Interaktion muriner regulatorischer T
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Interaktion muriner regulatorischer T-Zellen mit Dendritischen Zellen Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Jens Haenig aus Goslar Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 13.02.2008 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. T. Winkler Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Alexander Steinkasserer Meinen Eltern -2- -Inhaltsverzeichnis- 1 Einleitung ............................................................................................... - 1 - 1.1 Das Immunsystem ........................................................................................ - 1 - 1.1.1 Das angeborene Immunsystem ................................................. - 1 - 1.1.2 Das adaptive Immunsystem ...................................................... - 3 - 1.2 Dendritische Zellen ....................................................................................... - 6 - 1.2.1 Antigenpräsentation................................................................... - 7 - 1.2.2 Myeloische Dendritische Zellen ................................................. - 8 - 1.2.3 Plasmazytoide Dendritische Zellen............................................ - 9 - 1.2.4 Reifungsstadien Dendritischer Zellen ...................................... - 10 - 1.3 1.2.4.1 Unreife Dendritische Zellen .............................................. - 10 - 1.2.4.2 Semireife Dendritische Zellen........................................... - 11 - 1.2.4.3 Vollreife Dendritische Zellen ............................................. - 13 - Aktivierung der Effektor T-Zellen ................................................................ - 13 - 1.3.1 T-Helfer 1 Antwort ................................................................... - 17 - 1.3.2 T-Helfer 2 Antwort ................................................................... - 17 - 1.3.3 T-Helfer-17 Antwort ................................................................. - 19 - 1.4 Toleranz ...................................................................................................... - 21 - 1.4.1 Zentrale Toleranz .................................................................... - 21 - 1.4.2 Periphere Toleranz .................................................................. - 23 - 1.4.2.1 Anergie ............................................................................. - 24 - 1.4.2.2 Ignoranz ........................................................................... - 25 - 1.4.2.3 Immundeviation ................................................................ - 25 - 1.4.2.4 Deletion ............................................................................ - 26 - 1.4.2.5 Regulation/Suppression ................................................... - 27 - 1.4.3 1.5 Autoimmunreaktionen.............................................................. - 27 - Regulatorische T-Zellen.............................................................................. - 29 - 1.5.1 Th3/Tr1: Adaptive regulatorische T-Zellen .............................. - 29 - 1.5.2 Natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen ..................... - 31 - 1.5.2.1 Bildung der regulatorischen T-Zellen ................................ - 32 - 1.5.2.2 Eigenschaften................................................................... - 34 - 1.5.2.3 Dendritische Zellen und regulatorische T-Zellen .............. - 36 - 1.5.2.4 Regulatorische T-Zellen in Allergien und Autoimmunerkrankungen ................................................ - 37 - 2 1.5.2.5 Mechanismen der Regulation ........................................... - 38 - 1.5.2.6 Regulatorische T-Zellen in DO11.10 Mäusen................... - 43 - Problemstellung ................................................................................... - 44 - 2.1 Welche Art von DZ wird für Aktivierung und Proliferation der regulatorischen T-Zellen benötigt? ............................................................. - 44 - 2.2 Welches sind die Mechanismen der Regulation in vivo?............................ - 45 - 2.1 Welche Funktionen haben regulatorische T-Zellen im Verlauf von Infektionen? ................................................................................................ - 45 - 3 Material und Methoden ........................................................................ - 49 - 3.1 Standardlösungen, Puffer und Medien ....................................................... - 49 - 3.2 Spezielle Reagenzien ................................................................................. - 51 - 3.2.1 Stimulantien und Zytokine ....................................................... - 51 - 3.2.2 Oligonukleotide ........................................................................ - 51 - 3.2.3 Antigene .................................................................................. - 52 - 3.3 Antikörper ................................................................................................... - 52 - 3.4 Verwendete Mausstämme .......................................................................... - 55 - 3.5 Zellkulturmethoden ..................................................................................... - 56 - 3.5.1 3.5.1.1 Handhabung der Zellen .................................................... - 56 - 3.5.1.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen .................................. - 56 - 3.5.1.3 Zellzählung und Vitalitätsbestimmung .............................. - 57 - 3.5.1.4 Gewinnung von murinem GM-CSF Kulturüberstand ........ - 57 - 3.5.2 3.6 Allgemeine Arbeitstechniken mit Zellen ................................... - 56 - Spezielle Arbeitstechniken mit Zellen ...................................... - 58 - 3.5.2.1 Knochenmarkspräparation ............................................... - 58 - 3.5.2.2 Generierung Dendritischer Zellen..................................... - 58 - 3.5.2.3 Generierung von plasmazytoiden Dendritischen Zellen ... - 59 - 3.5.2.4 Lymphknoten- und Milzpräparation als Quelle für T-Zellen- 59 - 3.5.2.5 Separation von T-Zell Unterarten ..................................... - 60 - 3.5.2.6 Isolierung der T-Zellen mit Dynal Magnetkugeln .............. - 60 - 3.5.2.7 Isolierung der T-Zellen mit Stemcell Magnetkugeln.......... - 61 - 3.5.2.8 Isolierung der CD25+ T-Zellen .......................................... - 62 - 3.5.2.9 Zellmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen....................... - 63 - Immunologische Methoden......................................................................... - 64 - 3.6.1.1 T-Zell-Proliferationstest durch 3H-Thymidineinbau .......... - 64 - -4- 3.7 4 3.6.1.2 Fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie (FACS) ........ - 65 - 3.6.1.3 Extrazelluläre FACS-Färbung........................................... - 65 - 3.6.1.4 Intrazelluläre FACS-Färbung ............................................ - 66 - 3.6.1.5 Intrazelluläre Färbung gegen Foxp3 ................................. - 66 - 3.6.1.6 Apoptose-Färbung............................................................ - 67 - Mikroskopische Methoden .......................................................................... - 68 - 3.7.1 Präparation lymphatischer Organe .......................................... - 68 - 3.7.2 Immunfluoreszenzfärbung von Gefrierschnitten ...................... - 68 - Ergebnisse ........................................................................................... - 70 - 4.1 Markierung von DZ und CD4+ T-Zellen mit drei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen. .............................................................................. - 70 - 4.2 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Milz ...................................... - 70 - 4.3 Charakterisierung, Isolation und Sortierung von T-Zellen mit MACSMagnetkugeln ............................................................................................. - 73 - 4.4 Fluoreszenzmarkierung der Treg beeinflusst deren suppressive Eigenschaften nicht .................................................................................... - 76 - 4.5 In vitro Kultivierung von TNFα- und LPS-stimulierten DZ resultiert in der Aktivierung von Treg und Teff. ....................................................................... - 76 - 4.6 Generierung von pDZ durch in vitro Stimulation mit Flt3-L ......................... - 80 - 4.7 Reifung von plasmazytoiden DZ und myeloischen DZ durch CpG und LPS über Nacht .................................................................................................. - 82 - 4.8 CD25+ T-Zellen werden durch reife pDZ und mDZ schwächer aktiviert als CD25- T-Zellen............................................................................................ - 83 - 4.9 Unreife pDZ und mDZ sind nicht in der Lage T-Zellen zu aktivieren .......... - 86 - 4.10 Sich teilende Treg und Teff, die durch pDZ und mDZ stimuliert wurden behalten ihren Foxp3+ oder Foxp3- Phänotyp............................................. - 88 - 4.11 Knochenmarks-DZ zeigen nach Behandlung mit verschiedenen Stimuli über Nacht einen reifen Phänotyp .............................................................. - 88 - 4.12 Intravenös injizierte T-Zellen wandern in die T-Zell Areale der Milz zusammen mit zuvor injizierten antigentragenden DZ und interagieren dort mit diesen ................................................................................................... - 91 - 4.13 Intravenös injizierte T-Zellen und Dendritische Zellen interagieren in der Milz ............................................................................................................. - 92 - 4.14 Die durch Treg vermittelte Suppression ist abhängig von deren Voraktivierung in vivo.................................................................................. - 94 - -5- 4.15 Treg kontrollieren die maximale T-Zellexpansion und begrenzen die TZellantwort .................................................................................................. - 96 - 4.16 Voraktivierte Treg verhindern die Bildung von Zellhaufen und individuellen Kontakten zwischen DZ und T-Zellen sowie zwischen den T-Zellen untereinander.............................................................................................. - 98 - 4.17 Treg bewirken einen Verlust von kostimulatorischen Oberflächenproteinen auf LPS- und TNFα- aber nicht auf LPS/CD40-gereiften DZ .................... - 101 - 4.18 Der Verlust der DZ-Oberflächenproteine wird nicht durch Apoptose verursacht ................................................................................................. - 104 - 4.19 Lizensierung der DZ durch CD40 verhindert die Suppression der Teff durch Treg. ........................................................................................................... - 104 - 5 Diskussion.......................................................................................... - 107 - 5.1 Reife DZ werden für die Aktivierung der Treg benötigt............................... - 107 - 5.2 Plasmazytoide und myeloische Dendritische Zellen haben vergleichbare stimulatorische Fähigkeiten gegenüber Treg ............................................. - 108 - 5.3 Treg kontrollieren die Expansion von Teff nach deren Aktivierung .............. - 109 - 5.4 Die Antigen-Avidität der regulatorischen T-Zellen ist ein wichtiger Faktor, der zwischen Immunität und Toleranz entscheiden kann. ........................ - 111 - 5.5 Treg vermitteln ihre regulatorischen Fähigkeiten partiell über die DZ. Durch CD40-Ligation kann dieser Effekt aufgehoben werden. ........................... - 114 - 5.6 Hypothese: Treg erfüllen unterschiedliche Funktionen in Abhängigkeit der Immunreaktion gegen Selbst- oder Fremdpeptide ................................... - 117 - 6 Zusammenfassung ............................................................................ - 120 - 7 Ausblick .............................................................................................. - 122 - 8 Veröffentlichungen ............................................................................ - 124 - 9 8.1 Wissenschaftliche Originalveröffentlichungen .......................................... - 124 - 8.2 Posterpräsentationen................................................................................ - 124 - 8.3 Vorträge .................................................................................................... - 125 - Literaturverzeichnis ........................................................................... - 126 - 10 Abkürzungsverzeichnis..................................................................... - 141 - 11 Lebenslauf .......................................................................................... - 144 - -6- -Einleitung- Einleitung 1 1.1 Das Immunsystem Das Immunsystem besteht aus mehreren, sich unterstützenden zellulären und löslichen Komponenten zur Abwehr von Infektionen und selbstreaktiven Zellen. Es wird in ein angeborenes (1) und ein adaptives Immunsystem unterteilt (2). Alle Zellen des Immunsystems stammen von hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark ab. Aus diesen differenzieren sie in die unterschiedlichen Arten von Zellen aus denen sich das Immunsystem zusammensetzt. 1.1.1 Das angeborene Immunsystem Das angeborene Immunsystem ist die erste Verteidigungslinie gegen Pathogene Erreger. Der Körper wird durch Epithelien geschützt, welche eine physische Barriere für eindringende Erreger sind. Zusätzlich werden eindringende Mikroorganismen durch chemische Mittel wie zum Beispiel ein niedriger pH Wert im Magen und Lysozym in der Tränenflüssigkeit oder im Speichel wirksam bekämpft. Lysozym ist ein Enzym das bakterielle Zellwände zersetzen kann. Zusätzlich müssen Pathogene dort mit bereits vorhanden, harmlosen, die Epithelien besiedelnden Organismen konkurrieren. Gelingt es den Erregern dennoch, diese äußeren Barrieren zu überwinden, müssen sie vom Körper als fremd erkannt und wirksam bekämpft werden. Die Komponenten des angeborenen Immunsystems sind in der Lage grundlegende Strukturen auf den eindringenden Organismen zu erkennen. Es greift diese direkt, zum Beispiel durch antimikrobielle Enzyme an und es werden Fresszellen an den Ort der Infektion rekrutiert. Dort werden dann unter anderem Entzündungsfördernde Mediatoren ausgeschüttet. Es kommt zur Anhäufung von Plasmaproteinen die Teile des Komplementsystems bilden. Dies kann zur Beseitigung der Eindringlinge führen. Das Komplementsystem besteht aus einer großen Gruppe von spezialisierten Plasmaproteinen. Das Komplementsystem -1- -Einleitung- setzt, wenn aktiviert, eine Enzymkaskade in Gang welche aus den im Blut vorhandenen oder zellgebundenen Substratmolekülen die reaktiven Komponenten rekrutiert. Diese sind in der Lage die eindringenden Fremdorganismen effektiv anzugreifen. Die Pathogene werden entweder opsonisiert oder direkt lysiert. Opsonisierung bedeutet, dass die Zielzellen mit Komplementfaktoren eingehüllt und so besser phagozytiert werden können. Neben Fresszellen und Komplementsystem gibt es außerdem noch natürliche Killerzellen, die sich im Knochenmark entwickeln. Diese zu den Lymphozyten zählenden Zellen können Tumorzellen oder Veränderungen durch Virusbefall erkennen und in der Zielzelle Apoptose induzieren. Der menschliche Körper ist nahezu jederzeit mit fremden Mikroorganismen konfrontiert. Die Mechanismen des angeborenen Immunsystems sind in der Regel ausreichend um den Körper vor einfachen Infektionen zu schützen. Oft können sie schon nach sehr kurzer Zeit wirksam bekämpft werden. Die angeborene Abwehr ist nicht auf die Vermehrung von hochspezifischen Abwehrzellen angewiesen sondern kann auf ein bereits bestehendes Repertoire von Zellen zurückgreifen. Bei komplexeren pathogenen Erregern die eine Immunabwehr umgehen können kann es häufig zu keiner effizienten Bekämpfung durch das angeborene Immunsystem kommen. Auch wenn das angeborene Immunsystem im Hinblick auf viel komplexere Pathogene machtlos erscheint, ist es dennoch der Grundpfeiler der körpereigenen Verteidigung gegen Infektionen. Defekte im angeborenen Immunsystem haben sich als fatal für die Betroffenen herausgestellt und führen unbehandelt meistens zum Tode (3). Viele Erreger haben Strategien zur Umgehung der adaptiven Abwehr entwickelt und machen eine flexiblere Antwort und ein „immunologisches Gedächtnis“ notwendig. Das „immunologische Gedächtnis“ besteht aus Körperabwehrzellen und Antikörpern des adaptiven Immunsystems, die bereits erfolgreich eine Infektion abgewehrt haben. Sie verweilen oft noch jahrelang im Organismus um bei Reinfektion mit demselben oder einem ähnlichen Pathogen eine schnelle Immunantwort zu gewährleisten (2). -2- -Einleitung- 1.1.2 Das adaptive Immunsystem Das adaptive Immunsystem besteht aus mehreren Komponenten, wie zum Beispiel B- und T-Zellen (2). Die B-Lymphozyten oder auch B-Zellen sind in der Lage nach Aktivierung Antikörper zu sezernieren. Die Spezifität dieser Antikörper entspricht dann dem auf der Oberfläche der B-Zelle exprimierten B-Zellrezeptors. B-Zellen entwickeln sich im Knochenmark. Antikörper sind Proteine aus der Klasse der Immunglobuline welche in der Lage sind spezifische Antigenstrukturen zu erkennen und an diese zu binden. Jeder Antikörper besteht aus zwei identischen schweren Ketten (heavy chains, H) und zwei identischen leichten Ketten (light chains, L). Diese beiden Ketten sind durch kovalente Disulfidbrücken zu einer Ypsilon-förmigen Struktur miteinander verknüpft. Am Ende jeder schweren und leichten Kette befinden sich zwei hochvariable Regionen die die Antigenbindungsstelle bilden. Am anderen Ende der schweren Ketten befindet sich eine Bindungsstelle für Komponenten des Komplementsystems. Durch die Antigenbindung kann es zu einer Neutralisierung des Fremdkörpers oder zu einer vermehrten Lyse der Erreger durch das Komplementsystem kommen. Zudem kann die Bindung der Antikörper auf der Oberfläche eine leichtere Phagozytose der befallenen Zellen hervorrufen. T-Lymphozyten oder auch T-Zellen entwickeln sich im Thymus aus einer, dem Knochenmark entspringenden Vorläuferzelle. Sie tragen einen für jede Zelle einzigartigen Oberflächenrezeptor, der in der Lage ist, bestimmte Antigene zu erkennen. Vorrausetzung hierfür ist, dass diese Antigene auf MHC-Molekülen präsentiert werden. MHC-Moleküle sind spezialisierte Proteine, die Peptidfragmente auf Zelloberfläche transportieren und dort präsentieren können. CD4+ T-Zellen tragen den CD4-Korezeptor auf der Oberfläche. CD steht hier für „Cluster of Differentiation“. Dieses Protein besteht aus vier extrazellulären Immunglobulindomänen und einem zytoplasmatischen Abschnitt. Es trägt wesentlich zur Erkennung des MHC II Antigenkomplexes durch den T-Zellrezeptor -3- -Einleitung- bei. CD4+ T-Zellen werden auch als T-Helferzellen bezeichnet, da sie in den weiterführenden Schritten der Immunantwort entscheidende Signale an die dort beteiligten Zellen liefern. CD4+ T-Zellen können nach Aktivierung in spezialisierte Unterarten wie Th1-, Th2- oder Th17-Zellen differenzieren (Abb. 6). Diese T-Zellen haben nicht nur verschiedene Interaktionspartner, sie produzieren auch unterschiedliche Zytokine mit unterschiedlichen Aufgaben. Zytokine sind eine Gruppe von Proteinen die Signal übermittelnde Funktionen haben. Diese Signale können sich auf Wachstum und Differenzierung von anderen Zellen auswirken. Th1-Zellen produzieren überwiegend IFN-γ und differenzieren unter Einwirkung von IL-12 aus naiven T-Zellen. Sie aktivieren Makrophagen und Fresszellen. Th2Zellen produzieren IL-4 und helfen bei der weiteren Aktivierung von B-Zellen. Th17-Zellen entstehen aus Vorläuferzellen in Anwesenheit von TGF- und IL-6. Ihre Aufgabe ist vermutlich die Bekämpfung von extrazellulären Pathogenen deren Abwehr nicht durch Th1 und Th2-Zellen gewährleistet werden kann. Es ist möglich, dass Th17-Zellen auch eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen spielen. Th17-Zellen sezernieren IL-17A und IL-17F (4). CD8+ T-Zellen werden als zytotoxische Zellen oder auch T-Killerzellen bezeichnet. Neben einem antigenspezifischen T-Zellrezeptor tragen sie den CD8-Korezeptor auf der Oberfläche. Sie erkennen Antigene die von nahezu allen Kernhaltigen Zellen auf MHC I Molekülen präsentiert werden. Zellen, die das für sie spezifische Antigen tragen werden von den T-Killerzellen durch Induktion von Apoptose beseitigt. Des Weiteren gibt es NK-T-Zellen, die zwar einen spezifischen T-Zellrezeptor haben, jedoch auch das für NK-Zellen spezifische Oberflächenmolekül NK1.1 (CD161) exprimieren. NK-T-Zellen sind entweder CD4+ oder doppelt negativ (CD4- CD8-). Sie können Antigene nicht auf MHC I oder MHC II Molekülen präsentiert erkennen, sondern benötigen hierzu CD1d. CD1d besitzt Strukturähnlichkeit mit MHC I Klasse Molekülen und präsentiert den NK-T-Zellen Glycolipid-Antigene. Nach Aktivierung produzieren NK-T-Zellen IFNγ, IL-4 und GMCSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor). -4- -Einleitung- Eine weitere Unterart der T-Zellen sind die γδ T-Zellen. Sie haben einen TZellrezeptor der nicht aus α- und β-Polypeptidkette besteht wie das bei einem großen Teil der T-Zellen der Fall ist. Ihr T-Zellrezeptor setzt sich aus zwei Polypeptidketten zusammen, die als γ und δ bezeichnet werden. Die genaue Funktion und Spezifität der γ.δ T-Zellen ist bisher weitestgehend unbekannt (5). Das adaptive Immunsystem wird aktiviert, wenn das angeborene Immunsystem nicht in der Lage ist, die Infektion mit pathogenen Organismen zu kontrollieren. Das Grundprinzip der adaptiven Immunität ist die klonale Selektion welches ein breites Repertoire an für jeden Erreger maßgeschneiderten Lymphozyten schafft. Jeder Lymphozyt trägt auf der Zelloberfläche einen einzigartigen Oberflächenrezeptor, der in der Lage ist, Antigene zu erkennen. Diese hohe Varianz wird durch eine zufällige Rekombination der rezeptorbildenden Komponenten im Thymus und Knochenmark erreicht. Ein solcher Rezeptor besteht aus einem konstanten und einem variablen Teil. Der variable Teil der α-Kette des T-Zellrezeptors wird aus zufälliger Rekombination eines Vα Segments mit einem Jα Segment zusammengesetzt. Die variable Region der β-Kette besteht aus einem Vβ, einem Dβ und einem Jβ Segment (5). B- und T-Zellen lernen während ihrer Entwicklung, zwischen „selbst“ und „nichtselbst“ zu entscheiden. Im Thymus werden die T-Zellen auf die Fähigkeit, selbstMHC-Moleküle zu erkennen selektiert. Dieser Prozess wird als positive Selektion bezeichnet. Im Gegensatz dazu werden Zellen die an Selbstpeptide mit zu hoher Affinität binden durch Apoptose beseitigt. Dies bezeichnet man als „negative Selektion“. Die Polarisierung der Immunantwort hängt vor allem vom Erreger und den antigenpräsentierenden Zellen sowie dem immunologischen Milieu ab (Siehe 1.3). -5- -Einleitung- 1.2 Dendritische Zellen Dendritische Zellen (DZ) sind wichtige, antigenpräsentierende Komponenten des Immunsystems (6). Sie nehmen pathogene Erreger und apoptotisches Zellmaterial in den peripheren Organen auf. Anschließend wandern sie in die Lymphorgane und präsentieren dort die zu Peptiden prozessierten Antigene auf MHC-Molekülen den dort zirkulierenden T- und B-Zellen. DZ wurden erstmals von Steinman und Cohn im Jahre 1973 als „dendritic cells“ beschrieben, die als Zellen mit besonders langen Fortsätzen aus murinen Milzen isoliert wurden (7). Entdeckt wurden sie jedoch bereits 100 Jahre zuvor vom Medizinstudenten Paul Langerhans in der Epidermis (8). Diese spezielle Unterart der DZ wird auch heute noch als Langerhans-Zellen (LZ) bezeichnet und stellt eine Subpopulation der DZ dar (9, 10). Die DZ entwickeln sich aus Vorläuferzellen, welche CD34 als gemeinsames Oberflächenprotein exprimieren und die sich aus dem Knochenmark bilden (Abb.1) (11). Aus diesen pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen entwickeln sich dann unter Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren und Zytokine die DZ-Subpopulationen. Man unterscheidet zwischen myeloischen (mDZ) und plasmazytoiden DZ (pDZ). Bisher ging man davon aus, dass sich beide getrennt voneinander entwickeln. Die bisherige Vorstellung, das mDZ und pDZ sich aus unterschiedlichen Vorläuferzellen differenzieren wurde jedoch durch neuere Untersuchungen angezweifelt. Es gelang, sowohl pDZ aus myeloischen und lymphatischen Vorläufern zu generieren. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass es möglich ist aus myeloischen Vorläuferzellen pDZ zu differenzieren (12, 13). DZ haben auf der Zelloberfläche Rezeptoren, die es ihnen ermöglichen, hochkonservierte Strukturen von Pathogenen zu binden. Binden bakterielle Bestandteile wie Lipopolysaccharide (LPS) RNA oder DNA an die Pathogenrezeptoren, kann es zur Reifung der DZ kommen. Ein Vertreter dieser Rezeptoren sind zum Beispiel Toll-Like Rezeptoren (TLR) (14). Durch die Reifung erfolgt ein grundlegender struktureller und funktioneller Wandel von einer ruhenden, phagozytierenden zu einer migrierenden, antigenpräsentierenden Zelle. -6- -Einleitung- 1.2.1 Antigenpräsentation DZ sind sehr effektive antigenpräsentierende Zellen. Sie verfügen über mehrere Mechanismen die es ihnen ermöglichen, fremde Antigene aufzunehmen (15). DZ internalisieren gelöste Partikel, Proteine und auch ganze Mikroorganismen mittels Phagozytose, Makropinozytose oder rezeptorvermittelter Endozytose. Sie zersetzen diese dann zu Peptidfragmenten, welche auf der Oberfläche auf MHCMolekülen präsentiert werden (16). Es gibt zwei verschiedene Arten solcher Moleküle die als MHC I und MHC II bezeichnet werden. Sie sind für die Präsentation von unterschiedlichen Antigenen verantwortlich (17). Der Haupthistokompatibilitätskomplex (engl. Major Histocompatibilic Complex, MHC) umfasst eine Gruppe von Genen die Proteine kodieren, welche in der Lage sind Peptide auf die Zelloberfläche zu transportieren und diese dort zu präsentieren. Extrazellulär aufgenommene Antigene werden überwiegend auf MHC II präsentiert. Intrazellulär exprimierte Antigene werden auf MHC I Molekülen präsentiert. T-Zellen werden in weitere Unterarten wie beispielsweise CD4+ und CD8+ T-Zellen unterteilt. Endogene Antigene werden direkt in der Zelle durch das Proteasom zerkleinert und auf MHC I Molekülen an die Oberfläche gebracht. MHC I wird von den meisten Zellen auf der Oberfläche in unterschiedlicher Menge exprimiert. Exogene Antigene werden durch Vesikel die als Endosomen bezeichnet werden, in die APZ aufgenommen. In diesen Endosomen mit niedrigem pH-Wert zerkleinern dann Proteasen die Proteine. Durch Verschmelzen dieser Vesikel mit MHC II enthaltenden Vesikeln kommt es zur Bindung der Peptidfragmente auf den MHC II Molekülen und zum Transport auf die Zellmembran.