Toll Like Receptor - Universität Salzburg

Differenzierung: Wnt und BMP
Prof. Dr. Albert Duschl
Wnt: Der Ligand und seine Wirkungen
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Das erste Wnt-Gen wurde in der Maus kloniert,
als Gen das bei Integration des Provirus von
Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV)
aufreguliert wird. Es wurde als int-1 bezeichnet.
Später wurde entdeckt daß das Drosophila-Gen
wingless (wg) dazu homolog ist. Das Gen wurde
in Wnt-1 umbenannt. Heute sind mindestens 19
Homologe bekannt.
Mutationen in Wnt Genen führen nicht nur zum
wingless Phänotyp, sondern sind in allen
untersuchten Organismen mit
Embryonalentwickung assoziiert.
Wnt-1 knockout Mäuse sterben perinatal
aufgrund von Defekten in der Entwicklung des
Gehirns.
Drosophila melanogaster
© Wikipedia
Der Ligand und sein Rezeptor
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Wnt Proteine haben meist 350-400
Aminosäuren und enthalten mehrere
konservierte N-Glykosylierungsstellen.
Wnt ist eng assoziiert mit Proteoglycanen
der Zellmembran und lässt sich nur schwer
isolieren.
Der Rezeptor is Frizzled. Der Name kommt
daher daß der Phänotyp der zugehörigen
Drosophila-Mutante gestörte Haarmuster
auf den Flügeln hat. Vertebraten haben
mindestens 8 Homologe.
Frizzled hat 7 a-helikale TransmembranDomänen und eine N-terminale
cysteinreiche Domäne (CRD), die für WntBindung zuständig ist.
Neben Wnt gibt es auch antagonistische
Liganden die an den Rezeptor binden.
© Gutkind: Signaling Networks and Cell Cycle Control
Zur Abwechslung:
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Wir haben es heute mit einem Signalweg zu tun in dem keine Tyrosinkinasen
auftauchen, keine SH2- oder SH3-Domänen, in dem es keine second Messengers
gibt (Ca++, cAMP …) und
in dem es in Abwesenheit des Liganden eine substanzielle Signalübertragung gibt.
Das System hat damit zwei Modi:
1) Signal in Abwesenheit des Liganden und
2) Signal in Anwesenheit des Liganden.
Das ist konzeptionell etwas anderes als die zwei Modi an/aus, die wir in den meisten
Signalsystemen finden. Wir müssen also in diesem Fall zwei unterschiedliche
Signalketten betrachten.
The canonical Wnt signaling pathway: off
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Der entscheidende Faktor ist ß-Catenin.
Im inaktiven Zustand wird ß-Catenin im
Cytoplasma durch Bindung an Axin und
Adenomous Polyposis Coli (APC) Protein
zurückgehalten. In dieser Lokalisierung
kann ß-Catenin von den S/T-Kinasen
Casein Kinase (CK*) und Glycogen
Synthase Kinase 3ß (GSK*) phosphoryliert
werden.
Phosphoryliertes ß-Catenin wird von
ß-Transducin Repeat Containing Protein
(ß-TRCP) erkannt, was zu Ubiquitinierung
und zur proteasomalen Degradation führt.
* Eigentlich ganz normale Kinasen für die
Regulation des Stoffwechsels.
European Journal of Immunology
Volume 38, Issue 7, pages 1788-1794, 25 JUN 2008 DOI: 10.1002/eji.200738118
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/eji.200738118/full#fig1
The canonical Wnt signaling pathway: on
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Wnt bindet an Frizzled und an
Co-Rezeptoren (LRP5 oder LRP6).
Die LRP werden phosphoryliert, wobei
nicht klar ist wie das zustande kommt. Die
Phosphorylierung ist aber für die
Signalweiterleitung erforderlich.
Das Protein Dishevelled führt nun zur
Dissoziation des normalen “destruction
complex” von ß-Catenin. Der
Mechanismus ist auch hier nicht völlig
geklärt.
