisches Geschehen geben kann (TANAKA et al. 1995, INUZUKA 2000). In Tab. 8 ist eine Übersicht über einige klinisch relevante anti-onkoneuronale Antikörper beim Menschen dargestellt. Das Hu-Antigen, das normalerweise in den Zellkernen von Neuronen exprimiert wird und ein m-RNA-Bindungsprotein darstellt (MARISICH et al. 1994), wird ektopisch in den malignen Zellen des kleinzelligen Lungenkarzinoms exprimiert (DARNELL 1996, POSNER u. DALMAU 2000). Bei 80% aller Patienten, die anti-Hu-Autoantikörper produzieren, liegt ein kleinzelliges Lungenkarzinom vor, so dass anti-Hu-Antikörper übereinstimmend als spezifischer Marker für das kleinzellige Lungenkarzinom angesehen werden (ANDERSON et al. 1988, DALMAU et al. 1990, LUCCHINETTI et al. 1998, INUZUKA 2000). Zudem korreliert das Auftreten von anti-Hu-Antikörpern mit einer verbesserten Überlebensrate im Vergleich zu seronegativen Patienten und einer guten Ansprechbarkeit auf Chemotherapie (DALMAU et al. 1990, GRAUS et al. 1997). Dass Krebspatienten mit 32 Literaturübersicht paraneoplastischen neurologischen Symptomen generell eine verbesserte Überlebenschance aufweisen, wurde auch von POSNER u. DALMAU (2000) u. SUTTON (2002) beschrieben. Anti-Yo-Antikörper, die sich gegen die zytoplasmatischen onkoneuronalen Purkinje-ZellAntigene CDR 34, CDR 62-1 und CDR 62-2 richten (POSNER u. DALMAU 2000), werden als spezifisch für den Brustkrebs und gynäkologische Tumoren angesehen. Sie werden fast ausschließlich bei weiblichen Patienten angetroffen, die an einem der genannten Tumoren erkrankt sind (DRLICEK et al. 1997, INUZUKA 2000). Tab. 8 Antikörper anti-Hu (ANNA-1) Anti-onkoneuronale Antikörper bei Tumorerkrankungen des Menschen in verschiedenen Literaturangaben assoziierter Tumor Enzephalomyelitis, akute ANDERSON et al. Lungenkarzinom sensorische und autonome 1988, GRAUS et al. Neuropathie 1997, INUZUKA 2000 zerebelläre Degeneration TANAKA et al. 1995, Mammakarzinom, (PCA-1) Ovarkarzinom (ANNA-2) Zitat kleinzelliges anti-Yo anti-Ri Klinik INUZUKA 2000 Mammakarzinom, zerebelläre Degeneration, INUZUKA 2000, Ovarkarzinom, kleinzelliges Myoklonus PITTOCK et al. 2003 kleinzelliges „Lambert-Eaton POSNER u. DALMAU Lungenkarzinom Myasthenic-Syndrom“ 2000, SUTTON 2002 Mammakarzinom, „Stiff man syndrome” INUZUKA 2000, Lungenkarzinom anti-VGCC anti-amphiphysin Thymom POSNER u. DALMAU 2000 anti-CAR (Recoverin) kleinzelliges Lungenkarzinom u. andere Photorezeptordegeneration INUZUKA 2000, POSNER u. DALMAU 2000 Literaturübersicht 2.4.2 33 Hypothesen zur pathophysiologischen Bedeutung autoreaktiver Antikörper Es wird vielfach postuliert, dass autoreaktive Antikörper, die in den Seren von Tumorpatienten angetroffen werden, direkte tumorsuppressive Eigenschaften besitzen (WINTER et al. 1993, IAKOUBOV u. TORCHILIN 1997, KOZYR et al. 2000, TORCHILIN et al. 2001). Diese Hypothese stützt sich auf das klinische Erscheinungsbild seropositiver Patienten und auf die Beobachtungen, die in Tier- bzw. in vitro-Versuchen gemacht werden konnten. Charakteristika autoantikörperpositiver Tumorpatienten und Beobachtungen aus Tier- und in vitro-Versuchen Das Wachstumsverhalten der Tumoren ist bei autoantikörperpositiven Patienten, wie u.a. für ANA (BLAES et al. 2000, SYRIGOS et al. 2000), anti-Hsp- (CONROY et al. 1998a) oder anti-onkoneuronale Antikörper (DALMAU et al. 1990, GRAUS et al. 1997, SUTTON 2002) bekannt, oftmals weniger aggressiv. Dies geht letztlich mit einer verlängerten Überlebensrate der Patienten (CONROY et al. 1998a, BLAES et al. 2000, SYRIGOS et al. 2000) und guter Ansprechbarkeit auf Therapeutika (GRAUS et al. 1997, TRIEB et al. 2000) einher. In Tierversuchen konnte vielfach beobachtet werden, dass autoreaktive Antikörper einen direkten antitumoralen Effekt ausüben. So unterdrückte ein monoklonaler antinukleärer Antikörper das Wachstum eines chemotherapieresistenten T-Zell-Lymphoms in Mäusen und verlängerte die Überlebensrate von Mäusen, bei denen ein Melanom induziert wurde (IAKOUBOV et al. 1995, IAKOUBOV u. TORCHILIN 1997). Bei Mäusen, deren Tumorzellen das Antigen HuD exprimierten, konnte nach der Immunisierung mit HuD-cDNA eine Tumorregression beobachtet werden (REEVES 2001). KOZYR et al. (2000) konnten nach in vitro-Versuchen zeigen, dass anti-DNA-Antikörper, die von Patienten mit SLE bzw. chronisch lymphatischer Leukämie stammten, einen zytotoxischen Effekt auf bestimmte Tumorzelllinien ausübten. Ein zytotoxischer Effekt in Form einer Apoptoseinduktion wurde zudem bei der Inkubation von anti-ds-DNA-Antikörpern, die von Menschen mit SLE bzw. chronisch lymphatischer Leukämie stammten, mit Mesangiumzellen (TSAI et al. 1992), Endothelzellen (LAI et al. 1997), Lymphozyten (SHOENFELD et al. 1985) und verschiedenen Tumorzelllinien (KOZYR et al. 2002) beobachtet. Anti-HER-2/neu-Antikörper sind in der Lage, das Zellwachstum von Tumorzelllinien zu unterdrücken, die eine Überexpression von c-erbB aufweisen (HUDZIAK et al. 1989, FENDLY et al. 1990). Dieser Effekt wurde in vivo bei Brustkrebspatientinnen ebenso beobachtet und hat in der erfolgreichen Applikation des Medikamentes Herceptin® bereits seine Anwendung gefunden (MEHIGAN u. KERIN 1999, HARRIS u. SMITH 2002). Hypothesen zum pathophysiologischen Effekt Über die zugrunde liegenden Pathomechanismen, die einen antitumoralen Effekt auslösen, wurden bislang nur Spekulationen angestellt. Übereinstimmend wird davon ausgegangen, dass die Autoantikörper zunächst an die Zellmembran der Zielzellen binden, was hypothetisch durch Nukleosomen oder Kreuzreaktivitäten vermittelt werden kann, oder aber eine Internalisierung der Autoantikörper stattfindet und sie somit einen zytotoxischen Effekt ausüben können. 34 Literaturübersicht Nukleosomentheorie Nukleosomen sind Wiederholungssequenzen in den Chromatiden, die im Rahmen apoptotischer Vorgänge durch zelluläre Endonukleasen in mono- und oligonukleosomale Fragmente gespalten werden (SCHWARTZ u. OSBORNE 1993). Es konnte gezeigt werden, dass bei der in vitro-Kultivierung von Fibroblasten (KOUTOUZOV et al. 1996), B- und T-Lymphozyten (MECHERI et al. 1993, WATSON et al. 1995 u. 1999), Monozyten (EMLEN et al. 1992) und verschiedenen Tumorzelllinien (JACOB et al. 1989, IAKOUBOV u. TORCHILIN 1998) Nukleosomen aus apoptotischen Zellen in das Nährmedium gelangen und an die Oberflächenmembran vitaler Kulturzellen binden. Diese zellgebundenen Nukleosomen sollen die Zielstruktur von ANA darstellen und somit maßgeblich an der pathophysiologischen Bedeutung dieser Autoantikörper beteiligt sein (KOUTOUZOV et al. 1996, TORCHILIN et al. 2001). Es konnte gezeigt werden, dass zwei monoklonale ANA, die aus nicht immunisierten älteren Mäusen gewonnen wurden, an die Zellmembran von Tumorzellen mittels Nukleosomen binden (IAKOUBOV u. TORCHILIN 1997). Diese Bindung konnte bei einem der beiden Antikörper durch eine Dexamethason- bzw. Vincristin-Zugabe in das Nährmedium um das 50fache gesteigert werden, da die Wirkstoffzugabe in einem partiellen Zelltod mit massiver Nukleosomenfreisetzung resultierte (IAKOUBOV u. TORCHILIN 1998). Des Weiteren konnte bei dem SLE beobachtet werden, dass die Bindung von anti-ds-DNA-Antikörpern an die Mesangiumzellen der Nierenglomerula durch Nukleosomen vermittelt wird (TERMAAT et al. 1990 u. 1992). So sollen Nukleosomen zum einen die Zielstrukturen für ANA darstellen, zum anderen wird von vielen Autoren postuliert, dass sie den immunogenen Stimulus zur Produktion von ANA – insbesondere bei systemischen Autoimmunerkrankungen wie dem SLE – darstellen (MOHAN et al. 1993, BURLINGAME et al. 1994, KOUTOUZOV et al. 1996). Kreuzreaktivität Für anti-DNA-Antikörper wird ebenso postuliert, dass sie aufgrund von Kreuzreaktivitäten an die Zellmembran ihrer Zielzellen binden (RAZ et al. 1993). So konnte gezeigt werden, dass anti-DNA-Antikörper Proteoglykane (FAABER et al. 1984), Zytoskelettproteine (ANDRÉSCHWARTZ et al. 1984), verschiedene Sulfate (FAABER et al. 1986) und Zelloberflächenproteine (JACOB et al. 1984, RAZ et al. 1993), die sich nicht von Nukleosomen ableiten, binden. Internalisierung von Autoantikörpern Dass Antikörper lebende Zellen inklusive des Zellkerns penetrieren können – dies wurde lange Zeit kategorisch ausgeschlossen – wurde wiederum für anti-ds-DNA-Autoantikörper beschrieben (SCHUSTER et al. 1992, ALARCON-SEGOVIA et al. 1996, KOZYR et al. 2002). Zytotoxischer Effekt Es wird angenommen, dass zellmembrangebundene Autoantikörper einen zytotoxischen Effekt in Form einer antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC) ausüben oder aber intrazelluläre Enzymkaskaden aktivieren, die in einer Apoptose der Zellen resultieren Literaturübersicht 35 (IAKOUBOV u. TORCHILIN 1998, TORCHILIN et al. 2001, KOZYR et al. 2002). Eine Komplement-vermittelte Lyse wird mit großer Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen, da diese bei eukaryotischen Zellen wenig effektiv ist (JANEWAY et al. 2003). Zum anderen konnte von KOZYR et al. (2000) gezeigt werden, dass ein zytotoxischer Effekt mit reinen FabFragmenten ebenso auszulösen ist. Des Weiteren wird spekuliert, dass autoreaktive Antikörper anstelle der normalen Liganden an „Fibroblasten assoziierte“ (Fas)- bzw. Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α)-Rezeptoren binden und somit eine Apoptose der Zellen induzieren (ENGELMANN et al. 1990, OGASAWARA et al. 1995). Für internalisierte anti-DNAAutoantikörper konnte gezeigt werden, dass diese wichtige Zellfunktionen blockieren (LAI et al. 1997), eine Apoptose induzieren (TSAI et al. 1993) oder zur direkten Hydrolisierung der DNA führen (SCHUSTER et al. 1992, KOZYR 1996, KOZYR et al. 2002). 2.5 Autoreaktive Antikörper und neoplastische Erkrankungen des Hundes Bislang liegen in der zugänglichen Literatur nur sehr wenige Berichte bzw. Untersuchungen über das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern bei neoplastischen Erkrankungen des Hundes vor. Vereinzelt wird über die Entwicklung von ANA bei caninen Tumorpatienten berichtet. So beobachtete SHULL et al. (1983) bei einem Hund, der an einer Granulozytenleukämie erkrankt war, das Auftreten von anti-DNA-Autoantikörpern. In einer weiteren Untersuchung waren bei 4 von insgesamt 20 untersuchten Tieren, die an einem malignen Lymphom erkrankt waren, ANA gegen extrahierbare Kernantigene nachzuweisen (WHITE et al. 1992). In der Arbeit von WAGNER (2002) wurde über ein „ANA-positives“ Tier innerhalb eines gemischten Patientenkollektives mit insgesamt 120 Tumorpatienten berichtet. KROTJE et al. (1990) beschreiben in einem Fallbericht die Entwicklung einer Myasthenia gravis bei einem Hund, der an einem cholangiozellulären Karzinom erkrankt war, und diskutieren, ob dies als paraneoplastisches Symptom zu werten ist. In einer Arbeit neueren Datums wurde in Anlehnung an den Menschen erstmalig das Auftreten von anti-p53-Antikörpern bei caninen Tumorpatienten untersucht (KANAYA et al. 2002). Insgesamt gingen in diese Studie 16 Patienten ein, die an unterschiedlichsten Tumoren erkrankt waren. Bei vier dieser Patienten, die an einem malignen Melanom, Leydigzelltumor, malignen Myoepitheliom und einem malignen Perianaltumor erkrankt waren, konnten zirkulierende anti-p53-Autoantikörper nachgewiesen werden. Dies ging in einem Fall mit einer Missense-Mutation des p53-Gens im korrespondierenden Tumorgewebe einher. Mit Ausnahme der genannten Studie von WAGNER (2002) wurden bislang keine größeren onkologischen Patientenkollektive auf das Vorhandensein von autoreaktiven Antikörpern untersucht. Somit sind das Auftreten und die klinische Relevanz dieser Immunglobuline insbesondere bei einzelnen definierten Tumorerkrankungen des Hundes weitestgehend unbekannt. 36 3 Material und Methoden Material und Methoden 3.1 Geräte und Materialien 3.1.1 Geräte Aqua dest. Aufbereitungsanlage, „SG Umkehr(Wasser- und Regenerierstation, Osmoseanlage Typ RO 50/14 SMB TypI“ Barsbüttel) Aqua tridest. Aufbereitungsanlage, „SG (Wasser- und Regenerierstation, Reinstwasser System Typ SG-RS 90-4 UF“ Barsbüttel) Autoklav, „Typ GE406“ (Getinge AB, Getinge, Schweden) Bodenzentrifuge, „UJIIKS“ (Hereaus-Christ, Hanau) Bunsenbrenner mit automatischer Zündung, (Wartewig, Göttingen) „Gasprofi1“ CO2-Brutschrank, „Typ BK5060E“ (Hereaus-Christ, Hanau) Durchflusszytometer mit Computereinheit, (Becton Dickinson, Heidelberg) ® „Fluorescence Activated Cell Analyser (FACScan )“ Eismaschine, „Typ UBE 30-10“ (Ziegra, Isernhagen) Elektrophoresekammer, „Mini-Protean II“ (BioRad, München) Photometer, „MR 5000“ (Dynatech, Guernsey Island, England) (Zeiss, Oberkochen) Fluoreszenzmikroskop mit PloemIlluminator und Phasenkontrasteinrichtung Okular: Kpl 10xW Objektive: Ph2 Neofluar 16/0,40 Ph2 Neofluar 40/0,75 Planneofluar 63 x/1,25; Öl Filtereinsatz 09: Erregerfilter 450-490nm Farbteiler 510nm Sperrfilter 520nm Gel-Trockner, „Model 543“ Invertmikroskop Okular: CPL W 10x/18 Objektive: Ph1-F-LD 20/0,25 Ph1 10/0,22 Kühlzentrifuge, „Varifuge K Typ 4500“ Laborfeinwaage, „B6“ Laborwaage, „BL310“ Magnetrührer mit Heizplatte, „IKAMAGRH“ Mikroliterpipetten, einstellbar, „pipetman“ (100-1.000 µl, 20-200 µl, 10-100 µl, 1-20 µl) Netzgerät, „E452“ (300 mA/500V) pH-Meter, „766 Calimatic“ (BioRad, München) (Zeiss, Oberkochen (Hereaus-Christ, Hanau) (Mettler, Zürich, Schweiz) (Sartorius, Göttingen) (Janke u. Kunkel, Staufen) (Gilson, Villers Le Bel, Frankreich) (Keutz, Reiskirchen) (Knick, Berlin) Material und Methoden 37 Pipette, „Transferpette®“, 50-200 µl Pipettierhilfe, „accu-jet®“ Röhrchen-Schüttler, „Typ Reamix“ Rüttler für Mikrotiterplatten, „AM69 Microshaker“ Schwenker, „Typ Mini-Taumler“ sterile Werkbank, „Hereaus Lamin Air® HLB 2472“ Tischzentrifuge, „Chemico“ mit Winkelrotor für 1,5 ml Reaktionsgefäße Tischzentrifuge, „Labofuge 400“ Tischzentrifuge, „Megafuge 1.OR“ Wärmebad, „Typ E-Brue/PU“ Wippschüttler, „GFL“ Zellzählkammer nach Bürker 3.1.2 (Brand, Wertheim) (Brand, Wertheim) (ASID, Unterschleißheim) (Dynatech, Zug, Schweiz) (Heidolph, Nürnberg) (Hereaus-Christ, Hanau) (Wifug, Bradford, England) (Hereaus-Christ, Osterode) (Hereaus-Christ, Osterode) (Julabo, Seelbach) (Jürgens, Hannover) (Brand, Wertheim) Verbrauchsmaterialien Butterfly-Kanüle, „Micro-FloTM“, 21 G, 0,8 mm Combitips plus, 0,5 ml Combitips plus, 2,5 ml Deckgläser, 24 mm x 50 mm Einmalspritze Luer, 5 ml Einmalspritze Luer, 50 ml, „Plastipak®“ Eppendorf-Reaktionsgefäß mit Deckel, 1,5 ml Filter, 0,2 µm „Sartobran-PH Capsule Sartobran®” Filterpapier Kanülen, 0,9 x 40 mm (Industria Biomedica, Mailand, Italien, Nr. AS2102) (Eppendorf, Hamburg, Nr. 0030069.420) (Eppendorf, Hamburg, Nr. 0030069) (Menzel, Braunschweig, Nr. 2243682) (AMEFA, Limburg, Nr. 302010) (Becton Dickinson, Drogheda, Irland, Nr. 300865) (Greiner, Frickenhausen, Nr. 616201) (Sartorius, Göttingen, Nr. 5231307H7SOB) (Schleicher&Schnell, Dassel, Nr. 426392) (Becton Dickinson, Heidelberg, Nr. 301300) Laborflaschen mit Gewinde, 100 ml und 500 ml (VWR international, Hannover, Nr. 66593630/6659364099) Mikrotiterplatte, 96-Loch, Flachboden, steril (Corning, New York, USA, Nr. 3799) Mikrotiterplatten, 96-Loch, Rundboden, steril (Corning, New York, USA, Nr 3799) Mikrotiterplatte, 96- Loch, Rundboden, unsteril (Greiner, Frickenhausen, Nr. 650101) ® „Multipette pro“ (Eppendorf, Hamburg, Nr. 4985000.013) Objektträger (FARA) (Dynatech, Denkendorf, Nr. CL012B) Pasteurpipetten, 15 cm und 23 cm, Glas (Nunc, Hereford, England, Nr. D810/D812) Pipettenspitzen, blau und gelb (Sarstedt, Nürnbrecht, Nr. 70/762002 u. 70/760002) Pipettenspitzen, „gel loader tips“ (Biozym, Oldendorf, Nr. 729011) ® Pipettenspitzen, „Plastibrand “, 0,5 µl-20 µl (Brand, Wertheim, Nr. 702565) Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 ml (Becton Dickinson, Heidelberg, Nr. 352008) 38 Material und Methoden serologische Pipetten, 10 ml Serumröhrchen, 10 ml Vacutainer® Brand Luer Adapter Vacutainer® Röhrchen, 10 ml, mit Natrium-Heparin, 170 IU Vacutainer® Systems Halter Vinylhandschuhe, „Gentle Skin®” „Vivapure Protein A Mini spin column” „Vivaspin 500”, MWCO: 50000 Da Western-Blot-Streifen mit HEp-2-Antigenen Zellkulturflaschen, 50 ml Zellkulturflaschen, 200 ml Zentrifugenröhrchen, 15 ml, graduiert mit Schraubverschluss Zentrifugenröhrchen, „Falcon”, 50 ml, graduiert mit Schraubverschluss 3.1.3 (Sarstedt, Nürnbrecht, Nr. 86.1254.01) (Sarstedt, Nürnbrecht, Nr. 26.367) (Becton Dickinson, Heidelberg, Nr. 367300) (Becton Dickinson, Heidelberg, Nr. 3683480) (Becton Dickinson, Heidelberg, Nr. 364887) (Meditrade, Kiefersfelden, Nr. 1221R) (Vivascience, Hannover, Nr. VS-PA01PA24) (Vivascience, Hannover, Nr. VS0131) (Euroimmun, Lübeck, Nr. 1520-1601) (Nunc, Hereford, England, Nr. 156367) (Nunc, Hereford, England, Nr. 147589) (Corning, New York, USA, Nr. 430791) (Corning, New York, USA, Nr. 430829) Reagenzien Aceton, reinst Acridinorange Acrylamid-ultrograde (AA) Albumin Standard Lösung (2 mg/ml) („BCAProtein-Assay Reagent Kit“) Ameisensäure, reinst Ammoniumpersulfat (APS) Ampholine pH 3,5-10 BCA-Reagent A („BCA-Protein-Assay Reagent Kit”) BCA-Reagent B („BCA-Protein-Assay Reagent Kit”) Bisacrylamid (BA) bovines Serum Albumin (BSA), Fraktion V 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) Bromphenolblau Concanavalin A (ConA) Coomassie-Brilliant-Blau Dimethylsulfoxid (DMSO) 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (J.T. Baker, Deventer, Holland, Nr. 8002) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. A6014) (Pharmacia LKB, Freiburg, Nr. 80-1128-10) (Pierce, Rockford, USA, Nr. 23225) (J.T. Baker, Deventer, Holland, Nr. 6062) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. A-7460) (Pharmacia LKB, Freiburg, Nr. 80-1125-91) (Pierce, Rockford, USA, Nr. 23225) (Pierce, Rockford, USA, Nr. 23225) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. M-7279) (PAA, Linz, Österreich, Nr. K41-001-100) (Euroimmun, Lübeck, Nr. 1520-1601G) (Serva, Heidelberg, Nr. 42940) (Pharmacia LKB, Freiburg, Nr. 17-0450-01) (Serva, Heidelberg, Nr. 17524) (J.T.Baker, Deventer, Holland, Nr. 7033) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. M-2128) Material und Methoden Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Ethanol, absolut Evansblau ExtrAvidin®-Alkalische Phosphatase Fetales Kälberserum (FCS) Flächendesinfektionsmittel, „Antifect®“ Fluoreszeinisothiocyanate (FITC) Glycerin Glycin Händedesinfektionsmittel, „Sterillium®” Immersionsöl Iscove-Trockenmedium Isopropanol Kaliumchlorid (KCl), kristallin Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat (Cu [SO4] x 5 H2O) L-Glutamin Lymphozytenseparationsmedium, isoton, Dichte 1077 g/l Magnesiumchlorid (MgCl2 x 6 H2O) 2-Mercaptoethanol Methanol, reinst Molekulargewichtsstandard, „Mark 12TM” Natriumazid (NaN3), 10%ig Natriumbicarbonat (NaHCO3) Natriumchlorid (NaCl) Natriumhydroxyd-Pellets, wasserfrei Natriumhypochlorit-Lösung, 12%ig N-(2-Hydroxylethyl)piperazin-N’(-ethansulfonsäure), „Hepes dry substance“ (HEPES) N,N,N`,N`-Tetramethylethylenediamin (TEMED) Paraformaldehyd PBS Dulbecco, Instant (9,55 g/l, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) Penicillin(-G)-Streptomycin (10.000 U/ml und 10000 µg/ml) Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) Propidiumjodid (PJ) RPMI 1640-Medium, Trockensubstanz Salzsäure (HCl), konzentriert (37%) Saponin Sodiumdodecylsulfate (SDS) 39 (Merck, Darmstadt, Nr. 6580) (J.T. Baker, Deventer, Holland, Nr. 8228) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. 2129) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. E-2636) (Biochrom, Berlin, Nr. SO113/413B) (Schülke&Mayr, Norderstedt, Nr. 08360425) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. F7250) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. G-7757) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. G-7126) (Bode Chemie, Hamburg, Nr. 669) (Merck, Darmstadt, Nr. 1.046990100) (Biochrom, Berlin, Nr. T046-10) (Roth, Karlsruhe, Nr. 9866.4) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. P-4504) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. 7778-77-0) (Roth, Karlsruhe, Nr. 8175.1) (Biochrom, Berlin, Nr. K0283) (PAA Laboratories, Linz, Österreich, Nr. J15-004) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. M-0250) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. M-6250) (J.T. Baker, Deventer, Holland, Nr. 8046) (Novex, San Diego, USA, Nr. LC5677) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. S-2002) (Biochrom, Berlin, Nr. L1703) (Roth, Karlsruhe, Nr. 9265.2) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. S-5881) (Roth, Karlsruhe, Nr. 9062) (Biochrom, Berlin, Nr. L-1603) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. T-8133) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. P6148) (Biochrom, Berlin, Nr. L-182-10) (Biochrom, Berlin, Nr. A2213) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. P-8139) (Calbiochem, Bad Soden, Nr. 537059) (Biochrom, Berlin, Nr. T121-10) (J.T. Baker, Deventer, Holland, Nr. 6081) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. S-2149) (BioRad, München, Nr. 161-0303) 40 Material und Methoden Staphylokokken-Enterotoxin A, lyophilisiert Trisma Base (Tris[hydroxymethyl]aminomethan) Trypanblau Trypsin/EDTA-Solution UniversalpufferPlus® 3.1.4 (Sigma-Aldrich, Heidelberg, Nr. S-9399)) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nr. T-1502) (Ega-Chemie, Steinheim, Nr. 23850) (Biochrom, Berlin, Nr. L2153) (Euroimmun, Lübeck, Nr. DW1520-1601G) Antikörper 3.1.4.1 Nachweisantikörper Bei den in Tab. 9 aufgeführten Sekundärantikörpern handelt es sich um affinitätschromatographisch aufgereinigte, polyklonale Antikörper. Mit Ausnahme des zuletzt dargestellten Sekundärantikörpers, der zur Markierung boviner Referenzzellen diente, wurden sie zum Nachweis caniner autoreaktiver Antikörper eingesetzt. Tab. 9 Bezeichnung, Eigenschaften und Bezugsquellen der Sekundärantikörper, die zum Nachweis caniner Autoantikörper eingesetzt wurden (Ausnahme1)) Bezeichnung Spezifität FITC-KaαHd- canines IgG (H+L) IgG (H+L) Herkunft Konjugat Endkonz. Bezugsquelle Kaninchen FITC 15 µg/ml Dianova, (in PBS) Nr. 304-095003 FITC-ZgαHd- canines IgG (H+L) IgG (H+L) Ziege FITC 5 µg/ml (in MIF- Kirkegaard& Saponin-Puffer) Perry, Nr. 02-19-06 Biotin- canines ZgαHd-IgG IgG (H+L) Ziege Biotin 0,1 µg/ml (in Kirkegaard& Universalpuffer) Perry, Nr. 16-19-06 (H+L) FITC-ZgαHd- canines IgG (Fc) IgG (Fc) Ziege FITC 5 µg/ml (in MIF- Kirkegaard& Saponin-Puffer) Perry, Nr. 02-19-02 FITC-ZgαHd- canines IgM (Fc) IgM (Fc) Ziege FITC 5 µg/ml (in MIF- Kirkegaard& Saponin-Puffer) Perry, Nr. 02-19-03 murines FITCZgαMa-IgG, IgG (H+L) 1) IgM (H+L) IgM (H+L) Ziege FITC 15 µg/ml Dianova, (in MIF-Puffer) Nr. 115-015068 Dieser Sekundärantikörper wurde zur Markierung boviner Referenzzellen eingesetzt. Dianova: Hamburg, Kirkegaard&Perry: Gaithersburg, England. Endkonz: Endkonzentration. Material und Methoden 41 3.1.4.2 Monoklonaler Antikörper gegen bovine Zelloberflächenstrukturen Zur Herstellung boviner mononukleärer Referenzzellen diente ein in der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover produzierter und charakterisierter (REBESKI 1990) monoklonaler Antikörper (mAk), der bovine MHC-Klasse I Moleküle erkennt (mAk Bo1, SCHUBERTH et al. 1991). 3.1.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen 3.1.5.1 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung Zur Herstellung der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) wurde 9,55 g einer kommerziell erhältlichen PBS-Trockensubstanz in 1000 ml Aqua tridest. gelöst. Die Zusammensetzung der Lösung war dann wie folgt: NaCl Na2HPO4 8 g/l 1,24 g/l KCl 0,2 g/l KH2PO4 0,2 g/l Der pH-Wert der Lösung wurde mit HCl/NaOH auf 7,4 eingestellt. 3.1.5.2 Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, doppelt konzentriert Zur Herstellung der doppelt konzentrierten phosphatgepufferten Kochsalzlösung (2 x PBS) wurde doppelt so viel (19,1 g) PBS-Trockensubstanz eingesetzt und mit Aqua tridest. auf 1000 ml ergänzt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit HCl/NaOH auf 7,4 eingestellt. 3.1.5.3 Lösungen für den fluoreszenzserologischen Nachweis autoreaktiver Antikörper a) Methanol-Aceton-Lösung zum Fixieren der HEp-2-Zellen Die Methanol-Aceton-Lösung wurde durch Mischen gleicher Volumenanteile Methanol und Aceton hergestellt. Die fertige Lösung wurde anschließend bei -20°C gelagert. b) Evansblau-Färbelösung (0,1%) Zur Herstellung der Evansblau-Färbelösung wurden 100 mg Evansblau in 100 ml Aqua tridest. gelöst. 3.1.5.4 Lösungen und Puffer für den indirekten Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie a) Paraformaldehydlösung (4%) zum Fixieren von HEp-2-Zellen Paraformaldehyd (4 g) wurden in 100 ml PBS unter Wärmezufuhr gelöst. Vor dem Einsatz zur Fixation wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt. 42 Material und Methoden b) Paraformaldehydlösung (8%) zum Fixieren von caninen Leukämie-Zellen Paraformaldehyd (8 g) wurden in 100 ml PBS unter Wärmezufuhr gelöst. Vor dem Einsatz zur Fixation wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt. c) Wasch- und Verdünnungspuffer (0,5% MIF-Saponin-Puffer) Der Wasch- und Verdünnungspuffer (0,5% MIF-Saponin-Puffer) wurde wie folgt hergestellt: BSA 5 g NaN3 0,1 g Saponin PBS 5 g ad 1000 ml 3.1.5.5 Wasch- und Verdünnungspuffer für die indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer) Das Rezept zur Herstellung des Wasch- und Verdünnungspuffer für die indirekte Membranimmunfluoreszenz war: BSA 5 g NaN3 0,1 g PBS ad 1000 ml 3.1.5.6 Lösungen für die Durchflusszytometrie a) Trägerflüssigkeit zur Messung Die Trägerflüssigkeit bestand aus sterilfiltriertem PBS (Porenweite: 0,2 µm) mit Zusatz von Natriumazid (Endkonzentration: 1,5 mmol/l). b) Propidiumjodid Aus der kristallinen Trockensubstanz wurde mit Hilfe von PBS eine Stammlösung mit einer Konzentration von 100 µg/ml hergestellt. Diese wurde zu gleichen Teilen portioniert (1 ml) und bei -20°C eingefroren. Für die Durchflusszytometrie wurden 20 µl der Stammlösung in 1 ml Trägerflüssigkeit gegeben, so dass die Endkonzentration von Propidiumjodid 2 µg/ml betrug. c) Spüllösung Zur Spülung und Reinigung des Messkanal- und Schlauchsystems innerhalb des Durchflusszytometers wurde sterilfiltriertes Aqua tridest. (Porenweite: 0,2 µm) und 1%ige Natriumhypochlorit-Lösung (hergestellt durch 12fache Verdünnung einer 12%igen NatriumhypochloritLösung mit Aqua tridest.) verwendet. Material und Methoden 43 3.1.5.7 Lösung zur Zählung von Leukozyten Die Lösung zum Zählen von Leukozyten wurde aus 2,5 mg Acridinorange, das in 1000 ml PBS gelöst wurde, hergestellt. 3.1.5.8 Lösung für die Vitalitätsbestimmung und Zählung von HEp-2-Zellen Die Lösung für die Vitalitätsbestimmung und Zählung von HEp-2-Zellen wurde aus 100 mg Trypanblau, das in 100 ml PBS gelöst wurde, hergestellt. 3.1.5.9 Zellkulturmedien und Zusätze Alle im Folgenden aufgeführten Zellkulturmedien wurden nach der Herstellung sterilfiltriert (Porenweite: 0,2 µm) und bei -20°C gelagert. a) Fetales Kälberserum Fetales Kälberserum (FCS) wurde bei 56°C für 60 min im Wasserbad Komplement- und Mykoplasmen-inaktiviert, in sterilen Röhrchen zu gleichen Teilen portioniert und bei -20°C gelagert. b) Medium „R10F“ Dem RPMI 1640 Grundmedium (104,3 g RPMI 1640-Medium-Trockensubstanz in 10 l Aqua tridest. gelöst) wurden folgende Substanzen zugesetzt: L-Glutamin 2 mmol/l HEPES 15 mmol/l NaHCO3 18 mmol/l FCS 100 ml/l c) Medium „R10F+“ Das Medium „R10F+“ wurde aus dem R10F-Medium durch Zusatz von Penicillin-Streptomycin (Penicillin 100 IU/ml, Streptomycin 100 µg/ml) hergestellt. d) Medium „I10F“ Dem Iscove-Grundmedium (Iscove®-Trockenmedium in 10 l Aqua tridest. gelöst) wurden folgende Substanzen zugesetzt: L-Glutamin FCS 4 mmol/l 100 ml/l e) Medium „I10F+“ Das Medium „I10F+“ wurde aus dem I10F-Medium durch Zusatz von Penicillin-Streptomycin (Penicillin 100 IU/ml, Streptomycin 100 µg/ml) hergestellt. 44 Material und Methoden f) Stammlösungen der Superantigene und Mitogene Für die Stimulationsversuche mit caninen Lymphozyten wurden das Superantigen Staphylokokken Enterotoxin A (SEA) und das Mitogen Concanavalin A (ConA) als 7fach konzentrierte Stammlösungen der in vitro eingesetzten Endkonzentration (25 µl Mitogenstammlösung wurden auf 175 µl Volumen gegeben) bei -20°C vorrätig gehalten. Zur Herstellung dieser Mitogenlösungen wurden die lyophilisierten Substanzen mit I10F-Medium rekonstituiert und auf eine Konzentration von 7 ng/ml (SEA) bzw. 7 µg/ml (ConA) eingestellt. 3.1.5.10 Puffer für die Immunglobulin G-Aufreinigung Die Puffer für die Immunglobulin G-Aufreinigung wurden nach der Herstellung sterilfiltriert (Porenweite: 0,2 µm) und bei 4 oC aufbewahrt. a) Equilibrierungspuffer Der Equilibrierungspuffer setzte sich wie folgt zusammen: NaCl 2,92 g Kaliumphosphat 136 mg Aqua tridest. ad 100 ml Der pH-Wert der Lösung wurde mit HCl/NaOH auf 7,4 eingestellt. b) Eluierungspuffer Zur Herstellung des Eluierungspuffers wurden 750 mg Glycin in 100 ml Aqua tridest. gelöst und der pH-Wert anschließend mit HCl/NaOH auf 2,8 eingestellt. c) Neutralisationspuffer Zur Herstellung des Neutralisationspuffers wurden 12,1 g Trishydroxymethylaminomethan (Tris) in 100 ml Aqua tridest. gelöst und der pH-Wert anschließend mit HCl/NaOH auf 9 eingestellt. 3.1.5.11 Puffer und Lösungen für die Gelelektrophorese Für die Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden folgende Lösungen angesetzt: a) Elektrodenpuffer Tris 3,03 g Glycin 14,26 g SDS Aqua tridest. 1 g ad 1000 ml Material und Methoden 45 b) Trenngelpuffer (4x) Der vierfach-konzentrierte Trenngelpuffer war folgendermaßen zusammengesetzt: Tris 18,15 g SDS 0,4 g Aqua tridest. ad 100 ml Der pH-Wert der Lösung wurde mit HCl/NaOH auf 8,8 eingestellt. c) Sammelgelpuffer (4x) Der vierfach-konzentrierte Sammelgelpuffer enthielt folgende Komponenten: Tris 6,06 g SDS 0,4 g Aqua tridest. ad 100 ml Der pH-Wert der Lösung wurde mit HCl/NaOH auf 6,8 eingestellt. d) SDS-Probenpuffer (2x) Der zweifach-konzentrierte SDS-Probenpuffer setzte sich wie folgt zusammen: Tris 1,5 g SDS 4 g Glycerin 20 ml Bromphenolblau- 200 µl lösung (1%) Aqua dest. ad 100 ml Der pH-Wert der Lösung wurde mit HCl/NaOH auf 6,8 eingestellt. Für ein reduzierendes Gelsystem wurden dem SDS-Probenpuffer 2-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 100 µl/ml zugegeben. e) Acrylamid/Bisacrylamidstammlösung Die Acrylamid/Bisacrylamid (AA/BA)-Stammlösung bestand aus folgenden Komponenten: Acrylamid 30 g Bisacrylamid 0,8 g Aqua tridest. ad 100 ml 46 f) Material und Methoden Ammoniumpersulfatlösung Die Ammoniumpersulfat (APS)-Lösung wurde unmittelbar vor dem Gebrauch aus 100 mg Ammoniumpersulfat, das in 1 ml Aqua tridest. gelöst wurde, hergestellt. g) Coomassie-Brilliant-Blau Färbelösung Coomassie-Brilliant- Blau h) 120 mg Methanol 50 ml Essigsäure 20 ml Aqua dest. 50 ml Coomassie-Brilliant-Blau Entfärbelösung Methanol 150 ml Essigsäure 50 ml Aqua dest. 300 ml i) Trenngel (10%) Das Trenngel war bei einem Gelvolumen von 10 ml folgendermaßen zusammengesetzt: AA/BA (30:0,8) Trenngelpuffer (4x) 3,25 ml 2,5 ml Aqua tridest. 