(18) -7- -Einleitung- 1.2.2 Myeloische Dendritische Zellen Man unterscheidet verschiedene DZ-Subtypen die unterschiedliche Morphologien und Aufgaben im Immunsystem haben (Abb. 2). Myeloische DZ (mDZ) entwickeln sich aus Knochenmarksvorläuferzellen der myeloischen Reihe. Diese Entwicklung verläuft unter Einwirkung von „granulocyte macrophage colony stimulating factor“ (GM-CSF), IL-3 oder Flt3-L in Mäusen. Abb. 1: Entwicklung und Differenzierung von APZ aus hämatopoetischen Stammzellen (CLA: Cutanes Lymphozyten assoziiertes Antigen, myeloische DZ: mDZ, plasmazytoide DZ: pDZ, modifiziert nach Shortman und Liu (11)). Pluripotente hämatopoetische Stammzellen aus dem Knochenmark differenzieren in eine myeloische und eine lymphatische Reihe. Nach klassischer Theorie entwickeln sich aus der myeloischen Linie vor allem Monozyten und DZ. Aus der lymphatischen Linie entstehen pDZ. Neuere Erkenntnisse belegen das sich auch pDZ aus myeloischen Vorläuferzellen entwickeln können. Außerdem können sich Monozyten ebenfalls aus lymphatischen Vorläufern differenzieren. -8- -Einleitung- DZ besitzen je nach Reifegrad sehr unterschiedliche Eigenschaften. Unreife DZ zeichnen sich durch sehr effektive Phagozytose aus und erlangen durch Reifung erst ihre migratorischen Fähigkeiten. Der den Reifegrad der DZ und die damit verbundenen Eigenschaften können maßgeblich entscheiden ob und was für eine Art der Immunantwort durch die DZ vermittelt wird (19). In den letzten Jahren hat sich zunehmend herausgestellt, dass DZ nicht nur eine wichtige Rolle bei T-Zell vermittelten Immunantworten spielen (20), sondern auch bei der Erhaltung von Toleranz entscheidend mitwirken (21, 22). 1.2.3 Plasmazytoide Dendritische Zellen Plasmazytoide DZ (pDZ) stellen sowohl in Mäusen als auch in Menschen ca. 0,2– 0,8 Prozent der mononuklearen periphären Blutzellen. Sie ähneln in ihrem morphologischen Erscheinungsbild eher Plasmazellen. Murine pDZ tragen auf Ihrer Oberfläche, wenn auch in geringerer Menge, das für DZ typische Oberflächenprotein CD11c sowie CD8α. Humane pDZ exprimieren kein CD11c auf der Oberfläche (siehe Abb. 2). FLT3-L ist ein Schlüsselzytokin bei der Entwicklung der pDZ aus Vorläuferzellen (23). pDZ sind in der Lage durch ihre Pathogenrezeptoren virale Infektionen sehr zügig zu detektieren und hohe Mengen an Typ-1 Interferonen auszuschütten. Typ-1 Interferone rekrutieren und aktivieren NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen am Ort der Infektion und sorgen für eine Beseitigung der befallenen Zellen. NK-Zellen können eine Verringerung der Expression von MHC I Molekülen auf Zellen über spezielle Rezeptoren detektieren. Vor allem virusinfizierte Zellen haben oft weniger MHC I Moleküle auf der Zelloberfläche als gesunde und werden durch die NK Zellen zur Apoptose getrieben. pDZ stellen somit ein Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort dar. Neben der Abwehr von Viren können sie noch andere Funktionen im Körper wahrnehmen, wie die Rekrutierung von adaptiven und vielleicht auch natürlichen Treg (24). Jüngste Untersuchungen -9- -Einleitung- haben bestätigt, dass pDZ als Induktoren von IL-10 produzierenden Treg wirken können. Diese Fähigkeit ist vermutlich auf ICOS/ICOS-L Interaktionen zurückzuführen (25). In unreifem Stadium sind pDZ sehr schlechte Simulatoren von normalen TZellantworten und exprimieren nur geringe Mengen an MHC II auf der Oberfläche. Dies kann durch Reifung mit TLR 7 und TLR 9 bindenden Pathogenen geändert werden. Die Reifung bewirkt eine vermehrte Expression von MHC II sowie verschiedener kostimulatorischer Moleküle wie CD80 und CD86. Kostimulatorische Moleküle auf DZ liefern T-Zellen zusätzliche aktivierende oder inhibitorische Signale (Siehe Abb. 8) . 1.2.4 Reifungsstadien Dendritischer Zellen mDZ und pDZ existieren in den peripheren und lymphatischen Organen sowie im Blut zumeist im unreifem Stadium. Erst nach Kontakt mit einem Reifungsstimulus verändern sie ihre Beschaffenheit, beginnen verstärkt Antigene auf ihrer Oberfläche zu präsentieren und erlangen ihre migratorischen Fähigkeiten. Des Weiteren vermögen reife DZ Zytokine wie IL-12 zu produzieren und exprimieren auf ihrer Oberfläche eine große Menge von kostimulatorischen Molekülen (Abb. 4). Der Reifungszustand einer DZ entscheidet möglicherweise maßgeblich zwischen Toleranz und Immunität (26). 1.2.4.1 Unreife Dendritische Zellen Die meisten in den peripheren Geweben und lymphoiden Organen vorhandenen DZ sind in einem unreifen Stadium. Sie haben sehr gute phagozytotische Fähigkeiten sowie eine niedrige Expression von kostimulatorischen Molekülen auf ihrer Oberfläche. Durch Endozytose können sie Zellmaterial fremder oder apoptotischer Zellen in sich aufzunehmen. Dieser Vorgang findet im normalen immunologischen Gleichgewicht fast ständig statt. (27) Die Aufnahme von - 10 - -Einleitung- Antigenen alleine verursacht keine Reifung der DZ und somit auch keine TZellaktivierung (27). Unreife DZ produzieren keine proinflamatorischen Zytokine (6). 1.2.4.2 Semireife Dendritische Zellen Der Begriff “semireif” wurde gewählt, um ein Entwicklungsstadium der DZ zu beschreiben, welches zwischen dem der ruhenden, unreifen DZ und dem der migrierenden, vollreifen DZ liegt. Abb. 2: Charakterisierung von Dendritischen Zellen in Maus und Mensch (mDZ: myeloische Dendritische Zelle, pDZ: plasmazytoide Dendritische Zelle, CLR: C-Typ Lectin Rezeptor, TLR: Toll-Like Rezeptor) mDZ und pDZ reagieren auf verschiedene bakterielle und virale Stimuli durch ein unterschiedliches Repertoire an Pathogenrezeptoren. Des Weiteren unterscheiden sie sich durch unterschiedliche Moleküle die auf der Zelloberfläche vorhanden sind. Zusätzlich haben menschliche und murine DZ bedeutende Unterschiede in der Expression einiger Oberflächenmarker wie beispielsweise CD33, CD13 oder Gr-1 - 11 - -Einleitung- Semireife DZ können in vitro durch unvollständige Reifung mit TNFα generiert werden. Durch wiederholte Injektion in Mäuse können sie eine peptidspezifische Toleranz gegen die experimentelle autoimmune Encephalomyelitis (EAE) induzieren (28). EAE ist eine artifiziell erzeugte Autoimmunerkrankung, die der Multiplen Sklerose beim Menschen ähnelt (29). Durch Injektion von Peptiden des Myelins in Kombination mit Freundschem Adjuvans kommt es zu einer Entzündung der Myelinscheiden und somit zu einer partiellen Lähmung der Versuchstiere die zum Tode führen kann. Freundschem Adjuvans ist eine die Immunreaktion verstärkende ölige Emulsion. Semireife DZ haben viele Charakteristika der vollreifen DZ wie eine hohe Expression an MHC II, CD80 und CD86. Außerdem exprimieren sie den CCChemokine Rezeptor 7 (CCR7) welcher ihnen ermöglicht, in die Lymphknoten zu migrieren. Sie sind jedoch nicht in der Lage, Zytokine und andere lösliche Mediatoren zu produzieren (26). Es stellt sich die Frage ob in vitro generierte DZ mit solchem Phänotyp auch in vivo eine physiologische Rolle spielen. Weiterführende Experimente zu dieser Thematik haben gezeigt, das die in vitro generierten TNFα DZ nicht den „steady state“ migrierenden DZ in vivo entsprechen. Darüber hinaus findet man sie auch in TNFR1+2 KO Mäusen. Das schließt eine Differenzierung der semireifen DZ durch Einwirkung von TNFα in diesen Mäusen aus (Azukizawa, Lutz, unpubliziert). Ohne dass eine Infektion vorliegt, kommt es bei den DZ und LZ immer wieder zur spontanen Reifung und Migration in die Lymphknoten (9). Dennoch findet hier keine Immunantwort statt, da es zu keiner vollständigen Aktivierung der T-Zellen kommen kann, solange ein „Gefahrensignal“ fehlt. Weitere Experimente haben gezeigt, dass die in vitro generierten TNFα DZ eine Th2-polarisierte oder Tr-1-regulatorische Immunantwort induzieren. Aus diesem Grund vermutet man, dass die Th1 polarisierte Immunreaktion gegen die Experimentelle Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in Mäusen durch Immundeviation und Tr-1-vermittelte IL-10 Produktion blockiert wird. Es gibt jedoch - 12 - -Einleitung- mehrere Hinweise, dass die EAE nicht alleine durch Th1-Zellen vermittelt wird, sondern das auch Th17-Zellen hier eine wichtige Rolle spielen (4). DZ phagozytieren im Körper permanent auch eigenes Zellmaterial abgestorbener Zellen. Spontan gereifte DZ transportieren die so entstehenden Selbstantigene in die lymphatischen Organe zur Induktion von Toleranz (Azukizawa, Kanazawa, Lutz, in Vorbereitung). 1.2.4.3 Vollreife Dendritische Zellen Vollreife DZ sind die klassischen antigenpräsentierenden Zellen die durch den Transport von Antigenen aus den peripheren Organen in den Lymphknoten Immunität gegen eindringende pathogene Erreger erzeugen. Vollreife DZ sind charakterisiert durch viel MHC II, Kostimulation und Zytokinproduktion. Letztere Funktion scheint der entscheidende Unterschied zu semireifen DZ zu sein und bei der differenziellen Induktion von Toleranz und Immunität mitzuwirken (Abb. 4). 1.3 Aktivierung der Effektor T-Zellen Gelangen antigentragende vollreife DZ in die lymphatischen Organe, migrieren sie geleitet durch Chemokine in die T-Zell Areale. Dort präsentieren sie auf Ihrer Oberfläche Antigene auf MHC-Molekülen an T-Zellen, so dass diese zu Effektor TZellen(Teff) differenzieren. Findet sich eine naive T-Zelle die einen T-Zellrezeptor spezifisch für das präsentierte Antigen trägt, kann es zur Aktivierung der T-Zelle kommen. Dies hängt nicht nur von der Spezifität des T-Zellrezeptors ab, sondern auch von weiteren Signalen die die Zelle zur Aktivierung braucht. Neben dem T-Zellrezeptor-Signal sind das die kostimulatorischen Signale sowie bestimmte Zytokine (Siehe Abb. 5). Diese benötigen die T-Zellen um die Proliferation und die Polarisierung zu einer bestimmten T-Zellantwort zu ermöglichen. Auf der Zelloberfläche der T-Zellen wird CD28 konstitutiv exprimiert. Es bindet auf der DZ-Seite an die Kostimulatoren CD80 und CD86, welche der T-Zelle dann ein Signal zur IL-2 Produktion geben. IL-2 ist für die klonale Expansion der T-Zellen - 13 - -Einleitung- von essentieller Bedeutung und wird ohne das zweite Signal durch die DZ nicht produziert (30). Nach Aktivierung der T-Zellen wird auf deren Oberfläche CD154 (CD40L) exprimiert. CD154 liefert ebenfalls ein aktivierendes Signal an die DZ welche in einer stärkeren Expression von kostimulatorischen Molekülen resultiert. Dies verstärkt die Immunantwort. Abb. 4: Die Reifung von DZ und ihre Eigenschaften (LPS: Lipopolysachararid, TNFα: Tumor Nekrose Faktor α, GM-CSF: Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) Aus Vorläuferzellen entstehen unter Einwirkung von GM-CSF und beim Menschen zusätzlich IL-4 unreife DZ. Diese betreiben in hohem Maße Endozytose und exprimieren geringe Mengen an MHC II und kostimulatorischen Molekülen. Durch eine Infektion können sie Signale zur Reifung erhalten. Reife DZ endozytieren weitaus weniger als unreife DZ, exprimieren dafür jedoch mehr kostimulatorische Oberflächenmoleküle und präsentieren große Mengen an aufgenommenen Antigenen auf MHC II Molekülen. Des Weiteren produzieren sie Zytokine und können migrieren. DZ ohne Gefahrensignal nehmen aus den peripheren Organen apoptotisches Zellmaterial auf und erlangen einen „semireifen“ Phänotyp. Diese DZ können zwar ebenfalls migrieren und kostimulatorische Oberflächenmoleküle sowie MHC II exprimieren, jedoch produzieren sie keine Zytokine. Semireife DZ können durch einen Reifungsstimulus wie LPS weiter in vollreife DZ differenzieren. - 14 - -Einleitung- Interaktionen zwischen CD154 und CD40 sind auch bei der „DZ-Lizensierung“ von Bedeutung. Die „DZ-Lizensierung“ ist ein Konzept der Differenzierung von DZ (31). Die DZ erhalten hier durch die CD4 T-Helfer Zellen ein weiteres Signal über CD154 auf den T-Zellen an das CD40 auf den DZ welches ihnen ermöglicht, CD8+ zytotoxische Killer Zellen zu aktivieren (32). Für die Differenzierung in Th1- und Th2-Effektorzellen sind für die T-Zellen weitere Signale notwendig wie die Sekretion von immunmodulatorischen Zytokinen. Das klassische Modell der Immunantworten sah bisher eine Differenzierung in Th1 und Th2-Zellen vor, welche sich durch die Produktion unterschiedlicher Zytokine unterscheiden. Durch Th1-Zellen werden vor allem Phagozyten wie Makrophagen und NK-Zellen und bei der Th2-Antwort B-Zellen aktiviert (34). Aus diesem Grund wurden Th1Antworten als zellvermittelt und Th2-Antworten als humoral bezeichnet. Die Theorie der Th1- und Th2-Antwort hat sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt sodass eine starre Einteilung der Polarisierungen sich mittlerweile als zu eng herausgestellt hat. Eine eindeutige Unterteilung zwischen Th1- und Th2-Antworten in vivo ist nicht möglich. So hat sich zum Beispiel gezeigt, dass IFNγ bei murinen B-Zellen einen Isotyp-Wechsel der Antikörper zu IgG2a bewirken kann (35). Es wurden weitere Polarisationen der T-Zellen entdeckt und verschiedene andere Modi der Immunantworten beschrieben. Daher wurde dem bisherigen System die Th17-Zelle als neuer Typ von Effektor T-Zelle hinzugefügt (4, 36) (Abb.7). - 15 - -Einleitung- Ab bb. 5: Kostimulatorisch he Oberfläch henrezeptorrmoleküle (T Tumornekrosefaktor: TNF F, cytotoxic T-lymphocyt T te antigen 4:: CTLA-4, prrogrammed cell death 1: PD D1, inducible e co-stimulatory molecule e: ICOS, mod difiziert nach h Pardoll (33))) Im m Laufe derr letzten Jah hre hat sich h das Spekttrum der ko ostimulatoriscchen Molekü üle erheblich h errweitert. Auftteilen lassen n sie sich in die B7-Fam milie, die TNF-Familie un nd die Zytok kine. Die B7Fa amilie besteh ht derzeit au us sieben Ob berflächenmo olekülen. B7 7-1 und B7-2 2 sind beide in der Lage e, an n CD28 als sstimulatorisch hes Signal, aber a auch an n CTLA-4 als inhibitorisch hes Signal zu u binden. B7H1 und B7-DC C haben sow wohl stimulatorische als a auch inhibito orische Eigen nschaften auf die T-Zelle e. Ve ermutlich wird das inhib bitorische Signal über den d Ligande en PD1 verrmittelt. Der aktivierende e Lig gand für B7--H1 und B7--DC auf den T-Zellen istt bisher noch h unbekanntt. B7-RP bindet an ICOS S un nd scheint eiine besondere Rolle bei der B-Zell/T T-Zell Interaktion zu spielen. Die Liga anden für B7H3 3 und B7-H4 4 sind bishe er ebenfalls unbekannt. u M Mehrere Mitglieder der T TNF-Familie werden von n AP PZ exprimie ert und bind den an ihre entsprechenden Ligand den auf den n T-Zellen. Die meisten n Mitglieder derr TNF-Rezep ptor-Familie werden auff T-Zellen nach stärker exprimiert sobald s diese e akktiviert wurde en. Dies weiist auf ihre potenziell p wichtige Rolle bei der weiiterführenden n Aktivierung g de er T-Zellen hin. Zyytokine wie IIL-12 entscheiden in hoh hem Maße über ü die Pola arisierung de er Immunanttwort, in dem m sie e die Differe enzierung de er T-Zellen beeinflussen. b . Die genaue en Auswirku ungen der ve erschiedenen n Zyytokine und ihrer Ligande en in Verbind dung mit den n anderen Signalen, die d durch Rezep ptor-Liganden n Interaktionen vermittelt v we erden, bleibt jedoch j noch genauer zu bestimmen. 6- 16 -Einleitung- 1.3.1 T-Helfer 1 Antwort Eine Th1-Antwort wird normalerweise durch DZ, welche IL-12p70 als Signalzytokin ausstoßen hervorgerufen. Dies hat eine Differenzierung der T-Zellen zur Folge, die bei der zellulären Immunantwort helfen sollen (Abb. 6). Th1-Zellen liefern das für die Aktivierung der zytotoxischen Killer Zellen wichtige über CD154 vermittelte Signal an die DZ (36). IL-12 wird von aktivierten DZ in den T-Zell Arealen ausgestoßen (37, 38). Das dort wirksame IL-12 ist das bioaktive IL-12p70, ein Heterodimer, bestehend aus einer p40 und einer p35 Untereinheit (39). Ob und wie viel IL-12 von den DZ produziert wird ist unter anderem von den auf der Oberfläche vorhandenen Pathogenrezeptoren abhängig. Nach neueren Untersuchungen sind weitere Mitglieder der IL-12 Familien, wie IL23 oder IL-27 an der Differenzierung von Th1-Zellen beteiligt (40). Die Entwicklung von Th1-Zellen wird vor allem durch Transkriptionsfaktoren wie STAT-4 und T-bet gesteuert (41). Differenzierte Th1-Zellen zeichnen sich durch die Produktion von IFN-γ aus. 1.3.2 T-Helfer 2 Antwort Th2-Zellen sind die Aktivatoren der B-Zellen und können bei Parasiten- und Pilzinfektionen wirksam sein. Im Unterschied zur Th1- ist der genaue Mechanismus der Th2-Polarisierung noch nicht eindeutig geklärt und ist Gegenstand kontroverser Diskussionen. Anfänglich ging man davon aus, dass allein die Abwesenheit von IL-12 ausreicht, um Th2Immunantworten zu induzieren (42, 43). Neuere Daten weisen darauf hin, dass das benötigte IL-4 von den T-Zellen selbst produziert wird. Dies kann nach Interaktion des Notch-Rezeptors auf den T-Zellen mit dem Jagged-Liganden auf den DZ geschehen (44, 45). In Fällen von parasitären Infektionen wurde von einem - 17 - -Einleitung- bisher unbekannten Zelltyp berichtet der nach Stimulation durch Mastzellen und Makrophagen IL-4 produziert (46). Th2-Zellen liefern wichtige Signale an die B-Zellen zum Beispiel über CD40/CD40L Interaktionen. Dies ist eine Vorraussetzung für deren Aktivierung. Aktivierte BZellen differenzieren zu Plasmazellen die Antikörper produzieren. Die Entwicklung von Th2-Zellen wird vermutlich durch die Transkriptionsfaktoren STAT-6, GATA-3 und c-maf gesteuert (41). Differenzierte Th2-Zellen produzierten IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13. Abb. 6: Signale der Th1 Differenzierung. (DZ: Dendritische Zelle, T-Zellrezeptor: TZR) Eine T-Helfer 1 Antwort kommt durch drei unterschiedliche Signale zustande. Signal 1 ist die Bindung des T-Zellrezeptors in Kombination mit CD4 an den MHC II/Peptid Komplex auf der APZ. Signal 2 ist die IL-2 Produktion verursacht durch die Bindung von CD28 an seine kostimulatorischen Liganden. Das ausgeschüttete IL-2 gibt der Zelle ein Feedback-Signal, wie auch die CD40/CD40L Interaktion bei den DZ die Produktion von IL12p70 verstärkt. Die Bindung von IL12p70 an den IL-12 Rezeptor in Kombination mit den anderen beiden Signalen bewirkt die Th1-Polarisierung der T-Zelle. - 18 - -Einleitung- 1.3.3 T-Helfer-17 Antwort Th17-Zellen sind eine neu definierte Art von Helferzellen die in der Lage sind, IL17A und IL-17F zu produzieren (47). Ursprünglich nahm man an, dass sich dieser Subtyp von T-Helferzellen aus Th1-Vorläuferzellen entwickeln kann (48). Erst spätere Arbeiten deuteten darauf hin, dass es sich um eine eigenständige, von Th1/Th2-Zellen unterscheidende Zelllinie handeln könnte. (49, 50) Th17-Zellen bilden sich unter Einwirkung von IL-6 und TGF-β aus T-Zellen. Bisher wurde vermutet, dass sich TH17-Zellen auch durch IL-23 bilden können (51). IL-23 ist verwandt mit IL-12p70 und hat dieselbe IL-12p40 Kette. Beim IL-23 ist diese jedoch mit einer eigenen p19 Kette verknüpft. Diese Behauptung trifft jedoch nur für aktivierte Gedächtniszellen des Immunsystems, nicht jedoch für naive T-Zellen zu (52). Derzeit vermutet man, das IL-23 den Phänotyp der Th17-Zellen stabilisiert und auf diese antiapoptotisch wirkt und das sich naive T-Zellen in Anwesenheit von TGF-β in Th17 oder Treg entwickeln können. Der entscheidende Faktor könnte IL-6 sein, das die Entwicklung zur Th17-Zelle fördern und die Differenzierung zur Treg hemmen könnte (4). Th17-Zellen wurden vor allem bei Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose, Rheumathoide Arthritis und auch Asthma gefunden. Man vermutet dass diese Zellen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese dieser Krankheiten spielen (4) und vor allem inflammatorische Funktionen haben. Neuere Erkenntnisse weisen darauf in, das EAE in Mäusen auch durch die Einwirkung von Th17-Zellen ausgelöst wird (4). Nach dem derzeitigen Stand der Forschung vermutet man, dass sowohl Th1als auch Th17-Zellen bei der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen beteiligt sein könnten. Diese können jedoch in unterschiedlichen Phasen der Krankheit eine Rolle spielen (4). Ein Transkriptionsfaktor, der bei der Differenzierung der Th17-Zellen eine Rolle spielen könnte ist RORγt (53). - 19 - -Einleitung- Abb. 7: Zytokinabhängigkeit der T-Zell Differenzierung: Nach Aktivierung durch die APZ können die naiven T-Zellen unter Einwirkung von Zytokinen in verschiedene Arten von Effektor- oder Regulatorzellen differenzieren. Th1-Zellen entstehen durch Einwirkung von IL-12p70 und produzieren große Mengen an IFNγ. Th2-Zellen differenzieren durch die Wirkung von IL-4 und können IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13 ausschütten. Die durch Th1- und Th2-Zellen produzierten Zytokine wirken jeweils inhibierend zueinander und haben eine Polarisierung der Immunantwort zur Folge. Th17-Zellen sind eine neu definierte Art von Effektorzellen. Durch IL-6 und TGF-β können diese aus naiven T-Zellen differenzieren. Sie sind in der Lage IL17A und IL-17F auszuschütten. Foxp3+ Treg entstehen normalerweise im Thymus. Unter Einwirkung von TGF-β können diese jedoch auch aus naiven T-Zellen differenzieren. Diese sind in der Abbildung als iTreg (induzierte Treg) gekennzeichnet. - 20 - -Einleitung- 1.4 Toleranz Von Toleranz spricht man im immunologischen Sinne, wenn gegen Selbst- oder Fremdantigene keine Immunität erzeugt wird. Im Allgemeinen unterscheidet man zentrale und periphere Toleranz. Zentrale Toleranz entsteht im Thymus und im Knochenmark. Periphere Toleranz wird durch verschiedene Mechanismen in den peripheren Geweben erzeugt. 1.4.1 Zentrale Toleranz Von zentraler Toleranz spricht man bei der Selektion der entstehenden T-Zellen auf Selbstreaktivität (54). Die entstehenden T-Zellen werden im Thymus zunächst positiv, dann negativ selektioniert. Die Positivselektion findet im Cortex, die Negativselektion in der Medulla des Thymus statt. Der Thymus ist ein primäres lymphatisches Organ oberhalb des Herzens das der Generierung von T-Zellen dient und eine wichtige Rolle bei der Toleranzinduktion spielt (Abb. 8). Positive Selektion ist die Beseitigung von T-Zellen die mit zu niedriger oder Affinität an die eigenen MHC-Moleküle binden. Durch die zufällige Vermischung der TZellrezeptorsegmente bei der V(D)J Rekombination entsteht ein sehr großes TZellrezeptor Repertoire. Nicht alle der so entstandenen Rezeptoren sind geeignet, Peptide auf Selbst-MHC Molekülen zu erkennen. Die Fähigkeit mit niedriger Avidität an die eigenen MHC-Moleküle zu binden ist eine essentiell wichtige Eigenschaft der T-Zellen. Sie ist die Grundvoraussetzung für die Erkennung von Fremdpeptiden. Der zweite darauf folgende Selektionsschritt ist die negative Selektion. Hier werden die T-Zellen auf Autoreaktivität geprüft. - 21 - -Einleitung- Abb. 8: T-Zell Selektion im Thymus (Teff: effektorische T-Zelle, Tauto: autoreaktive T-Zelle, Treg: regulatorische T-Zelle) Im Thymus werden die Thymozyten durch negative und positive Selektion aussortiert. Bei der Negativselektion durchlaufen die Zellen den Thymus und können hierbei an den auf den medullären ThymusEpithelzellen präsentierten Antigene binden. Die Expression dieser Antigene wird durch den Transkriptionsfaktor AIRE reguliert. Diese entsprechen den in den peripheren Geweben exprimierten Antigenen. Nur konventionelle T-Zellen die eine nicht zu hohe Avidität zu den Selbstpeptiden haben dürfen den Thymus als naive T-Zellen verlassen. Die T-Zellen deren Rezeptor zu stark an endogene Peptide bindet werden durch Apoptose beseitigt. T-Zellen mit intermediärer Avidität können im Thymus zu Treg differenzieren oder verlassen den Thymus als potentiell autoreaktive T-Zellen. Abgesehen von ihrer Spezifität für Selbstantigene können die Treg auch kreuzreaktiv für Fremdantigene sein. Diese Treg können eine wichtige Rolle bei der Begrenzung von Immunantworten spielen, da sie nicht die frühe Aktivierung der T-Zellen inhibieren aber eine spätere Expansion begrenzen können. - 22 - -Einleitung- Auf den medullären Epithelzellen werden nahezu alle in den peripheren Organen exprimierten Antigene präsentiert. Die Expression dieser Antigene wird durch den Transkriptionsfaktor AIRE (Auto Immune REgulator) gesteuert (55). Die TZellvorläuferzellen durchlaufen so den Thymus und binden an die auf den Epithelzellen präsentierten Antigene. Bindet ein Rezeptor dieser Zellen zu gut an diese Antigene wird die entsprechende Zelle durch Apoptose beseitigt. 95% der Thymozyten werden so deletiert. T-Zellen die mit einer intermediären Avidität an endogene Antigene binden können in Tregs differenzieren oder sie verlassen den Thymus als autoreaktive Zellen. Binden die T-Zellen mit zu hoher Avidität an Selbstpeptide, kann dies in den peripheren Organen zu einer Aktivierung der T-Zellen führen. Dies kann Autoimmunerkrankungen zur Folge haben. Aus diesem Grund müssen alle TZellen im Thymus zunächst auf die Fähigkeit, Selbstpeptide zu erkennen geprüft und aussortiert werden. 1.4.2 Periphere Toleranz Trotz der Erzeugung von zentraler Toleranz im Thymus, können autoreaktive TZellen in der Peripherie vorkommen, die der negativen Selektion entgehen (56). Damit diese Zellen keinen Schaden anrichten können, gibt es mehrere Mechanismen, die Autoimmunreaktion verhindern. Man unterscheidet zwischen intrinsischen und durch andere Zellen vermittelte extrinsische Mechanismen (56). Intrinsische Fähigkeiten der T-Zellen sind zum Beispiel die Anergie und Deletion durch Apoptose. Anergie kann durch Mangel an kostimulatorischen Molekülen auf den APZ verursacht werden. Die Deletion der T-Zellen kann eine Folge von Überstimulation sein. Dies wird als „activation induced cell death“ (AICD) bezeichnet. Extrinsische Mechanismen umfassen die Suppression durch regulatorische TZellen (Treg). Eine Unterart sind die CD4 und CD25 exprimierenden Treg. Diese können durch Zellkontakt naive T-Zellen (Teff) an der Aktivierung hindern. Des Weiteren gibt es die als „induzierbare“ T-Zellen bezeichneten IL-10 produzierenden - 23 - -Einleitung- CD4+ Tr1-Zellen. Diese können durch Ausschüttung von IL-10 andere T-Zellen auch zellkontaktunabhängig an der Aktivierung hindern (57, 58) (Abb. 10). 