ß-Catenin wird nicht weiter abgebaut,
sondern wandert in den Kern, wo es die
Transkriptionsfaktoren TCF und LEF
aktiviert.
European Journal of Immunology
Volume 38, Issue 7, pages 1788-1794, 25 JUN 2008 DOI: 10.1002/eji.200738118
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/eji.200738118/full#fig1
Etwas hübscher:
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TCF/LEF Aktivität wird
nicht nur durch das
Fehlen von ß-Catenin
verhindert sondern auch
durch die Bindung an
Inhibitoren aus der
Groucho Familie.
ß-Catenin kann die
Inhibitoren verdrängen,
die Transkriptionsfaktoren
werden aktiviert.
© Cell Signaling Technologies
Dishevelled
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Dishevelled ist nach seinem
Drosophila-Phänotyp benannt.
Vertebraten haben drei Homologe.
PDZ ist eine häufige Protein-ProteinInteraktionsdomäne, die hier dazu
dienen könnte Bindung an die Cterminale S/T-XXX-V/I Sequenz von
Frizzled zu vermitteln. Das wäre eine
typische Bindungsstelle für PDZ.
DIX ist auch in Axin vorhanden, die
Funktion ist unbekannt.
DEP ist eine Domäne mit ebenfalls
unklarer Funktion, sie taucht aber in
Proteinen auf die mit G-ProteinSignaltransduktion zusammenhängen.
© Gutkind: Signaling Networks and Cell Cycle Control
Glycogen synthase kinase
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Eine S/T Kinase.
Dsh könnte direkt mit Fz interagieren
und GSK mit Axin.
Auslöser für die Neubildung dieser
Komplexe ist die Phosphorylierung von
Dsh (durch GSK?), das auch
ubiquitiniert wird.
Wesentlich bleiben ß-Catenin und seine
Loslösung aus dem Komplex in offstate. Es ist klar dass der off-State nicht
Inaktivität bedeutet: ß-Catenin wird
lebhaft reguliert, was aber
proteolytischen Abbau zur Folge hat.
© Gutkind: Signaling Networks and Cell Cycle Control
ß-Catenin
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ß-Catenin wurde zuerst als
Komponente von tight junctions
identifiziert. Es ist also an sich ein
strukturgebendes Protein.
Die Armadillo Repeats sind für solche
Proteine nicht ungewöhnlich. Axin hat
ebenfalls solche Motive.
© Gutkind: Signaling Networks and Cell Cycle Control
Wnt in Tumoren
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Eine Reihe von Komponenten des
Wnt-Pathways sind an der
Entstehung von Tumoren beteiligt.
Die mit Krebs assoziierten Mutationen
führen jeweils zu einer Disregulation
die in Aktivierung von TCF-1
resultiert. Entscheidend ist also eine
zu starke Stimulierung der
kanonischen Signalkette
(dem on-Modus) für Wnt.
© Gutkind: Signaling Networks and Cell Cycle Control
© Curtin und Lorenzo, Oncotarget 1:563-566 (2010)
Therapie-Targets
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Komponenten der WntSignalkette sind attraktive
Targets weil sie speziell in
den sonst oft therapieresistenten TumorStammzellen wichtig sind.
Therapeutika könnten sich
auch für eine Kombination
mit konventionellen
Wirkstoffen eignen.
Die Entwickung
entsprechender Moleküle
ist allerdings noch nicht
weit fortgeschritten.
© Gutkind: Signaling Networks and Cell Cycle Control
© Curtin und Lorenzo, Oncotarget 1:563-566 (2010)
Lymphozyten
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TCF und LEF werden auch in
Lymphozyten exprimiert. TCF ist
sogar danach benannt (T cell factor).
T-Zell-Aktivierung und
Differenzierung zu TH2 Zellen führt
zu verminderter Expression von LEF
und vor allem von TCF. Dieser Effekt
ist von IL-4 abhängig.
