Nachweis Cytokeratin positiver Zellen im Blut von Patientinnen mit

Aus dem Klinikum Offenburg,
Akademisches Lehrkrankenhaus der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.
Nachweis Cytokeratin positiver Zellen im Blut
von Patientinnen mit Mammakarzinom
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i.Br.
Vorgelegt im Januar 2007
von Peter Sutterer
geboren in Lahr / Schwarzwald
am 24.02.1980
Dekan:
Prof. Dr. Christoph Peters
1. Gutachter.
Prof. Dr. Hirsch
2. Gutachter:
Apl. Prof. Dr. Elmar Stickeler
Jahr der Promotion: 2008
Widmung
Ich widme diese Dissertationsarbeit meinem verstorbenen Vater Roland Sutterer.
1
I.
EINLEITUNG
3
1.1
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.2
1.3
1.4
1.5
1.5.1
1.5.2
1.6
BRUSTKREBSHÄUFIGKEIT / EPIDEMIOLOGIE
RISIKOFAKTOREN
PRÄVENTIVE FAKTOREN
HISTOLOGISCHE EINTEILUNG
TUMORDISSEMINATION
CYTOKERATIN
MOLEKULARE MARKER
ZELLANREICHERUNGSYSTEME
ZELLSEPARATIONPRINZIPIEN
ZELLSEPARATIONSTECHNIK
ZIELSETZUNG UND FRAGESTELLUNG
3
5
7
9
9
11
11
13
13
14
16
II.
MATERIAL UND METHODIK
17
2.2
2.2.1
2.2.2
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.4
2.4.1
2.4.2
2.4.3
2.5.
2.5.1
2.5.2
2.5.3
2.5.4
2.5.5
2.5.6
PATIENTENGUT
ONCOQUICK®
MACS®
ONCOQUICK®
PRINZIP
MATERIAL
METHODIK
MACS®
PRINZIP
MATERIAL
METHODIK
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHER TUMORZELLNACHWEIS
PRINZIP DER DURCHFLUSSZYTOMETRIE
PRINZIP DER MESSUNG
MATERIAL
METHODIK
POSITIVKONTROLLE
NEGATIVKONTROLLE
17
18
19
20
20
22
24
25
25
27
27
29
29
31
32
33
33
34
III.
ERGEBNISSE
34
3.1
3.2
ONCOQUICK®
MACS®
34
52
IV.
DISKUSSION
55
4.1
4.2
4.3
4.4
TUMORZELLMARKIERUNG MIT HILFE VON FLUORESZIERENDEN ANTIKÖRPERN GEGEN
CYTOKERATIN, CD 45 UND CD 14
VERGLEICH DER TUMORZELLANREICHERUNGSSYSTEME ONCOQUICK® UND MACS®
DETEKTION CYTOKERATIN POSITIVER ZELLEN MITTELS FACS-METHODE
CYTOKERATINNACHWEIS – KONSEQUENZEN FÜR THERAPIE UND ÜBERLEBEN
55
58
61
64
V.
ZUSAMMENFASSUNG
69
VI.
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
70
2
VII. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS
71
7.1
7.2
71
72
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
TABELLENVERZEICHNIS
VIII. DANKSAGUNG
73
IX.
LEBENSLAUF
74
X.
LITERATURVERZEICHNIS
76
3
I.
Einleitung
1.1
Brustkrebshäufigkeit / Epidemiologie
Brustkrebs ist die häufigste Krebserkrankung bei Frauen weltweit. Die höchsten
Inzidenzraten wurden in Nordamerika beobachtet, wohingegen das niedrigste Brustkrebsrisiko in Asien und Afrika beobachtet wurde (79).
Weltweit erkrankten nach Schätzungen der WHO im Jahre 2000 über eine Million Frauen
an Brustkrebs, 370.000 Frauen verstarben daran. Für Europa ging man im selben Jahr
von 350.000 Neuerkrankungen und 130.000 Sterbefällen aus (102). Auch in Deutschland
ist Brustkrebs die häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Das mittlere Lebenszeitrisiko
von Frauen an Brustkrebs zu erkranken beträgt in Deutschland 9,2%. Somit erkrankt
durchschnittlich jede 11. Frau im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs (95).
Im Jahre 2004 starben in Deutschland 17.590 Frauen an Brustkrebs. Dies entspricht 4%
aller Todesfälle bei Frauen. Der Anteil von Brustkrebs an den durch Krebs verursachten
Todesfällen bei Frauen lag im Jahre 2004 bei 17%. Damit ist Brustkrebs bei Frauen die
am häufigsten zum Tode führende Krebsart (92).
In Deutschland erkranken jährlich 55.100 Frauen an Brustkrebs, davon etwa 23.200
Frauen im Alter unter 60 Jahren. Brustkrebs ist für 26,8% aller Krebsneuerkrankungsfälle
bei Frauen und für deutlich mehr als ein Drittel (40%) der Neuerkrankungen bei Frauen
unter 60 Jahren verantwortlich. Das mittlere Erkrankungsalter liegt bei etwas über 62
Jahren, was etwa 7 Jahre unter dem mittleren Erkrankungsalter für Krebs insgesamt liegt
(8). Selten sind auch Männer von dieser Erkrankung betroffen.
4
Abb. 1:
Schätzung der altersspezifischen Inzidenz in Deutschland
Quelle: GESTIS Krebs in Deutschland Häufigkeiten und Trends (2006)
Abb. 2:
Durchschnittliches Alter der Bevölkerung
5
Die Schätzung der altersspezifischen Inzidenz in Deutschland aus dem Jahre 2002 wird in
Abb. 1 dargestellt. In Abb. 2 wird die Vorausberechnung des Anstiegs der Alterstruktur der
Bevölkerung der Bundesrepublik Deutschland bis zum Jahre 2050 dargestellt. Die
Zunahme der Erkrankungsfälle lässt sich durch die Entwicklung der Alterstruktur der
Bevölkerung erklären.
1.1.1
Risikofaktoren
Verschiedenste endogene wie auch exogene Faktoren, die das Brustkrebsrisiko
beeinflussen können sind bekannt. Lifestylefaktoren, wie z.B. Diäten oder Fettleibigkeit,
Alkohol und Nikotinkonsum, aber auch die Geburt eines Kindes und das Stillen des Kindes
sind Faktoren, die sich auf die Brustkrebsentstehung auswirken können. Zu den
Einflussfaktoren gehören auch der Hormonstatus (Menarche und Menstruationszyklus,
orale Kontrazeptiva und die Hormonersatztherapie), Anthropometrie, Strahlung und die
genetische Prädisposition (51;64). Einige der Faktoren stehen im Zusammenhang mit
einer verlängerten Exposition mit Östrogenen.
6
In Tabelle 1 werden die etablierten und vermuteten Risikofaktoren für eine Brustkrebserkrankung aufgeführt (64).
Tabelle 1:
Risikofaktoren für Brustkrebs
Faktoren
Relatives Risiko
Alter
Geographische Lage
Menarche
Menopause
Schwangerschaft
Familienanamnese
>10
5
3
2
3
≥2
Frühere Benigne Brusterkrankung
Brustkrebserkrankung der
kontralateralen Brust
Diät
4-5
>4
Hoch-Risiko Gruppe
höheres Alter
Industrienationen
Menarche vor dem 11. Lebensjahr
Menopause nach dem 54. Lebensjahr
Erstes Kind nach dem 40. Lebensjahr
Brustkrebserkrankung im jungen Alter bei
einem 1-gradig Verwandten
atypische Hyperplasie
1,5
Hohe Aufnahme gesättigter Fettsäuren
Körpergewicht:
Prämenopausal
Postmenopausal
0,7
2
Body Mass Index >35
Body Mass Index >35
Alkoholkonsum
Ionisierende Strahlung
1,3
3
Exzessive Aufnahme
abnorme Aufnahme bei jungen Frauen nach
dem 10. Lebensjahr
Exogene Hormoneinnahme:
Orale Kontrazeptiva
Hormon Ersatztherapie
Diethylstilbestrol
1,2
1,3
2
laufende Einnahme
Anwendung >10 Jahre
Anwendung während der Schwangerschaft
Das frühe Einsetzen der Menarche (<11. Lebensjahr), Kinderlosigkeit und die späte
Geburt des ersten Kindes (nach dem 40. Lebensjahr) sind Faktoren, die sowohl bei präwie auch postmenopausalen Frauen mit einem erhöhten Risiko für eine Brustkrebserkrankung einhergehen. Faktoren wie das Stillen und eine späte Menopause (nach dem
54. Lebensjahr) sind nur bei den postmenopausalen Frauen mit einem erhöhten
Brustkrebsrisiko assoziiert (20;41).
7
Generell steht die Dauer der Einnahme oraler Kontrazeptiva nicht direkt in Beziehung mit
der Entstehung von Brustkrebs. Besonders bei postmenopausalen Frauen ist die Rolle der
eingenommenen oralen Kontrazeptiva unklar. Van Hoften et al. konnten in ihrer Studie bei
Frauen, die älter als 55 Jahre sind und orale Kontrazeptiva über mehr als 10 Jahre
eingenommen hatten, ein zweifach erhöhtes Brustkrebsrisiko nachweisen (Odds Ratio 2,1
95% Konfidenzintervall 1,1-4,0) (104).
Mutationen im BRCA-1-Gen gehören zu den häufigsten Gendefekten. Betroffen ist das
Chromosom 17q21. In 80% der Fälle sind Tumore auf dem Boden dieser Mutation
Hormonrezeptor negativ und mit einem erhöhten Rezidivrisiko assoziiert. Gendefekte auf
Chromosom 13q12-13 sind als BRCA-2-Gen bekannt. Das BRCA-2-Gen wird autosomal
dominant vererbt. Das BRCA-1-Gen ist mit Tumoren in der Brust, Ovarien, Kolon-Rectum
und in der Prostata assoziiert. Beim BRCA-2-Gen kommt es indes weniger häufig zu
Ovarialkarzinomen. Des Weiteren kann es zu Tumoren im Pankreas kommen (32). BRCA1- und BRCA-2-Gen-Mutationsträger haben ein Lebenszeitrisiko von 80-85% an
Brustkrebs zu erkranken und 44% für ein Ovarialkarzinom (30;36).
Bei Patienten mit nachgewiesener Genmutation gibt es verschiedene Präventionsstrategien.
Die
Mastektomie
ist
das
beste
Mittel
zur
Prävention
einer
Brustkrebserkrankung bei Patienten, die BRCA-Genträger sind (97). Als weitere Option ist
die Chemoprävention mittels Tamoxifen (11;87) oder Raloxifen (26) zu nennen. Patienten
mit BRCA-Genmutationen sollten mittels Mammographie, Ultraschalluntersuchung der
Brust und Magnet-Resonanz-Tomographie überwacht werden. Die Magnet-ResonanzUntersuchung bietet hierbei die höchste Sensitivität (56).
Eine vaginale Ultraschalluntersuchung zur Detektion von Ovarialkarzinomen ist ebenfalls
indiziert. Eine präventive bilaterale Oophorektomie bei Patientinnen mit BRCA-1Genmutation kann das Brustkrebsrisiko durch eine Senkung des Hormonspiegels
reduzieren (84).
1.1.2
Präventive Faktoren
Zur Reduktion des Brustkrebsrisikos kann eine gesundheitsbewusste Lebensweise
beitragen. Diese beinhaltet eine Reduktion des Alkohol- und Nikotinkonsums, eine
gesunde Ernährung mit Obst und Gemüse und eine Vermeidung von Übergewicht.
8
Körperliche Aktivität in der Freizeit aber auch während der Arbeit trägt ebenfalls zu einem
reduzierten Brustkrebsrisiko bei (100). Zur so genannten Primärprävention gehört auch die
Chemoprävention mit Tamoxifen oder Raloxifen. Die Tamoxifen Präventionsstudien
zeigten
eine
38%-ige
(Konfidenzintervall
28-46;
p<0.0001)
Reduktion
der
Brustkrebsinzidenz. Die Östrogen positiven Tumore konnten in den Tamoxifen
Präventionsstudien um 48% (p<0.0001) verringert werden (27).
Als sekundäre Prävention werden die Verfahren zur Früherkennung zusammengefasst.
Dazu gehören das regelmäßige Mammographie-Screening, die körperliche Untersuchung
der Brust sowie die Selbstuntersuchung der Brust.
Die American Cancer Society empfiehlt Frauen im Alter von 40 - 49 Jahren alle 1 - 2 Jahre
die Durchführung einer Mammographie. Ab dem 50. Lebensjahr sollte die Mammographie
jährlich durchgeführt werden. Bei Patientinnen mit erhöhtem Brustkrebsrisiko sollte bereits
zwischen dem 30. und 35. Lebensjahr eine Mammographie erfolgen. Diese Aufnahme
dient als Basis für die weiteren Kontrollen, die bis zum 50. Lebensjahr in dreijährigen
Abständen und zwischen dem 50. und 60. Lebensjahr jährlich vorgenommen werden
sollten (94). In mehreren Studien konnte eine Reduktion der Brustkrebsmortalität von 24%
bei Patienten, die ein Mammographie-Screening erhalten hatten, im Gegensatz zu den
Patienten, die nicht am Mammographie-Screening teilnahmen, gezeigt werden. Die größte
Reduktion der Brustkrebsmortalität war in der Gruppe der 50 - 69-jährigen Patienten zu
beobachten (73).
Die Selbstuntersuchung sollte bei prämenopausalen Frauen ab dem 20. Lebensjahr in der
ersten Zyklushälfte durchgeführt werden. Für eine effektive Selbstuntersuchung ist eine
eingehende Unterweisung durch den Hausarzt oder den Gynäkologen obligat (94).
Allerdings konnten Gao et al. in ihrer Studie zur Selbstuntersuchung der Brust bei 266.064
Frauen keine Reduktion der Brustkrebsmortalität durch intensive Schulungen zur
Selbstuntersuchung feststellen. Durch die Selbstuntersuchung wurden lediglich mehr und
kleinere benigne Knoten in der Brust entdeckt (40).
9
1.1.3
Histologische Einteilung
Mammakarzinome werden in Anlehnung an den Vorschlag der WHO in zwei histologische
Gruppen eingeteilt:
•
Nichtinvasives Karzinom (Carcinoma in situ) und
•
Invasives Karzinom
10% - 20% der Tumore entfallen auf das intraduktale Karzinom in situ (DCIS) und das
intralobuläre Karzinom in situ (LCIS). Früherkennungsuntersuchungen wie die Mammographie tragen zu einer gesteigerten Rate von diagnostizierten Karzinomen in situ bei (16).
Zu den häufigsten histologischen Tumorformen gehören das:
•
Infiltrierende duktale Karzinom (75%),
•
Lobulär invasive Karzinom (10%),
•
Medulläre und das Kolloidkarzinom (50).
Zu den seltenen Formen wird:
•
das tubuläre,
•
das adenoidzystische und
•
das papilläre Karzinom gezählt.
•
Karzinosarkome stellen eine Seltenheit dar (94).
1.2
Tumordissemination
Die Absiedlung zirkulierender Tumorzellen eines Primärtumors wird prinzipiell als
Metastasierung bezeichnet. Hierbei unterscheidet man eine Regionale- von einer Fernmetastasierung.
Tumorzellen können über folgende Metastasierungswege ausgeschwemmt werden:
lymphogene Metastasierung, hämatogene Metastasierung, kavitäre Metastasierung sowie
Impfmetastasen.
Die Metastasierung der Brustkrebszellen findet hauptsächlich über die zirkulierenden
Lymph-
und
Blutbahnen
statt
(112).
Eine
wichtige
Rolle
spielt
hierbei
der
Sentinellymphknoten, der als „Filtersystem“ in die Lymphabstrombahn integriert ist. Der
Sentinellymphknoten kann mit radioaktiv markierten lymphpflichtigen Substanzen markiert
10
werden
und
mittels
Messsonde
lokalisiert
werden.
Die
Untersuchung
des
Sentinellymphknotens zum Nachweis von malignen epithelialen Zellen spielt eine wichtige
Rolle beim Staging von Brustkrebspatienten (28).
Als weitere Vorteile der Sentineltechnik sind zu nennen:
•
Unnötige Eingriffe ins regionale Lymphabflusssystem mit der Folge von
konsekutiven Lymphödemen können vermieden werden.
•
Präzise Aussage über die frühe Tumorzellaussaat und damit das Tumorstaging
können getroffen werden.
•
Frühzeitige Präzisierung der adjuvanten Tumortherapie (86).
Abb. 3:
Metastasierungskaskade
Quelle: Pantel K, Detection and clinical importance of micrometstatic disease,
J Natl Cancer Inst 1999 Jul 7
Am häufigsten werden Fernmetastasen im Knochen (40 - 60%) nachgewiesen. An zweiter
Stelle stehen die Metastasen in der Lunge (15 - 22%), gefolgt von Metastasen in der
Pleura (10 - 14%), Weichteilgewebe (7 - 15%) und der Leber (5 - 15%) (58).
11
1.3
Cytokeratin
Die Cytokeratine gehören zu den intermediären Filamenten welche, zusammen mit den
Mikrotubuli und den Mikrofilamenten, das Zytoskelett in den meisten eukaryoten Zellen
aufbauen. Im Gegensatz zu anderen intermediären Filamenten sind die Cytokeratine aus
einer hochkomplexen, differenzierten Familie von Polypetiden zusammengesetzt. Diese
Polypeptide haben ein Molekulargewicht zwischen 40 und 68 kDa (68). Entsprechend
ihres Molekulargewichtes können sie in hoch- und niedrigmolekulare Cytokeratine
eingeteilt werden. Cytokeratine gehören zu den wichtigsten Markern für die epitheliale
Differenzierung.
Bisher
konnten
20
verschiedene
Cytokeratin-Polypeptide
in
verschiedenartigsten menschlichen Epithelzellen nachgewiesen werden (19).
Die Cytokeratine werden in zwei Klassen eingeteilt: Klasse 1 beinhaltet die Cytokeratine
vom saueren Typ (CK9-CK20), Klasse 2 die Cytokeratine vom neutral-basischen Typ
(CK1-CK8) (47). Die beiden Unterklassen bilden dabei paarweise Heterodimer-Komplexe
aus mindestens einem Typ 1 und einem Typ 2 Cytokeratin (38). Somit exprimieren
Epithelien immer mindestens zwei Cytokeratin Subklassen, anhand derer sie über einen
Antikörpernachweis detektiert werden können. Die Einsatzmöglichkeiten der Cytokeratine
als epitheliale Marker in der histopathologischen Diagnostik wurden bereits vor mehr als
20 Jahren erkannt (21;68). Anhand des Cytokeratinprofils kann die Primärlokalisation des
Tumors häufig eingegrenzt werden. Durch den Einsatz weiterer Tumormarker kann dann
häufig eine Zuordnung der Tumorzellen zum Primärtumor erfolgen (45;50).