4,21 ml APS-Lösung 30 µl TEMED 10 µl j) Sammelgel (5%) Das Sammelgel war bei einem Gelvolumen von 5 ml folgendermaßen zusammengesetzt: AA/BA (30:0,8) 0,83 ml Trenngelpuffer (4x) 1,25 ml Aqua tridest. 2,87 ml APS-Lösung 50 µl TEMED 5 µl Material und Methoden 47 3.1.5.12 Lösungen für den Methyl-Thiazol-Tetrazolium-Test Für den Methyl-Thiazol-Tetrazolium-Test (MTT-Test) wurden folgende Lösungen hergestellt: a) MTT-Lösung Zur Herstellung der MTT-Lösung wurden 120 mg 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) in 50 ml PBS gelöst. b) Ameisensaures Isopropanol (0,5%) Zur Herstellung des ameisensauren Isopropanols (0,5%) wurden 2,5 ml Ameisensäure mit 500 ml Isopropanol vermischt. 3.1.5.13 Phorbol-Myristat-Acetat Die Stammlösung von 1 mmol/l Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) in Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde bei -100°C gelagert und bei Bedarf mit PBS zur Gebrauchslösung von 100 µmol/l oder 100 nmol/l verdünnt und in aliquoten Teilen zu 200 µl bei -20°C gelagert. 3.1.6 HEp-2-Western-Blot Testkit Folgenden Materialien aus insgesamt vier Testkits (Ch.B. S020307aa-74/62/35 und S021206aa-04) zu je 16 Blotstreifen wurden zur Untersuchung der Autoantikörperspezifitäten eingesetzt: - Blotstreifen aus einer Nitrozellulose-Membran mit HEp-2-Vollantigenen (nukleär, zytoplasmatisch, mitochondrial), die nach Zellextraktion durch diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt wurden. - UniversalpufferPlus® (10fach konzentriert); für die Gebrauchslösung wurden – gemäß der Herstellervorschrift – 5 ml UniversalpufferPlus® mit 45 ml Aqua. dest. angesetzt. - Substratlösung, gebrauchsfertig (Nitroblautetrazoliumchlorid/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat [NBT/BCIP]) - Auswerte-Schablone, diese bestand aus einem der o.g. Blotstreifen, der mit einem Referenzserum inkubiert wurde. - Inkubationswannen mit je 8 Rinnen 3.1.7 Zelllinien Zum Nachweis autoreaktiver Antikörper und in Funktionsanalysen wurde die HEp-2-Zelllinie (humane [epitheliale] laryngeale Karzinomzelllinie, American Type Culture Collection [ATCC], DEN BESTE et al. 1966) eingesetzt. In den Funktionsanalysen diente zudem die DH82-Zelllinie (Progenitorzellen aus dem Knochenmark eines Hundes, der an maligner Histiozytose erkrankt war, American Type Culture Collection [ATCC], BARNES et al. 2000) als Zielzelle. Bei beiden Zellarten handelt es sich um permanent, adhärent wachsende Kulturzelllinien. 48 Material und Methoden 3.2 Tiere Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Patientenseren stammten von Hunden, die in dem Zeitraum von November 2000 bis Mai 2003 in der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover ambulant oder stationär untersucht und behandelt wurden. a) Hunde mit neoplastischen Erkrankungen Insgesamt gingen 314 Seren, die von Tieren stammten, die an einem solitären oder multiplen Tumor erkrankt waren, in die Untersuchungen ein. Die Geschlechterverteilung der Patienten ist Tab. 10, die einzelnen Tumoren sind Tab. 11 zu entnehmen. Die Rassen sind in Tab. I des tabellarischen Anhangs aufgeführt. Das Alter der Patienten betrug im Median 8 Jahre (Minimalwert [Min]: 1 Jahr, Maximalwert [Max]: 17 Jahre). Die Blutentnahme erfolgte stets vor Therapiebeginn. Für sämtliche untersuchten Patienten lag das Ergebnis einer im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführten histopathologischen bzw. in der Klinik für Kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführten zytologischen Untersuchung des Tumors vor. Tab. 10 Geschlechterverteilung der caninen Tumorpatienten, deren Seren in der vorliegenden Studie auf das Vorhandensein von autoreaktiven Antikörpern untersucht wurden Geschlecht Anzahl untersuchter Anteil an Tiere (n) Gesamtpopulation M 153 48,7% K 14 4,5% W 127 40,5% S 20 6,3 % M: männlich, K: männlich kastriert, W: weiblich, S: weiblich kastriert. Material und Methoden Tab. 11 49 Histopathologische bzw. zytologische Diagnosen der Tumoren caniner Tumorpatienten (n = 314), deren Seren in der vorliegenden Studie auf das Vorhandensein von autoreaktiven Antikörpern überprüft wurden Tumoren benigne Mammatumoren benigner Mammamischtumor Adenom maligne Mammatumoren Adenokarzinom Spindelzellkarzinom maligner Mischtumor Tierzahl (n) 33 21 12 20 16 3 1 malignes Lymphom 40 B-Zell T-Zell ohne Immunphänotypisierung Leukämie (zytolog. Diagnose) ALL CLL Basophilenleukämie undifferenzierte Leukämie Megakaryozytenleukämie Erythrozytenleukämie multiples Myelom maligne Histiozytose Hauttumoren (Ausnahmen1)2)) Plattenepithelkarzinom1) Mastozytom malignes Melanom2) Histiozytom Papillom kutanes Osteosarkom (primär) Trichoepitheliom Hämangioperizytom Basaliom Hodentumoren Leydigzelltumor Seminom Sertolizelltumor 15 7 18 25 13 7 2 1 1 1 10 8 28 16 10 7 5 3 1 1 1 1 21 11 6 4 Legende: s. nachfolgeden Seite Tumoren Perianaltumoren Adenom der hepatoiden Drüsen Adenom der apokrinen Drüsen Karzinom der apokrinen Drüsen Knochen- und Knorpeltumoren Osteosarkom Chondrosarkom Chondrom Lidtumoren Adenom der Meibomschen Drüsen Adenom des Ziliarkörpers sonstige mesenchymale Tumoren Lipom Fibrom Hämangiom Pilomatrixom Hämangiosarkom Fibrosarkom Spindelzellsarkom Myxosarkom undifferenziertes Sarkom Synovialzelltumor sonstige epitheliale Tumoren Karzinome3) Nebenschilddrüsenadenom rektaler Polyp Gehirntumoren Meningiom Neurofibrom Insulinom Tierzahl (n) 12 9 1 2 18 15 2 1 12 11 1 19 9 8 1 1 10 8 1 1 1 1 25 22 1 1 2 1 1 3 50 Material und Methoden 1) 2) 3) oral (n = 10), pharyngeal (n = 3), kutan (n = 3). oral (n = 4), kutan (n = 3). Übergangszell- (n = 5), intestinales (n = 5), Schilddrüsen- (n = 2), Bronchial- (n = 2), Leber- (n = 3), Vaginal- (n = 2) Larynx- (n = 1), Lymphknoten- (n = 1) und Prostata- (n = 1). zytolog. Diagnose: zytologische Diagnose. b) Hunde mit sonstigen Erkrankungen Als Vergleichsgruppe dienten die Seren von 40 Hunden, bei denen aufgrund der klinischen Untersuchung zunächst ein Tumorverdacht bestand, der sich in der histopathologischen Untersuchung jedoch nicht bestätigt hat. Tab. 12 zeigt die Geschlechterverteilung dieser Tiere, die histopathologischen Diagnosen sind Tab. 13, die Rassen sind Tab. II im tabellarischen Anhang zu entnehmen. Das Alter der Vergleichsgruppe betrug im Median 7 Jahre (Min: 1 Jahr, Max: 13 Jahre). Tab. 12 Geschlechterverteilung der Hunde mit sonstigen Erkrankungen, deren Seren auf das Vorhandensein von autoreaktiven Antikörpern untersucht wurden Geschlecht Anzahl untersuchter Anteil an Tiere (n) Gesamtpopulation M 24 60 % K - - W 14 35 % S 2 5% M: männlich, K: männlich kastriert, W: weiblich, S: weiblich kastriert. Tab. 13 Diagnosen der Hunde mit sonstigen Erkrankungen (n = 40), deren Seren in die vorliegenden Untersuchungen zum Nachweis autoreaktiver Antikörper einbezogen wurden Diagnose Dermatitis Rhinitis Abszess Epidermiszyste Osteomyelitis Gastritis Hämatom Hyperplasie der Prostata Leberzyste Dysplasie der Mamma Tierzahl (n) 6 5 4 3 3 2 2 2 2 1 Diagnose Endometritis Enteritis Hygrom Leberzirrhose lobuläre Hyperplasie der Mamma metaplastische Verkalkung noduläre Hyperplasie der Milz Panostitis Periostitis Zystitis Tierzahl (n) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Material und Methoden 51 c) gesunde Kontrollgruppe Die Kontrollpopulation bestand aus 46 Tieren, die in der klinischen Allgemeinuntersuchung unauffällig waren. Ein Teil der Hunde wurde freundlicherweise von Privatpersonen zur Verfügung gestellt (n = 28). Weiterhin bestanden sie aus klinikeigenen Tieren, die bis zu dem Zeitpunkt der Blutentnahme in keine Studie involviert waren (n = 8), oder sie wurden zu lokalen chirurgischen Eingriffen (z.B. Kastration, Korrektur von Zahnfehlstellungen) in die Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingestellt (n = 10). Die Geschlechterverteilung der Tiere ist Tab. 14, die Rassenverteilung Tab. II im tabellarischen Anhang zu entnehmen. Das Alter der Kontrollpopulation betrug im Median 2 Jahre (Min:1 Jahr, Max: 10 Jahre). Tab. 14 Geschlechterverteilung der gesunden Kontrollhunde, deren Seren auf das Vorhandensein von Autoantikörpern überprüft wurden Geschlecht Anzahl untersuchter Anteil an Tiere (n) Gesamtpopulation M 20 43,5 % K 4 8,7 % W 20 43,5 % S 2 4,3 % M: männlich, K: männlich kastriert, W: weiblich, S: weiblich kastriert. 52 Material und Methoden 3.3 Methoden 3.3.1 Blutentnahme Die Blutentnahme erfolgte durch Punktion der gestauten Vena cephalica antebrachii bzw. Vena saphena lateralis. Zur Serumgewinnung erfolgte die Punktion mittels Einmalkanüle, wobei 10 ml Röhrchen mit Separationskügelchen verwendet wurden. Die Blutentnahme zur Zellgewinnung erfolgte unter sterilen Kautelen unter Einsatz einer „Butterfly“-Kanüle und 10 ml Vacutainer® Röhrchen mit Na-Heparin Zusatz (170 IU/10 ml Blut). 3.3.2 Serumgewinnung Das Blut (3.3.1) wurde nach mindestens 10-minütiger Koagulation 10 Minuten bei 3000 x g zentrifugiert und der Überstand abpipettiert, wobei alle Schritte bei Raumtemperatur erfolgten. Das Serum wurde zu gleichen Teilen portioniert (0,5 ml) und bei – 20°C gelagert. 3.3.3 Gewinnung vitaler Zellen aus dem peripheren Blut Vitale Zellen aus dem peripheren Blut wurden aus heparinisiertem Vollblut (3.3.1) mittels diskontinuierlicher Dichtegradientenzentrifugation (Ficoll-Separation) und Erythrozytenlyse (hypotone Lyse) gewonnen. 3.3.3.1 Zellseparation über einen diskontinuierlichen Dichtegradienten Die Zellseparation über einen diskontinuierlichen Dichtegradienten dient der Auftrennung von Blutzellen nach einzelnen Zellfraktionen. Dies erfolgt über ein Trennmedium, dessen Dichte zwischen der gewünschten Zellpopulation und der Dichte der übrigen Blutzellen liegt. Als Trennmedium wurde ein handelsübliches Lymphozytenseparationsmedium („Ficoll“) verwendet, welches aus einer wässrigen Lösung eines hochmolekularen Zuckers mit einer Dichte von 1,077 g/ml bei 10°C besteht. In einem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss wurden mit Hilfe einer Saugpipette 15 ml Ficoll vorsichtig mit 30 ml heparinisiertem Vollblut, das zuvor 1:2 mit PBS verdünnt wurde, überschichtet. Bei einer 30-minütigen Zentrifugation bei 1100 x g und 4°C (ohne Bremse) durchwanderten die spezifisch schwereren Erythrozyten sowie die polymorphkernigen Granulozyten die Ficollschicht, während sich die mononukleären Zellen als Saum in der sogenannten Interphase zwischen dem Plasmaüberstand und dem Lymphozytenseparationsmedium sammelten. Zur Gewinnung der mononukleären Zellen wurde die Interphase vorsichtig mit einer Pasteurpipette abgesaugt und in 20 ml PBS aufgenommen. Es folgten drei Waschgänge mit je 20 ml PBS bei 4°C und je 10-minütiger Zentrifugation bei 550 x g, 450 x g und 350 x g (ohne Bremse) bei denen die Thrombozyten und Reste des Separationsmediums weitestgehend entfernt wurden. Meist enthielt die Interphase nach dem ersten Waschschritt noch Erythrozyten, weshalb zwischen dem ersten und zweiten Waschvorgang eine Erythrozytenlyse (hypotone Lyse, 3.3.3.2) eingeschoben wurde. Nach dem letzten Waschgang wurden die Zellen je nach Fragestellung in PBS oder Nährmedium aufgenommen. Material und Methoden 53 3.3.3.2 Erythrozytenlyse Aufgrund der Tatsache, dass kernlose Zellen gegenüber hypotonen Lösungen wesentlich empfindlicher sind als kernhaltige Zellen, ermöglicht die Erythrozytenlyse in Zellsuspensionen eine gezielte Lyse von Erythrozyten, nicht aber von weißen Blutkörperchen. Zur Gewinnung mononukleärer Zellen wurde die Interphase nach dem ersten Waschschritt (3.3.3.1), zur Separation caniner neutrophiler Granulozyten das Zellpellet aus der diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation eingesetzt. Der Zellsuspension (Interphase oder Zellpellet) wurden 15 ml Aqua bidest. zugegeben und für 30 Sekunden geschwenkt. Die Isotonie des Mediums wurde durch Zugabe von 15 ml doppelt-konzentrierter PBS-Lösung wieder hergestellt. Die Suspension wurde bei 500 x g 10 Minuten ohne Bremse zentrifugiert, woran sich gegebenenfalls weitere hypotone Lysen anschlossen, bis grobsinnlich keine roten Blutkörperchen mehr vorhanden waren. Nach dem letzten Durchgang wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen (10 Minuten bei 300 x g ohne Bremse) und das Zellpellet je nach Fragestellung in PBS oder Nährmedium resuspendiert. 3.3.4 Zellzählung caniner Leukozyten Um die Zahl der caninen mononukleären Zellen und der caninen neutrophilen Granulozyten nach der Zellseparation (3.3.3.1) zu bestimmen, wurden die Zellen mit Acridinorange angefärbt. Dieser Fluoreszenzfarbstoff dringt in intakte Zellen ein und interkaliert mit der DNA. Kernhaltige Zellen stellen sich daher bei der Betrachtung im Fluoreszenzmikroskop mit einer deutlichen Grünfluoreszenz im Zellkern dar. Dadurch können kernlose Zellen von der Zählung ausgeschlossen werden. Zur Zellzählung wurden 10 µl der Zellsuspension mit 190 µl einer 0,25%igen Acridinlösung versetzt, gut durchmischt und 10 µl dieser Suspension in der Bürker Kammer mikroskopisch ausgezählt. Die Zellkonzentration wurde anschließend je nach Fragestellung mit PBS oder Nährmedium auf die gewünschte Zellkonzentration eingestellt. 3.3.5 Zellzählung vitaler HEp-2- und DH82-Zellen Um die Zahl vitaler HEp-2- und DH82-Zellen zu bestimmen, wurden die Zellen mit 0,1%iger Trypanblaulösung versetzt. Dieser Farbstoff dringt nur in Zellen mit beschädigter Zellmembran ein. Somit stellen sich tote und beschädigte Zellen durch eine intensive Blaufärbung dar und können von den ungefärbten, intakten Zellen unterschieden werden. Zur Zellzählung wurden 10 µl der HEp-2- bzw. DH82-Zellsuspension mit 190 µl Trypanblaulösung (0,1%) versetzt und gut durchmischt. Anschließend wurde die Zahl vitaler Zellen mit Hilfe der Bürker Kammer unter dem Phasenkontrastmikroskop bestimmt und durch Zugabe von Zellkulturmedium (R10F+) auf die gewünschte Konzentration eingestellt. 3.3.6 Zellzählung von fixierten HEp-2-Zellen und fixierten caninen Leukämiezellen Die Zellzählung von fixierten HEp-2-Zellen und fixierten caninen Leukämiezellen (3.3.8) erfolgte in der Bürker Kammer (10 µl Zellsuspension) ohne Zugabe eines Farbstoffes. Anschließend wurde die Zellsuspension durch Zugabe von PBS auf die gewünschte Zellkonzentration eingestellt. 54 3.3.7 Material und Methoden Kultivierung und Trypsinierung von HEp-2- und DH82-Zellen Alle Zellkulturarbeiten erfolgten unter sterilen Bedingungen unter der Lamina. HEp-2- und DH82-Zellen wurden in R10F-Medium in liegenden 50 ml und 100 ml Zellkulturflaschen bei 37°C und 5% CO2 (in Luft) im Brutschrank kultiviert. Die Zellen wurden alle 5 Tage – zu diesem Zeitpunkt war üblicherweise ein vollständiger Zellrasen entstanden – trypsiniert. Dazu wurde das Nährmedium abgegossen und der Zellrasen zunächst mit 10 ml sterilem PBS gewaschen. Im Anschluss erfolgte eine 10-minütige Inkubation mit 10 ml sterilem Trypsin (10%, verdünnt in PBS) bei Raumtemperatur. Nachdem sich die Zellen vollständig vom Flaschenboden gelöst hatten, wurde die Zellsuspension entweder verworfen oder für nachfolgende Versuche in 50 ml Zentrifugenröhrchen gegeben, mit 30 ml R10F-Medium versetzt und 10 Minuten bei 220 x g ohne Bremse abzentrifugiert. Je nach Versuchsansatz erfolgten zwei weitere Waschschritte mit je 50 ml R10F-Medium oder PBS. Die Zellkulturflaschen wurden zur weiteren Kultivierung mit 30 ml Nährmedium (R10F) aufgefüllt und in den Brutschrank verbracht. 3.3.8 Fixation von Zellen Die Fixation der Zellen erfolgte mit Paraformaldehyd. Dem Zellpellet, das entweder durch Trypsinierung (HEp-2-Zellen, 3.3.7) oder diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugation (chronische lymphatische Leukämie-, akute lymphatische Leukämie-, undifferenzierte Leukämie-Zellen, 3.3.3.1) gewonnen und in 5 ml PBS resuspendiert wurde, wurden 5 ml einer 4 (HEp-2-Zellen) bzw. 8%igen (Leukämiezellen) Paraformaldehydlösung zugeben. Nachdem die Zellen resuspendiert wurden, erfolgte eine 20- (HEp-2-Zellen) bzw. 30-minütige (Leukämiezellen) Inkubation bei Raumtemperatur. Nach Beendigung der Inkubation wurden die Zellen 10 Minuten bei 220 x g zentrifugiert, das Zellpellet in 30 ml PBS resuspendiert und das Paraformaldehyd durch zwei weitere Waschschritte mit je 30 ml PBS entfernt. 3.3.9 Indirekte Membranimmunfluoreszenz mit fixierten HEp-2-Zellen Um sicherzugehen, dass die zu beobachtende Zunahme der mittleren Fluoreszenzintensität bei Einsatz autoantikörperpositiver Seren im IIFD tatsächlich auf einer intrazellulären Bindung der Autoantikörper beruht und nicht auf einer Antigen-Antikörperreaktion, die auf der Zelloberfläche stattfindet, wurde eine indirekte Membranimmunfluoreszenz mit fixierten HEp-2Zellen durchgeführt. Als Testseren dienten zwei FARA-kernpositive, drei -zytoplasmapositive und ein -negatives Serum, die in einer Verdünnung von 1:500, 1:1000 und 1:2000 (in MIF-Puffer) eingesetzt wurden. In dem nachfolgenden Versuchsprotokoll wurde stets bei 220 x g für 5 Minuten zentrifugiert. Als Wasch- und Verdünnungspuffer diente stets MIF-Puffer, wobei für jeden Waschschritt pro Vertiefung (s.u.) 200 µl eingesetzt wurden. Die trypsinierten (3.3.7) und fixierten (3.3.8) HEp-2-Zellen wurden auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml eingestellt und 100 µl dieser Zellsuspension (1 x 105 Zellen) in jede Material und Methoden 55 Vertiefung einer 96-Loch-Rundbodenplatte pipettiert und anschließend abzentrifugiert. Der Überstand wurde durch Abschlagen entfernt und das Zellpellet auf dem Plattenrüttler resuspendiert. Nach einer 30-minütigen Inkubation mit 25 µl Serumverdünnung wurden ungebundene Antikörper durch Zugabe von je 200 µl MIF-Puffer, anschließendes Abzentrifugieren, Abschlagen und Resuspendieren entfernt. Nach dem dritten Waschschritt erfolgte die Zugabe von 25 µl FITC-konjugierter Ziege-anti-Hund-IgG Sekundärantikörperverdünnung (1:100). Nach einer 30-minütigen Inkubation folgten wiederum drei Waschgänge. Zur durchflusszytometrischen Analyse wurden die Proben in 200 µl Trägerflüssigkeit aufgenommen und in jeder Probe die mittleren Fluoreszenzintenstitäten (FL1) von 10000 Zellen bestimmt. Der Kontrollansatz bestand aus Zellen, die nur mit dem Sekundärantikörper inkubiert wurden, um die mittlere Fluoreszenzintensität, die auf einer unspezifischen Bindung des Detektionsantikörpers beruht, zu ermitteln („Konjugatkontrolle“). 3.3.10 Fluoreszenzserologischer mikroskopischer Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) Die indirekte Immunfluoreszenz mit Kulturzellen, die auch als fluoreszenzserologischer mikroskopischer Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) bezeichnet wird, ist ein Standardverfahren zum Nachweis antinukleärer Antikörper (TAN 1982, OSBORN et al. 1984) und in der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover etabliert. HEp-2-Zellen dienen bei diesem Verfahren als Antigenquelle und werden auf einem Objektträger kultiviert und fixiert. Serumantikörper, die an Epitope der HEp-2-Zellen binden, werden durch einen Fluorochrom-gekoppelten Sekundärantikörper markiert. Die Beurteilung der Fluoreszenz erfolgt mikroskopisch, wobei die Lokalisation (nukleär und zytoplasmatisch) und Intensität der Fluoreszenz erfasst werden. 3.3.10.1 Vorbereiten der Objektträger Die trypsinierten (3.3.7) HEp-2-Zellen wurden nach dem letzten Waschschritt in R10F+Medium aufgenommen und auf 3,5 x 104 Zellen/ml eingestellt. Bevor die Zellen auf den Objektträger verbracht wurden, erfolgte die Zugabe von PMA (Endkonzentration: 100 nmol/ml). PMA greift ohne Beteiligung von Rezeptoren in Enzymkaskaden innerhalb des Zellstoffwechsels ein und aktiviert dabei die Proteinkinase C. Diese wiederum führt u.a. zur Bildung von Wachstumsfaktoren, wodurch bei einigen Kulturzellen durch die Zugabe von definierten PMA-Konzentrationen eine Proliferationssteigerung erreicht werden kann (KIM et al. 1986, GALRON et al. 1994). Die speziell fabrizierten Objektträger waren mit einem lichtmikroskopisch undurchsichtigen, teflonhaltigen Material beschichtet, in dem sich 8 kreisrunde, nummerierte Aussparungen befanden. Nach der Zugabe von je 20 µl Zellsuspension auf jede dieser Aussparungen wurden die Objektträger 12 Stunden in einer feuchten Kammer (10%ige Kupfersulfatlösung) bei 37°C mit 5% CO2 (in Luft) im Brutschrank inkubiert, um ein Adhärieren der Zellen zu ermöglichen. Nachdem das Nährmedium und nicht adhärente Zellen durch einmaliges Waschen mit PBS entfernt wurden, erfolgte zur Fixation der Zellen eine 2-minütige Inkubation in einer eiskalten (-20°C) Methanol-Aceton-Lösung. Während der Fixation wurden hydrophobe Bestandteile aus der Zellmembran herausgelöst und die Membran aufgebrochen. Dadurch wurden die intrazellulär gelegenen Antigene für die 56 Material und Methoden Antikörper zugänglich gemacht. Bis zur Testdurchführung wurden die Objektträger bei -20°C durch Zugabe von pelletiertem Kupfersulfat trocken gelagert. 3.3.10.2 Versuchsdurchführung Als Wasch- und Verdünnungsmedium diente stets PBS. Bei jedem Testansatz wurden ein positives und ein negatives Kontrollserum eingesetzt, deren Reaktivitäten mit HEp-2-Zellen im FARA bekannt waren. Das positive Serum zeigte bei einem Titer von 1:32000 eine deutliche nukleäre Fluoreszenz, das negative Serum war bei einem Titer von 1:100 reaktionslos. Die zu untersuchenden Hundeseren wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und 1:10; 1:100 und 1:1000 (je nach Fragestellung zusätzlich 1:2000, 1:4000... bis 1:64000) verdünnt. Die Objektträger wurden abgespült, zwischen den einzelnen Aussparungen abgetrocknet, je 30 µl der Serumverdünnungen und der beiden Kontrollseren (1:100 verdünnt) auf die Aussparungen verbracht und 45 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Abspülen der Objektträger wurden sie weitere 10 Minuten auf einem Schwenker gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Auf die Aussparungen der abgetrockneten Objektträger wurden anschließend je 20 µl FITC-konjugierte Kaninchen-antiHund-IgG Sekundärantikörperverdünnung (1:100 verdünnt) verbracht und 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss inkubiert. Nach dem Abwaschen der Objektträger und 10-minütigem Schwenken in PBS wurden die abgetrockneten Objektträger zwei Minuten mit Evansblaulösung (0,1%) beschichtet, welches durch einmaliges Waschen wieder entfernt wurde. Vor der mikroskopischen Auswertung wurden die Objektträger zur Konservierung mit einer Mischung aus einem Teil PBS und einem Teil Glycerin eingedeckt. 3.3.10.3 Beurteilung Die Objektträger wurden mit Hilfe eines Phasen-Kontrast-UV-Mikroskopes mit PloemIlluminator (Erregerfilter 450-490 nm, Sperrfilter 520 nm) bei einer bis zu 1000fachen Vergrößerung ausgewertet. Die Morphologie der Zellen wurde zunächst im Durchlicht beurteilt. Im UV-Licht wurde die Fluoreszenzlokalisation (Kern, Zytoplasma) und -intensität beurteilt. Bei einer Serumverdünnung von 1:10 zeigen üblicherweise etwa 90% der Proben eine zytoplasmatische oder gemischte Fluoreszenz, die bei der Diagnostik von antinukleären Antikörpern in der Arbeitsgruppe Immunologie wie auch bei anderen Autoren (TOTH u. REBAR 1987, HANSSON et al. 1996) als unspezifisch angesehen wird. Eine Differenzierung der Fluoreszenzintensitäten ist erst ab einer Verdünnung von 1:100 möglich. Als positives Testergebnis wurde demzufolge eine nukleäre, zytoplasmatische oder gemischte Fluoreszenz bei einem Titer ≥ 1:100 angesehen. Eine Probe galt als negativ, wenn sie bei einem Titer von 1:100 keine Fluoreszenz zeigte. Der Titer seinerseits wurde als die letzte Verdünnungsstufe angegeben, bei der eine im Vergleich zur Negativkontrolle deutliche Fluoreszenz zu beobachten war. Material und Methoden 57 3.3.10.4 Versuchsansatz zum Einfluss des Untersuchers auf die mikroskopische Auswertung und zur Reproduzierbarkeit der Methode Drei Seren tumorerkrankter Hunde, die bei der Erstuntersuchung eine zytoplasmatische (n = 1) oder sowohl im Kern als auch im Zytoplasma lokalisierte Fluoreszenz (n = 2) zeigten, wurden in einer Verdünnung von 1:100 und 1:500 an insgesamt vier Testtagen im FARA eingesetzt und von drei Untersuchern, die mit der Auswertung von ANA-positiven Seren vertraut und ebenso darin geübt waren, beurteilt. Die Versuchsdurchführung erfolgte an allen vier Testtagen durch dieselbe Person. Die Beschriftung der Proben war verschlüsselt, so dass es dem Untersucher nicht möglich war, die einzelnen Proben an den aufeinanderfolgenden Tagen einander zuzuordnen. Der 7fach-Ansatz eines Serums an einem Testtag diente der Beurteilung der Intraassay Varianz und wurde durch eine Person beurteilt. 3.3.11 Durchflusszytometrie Das Durchflusszytometer ermöglicht eine schnelle und empfindliche Charakterisierung großer Zellzahlen aufgrund ihrer Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften. Es besteht aus einem Sensormodul mit einem Argon-Ionen-Laser zur Messung optischer Eigenschaften von Zellen und einer Computereinheit zur Datenerfassung und -speicherung. Die im Probenröhrchen befindliche Zellsuspension wird der Messküvette durch Überdruck zugeführt. Innerhalb dieser Küvette passieren die Zellen, die sich in einer Trägerflüssigkeit befinden, einzeln den fokussierten Strahl eines Argon-Ionen-Lasers (Wellenlänge 488 nm), wobei jede Zelle aufgrund ihrer Größe und Granularität der Zelloberfläche und des Zellinneren eine Lichtbrechung des Laserstrahles verursacht, was als Streulichtsignale von Detektoren mit 1.024 Kanälen erfasst wird. Dabei wird das Vorwärtsstreulicht, das in Richtung des Laserstrahles gebeugt wird (forward scatter, FSC) und durch die Größe der Zelle moduliert wird, und das Seitwärtsstreulicht, das im rechten Winkel zum Strahlengang gebeugt wird (side scatter, SSC) und Hinweise auf die Komplexität der Zelle gibt, unterschieden. Somit erlaubt die Korrelation von SSC und FSC eine Charakterisierung der Zelle nach ihrer Größe und Komplexität. Bei einer Markierung der Zellen mit Fluorochromen werden diese durch die Energie des einfallenden Lasers angeregt und emittieren dabei Photonen einer für jeden Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Wellenlänge. Für die verschiedenen Wellenlängen existieren wiederum unterschiedliche Photodetektoren, die die Fluoreszenzsignale registrieren. Die Fluoreszenzintensität ist dabei ein relatives Maß für die Anzahl emittierter Lichtquanten einer Wellenlänge. Das zur Verfügung stehende Durchflusszytometer enthält Detektoren für Grün- (FL1, Wellenlänge 530 ± 15 nm), für Orange- (FL2, Wellenlänge 585 ± 21 nm) und für Rotfloureszenz (FL3, Wellenlänge > 650 nm). Die Fluoreszenzintensität wird logarithmisch verstärkt und auf einer linearen Skala mit 1.024 Kanälen, die 4 Log-Dekaden (0-10.000) entspricht, dargestellt. Somit können pro Partikel bis zu 5 verschiedene Messparameter (FSC, SSC und 3 Fluoreszenzen) simultan erfasst und mit Hilfe der zugehöriger Software (WinMDI®, TROTTER 1999) beliebig miteinander korreliert und ausgewertet werden. Die graphische Darstellung der Messwerte erfolgt entweder als Zweiparameterdarstellung („Dot-Plot“) oder als Histogramm. Bei der Zweiparameterdarstellung werden zwei Messparameter in einem Koordinatensystem gegeneinander aufgetragen und an der Schnitt- 58 Material und Methoden stelle der beiden Messwerte ein Punkt angezeigt (Abb. 1 A, B). Dagegen kann in der Einparameterdarstellung, dem sogenannten Histogramm, jeder Messparameter einzeln dargestellt werden. Dabei bezeichnet die Abszisse den jeweiligen Parameter und die Ordinate die Anzahl der jeweiligen Messsignale pro Größenordnung des Parameters (Abb. 1 C). Zudem können einzelne Zellpopulationen eines Probenansatzes gesondert analysiert oder von der Messung bzw. Auswertung ausgeschlossen werden, indem Regionen definiert werden, in denen sich die Ereignisse der gewünschten Teilpopulationen befinden. Diese Regionen können während der Auswertung logisch miteinander verknüpft werden. Diese sogenannten Fenster können bereits während der Messung eingestellt werden, so dass nur diejenigen Zellen erfasst werden, die sich innerhalb dieses Bereiches befinden („Lifegate“). Somit lassen sich mit Hilfe der Durchflusszytometrie große Zellzahlen schnell und empfindlich charakterisieren und differenzieren und mit Hilfe der zugehörigen Software graphisch und statistisch auswerten. 