TGFß
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Zelluläre Signaltransduktion II • TGF-ß, der Wachstumsfaktor, der das Wachstum hemmt? Transforming growth factor ß (TGF-ß) Growth factor Stimulation der Verankerungs-unabhängigen Zellproliferation von Tumorzellen in serumfreiem Medium in Weichagar Transforming Umwandlung epithelialer Zellen in Zellen mit mesenchymalen Eigenschaften. Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation Transforming growth factor ß (TGF-ß) Growth factor Stimulation der Verankerungs-unabhängigen Zellproliferation von Tumorzellen in serumfreiem Medium in Weichagar Transforming Umwandlung epithelialer Zellen in Zellen mit mesenchymalen Eigenschaften. Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation Epithel: Schicht engverbundener, polarisierter Zellen Mesenchym: Gewebe aus locker verbundenen, nicht polarisierten Zellen Transforming Growth Factor-ß-Induced Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation Control TGF-ß Bhowmick et al., Mol Cell Biol 12, 27-36 (2001) Transforming Growth Factor-ß-Induced Epithelial to Mesenchymal Transdifferentiation Link to Cadherins Bhowmick et al., Mol Cell Biol 12, 27-36 (2001) TGFß ein pleiotropes Cytokin - 3 Isoformen werden von Säugetierzellen exprimiert (TGFß 1-3) - Sequenz in verschiedenen Spezies hoch konserviert - TGFß1: Endotheliale, hämapoetische und Bindegewebszellen - TGFß2: Epitheliale und neuronale Zellen - TGFß3: Mesenchymale Zellen TGF-ß und verwandte Proteine TGF-ß-Familie BMP-Familie TGF-ß BMP2 (bone morphogenic Protein) Activin BMP4 Nodal BMP7 Sekretion von TGF-ß1 als inaktiver Komplex ß1-LAP (80 kDa) S S S S LTBP (125-160 kDa) LAP = Latency-associated protein LTBP = Latent TGF-ß-binding protein TGF-ß1 (25 kDa) S S Sekretion von TGF-ß1 als inaktiver Komplex ß1-LAP (80 kDa) S S S S TGF-ß1 (25 kDa) S S LTBP (125-160 kDa) Aktivierung von TGFß durch proteolytische Prozesse LAP = Latency-associated protein LTBP = Latent TGF-ß-binding protein TGFß ein pleiotropes Cytokin - 3 Isoformen werden von Säugetierzellen exprimiert (TGFß 1-3) - Sequenz in verschiedenen Spezies hoch konserviert - TGFß1: Endotheliale, hämapoetische und Bindegewebszellen - TGFß2: Epitheliale und neuronale Zellen - TGFß3: Mesenchymale Zellen Signale für die proteolytische Aktivierung: - Stimulation von Integrinrezeptoren der extrazellulären Matrix - Gefäßschädigungen und Aktivierung von Plasmin/Thrombospondin TGFß Funktionen - Inhibition der Zellproliferation - Supression der Immunantwort - Induktion von Zelldifferenzierung - Stimulation der Synthese von extrazellulärer Matrix - Stimulator der Angiogenese Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren 3 Typen von TGF-Rezeptoren wurden in Säugetierzellen indentifiziert: TGFß-R I: 55 kDa TGFß-R II: 75 kDa TGFß-R III: 200 – 400 kDa Proteoglycan ohne Signaltransduktionseigenschaften Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-II Ligandbindungsdomäne TßR-I Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-II Ligandbindungsdomäne Transmembrandomäne TßR-I Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-II Ligandbindungsdomäne Transmembrandomäne Kinasedomäne TßR-I Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-II Ligandbindungsdomäne Transmembrandomäne Kinasedomäne Tß-R I und TßR-II sind Serin/Threonin Kinasen TßR-I Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-II Ligandbindungsdomäne Transmembrandomäne