In normalen Brustepithelien werden z. B. die Cytokeratine 8, 18 und 19 von den luminalen
Zellen exprimiert (68). Daher bietet sich zum Nachweis der MNF 116-Antikörper an, der
als Pancytokeratinmarker die Cytokeratinklassen 5, 6, 8, 17, 18 und möglicherweise 19
detektiert. Alternativ können auch Antikörpergemische aus saueren und basischen
Cytokeratinen, wie z. B. der AE1/AE3-Antikörper, verwendet werden (48).
1.4
Molekulare Marker
Die CD-Nomenklatur (CD = Cluster of differentiation) ist ein internationales System zur
Klassifizierung der Oberflächenmerkmale von Zellen. Eine Einteilung erfolgt nach
biochemischen oder funktionellen Kriterien. In den meisten Fällen setzen sich die CD-
12
Moleküle aus membrangebundenen Glykoproteinen zusammen. CD-Moleküle können
anhand ihrer Funktionen unterschieden werden. Verschiedene CD-Moleküle übernehmen
Rezeptor- und Signalfunktionen. Neben der interzellulären Kommunikation konnte bei den
CD-Molekülen auch eine enzymatische Aktivität nachgewiesen werden. Spezifische
Antikörper gegen diese Leukozytenmoleküle bieten die Möglichkeit zur Analyse der
Struktur, Funktion und deren Verteilung. So finden die Antikörper häufig Anwendung in der
Hämatologie, Immunologie, Pathologie und Forschung, sowie zur Diagnose und Therapie
(113).
Eine Anwendungsmöglichkeit ist z.B. die Immunphänotypisierung der Expressionsmuster
von CD-Molekülen auf Leukämiezellen. Die Analyse der Expressionsmuster der CDMoleküle kann hierbei zur Diagnose und Klassifizierung der Leukämien eingesetzt werden
(18;111). Die Zellspezifität der CD-Moleküle stellt die Grundlage der zielgerichteten
Immuntherapie dar. Zum Einsatz kommen hierbei monoklonale Antikörper, die gegen
Oberflächenmoleküle auf Lymphozyten gerichtet sind. Der Anti-CD-20-Antikörper
Rituximab findet z.B. Anwendung in der Behandlung von Non-Hodgkin-Lymphomen.
Sowohl eine Kombination mit weiteren monoklonalen Antikörpern wie auch eine Kombination mit einer Chemotherapie stellen mögliche Behandlungsstrategien dar (81;90).
Mittels Gen-Chip-Analyse können pathobiologisch bedeutsame Gene detektiert werden.
Die Analyse des Gen-Chips gibt Aufschluss über das Vorhandensein beziehungsweise die
Aktivität verschiedener pathologischer Gene.
Dieses Verfahren findet auch in der Diagnostik von Patienten mit Brustkrebs Anwendung.
Gen-Chips bieten hierbei die Möglichkeit, mehrere hundert Gene auf deren Aktivität in
bestimmten Geweben zu untersuchen. Zum Einsatz kommt hierbei Messenger-RNA, die
aus dem zu untersuchenden Gewebe isoliert wurde. Trifft diese mittels Farbstoff markierte
Messenger-RNA auf ein „passendes“ markiertes DNA-Stück auf dem Gen-Chip, kommt es
zu einer Verbindung. Die farbstoffmarkierten Verbindungen können durch einen Laser
erkannt werden. Leuchtsignale zeigen hierbei eine Verbindung zwischen Messenger-RNA
und DNA an, die Rückschlüsse auf die vorhanden Gene in der zu untersuchenden Probe
zulassen (89).
13
Abb. 4:
Prinzip der Gen-Chip-Analysen
Quelle: Predictive molecular pathology, Sauter,G.; Simon,R., 19.12.2002
Im Ergebnissteil sind die Gen-Chip-Analysen der untersuchten Probanden dargestellt.
Diese Gen-Chips werden routinemäßig in der St. Josefsklinik Offenburg bestimmt.
1.5
Zellanreicherungsysteme
1.5.1
Zellseparationprinzipien
Primär werden bei der Zellseparation zwei grundlegende Strategien unterschieden. Die
Anreicherung kann entweder über eine Positiv- oder Negativselektion der Zielzellen
erfolgen.
Bei der Positivselektion werden die gesuchten Zellen durch einen spezifischen Antikörper
gegen ein Oberflächenantigen zur Selektion markiert. Bei der Negativselektion werden im
Gegensatz zur Positivselektion nicht die Zielzellen, sondern die unerwünschten Zellen in
der Probe markiert. Als Vorteil ist dabei zu nennen, dass die gesuchten Zielzellen frei von
Antikörpern sind.
Des Weiteren unterscheiden sich die Zellseparationstechniken durch den Einsatz von
nichtmagnetischen- wie auch magnetischen Verfahren. Die Auswahl der Zellseparations-
14
strategie hängt maßgeblich von der gesuchten Zellart und dem eingesetzten
Nachweisverfahren ab.
Wird eine hohe Reinheit der gesuchten Zielzellen gefordert, bietet sich eine
Positivselektionsstrategie zum Nachweis der gewünschten Zellen an. Eine weitere
Anwendungsmöglichkeit der Positivselektionsstrategie ist dann gegeben, wenn die zu
separierenden Zielzellen als einzige Zellen in der Zellpopulation einen bestimmten
Oberflächenmarker tragen, über den sie selektiert werden können.
Eine
Negativselektion
ist
dann
anzustreben,
wenn
die
Zielzellen
über
Oberflächenmoleküle aktiviert werden. Ist der Phänotyp der gesuchten Zellen nicht genau
bekannt, bietet sich ebenfalls eine Depletion der unerwünschten Zellen mittels
Negativselektionsstrategie an.
1.5.2
Zellseparationstechnik
Das gemeinsame Ziel der verschieden Zellseparationstechniken ist die Anreicherung bzw.
die Isolierung der gesuchten Zellen aus einem Zellgemisch. Die Zellen werden hierbei
anhand
physikalischer
Merkmale
wie
Zellgröße,
Zelldichte
und
Zellgranularität
differenziert. Eine Separation aufgrund von Zellgröße und Zelldichte erfolgt bei der
Dichtegradientenzentrifugation. Die Dichtegradientenzentrifugation hat ihre Vorteile in der
Anreicherung homogener Zellpopulationen, wie z.B. Leukozyten und Erythrozyten.
Häufigen Einsatz findet die Dichtegradientenzentrifugation mittels Ficoll-Paque zur
Isolierung von PBMC (=Peripheral Blood Mononuclear Cell) (10). Die FACS-Methode
bietet den Vorteil, dass gleichzeitig mehrere physikalische Eigenschaften der Zellen, wie
Zellgröße und Zellgranularität, bestimmt werden können. Parallel dazu wird das
Fluoreszenzverhalten
der
markierten
Zielzellen
erfasst.
Über
eine
spezielle
Sortiervorrichtung können die detektierten Zellen isoliert werden.
Eine weitere Zellseparationstechnik ist die „Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells“Technik (ISET-Technik). Die ISET-Technik selektiert die zirkulierenden Tumorzellen
anhand ihrer Größe. Die epithelialen Tumorzellen werden bei der Zellfiltration aufgrund
ihres größeren Volumens im Vergleich zu den Leukozyten zurückgehalten. Die
selektierten Tumorzellen stehen dann zur morphologischen, immunozytologischen und
genetischen Charakterisierung zur Verfügung. Die ISET-Technik ist dagegen nicht
geeignet zur Separation von Zellsuspensionen, deren Zellen annähernd den gleichen
15
Durchmesser haben. Des Weiteren kann die ISET-Technik nicht zur Separation von
kleinen neuroendokrinen Tumorzellen eingesetzt werden (59;105).
Weitere biochemische Zellparameter, die zur Zellseparation heran gezogen werden
können, sind z.B. DNA-Gehalt, Enzyme und Ionenkonzentrationen. Mittels Elektrophorese
gelingt es, Proteine und DNA-Fragmente, die sich anhand ihrer Größe und Ladung
unterscheiden, zu trennen. Die Auftrennung der Molekülgemische erfolgt dabei in einem
Spannungsfeld. Die unterschiedlichen Moleküle bewegen sich in diesem Spannungsfeld
aufgrund ihrer Landung und ihrer Größe unterschiedlich schnell und können so
aufgetrennt werden (106).
Immunologische Parameter, wie z.B. spezifische Öberflächenantigene, finden bei den
immunomagnetischen
Zellseparationsverfahren
Anwendung
zur
Separation
von
zirkulierenden Tumorzellen. Bei der MACS® - Technik werden die gesuchten Zellen mit
supramagnetischen Partikeln inkubiert. Diese magnetgekoppelten Antikörper sind gegen
spezifische Oberflächenmerkmale auf den Zielzellen gerichtet. Beim Passieren einer sich
in einem Magnetfeld befindlichen, mit Stahlwolle befüllten Kanüle, werden die magnetgekoppelten Zellen zurückgehalten. Ein Vorteil der immunomagnetischen Verfahren ist die
Möglichkeit zur Separation großer Zellzahlen (67). Als weiteres immunomagnetisches
Verfahren ist das Dynabead®-Verfahren der Firma Dynal zu nennen (52). Prinzipiell
unterscheiden sich die beiden Verfahren lediglich durch die Größe der verwendeten
Magnetbeads und durch die persistierende Bindung der Dynabeads®, die sich auf weitere
Untersuchungsschritte auswirken kann.
16
1.6
Zielsetzung und Fragestellung
Bereits im Jahre 1869 konnte in einer Studie die Präsenz von Karzinomzellen im
peripheren Blut demonstriert werden (91). Ziel war es daraufhin, Verfahren zu etablieren,
die die Detektion der Mikrometastasen verbessern und zur Klärung der klinischen
Signifikanz beitragen (80).
In der Vergangenheit wurden verschiedene Studien zum Tumorzellnachweis durchgeführt.
Der Tumorzellnachweis erfolgte hierbei im Blut (57), im Knochenmark (60;85) und im
Lymphknotengewebe (15;101).
Der Tumorzellnachweis kann über verschiedenste Methoden erfolgen. Ein häufig
eingesetztes Verfahren ist die Detektion von zirkulierenden Tumorzellen mittels
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) (7;109). Als weitere gut etablierte Methode ist der
Tumorzellennachweis mittels immuncytochemischer Verfahren zu nennen (12;93). Des
Weiteren können die Tumorzellen mit Fluoreszenz gekoppelten Antikörpern inkubiert
werden und mittels FACS Methode nachgewiesen werden (25;76).
Ziel dieser Arbeit war es, ein ausreichend sensitives Verfahren zum Nachweis von
Tumorzellen bei Patienten mit Brustkrebserkrankungen zu etablieren. Dieses Verfahren
sollte sich durch eine einfache klinische Anwendung auszeichnen, um so in der täglichen
Routine Verwendung finden zu können.
Aufgrund der im Labor bereits vorhanden Erfahrungen entschieden wir uns für den Einsatz
der FACS-Methode. Da sich auch die Probengewinnung im klinischen Alltag einfach
gestalten sollte, wählten wir Vollblut als Ausgangsmaterial für unsere Untersuchungen.
Da die Cytokeratin-positiven Tumorzellen aber nur in sehr geringen Zellzahlen im
peripheren Blut vorkommen, war es notwendig, ein Tumorzellanreicherungsystem zu
verwenden (62). Hierzu wurden zwei prinzipiell verschiedene Anreicherungssysteme
erprobt, deren Sensitivität für den Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen untersucht
wurde.
17
II.
Material und Methodik
2.2
Patientengut
Insgesamt wurden innerhalb der Studie 55 Patientinnen untersucht. Eingeschlossen
wurden weibliche Patienten im Alter zwischen 30 und 80 Jahren mit nachgewiesener
Brustkrebserkrankung zum Zeitpunkt der primären Operation. Eine Auswahl anhand des
Behandlungsregimes wurde nicht getroffen. Die Auswahl der Patientinnen wurde durch
den betreuenden Arzt / die betreuende Ärztin der onkologischen Ambulanz der St.
Josefsklinik in Offenburg vorgenommen.
Die St. Josefsklinik Offenburg ist Teil eines zertifizierten Brustzentrums mit über 200
Neuerkrankungen pro Jahr. Die Patientenaufklärung erfolgte durch einen Arzt / eine Ärztin
und beinhaltete die Informationen über mögliche Risiken, die Studienbedingungen sowie
die Möglichkeit, jederzeit ohne Angabe von Gründen aus der Studie auszuscheiden. Nach
dokumentierter Einverständniserklärung wurde die Probenuntersuchung unter anonymen
Bedingungen durchgeführt, so dass während der Messungen keinerlei Informationen über
den klinischen Status der Patienten vorlagen.
Moreno et al. konnten durch mehrfache Messungen über eine Dauer von 24 Stunden
nachweisen, dass die Ausschüttung der Tumorzellen über den Tagesverlauf konstant ist
(70). Somit konnte der jeweilige Tageszeitpunkt für die Blutentnahme frei gewählt werden,
ohne tageszeitliche Schwankungen der nachgewiesen Tumorzellen erwarten zu müssen.
Aufbewahrungszeiten der Vollblutproben von bis zu 7 Tagen wirken sich nur geringfügig
auf die Zahl der wieder gefunden epithelialen Zellen aus (76). Trotzdem wurden die
gekühlten
Blutproben
innerhalb
von
12
Stunden
untersucht.
Auch
dürfte
die
chemotherapeutische Behandlung der Patienten keine Auswirkungen auf den Nachweis
von Cytokeratin-positiven Zellen haben, da die zirkulierenden Tumorzellen wohl nicht zu
den vermehrungsfähigen Zellen zählen (71).
18
2.2.1
OncoQuick®
Tabelle 2:
Untersuchtes Patientenkollektiv mittels OncoQuick® - Methode
Histologische Auswertung / Tumorcharakteristiken
Durchschnittsalter
Anzahl der Patienten
61
n=50
Histologischer Typ
n
%
Grad
n
%
Duktales Karzinom
19
38
G1
0
0
Lobuläres Karziom
3
6
G2
26
52
Duktales Karzinom/DCIS
23
46
G3
24
48
Duktales/Lobuläres CA
3
6
NA
0
0
Muzinöses Karzinom
1
2
NA
1
2
T-Status
n
%
N-Status
n
%
T1
16
32
N0
16
32
T2
20
40
N1
12
24
T3
3
6
N2
4
8
T4
6
12
N3
13
26
NA
5
10
NA
5
10
M-Status
n
%
Her 2/neu
n
%
M0
31
62
Negativ
28
56
M1
14
28
Positiv
21
42
NA
5
10
NA
1
2
Ploidie
n
%
St. Gallen Klassifikation
n
%
anaeuploid
20
40
low
0
0
diploid
12
24
intermediate
16
32
tetraploid
2
4
high
20
40
multiploid
3
6
Metastasiert
14
28
NA
13
26
NA, not analyzed
19
2.2.2
MACS®
Tabelle 3:
Untersuchtes Patientenkollektiv mittels MACS® - Methode
Histologische Auswertung / Tumorcharakteristiken
Durchschnittsalter
Anzahl der Patienten
54
n=5
Histologischer Typ
n
%
Grad
n
%
Duktales Karzinom
3
60
G1
0
0
Lobuläres Karziom
0
0
G2
4
80
Duktales Karzinom/DCIS
2
40
G3
1
20
Duktales/Lobuläres CA
0
0
NA
0
0
Muzinöses
0
0
NA
0
0
T-Status
n
%
N-Status
n
%
T1
3
60
N0
1
20
T2
2
40
N1
3
60
T3
0
0
N2
0
0
T4
0
0
N3
0
0
NA
0
0
NA
1
20
M-Status
n
%
Her 2/neu
n
%
M0
2
40
Negativ
3
60
M1
3
60
Positiv
2
40
NA
0
0
NA
0
0
Ploidie
n
%
St. Gallen Klassifikation
n
%
anaeuploid
0
0
low
0
0
diploid
1
20
intermediate
0
0
tetraploid
1
20
high
2
40
multiploid
0
0
Metastasiert
3
60
NA
3
60
NA, not analyzed
20
2.3
OncoQuick®
2.3.1
Prinzip
Der Nachweis von ausgeschwemmten Tumorzellen im Blut gewinnt im Rahmen der
Überwachung minimaler Resterkrankungen, des Tumorstaging sowie der Prognoseeinschätzung immer mehr an Bedeutung. Disseminierte Tumorzellen, ausgehend von
soliden Tumoren, können zu Metastasen in verschiedenen Organen führen (44;60;101).
In letzter Zeit konnte daher ein wachsendes Interesse am frühen Nachweis von circulating
tumor cells (CTC´s) im Blut und Knochenmark beobachtet werden. So bedeutet der
Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen vor und nach Beginn der Therapie einen
starken unabhängigen prognostischen Faktor (24). Patienten mit Mammakarzinom, bei
denen eine hohe Zahl an disseminierten Tumorzellen nachgewiesen wurde, haben ein
erhöhtes Risiko einen Rückfall zu erleiden (77). Da die disseminierten Tumorzellen nur in
sehr geringer Anzahl im peripheren Blut erscheinen, stellt sich der Nachweis als sehr
diffizil dar (49).
OncoQuick® der Firma Greiner Bio-One ist ein Kit zur Detektion disseminierter
zirkulierender Tumorzellen im Blut von Patienten.
Das OncoQuick® - Zentrifugenröhrchen ist mit einer porösen Trennscheibe ausgestattet,
die das am Boden befindliche Trennmedium vom eingefüllten Vollblut abtrennt. Die
Anreicherung der zirkulierenden Tumorzellen basiert auf einem Dichtegradienten, der an
die Größe der Zellen angepasst wurde. Bei der 20 Minuten dauernden Zentrifugation
werden die Erythrozyten sowie die Leukozyten durch die Trennscheibe in das untere
Kompartiment sedimentiert. Dies führt dazu, dass das Trennmedium in das obere
Kompartiment verdrängt wird. Die Zellfraktion mit der geringeren Dichte, welche die
Tumorzellen enthält, lagert sich zwischen verdrängtem Trennmedium und Plasma an und
kann von dort mittels einer Pipette entnommen werden.