Das ist merkwürdig: TCF und LEF
verstärken die Differenzierung zu
TH2 Zellen, Wnt ist also ein proallergischer Faktor. Wieso vermindert
dann IL-4 in TH2 Zellen TCF/LEF
Expression, und das stärker als in
TH1 Zellen?
© Maier et al., J. Biol. Chem. 286:919-28 (2011)
STAT6
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Der IL-4 induzierte
Transkriptionsfaktor STAT6
bindet an 4 von 5 potenziellen
Bindungsstellen im TCFPromoter bzw. -Gen.
Übrigends: Einer der seltenen
Fälle wo STAT6 Expression
unterdrückt und nicht fördert.
Wie lange es dauert eine solche
Abbildung zu machen? Wissen
Sie, da fragen Sie am besten
Frau Maier.
© Maier et al., J. Biol. Chem. 286:919-28 (2011)
Wie es geht
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Es werden bevorzugt die
kürzeren Isoformen von TCF
gehemmt, und die sind
dominant-negativ.
Der Endeffekt ist also doch eine
Verstärkung des TH2 Signals.
© Maier et al., J. Biol. Chem. 286:919-28 (2011)
Transkriptionsfaktoren
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Signalabhängige
Transkriptionsfaktoren
werden reguliert durch
interne Signale
(e.g. DNA-Schädigung,
missgefaltete Proteine,
niedrige Lipidspiegel)
externe Signale die
innen wirken (Steroide,
ca. 50 Rezeptoren, bis
auf GR alle im Kern)
und externe Signale die
extern, also durch
Membran-Rezeptoren
vermittelt wirken.
From: Brivanlou and Darnell, Science 295: 813-818 (2002)
Überblick
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Konstitutive Faktoren sind im
Kern, werden aber nur über
Signalketten aktivert, oft durch
S/T-Phosphorylierung.
Latente Faktoren liegen im
Cytoplasma und werden erst
nach Aktivierung in den Kern
transportiert. Sie scheinen
weniger alt zu sein und fehlen in
Pflanzen und Pilzen.
Nach Darnell und Baltimore gibt
es acht Hauptwege. Zwei
aktivieren Faktoren durch
Rezeptoren, vier werden durch
aktivierende oder inhibierende
S/T-Phosphorylierung gesteuert,
je einer über Ca++ und
Phosphoinositid-Konzentrationen
Both figures from: Brivanlou and Darnell, Science 295: 813-818 (2002)
TGF-ß
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TGF-ß ist ein sezerniertes Cytokin. Es
kann von allen Immunzellen produziert
werden, z.B. TR1, DC, B und
Makrophagen.
TGF-ß unterdrückt Wachstum,
Differenzierung und Aktivierung durch
andere Cytokine. Es hat also
wachstumshemmende und
immunsuppressive Aufgaben.
Störungen seiner Signalübertragung
sind assoziiert mit Autoimmunität,
Entzündung und Krebs.
Der TGF-ß Rezeptor ist ein
Heterodimer (RI und RII) aus zwei
transmembranen Serin/Threonin
Rezeptorkinasen. Die
Signalübertragung läuft über SMADs.
© BioCarta
SMAD
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Der Name SMAD leitet sich ab von
MAD, einem Drosophila-Protein
(mothers against decapentaplegic) und
von SMA (smaller worms), einem Gen
aus Caenorhabditis.
SMADs sind Tumorsuppressoren und
Transkriptionsfaktoren. Regulatorische
SMADs, im Fall von TGF-ß SMAD2
und SMAD3, werden durch die
Rezeptorkinase phosphoryliert,
assozieren mit dem Co-SMAD SMAD4
und wandern in den Kern.
In inaktiven Zustand werden SMADs
durch Adaptermoleküle wie SARA
(SMAD Anchor for Receptor
Activation) am Rezeptor
zurückgehalten.