1.4.2.1 Anergie Periphere Toleranz kann durch mangelnde Responsivität der T-Zellen entstehen. Diese werden als anergisch bezeichnet. Anergie kann entstehen, wenn die TZellen kein vollständiges Signal zur Aktivierung erhalten. Hierfür wird, neben der Interaktion zwischen T-Zellrezeptor und MHC-Antigenkomplex zusätzlich ein kostimulatorisches Signal der antigenpräsentierenden Zelle benötigt. Unreife DZ können diese kostimulatorischen Signale nicht liefern. DZ reifen in der Regel durch die Erkennung von „Gefahrensignalen“, durch die auf der Zelloberfläche vorhandenen Pathogenrezeptoren. Bleiben die DZ unreif kann dies durch Mangel an Erregern oder durch Immunevasion verursacht werden. Immunevasion ist die Fähigkeit einiger Mikroorganismen die Immunabwehr zu umgehen. Das Herpes-Simplex-Virus kann beispielsweise ebenso wie das humane Zytomegalo-Virus die Reifung von DZ unterbinden und so eine Immunantwort verhindern (59, 60). DZ die zwar für die T-Zellen erkennbare Antigene präsentieren, aber keine kostimulatorischen Moleküle tragen, können die T-Zellen nur suboptimal aktivieren. Kommt es zu ein unvollständigen Aktivierung nur über den T-Zellrezeptor, wird über den Transkriptionsfaktor N-FAT das Molekül CTLA-4 auf den T-Zellen hochreguliert. CTLA-4 vermittelt negative Signale an die T-Zellen. Es bindet mit 10fach höherer Affinität als CD28 an Kostimulatoren wie CD80 und CD86 (33)(siehe Abb. 9). CD28 ist ein Molekül auf den T-Zellen das aktivierende Signale an die Zelle weiterleiten kann. CTLA-4 liefert inhibitorische Signale die unter anderem die IL-2 Produktion verringert (61). IL-2 ist für die klonale Expansion von T-Zellen von essentieller Bedeutung. Viele der anergischen T-Zellen werden anschließend durch Apoptose beseitigt, wenige verweilen noch länger im Körper. (62, 63) - 24 - -Einleitung- 1.4.2.2 Ignoranz Als Ignoranz bezeichnet man eine nicht erfolgende Immunantwort aufgrund der räumlichen Trennung von Antigenen und T-Zellen. Das bedeutet, dass Antigene, die in peripheren Organen exprimiert werden nicht in die Lymphorgane gelangen können, um dort den T-Zellen präsentiert zu werden (64). Bereiche des Körpers, die über eine solche effiziente Blut-Organ-Barriere verfügen werden als immunprivilegierte Bereiche bezeichnet. Eine solche Barriere verhindert das passieren von Zellen des Immunsystems. Das Auge galt bisher als der Prototyp eines immunprivilegierten Organs. Antigene aus dem Auge werden demzufolge nicht in den Lymphorganen präsentiert. Dies ließ darauf schließen, dass Antigene aus dem Auge dem Immunsystem weitestgehend unbekannt waren und periphere Toleranz überwiegend durch Ignoranz vermittelt wurde. Neuere Studien weisen darauf hin, dass auch im Thymus Antigene aus dem Auge exprimiert werden und es somit auch aktive Mechanismen zur Unterdrückung von adaptiven und angeborenen Immunantworten gegen Augenantigene geben kann (64). Ignoranz wurde bisher als theoretischer Mechanismus für Toleranz beschrieben, allerdings konnte dieser Zusammenhang in vivo bisher noch nicht ausreichend nachgewiesen werden. 1.4.2.3 Immundeviation Th1- und TH2-Antwort schließen sich durch unterschiedliche Zytokinprofile gegenseitig aus. Die durch Th1-Zellen produzierten Zytokine hemmen eine Th2Antwort und umgekehrt. Th1 polarisierende Zytokine sind IFNγ und IL-12, Th2 Zytokine sind IL-4, IL-5 und IL-13. Im Körper kann es zu einer humoralen, Th2 gestützten oder zu einer Zellvermittelten Th1-Immunantwort kommen. Eine eindeutige Entscheidung zwischen Th1 und Th2 findet in vivo nie statt, es kommt jedoch zu einer deutlichen - 25 - -Einleitung- Polarisierung. Die Polarisierung zwischen Th1 und Th2 muss nicht immer zur effektivsten Bekämpfung der Erreger führen. Einige Pathogene wie zum Beispiel Leishmania Major nutzen die sich gegenseitig behindernden Ausrichtungen der Immunantworten als Strategie der Immunevasion aus. BALB/c Mäuse entwickeln Th2-Antworten, welche im Falle einer Leishmania-Infektion jedoch nicht zur wirksamen Bekämpfung des Erregers führt. In C57B/6 Mäusen hingegen wird eine wirkungsvolle, auf Zellen und nicht Antikörpern basierende Th1-Antwort initiiert. (65) Bei einigen Autoimmunerkrankungen kann eine Infektion mit einem pathogenen Erreger auch zu einer Linderung der Symptome führen. Dies geschieht durch die Inhibition der Th1-Polarisierten Autoimmunerkrankungen durch Infektionen mit Th2-Polarisierenden Erregern wie zum Beispiel Parasiten. So führte beispielsweise eine Infektion von Morbus Crohn-Patienten mit Würmern der Art Trichuris suis bei den meisten zu einer deutlichen Linderung der Beschwerden (66). Morbus Crohn ist eine Autoimmunerkrankung der Darmschleimhaut. Auch die zunehmende Häufigkeit an Allergien bei Bewohnern westlicher Länder könnte so erklärt werden. Allergien sind Th2-vermittelte Erkrankungen. Durch hohe hygienische Standards fehlen dem Immunsystem die möglicherweise notwendigen Th1-Stimuli die durch Bakterien geliefert werden können. Die Folge ist eine Zunahme an Th2-gerichteten Allergien (67, 68). Diese Theorie wird auch als Hygiene-Hypothese bezeichnet. Sie stellt einen direkten Zusammenhang zwischen fehlenden bakteriellen und parasitären Herausforderungen in westlichen Ländern und der zunehmenden Häufigkeit von allergischen Erkrankungen her. Neuere Studien führen die Zunahme an Allergien auch auf eine Störung des Gleichgewichtes zwischen normalen T-Zellen und Treg zurück. (69, 70) 1.4.2.4 Deletion Induktion von Apoptose kann bei einer Vielzahl von T-Zell Interaktionen vorkommen. Es wurde bereits die apoptotische Beseitigung von ignoranten Zellen - 26 - -Einleitung- als mögliches Beispiel genannt. Durch „activation induced cell death” (AICD) kommt es bei überstimulierten Zellen zur Apoptose und somit zur Begrenzung der Immunantwort. Dies geschieht durch Interaktion von Fas (CD95) auf den T-Zellen mit Fas-L(CD95L). CD95L kann durch viele Zellen in den peripheren Geweben exprimiert werden. Die Induktion von T-Zell Apoptose durch den FAS/FAS-L Signalweg ist überwiegend in den peripheren Organen zu beobachten. Es gibt jedoch auch andere Signalmoleküle die Apoptose in T-Zellen auslösen können wie zum Beispiel TNFα (71, 72). Apoptose im Thymus wird vermutlich über andere Wege vermittelt. Die Beseitigung von sich entwickelnden Thymozyten durch positive oder negative Selektion wird als klonale Deletion bezeichnet (1, 73) 1.4.2.5 Regulation/Suppression Immunreaktionen können durch spezialisierte regulatorische T-Zellen unterdrückt werden. Dies kann durch adaptive wie auch durch natürlich vorkommende Treg und myeloische Suppressorzellen geschehen (74). Ein besonderes Augenmerk soll hier in diesem Falle auf die natürlich vorkommenden, CD4+Foxp3+ Treg geworfen werden (siehe 1.5). 1.4.3 Von einer Autoimmunreaktionen Autoimmunreaktion spricht man, wenn Selbstantigene vom Immunsystem als fremd erkannt werden. Wie genau eine Autoimmunerkrankung entsteht ist noch nicht genau bekannt, jedoch gibt es dazu unterschiedliche Theorien. Dies kann in organspezifischen, als auch in systemischen Autoimmunerkrankungen resultieren. Eine systemische Autoimmunkrankheiten ist zum Beispiel Lupus Erythematosus (SLE). Organspezifische Autoimmunerrankungen sind Multiple Sklerose, Diabetes oder Rheumatoide Arthritis. Schon Paul Ehrlich hat zu beginn des 20. Jahrhunderts bereits mit seinem - 27 - -Einleitung- Konzept des „Horror Autotoxicus“ eine fälschliche Immunreaktion des eigenen Körpers gegen sich selbst formuliert. (75) Die Ursache des Verlustes der Toleranz gegen Selbstantigene ist auch heute, 100 Jahre nach Ehrlichs Hypothese immer noch ungeklärt. Derzeit anerkannte Theorien gehen davon aus, dass erbliche Faktoren wie bestimmte HLA-Allele die Wahrscheinlichkeit eine Autoimmunerkrankung zu bekommen, erhöhen. Ebenso können diverse Umweltfaktoren wie Stress, Infektionen oder auch Schwangerschaft eine Rolle spielen (18). Auch ein Defizit an Treg kann der Grund für ein Versagen der peripheren Toleranz sein Der Verlust an Treg durch einen Defekt am Foxp3-Gen wird beim Menschen als IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, entheropathy, X-linked) Syndrom bezeichnet (76, 77). Patienten mit dem IPEX Syndrom leiden an einer Vielzahl von Autoimmunerkrankungen (78). Mäuse mit einer Veränderung am Foxp3-Gen werden als „scurfy mice“ bezeichnet. Mangel an IL-2 kann ebenfalls zu einem Defizit an Treg und somit zur Entwicklung von autoimmunen Erkrankungen führen. Dies konnte in Mäusen bereits erfolgreich gezeigt werden. Alle IL-2, IL2-Rα (CD25) oder IL-2Rβ (CD122) defizienten Mäuse leiden an schweren Autoimmunerkrankungen und haben eine stark reduzierte Anzahl an Treg (77, 79). Beim Menschen hat ein Defekt im CD25-Gen vergleichbare Auswirkungen auf die Treg Population (80). Diese Erkrankungen werden im Allgemeinen als „IL-2 deficiency syndrome“ bezeichnet. Die Theorie des „Molekularen Mimikry“ geht beispielsweise von einer Infektion als Auslöser einer Autoimmunerkrankung aus (siehe 1.4.3.1) Man vermutet, dass durch eine Immunabwehr gegen pathogene Erreger auch eine Immunreaktion gegen Selbstpeptide initiiert wird. Werden Fremdantigene in den Lymphorganen präsentiert, kommt es zur Aktivierung von T-Zellen. Ähneln diese Antigene bereits vorhandenen Selbstantigenen, kann es zur Immunreaktion der aktivierten T-Zellen gegen körpereigene Zellen kommen. Diese T-Zellen sind dann sowohl reaktiv für das eingedrungene Fremdantigen als auch kreuzreaktiv für die ähnlichen Selbstantigene (siehe Abb. 7). - 28 - -Einleitung- Zudem können „Superantigene“ die Mechanismen einer normalen antigenabhängigen Immunantwort außer Kraft setzen. Superantigene sind Moleküle, die simultan die Rezeptorbindungsstelle von MHC-Klasse Molekülen und T-Zellrezeptoren binden können. Sie werden zum Beispiel von Bakterien produziert. Dadurch kann es zur systemischen Aktivierung der T-Zellen kommen. Staphylococcus aureus und Streptococcus pyogenes sind gut charakterisierte Bakterienarten die mehr als 20 verschiedene Superantigene produzieren (81). 1.5 Regulatorische T-Zellen Man unterscheidet zwischen unterschiedlichen Arten an Treg. Es gibt die als CD4+CD25+Foxp3+ bezeichneten regulatorischen T-Zellen (Treg), die induzierbaren Tr1- sowie die Th3-Zellen. Treg können die Aktivierung von naiven Teff durch Zellkontakt verhindern und spielen eine wichtige Rolle bei der Prävention von Autoimmunerkrankungen. 1.5.1 Th3/Tr1: Adaptive regulatorische T-Zellen Als Th3-Zellen bezeichnet man regulatorische T-Zellen, welche durch TGF-ßSekretion regulieren können und vermutlich eine Rolle bei der oralen Toleranz spielen (82). Sie differenzieren aus den naiven T-Zellen. Tr1-Zellen dagegen sind induzierbare regulatorische T-Zellen, die nach ihrer Aktivierung in der Lage sind große Mengen an IL-10 zu produzieren (83-85). Unter bestimmten Bedingungen sind sie in vivo und in vitro durch antigenspezifische Stimulation induzierbar (86, 87). Aktuelle Forschungsergebnisse belegen, das vor allem pDZ bei der Generierung von Tr1-Zellen eine wichtige Rolle spielen (25). Die Generierung der Tr1-Zellen aus dem naiven T-Zell Repertoire ist eine Folge der ICOS-ICOS-L Interaktion. pDZ exprimieren vor allem im reifen Stadium im Gegensatz zu reifen mDZ sehr viel ICOS-L. - 29 - -Einleitung- Auch unreife mDZ können die Bildung von Tr1-Zellen induzieren. Hierzu wurden unreife, aus humanen Monozyten generierte DZ mehrfach aufeinander folgend mit naiven T-Zellen Inkubiert. Es konnte die Differenzierung eines IL-10 und TGF-β produzierenden T-Zelltyps beobachtet werden. Diese konnten eine T- Zellaktivierung in Abhängigkeit von IL-10 und TGF-β inhibieren (88). Nicht nur unreife, sondern auch tolerogene DZ können die Bildung von Tr1-Zellen induzieren. Tolerogene DZ können durch den Einfluss von biologischen und pharmazeutischen Mitteln entstehen. Immunmodulatorische Zytokine wie IL-10 oder TGF-β, aber auch Allergene wie Lactobacillus Reuteri können zur Bildung von tolerogenen DZ beitragen (89). Abb. 9: Periphäre Toleranzmechanismen (AICD: activation induced cell death, Th1: T-Helfer 1, Th2: T-Helfer 2) Toleranzmechanismen in der Peripherie umfassen entweder intrinsische Eigenschaften der TZellen oder extrinsische Mechanismen, die durch andere Zellen vermittelt werden. Intrinsische Mechanismen sind die Anergie durch mangelnde Kostimulation, die apoptotische Deletion verursacht durch T-Zellrezeptor Stimulation sowie die Ignoranz durch immunprivilegierte Bereiche. Extrinsische Mechanismen umfassen die Immundeviation bedingt durch die gegenseitige Hemmung von Th1- und Th2-Immunantworten sowie die Suppression durch Treg. - 30 - -Einleitung- IL-10 Produktion konnte ebenso in pulmonalen DZ induziert werden. Durch die Verabreichung von Antigenen die intranasal in Mäuse Verabreicht wurden konnte die Entwicklung von IL-10 produzierenden DZ nachgewiesen werden. Die durch OVA stimulierten DZ exprimierten im Gegensatz zu unreifen DZ gesteigerte Mengen an CD80, CD86 sowie CD40 und betrieben verringerte Endozytose (90). Tr1-Zellen können eine T-Zell Expansion in vivo hemmen und sind auch in verschiedenen Krankheitsmodellen in der Maus wirksam (91). So können Tr1Zellen EAE in Mäusen über IL-10 Produktion verhindern (92). Th1- als auch Th2Antworten scheinen durch Tr1-Zellen reguliert werden zu können (93). Neuere Studien zu allergenspezifischen Immuntherapien (SIT) weisen auf die wichtige Rolle antigenspezifischer Tr1-Zellen hin, die sich in den frühen Phasen der Therapie bilden (70, 94).. 1.5.2 Natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen Die CD4+CD25+Foxp3+ Treg standen in dieser Arbeit als Erzeuger von peripherer Toleranz im Mittelpunkt des Interesses. 5 –10% der in peripheren und lymphoiden Organen vorhandenen T-Zellen sind natürlich vorkommende Treg. Murine Treg zeichnen sich durch die hohe Expression von CD25 auch im naiven, unaktivierten Stadium aus und verfügen über den Transkriptionsfaktor Foxp3 (Abb. 11). Es gibt Unterschiede zwischen murinen und humanen T-Zellen. Humane CD4+CD25- T-Zellen können im Gegensatz zu murinen Zellen Foxp3 nach Aktivierung hochregulieren. Dies ist der Grund, warum Foxp3 zur Charakterisierung von menschlichen Treg schlechter geeignet ist, als bei Mäusen (95, 96). CD25 ist kein für die Treg exklusiver Oberflächenmarker. Auch normale T-Zellen exprimieren nach Aktivierung große Mengen dieses Moleküls auf der Zelloberfläche. Eine Unterscheidung zwischen Treg und Teff anhand der CD25Expression ist also nur in unaktiviertem Stadium der T-Zellen möglich. Treg - 31 - -Einleitung- exprimieren konstitutiv die Proteine CTLA-4, OX40, GITR (glucocorticoid-induced tumour-necrosis-factor-related-protein) und LAG3 (Lymphocyte-activation Gene 3) (97, 98). Ein weiteres Molekül zur Identifizierung der Treg ist eine, wenn auch niedrige Expression von CD127 (99). CD127 ist die α-Kette des Interleukin-7 Rezeptors. 1.5.2.1 Bildung der regulatorischen T-Zellen Foxp3+ Treg entwickeln sich im Thymus vermutlich als Folge der Selektion gegen Selbstantigene. Die ersten Experimente, die zeigen konnten, dass immunsuppressive T-Zellen im Thymus heranreifen, beinhalteten neonatale Thymektomien bei Mäusen (100). Hierbei wurde jungen Mäusen 3 Tage nach der Geburt der Thymus entfernt. Im Gegensatz zu der erwarteten Lymphopenie, also dem Mangel an T-Zellen, erkrankten die Mäuse an diversen Autoimmunerkrankungen (101, 102). Der Grund hierfür war ein Mangel an Treg, die sich bis zum Zeitpunkt der Thymusentnahme noch nicht gebildet hatten. Die Treg entwickeln sich langsamer als die normalen TZellen in jungen Mäusen und erreichen erst 3 Wochen nach der Geburt ihre volle Populationsgröße. Die entscheidende Zellpopulation charakterisierten Sakaguchi et al. 1996. Nach Thymusentnahme fanden sie eine stark reduzierte Menge an CD4+CD25+ T-Zellen in den betreffenden Mäusen (103). Diese konnten Autoimmunerkrankungen, die in thymektomisierten und lymphopenischen Mäusen auftreten nach adoptivem Transfer zu verhindern. Die Entwicklung von einer normalen T-Zelle zu einer Treg wird durch den Transkriptionsfaktor Foxp3 als entscheidenden Regulator gesteuert. Dieser Transkriptionsfaktor wurde als Verursacher des IPEX-Syndroms identifiziert (104). - 32 - -Einleitung- Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, das Foxp3 nicht nur wichtig für die Entwicklung der Treg ist, sondern auch für die Aufrechterhaltung des regulatorischen Phänotyps von entscheidender Bedeutung ist (105, 106). Foxp3 gehört zur Proteinfamilie der FOX-Transkriptionsfaktoren und verfügt über eine hoch konservierte DNA-Bindungsdomäne, die als „Forkhead/winged-helixDomain“ bekannt ist (107, 108) Die Treg werden nach dem heutigen Stand der Forschung vermutlich durch Bindung an MHC II mit Selbstpeptiden auf den Epithelzellen des Thymus (TEC) positiv selektioniert. (109, 110) Dass ihre T-Zellrezeptoren vermutlich Selbstantigene erkennen, konnte durch Experimente mit Mäusen, die ein NeoAntigen im Thymus exprimierten gezeigt werden. Die verwendeten Mäuse hatten außerdem T-Zellen, die alle mit einem transgenen T-Zellrezeptor ausgestattet waren. Dieser T-Zellrezeptor war spezifisch für das im Thymus exprimierte Antigen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Anteil an Treg unter den T-Zellen, die für das im Thymus exprimierte Antigen spezifisch waren, stark erhöht war (111-113). Somit konnte gezeigt werden, dass die Entscheidung im Thymus zu Entwicklung zur Treg oder zur Teff maßgeblich von der Avidität für Selbstantigene abhängt. Daraus folgernd wurde die These aufgestellt, dass die Affinität der Treg gegen Selbstpeptide höher ist, als die der normalen T-Zellen (113, 114). Neuere Arbeiten scheinen dieses Konzept jedoch zu widerlegen und die Spezifität der Treg bleibt weiterhin ein kontroverses Thema. Eine Analyse der T-Zellrezeptoren in TCRmini Mäusen konnte zeigen, dass die TZellrezeptoren, die spezifisch für Selbstantigene waren, nicht häufiger in Treg zu finden waren. TCRmini Mäuse haben ein stark verringertes T-ZellrezeptorRepertoire. Durch die Generierung von T-Zell-Hybridomen mit T-Zellrezeptoren die aus Treg stammten konnten die Autoren die Spezifitäten gegen selbst und nichtselbst ermitteln (115). Überraschenderweise fanden sie außerdem, dass sich die Repertoires an T-Zellrezeptoren von Treg und Teff in großem Maße überschnitten (116). - 33 - -Einleitung- Jedoch scheint die Thymusselektion nicht der einzige Mechanismus zur Bildung der Treg zu sein. Neuere Artikel zu diesem Thema differenzieren zwischen natürlich vorkommenden nTreg und induzierbaren iTreg (4). Die Generierung von iTreg in der Peripherie aus normalen naiven T-Zellen konnte beobachtet werden. Dabei wurden Mäuse mit Peptiden in subimmunogenen Dosen infundiert. Es wurden dabei kleine, osmotische Pumpen verwendet die den Mäusen unter die Haut implantiert wurden. Nach einer kontinuierlichen Abgabe von Antigen in sehr geringen Dosen wurde eine Zunahme der Treg Population beobachtet. Die neu entstandenen Treg waren antigenspezifisch (117-119). Aktuelle Untersuchungen haben gezeigt, das sich Treg aus naiven T-Zellen in den peripheren Organen unter Einwirkung von TGF-β entwickeln können (4). Naive TZellen können aber auch unter Anwesenheit von TGF-β und IL-6 in die bereits erwähnten Th17-Zellen differenzieren. Die Entscheidung, ob aus den naiven TZellen Treg oder Th17-Zellen werden, hängt dann vermutlich davon ab ob IL-6 vorhanden ist oder nicht. 1.5.2.2 Eigenschaften Vorherige Arbeiten konnten zeigen, dass Treg die Aktivierung und die Proliferation von CD4+ T-Zellen, von B-Zellen, NK- und NKT-Zellen sowie die Funktionen und die Reifung von DZ in vitro inhibieren konnten. Außerdem hatten sie suppressorische Wirkung auf CD8+ zytotoxische T-Zellen (120, 121). Viele der frühen Arbeiten über Treg wurden mit polyklonalen Populationen in vitro durchgeführt. Die Treg wurden mit CD25- Teff Zellen koinkubiert und entweder mit antigentragenden DZ oder mit Antikörpern gegen den T-Zellrezeptor stimuliert. Die Erkenntnisse aus diesen Experimenten führten zu der Schlussfolgerung, dass Treg die Proliferation und die IL-2-Produktion naiver T-Zellen hemmen (122, 123). Diese Studien zeigen ebenfalls, dass sich die Treg nach Stimulation durch den TZellrezeptor nicht teilten. Diese Information führte zu der Annahme, das Treg in vitro - 34 - -Einleitung- anergisch seien (124, 125). Erst spätere Experimente bewiesen, dass die ursprünglich als antigenpräsentierende Zellen verwendeten Milzzellen nur sehr schwache Stimulatoren von T-Zellen sind. Erst die Verwendung von reifen, aus murinem Knochenmark generierten DZ zeigte, dass Treg auch in vitro proliferieren können (126). TGF-β Abb. 10: Induzierbare und natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen Es gibt unterschiedliche Arten an Treg. 5-10% der naiven T-Zellen gehören zu den Foxp3 exprimierenden natürlich vorkommenden Treg. Diese sind in der Lage, durch Zellkontakt andere Zellen an der Aktivierung zu hindern. Unter Einwirkung von IL-10 können aus den naiven T-Zellen Tr1-Zellen differenzieren. Diese werden als induzierbare regulatorische T-Zellen bezeichnet und produzieren IL-10. IL-10 wirkt hemmend auf naive T-Zellen. - 35 - -Einleitung- Es stellte sich heraus, dass die Treg für ihre Expansion auf exogenes IL-2 angewiesen sind (125). Es kann in vitro und in vivo durch Foxp3- T-Zellen produziert werden. In Zellkulturversuchen war es möglich, Treg unter Zugabe von IL-2 zu expandieren. Die Möglichkeit, antigenspezifische Treg durch Zugabe von IL2 in vitro vermehren zu können ebnete den Weg für neue Experimente. Treg konnten nun in weitaus größeren Mengen verwendet werden. Versuche mit Treg zeigten in vivo, das diese dort nicht anergisch waren (126). Wenn diese in vivo antigenspezifisch aktiviert wurden, begannen sie zu proliferieren. Dies stand im Gegensatz zu den Ergebnissen der in vitro durchgeführten Experimente (127). Zudem unterstützt es die These, dass die Treg auf durch normale T-Zellen produziertes IL-2 angewiesen sind . Treg scheinen die Moleküle CD40, die kostimulatorisch wirkenden Moleküle CD80 und CD86 sowie CD28 für die Bildung oder Aufrechterhaltung ihrer Population zwingend zu benötigen. Knockout-Mäuse die diese Oberflächenproteine nicht exprimieren, haben einen Mangel an Treg und sind besonders anfällig für Autoimmunerkrankungen (128). 1.5.2.3 Dendritische Zellen und regulatorische T-Zellen Die Entscheidung für Toleranz oder Immunität scheint vom Reifegrad der DZ abhängig zu sein (19, 129). Reife DZ, die die entsprechenden Antigene tragen, können Treg zur Proliferation bringen (126). Man vermutet, dass dies eine wichtige Eigenschaft ist, die vor Autoimmunität und chronischer Inflammation schützen kann. Ob reife DZ nicht nur zur Immunität, sondern auch zur Toleranz beitragen können, ist noch nicht genau bekannt. Man vermutet jedoch, das reife DZ nicht nur Teff sondern auch Treg stimulieren und so zur Aufrechterhaltung des immunologischen Gleichgewichtes beitragen. - 36 - -Einleitung- Werden Fremdantigene auf reifen DZ in den Lymphorganen präsentiert, kommt es zur Aktivierung und zur Proliferation der spezifischen T-Zellen. Zusätzlich können auf den reifen DZ auch Selbstantigene von apoptotischen Zellen präsentiert werden. Treg, die für diese Antigene spezifisch sind, könnten so aktiviert werden und proliferieren. Das kann eine Immunreaktion gegen die „harmlosen“ Selbstantigene verhindern, während die fremdantigenspezifischen T-Zellen eine Immunantwort gegen die Fremdpeptide initiieren Aktuelle Studien des menschlichen Thymus zeigen, dass CD4+CD25- Thymozyten in Treg differenzieren und proliferieren, wenn sie mit speziell behandelten DZ kokultiviert wurden. Diese DZ wurden vorher mit Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP) konditioniert (130). TSLP ist ein Zytokin, dass im Thymus von den HassallKörperchen in der Medulla produziert wird. Die so generierten DZ exprimierten große Mengen an kostimulatorischen Molekülen wie CD80 und CD86 auf ihrer Oberfläche. Diese Moleküle sind notwendig für die positive Selektion und die Bildung der Treg (131). 1.5.2.4 Regulatorische T-Zellen in Allergien und Autoimmunerkrankungen Viele Autoimmunerkrankungen und Allergien beruhen nach heutigen Untersuchungen oftmals auf einer schweren Störung des immunologischen Gleichgewichts zwischen den normalen naiven T-Zellen und den Treg.(132) So haben zum Beispiel Allergiker in der Pollensaison eine verringerte Anzahl an Treg spezifisch für das Antigen auf das sie allergisch reagieren (133). Vor allem in Mäusen wurden diverse Krankheitsmodelle untersucht, in denen Treg nachweislich ein wichtige Rolle spielen. Viele der Eigenschaften der Treg sind in vivo noch unbekannt. Versuche mit NODMäusen führten zu einer dramatischen Verringerung der Treg Population (134). NOD-Mäuse sind Inzucht-Mäuse die ab einem Alter von 12 Wochen einen autoimmunen Diabetes entwickeln. Die verringerte Anzahl an Treg führte in den NOD-Mäusen zu einer Beschleunigung des Krankheitsverlaufs. - 37 - -Einleitung- Experimente zeigten, dass Treg den Fortgang der Krankheit verhindern konnten wenn diese in großen Mengen injiziert wurden (135). Die benötigte Menge an Treg die für eine Verhinderung der Diabetes notwendig war, war bedeutend geringer, wenn nicht polyklonale, sondern transgene Treg verwendet wurden. BDC2.5 TZellrezeptor transgene T-Zellen sind spezifisch für ein auf den Insulin produzierenden Zellen exprimiertes Autoantigen (136, 137). Bei der EAE führt die Immunisierung mit verschiedenen Myelinantigenen in Kombination mit Freundschen Adjuvans nach wenigen Tagen zum Ausbruch der Krankheit. Durch den Transfer von T-Zellrezeptor transgenen T-Zellen, die spezifisch für Myelin sind, kann auch hier EAE ausgelöst werden. Allerdings müssen dafür die Treg aus den zu transferierenden T-Zellen zuvor depletiert werden. Durch den Transfer von transgenen Myelin-spezifischen Treg in entsprechende Mäuse konnte die EAE verhindert werden. Interessanterweise konnten die PLP-peptidspezifischen Treg nicht nur EAE die durch PLP-Peptid verursacht war verhindern. Sie verhinderten auch die EAE, die durch mehrere verschiedene Antigene induziert wurde (138, 139). 1.5.2.5 Mechanismen der Regulation Wie genau Treg ihre suppressiven Eigenschaften auf andere T-Zellen übertragen können, ist bisher noch nicht genau bekannt. Nach dem derzeitigen Stand der Forschung scheinen mehrere unterschiedliche Mechanismen daran beteiligt zu sein (140). Damit sie andere T-Zellen regulieren können, müssen Treg antigenspezifisch über ihren T-Zellrezeptor aktiviert werden (141). Nach Aktivierung können sie in vitro zellkontaktabhängig und auch antigenunspezifisch regulieren (124, 142). Diese unspezifische Regulation wird auch als „BystanderRegulation“ bezeichnet (143). - 38 - -Einleitung- 1.5.2.5.1 Die Rolle von IL-2 in vitro Zunächst wurde versucht, den genauen Mechanismus der Suppression durch in vitro Studien aufzuklären. Diese Systeme basierten zumeist auf polyklonalen, aktivierten Treg. Sie konnten die Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Zellen inhibieren. Diese Experimente zeigten, dass Treg anergisch sind und ohne externes IL-2 nicht proliferieren konnten (98). Sie waren selber auch nicht in der Lage IL-2 zu produzieren. Die Zugabe von externem IL-2 reversierte die Suppression. Weitere Experimente mit Knockout-Mäusen zeigten außerdem, dass der Mechanismus unabhängig von IL-10 und TGF-β funktionierte (98). Das Ziel der IL-2 bedingten Suppression scheint die Kontrolle der Transkription des IL-2-Gens in Teff zu sein. Eine genauere Analyse führt zu der Vermutung, das die Treg die anfängliche Produktion von IL-2 durch die Teff benötigen um funktional aktiv zu werden (125). Es ist zudem nicht auszuschließen, das die Teff durch den kompetitiven Verbrauch von IL-2 durch die Treg an der Teilung gehindert werden (144). 