3.3.11.1 Der intrazelluläre Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) Um eine optimale Diskriminierung der Fluoreszenzintensitäten autoantikörperpositiver und negativer Seren in dem durchflusszytometrischen Verfahren zu gewährleisten, wurden in Vorversuchen zunächst die erforderlichen Waschzeiten und -zyklen, die optimale Zellzahl und das erforderliche Serumvolumen, das mit einer definierten Anzahl HEp-2-Zellen inkubiert wurde, bestimmt. Außerdem wurden in Vorversuchen Referenzwerte bzw. ein Schwellenwert entwickelt, mit Hilfe dessen die analysierten Seren beurteilt wurden, und die Interund Intraassay Varianz der Methode bestimmt. Sämtliche in den Vorversuchen eingesetzten Seren stammten von Hunden, die an einem Tumor erkrankt waren. Die Angaben über die Fluoreszenzlokalisation bzw. das Reaktionsverhalten der Seren bei der Inkubation mit HEp-2Zellen beziehen sich in allen Unterpunkten auf die Untersuchungsergebnisse der jeweiligen Seren im FARA (3.3.10 u. 4.1), worauf im Weiteren nicht explizit hingewiesen wird. Vorversuche a) Waschzyklen und Waschzeit Die mittleren Fluoreszenzintensitäten eines kernpositiven (Titer 1:16000) und eines negativen Serums wurden nach 10- und 30-minütiger Waschzeit bzw. einem und zwei Waschzyklen mit MIF-Saponin-Puffer, die der Inkubation mit dem Serum bzw. Sekundärantikörper folgten, bestimmt. Dabei wurde wie in dem dargestellten Versuchsprotokoll (s.u.) vorgegangen, abweichend wurden jedoch 100000 HEp-2-Zellen mit 50 µl Serumverdünnung inkubiert. b) Zellzahl und Serumvolumen In vier Ansätzen wurden verschiedene Zellzahlen und Serumvolumina miteinander kombiniert (Tab. 15) und die jeweiligen mittleren Fluoreszenzintensitäten durchflusszytometrisch erfasst. Das prinizipielle Vorgehen entsprach dabei dem in dem Versuchsprotokoll (s.u.) beschriebenen. Als Testseren dienten ein kernpositives (Titer 1:16000) und ein negatives Serum in einer Verdünnung von 1:500, 1:1000, 1:2000 und 1:4000. Material und Methoden Tab. 15 59 Unterschiedliche Anzahl HEp-2-Zellen, die in der durchflusszytometrischen Analyse (IIFD) zur optimalen Diskriminierung autoantikörperpositiver und negativer caniner Seren mit verschiedenen Serumvolumina inkubiert wurden Serumvolumen Anzahl HEp-2-Zellen 25µl 25000 50000 75000 100000 50µl 25000 50000 75000 100000 c) Bestimmung eines Schwellenwertes Um den Titer eines Serums nach durchflusszytometrischer Analyse bestimmen zu können, wurden die mittleren Fluoreszenzintensitäten von 17 negativen Seren in einer Verdünnung von 1:500, 1:1000, 1:2000... bis 1:64000 erfasst und ein Schwellenwert bestimmt. Dieser wurde als Mittelwert plus der doppelten Standardabweichung der mittleren Fluoreszenzintensitäten definiert (Tab. 16). Dabei wurde an insgesamt drei Versuchstagen jeweils eine Untergruppe der genannten Seren nach dem unten dargestellten Versuchsprotokoll getestet. Bei sämtlichen Seren lagen die mittleren Fluoreszenzintensitäten unter dem hier definierten Schwellenwert, so dass die Seren retrospektiv nach durchflusszytometrischer Analyse ebenfalls als autoantikörpernegativ eingestuft wurden. Der Titer eines Serums wurde in allen nachfolgenden Untersuchungen als die letzte Verdünnungsstufe angegeben, bei der die mittlere Fluoreszenzintensität über dem Schwellenwert lag. Tab. 16 Mittlere Fluoreszenzintensitäten (FL1) (MW ± s) und der daraus entwickelte Schwellenwert von 17 in der mikroskopischen Untersuchung (FARA) autoantikörpernegativen Seren nach Analyse im intrazellulären Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) Serum- mittlere FL1 Schwellenwert verdünnung (MW ± s) (MW + 2s) 1:500 445 ± 140 724 1:1000 289 ± 105 500 1:2000 187 ± 72 331 1:4000 138 ± 32 203 1:8000 103 ± 29 160 1:16000 85± 22 129 1:32000 76 ± 26 127 1:64000 71 ± 24 119 60 Material und Methoden e) Intraassay Varianz Um die Reproduzierbarkeit der Methode innerhalb eines Versuches zu überprüfen, wurde ein kernpositives Serum (Titer 1:16000) in einem 7fach-Ansatz getestet. Das Serum wurde nach dem unten stehenden Versuchsprotokoll in einer Verdünnung von 1:500, 1:1000, 1:2000... bis 1:64000 eingesetzt. Die mittleren Fluoreszenzintensitäten wurden für jede Verdünnungsstufe und Ansatz getrennt ermittelt und Mittelwert und Standardabweichung zur Berechnung des Variationskoeffizenten (VK=[s/MW]100) bestimmt. f) Interassay Varianz Um die Reproduzierbarkeit der Methode anhand eines Variationskoeffizenten zu überprüfen, wurden ein kernpositives (Titer 1:16000), ein zytoplasmapositives (Titer 1:1000) und ein negatives Serum in einer Verdünnung von 1:500, 1:1000, 1:2000... bis 1:64000 an fünf verschiedenen Tagen entsprechend dem unten dargestellten Versuchsprotokoll getestet. Zur Berechnung des Variationskoeffizenten (VK = [s/MW]100) wurde der Mittelwert und die Standardabweichung der mittleren Fluoreszenzintensitäten für jede Verdünnungsstufe aus allen fünf Testtagen bestimmt. Die beiden hier eingesetzten positiven und das negative Serum dienten als Kontrollen in jedem Versuchsansatz. Unter der Voraussetzung, dass sich die mittleren Fluoreszenzintensitäten der Kontrollseren innerhalb der ermittelten Variationsbreite befanden, wurde der Versuch in die Auswertung einbezogen, anderenfalls wiederholt. Versuchsprotokoll a) Aufbereiten der HEp-2-Zellen Die trypsinierten (3.3.7) und fixierten (3.3.8) HEp-2-Zellen wurden mit PBS auf eine Konzentration von 0,25 x 106/ ml (3.3.6) eingestellt. b) Versuchsdurchführung In dem nachfolgend beschriebenen Versuchsprotokoll erfolgten sämtliche Zentrifugationsschritte bei 220 x g für 5 Minuten mit Bremse. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand stets abgeschlagen und die Zellen auf einem Plattenrüttler resuspendiert. Als Verdünnungsund Waschmedium diente stets MIF-Saponin-Puffer, wobei für jeden Waschschritt pro Vertiefung (s.u.) 200 µl eingesetzt wurden. In jedem Versuchsansatz wurden ein kernpositives, zytoplasmapositives und negatives Serum, die aliquotiert und zur Bestimmung der Inter- und Intraassay Varianz (s.o.) im IIFD bereits mehrfach analysiert wurden, als Kontrolle eingesetzt. Zusätzlich erfolgte bei jeder Testdurchführung eine „Konjugatkontrolle“, bei der die HEp-2-Zellen lediglich mit dem Sekundärantikörper inkubiert wurden. In jede Vertiefung einer 96-Loch-Rundbodenplatte wurden 100 µl Zellsuspension (2,5 x 104 Zellen) gegeben, abzentrifugiert und mit 50 µl der zu prüfenden Hundeseren (1:500, 1:1000, 1:2000... bis 1:64000 verdünnt) versetzt. Nach kurzem Aufrütteln auf dem Plattenrüttler wurden die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend Material und Methoden 61 wurden in jede Vertiefung 200 µl MIF-Saponin-Puffer gegeben und abzentrifugiert. Bei zwei weiteren Waschschritten erfolgte eine je 30-minütige Inkubation mit der Waschflüssigkeit. Nach dem letzten Waschdurchgang wurden in jede Vertiefung 25 µl Fluoreszeinisothiocyanat-konjugierte Ziege-anti-Hund-IgG Sekundärantikörperverdünnung (1:100 verdünnt) gegeben und nach kurzem Aufrütteln 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde dreimal gewaschen, wobei zwischen den einzelnen Waschschritten wiederum eine 30-minütige Inkubation mit der Waschflüssigkeit erfolgte. Nach dem letzten Waschen wurden zu den resuspendierten Pellets je 100 µl Trägerflüssigkeit gegeben und die Platte zwei Minuten aufgerüttelt. Schließlich erfolgte das Überführen der Zellsuspension in 5 ml Röhrchen (für die Durchflusszytometrie), in die zuvor 100 µl Trägerflüssigkeit vorgelegt wurden. Die Proben wurden bis zur Messung unter Lichtausschluss bei 4°C aufbewahrt. c) Messung und Auswertung Die Messung der Fluoreszenzintensitäten im Grünbereich (FL1) erfolgte stets mit denselben Geräteeinstellungen, um eine Vergleichbarkeit der einzelnen Versuchsansätze zu gewährleisten. In jeder Probe wurden mindestens 3000 Zellen analysiert. Die computergestützte Auswertung erfolgte mit dem Programm WinMDI® (TROTTER, 1999). Zunächst wurde in der FSC/SSC-Zweiparameterdarstellung eine Region auf die morphologisch intakten HEp-2Zellen gelegt und ein Fenster auf diese in der FL1/SSC-Darstellung gesetzt (Abb. 1 A, B). Für jede Verdünnungsstufe wurde die mittlere Fluoreszenzintensität bestimmt und statistisch ausgewertet. Zusätzlich wurde für jede Verdünnungsstufe ein Histogramm erstellt und die Verteilungshäufigkeiten der Fluoreszenzintensitäten (FL1) beurteilt (Abb. 1 C). R1 Vorwärtsstreulicht (FSC) Abb. 1 C) B) Ereignisse Seitwärtsstreulicht (SSC) Seitwärtsstreulicht (SSC) A) Fluoreszenzintensität (FL1) Fluoreszenzintensität (FL1) Zweiparameterdarstellung („Dot-Plot“) und Einparameterdarstellung (Histogramm) nach durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) von HEp-2-Zellen A) FSC/SSC-Darstellung von fixierten, mit dem FITC-konjugierten Ziege-anti-Hund-IgG (H+L) Sekundärantikörper markierten HEp-2-Zellen. B) FL1/SSC-Darstellung von A), mit einem Fenster auf Region 1. C) Histogramm (FL1) von B), mit einem Fenster auf Region 1. FL1: Fluoreszenzintensität im Grünbereich (530 nm ± 15 nm). 62 Material und Methoden 3.3.11.2 Besonderheiten des durchflusszytometrischen Verfahrens (IIFD) zur Differenzierung der Immunglobulinisotypen IgG und IgM in autoantikörperpositiven Seren Die Durchführung des IIFD erfolgte wie unter 3.3.11.1 beschrieben. Abweichend davon wurde bei der Prüfung auf Immunglobuline des Isotyps IgG ein Fluoreszeinisothiocyanatgekoppelter Ziege-anti-Hund-IgG Sekundärantikörper (FITC-ZgαHd-IgG [Fc]), der an den Fc-Teil der Immunglobuline des Isotyps IgG bindet, verwendet. Immunglobuline des Isotyps IgM wurden durch einen Fluoreszeinisothiocyanat-konjugierten Ziege-anti-Hund-IgM Detektionsantikörper (FITC-ZgαHd-IgM [Fc]) spezifisch nachgewiesen. Im Gegensatz zu dem bislang eingesetzten FITC-ZgαHd-IgG (H+L) Sekundärantikörper, bei dem aufgrund der Spezifität für schwere und leichte Ketten eine Kreuzreaktivität mit den leichten Ketten anderer Immunglobulinisotypen möglich ist, kann bei den hier eingesetzten Detektionsantikörpern eine Kreuzreaktivität mit anderen Isotypen weitestgehend ausgeschlossen werden. Um die im IIFD als autoantikörperpositiv beurteilten Seren auf das Vorhandensein von Autoantikörpern des Isotyps IgG und IgM zu überprüfen, wurde zunächst für die beiden o.g. Sekundärantikörper separat ein Schwellenwert (Tab. III im tabellarischen Anhang) ermittelt. Dies erfolgte wie unter Einsatz des herkömmlichen Sekundärantikörpers beschrieben, wobei zur Ermittlung des Schwellenwertes nur 14 der 17 negativen Seren einbezogen wurden (s.o.). Der Titer eines Serums ergab sich wiederum aus der letzten Verdünnungsstufe, bei der die mittlere Fluoreszenzintensität über dem Schwellenwert lag. Ein Serum wurde als positiv eingestuft, d.h. die zuvor nachgewiesenen Autoantikörper konnten Immunglobulinen des Isotyps IgG oder IgM zugeordnet werden, wenn dessen Titer größer, gleich oder maximal um zwei Titerstufen niedriger als der ursprünglich ermittelte Titer unter Einsatz des FITC-Zg-α-HdIgG (H+L) war. 3.3.11.3 Besonderheiten des durchflusszytometrischen Verfahrens (IIFD) mit caninen Leukämiezellen als Substrat Der IIFD unter Verwendung von caninen chronischen lymphatischen, akuten lymphatischen und undifferenzierten Leukämie-Zellen des peripheren Blutes (Tab. 17) als Substrat erfolgte wie unter 3.3.11.1 für HEp-2-Zellen beschrieben. Abweichend davon wurden die separierten (3.3.3) und fixierten (3.3.8) Leukämiezellen mit PBS auf eine Konzentration von 0,45 x 106 Zellen/ml (die Zellen waren deutlich kleiner als die zuvor eingesetzten HEp-2-Zellen) eingestellt (3.3.6) und 100 µl dieser Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Loch-Rundbodenplatte verbracht. Um den Titer eines Serums bestimmen zu können, wurden zunächst die mittleren Fluoreszenzintensitäten von 14 negativen Seren, die bereits unter Einsatz von HEp-2-Zellen zur Schwellenwertberechnung dienten (3.3.11.1), für jedes Zellsubstrat getrennt ermittelt. Der daraus ermittelte Schwellenwert, oberhalb dessen ein Serum als positiv eingestuft wurde, kann Tab. IV im tabellarischen Anhang entnommen werden. Der Titer wurde als die letzte Verdünnungsstufe angesehen, bei der die mittlere Fluoreszenzintensität über dem Schwellenwert lag. Insgesamt wurden 90 Seren mit chronischen lymphatischen LeukämieZellen inkubiert, davon stammten 78 Proben von caninen Tumorpatienten, 10 Seren von Material und Methoden 63 gesunden Kontrollhunden und zwei aus der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen. Seren, die mit akuten lymphatischen bzw. undifferenzierten Leukämie-Zellen inkubiert wurden, bestanden aus einer Untergruppe der 78 Seren tumorerkrankter Hunde. Tab. 17 Patient Angaben zu den drei Hunden mit einer Leukämie, deren Leukämiezellen des peripheren Blutes in der durchflusszytometrischen Analyse (IIFD) als Substrat eingesetzt wurden Leukämieform Rasse -Nr. Alter Geschlecht (Jahre) 1 chronische lymphatische Leukämie Berner Sennenhund 5 S 2 akute lymphatische Leukämie Sibirischer Husky 6 M 3 undifferenzierte Leukämie Irischer Setter 6 W S: weiblich kastriert, M: männlich, W: weiblich. 3.3.11.4 Bestimmung der Zellvitalität mit Hilfe des Durchflusszytometers Mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes Propidiumjodid lassen sich Zellen mit geschädigter Membranintegrität von vitalen Zellen unterscheiden. Propidiumjodid, das der Zellsuspension (canine mononukleäre Zellen, 3.3.11.5) in einer Endkonzentration von 2 µg/ml zugegeben wurde, dringt in Zellen mit Membrandefekten oder gestörten Transportmechanismen ein und interkaliert mit der DNA-Doppelhelix. Anhand der Fluoreszenzsignale im Rotbereich (FL3 > 650 nm) können somit morphologisch intakte Zellen von geschädigten Zellen unterschieden werden. Durch Setzen eines Fensters („life-gate“) um FL3-positive Zellen können membrandefekte Zellen bereits während der Messung von der Analyse ausgeschlossen werden. 3.3.11.5 Durchflusszytometrische Auswertung der Lymphozytenstimulation: Bestimmung der Zahl vitaler Zellen über die Referenzzellmethode Während der in vitro-Kultivierung caniner mononukleärer Zellen im Verlauf des unter 3.3.15 beschriebenen Lymphozytenstimulationstestes kommt es zum Absterben und zur Vermehrung der eingesäten Zellen. Um die Zahl vitaler Zellen in der Zellsuspension zu bestimmen, wurde die „Referenzzellmethode“ eingesetzt (PECHOLD et al. 1994, HENDRICKS 1998). Diese ermöglicht in einer Zellsuspension die Quantifizierung einer unbekannten Zahl vitaler Zellen durch die Zugabe einer bekannten Anzahl von Referenzzellen. Diese unterscheiden sich in mindestens einem durchflusszytometrisch erfassbaren Parameter von den zu quantifizierenden Zellen und sind gleichzeitig durch dieselben Geräteeinstellungen messbar. Der absolute Gehalt vitaler Zellen kann bestimmt werden, indem die Zahl gemessener Referenzzellen, unter Berücksichtigung der Zahl eingesetzter Referenzzellen, mit den als vitale Zellen identifizierten Ereignissen ins Verhältnis gesetzt wird. 64 Material und Methoden Als Referenzzellen dienten bovine mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, die über einen monoklonalen Antikörper (mAk Bo1, Maus-anti-bovine MHC-Klasse I) indirekt durch einen FITC-gekoppelten Ziege-anti-Maus Antikörper markiert wurden. Durch die ParaformaldehydFixierung war die Zellmembran für Propidiumjodid durchlässig, wodurch die Referenzzellen durch ihre grüne Membran- (FL1+) und rote (FL3+) Kernfluoreszenz von den zu quantifizierenden Zellen durchflusszytometrisch zu unterscheiden waren. Herstellung der Referenzzellen Frisch separierte (3.3.3) bovine mononukleäre Zellen des peripheren Blutes wurden zu je 2 x 107 Zellen in ein 10 ml Röhrchen verbracht, 5 Minuten bei 80 x g und 4°C abzentrifugiert, in 100 µl PBS resuspendiert und mit 100 µl des unverdünnten mAk Bo1 für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Nachdem die Zellen mit 5 ml MIF-Puffer gewaschen (7 Minuten, 80 x g, 4°C) und in 100 µl MIF-Puffer resuspendiert wurden, erfolgte eine 20-minütige Inkubation bei 4°C mit 100 µl FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus Antikörper (1:40 in MIF-Puffer verdünnt). Nach einmaligem Waschen mit 5 ml PBS (7 Minuten, 80 x g, 4°C) wurde das Zellpellet in 5 ml PBS resuspendiert. Der Inhalt aller Röhrchen wurde in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen verbracht, mit PBS auf 50 ml aufgefüllt und abzentrifugiert (15 Minuten, 80 x g, 4°C). Die Zellen wurden in 30 ml 4%iger Paraformaldehydlösung (in PBS verdünnt) resuspendiert und unter Lichtausschluss bei 4°C fixiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen 15 Minuten bei 880 x g und Raumtemperatur abzentrifugiert, der Überstand dekantiert, die Zellen in PBS resuspendiert und ein weiteres Mal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden schließlich in Trägerflüssigkeit aufgenommen und auf eine Konzentration von 9 x 105 Zellen/ml eingestellt. Die Referenzzellsuspension wurde lichtgeschützt bei 4°C gelagert. Vor jedem Einsatz wurde die Zellkonzentration überprüft und gegebenenfalls korrigiert. Durchführung der Referenzzellmethode zur Bestimmung der Anzahl vitaler Lymphozyten Nach der Inkubation kultivierter Zellen (3.3.15.1) wurden die Mikrotiterplatten unter dem Mikroskop auf eine eventuelle Kontamination überprüft und anschließend 15 Minuten auf Eis und zwei Minuten auf einen Plattenrüttler gestellt, um adhärente Zellen zu lösen. Nach Vorlage von 4,5 µl Propidiumjodidstammlösung (Endkonzentration: 2 µg/ml) wurde die Zellsuspension jeder Vertiefung durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren aufgenommen, vollständig in 5 ml Röhrchen (für die Durchflusszytometrie) überführt und 50 µl Referenzzellsuspension (4,5 x 104 Zellen) zugegeben. Nach einem gründlichen Durchmischen der Zellen wurden die Proben im Durchflusszytometer gemessen. Um die Masse der toten Zellen und Zelldebris von der Analyse auszuschließen, wurde bereits während der Messung ein Fenster („life-gate“) gesetzt und nur die Ereignisse innerhalb dieses Fensters erfasst (20000 pro Messung). Aufgrund der ähnlichen FSC/SSC-Charakteristika der Referenzzellen und der caninen mononukleären Zellen, wurden somit die Referenzzellen sowie alle morphologisch intakten mononukleären Zellen erfasst. Wurden die gemessenen Ereignisse in einem FL1/FL3-Diagramm dargestellt, so konnten Referenzzellen (rechter oberer Quadrant, FL1+FL3+), canine mononukleäre Zellen (linker unterer Quadrant, FL1-FL3-) und membrangeschädigte Kulturzellen (linker oberer Quadrant Material und Methoden 65 FL1-FL3+) aufgrund ihrer unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaften differenziert werden (Abb. 2). Nach Quadrantenanalyse, bei der die Messereignisse im linken unteren Quadranten (E[Vit]) und rechten oberen Quadranten (E[Ref]) erfasst wurden, konnte unter Berücksichtigung der Zahl eingesetzter Referenzzellen (n[Ref]) die Zahl der lebenden Kulturzellen (n[vitale Zellen]) mit folgender Formel berechnet werden: n[vitale Zellen] = E[Vit] x n[Ref] E[Ref] B) A) 1 FL3 SSC E[Ref] E[Vit] R1 FSC Abb. 2 FL1 Prinzip der durchflusszytometrischen Quantifizierung in vitro-stimulierter vitaler caniner Lymphozyten mit Hilfe der Referenzzellmethode A) Region (R1) um morphologisch intakt erscheinende Kulturzellen in der FSC/SSC-Darstellung. B) FL1/FL3+ + Diagramm mit Quadrantenanalyse der Ereignisse in Region 1. Die Referenzzellen stellen sich als FL1 FL3 im rechten oberen Quadranten dar. Die Lymphozyten befinden sich in den beiden linken Quadranten, die + membrangeschädigten (propidiumjodidpositiv, FL3 ) im oberen und die intakten (propidiumjodidnegativ, FL3 ) im unteren. Die Zahl vitaler Lymphozyten kann wie unter 3.3.11.5 beschrieben berechnet werden. E[Vit]: als vitale Lymphozyten identifizierte Messereignisse, E[Ref]: als Referenzzellen identifizierte Messereignisse, FSC: Vorwärtsstreulicht, SSC: Seitwärtsstreulicht, FL1: Fluoreszenzintensität im Grünbereich (530 nm ± 15 nm), FL3: Fluoreszenzintensität im Rotbereich (> 650 nm). 66 Material und Methoden 3.3.12 HEp-2-Western-Blot-Analysen Sämtliche Reagenzien wurden in einem Volumen von je 1,5 ml in die Rinnen der Inkubationswanne gegeben. Als Wasch- und Verdünnungsmedium diente, sofern nicht anders angegeben, der UniversalpufferPlus® (1:10 verdünnt in Aqua dest.). Alle Inkubations- und Waschschritte erfolgten auf dem Wippschüttler bei Raumtemperatur. Die Blotstreifen wurden entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Seren in die Rinnen der Inkubationswanne gegeben, mit UniversalpufferPlus® bedeckt und 15 Minuten gewaschen. Nachdem die Flüssigkeit aus jeder Rinne abgesaugt wurde, erfolgte die Zugabe des zu untersuchenden Serums (1:100 verdünnt). Nach einer einstündigen Inkubation wurde das Serum abpipettiert und die Teststreifen dreimal für je 5 Minuten gewaschen. Im Anschluss wurde 60 Minuten mit Biotin-konjugierter Ziege-anti-Hund-IgG Sekundärantikörperverdünnung (1:1000) inkubiert. Nach drei weiteren 5-minütigen Waschschritten, erfolgte die Inkubation mit Streptavidin-Alkalischer Phosphatase (1:5000 verdünnt, Endkonzentration: 0,74 IU/ml). Bevor die Substratlösung (NBT/BCIP) hinzugeben wurde, erfolgten wiederum drei Waschschritte für je 5 Minuten. Nach einer 10-minütigen Inkubation mit der Substratlösung unter Lichtausschluss wurde die Reaktion durch dreimaliges, einminütiges Waschen mit Aqua dest. gestoppt. Die Streifen wurden luftgetrocknet, auf Papier geklebt, unter zu Hilfenahme der jeweiligen Auswerteschablone (Abb. 3) visuell ausgewertet. Als Kontrolle für die unspezifische Bindung durch den Sekundärantikörper diente ein Streifen, der nur mit dem Biotin-konjugierten Detektionsantikörper, der Streptavidin-Alkalischer Phosphatase und der Substratlösung inkubiert wurde. In den Immunoblot-Analysen wurden insgesamt 41 Seren tumorerkrankter Hunde (Tab. 18), 6 Seren aus der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen und 4 Proben gesunder Tiere analysiert. Mit Ausnahme zweier Seren gesunder Tiere und einer Probe eines Tumorpatienten zeigten alle eingesetzten Seren nach durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) eine positive Reaktion. Tab. 18 Immunoblot-Analysen mit elektrophoretisch aufgetrennten HEp-2-Antigenen: eingesetzte Seren caniner Tumorpatienten Tumor Anzahl Tumor Anzahl untersuchter untersuchter Seren (n) Seren (n) malignes Lymphom 13 ALL 1 Plattenepithelkarzinom 5 Leydigzelltumor 3 benigner Mammamischtumor 4 Sertolizelltumor 1 Mammakarzinom 2 kutanes Histiozytom 2 CLL 3 1) Sonstige 7 Lipom (n = 2), Synovialzelltumor (n = 1), multiples Myelom (n = 1), Übergangszellkarzinom (n = 1), malignes Melanom (n = 1), Schilddrüsenkarzinom (n = 1). Material und Methoden Abb. 3 67 Auswerteschablone des HEp-2-Westernblot Testkits Dargestellt ist exemplarisch eine Auswerteschablonen der insgesamt vier eingesetzten Westernblot-Testkits CENP Zentromerprotein, PM-Scl: Polymyositis-Scleroderma Antigen, Scl-70: Scleroderma Antigen, M2: mitochondriale Antigene, SS-A: Sjøgren`s Syndrom Antigen A, SS-B: Sjøgren`s Syndrom Antigen B, rib. PProtein: ribosomales P-Protein, RNP Ribonukleoprotein, Sm: Smith-Antigen. 68 Material und Methoden 3.3.13 Zytotoxizitätsmessungen Zur Überprüfung eines zytotoxischen Effektes autoantikörperpositiver Seren wurden die beiden Kulturzelllinien HEp-2 und DH82 und canine mononukleäre Zellen des peripheren Blutes einer drei Jahre alten Beagle Hündin (Tier 1) und ihres gleichaltrigen Bruders (Tier 2) wie unter 3.3.14.1 u. 3.3.15.1 beschrieben eingesetzt. Ein zytotoxischer Effekt auf die genannten Zellarten wurde anhand der absoluten Zahl vitaler Zellen nach Inkubation mit autoantikörperpositiven bzw. -negativen Seren überprüft. Die Bestimmung der absoluten Zahl vitaler HEp-2- und DH82-Zellen erfolgte mit Hilfe des MTT-Testes (3.3.14) und die der mononukleären Zellen anhand der Referenzzellmethode (3.3.11.5). Um eine Vergleichbarkeit der einzelnen Testansätze zu ermöglichen, wurden die Zellzahlen als prozentualer Anteil der in der Mediumkontrolle (ohne Serumzugabe) enthaltenen vitalen Zellen (=100%) dargestellt. Ein Serum wurde als zytotoxisch angesehen, wenn es die Lebendzellzahl im Vergleich zur Mediumkontrolle um mindestens 40% reduzierte. 3.3.14 Methyl-Thiazol-Tetrazolium-Test Der Methyl-Thiazol-Tetrazolium-Test (MTT-Test) dient der Messung vitaler Zellen. Stoffwechselaktive, vitale Zellen produzieren im Gegensatz zu nekrotischen Zellen mitochondriale Dehydrogenasen. Die Succinatdehydrogenase oxidiert das schwach gelbliche 3-[4,5Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT-Salz), das in das Zytoplasma intakter Zellen eindiffundieren kann, zu einem violetten, lipohilen Formazansalz, das im wässrigen Milieu auskristallisiert. Die Kristalle können für eine quantitative Testauswertung mit 0,5% ameisensaurem Isopropanol gelöst und die Extinktion mit einem Photometer gemessen werden. Diese ist ein Maß für die Menge an mitochondrialen Dehydrogenasen und somit ein Maß für die Anzahl vitaler Zellen (MOSMANN 1983). Der MTT-Test kann somit für Zytotoxizitätsmessungen herangezogen werden, wie in den nachfolgendenen Versuchsansätzen beschrieben. Durchführung des Methyl-Thiazol-Tetrazolium-Testes Alle Inkubationsschritte erfolgten in einer feuchten Kammer (Plastikbox mit Gittereinsatz und 50 ml 1%ige Kupfersulfatlösung) bei 37°C mit 5% CO2 (in Luft) im Brutschrank. Die Mikrotiterplatten wurden stets bei 300 x g für 10 Minuten mit Bremse bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die MTT-Lösung wurde bei allen Ansätzen in einem Volumen von 25 µl (Endkonzentration: 300 µg/ml) zugegeben. Diese Angaben beziehen sich auf alle hier aufgeführten Versuchsansätze. Die HEp-2- und DH82-Zellen wurden zunächst trypsiniert und mit R10F-Medium dreimal gewaschen (3.3.7). Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen in R10F+-Medium aufgenommen und auf eine Konzentration von 10 x 104 Zellen/ml (HEp-2) bzw. 15 x 104 Zellen/ml (DH82) eingestellt. In jede Vertiefung einer sterilen 96-Loch-Flachbodenplatte wurden 100 µl Zellsuspension eingesät, je 100 µl R10F+-Medium dazugegeben und an- Material und Methoden 69 schließend mit der MTT-Lösung versetzt. Nach 6 Stunden Inkubation wurden die Platten abzentrifugiert, der Überstand vorsichtig abgenommen und einmal mit PBS (200 µl pro Vertiefung) gewaschen, um eine Fällung der im Nährmedium enthaltenen Proteine durch die nachfolgende Zugabe von 0,5 % ameisensaurem Isopropanol zu vermeiden. Nach einer erneuten Zentrifugation wurde der Überstand vorsichtig abpipettiert, 200 µl 0,5 % ameisensaures Isopropanol je Vertiefung hinzugegeben und gründlich durchpipettiert. Bevor die Messung der Extinktion im Photometer (Testwellenlänge: 570 nm; Referenzwellenlänge: 630 nm) erfolgte, wurde die Platte für drei Minuten auf einen Plattenrüttler gegeben. Die absolute Zahl vitaler Zellen wurde anhand einer Eichkurve und computerunterstützter Kurvenanalyse errechnet. Die Eichkurve ergab sich aus den Extinktionen einer HEp-2- und DH82-Verdünnungsreihe (Zellzahl: 3,12 x 102; 6,25 x 102; 12,5 x 102... bis 16 x 104) im MTT-Test. Pro Verdünnungsstufe wurden Pentaplikate angesetzt und die Optische Dichte (OD)-Werte anschließend gemittelt. 3.3.14.1 Methyl-Thiazol-Tetrazolim-Test mit HEp-2- und DH82-Zellen unter Zugabe von Seren tumorerkrankter Hunde und gesunder Hunde zur Überprüfung eines zytotoxischen Effektes Die HEp-2- und DH82-Zellen wurden mit R10F+-Medium auf die entsprechende Zellkonzentration (3.3.14) eingestellt. Das zu untersuchende Serum wurde 1:2, 1:4 u. 1:10 in R10F+Medium verdünnt und die in Tab. 19 aufgeführten Ansätze in die Mikrotiterplatte verbracht. Tab. 19 Metyhl-Thiazol-Tetrazolium-Test mit HEp-2- und DH82-Zellen unter Zusatz von Seren caniner Tumorpatienten und gesunder Kontrolltiere Serumansatz 100 µl Zellsuspension 25 µl Serum unverdünnt (Endkonzentration: 1:8) oder 25 µl Serumverdünnung (Endkonzentration: 1:16, 1:32 u. 1:80) 75 µl R10F+-Medium Kontrollansatz ohne Serum 100 µl Zellsuspension 100 µl R10F+-Medium Jedes Serum wurde verdünnt und unverdünnt eingesetzt, wobei die Ansätze mit unverdünntem Serum als Unikate (die zur Verfügung stehende Serummenge war begrenzt), diejenigen mit Serumverdünnungen als Duplikate und die Kontrollansätze ohne Serumbeigabe als Triplikate erfolgten. Nach einer 72-stündigen Inkubation wurde in jede Vertiefung die MTT-Lösung gegeben und im Folgenden wie unter 3.3.14 beschrieben fortgefahren. Bei Einsatz von ultrafiltrierten IgG-Fraktionen anstelle des Serums (3.3.17) wurde mit den Filtraten wie unter 3.3.15.1 beschrieben vorgegangen. 70 Material und Methoden 3.3.14.2 Methyl-Thiazol-Tetrazolium-Test und antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) Zur Messung einer antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität im MTT-Test dienten als Zielzellen („Targetzellen“) HEp-2-Zellen und als Effektorzellen canine neutrophile Granulozyten. Die Antikörper, deren potentieller zytotoxischer Effekt verstärkt werden sollte, stammten aus den Patientenseren. Die Effektorzellen (canine neutrophile Granulozyten) wurden durch hypotone Lyse (3.3.3.2) aus dem Zellpellet einer diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation (3.3.3.1) mit gerinnungsgehemmtem (Na-Heparin) Vollblut gewonnen, in I10F+-Medium aufgenommen und auf die entsprechende Zellzahl (s.u.) eingestellt. Zunächst wurde eine sterile 96-Loch-Mikrotiterplatte entsprechend dem in 3.3.14.1 beschriebenen Vorgehen – abweichend jedoch als dreifacher Ansatz und in nur zwei Serumendverdünnungen (1:8 und 1:80) – befüllt und eine Stunde inkubiert. Nachdem die Platten abzentrifugiert, der Überstand vorsichtig abpipettiert und je 200 µl PBS hinzugegeben wurden, erfolgte ein zweiter Waschschritt, um ungebundene Serumbestandteile vollständig zu entfernen. Nach dem letzten Waschen wurden die Zellen in je 100 µl I10F+-Medium resuspendiert und 100 µl Effektorzellsuspension (verdünnt in I10F+) in einem Effektor-TargetzellVerhältnis von 1:1 und 10:1 zugegeben. Als Kontrollansatz dienten Zellen, die anstelle der Effektorzellen mit 100 µl I10F+-Medium inkubiert wurden. So ergaben sich für jedes Serum sechs Ansätze: pro Effektor-Targetzellverhältnis (1:1 u. 10:1) ein Ansatz mit unverdünntem und einer mit verdünntem Serum und je ein Kontrollansatz (ohne Zugabe von Effektorzellen) mit verdünntem und unverdünntem Serum. Nach einer 48-stündigen Inkubation folgte ein zweimaliges Waschen mit je 200 µl I10F+-Medium, um die neutrophilen Granulozyten zu entfernen. Nach dem letzten Waschen erfolgte die Zugabe von je 200 µl I10F+-Medium und der MTT-Lösung. Alle weiteren Schritte erfolgten wie unter 3.3.14 beschrieben. 3.3.15 Lymphozytenstimulation Canine Lymphozyten wurden zur Zellproliferation angeregt, um den zytotoxischen Effekt von Seren tumorerkrankter und gesunder Hunde auf stimulierte und unstimulierte Lymphozyten zu untersuchen. Die Aktivierung von Lymphozyten durch Mitogene oder Superantigene lässt diese aus dem Ruhezustand in den Zellzyklus eintreten, wodurch es im Zuge der mitotischen Aktivität zu morphologischen Veränderungen wie Größenzunahme und Komplexitätssteigerung durch Verschiebung im Kern/Plasma-Verhältnis kommt. Die Gesamtheit der damit einhergehenden Veränderungen wird auch als blastische Transformation bezeichnet. Diese kann anhand von großen Lymphozyten morphologisch erfasst und mit Hilfe der Referenzzellmethode nach HENDRICKS (1998) quantifiziert werden, indem die absolute Zahl generierter Lymphoblasten bestimmt wird. In dem hier eingesetzten Verfahren wurde jedoch aufgrund der o.g. Fragestellungen nicht die Zahl der proliferierenden Lymphozyten bestimmt, sondern die Gesamtzahl vitaler Lymphozyten (3.3.11.5). Material und Methoden 71 3.3.15.1 Durchführung der Lymphozytenproliferation zur Überprüfung eines zytotoxischen Effektes autoantikörperpositiver caniner Seren Nach der Separation (3.3.3) wurden canine mononukleäre Zellen des Blutes in Kulturmedium (I10F+) resuspendiert und auf eine Konzentration von 2 x 106/ml eingestellt. Die Stimulationsansätze erfolgten in sterilen 96-Loch-Rundbodenmikrotiterplatten, wobei das Gesamtvolumen pro Vertiefung 175 µl betrug. Als Mitogen wurde einmalig ConA eingesetzt und bei allen weiteren Untersuchungen SEA, da eine Interaktion zwischen Zuckerketten des ConA-Moleküles und den Fc-Teilen der in den Seren enthaltenden Antikörpern ausgeschlossen werden sollte. Von den Stammlösungen wurde eine Verdünnung in I10F+-Medium angesetzt, so dass die Endkonzentration der zugegebenen Mitogenlösungen 1 µg/ml (ConA) bzw. 1 ng/ml (SEA) betrug. Die zu untersuchenden Seren caniner Tumorpatienten und gesunder Kontrolltiere wurden 1:10 in I10F+Medium verdünnt und die in Tab. 20 dargestellten Proliferations- und Vergleichsansätze in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte verbracht. Tab. 20 Lymphozytenstimulationsansätze mit Seren caniner Tumorpatienten und gesunder Kontrolltiere Proliferationsansatz (mit ConA/SEA) Vergleichsansatz ohne Proliferationsstimulans mit 100 µl Zellsuspension 100 µl Zellsuspension Serum 25 µl ConA-/SEA-Verdünnung 25 µl Serum (Endkonzentration: 1:7) oder (Endkonzentration: 1 µg/ml bzw. 1 ng/ml) 25 µl Serumverdünnung 25 µl Serum (Endkonzentration: 1:7) oder (Endkonzentration: 1:70) 25 µl Serumverdünnung 50 µl I10F+-Medium (Endkonzentration: 1:70) 25 µl I10F+-Medium ohne 100 µl Zellsuspension 100 µl Zellsuspension Serum 25 µl ConA- bzw. SEA-Verdünnung 75 µl I10F+-Medium 50 µl I10F+-Medium Jedes Serum wurde verdünnt und unverdünnt eingesetzt, wobei die Ansätze mit unverdünntem Serum als Unikate (die zur Verfügung stehende Serummenge war begrenzt), diejenigen mit Serumverdünnungen als Duplikate und alle Kontrollansätze als Triplikate erfolgten. Die Mikrotiterplatte wurde 48 Stunden bei 37°C und 5% CO2 (in Luft) in einer feuchten Kammer (50 ml 1% Kupfersulfatlösung) inkubiert. Die Quantifizierung vitaler Lymphozyten in den einzelnen Ansätzen erfolgte durchflusszytometrisch (3.3.11.5). 