© BioCarta
TGF-ß/BMP Superfamilie
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Es gibt mehr als 30
TGFß-artige Proteine im
Menschen.
Man unterscheidet zwei
Hauptgruppen, die
TGF/Activin und
BMP/GMP-Familien. Sie
verwenden verschiedene
Typen von R-SMADs,
aber SMAD4 ist immer
das Co-SMAD. (Es gibt
auch noch inhibitorische
SMADs wie SMAD 6 und
SMAD 7).
Dazu kommen
inhibitorische Liganden
wie Inhibin.
From Miyazono, Kusanag and Inoue, J. Cell. Phys. 187:265-276 (2001)
Assoziierte Krankheiten
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Aus den assoziierten
Krankheitsbildern sieht man,
daß die TGF-ß / BMP Familie hauptsächlich mit
Wachstumskontrolle und mit
Embryonalentwicklung zu tun
hat.
Tumorprogression geht oft
auf Verlust von TGF-ß- oder
SMAD-Signalkompetenz
zurück.
BMPs sind verantwortlich für
Anlage, Umbau und
Reparatur von Knochen.
GDFs sind für Knorpel und
Sehnen zuständig.
From Miyazono, Kusanag and Inoue, J. Cell. Phys. 187:265-276 (2001)
Smad 4 im Coloncarcinom
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Tumorprogression erfordert normalerweise die sequentielle Mutation von ProtoOncogenen und Tumorsuppressoren. Das am besten untersuchte Beispiel ist das
Coloncarcinom, mit mindestens 4 Progressionsstufen. Der Verlust der
Tumorsuppressoren bewirkt am Ende Malignität und Metastasierung.
From Schwarte-Waldhoff, BioSpektrum 9:260ff (2003)
BMP-Anwendung
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BMPs sind in der Knochenregeneration
klinisch interessant. Am Verletzungsort
werden BMPs produziert. Dem
Konzentrationsgradienten der BMPs
folgend wandern Vorläuferzellen für
Knochenbildungszellen in die
Defektstelle ein und differenzieren unter
dem Einfluß hoher BMP-Konzentrationen
in funktionelle Osteoblasten um.
BMPs können sogar in völlig fremden
Geweben nicht vorgesehene (ektope)
Knochenbildung auslösen. Gezeigt ist
dies rechts im Oberschenkelmuskel der
Ratte.
BMP-2 und BMP-7/OP-1 werden zur
Förderung von Knochenreparatur klinisch
verwendet.
© Norbert Kübler, MKG-Chirurgie, Universität Würzburg
Knochenreparatur
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Ohne BMPs gibt es auch Heilung, aber
in Problemfällen wird entweder der
Defekt nur durch schnell
einwachsendes Bindegewebe ersetzt,
oder es entsteht ein mechanisch
schwacher Knochen mit wenig
Knochenmatrix.
Es ist zu vermuten daß die
verschiedenen BMPs nicht identisch
wirken, aber dieser Punkt ist nicht gut
verstanden.
BMP wurde durch seine hohe Stabilität
in Knochenpräparationen entdeckt - es
ist kaum dauerhaft zu denaturieren
und wirkt über alle Speziesgrenzen.
Drosophila-Homologe haben
Funktionen bei der Flügelbildung.
© both figures Norbert Kübler, MKG-Chirurgie, Universität Würzburg
Ihr Job?
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© Nature, 468:139 (2010)
Die Pipelines der Pharmaforschung
sind nicht so gut gefüllt wie man es
sich wünschen würde.
Input von Universitäten, Biochech und
Pharma ist dringend erforderlich.
Die Faustregel
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Suchen Sie nach etwas ganz
bestimmten.
Wenn Sie es nicht finden
untersuchen Sie das was Sie
statt dessen gefunden haben.
© Sidney Harris: Einstein Atomized