1.5.2.5.2 Die Funktionen von CTLA-4, CD80 und CD86 in vitro Neuere Studien zur Suppression in vitro behandeln die Beteiligung von CD80- und CD86 sowie deren Liganden, die auf Treg exprimiert werden (Abb. 9). Das sind beispielsweise CD28 und CTLA-4. Die Moleküle CD80 und CD86, die auch auf T-Zellen exprimiert werden sind für eine Suppression von wichtiger Bedeutung (145). Fehlen sie auf den T-Zellen, ist eine Suppression durch Treg nicht möglich. Ein möglicher Bindungspartner für CD80 und CD86 auf den Treg könnte CTLA-4 sein (146). Das würde die Notwendigkeit von Zellkontakten in vitro für eine erfolgreiche T-Zellsuppression erklären. Diese These über die Interaktion zwischen den Treg und den Teff unterscheidet sich von der postulierten Funktion von CTLA-4 und CD80/86 bei der Bindung zwischen Treg und DZ (Abb. 10). Bei DZ geht man davon aus, das die Bindung von CTLA-4, - 39 - -Einleitung- das auf Treg vorhanden ist Indoleamin 2,3 Dioxygenase (IDO) aktiviert. IDO ist ein Enzym das freies Tryptophan umwandelt. Tryptophan ist eine essentielle Aminosäure. Ihr Mangel verursacht eine reduzierte T-Zellaktivierung. Das würde einen Suppressionsmechanismus beschreiben, der von den APZ abhängig ist (147). In vitro scheint das aber nicht relevant zu sein, da dort auch Suppression in APZ-freien Zellkulturen beobachtet werden konnte (98). 1.5.2.5.3 Die Funktionen von Perforin und Granzym in vitro Die zytolytische Aktivität der Treg wurde ebenfalls als ein möglicher Mechanismus der Suppression untersucht. Humane Treg konnten durch eine Inkubation mit einer Kombination von Antikörpern gegen CD3 und CD46 zur Expression von Granzym A stimuliert werden. Dadurch können sie aktivierte allogene CD4+ und CD8+ TZellen töten. Dieser Mechanismus war unabhängig von FAS/FAS-L Interaktionen (148). Ob das auch bei antigenspezifischer Stimulation der Treg von Bedeutung ist, bleibt aber noch zu Untersuchen. 1.5.2.5.4 Die Rolle von IL-2 in vivo Die Analyse von IL-2- oder IL-2-Rezeptor defizienten Mäusen hat gezeigt, dass IL2 in vivo keinen essentiell notwendigen Wachstumsfaktor für normale T-Zellen darstellt. Effektive Immunantworten konnten trotzdem ablaufen (79). Für die Aufrechterhaltung der Treg Population hat sich IL-2 jedoch als absolut notwendig erwiesen. Mäuse mit verringerten Mengen an Treg litten an multiplen Autoimmunerkrankungen (149). IL-2 scheint jedoch in vivo nicht zwingend für eine erfolgreiche Suppression von Teff durch Treg notwendig zu sein. Sie können auch T-Zellen aus IL-2 Rezeptor defizienten Mäusen an der Proliferation hindern. Dies zeigt, dass die in vitro - 40 - -Einleitung- gezeigte Konkurrenz um das IL-2 zwischen Treg und Teff kein Mechanismus der in vivo Suppression sein kann (150). 1.5.2.5.5 Die Bedeutung von CTLA-4, CD80 und CD86 in vivo Die Relevanz von CTLA-4, CD80 und CD86 in vivo wurde anhand von Experimenten die auf der Grundlage einer Graft-Versus-Host Reaktion durchgeführt wurden, bewiesen. In diesen Versuchen wurden CD4+CD25- T-Zellen aus normalen und CD80/CD86 defizienten Mäusen in Mäuse ohne eigene T-Zellen transplantiert. Die verwendeten lymphopenischen Mäuse hatten einen Defekt am Recombination-Activating Gene 2 (RAG-2). Zusätzlich wurden Treg in die Mäuse injiziert. Ohne Koinjektion von Treg erkranken die Mäuse an einer Vielzahl an Autoimmunerkrankungen. Die Treg konnten die Krankheit bei den Mäusen, die normale T-Zellen injiziert bekommen hatten, verhindern. Die Mäuse die CD80/CD86-Knockout-T-Zellen transplantiert bekommen hatten erkrankten trotz Koinjektion von Treg (140). Diese Befunde unterstützten die zuvor in vitro gewonnen Erkenntnisse das CD80 und CD86 auf T-Zellen vorhanden sein muss, damit diese durch Treg supprimiert werden können. Blockiert man den Rezeptor CTLA-4 auf den Treg, verlieren sie ihre regulatorischen Fähigkeiten (151). - 41 - -Einleitung- Abb. 11: Mögliche auf DZ basierende CTLA-4-abhängige Supressionsmechanismen (Treg: regulatorische T-Zelle, Teff: Effektor T-Zelle, IDO: Indoleamine 2,3 Dioxygenase, TZR) Es werden mehrere verschiedene Wege vorgeschlagen, wie CTLA-4 in der Zellkontakt abhängigen Suppression durch Treg wirken könnte. CTLA-4 auf den Treg könnte direkt mit den kostimulatorischen Molekülen auf den Teff interagieren und ihnen ein ínhibitorisches Signal vermitteln (A). Des Weiteren kann über die Bindung von CTLA-4 auf den Treg mit CD80/86 auf den DZ eine starke Erhöhung der IDO-Expression in den DZ erfolgen. IDO wandelt vorhandenes freies Tryptophan um in Kynurenin. Da Tryptophan eine essentielle Aminosäure ist, reduziert es die T-Zellaktivierung. (B). Eine dritte Möglichkeit ist die direkt Bindung von CTLA-4 auf den Teff mit den Kostimulatoren ohne Anwesenheit von Treg. Das kann zu einer Wechselseitigen Suppression führen und könnte ein Mechanismus der Terminierung von Immunantworten sein (C). - 42 - -Einleitung- 1.5.2.6 Regulatorische T-Zellen in DO11.10 Mäusen Mäuse mit einem transgenen T-Zellrezeptor die auf einem RAG-Knockout Hintergrund generiert wurden haben T-Zellen, die ausschließlich die transgenen TZellrezeptoren exprimieren. Da im Thymus keine T-Zellselektion mehr stattfindet haben diese Mäuse keine Tregs mehr (96). Die in dieser Arbeit verwendeten DO11.10 Mäuse haben T-Zellen, die spezifisch für das auf MHC II Molekülen präsentierte OVA-Epitop 323 – 339 sind (152). Sie wurden jedoch nicht auf einem RAG-Knockout Hintergrund generiert. Das bedeutet, sie exprimieren auf ihren T-Zellen noch eine endogene α-Kette des TZellrezeptors (153). Dies lässt darauf schließen, das die Treg welche im Thymus positiv selektioniert wurden, spezifisch für Selbstantigene sind. Sie sind vermutlich kreuzreaktiv für das verwendete OVA-Peptid (96). Die DO11.10 Treg haben also eine niedrigere Avidität für OVA 323-339 als die DO11.10 Teff. - 43 - -Problemstellung- 2 Problemstellung Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Interaktionen von Treg mit DZ in vivo zu untersuchen. Die genauen Mechanismen der Regulation durch Treg sind bisher unbekannt (Abb. 12). Thematische Schwerpunkte in der vorliegenden Arbeit lagen auf der Treg-Stimulation durch DZ und der Regulation von DZ durch Treg. Aufgrund der vorliegenden in vitro Experimente, galten Treg lange als anergisch. Die Basis dieser Erkenntnis waren die experimentellen Befunde, dass Treg alleine durch Antikörper gegen CD3 und CD28 nicht stimulierbar waren. Sie benötigten auch hohe Dosen an IL-2 um proliferieren zu können. Erst jüngere Arbeiten zeigten, dass es reifer DZ bedurfte, um die Foxp3+ Treg zur Aktivierung und zur Proliferation zu bringen (98, 154, 155). 2.1 Welche Art von DZ wird für Aktivierung und Proliferation der regulatorischen T-Zellen benötigt? Wenn Treg nur durch reife DZ stimulierbar sind, muss folglich eine Bedrohung, also eine Infektion vorliegen, damit APZ mit kostimulatorischen Fähigkeiten in die Lymphatischen Organe einwandern. Da ohne Immunstimulation kein Bedarf an Regulation besteht, würde es Sinn machen, wenn nur reife DZ die suppressorischen Eigenschaften der Treg und deren Expansion hervorrufen könnten, da auch Effektorzellen nur durch reife DZ aktiviert werden können. Eine der Zielsetzungen dieser Arbeit war es, herauszufinden, wie reif eine Dendritische Zelle sein muss um eine Treg stimulieren zu können. Zu diesem Zweck wurden transgene (DO11.10) T-Zellen mit einem für das OVAPeptid spezifischen T-Zellrezeptor mit DZ verschiedenen Reifegrades und Ursprungs stimuliert. Auf diesem Wege sollte ermittelt werden, ob sich Treg auch durch unreife, semireife oder vollreife DZ des myeloischen und des plasmazytoiden Typs stimulieren lassen. Außerdem sollte herausgefunden werden, ob diese dann regulieren können und ob es zur Expansion der Treg kommt. - 44 - -Problemstellung- 2.2 Welches sind die Mechanismen der Regulation in vivo? Vor Beginn dieser Arbeit waren viele Studien über die regulatorischen Mechanismen und deren Vorraussetzungen aus in vitro Versuchen bekannt. Die anfängliche Annahme, dass Treg in vitro von Grund auf anergisch seien, stellte sich als falsch heraus und zeigte die deutlichen Unterschiede zwischen in vitro und in vivo Experimenten. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit sollte die genauere Betrachtung der Suppression sein, die durch Treg vermittelt wird. Außerdem sollten die Untersuchungen zeigen, welche Mechanismen für eine Suppression der naiven TZellen durch die Treg verantwortlich sind. Inwiefern die DZ bei der in vivo Suppression eine Rolle spielen, soll anhand von fluoreszensmikroskopischen Aufnahmen, Oberflächenrezeptoranalysen der DZ und durch die unterschiedliche Reifung der DZ ermittelt werden. 2.1 Welche Funktionen haben regulatorische T-Zellen im Verlauf von Infektionen? Die Rolle der Treg bei der Suppression von naiven T-Zellen ist mittlerweile sowohl in vitro, als auch in vivo dokumentiert. Es stellt sich die Frage, ob die Treg neben dem verhindern von Autoimmunreaktionen auch an Immunantworten gegen Fremdantigene beteiligt sind. Frühe Experimente haben gezeigt, dass es eine unterschiedliche Aktivierungskinetik zwischen den Treg und den Teff aus DO11.10 Mäusen geben kann. - 45 - -Problemstellung- Abb. 12: Interaktionen von Teff und Treg mit DZ (TZR: T-Zellrezeptor, IDO: Indoleamine 2,3 Dioxygenase) Viele Auswirkungen der Interaktionen zwischen Treg, Teff und DZ sind noch weitestgehend unbekannt. Treg können Teff durch verschiedene unterschiedliche Mechanismen an der Proliferation hindern. Beispiele sind die Hemmung der IL-2-Produktion in Teff, die Interaktion zwischen CTLA-4 auf den Treg und CD80/86 auf den Teff oder die Konkurrenz um die TZR-Ag Bindung durch höhere TZR Avidität. Die Treg können außerdem die Expression von IDO in den DZ stimulieren, was einen Mangel an freiem Tryptophan zur Folge haben kann. Tryptophan ist eine essentielle Aminosäure und ein Mangel daran kann die T-Zellaktivierung inhibieren. Ob die Treg noch weiteren Einfluss auf die DZ haben, ist bisher noch nicht genau bewiesen. Möglich ist, dass die Treg in den DZ Apoptose induzieren können oder die Expression von Kostimulatorischen Molekülen verringern. Die DZ liefern das für die T-Zellen notwendige TZR-Signal über die auf den MHC-Molekülen präsentierten Antigene. Zudem geben reife DZ weitere Signale an die T-Zellen über die auf ihrer Oberfläche exprimierten kostimulatorischen Moleküle. Aktivierte Teff können über das auf ihrer Oberfläche vorhandene CD40L durch Bindung an CD40 die DZ „Lizensieren“. Sie erhalten dadurch die Fähigkeit, CD8+ zytotoxische Killerzellen zu aktivieren. Die Bindung von CD40L verursacht außerdem das die DZ mehr kostimulatorische Moleküle exprimieren. - 46 - -Problemstellung- Es wurde beschrieben, dass die DO11.10 Treg im Vergleich zu den Teff. eine niedrigere Avidität für das OVA 323 – 339 Peptid haben. Dies liegt an der Expression einer zusätzlichen endogenen α-Kette des T-Zellrezeptors auf den DO11.10 T-Zellen. Ist die langsamere Aktivierung der Treg bei Stimulation mit OVA-Peptid eine Folge der unterschiedlichen Avidität zum Antigen? Hat diese Unterschiedliche Aktivierungskinetik einen Einfluss auf die Begrenzung von Immunantworten? Da die DO11.10 Mäuse kein OVA im Thymus exprimieren, ist der Transfer der transgene T-Zellen in Mäuse vergleichbar mit der in Abb. 13 beschriebenen „Fremdantigen“ Situation. Durch die Injektion von mit Antigen beladenen DZ in die BALB/c Mäuse treffen die DO11.10 T-Zellen in der Milz auf das Antigen. Die Teff sind hochspezifisch für das verwendete OVA-Antigen, während die Tregs eine niedrigere durch ihre Selektion im Thymus bedingte Avidität aufweisen. Durch die adoptiven Transfers von DO11.10 T-Zellen soll deren Expansion in vivo untersucht werden. Stimuliert durch OVA-Peptid auf zuvor injizierten reifen DZ soll die Expansion der transgenen Teff in An- oder Abwesenheit von DO11,10 Treg gemessen werden (Abb. 13). - 47 - -Problemstellung- Abb. 13: Hypothese: T-Zell Antworten gegen „selbst“ und „nicht-selbst“ und die Rolle der Treg (Treg: regulatorische T-Zellen, Teff: effektorische T-Zellen, Ag: Antigen) Treg und Teff können in Abhängigkeit des präsentierten Antigens auf reifen DZ unterschiedliche Rollen spielen. Diese Hypothese basiert auf der Annahme, dass durch die Selektion im Thymus die Teff und Treg unterschiedliche Aviditäten für Selbstantigene und für „Fremdantigene“ haben. Bei einer Präsentation von Selbstantigenen proliferieren die Treg mit der höheren Avidität schneller als die Teff und können so eine Immunantwort verhindern. Eine Präsentation von Fremdantigenen verursacht eine schnelle Proliferation der Teff, die eine höhere Avidität für diese haben. Die sich langsamer teilenden Treg können die Immunantwort zunächst nicht regulieren und begrenzen erst später die T-Zellproliferation. - 48 - - Material und Methoden - 3 Material und Methoden Sämtliche Chemikalien und Reagenzien wurden von den aufgeführten Firmen bezogen. Dabei entsprachen alle Chemikalien mindestens dem Reinheitsgrad „reinst“. Es wurde stets Reinstwasser aus einer Deionisationsanlage Milli-Q Plus PF (Millipore, Eschborn) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2MΩ/cm3 für die Herstellung aller Lösungen, Puffer und Verdünnungen verwendet. 3.1 Standardlösungen, Puffer und Medien Einfriermedium (für 50ml): 45ml sterilfiltriertes, hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FKS) (PAA Laboratories, Parsching, Österreich) 5ml DMSO (Sigma, Deisenhofen) FACS-Puffer (für 1000ml): 100ml 10x PBS 50ml sterilfiltriertes, hitzeinaktiviertes FKS 10ml 10% Natriumazid (Merck, Darmstadt) 840ml H2O 2% ige Formaldehydlösung 5,4ml 37% Formaldehyd (Roth, Karlsruhe) 96,6ml 1x PBS - 49 - - Material und Methoden - HL-1-Medium (komplett): 500ml HL-1-Medium (BioWhittaker, Verviers, Belgien) 100U/ml Penicillin (Sigma, Deisenhofen) 100µg/ml Streptomycin (Sigma, Deisenhofen) 2mM L-Glutamin (Sigma, Deisenhofen) 50µM 2-Mercaptoethanol (Sigma, Deisenhofen) 10x PBS: 1,37M NaCl (Merck, Darmstadt) 27mM KCl (Roth, Karlsruhe) 43mM Na2HPO4 (Sigma, Deisenhofen) 14mM KH2PO4 (Sigma, Deisenhofen) → Einstellen des pH-Wertes auf 7,4 Zellkulturmedium (R10-Medium): 500ml RPMI1640 (BioWhittaker, Verviers, Belgien) 50ml sterilfiltriertes, hitzeinaktiviertes FKS 100U/ml Penicillin 100µg/ml Streptomycin 2mM L-Glutamin 50µM 2-Mercaptoethanol MACS™ Puffer: 500ml 1X PBS (pH 7,4) 8,3ml 30% BSA 4ml 250 mM EDTA - 50 - - Material und Methoden - Dynal™ Puffer: 500 ml 1X PBS (pH 7,4) 1,66ml 30% BSA Easysep™ Puffer: 500ml 1X BPS (pH 7,4) 2,5ml FKS 3.2 Spezielle Reagenzien 3.2.1 Stimulantien und Zytokine Stimulantien eingesetzte Konzentration Bezugsquelle TNFα 500U/ml PeproTech LPS (E.coli 0127:B8) 1µg/ml Sigma Tab.1: DZ Stimulantien (PeproTech/TEBU, Cölbe; NatuTec, Frankfurt; Sigma, Deisenhofen) 3.2.2 Oligonukleotide ODN Sequenzen Bezugsquelle CpG1668 TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT MWG, TIB Molbiol Tab.2: Oligodinukleotide (ODN) (156) (MWG) - 51 - - Material und Methoden - 3.2.3 Antigene Antigen eingesetzte Konzentration Bezugsquelle OVA 327 - 339 1mg/ml Sigma, Biochemie Erlangen MOG 35 - 55 1mg/ml Biochemie Erlangen Tab.3: Antigene für peptidspezifische Immunisierung (Sigma, Deisenhofen; Calbiochem/Merck, Darmstadt) 3.3 Antikörper Antigen Klon Konjugat Isotyp Konz. Bezugsquelle CD4 RM4-5 FITC rat IgG2a 1:100 BD Pharmingen CD4 RM4-5 APC rat IgG2a 1:100 BD Pharmingen CD4 RM4-5 PerCP rat IgG2a 1:100 BD Pharmingen CD11a TIB-213 SN/Hyb rat IgG2b pure Hybridom CD11b M1-70 PE rat IgG2b 1:100 BD Pharmingen CD11c HL-3 FITC ham IgG 1:100 BD Pharmingen CD11c HL-3 APC ham IgG 1:100 BD Pharmingen CD25 7D4 PE rat IgM 1:10 Miltenyi Biotech CD25 7D4 PE rat IgM 1:100 BD Pharmingen CD40 3/23 PE rat IgG2a 1:100 BD Pharmingen - 52 - - Material und Methoden - CD40 NA/LE 3/23 Pure rat IgG2a 5 µg/ml BD Pharmingen CD45R RA3- PE rat IgG2a 1:100 6B2 CD54 (ICAM-1) YN.1/1. BD Pharmingen SN/Hyb rat IgG2b pure Hybridom PE rat IgG2a 1:100 BD 7.4 CD62L MEL-14 Pharmingen CD69 H1.2F3 Bio ham IgG 1:100 BD Pharmingen CD69 H1.2F3 PE ham IgG 1:100 BD Pharmingen CD80 (B7-1) 16-10A1 PE ham IgG 1:100 BD Pharmingen CD86 (B7-2) GL-1 FITC rat IgG2b 1:100 BD Pharmingen CD86 (B7-2) GL-1 PE rat IgG2b 1:100 BD Pharmingen CD90.2 (Thy1.2) 53-2.1 BIO rat IgG2a 1:200 BD Pharmingen CD273 (B7-DC) TY25 BIO rat IgG2a 1:100 eBioscience CD274 (B7-H1) MIH5 BIO rat IgG2a 1:100 eBioscience DO11.10 TCR KJ1-26 APC mur 1:100 Caltag 1:250 BD IgG2a MHC II M5-114 PE rat IgG2b Pharmingen Tab.4: Antikörper gegen murine Zelloberflächenantigene (FITC = Fluoreszein-Isothiocyanat, APC = Allophycocyanin, PE = Phycoerythrin, BIO = Biotin, SN/Hyb = Hybridoma-supernatant ) - 53 - - Material und Methoden - Antigen Klon Konjugat Isotyp Konzentration Bezugsquelle Steptavidin - PE - 1:200 BD Pharmingen Steptavidin - PerCP - 1:200 CALTAG Tab.5: Sekundärantikörper (CALTAG, Hamburg, BD Pharmingen, Heidelberg Antigen Klon Konjugat Isotyp Konzentration Bezugsquelle Foxp3 FJK-16s PE rat IgG2a 1:100 eBioscience Tab.6: Antikörper für intrazelluläre Färbung (BD Pharmingen, Heidelberg) Isotyp Klon Konjugat Konzentration Bezugsquelle rat IgG1 R3-34 PE 1:100 BD Pharmingen rat IgG2a R35-95 PE 1:100 BD Pharmingen rat IgG2b A95-1 PE 1:100 BD Pharmingen ham IgG C235-2356 PE 1:100 BD Pharmingen rat IgG2a R35-95 FITC 1:100 BD Pharmingen rat IgG2b A95-1 FITC 1:100 BD Pharmingen ham IgG C235-2356 FITC 1:100 BD Pharmingen rat IgG2a R35-95 Bio 1:100 BD Pharmingen Tab.7: Isotypkontrollen Antikörper (BD Pharmingen, Heidelberg) Antigen Annexin V Konjugat Konzentration Bezugsquelle PE 1:100 BD Pharmingen - 1:10 BD Pharmingen 7-AAD Tab.8: Apoptose-Färbung (BD Pharmingen, Heidelberg) - 54 - - Material und Methoden - 3.4 Verwendete Mausstämme Die für die Experimente benötigten C57BL/6 und BALB/c Mäuse wurden entweder von Charles River (Sulzfeld) bezogen oder aus eigener Zucht verwendet. Vorwiegend wurden für diese Versuche Tiere im Alter von 6-12 Wochen eingesetzt. Die verwendeten DO11.10 Mäuse wurden aus eigener Zucht im Alter zwischen 8 – 10 Wochen verwendet. Genehmigung der Tierversuche: Die zum Zwecke immunologischer Untersuchungen am Tier vorgenommenen Immunisierungen und Organentnahmen wurden bei der Gesundheitsbehörde der Stadt Erlangen entsprechend dem Tierschutzgesetz angezeigt. Die Durchführung der genehmigungspflichtigen Versuche Mittelfranken bewilligt. - 55 - wurde vom Regierungspräsidium - Material und Methoden - 3.5 Zellkulturmethoden 3.5.1 Allgemeine Arbeitstechniken mit Zellen 3.5.1.1 Handhabung der Zellen Sämtliche Arbeiten mit Zellkulturen wurden stets unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die verwendeten Zellen wurden unter Normalbedingungen, d.h. bei 5% CO2, wassergesättigte Atmosphäre und 37°C kultiviert. Die Aufbewahrung lebender Zellen während der Versuchsdurchführung erfolgte immer bei 4°C auf Eis. Die Zentrifugationsschritte wurden ebenfalls immer bei 4°C für 5min bei 1200 rpm durchgeführt (Megafuge 2.0R, Heraeus, Hanau). 3.5.1.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen Zum Einfrieren der Zellen wurden diese auf eine Dichte von etwa 1,5x107 Zellen/ml eingestellt und in eiskaltem Einfriermedium aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen langsam auf -80°C abgekühlt und nach etwa 24h in flüssigem Stickstoff transferiert. Zum Auftauen der Zellen wurden diese in einem auf 37°C vorgewärmtem Wasserbad zügig angetaut und rasch in ein ebenfalls auf 37°C warmes Kulturmedium überführt. Um das DMSO zu entfernen, wurden die Zellen abzentrifugiert und in frischem Medium aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen zur Regeneration über Nacht in den Brutschrank gestellt. - 56 - - Material und Methoden - 3.5.1.3 Zellzählung und Vitalitätsbestimmung Um die genaue Zellzahl zu bestimmen, wurden 10µl der Zellsuspension mit 10µl Trypanblaulösung vermengt und mit Hilfe einer Neubauerzählkammer unter dem Lichtmikroskop ausgezählt. Der Farbstoff durchdringt die durchlässig gewordene Membran sterbender und toter Zellen, wodurch diese sich selektiv blau anfärben und somit bei der Zählung außer Acht gelassen werden können. Zu diesem Zweck wurden je 4 mal 4 Quadranten ausgezählt. Zellzahl x 2x104 = Zellen/ml 3.5.1.4 Gewinnung von murinem GM-CSF Kulturüberstand Um GM-CSF angereicherten Kulturüberstand zu erhalten, wurde eine mit dem GMCSF Gen transfizierte Plasmozytom-X63-Ag8-Zelllinie verwendet. Diese wurde freundlicher Weise von Dr. B. Stockinger (London, Großbritannien) zur Verfügung gestellt (157). Nach Auftauen der Zellen wurden diese in 20ml R10-Medium für ca. 2-4 Tage in Zellkulturschalen kultiviert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert, in ca. 100ml frischem R10-Medium aufgenommen und auf Zellkulturflaschen verteilt. Nach etwa 3-4 Tagen, wenn das Medium aufgrund des pH-Wertes einen orange-gelben Farbton angenommen hatte, wurden 80ml der Zellsuspension bei 3000rpm und 4°C für 15min abzentrifugiert und der Überstand in sterile Gefäße überführt. Die restlichen 20ml der Zellsuspension wurden wieder auf 100ml mit frischem R10-Medium eingestellt und für weitere 3-4 Tage kultiviert. Die weitere Durchführung erfolgte wie zuvor beschrieben. Insgesamt wurde diese Prozedur etwa 3-4-mal wiederholt. Vor Verwendung zur Generierung von Knochenmarks DZ wurde der GM-CSF Kulturüberstand sterilfiltriert. Die Zellen wurden entsprechend den Vorschriften der Gentechnik-Verordnung (GVO) entsorgt. Zehn Prozent von diesem GM-CSF Kulturüberstand induzieren optimales Wachstum der DZ. - 57 - - Material und Methoden - 3.5.2 Spezielle Arbeitstechniken mit Zellen 3.5.2.1 Knochenmarkspräparation Nachdem die Mäuse durch Begasung mit CO2 getötet wurden, wurden Femur (Oberschenkel) und Tibia (Unterschenkel) der Hinterläufe unter sterilen Bedingungen freipräpariert und entnommen. Am Knochen anliegendes Gewebe wurde mittels Papiertüchern unsteril entfernt. Im Anschluss wurden die gesäuberten Knochen mit 70% Ethanol in einer Zellkulturschale desinfiziert, um eine anschließende Kontamination der Knochenmarkskultur durch vereinzelte, noch außen am Knochen anhaftende Gewebszellen zu vermeiden. Nach einer Desinfektionszeit von ca. 2min wurden die Knochen aus der Flüssigkeit entnommen und der restliche Alkohol an der Luft verdampft. Anschließend wurden die Knochen an beiden Enden mit einer sterilen Schere geöffnet. Das Knochenmark wurde mit PBS unter der Verwendung einer Kanüle (0,4 x 19mm Nr.20, BD Pharmingen, Heidelberg) aus dem Knochen gespült. Nach einmaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen in R-10 Medium aufgenommen und gezählt. Die Zellausbeute lag bei etwa 4-6x107 Knochenmarkszellen pro Maus, wobei Erythrozyten nicht mitgezählt wurden. 3.5.2.2 Generierung Dendritischer Zellen Die Gewinnung von DZ aus murinem Knochenmark wurde erstmals von Inaba und Mitarbeitern beschrieben (158). Die praktische Durchführung erfolgte nach der von Lutz und Mitarbeitern modifizierten Methode (159). Die isolierten Knochenmarkszellen wurden in einer Dichte von 2x106 Zellen pro Zellkulturschale (Nr. 351005, Falcon, Heidelberg) ausgesät und in einem Volumen von 10ml R10 Medium aufgenommen. Um aus den Knochenmarksvorläuferzellen DZ zu generieren, wurde das Kulturmedium - 58 - - Material und Methoden - zusätzlich mit 10% GM-CMF Kulturüberstand versetzt. Am dritten Tag wurden weitere 10ml R10-Medium, welches 10% GM-CSF Kulturüberstand enthielt, zugegeben. Am Tag sechs und acht wurden jeweils 10ml der Zellsuspension abgenommen und abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet in frischem 10ml R10-Medium plus 10% GM-CSF Kulturüberstand resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen wieder in die ursprüngliche Zellkulturschale überführt. Die DZ wurden je nach Experiment am Tag 8 oder 9 verwendet. Mittels dieser Methode konnte eine Reinheit der DZ von 50-90% (niedrige MHC II Expression: 40-60%, hohe MHC II Expression: 10-30%) erzielt werden. Bei den restlichen Zellen dieser Mischpopulation handelte es sich vorwiegend um adhärente Makrophagen, Zellen mit einer negativen MHC II Expression und Granulozyten (ca. 10%), B-Zellen (5-8%) und T-Zellen (ca.1%). 3.5.2.3 Generierung von plasmazytoiden Dendritischen Zellen Knochenmarkszellen wurden, wie zuvor beschrieben aus Femur und Tibia von BALB/c und C57BL/6 Mäusen gewonnen. Die Zellen wurden mit einer Konzentration von 2x106 Zellen/ml in R10 Medium in einer 10 ml Zellkulturflasche (Falcon) ausgesät. Zu den Zellen wurde humanes Flt3-L mit einer Konzentration von 10 µg/ml zugegeben und für 8 Tage bei 37° im Brutschrank inkubiert. An Tag 8 wurden die Zellen geerntet und gezählt. Mit MACS-Magnetkugeln wurden anschließend die CD11b-positiven Zellen depletiert und die Zellen über Nacht mit 1 µg/ml CpG gereift. Die so erhaltenen Zellen waren CD11b-, CD11c+ und B220+ (Siehe Abb. 19). 3.5.2.4 Lymphknoten- und Milzpräparation als Quelle für T-Zellen Nach Tötung der Mäuse durch CO2 Begasung wurden die Lymphknoten unter sterilen Bedingungen entnommen und in eiskaltem PBS aufbewahrt. Um die Lymphozyten zu isolieren, wurden die Lymphknoten mittels der rauen Seite - 59 - - Material und Methoden - zweier Objektträger zerrieben. Es folgte ein Erythrozytenlyse mit 1,6% Ammoniumchlorid für 5 Minuten bei 37° C. Die nun erythrozytenfreie Lösung wurde anschließend mit PBS gewaschen und durch mehrmaliges Pipettieren weiter zerkleinert und anschließend durch ein Zellsieb (∅ 70µm) gegeben, um größere Gewebeteile von den Lymphozyten zu trennen. Nach zwei Waschschritten mit PBS wurden die Zellen in HL-1 Medium aufgenommen und gezählt. Aus dieser Einzelzellsuspension wurden in den folgend beschriebenen Schritten die T-Zell Unterarten isoliert. 3.5.2.5 Separation von T-Zell Unterarten Die Einzelzellsuspension wurde, wie zuvor beschrieben aus Lymphknoten und Milzen gewonnen. Zur Depletion der CD4-negativen Zellen wurde entweder das „CD4-Negative Isolation Kit“ der Firma Dynal oder das „Easysep-T Cell Separation Kit“ der Firma Cellsystems verwendet. Im Vergleich mit dem Miltenyi-Kit zur negativen Isolation der T-Zellen war die Ausbeute an T-Zellen mit dem Dynal- als auch dem Cellsystems-System besser und günstiger. 3.5.2.6 Isolierung der T-Zellen mit Dynal Magnetkugeln 1x108 wie in 3.5.2.4 beschrieben hergestellte Zellen wurden in 1 ml Dynal-Puffer in einem 50 ml Plastikreaktionsgefäß aufgenommen und mit 200 µl hitzeinaktiviertem FKS gemischt. Die maximal depletierbare Zellzahl pro 50 ml Gefäß sind 2x108 Zellen in 2 ml Puffer. 