72 Material und Methoden Besonderheiten bei dem Einsatz von ultrafiltrierten IgG-Fraktionen Die ultrafiltrierten Eluate (15 µl, 3.3.17) wurden mit 15 µl I10F+-Medium versetzt und 25 µl dieser Lösung analog einem unverdünnten Serum (s.o.) eingesetzt. Die restlichen 5 µl wurden mit 45 µl I10F+-Medium versetzt (1:10) und wie ein verdünntes Serum (s.o.) eingesetzt. 3.3.16 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese In Anlehnung an LAEMMLI (1970) werden in der Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Proteine gemäß ihres Molekulargewichtes in einem diskontinuierlichen Elektrophoresesystem aufgetrennt. Die Proteine werden dabei mit dem negativ geladenen Detergenz Sodiumdodecylsulfat (SDS) versetzt. Sie erhalten somit eine negative Gesamtladung und nehmen eine „random coil configuration“ an. Diese bezeichnet eine dreidimensionale Ellipse, deren Durchmesser und Ladung dem Molekulargewicht proportional ist. Während der diskontinuierlichen Elektrophorese werden die Proteine zunächst in einem großporigen Sammelgel konzentriert und erreichen dann auf ihrer Wanderung zur Anode das engmaschige Trenngel, wo sie nach ihrer Auftrennung entsprechend ihrem relativen Molekulargewicht deutliche Banden bilden. a) Probenvorbereitung für die Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelektrophorese Für die SDS-PAGE wurden 15 µl der Proteine 1:2 mit doppelt konzentriertem Probenpuffer – je nach Fragestellung mit oder ohne Zusatz von 2-Mercaptoethanol (100 µl/ml) – versetzt. Danach wurden die Proben für 10 Minuten gekocht und anschließend zwei Minuten bei 3000 x g abzentrifugiert, um den Überstand von Proteinaggregaten und Partikeln zu befreien. b) Durchführung der Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelektrophorese Die Elektrophorese wurde in einer Mini-Protean II Kammer vertikal mit 5 cm effektiver Trennstrecke und 1 mm Gelstärke durchgeführt. Zunächst wurde das Trenngel gegossen und mit Aqua dest. überschichtet, um eine vollständige Polymerisation (30 Minuten) unter Luftausschluss zu gewährleisten. Nach Absaugen des Wassers wurde das Sammelgel gegossen und zur Ausbildung der Probentaschen ein Kamm eingesetzt. Nach einer 30-minütigen Polymerisation wurden die Kämme entfernt, die Kammer zusammengebaut und mit Elektrodenpuffer befüllt. Unter Verwendung von speziellen Pipettenspitzen („gel loader tips“) wurden 30 µl der vorbereiteten Proben bzw. 20 µl eines kommerziell erhältlichen Molekulargewichtsstandards in die Probentaschen pipettiert. Unbeladene Probentaschen wurden mit je 30 µl SDS-Probenpuffer befüllt. Bei einer konstanten Spannung von 200 V (bei initial maximal 40 mA pro Gel) und Raumtemperatur war der Gellauf nach 45-60 Minuten beendet. c) Coomassie-Brilliant-Blau Färbung des Polyacrylamidgels Nach Beendigung der Gelelektrophorese wurde das Gel zur unspezifischen Färbung aller Proteine 20 Minuten in Coomassie-Brilliant-Blau Färbelösung geschwenkt. Anschließend erfolgte eine Inkubation in der Coomassie-Brilliant-Blau Entfärbelösung. Die Lösung wurde dabei mehrmalig gewechselt, bis die unspezifische Hintergrundfärbung verschwunden war, und nur noch die gefärbten Proteine als deutliche blaue Bande erkennbar waren. Material und Methoden 73 3.3.17 Immunglobulin G-Aufreinigung und Ultrafiltration Die an Protein A bindende IgG-Fraktion kann mit Hilfe einer „Protein A Mini Spin Column“ in Mengen von 0,2 - 0,3 mg aus Probenflüssigkeiten wie zum Beispiel Serum durch Zentrifugation gewonnen werden. Protein A ist dabei an eine Membran gekoppelt, die sich innerhalb eines 2,2 ml Zentrifugenröhrchens befindet. Protein A wird aus der Zellwand von Staphylokokkus aureus gewonnen und bindet bei den einzelnen Spezies mit einer unterschiedlichen Affinität an die Fc-Teile von IgG-Subtypen. Für den Hund besteht nach PENG et al. (1991) eine hohe Affinität für IgG, wobei nicht bekannt ist, welche IgG-Subtypen gebunden werden. In den vorliegenden Untersuchungen sollte die IgG-Fraktion aus Patientenseren und Proben von gesunden Hunden gewonnen werden. Durchführung der IgG-Aufreinigung Zur Aufreinigung von IgG wurden 200 µl Serum mit 200 µl Equilibrierungspuffer versetzt und auf die Membran gegeben, nachdem diese zuvor mit 400 µl Equilibrierungspuffer gewaschen wurde (5 Minuten, 800 x g). Einer 7-minütigen Zentrifugation bei 400 x g folgte ein Waschschritt mit 400 µl Equilibrierungspuffer (5 Minuten, 800 x g). Anschließend wurden die Immunglobuline durch eine pH-Wert-Erniedrigung von der Membran gelöst, indem mit 400 µl Eluierungspuffer gewaschen wurde (5 Minuten, 400 x g). Das Eluat wurde in einem 2,2 ml Sammelröhrchen aufgefangen. Um die Antikörperaktivität zu erhalten, wurde das Eluat unmittelbar nach der Zentrifugation mit 20 µl Neutralisationspuffer versetzt. Ultrafiltration der IgG-Fraktionen Vor dem Testeinsatz wurden die IgG-Fraktionen mit Hilfe einer Ultrazentrifugationseinheit („Vivaspin 500“) aufkonzentriert. Während der Ultrafiltration passieren alle Bestandteile mit einem Molekulargewicht unterhalb des „molecular weight cut off“ (MWC)-Wertes die in einem 2,2 ml Zentrifugenröhrchen befindliche Membran. Die Restbestandteile der Probe bleiben in einem bis zu 40fach verkleinerten Volumen erhalten. Als MWC-Wert wurde 50000 gewählt, was deutlich unter dem Molekulargewicht von caninem IgG (180 kDa) liegt (HEDDLE u. ROWLEY 1975). Die neutralisierten Eluate (400 µl) wurden unmittelbar nach der Gewinnung auf die Membran des Zentrifugenröhrchens gegeben und 30 Minuten bei 10000 x g abzentrifugiert. Das Eluat wurde verworfen und der Überstand (15 µl) in Funktionsanalysen (3.3.14.1 u. 3.3.15.1) eingesetzt. 3.3.18 Protein-Bestimmung mit Hilfe des Bicinchoninsäure-Assays Der Bicinchoninsäure (BCA)-Assay nach SMITH et al. (1987) ermöglicht eine quantitative Proteinbestimmung durch den kolorimetrischen Nachweis von BCA und Cu1+-Ionen. Diese gehen aus der Reduktion von Cu2+ zu Cu1+ bei der Anwesenheit von Proteinen im alkalischen Milieu (Biuret-Reaktion) hervor und werden mit dem BCA-Nachweisreagenz zu einem violetten Reaktionsprodukt komplexiert. Dieser Farbkomplex kann kolorimetrisch bei 562 nm 74 Material und Methoden (Absorptionsmaximum des Komplexes) detektiert werden, wobei die Extinktion proportional zur ursprünglichen Proteinkonzentration ist. In der vorliegenden Untersuchung sollte der Proteingehalt im Eluat vor und nach der Ultrafiltration (3.3.17) bestimmt werden, um die Effektivität der Ultrafiltration zu überprüfen. Durchführung der Proteinbestimmung Zunächst wurden Albumin-Standards in einer Konzentration von 31,25 µg/ml, 62,5 µg/ml, 125 µg/ml... bis 2000 µg/ml (in PBS verdünnt) hergestellt. Nach Vorlage von je 25 µl Albuminstandard, Eluat oder Ultrafiltrat (15 µl Ultrafiltrat vermischt mit 10 µl PBS) in die Vertiefungen einer 96-Loch-Flachbodenplatte wurden 200 µl eines Arbeitsreagenzes (BCAReagenz A : BCA-Reagenz B [50:1]) hinzugegeben und die Lösungen 30 Sekunden auf dem Plattenrüttler durchmischt. Die Extinktion wurde nach 20 und 40 Minuten Inkubation bei 37oC im Photometer bestimmt (Testwellenlänge: 570 nm, Referenzwellenlänge: 490 nm). Als „Nullwerte“ dienten die Extinktionen von 25 µl PBS, 25 µl Eluierungspuffer und 15 µl Eluierungspuffer versetzt mit 10 µl PBS. Die in der Probe enthaltene Proteinkonzentration wurde anhand einer aus den OD-Werten der Albuminstandards generierten Eichkurve und computerunterstützter Kurvenanalyse errechnet. 3.3.19 Datenverarbeitung und statistische Verfahren Sämtliche durchflusszytometrisch gewonnenen Messdaten wurden mit Hilfe der Software WinMDI© (TROTTER 1999) analysiert und ausgewertet. Mit der Software Extract© (SCHUBERTH 1993) konnten durch WinMDI© gewonnene Daten umformatiert und dadurch in Microsoft Excel® weiter verarbeitet werden. Die statistische Auswertung wurde mit Hilfe der Software GFA-Statistik® und Microsoft Excel® durchgeführt. Als deskriptive statistische Messgrößen wurden bei annähernd normal verteilten Daten arithmetischer Mittelwert (MW) und Standardabweichung (s) berechnet. Nicht normal verteilte Daten wurden zu Median, Min und Max zusammengefasst. Um Unterschiede in der Inzidenz positiver Befunde bei den einzelnen Untersuchungsgruppen auf statistische Signifikanz zu überprüfen, wurde der Chi2-Test eingesetzt. Der Vergleich der Verteilungsbreite der nach durchflusszytometrischer Analyse ermittelten Histogramme erfolgte mit Hilfe des einseitigen T-Tests. Bei dem Chi2- und T-Test wurde p < 0,05 als signifikant angesehen. Ergebnisse 4 75 Ergebnisse 4.1 Fluoreszenserologischer Nachweis antinukleärer Antikörper mit dem FARA Bei der Überprüfung der 314 Seren tumorerkrankter Hunde, 40 Seren aus der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen und 46 Seren aus der gesunden Kontrollgruppe auf das Vorhandensein von antinukleären Antikörpern im FARA enthielten 2,2% der Seren tumorerkrankter Hunde ausschließlich antinukleäre Antikörper (Tab. 21 b). Die Mehrheit der positiv beurteilten Tumorpatientenseren zeigte eine ausschließliche Reaktion mit dem Zytoplasma (55%) oder sowohl dem Zytoplasma als auch dem Kern (39%) der HEp-2-Zelle (Abb. 4). Letzteres wurde im Folgenden als „gemischte Fluoreszenz“ bezeichnet. Die Patientendaten zu den „ANA-positiven“ Tieren sind unter 4.2.2.7 zusammengestellt. In der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen und der gesunden Kontrollpopulation konnte keine reine Kernfluoreszenz beobachtet werden (Tab. 21 b). Insgesamt betrug die Inzidenz positiver Testergebnisse bei den Tumorpatienten 40%, der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen 53% und der gesunden Kontrollpopulation 28% (Tab. 21 a). nukleäre Fluoreszenz Abb. 4 gemischte Fluoreszenz zytoplasmatische Fluoreszenz Mikroskopisches Bild (1000fache Vergrößerung) verschiedener Fluoreszenzlokalisationen bei der Inkubation caniner Seren mit HEp-2-Zellen beim fluoreszenzserologischen mikroskopischen Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) 76 Tab. 21 Ergebnisse Anteil autoantikörperpositiver Tiere und Reaktivitäten der autoantikörperpositiven Seren bei der Untersuchung von 314 Seren tumorerkrankter Hunde, 40 Seren aus der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen und 46 Seren gesunder Hunde im fluoreszenzserologischen mikroskopischen Verfahren zum Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) a: Anteil positiver Tiere in den drei Untersuchungsgruppen Anzahl unter- Anzahl positiver Anteil positiver suchter Tiere (n) Tiere (n) Tiere (%) Tumorpatienten 314 125 40 Tiere mit sonstigen 40 21 53 46 13 28 Erkrankungen gesunde Kontrollgruppe b: Fluoreszenzlokalisation positiv beurteilter Seren Tumorpatienten gesunde Erkrankungen Kontrollgruppe Seren Anteil3) (%) (n) (%) 13 62 6 46 39 8 38 7 54 6 - Fluoreszenz- Seren Anteil lokalisation (n) Zytoplasma 1) Tiere mit sonstigen Seren Anteil (%) (n) 69 55 Zytoplasma u. Kern 49 Kern 7 1) 2) 2) Anteil an allen positiven Seren (n = 125) der Tumorpatienten. Anteil an allen positiven Seren (n = 21) der 3) Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen. Anteil an allen positiven Seren (n = 13) innerhalb der gesunden Kontrollgruppe. Ergebnisse 77 Wie der Abb. 5 zu entnehmen ist, überschritt in allen Untersuchungsgruppen die Mehrheit (Tumorpatienten: 83%; Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen: 81%, gesunde Kontrollgruppe: 85%) aller positiv beurteilten Seren einen Titer von 1:100 nicht. Eine Ausnahme bildeten die 7 ANA-positive Seren, die bis auf eine Probe höher-titrig waren (4.2.2.7). Anteil aller positiven Seren 80 60 1) Titer = 1:1000 Titer > 1:10001) 20 0 Abb. 5 Titer = 1:100 40 Tumorpatienten Vergleichsgruppe gesunde Kontrollgruppe Titerverteilung der im mikroskopischen Verfahren (FARA) als autoantikörperpositiv beurteilten Seren von 314 Seren tumorerkrankter Hunde (n = 125), 40 Seren aus der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen (n = 21) und 46 gesunden Kontrollhunden (n = 13) Titer 1:2000 (n = 1), Titer 1:8000 (n = 1), Titer 1:16000 (n = 1), Titer 1: 64000 (n = 1). 4.1.1 Reproduzierbarkeit und Präzision des mikroskopischen Verfahrens zum Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) Bei den Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit und Präzision des FARA (3.3.10.4) zeigte sich, dass innerhalb eines Testtages die Beurteilung der Fluoreszenzlokalisationen als auch der -intensitäten in Abhängigkeit des jeweiligen Untersuchers zum Teil deutlich differierte (Tab. 22). Die Auswertung durch einen Untersucher an unterschiedlichen Testtagen (Interassay Varianz) führte ebenfalls zu variablen Ergebnissen. Weiterhin ist Tab. 22 zu entnehmen, dass sich die Lokalisation der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Serumverdünnung unterschiedlich darstellte. Hingegen führte die Beurteilung des 7fachen Ansatzes durch eine Person zu relativ konstanten Ergebnissen (Tab. 23). Die mikroskopische Beurteilung der caninen Seren, die im FARA eine im Zytoplasma oder sowohl im Zytoplasma als auch Kern der HEp-2-Zellen (Tab. 21 b) lokalisierte Fluoreszenz zeigten, gestaltete sich im Vergleich zu ANA-positiven Seren, deren Einordnung aufgrund der zur Verfügung stehenden Referenzseren keine Probleme bereitete, bedeutend schwieriger. Dies war zum einen darin begründet, dass meist nicht auszumachen war, ob eine gemischte Fluoreszenz auf einer räumlichen Überlagerung des Kerns mit der zytoplasmatischen Fluoreszenz beruhte. Zum anderen variierte die Lokalisation der Fluoreszenz sowohl 78 Ergebnisse innerhalb eines Objektträgerfeldes, d.h. innerhalb eines Probenauftrages, als auch in Abhängigkeit von der Serumverdünnung. Schließlich gestaltete sich die Einordnung der Seren in „positiv“ oder „negativ“ anhand der Fluoreszenzintensität schwierig, da fast die Hälfte der untersuchten Seren bei einer Verdünnung von 1:100 eine relativ schwache Fluoreszenz zeigte (Abb. 5), und sich nur wenige Seren durch eine intensivere Fluoreszenz hervortaten und Referenzseren für zytoplasmatische bzw. gemischte Fluoreszenzen nicht zur Verfügung standen. Tab. 22 Ergebnisse des fluoreszenzserologischen mikroskopischen Nachweises autoreaktiver Antikörper (FARA) dreier caniner Seren, die von Tumorpatienten stammten und keine klassische nukleäre Fluoreszenz im FARA zeigten, durch drei Untersucher an vier aufeinanderfolgenden Testtagen Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Nr. U 1:100 1:500 1:100 1:500 1:100 1:500 1:100 1:500 A Z(+) neg. Z(+) K(+) neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. Z+ K+ neg. Z+ K+ neg. Z+ K+ Z+ K+ K+ K+ K+ - - neg. Z(+) K(+) neg. Z(+) K(+) neg. Z(+) neg. 1 B Z++ K++ Z(+) K(+) C Z+++ A Z(+) K(+) 2 3 B Z+ K++ K++ Z+ K+ neg. Z+ K+ neg. Z++ K++ neg. C K++ K++ K++ neg. K++ K+ - - A Z(+) K(+) neg. Z(+) K(+) K(+) Z(+) K(+) K(+) Z(+) neg. B Z++ K++ Z+ K+ Z(+) K(+) neg. Z(+) K(+) Z(+) K(+) Z(+) neg. C Z++ K++ K+ Z+ K+ K(+) Z(+) K(+) - - neg. An Tag 4 stand der dritte Untersucher nicht zur Verfügung. Die Beschriftung der Seren war verschlüsselt, so dass der Untersucher die einzelnen Proben an den unterschiedlichen Testtagen einander nicht zuordnen konnte. Z: Fluoreszenz im Zytoplasma, K: Fluoreszenz im Kern, (+): sehr schwache Fluoreszenzintensität, +: schwache Fluoreszenzintensität, ++: starke Fluoreszenzintensität, +++: sehr starke Fluoreszenzintensität, neg.: negativ, 1:100, 1:500: Serumverdünnungen, die beurteilt wurden, Nr.: Serumnummer, U: Untersucher A, B und C. Tab. 23 Ergebnisse des fluoreszenzserologischen mikroskopischen Nachweises autoreaktiver Antikörper (FARA) eines 7fach-Ansatzes eines Serums, das von einem caninen Tumorpatienten stammte und im FARA keine klassische nukleäre Fluoreszenz zeigte 1 1:100 1:500 2 3 4 Z ++ K (+) Z ++ K++ Z ++ K (+) Z ++ K (+) neg. neg. neg. neg. 5 6 7 Z+K+ Z+K+ Z ++ K ++ neg. neg. neg. Der FARA wurde durch eine Person beurteilt. Z: Fluoreszenz im Zytoplasma, K: Fluoreszenz im Kern, (+): sehr schwache Fluoreszenzintensität, +: schwache Fluoreszenzintensität, ++: starke Fluoreszenzintensität, +++: sehr starke Fluoreszenzintensität, 1:100, 1:500: Serumverdünnungen, die beurteilt wurden, 1-7: Ansatz eins bis sieben. Ergebnisse 79 4.2 Intrazellulärer Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) und HEp-2-Zellen als Substrat Aufgrund der geschilderten Problematik bei der Beurteilung der vorliegenden Hundeseren im FARA wurde ein alternatives Testverfahren, das üblicherweise zum Nachweis intrazellulärer Antigene konzipiert ist und auf der Durchflusszytometrie beruht, so modifiziert, dass es sich ebenso dazu eignet Autoantikörper, die sich gegen intrazellulär gelegene Zielstrukturen richten, zu detektieren. Mit Hilfe dieses Untersuchungsverfahrens – im Folgenden als „IIFD“ bezeichnet – sollten die Ergebnisse aus der mikroskopischen Beurteilung im FARA reevaluiert werden. 4.2.1 Modifikation und Evaluierung der Methode In den Vorversuchen (3.3.11.1) wurden die Versuchsbedingungen optimiert, die Inter- und Intraassay Varianz der Methode bestimmt und eine indirekte Membranimmunfluoreszenz mit HEp-2-Zellen durchgeführt. Waschzyklen und Waschzeit Die Histogramme und das Verhältnis der durchflusszytometrisch erfassten mittleren Fluoreszenzintensitäten eines FARA-kernpositiven und eines -negativen Serums nach 10- und 30minütiger Waschzeit bzw. ein und zwei Waschzyklen (3.3.11.1) sind in Abb. 6 dargestellt. Eine Verlängerung der Waschzeit von 10 auf 30 Minuten bei zwei Waschdurchgängen anstelle von einem verbesserte die Diskriminierung von positivem und negativem Serum deutlich. In allen nachfolgenden Untersuchungen wurden daher zwei Waschschritte zu je 30 Minuten durchgeführt und in das entsprechende Versuchsprotokoll (3.3.11.1) aufgenommen. Ereignisse 1 x 10 Minuten [0,9] 1 x 30 Minuten 2 x 30 Minuten [2,7] [3,6] Fluoreszenzintensität (FL1) negatives Serum Abb. 6 positives Serum Durchflusszytometrisch (IIFD) ermittelte Histogramme eines im mikroskopischen Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) kernpositiven (Titer 1:16000) und eines negativen caninen Serums nach 10- bzw. 30-minütiger Waschzeit und einem oder zwei Waschzyklen, die der Seruminkubation folgten Es wurden 100000 HEp-2-Zellen mit 25 µl Serumverdünnung (1:500) inkubiert. Die in eckigen Klammern dargestellten Zahlen geben das Verhältnis der mittleren Fluoreszenzintensität von positivem und negativem Serum an. 80 Ergebnisse Zellzahl und Serumvolumen Wie Abb. 7 zu entnehmen ist, stiegen bei einer nahezu parallelen Verschiebung der Kurven die durchflusszytometrisch erfassten mittleren Fluoreszenzintensitäten eines FARA-kernpositiven und eines -negativen Serums (3.3.11.1) mit zunehmendem Serumvolumen an und fielen mit steigender Zellzahl ab. Um diejenige Zellzahl-Serumvolumen-Kombination zu ermitteln, die die beste Diskriminierung negativer und positiver Seren erlaubt, wurde das Verhältnis der für die beiden Seren ermittelten mittleren Fluoreszenzintensität bestimmt. Wie aus Tab. 24 ersichtlich, war dieses bei einer Zellzahl von 25000, inkubiert mit 50 µl Serumverdünnung, am größten. Die entsprechende Zellzahl-Serumvolumen-Kombination wurde daher in das unter 3.3.11.1 beschriebene Versuchsprotokoll aufgenommen und in allen nachfolgenden Ansätzen befolgt. 50 µl Serumvolumen 25 µl Serumvolumen 1000 mittlere Fluoreszenzintensität (FL1) (log 10) 1000 positives Serum 100 100 1000 1000 1000 1000 negatives Serum 100 100 1000 1000 Serumverdünnung (x 10-1) (log 10) 25 000 Zellen Abb. 7 50 000 Zellen 75 000 Zellen 100 000 Zellen Mittlere Fluoreszenzintensitäten (FL1) bei unterschiedlichen Zellzahl-Serumvolumen-Kombinationen nach durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) eines beim fluoreszenzserologischen mikroskopischen Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) kernpositiven (Titer 1:16000) und eines negativen caninen Serums Die Seren wurden 1:500, 1:1000, 1:2000 u. 1:4000 verdünnt und in unterschiedlichen Zellzahl-SerumvolumenKombinationen (Tab. 24) mit HEp-2-Zellen inkubiert. FL1: Fluoreszenzintensität im Grünbereich (530 nm ± 15 nm). Ergebnisse Tab. 24 81 Quotient aus den durchflusszytometrisch erfassten (IIFD) mittleren Fluoreszenzintensitäten (FL1) eines beim fluoreszenzserologischen mikroskopischen Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) kernpositiven (Titer 1:16000) und eines negativen caninen Serums bei unterschiedlichen Zellzahl-SerumvolumenKombinationen Serumvolumen Anzahl HEp-2-Zellen 25000 50000 75 000 100000 25 µl 5,0 4,6 4,3 3,8 50 µl 5,4 5,0 4,8 4,8 Die Anzahl HEp-2-Zellen bezieht sich auf die Zellen, die in jede Vertiefung einer 96-Loch-Rundbodenplatte gegeben und mit 25 µl bzw. 50 µl der jeweiligen Serumverdünnung (1:500, 1:1000, 1:2000 u. 1:4000) inkubiert wurden. Das Verhältnis der mittleren Fluoreszenzintensitäten (FL1) von positivem und negativem Serum wurde für die vier Verdünnungsstufen gemittelt und in der Tabelle dargestellt. Intraassay Varianz Der Variationskoeffizent für die mittleren Fluoreszenzintensitäten, die bei einem 7fachAnsatz eines FARA-kernpositiven Serums im IIFD (3.3.11.1) ermittelt wurden, können Tab. 25 entnommen werden. Der aus allen Verdünnungsstufen gemittelte Variationskoeffizent lag bei 8%. Tab. 25 Intraassay Varianz der durchflusszytometrischen Analyse (IIFD): Variationskoeffizent der mittleren Fluoreszenzintensitäten (FL1) bei einem 7fach-Ansatz eines beim fluoreszenzserologischen mikroskopischen Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) kernpositiven Serums Serumver- mittlere FL1 VK (%) dünnung (MW ± s) (s/MW)100 1:500 1232 ± 57 5 1:1000 1034 ± 71 7 1:2000 822 ± 53 6 1:4000 608 ± 52 8 1:8000 423 ± 31 7 1:16000 320 ± 34 11 1:32000 229 ± 26 11 1:64000 175 ± 16 9 MW: Mittelwert, s: Standardabweichung, VK: Variationskoeffizent, FL1: Fluoreszenzintensität im Grünbereich (530 ± 15nm). 82 Ergebnisse Interassay Varianz Bei einer wiederholten Messung der mittleren Fluoreszenzintensitäten eines FARA-kernpositiven, -zytoplasmapositiven und -negativen Serums an insgesamt 5 Versuchstagen (3.3.11.1) lag der Variationskoeffizient zwischen 8 und 25% (Tab. 26). Ab einer Verdünnung von 1:2000 betrug er für alle Seren ≤ 20%. Der Variationskoeffizent – gemittelt aus allen Verdünnungsstufen – lag für das kernpositive bei 14,8%, für das negative bei 15,8% und für das zytoplasmapositive Serum bei 17,3%. Tab. 26 Interassay Varianz der durchflusszytometrischen Analyse (IIFD): Variationskoeffizent der mittleren Fluoreszenzintensitäten (FL1) eines beim fluoreszenzserologischen mikroskopischen Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) kernpositiven, eines zytoplasmapositiven und eines negativen Serums an 5 unterschiedlichen Testtagen zytoplasmapositives Serum Serum- kernpositives Serum negatives Serum mittlere FL1 VK (%) mittlere FL1 VK (%) mittlere FL1 VK (%) verd. (MW ± s) (s/MW)100 (MW ± s) (s/MW)100 (MW ± s) (s/MW)100 1:500 1629 ± 410 25 1348 ± 281 21 358 ± 87 24 1:1000 910 ± 227 25 1122 ± 196 17 264 ± 56 21 1:2000 597 ± 83 14 859 ± 95 11 181 ± 36 20 1:4000 361 ± 68 19 694 ± 93 13 130 ± 14 11 1:8000 232 ± 34 15 486 ± 67 14 102 ± 90 9 1:16000 170 ± 18 10 333 ± 47 14 87 ± 7 8 1:32000 125 ± 21 17 275 ± 46 17 77 ± 14 18 1:64000 113 ± 16 14 184 ± 23 12 67 ± 11 16 Konjugat1) mittlere FL1 = 67 ± 8 ; VK = 11 % Dargestellt sind für jede Verdünnungsstufe Mittelwert und Standardabweichung der mittleren Fluoreszenz1) intensität (FL1) aus den 5 Versuchstagen sowie die Variationskoeffizenten. Konjugatkontrolle: Inkubation der HEp-2-Zellen mit dem FITC-konjugierten Ziege-anti-Hund-IgG Sekundärantikörper. Serumverd.: Serumverdünnung, MW: Mittelwert, s: Standardabweichung, VK: Variationskoeffizent, FL1: Fluoreszenzintensität im Grünbereich (530 ± 15nm. Ergebnisse 83 mittlere Fluoreszenzintensität (FL1) Indirekte Membranimmunfluoreszenz Die Mittelwerte der durchflusszytometrisch erfassten mittleren Fluoreszenzintensitäten (FL1) von zwei FARA-kernpositiven, drei -zytoplasmapositiven und einem -negativen Serum nach indirekter Membranimmunfluoreszenz mit fixierten HEp-2-Zellen (3.3.9) sind in Abb. 8 dargestellt. Demnach unterschied sich die mittlere Fluoreszenzintensität positiver und negativer Seren nur gering, und mit steigender Serumverdünnung war keine Abnahme der mittleren Fluoreszenzintensität zu beobachten. Die mittlere Fluoreszenzintensität der „Konjugatkontrolle“ war mit 16 um den Faktor 0,5-0,8 geringer als diejenige der hier eingesetzten Seren. Alle Werte lagen jedoch deutlich unter den für negative Seren ermittelten mittleren Fluoreszenzintensitäten (Tab. 26). 40 30 20 10 500 1000 1500 Serumverdünnung (x zytoplasmapositiv Abb. 8 2000 10-1) kernpositiv negativ Durchflusszytometrisch erfasste mittlere Fluoreszenzintensitäten (FL1) von zwei beim fluoreszenzserologischen mikroskopischen Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) kernpositiven, drei zytoplasmapositiven und einem negativen Serum nach indirekter Membranimmunfluoreszenz mit fixierten HEp-2-Zellen Die dargestellten mittleren Fluoreszenzintensitäten wurden für die positiven Seren gemittelt. Bei alleiniger Inkubation der HEp-2-Zellen mit dem FITC-konjugierten Ziege-anti-Hund-IgG Sekundärantikörper betrug die mittlere Fluoreszenzintensität 16. FL1: Fluoreszenzintensität im Grünbereich (530 ± 15 nm). 84 4.2.2 Ergebnisse Durchflusszytometrische Untersuchung der Seren tumorerkrankter Hunde 4.2.2.1 Inzidenz autoreaktiver Antikörper und Titerverteilung der positiven Seren Insgesamt konnten bei 16% der im IIFD (3.3.11.1) untersuchten Tumorpatienten (n = 314) autoreaktive Antikörper in den entsprechenden Seren nachgewiesen werden (Tab. 27). Bei der gesunden Kontrollpopulation (n = 46) betrug die Inzidenz positiver Autoantikörperbefunde 4%. In der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen (n = 40) befanden sich zu 20% autoantikörperpositive Tiere. Die Inzidenz positiver Autoantikörperbefunde war bei der Gesamtzahl der Tumorpatienten (p = 0,0408) und der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen (p = 0,0239) signifikant größer als bei der gesunden Kontrollgruppe. Zwischen dem Anteil positiver Tiere in der Kontrollgruppe mit sonstigen Erkrankungen im Vergleich zu der Gesamtheit der Tumorpatienten bestand hingegen kein signifikanter Unterschied (p = 0,4763). Tab. 27 Inzidenz autoreaktiver Antikörper bei Hunden mit Tumoren, einer gesunden Kontrollpopulation und einer Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen nach Analyse im intrazellulären Immunfluoreszentest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) Anzahl untersuchter Anzahl positiver Anteil positiver Tiere (n) Tiere(n) Tiere (%) Tumorpatienten 314 49 16 Tiere mit sonstigen 40 8 20 46 2 4 Erkrankungen gesunde Kontrollgruppe Bei einer Differenzierung der autoantikörperpositiven Tumorpatientenseren in niedrig- (Titer: 1:500 u. 1:1000), mittel- (Titer: 1:2000, 1:4000 u. 1:8000) und hochtitrige (Titer: 1:16000, 1:32000 u. 1:64000) Seren hatten die anteilig meisten Seren einen mittleren Titer (49%, Abb. 9). Im Vergleich zu den Tumorpatienten war die Inzidenz hochtitriger Seren (Titer ≥ 1:16000) bei den Tieren mit sonstigen Erkrankungen mit 12,5% geringer, niedrigtitrige (Titer ≤ 1:1000) Seren waren bei der Vergleichsgruppe nicht vertreten (Abb. 9). Die beiden positiven Seren aus der gesunden Kontrollgruppe hatten einen Titer von 1:500 und 1:4000. Die genauen Titer der einzelnen Seren können Tab. V u. VI des tabellarischen Anhangs entnommen werden. Anteil aller positiven Seren (%) Ergebnisse 85 80 60 40 Titer 1:500 u. 1:1000 Titer 1:2000, 1:4000 u. 1:8000 Titer 1:16000, 1:32000 u. 1:64000 20 0 Tumorpatienten n = 49 Abb. 9 Vergleichsgruppe n=8 Titerspektrum der autoantikörperpositiven Seren nach Untersuchung von 314 Seren tumorerkrankter Hunde und 40 Seren aus der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen im intrazellulären Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) 4.2.2.2 Vergleich der Ergebnisse aus dem durchflusszytometrischen (IIFD) und fluoreszenzserologischen mikroskopischen Verfahren (FARA) zum Nachweis autoreaktiver Antikörper In Tab. 28 sind die vorliegenden Ergebnisse aus der Untersuchung von 314 Seren tumorerkrankter Hunde (Tab. 27) denjenigen, die zuvor in der Standardmethode – dem FARA – ermittelt wurden (Tab. 21), gegenübergestellt. Es zeigte sich, dass die größte Diversität beider Untersuchungsmethoden bei der Beurteilung von Seren bestand, die in dem herkömmlichen Verfahren einen Titer von 1:100 nicht überschritten. Die überwiegende Mehrheit dieser Seren erwies sich in der durchflusszytometrischen Methode als negativ. Dies traf insbesondere für zytoplasmapositive Seren zu, deren mittlere Fluoreszenzintensitäten (FL1) im IIFD zu 89% unter dem Schwellenwert lagen. Im Gegensatz dazu wurden sämtliche Seren, die im Standardverfahren bei einer Verdünnung ≥ 1:1000 positiv beurteilt wurden, in der durchflusszytometrischen Untersuchung ebenfalls als positiv identifiziert. Ähnlich übereinstimmend fielen die Ergebnisse bei der Beurteilung derjeniger Seren aus, die im FARA negativ eingestuft wurden. Bei 97% dieser Seren lagen die mittleren Fluoreszenzintensitäten unter dem Schwellenwert, 3% der ursprünglich negativ beurteilten Seren erwiesen sich im IIFD als autoantikörperpositiv. 