21
Abb. 5:
OncoQuick® - Röhrchen mit dargestellter Interphase
Nach zweifachem Waschen können die Tumorzellen für weitere Nachweisverfahren, wie
die immunchemische Färbung, PCR, Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) oder für den
Nachweis mittels Durchflusszytometrie sowie auch für die Zellkultur, verwendet werden.
Das OncoQuick® - Kit ist für 15-30 ml Vollblut optimiert und ausschließlich für
Forschungszwecke bestimmt und darf nicht zu Verfahren der Diagnosestellung eingesetzt
werden. Das Verfahren liefert etwa 104 mononukleäre Zellen bei einem Anreicherungsfaktor von insgesamt bis zu 6 Log-Stufen.
Abb. 6:
Darstellung des OncoQuick® - Verfahrens
Quelle: Greiner Bio-One GmbH
22
Tabelle 4:
Validierungsergebnisse
Validierungsparameter Mittelwert Standardabweichung Abweichungsbereich
Wiederfindung
72%
18%
56% - 92%
Linearität
0.994
0.002
0,991 – 0995
Nachweisgrenze
1,46
0,36
1,08 – 1,83
Reproduzierbarkeit
83%
8%
69% - 91%
Anreicherungsfaktor
(log)
3,8
0,08
3,72 – 3,88
Datenblatt OncoQuick®
Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse beruhen auf „Spiking“ Experimenten der Firma
Greiner Bio-One. Dabei werden verschiedene Tumorzelllinien in 20 ml Vollblut gesunder
Probanden gegeben, das vor dieser Zugabe 48 Stunden bei 2-8°C gelagert wurde. Nach
erfolgter Anreicherung mittels OncoQuick® werden die wieder gefundenen Tumorzellen
quantifiziert.
2.3.2
Material
Für eine Messung war es notwendig 30 ml Vollblut zu entnehmen. Dies erfolgte im
Rahmen der routinemäßigen Nachsorgeuntersuchungen in der St. Josefsklinik Offenburg.
Moreno et al. konnten durch mehrfache Messungen über eine Dauer von 24 Stunden
nachweisen, dass die Ausschüttung der Tumorzellen über den Tagesverlauf konstant ist
(69). Somit konnte der jeweilige Tageszeitpunkt für die Blutentnahme frei gewählt werden,
ohne tageszeitliche Schwankungen der nachgewiesen Tumorzellen erwarten zu müssen.
Die Blutentnahme erfolgte via periphervenösen Zugang bzw. zentralen Port. Hierfür
wurden 10 ml EDTA-Monovetten® der Firma SARSTEDT verwendet. Aufbewahrungszeiten der Vollblutproben von bis zu 7 Tagen wirken sich nur geringfügig auf die Zahl der
wieder gefunden epithelialen Zellen aus (76). Trotzdem wurde das entnommene Blut bei
4°C – 8°C gekühlt gelagert und innerhalb von 12 Stunden untersucht.
23
Auch dürfte die chemotherapeutische Behandlung der Patienten keine Auswirkungen auf
den Nachweis von Cytokeratin-positiven Zellen haben, da die zirkulierenden Tumorzellen
wohl nicht zu den vermehrungsfähigen Zellen zählen (71).
Für die Messungen wurden 50 ml OncoQuick® Röhrchen der Firma Greiner Bio-One
verwendet.
Des Weiteren wurden verwendet:
Probe:
EDTA-Vollblut
Material:
PBS Pufferlösung
Waschpuffer (PBS Pufferlösung + 0,2% Rinderserumalbumin (RSA))
70% Ethanol
OncoQuick® - Probenröhrchen
50 ml Probenröhrchen
5 ml Probenröhrchen
Geräte:
Vortex-Mischer
Pipette mit Aufsatz
Zentrifuge
Kühlzentrifuge Varifuge der Firma Heraeus Instuments
Durchflusszytometer FACS Calibur® der Firma Becton and Dickinson
24
Wir verwendeten dafür folgende Antikörper:
Tabelle 5:
Verwendete Antikörper OncoQuick®
Bezeichnung
Anti-Human
Cytokeratin
5/6/8/17/18
2.3.3
Fluorochrom
FITC
CD 45
PerCP
CD 14
PE
Simultest
Control γ1/γ2a
FITC/PE
Firma
Klon
Konzentration
Dako
Cytomation MNF 116
Denmark
BD
Bioscience
San Jose,
USA
BD
Bioscience
San Jose,
USA
BD
Bioscience
San Jose,
USA
25µg/ml
50µg/ml
Methodik
Im ersten Schritt wurde die PBS-Lösung hergestellt. Diese Lösung sollte täglich frisch
angesetzt werden. Dazu wurde die PBS Lösung der Firma Gibco im Verhältnis 1:10 mit
Aqua bidest verdünnt. Zur Herstellung des Waschpuffers wurde zur verdünnten PBSLösung 0,2% Rinderserumalbumin im Verhältnis 1:100 zugegeben.
Die OncoQuick® - Proberöhrchen sowie die EDTA-Blutproben wurden zunächst für 10 –
15 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurde das gekühlte Vollblut (30 ml) vorsichtig
und ohne Aufwirbelung in das obere Kompartiment des OncoQuick® - Proberöhrchens
gefüllt. Das befüllte OncoQuick® - Proberöhrchen wurde in der auf 4°C vorgekühlten
Zentrifuge der Firma Heraeus Instruments bei 2600/U für 20 Minuten ohne Bremsvorgang
zentrifugiert. Zellpelletablagerungen an der Wand des OncoQuick® - Röhrchens wurden
mit der Pipette abgenommen und anschließend wurde der Rand des Röhrchens mit
Waschpufferlösung gespült. Die Zellen wurden in ein neues 50 ml Röhrchen überführt und
25
auf ein Gesamtvolumen von 50 ml mit Waschpuffer aufgefüllt. Vor dem nächsten
Zentrifugationsschritt von 10 Minuten bei 4°C und 800/U wurde die Zell-WaschpufferSuspension durch 5-faches Überkopfdrehen des Probenröhrchens vermischt. Im
Anschluss daran wurden mit einer Pipette vorsichtig 45 ml des Überstandes
abgenommen. Bei diesem Schritt war besonders darauf zu achten, dass es zu keiner
Aufwirblung des Zellpellet kam. Das Pellet wurde in den restlichen 5 ml Waschpuffer
belassen. Die Zellfraktion wurde durch vorsichtiges Mischen oder Klopfen mit dem Finger
resuspendiert und anschließend mit Waschpuffer auf ein Endvolumen von 50 ml aufgefüllt.
Durch 5-maliges Überkopfdrehen des Röhrchens wurde der Inhalt vorsichtig vermischt.
Bei einer Temperatur von 4°C und 800/U wurden die Zellen erneut ohne Abbremsvorgang
zentrifugiert. Es wurde dann soviel Überstand mittels Pipette abgenommen, wie es ohne
Aufwirbelung des Zellpellet möglich war. Zwei 5 ml Röhrchen mit jeweils 0,5 ml 70%
Ethanol
und
0,5
ml
PBS
wurden
vorbereitet,
in
die
wiederum
200
µl
der
Tumorzellsuspension resuspendiert wurden. Anschließend erfolgte eine Inkubation bei
Raumtemperatur in Dunkelheit für eine Dauer von 30 Minuten. Die Röhrchen wurden für 5
Minuten bei 300g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette aspiriert, sodass 50
µl im Probenröhrchen verblieben. Nach einer weiteren Zugabe von 2 ml PBS-Lösung und
vorsichtigem Mischen erfolgte eine erneute Zentrifugation von 300g für 5 Minuten. Der
Überstand wurde wiederum bis auf 50 µl mit einer Pipette abgenommen und stand im
Anschluss daran zur durchflusszytometrischen Messung zur Verfügung.
2.4
MACS®
2.4.1
Prinzip
Das Grundprinzip der MACS® - Technologie (Magnet activated cell sorting) besteht in der
Zellseparation durch magnetgekoppelte Antikörper. Die Magnetbeads sind kleine superparamagnetische Partikel mit einem Durchmesser von 50 nm, die an hochspezifische
monoklonale Antikörper gebunden sind. Primär wird zwischen zwei unterschiedlichen
Separationsstrategien unterschieden: der positiven und der negativen Selektion. Bei
beiden Methoden kommen spezifische magnetaktivierte Antikörper, die entweder direkt
oder indirekt an Oberflächenantigene oder intrazelluläre Strukturen binden, zum Einsatz.
Bei der positiven Selektionsstrategie werden die gesuchten Zellen mit einem spezifisch
gegen diese Zelle gerichteten magnetaktivierten Antikörper inkubiert. Zur Separation wird
26
eine spezielle Kanüle verwendet, deren Schaft mit Stahlwolle versehen ist. Diese Stahlwolle dient zur Oberflächenvergrößerung und erlaubt eine spezifische Bindung der
magnetgekoppelten Zielzellen.
Abb. 7:
Matrix einer Selektionskanüle
Quelle: Miltenyi Biotec GmbH
1/1 MD0xxx.01
Während des Separationsvorgangs ist die Kanüle in einem Dauermagnetfeld eingesteckt.
Die unmarkierten Zellen passieren die Kanüle ungehindert und werden in einem Behältnis
aufgefangen. Wird die Kanüle aus dem Dauermagnetfeld entfernt, können die gesuchten
Zellen durch einfaches Spülen abgelöst und zur weiteren Untersuchung aufgenommen
werden.
Abb. 8:
Positiv Selektionsstrategie
1/1 MD0xxx.01
Quelle: Miltenyi Biotec GmbH
Bei der Negativ- oder Depletionsstrategie werden die unerwünschten Zellen magnetisch
separiert. Die gesuchten Zellen, die hier im Gegensatz zur Positivselektion nicht magnetgekoppelt sind, passieren die Kanüle und stehen zur weiteren Untersuchung zur
27
Verfügung. Um die Anreicherungsrate zu erhöhen, kann der Separationsschritt im Dauermagnetfeld wiederholt werden.
2.4.2
Material
Instrumente:
MiniMACS™ Magnetic cell separator
MS + Columns positive selection columns
Pre-Column Separation Filter
Zubehör:
10x Dilution Puffer
MACS® CellPerm Solution
10x MACS® CellStain Solution
FcR Blocking Reagent: Human IgG
MACS® Cytokeratin MicroBeads
MACS® CellFix Solution
2.4.3
Methodik
Herstellung der Arbeitslösungen:
Im ersten Schritt mussten die benötigten Arbeitslösungen hergestellt werden. Hierfür
wurde der 10x Dilution-Puffer im Verhältnis 1:10 mit zweifach destilliertem Wasser
verdünnt. Für eine Patientenprobe aus dem peripheren Blut wurden 100 ml 1x DilutionPuffer benötigt.
Der 1x Dilution-Puffer setzt sich wie folgt zusammen: 10ml 10x Dilution Puffer + 90 ml
zweifach destilliertes Wasser.
Im weiteren Verlauf der Messungen wurde zusätzlich eine 1x MACS CellStain Solution
benötigt, die durch 1:10-fache Verdünnung der 10x MACS CellStain Solution mit 1x
Dilution Puffer hergestellt wurde.
Protokoll zur Anreicherung der Cytokeratin exprimierenden Tumorzellen:
Zur Präparation der peripheren Blutzellen wurde 30 ml antikoaguliertes Blut bei 400g für
35 Minuten ohne Abbremsung zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde mittels einer
Pipette die Interphase vorsichtig abgenommen. Falls das Volumen des Erythrozytenpellet
28
kleiner als 5 ml war, musste das zellfreie Plasma abgenommen werden und das „buffycoat“ mit dem kompletten Zellpellet (Erythrozyten und Leukozyten) verwendet werden.
Unter einem „buffy coat“ versteht man die Schicht aus Leukozyten und Thrombozyten, die
sich nach Zentrifugation von Vollblut zwischen der Plasmaphase und den sedimentierten
Erythrozyten bildet. Zu jeder 5 ml Probe wurden 35 ml des 1x Dilution-Puffers zugegeben,
bis das Endvolumen von 40 ml erreicht war und anschließend gut vermischt. Nach einer
erneuten Zugabe von 5 ml MACS® CellPerm Solution wurde die Suspension durch
leichtes Schütteln nochmals vermischt. Im Anschluss daran wurde die Zellsuspension für
exakt 5 Minuten bei 20 – 25°C inkubiert. Nach erfolgter Zugabe von 5 ml CellFix Solution
schloss sich eine weitere Inkubation von einer Dauer von 30 Minuten bei 20 – 25°C an.
Die Zentrifugation der Zellsuspension wurde bei 300g für 10 Minuten durchgeführt.
Anschließend wurde der Überstand mittels einer Pipette abgenommen und das Zellpellet
in 30 ml 1x MACS CellStain Solution resuspendiert. In zwei weiteren optionalen Schritten
erfolgte eine weitere Zentrifugation für 10 Minuten bei 300g und eine erneute
Resuspendierung des Zellpellet in 10 ml 1x MACS® CellStain Solution, nachdem der
Überstand komplett abgenommen wurde.
Magnetmarkierung der Cytokeratin exprimierenden Tumorzellen:
Zu Beginn wurde die Zellsuspension bei 300g für 10 Minuten zentrifugiert. Nachdem der
Überstand komplett abgenommen war, wurde das Zellpellet in 1x MACS® CellStain
Solution zu einem Gesamtvolumen von 600 µl resuspendiert. Bevor die MACS®
Cytokeratin MicroBeads zugegeben und bei 20 – 25 °C inkubiert werden konnten, musste
die Zugabe von 200 µl FcR blocking reagent erfolgen. Beides wurde jeweils gut
miteinander
vermischt.
Um
die
Cytokeratin
exprimierenden
Tumorzellen
mittels
Flowzytometrie zu detektieren, erfolgte in diesem Schritt die Zugabe der Fluoreszenz
markierten Antikörper in folgenden Mengen: 10 µl FITC-konjugierter Cytokeratin
Antikörper, 20 µl CD 45 PerCp, und 20 µl CD 14 PE. Die Negativkontrolle wurde mit 10 µl
FITC konjugiertem IgG1/IgG2a Antikörper inkubiert. Nach erfolgter Zugabe von 4 ml 1x
MACS® CellStain Solution wurde die Zellsuspension für 10 Minuten bei 300g zentrifugiert.
Der Überstand wurde komplett abgenommen und das Zellpellet in 1 ml 1x MACS®
CellStain Solution resuspendiert.
29
Magnetische Trennung der angereicherten Cytokeratin exprimierenden Tumorzellen:
Für die magnetische Trennung wurde die positive Selektionskanüle vom Typ MS der
Firma Miltenyi und der dazugehörige MACS®-Separator verwendet. Nach dem Einstecken
der Kanüle in das Magnetfeld des MACS®-Separators wurde die Kanüle durch Waschen
mit 500 µl 1x Dilution-Puffer für die Messung vorbereitet. Um mögliche Zellverklumpungen
zu entfernen, wurde die Zellsuspension über ein 30 µl Nylonnetz gefiltert. Dieser Filter
wurde zuvor mit 1x Dilution-Puffer befeuchtet. Im Anschluss daran wurde die
Zellsuspension auf die Kanüle gegeben. Nachdem die Zellen die Kanüle passiert hatten,
wurde die Kanüle dreimal mit 500 µl 1x Dilution-Puffer gewaschen. Nach erfolgtem
Waschvorgang wurde die Kanüle aus dem MACS®-Separator entfernt und auf ein 5 ml
Proberöhrchen aufgesteckt. Auf die Kanüle wurde 1 ml 1x Dilution-Puffer pipettiert, der mit
Hilfe des aufgesetzten Stempels durch die Kanüle gepresst wurde. Um eine höhere
Anreicherungsrate zu erreichen, wurden die aufgefangenen Zellen erneut auf eine frisch
präparierte positive Selektionskanüle gegeben. Im Anschluss daran wurde die Kanüle mit
2x 500 µl 1x Dilution Puffer und 1x 500 µl PBS gewaschen. Zuletzt wurde 1 ml PBSLösung auf die Kanüle pipettiert. Mittels aufgesetztem Stempel wurde die PBS-Lösung
durch die Kanüle gedrückt und in einem 5 ml Proberöhrchen aufgefangen. Nach diesem
Vorgang standen die Zellen zur Durchflusszytometrie zu Verfügung.
2.5.
Durchflusszytometrischer Tumorzellnachweis
2.5.1
Prinzip der Durchflusszytometrie
Bei der Durchflusszytometrie, die auch als FACS-Methode (fluorescence activated cell
sorting) bezeichnet wird, lassen sich parallel mehrere Eigenschaften von gelösten
Partikeln, wie z.B. Chromosomen, Protozoen aber auch Blutzellen, bestimmen. Die
Erkennung der physikalischen und molekularen Eigenschaften sowie die Zellzählung erfolgen während die Einzelzellen - in einer Kapillare gebündelt - den Laserstrahl passieren.
Dabei lassen sich 5 – 7 Eigenschaften pro Zelle detektieren, sodass eine detaillierte
Korrelation mit dem Krankheitsprozess sowie mit weiteren klinischen Markern möglich ist
(37). Mittels von Fluoreszenz markierten Antikörpern lassen sich verschiedene Zelleigenschaften detektieren. Diese spezifische Antikörperbindung stellt daher auch das
Grundprinzip der Durchflusszytometrie dar. Nach Depletion der kernlosen Zellen kann die
Messung der Einzelzellsuspension erfolgen. Hierfür sind verschiedene Verfahren
30
einsetzbar:
Entweder
die
Anreicherung
der
mononukleären
Zellen
durch
Dichtegradientenzentrifugation oder die Lysierung der Erythrozyten mittels spezifischen
Lysedetergenzien. Durch die hydrodynamische Fokussierung wird der Abstand der
Einzelzellen in der Kapillare vergrößert, so dass diese den Laserstrahl einzeln passieren
und damit als einzelne Zelle gemessen werden können. Beim Passieren des Laserstrahls
werden die Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffs auf ein höheres Energieniveau gehoben.