200 µl des Antikörpergemisches aus αCD45R, αCD11b, αTer-119, αCD16/32 und αCD8 wurden anschließend zu den Zellen gegeben und für 20 Minuten im Kühlschrank aufbewahrt. Durch Zugabe von 30 ml PBS wurden die Zellen dann gewaschen und 8 min bei 1200 RPM und 2-8 °C abzentrifugiert. Die Zellen wurden dann in 10 ml Dynal-Puffer resuspendiert. 2 ml der vorher gewaschenen Dynal-Magnetkugeln wurden zu - 60 - - Material und Methoden - den Zellen gegeben und für weitere 15 min bei Raumtemperatur und konstantem Mischen auf einem Drehrad inkubiert. Zu den Zellen wurden dann 15 ml Puffer hinzugegeben und die Metallkugel-Gebundenen Zellen vorsichtig durch sanftes Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Die Zellsuspension wurde dann in dem 50 ml Reaktionsgefäß für 2 Minuten an den Dynal Magneten gehalten und der Überstand abgekippt. Die in dem Überstand enthaltenen TZellen waren in der Regel über 90% rein. Nach Bedarf wurde der Separationsschritt wiederholt um kleinere Mengen an kontaminierenden Magnetkugeln zu entfernen. 3.5.2.7 Isolierung der T-Zellen mit Cellsystem-Magnetkugeln Die Einzelzellsuspension wurde zuvor wie in 3.5.2.4 beschrieben hergestellt. 1x108 Zellen wurden in 1 ml Easysep-Puffer mit 5% Rattenserum in einem 5 ml Plastikreaktionsgefäß aufgenommen. Die maximale Anzahl an Zellen pro 5 ml Gefäß sollte 2x108 Zellen nicht überschreiten. Pro ml Zellsuspension wurden 50 µl T-Zell Anreicherungscocktail bestehend aus Antikörpern gegen αCD8, αCD11b, αCD19, αCD45R, αCD49b und αTER119 zugegeben und im Kühlschrank inkubiert. Nach 15 Minuten wurden anschließend 100 µl des BiotinSelektionscocktails zu den Zellen gegeben und weitere 15 Minuten im Kühlschrank aufbewahrt. Zuletzt wurden 50 µl/ml der magnetischen Nanopartikel zu den Zellen gegeben, gut gemischt und weitere 15 Minuten im Kühlschrank inkubiert. Das 5 ml Röhrchen wurde danach in den EasysepMagneten für 5 Minuten gestellt und der Überstand aufgefangen. Dieser Separationsschritt wurde 1-mal wiederholt. Die so aufgereinigten T-Zellen waren über 90% rein. - 61 - - Material und Methoden - 3.5.2.8 Isolierung der CD25+ T-Zellen Die aus den oben beschriebenen Aufreinigungsarten gewonnenen T-Zellen wurden nun mit einem PE-gekoppelten, 1: 11 mit MACS-Puffer verdünnten αCD25 Antikörper von Miltenyi gefärbt. Zu erwähnen ist hier, dass der 7D4 Klon der verwendet wurde nicht die Bindung von IL-2 an die IL-2 Rezeptoren inhibiert. 1x107 Zellen wurden in 100 µl Puffer aufgenommen und 10 Minuten bei 4 – 8° C inkubiert. Die Zellsuspension wurde anschließend mit 2 ml MACSPuffer gewaschen und 5 Minuten bei 1200 rpm abzentrifugiert. Danach wurden die Zellen wieder in 100 µl Puffer pro 1x107 Zellen resuspendiert sowie mit den αPE Magnetischen Kugeln des MACS-Kits mit einer 1:10 Verdünnung inkubiert. Nach zweimaligem waschen mit 2 ml MACS-Puffer wurden diese abzentrifugiert und in 500 µl MACS Puffer pro 1x107 Zellen aufgenommen. Kurz vor dem Separationsschritt erfolgte die Vorbereitung der MACSSeparationssäule mit 500 µl MACS-Puffer der in die in dem MiniMACSMagneten eingespannte Säule gegeben wurde. Die entsprechende Separationssäule wurde vorher unter Berücksichtigung der Anzahl der gewünschten positiv-sortierten Zellen ausgewählt. Für die Aufreinigung der regulatorischen Zellen war eine MS-Säule in allen Fällen ausreichend. Separationssäule Max. Anzahl an positiven Max. Zellen Zellen MS 1x107 2x108 LS 1x108 2x109 Tab.9: Kapazitäten der Magnetseparationssäulen (Miltenyi, Bergisch-Gladbach) - 62 - Gesamtanzahl an - Material und Methoden - Nach dem durchlaufen der Zellsuspension wurden anschließend 3-mal je 500 µl MACS-Puffer auf die Säule gegeben um die verbliebenen negativen Zellen in der Säule auszuwaschen. Um die Reinheit der CD25+ Zellen zu erhöhen wurde ein zweiter darauf folgender Separationschritt mit einer weiteren Säule durchgeführt. Die Reinheit der mit dieser Methode gewonnenen Zellen lag bei 90% und höher. 3.5.2.9 Zellmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen Um die verwendeten Zellen nach einer Injektion in vivo wieder zu finden wurden drei verschiedene Fluoreszenzmarker verwendet mit denen lebende Zellen markiert werden können. Die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe Carboxy Fluoroscein Succinimidyl Ester (CFSE), 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CellTracker Blue) und 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino)tetramethylrhodamine (CellTracker Orange) beeinträchtigen die Zellfunktionen nicht und wirken nur sehr leicht zytotoxisch (siehe Abb. 17 + 31) 3.5.2.9.1 Markieren der Zellen mit CFSE (CFDA SE)) Je 2x107 Zellen wurden in je 1 ml PBS aufgenommen. Die CFSE-Lösung wurde aus dem CFSE-Markierungs-Kit von Molecular Probes/Invitrogen (Heidelberg) gemäß den Herstellerangaben vorbereitet. Die im Verhältnis 1:1 in DMSO und PBS gelöste Stocklösung hatte eine Konzentration von 5 µM und wurde durch eine 1:1 Verdünnung mit der Zellsuspension auf eine finale Konzentration von 2,5 µM eingestellt. Die Zellen wurden so für 10 Minuten lichtgeschützt bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend mit PBS gewaschen und 5 Minuten bei 1200 rpm abzentrifugiert. Die nun deutlich grün-gelblichen Zellen wurden nun erneut in PBS gewaschen und anschließend verwendet. - 63 - - Material und Methoden - 3.5.2.9.2 Markieren der Zellen mit CellTracker Blue (CMAC) und CellTracker Orange (CMTMR) Die CellTracker Substanzen zum Fluoreszenzmarkieren von lebenden Zellen sind Choromethyl Derivate die frei durch die Zellwand diffundieren können und dort intrazellulär binden. Die Zellen wurden auf 1x107 Zellen/ml in warmem HL-1 Medium eingestellt. Die CellTracker Substanz wurde nun mit einer finalen Konzentration von 20 µM für das CellTracker Blue und 10 µM für das CellTracker Orange hinzugegeben und 30 min bei 37° C lichtgeschützt inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit warmem HL-1 Medium gewaschen und erneut 30 Minuten lang bei 37° C im Brutschrank aufbewahrt und weiterverwendet. Sowohl das CellTracker Blue als auch das CellTracker Orange wurden von Molecular Probes/Invitrogen, (Heidelberg) bezogen. 3.6 Immunologische Methoden 3.6.1.1 T-Zell-Proliferationstest durch [3H]-Thymidineinbau Die Proliferation der restimulierten Lymphozyten kann in vitro über den Einbau von radioaktiv markiertem [3H]-Thymidin in die DNA der sich teilenden Zellen gemessen werden. Nach der bereits erwähnten 72-stündigen Inkubationsdauer wurde jeweils 1µCi Methyl-[3H]-Thymidin pro Vertiefung zu der Zellsuspension gegeben, die Zellen für weitere 18h inkubiert und anschließend die Kulturen mit einem ICH-110 Erntegerät (Inotech, Dottikon, Schweiz) auf Glasfaserfilter übertragen. Nach dem Trocknen und Einbetten der Filter in Wachs, welches Szintillationsflüssigkeit enthielt, wurden sie unter Verwendung eines 1450 Mikroplattenzähler (Wallac, Turku, Finnland) eingemessen. Aus den jeweiligen Triplikaten wurden die Mittelwerte und die einfache Standardabweichung der - 64 - - Material und Methoden - Radioaktivitäten in „counts per minute“ (cpm) ermittelt, wodurch eine graphische Darstellung in Abhängigkeit zur eingesetzten Antigenkonzentration möglich war. 3.6.1.2 Fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie (FACS) Mit Hilfe der „Fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrie“ ist es möglich, Zellen genauer zu charakterisieren und deren Zytokin- und Proteinexpression auf Einzelzellbasis zu analysieren. Die „side scatter“ Achse (SSC) zeigt die Granularität der Zellen an und die „forward scatter“ Achse (FSC) die Zellgröße und Fluoreszenz von markierten Antikörpern. 3.6.1.3 Extrazelluläre FACS-Färbung Zur phänotypischen Charakterisierung der Zellen wurde die Methode der Durchflusszytometrie angewandt. Die Messung erfolgte mit Hilfe eines Durchflusszytometers (FACScanTM, FACSCanto IITM, BD Pharmingen, Heidelberg,) unter Verwendung der „CellQuestTM“ (BD Pharmingen, Heidelberg) oder der „FACSdivaTM“-Software eingemessen und analysiert. Die Grundlage dieser Methode ist eine Antigen-Antikörper-Reaktion, die unter Verwendung von fluoreszenzfarbstoffmarkierter Antikörper durchgeführt wird. Je Färbung wurden zwischen 1x105 bis 2x106 Zellen eingesetzt. Diese wurden in einem Volumen von 50 - 100µl FACS-Puffer (siehe 3.2) mit den jeweiligen Antikörpern für 30min inkubiert. Um eine photochemische Inaktivierung der Fluoreszenzfarbstoffe zu vermeiden, wurde die Inkubation im Dunkeln und auf Eis durchgeführt. Die nicht direkt markierten monoklonalen Antikörper wurden in einem zweiten Schritt durch fluoreszenzfarbstoffmarkierte (Inkubationsbedingungen wie bei Sekundärantikörper Primärantikörpern). Zur nachgewiesen Kontrolle der Hintergrundfärbung und Kompensation wurden parallel zu jedem Ansatz entsprechende Isotypen-Kontrollantikörper mitgeführt. Die Fixierung der Zellen erfolgte für 15min bei Raumtemperatur durch Verwendung einer 2%-igen - 65 - - Material und Methoden - Formaldehydlösung, welche im Verhältnis 1:1 mit FACS-Puffer eingesetzt wurde. 3.6.1.4 Intrazelluläre FACS-Färbung Die intrazelluläre Analyse der Zytokinexpression wurde unter Verwendung des „Cytofix/Cytoperm PlusTM (mit GolgiStopTM)“ von BD Pharmingen nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Im Gegensatz zur extrazellulären FACS-Analyse, wurden hier pro Ansatz 1x106 Zellen verwendet. Die Messung erfolgte wie bereits im Punkt 3.6.4.1 beschrieben, außer dass hierfür 2x104 morphologisch intakte Zellen aufgenommen wurden. Durch die Zugabe von GolgiStopTM, welches Monensin enthält, wurden intrazelluläre Transportprozesse blockiert, wodurch es zu einer Anreicherung der exprimierten Zytokine im Golgikomplex kam (Inkubationszeit für DZ: 16h, Inkubationszeit für T-Zellen: 6h). Je nach Versuchsansatz wurde vor der intrazellulären Zytokinfärbung erst eine Oberflächenfärbung durchgeführt (siehe 3.6.4.1), um die zytokinproduzierenden Zellen genauer zu charakterisieren. Nach diesem Schritt wurden die Zellen fixiert und die Zellmembran permeabilisiert, um ein Eindringen der Antikörper zu ermöglichen. Die Inkubationszeit erfolgte im Dunkeln für 30-60min auf Eis. Abschließend wurden die Zellen mit einer 2%-igen Formaldehydlösung fixiert. 3.6.1.5 Intrazelluläre Färbung gegen Foxp3 Für die direkte Identifizierung von Treg wurden die Zellen mit dem anti-Maus Foxp3-PE- Kit von eBioscience (San Diego, USA) intrazellulär gefärbt. Zuvor wurden die Zellen noch zusätzlich extrazellulär für verschiedene Oberflächenmarker markiert. Dem Herstellerprotokoll folgend wurde zunächst die Fix/Perm Lösung frisch zubereitet und die Zellen darin in 1x106 Zellen/200 µl aufgenommen. Der Fixiervorgang wurde nicht kürzer als 30 Minuten und nicht - 66 - - Material und Methoden - länger als 3 Stunden durchgeführt. Nach dem fixieren wurden die Zellen mit dem im Kit enthaltenen, verdünnten, 1X Permeabilisierungspuffer gewaschen. Nach dem abzentrifugieren für 5 Minuten bei 1200 rpm wurden die Zellen in 25 µl Permeabilisierungspuffer mit 2% Mausserum resuspendiert. Nach 15 Minuten inkubation bei 4 – 8° C im Kühlschrank wurde der in Permeabilisierungspuffer verdünnte Foxp3-Antikörper mit der Zellsuspension vermischt. Die entgültige Foxp3 Antikörperverdünnung betrug 1: 100. Die Inkubationszeit für den Antikörper betrug 30 Minuten bei 4 – 8° C. Danach wurden die Zellen wieder mit Permeabilisierungspuffer resuspendiert. Die gewaschen FACS-Messung und der in normalem Zellen wurde FACS-Puffer entweder sofort durchgeführt werden oder die Zellen wurden in 1% Paraformaldehyd fixiert und bis zu einer Woche bei 4° C lichtgeschützt aufbewahrt. 3.6.1.6 Apoptose-Färbung Apoptose, welche auch als programmierter Zelltod bezeichnet wird, ist im Unterschied zur Nekrose ein genetisch regulierter Vorgang und somit ein genau kontrolliertes Ereignis, bei dem die Zelle entfernt werden soll. Nachdem es zuerst zur Verklumpung des Chromatins und zu einem Zusammenschrumpfen der Zelle kommt, bilden sich im nächsten Schritt (nach etwa 4-6h) Ausstülpungen der Zellmembran („blebbing“). Durch dieses Umstülpen der Zellmembran gelangt Phosphatidylserin nach außen und kann somit mittels Annexin V, welches mit Fluoreszein-Isothiocyanat (PE) konjugiert ist, detektiert werden. Für die Apoptose-Färbung wurde das „Annexin V/PE Kit“ von BD Pharmingen (Heidelberg) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Um die apoptotischen Zellen von den nekrotischen zu unterscheiden, wurde gleichzeitig eine 7-AAD-Färbung durchgeführt. 7-AAD ist ein Farbstoff der, im Gegensatz zu Propidiumjodid, in Kombination mit AnnexinV-PE verwendet werden kann. Da im Gegensatz zu apoptotischen Zellen die - 67 - - Material und Methoden - Zellmembran bei nekrotischen Zellen durchlässig ist, kann 7-AAD in die Zelle eindringen und sich in die DNA einlagern. 3.7 Mikroskopische Methoden 3.7.1 Präparation lymphatischer Organe 6 – 8 Wochen alten BALB/c oder C57BL/6 Mäusen wurden die Milzen sowie die inguinalen und poplitealen Lymphknoten entnommen. Diese wurden umgehend in Tissue-Tek® O.C.T Compound (Sakura, NL) eingebettet und mit flüssigem Stickstoff in einem 1,5 ml Plastikreaktionsgefäß eingefroren. Die gefrorenen Organe wurden an einem Leica CM3050 S Cryostat (Leica, Wetzlar, Germany) in 10 µm dicke Scheiben geschnitten und mit SuperFrost Plus Objektträgern (Menzel GmbH, Braunschweig, Germany) aufgenommen und bei -20° gelagert. 3.7.2 Immunfluoreszenzfärbung von Gefrierschnitten Die Gefrierschnitte wurden 10 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer aufgetaut und getrocknet. 4% Paraformaldehyd (Merck, Darmstadt, Germany) wurde anschließend für die 20 Minuten dauernde Fixierung der Schnitte verwendet. Nach dem Waschen mit PBS wurde eine Lösung aus 0,1 M Glycin zum Blocken von ungebundenen Aldehydgruppen für 15 Minuten verwendet. Danach folgte eine weitere, 15 Minuten dauernde Inkubation mit einer 2%igen BSA Blocklösung. Nach diesem Schritt konnten nun die entsprechenden Gefrierschnitte Fluoreszenzfarbstoff-Gekoppelten gegeben werden. Die Antikörper entsprechenden auf die Konzentrationen variierten, je nach verwendeten Antikörpern und Sekundärantikörpern (Siehe Tabelle 4). Die Inkubationszeit entsprach jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur. Zwischen den Färbeschritten wurde jeweils dreimal mit PBS gewaschen. Nach dem Färben der Schnitte erfolgte eine Einbettung in - 68 - - Material und Methoden - Fluoromount Eindeckmedium (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany). Die Fluoreszenzanalyse wurde immer sofort nach der Färbung an einem Leica DMRD Forschungsmikroskop durchgeführt. - 69 - (Leica, Wetzlar, Germany) -Ergebnisse - Ergebnisse 4 4.1 Markierung von Dendritischen Zellen und CD4+ T-Zellen mit drei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen. Die Generierung der DZ erfolgte nach der von Lutz und Mitarbeitern beschriebenen Methode aus murinen Knochenmarkszellen (159). Die verwendeten T-Zellen wurden aus BALB/c Mäusen durch Entnahme der Milz und der Lymphknoten Einzelzellsuspension gewonnen. gewonnen und Aus die diesen Organen Erythrozyten mit wurde eine einer 1,6% Ammoniumchloridlösung lysiert. Die CD4-negativen Zellen wurden anschießend depletiert (Siehe Abb. 16). Die so gewonnenen T-Zellen und die DZ wurden dann mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern gefärbt. Daraufhin wurden und mit einer Zytospinzentrifuge auf geschliffene Objektträger übertragen. Die Auswertung der Präparate erfolgte mit einem Leica DMRM Fluoreszenzmikroskop (Abb. 14). DZ und T-Zellen wurden nach demselben Protokoll gefärbt. Es war mit dieser Methode nun möglich, sowohl T-Zellen als auch DZ mit 3 unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen zu markieren und diese damit in vivo wieder zu finden. Sowohl CFSE als auch das CellTracker Orange sind beide im FACS messbar als auch unter dem Fluoreszenzmikroskop zu erkennen. Die CellTracker Substanzen und das CFSE sind nach Herstellerangaben dazu geeignet noch 72h nach Injektion in vivo und über 4 Teilungen hinweg die Zellen klar zu markieren. Die verwendeten Farbstoffe waren in den eingesetzten Konzentrationen nicht zytotoxisch (siehe Abb. 31). 4.2 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Milz Um die Verwendbarkeit der fluoreszenzmarkierten Zellen in vivo zu überprüfen wurden Immunfluoreszenzfärbungen von Kryogewebeschnitten der Milz angefertigt (Abb. 15). Insbesondere die Kompatibilität der verwendeten - 70 - -Ergebnisse - Fluoreszenzfarbstoffe untereinander war hier von Interesse. Durch die spezifische Färbung der Marginalzone sowie der T-Zell Areale der Milz eröffnet sich die Möglichkeit eine klare Aussage über die Migration der DZ und der TZellen nach Injektion in die Mäuse zu treffen. Hierzu wurden die 10 µM dicken Gewebeschnitte mit 4% Paraformaldehyd fixiert und anschließend entweder mit einem Antikörper der direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist, oder unter Verwendung eines Sekundärantikörpers gefärbt. Unspezifische Bindungen wurden vor der Färbung durch eine 2%ige BSA Blocklösung oder unter Verwendung eines gegen FcγR II/III der Maus gerichteten Antikörpers (Klon 2.4G2) minimiert. Abb. 14: Markierung von DZ und CD4+ T-Zellen mit drei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen. Aus Knochenmarkszellen generierte DZ sowie aus Lymphknotenzellen isolierte und mit Magnetkugeln sortierte CD4+ T-Zellen wurden mit CellTracker Blue (20 µM), CellTracker Orange (10 µM) und CFSE (2,5 µM) markiert und unter dem Mikroskop betrachtet. - 71 - -Ergebnisse - Abb. 15: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Milz. 6 – 8 Wochen alten BALB/c Mäusen wurden die Milzen entnommen und diese wurden umgehend mit flüssigem Stickstoff in Tissue-Tek® O.C.T Compound eingefroren. Anschließend wurden daraus 10 µM dicke Gewebeschnitte hergestellt und vor dem markieren mit Fluoreszenzantikörpern mit 4% Paraformaldehyd fixiert. A) Der Milzgewebeschnitt wurde mit einem FITC-gekoppelten Antikörper gegen Sialoadhesin (CD169) gefärbt, der die Marginalzonen-Makrophagen spezifisch markiert. B) Die Marginalzone umschließt die weiße Pulpa, welche vorwiegend T- und B-Zellen enthält. Außerhalb der Marginalzonenscheide liegt der als rote Pulpa bezeichnete Zwischenraum, welcher Makrophagen, Plasmazellen und rote Blutkörperchen enthält. C) Der Gewebeschnitt wurde mit einem aus der Ratte stammenden Antikörper gegen CD4 und einem sekundären, gegen Ratte gerichteten Alexa-555 gekoppelten Antikörper inkubiert. In Rot zu sehen sind die in der weißen Pulpa liegenden T-Zellen. D) Der Maus wurden 24h zuvor 1x107 reife Knochenmarks-DZ injiziert, die zuvor wie beschrieben mit CellTracker Blue markiert wurden. Die reifen DZ wandern primär in die T-Zell Areale innerhalb der weißen Pulpa, die durch die mit CD169-FITC markierte Marginalzone eingeschlossen ist. E) Auf diesem Gewebeschnitt wurden wie in C) die T-Zellen mit an Antikörpergebundenem rotem Alexa555 Farbstoff markiert. Die wie in D) blau gefärbten DZ kolokalisieren mit den TZellen innerhalb der weißen Pulpa. F) Doppelfärbung der Marginalzone in grün und des T-Zell Areals in rot in Kombination mit blau markierten, 24h vorher injizierten DZ. Die schwarzen, kreisrunden Aussparungen am unteren rechten Rand deuten auf die B-Zell Bereiche hin. - 72 - -Ergebnisse - Abbildung 15 A bis C zeigen die Markierung der Marginalzone mit einem gegen CD169 gerichteten, direkt mit FITC-gekoppelten Antikörper. Die T-Zell Areale wurden mit einem für das auf den T-Zellen vorhandene Thy1.2-spezifischen Antikörper gefärbt. Der aus der Ratte stammende Thy1.2 Antikörper wurde zusätzlich mit einem gegen Ratte IgG gerichteten Alexa555 SekundärAntikörper kombiniert. Die mikroskopischen Aufnahmen zeigen deutlich die Abgrenzung der roten und der, die T-Zellen enthaltenden, weißen Pulpa durch die Marginalzone. Um nun die Möglichkeit zu überprüfen, injizierte, fluoreszenzfarbstoffmarkierte DZ in der Milz wieder zu finden, wurden 1x107 reife DZ zuvor mit CellTracker Blue markiert und intravenös in eine BALB/c Maus injiziert. Nach 24h wurden die Milzen entnommen und wie beschrieben zu Kryogewebeschnitten verarbeitet. Die zusätzliche Färbung der Milzen mit dem CD169-FITC Antikörper ergab eine saubere Auftrennung der beiden verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe und eine klare Lokalisation der DZ in der weißen Pulpa (Abb. 15D). Eine Färbung derselben Milzen ergab zusätzlich eine deutliche Kolokalisation der injizierten DZ mit den in der weißen Pulpa enthaltenen T-Zellen (Abb. 15E). Eine Kombination aus den beiden vorhergehenden Färbungen ergab somit die eindeutige Lokalisation der DZ in den T-Zell Arealen der Milz 24h nach Injektion. Bei dieser wurden die DZ in blau, die T-Zellen zusätzlich in rot und die Marginalzone in grün markiert (Abb. 15F). 4.3 Charakterisierung, Isolation und Sortierung von T-Zellen mit MACSMagnetkugeln Da die Aufgabenstellung der Arbeit auf die Interaktion der Treg mit den DZ ausgerichtet ist, wurde eine Möglichkeit benötigt, aufgereinigte Treg, als auch Teff aus murinen Organen zu gewinnen und aufzureinigen. Der Verwendung von Separationssystemen die auf Magnetkugeln basieren wurde hier den Vorzug vor der FACS-Sortierung von Zellen gegeben. Unter Berücksichtigung der benötigten Menge an T-Zellen, der Reinheit der sortierten T-Zell Unterarten und - 73 - -Ergebnisse - den voraussichtlichen Kosten und der Verfügbarkeit der Geräte ergab sich ein klarer Vorteil der Dynal/Cellsystems/Miltenyi-Systeme. Die Aufreinigung der Zellen aus Milzen und Lymphknoten von DO11.10 Mäusen war hierbei in grundsätzlich 2 Schritte einzuteilen: eine Depletion aller CD4-negativen Zellen und darauf folgend eine positive Selektion der Treg basierend auf der Expression von CD25. Es wurden insgesamt 3 verschiedene Systeme zu Depletion der CD4- T-Zellen ausprobiert, die alle auf der Bindung eines Antikörper-Gemisches das spezifisch ist für die unerwünschten Zellen sowie einer Magnetkugelbindung an die verwendeten Antikörper basieren. Das Zellgemisch wurde anschließend an einem starken Magnetfeld vorbeigeführt welches die Magnetkugeln und die daran gebundenen Zellen zurückhielt. Die durchfließende Zellfraktion enthielt nun die gewünschten CD4+ T-Zellen. Das MACS-System von Miltenyi verwendet zusätzliche Magnetsäulen, durch die die Zellsuspension fließen muss. Ein Vergleich der verschiedenen Systeme ergab hier höhere Selektionskosten und eine geringere Ausbeute. Das DynalSystem sowie das Cellsystems-System verwenden hier lediglich einen starken Magneten an den das die Zellen enthaltene Gefäß gehalten wird. Die Reinheit der so gewonnenen Zellen war bei allen 3 Systemen vergleichbar und betrug durchgehend über 85% an reinen CD4+ T-Zellen (Abb. 16). Der zweite Schritt, die positive Sortierung der Treg erfolgte mit dem MiltenyiSystem, welches für diese Aufgabe die einzige Alternative mit dieser Technik darstellte. Der bei der positiven Selektion verwendete Antikörper war gegen murines CD25 gerichtet, der α-Kette des IL-2 Rezeptors. CD25 ist jedoch nur für die Charakterisierung von naiven, unaktivierten Zellen ein zuverlässiges Oberflächenprotein, da aktivierte Teff dieses ebenfalls in großer Menge auf der Oberfläche tragen. Die Selektion mit Foxp3, einem Transkriptionsfaktor, der für Treg exklusiv zu sein scheint, war nicht möglich, da dieser nur intrazellulär exprimiert wird und somit für eine Separation von lebenden Zellen nicht in Frage kommt. Die verwendeten DO11.10 Milzzellen wurden vor der Separation auf die - 74 - -Ergebnisse - Expression des Klonotyp-spezifischen T-Zellrezeptors mit Hilfe des diesen Rezeptor binden KJ1-26 Antikörpers überprüft. Von den CD4+ T-Zellen in den Milzen waren 77% der Zellen mit diesem T-Zellrezeptor ausgestattet. Die Reinheit der gewonnenen Treg betrug immer mehr als 90% (Abb. 16). Abb. 16: Isolation und Sortierung von DO11.0 CD25+ und CD25- T-Zellen mit MACSMagnetkugeln. Aus Milzen und Lymphknoten von DO11.10 Mäusen wurde eine Einzelzellsuspension hergestellt. Die DO11.10 Splenozyten wurden zur Kontrolle mit Antikörpern gegen CD4 sowie CD25, KJ1-26 und intrazelluläres Foxp3 gefärbt. Mit Hilfe von Dynal und EasySep Magnetkugeln wurden dann die CD4-negativen Zellen depletiert. Anschließend erfolgte die Trennung mit MACS-Magnetkugeln in die CD25+ und CD25- Fraktion durch eine MSSeparationssäule. Die Reinheit der so gewonnen Treg war immer > 90%. Die Zahlen in den Quadranten stellen die Prozentzahlen der Subpopulationen dar. - 75 - -Ergebnisse - 4.4 Fluoreszenzmarkierung der regulatorischen T-Zellen beeinflusst deren suppressive Eigenschaften nicht Die Bindung der Fluoreszenzfarbstoffe ist ein nicht unwesentlicher Eingriff in die Physiologie der Zellen. Vor der Verwendung der Zellen musste sichergestellt werden, ob die so markierten Treg noch in der Lage waren, ihre suppressiven Eigenschaften weiterhin auszuüben. Zu diesem Zweck wurden allogene, aus BALB/c Mäusen stammende DZ zusammen mit einer festen Anzahl an C57BL/6 Lymphknotenzellen in vitro inkubiert. Zusätzlich zu den Lymphknotenzellen wurden unterschiedliche Mengen an sortierten C57BL/6 CD25+ Treg hinzugegeben. Nach 72h Inkubation in vitro wurden zu den Zellen 1 µCi Methyl[3H]-Thymidin pro Vertiefung zu der Zellsuspension gegeben und die Zellen für weitere 18h inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen geerntet und die cpm pro Vertiefung mit einem Radioaktiv-Mikroplattenzähler ermittelt. Das [3H] lagerte sich in die DNA der sich teilenden Zellen ein und konnte somit als Maß für die Teilung der sich in der Vertiefung befindlichen T-Zellen gewertet werden. Mit zunehmender Menge an Treg in den Vertiefungen war eine Verringerung der cpm festzustellen, was auf eine zunehmende Suppression der Proliferation der T-Zellen durch die fluoreszenzmarkierte Treg und schließen lässt. unmarkierte Treg Somit die war gleichen gezeigt das suppressiven Eigenschaften besaßen (Abb. 17). 4.5 In vitro Kultivierung von TNFα- und LPS-stimulierten Dendritischen Zellen resultiert in der Aktivierung von regulatorischen und Effektor T-Zellen. Die Formierung von Zellkomplexen alleine war nicht ausreichend als Grundlage für die Beurteilung der T-Zell Aktivierung und Teilung. Es sollten die Expression von Oberflächenmarken und die Proliferation der T-Zellen, gemessen an der CFSE-Verdünnung ermittelt werden. Zu diesem Zweck wurden die bereits - 76 - -Ergebnisse - beschriebenen Kokulturen aus reifen TNFα− oder LPS-gereiften DZ mit und ohne OVA-Peptid und den T-Zell Unterarten per FACS analysiert (Abb. 18). 