86 Tab. 28 Ergebnisse Vergleichende Darstellung der Ergebnisse aus der Untersuchung von 314 Seren tumorerkrankter Hunde im mikroskopischen (FARA) und durchflusszytometrischen (IIFD) Verfahren zum Nachweis autoreaktiver Antikörper FARA IIFD (n) IIFD (%) Beurteilung Anzahl (n) negativ positiv negativ positiv negativ pos. Z 100 pos. ZK 100 pos. K 100 pos. Z ≥1000 pos. ZK ≥1000 pos. K ≥1000 189 63 40 1 6 9 6 183 56 25 1 - 6 7 15 6 9 6 97 89 63 100 - 3 11 37 100 100 100 Z: zytoplasmatische Fluoreszenz, ZK: gemischte, sowohl im Kern als auch Zytoplasma lokalisierte Fluoreszenz, K: reine Kernfluoreszenz, pos.: positiv, 100: Titer 1:100, ≥1000: Titer ≥1:1000. Nach Vergleich der Titer von Seren, die sich in beiden Testverfahren als positiv identifizieren ließen, wurde deutlich, dass eine Titerstufe im FARA durch eine Vielzahl von Titerstufen im IIFD repräsentiert wurde. Zudem lagen die Titer in der durchflusszytometrischen deutlich über denen, die in der herkömmlichen Methode ermittelt wurden (Abb. 10). In keinem Fall lag der in der durchflusszytometrischen Analyse ermittelte Titer niedriger als im FARA. Nur bei einem Serum konnte ein übereinstimmender Titer in beiden Testverfahren beobachtet werden. Wie aus Abb. 10 ersichtlich, wurden Seren, die in dem Standardverfahren (FARA) einen Titer von 1:100 aufwiesen, in der durchflusszytometrischen Methode vorrangig durch niedrig- und mitteltitrige Seren und diejenigen, die im FARA bis zu einer Verdünnung von 1:1000 positiv reagierten, in der Hauptsache durch mittel- und hochtitrige Seren repräsentiert. Drei von vier Seren, die aufgrund der im FARA hohen Titer in der Abbildung nicht berücksichtigt wurden, zeigten in der herkömmlichen Methode einen Titer von 1:2000, 1:16000 und 1:64000. Diese drei Seren wiesen im IIFD einen Titer von 1:64000 auf. Ein weiteres Serum zeigte nach mikroskopischer Beurteilung bis zu einer Verdünnung von 1:8000 und in der durchflusszytometrischen Analyse bis zu einer Verdünnung von 1:16000 eine positive Reaktion. Ergebnisse Anteil der Seren (%) A) 87 B) FARA-Titer 1:100 (n = 22) 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 FARA-Titer 1:1000 (n = 17) IIFD-Titer 1:500 u. 1:1000 IIFD-Titer 1:2000, 1:4000 u. 1:8000 IIFD-Titer 1:16000, 1:32000 u. 1:64000 Abb. 10 Vergleichende Darstellung derjenigen Seren caniner Tumorpatienten, die sowohl im mikroskopischen (FARA) als auch im durchflusszytometrischen (IIFD) Verfahren zum Nachweis autoreaktiver Antikörper einen autoantikörperpositiven Befund ergaben A) Dargestellt sind die im IIFD ermittelten Titer derjenigen Seren, die im FARA bei einer Verdünnung 1:100 positiv reagierten. B) Dargestellt sind die im IIFD ermittelten Titer derjeniger Seren, die im FARA bei einer Verdünnung von 1:1000 positiv reagierten. 4.2.2.3 Inzidenz positiver Autoantikörperbefunde bei den einzelnen Tumoren In Tab. 29 ist der durchflusszytometrisch ermittelte Anteil positiver Seren gegliedert nach den histopathologischen bzw. zytologischen Diagnosen der Tumoren aufgeführt. Die höchste Inzidenz autoreaktiver Antikörper bestand bei Tieren, die an einem Leydigzelltumor (36%), Plattenepithelkarzinom (31%), malignen Melanom (29%) oder der chronisch lymphatischen Leukämie (29%) erkrankt waren. Bei einem statistischen Vergleich mit dem Chi2-Test (berücksichtigt wurden nur Tumoren n ≥ 6) war die Frequenz positiver Testergebnisse bei dem Leydigzelltumor (p = 0,0018), Plattenepithelkarzinom (p = 0,0034), dem malignen Melanom (p = 0,0238), der chronisch lymphatischen Leukämie (p = 0,0238), der malignen Histiozytose (p = 0,0395), dem benignen Mammamischtumor (p = 0,0157) und dem malignen Lymphom (p = 0,0239) signigikant größer als bei der gesunden Kontrollpopulation (Abb. 11). Bei keinem der genannten Tumoren war die Inzidenz positiver Befunde signifikant größer als bei der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen (p > 0,05). Zwischen dem Anteil positiver Befunde bei dem Lipom (p = 0,0589), Adenom der Talgdrüsen (p = 0,2891), Fibrom (p = 0,8632), Mammakarzinom (p = 0,2529), Hämangiosarkom (p = 0,4719), multiplen Myelom (p = 0,47187) und der akuten lymphatischen Leukämie (p = 0,6279) im Vergleich zu der gesunden Kontrollgruppe und Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen bestand kein signifikanter Unterschied. Bei den zur Verfügung stehenden Seren (n ≥ 6) folgender Tumoren ließen sich keine Autoantikörper nachweisen: Osteosarkom, Adenom der Mamma, Mastozytom, Adenom der hepatoiden Drüsen, Fibrosarkom und Seminom. 88 Ergebnisse Tab. 29 Inzidenz autoreaktiver Antikörper bei 314 Hunden mit unterschiedlichen Tumoren nachgewiesen durch den intrazellulären Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) Tumorart Anzahl untersuchter Tiere (n) Anzahl Anteil positiver Tiere positiver Tiere1) (n) (%) Mammatumoren 53 7 13 benigne Mammatumoren 33 5 15 benigner Mammamischtumor 21 5 24 Adenom 12 0 0 20 2 10 maligne Mammatumoren Adenokarzinom 16 2 13 2) 4 0 0 malignes Lymphom 40 8 20 B-Zell 15 1 7 T-Zell 7 1 14 ohne Immunphänotypisierung 18 6 33 multiples Myelom 10 1 10 maligne Histiozytose 8 2 25 Leukämie 25 6 24 akute lymphatische Leukämie 13 1 8 chronische lymphatische Leukämie 7 2 29 Basophilenleukämie 2 1 50 undifferenzierte Leukämie 1 1 100 Megakaryozytenleukämie 1 1 100 Erythroleukämie 1 0 0 16 54) 31 6) 29 Sonstige Hauttumoren, Ausnahmen3)5) Plattenepithelkarzinom3) 5) malignes Melanom 7 2 Mastozytom 10 0 0 Histiozytom 5 2 40 Papillom 3 0 0 kutanes Osteosarkom (primär) 1 1 100 3 0 0 2 0 0 Meningiom 1 0 0 Neurofibrom 1 0 0 Sonstige 7) Gehirntumoren Ergebnisse 89 Fortsetzung Tab. 30 Tumorart Anzahl Anzahl Anteil positiver untersuchter positiver Tiere Tiere1) Tiere (n) (n) (%) 21 6 29 Leydigzelltumor 11 4 36 Seminom 6 0 0 Sertolizelltumor 4 2 50 Perianaltumoren 12 0 0 Adenom der hepatoiden Drüsen 9 0 0 Adenom der apokrinen Drüsen 1 0 0 Karzinom der apokrinen Drüsen 2 0 0 Knochen- und Knorpeltumoren 18 0 0 Osteosarkom 15 0 0 Chondrosarkom 2 0 0 Chondrom 1 0 0 Extra- und intraokulare Tumoren 12 1 8 Adenom der Meibomschen Drüsen 11 1 9 Adenom des Ziliarkörpers 1 0 0 benigne 19 3 16 Lipom 9 2 22 8 1 13 2 0 0 maligne 21 1 5 Hämangiosarkom 10 1 10 Fibrosarkom 8 0 0 Synovialzelltumor 1 1 100 Sonstige9) 3 0 0 Karzinome10) 22 211) 9 rektaler Polyp 1 1 100 Nebenschilddrüsenadenom 1 0 0 3 0 0 Hodentumoren sonstige mesenchymale Tumoren Fibrom Sonstige 8) sonstige epitheliale Tumoren Insulinom Legende: s. nachfolgende Seite 90 Ergebnisse 1) 2) Prozentualer Anteil autoantikörperpositiver Seren aller untersuchten Seren einer Tumorart. Spindel3) 4) zellkarzinom (n = 3), maligner Mischtumor (n = 1). oral (n = 10), pharyngeal (n = 3), kutan (n = 3). 5) 6) 7) pharyngeal (n = 3), oral (n = 2). oral (n = 4), kutan (n = 3). oral (n = 1), kutan (n = 1). Basaliom 8) (n = 1), Trichoepitheliom (n = 1), Hämangioperizytom (n = 1). Hämangiom (n = 1), Pilomatrixom (n = 1). 9) 10) Spindelzellsarkom (n = 1), Myxosarkom (n = 1), undifferenziertes Sarkom (n = 1). Übergangszell- (n = 5), intestinales (n = 5), Schilddrüsen- (n = 2), Bronchial- (n = 2), Leber- (n = 3), Vaginal- (n = 2), Larynx- (n = 1), 11) Lymphknoten- (n = 1) und Prostatakarzinom (n = 1). Schilddrüsenkarzinom (n = 1), Übergangszellkarzinom (n = 1). Abb. 11 gibt einen Gesamtüberblick über den Anteil positiver Seren bei den einzelnen Tumoren im Vergleich zu der gesunden Kontrollgruppe und der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen. Berücksichtigt wurden nur diejenigen Tumoren, für die mindestens 6 Seren unterschiedlicher Patienten zur Verfügung standen. Sonstige1) gesunde Kontrollgruppe (n = 46) akute lymphatische Leukämie (n = 13) Adenom der Meibomschen Drüsen (n = 11) multiples Myelom (n = 10) Hämangiosarkom (n = 10) Mammakarzinom (n = 19) Fibrom (n = 8) sonstige Erkrankungen (n = 40) malignes Lymphom (n = 40) Lipom (n = 9) benigner Mammamischtumor (n = 21) maligne Histiozytose (n = 8) chronische lymphatische Leukämie (n = 7) malignes Melanom (n = 7) Plattenepithelkarzinom (n = 16) Leydigzelltumor (n = 11) * * 20 30 ** 10 * ** 0 * 40 Anteil positiver Seren in Prozent (%) Abb. 11 Gesamtübersicht über den prozentualen Anteil autoantikörperpositiver Seren bei einzelnen Tumoren im Vergleich zu gesunden Kontrollhunden und Vergleichshunden mit sonstigen Erkrankungen nach Analyse von 314 Seren tumorerkrankter Hunde im intrazellulären Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) Dargestellt sind nur diejenigen Tumoren, für die mindestens 6 Seren unterschiedlicher Patienten zur Verfügung 1) standen (die Anzahl der untersuchten Seren steht in Klammer). Osteosarkom (n = 15), Adenom der Mamma (n = 12), Mastozytom (n = 10), Adenom der hepatoiden Drüsen (n = 9), Fibrosarkom (n = 8), Seminom (n = 6). Markiert sind alle Vergleiche einzelner Tumoren mit der gesunden Kontrollgruppe und der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen, die im Chi2-Test einen signifikanten Unterschied ergaben. * unterschiedlich mit p < 0,05; ** unterschiedlich mit p < 0,01. Ergebnisse 91 Die genauen Titer der positiven Seren können Tab. V und VI im tabellarischen Anhang entnommen werden. Einen Überblick über das Titerspektrum aller positiven Seren gibt Abb. 9. Bei einigen Tumorarten wich die Titerverteilung von der Gesamtpopulation der positiven Seren ab. So lag der Anteil niedrigtitriger Seren (Titer 1:500 u. 1:1000) bei den benignen Mammamischtumoren mit 40% über dem für alle positiven Seren ermittelten Wert (22%). Der höchste Anteil hochtitriger Seren (Titer 1:16000, 1:32000 u. 1:64000), der über dem Prozentsatz aller positiven Seren lag (29%), war mit je 50% bei dem malignen Lymphom und dem Plattenepithelkarzinom zu verzeichnen. Unter den Proben, die von Patienten mit einem malignen Lymphom stammten, befanden sich zudem keine niedrigtitrigen Seren. Das Serum, das bis zu einer Verdünnung von 1:64000 die mit Abstand höchsten mittleren Fluoreszenzintensitäten zeigte, stammte von einem Patienten, der an einem multiplen Myelom erkrankt war (Abb. 14). 4.2.2.4 Einfluss des Geschlechtes der Tumorpatienten auf den Autoantikörperbefund Die Verteilung der Geschlechter unter den Tumorpatienten mit positivem und negativem Autoantikörperbefund ist in Tab. 30 dargestellt. Bei einem statistischen Vergleich der positiven Befunde mit dem Chi2-Test konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen Geschlechtern festgestellt werden (p > 0,05). Bei den beiden positiven Tieren aus der gesunden Kontrollgruppe handelte es sich um männliche kastrierte Tiere. Tab. 30 Geschlechterverteilung der Patienten mit positivem und negativem Autoantikörperbefund nach Analyse von 314 Seren tumorerkrankter Hunde im intrazellulären Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) Anzahl untersuchter Anteil an Gesamt- Anzahl positiver Anteil positiver Tiere (n) population (%) Tiere (n) Tiere (%)1) M 153 48,7 28 18 K 14 4,5 1 7 W 127 40,5 18 14 S 20 6,3 2 10 Die Frequenz positiver Autoantikörperbefunde unterschied sich bei den einzelnen Geschlechtern nicht 1) signifikant (p > 0,05). Prozentualer Anteil positiver Tiere eines Geschlechtes. M: männlich, K: männlich kastriert, W: weiblich, S: weiblich kastriert. 92 Ergebnisse 4.2.2.5 Einfluss des Alters der Tumorpatienten auf den Autoantikörperbefund Die Tumorpatienten mit positivem Autoantikörperbefund (n = 49) waren im Median 8 Jahre (Min.: 1 Jahr, Max.: 14 Jahre) alt. Die Altersverteilung der Tumorpatienten mit positivem Autoantikörperbefund kann Tab. 31 entnommen werden. Bei einem statistischen Vergleich der positiven Befunde mit dem Chi2-Test kann kein signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen Altersgruppen festgestellt werden (p > 0,05). Die beiden positiven Tiere in der gesunden Kontrollgruppe hatten ein Alter von 11 und 3 Jahren. Tab. 31 Altersverteilung der Patienten mit positivem Autoantikörperbefund nach Analyse von 314 Seren tumorerkrankter Hunde im intrazellulären Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) Altersstufe (Jahre) Anzahl untersuchter Anzahl positiver Anteil positiver Tiere (n) Tiere (n) Tiere1)(%) 1-3 26 3 12 4-7 102 17 17 8-12 159 22 14 13-17 27 7 26 Die Frequenz positiver Autoantikörperbefunde unterschied sich bei den einzelnen Altersgruppen nicht 1) signifikant (p > 0,05). Prozentualer Anteil positiver Tiere je Altersstufe. Ergebnisse 93 4.2.2.6 Einfluss der Rassen der Tumorpatienten auf den Autoantikörperbefund Der Anteil positiver Befunde der anteilig stärksten Rassen unter den Tumorpatienten (n ≥ 6) ist in Tab. 32 dargestellt. Die höchste Inzidenz positiver Befunde waren beim Golden Retriever (33%), Münsterländer (29%), Westhighland White Terrier (25%), Schnauzer (25%), Dobermann (22%), Berner Sennenhund (22%) und Boxer (20%) anzutreffen. Bei einem statistischen Vergleich der einzelnen Rassen (n ≥10) mit dem Chi2-Test war die Inzidenz positiver Autoantikörperbefunde bei dem Golden Retriever signifikant größer als bei den Mischlingen (p = 0,0281). Zwischen den anderen Rassen bestand kein signifikanter Unterschied (p > 0,05). Die beiden positiven Tiere aus der Kontrollpopulation waren Mischlinge. Tab. 32 Rassenverteilung der Patienten mit positivem Autoantikörperbefund nach Analyse von 314 Seren tumorerkrankter Hunde im intrazellulären Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) unter Berücksichtigung der anteilig stärksten Rassen (n ≥ 6) Rasse Anzahl untersuchter positiv Anteil positiver Tiere (n) (n) Tiere1) (%) Golden Retriever 15 5 33 Münsterländer 7 2 29 Westhighland White Terrier 12 3 25 Schnauzer 8 2 25 Dobermann 9 2 22 Berner Sennenhund 23 5 22 Boxer 10 2 20 Rottweiler 11 2 18 Labrador Retriever 12 2 17 Pudel 7 1 14 Rauhaardackel 8 1 13 Mischling 72 8 11 Deutscher Schäferhund 21 2 10 Bei einem statistischen Vergleich der Inzidenz positiver Autoantikörperbefunde der einzelnen Rassen (n ≥ 10) mit dem Chi2-Test bestand nur zwischen dem Golden Retriever und den Mischlingen ein signifikanter 1) Unterschied (p = 0,0281). Prozentualer Anteil positiver Tiere aller untersuchten Patienten einer Rasse. 94 Ergebnisse 4.2.2.7 Zusammenstellung der Daten zu den Seren, die ausschließlich antinukleäre Antikörper enthielten Basierend auf den Ergebnissen aus dem FARA, befanden sich 7 ANA-positive Proben unter den 314 Seren tumorerkrankter Hunde (Tab. 21 b). Die zu diesen Tieren erhobenen Patientendaten können Tab. 33 entnommen werden. Die Inzidenz positiver ANA-Befunde betrug somit bezogen auf die Gesamtzahl der bei den einzelnen Tumoren untersuchten Seren 20% (kutanes Histiozytom), 13% (Plattenepithelkarzinom), 8% (Leukämie, die einzelnen Formen zusammengefasst) und 3% (malignes Lymphom). Tab. 33 Nr. Zusammenstellung der Daten zu den 7 Hunden, bei denen bei der Untersuchung von insgesamt 314 Seren tumorerkrankter Hunde im mikroskopischen (FARA) und durchflusszytometrischen (IIFD) Verfahren zum Nachweis autoreaktiver Antikörper antinukleäre Antikörper nachgewiesen wurden Rasse Alter1)/ Diagnose Geschlecht FARA- IIFD-Titer Titer 149 Mischling 10/M Plattenepithelkarzinom 1:16000 1:64000 227 Sheltie 8/W Plattenepithelkarzinom 1:1000 1:32000 17 Labrador Retriever 2/W kutanes Histiozytom 1:1000 1:1000 401 Rottweiler 3/W Megakaryozytenleukämie 1:8000 1:16000 407 Hovawart 10/M Basophilenleukämie 1:1000 1:8000 300 Golden Retriever 5/M Schilddrüsenkarzinom 1:1000 1:4000 380 Mischling 8/W Malignes Lymphom 1:100 negativ 1) in Jahren. Nr.: Serumnummer, M: männlich, W: weiblich. 4.2.2.8 Identifikation von Seren mit antinukleären Antikörpern mittels durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) Der IIFD ermöglicht im Gegensatz zum FARA keine Differenzierung zwischen kern-, zytoplasma- und gemischtpositiven Seren. In den FL1/SSC-Zweiparameterdarstellungen fiel jedoch eine zusätzliche Zellpopulation auf, die sich durch eine im Vergleich zur Hauptpopulation stärkere Fluoreszenzintensität (FL1) auszeichnete und sich in den Histogrammen durch eine Rechtsschiefe darstellte (Abb. 12). Dieses Phänomen konnte bei klassischen ANA-positiven Seren, nicht aber bei Seren beobachtet werden, die sich im FARA mit einer zytoplasmatischen oder gemischten Fluoreszenz darstellten. Jedoch nicht alle ANApositiven Seren der Tumorpatienten zeigten dieses Phänomen. So bestätigte sich die Rechtsschiefe bei 4 der 7 ANA-positiven Patientenseren. Die Verteilungsbreite (VB) – definiert als die relative Strecke zwischen Histogrammpeak und rechtsseitigem Histogrammende (Abb. 12) – war bei diesen 4 ANA-positiven Seren hoch-signifikant größer als bei den zytoplasma- bzw. gemischtpositiven Seren (p < 0,001) (Tab. 34). Ergebnisse VB R1 Ereignisse kernpositives Serum Seitwärtsstreulicht (SSC) 95 VB Ereignisse gemischtpositives Serum Seitwärtsstreulicht (SSC) Fluoreszenzintensität (FL1) Fluoreszenzintensität (FL1) Abb. 12 Zweiparameterdarstellung („Dot-Plot“) und Histogramm nach durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) von Seren caniner Tumorpatienten, die beim fluoreszenzserologischen mikroskopischen Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) eine nukleäre bzw. gemischte Fluoreszenz zeigten Die in der Region 1 befindliche Zellpopulation stellte sich im Histogramm durch eine Rechtsschiefe (Pfeil) dar. Diese konnte bei der durchflusszytometrischen Analyse von reinen ANA-positiven, nicht aber bei Seren beobachtet werden, die im FARA eine zytoplasmatische oder gemischte Fluoreszenz zeigten. Auf die Abbildung eines zytoplasmapositiven Serums wurde verzichtet, da sich diese wie gemischtpositive Seren darstellten. R1: Region 1, VB: Verteilungsbreite, FL1 Fluoreszenzintensität im Grünbereich (530 ± 15 nm). Tab. 34 Strecke zwischen Histogrammpeak und rechtsseitigem Histogrammende (VBWert) nach durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) von Seren (Verdünnung 1:500) caniner Tumorpatienten, die im mikroskopischen Verfahren (FARA) eine nukleäre, zytoplasmatische bzw. gemischte Fluoreszenz zeigten FARA-Ergebnis VB-Wert (MW ± s) ANA-positiv (n = 7) 4,95 ± 1,44 a ANA-positiv (n = 4)1) 5,94 ± 0,97 b zytoplasmapositiv (n = 7) 3,3 ± 0,8 c gemischtpositiv (n = 7) 3,5 ± 0,7 c Legende: s. nachfolgende Seite 96 Ergebnisse Eine Rechtsschiefe im Histogramm, die bei reinen ANA-positiven Seren, nicht aber bei zytoplasma- bzw. 1) gemischtpositiven Seren beobachtet werden konnte, wurde anhand der VB-Werte quantifiziert (Abb. 12). Bei 4 der insgesamt 7 ANA-positiven Seren konnte die Rechtsschiefe beobachtet werden. Bei einem statistischen Vergleich mit dem t-Test sind a (p < 0,05) und b (p < 0,001) signifikant größer als c. MW: Mittelwert, s: Standardabweichung, VB: Verteilungsbreite. 4.3 Differenzierung der Isotypen IgG und IgM in autoantikörperpositiven Seren Anteil aller positiven Seren (%) Wie Abb. 13 zu entnehmen ist, dominierten nach Einsatz isotypspezifischer Sekundärantikörper im IIFD (3.3.11.2) sowohl in den Seren der Tumorpatienten als auch in den Proben der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen Immunglobuline des Isotyps IgG. Nur in wenigen Seren konnten IgM-Autoantikörper nachgewiesen werden, die zudem bei den Tumorpatienten stets von Autoantikörpern des Isotyps IgG begleitet waren. Eines der Seren, das von einem Tumorpatienten stammte, ließ eine eindeutige Zuordnung nicht zu, da es bei Einsatz des FITC-Zg-α-Hd-IgG (H+L) bis zu einer Verdünnung von 1:32000 positiv reagierte, bei der Isotypbestimmung hingegen nur einen Titer von 1:500 (für IgG) aufwies. Die beiden positiven Seren aus der Kontrollgruppe enthielten Autoantikörper des Isotyps IgG. Die jeweiligen Titer können der Tab. V und VI im tabellarischen Anhang entnommen werden. 80 60 40 20 0 IgG Tumor Abb. 13 IgG+IgM IgM sonstige Erkrankungen Isotypverteilung der nach durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) autoantikörperpositiven Seren der Tumorpatienten (n = 49) und der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen (n = 8) Bei einem Serum, das von einem Tumorpatienten stammte, gelang die eindeutige Zuordnung nicht, da es bei Einsatz des FITC-konjugierten Ziege-anti-Hund-IgG (H+L) Sekundärantikörpers im IIFD bis zu einer Verdünnung von 1:32000 positiv reagierte, bei der Isotypbestimmung hingegen nur einen Titer von 1:500 (für IgG) aufwies. Ergebnisse 97 4.4 Intrazellulärer Immunfluoreszenztest (IIFD) mit caninen Tumorzellen als Substrat 4.4.1 Reaktivität caniner Seren mit allogenen Leukämie-Zellen Wie aus Tab. 35 ersichtlich, war bei dem Großteil der untersuchten Seren (3.3.11.3), die von Tumorpatienten, gesunden Kontrolltieren und der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen stammten, die Reaktivität unter Verwendung der humanen Antigenquelle und der neoplastisch transformierten allogenen Zellsubstrate (akute lymphatische, chronische lymphatische und undifferenzierte Leukämiezellen) vergleichbar, sofern sich die Beurteilung auf „positive Reaktion“ bzw. „keine Reaktion“ beschränkte. Die größte Übereinstimmung (94%) mit HEp-2-Zellen hinsichtlich des Reaktionsverhaltens der einzelnen Seren zeigten dabei chronische lymphatische Leukämie-Zellen. Tab. 35 Anteil übereinstimmender Autoantikörperbefunde bei Einsatz von HEp-2- und caninen Leukämiezellen als Antigensubstrat im intrazellulären Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) Vergleich Anzahl (n) und Anteil (%) der Anzahl aller 1) untersuchten Seren Seren mit übereinstimmenden (n) Ergebnissen2) HEp-2- mit CLL-Zellen 90 85 (94%)3) HEp-2- mit ALL-Zellen 58 49 (84%)4) HEp-2- mit UL-Zellen 48 41 (85%)5) Bei den 90 Seren, die mit CLL-Zellen inkubiert wurden, handelte es sich um 78 Seren tumorerkrankter Hunde, 10 Proben stammten von gesunden Kontrolltieren und zwei aus der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen. Seren, die mit ALL- bzw. UL-Zellen inkubiert wurden, bestanden aus einer Untergruppe der 1) 78 Seren tumorerkrankter Hunde. Angegeben ist die Anzahl der Seren, die unter Verwendung von HEp-2- und 2) den jeweiligen Leukämiezellen getestet wurden. Dargestellt sind die mit HEp-2- und den jeweiligen caninen 3) Leukämiezellen ermittelten übereinstimmenden Ergebnisse (positive/keine Reaktion). 64 der 85 Seren zeigten weder mit HEp-2- noch mit CLL-Zellen eine Reaktivität, 21 Seren reagierten mit beiden Zellarten positiv. 4) 37 der 49 Seren zeigten weder mit HEp-2- noch mit ALL-Zellen eine Reaktivität, 12 Seren reagierten mit 5) beiden Zellarten positiv. 26 der 41 Seren zeigten weder mit HEp-2- noch mit UL-Zellen eine Reaktivität, 15 Seren reagierten mit beiden Zellarten positiv. CLL: chronische lymphatische Leukämie, ALL: akute lymphatische Leukämie, UL: undifferenzierte Leukämie. 98 Ergebnisse Die Titer derjenigen Seren, die mit HEp-2-Zellen und dem jeweiligen caninen Zellsubstrat eine positive Reaktion ergaben, divergierten bei etwa der Hälfte der Seren, wobei er unter Einsatz der xenogenen Antigenquelle tendenziell höher lag. Nur wenige Seren (n = 6) ließen sich unter Verwendung von allogenen Antigenen weiter austitrieren als bei Einsatz des herkömmlichen Zellsubstrates. Die Relation der mittleren Fluoreszenzintensitäten einzelner Seren unter Einbeziehung der unterschiedlichen Zellsubstrate blieb dabei jedoch weitestgehend konstant. In Abb. 14 ist dies für das Serum Nr. 373, das unter Einsatz von HEp-2Zellen die mit Abstand stärkste mittlere Fluoreszenzintensität zeigte, und ein weiteres positives und negatives Serum exemplarisch dargestellt. ALL-Zellen CLL-Zellen UL-Zellen SSC Ereignisse HEp-2-Zellen Fluoreszenzintensität (FL1) negatives Serum (Nr. 276) Abb. 14 positives Serum (Nr. 82) positives Serum (Nr. 373) Vergleichende Darstellung der Histogramme eines autoantikörpernegativen und zweier -positiver caniner Seren unter Einsatz von HEp-2-, CLL-, ALL- und ULZellen als Substrate im intrazellulären Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) Die FL1/SSC-Zweiparameterdarstellungen geben die Reaktivität des Serums Nr.373, das von einem Patienten mit einem multiplen Myelom stammte, mit der jeweiligen Zellart wieder. CLL: chronische lymphatische Leukämie, ALL: akute lymphatische Leukämie, UL: undifferenzierte Leukämie, SSC: Seitwärtsstreulicht, FL1: Fluoreszenzintensität im Grünbereich (530 nm ± 15 nm). Ergebnisse 99 Die Reaktionsmuster derjenigen Seren, die bei der Inkubation mit den vier Zellsubstraten zu divergierenden Ergebnissen führten, sind in Tab. 36 dargestellt. Es konnten drei Seren identifiziert werden, die mit den caninen Zellen nicht reagierten, aber mit der xenogenen Antigenquelle eine positive Reaktion ergaben. Bei allen weiteren Seren konnte ein positiver Autoantikörperbefund nach Einsatz von HEp-2-Zellen nur mit einem Teil der allogenen Zellen reproduziert werden. Die größte Diversität bezüglich der Reaktionsmuster bestand zwischen HEp-2- und ALL-Zellen. Aus Tab. 36 geht überdies hervor, dass bei Betrachtung einzelner Tumoren die größte Diversität bei dem Plattenepithelkarzinom zu verzeichnen war. Drei von insgesamt neun untersuchten Seren zeigten ein von der jeweiligen Zellart abhängiges Reaktionsmuster. Tab. 36 Reaktionsmuster caniner Seren, die nach durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) mit HEp-2- und caninen Leukämiezellen als Substrat divergierende Autoantikörperbefunde ergaben HEp-2- CLL- ALL- UL- Anzahl Tumor Zellen Zellen Zellen - + + + 2 Mammmakarzinom, Mammaadenom - + + - 1 malignes Melanom + + - + 3 Leydigzelltumor, Plattenepithel- Zellen der Seren (n) karzinom, malignes Melanom + + + - 1 malignes Lymphom + + - - 2 Plattenepithelkarzinom, Adenom der Meibomschen Drüse + - + - 1 Lipom + - - - 1 Plattenepithelkarzinom CLL: chronische lymphatische Leukämie, ALL: akute lymphatische Leukämie, UL: undifferenzierte Leukämie. Unter den mit caninen Leukämiezellen inkubierten Seren befanden sich 8 Seren, die von Patienten mit unterschiedlichen Leukämieformen (akute lymphatische Leukämie, chronische lymphatische Leukämie, Erythroleukämie) stammten und mit HEp-2-Zellen keinen autoantikörperpositiven Befund ergaben. Keines der 8 Seren, worunter sich auch die Seren der ersten beiden Patienten befanden, ergab bei der Inkubation mit CLL-Zellen einen positiven Autoantikörperbefund. Vier der 8 Seren wurden außerdem mit ALL- bzw. UL-Zellen analysiert, wobei auch hier keine positive Reaktion zu verzeichnen war. 100 Ergebnisse 4.5 Spezifitäten der in caninen Seren nachgewiesenen Autoantikörper nach Immunoblot-Analysen mit HEp-2-Zellantigenen 4.5.1 Reaktivität caniner Seren mit HEp-2-Antigenen Autoantikörper, die in den Seren caniner Tumorpatienten (n = 41, Tab. 18), gesunder Kontrolltiere (n = 4) und in den Proben der Tiere mit sonstigen Erkrankungen (n = 6) im IIFD nachgewiesen wurden, erkannten bei eins bis fünf Banden pro Serum ein Antigenspektrum, das sowohl charakterisierte als auch nicht identifizierte HEp-2-Antigene von kommerziell erhältlichen Western-Blot-Streifen aus der Humandiagnostik umfasste (Tab. 37). Canine Seren zeigten eine Reaktivität mit sämtlichen identifizierten Kernantigenen, mit Ausnahme des Smith-Antigens B (Sm B), des Zentromerproteins CENP-C und der Ribonukleoproteine RNP und RNP-B. Die Reaktivität gegen SS-B beschränkte sich mit einer Ausnahme auf nur ein Antigen des Bandentriplets bei 47, 44 und 43 kDa. Aus Übersichtsgründen wurde von einer Differenzierung der einzelnen Antigene des Bandentriplets abgesehen. Es wurde von einer Spezifität für SS-B gesprochen, wenn mindestens eines der Antigene des Triplets erkannt wurde. Mit Ausnahme des ribosomalen P-Proteins und Jo-1 Antigens wurden alle charakterisierten zytoplasmatischen Antigene von caninen Autoantikörpern erkannt. Tab. 37 Nukleäre, zytoplasmatische und mitochondriale HEp-2-Antigene, die von caninen Autoantikörpern nach Einsatz in einem kommerziell erhältlichen Western-Blot-Testkit erkannt wurden a: identifizierte Antigene Molekular- Antigen gewicht Lokali- assoziierte Erkrankung1) sation 120 kDa CENP-C Kern limitierte Form der progressiven Systemsklerose 103 kDa PM-Scl Kern Überlappungssyndrom Polymyositis und Sklerodermie 100 kDa Scl-70 Kern progressive Systemsklerose 86 kDa Ku Kern Lupus erythematodes disseminatus 74 kDa M2 Zytoplasma primär biliäre Leberzirrhose 60 kDa SS-A Kern Sjøgren Syndrom, Lupus erythematodes disseminatus 55 kDa Jo-1 Zytoplasma Polymyositis 52 kDa SS-A Kern Sjøgren Syndrom, Lupus erythematodes disseminatus 47, 44, 43 kDa SS-B Kern Sjøgren Syndrom, Lupus erythematodes disseminatus 32 kDa RNP-A Kern Sharp-Syndrom, Lupus erythematodes dissemimatus 11 kDa Sm E/Sm F Kern Lupus erythematodes disseminatus Ergebnisse 101 b: nicht identifizierte Antigene Bandenlokalisation Bezeichnung2) > 120 kDa A120 > 74 < 88 kDa A 88/74 Bemerkung Bande liegt in der Mitte zwischen M2 (74 kDa) und CENP B (88 kDa) > 74 < 88 kDa M2’ Bande liegt unmittelbar „über“ M2 (74 kDa) > 72 < 74 kDa M2” Bande liegt unmittelbar „unter“ M2 (74 kDa) > 60 < 70 kDa SS-A’ Bande liegt unmittelbar „über“ SS-A (60 kDa) > 55 < 60 kDa A 60/55 > 52 < 55 kDa A 55/52 > 47 < 52 kDa A 52/47 > 38 < 43 kDa A 43/38a u. b A 43/38a liegt in der Mitte zwischen rib. P-Prot. (38 kDa) und SS-B (43 kDa), A 43/38b liegt unmittelbar „unter“ A 43/38a > 32 < 38 kDa A 38/32 > 11 < 12 A 12/11 Insgesamt wurden 41 Seren tumorerkrankter Hunde, 6 Seren aus der Vergleichsgruppe mit entzündlichen Erkrankungen und 4 Proben von gesunden Tieren untersucht. Bis auf wenige Ausnahmen zeigten die Seren nach 1) durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) eine positive Reaktion. NAKAMURA u. TAN (1986), REIMER 2) (1987), TAN (1989), FRITZLER (1993). Die aufgeführten Bezeichnungen wurden neu definiert und in allen nachfolgenden Untersuchungen eingehalten. 4.5.2 Vergleich von kern-, zytoplasma- und gemischtpositiven Seren caniner Tumorpatienten Drei von vier Seren, die nach Analyse im FARA ausschließlich antinukleäre Antikörper enthielten, zeigten eine Reaktivität mit Scl-70 (Tab. 38). Dieses Antigen wurde entweder allein oder in Kombination mit PM-Scl, A 38/32 oder A 12/11 erkannt und war auch bei gemischtpositiven Seren anzutreffen. Eine Reaktivität mit A 55/52 und A 43/38b war nur innerhalb der ANA-positiven Seren zu verzeichnen, dabei handelte es sich jedoch um Einzelfälle. Seren, die bei der Inkubation mit HEp-2-Zellen eine zytoplasmatische Fluoreszenz zeigten, erkannten bevorzugt M2, welches von kernpositiven und gemischtpositiven Seren nicht gebunden wurde, gefolgt von SS-A’, das bei den letztgenannten ebenfalls angetroffen wurde. Zytoplasmapositive Seren zeigten als einzige eine Reaktivität für M2”, M2’ und A 88/74. Dabei handelt es sich jedoch mit Ausnahme von M2’ um Einzelfälle. Von den identifizierten Kernantigenen bestand eine Spezifität für Ku, SS-A und SS-B. Die dominierenden, von gemischtpositiven Seren erkannten Antigene waren A 43/38a und SS-A, die in allen 4 Fällen in Kombination auftraten, SS-B und Ku. Die Antigene A 43/38a und SS-A wurden sowohl bei gemischt- als auch bei zytoplasmapositiven Seren nicht aber bei reinen ANA-positiven Seren angetroffen. Gemeinsam mit kernpositiven Seren wurde das 102 Ergebnisse Antigen A 38/32 und A 12/11 erkannt. In Abb. 15 (Streifen 4-6) sind die Antigenspektren eines kern-, zytoplasma- und gemischtpositiven Serums exemplarisch dargestellt. Tab. 38 Zielantigene autoreaktiver Antikörper aus Seren caniner Tumorpatienten, die im fluoreszenzserologischen mikroskopischen Nachweis autoreaktiver Antikörper (FARA) eine nukleäre, zytoplasmatische bzw. gemischte Fluoreszenz zeigten, nach Immunoblot-Analysen kernpositiv gemischtpositiv zytoplasmapositiv (n = 4) (n = 12) (n = 12) Scl-70 (3) SS-A (4) M2 (4) PM-Scl (1) SS-B (4) Ku (3) SS-B (1) Ku (3) SS-A (2) Scl-70 (2) SS-B (1) CENP-C (2) RNP-A (1) A 38/32 (2) A 43/38a (6) SS-A’ (3) A 55/52 (1) SS-A’ (2) A43/38a (2) A 43/38b (1) A 60/55 (2) M2’ (2) A 12/11 (1) A 38/32 (2) M2” (1) A 120 (1) A 88/74 (1) A 21/26 (1) A 12/11 (1) Zur Nomenklatur der nicht charakterisierten Antigene siehe Tab. 37 b. Die Zahlen in Klammern geben die Häufigkeit an, mit der das Antigen von den in den Seren enthaltenen Autoantikörpern pro Serumgruppe erkannt wurde. Die einzelnen Seren zeigten eine Reaktivität mit je ein bis fünf Antigenen. 