Kehren diese Elektronen auf ihr ursprüngliches Energieniveau zurück, wird Energie in
Form von Photonen frei. Diese Photonen besitzen eine größere Wellenlänge, was mit
einer geringeren Energie einhergeht. Die Energie des emittierten Fluoreszenzlichtes lässt
sich mittels eines Photodetektors messen. Die Wellenlängendifferenz zwischen Absorption
und Emission wird als „Stoke´s-Shift“ bezeichnet. Die Höhe der Energie korreliert dabei mit
der Anzahl der gebunden fluoreszierenden Antikörper pro gemessene Zelle. Zusätzlich
wird von der Sammeloptik auch die Lichtbeugung und Lichtstreuung als optisches Signal
aufgenommen. Das Vorwärtsstreulicht (FSC) wird entlang der Achse des einfallenden
Lichtes gemessen und ist proportional zur Zelloberfläche, respektive der Zellgröße. Das
Seitwärtsstreulicht (SSC) wird dagegen in einem Winkel von 90° zu dem einfallenden Licht
gemessen und ist proportional zur Zellkomplexität oder der Zellgranularität.
Abb. 9:
FSC/SSC Darstellung; lysiertes Vollblut
Granulozyten
Monozyten
Lymphozyten
Die verschieden Fluoreszenzsignale werden aufgrund ihrer Wellenlängen mit Hilfe von
Spiegeln und Filtern voneinander getrennt und von den Photomultipliern gemessen. Die
Fluoreszenzen werden wiederum im Winkel von 90° zu dem einfallenden Licht gemessen.
31
Bei dem von uns verwendeten FACS Calibur® Durchflusszytometer der Firma Becton and
Dickinson besteht die Möglichkeit, mittels zwei Lasern 3 – 4 Fluoreszenzen gleichzeitig zu
messen. Die beiden Laser haben Wellenlängen von 488nm (15 mW) und 635 nm (10
mW). Durch die Elektronik werden die detektierten optischen Signale proportional in
elektronische Signale umgewandelt. Mittels eines digital-analog-Wandlers werden die
elektronischen Spannungsimpulse in digitale Werte konvertiert, die am angeschlossenen
Computer weiter verarbeitet werden können.
2.5.2
Prinzip der Messung
Die ausgeschwemmten Tumorzellen gelten als epithelialen Ursprungs (22) und wurden
von uns mit einem FITC konjugiertem Pan-Cytokeratin Antikörper der Firma Dako,
Hamburg angefärbt. Dieser Antikörper markiert Epithelgewebe vom einfachen glandulären
Epithel bis hin zum stratifizierten squamösen Epithel. Der MNF 116 Klon detektiert dabei
spezifisch folgende Cytokeratine: 5, 6, 8, 17 und wahrscheinlich 19. Da es sich bei den
Cytokeratinen um intrazellulär gelegene Filamente handelt, wurde – wie bereits oben
beschrieben – eine Lysierung der Blutzellen mit 70 % Ethanol durchgeführt. Des Weiteren
wurde parallel die Anfärbung mit CD 45 und CD 14 durchgeführt. Das CD 45-Antigen ist
eine Tyrosin-Phosphatase, die auch als „leukocyte common antigen (LCA)“ bezeichnet
wird. CD 45 wird auf allen Zellen mit hämatologischem Ursprung exprimiert. Zu diesen
Zellen zählen die Erythrozyten, die Leukozyten, die Thrombozyten sowie deren Vorstufen.
CD 45 wird für die Aktivierung von T- und B-Zellen benötigt. Abhängig vom
Differenzierungsgrad der Zellen unterscheidet man mindestens fünf verschiedene
Isotypen. Das CD 14-Antigen ist ein Rezeptor mit hoher Affinität für den Komplex aus
Lipopolysachariden (88) und LPS-binding protein (LBP). Das CD 14-Antigen ist stark auf
Monozyten und Makrophagen im peripheren Blut, anderen Körperflüssigkeiten und
verschiedenen Geweben, wie Milz und Lymphknoten, exprimiert. Zur spezifischen
Anfärbung der Monozyten wurde der PE konjugierte CD 14-Antikörper der Firma Becton
and Dickinson gewählt.
32
2.5.3
Material
Instrumente:
Durchflusszytometer FACS Calibur™ der Firma Becton and Dickinson
FACS-Station™
FACS-Loader
Software:
Auswertprogramm CellQuest™ Pro der Firma Becton and Dickinson
Zubehör:
Destilliertes Wasser
PBS
CaliBrite™Beads
FACSRinse™
FACSFlow™
5 ml FALCON®-Röhrchen
Folgende Antikörper wurden für die Messungen eingesetzt:
Tabelle 6:
Verwendete Antikörper
Bezeichnung
Anti-Human
Cytokeratin
5/6/8/17/18
Fluorochrom
FITC
CD 45
PerCP
CD 14
PE
Simultest
Control γ1/γ2a
FITC/PE
Firma
Klon
Konzentration
Dako
Cytomation MNF 116
Denmark
BD
Bioscience
San Jose,
USA
BD
Bioscience
San Jose,
USA
BD
Bioscience
San Jose,
USA
25µg/ml
50µg/ml
33
2.5.4
Methodik
Für jede Patientenprobe wurden jeweils zwei Probenröhrchen verwendet. In Röhrchen 1,
das als Messröhrchen fungierte, wurden 10 µl FITC-konjugierter Cytokeratin-Antikörper,
10 µl PerCP-konjugierter CD 45-Antikörper sowie 10 µl PE-konjugierter CD 14-Antikörper
zugegeben. Röhrchen 2 diente als Negativkontrolle und wurde entsprechend mit 10 µl
FITC-konjugierten IgG1/IgG2a-Antikörpern bestückt. Beide Probenröhrchen wurden im
Anschluss bei 4°C im Kühlschrank für eine Dauer von 30 Minuten inkubiert. Nach einer erneuten Zugabe von 2 ml PBS-Lösung wurden die Probenröhrchen vorsichtig vermischt
und für weitere drei Minuten bei 500g zentrifugiert.
Der Überstand wurde mit einer Pipette bis auf 50 µl abgenommen und anschließend mit
500 µl PBS-Lösung aufgefüllt. Der Probeansatz wurde kurz durchgemischt und stand nach
diesem Vorgang für die durchflusszytometrische Messung zur Verfügung.
Geräte-Einstellungen:
Die Kalibrierung des FACS Calibur™ Durchflusszytometers erfolgte mittels LatexPartikeln, so genannter Calibrite-Beads, der Firma Becton and Dickinson. Die Spannungsund Verstärkereinstellungen wurden für den Detektor FSC und SSC linear gewählt, FL1 –
FL4 wurden hingegen logarithmisch verstärkt. Der Schwellenwert wurde so eingestellt,
dass sich die Zellpopulationen klar abgrenzen ließen. Der FSC-Schwellenwert wurde so
gewählt, dass die lysierten Erythrozyten und der Zellschrott (Debris) von der Datenaufnahme ausgeschlossen wurden. Bei der Anwendung von mehreren Fluoreszenzen
musste eine Kompensation durchgeführt werden, wodurch eine Korrektur der spektralen
Überlappung erfolgte. Die zu messende Zellzahl wurde im Vorfeld nicht fest definiert,
sondern anhand der Zellzahl in der zu messenden Probe individuell festgelegt. Die
Flussrate wurde auf den „High-Modus“ eingestellt.
2.5.5
Positivkontrolle
Zur Positivkontrolle wurde die Tumorzelllinie SKBR 3 gewählt. Diese wurde uns freundlicherweise von der Firma Miltenyi Biotec zur Verfügung gestellt. Die Tumorzellen wurden
mit Methylenblau angefärbt und in einer Neubauerzählkammer ausgezählt. Anschließend
wurden die Tumorzellen ins Vollblut eines gesunden Probanden gegeben. Eine genaue
34
Darstellung der zugegebenen Zellzahlen ist für die beiden Methoden im Ergebnisteil
dargestellt.
2.5.6
Negativkontrolle
Für die Negativkontrolle wurden jeweils 30 ml Blut von gesunden Probanden entnommen.
Die Negativkontrollgruppe setzte sich aus jeweils fünf männlichen und fünf weiblichen
Probanden zusammen. Das Durchschnittsalter der Männergruppe lag bei 32 Jahren, das
der Frauengruppe bei 43 Jahren. Bei keinem der untersuchten Probanden bestand zu
diesem Zeitpunkt eine nachgewiesene Tumorerkrankung. Die Probanden wurden über die
Studie aufgeklärt und stimmten der Verwendung ihrer Daten zu Studienzwecken zu.
III.
Ergebnisse
3.1
OncoQuick®
Um eine Zelle als disseminierte Tumorzelle identifizieren zu können, wurden folgende
Kriterien definiert: Cytokeratin-positiv, CD 45-negativ sowie CD 14-negativ (1;3;23).
Bei der Messung wurde jede Zelle als separates Event erfasst und als Datensatz
archiviert. Dies ermöglichte jederzeit einen Zugriff auf die gespeicherten Daten, die
dadurch für eine mehrfache Auswertung mittels Multi-Gating-Strategie zur Verfügung
standen. Bei der Auswertung wurde jedes einzelne Event als Dot-Point in einem
Koordinatensystem dargestellt.
In Abb. 10 sind alle gemessen Ereignisse wie folgt dargestellt: Die Abszisse markiert den
FSC-Height, was dem Forward-Scatter entspricht. Dieser gibt – nach rechts aufsteigend –
die relative Größe der gemessen Zellen wieder. Auf der Ordinate ist der SSC-Height
aufgetragen, der als Sideward-Scatter die relative Granularität und interne Komplexität der
Zellen widerspiegelt. Dementsprechend können die gemessen Zellen eingeteilt werden:
Ganz links im Bereich von 200 – 400 liegen die Lymphozyten, rechts davon die Monozyten
im Bereich von 400 – 600. Ganz links im Bereich von 600 – 800 stellen sich die
Granulozyten dar.
35
FACS Auswertung:
Abb. 10:
Darstellung FSC/SSC
Granulozyten
Monozyten
Lymphozyten
Auf der Abszisse werden nach rechts ansteigend die Cytokeratin-positiven Ereignisse
dargestellt. Auf der Ordinate werden ansteigend die CD 45-positiven Ereignisse skizziert.
Die auf der X-Achse aufgetragenen Fluoreszenz-Ereignisse werden der Intensität nach
rechts ansteigend erfasst: Je weiter rechts ein Ereignis dargestellt wird, umso mehr
fluoreszierende Antikörper wurden auf der Oberfläche gebunden. Die Tumorzellen, die die
geforderten Kriterien erfüllen, müssen daher im rechten unteren Quadranten (lower right)
des Koordinatensystem liegen. (Siehe Abb. 11 und Abb. 13.)
Zur Durchführung der Positivkontrolle wurden Tumorzellen der Brustkebszelllinie SKBR 3
ins Blut eines gesunden Probanden gegeben. Dies geschah bei der high control im
Verhältnis 1:500. Die low control wurde bei einem Verhältnis Tumorzellen zu Blutzellen
von lediglich 1:25000 durchgeführt.
36
Abb. 11:
Darstellung Anti-Cytokeratin/CD 45
Abb. 12:
Darstellung FSC/SSC
(OncoQuick® vor Anreicherung)
In Abb.11 und Abb. 12 ist die Dot-Plot-Analyse der Messung vor Anreicherung mittels
OncoQuick® dargestellt.
Abb. 13:
Darstellung Anti-Cytokeratin/CD 45
Abb. 14:
Darstellung FSC/SSC
(OncoQuick® nach der Anreicherung)
Abb. 13 und Abb. 14 zeigt die Tumorzellen nach der Anreicherung, die sich - wie zuvor
erwartet - im rechten unteren Quadranten darstellen. Durch das OncoQuick® - Kit der
Firma Greiner Bio-One konnte in der high control eine Anreicherung um den Faktor 3,6
37
erreicht werden. In der low control hingegen konnte nur eine Anreicherung um den Faktor
2 erzielt werden.
Tabelle 7:
Anreicherungsfaktor OncoQuick®
high control
low control
Vor Anreicherung
0,08
0,01
Nach Anreicherung
0,29
0,02
In Abb. 15 ist auf der Ordinate logarithmisch die CD 45 PerCP-Fluoreszenz gegen den
SSC-Height auf der Abszisse aufgetragen. Die CD 45-negativen Zellen wurden durch ein
Gate auswählt und erscheinen in der Darstellung „grün“.
Abb. 15:
Darstellung SSC/CD 45
38
Abb. 16:
Darstellung Anti-Cytokertain/CD 45
Abb. 17:
Darstellung FSC/SSC
Durch die Darstellung des SSC gegen den FSC können die Zellen anhand ihrer
Eigenschaften, wie z.B. Zellgranularität und Zellgröße, identifiziert werden. Die in Abb. 16
gegateten Cytokeratin positiven und CD 45-negativen Zellen erscheinen in Abb. 17 als
„rote“ Dot-Points im Koordinatensystem.
Patientendarstellung:
Abb. 18:
Darstellung SSC/CD 45
39
Abb. 19:
Darstellung Anti-Cytokeratin/CD 45
Abb. 20:
Darstellung FSC/SSC
In Abb. 18 bis Abb. 22 sind die Ergebnisse eines Patienten mit metastasiertem Mammakarzinom dargestellt. Deutlich zu erkennen ist die geringere Zellzahl im Vergleich mit Abb.
13 und Abb. 14 der Positivkontrolle. Die Cytokeratin positiven Zellen liegen im Bereich
zwischen 0 und 400.
Abb. 21:
Darstellung Anti-Cytokeratin/CD 14
Abb. 22:
Darstellung CD 14/CD 45
In den Abb. 21 und Abb. 22 sind die unterschiedlichen Fluoreszenzen nochmals
gegeneinander aufgetragen. Diese Multi-Gating-Strategie ermöglicht ein eindeutiges
Identifizieren der Zellen.
40
Als Negativkontrolle wurde ein FITC konjugierter IgG1/IgG2a-Antikörper der Firma Becton
and Dickinson verwendet. Der verwendete IgG1/IgG2a-Antikörper wird eingesetzt, um die
Quadrantenmarker
für
die
beiden
Fluoreszenzen
um
die
ungefärbte
negative
Lymphozyten Population zu setzten. Dabei kann gleichzeitig die nicht antigenspezifische
Antikörperbindung, die durch FC-Rezeptoren verursacht wird, abgeschätzt werden.
Abb. 23:
Darstellung IgG1/IgG2
In Abb. 23 ist die Negativkontrolle dargestellt. Auf der Abszisse werden aufsteigend die
IgG1 positiven Ereignisse, auf der Ordinate die IgG2 positiven Ereignisse dargestellt.
41
Tabelle 8:
Nr.
Risiko
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
High
High
Intermediate
Intermediate
Intermediate
High
Intermediate
M1
Intermediate
Intermediate
Intermediate
High
High
M1
M1
Intermediate
High
Intermediate
Intermediate
M1
High
Intermediate
High
M1
Intermediate
M1
M1
Intermediate
M1
M1
High
Intermediate
High
M1
M1
High
High
High
High
Intermediate
M1
High
High
High
M1
M1
Intermediate
High
High
High
Darstellung des Patientenkollektivs:
Alter Cytokeratin T
54
76
59
63
57
45
50
57
47
61
61
61
72
63
54
78
76
67
59
77
80
64
64
42
71
71
69
61
76
69
74
63
65
49
77
67
68
38
54
74
60
44
68
59
64
50
66
42
44
42
0,03
0,21
0,02
0,08
0,36
0,04
0,05
0,06
0,13
0,01
0,02
2,18
0,08
0,32
0,07
0,01
0,03
0,97
0,10
0,03
0,18
0,03
0,13
0,10
1,19
0,05
0,01
0,03
0,02
0,05
0,06
0,02
0,02
0,09
1,95
0,01
0,12
0,01
0,08
0,02
0,04
14,44
0,02
0,01
0,01
0,27
0,01
0,02
0,13
0,01
2
2
1
4
2
1
2
3
2
is
1
1
2
2
NA
2
1
1
1
2
2
1
2
1
1
2
2
1
4
4
4
2
2
4
1
1
2
NA
2
1
3
1
2
4
2
2
1
NA
3
NA
N LKAnzahl M
3
3
0
1
1
3
0
3
1
0
0
NA
3
0
0
1
3
0
0
1
2
0
1
0
0
3
1
0
3
1
2
0
3
3
0
3
1
NA
1
0
2
3
3
NA
1
0
1
NA
2
NA
18
26
0
1
1
9
0
10
1
0
0
NA
16
0
0
2
4
0
0
2
5
0
2
0
0
18
2
0
9
2
5
0
12
10
0
9
2
NA
1
0
6
29
13
NA
2
0
3
NA
8
NA
Metastasen
G
0
NA
2
0
NA
2
0
NA
2
0
NA
2
0
NA
2
0
NA
3
0
NA
2
1
Leber
3
0
NA
3
0
NA
2
NA
NA
3
0
NA
2
0
NA
3
1
Knochen
2
1
Knochen, Lunge
3
0
NA
3
0
NA
3
0
NA
2
0
NA
3
1
Knochen
3
0
NA
3
0
NA
2
0
NA
2
1
Knochen, Leber
3
0
NA
3
1
Leber
2
1
Pleura,Peritoneum
3
0
NA
2
1
Knochen, Pleura
2
1
Knochen
2
0
NA
2
0
NA
3
0
NA
3
1 Lunge,Pleura,sonstige 2
1
Leber
2
0
NA
2
0
NA
3
NA
NA
2
0
NA
2
0
NA
3
1
Knochen, Leber, LK 3
0
NA
2
0
NA
3
NA
NA
3
1 Leber,Knochen,Lunge 3
1
Knochen
2
0
NA
2
NA
NA
3
0
NA
3
NA
NA
2
HER2 L.H.
positiv negativ
0
0
0
0
0
NA
0
NA
0
0
0
NA
1
1
0
NA
0
NA
1
0
1
NA
1
NA
1
0
1
NA
0
NA
0
NA
1
NA
1
NA
1
NA
0
NA
1
0
1
1
1
NA
1
0
1
NA
1
0
0
NA
0
NA
0
0
0
NA
0
NA
1
0
0
0
0
0
0
NA
0
0
1
0
0
NA
1
NA
0
NA
1
0
0
NA
NA
NA
0
0
1
0
0
NA
0
NA
0
0
1
0
0
NA
42
Erläuterung zur Tabelle:
Nr.