24h nach dem Mischen der Zellen wurden diese aus den Vertiefungen geerntet und je 2x105 Zellen gegen CD4 und CD25 bzw. CD69 gefärbt. CD69 ist ein frühes Aktivierungsprotein das auf Lymphozyten schon 2h nach Aktivierung nachzuweisen ist (160). Bei den Teff war nach 24h eine deutliche CD69 Expression bei den mit OVAbeladenen DZ zu beobachten. Die DZ ohne OVA-Peptid waren hier nicht in der Lage die T-Zellen zu aktivieren. Die LPS-gereiften DZ waren der stärkere Stimulus für die T-Zellen. Hier waren insgesamt mehr CD69 positive Zellen zu finden. Abb. 17: Fluoreszenzmarkierung der regulatorischen T-Zellen beeinflusst deren immunsuppressive Eigenschaften nicht. Es wurden 1x104 reife BALB/c DZ zusammen mit 2x105 C57BL/6 Lymphknotenzellen in eine 96Loch Platte gegeben und nach 3 Tagen für 16h mit [3H]-Thymidin gepulst. Anschließend wurden sie eingemessen. Die C57BL/6 CD25+ Foxp3+ Treg wurden in steigender Anzahl zu den Zellen hinzugegeben. Die cpm geben die jeweilige 3H-Thymidin Inkorporation an und sind ein Maß für die Proliferation der Zellen. Mit steigender Anzahl an Treg verringerten sich die cpm deutlich. - 77 - -Ergebnisse - Ein Teil der Treg waren 24h nach Kokultur mit den verschieden gereiften DZ ebenfalls positiv für CD69, jedoch geringer als die Teff. Der Unterschied in der CD69 Expression zwischen den mit LPS und den TNFα kokultivierten Treg war hier mit 12% und 14% positiven Zellen allerdings geringer. CD25 ist auf den Treg dauerhaft auf der Oberfläche exprimiert. Selbst ohne Stimulation der Treg mit OVA-Peptid auf den DZ ist hier ein großer Prozentsatz an Zellen CD25 positiv. Durch inkubation mit peptidtragenden, unterschiedlich gereiften DZ wird dieses sogar noch weiter hochreguliert. Zwischen den verschiedenen Reifungsarten der DZ war hier kein Unterschied festzustellen. Fast alle Teff blieben CD25 negativ, was hinsichtlich der nicht vorhanden CD69 Expression auch zu erwarten war. Die mit Peptid stimulierten Teff zeigten, in Übereinstimmung mit der Hochregulation von CD69, auch eine hohe Menge an CD25 auf der Zelloberfläche. Die LPS-gereiften DZ hatten wiederum eine größere Menge an Zellen aktiviert. Somit konnte gezeigt werden, dass reife DZ für die Aktivierung der sortierten Treg und Teff in vitro benötigt wurden, und LPS-gereifte DZ die Teff-Aktivierung besser stimulieren. - 78 - -Ergebnisse - Abb. 18: in vitro Kultivierung von TNFα und LPS stimulierten DZ mit und ohne OVABeladung resultiert in der Aktivierung von Treg und Teff. 2x105 DO11.10 CD25+ und CD25- T-Zellen wurden im Verhältnis von 1:5 mit LPS- und TNFαgereiften DZ in einem Kammerobjektträger für 24h in HL-1 Medium inkubiert. Die DZ wurden zeitgleich mit der Reifung über Nacht mit OVA-Peptid (10 µM) beladen oder unbeladen gelassen. A) CD69 wurde als früher Aktivierungsmarker auf den T-Zellen gemessen. Die Aktivierung der T-Zellen ist antigenspezifisch. Die CD69 Expression war stärker auf den CD25als auf den CD25+ T-Zellen festzustellen. Des Weiteren wurden mehr CD25- T-Zellen durch die LPS-stimulierten DZ zur Expression von CD69 angeregt. B) CD25 als Marker für regulatorische und aktivierte T-Zellen wurde gemessen. Die Treg haben selbst unstimuliert ohne OVA-Beladung eine große Menge CD25-Moleküle auf der Oberfläche. Durch die Aktivierung mit TNFα- und - 79 - -Ergebnisse - LPS-gereiften DZ wird die Expression von CD25 auf den Zellen noch erhöht. Wie bei den ursprünglich CD25-negativen T-Zellen zu sehen ist, wird dies nach Kontakt mit reifen, antigentragenden Zellen hochreguliert. Auch hier war eine stärkere Reaktion der mit LPSgereiften DZ stimulierten Zellen zu beobachten. 4.6 Generierung von plasmazytoiden Dendritischen Zellen durch in vitro Stimulation mit Flt3-L Um den Effekt von pDZ auf die Treg zu untersuchen, wurden aus Knochenmarkszellen unter Verwendung von FLT3-L in vitro pDZ wie beschrieben generiert (161). FLT3-L ist ein Schlüsselzytokin bei der Entwicklung der DZ aus hematopoetischen Stammzellen bei der Maus und beim Menschen (162). Murine pDZ exprimieren genau wie mDZ das Protein CD11c, haben jedoch ein ansonsten unterschiedliches Profil an Oberflächenrezeptoren und Funktionen. pDZ sind mit ihrer Fähigkeit, auf Stimuli wie CpG und virale DNA und RNA mit der Freisetzung großer Mengen von Typ-1 Interferonen zu reagieren ein Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort (163). Die freigesetzten Interferone aktivieren direkt die zytolytischen Fähigkeiten der NK-Zellen. Um Herauszufinden ob die pDZ eine Rolle bei der Aktivierung der Treg spielen, wurden in den folgenden Experimenten die Stimulation der Treg durch die pDZ und die mDZ direkt verglichen. Zunächst wurden die pDZ durch Zugabe von 10µg/ml hFLT3-L aus den Knochenmarkszellen nach 8 Tagen in vitro Inkubation generiert. Anschließend wurden sie mit Hilfe von MACS-Magnetkugeln noch einmal zusätzlich angereichert. Das nach der Generierung entstandene Zellgemisch war heterogen. Neben pDZ waren auch mDZ enthalten. Durch einen αCD11b Antikörper wurden alle CD11b-positiven Zellen mit Magnetkugeln markiert und über eine MACS-MS-Separationssäule gegeben. Die in der Zellsuspension unerwünschten CD11b+ Zellen verblieben so in der Magnetsäule, während die erwünschten aufgereinigten CD11b-negativen Zellen durchliefen und in der Durchflussfraktion gesammelt wurden. - 80 - -Ergebnisse - Eine FACS-Färbung mit CD11c, CD11b und B220 sollte den CD11c+ CD11bB220+ Phänotyp der pDZ bestätigen. Die so aufgereinigten Zellen entsprachen wie die FACS-Analyse zeigte zu einem großen Prozentsatz dem pDZ-Phänotyp. Zum Vergleich wurden parallel mit GM-CSF-Überstand aus Knochenmark generierte mDZ ebenfalls mit den oben beschriebenen Antikörpern gefärbt. Diese waren CD11c+,C11b+, und B220- (Abb. 19). Abb. 19: Generierung von pDZ in vitro mit Flt3L. Knochenmarks-Zellen wurden, wie zuvor beschrieben aus 6-8 Wochen alten BALB/c Mäusen gewonnen und mit 10 µg/ml hFlt3L für 8 Tage in einer 10 ml Zellkulturflasche inkubiert. Zum Vergleich wurden parallel mDZ aus Knochenmarkszellen unter Zugabe von 10% GM-CSF Überstand nach dem etablierten Protokoll hergestellt. Die pDZ wurden zusätzlich an Tag 7 mit CD11b Magnetkugeln angereichert. Die CD11b-positive Fraktion wurde aussortiert. Die Zellen wurden dann über Nacht mit 1 µg/ml CpG gereift und für die Oberflächenmarker CD11c, CD11b und B220 gefärbt. - 81 - -Ergebnisse - 4.7 Reifung von plasmazytoiden DZ und myeloischen DZ durch CpG und LPS über Nacht pDZ besitzen auf ihrer Oberfläche, genau wie die mDZ verschiedene Toll-Like Rezeptoren (TLR), die es Ihnen ermöglichen auf bestimmte Stimuli, verursacht durch pathogene Organismen, mit Reifung und Migration zu reagieren (siehe Abb. 2). Das Pathogenrezeptor-Repertoire der pDZ unterscheidet sich erheblich von dem der mDZ. pDZ haben TLR7 und 9, welches ihnen die schnelle Detektion viraler RNA und DNA ermöglicht. Vor allem TLR9 ist für die Aktivierung der pDZ durch CpG Oligonukleotide verantwortlich, welche bakterielle DNA simulieren. Die pDZ verfügen nicht, im Gegensatz zu den mDZ über TLR 2, 4, 5 oder 3 und reagieren folglich auch nicht auf bakterielle Produkte, wie zum Beispiel Lipopolysaccharide. In diesem Experiment sollen die Möglichkeiten der Reifung der verwendeten DZ evaluiert werden. Als ein, auf pDZ und mDZ wirkender Stimulus waren CpG Oligonukleotide geeignet. Zusätzlich wurden die Zellen mit LPS gereift oder völlig unbehandelt gelassen. MHC II- und CD86-Expression als Indikator für den Reifungszustand der DZ wurden mittels FACS-Färbung auf den Zellen analysiert (Abb. 20). Es ergab sich bei den unbehandelten DZ, welche nicht wie die stimulierten DZ vor der Reifung in einer einzigen Kulturschale gesammelt wurden, ein überwiegend unreifer Phänotyp mit sehr wenig CD86-Protein auf der Oberfläche und einer moderaten MHC II-Expression. Die Reifung der mDZ durch LPS Ü.N. resultierte in einer hohen Anzahl an reifen CD86+ MHC IIhoch exprimierenden DZ, während bei den pDZ der Prozentsatz an reifen DZ gering war. Die Behandlung mit CpG ergab mit 35% einen weitaus höheren Prozentsatz an pDZ, die für CD86 und MHC IIhoch positiv waren. Die mDZ waren mit fast 60% zu einem noch stärkeren Anteil gereift. Somit war gesichert, dass eine Behandlung von mDZ und pDZ mit CpG bei beiden Sorten von DZ zu einem reifen Phänotyp führt. - 82 - -Ergebnisse - 4.8 CD25+ T-Zellen werden durch reife plasmazytoide und myeloische Dendritische Zellen schwächer aktiviert als CD25- T-Zellen Analog zu dem bereits in vitro durchgeführten Experiment (Abb. 18), sollten nun die stimulatorischen Eigenschaften der verschiedenen DZ in vivo untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden 1x107 reife OVA-beladene mDZ und pDZ in BALB/c Mäuse injiziert. 6h später folgte eine Injektion von 2x106 sortierten, aus DO11.10 Mäusen gewonnen Treg- und Teff-Zellen. Die T-Zellen wurden vor der Injektion mit einer 2,5 µM CFSE-Lösung markiert. 20h danach wurden die Milzen entnommen und eine Hälfte für eine spätere fluoreszenzmikroskopische Analyse mit Tissue-Tek® Einbettmedium in flüssigem Stickstoff eingefroren. Abb. 20: Reifung von pDZ und mDZ durch CpG und LPS über Nacht (Ü.N.). Die wie zuvor beschrieben aus Knochenmarkszellen generierten pDZ und mDZ wurden über Nacht mit 1 µg/ml CpG oder 0,1 µg/ml LPS gereift oder unbehandelt gelassen. Zur Kontrolle des Reifegrades der DZ wurde die MHC II- und CD86-Expression auf der Oberfläche der Zellen bestimmt. Die mDZ und die pDZ hatten beide einen reifen Phänotyp und exprimierten CD86und MHC II-Moleküle auf ihrer Oberfläche. Die unbehandelten DZ hatten geringere Mengen an MHC II-Molekülen und fast kein CD86 auf der Oberfläche. Die pDZ waren durch CpG besser zu reifen als mit LPS. - 83 - -Ergebnisse - Die andere Hälfte wurde zu einer Einzellsuspension verarbeitet, mit Antikörpern gegen CD69, CD25 und CD62L gefärbt und umgehend im FACS-Gerät (FACScan, BD-Bioscience) ausgewertet (Abb. 21). In Übereinstimmung mit den zuvor in vitro gewonnenen Daten war auch hier eine starke Aktivierung der Teff durch die reifen mDZ als auch durch die pDZ festzustellen was in einer hohen Expression an CD69, CD25 und einer Herunterregulation von CD62L resultierte. Zwischen den stimulatorischen Eigenschaften der pDZ und mDZ war auch hier kein nennenswerter Unterschied festzustellen. Die mDZ erreichten auf den Teff eine leicht höhere Expression an CD69 mit 96% im Vergleich zu 86% bei den pDZ. Die Treg zeigten ebenfalls eine Aktivierung durch die reifen DZ in vivo. Die CD69 Expression lag hier jedoch mit 34% (mDZ) und 56% (pDZ) weitaus niedriger als bei den vergleichbar angeregten Teff. Die zuvor schon auf CD25-Expression sortierten Treg hatten, auch in Übereinstimmung mit den zuvor erhobenen in vitro Daten, eine starke Expression an CD25 auf der Oberfläche die noch über der der Teff lag. Auch hier war kein Unterschied zwischen den mit den pDZ und mDZ zusammen injizierten Treg festzustellen. CD62L (L-Selektin) gilt als ein Oberflächenprotein das charakteristisch ist für naive T-Zellen. Es wird von diesen benötigt, um in die in den Lymphknoten verlaufenen venösen Gefäße vorzudringen. Dort binden sie an den CD62LLiganden Glycam1 und dringen in die T-Zell Areale ein. Nach Antigenkontakt und Aktivierung wird es von der Zelloberfläche herunterreguliert. Im Vergleich mit naiven, unstimulierten T-Zellen war hier bei allen verwendeten T-Zell Unterarten eine Herunterregulation von CD62L festzustellen (siehe Abb. 21). - 84 - -Ergebnisse - Abb. 21: CD25+ T-Zellen werden durch reife pDZ und mDZ schwächer aktiviert als CD25T-Zellen. Aus Knochenmarkszellen generierte pDZ und mDZ wurden über Nacht mit 1 µg/ml CpG gereift und mit OVA-Peptid beladen (10 µM). 1x107 DZ wurden anschließend intravenös in BALB/c Mäuse injiziert. 6h später wurden 2x106 aus DO11.10 Mäusen sortierte CD25+ und CD25- TZellen mit CFSE markiert und in die Schwanzvene der Mäuse injiziert. Die Milz wurde 20h später entnommen und mit dem FACS-Gerät analysiert. Es wurden CD62L, CD25 und CD69 als Oberflächenmarker auf den Zellen gefärbt. Festzustellen war, dass insbesondere die CD25+ TZellen weniger CD69 hochregulierten als die CD25- T-Zellen. Bei den Treg war außerdem eine Hochregulation von CD25 festzustellen. Eine unterschiedliche Stimulation durch die pDZ im Vergleich zu den mDZ war nicht zu beobachten. Die hier gezeigten Daten sind repräsentativ für 3 Experimente mit ähnlichem Ergebnis. - 85 - -Ergebnisse - 4.9 Unreife plasmazytoide und myeloische Dendritische Zellen sind nicht in der Lage T-Zellen zu aktivieren Um den Einfluss von unreifen DZ auf die Treg in vivo zu untersuchen wurden, wie bereits in Abb. 21 erläutert, mDZ und pDZ in BALB/c Mäuse injiziert. Sortierte, CFSE-markierte Treg und Teff Zellen wurden 6h später ebenfalls in dieselben Mäuse über die Schwanzvene injiziert und die Milzen 20h später analysiert (Abb.22). Die Teff als auch die Treg zeigten so gut wie keine CD69 Expression nach 20h in vivo. Da CD69 schon nach 2h auf der Zelloberfläche nach Aktivierung zu finden sein sollte (160), ist hier keine Stimulation durch die unreifen DZ erfolgt. Zwischen den mDZ und den pDZ war auch hier kein Unterschied festzustellen. CD62L ist hier bei allen T-Zellen mit mindestens über 73% in hohen Mengen vorhanden und zeigt im direkten Vergleich mit den T-Zellen aus Abb. 21 dass dort dieses Oberflächenprotein von der Zelloberfläche entfernt wurde. CD25 konnte nur auf den Treg gefunden werden und zeigt hierzu im direkten Vergleich zu Abb. 21, dass bei deren Aktivierung die α-Kette des IL-2 Rezeptors noch stärker exprimiert wird. Zusammengefasst hatten die pDZ und die mDZ keine unterschiedlichen stimulatorischen Eigenschaften bei Treg als auch bei den Teff. Die Aktivierung der T-Zellen war hier hauptsächlich vom reifen Zustand der DZ abhängig. - 86 - -Ergebnisse - Abb. 22: Unreife pDZ und mDZ sind nicht in der Lage T-Zellen zu aktivieren. Wie zuvor beschrieben aus Knochenmarkszellen generierte pDZ und mDZ wurden über Nacht mit OVA-Peptid beladen (10 µM). Danach wurden 1x107 DZ anschließend intravenös in BALB/c Mäuse injiziert. 6h später wurden 2x106 aus DO11.10 Mäusen sortierte CD25+ und CD25- TZellen mit CFSE markiert und in die Schwanzvene der Mäuse injiziert. Die Milz wurde 20h später entnommen und mit dem FACS-Gerät analysiert. Es wurden CD62L, CD25 und CD69 als Oberflächenmarker auf den Zellen gefärbt. Alle verwendeten T-Zellen zeigten nur schwache Expressionen von CD69. Auch CD25 war nicht in höherer Menge als im naiven Zustand auf den Zellen exprimiert. CD62L, welches bei aktivierten Zellen herunterreguliert wird war ebenfalls noch auf den Zelloberflächen vorhanden. - 87 - -Ergebnisse - 4.10 Sich teilende regulatorische und Effektor T-Zellen, die durch plasmazytoide und myeloische Dendritische Zellen stimuliert wurden behalten ihren Foxp3+ oder Foxp3- Phänotyp. Um nicht nur die Oberflächenproteine nach 20h auf den Treg und den Teff zu untersuchen wurden die wie in Abb. 21 beschrieben injizierten und analysierten Milzen für weitere 4 Tage ex vivo in 24-Loch Zellkulturplatten weiter inkubiert. Nach 4 Tagen wurden die Zellen gegen KJ1-26 und Foxp3 gefärbt und im FACS-Gerät analysiert (Abb. 23). Die hier gezeigten FACS-Abbildungen zeigen die KJ1-26 gefärbten DO11.10 TZellen. Sowohl die mit pDZ als auch die mit mDZ stimulierten Teff Zellen haben sich deutlich, wie durch die CFSE-Verdünnung bewiesen, geteilt. Die Foxp3Färbung zeigt, dass die sich teilenden Zellen ihren Foxp3-negativen Phänotyp behalten und es keine neue Bildung von Treg gegeben hat. Die Foxp3+-positiven Treg haben sich ebenfalls, jedoch deutlich langsamer, geteilt. Die mittlere Fluoreszenz Intensität (MFI) der gezeigten T-Zell Populationen deutet auf eine durchschnittlich höhere CFSE-Intensität der Treg mit 78, im Vergleich zu 51 bei den Teff Zellen hin. Die Treg blieben auch nach der Teilung Foxp3+. Es konnte somit gezeigt werden, dass die aktivierten Treg sich deutlich langsamer teilen als die Teff und beide T-Zell Sorten ihren Phänotyp beibehalten. 4.11 Knochenmarks-Dendritische Zellen zeigen nach Behandlung mit verschiedenen Stimuli über Nacht einen reifen Phänotyp Da, wie zuvor gezeigt, der Reifegrad der DZ vermutlich eine wichtige Rolle bei der Stimulation der T-Zellen spielt, wurden in folgendem Experiment mDZ mit verschiedenen Reifungsreizen über Nacht behandelt. Zusätzlich zu den bisher verwendeten TNFα- und LPS-gereiften DZ wurden die Zellen zusätzlich zum LPS mit 5 µg/ml αCD40 Antikörper (NA/LE) behandelt. CD40 gibt den DZ ein - 88 - -Ergebnisse - zusätzliches, antiapoptotisches und stimulierendes Signal das als „Lizensierung“ bezeichnet wird (164). In vivo erhalten die DZ dieses Signal vermutlich ebenfalls durch aktivierte T-Zellen. Die in den folgenden Experimenten verwendeten Zellen wurden vor und nach der Reifung gegen CD11c, sowie für die kostimulatorischen Proteine CD80 (B71), CD86 (B7-2), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1) sowie MHC II gefärbt (Abb. 24). Ein Vergleich mit den d7 DZ zeigte einen reifen Phänotyp, mit hoher Expression an allen kostimulatorischen Oberflächenproteinen für alle 3 verschieden gereiften DZ. Abb. 23: Sich teilende Treg und Teff die durch pDZ und mDZ stimuliert wurden behalten ihren Foxp3+ oder Foxp3- Phänotyp. Die wie zuvor in Abb. 22 präparierten Milzellen wurden weitere 4 Tage ex vivo inkubiert. Die Zellteilung der enthaltenen T-Zellen wurde mittels der CFSE-verdünnung bestimmt. Zusätzlich wurden die Zellen für Foxp3 gefärbt um zwischen Regulatoren und Effektoren unterscheiden zu können. - 89 - -Ergebnisse - Abb. 24: Gereifte Knochenmarks-DZ ze eigen nach h über Na acht Behandlung mit verschiede enen Stimulli einen reife en Phänotyp p. Murine Kno ochenmarks-DZ wurden nach dem beschriebenen Protokolll generiert und entweder unbehande elt gelassen oder über Nacht mit verschieden nen Reifungs s-Stimuli be ehandelt. Die e Zellen wurrden mit CD D11c und de en angezeig gten Markern n gefärbt. D Die Histogramme zeigen n CD11c+ Ze ellen. Die durchgehend d den Linien zeigen die gefärbten Oberflächen nproteine die e gepunktete en zeigen die e Isotyp-Konttrollen. 9 - 90 -Ergebnisse - 4.12 Intravenös injizierte T-Zellen wandern in die T-Zell Areale der Milz zusammen mit zuvor injizierten antigentragenden Dendritischen Zellen und interagieren dort mit diesen Der zuvor erfolgten FACS-Analyse folgten nun zur weiteren Verifizierung der Ergebnisse fuoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Milzen und Lymphknoten. Um die zuvor intravenös injizierten und fluoreszenzmarkierten DZ und T-Zellen in vivo wieder finden zu können wurden in diesem Experiment 1x107 mit CellTracker Blue markierte reife und OVA-beladene DZ und 2x107 CFSE-markierte CD25- T-Zellen in BALB/c Mäuse injiziert. Abb. 25: Intravenös injizierte T-Zellen und DZ interagieren in der Milz. 1x107 reife, mit OVA-Peptid beladene DZ wurden mit CellTracker Blue (20 µM) markiert und I.V. in BALB/c Mäuse injiziert. 6h später wurden 2x107 aufgereinigte aus DO11.10 Mäusen gewonnene CD25- T-Zellen in die Schwanzvene injiziert. 20h später wurden die Milzen der Mäuse entnommen und Kryoschnitte angefertigt. Die 10 µM dicken Gewebeschnitte wurden mit einem Leica DMRM Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. - 91 - -Ergebnisse - Die Milzen wurden nach 24h entnommen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und zu 10µM dicken Kryogewebeschnitten verarbeitet. Diese wurden anschließend unter dem Fluoreszenzmikroskop analysiert (Abb. 25). Die mit CFSE grün markierten T-Zellen interagieren mit den blau gefärbten DZ in den T-Zell Bereichen der Milz. Die Zellhaufenbildung der T-Zellen um die DZ lässt auf viele Zellkontakte 20h nach Injektion schließen. 4.13 Intravenös injizierte T-Zellen und Dendritische Zellen interagieren in der Milz Nachdem sicher gestellt war, das intravenös injizierte DZ und T-Zellen mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen in vivo wieder gefunden und deren Interaktionen analysiert werden konnten, wurde in den folgenden Experimenten das Verhalten der einzelnen Treg und Teff einzeln und in Kombination miteinander Untersucht. Hierzu wurden die sortierten Treg mit CellTracker Orange und die Teff mit CFSE markiert und mit OVA-beladenen reifen DZ in BALB/c Mäuse injiziert. Die verwendeten DZ wurden zuvor wie beschrieben mit CellTracker Blue markiert. Die 20h nach den Injektionen aus den Milzen hergestellten Kryoschnitte wurden mit dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet (Abb. 26). In Abbildung 26 A) und C) sind deutlich die zuvor je alleine mit den DZ injizierten T-Zell Unterarten zu erkennen, welche in den T-Zell Bereichen der Milzen mit den blau markierten DZ interagieren. Die Kombination aus roten Treg, grünen Teff und blauen DZ in Abbildung 26 C) zeigt hier deutlich das die Treg Zellkontakte sowohl mit den Teff als auch mit den DZ haben. Abb. 26 D) zeigt hier deutlich die in den Lymphknoten verteilten Teff, jedoch sind hier keine DZ zu finden Diese waren zwar in der Lage in die Milz zu wandern, eine Migration zu den Lymphknoten ist ihnen jedoch nicht möglich. In Abb. 26 E) sieht man, nach kombinierter Injektion der Treg und Teff, dass beide Arten von TZellen in die poplitealen Lymphknoten wandern können, jedoch auch hier keine - 92 - -Ergebnisse - DZ zu finden sind. Dies ist in Übereinstimmung mit vorherigen Arbeiten, die gezeigt haben das DZ in die Lymphknoten über die afferenten Lymphgefäße wandern können, jedoch nicht direkt über die Blutbahn (165). Die T-Zellen sind hier gleichmäßig in den T-Zell Bereichen des Lymphknotens verteilt und es zeigten sich, im Gegensatz zu den Milzen keine T-Zell Anhäufungen um die DZ. Abb. 26: Intravenös injizierte rote CD25+ und grüne CD25- T-Zellen migrieren in die T-Zell Areale der Milz und interagieren dort mit blauen DZ. Die injizierten T-Zellen wanderten auch in die Lymphknoten im Gegensatz zu den DZ. Es wurden 1x107 reife, mit OVA-Peptid beladene DZ mit CellTracker Blue (20 µM) markiert und intravenös in BALB/c Mäuse injiziert. 6h später wurden 2x107 aufgereinigte aus DO11.10 Mäusen gewonnene CD25- T-Zellen in die Schwanzvene injiziert. 20h später wurden die Milzen den Mäusen entnommen und davon Kryoschnitte angefertigt. Die 10 µM dicken Gewebeschnitte wurden mit einem Leica DMRM Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. - 93 - -Ergebnisse - 4.14 Die durch regulatorische T-Zellen vermittelte Suppression ist abhängig von deren Voraktivierung in vivo Es konnte in der vorhergehenden Experimenten gezeigt werden, das gleichzeitig injizierte DZ, Treg und Teff in die Milzen migrieren und dort durch Zellkontakt interagieren. Die folgenden Experimente sollten nun klären, inwiefern die Aktivierung und Proliferation der injizierten Teff durch die Treg verhindert werden kann. Es wurden wie zuvor beschrieben 1x107 OVA-beladene, LPS-gereifte DZ in BALB/c Mäuse injiziert. 6h später folgte eine intravenöse Injektion an 4x105 oder 2x106 regulatorischen DO11.10 T-Zellen. Es wurden entweder zeitgleich mit den Treg oder mit 10 und 24h Abstand 2x106 aus DO11.10 Mäusen gewonnene und mit CFSE-markierte Teff zusätzlich in die Mäuse injiziert. Das Verhältnis zwischen den Treg und den Teff betrug 1:5 oder 1:1. Als Kontrolle wurden zusätzlich Mäuse ohne zusätzliche Zugabe von Treg als auch ohne OVA gereifte DZ mit Teff injiziert. 3 Tage nach der Teff Injektion wurden die Milzen entfernt und mit Hilfe eines gegen KJ1-26 und CD4 gerichteten Antikörpers die proliferierenden DO11.10 Teff ausgeschlossen. Die dargestellten Histogramme repräsentieren die CD4+KJ1-26+ T-Zellen der Milzzellsuspension (Abb. 27). Bei gleichzeitig injizierten T-Zellen ist sowohl ohne, als auch mit Treg im Verhältnis 1:5 und 1:1 kein Unterschied in der Zellteilung der Teff festzustellen. Die Treg waren nicht in der Lage die Teff an der Aktivierung und Teilung zu hindern. Ohne OVA auf den DZ war keine Teilung der T-Zellen festzustellen, somit war gesichert dass die T-Zellaktivierung antigenspezifisch war. Bei 10 Stunden Abstand ist eine deutliche Reduzierung der Zellteilung schon im Verhältnis 1:5 zu beobachten. Diese war im Verhältnis von 1:1 zwischen Treg und Teff noch geringer. - 94 - -Ergebnisse - Mit 24h Verzögeru V ng der Tefff Injektion war eine fast vollsttändige Su uppression n der Teff durch die Treg festzusttellen. Die Kontrolle ohne Treg zeigt z hier das d die DZ Z orischen Eigenscha aften hab ben. Somit ist die e noch ihrre vollen stimulato Reduzierrung der Teff ation auf diie Suppres ssion durch h die zuvorr injizierten n e -Prolifera Treg zurücckzuführen n. Hiermit konnte k ge ezeigt werden, dasss die verwendeten n DO11.10 0 Treg be ei gleichzeittiger Injekttion mit den n Teff diese e nicht an der d Zellteillung hindern können. Sie benö ötigen eine en zeitliche en Vorspru ung von mindestens m s 10h um die später injizierten n Teff zu supprimieren n. Abb. 27 Diie Treg vermiittelte Supprression ist a abhängig vo on deren Vo oraktivierung g in vivo. OVA-belad dene oder unbeladene reife r DZ wu urden zusam mmen mit Trreg intravenös in BALB/c c Mäuse injiz ziert. Zusätz zlich wurden CFSE-mark kierte CD25- T-Zellen en ntweder gleic chzeitig oder mit 10 ode er 24h Verspätung in 3 verschied denen Verhä ältnissen injiziert. 3 Tag ge nach der Injektion w wurden die Milzen entn nommen und analysiertt. Die aus den Milzen gewonnene e Einzelzellsuspension wurde w mit Antikörpern A ffür KJ1-26 und u CD4 ge efärbt. Die Histogramme H e 6+ Zellen. Die ese Daten sind repräsen ntativ für 3 un nabhängige Experimente e zeigen die CD4+KJ1-26 mit vergleicchbaren Erge ebnissen. 9 - 95 -Ergebnisse - 4.15 Regulatorische T-Zellen kontrollieren die maximale T-Zellexpansion und begrenzen die T-Zellantwort Da durch das vorhergehende Experiment die Unfähigkeit der Treg, die unmittelbare Proliferation der effektorischen DO11.10 T-Zellen zu verhindern, demonstriert wurde, stellte sich die Frage, inwiefern die Treg Auswirkungen auf die weiterführende Immunantwort der T-Zellen haben. Es wurden je 1x107 Teff und 2x106 Treg in BALB/c Mäuse injiziert. In dieselben Mäuse wurden 6h zuvor 1x107 OVA-beladene LPS-gereifte DZ intravenös injiziert. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurden die Milzen entnommen und die absolute Zellzahl ermittelt. Mit Antikörpern gegen KJ1-26, CD4 und Foxp3 wurden sie anschließend analysiert (Abb. 28). Zu diesem Zweck wurden je 1x106 Milzzellen mit dem FACS-Gerät eingemessen und der Prozentsatz der Foxp3-, KJ1-26+ und CD4+ Zellen gezählt. Die absoluten Zahlen der in der Milz befindlichen DO11.10 Teff wurden anschließend durch die gewonnenen FACSDaten und durch die ermittelte Gesamtzellzahl der Milzen berechnet. Abbildung 28 A) zeigt einen starken Anstieg der Milzgrößen bis zu 5 Tage nach Injektion der DO11.10 Zellen ohne die Anwesenheit der Treg. Bei Koinjektion der Treg sind ein verringertes Zunehmen der Milzgröße und auch eine wieder abnehmende Zellzahl 3 Tage nach Injektion zu beobachten. Die absolute Anzahl an DO11.10 Zellen in der Milz nimmt mit Treg bis Tag 3 nach der Injektion exponential bis auf 1,4x107 Zellen/Milz zu. Bei fehlenden Treg nimmt die Zahl der Zellen bis fast auf 1,8x107 Zellen/Milz zu. Die Zellzahl nimmt jedoch nach Tag 3 nur unter Anwesenheit der Treg wieder bis auf ungefähr 5x106 Zellen/Milz ab, während sich die Zellzahl der Teff ohne Treg fast konstant bei über 1x107 Zellen/Milz hält. Die Treg scheinen also eine die Teff Expansion begrenzende, terminierende Wirkung zu haben, ohne diese jedoch in der Anfangsphase der Proliferation einzuschränken. - 96 - -Ergebnisse - Abb. 28 Treg verhindern nicht die Effektorzellantwort der DO11.10 Zellen sondern kontrollieren die maximale T-Zellexpansion sowie die Begrenzung der T-Zellantwort. OVA-beladene LPS-gereifte DZ und Teff wurden intravenös mit und ohne zusätzliche Treg im Verhältnis 1:5 in BALB/c Mäuse injiziert. A) Die absolute Zellzahl der Milzen wurde zu den angegebenen Tagen nach Erythrozytenlyse bestimmt. B) Die FACS-Analyse der Milzzellen wurde mit murinen Antikörpern gegen CD4, KJ1-26 und Foxp3 durchgeführt. Die KJ126+CD4+Foxp3+ Treg wurden aus der Analyse ausgeschlossen um nur die Expansion der KJ126+CD4+Foxp3- Teff zu verfolgen. Die absoluten Zellzahlen wurden aus der Gesamtzellzahl der Milzen sowie dem prozentualen Anteil der Teff aus der FACS-Analyse errechnet. Die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung vom Mittelwert bestimmt durch die Analyse von Mäusen aus 3 verschiedenen Experimenten mit vergleichbaren Ergebnissen. - 97 - -Ergebnisse - 4.16 Voraktivierte regulatorische T-Zellen verhindern die Bildung von Zellhaufen und individuellen Kontakten zwischen Dendritischen Zellen und T-Zellen sowie zwischen den T-Zellen untereinander Wie in Abbildung 28 gezeigt findet bei gleichzeitiger Injektion von Teff und Treg keine Suppression nach 3 Tagen in vivo statt. Erst ein Vorsprung von mindestens 10h vor den Teff lässt den Treg die Möglichkeit, supprimierend in die Immunantwort auf die injizierten OVA-beladenen DZ einzugreifen. Da keine Proliferation der supprimierten Teff stattfindet, stellt sich also die Frage ob dieser Unterschied auch über fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der entsprechenden Milzen zu beobachten ist. Es konnte hier bereits von anderen Arbeitsgruppen gezeigt werden, dass die Kontakte der Teff zu den DZ unter durch Treg vermittelten suppressiven Bedingungen abnahmen und eine hohe Anzahl an Kontakten der Treg mit den DZ zu beobachten war (166). Vor allem die Evaluierung der Zellkontakte der fluoreszenzmarkierten Zellen untereinander als auch deren Verteilung in den T-Zell Bereichen der Milzen sollten in diesem Experiment im Vordergrund stehen. Es wurden 1x107 reife OVA-beladene und mit CellTracker Blue markierte DZ und je 2x106 mit CellTracker Orange rot markierte regulatorische aus DO11.10 Mäusen sortierte T-Zellen in BALB/c Mäuse injiziert. Hierzu wurde 1x107 CFSEmarkierte DO11.10 Teff entweder gleichzeitig oder mit 24h Verzögerung in die Mäuse intravenös gegeben. Die Milzen wurden je 24h nach Injektion der Teff herausgenommen und Kryopräperate der entnommenen Milzen hergestellt (Abb. 29). Abbildungen 29 A) und C) zeigen hier gleichzeitig injizierte roten Treg, grünen Teff und blaue DZ. Deutlich ist eine Kolokalisation der injizierten Zellen zu sehen, welche dichte Zellhaufen um die blauen OVA-tragenden DZ bilden. Sowohl Kontakte zwischen den verschiedenen T-Zellen als auch der T-Zellen zu den DZ sind vorhanden. - 98 - -Ergebnisse - Abbildungen 29 B) und D) stellen die Zellverteilung unter suppressiven Bedingungen dar. Ein Vergleich mit den proliferierenden Zellen bei gleichzeitiger Injektion zeigt hier schon deutliche Unterschiede in der Gesamtverteilung der Zellen in den T-Zell Arealen. Die Verteilung der supprimierten Teff über die die TZellen enthaltenden Milz-Bereiche ist diffus. Auch finden sich hier keine größeren Zellansammlungen die die dort vorhanden OVA-tragenden DZ umschließen. Eine Quantifizierung der Zellkontakte unter den rot, grün und blau gefärbten Zellen ergibt eine Reduzierung der Kontaktwahrscheinlichkeit zwischen den Teff und den DZ von 30% auf fast 15%. Auch nimmt in der suppressiven Situation überraschenderweise die Zahl der Kontakte zwischen den Treg und den Teff ab. Im Vergleich hierzu bleibt die Kontaktwahrscheinlichkeit zwischen den DZ und den Treg auch in einer suppressiven Situation mit der nicht-suppressiven bei ungefähr 25% vergleichbar. Zusammenfassend kann hier gesagt werden, dass die Zahl der Kontakte 24h nach Injektion der Teff zwischen den Treg und den Teff sich verringern, die Zahl der Kontakte zwischen den Treg und den DZ aber gleich bleibt. Entsprechend der verringerten Aktivierung der Teff bei verzögerter Injektion ist die Kontakthäufigkeit zwischen den Teff und den DZ klar verringert. - 99 - -Ergebnisse - Abb. 29: Voraktivierte Treg verhindern die Bildung von Zellhaufen und individuellen Kontakten zwischen DZ-Teff und Treg-Teff OVA-beladene, LPS-gereifte DZ wurden intravenös in BALB/c Mäuse injiziert. 4h später wurden CellTracker Orange markierte aus DO11.10 Mäusen gewonnene Treg intravenös in dieselben Tiere injiziert. CFSE-markierte Teff wurden entweder gleichzeitig oder mit 24h Verzögerung im Verhältnis 1:5 (Treg/Teff) injiziert. Von den Milzen wurden 20h nach Injektion der Teff Kryoschnitte - 100 - -Ergebnisse - hergestellt und unter dem Fluoreszenzmikroskop analysiert. A) + C) Die CFSE-markierten Teff wurden zeitgleich mit den Treg injiziert. Eine deutliche Zellhaufenbildung mit zahlreichen Kontakten zwischen den blauen DZ und den grünen Teff und den roten Treg ist zu beobachten. B) + D) Die CFSE-markierten Teff wurden mit 24h Verzögerung nach den Treg injiziert. Die T-Zellen sind breit gefächert über die T-Zell Areale verstreut und zeigen eine reduzierte Zellhaufenbildung mit den DZ. E) Die Anzahl der Zellkontakte zwischen den Teff und den DZ, den Teff und den Treg und den Treg mit den DZ wurden durch die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen analysiert und quantifiziert. Die gezeigten Daten sind aus 2 unterschiedlichen Experimenten mit übereinstimmenden Ergebnissen. Es wurden mehr als 20 Kryoschnitte mit insgesamt über 3000 Zell-Zell-Kontakten ausgezählt, analysiert (C, D) und für die Auswertung in E) verwendet. A) und B) zeigen die punktierten, exemplarischen Ausschnitte aus C) und D). Die P-Werte wurden mit ungepaartem Student´s T-Test errechnet (* p < 0.05, ** p < 0.01). 4.17 Regulatorische T-Zellen bewirken einen Verlust von kostimulatorischen Oberflächenproteinen auf LPS- und TNFα- aber nicht auf LPS/CD40-gereiften Dendritischen Zellen Die zuvor durchgeführten Experimente deuten auf eine Abhängigkeit der stimulatorischen Eigenschaften der DZ von deren Reifegrad hin. Ein wichtiges Merkmal reifer DZ ist deren Expression an kostimulatorischen Oberflächenproteinen. Auch konnte gezeigt werden, dass die hier verwendeten DO11.10 Treg die Teff erst nach deren verzögerter Injektion supprimieren können. Diese Suppression hatte eine geringere Wahrscheinlichkeit einer Bindung der Teff zu den Treg zur Folge, jedoch keine verringerte Bindung der Treg zu den DZ. Um den Einfluss der Treg zu den DZ genauer zu Untersuchen wurden in folgendem Experiment verschieden gereifte, OVA-beladene DZ mit CFSE markiert um diese später in vivo wieder finden zu können. Zusätzlich wurden zeitgleich 2x106 DO11.10 Treg und entweder gleichzeitig oder 24h verzögert 1x107 DO11.10 Teff im Verhältnis von 1:5 zueinander injiziert. Als Reifungsstimulus wurden hier 0,1 µg/ml LPS- oder 0,1 µg LPS/ml zusammen mit 5 µg/ml αCD40 Antikörper über Nacht verwendet. CD40 ist ein zusätzliches Signal für die DZ die den Liganden CD154 (CD40L) exprimieren. - 101 - -Ergebnisse - Dieser als „DZ-Lizensierung“ bezeichnete Vorgang ermöglicht den DZ die Rekrutierung und Aktivierung der CD8+ Killerzellen und erhöht ihre Immunogenität durch erhöhte IL-12 Produktion (167). Die Milzen wurden zwei Tage nach Injektion der DZ entnommen und mit einem Antikörper gegen CD11c sowie gegen verschiedene kostimulatorische Oberflächenproteine auf den DZ gefärbt. Die Expression der verschiedenen Proteine wurde auf den CFSE+, CD11c+ Zellen analysiert (Abb. 30). Die in der Abbildung 30 gezeigten Populationen zeigen nur die CD11c+ Zellen der Milzen. Vor der Injektion der DZ wurde deren Phänotyp bestimmt (siehe Abb. 24). Sowohl die hier verwendeten LPS- als auch die LPS/CD40 gereiften DZ hatten eine hohe Expression an CD80, CD86, CD273 (PD-L1), CD274 (PDL2) und MHC II Molekülen. Abbildung 30 A) zeigt den direkten Vergleich der LPS- und der LPS/CD40gereiften DZ. Bei gleichzeitiger Injektion der Treg und der Teff als auch bei alleiniger Injektion der Teff ist eine hohe, vergleichbare Menge an CD80, CD86 und MHC II auf der Zelloberfläche der DZ zu finden. Bei 24h Verzögerung der Teff Injektion und somit in einer suppressiven Situation, ist die CD80- als auch CD86-Expression deutlich niedriger mit 29% und 26% als verglichen mit den gleichzeitig Injizierten Teff und ohne Treg. Hier lagen die prozentualen Werte der Proteinexpression im Schnitt bei 70% und bei 60%. Eine Reifung der Zellen über Nacht mit LPS/CD40 führte resultierte in keiner Herunterregulation von CD80 und CD86. Die Expression dieser Proteine sind bei gleichzeitig und mit 10h oder 24h früher injizierten Treg vergleichbar hoch. Es wurden verschiedene kostimulatorische Proteine als auch ICOS-L, CD40, CD70 und MHC II auf den DZ gemessen. - 102 - -Ergebnisse - Abb. 30: Treg bewirken eine Herunterregulation von kostimulatorischen Oberflächenproteinen auf LPS- und TNFα-, aber nicht von LPS/CD40-gereiften DZ. CFSE-markierte, OVA-beladene reife DZ wurden zusammen mit aus DO11.10 gewonnenen Treg in BALB/c Mäuse intravenös injiziert. Die DO11.10 Teff wurden entweder gleichzeitig oder mit 24h Verzögerung in dieselben Mäuse injiziert. Zusätzlich als Kontrolle wurden auch DZ und Teff alleine injiziert. Die Milzen wurden 48h nach Injektion der DZ entnommen. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente mit gleichen Ergebnissen. Die Statistische Auswertung erfolgte mit einem ungepaarten Student´s T-Test. - 103 - -Ergebnisse - Es konnten sowohl für die TNFα- als auch für die LPS-gereiften DZ signifikant niedrigere Expressionen an CD80, CD86, CD274 und CD273 bei den 24h verzögerten Injektionen verglichen mit den gleichzeitig injizierten Zellen ermittelt werden. CD40-Ligation der DZ bei der Reifung scheint diese für die suppressive Wirkung der Treg unempfindlich zu machen. 4.18 Die Herunterregulation der Oberflächenproteine auf den Dendritischen Zellen wird nicht durch Apoptose verursacht Ob der im zuvor gezeigten Experiment gezeigte Effekt der Herunterregulation der kostimulatorischen Marker auf den DZ bei Suppression nicht durch ein beginnendes apoptotisches Stadium der Zellen verursacht wird, sollte im folgenden Experiment untersucht werden. Die zusammen mit den T-Zellen injizierten DZ wurden für CD11c und für Annexin V, als auch für 7-AAD gefärbt. Annexin V welches Phosphatidylserin auf der Zelloberfläche der Zellen bindet ist ein Indikator für den apoptotischen Status der Zelle. 7-AAD färbt DNA in der Zelle an und ermöglicht so eine Aussage über die Membranintegrität der Zelle, da 7-AAD keine Intakte Zellmembran passieren kann (Abb. 31). Weder die LPS- noch die LPS/CD40-gereiften DZ die mit den 0h sowie mit den 24h verzögerten T-Zellen zusammen injiziert wurden zeigten eine erhöhte Frequenz an apoptotischen Zellen. Eine Verringerung der Expression der Oberflächenproteine verursacht durch Apoptose ist somit bis zu diesem Zeitpunkt auszuschließen. 4.19 Lizensierung der Dendritischen Zellen durch CD40 verhindert die Suppression der Effektor T-Zellen durch regulatorische T-Zellen Es konnte gezeigt werden, das LPS/CD40-gereifte DZ nicht der Wirkung der Treg auf die Oberflächenmarkerexpression der DZ unterliegen. Um zusätzlich zur Analyse der Oberflächenproteine die Proliferation der T-Zellen zu beobachten, - 104 - -Ergebnisse - wurden vvergleichba ar zu dem m in Abb. 30 besch hriebenen Experimen nt TNFα- , LPS- ode er LPS/CD D40-gereiftte, mit OV VA-beladene DZ zu usammen mit Treg in n BALB/c M Mäuse injiz ziert. Abb. 31: Die D beobach htete Heruntterregulatio on der DZ-Oberflächenp proteine ist nicht durch h Apoptose verursacht. CFSE-mark kierte OVA-b beladene, re eife DZ wurden, wie zuvo or in Abb. 30 0 en in BALB//c Mäuse in njiziert. Die Milzen wurrden 72h na ach Injektion n der Zellen n beschriebe herausgeno ommen. Die Splenozyten wurden mit CD11c und 7-AAD oder Annexin V gefärbt um m den apopto otischen Zus stand der Ze ellen sowie d die Membran nintegrität zu bestimmen. Es konnten n keine Anze eichen für eine vermehrtte Apoptose bei den DZ Z mit und ohne Anwesen nheit der Treg gefunden werden. w 1 - 105 -Ergebnisse - Mit 24h Verzögerung wurden anschließend CFSE-markierte Teff in dieselben Mäuse im Verhältnis 1: 5 injiziert und die Proliferation der Zellen 3 Tage nach Injektion gemessen. Zu diesem Zweck wurden die Milzen herausgenommen und diese mit Antikörpern gegen CD4 und dem klonotypischen T-Zellrezeptor der DO11.10 Zellen gefärbt. Die unten dargestellten Histogramme repräsentieren die CD4+KJ1-26+ Zellen der Milzzellsuspension. Die CFSE-Verdünnung der Teff Zellen wurde hier als Indikator für die Proliferation der T-Zellen gewertet. Alle drei unterschiedlich gereiften DZ sind in der Lage, naive Teff Zellen zur Proliferation zu bringen unter Abwesenheit von Treg. Die im Verhältnis 1: 5 koinjizierten Treg verhinderten eine Proliferation der TNFαals auch der LPS-stimulierten, nicht jedoch die der LPS/CD40-stimulierten DZ. Die zuvor beobachtete Revertierung der Treg-vermittelten Suppression durch die CD40 Lizensierung der DZ konnte somit durch die erfolgte Proliferation der Teff auch in Anwesenheit der 24h zuvor injizierten Treg bestätigt werden. Abb. 32: CD40 Lizensierung der antigenpräsentierenden DZ verhindert die Suppression der Teff-Proliferation durch die Treg. OVA-beladene, verschieden gereifte DZ wurden intravenös alleine oder mit Treg in BALB/c Mäuse injiziert. Zusätzlich wurden CFSE-markierte Teff mit 24h Verzögerung im Verhältnis 1:5 oder ohne Treg injiziert. 3 Tage nach der Injektion wurden die Milzen entnommen und analysiert. Die aus den Milzen gewonnene Einzelzellsuspension wurde mit einem für die DO11.10 T-Zellen spezifischen KJ1-26 sowie einem CD4-Antikörper gefärbt. Die gezeigten Histogramme sind die CFSE+CD4+KJ1-26+ T-Zellen. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente mit gleichen Ergebnissen. - 106 - -Diskussion- 5 Diskussion In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Treg mit DZ in vivo interagieren und ob durch diese Interaktion ein regulatorischer Einfluss über die DZ vermittelt wird. Das in dieser Arbeit verwendete adoptive Transfersystem ermöglichte uns, die zeitliche Analyse der Teff-Antwort in Gegenwart gleichzeitig oder von zuvor injizierten und somit voraktivierten Treg zu analysieren. Die erhobenen Daten weisen auf eine rege Interaktion der Treg mit den injizierten T-Zellen als auch mit den DZ hin und zeigen eine Herunterregulation der auf den DZ bereits exprimierten kostimulatorischen Moleküle PD-L1, PD-L2, CD80 und CD86 auf der Zelloberfläche. Eine zuvor durch Antikörper erfolgte „Lizensierung“ der DZ durch CD40-Ligation hob diesen Effekt auf. Die Art der Applikation der DZ ist ein entscheidendes Kriterium für deren Funktionalität. Vorherige Arbeiten unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, das subkutane Injektionen von unterschiedlich gereiften DZ auch weitergehenden Einfluss auf deren Reifegrad haben und das durch „Bystander-Effekte“ die endogenen DZ nach der Migration der injizierten DZ beeinflusst werden können (168). Aus diesem Grund wurde die intravenöse der subkutanen Verabreichung Vorgezogen um die Beeinflussung der verschieden reifen DZ-Typen so gering wie möglich zu halten und deren Interaktionen mit den regulatorischen und effektorischen T-Zellen zu verfolgen. 5.1 Reife Dendritische Zellen werden für die Aktivierung der regulatorischen T-Zellen benötigt. Die in vitro und in vivo Experimente zur Aktivierung der T-Zellen haben keine wesentlichen Unterschiede der semireifen und vollreifen mDZ ergeben. Auch die reifen pDZ waren in der Lage die DO11.10 Treg und Teff zur Aktivieren und zur Proliferation zu bringen. Diese Befunde stehen im Einklang mit anderen Arbeiten zu diesem Thema, die vor allem den Reifegrad der DZ und somit ihre - 107 - -Diskussion- kostimulatorischen Eigenschaften als Vorraussetzung für eine erfolgreiche TZellrezeptorspezifische Aktivierung der T-Zellen sehen. Die Versuche mit unreifen im direkten Vergleich zu reifen DZ ergaben hier sehr deutlich, das diese nicht in der Lage sind die Aktivierung und die Expansion der T-Zellen zu induzieren. Dies widerspricht der These früherer Arbeiten, dass unreife DZ im immunologischen Gleichgewicht für die Aufrechterhaltung des Verhältnisses zwischen Teff und Treg verantwortlich sein könnten. (155) 5.2 Plasmazytoide vergleichbare und myeloische Dendritische stimulatorische Fähigkeiten Zellen haben gegenüber regulatorischen T-Zellen In vitro mit FLT3-L aus murinem Knochenmark generierte pDZ gelten nach ihrer Generierung als unreife DZ. Sie verfügen über geringe kostimulatorische Eigenschaften (161). Zu Beginn dieser Arbeit postulierte man, das vor allem unreife DZ an der Generierung von Treg beteiligt sind (169, 170). Dies würde den Schluss zulassen, dass diese besondere stimulatorische Eigenschaften gegenüber den Treg haben könnten (171). In der vorliegenden Arbeit wurden sortierte Treg und Teff aus DO11.10 Mäusen zusammen mit antigenbeladenen pDZ und mDZ in Balb/c Mäuse injiziert. Dies sollte Aufschluss über die Aktivierung der T-Zellunterarten durch die antigentragenden DZ geben. Die Involvierung von pDZ in die kontinuierliche Stimulation der natürlich vorkommenden Treg und deren Generierung in den peripheren Organen konnte hier nicht gezeigt werden. Die zusammen mit unreifen pDZ injizierten Treg zeigten keinerlei Aktivierung gemessen an der CD25 und der CD69 Expression nach 24h in vivo. Unsere Ergebnisse zeigen außerdem, das der Reifegrad der mDZ und pDZ wichtig bei der Stimulation der Treg ist. Unreife pDZ und mDZ konnten Treg und Teff nicht Aktivieren. - 108 - -Diskussion- Auch die durch reife pDZ und mDZ stimulierten T-Zellen hatten vergleichbare Expressionen an CD69, CD25 und CD62L. Durch reife pDZ und mDZ stimulierte Treg und Teff expandierten nach deren Kultivierung ex vivo in vergleichbarer Menge und behielten ihren Foxp3+ oder Foxp3- Phänotyp bei. Das lässt den Schluss zu, dass die Expression von kostimulatorischen Molekülen auf den DZ eine wichtige Rolle bei der Aktivierung und der Expansion von Treg in den periphären Organen spielt (117, 128). Auch im Thymus scheinen die kostimulatorischen Signale von essentieller Bedeutung bei der Bildung der Treg zu sein. Dies ist Sinnvoll, wenn man bedenkt, unter welchen Umständen es zur Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen kommen könnte. Wenn man beispielsweise von molekularem Mimikry als Auslöser einer Autoimmunreaktion ausgeht, so kann man daraus schließen, dass Fremdpeptide auf reifen DZ präsentiert werden (172). Eine Aktivierung von kreuzreaktiven T-Zellen die auch Selbstpeptide erkennen, kann hier zu einer Autoimmunreaktion führen. Durch reife DZ stimulierte und expandierte Tregs könnten dies verhindern (56). 5.3 Regulatorische T-Zellen kontrollieren die Expansion von Effektor TZellen nach deren Aktivierung Normale Immunreaktionen sehen eine Aktivierung und eine rasche Zellteilung von für das Pathogen spezifischen T-Zellen vor. Nach erfolgreicher Immunantwort muss es aber auch zur Beendigung der T-Zell Expansion und der Immunreaktion kommen. Der durch die Bekämpfung der eingedrungenen Fremdorganismen angerichtete Immunpathologie am eigenen Körper muss so gering wie möglich gehalten werden (173). Derzeit vermutet man, dass ein Mechanismus zur Beendigung von Immunantworten beispielsweise die Induzierung von AICD ist. Dies geschieht über den Fas/Fas-L Signalweg. Es wird vermutet, dass dies einer der wichtigsten Wege zur Abtötung von T-Zellen ist, die kontinuierlich mit Antigen - 109 - -Diskussion- stimuliert werden. Dies ist beispielsweise bei autoimmunen Erkrankungen der Fall. Diese Theorie wird dadurch belegt, das Mäuse mit einer Mutation im Fasoder Fas-L-Gen an Autoimmunerkrankungen leiden, aber gegen Fremdantigene normale Immunantworten produzieren (173). T-Zellreaktionen können auch über die Ligation von CTLA-4 beendet werden. Dies kann der T-Zelle hemmende Signale geben, die die IL-2 Produktion abschalten. Das lässt folgern, dass aktivierte T-Zellen ihre Proliferation nach Erfolgter Aktivierung durch einen Feedback-Mechanismus selbst beenden können (174). Da auch Treg konstitutiv CTLA-4 exprimieren könnte dies auch ein Mechanismus der Immunregulation sein (175). Weitere Mechanismen der Terminierung von Immunantworten werden über Zytokine wie IL-2, TGF-β und IL-10 vermittelt (173). Ein wichtiger Faktor der über die Dauer einer Immunreaktion entscheiden kann ist auch die Menge des Antigens. Im Allgemeinen stellt man fest, das mit dem verschwinden des Antigens auch die Immunantwort abgeschaltet wird (176). Es stellt sich also die Frage, ob auch Treg einen Einfluss auf die Terminierung oder die Begrenzung von Immunantworten haben. Eine unterschiedliche Aktivierungskinetik, die von der Antigenavidität abhängt, könnte in den frühen Phasen der Aktivierung den sich schneller teilenden T-Zellen einen Vorteil verschaffen. In einer späteren Phase der Teff Expansion könnten so die Treg wieder die Kontrolle gewinnen und eine Abschaltung der Immunantwort initiieren. Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente belegen, dass nach einer anfänglichen T-Zellexpansion eine Verringerung der T-Zellanzahl nach ungefähr 5 – 7 Tagen in Anwesenheit der Treg stattfindet. Fehlen die Treg ist eine nur leichte Verringerung der T-Zellenanzahl zu beobachten (Abb. 28). Das Ergebnis spricht somit für einen Einfluss der Treg bei der späten Begrenzung der Teff-Proliferation. - 110 - -Diskussion- 5.4 Die Antigen-Avidität der regulatorischen T-Zellen ist ein wichtiger Faktor, der zwischen Immunität und Toleranz entscheiden kann. DZ gelten als Weichensteller zwischen Toleranz und Immunität. Ohne TLRStimulus findet keine T-Zellaktivierung durch die DZ statt. Sind DZ die alleinigen Faktoren die entscheiden ob, eine Immunreaktion erfolgreich sein kann? Die In dieser Arbeit verwendeten DO11.10 Treg zeigen eine verzögerte Aktivierungskinetik verglichen mit den Teff. Die nach 24h in vivo gemessene Expression der Aktivierungsproteine auf der Zelloberfläche der Treg nach der Koinjektion mit OVA-beladenen DZ, zeigen, das die Treg im Vergleich zu den Teff langsamer Aktiviert werden. Die darauf folgende ex vivo Proliferation gemessen an der CFSE-Verdünnung, konnte außerdem zeigen, dass die Treg langsamer als die Teff proliferieren. OVA ist für die verwendeten DO11.10 Mäuse ein Fremdantigen. Es wird nicht im Thymus exprimiert. Die aus diesen Mäusen gewonnenen T-Zellen sind zu einem hohen Prozentsatz von über 75% (siehe Abb. 17) spezifisch für das auf I-Ad präsentierte OVA-327-339 Peptid (152, 153). Wie genau die T-Zellen im Thymus selektiert werden ist noch immer ungeklärt. Es wird vermutet, dass die Treg durch auf den medullären Thymus-Epithelzellen präsentierte Selbstantigene positiv selektioniert werden (111-113). Nach dem derzeitigen Stand der Forschung wird die Expression der Selbstantigene auf diesen Zellen durch AIRE reguliert (177). AIRE ist ein Transkriptionsfaktor der die Expression von Proteinen in den Thymusepithelzellen steuert, die normalerweise nur gewebespezifisch exprimiert werden. Es gilt als bewiesen, dass die Expression dieser Antigene für eine Deletion der daran bindenden TZellen im Thymus sorgt (178). Dies wird als negative Selektion bezeichnet. Fraglich ist jedoch, ob AIRE nicht nur für die Depletion autoreaktiver T-Zellen verantwortlich ist, sondern auch eine Rolle bei der positiven Selektion der Treg spielt. Ein Argument, das gegen die These spricht, ist, dass man bei der Analyse von AIRE-Knockout Mäusen keine verringerte Anzahl an Treg gefunden - 111 - -Diskussion- hat. Auch konnten die aus diesen Mäusen sortierten Treg in in vitro Suppressionsversuchen ohne Probleme andere T-Zellen regulieren (179, 180). Für eine Selektion der Treg auf Selbstantigene im Thymus sprechen Versuche mit Thymozyten, die einen autoreaktiven T-Zellrezeptor hatten. Diese zeigten, das diese nach Interaktion mit ihrem Selbstpeptid in Tregs differenzierten (113). Außerdem ergaben Versuche mit DO11.10 Mäusen, die mit Mäusen gekreuzt wurden, die OVA-Peptid systemisch exprimieren, das alle OVA-spezifischen TZellen die den Thymus verließen vom Treg-Phänotyp waren (153). Dies wurde mit Antikörpern, die spezifisch für den klonotypischen T-Zellrezeptor waren, ermittelt. Eine Studie aus dem Jahr 2004 untersuchte die Treg Spezifität anhand retroviraler Expression von T-Zellrezeptor α-Ketten in transgenen RAGdefizienten T-Zellen. Die so entstandenen T-Zellen besaßen die endogenen αKetten der Treg oder der Teff und eine transgene β-Kette. Diese wurden in lymphopänische Wirte transplantiert. Die T-Zellen die den aus Treg stammenden T-Zellrezeptor hatten, proliferierten weitaus stärker verglichen mit den T-Zellen, die die Teff α-Kette exprimierten. Das wurde als ein deutlicher Hinweis gewertet, dass die T-Zellrezeptoren aus den Treg in der Peripherie weitaus spezifischer auf die dort exprimierten Selbstantigene reagierten. Diese T-Zellen expandierten weitaus stärker. Hsieh et al. analysierten allerdings nur die 10 häufigsten T-Zellrezeptorklone. Vor dem Hintergrund der hohen T-Zellrezeptor-Diversität scheint diese Anzahl einen nur sehr begrenzten Einblick in die Treg Spezifitäten zu liefern. Gegen die Selektion der Treg durch Selbstpeptide argumentieren vor allem neuere Arbeiten, die auf den zuvor erwähnten Untersuchungen zur TregSpezifität aufbauen (115, 116). Die Autoren dieser Arbeiten analysierten die Spezifitäten von hunderten von Treg aus transgenen TCRmini Mäusen. Diese TCRmini Mäuse können ein nur sehr eingeschränktes T-Zellrepertoire bilden. Durch die Generierung von Hybridomen mit T-Zellrezeptoren von aus den TCRmini Mäusen stammenden Treg und Teff war es so möglich, die Spezifitäten zu - 112 - -Diskussion- vergleichen. Interessanterweise ergab dieser Vergleich, dass die aus diesen Mäusen stammenden Treg keinen höheren Anteil an selbstspezifischen TZellrezeptoren hatten. Außerdem stellten sie fest, dass sich die T-ZellrezeptorRepertoires von TCRmini Treg und Teff zu einem großen Teil überlappen. Daraus schlussfolgerten sie, dass Selbstantigene nicht die Spezifität der Treg sein können. Pacholzyk et al. analysierten deutlich mehr verschiedene TZellrezeptoren als die vorhergehenden Studien. Fraglich ist jedoch, ob die Untersuchung eines dennoch so eingeschränkten T-Zellrezeptor-Repertoires aus transgenen Mäusen tatsächlich repräsentativ ist und man daraus eine Schlussfolgerung zur Spezifität von Treg im Allgemeinen ziehen kann (181). Auch die Verwendung von Hybridomen zur Untersuchung der Aktivierbarkeit von T-Zellen durch ihre Rezeptoren kann in Frage gestellt werden. Ihnen stehen möglicherweise dadurch unterschiedliche Signalwege zur Aktivierung zur Verfügung die einen Vergleich erschweren (181). Die DO11.10 Teff verfügen über einen T-Zellrezeptor mit hoher Avidität für das OVA-Peptid (152). Da die in diesen Mäusen vorhandenen Treg im Thymus vermutlich auf die Bindung von Selbstpeptiden selektiert worden sind bedeutet das, dass diese auf eine mittlere Avidität gegen Selbstpeptide selektierten Treg kreuzreaktiv für das OVA-Peptid sein können. Durch die im Vergleich zu den normalen DO11.10 T-Zellen geringere Avidität für das OVA-Peptid könnten sie sie eine langsamere Aktivierungskinetik haben. Die in dieser Arbeit durchgeführten Ergebnisse zeigen, das die Treg bei gleichzeitiger Stimulation mit den Teff weniger CD69 auf der Oberfläche exprimieren und diese sich nach ex vivo inkubation langsamer Teilen (Abb. 21 + 23). CD69 ist ein Aktivierungsmarker, der schon 2h nach Aktivierung auf T-Zellen nachzuweisen ist (182, 183). Seine Expression wird im Allgemeinen mit einem aktivierten Stadium der T-Zellen assoziiert. Zusätzlich vermutet man, das es die Expression von immunmodulatorischen Molekülen wie TGF-β steuern könnte (184). T-Zellen aus CD69-Knockout Mäusen haben keine Defizite bei der Aktivierung und der Proliferation (185). - 113 - -Diskussion- Die Situation der Teff und Treg in diesem Experiment entspricht der Kinetik einer Immunreaktion gegen Fremdpeptide und könnte erklären, warum Treg diese nicht verhindern obwohl auch sie das Antigen erkennen. Für Fremdantigene währen die Teff mit hoher Avidität spezifisch. Im Gegensatz dazu, werden die Treg im Thymus primär auf die Fähigkeit, Selbstpeptide zu binden selektiert. Dies würde bedeuten, dass diese kreuzreaktiv für die Fremdantigene sind. Kreuzreaktivität von T-Zellen ist nicht unüblich. Es wird sogar postuliert, dass fast alle T-Zellen spezifisch für mehrere Antigene sind (186). Nach dieser Ansicht ist eine hohe Kreuzreaktivität der T-Zellrezeptoren bei der extrem großen Menge an unterschiedlichen Antigenen die auf MHC-Molekülen präsentiert werden können notwendig. Treg können auch spezifisch für Fremdantigene sein. So waren Treg aus Patienten die mit Helicobacter pylori infiziert sind, nur suppressiv wenn sie durch H. pylori Antigene stimuliert wurden (187). Mäuse die chronisch mit Schistosomen oder Leishmanien infiziert sind haben Treg, die nach Stimulation mit Parasitenantigenen IL-10 produzieren (188, 189). Ob diese Tregs auf eine ursprünglich in den Mäusen vorhandene expandierte kreuzreaktive Populationen zurückzuführen ist oder ob diese sich neu aus Teff gebildet haben ist nicht geklärt. Einen Einfluss von Kreuzreaktivität der DO11.10 T-Zellen in unserem System kann jedoch ausgeschlossen werden, da nur mit OVA-Peptid eine Reaktion der T-Zellen beobachtet wurde. 