4.5.3 Vergleich der Tumorpatienten mit den gesunden Kontrolltieren und der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen In Tab. 39 sind die Antigenspektren, die von den Seren der Tumorpatienten, der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen und den Seren der gesunden Kontrolltiere erkannt wurden, vergleichend dargestellt. Die Anzahl der erkannten Antigene variierte bei allen drei Untersuchungsgruppen zwischen ein und fünf pro Serum. Autoantikörper caniner Tumorpatienten (n = 41) zeigten eine bevorzugte Reaktivität mit SS-A’ (24%), A 43/38a (22%), SS-B (20%) und SS-A (15%). Diese Antigene wurden auch von Autoantikörpern, die innerhalb der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen vorgefunden wurden, erkannt. Hingegen konnte eine Reaktivität mit den Antigenen Ku (12%), Scl-70 (12%) und M2 (10%) nur innerhalb der Tumorgruppe beobachtet werden. Die jeweiligen Seren stammten von Tieren, die an folgenden Tumoren erkrankt waren (die mehrfach vertretenen Tumoren beziehen sich auf unterschiedliche Tiere): Ku: malignes Ergebnisse 103 Lymphom (n = 2), Plattenepithelkarzinom (n = 1) (Abb. 17 A, Streifen 9), chronische lymphatische Leukämie (n = 1), kutanes Histiozytom (n = 1); Scl-70: mal. Lymphom (n = 2), Plattenepithelkarzinom (n = 1) (Abb. 15, Streifen 4), Schilddrüsenkarzinom (n = 1), benigner Mammamischtumor (n = 1) (Abb. 17 A, Streifen 4 ); M2: malignes Lymphom (n = 1), chronische lymphatische Leukämie (n = 1), multiples Myelom (n = 1) (Abb. 15, Streifen 6), Synovialzelltumor (n = 1). In der Vergleichsgruppe mit entzündlichen Erkrankungen (n = 6) zeigten 80% der Seren eine Spezifität für M2” und 60% für M2’ und SS-A’ (Abb. 16, Streifen 1-4). Des Weiteren wurden SS-B, SS-A, A 88/74, A 55/52 und A 43/38a erkannt. All diese Antigene wurden auch bei den Tumorpatienten angetroffen. Hingegen konnte eine Reaktivität mit dem Antigen Sm E/ Sm F nur innerhalb der Kontrollpopulation mit sonstigen Erkrankungen verzeichnet werden (Abb. 16, Streifen 2). Die beiden Seren gesunder Tiere, die nach durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) autoantikörperpositiv waren, zeigten eine Spezifität für SS-A’, A 88/74, A 60/55 und 43/38a. Seren von zwei gesunden Tieren, die im IIFD negativ waren, zeigten keine Reaktivität mit den HEp-2-Antigenen. Im Kontrollansatz ohne Serumbeigabe konnten zwei Banden zwischen 38 und 32 kDa beobachtet werden, die auf einer unspezifischen Bindung des Sekundärantikörpers beruhten und daher bei allen Auswertungen unberücksichtigt blieben. 104 Ergebnisse Tab. 39 a: Antigenspektren, die von caninen Autoantikörpern nach Einsatz in einem kommerziell erhältlichen Western-Blot-Testkit aus der Humandiagnostik mit HEp-2-Vollantigenen erkannt wurden, differenziert nach Hunden mit Tumoren (a), mit sonstigen Erkrankungen und gesunden Tieren (b) Anteil der Seren tumorerkrankter Hunde2) (n = 41), die übereinstimmend bestimmte Antigene erkannten Anteil 1) Antigen 24 % 22% 20% 15% 12% 10% 7% 5% 2% (n =10) (n = 9) (n = 8) (n = 6) (n = 5) (n = 4) (n = 3) (n = 2) (n = 1) SS-A’ A43/38a SS-B SS-A Scl-70 M2 A60/55 A120 RNP-A Ku M2’ A55/52 A43/38b CENP-C A38/32 PM-Scl M2” A88/74 A52/47 A32/26 A12/11 b: Anteil der Seren aus der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen3) und gesunder Tiere, die übereinstimmend bestimmte Antigene erkannten Anteil 1) Antigen Vergleichsgruppe mit sonstigen Seren gesunder Tiere Erkrankungen (n = 6) (n=2) 80% 60% 40% 20% 50% (n = 4) (n = 3) (n = 2) (n = 1) (n = 1) M2” M2’ SS-B Sm E/ SS-A’ SS-A’ A55/52 Sm F A43/38a SS-A A60/55 A88/74 A88/74 A43/38a Die grau hinterlegten Antigene werden nur von Autoantikörpern der Tiere innerhalb einer Untersuchungs1) gruppe erkannt. Dargestellt ist derjenige Anteil aller untersuchten Seren innerhalb jeder Untersuchungsgruppe, deren Autoantikörper eine Reaktivität mit dem entsprechenden Antigen zeigten. Die Anzahl der 2) erkannten Antigene variierte zwischen ein und fünf pro Serum. Die einzelnen Tumoren können Tab. 18 3) entnommen werden. Bei den Tieren mit sonstigen Erkrankungen lagen ein entzündliches Geschehen (Panostitis, Enteritis, Endometritis, Abszess), eine Hyperplasie der Prostata und eine Epidermiszyste vor. Die Nomenklatur der nicht identifizierten Antigene kann Tab. 37 b entnommen werden. Ergebnisse 105 Scl-70/ PM-Scl M2 SSA SSB A 43/38 a Konjugat1) 1 Abb. 15 2 3 1: kernpos. Serum (Nr. 149) 2: gemischtpos. Serum (Nr. 310) 3: zytoplasmapos. Serum (Nr. 373) Immunoblot-Analysen unter Einsatz caniner Seren in einem kommerziell erhältlichen Western-Blot-Testkit aus der Humandiagnostik mit elektrophoretisch aufgetrennten HEp-2-Vollantigenen Die dargestellten Seren stammten von caninen Tumorpatienten und ergaben in der durchflusszytometrischen (IIFD) und der mikroskopischen Analyse (FARA) einen autoantikörperpositiven Befund. Die jeweiligen 1) Probennummern stehen in Klammern. Diese Banden beruhten auf einer unspezifischen Bindung des Sekundärantikörpers. 106 Ergebnisse M’/M’’ SSA’ SSB Konjugat 1 Abb. 16 2 3 4 1: Abszess (Nr. 277) 2: Enteristis (Nr. 201) 3: Epidermiszyste (Nr. 287) 4: Panostitis (Nr. 172) Immunoblot-Analysen unter Einsatz caniner Seren aus der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen in einem kommerziell erhältlichen Western-Blot-Testkit aus der Humandiagnostik mit elektrophoretisch aufgetrennten HEp-2-Vollantigenen Sämtliche hier dargestellten Seren (die Serumnummern stehen in Klammern) waren nach durchfluss1) zytometrischer Analyse (IIFD) autoantikörperpositiv. Diese Banden beruhten auf einer unspezifischen Bindung des Sekundärantikörpers. Ergebnisse 4.5.4 107 Vergleich der einzelnen Tumoren Im Hinblick auf die Korrelation bestimmter Tumorarten mit dem Auftreten spezifischer Autoantikörper wird nachfolgend auf übereinstimmende Antigene bzw. Antigenkombinationen und Besonderheiten innerhalb der jeweiligen Tumoren eingegangen. a) Benigner Mammamischtumor (n = 4) und Mammakarzinom (n = 2) Wie Abb. 17 A zu entnehmen ist, erkannten Autoantikörper, die bei drei der vier untersuchten Patienten mit einem benignen Mammamischtumor nachgewiesen wurden, die Antigenkombination SS-A’/A 43/38a (Streifen 3-5). Serum Nr. 344 enthielt zusätzlich Autoantikörper gegen CENP-C und Serum Nr. 82 gegen Scl-70 und SS-B. Das vierte Serum (Nr. 120) zeigte eine Reaktivität mit M2”. Die Antigenkombination SS-A’/A 43/38a wurde außerdem bei je einer Probe aus der gesunden Kontrollgruppe, der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen und bei einem Serum, das von einem Patienten mit Leydigzelltumor stammte, angetroffen. Die beiden Seren, die von Patienten mit einem Mammakarzinom stammten, zeigten keine Reaktion mit HEp-2-Antigenen (Abb. 17 A, Streifen 1 u. 2). Die beiden Seren wurden im FARA negativ beurteilt und waren nach durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) bei einem Titer von 1:500 und 1:2000 positiv. b) Leydigzell- (n = 3) und Sertolizelltumor (n = 1) Autoantikörper, die bei dem Patienten mit Sertoli- bzw. zwei Patienten mit Leydigzelltumor vorgefunden wurden, erkannten gemeinsam SS-A’ (Abb. 17 B, Streifen 1-3). Bei Serum Nr. 64 konnte außerdem eine Reaktivität mit M2”, A 60/55 und A 52/47 beobachtet werden (Abb. 17 B, Streifen 2). c) Malignes Lymphom (n = 13) Vier Seren zeigten keine Reaktivität mit HEp-2-Antigenen (Daten nicht gezeigt). Drei dieser Seren wiesen nach durchflusszytometrischer Analyse einen Titer von 1:2000, 1:8000 und 1:16000 auf, ein Serum war negativ. Alle vier Seren wurden im FARA positiv beurteilt. Bei fünf Seren bestand eine Spezifität entweder für Ku, M2 oder Scl-70 in Kombination mit oder ohne SS-A/SS-B. Autoantikörper weiterer Proben erkannten RNP-A, A32/36, A12/11 und M2’ (Daten nicht gezeigt). d) Plattenepithelkarzinom (n = 5) Wie aus Abb. 17 A ersichtlich, zeigte eines der fünf Seren, das im IIFD bei einem Titer von 1:4000 und im FARA bis zu einer Verdünnung von 1:100 positiv reagierte, keine Reaktion in den Immunoblot-Analysen (Streifen 7). Eines der Seren besaß eine Spezifität für Ku und CENP-C (Abb. 17 A, Streifen 9) und ein weiteres für PM-Scl und Scl (Abb. 15, Streifen 4). Die letzten beiden Seren (Abb. 15, Streifen 5 u. Abb. 17 A, Streifen 8) erkannten zu unterschiedlichen Anteilen SS-A, SS-B, A 60/55 und A 43/38a u. b. 108 Ergebnisse e) Chronische lymphatische Leukämie (n = 2) und akute lymphatische Leukämie (n = 1) Eines der beiden Seren, die Patienten mit einer chronischen lymphatischen Leukämie entnommen wurden, zeigte eine Reaktivät mit Ku, M2, SS-A und SS-A’, das zweite mit M2’. Die Autoantikörper des Patienten mit einer akuten lymphatischen Leukämie erkannten SS-A’, A120 und A43/38a (Daten nicht gezeigt). f) Kutanes Histiozytom (n = 2) Bei einem Serum, das im IIFD und FARA jeweils einen Titer von 1:1000 hatte, konnte in der Immunoblot-Analyse keine Reaktion beobachtet werden. Die Autoantikörper des zweiten Patienten erkannten das Antigen Ku (Abb. 17 B, Streifen 4 u. 5). g) Sonstige Tumoren (n = 7) Bei den Patienten mit sonstigen Tumoren zeigte das Serum Nr. 373, das von einem Tier mit einem multiplen Myelom stammte (vgl. Abb. 14), die mit Abstand deutlichste Bande bei M2 (Abb. 15, Streifen 6). Ein Serum, das einem Patienten mit Schilddrüsenkarzinom entnommen wurde, besaß eine Spezifität für Scl-70, die Autoantikörper der restlichen Tumorpatienten erkannten die Antigene SS-B, SS-A’, A120, A66/55, A43/38a, A32/26 und A12/11 (Daten nicht gezeigt). A) CENPC Scl-70 M2’’ Ku SSA’ A 43/38 a u. b Konjugat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1-2: Mammakarzinom 3-6: benigner Mammamischtumor 7-9: Plattenepithelkarzinom (Nr. 345 u. 367) (Nr. 344, 82, T10 u. 120) (Nr. 191, 227 u. 152) Legende: s. nachfolgende Seite Ergebnisse 109 B) Ku M2’’ SSA’ A 60/55 A 52/47 Konjugat 1 2 3 1: Leydigzelltumor (Nr. 49) 2: Leydigzelltumor (Nr. 64) 3: Sertolizelltumor (Nr. 299) 4 5 4: kutanes Histiozytom (Nr. 17) 5: kutanes Histiozytom (Nr. 205) Abb. 17 A u. B Immunoblot-Analysen unter Einsatz von Seren caniner Tumorpatienten in einem kommerziell erhältlichen Western-Blot-Testkit aus der Humandiagnostik mit elektrophoretisch aufgetrennten HEp-2-Vollantigenen Sämtliche hier dargestellten Seren (die Serumnummern stehen in Klammern) waren nach durchflusszyto1) metrischer Analyse (IIFD) autoantikörperpositiv. Diese Banden beruhten auf einer unspezifischen Bindung des Sekundärantikörpers. 110 Ergebnisse 4.6 Funktionsanalysen zur pathophysiologischen Bedeutung der in caninen Seren nachgewiesenen Autoantikörper 4.6.1 Prüfung auf einen zytotoxischen Effekt Bei einem (14%) der insgesamt 7 untersuchten autoantikörpernegativen Seren aus der gesunden Kontrollgruppe und 14 (67%) von insgesamt 21 eingesetzten Patientenseren, die sich im IIFD positiv darstellten, konnte ein zytotoxischer Effekt auf Kulturzellen (HEp-2, DH82) und/oder canine mononukleäre Zellen beobachtet werden. Dieser zytotoxische Effekt beruhte bei caninen mononukleären Zellen auf deren Lyse, da nach Versuchsende weniger vitale Zellen vorhanden waren als eingesetzt wurden (Daten nicht gezeigt). In den Ansätzen mit den Kulturzelllinien konnte anhand der absoluten Zellzahlen (Daten nicht gezeigt) eine im Vergleich zur Mediumkontrolle lediglich verminderte Zellproliferation abgelesen werden. Dies traf allerdings für den Ansatz mit Serum Nr. 279 (Abb. 18) nicht zu, da sich in diesem nach Beendigung der Inkubationsphase weniger Zellen als ursprünglich eingesetzt befanden. Wie der Abb. 18 zu entnehmen ist, übten die zytotoxischen Seren – mit Ausnahme des Serums Nr. 279 – den Effekt selektiv auf einzelne Zellarten aus, wobei die jeweils betroffenen Zelltypen in den einzelnen Ansätzen divergierten. Die Mehrheit der untersuchten Seren beeinflusste die Vitalität von nur einer Zellart (Serum Nr. 373, 402, 66, 310, 1, 122, 152, 49 u. 407). Die restlichen Seren induzierten mit Ausnahme des Serums Nr. 279 und mit Ausnahme des Serums, das von dem gesunden Tier stammte (Nr. 12g), bei je zwei Zelltypen einen zytotoxischen Effekt. Am empfänglichsten für einen zytotoxischen Effekt erwiesen sich die mononukleären Zellen: im Vergleich mit den beiden Kulturzelllinien erschien der zytotoxische Effekt bei den ex vivo Zellen deutlicher ausgeprägt. Anteil vitaler Zellen (%) (Mediumkontrolle =100%) Ergebnisse 111 150 150 125 125 100 100 75 75 50 50 25 25 0 Nr. 373 Nr. 402 Nr. 66 Nr. 310 0 125 125 100 100 75 75 50 50 25 25 0 Abb. 18 Nr. 407 Nr. 195 Nr. 174 Nr. 149 0 Nr. 1 Nr. 122 Nr. 152 Nr. 193 Nr. 279 Nr. 12g HEp-2-Zellen MNC 1 unstim. MNC 2 unstim. DH82-Zellen MNC 1 stim. MNC 2 stim. Nr. 49 Prozentualer Anteil vitaler Zellen in Bezug zu einem Kontrollansatz ohne Serumzugabe (=100%) nach 72- (HEp-2 u. DH82) bzw. 48-stündiger (MNC) Inkubation mit caninen Seren Insgesamt gingen 7 Proben gesunder Hunde, die nach durchflusszytometrischer Analyse (IIFD) autoantikörpernegativ waren und 21 Seren von Tumorpatienten, die sich im IIFD positiv verhielten, in die Untersuchungen ein. Dargestellt sind nur diejenigen Seren, bei denen ein zytotoxischer Effekt zu beobachten war (die aufgeführten Nummern geben die jeweiligen Serumnummern an, das mit g gekennzeichnete Serum stammte von einem gesunden Tier). Dargestellt sind nur die Ergebnisse bei Einsatz der unverdünnten Seren, da in den höheren Verdünnungen keine Beeinflussung der Zellvitalität zu beobachten war. DH82: Progenitorzellen aus dem Knochenmark eines an maligner Histiozytose erkrankten Hundes (Zelllinie), MNC 1: mononukleäre Zellen von Tier 1: drei Jahre alte Beagle Hündin, MNC 2: mononukleäre Zellen von Tier 2: männliches Wurfgeschwister von Tier 1, unstim.: unstimulierter Ansatz, stim.: Mitogenstimulierter Ansatz. 112 4.6.2 Ergebnisse Prüfung auf antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität Wie aus Tab. 40 ersichtlich, war weder bei einem Effektor-Targetzellzahlverhältnis von 1:1 bzw. 10:1 noch bei den Vergleichsansätzen ohne canine neutrophile Granulozyten (3.3.14.2) ein zytotoxischer Effekt zu beobachten. Tab. 40 Prozentualer Anteil vitaler Zellen in Bezug zu einem Kontrollansatz ohne Serum und Effektorzellen (=100%) als Maß für den zytotoxischen Effekt caniner Seren auf HEp-2-Zellen (Targetzelle) nach Zugabe von Effektorzellen (canine neutrophile Granulozyten) Serum-Nr. 12g 195 373 310 ohne Effektorzellen 84 96 91 110 E:T = 1:1 99 118 131 145 E:T = 10:1 155 161 136 152 Das mit g gekennzeichnete Serum stammte von einem gesunden Tier, die anderen Seren wurden caninen Tumorpatienten entnommen. Die aufgeführten Seren übten in vorherigen Untersuchungen einen zytotoxischen Effekt auf HEp-2-Zellen aus (Abb. 18). Dargestellt sind die Ansätze mit unverdünntem Serum, da ein zytotoxischer Effekt bei Einsatz des verdünnten Serums ebenso ausblieb. Bei einem Kontrollansatz mit Effektorzellen und ohne Serum betrug der Anteil vitaler Zellen in Bezug zu dem Kontrollansatz ohne Serum und Effektorzellen 116%. E:T: Effektor-Targetzellverhältnis, Nr. Nummer. 4.6.3 Prüfung auf einen zytotoxischen Effekt mit aufgereinigten Immunglobulin G-Fraktionen Die IgG-Fraktion (vor Ultrafiltration, 3.3.17) eines autoantikörpernegativen Serums von einem Tumorpatienten (auf den Einsatz eines autoantikörperpositiven Serums wurde aufgrund der begrenzten Serummenge verzichtet) wurde in einer SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen (3.3.16) auf das Vorhandensein von schweren und leichten Ketten und vollständigen IgG-Molekülen überprüft. Wie aus Abb. 19 ersichtlich, wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen eine Proteinbande von 180 kDa, die höchstwahrscheinlich IgG darstellt, und unter reduzierenden Bedingungen je eine Bande bei etwa 56 kDa und 34 kDa nachgewiesen. Letztere repräsentieren mit hoher Wahrscheinlichkeit die schweren und leichten Ketten der IgG-Moleküle. Anhand des BCA-Assay zeigte sich, dass die Proteinkonzentration nach der IgG-Aufreinigung im Eluat (400 µl) vor Ultrafiltration (3.3.17) 285 µg/ml betrug. Somit befanden sich in einem Volumen von 400 µl 114 µg Protein. Die Proteinkonzentration im ultrafiltrierten Eluat (15 µl) betrug rein rechnerisch 7850 µg/ml (117 µg/15 µl). Die Ausbeute bei der Ultrafiltration konnte demnach mit 100% veranschlagt werden Ergebnisse 113 kDa 200 IgG (180 kDa) 116 97 66 55 schwere Kette 37 31 leichte Kette 1 Abb. 19 1: Marker 2: vollständiges Serum 3: Eluat nicht red. 4: Eluat red. 2 3 4 SDS-PAGE nach IgG-Aufreinigung eines autoantikörpernegativen Serums eines caninen Tumorpatienten Das komplette Serum (Spur 2, nicht-reduzierende Bedingungen) und eine aufgereinigte IgG-Präparation („Eluat“, Spur 3: nicht-reduzierende Bedingungen, Spur 4: reduzierende Bedingungen) wurden in der SDSPAGE aufgetrennt und das Gel nach Beendigung des Gellaufes mit Commassie-Brilliant-Blau gefärbt. nicht red.: unter nicht reduzierenden Bedingungen, red.: unter reduzierenden Bedingungen. Anteil vitaler Zellen (%) (Mediumkontrolle =100%) HEp-2-Zellen MNC Tier 21) unstimuliert2) MNC Tier 2 stimuliert3) 150 150 150 125 125 125 100 100 100 75 75 75 50 50 50 25 25 25 0 0 0 279 12g 402 195 149 195 komplettes Serum Abb. 20 193 12g 149 195 193 12g IgG-Fraktion Anteil vitaler Zellen in Bezug zu einem Kontrollansatz ohne Serumzugabe (=100%) als Maß für den zytotoxischen Effekt aufkonzentrierter IgG-Fraktionen und der jeweiligen kompletten Seren auf HEp-2-Zellen bzw. canine MNC nach 72- bzw. 48-stündiger Inkubation Die dargestellten Zahlen geben die jeweiligen Serumnummern an, das mit g gekennzeichnete Serum stammte 1) von einem gesunden Tier. Mononukleäre Zellen (MNC) von Tier 2: männlich kastrierter drei Jahre alter 2) 3) Beagle. Ansatz ohne Zugabe von Mitogen Ansatz mit Zugabe von Mitogen. MNC: mononukleäre Zellen. 114 5 Diskussion Diskussion In der vorliegenden Promotionsarbeit galt es zu prüfen, in welchem Umfang canine Tumorpatienten Autoantikörper entwickeln und ob ein differenzierter Autoantikörpernachweis beim Hund eine diagnostische Relevanz besitzt. 5.1 Methodische Ansätze Im Mittelpunkt der Betrachtungen standen zunächst antinukleäre Antikörper, die beim Menschen die Mehrheit der bei Tumorerkrankungen nachgewiesen Autoantikörper darstellen (IMAI et al. 1992, SWISSA et al. 1992, ABU-SHAKRA et al. 2001) und bezüglich der systemischen Autoimmunerkrankungen Parallelen bei Mensch und Hund aufweisen (MONIER et al. 1980, COSTA et al. 1984, TOTH u. REBAR 1987). Der FARA (3.3.10) gilt als anerkanntes Standardverfahren zum Nachweis antinukleärer Antikörper (KOZEN et al. 1980, MOLDEN et al. 1984) und wurde aufgrund dieser Tatsache zur Analyse der vorliegenden Patientenseren eingesetzt. Wie sich anhand der Doppelblindstudien zeigte (Tab. 22), musste der FARA für die Beurteilung von nicht klassischen ANA-positiven Seren, die die Mehrzahl der positiven Seren darstellten, als bedingt geeignet angesehen werden. Der Hauptkritikpunkt bestand in der mangelnden Objektivität, die sich aus der differierenden Beurteilung der Fluoreszenzintensität und –lokalisation in Abhängigkeit von dem Untersucher ergab. Das Problem der Standardisierung der optischen Auswertung ist in der Literatur weit bekannt (BONIFACIO et al. 1986, McVEY u. SHUMAN 1991, TAN et al. 1997) und spiegelt sich auch darin wider, dass die Angaben über den „cut-off“-Titer in den einzelnen Laboratorien mit Angaben zwischen 1:25, 1:40, 1:80 und 1:160 deutlich differieren (IMAI et al. 1992, CASIANO et al. 1995, HANSSON et al. 1996, COVINI et al. 1997). BONIFACIO et al. (1986) konnten in einer Studie, die in den USA durchgeführt wurde, zeigen, dass die Beurteilung eines ANApositiven Serums in unterschiedlichen Diagnostiklaboren zu erstaunlich differierenden Titerangaben führte. Sie empfahlen daher ein Beurteilungssystem, das die Seren bei einer vorgegebenen Verdünnung lediglich in negativ, schwach- bzw. stark-positiv einteilt. MOLDEN et al. (1984) schlugen vor, die Beurteilung der Fluoreszenzen anhand von Referenzseren mit bekannter Intensität zu standardisieren. Damit konnte in den vorliegenden Untersuchungen jedoch keine Abhilfe verschaffen werden, da positive Referenzseren für nukleäre nicht aber für gemischte oder zytoplasmatische Fluoreszenzen vorlagen. NAKABAYASHI et al. (2001) evaluierten einen „Automatic Fluorescent Image Analyzer“, der eine individuelle optische Auswertung überflüssig macht, und konnten damit die personenbezogenen Unterschiede im Vergleich zur klassischen Methode deutlich reduzieren. Die schlechte Reproduzierbarkeit des FARA in den vorliegenden Untersuchungen (Tab. 22) ist primär auf die mangelnde Objektivierbarkeit zurückzuführen. Zum anderen ist sie mit großer Wahrscheinlichkeit technischer Natur. So unterschied sich die Qualität der eingesetzten Objektträger, bei denen es sich aus Kostengründen nicht um kommerziell erhältliche Diskussion 115 handelte, zum Teil erheblich. Ein möglicher Einflussfaktor war zudem in der Handhabung der Objektträger während der Versuchsdurchführung zu sehen, bei der ein Austrocknen peinlichst vermieden werden musste. Das Phänomen, dass sowohl in Abhängigkeit von der Verdünnung als auch innerhalb eines Probenauftrages die Lokalisation der Fluoreszenz variierte, wird durch Angaben in der Literatur bestätigt (THOMAS et al. 1983, ARMAS et al. 2000). Ersteres war höchstwahrscheinlich auf eine unterschiedliche Konzentration der einzelnen Autoantikörperfraktionen in den polyvalenten Seren zurückzuführen. Die Konzentration einzelner Immunglobuline reichte in höheren Verdünnungen somit nicht mehr für ein sichtbares Fluoreszenzsignal aus, während andere Antikörperfraktionen noch in ausreichender Menge zur Verfügung standen. Die mangelnde Objektivierbarkeit und schlechte Reproduzierbarkeit des FARA bei der Beurteilung von Seren mit niedrigem Titer, die bei der Inkubation mit HEp-2-Zellen keine klassische nukleäre Fluoreszenz zeigten, und die Tatsache, dass bei etwa 80% der positiv beurteilten Seren genau dieses zutraf, waren ausschlaggebend für die Entwicklung eines alternativen Testverfahrens. Mit dessen Hilfe sollten die Ergebnisse des FARA reevaluiert werden. Das in dieser Arbeit vorgestellte durchflusszytometrische Testverfahren stellt eine übliche Methode zum Nachweis intrazellulärer Antigene dar und eignet sich nach den vorliegenden Untersuchungen ebenso zum Nachweis autoreaktiver Antikörper, die ihrerseits gegen intrazelluläre Strukturen gerichtet sind. Die durchflusszytometrische Methode erlaubte, nach entsprechender Modifikation, anhand der mittleren Fluoreszenzintensitäten (FL1) eine deutliche Diskriminierung zuvor autoantikörperpositiv und -negativ bewerteter Seren (Abb. 6 u. Tab. 24). Der wesentliche Vorteil gegenüber dem herkömmlichen Verfahren bestand in der besseren Objektivierbarkeit der durchflusszytometrischen Analyse, was zudem in einer besseren Reproduzierbarkeit der Ergebnisse resultierte. Die Erfassung der Fluoreszenzintensität blieb aufgrund der Automatisierung unberührt von jeder subjektiven Einschätzung und persönlichen Erfahrung des Untersuchers und war somit – vorausgesetzt sie erfolgte stets unter denselben Geräteeinstellungen – standardisierbar, was eingeschränkt auch bei unterschiedlichen Laboratorien Gültigkeit hat. Zudem bot die durchflusszytometrische Untersuchung hinsichtlich der quantitativen Analyse einen im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren sehr viel größeren Informationsgehalt, da für jedes Serum ein Datensatz zur Verfügung stand, der für statistische und graphische Auswertungen herangezogen werden konnte. Reproduzierbare Ergebnisse waren jedoch nur zu erwarten, wenn auch die Testdurchführung an sich unter konstanten Bedingungen erfolgte. Die Tatsache, dass die eingesetzte Anzahl an HEp-2-Zellen und das mit einer konstanten Zellzahl inkubierte Serumvolumen direkten Einfluss auf die Stärke des Fluoreszenzsignales hatten (Abb. 7), ist darauf zurückzuführen, dass es sich bei den eingesetzten Serumverdünnungen um ungesättigte Autoantikörperlösungen handelte. Die absolute Menge eingesetzter Autoantikörper sowie deren Verteilungsvolumen 116 Diskussion beeinflussten somit unmittelbar die Intensität der Fluoreszenz. Dass es offensichtlich nicht vollständig gelang, insbesondere den letztgenannten Parameter in den jeweiligen Versuchsansätzen konstant zu halten, ist an dem Variationskoeffizenten für die Interassay Varianz, der mit 16% deutlich über dem für die Intraassay Varianz ermittelten Wert lag (8%), abzulesen. Unter der Prämisse, dass die Auswertung der Fluoreszenzintensität standardisiert und Zellzusammensetzung und eingesetzte Zellzahl in dem 7fach-Ansatz zur Ermittlung der Intraassay Varianz weitestgehend konstant gehalten wurden, war die Differenz von 8% mit hoher Wahrscheinlichkeit auf eine variable Zellzahl und Zellzusammensetzung an den jeweiligen Versuchstagen zur Bestimmung der Interassay Varianz zurückzuführen. Bei den eingesetzten HEp-2-Zellen handelte es sich um permanent wachsende, nicht synchronisierte Kulturzellen, womit nahe liegt, dass der Anteil der in einem definierten Zellzyklusstadium befindlichen Zellen im Moment der jeweiligen Ernte variierte. Auch muss die Ungenauigkeit der visuellen Zellzählung in der Bürker Kammer berücksichtigt werden. Ein Variationskoeffizent von 16% bedeutet in der praktischen Umsetzung jedoch lediglich, dass der Titer eines Serums bei wiederholter Untersuchung um maximal eine Stufe differieren kann und ist daher als akzeptabel anzusehen. Der Nachteil der durchflusszytometrischen Methode bestand darin, dass sie im Gegensatz zum herkömmlichen Testverfahren keine Aussagen über die Fluoreszenzlokalisation erlaubte. Aufgrund der Tatsache, dass ausschließlich bei 57% aller untersuchten kernpositiven Seren eine Rechtsschiefe im Histogramm zu beobachten war, traf dieser Mangel jedoch nur eingeschränkt zu. Die biologische Grundlage dieses Phänomens war mit großer Wahrscheinlichkeit auf die Markierung von zellzyklusabhängig exprimierten Kernantigenen, wie DNA-assoziierte Proteine oder beispielsweise das „proliferating cell nuclear antigen“ (CELIS et al. 1986, TAKEUCHI et al. 1996) oder das Zentromerprotein p330d (CASIANO et al. 1993 u. 1995, RATTNER et al. 1993) zurückzuführen. Eine Differenzierung von zytoplasma- und gemischtpositiven Seren war mit Hilfe des IIFD nicht möglich. Allerdings erschien auch in der herkömmlichen Methode die Einordnung dieser Seren problematisch (4.1.1). Die durchflusszytometrische Methode ermöglicht in der Summe eine objektive und gut reproduzierbare Erfassung der Fluoreszenzintensität und ist im Sinne der quantitativen Analyse dem FARA überlegen. Sie besitzt bezüglich der qualitativen Auswertung aber nur eine eingeschränkte Aussagekraft. Wird der IIFD als initiales Screeningverfahren eingesetzt, so sollten Proben, die sich als autoantikörperpositiv erweisen, anhand der VB-Werte der Fluoreszenzhistogramme aber nicht als „ANA-positiv“ zu identifizierten sind, mit Hilfe der herkömmlichen Methode hinsichtlich der Fluoreszenzlokalisation überprüft werden. In der vorliegenden Arbeit wurde im Rahmen der Methodenetablierung in umgekehrter Reihenfolge vorgegangen und die Ergebnisse des FARA mit Hilfe des IIFD reevaluiert. Bei einer durchflusszytometrischen quantitativen Reevaluierung der Ergebnisse aus dem FARA divergierten im niedrigtitrigen Bereich die in den beiden Testverfahren ermittelten Ergebnisse deutlich. Somit deutet sich an, dass der FARA bei einer Serumverdünnung von 1:100 zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann (Tab. 28). Diese Hypothese begründet sich Diskussion 117 zum einen in der bereits geschilderten Subjektivität des Testverfahrens, zum anderen in der Tatsache, dass die Inzidenz schwach-positiver Testergebnisse bei der gesunden Kontrollgruppe mit 28% wider Erwarten hoch war. Die der Literatur zu entnehmenden Angaben über die Inzidenz antinukleärer Antikörper nach Analyse gesunder Kontrolltiere im FARA variiert je nach Publikation zwischen 0% und 5% (WHITE et al. 1992, BELL et al. 1997, HANSSON u. KARLSSON-PARRA 1999). Wobei der „cut-off“-Titer üblicherweise so definiert wird, dass für gesunde Kontrolltiere genau diese erreicht werden. In einer Studie aus der Humanmedizin konnten ARMAS et al. (2000) nur bei zwei Individuen einer aus 145 gesunden Blutspendern bestehenden Kontrollgruppe, die auf das Vorhandensein von antizytoplasmatischen und antinukleären Antikörpern untersucht wurde, antinukleäre Antikörper nachweisen. Aufgrund dieser Daten liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei den Fluoreszenzen, die in der vorliegenden Arbeit zu einer positiven Beurteilung im niedrig-titrigen Bereich führten, zum großen Teil um unspezifische Hintergrundfluoreszenzen handelte. Dass der FARA insbesondere bei der Beurteilung schwachpositiver Seren zu kontroversen Ergebnissen führt, kam auch in der von McVEY u. SHUMAN (1991) publizierten Studie, nach der bei Mehrfachuntersuchungen eines schwachpositiven caninen Serums ein Variationskoeffizent von 72% zu verzeichnen war, zum Ausdruck. Dies legt nahe, dass einige Autoren von vornherein mit höheren Serumverdünnungen arbeiten bzw. positiv beurteilte Seren grundsätzlich mit einem zweiten Testverfahren wie einem Immunoblot oder einer Doppelimmundiffusion nach Outherlony überprüfen, was in der klinischen Diagnostik von antinukleären Antikörpern beim Menschen üblich ist (SCHLUMBERGER et al. 1995, COVINI et al. 1997, ARMAS et al. 2000). Die höheren Titer bei der durchflusszytometrischen Methode erklären sich durch das empfindliche Detektionssystems einer durchflusszytometrischen Analyse an sich, ein gleichzeitig differenzierterer