Patientennummer
Risiko
Risikogruppen Einteilung nach der Konsensuskonferenz St. Gallen
Alter
Patientenalter
Cytokeratin
Anzahl der Cytokeratin positiven Zellen in Prozent
T
Tumorstatus (T1 - T4)
N
Lymphknotenbefall (N0 – N1)
LK Anzahl
Anzahl der befallenen Lymphknoten
M
Metastasierung (M0 – M1)
Metastasen
Lokalisation der Metastasen
G
Tumorgrading (G1- G3)
Her2 positiv
Her2/neu Gen Überexpression (1 – 0)
L.H.negativ
Lymphangiosis / Hämangiosis negativ (1 – 0)
Die Angabe der Cytokeratinwerte erfolgt in Prozent. Die nicht metastasierten Patientinnen
wurden nach ihrem Metastasierungsrisiko in drei Gruppen klassifiziert. Die Einteilung
erfolgte in Anlehnung an die St.Gallen Konsensuskonferenz in drei Risikogruppen:
Niedriges Risiko:
Patienten ohne Lymphknotenbefall, bei denen alle die nachfolgenden Bedingungen erfüllt
sind: Tumorgröße ≤ 2 cm, Tumorgrad 1, keine Gefäßinvasion des Tumors und keine
Überexpression des Her2/neu-Gens. Des Weiteren müssen die Patienten das 35.
Lebensjahr erreicht haben.
Mittleres Risiko:
Patienten ohne Lymphknotenbefall, bei denen mindestens eine der nachfolgenden
Bedingungen erfüllt ist: Tumorgröße ≤ 2 cm oder Tumorgrad 2-3 oder stattgefundene
Gefäßinvasion des Tumors oder Überexpression des Her2/neu Gens oder Patientenalter <
35 Jahre.
43
Hoch Risiko:
Patienten
mit
Lymphknotenbefall
(mindestens
1-3
befallene
Lymphknoten)
und
nachgewiesener Überexpression des Her2/neu Gens. Oder Patienten mit vier oder mehr
befallenen Lymphknoten (43).
M1:
Patienten mit nachgewiesener Metastasierung.
In Tabelle 9 ist ein Auszug des Patientenkollektivs aus Tabelle 8 dargestellt. Es handelt
sich hierbei um Patienten mit erhöhten Cytokeratinwerten. Dargestellt sind alle Patienten,
bei denen mehr als 0,15% Cytokeratin positive Zellen nachgewiesen werden konnten.
Tabelle 9:
Nr.
Risiko
2
High
5 Intermediate
12
High
14
M1
18 Intermediate
21
High
25 Intermediate
35
M1
42
High
46
M1
Darstellung der OncoQuick® Patienten mit erhöhten Cytokeratinwerten
Alter Cytokeratin T
76
57
61
62
67
80
71
77
44
50
0,21
0,36
2,18
0,32
0,97
0,18
1,19
1,95
14,44
0,27
N LKAnzahl M
2 3
2 1
1 NA
2 0
1 0
2 2
1 0
1 0
1 3
2 0
26
1
NA
0
0
5
0
0
29
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
Metastasen
G
NA
NA
NA
Knochen
NA
NA
NA
Leber
NA
Knochen
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
HER2 L.H.
positiv negativ
0
0
0
0
1
NA
1
NA
1
NA
1
0
1
NA
0
NA
0
NA
0
NA
Die Tumorcharakteristiken der oben aufgeführten Patienten sind in Tabelle 10 dargestellt.
44
Tabelle 10:
Patientenkollektiv mit erhöhten Cytokeratinwerten
Histologische Auswertung / Tumorcharakteristiken
Durchschnittsalter
Anzahl der Patienten
65
n=10
Histologischer Typ
n
%
Grad
n
%
Duktales Karzinom
4
40
G1
0
0
Lobuläres Karziom
1
10
G2
8
80
Duktales Karzinom/DCIS
4
40
G3
2
20
Duktales/Lobuläres CA
1
10
NA
0
0
Muzinöses Karzinom
0
0
NA
0
0
T-Status
n
%
N-Status
n
%
T1
5
50
N0
5
50
T2
5
50
N1
1
10
T3
0
0
N2
1
10
T4
0
0
N3
2
20
NA
0
0
NA
1
10
M-Status
n
%
Her 2/neu
n
%
M0
7
70
Negativ
5
50
M1
3
30
Positiv
5
50
NA
0
0
NA
0
0
Ploidie
n
%
St.Gallen Klassifikation
n
%
anaeuploid
5
50
low
0
0
diploid
1
10
intermediate
3
30
tetraploid
1
10
high
4
40
multiploid
1
10
Metastasiert
3
30
NA
2
20
NA, not analyzed
45
Für eine Reihe der Tumoren sind die in der Tabelle aufgelisteten biologischen Faktoren
bekannt.
Darstellung der Gen Chip Analyse
Tabelle 11:
Nr. ERpositiv
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
13
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
1
NA
NA
NA
22
63
NA
80
10
5
NA
39
NA
87
NA
NA
NA
NA
199
95
82
NA
20
NA
309
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
49
NA
NA
NA
20
NA
NA
NA
NA
OncoData IHC
IHC
IRS
IHC
OncoData IHC
IHC
IRS
IHC
Allred
PRpositiv
Allred
Base Score
Score Remmele Score
Base Score
Score Remmele Score
60
100
100
100
80
75
35
NA
0
0
0
0
70
NA
0
100
NA
NA
0
NA
0
NA
0
60
55
60
NA
NA
NA
100
100
12
NA
0
0
100
40
100
90
0
0
NA
NA
0
100
NA
95
100
0
20
240
400
500
300
160
300
70
NA
0
0
0
0
210
NA
0
300
NA
NA
0
NA
0
NA
0
120
55
120
NA
NA
NA
300
300
24
NA
0
0
400
40
300
180
0
0
NA
NA
0
500
NA
380
400
0
20
4
5
5
5
5
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
5
NA
0
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
0
4
4
4
NA
NA
NA
5
5
3
NA
0
0
5
4
5
5
0
NA
NA
NA
0
5
NA
5
5
NA
3
7
8
8
7
7
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
7
NA
0
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
0
6
5
6
NA
NA
NA
7
7
5
NA
0
0
8
5
7
7
0
NA
NA
NA
0
8
NA
8
8
NA
4
3
4
4
4
3
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
3
NA
0
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
0
3
3
3
NA
NA
NA
4
4
2
NA
0
0
4
2
4
4
0
NA
NA
NA
0
4
NA
4
4
NA
2
9
12
12
8
6
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
6
NA
0
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
0
6
3
6
NA
NA
NA
8
8
4
NA
0
0
12
2
8
8
0
NA
NA
NA
0
12
NA
12
12
NA
2
501
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
7
NA
NA
NA
20
337
NA
120
10
7
NA
15
NA
5
NA
NA
NA
NA
454
135
12
NA
5
NA
78
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
39
NA
NA
0
98
NA
NA
NA
NA
75
95
1
100
50
2
0
NA
1
0
0
0
65
NA
0
98
NA
NA
0
NA
0
NA
0
95
70
10
NA
NA
NA
100
20
11
NA
0
0
100
0
100
90
0
0
NA
NA
0
0
NA
60
80
0
12
300
285
3
500
100
6
0
NA
1
0
0
0
260
NA
0
196
NA
NA
0
NA
0
NA
0
380
280
30
NA
NA
NA
200
40
33
NA
0
0
400
0
500
360
0
0
NA
NA
0
0
NA
240
160
0
24
5
5
1
5
4
NA
NA
NA
1
NA
0
NA
4
NA
0
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
0
5
5
2
NA
NA
NA
5
3
3
NA
0
0
5
0
5
5
0
NA
NA
NA
0
0
NA
4
5
NA
3
8
7
3
8
6
NA
NA
NA
2
NA
0
NA
7
NA
0
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
0
8
8
4
NA
NA
NA
7
5
5
NA
0
0
8
0
8
8
0
NA
NA
NA
0
0
NA
7
7
NA
5
3
4
1
4
2
NA
NA
NA
1
NA
0
NA
3
NA
0
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
0
4
3
1
NA
NA
NA
4
2
2
NA
0
0
4
0
4
4
0
NA
NA
NA
0
0
NA
3
3
NA
2
9
8
2
12
4
NA
NA
NA
1
NA
0
NA
9
NA
0
NA
NA
NA
0
NA
0
NA
0
12
9
2
NA
NA
NA
8
4
4
NA
0
0
12
0
12
12
0
NA
NA
NA
0
0
NA
9
6
NA
4
46
Tabelle 12:
Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
Darstellung der Gen Chip Analyse
HER2
Genkopien Her2.Chr.17
positiv
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
1
0
1
0
NA
0
1
0
0
0
1
0
2,60
3,00
2,30
2,01
NA
2,70
16,60
3,00
NA
21,80
6,79
25,00
8,20
12,40
NA
2,00
NA
21,20
24,70
1,70
39,00
11,50
NA
27,90
19,74
335,00
NA
3,00
2,00
NA
3,97
NA
2,60
2,10
3,82
4,00
NA
NA
21,80
NA
17,80
2,00
NA
3,00
6,60
2,00
2,19
2,00
26,20
NA
1,00
1,03
1,00
1,00
NA
1,31
5,80
1,40
NA
5,30
1,13
12,50
2,30
3,80
NA
1,00
NA
8,30
8,00
1,30
6,60
5,10
NA
14,90
6,66
64,00
NA
1,00
1,00
NA
1,06
NA
1,20
1,10
1,06
1,00
NA
NA
10,39
NA
17,20
1,00
NA
1,15
1,21
1,10
1,01
1,00
8,10
NA
Fish
Art
p53
neg
neg
neg
neg
NA
neg
pos
neg
NA
pos
pos
pos
pos
NA
NA
neg
NA
pos
pos
neg
pos
pos
NA
pos
pos
pos
NA
neg
neg
NA
neg
NA
neg
neg
neg
neg
NA
NA
pos
NA
pos
neg
NA
neg
neg
NA
neg
neg
pos
NA
duktales CA/DCIS
lobuläres CA/DCIS
duktales CA
duktales CA/DCIS
duktales CA/DCIS
duktales CA
duktales CA/DCIS
lobuläres CA
duktales CA/DCIS
duktales CA/DCIS
duktales CA
duktales CA/DCIS
duktales CA/DCIS
duktales/lobuläres CA
duktales CA
duktales/lobuläres CA
duktales CA/DCIS
duktales CA/DCIS
duktales CA/DCIS
lobuläres CA
duktales CA/DCIS
duktales CA/DCIS
duktales CA/DCIS
duktales CA/DCIS
duktales CA
duktales CA/DCIS
lobuläres CA
duktales CA
duktales CA
duktales CA
duktales CA/DCIS
duktales CA
duktales CA
duktales CA
duktales CA
duktales CA/DCIS
duktales CA/DCIS
muzinös
duktales CA
duktales CA
duktales/lobuläres CA/DCIS
duktales CA
NA
duktales CA/DCIS
duktales CA/DCIS
duktales CA
duktales CA/DCIS/LCIS
duktales CA
duktales CA/DCIS
duktales CA
20
3
0
0
10
0
100
NA
0
0
100
0
90
NA
70
0
98
0
35
0
10
0
100
0
0
NA
NA
0
0
0
0
0
25
0
0
0
0
0
100
100
35
0
NA
100
0
8
0
0
0
40
Histo
Histo
mutiert codon bcl2
score
score
40
3
0
0
10
0
NA
NA
0
NA
500
NA
360
NA
210
294
0
NA
NA
20
NA
400
0
0
NA
NA
0
0
0
0
0
NA
0
0
0
0
0
400
300
NA
NA
NA
400
0
24
0
0
NA
40
0
0
0
0
NA
0
0
NA
1
0
NA
0
1
NA
NA
0
NA
0
0
0
0
0
NA
1
1
0
NA
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
NA
1
1
0
0
NA
0
NA
1
0
NA
0
NA
0
0
0
0
NA
0
0
NA
79
0
NA
NA
248
NA
NA
NA
NA
0
NA
NA
0
0
NA
134
152
0
NA
0
138
0
0
0
282
0
0
0
0
NA
220
238
0
0
NA
0
NA
72
0
NA
0
NA
100
95
100
100
90
90
50
NA
0
0
0
0
0
NA
100
90
NA
0
0
70
0
90
0
70
35
NA
70
NA
60
90
90
100
100
0
0
100
0
100
90
90
0
20
NA
0
100
40
100
100
0
100
500
285
300
500
180
NA
NA
80
0
NA
0
NA
0
NA
400
NA
NA
0
NA
NA
0
NA
0
NA
35
NA
140
NA
NA
180
180
300
NA
0
0
400
0
400
180
180
NA
NA
NA
0
300
80
300
300
NA
400
47
Tabelle 13:
Darstellung der Gen Chip Analyse
Nr. Ki67 Mib SPhase Ploidie
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
30
NA
40
NA
30
26
51
5
90
51
60
15
70
12
NA
12
22
50
40
4
80
22
NA
45
NA
60
35
12
4
30
NA
NA
80
50
15
NA
85
NA
NA
NA
50
16
NA
NA
NA
5
NA
12
50
NA
NA
30
NA
25
NA
NA
NA
10
NA
NA
60
38
NA
NA
90
NA
NA
NA
NA
10
NA
NA
NA
NA
60
NA
NA
NA
NA
NA
40
40
NA
NA
NA
13
NA
35
40
70
NA
NA
NA
95
NA
15
6
NA
NA
45
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
2,31
NA
NA
NA
NA
6,2
NA
NA
NA
NA
1,07
NA
NA
NA
NA
NA
0,9
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
EGF
Rez
diploid
0
aneuploid
0
diploid
0
diploid
0
NA
0
aneuploid
0
aneuploid
0
diploid
NA
aneuploid
3+
aneuploid
0
NA
3+
diploid
0
diploid
0
multiploid
0
NA
2+
diploid
0
aneuploid
0
aneuploid
0
NA
0
aneuploid
0
aneuploid
0
diploid
NA
NA
1+ bis 2+
NA
0
aneuploid
0
multiploid
0
aneuploid
0
diploid
0
aneuploid
0
diploid
0
aneuploid
0
aneuploid
0
aneuploid
0
NA
2+
NA
3+
aneuploid
0
aneuploid
0
NA
0
tetraploid
0
aneuploid
3+
NA
0
tetraploid
0
NA
NA
diploid
0
multiploid
2+
aneuploid
0
diploid
0
NA
0
aneuploid
0
NA
0
uPa PAI-1 CEA CA15.3 Eralpha PR Erbeta Ps2
5,3
2,8
2,5
5,4
5,9
4,3
5,9
NA
5,1
NA
NA
NA
1,8
1,6
2
0,5
3,1
3
NA
2,8
9,27
3,5
NA
8,2
NA
59
1,2
NA
6,8
NA
3,6
4,6
1,4
1,3
2,92
12,9
10,4
3,2
9,2
6,6
NA
2,1
NA
NA
6,7
NA
2,5
NA
2,2
NA
41,4
1,8
29,2
0,5
6,3
84,3
2,3
19,9
1,7
21,6
8,7
17
NA
NA
46
172,5 NA
NA
NA
NA
2,2
NA
NA
33,8
5
6,8
11,6
87,4
1
2,7
6,6
7,2
NA
17,9
1,3
NA
NA
106
6,2
19,18 3,5
80,2
NA
NA
NA
11,9
NA
NA
2,1
743
151
33,9
9,9
NA
NA
15,3
NA
NA
1,5
25
5,8
15,5
2,4
8,2
4,8
241,8 NA
17,99 NA
84,9
1,6
32,6
NA
19,4
1,6
51,6
NA
45,9
1
NA
5,9
10
NA
NA
NA
NA
2,2
24,6 36,86
NA
NA
2,5
1,2
NA
NA
19,4
0,8
NA
0,7
21,6
12,7
6,8
25,9
25,2
NA
2400
NA
NA
27,4
NA
23,8
90,4
52
13,4
NA
7,2
NA
41,2
9,8
NA
NA
NA
19,4
262
242,3
NA
NA
39
15,7
11,8
269
NA
NA
22,5
NA
10
NA
8,3
13,5
NA
NA
22,9
135,9
NA
18
NA
10
22,5
35,1
59,1
86,5
49,3
NA
58,9
70
NA
15,4
NA
NA
NA
35,1
NA
0,5
100
NA
16,1
NA
NA
6,2
NA
24,6
30
NA
51,3
59,3
NA
NA
NA
49,3
21,1
93,2
19,6
11,2
44,4
24,2
NA
37,9
6,8
NA
NA
NA
NA
90,1
NA
NA
NA
15,6
NA
80,5
80,7
32,4
90,2
NA
53,1
5,4
NA
31,8
NA
NA
NA
60,2
NA
7
100
NA
24,2
NA
NA
39,4
NA
59,6
77,2
NA
34,2
80,9
NA
NA
NA
39,9
50,6
65
18,2
39,5
83,9
23,9
NA
72,9
17,4
NA
NA
NA
NA
15,7
NA
NA
NA
9,9
NA
54
42,5
21,5
25
NA
28,1
27,2
NA
80,2
NA
NA
NA
54
NA
26,1
93,9
NA
80,8
NA
NA
31,4
NA
80,2
86,5
NA
93,7
26,1
NA
NA
NA
43,7
42,7
17,1
40,1
69,2
67,5
NA
31,7
71,8
NA
NA
NA
NA
20,2
NA
NA
NA
64,5
NA
61,5
69
61,5
62,8
NA
89,3
24,5
NA
42,1
NA
NA
NA
48,3
NA
22,7
97,1
NA
23,5
NA
NA
61,7
NA
47,7
76,8
NA
41
61,5
NA
NA
NA
29,9
55,6
57,2
23,5
33,9
41,5
28,4
NA
76,6
22,3
NA
NA
NA
NA
88,4
NA
NA
NA
73,8
NA
48
Tabelle 14:
Darstellung der Gen Chip Analyse
Nr. AIB BCRP LRP MDR1 MRP1 HER1 HER2 HER4 Survivin bcl2 VEGF UPA PAI1
1 NA
2 NA
3 NA
4 NA
5 NA
6 NA
7 NA
8 NA
9 NA
10 NA
11 NA
12 NA
13 NA
14 NA
15 NA
16 99,2
17 NA
18 NA
19 NA
20 NA
21 NA
22 NA
23 NA
24 NA
25 NA
26 NA
27 NA
28 NA
29 NA
30 NA
31 NA
32 NA
33 36,8
34 NA
35 NA
36 NA
37 NA
38 NA
39 NA
40 NA
41 NA
42 NA
43 NA
44 NA
45 NA
46 NA
47 NA
48 NA
49
50 NA
NA
NA
NA
NA
NA
77,5
92,9
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
95,5
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
73
NA
62,5
NA
NA
NA
NA
NA
NA
69,3
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
82,1
NA
NA
NA
14,1
NA
NA
NA
NA
NA
NA
73,2
66,9
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
99,1
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
71,3
NA
91,3
NA
NA
NA
NA
NA
NA
78,8
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
89
NA
NA
NA
27,5
NA
26,8
47,1
44,9
31,9
NA
96,5
87,4
NA
42,5
NA
NA
NA
64,1
NA
4,6
NA
NA
63,6
NA
NA
14
NA
91,9
21,6
NA
21,1
15,3
NA
NA
NA
31,7
30,8
90,4
6
46
22,5
12,5
NA
16
31,1
NA
NA
NA
NA
32,2
NA
NA
NA
34,8
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
99,1
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
54,4
NA
87,2
NA
NA
NA
NA
NA
NA
50
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
57,9
NA
NA
NA
10,3
NA
56
21,2
56
22,3
NA
94,4
69,7
NA
95
NA
NA
NA
56