5.5 Regulatorische T-Zellen vermitteln ihre regulatorischen Fähigkeiten partiell über die Dendritischen Zellen. Durch CD40-Ligation kann dieser Effekt aufgehoben werden. Die Mechanismen der Regulation in vivo sind noch immer weitestgehend unbekannt. Vor allem die ob diese direkt über die T-Zellen vermittelt wird oder ob die DZ eine wichtige Rolle dabei spielen wird diskutiert und ist Gegenstand aktueller Forschung. In vitro Daten sprechen für einen klaren direkten Effekt der - 114 - -Diskussion- Treg auf die naiven T-Zellen (190, 191). Neuere Daten hingegen weisen jedoch auch auf eine direkte Interaktion der Treg mit den DZ in vivo hin (166), welche auch in dieser Arbeit durch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen bestätigt werden können. Die Ergebnisse von intravitalen 2-photonmikroskopischen Aufnahmen überraschten mit der Erkenntnis, das die Regulation durch direkte T-Zellkontakte der Treg mit den Teff offenbar in vivo von geringerer Bedeutung zu sein scheinen. Durch den Kontakt der Treg mit den DZ zeigten sich allerdings stark verringerte Kontakte zwischen DZ und Teff (142). Im Gegensatz zu diesen Daten zeigten die Ergebnisse dieser Arbeit, das ein grundsätzliches Maß an Kontakten zwischen den beiden T-Zellunterarten vorhanden war. Die Anzahl der Bindungen zwischen DZ und Teff sank bei Anwesenheit von Treg um ungefähr die Hälfte. Das könnte auf Regulationsmechanismen hinweisen, die sowohl den direkten Kontakt zwischen Treg und Teff benötigen als auch über die DZ vermittelt werden. DZ reifen durch verschiedene Mechanismen. Durch inflammatorische Signale, wie TNFα, TLR-Liganden wie LPS oder CpG , CD40-CD40L Interaktionen durch entzündete Gewebe oder T-Helferzellen können die DZ zu verschiedenen Reifungsstadien mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften differenzieren (26). Die Fähigkeiten einer DZ sind von deren Zytokinproduktion abhängig (19, 192). TNFα-gereifte DZ können als “semireif” bezeichnet werden. Sie können keine Zytokine produzieren und sogar tolerogen wirken. Im Gegensatz dazu sind die LPS-gereiften DZ in der Lage ein breites Spektrum an Zytokinen zu sezernieren. Dies kann beispielsweise IL-12 sein das zu Th1-Polarisierung der T-Zellen führen kann.(28). CD40 Signale können ebenfalls eine Reifung der DZ bewirken (193) und sind in der Lage die DZ zu “lizensieren“. Das verleiht Ihnen die Fähigkeit, weitergehende Aktivierung von CD8+ Killerzellen über MHC IKreuzpräsentation zu induzieren. (194, 195). Die Reifung über CD40 allein ist zwar gut beschrieben und etabliert, jedoch zeigen sowohl eigene Experimente, als auch andere in vivo Arbeiten zu diesem Thema, dass zusätzlich zu dem CD40-Stimulus auch ein TLR-Signal benötigt wird (28, 196), um die DZ in ein Vollreifes und „lizensiertes“ Stadium zu versetzen (197). Die Daten dieser Arbeit - 115 - -Diskussion- unterstützen diese These und lassen die Vermutung zu, das nur beide Signale, also der TLR-Stimulus als auch das CD40 Signal, notwendig sind, um vollreife immunogene DZ zu schaffen, die in der Lage sind auch CD8+ Killerzellen zu aktivieren. Es stellt sich die Frage, was die “lizensierte” DZ der normalen vollreifen DZ im Bezug auf ihre Immunogenität überlegen macht. Obwohl CD40 als Signal in Kombination mit einem TLR-Stimulus die IL-12 Produktion erhöht, ist es dennoch fraglich, ob eine quantitative Erhöhung von IL-12 den Effekt auf die CD8+ T-Zellen erklären kann (198). Neuere Arbeiten zeigen, das CD40-Ligation von DZ in vitro diese von den regulatorischen Effekten der Treg befreien kann und eine effektive Regulation verhindert (199, 200). Diese Arbeit zeigt dass dieser Effekt auch in vivo zu beobachten ist. Im Gegensatz zu einer in vitro Studie mit murinen Knochenmarks-DZ (199) können wir, trotz des einseitigen Reizes durch TNFα oder LPS, einen klaren regulatorischen Effekt auf die DZ beobachten. Dies hatte eine Verringerung der T-Zellproliferation zur Folge. Der Effekt auf die DZ beinhaltete nicht nur die in vivo durch Fluoreszenzmikroskopie beobachteten verringerten Kontakte zwischen den Teff, sondern auch eine Verringerung der Expression der kostimulatorischen Moleküle auf der Zelloberfläche. Es konnte hier deutlich gemacht werden, dass die verwendeten injizierten DZ eine große Menge an diesen Molekülen exprimierten und diese auf den injizierten DZ in Gegenwart der Treg deutlich reduziert waren. Die Kontrollen zeigten hier eindeutig, dass der Effekt auf die Anwesenheit von Treg zurückzuführen war. Ähnliche Effekte sind durch eine Arbeit mit humanen DZ in vitro beschrieben (121). In diesem Falle beobachteten die Autoren einen semireifen DZ-Phänotyp nach Reifung der Zellen mit einem TLR-Liganden in Anwesenheit von voraktivierten Treg. Die dort beschriebenen DZ waren in der Lage CCR7-abhängig zu migrieren. Sie hatten eine erhöhte Expression von MHC II-Molekülen, jedoch deutlich verringerte kostimulatorische Eigenschaften. - 116 - -Diskussion- Interessanterweise reduzierte sich die Anzahl der Zellkontakte zwischen den Treg und Teff bei einer verzögerten Injektion von Teff. In unseren Versuchen hatte diese eine starke Inhibierung der Teff Proliferation zur Folge. Eine Suppression durch direkte Zellkontakte der Treg zu den Teff würde hier mehr Zellkontakte erwarten lassen. Dieser Befund in könnte ein Hinweis auf die Beteiligung von DZ bei der Suppression sein. Wir schlagen hier als einen möglichen Mechanismus der Regulation durch Treg die Herunterregulation von kostimulatorischen Molekülen auf DZ vor. Reife DZ exprimieren autoreaktive hohe Mengen T-Zellen an kostimulatorischen stimulieren können. Molekülen Die die auch Verringerung der kostimulatorischen Moleküle auf der Zelloberfläche würde immunogene DZ in tolerogene DZ umwandeln. Vorraussetzung hierfür ist, das die DZ Antigene präsentieren, die durch die Treg erkannt werden. Wenn man davon ausgeht, dass die Treg spezifisch für Selbstantigene sind, so wäre dies ein plausibler Mechanismus zur Vermeidung von Autoimmunreaktionen. 5.6 Hypothese: Regulatorische T-Zellen erfüllen unterschiedliche Funktionen in Abhängigkeit der Immunreaktion gegen Selbst- oder Fremdpeptide Fasst man die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit und der zu diesem Thema veröffentlichten Literatur zusammen so lassen sie den Schluss zu folgender These zu: Es ergeben sich zwei mögliche Aufgaben der natürlich vorkommenden Treg im Körper. Zum einen verhindern sie die Aktivierung und Expansion von autoreaktiven Teff. Zum anderen können sie nach der Aktivierung von fremdantigenspezifischen Teff für die nachträgliche Terminierung oder Begrenzung der Immunantwort sorgen. Das in dieser Arbeit verwendete Modell verwendet mit OVA ein Fremdantigen. Folglich sind die verwendeten DO11.10 T-Zellen von vermutlich höherer Avidität für das OVA-Peptid als die regulatorischen. - 117 - -Diskussion- Eine Terminierung oder Regulierung der erfolgreichen Abwehrreaktion würde dann der Begrenzung von durch die Abwehrzellen verursachten Immunpathologien dienen. Eine Immunreaktion ist im Falle eines Fremdpeptids das aus einem Erreger stammen könnte erwünscht und soll den Organismus davon befreien. Eine frühe Expansion der aktivierten Teff würde in diesem Fall für eine erfolgreiche Immunantwort sorgen. Die später oder langsamer aktivierten und proliferierenden Treg erlangen erst nach einiger Zeit die Kontrolle über die Immunreaktion. Die Treg können entweder mit geringerer Avidität kreuzreaktiv für das Antigen sein oder erst peripher induziert werden. Sie sind zu Beginn der Immunantwort gegen Fremdantigene gegenüber den Teff im Nachteil. - 118 - -Diskussion- Abb. 33: Hypothetische Aufgaben der Treg bei Immunreaktionen gegen Selbst- und Fremdpeptide Bei einer Präsentation von Selbstpeptiden auf reifen DZ könnten autoreaktive T-Zellen aktiviert werden. Durch die Treg kommt es zu einer inhibierenden Wirkung auf die Teff. Dies führt zur Toleranz für das Selbstantigen. Werden hingegen Fremdantigene auf reifen DZ präsentiert, so kommt es zu einer Immunantwort durch die Teff. Die Treg, die in diesem Fall langsamer als die Teff aktiviert werden und auch langsamer proliferieren können die Immunreaktion nicht kontrollieren. Erst später nach erfolgter Expansion in den periphären Organen und Geweben begrenzen sie die Immunreaktion. Ob die Treg in der Lage sind, die Teff zu regulieren hängt in diesem Fall von der Avidität der Treg und der Teff für das entsprechende Antigen ab. - 119 - -Zusammenfassung- 6 Zusammenfassung Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktionen von regulatorischen T-Zellen mit Dendritischen Zellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden OVA-spezifische DO11.10 T-Zellen in eine Treg- und Teff-Fraktion mit Hilfe von Magnetkugeln aufgetrennt. Die so gewonnenen Zellen wurden zusammen mit OVA-beladenen Knochenmarks-DZ in Balb/c Mäuse zusammen oder einzeln transferiert. Die Aktivierung der T-Zellen und die darauf folgende Proliferation wurden anhand der Expression von Oberflächenmolekülen und der CFSE-Verdünnung evaluiert. Außerdem wurden die Zellkontakte in vivo durch Präparation der Milzen 24h nach Injektion und anschließender Auswertung unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten DZ, Treg und Teff konnten so statistisch erfasst werden. Dies ermöglichte eine Aussage über die Häufigkeit der Zellkontakte untereinander. Diese Arbeit konnte zeigen, dass es für die Aktivierung und Expansion von Treg der Stimulation von vollständig reifen DZ bedarf. Die Treg als auch die Teff hatten eine Vielzahl von Zellkontakte mit den DZ. Die Häufigkeit der Bindung der Treg an die DZ änderte sich jedoch auch bei Suppression koinjizierter Teff nicht wesentlich. Interessanterweise erhöhte sich bei Suppression durch die Treg deren Häufigkeit der Bindung an die Teff nicht. Vor allem eine Reduzierung der Zellkontakte der Teff bei einer Suppression durch die Treg mit den DZ war zu beobachten. Dieses Ergebnis wird durch eine fast vollständige Reduzierung der Proliferation der Teff durch voraktivierte Treg bestätigt. Ohne DZ-Teff Kontakte finden auch keine Aktivierung und keine klonale Expansion statt. Ein Mechanismus der Suppression in vivo könnte die Reduzierung der kostimulatorischen Moleküle auf den antigentragenden DZ durch die Treg sein. - 120 - -Zusammenfassung- Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche belegen, dass die Reduzierung der Kostimulatoren auf der DZ Oberfläche antigenspezifisch und durch die Treg verursacht wird. Eine Überprüfung der apoptotischen Stadien der DZ bewies, das Apoptose als Grund für die geringere Expression der Oberflächenmoleküle auszuschließen war. Die Herunterregulation der kostimulatorischen Moleküle, so wie die Suppression der Teff durch die Treg ließ sich durch eine Ligation der DZ durch CD40 verhindern. Dies lässt den Schluss zu, dass Regulation von DZ durch Treg abhängig von der CD40-Lizensierung ist. Nur bei TNFα− oder LPS-, nicht jedoch bei LPS/CD40Reifung war ein regulatorischer Effekt der Treg zu beobachten. Dies bedeutet, dass Feedback-Signale aktivierter Teff die Immunogenität von DZ im Verlauf der Immunreaktion erhöhen können. - 121 - -Ausblick- 7 Ausblick Treg sind immer noch, trotz intensiver Forschung auf diesem Gebiet schlecht verstanden und werden kontrovers diskutiert. Insbesondere die medizinische Nutzung dieser natürlichen Regulatoren von Autoimmunerkrankungen und als Mittel gegen Allergien versprechen ein großes Potential. In Mäusen konnte bereits gezeigt werden, dass der Transfer von Treg zur Kontrolle von Typ-1-Diabetes, von Transplantatabstoßungen und „graftversus-host“ Krankheit geeignet ist (128, 201, 202). Aus diesem Grund sind genauere Kenntnisse über die Eigenschaften und die Induzierbarkeit der Treg als auch die Möglichkeit zur Neutralisierung dieser Zellen für die Tumorimmunologie von großer Wichtigkeit. Will man mit immunologischen Mitteln wie DZVakzinierung die eigene Abwehr gegen die Tumorzellen sensibilisieren, muss man zunächst die körpereigenen Toleranzmechanismen überwinden. Die Tumorzellen werden weitgehend als „Selbst“ erkannt und unterliegen so der peripheren Toleranz. In einer umfangreichen, durch Immuntherapie vermittelten Behandlung könnten sich die Regulatoren so als eher schädlich als nützlich erweisen. Das Verständnis um die Mechanismen der Regulation ist also ein wichtiger Schritt auch zum Verständnis von Autoimmunerkrankungen. Es gilt zu klären, unter welchen Umständen es zur Bildung von schädlichen Lymphozyten kommt und warum die Mechanismen der peripheren Toleranz dort nicht wirksam sind. Eine Interessante Fortführung unserer Experimente wäre die Generierung von DO11.10xK5mOVA Mäusen. Diese würden aus der Kreuzung von DO11.10 Mäusen mit K5mOVA Mäusen entstehen. K5mOVA Mäuse exprimieren Ovalbumin im Thymus und in der Haut unter der Kontrolle des Keratin 5 (K5) Promotors. Ovalbumin währe für diese Mäuse dann ein Selbstantigen. - 122 - -Ausblick- Durch die Expression des OVA-Peptids in den DO11.10 Mäusen hätte man dann Treg, die auf OVA-Peptid im Thymus selektioniert sind. Das derzeitige DO11.10 System kann dies nicht leisten. Wenn man vergleichbare Versuche zu dieser Arbeit mit diesen Mäusen durchführen würde, müssten die DO11.10xK5mOVA Voraktivierung eine effiziente Regulation der Teff Treg, auch ohne zeigen. Diese würden im Thymus für die Reaktivität gegen OVA negativ selektiert werden und hätten folglich eine sehr geringe Avidität für OVA. - 123 - -Persönliche Veröffentlichungen- 8 Veröffentlichungen 8.1 Wissenschaftliche Originalveröffentlichungen 1. Hanig, J., and M.B. Lutz. 2007. Suppression of mature dendritic cell function by regulatory T cells in vivo is abrogated by CD40 licensing. J Immunol : Accepted for publication 11/07 2. Rossner, S., C. Voigtlander, C. Wiethe, J. Hanig, C. Seifarth, and M.B. Lutz. 2005. Myeloid dendritic cell precursors generated from bone marrow suppress T cell responses via cell contact and nitric oxide production in vitro. Eur J Immunol 35:3533-3544. 3. Dorrie, J., N. Schaft, I. Muller, V. Wellner, T. Schunder, J. Hanig, G.J. Oostingh, M.P. Schon, C. Robert, E. Kampgen, and G. Schuler. 2007. Introduction of functional chimeric E/L-selectin by RNA electroporation to target dendritic cells from blood to lymph nodes. Cancer Immunol Immunother (elektronische Publikation vor Druck) 8.2 Posterpräsentationen 1. Interaction of dendritic cells with regulatory T cells Jens Haenig, Manfred B. Lutz. 34. Annual Meeting of the German Society of Immunology (DGfI) Berlin, September 24 – 2, 2003 2. Interaction of dendritic cells and CD4+ CD25+ regulatory T cells in vivo. Jens Haenig, Manfred B. Lutz. 36. Annual Meeting of the German Society of Immunology (DGfI) and36. Annual Meeting of the Scandinavian Society for Immunology (SSI)Kiel, September 21 - 24, 2005 3. CD4+ CD25+ regulatory t cell activity in vivo is controlled by and occurs indirectly through mature dendritic Cells. Haenig J Lutz MB 1st Joint Meeting of European National Societies of Immunology Paris, September 6 – 9, 2006 4. Suppression of mature dendritic cell function by regulatory T cells in vivo is abrogated by CD40 licensing Jens Haenig, Manfred B. Lutz. 37. Annual Meeting of the German Society of Immunology (DGfI) Heidelberg, September 5 - 8, 2007 - 124 - -Persönliche Veröffentlichungen- 8.3 Vorträge 1. Interaction of regulatory T cells with Dendritic cells Retreat of the DFG-Training Group GK592 (Erlangen) Heiligenstadt, 2004, 2005, 2006 2. Interaction of regulatory T cells and Dendritic cells in vivo Joint Retreat of the DFG-Training Groups GK520 (Würzburg)and GK592 (Erlangen) Markt Taschendorf, July 18 – 23, 2005 3. Suppression of mature dendritic cell function by regulatory T cells in vivo is abrogated by CD40 licensing Jens Haenig, Manfred B. Lutz. 37. Annual Meeting of the German Society of Immunology (DGfI) Treg session T3.Heidelberg, September 5 - 8, 2007 - 125 - -Literaturverzeichnis- 9 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Literaturverzeichnis Janeway, C.A.T., P ; Walport, M ; Shlomchik, M. 2001. Immunobiology, Part I, An introduction to immunobiology and innate immunity. Garland Publishing, New York. Janeway, C.A.T., P ; Walport, M ; Shlomchik, M. 2001. Immunobiology, Part IV, The adaptive immune response. Garland Publishing, New York. Janeway, C.A.T., P ; Walport, M ; Shlomchik, M. 2001. Immunobiology, Part V, The immune system in health and disease. Garland Publishing, New York. Bettelli, E., M. Oukka, and V.K. Kuchroo. 2007. T(H)-17 cells in the circle of immunity and autoimmunity. Nat Immunol 8:345-350. Janeway, C.A.T., P ; Walport, M ; Shlomchik, M. 2001. 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Abbildung Ak Antikörper Ag Antigen APZ antigenpräsentierenden Zelle BSA Bovines Serumalbumin CCR “CC chemokine receptor” cDNA kompementäre DNA Ci Curie cpm “counts per minute” (Zahl der Zerfälle pro Minute) CpG unmethylierte Nukleotidstränge mit Cytosin-Guanin-Motiven CTLA-4 cytotoxic t lymphocyte antigen 4 DMSO Dimethylsufoxid DNA “desoxyribonucleic acid” (Desoxyribonukleinsäure) DNP Dinitrophenyl ds “double stranded” (doppelsträngig) DTT 1,4-Dithiothreitol DZ Dendritische Zelle EAE Experimentelle autoimmune Encephalomyelitis ELISA “enzyme-linked-immunoabsorbent-assay” E.coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamin-N, N, N’, N’-tetraacetat FACS “fluorescence-activated cell sorting” FITC Fluoreszein-Isothiocyanat Foxp3 Forkhead box P3 FKS fötales Kälberserum FSC “forward scatter” GM-CSF “granulocyte-macrophage colony stimulating factor” (Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor) - 141 - -Abkürzungsverzeichnis- HEL „hen egg lysozyme“ HRP „horse-raddish-peroxidase“ (Sterptavidin-gekoppelte Meerretichperoxidase) Ig Immunglobulin IL Interleukin IFN Interferon i.v. intravenös KLH “keyhole limpet hemocyanin” von Megathura crenulata KO Knock out LPS Lipopolysaccharide M Mol = mol/Liter ME Mercaptoethanol MFI “mean fluorescence intensity” MHC “major histocompatibility complex” (Haupthistokompatibilitätskomplex) OD optische Dichte ODN “oligodinucleotide” (Oligodinukleotid) OVA Ovalbumin PBS “phosphate buffer saline” (Phosphatpuffer) PCR “polymerase chain reaction” (Polymerasekettenreaktion) PE Phycoerythrin pH “potentia Hydrogeni” negativer dekadischer Logarithmus Protonenkonzentration PMA Phorbolmyristatacetat PO Phosphodiester RNA “ribonucleinacid” (Ribonukleinsäure) RNase Ribunuklease RT Reverse Transkription RT Raumtemperatur rpm “rounds per minute” (Umdrehungen pro minute) - 142 - der -Abkürzungsverzeichnis- s.c. subkutan SLC „secondary lymphoid tissue chemokine“ ss “single stranded” (einzelstängig) SSC “side scatter” Tab. Tabelle Tauto autoreaktive T-Zelle Teff effektorische T-Zelle Th1 T-Helfer 1 Th2 T-Helfer 2 Th3 T-Helfer 3 Th17 T-Helfer 17 TLR Toll-like Rezeptor TNFα Tumornekrosefaktor α Treg regulatorische T-Zelle Tr1 adaptive regulatorische T-Zelle TZR T-Zellrezeptor U Unit (Enzymeinheit) Ü.N. über Nacht v/v “volume per volume” WT Wildtyp w/v “weight per volume” V Volt - 143 - -Lebenslauf- 11 Lebenslauf Persönliche Daten: Name: Jens Hänig Geburtstag: 27.01.1976 Geburtsort: Goslar Wohnort: Würzburg, Winterleitenweg 5 Familienstand: ledig Staatsangehörigkeit: deutsch Schulbildung: 1982 – 1986: Grundschule Altenau 1986 – 1988: Orientierungsstufe Clausthal-Zellerfeld 1989 – 1995: Robert-Koch-Schule Clausthal-Zellerfeld 1995 Abschluss der allgemeinen Hochschulreife Studium: 11/1995 – 11/2001: Studium der Biologie (Diplom) an der Georg-August Universität Göttingen 11/1997 Diplomvorprüfung 11/2001 Diplomhauptprüfung 02/2001 – 11/2002 Diplomarbeit in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Thomas Kietzmann am Lehrstuhl für Biochemie I. der Georg-August-Universität Thema: „Modulation Aktivierung der der Göttingen Hypoxie-abhängigen Plasminogen-Aktivator Inhibitor Genexpression durch Überexpression von Genen der „Clock“-Familie. - 144 - -Lebenslauf- Promotion: 06/2003 – 04/2007: Doktorarbeit in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Manfred Lutz an der Hautklinik der FriedrichAlexander Universität Erlangen-Nürnberg Thema: „Interaktion von regulatorischen TZellen mit Dendritischen Zellen in vivo“ 04/2007 - Wechsel mit der Arbeitsgruppe Lutz an das Institut für Virologie und Immunbiologie in Würzbug Stipendium: 06/2003 – 06/2006: Stipendium der Forschungsgesellschaft Graduiertenkollegs - 145 - Deutschen im 592 Rahmen des („Lymphozyten“ -Danksagung- Ich danke Herrn Prof. Dr. T. Winkler für die freundliche Betreuung dieser Arbeit seitens der Naturwissenschaftlichen Fakultät und seine Bereitschaft als Gutachter und Prüfer zu wirken. Ebenso möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. A. Steinkasserer für die Übernahme des Zweitgutachtens und seine Unterstützung bedanken. Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Manfred Lutz, der mich bei meiner Doktorarbeit außerordentlich gut betreut und mich immer unterstützt und gefördert hat. Seine Ratschläge und sein Fachwissen, sowie die Selbstverständlichkeit mit der ich viele neue Sachen lernen durfte waren die Grundlage zum Gelingen dieser Dissertation. Weiterhin möchte ich mich besonders bei meiner Arbeitsgruppe in Erlangen für ihre Unterstützung, und bei meiner Arbeitsgruppe in Würzburg und beim gesamten „Container“ und dem „Schuppen“ aus der Hautklinik für die sehr angenehme Arbeitsatmosphäre bedanken. Insbesondere Bedanke ich mich beim Graduiertenkolleg 592 „Lymphozyten“ und seinem Sprecher Prof. Hans-Martin Jäck für die Förderung und Weiterbildung. Dem „harten Kern“ danke ich für die vielen schönen Stunden und die Freundschaften, die aus dieser Promotion mehr als eine wissenschaftliche Arbeit gemacht haben. Nicht zuletzt danke ich aber meiner Familie von ganzem Herzen für ihre Hilfe und Verständnis und für alles was sie mir ermöglicht haben. Zu guter Letzt danke ich dem Menschen, der mich besonders in der letzten Zeit mit viel Liebe und Verständnis sehr unterstützt hat. Vielen Dank! 146 -Summary- 12 Summary The priming of CD4+ effector T cells (Teff) in vivo is induced by mature dendritic cells (DC) and controlled by CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Treg). It remains unclear,however, how Teff priming vs Treg suppression are regulated during Ag presentation by DC in secondary lymphoid organs at the simultaneous presence of Teff and Treg. In this study, we used an peptide-specific DO11.10 TCR-transgenic adoptive transfer model to follow the Teff priming kinetics and the mechanisms of suppression by Treg. Teff activation was slower as compared with Teff and could not influence the early Teff expansion but limited the Teff response leading to lower Teff numbers in the memory phase. DC-Teff cell contacts remained unaltered during suppression by Teff and led to a downregulation of the costimulatory molecules CD80, CD86, PD-L1, and PD-L2 but not MHC II, CD40, ICOS-L, or CD70 from the mature DC surface. This effect was observed only after DC maturation with TNF or LPS but not after additional CD40 licensing. Together, our data indicate that Teff suppression against nonself Ags in vivo occurs delayed due to the slower Teff response, is mediated to a large extent through DC modulation, but is controlled by the type of DC maturation. 147