Titer ist mit einiger Wahrscheinlichkeit auf die unterschiedliche Fixation des Zellsubstrates und den Einsatz verschiedener Sekundärantikörper in den beiden Testverfahren zurückzuführen (Abb. 10). Es wurde vielfach beschrieben, dass in Abhängigkeit von der Fixationsmethode Antigene zerstört oder schlichtweg herausgewaschen werden. Davon sind insbesondere solche betroffen, die nicht mit Histonen assoziiert sind, wie sn-RNP oder SS-A/Ro (TAN 1982, HARMON et al. 1984, BYLUND u. NAKAMURA 1991). THOMAS et al. (1983) postulierten, dass insbesondere der Einsatz von Methanol während der Fixation zu einem massiven Antigenverlust führt. Dies lässt den Schluss zu, dass die Konzentration intakter Antigene nach einer Paraformaldehydfixation vergleichsweise höher einzuschätzen ist als bei Methanol-fixierten Zellen. Dies würde einerseits die höheren als auch differenzierteren Titer im IIFD erklären. Letzteres unter der Prämisse, dass die einzelnen Autoantikörperpopulationen in den polyvalenten Seren in unterschiedlichen Konzentrationen vorlagen. GROSSJUNG (1996) konnte zeigen, dass der im FARA eingesetzte Sekundärantikörper, der aus dem Kaninchen stammte, für bestimmte Isotypen (IgG1/3 u. IgM) eine eher schwache Affinität besitzt. Die Hypothese, dass diese Isotypen einzeln oder in Kombination mit anderen unter den Autoantikörpern vertreten waren, erklärt ebenso die höheren und differenzierteren Titer in der durchflusszytometrischen Methode im Vergleich zum FARA. 118 Diskussion Beim Einsatz allogener Zellsubstrate im IIFD zeigte sich, dass autoreaktive Antikörper, die in den Seren caniner Tumorpatienten angetroffen werden, vornehmlich speziesübergreifende Strukturen erkennen (Tab. 35), was den Einsatz der HEp-2-Zelle als xenogene Antigenquelle rechtfertigen würde. Bei drei Seren hatte dies jedoch nur eine eingeschränkte Gültigkeit, da sie mit den caninen Zellsubstraten, nicht aber mit HEp-2-Zellen eine positive Reaktion ergaben (Tab. 36). Dies kann als Hinweis gewertet werden, dass die Autoantikörper in diesen Seren tatsächlich speziesspezifische Antigene erkennen und würde im Kontrast zu den Beobachtungen von GROSSJUNG (1996) stehen, wonach in vergleichenden Analysen unter Einbezug der HEp-2- und einer caninen Zelllinie (MDCK, Madin-Darby Canine Kidney) keines der ANA-positiven Seren präferentiell mit dem allogenen Zellsubstrat reagierte. Es ist jedoch ebenso vorstellbar, dass die drei Seren eine Spezifität für Antigene besitzen, deren Expressionsdichte in HEp-2-Zellen sehr gering ist, wie für das SS-A/Ro-Antigen bekannt (HENDRICK et al. 1981, HARMON et al. 1984, BYLUND u. NAKAMURA 1991). Demzufolge würde das Reaktionsmuster der drei Seren nicht auf spezies- sondern auf gewebespezifische Antigene zurückzuführen sein. Des Weiteren ist bekannt, dass Zellen abhängig von der Fixation mit unterschiedlich starkem oder selektivem Antigenverlust reagieren (NAKAMURA u. RIPPEY 1985, GROSSJUNG 1996), so dass das unterschiedliche Reaktionsverhalten nicht in jedem Fall Expressionsdifferenzen widerspiegelt, sondern im Einzelfall auch rein technisch bedingt sein kann. Die Frage, ob canine Autoantikörper gewebespezifische Antigene erkennen, kann eindeutig bejaht werden. Etwa 15% der untersuchten Seren zeigten mit HEp-2-Zellen eine Reaktion, die sich nur mit einem Teil der caninen Zellen reproduzieren ließen. Dies legt die Vermutung nahe, dass bestimmte Antigene von bestimmten caninen Zellen nicht exprimiert werden oder aber die Expressionsdichte sehr gering ist (s.o.). Ein selektiver Einfluss der Fixation ist hier ebenfalls denkbar. Zudem gilt es zu bedenken, dass es sich bei der HEp-2-Zelle um eine schnell proliferierende Kulturzelle epithelialen und bei den caninen um ex vivo Zellen lymphoiden Ursprungs handelt. Das ist insofern von Interesse, als bestimmte Zellorganellen wie Nucleoli oder Kinetochore in proliferierenden Zellen größer sind als in ausdifferenzierten Zellen, und demzufolge bestimme Antigene in höherer Konzentration vorliegen. Dies würde zudem eine Erklärung dafür liefern, dass die Titer unter Verwendung von HEp-2-Zellen tendenziell höher lagen als bei Einsatz der allogenen Zellsubstrate. Somit ist festzuhalten, dass bei Einsatz der HEp-2-Zelle zu einem geringen Prozentsatz mit falsch-negativen Ergebnissen gerechnet werden muss, was möglicherweise auf ihren humanen Ursprung zurückzuführen ist. Im Bezug auf gewebespezifische Antigene scheint sie jedoch die „Obermenge“ aller von caninen Zellen exprimierten Antigene darzustellen, was deren Einsatz als Zellsubstrat zum Nachweis caniner autoreaktiver Antikörper rechtfertigt. Diskussion 119 5.2 Inzidenz und Charakteristika autoreaktiver Antikörper bei den Tumorerkrankungen des Hundes Seren, die ausschließlich antinukleäre Antikörper enthielten, waren nach den vorliegenden Untersuchungen in einer repräsentativen Gesamtpopulation caniner Tumorpatienten mit anteilig 2,2% nur selten anzutreffen. Dies entspricht etwa den Angaben, die der Literatur für gesunde Tiere entnommen werden können (BELL et al. 1997, HANSSON u. KARLSSONPARRA 1999), liegt jedoch über den von WAGNER (2002) erhobenen Daten, wonach sich unter 120 Tumorpatienten, deren Zusammensetzung der vorliegenden Patientengruppe ähnelte, nur ein einziges ANA-positives Tier befand (0,8%). Die Angaben über die Inzidenz positiver ANA-Befunde bei gemischten Tumorgruppen beim Menschen variiert in den Publikationen zwischen 3,4% (ARMAS et al. 2000) und 42% (IDEL et al. 1978). Die hier ermittelten Inzidenzen bei einzelnen Tumoren (kutanes Histiozytom: 20%, Plattenepithelkarzinom: 13%, Leukämie: 8% und malignes Lymphom: 3%) lagen unter den Frequenzen, die nach indirekter Immunfluoreszenz (FARA) für einzelne Tumoren des Menschen beschrieben sind: malignes Lymphom: 24% (SWISSA et al. 1992), kleinzelliges Lungenkarzinom: 33% (BLAES et al. 2000), hepatozelluläres Karzinom: 31% (IMAI et al. 1992). Zu bedenken gilt es jedoch, dass die klassischen „ANA-positiven Tumoren“ wie Lungenkarzinome und das hepatozelluläre Karzinom beim Hund nur selten angetroffen werden und in der vorliegenden Studie mit Ausnahme zweier Bronchialkarzinome nicht repräsentiert waren. Zudem geht aus einzelnen Studien in der Humanmedizin hervor, dass nukleäre Fluoreszenzen im FARA zu einem geringen Prozentsatz von zytoplasmatischen Fluoreszenzen begleitet waren (THOMAS et al. 1983, ARMAS et al. 2000), so dass die für den Menschen angegebenen Inzidenzen nicht in jedem Fall das Auftreten von reinen antinukleären Antikörpern beschreiben. Trotz dieser Einschränkung deutet sich an, dass reine antinukleäre Antikörper bei den neoplastischen Erkrankungen des Hundes weniger häufig anzutreffen sind als bei den Tumorerkrankungen des Menschen. In den Seren caniner Tumorpatienten dominierte entweder ein Autoantikörperrepertoire, das antizytoplasmatische als auch antinukleäre Antikörper umfasste, oder es wurden Autoantikörper angetroffen, die eine alleinige Reaktiviät mit dem Zytoplasma zeigten. Die zytoplasmatische Fluoreszenz im FARA kann einerseits auf die Markierung von Kernantigenen zurückzuführen sein, deren Anwesenheit im Zytoplasma beschrieben wurde (SS-A/Ro-Antigen, KEECH et al. 1995), oder auf einer Spezifität für rein im Zytoplasma der HEp-2-Zelle exprimierte Autoantigene beruhen wie das p62 (ZHANG et al. 1999 u. 2001a), CLP-170 (GRIFFITH et al. 2002), mitochondriale Antigene (LEUNG et al. 1997, MATTALIA et al. 1998) und das ribosomales P Protein (TAKEHARA et al. 1990, MASSARDO et al. 2002). Das Auftreten dieser Autoantikörper wird mit Ausnahme von anti-p62-Antikörpern vorrangig bei systemischen und organspezifischen Autoimmunerkrankungen des Menschen beschrieben (PIERRE et al. 1992, LEUNG et al. 1997, YOSHIO et al. 1998). 120 Diskussion Die Inzidenz positiver Autoantikörperbefunde unterschied sich bei den einzelnen Tumoren deutlich. So konnten beispielsweise bei Patienten, die an einem Leydigzelltumor, Plattenepithelkarzinom bzw. der chronischen lymphatischen Leukämie erkrankt waren, Frequenzen zwischen 20 und 30% beobachtet werden. Bei Hunden, die an einem Osteosarkom oder Adenom der hepatoiden Drüsen erkrankt waren, konnten hingegen keine autoreaktiven Antikörper nachgewiesen werden (Tab. 29). Über die biologische Grundlage dieses Phänomens kann aufgrund der Tatsache, dass die immunologischen Mechanismen, die zur Generierung von autoreaktiven Antikörpern bei neoplastischen Erkrankungen führen, bis dato nur in Einzelfällen geklärt sind und Untersuchungen diesbezüglich vornehmlich beim Menschen vorgenommen werden, nur vorsichtig spekuliert werden. Unter der Prämisse, dass Autoantikörper gegen neoplastisch überexprimierte oder mutierte Proteine gerichtet sind, die wichtige Funktionen bei der Zellproliferation einnehmen, ist vorstellbar, dass sich die einzelnen Tumoren aufgrund ihres unterschiedlichen Wachstumsverhaltens, Proliferationsraten und Zellursprungs auch hinsichtlich der molekularen Modifikationen während der Karzinogenese unterscheiden und sie somit einen quantitativ und qualitativ unterschiedlichen immunologischen Stimulus ausüben. Weiterhin kann hypothetisiert werden, dass „Tumor escape“-Mechanismen für die unterschiedliche Inzidenz autoreaktiver Antikörper bei den einzelnen Tumoren verantwortlich sind (DUNN et al. 2002). Hinsichtlich der Tumoren, die mit unterschiedlichen Inzidenzen positiver Autoantikörperbefunde einhergehen, bestehen Parallelen bei Mensch und Hund. So wurde das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern beim Menschen vornehmlich für epitheliale und hämatopoetische Tumoren beschrieben (TOMER et al. 1998, ABU-SHAKRA et al. 2001, ZHANG et al. 2001a), was sich mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie weitestgehend deckt (Tab. 29). Für das oropharyngeale Plattenepithelkarzinom (Tab. 29) wurde beim Menschen das Auftreten von anti-p53-, anti-Hsp60- und anti-Tubulin-Autoantikörpern mit Inzidenzen zwischen 10 und 22% beschrieben (CASTELLI et al. 2001, HOFELE et al. 2002, JALBOUT et al. 2002). Das maligne Melanom wird per se zu den „immunologisch aktiveren“ Tumoren gezählt. Demzufolge finden sich viele Berichte über das Auftreten von antinukleären und antizytoplasmatischen Autoantikörpern in den zugehörigen Patientenseren (BETTERLE et al. 1979, THOMAS et al. 1983, RAMIREZ-MONTAGUT et al. 2003). Bei hämatopoetischen Tumoren wie dem Lymphom und der Leukämie ist das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern, die zumeist gegen nukleäre Strukturen gerichtet sind und zum Teil mit autoimmunen Manifestationen in den betroffenen Patienten einhergehen, weitläufig bekannt (SWISSA et al. 1992, TOMER et al. 1998, ABU-SHAKRA et al. 2001). Schließlich wurde für den Brustkrebs des Menschen (in Analogie zu den Mammatumoren des Hundes) das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern gegen eine Vielzahl von Antigenen wie u.a. p53, Hsp27, p62 und HER-2/neu beschrieben (DISIS et al. 1994, CONROY et al. 1998a, METCALFE et al. 2000, REEVES 2001). Dieser Vergleich ist jedoch nur eingeschränkt zulässig, da sich die Angaben beim Menschen meist auf Mammakarzinome beziehen. Beim Hund hingegen war das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern vorwiegend bei benignen Mischtumoren zu beobachten. Beim Osteosarkom des Menschen wurde das Auftreten von anti-Hsp90-Antikörpern be- Diskussion 121 schrieben (TRIEB et al. 2000). Dieser Tumor findet in anderen Arbeiten jedoch kaum Erwähnung, was im Einklang mit den eigenen Beobachtungen steht. Ein positiver Autoantikörpernachweis lässt nach den vorliegenden Untersuchungen nicht auf den malignen Charakter eines Tumors schließen. So befanden sich bei den Hauttumoren positive Patienten zum Beispiel sowohl unter denjenigen, die an einem kutanen Histiozytom als auch denjenigen, die an einem malignen Melanom erkrankt waren (Tab. 29). Unter den mesenchymalen Tumoren waren positive Befunde bei dem Fibrom, nicht aber beim Fibrosarkom zu verzeichnen. Ein ähnliches Bild ergab sich bei den Mammatumoren. Der Anteil positiver Seren als auch der Titer lag bei dem benignen Mammamischtumor über den für das Mammakarzinom ermittelten Werten. Ein möglicher Ansatz zur Erklärung ist die Beobachtung von RUNGSIPIPAT et al. (1998), wonach die Expression der Onkogenprodukte c-yes und c-erbB-2 in benignen Mammatumoren häufiger nachzuweisen war als in den malignen Formen. Fest steht, dass der immunologische Stimulus, der zur Generierung von Autoantikörpern führt, nicht mit der Dignität eines Tumors in Zusammenhang steht, womit er auf andere Charakteristika der Tumoren zurückzuführen ist. Bezüglich der Generierung autoreaktiver Antikörper bestand in der vorliegenden Arbeit keine gesicherte Geschlechts-, Alters- oder Rassendisposition. Aufgrund der zu geringen Untersuchungszahlen wurde bei den folgenden Überlegungen nicht zwischen den einzelnen Tumorgruppen differenziert, sondern die Gesamtheit der Tumorpatienten betrachtet. Dadurch besitzen statistisch ermittelte Aussagen nicht unbedingt eine biologische Relevanz, sondern können ebenso auf einer ungleichen Verteilung der einzelnen Tumoren in den jeweiligen Untersuchungsgruppen beruhen. Die fehlende Geschlechtsdisposition (Tab. 30) ist insofern von Bedeutung als bekannt ist, dass Hündinnen infolge einer Trächtigkeit Antikörper gegen paternale Antigene wie beispielweise MHC-Klasse I Moleküle entwickeln können. Zum anderen wurde von QIMBY et al. (1980) eine Prädisposition für Hündinnen bezüglich der Generierung von antinukleären Antikörpern beschrieben. Die fehlende Geschlechtsdisposition in der vorliegenden Arbeit steht hingegen im Einklang mit den Beobachtungen anderer Autoren, die sich jedoch ausschließlich auf antinukleäre Antikörper beziehen (DAY u. PENHALE 1986, McVEY u. SHUMAN 1991, GROSSJUNG 1996). In dieser Studie ist sie entweder darauf zurückzuführen, dass die Autoantikörperbildung tatsächlich unbeeinflusst von der Zusammensetzung der Sexualhormone bleibt, zum anderen ist ebenso denkbar, dass eine fehlende Geschlechtsdisposition auf die Heterogenität der Tumoren zurückzuführen ist (s.o.). Hinsichtlich des fehlenden Alterseinflusses decken sich die vorliegenden Beobachtungen mit denen von GROSSJUNG (1996), wonach ebenfalls unter den sehr jungen Tieren autoantikörperpositive Befunde zu verzeichnen waren, und die positiven Patienten über die Altersstufen relativ homogen verteilt waren. In der eigenen Studie traf letzteres jedoch nur für die 122 Diskussion ersten drei Altersstufen zu (Tab. 31). Die fehlende Alterspräferenz steht den Aussagen von BALAZS u. ROBINSON (1983) und KASS et al. (1985) entgegen, wonach junge Tiere zumindest keine antinukleären Antikörper entwickeln. Sie widerspricht auch der für den Menschen von einigen Autoren postulierten Hypothese, dass das verstärkte Auftreten von autoreaktiven Antikörpern bei Neoplasien mehr auf das fortgeschrittene Alter dieser Patienten zurückzuführen ist als auf die Erkrankung an sich (HUMINER et al. 1990, SWISSA et al. 1990). Damit ist der direkte Vergleich mit der gesunden Kontrollgruppe zulässig, obgleich das Durchschnittsalter dieser Tiere deutlich unter dem der Tumorpatienten lag. Die im Vergleich zu den Mischlingen signifikant höhere Inzidenz positiver Autoantikörperbefunde bei dem Golden Retriever (Tab. 32) ist möglicherweise auf eine deutliche Überrepräsentation von Patienten, die an einem malignen Lymphom erkrankt waren, in dieser Rasse zurückzuführen. Daran wird deutlich, dass ein Vergleich der Tumorpatienten ohne Berücksichtigung der einzelnen Tumoren nur eine eingeschränkte Aussagekraft besitzen kann (s.o.). Die fehlende Rassedisposition für die anderen diesbezüglich untersuchten Rassen wurde auch von anderen Autoren (DAY u. PENHALE 1986, GROSSJUNG 1996) ermittelt. Die nachgewiesenen Autoantikörper repräsentieren, da sie sich größtenteils als Immunglobuline des Isotyps IgG identifizieren ließen (Abb. 13), mit hoher Wahrscheinlichkeit keine natürlichen Autoantikörper. Letzteren wird im Allgemeinen eine geringe pathogenetische Bedeutung zugeschrieben, da sie – typischerweise als polyvalente, niederaffine Immunglobuline des Isotyps IgM – regelmäßig in gesunden Individuen angetroffen werden (DIAMOND u. SCHARFF 1984, GALVANICO 1993). Die vorgefundenen Autoantikörper sind somit mit großer Wahrscheinlichkeit Ausdruck einer antigenspezifischen adaptiven Immunantwort, was eine pathophysiologische Bedeutung dieser Autoantikörper vermuten lässt (DIAMOND u. SCHARFF 1984, GALVANICO 1993, ABU-SHAKRA et al. 2001). Die Tatsache, dass zu einem geringen Prozentsatz IgM-Antikörper nachgewiesen wurden, deckt sich mit den Angaben für den Menschen, wonach der überwiegende Anteil der bei Tumorpatienten nachgewiesenen Autoantikörper Immunglobulinen des Isotyps IgG angehören. In wenigen Fällen werden IgM- und zu marginalen Anteilen IgA-Antikörper angetroffen (IDEL et al. 1978, THOMAS et al. 1983, JALBOUT et al. 2002). Beim Hund ergibt sich hinsichtlich antinukleärer Antikörper ein ähnliches Bild (KASS et al. 1985, SOULARD et al. 1991, LUCENA u. GINEL 1998). Die Beobachtung, dass in der Vergleichsgruppe mit vorwiegend entzündlichen Erkrankungen die Inzidenz positiver Autoantikörperbefunde ebenfalls deutlich erhöht war, steht im Einklang mit der bekannten Tatsache, dass ANA neben systemischen Autoimmunerkrankungen auch bei anderen inflammatorischen oder infektiösen Prozessen angetroffen werden, die mit einem massiven Zelluntergang einhergehen (QUIMBY et al. 1980, SHULL et al. 1983, KASS et al. 1985, TOTH u. REBAR 1987). Ein undifferenzierter Autoantikörpernachweis ist somit zur Abgrenzung neoplastischer von entzündlichen Prozessen, die als Differentialdiagnose Diskussion 123 üblicherweise in Betracht gezogen werden müssen, wenig geeignet. Eine Ausnahme ist möglicherweise bei dem Osteosarkom zu sehen. Falls sich anhand eines größeren Patientenkollektives bestätigen sollte, dass ein Fehlen autoreaktiver Antikörper für diesen Tumor charakteristisch ist, könnte bei einer Knochenveränderung, die mit einem autoantikörperpositiven Befund einhergeht, ein Osteosarkom mit einiger Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. Differentialdiagnostisch ist jedoch einzuschränken, dass in der vorliegenden Studie auch nur einer von insgesamt drei untersuchten Patienten mit einer Osteomyelitis einen positiven Autoantikörperbefund aufwies. Bei dem Plattenepithelkarzinom ist hervorzuheben, dass bei allen drei zur Verfügung stehenden Patienten, die an einem pharyngealen Karzinom litten – eines der bösartigsten Tumoren des Hundes (McMILLAN et al. 1982, VOS u. VAN DER GAAG 1987) –, der Autoantikörpernachweis positiv ausfiel, und zudem zwei der drei Seren ausschließlich antinukleäre Antikörper enthielten. Sofern dies bei größeren Patientenkollektiven reproduzierbar ist, kann möglicherweise der Schluss gezogen werden, dass bei einem pharyngealen Prozess unbekannter Genese ein positiver ANA- bzw. Autoantikörperbefund ein Plattenepithelkarzinom wahrscheinlich macht. Eine endgültige Bewertung der klinischen Anwendbarkeit des reinen Screeningverfahrens ist jedoch aufgrund der relativ geringen Untersuchungszahlen bei den genannten Tumoren und den fehlenden Vergleichsdaten für entzündliche Prozesse gleicher Lokalisation zu diesem Zeitpunkt nicht gegeben. Die Ergebnisse des Screeningverfahrens zeigen jedoch, dass das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern auch bei den Tumorerkrankungen des Hundes ein häufiges Ereignis darstellt, so dass im Falle eines positiven Autoantikörperbefundes neben autoimmunen Prozessen immer auch ein tumoröses Geschehen in Betracht gezogen werden muss. Ob ein spezifischer Autoantikörpernachweis die Aussagekraft hinsichtlich der Abgrenzung tumoröser von entzündlichen Prozessen oder einzelner Tumoren erhöht, wurde anhand der Immunoblot-Analysen näher untersucht. Wie sich anhand der Immunoblot-Analysen zeigte, erkennen Autoantikörper, die bei neoplastischen Erkrankungen des Hundes angetroffen werden, ein weites Spektrum nukleärer Antigene, die üblicherweise Zielstrukturen von Autoantikörpern bei systemischen Autoimmunerkrankungen sowohl des Menschen als auch des Hundes darstellen (COSTA et al. 1984, MONIER et al. 1988, TAN 1989, VENROOIJ u. PUTTE 1991). Die Tatsache, dass die Spezifitäten der im Zuge autoaggressiver und neoplastischer Erkrankungen generierten antinukleären Antikörper Übereinstimmungen aufweisen, deckt sich mit den Erkenntnissen beim Menschen (SWISSA et al. 1990, IMAI et al. 1992, TOMER et al. 1998). Offensichtlich ist diese Autoantikörperantwort weder für neoplastische noch für Autoimmunerkrankungen spezifisch. Im Falle der anti-Scl-70-Antikörper hat dies jedoch nur eingeschränkte Gültigkeit, da diese bei den Autoaggressionserkrankungen des Hundes keine Erwähnung finden (COSTA et al. 1984, TOTH u. REBAR 1987, MONIER et al. 1988, WHITE et al. 1992). Über die Identität bzw. Lokalisation der nicht identifizierten Antigene, die ebenso zahlreich von caninen Autoantikörpern markiert wurden, können nur Spekulationen angebracht werden. 124 Diskussion Es lässt sich jedoch unter Berücksichtigung der mikroskopischen Untersuchungen vermuten, dass es sich bei den Antigenen A 43/38a, M2’, M2” und SSA’ um zytoplasmatische Strukturen handelt (Tab. 38). Das Antigen SS-A’, das ein Molekulargewicht von 62 kDa aufwies (Tab. 37 b), ist unter den Genannten von besonderem Interesse. ZHANG et al. (1999 u. 2001a) identifizierte bei Menschen, die an unterschiedlichen Karzinomen erkrankt waren, Autoantikörper gegen ein Antigen (p62), das mit einem Molekulargewicht von 62 kDa im Zytoplasma epithelialer Zellen in großer Menge exprimiert wird und sich im FARA als deutliche zytoplasmatische Fluoreszenz in den HEp-2-Zellen darstellt. Es bleibt jedoch offen, ob das als SS-A’ bezeichnete Antigen tatsächlich p62 darstellt. Ein relevantes, identifiziertes zytoplasmatisches Antigen, das von Autoantikörpern caniner Tumorpatienten regelmäßig erkannt wird, stellt das M2-Antigen (E2-Enzym und Protein X des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes der inneren Mitochondrienmembran, FLANERY et al. 1989, NISHIO et al. 2002) – die Zielstruktur sogenannter anti-mitochondrialer Antikörper – dar. Beim Menschen werden anti-mitochondriale Antikörper in hohen Titern als spezifisch für die biliäre Leberzirrhose angesehen (FLANERY et al. 1989, BYLUND u. McHUTCHISON 1997, NISHIO et al. 2002). In dieser Studie enthielt unter anderem das Serum Nr. 373, das von einem Patienten mit multiplem Myelom stammte und bei einem Titer von 1:64000 die mit Abstand stärksten mittleren Fluoreszenzintensitäten im IIFD aufwies (Abb. 14), anti-mitochondriale Antikörper (Abb. 15, Streifen 6). Möglicherweise stellt dieses Antigen im vorliegenden Fall die Zielstruktur der von einem transformierten Plasmazellklon generierten Immunglobuline dar, die im Rahmen einer monoklonalen Gammopathie auftraten. Dass Autoantikörper von den entarteten Tumorzellen selbst generiert werden und somit nicht Ausdruck einer Antigen-gesteuerten humoralen Immunantwort sind, wurde ebenso von SHOENFELD et al. (1986) für das B-Zell Lymphom des Menschen beschrieben. Unter Berücksichtigung der charakteristischen Reaktionsmuster einzelner Seren auf den unterschiedlichen Zellsubstraten (Tab. 36) und der Autoantikörperspezifitäten dieser Seren lassen sich Rückschlüsse darüber ziehen, ob es sich bei den erkannten Antigenen um solche handelt, die spezies- bzw. gewebespezifisch exprimiert werden. So kann mit einiger Wahrscheinlichkeit gefolgert werden, dass es sich bei den Antigenen M2 und Scl-70 um speziesübergreifend und nicht gewebespezifisch exprimierte Antigene handelt, da diejenigen Seren, die eine Spezifität für diese Antigene besaßen, mit allen vier im IIFD eingesetzten Zellsubstraten eine Reaktivität zeigten. Hingegen scheinen die Antigene Ku, CENP-C, SS-A und SS-B speziesübergreifende und zugleich gewebespezifische Antigene darzustellen, da Seren, die diese Antigene markierten, mit den HEp-2-Zellen regelmäßig, nicht aber mit allen caninen Zellsubstraten reagierten (Tab. 36). Die meisten in den vorliegenden Untersuchungen nachgewiesenen Autoantikörper ließen eine Spezifität für die zugrunde liegende Erkrankung vermissen. Dies traf insbesondere für Autoantikörper gegen die Antigene SS-A’, SS-A, SS-B, M2’ und M2” zu, da diese bei den Tumorpatienten und der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen gleichermaßen angetroffen wurden (Tab. 39 a-b). Offensichtlich induzieren diese Antigene ungeachtet der zugrunde Diskussion 125 liegenden Erkrankungsform eine humorale Immunantwort. Demzufolge sind die korrespondierenden Autoantikörper als serologische Tumorindikatoren wenig geeignet. Autoantikörper gegen Ku, Scl-70 und M2 wurden hingegen ausschließlich bei den Tumorpatienten angetroffen (Tab. 39 a-c). Damit deutet sich an, dass Autoantikörper gegen diese drei Antigene eine Tumorspezifität besitzen und potentielle Kandidaten als Tumorindikatoren darstellen könnten. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Untersuchungszahl der Kontrollgruppe relativ gering war, so dass eine Tumorspezifität nur unter Vorbehalt postuliert werden kann. Die angetroffenen Autoantikörper ließen zudem eine Spezifität für einzelne Tumoren vermissen, da die Antigenspektren innerhalb einzelner Erkrankungsformen sehr heterogen waren (4.5.4). Dies traf für einzelne Autoantikörper wie den “tumorspezifischen“ gegen Ku, Scl-70 und M2 als auch für bestimmte Autoantikörperkombinationen zu. So gab es bezüglich der Antigenkombination SS-A’/A 43/38a bei den benignen Mammatumoren zwar Übereinstimmungen (Abb. 17 A, Streifen 3-5), jedoch lässt der Nachweis der assoziierten Autoantikörper nicht auf einen benignen Mammatumor schließen, da diese Kombination ebenso bei anderen Erkrankungen anzutreffen war. Bei dem Plattenepithelkarzinom war die Heterogenität der Autoantikörperantwort, die sich bereits anhand der unterschiedlichen Reaktionsmuster mit allogenen und xenogen Zellsubstraten abgezeichnet hatte (Tab. 36), besonders augenfällig. Jedes positive Serum unterschied sich bezüglich der Autoantikörperzusammensetzung (Abb. 15, Streifen 4-5 u. Abb. 17 A, Streifen 7-9). Die Tatsache, dass die meisten Autoantikörper eine Spezifität für einzelne Tumoren vermissen ließen, schlägt sich ebenso darin nieder, dass die beiden von ihrem Zellursprung und biologischen Verhalten unterschiedlichen Leydig- und Sertolizelltumoren zu einer ähnlichen Autoimmunantwort führten (Abb. 17 B, Streifen 1-3). Bei dem malignen Lymphom deutet sich an, dass die korrespondierenden Autoantikörper Antigene identifizieren, die in dieser Präparation entweder nicht enthalten waren oder in ihrer Struktur so verändert waren, dass eine spezifische Bindung nicht möglich war, da Seren, die nach durchflusszytometrischer Analyse autoantikörperpositiv waren in den Immunoblot-Analysen keine Reaktivität mit den HEp-2-Antigenen zeigten. Die starke Heterogenität der Autoantikörperantwort und die mangelnde Spezifität für einzelne Tumoren wurde ebenfalls für den Menschen beschrieben (IMAI et al. 1992, COVINI et al. 1997). So wurden beispielsweise anti-p53-, anti-ds/ss-DNA- und anti-p62-Autoantikörper bei einer Vielzahl epithelialer und hämatopoetischer Tumoren nachgewiesen (TOMER et al. 1998, ABU-SHAKRA et al. 2001, ZHANG et al. 2001a). Eine Ausnahme stellen Autoantikörper dar, die im Zusammenhang mit Lungentumoren und insbesondere dem kleinzelligen Lungenkarzinom angetroffen werden. So konnte FERNÁNDEZ-MADRID et al. (1999) eine Korrelation zwischen den ANA-Spezifitäten und einzelnen Lungentumorzelltypen feststellen. Des Weiteren werden die mit paraneoplastischen Symptomen einhergehenden antineuronalen nukleären anti-Hu-Autoantikörper als spezifisch für das kleinzellige Lungenkarzinom angesehen (GRAUS et al. 1986, ANDERSON et al. 1988, DALMAU et. al. 1990). 126 Diskussion Trotz der mangelnden Spezifität für einzelne Tumoren wird die Identifikation der mit den Autoantikörpern assoziierten Antigene von großen Anstrengungen begleitet, da nur ein spezifischer Autoantikörpernachweis eine diagnostische Relevanz bezüglich der Früherkennung von Tumoren besitzt und als Parameter hinsichtlich der Prognose des Patienten herangezogen werden kann. Die Entwicklung von Therapeutika, die sich gegen die Zielstrukturen der Autoantikörper richten, ist ebenso nur mit dem Wissen über deren Identität möglich. Aufgrund der Tatsache, dass ein undifferenzierter Autoantikörpernachweis beim Hund ebenso bei Erkrankungen, die nicht neoplastischen Ursprungs sind, positiv ausfällt, erscheint es hinsichtlich der Etablierung eines Autoantikörpernachweises in Zukunft unerlässlich, neben quantitativen Analysen auch Untersuchungen zur Spezifität der vorgefundenen Autoantikörper einzubeziehen. 