NA
20,7
85,3
NA
34,9
NA
NA
78,2
NA
76,6
63
NA
68,8
21,4
NA
NA
NA
59,1
22,3
68,8
54,2
78,2
36,1
19,2
NA
58,7
37,9
NA
NA
NA
NA
23,2
NA
NA
NA
14,5
NA
47,9
48
69,2
49,6
NA
98,9
84,6
NA
47,3
NA
NA
NA
89,3
NA
2,7
72,6
NA
92,9
NA
NA
97
NA
88,9
97
NA
99,4
48,2
NA
NA
NA
49,3
92,9
27,7
47,3
69,4
20,8
96,7
NA
89,2
3,2
NA
NA
NA
NA
76,2
NA
NA
NA
90,6
NA
44,9
62
97,5
64,3
NA
98,7
27,5
NA
34,5
NA
NA
NA
25,8
NA
5,7
90,4
NA
18,2
NA
NA
25,4
NA
43,2
63,7
NA
34,4
79,1
NA
NA
NA
47,3
36,8
78,5
24,7
18
32,8
17,6
NA
46,6
18,2
NA
NA
NA
NA
95,4
NA
NA
NA
33,8
NA
28,3
31
50
35,2
NA
NA
NA
NA
83,3
NA
NA
NA
71,8
NA
86,8
76,3
NA
71,1
NA
NA
72,9
NA
47
95,3
NA
69,6
74,5
NA
NA
NA
76,8
33,9
72,6
47
51,2
45,6
68,9
NA
34,1
55,3
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
58
59,4
58
42,8
NA
100
40,3
NA
38,6
NA
NA
NA
58
NA
39,7
87,1
NA
57,7
NA
NA
21
NA
57
68
NA
49
70
NA
NA
NA
42,7
41,4
89,3
11,2
21,2
40,5
38,2
NA
22,4
41,7
NA
NA
NA
NA
84,3
NA
NA
NA
4,6
NA
31,7
35,3
31,7
60,8
NA
51,6
49,6
NA
89,8
NA
NA
NA
31,7
NA
0,3
96,5
NA
55,5
NA
NA
32,9
NA
29,7
56,9
NA
98,8
15,2
NA
NA
NA
4,7
17,5
66,7
89,8
33
25,7
78,8
NA
91,5
17,5
NA
NA
NA
NA
80
NA
NA
NA
34,8
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
98
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
84,5
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
49
Tabelle 15:
Darstellung der Gen Chip Analyse
Nr. MAD XPAC GADD KI67 CyclinE1 DDB
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
NA
NA
NA
NA
NA
NA
28,2
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
88,8
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
89
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
22,3
NA
15,3
21,3
32,4
16,1
NA
35,6
75
NA
51
NA
NA
NA
32,4
NA
4,4
81,5
NA
15,3
NA
NA
7,8
NA
51
43,7
NA
78,9
11,5
NA
NA
NA
15,7
14,7
75,5
29,7
7,9
9,9
29,3
NA
26,3
2,3
NA
NA
NA
NA
62,6
NA
NA
NA
15,3
NA
78,7
20,6
78,7
52,4
NA
93,9
76,9
NA
46,7
NA
NA
NA
78,7
NA
7,2
96,8
NA
47,8
NA
NA
48,3
NA
46,7
92,3
NA
98,9
49,7
NA
NA
NA
52,4
80,4
63,1
77,6
94,7
44
46,5
NA
80,5
21,6
NA
NA
NA
NA
79,7
NA
NA
NA
16,3
NA
23,8
40,2
58,3
38
NA
31,5
15,6
NA
88,7
NA
NA
NA
75,3
NA
76,3
NA
NA
75,3
NA
NA
57,1
NA
74,7
67,1
NA
44,6
40,4
NA
NA
NA
62,1
28,3
NA
37,2
13,9
70,6
74,6
NA
61,2
42,3
NA
NA
NA
NA
79,5
NA
NA
NA
12,2
NA
49,2
29,6
68,2
17,7
NA
76,7
43,7
NA
82,8
NA
NA
NA
92
NA
69,5
NA
NA
68,1
NA
NA
68,7
NA
82,9
71,1
NA
67,2
29,7
NA
NA
NA
55
31,2
NA
26,1
50
25,4
66,8
NA
16,3
31,4
NA
NA
NA
NA
66,8
NA
NA
NA
34,4
NA
27,4
31,8
10
15,7
NA
NA
NA
NA
49,7
NA
NA
NA
52,6
NA
0,8
NA
NA
52,3
NA
NA
11,3
NA
49,7
43,6
NA
95,3
12,9
NA
NA
NA
60,8
35,4
NA
74,6
29,4
37,4
49,3
NA
35,7
14,7
NA
NA
NA
NA
87,4
NA
NA
NA
26
NA
VitD3
COX2 Tubulin
Rez
93,2
11,8
17,1
51,7
NA
85,6
89,5
NA
63,2
NA
NA
NA
93,2
NA
25,9
46,3
NA
80,2
NA
NA
64,4
NA
79,4
46,5
NA
59,3
8,5
NA
NA
NA
12,9
82,6
5,3
98,5
80,5
61,9
16,8
NA
20,4
27,7
NA
NA
NA
NA
85,3
NA
NA
NA
19,5
NA
52,3
52,8
69,7
21,1
NA
92,6
92,6
NA
94,2
NA
NA
NA
69,7
NA
94,6
92,6
NA
35,3
NA
NA
35,3
NA
94,2
95,3
NA
85,4
53,2
NA
NA
NA
53,8
53,4
61,5
80,8
69,9
49,2
51,9
NA
81,9
35,7
NA
NA
NA
NA
62,8
NA
NA
NA
25,2
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
83,9
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
70,8
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
50
Erläuterungen zur Tabelle:
Nr.
Patientennummer
ERpositiv
Östrogen Rezeptor positiv
Allred
Score zur Beurteilung der Rezeptorpositivität von Tumorzellen
IRSRemmele
Immunreaktiver Score nach Remmele und Stegner
PRpositiv
Progesteron Rezeptor positiv
Art.
Art des Karzinoms
p53
Tumorsuppressorgen
codon
Sequenz von Nukleotiden
bcl2
B-cell lymphoma 2
Ki67
Proliferationsmarker
Mib
Proliferationsmarker
SPhase
Synthesephase
Ploidie
Anzahl der Chromosomensätze
EGFRez
EGF Rezeptor
uPA
Urokinase Plasminogen Aktivator
PAI-1
Plasminogen Aktivator Inhibitor 1
CEA
carcinoembryonales Antigen
CA15.3
Tumormarker
Eralpha
Östrogen Rezeptor alpha
PR
Progesteron
Erbeta
Östrogen Rezeptor beta
Ps2
Protein - Transkription unter der Kontrolle des Östrogenrezeptors
AIB
Onkogen
BCRP
breast cancer resistance protein
LRP
lung resistance protein
MDR1
multidrug resistance gene 1
HER 1/2/4
Her 1/2/4 Rezeptor
Survivin
Apoptose-inhibierenden Protein
VEGF
vascular endothelial growth factor
MAD
mothers against decapentaplegic homolog
XPAC
Xeroderma pigmentosum, complementation group A
GADD
growth arrest and DNA-damage-inducible
51
CyclinE1
kontrolliert den G1-S-Übergang im Zellzyklus
DDB
damaged DNA-binding protein
VitD3Rez
Vitamin D3 Rezeptor
COX2
Cyclooxygenase 2
Tubulin
Bausteine der Mikrotubuli
Die Ergebnisse der Negativkontrolle sind in Tabelle 16 aufgeführt.
Tabelle 16:
Darstellung der Negativkontrolle
Nr.
Geschlecht
Alter
Cytokeratin
1
2
3
4
5
Mittelwert
w
w
w
w
w
76
48
17
24
49
43
0,00
0,04
0,05
0,08
0,36
0,106
m
m
m
m
m
21
52
27
27
31
32
0,00
0,06
0,29
0,07
0,00
0,084
37
0,095
6
7
8
9
10
Mittelwert
Mittelwert
52
3.2
MACS®
Bei der Auswertung der Messungen, die nach der MACS® - Methode durchgeführt
wurden, erfolgte die Auswertung analog des Patientenkollektivs der OncoQuick® –
Methode.
Abb. 24:
Darstellung Anti-Cytokertain/CD 45
Abb. 25:
Darstellung FSC/SSC
Vor der Anreicherung mittels MACS®
Abb. 26:
Darstellung Anti-Cytokertain/CD 45
Abb. 27:
Darstellung FSC/SSC
Nach der Anreicherung mittels MACS®
53
In Abb. 24 bis Abb. 27 ist die Positivkontrolle dargestellt. Für die Positivkontrolle wurde
eine Blutprobe eines gesunden Probanden mit der Tumorzelllinie SKBR3 versetzt. Die
„high-control“ Probe enthielt eine Gesamtzahl von 2500x 104 Blutzellen, zu der 5 x 104
Tumorzellen zugegeben wurden, was einem Verhältnis 1:500 entspricht. Bei der “lowcontrol“ Probe wurden in die gleiche Anzahl von Blutzellen wie bei der „high-control“ Probe
1x 103 Tumorzellen gegeben, was einem Verhältnis von 1:25000 entspricht. In Abb. 24
und Abb. 26 sind die Cytokeratin-positiven und CD 45-negativen Tumorzellen durch ein
Gate markiert worden und in Abb. 25 und Abb. 27 als rote Wolke dargestellt. In dieser
Darstellung wurde der SSC gegen den FSC aufgetragen. Die Tumorzellen stellen sich
hierbei, wie aufgrund ihrer morphologischen Eigenschaften (Granularität und Größe)
erwartet, im rechten oberen Quadranten dar.
Tabelle 17:
Anreicherungsfaktor MACS®
high control
Low control
Vor Anreicherung
0,24%
0,01%
Nach Anreicherung
82%
8%
Bei der „high-control“ konnte eine 341-fache Anreicherung durch die MACS® – Methode
erreicht werden. Bei der „low-control“ war eine maximale Anreicherung mit einem Faktor
von 800 zu erreichen.
Patientenschaubild:
Abb. 28:
Darstellung SSC/CD 45
54
In Abb. 28 ist die Messung einer Patientin mit metastasiertem Mammakarzinom
dargestellt. Auf der Ordinate ist der SSC-Height gegen den auf der Abszisse
aufgetragenen FSC-Height dargestellt.
Abb. 29:
Darstellung Anti-Cytokertain/CD 45
Abb. 30:
Darstellung FSC/SSC
Darstellung der Cytokeratin-positiven und CD 45-negativen Tumorzellen im Dot-Plot.
Tabelle 18:
Darstellung des Patientenkollektivs:
Nr.
Risiko
Alter in
Jahren
1
2
3
4
5
M1
High
M1
High
M1
62
69
53
42
42
Cytokeratin T N Anzahl LK M Metastasen G
4,23
3,74
10,84
3,00
0,59
Erläuterung zur Tabelle siehe oben.
1
2
2
1
1
2
1
3
0
5
1
29
0
1
Lunge
0
NA
1
LK, Lunge
0
NA
1 Knochen, Leber
2
2
2
2
3
HER2 L.H.
positiv negativ
1
0
0
0
1
NA
NA
1
NA
0
55
IV.
Diskussion
Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer Methode zur Detektion von zirkulierenden
epithelialen Tumorzellen von Patienten mit Brustkrebs, um in Zukunft die Prognose der
Patienten besser einschätzen und therapeutische Entscheidungen frühzeitig treffen zu
können.
4.1
Tumorzellmarkierung mit Hilfe von fluoreszierenden Antikörpern gegen
Cytokeratin, CD 45 und CD 14
Die Tumorzellenidentifizierung mittels FACS-Analyse erfolgt nach dem Prinzip der
spezifischen Antikörperbindung. Dabei binden mit Fluorochromen gekoppelte Antikörper
an spezifische Oberflächenmoleküle der Zielzellen.
Nachstehende Kriterien wurden für den positiven Tumorzellennachweis definiert: Positives
Bindungsverhalten gegenüber dem Cytokeratin-Antikörper, jedoch keine Bindung durch
den CD 45- und CD 14-Antikörper (1;3;23).
Durch den CD 45-Antikörper können die Tumorzellen von der Leukozytenpopulation
unterschieden werden (23). Erfüllt eine Zelle alle der geforderten Eigenschaften, kann sie
eindeutig als Cytokeratin-positive Tumorzelle identifiziert werden.
Fehlermöglichkeiten:
Werden die verwendeten Antikörper in erhöhten Konzentrationen zu den Patientenproben
zugegeben, besteht die Möglichkeit, dass es zu einer unspezifischen Antikörperbindung
kommt. Hierbei binden die spezifischen Antikörper nicht nur an die gesuchten Zielzellen,
sondern völlig unwillkürlich an Zellen oder Zellfragmente. Durch eine unspezifische
Antikörperbindung kann es zu einer falsch-positiven Bewertung der Zellen kommen.
Die
Zellvitalität
stellt
eine
weitere
Einflussmöglichkeit
bei
der
unspezifischen
Antikörperbindung dar. Avitale Zellen nehmen durch die normalerweise undurchlässige
Membranschranke unspezifisch Antikörper in ihr Zytoplasma auf. Mittels einer Anfärbung
durch Propidiumiodid können diese avitale Zellen von der vitalen Zellpopulation
abgegrenzt werden.
56
In einigen der untersuchten Blutproben, die nach der OncoQuick® - Methode untersucht
wurden, fanden sich Zellen, die die oben genannten Kriterien erfüllten, damit eine Zelle als
Cytokeratin-positive Tumorzelle bewertet werden kann. Allerdings entsprachen die
markierten Zellen nicht der erwarteten Größe der Tumorzellen. Die als Cytokeratin-positiv
bewerteten Events lagen nicht wie erwartet im Bereich zwischen 400 – 800, in dem auch
die Monozyten, bzw. Granulozyten liegen. Sie waren vielmehr im Bereich zwischen 0 bis
400, in dem die Lymphozyten angesiedelt sind, zu finden. Somit lagen die Zellen in dem
Bereich, in dem sich die Zelltrümmer darstellen. Diese Zelltrümmer, die als Zelldebris
bezeichnet werden, können z. B. durch eine Lysierung der Erythrozyten entstehen.
Die Größe der Tumorzellen eines Patienten kann stark variieren. Die Schwankungsbreite
liegt zwischen <4 µm bis zu >30 µm (1). Trotzdem sollten sich die Tumorzellen im
erwarteten Bereich der Lymphozyten oder größer darstellen. Choesmel et al. fordern
sogar eine Mindestgröße von 12 µm, um eine Zelle als Tumorzelle zu identifizieren (17).
Rückschlüsse durch eine direkte Ableitung der gemessenen Zellgröße der sich in vitro
befindlichen Tumorzelllinie SKBR 3 auf die Tumorzellen in vivo ist generell nicht möglich.
Unklar ist, ob es sich bei diesem Phänomen um eine unspezifische Anfärbung von
Zelldebris handelt, oder ob die Tumorzellen durch mechanische Kräfte in Zelltrümmer
zerteilt
werden.
Dies
könnte
im
Rahmen
der
FACS-Analyse
während
der
hydrodynamischen Fokussierung geschehen. Dabei muss geklärt werden, ob die auf die
Zellen einwirkenden Kräfte tatsächlich in der Lage sind, Zellagglomerate aufzulösen bzw.
Zellen in Zelltrümmer zu zerreißen.
Zu einer unspezifischen Antikörperbindung an Zellen epithelialen Ursprungs kann es
möglicherweise im Rahmen der Venenpunktion kommen. Beim Durchstechen der Haut
kann es zu einem Ausstanzen der epithelialen Zellen und somit zu einer Kontamination
der Blutprobe kommen (6). Um den eventuellen Einfluss dieser Störgröße zu eliminieren,
empfiehlt es sich daher, die ersten entnommenen 5 ml nach der Punktion zu verwerfen.
Als weitere Einflussfaktoren sind eine lange Inkubationszeit und eine erhöhte
Umgebungstemperatur (> 25°C) zu nennen, die ebenfalls zu einer unspezifischen
Antikörperbindung führen können.
57
Eine Überprüfung der in Tabelle 8 und Tabelle 9 aufgeführten Patienten mit erhöhten
Cytokeratinwerten zeigte, dass es bei den als „positiv“ bewerteten Ereignissen um falschpositive Ergebnisse handelt. Durch eine Analyse mittels Multi-Gating-Strategie konnte
nachgewiesen werden, dass die als Cytokeratin positiv gewerteten Ereignisse nicht der
geforderten Größe von Tumorzellen entspricht. Unklar ist, welcher Mechanismus zu
diesem Ergebnis geführt hat. In jedem Fall sind die vermeintlich positiven Ergebnisse der
OncoQuick® - Methode nicht verwertbar. Somit lassen sich keine Korrelationen zwischen
erhöhten Cytokeratinwerten und dem TNM-Status der Patienten herstellen. Rückschlüsse
auf bestimmte Genexpressionsmuster bei erhöhten Cytokeratinwerten verbieten sich
daher ebenfalls. Demgegenüber sind die Ergebnisse, die mit der MACS® - Methode
gewonnen wurden, als valide einzustufen.
Neben der Detektion mittels FACS-Analyse kommen noch weitere Nachweisverfahren zur
Detektion von epithelialen Zellen zum Einsatz. So schließen Beitsch et al. eine
Untersuchung
mittels
Cytospin
an
die
FACS-Analyse
an.