5.3 Funktionsanalysen zum zytotoxischen Effekt autoantikörperpositiver Seren Die Tatsache, dass ein positiver Autoantikörpernachweis zum Teil mit verlängerten Überlebensraten der Tumorpatienten einhergeht (GRAUS et al. 1997, BLAES et al. 2000, SYRIGOS et al. 2000) und an Labornagern beobachtet wurde, dass die Applikation spezifischer monoklonaler ANA das Wachstum von hämatopoetischen Tumoren unterdrückt (SORACE u. JOHNSON 1990, IAKOUBOV u. TORCHILIN 1997), wirft die Frage nach einem möglichen antitumoralen Effekt der Autoantikörper auf. In der vorliegenden Arbeit hat sich anhand eines grob orientierenden Ansatzes gezeigt, dass etwa 2/3 der autoantikörperpositiven Seren, die von caninen Tumorpatienten stammten, einen zytotoxischen Effekt auf canine und/oder humane Zellen ausübten (Abb. 18). Die unterschiedlichen Reaktionsmuster einzelner Seren bei der Inkubation mit den vier Zellsubstraten legten zunächst die Vermutung nahe, dass der beobachtete zytotoxische Effekt auf einer spezifischen zellulären Interaktion bestimmter Serumbestandteile beruhte und somit am nahe liegendsten auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Diese kann auf einer Bindung der Autoantikörper an die Zellmembran, die aufgrund einer Kreuzreaktivität oder der „Nukleosomentheorie“ (2.4.2, EMLEN et al. 1992, WATSON et al. 1995, IAKOUBOV u. TORCHILIN 1998) möglich erscheint, oder auf einer Internalisierung der Autoantikörper beruhen. Dies kann in beiden Fällen zu einer Apoptose und/oder Depression der Zellproliferation führen, wie von KOZYR et al. (2002) für anti-DNA-Autoantikörper beschrieben. Eine Komplement-vermittelte Lyse ist aufgrund der Tatsache, dass diese bei eukaryotischen Zellen wenig effektiv ist (JANEWAY et al. 2003) und KOZYR et al. (2000) zeigen konnten, dass bereits reine Fab-Fragmente von anti-DNA-Antikörpern in der Lage sind, eine Apoptose zu induzieren, als zugrunde liegender Mechanismus unwahrscheinlich. In den vorliegenden Untersuchungen erwiesen sich die mononukleären Zellen als sensitiver, da im Vergleich zu den Kulturzelllinien ein zytotoxischer Effekt häufiger zu beobachten war und zudem deutlicher ausgeprägt erschien. Dies konnte unter der Prämisse, dass der zytotoxische Effekt trotz gegenteiliger Beobachtungen (s.u.) durch autoreaktive Antikörper induziert wurde, wiederum auf die „Nukleosomentheorie“ zurückzuführen sein. So wurden aufgrund der Tatsache, dass etwa 30-40% der eingesäten mononukleären Zellen innerhalb der Diskussion 127 ersten 48 Stunden der Kultivierung ohnehin starben, große Mengen nukleärer Zellbestandteile frei, die sich an die Zellmembran vitaler Zellen anlagern und somit eine Autoantikörperbindung ermöglichen konnten. Weiterhin ist denkbar, dass Fc-Rezeptor-vermittelte Interaktionen der mononukleären Zellen mit membrangebundenen Autoantikörpern oder Immunkomplexe, die aufgrund des freiwerdenden Zelldebris gebildet wurden, zu einer Verstärkung des zytotoxischen Effektes führten. Im Gegensatz dazu sind HEp-2- und DH82-Zellen unter Kulturbedingungen relativ stabil, so dass die Konzentration an Zelldebris und somit auch an Nukleosomen im Nährmedium als relativ gering einzuschätzen war. Anhand dieser Untersuchungen zeigte sich zudem, dass ruhende mononukleäre Zellen offensichtlich sensitiver gegenüber einem zytotoxischen Effekt waren als stimulierte Zellen. Aufbauend auf den zuvor genannten Hypothesen erschien es zunächst plausibel, dass in unstimulierten Ansätzen die Apoptoserate höher war und somit größere Mengen an Zelldebris frei wurden, die einen zytotoxischen Effekt verstärkten. Jedoch zeigte sich unter Berücksichtigung der absoluten Zahl vitaler Zellen in den beiden Ansätzen, dass dies nicht zutraf. Somit ist ebenso denkbar, dass im Rahmen der Zellaktivierung protektive Faktoren produziert wurden oder die Antigen- bzw. Rezeptorexpression moduliert wurde. Trotz dieser Beobachtungen und Hypothesen, die einen Autoantikörper-vermittelten Prozess möglich erschienen ließen, deutete sich anhand der ADCC-Ansätze und der Versuche mit aufgereinigten IgG-Fraktionen Gegenteiliges an. Der Befund, dass ein zytotoxischer Effekt durch Zugabe von Effektorzellen nicht zu triggern war, womit eine Fc-Rezeptor vermittelte ADCC offensichtlich ausblieb, und sich auch mit aufgereinigten IgG-Fraktionen nicht zeigte, impliziert, dass Immunglobuline des Isotyps IgG an einem zytotoxischen Effekt nicht maßgeblich beteiligt waren. Dass die fehlende Reproduzierbarkeit des zytotoxischen Effektes mit aufgereinigten IgG-Fraktionen nicht auf eine zu niedrige IgG-Konzentration in den einzelnen Ansätzen zurückzuführen war, konnte anhand von IgG-Fraktionen nach zweifacher Aufreinigung – wodurch die IgG-Konzentration in den einzelnen Ansätzen rein rechnerisch derjenigen in kompletten Seren entsprach – gezeigt werden. Auch in diesen Ansätzen blieb ein zytotoxischer Effekt aus (Daten nicht gezeigt). Somit stehen die Ergebnisse der Funktionsanalysen mit den Beobachtungen von VERSCHUUREN et al. (1997) im Einklang, wonach ein zytotoxischer Effekt anti-Hu-positiver Patientenseren auf humane Tumorzelllinien ebenso wenig durch Autoantikörper vermittelt erschien. Vielmehr kann vermutet werden, dass die Beeinflussung der Zellvitaliät auf andere Serumkomponenten zurückzuführen war, für die ebenfalls zytotoxische Eigenschaften bekannt sind, wie TNF-α, aber auch Fas-Liganden, Prostaglandine und Medikamente (u.a. Vincristin, Cyclophosphamid, Kortikoide). Von besonderem Interesse ist dabei das Zytokin TNF-α, das im Rahmen von inflammatorischen Prozessen von Makrophagen, Lymphozyten und Mastzellen ausgeschüttet wird (JANEWAY et al. 2003) und einen direkten rezeptorvermittelten zytotoxischen Effekt auf Tumorzelllinien ausübt (CREASEY et al. 1987). AOKI et al. (1998) konnten zeigen, dass canine Zelllinien in Abhängigkeit von der TNF-Rezeptorexpression, die von der Zellart bestimmt wird, und abhängig vom Zellzykluszustand unterschiedlich sensitiv 128 Diskussion auf TNF-α reagieren, und Medikamente wie Actinomycin D einen zytotoxischen Effekt verstärken. Diese Beobachtungen liefern jedoch nur ansatzweise eine Erklärung dafür, weshalb die jeweils betroffenen Zellarten bei der Inkubation mit den einzelnen Seren differierten. So ist vielmehr davon auszugehen, dass die zytotoxischen Eigenschaften der Seren nicht auf eine Serumkomponente allein zurückzuführen waren, sondern vielmehr deren Zusammenspiel vorlag. Aufgrund dieser Überlegungen und der Tatsache, dass mit einer Protein A-Aufreinigung nicht alle IgG-Isotypen erfasst werden, kann eine Beteiligung der Autoantikörper nicht grundsätzlich ausgeschlossen werden. Dieses konnte jedoch in den vorliegenden Untersuchungen nicht geklärt werden, so dass die durchgeführten Funktionsanalysen nur initialen Charakter besitzen können. Die Ergebnisse verdeutlichen jedoch, dass neben der Identifikation diagnostisch wertvoller Serumbestandteile auch deren pathophysiologischen Bedeutung – im Hinblick auf die Identifikation antitumoraler Serumkomponenten – in Zukunft Beachtung geschenkt werden sollte. Zusammenfassung 6 129 Zusammenfassung Karen Rösner: Nachweis, Vorkommen und Charakterisierung autoreaktiver Antikörper bei neoplastischen Erkrankungen des Hundes Mit der Entwicklung neuer therapeutischer Möglichkeiten und der zunehmenden Lebenserwartung der in der Obhut des Menschen lebenden Haustiere hat die Onkologie in der Veterinärmedizin – insbesondere beim Hund – während der letzten Jahre eine große Bedeutung gewonnen. Dies wird von erheblichen Anstrengungen begleitet, die Diagnostik von Tumorerkrankungen zu verbessern, wobei es bislang an leicht zugänglichen serologischen Tumorindikatoren mangelt. Für den Menschen ist bekannt, dass in den Seren von Tumorpatienten autoreaktive Antikörper angetroffen werden, die zur Frühdiagnostik von Neoplasien und aufgrund der Korrelation zu klinischen Parametern zur Prognose herangezogen werden können. Für die vorliegende Promotionsarbeit galt es die Grundhypothese zu überprüfen, ob zirkulierende Autoantikörper bei caninen Tumorpatienten eine diagnostische Relevanz besitzen. Das Hauptaugenmerk war dabei zunächst auf antinukleäre Antikörper (ANA) gerichtet, die die die Mehrzahl der bei neoplastischen Erkrankungen des Menschen angetroffenen Autoantikörper repräsentieren. Für die Untersuchungen standen 314 Seren caniner Tumorpatienten, eine Vergleichsgruppe mit vorwiegend entzündlichen Erkrankungen (n = 40) und 46 gesunde Kontrolltiere zur Verfügung. Es zeigte sich anhand der Standardmethode zum Nachweis von ANA – ein fluoreszenzserologisches Verfahren mit mikroskopischer Auswertung (FARA) –, dass das Auftreten von reinen ANA bei den neoplastischen Erkrankungen des Hundes ein vergleichsweise seltenes Ereignis darstellte. In caninen Patientenseren dominierte ein gemischtes Autoantikörperrepertoire, das sich sowohl gegen zytoplasmatische als auch nukleäre Strukturen richtete. Der FARA erwies sich als ungeeignet zum reproduzierbaren Nachweis solcher Autoantikörper, da er, wie anhand von Doppelblindstudien dokumentiert werden konnte, zu sehr subjektiven Ergebnissen führte. Aufgrund dieser Problematik wurde ein durchflusszytometrisches Verfahren etabliert, welches eine objektive, standardisierbare und gut reproduzierbare Erfassung der Autoantikörper erlaubte. Aussagen über die zelluläre Fluoreszenzlokalisation waren mit diesem Verfahren allerdings nur sehr eingeschränkt möglich. Daher empfiehlt sich zum initialen Autoantikörper-Screening eine Kombination aus dem FARA und der durchflusszytometrischen Methode. Das Auftreten von autoreaktiven Antikörpern bei den Tumorerkrankungen des Hundes stellte ein häufiges Ereignis dar, wobei die einzelnen Tumoren bezüglich der Frequenz autoantikörperpositiver Befunde deutlich differierten. So waren Autoantikörper insbesondere bei Patienten mit epithelialen und hämatopoetischen Tumoren anzutreffen, was mit den 130 Zusammenfassung Beobachtungen beim Menschen im Einklang steht. Hervorzuheben sind die folgende Tumoren (die Zahl in Klammer gibt die Inzidenz seropositiver Befunde wieder, welche signifikant größer war als bei der gesunden Kontrollgruppe [4%]): Leydigzelltumor (36%), Plattenepithelkarzinom (31%), malignes Melanom (29%), benigner Mammamischtumor (24%) und malignes Lymphom (20%). Hinsichtlich des Vorkommens autoreaktiver Antikörper konnte keine statistisch gesicherte Geschlechts-, Alters- oder Rassendisposition festgestellt werden. In der Vergleichsgruppe mit vorwiegend entzündlichen Erkrankungen befanden sich 20% autoantikörperpositive Tiere. Anhand von Immunoblot-Analysen zeigte sich, dass die Autoantikörper caniner Tumorpatienten gegen ein breites Spektrum nukleärer und zytoplasmatischer Antigene gerichtet waren, die in der Regel eine Spezifität für die zugrundeliegende Erkrankung vermissen ließen. Dies galt gleichermaßen für einzelne Tumoren, die generell mit einer sehr heterogenen Autoantikörperantwort einhergingen, als auch für das Autoantikörperrepertoire, das bei der Gesamtheit der Tumorpatienten und Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen vorgefunden wurde. Eine Ausnahme stellten Autoantikörper dar, die mit dem Antigen Ku, dem Scleroderma-Antigen (Scl-70) oder mitochondrialen Antigenen (M2) reagierten. Diese wurden weder in den Seren der Vergleichsgruppe angetroffen, noch finden sie bei den systemischen Autoimmunerkrankungen des Hundes eine Erwähnung. Somit kann vorsichtig postuliert werden, dass diese Autoantikörper für die Diagnose von Tumorerkrankungen relevant sind. Mittels initialer Funktionsanalysen konnte gezeigt werden, dass 14 (67%) von 21 autoantikörperpositiven Patientenseren zytotoxisch für humane bzw. canine ex vivo Zellen und Kulturzelllinien waren. Dieser zytotoxische Effekt schien jedoch nicht durch Antikörper vermittelt zu sein, da er mit aufgereinigten IgG-Präparationen nicht reproduziert werden konnte. Die Ergebnisse der vorliegenden Promotionsarbeit verdeutlichen, dass autoreaktive Antikörper nicht allein mit klassischen Autoimmunerkrankungen des Hundes einhergehen, sondern ebenso bei neoplastischen Erkrankungen anzutreffen sind. Diese Studie, die zweifelsohne den Charakter einer Pioneerarbeit hatte, dokumentiert die Bedeutung objektiver, durchflusszytometrischer Verfahren zum initialen Nachweis caniner Autoantikörper und den möglichen differentialdiagnostischen Wert eines Antigen-spezifischen Autoantikörpernachweises. Letzteres gilt es in Zukunft intensiver zu studieren und zudem der Frage einer pathophysiologischen Bedeutung der nachgewiesenen Autoantikörper nachzugehen, die nicht nur als Indikatoren einer Erkrankung angesehen werden können, sondern möglicherweise in der Pathogenese der Erkrankungen eine Rolle spielen. Summary 7 131 Summary Karen Rösner: Determination, frequency and characterization of autoreactive antibodies in dogs with neoplastic diseases Due to new therapeutic strategies and increasing life expectancy of domestic animals living in the care of humans, the veterinary oncology gained great importance during the last years, with special respect to the dog. Great efforts are made in order to improve diagnostic tests for tumors. Nevertheless, there is still a lack of easily accessible serological tumor markers. In humans, autoantibodies are frequently observed in sera of tumor patients. These antibodies can be used for early detection of a neoplastic condition and for prognosis, as there is a relation of their occurrence to the patients outcome. In the present study we prooved the hypothesis whether circulating autoantibodies are of diagnostic relevance in dogs affected by a tumor. Initially the attention was focussed on antinuclear antibodies (ANA) which represent the majority of autoantibodies detected in human patients suffering from neoplastic diseases. The study included sera of 314 canine tumor patients, of 46 healthy dogs and 40 dogs with mainly inflammatory diseases. Analyzing the sera in the standard immunofluorescence assay on slides (FARA) revealed that occurrence of ANA is a rare phenomenon among canine tumor patients as compared to humans. Mixed autoantibody populations with reactivity toward cytoplasmic and nuclear structures turned out to dominate in tumor affected dogs. The FARA proved to be insufficient for the reproducible detection of those antibodies due to subjective interpretation of results as shown by double blind studies. For this reason, an alternative method was developed based on flow cytometry which allowed for a standardized, objective and reproducible detection of these autoantibodies. As a drawback, only limited conclusions could be made with respect to the cellular localization of the fluorescence staining. Therefore the flow cytometric procedure should be combined with the conventional FARA method for initial screening assays. The occurrence of autoantibodies represented a frequent event in dogs with tumors, while the incidence of positive results differed strongly among the different types of tumors. In agreement with the findings in humans, autoantibody expression in dogs was mainly observed in patients with epithelial or hematological tumors, with emphasize on following tumors (the numbers in brackets indicate the incidence, which were significant higher as compared to healthy dogs [4%]): Leydig cell tumor (36%), squamous cell carcinoma (31%), malignant melanoma (29%), benign mixed mammary tumor (24%), and malignant lymphoma (20%). No correlation between autoantibody formation, sex, age or breed of the patients could be observed. The quantity of positive dogs in the group with predominantly inflammatory diseases amounted to 20%. 132 Summary Immunoblots revealed that autoantibodies found in canine tumor patients bind to a broad spectrum of nuclear and cytoplasmic antigens, which usually lack specifity for the underlying disease. This observation applied to single tumors, which were characterized by a heterogeneous autoantibody response, and to the entire tumor group compared to the control population (mainly inflammatory diseases), with exception of autantibodies to Ku, Scleroderma antigen (Scl-70) and mitochondrial antigens (M2). Autoantibodies with specificity for these proteins neither were detected in the control group of this study nor are they mentioned in canine systemic autoimmune diseases. Thus it can be taken into consideration that these autoantibodies are relevant for diagnosis of neoplastic diseases. It was shown by initial functional analyses that 14 (67%) of 21 autoantibody-positive sera mediated a cytotoxic effect on human and canine ex vivo cells and cultured cell lines. However, these effects seemed not to be mediated by antibodies, since toxicity did not persist with purified IgG preparations. In conclusion, these findings demonstrate that autoantibody formation does not occur in systemic autoimmune diseases only but also represents a frequent event in dogs suffering from neoplastic diseases. This pioneering study also demonstrates the relevance of more objective, flow cytometry-based assays for the initial autoantibody screening and the potential value of an antigen-specific detection system for differential diagnosis. The latter should be studied more intensively in the future. Moreover, emphasis should be placed on the pathophysiological role of autoantibodies, which may not be indicators of a disease only, but may be actively involved in disease pathogenesis. 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I Rassenverteilung der untersuchten Hunde mit Tumoren (n = 314) Rasse Mischling Berner Sennenhund Deutscher Schäferhund Golden Retriever Labrador Retriever Westhighland White Terrier Rottweiler Boxer Dobermann Rauhaardackel Cocker Spaniel Schnauzer Münsterländer Pudel Briard Hovawart Irish Terrier Airedale Terrier Bobtail Bouvier Eurasier Leonberger Rhodesian Ridgeback Sheltie Tibet Terrier Weimaraner Beagle Bullmastiff Cairn Terrier Canadian Shepherd Collie Anzahl (n) 75 23 21 15 12 12 11 10 9 9 8 8 7 7 4 4 4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 Rasse Deutsch Drahthaar Deutsche Dogge Flat-coated Retriever Groenendael Sibirischer Husky Kuvasz Neufundländer Akita Inu American Stafford Australian Shepherd Barsoi Bernhardiner Bordeaux Dogge Bulldogge Bullterrier Chihuahua Dalmatiner Deutsch Kurzhaar Elo Englischer Setter Gordon Setter Hannoverscher Schweisshund Harzer Fuchs Irischer Wolfshund Jagd Terrier Maremmaner Hirtenhund Pinscher Pon Saluki Soft-coated Wheaten Terrier Whippet Anzahl (n) 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Tabellarischer Anhang Tab. II 169 Rassenverteilung der untersuchten Hunde aus der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen und der gesunden Kontrollhunde Hunde mit sonstige Erkrankungen (n = 40) Rasse Anzahl (n) Mischling 6 Berner Sennehund 3 Deutscher Schäferhund 3 Dobermann 3 Bobtail 2 Cocker Spaniel 2 Labrador Retriever 2 Schnauzer 2 Airedale Terrier 1 Bouvier 1 Briard 1 Bull Terrier 1 Dachshund 1 Deutsch Drahthaar 1 Deutsche Dogge 1 Golden Retriever 1 Irish Setter 1 Irish Terrier 1 Jack Russell 1 Pudel 1 Rhodesian Ridgeback 1 Rottweiler 1 Sheltie 1 Rauhaardackel 1 Yorkshire Terrier 1 gesunde Kontrollgruppe (n = 46) Rasse Anzahl (n) Mischling 14 Beagle 8 Deutscher Schäferhund 5 Labrador Retriever 4 Münsterländer 3 Golden Retriever 2 Weimaraner 2 Autralian Shepherd 1 Cocker Spaniel 1 Deutsch Kurzhaar 1 Deutsche Dogge 1 Dobermann 1 Pinscher 1 Schnauzer 1 Shi-Tzu 1 170 Tab. III Tabellarischer Anhang Schwellenwert für die IgG- und IgM-Bestimmung autoantikörperpositiver caniner Seren im intrazellulären Immunfluoreszenztest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) FITC-Zg-anti-Hd-IgG (Fc) Serumver- FITC-Zg-anti-Hd-IgM (Fc) mittlere FL1 Schwellenwer mittlere FL1 Schwellenwer dünnung (MW ± s) t (MW+2s) (MW ± s) t (MW+2s) 1:500 315 ± 119 554 428 ± 160 748 1:1000 225 ± 69 364 259 ± 90 438 1:2000 167 ± 49 265 171 ± 57 285 1:4000 128 ± 15 159 122 ± 33 187 1:8000 107 ± 11 129 95 ± 17 130 1:16000 97 ± 8 112 78 ± 12 101 1:32000 88 ± 10 108 74 ± 6 86 1:64000 88 ± 9 106 70 ± 4 79 Abkürzungen: FL1: Fluoreszenzintensität im Grünbereich (530 ± 15 nm) MW: Mittelwert, s: Standardabweichung, FITC-Zg-anti-Hd-IgG (Fc): Fluoreszeinisothiocyanat-gekoppelter Ziege-anti-Hund-IgG (Fc) Sekundärantikörper, FITC-Zg-anti-Hd-IgM (Fc): Fluoreszeinisothiocyanat-gekoppelter Ziege-anti-HundIgG (Fc) Sekundärantikörper, Fc: kristallisierbarer Antikörperteil, IgG: Immunglobulin G, IgM: Immunglobulin M. Tab. IV Schwellenwert bei Einsatz caniner Leukämiezellen im intrazellulären Immunfluoreszentest mit Hilfe der Durchflusszytometrie (IIFD) CLL-Zellen ALL-Zellen UL-Zellen Serumver- mittlere FL1 Schwellenwert mittlere FL1 Schwellenwert mittlere FL1 Schwellenwert (MW ± s) (MW+2s) (MW ± s) (MW+2s) (MW ± s) (MW+2s) 1:500 59 ± 22 103 136 ± 33 202 64 ± 12 88 1:1000 42 ± 12 66 112 ± 24 160 54 ± 8 70 1:2000 31 ± 8 47 94 ± 18 130 50 ± 7 64 1:4000 24 ± 5 34 86 ± 17 120 46 ± 6 58 1:8000 21 ± 4 29 82 ± 15 112 42 ± 4 50 1:16000 20 ± 3 26 74 ± 10 94 40 ± 3 46 1:32000 19 ± 4 27 69 ± 12 93 39 ± 3 45 1:64000 19 ± 3 25 61 ± 9 79 38 ± 2 42 dünnung Abkürzungen: FL1: Fluoreszenzintensität im Grünbereich (530 ± 15 nm), MW: Mittelwert, s: Standardabweichung, CLL: chronische lymphatische Leukämie, ALL: akute lymphatische Leukämie, UL: undifferenzierte Leukämie. 1 23 122 132 174 279 390 402 10 82 120 180 344 345 367 7 329 386 407 401 418 373 411 419 Nr. Alter 10 1 10 9 14 6 4 6 6 13 6 10 7 11 10 9 6 5 10 3 6 7 10 6 Sex W M M M M M M W W W S W W W W M K S M W W W M M Diagnose malignes Lymphom malignes Lymphom malignes Lymphom (B-Zell) malignes Lymphom malignes Lymphom malignes Lymphom (T-Zell) malignes Lymphom malignes Lymphom benigner Mammamischtumor benigner Mammamischtumor benigner Mammamischtumor benigner Mammamischtumor benigner Mammamischtumor Adenokarzinom der Mamma Adenokarzinom der Mamma akute lymphatische Leukämie chronische lymphatische Leukämie chronische lymphatische Leukämie Basophilenleukämie Megakaryozytenleukämie undifferenzierte Leukämie multiples Myelom maligne Histiozytose maligne Histiozytose IgG (H+L) pos. (16000) pos. (8000) pos. (16000) pos. (64000) pos. (4000) pos. (16000) pos. (2000) pos. (8000) pos. (4000) pos. (64000) pos. (500) pos. (500) pos. (2000) pos. (2000) pos. (500) pos. (4000) pos. (8000) pos. (4000) pos. (8000) pos. (16000) pos. (16000) pos. (64000) pos. (8000) pos. (4000) IgM (Fc) neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. pos. (64000) neg. neg. neg. pos. (64000) neg. neg. pos. (64000) neg. neg. neg. pos. (16000) neg. neg. pos. (8000) neg. IgG (Fc) pos. (16000) pos. (2000) pos. (4000) pos. (8000) pos. (8000) pos. (16000) pos. (64000) pos. (8000) pos. (64000) pos.(16000) pos. (2000) pos. (2000) pos. (1000) pos. (2000) pos. (1000) pos. (4000) pos. (16000) pos. (4000) pos. (16000) pos. (8000) pos. (32000) pos. (64000) pos. (8000) pos. (4000) Isotyp IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG+IgM IgG IgG IgG IgG+IgM IgG IgG IgG+IgM IgG IgG IgG IgG+IgM IgG IgG IgG+IgM IgG Ergebnis nach der durchflusszytometrischen Analyse (IIFD) autoantikörperpositiver Seren caniner Tumorpatienten mit den isotypspezifischen (IgG [Fc] und IgM [Fc]) und kreuzreagierenden (IgG [H+L]) Ziege-anti-Hund Sekundärantikörpern Rasse Münsterländer Mischling Golden Retriever Golden Retriever Schnauzer Golden Retriever Mischling Golden Retriever Mischling Mischling Kuvasz Westhighland White Terrier Münsterländer Gordon Setter Dobermann Australian Shepherd Mischling Berner Sennenhund Hovawart Rottweiler Irish Setter Mischling Berner Sennenhund Berner Sennenhund Tab. V Tabellarischer Anhang 171 Rasse Mischling Flat-coated Retriever Deutscher Schäferhund Sheltie Boxer Tibet Terrier Rottweiler Labrador Retriever Boxer Berner Sennenhund Pudel Dobermann Deutsch Drahthaar Mischling Labrador Retriever Westhighland White Terrier Westhighland White Terrier Jagd Terrier Hovawart Deutscher Schäferhund Berner Sennenhund Golden Retriever Schnauzer Briard Rauhaardackel Alter 10 14 7 8 8 13 7 2 9 8 13 10 5 12 11 14 11 13 8 7 5 5 9 9 8 Sex M M M W M M M W M M M M M M M M W W W W M M M M W Diagnose Plattenepithelkarzinom (pharyngeal) Plattenepithelkarzinom (oral) Plattenepitehlkarzinom (pharyngeal) Plattenepithelkarzinom (pharyngeal) Plattenepithelkarzinom (oral) malignes Melanom (oral) malignes Melanom (kutan) kutanes Histiozytom kutanes Histiozytom kutanes Osteosarkom Leydigzelltumor Leydigzelltumor Leydigzelltumor Leydigzelltumor Sertolizelltumor Sertolizelltumor Adenom der Talgdrüsen Lipom Lipom Fibrom (Vagina) Hämangiosarkom Schilddrüsenkarzinom Übergangszellkarzinom Synovialzelltumor rektaler Polyp IgG (H+L) pos. (64000) pos. (32000) pos. (4000) pos. (32000) pos. (8000) pos. (8000) pos. (1000) pos. (1000) pos. (2000) pos. (4000) pos. (32000) pos. (2000) pos. (1000) pos. (2000) pos. (1000) pos. (8000) pos. (500) pos. (64000) pos. (500) pos. (500) pos. (1000) pos. (4000) pos. (32000) pos. (4000) pos. (4000) IgM (Fc) neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. pos. (4000) pos. (8000) neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. pos. (8000) pos. (64000) IgG (Fc) pos. (16000) pos. (32000) pos. (8000) pos. (16000) pos. (2000) pos. (16000) pos. (2000) pos. (8000) pos. (4000) pos. (8000) pos. (500) pos. (1000) pos. (2000) pos. (1000) pos. (2000) pos. (8000) pos. (2000) pos. (64000) pos. (1000) pos. (2000) pos. (500) pos. (16000) pos. (8000) pos. (8000) pos. (4000) Isotyp IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG+IgM IgG+IgM ? IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG IgG+IgM IgG+IgM Nr.: Serumnummer, Sex: Geschlecht, M: männlich, W: weiblich, K: männlich kastriert, S: weiblich kastriert, pos.: positiv, neg.: negativ, IgG (H+L): Fluoreszeinisothiocyanat-gekoppelter Ziege-anti-Hund-IgG (H+L) Sekundärantikörper, IgG (Fc): Fluoreszeinisothiocyanat-gekoppelter Ziege-anti-Hund-IgG (Fc) Sekundärantikörper, IgM (Fc): Fluoreszeinisothiocyanat-gekoppelter Ziege-anti-Hund-IgM (Fc) Sekundärantikörper. Nr. 149 152 191 227 310 85 154 17 205 162 49 50 64 413 299 410 186 195 271 156 280 300 193 66 134 Fortsetzung Tab. V 172 Tabellarischer Anhang Rasse Mischling Berner Sennenhund Rhodesian Ridgeback Mischling Schnauzer Berner Sennenhund Mischling Bobtail Alter 13 7 7 8 5 4 9 11 Sex M M W M M S W W Diagnose Hyperplasie der Prostata Osteomyelitis Dermatitis Panostitis Enteritis Abszess Epidermiszyste Endometritis IgG (H+L) pos. (16 000) pos. (4000) pos. (4000) pos. (4000) pos. (2000) pos. (8000) pos. (4000) pos. (4000) IgM (Fc) neg. IgM (64000) neg. neg. neg. IgM (16000) neg. neg. IgG (Fc) pos. (16000) pos. (500) pos. (8000) pos. (2000) pos. (4000) neg. pos. (8000) pos. (8000) Isotyp IgG IgG+IgM IgG IgG IgG IgM IgG IgG Ergebnis nach der durchflusszytometrischen Analyse (IIFD) autoantikörperpositiver caniner Seren aus der Vergleichsgruppe mit sonstigen Erkrankungen mit den isotypspezifischen (IgG [Fc]) und IgM [Fc]) und kreuzreagierenden (IgG [H+L]) Ziege-antiHund Sekundärantikörpern Nr.: Serumnummer, Sex: Geschlecht, M: männlich, W: weiblich, S: weiblich kastriert, pos.: positiv, neg.: negativ, IgG (H+L): Fluoreszeinisothiocyanat-gekoppelter Ziege-anti-Hund-IgG (H+L) Sekundärantikörper, IgG (Fc): Fluoreszeinisothiocyanat-gekoppelter Ziege-anti-Hund-IgG (Fc) Sekundärantikörper, IgM (Fc): Fluoreszeinisothiocyanat-gekoppelter Ziege-anti-Hund-IgM (Fc) Sekundärantikörper. 3 115 136 172 201 277 287 319 Nr. Tab. VI Tabellarischer Anhang 173 Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Nachweis, Vorkommen und Charakterisierung autoreaktiver Antikörper bei neoplastischen Erkrankungen des Hundes“ selbständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen: • Materialien und Geräte wurden von der Arbeitsgruppe Immunologie und der Klinik für Kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. • Die Blutproben wurden in Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. Mischke und Nina Eberle aus der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover entnommen. • Die bovinen mononukleären Referenzzellen wurden von Herrn Udo Rabe und Frau Silke Schöneberg in der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover hergestellt. • Die histopathologischen Untersuchungen der Tumoren wurden in dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt und die Ergebnisse für wissenschaftliche Zwecke freigegeben. • Die zytologischen Untersuchungen der Tumoren wurden in der Klinik für Kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. • Diese Arbeit wurde mit finanzieller Unterstützung in Form eines Promotionsstipendiums der H. WILHELM SCHAUMANN STIFTUNG angefertigt. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotions- berater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt: Arbeitsgruppe Immunologie und Klinik für Kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähn- lichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. Hannover, den 27. August 2003 ___________________________________ (Karen Rösner) 175 Danksagung Danken möchte ich allen voran meinen beiden Betreuern Herrn PD Dr. Hans-Joachim Schuberth und Prof. Dr. Reinhard Mischke. Herrn Schuberth für seine großartige Unterstützung, die er mir vom Beginn dieser Arbeit bis zum jetztigen Zeitpunkt gewährte. Er erklärte sich jederzeit zu spontanen Besprechungen bereit, half Zweifel aus dem Weg zu räumen, Computer und durchflusszytometrisch bedingte Probleme zu lösen und mit motivierenden und produktiven Worten auch die schwierigen Phasen einer Doktorarbeit zu bewältigen. Herrn Mischke möchte ich für seinen unermüdlichen Eifer danken, geeignete Patienten ausfindig zu machen und mir unzählige Blutproben zukommen zu lassen. Für seinen großartigen Einsatz während der Endphase dieser Arbeit, in der er unter großem Zeitdruck und organisatorischen Aufwand die Korrekturen zügig voranbrachte, möchte ich ihm besonders danken. Nina Eberle sei für die Überlassung einer großen Zahl an Blutproben herzlich gedankt. Danken möchte ich auch den Mitarbeitern aus der Klinik für kleine Haustiere, die bei der Blutentnahme immer wieder für optimale Arbeitsbedingungen sorgten. Ein großer Dank gilt Silke Schöneberg, Udo Rabe und Sonja Kordex aus der Arbeitsgruppe Immunologie, die mit einer endlosen Geduld inhaltliche und technische Fragen (!) jederzeit zu beantworten bzw. lösen wussten und somit über viele kleinere und größere Probleme hinweghalfen. Eure Unterstützung ist auf dem Weg eines Doktoranden durch die Labore der Immunologie unerlässlich, vielen Dank an Euch beide! Weiterhin möchte ich den Doktoranden/innen der Arbeitsgruppe Immunologie danken, die sich trotz ihrer unterschiedlichen Charaktere und Interessen sowohl in inhaltlichen als auch praktischen Fragen jederzeit hilfreich zur Seite stehen und auch für außerfachliche lustige und ernste Diskussionen Raum finden. Danken möchte ich insbesondere Julia Dahnke, die mir mit ihrer Lilly für viele Probenentnahmen zur Verfügung stand. Ein großer Dank sei an die H. WILHELM SCHAUMANN STIFTUNG gerichtet, die mir für die gesamte Zeit der Dissertation ungewöhnlich zügig ein Stipendium zur Verfügung gestellt hat, das mir ermöglichte, mich ganz auf diese Arbeit zu konzentrieren. Meinen engen Studienfreundinnen Daniela Rudowitz und Etta Politt möchte ich für die gemeinsam verbrachten Jahre in Hannover danken, in der wir so manch studienbedingte und persönliche Anforderung mit gegenseitiger Unterstützung bewältigt haben und dabei eine schöne und spannende Zeit erleben durften. Bedanken möchte ich mich auch für ihren selbstverständlichen Einsatz beim Korrekturlesen. Danken möchte ich auch Torge König, der mir spontan ebenfalls mit dem Rotstift zur Seite stand. 176 Meiner WG, die mich in teilweise wechselnder Belegschaft über die gesamte Studienzeit begleitet und mich auch in schwierigen und stressigen Phasen ertragen hat, möchte ich an dieser Stelle ebenfalls danken. Jan, Dir möchte ich für die mittlerweile acht gemeinsamen Jahre danken und für die unzähligen Tips und unterstützenden Worte, die sich auch in diesem Abschnitt meines Lebens wieder einmal als hilfreich erwiesen haben. Meine aufrichtige Dankbarkeit gebührt aber in erster Linie meinen Eltern Erika und Harald Rösner: Ihr seid es, die mich auf diesem langen Weg ohne Einschränkung immer unterstützt habt, die mir zugehört, mich auch in schwierigen Situationen ertragen und getragen und stets an mich geglaubt habt. Ohne Euch wäre dieser Weg niemals möglich gewesen, dafür danke ich Euch aus tiefstem Herzen.