Hierbei
wurde
ein
Anticytokeratin-Antikörper als epithelialer Zellmarker und ein Anti-MUC-1-Antikörper
verwendet.
Durch die Cytospin-Untersuchung und die sich daran anschließende lichtmikroskopische
Auswertung konnten die Tumorzellen anhand ihrer Morphologie eindeutig identifiziert
werden. Die Identifikation der Zellen anhand ihrer Morphologie ist ein Vorteil gegenüber
der FACS-Analyse, deren Aussagekraft sich alleinig auf das Bindungsverhalten
fluoreszenzmarkierter Antikörper stützt (6).
Die Immuncytochemie bietet die Möglichkeit, die zirkulierenden Tumorzellen durch eine
mehrfache Anfärbung oder mittels der Kombination aus Immunfärbung und Fluoreszenz in
Situ Hybrisierung zu detektieren (77).
58
Vergleich der Tumorzellanreicherungssysteme OncoQuick® und MACS®
4.2
Von der „International Society of Cell Therapy“ wurden nachstehende Kriterien für eine
optimale standardisierte Tumorzell-Nachweismethode definiert:
•
Hohe Spezifität und Sensitivität
•
Reproduzierbarkeit
•
Robustheit
•
Objektive Auswertung
•
Möglichkeit zur automatisierten Analyse
•
Quantifizierung der Tumorlast
•
Charakterisierung der Tumorzellen
•
Nachgewiesene klinische Signifikanz
Im Folgenden wird nun auf die beiden Tumorzellanreicherungssysteme eingegangen und
deren Aspekte beleuchtet.
Neue Anreicherungstechniken wie das OncoQuick® - System und die immunomagnetischen Verfahren können die Sensitivität immuncytochemischer Verfahren
erhöhen. Dabei können sie helfen, einheitliche Daten über die klinische Signifikanz von
disseminierten Tumorzellen zu erhalten (78).
Sowohl für das OncoQuick® -Anreicherungssystem der Firma Greiner Bio-One als auch
für das MACS® - System der Firma Miltenyi besteht die Möglichkeit, Blut als Ausgangsmaterial zur Anreicherung der Tumorzellen zu verwenden.
Bereits im Jahre 1961 konnte durch I. Zeidman et al. der Nachweis von malignen Zellen im
peripheren Blut erbracht werden (34;110).
Alternativ kann als Ausgangsmaterial Knochenmark oder eine Lymphknotenbiopsie
verwendet werden (60;101). Die einfache Probengewinnung bei der Entnahme von
Vollblut ist jedoch als klarer Vorteil gegenüber den aufgeführten Alternativen zu nennen
(78). Hinzu kommt, dass wiederholte Messungen zur Verlaufskontrolle ohne wesentliche
Belastung des Patienten möglich sind.
59
Beide Methoden sind auf den Nachweis zirkulierender Tumorzellen ausgelegt,
unterscheiden sich aber hinsichtlich ihrer Anreicherungsprinzipien grundlegend.
So erfolgt die Anreicherung mittels OncoQuick® - Kit der Firma Greiner Bio-One über eine
Dichtegradientenzentrifugation. Hierbei werden die Zellen anhand ihrer Größe und Dichte
aufgetrennt. Tumorzellen kommen dabei innerhalb der Interphase zu liegen, welche für die
weitere Untersuchung entnommen wird. Die Firma Greiner Bio-One gibt in ihrem
Datenblatt für das OncoQuick® - Kit eine Anreicherungsrate von 3,8 log Stufen bei einer
Standardabweichung von 0,08 an. Diese Angaben beziehen sich auf Spiking-Experimente,
bei denen eine definierte Anzahl Zellen einer Tumorzelllinie zu einer Vollblutprobe
gemischt wurden.
Balic et al. vergleichen in ihrer Studie das Cell Search System mit dem OncoQuick® - Kit,
wobei man als Ergebnis festhalten kann, dass das Cell Search System im Vergleich die
sensitivere Methode zum Nachweis von Tumorzellen ist (3).
So hat auch die hier vorliegende Arbeit das Ziel, ein geeignetes System zu Anreicherung
von disseminierten Tumorzellen zu etablieren. Wie oben beschrieben, wurde das Blut von
50 Patienten mittels OncoQuick® - Kit auf zirkulierende Tumorzellen untersucht.
Dabei zeigten sich bei den untersuchten Patienten vereinzelte Cytokeratin positive und CD
45-negative Zellen. Eine klar abgrenzbare Wolke ließ sich in der FACS-Analyse nicht
darstellen. Durch eine erweiterte Multi-Gating-Strategie konnten die als Cytokeratin-positiv
und CD 45-negativ bewerteten vermeintlichen Tumorzellen in einen Dot Plot, bei dem die
Zellgröße gegen die Granularität aufgetragen wird, dargestellt werden. Dabei zeigte sich,
dass es sich bei den angefärbten vermeintlichen Tumorzellen wahrscheinlich um
Zelldebris handelt. Dies könnte, wie oben beschrieben, auf eine unspezifische Antikörperbindung zurückzuführen sein. Diese Tatsache veranlasste uns dazu, ein weiteres
Tumorzellanreicherungssystem auf seine Effektivität zu prüfen.
Bei dem eingesetzten MACS® - Verfahren der Firma Miltenyi Biotec handelt es sich um
ein magnet-aktiviertes Zellanreicherungssystem. Hierbei werden die gesuchten Zielzellen
mit Antikörpern inkubiert, welche direkt an superparamagnetische Microbeads gekoppelt
sind.
Bei der Positiv-Selektion werden die magnetgekoppelten Zellen in speziellen Säulen,
welche in sich in einem starken Magnetfeld befinden, angereichert. Zellen, die nicht an
60
magnetgekoppelte Antikörper gebunden wurden, passieren die Säule und werden
verworfen.
Bei der Negativ-Selektion werden im Gegensatz zur Positiv-Selektion die Zielzellen nicht
markiert. Sie passieren die Säule und werden zur weiteren Untersuchung aufgefangen.
Alle anderen Zellen werden dagegen mit Antikörpern gegen hämatologische Zellen
inkubiert und werden dadurch beim Passieren der Säule zurückgehalten.
Durch den Einsatz von immunomagnetischen Verfahren konnte der Nachweis von
zirkulierenden Tumorzellen durch die Anreicherung der nur in sehr kleiner Anzahl im Blut
vorkommenden Tumorzellen deutlich verbessert werden (99).
In Experimenten, bei denen 5 bis 5.000 Tumorzellen ins Blut von gesunden Probanden
gegeben wurde, konnten Wiederfindungsraten von 57,7% bei einer Standardabweichung
von 16,9% erreicht werden. Die Tumorzellen konnten mittels magnet-aktivierter Technik
10,477-fach bei einer Standardabweichung von 4.242 angereichert werden (61).
Sowohl das OncoQuick® - als auch das MACS® - Verfahren bietet die Möglichkeit, die
angereicherte Zellfraktion mittels FACS-Analyse, Immuncytochemie oder FluoreszenzMikroskopie, weiter zu untersuchen.
Die von uns untersuchte Kohorte setzte sich aus fünf Probanden zusammen. Bei drei der
fünf Patienten konnten Cytokeratin-positive CD 45-negative Zellpopulation mittels FACSAnalyse abgegrenzt werden. Die Größe und Granularität der Zellen wurde, wie oben
beschrieben, in der Darstellung SSC gegen FSC überprüft. Die Zellen stellten sich mit
einer Größe von 400 - 800 im Bereich der Monozyten bzw. Granulozyten dar, was sich mit
den geforderten Kriterien und Merkmalen für disseminierte Tumorzellen vereinbaren lässt.
Ziel weiterer Studien könnte es daher sein, Cytokeratin positive Zellen im peripheren Blut
bei Patientinnen mit Brustkrebs nachzuweisen, um Rückschlüsse auf bestimmte
Expressionsmuster innerhalb des routinemäßig ermittelten Gen Chips treffen zu können.
Eine weitere mögliche Einsatzmöglichkeit wäre der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen zum Monitoring von neoadjuvanten bzw. adjuvanten Chemotherapien.
61
Da beide Protokolle sehr umfangreich sind, unterscheiden sie sich kaum vom
Zeitaufwand. Das MACS® - Verfahren verlangt durch den Einsatz von magnetgekoppelten
Antikörpern einen größeren Materialaufwand, da im Gegensatz zum OncoQuick® - Kit ein
spezieller Magnet inklusive Adapter und spezielle Magnetsäulen benötigt werden.
Bei beiden Verfahren ist es im Verlauf des Messprotokolls erforderlich, die in der
Interphase angereicherten Tumorzellen abzunehmen. Es besteht die Möglichkeit, dass es
zum Zellverlust kommt, wenn die Interphase nicht komplett abgenommen wird. Dieser
vermeintliche Zellverlust steht im Zusammenhang mit den variierenden Zellzahlen bei der
FACS-Analyse. Trotz gleichem Ausgangsvolumen der entnommen Blutprobe von 30 ml
wurden Schwankungen der gemessen Zellzahlen von 2.500 bis 250.000 Zellen pro
analysierter Probe beobachtet. Des Weiteren kann ein Zellverlust durch die häufigen
Zentrifugationsschritte auftreten.
Die Zahl der zirkulierenden Tumorzellen kann stark variieren und liegt bei metastasiertem
Brustkrebs zwischen 5 und 20.000 Zellen pro 7,5 ml Blut, was 6 bis 25.000 Zellen pro 2 x
106 mononukleären Blutzellen entspricht (24).
Somit lässt sich zusammenfassend sagen, dass die erfolgreiche Tumorzellanreicherung
und Detektion nur mittels MACS® -Verfahren möglich war.
4.3
Detektion Cytokeratin positiver Zellen mittels FACS-Methode
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie gelingt es im Vergleich zur Mikroskopie, gleichzeitig
mehrere optische Eigenschaften der Zellen zu quantifizieren. Die parallele Erfassung der
zellulären Eigenschaften wird hierbei durch den Einsatz zweier Laser ermöglicht.
So können z. B. die Zellgröße und die Zellkomplexität / Zellgranularität im Vorwärts- bzw.
Seitwärtsstreulicht mittels Lichtbeugung bzw. durch Lichtbrechung und Reflexion bestimmt
werden. Als weitere Parameter können die spezifischen Fluoreszenzen bestimmt werden.
So können die gesuchten Zielzellen über eine spezifische Bindung von fluoreszierenden
Antikörpern sicher detektiert werden. Es gilt zu beachten, dass sowohl bei gesunden
Patienten als auch bei Patienten mit nachgewiesener Brustkrebskrankung sowohl im
Knochenmark als auch im Blut häufig Cytokeratin-positive Zellen nachgewiesen werden
können. Der Einsatz von multiplen hämatopoetischen Zellmarkern im Rahmen der
62
Immunfluoreszenz erlaubt die genaue Differenzierung der Cytokeratin-positiven Zellen
anhand ihres Ursprungs (55).
Um die Tumorzellen klar von den hämatologischen Zellen abgrenzen zu können, verwendeten wir eine dreifache Färbung: Anti-Cytokeratin zur Detektion epithelialer Tumorzellen, CD 45 als Lymphozytenmarker und CD 14 zur Abgrenzung der Monozyten (83).
Erfüllt eine Zelle alle geforderten Merkmale, kann sie, sofern sich die Zellgröße und
Zellgranularität im geforderten Bereich bewegt, als Tumorzelle interpretiert werden.
Das FACS CALIBUR™ Gerät der Firma Becton and Dickinson bietet den Vorteil, große
Zellzahlen in vergleichsweise kurzer Zeit zu messen. So liegt die maximale Messgeschwindigkeit bei 4.000 Zellen pro Sekunde. Die Analyse mittels Flowzytometrie ist
daher als zeit- und personalsparende Methode einzustufen.
Die FACS-Analyse der angereicherten Tumorzellen ist sehr sensitiv. So konnten Simpson
et al. in einem Modellversuch, bei dem die Tumorzelllinie CAMA zu mononukleären Zellen
gegeben wurde, eine Sensitivität für die Detektion mittels Flowzytometrie von einer
Tumorzelle in 200.000 mononukleären Zellen erreichen (96).
Als Nachteil der Flowzytometrie ist die fehlende morphologische Kategorisierung der
Tumorzellen zu nennen, da diese den klinische Nutzen des Nachweises von isolierten
Tumorzellen im Knochenmark verbessert (72).
Zirkulierende epitheliale Zellen sind extrem selten bei gesunden Probanden oder
Patienten mit „gutartigen“ Erkrankungen nachzuweisen.
Mittels CellSearch™ System wurden jeweils 7,5 ml Blut von 344 Probanden, die entweder
völlig gesund waren oder bei denen der Nachweis einer „gutartigen“ Erkrankung bestand,
untersucht. Dabei konnten nur bei einem von 344 Probanden (0,3%) mehr als zwei
zirkulierende epitheliale Zellen im Blut nachgewiesen werden. Jedoch gelingt der
Nachweis bei vielen metastasierten Karzinomen mit einer großen Spannbreite an
nachgewiesenen Tumorzellen (1).
Allard et al. untersuchten 2.183 Blutproben von 964 Patienten mit metastasierten
Karzinomen. Es konnten durchschnittlich 60 zirkulierende Tumorzellen bei einer
63
Standardabweichung von 693 Zellen in 7,5 ml Blut nachgewiesen werden. Der Nachweis
von mehr als zwei Tumorzellen gelang bei den verschieden Karzinomentitäten in
folgenden Prozentzahlen: In 57% bei Patienten mit Prostatakarzinom, 37% bei Patienten
mit Brustkrebs, 37% bei Ovarialkarzinomen, 30% bei kolorektalen Karzinomen, 26% bei
Lungentumoren und in 26% bei anderen Krebserkrankungen (1).
Die molekulare Detektion ist als weiteres Verfahren zum Nachweis Cytokeratin-19-mRNA
positiver Zellen im peripheren Blut mittels RT-PCR zu nennen. Die Detektionsraten von
Cytokeratin-19-mRNA-positiven Zellen im Knochenmark bzw. im Blut bei Patienten mit
„frühem“ bzw. metastasiertem Brustkrebs liegen bei 63% / 30% respektive 74% / 52%
(98).
Eine weitere Alternative zum Nachweis zirkulierender Tumorzellen im peripheren Blut
bietet der immunhistochemische Nachweis.
Bei der Immunhistologie werden Antigen-Strukturen, die sich z. B. auf der Oberfläche von
Tumorzellen befinden, analysiert. Hierbei werden spezifische Antikörper eingesetzt, die an
Farbkomplexe gekoppelt sind.
Die histologischen Präparate können mittels Lichtmikroskopie ausgewertet werden. Neben
der
konventionellen
lichtmikroskopischen
Untersuchung
können
hierbei
auch
automatische Bildanalysesysteme wie z. B. die ACIS Chroma Vision, eine digitale
mikroskopische Analyse der Firma Chroma Vision Medical Systems Inc., San Juan
Capistrano, CA, verwendet werden. ACIS ist ein bildgebendes System zur Detektion
seltener zellulärer Ereignisse. Hierbei wird die lichtmikroskopische Analyse von immuncytochemischen Ausstrichen mittels computergestützter Auswertung und der Möglichkeit
zur Archivierung gekoppelt.
Die automatische Bildanalyse ist zum Nachweis von Mikrometastasen genauso
leistungsfähig wie die konventionelle Lichtmikroskopie (5). Der Einsatz von automatisierten
Systemen zur mikroskopischen Auswertung von immunhistochemischen Präparaten bietet
einen klaren Zeitvorteil bei der Untersuchung der Präparate (108). Die Reproduzierbarkeit
der Analyse kann durch den Einsatz einer automatisierten Auswertung durch Reduktion
der Subjektivität gesteigert werden. Durch die maschinelle Auswertung entfallen auch die
hohen Anforderungen an den Pathologen im Bezug auf eine große Erfahrung in der
Auswertung der Tumorzellen (4;9;54;65;66).
64
Klein et al. untersuchten 525 Knochenmark-, Lymphknoten- und Blutproben von 474
Patienten mit Brust-, Prostata- und gastrointestinalen Tumoren auf disseminierte Tumorzellen mittels Immunhistochemie. In 14% der Proben konnten zwei oder mehr Tumorzellen
nachgewiesen werden, deren genetische Organisation weiter untersucht wurde. Hierbei
stellte sich eine hohe genetische Divergenz bei der minimalen Resterkrankung,
vorzugsweise auf der Ebene von chromosomalen Ungleichgewichten, dar. Somit konnte
gezeigt werden, dass frühe disseminierte Tumorzellen genetisch sehr instabil sind (53).
Zusammenfassend haben wir zwei unterschiedliche Methoden zum Nachweis von
Tumorzellen erprobt. Die OncoQuick® - Methode erwies sich hierbei nach unserer
Auffassung als ungeeignet.
Mit der MACS® - Methode gelang es zuverlässig zirkulierende Tumorzellen anzureichern
und nachzuweisen. Mit der MACS® - Methode kann eine 10.000-fache Zellanreicherung
erreicht werden, wodurch es möglich ist, eine Tumorzelle in einer Population von 103 bis
107 Leukozyten nachzuweisen.
Wir werden in Zukunft mit dieser Methode Patienten mit primärem Brustkrebs
untersuchen, um zusätzliche prognostische Informationen zu gewinnen und Korrelationen
mit der Tumorbiologie herzustellen.
4.4
Cytokeratinnachweis – Konsequenzen für Therapie und Überleben
Cytokeratin-positive Tumorzellen können sowohl bei primären als auch bei metastasierten
Brustkrebserkrankungen erfolgreich nachgewiesen werden (2;6;39). Im Vergleich zu
Patienten ohne Mikrometastasen im Knochenmark, haben Patienten mit nachgewiesenen
Mikrometastasen im Knochenmark Tumore, die größer sind und ein höheres
histologisches Grading aufweisen. Des Weiteren werden bei diesen Patienten häufiger
Lymphknotenmetastasen und Hormonrezeptor-negative Tumore beobachtet (P<0.001 für
alle Variablen) (14). Die Zahl der nachweisbaren Tumorzellen steigt auch mit dem
Ausmaß der Erkrankung im Tumorstaging (13).
Die Absiedlung von zirkulierenden Brustkrebszellen im Knochenmark weist auf eine
systemische Tumorzellstreuung hin und lässt die Entstehung von Metastasen in
relevanten Organen wie Knochen, Lunge und Leber vorhersagen (78). Zirkulierende
Tumorzellen im Blut und Knochenmark scheinen ein nützliches Hilfsmittel zum frühen
65
Tumornachweis zu sein. Der Nachweis ist möglicherweise von prognostischem Nutzen in
der postchirurgischen Nachsorge (1).
Wichtige Prognosefaktoren bei Brustkrebserkrankungen sind:
•
Alter
•
Tumorgröße
•
Lymphknotenstatus
•
Histologischer Typ des Tumors
•
Pathologische Gradeinteilung
•
Hormonrezeptorstatus (103)
Braun et al. konnten durch ihre Studie an 4.703 Patienten, die sich über einen
Beobachtungszeitraum von 10 Jahren erstreckte, belegen, dass das Vorhandensein von
Mikrometastasen ein signifikanter prognostischer Faktor in Hinsicht auf ein schlechtes
Gesamtüberleben und brustkrebsspezifisches Überleben (univariate Mortalitätsrate 2,15
P<0,001 und 2,44 P<0,001) ist. Dies gilt auch für das krankheitsfreie Überleben und das
fernmetastasenfreie Überleben über einen Beobachtungszeitraum von 10 Jahren
(Inzidenzrate 2,13 P<0,001 und 2,33. P<0,001) (14).
Auch Wiedswang et al. bewerten den Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen als
unabhängigen negativen Prädiktor für fernmetastasenfreies Überleben und brustkrebsspezifisches Überleben (107).
Diel et al. bewerten die Detektion von Tumorzellen als unabhängigen prognostischen
Faktor für fernmetastasenfreies Überleben und Gesamtüberleben. Der Tumorzellnachweis
wird hier als die beste Alternative zur Prognoseeinteilung im Vergleich zum axillären
Lymphknotenstatus, des Tumorstatus bzw. des Tumorgrading bewertet (29).
Die Präsenz von Mikrometastasen im peripheren Blut nach adjuvanter Chemotherapie ist
zur Vorhersage von Rezidiven und brustkrebsbedingtem Tode besser geeignet als die
klassischen Faktoren bei Hochrisiko-Brustkrebspatienten, die eine Hochdosis Chemotherapie erhalten. Die Verwendung von Gen-Chips zum Nachweis von Mikrometastasen
scheint im Vergleich zu den klassischen Ansätzen, bei denen nur ein oder zwei Gene
untersucht wurden, exakter zu sein (82).
66
Der Nachweis zirkulierender Tumorzellen steht auch in direktem Zusammenhang mit
einem fortschreitenden Krankheitsverlauf und erhöhten Tumormarkerkonzentrationen bei
Patienten mit metastasiertem Brustkrebs (71).
Somit lässt sich zusammenfassend sagen, dass der Nachweis von Mikrometastasen im
Knochenmark zum Zeitpunkt der Brustkrebsdiagnose mit einer schlechten Prognose
einhergeht (14).
Eine weitere Möglichkeit zur Detektion von Tumorzellen im Blut bietet der Nachweis von
CK-19-positiven Zellen mittels RT-PCR. So kann ein positiver Nachweis bei Brustkrebspatienten mit Stadium 1 und Stadium 2 vor Beginn der adjuvanten Therapie als
unabhängiger prognostischer Wert für ein schlechtes klinisches Resultat betrachtet
werden (98).
In einer prospektiven Multicenterstudie wurden 177 Patienten mit metastasiertem
Brustkrebs zu Beginn einer neuen Therapie und der ersten Nachsorgeuntersuchung auf
zirkulierende Tumorzellen untersucht.
Es erfolgte eine Einteilung in zwei Gruppen anhand der Zahl der zirkulierenden
Tumorzellen im Vollblut: In Gruppe 1 wurden alle Patienten aufgenommen, die mindestens
fünf oder mehr Tumorzellen pro 7,5 ml Vollblut aufwiesen. In Gruppe 2 wurden diejenigen
Patienten, die weniger als fünf Tumorzellen pro 7,5 ml Vollblut hatten, aufgenommen.
Zu Beginn der Therapie zeigte sich, dass die Patienten der Gruppe 1 ein durchschnittlich
kürzeres progressionsfreies Überleben von 2,7 Monaten im Vergleich zu Gruppe 2 mit
sieben Monaten (P<0.001) hatten. So zeichnete sich auch ein kürzeres Gesamtüberleben
der Gruppe 1 mit 10,1 Monaten gegenüber Gruppe 2 mit >18 Monaten (P<0.001) ab. Der
Unterschied zwischen den beiden Gruppen zeigte sich auch bei der ersten
Nachsorgeuntersuchung. So lag der Unterschied für das progressionsfreie Überleben bei
2,1 Monaten in Gruppe 1 gegenüber 7,0 Monaten (P<0.001) bei Gruppe 2, bzw. für das
Gesamtüberleben 8,2 Monate in Gruppe 1 gegenüber > 18 Monate in Gruppe 2 (23).
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Anzahl der zirkulierenden Tumorzellen als
ein Vorhersagewert für progressionsfreies Überleben und Gesamtüberleben mit hoher
Signifikanz einzustufen ist (23;46).
Naume et al. gehen schon beim Nachweis einer einzelnen zirkulierenden Tumorzelle von
einem reduzierten Überleben aus (72).
67
Therapieoptionen und Einfluss von zirkulierenden Tumorzellen auf die Therapie:
Der
Nachweis
von
disseminierten
Tumorzellen
ist
bis
heute
noch
nicht
als
Routineprozedur in das klinische Behandlungsmanagement von Patienten mit Brustkrebs
eingegangen. Neu erschienene Studien deuten darauf hin, dass der Tumorzellnachweis in
der Zukunft eine Rolle in der Risikostratifizierung und zur Überwachung der Effizienz der
eingesetzten Therapie spielen wird (33).
Die Detektion und Charakterisierung von Tumorzellen im Knochenmark, in Lymphknoten
und im Blut kann eine verbesserte Abschätzung des individuellen Risikos, ein Rezidiv zu
erleiden, bieten. Möglicherweise gelingt es dadurch, effektivere Therapien zu entwickeln
(17).
Der
Nachweis
von
Mikrometastasen
könnte
in
Zukunft
dazu
beitragen,
patientenspezifische Therapien zu entwickeln. Des Weiteren kann die Genanalyse der
Mikrometastasen dazu beitragen, effektivere Behandlungsstrategien für Patienten mit
Tumoren zu entwickeln, sowie die Karzinogenese und die verantwortlichen Mechanismen,
die zur Metastasierung führen, zu entschlüsseln (63).
Die oben aufgeführten Daten von Cristofanilli et al. zeigen, dass der Nachweis von
zirkulierenden Tumorzellen einen prognostischen Nutzen zur Stratifizierung der Patienten
in verschiedene Behandlungsgruppen und zur Überwachung des Therapieansprechens
von Patienten mit Metastasen bietet (1).
Der postoperative Nachweis von Mikrometastasen charakterisiert Patienten mit minimaler
Resterkrankung. Die Identifikation solcher Patienten ist wichtig, da sie von einer
adjuvanten Therapie profitieren (74).
Generell profitieren die Patienten mit einer schlechten klinischen Prognose am meisten
von einer adjuvanten Chemotherapie (31;42).
In der neoadjuvanten Behandlung von Brustkrebs kann die Tumorreduktion als Indikator
für ein Ansprechen der Tumorzellen auf die eingesetzten Therapeutika gesehen werden.
Eine adjuvante systemische Therapie, die zum Ziel hat, potentielle disseminierte
Tumorzellen abzutöten, kann das Überleben von Patienten mit Tumoren klar verbessern.
In der adjuvanten Behandlung hat man dagegen kein Hilfsmittel zur Hand, um die Effizienz
68
der Therapie zu bestimmen, außer wenn es zur Absiedlung von Fernmetastasen kommt,
was wiederum unwillkürlich zum Tode führt (35).
Da jedoch das Ansprechen der zirkulierenden Tumorzellen auf die adjuvante Therapie
sehr genau dem Ansprechen des Primärtumors auf die Therapie gleicht, kann man den
Nachweis zirkulierender Tumorzellen zum Therapie-Monitoring heranziehen. Dadurch
können z. B. auch unnötige Toxizitäten während einer neoadjuvanten Therapie durch
Abbrechen von ineffektiven Therapien vermieden werden (75).
Eine
denkbare
Alternative
zur
Lymphknotendissektion
im
Hinblick
auf
eine
Prognoseabschätzung wäre der immuncytochemische Nachweis von Tumorzellen im
Knochenmark. So könnte die Lymphknotendissektion, die als chirurgischer Eingriff häufig
mit nachfolgenden Komplikationen einhergeht, bei einer definierten Patientengruppe mit
kleinen Tumoren entfallen. Es konnte nachgewiesen werden, dass bei Patienten mit T1Tumoren (Durchmesser < 2 cm) der Tumorzellnachweis im Knochenmark leistungsfähiger
war Fernrezidive vorherzusagen (RR 7;3) als die Vorhersage über den Lymphknotenstatus
(RR 2,00) (29).
Der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen ist ein unabhängiger Prognosefaktor für
Patienten mit primärem Mammakarzinom. Möglicherweise kann die Notwendigkeit und
Intensität adjuvanter Therapie anhand dieses Faktors weiter verfeinert werden.
In der metastatischen Situation bietet der Nachweis von Tumorzellen die Möglichkeit einer
früheren Überprüfung der Effektivität der Behandlung.
69
V.
Zusammenfassung
Die Entscheidung für eine eingreifende adjuvante Chemotherapie bei Patienten mit
Mammakarzinom wird in Abhängigkeit der Risikofaktoren getroffen. Als besonders
gravierender unabhängiger Risikofaktor gilt der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen
im Blut. In der vorliegenden Arbeit haben wir versucht, mit zwei verschiedenen Verfahren
eine standardisierte Technik zum Nachweis von zirkulierenden epithelialen Zellen im
peripheren Blut von Frauen mit Brustkrebs zu etablieren.
Die Anreicherung der Tumorzellen auf dem Boden einer Dichtezentrifugation mittels
OncoQuick® - Verfahren wurde bei 50 Patienten eingesetzt. Obgleich sich in Abhängigkeit
einer Reihe von biologischen und molekularen Markern unterschiedliche Resultate
zeigten, gelang es mit der oben genannten Technik nicht, intakte Tumorzellen
darzustellen.
Das Prinzip der Zellseparation durch magnetgekoppelte Antikörper („Magnetbeads“)
mittels MACS® -Technik ermöglichte dann den schlüssigen Nachweis von epithelialen
Zellen im peripheren Blut. Diese Technik wird in der vorliegenden Arbeit detailliert
beschrieben. Mit diesem Verfahren ist es möglich, in einem FACS-Labor zirkulierende
Tumorzellen bei Patienten mit Brustkrebs nachzuweisen bzw. auszuschließen.
Die MACS® - Methode werden wir für weitere Untersuchungen verwenden mit dem Ziel,
Korrelationen zwischen dem Cytokeratin Nachweis und der Tumorbiologie herzustellen.
70
VI.
Abkürzungsverzeichnis
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
AAD
Aminoactinomycin D
C
Celcius
CD
cluster of differentiation
CTC
circulating tumor cells
EDTA
ethylene diamine tetraacetic acid
FACS
fluorescence-activated cell sorter
FcR
Fc-Rezeptor
FITC
Fluorescein-isothiocyanat
FSC-Height
Forward Scatter-Height
IgG
Immunglobulin G
kDa
kilo Dalton
LBP
LPS binding protein
LCA
leukocyte common antigen
LPS
Lipopolysaccharid
MACS
magnetic activated cell sorting
ml
Milliliter
MNF
MNF-Klon
mW
MilliWatt
Nm
Nanometer
PBS
Phosphate-buffered saline
PCR
Polymerase Ketten Reaktion
PE
Phycoerythrin
PerCP
Peridiniumchlorophyll-Protein
RT-PCR
Reverse Transkriptase PCR
SKBR3
SKBR3-Brustkrebszelllinie
SSC-Height
Sideward Scatter-Height
U
Unit
71
VII.
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
7.1
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1:
Schätzung der alterspezifischen Inzidenz in Deutschland
Abb. 2:
Durchschnittliches Alter der Bevölkerung
Abb. 3:
Metastasierungskaskade
Abb. 4:
Prinzip der Gen Chip-Analysen
Abb. 5:
OncoQuick® - Röhrchen mit dargestellter Interphase
Abb. 6:
Darstellung des OncoQuick® - Verfahrens
Abb. 7:
Matrix einer Selektionskanüle
Abb. 8:
Positiv Selektionsstrategie
Abb. 9:
FSC/SSC Darstellung; lysiertes Vollblut
Abb. 10:
Darstellung FSC/SSC
Abb. 11:
Darstellung Anti-Cytokeratin/CD 45
Abb. 12:
Darstellung FSC/SSC
Abb. 13:
Darstellung Anti-Cytokeratin/CD 45
Abb. 14:
Darstellung FSC/SSC
Abb. 15:
Darstellung SSC/CD 45
Abb. 16:
Darstellung Anti-Cytokertain/CD 45
Abb. 17:
Darstellung FSC/SSC
Abb. 18:
Darstellung SSC/CD 45
Abb. 19:
Darstellung Anti-Cytokeratin/CD 45
Abb. 20:
Darstellung FSC/SSC
Abb. 21:
Darstellung Anti-Cytokeratin/CD14
Abb. 22:
Darstellung CD 14/CD 45
Abb. 23:
Darstellung IgG1/IgG2
Abb. 24:
Darstellung Anti-Cytokertain/CD 45
Abb. 25:
Darstellung FSC/SSC
Abb. 26:
Darstellung Anti-Cytokertain/CD 45
Abb. 27:
Darstellung FSC/SSC
Abb. 28:
Darstellung SSC/CD 45
Abb. 29:
Darstellung Anti-Cytokertain/CD 45
Abb. 30:
Darstellung FSC/SSC
72
7.2
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:
Risikofaktoren für Brustkrebs
Tabelle 2:
Untersuchtes Patientenkollektiv mittels OncoQuick® - Methode
Tabelle 3:
Untersuchtes Patientenkollektiv mittels MACS® - Methode
Tabelle 4:
Validierungsergebnisse
Tabelle 5:
Verwendete Antikörper OncoQuick®
Tabelle 6:
Verwendete Antikörper
Tabelle 7:
Anreicherungsfaktor OncoQuick®
Tabelle 8:
Darstellung des Patientenkollektivs:
Tabelle 9:
Darstellung der OncoQuick® Patienten mit erhöhten Cytokeratinwerten
Tabelle 10:
Patientenkollektiv mit erhöhten Cytokeratinwerten
Tabelle 11:
Darstellung der Gen Chip Analyse
Tabelle 12:
Darstellung der Gen Chip Analyse
Tabelle 13:
Darstellung der Gen Chip Analyse
Tabelle 14:
Darstellung der Gen Chip Analyse
Tabelle 15:
Darstellung der Gen Chip Analyse
Tabelle 16:
Darstellung der Negativkontrolle
Tabelle 17:
Anreicherungsfaktor MACS®
Tabelle 18:
Darstellung des Patientenkollektivs:
73
VIII.
Danksagung
Ganz herzlich bedanken möchte ich mich bedanken bei…
…Herrn Chefarzt Prof. Dr. Hirsch
für die freundliche Überlassung des Promotionsthemas und die gute Betreuung während
dieser Arbeit
…Herrn Chefarzt Dr. Jakob
für die geduldige Betreuung, die guten Ratschläge und Ideen über die gesamte Dauer
dieser Arbeit
…Herrn Prof. Dr. Siebers
für das Überlassen der Patientendaten
… dem Team der Onkologischen Ambulanz der St. Josefsklinik Offenburg
…dem MTA-Team des Durchfusszytometrie-Labors des Zentrallabors des Klinikums
Offenburg
für Tipps und Hilfestellungen während meiner Messungen.
…den Patienten, die sich trotz ihrer Krankheit und dem damit verbundenen Leidensdruck
bereit erklärt haben, mit ihren Ergebnissen für diese Arbeit zur Verfügung zu stehen.
74
IX.
Lebenslauf
Persönliche Daten
________________________________________________________________________________________
Name:
Peter Sutterer
Anschrift:
Wasserstraße 24
77749 Hohberg
Geburtsdatum:
24. Februar 1980
Geburtsort :
Lahr / Schwarzwald
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Familienstand:
ledig
Eltern:
Roland Sutterer, verstorben 1996
Industriemeister / REFA-Fachmann
Christina Sutterer, geb. Ehret
Bankkauffrau
Geschwister:
Anna Sutterer
Schülerin
Schulbildung
________________________________________________________________________________________
1986 -1990
Grundschule Niederschopfheim
1999 - 1996
Theodor-Heuss-Realschule, Offenburg
Abschluss: Mittlere Reife
1996 - 1999
Technisches Gymnasium Offenburg
Abschluss: Abitur
Zivildienst
________________________________________________________________________________________
01.07.1999 – 30.06.2000
DRK Offenburg
mit Ausbildung zum Rettungssanitäter
75
Berufsausbildung
________________________________________________________________________________________
01.10.2000 – 30.04.2001:
Studium Dipl.-Ing. Maschinenbau
Hobart GmbH, Offenburg
Seit Oktober 2001:
Studium der Medizin
Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg
Berufspraxis
________________________________________________________________________________________
Seit 01.05.2001:
Rettungsdienst Ortenau GmbH
Teilzeitkraft
Famulaturen
________________________________________________________________________________________
01.03.2004 – 18.04.2004:
Famulatur Allgemeinmedizin
Praxis Dr. Achim Wacker, OG - Griesheim
01.08.2004 – 12.09.2004:
Famulatur Anästhesie / Intensivmedizin
St. Josefsklinik Offenburg
28.02.2005 – 27.03.2005:
Famulatur Innere Medizin / Onkologische Amb.
St. Josefsklinik Offenburg
06.03.2006 – 26.03.2006:
Famulatur Anästhesie / Intensivmedizin
Klinikum Offenburg
Doktorarbeit
________________________________________________________________________________________
03/2005 - 01/2007:
Nachweis Cytokeratin positiver Zellen im Blut
von Patientinnen mit Mammakarzinom
Klinikum Offenburg in Zusammenarbeit
mit der St. Josefsklinik Offenburg.
Praktisches Jahr
________________________________________________________________________________________
08/2006 – 07/2007:
Praktisches Jahr Klinikum Offenburg
76
X. Literaturverzeichnis
1. Allard,W.J., Matera,J., Miller,M.C., Repollet,M., Connelly,M.C., Rao,C., Tibbe,A.G.,
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