Kinasedomäne P TßR-I Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-II Ligandbindungsdomäne Transmembrandomäne Kinasedomäne P Konstitutiv aktive Kinase TßR-I Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-II TßR-I Ligandbindungsdomäne Transmembrandomäne Kinasedomäne P Konstitutiv aktive Kinase Durch Phosphorylierung aktivierte Kinase Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-I TßR-II Ligandbindungsdomäne Transmembrandomäne Kinasedomäne P Konstitutiv aktive Kinase SGSGSG GS Domäne Durch Phosphorylierung aktivierte Kinase Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-I TßR-II Ligandbindungsdomäne TGF-ß Transmembrandomäne Kinasedomäne P P Konstitutiv aktive Kinase Durch Phosphorylierung aktivierte Kinase Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-I TßR-II Ligandbindungsdomäne TGF-ß Transmembrandomäne Kinasedomäne P P P Durch Phosphorylierung aktivierte Kinase P Konstitutiv aktive Kinase Phosphorylierung der GS Domäne Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-I TßR-II Ligandbindungsdomäne TGF-ß Transmembrandomäne Kinasedomäne P P P Durch Phosphorylierung aktivierte Kinase P Konstitutiv aktive Kinase Signalkaskade Bestimmung der Ligandspezifität durch Kombination unterschiedlicher Mitglieder der TßR-II- und TßR-I-Familien TGF-ß TßR-II Activin/Nodal TßR-I ActR-II ActR-IIB ActR-IB Bestimmung der Ligandspezifität durch Kombination unterschiedlicher Mitglieder der TßR-II- und TßR-I-Familien TGF-ß TßR-II Activin/Nodal TßR-I BMP2 BMP4 BMP7 BMPR-II BMPR-IA BMPR-IB ActR-II ActR-IIB ActR-IB GDF5 BMP4 ActR-II BMPR-IA ActR-IIB BMPR-IB BMP7 ActR-II ALK2 ActR-IIB AMH/MIS AMHR-II BMPR-IB Signalgenerierung durch TGF-ß-Rezeptoren TßR-I TßR-II Ligandbindungsdomäne TGF-ß Transmembrandomäne Kinasedomäne P P Konstitutiv aktive Kinase P Durch Phosphorylierung aktivierte Kinase P Signalkaskade Smad-Proteine Struktur der Smad-Proteine Fusion aus Sma: Analogon aus C. elegans Mad: Analogon aus Drosophila (Mad= „Mothers against decapentaplegig“) Decapentaplegic = TGFß-Analog aus Drosophila Struktur der Smad-Proteine R-Smads H2 N- DNA-Bindung (ß-hairpin ) NLS SXS -COO- Struktur der Smad-Proteine MH1-Domäne R-Smads H2 N- DNA-Bindung (ß-hairpin ) Linker MH2-Domäne NLS SXS -COO- Struktur der Smad-Proteine Phosphorylierungsstelle MH1-Domäne R-Smads H2 N- DNA-Bindung (ß-hairpin ) Linker MH2-Domäne NLS SXS -COO- Struktur der Smad-Proteine Phosphorylierungsstelle MH1-Domäne R-Smads H2 N- Co-Smad H2 N- DNA-Bindung (ß-hairpin ) Linker MH2-Domäne NLS SXS -COO- -COO- Struktur der Smad-Proteine Phosphorylierungsstelle MH1-Domäne R-Smads H2 N- DNA-Bindung (ß-hairpin ) MH2-Domäne NLS SXS -COO- -COO- Co-Smad H2 N- I-Smads Linker H2 N -COO- Interaktionsdomänen der Smad-Proteine Co-factor interaction Mitglieder der Smad-Familie Mitglieder der Smad-Familie Mitglieder der Smad-Familie Mitglieder der Smad-Familie Aktivierung der R-Smads durch TßR-I-abhängige Phosphorylierung der C-terminalen Domäne -NH 2 SXS -COO- ATP TßR-I ADP PP H2 N- SXS -COO- Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade TßR-I TßR-II TGF-ß -N H2 P P P P R-Smad SXS -COO- Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade TßR-I TßR-II TGF-ß -N H2 P P R-Smad P SXS -COO- P SARA SARA = Smad anchor for receptor activation Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade TßR-I TßR-II P P -NH2 SXS -COO- P P SARA TGF-ß R-Smad Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade TßR-I TßR-II P P -NH2 SXS -COO- P P SARA TGF-ß R-Smad PP H2 N- SXS -COO- Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade TßR-I TßR-II P P -NH2 SXS -COO- P P SARA TGF-ß R-Smad PP PP H2 N- SXS -COO-COO- H2 N- H2 N- SXS -COO- H2 N- SXS -COO- PP -NH2 SMAD-4 Co-Smad -COO- Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade TßR-I TßR-II P P -NH2 SXS -COO- P P SARA TGF-ß R-Smad PP PP H2 N- SXS -COO- H2 N- SXS -COO-COO- H2 N- H2 N- SXS -COO- PP -NH2 Translokation in den Zellkern Co-Smad -COO- Smad-Aktivierung durch die TGF-ß Signalkaskade TßR-I TßR-II -C OO- TGF-ß SARA P P SARA P P -N H2 X I-Smad SXS -COO- R-Smad H2 N X PP H2 N- SXS -COO- H2 N- SXS -COO-COO- H2 N- H2 N- PP X SXS -COO- PP -NH2 Translokation in den Zellkern Co-Smad -COO- Smad-abhängige Aktivierung der Transkription O P O PXS -C S OO C - OCO S SX PP H2N- Transaktivierung? H2 N- H 2N- 5' C AG A C 3' Smad Binding Element Smad-abhängige Aktivierung der Transkription O P O PXS -C S OO C - OCO S SX PP H2N- Transaktivierung? H2 N- H 2N- 5' C AG A C 3' Smad Binding Element Häufigkeit der Konsensussequenz 1/1024 bp (4 Basen, Pentanucleotid: 45 bp) In praktisch jedem Promotor kommt diese Sequenz vor. Smad-abhängige Aktivierung der Transkription O P O PXS -C S OO C - OCO S SX PP H2N- Transaktivierung? H2 N- H 2N- 5' C AG A C 3' Smad Binding Element Häufigkeit der Konsensussequenz 1/1024 bp (4 Basen, Pentanucleotid: 45 bp) In praktisch jedem Promotor kommt diese Sequenz vor. Genspezifität kann nur durch Kombination mit anderen Faktoren erreicht werden Smad-abhängige Aktivierung der Transkription O P O PXS -C S OO C - OCO S SX PP H2N- Transaktivierung? H2 N- H 2N- 5' C AG A C 3' Smad Binding Element Affinität von Smads für Konsensussequenz ist relativ gering: (etwa 10-7 M, Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren zum Vergleich 3 nM ) Smad-abhängige Aktivierung der Transkription O P O PXS -C S OO C - OCO S SX PP H2N- Transaktivierung? H2 N- H 2N- 5' C AG A C 3' Smad Binding Element Affinität von Smads für Konsensussequenz ist relativ gering: (etwa 10-7 M, Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren zum Vergleich 3 nM ) Ein SBE reicht für eine effektive Bindung der Smads an die DNA alleine nicht aus. Smad-abhängige Aktivierung der Transkription O P O PXS -C S OO C - OCO S SX PP H2N- Transaktivierung? H2 N- H 2N- 5' C AG A C 3' Smad Binding Element Affinität von Smads für Konsensussequenz ist relativ gering: (etwa 10-7 M, Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren zum Vergleich 3 nM ) Ein SBE reicht für eine effektive Bindung der Smads an die DNA alleine nicht aus. Eine effektive DNA-Bindung kann nur durch multiple SBEs und/oder andere Faktoren erreicht werden Smad-abhängige Aktivierung der Transkription DNA-Bindungs-Kofaktoren O P O P S -C SX O O -C S SX OO - PP H2N- H2 N- H 2N- 5' -C C AG A C Smad Binding Element Smad-abhängige Aktivierung der Transkription DNA-Bindungs-Kofaktoren O P O P S -C SX O O -C S SX -C OO - PP H2N- H2 N- H 2N- 5' C AG A C A T C AC A Smad Binding Element A ctivin R esponse Element Smad-abhängige Aktivierung der Transkription DNA-Bindungs-Kofaktoren O P O P S -C SX O O -C S SX OO - PP H2N- H2 N- FAST H 2N- 5' -C C AG A C A T C AC A Smad Binding Element A ctivin R esponse Element Transaktivierung Smad-abhängige Aktivierung der Transkription DNA-Bindungs-Kofaktoren O P O P S -C SX O O -C S SX OO - Transaktivierung PP H2N- H2 N- FAST H 2N- 5' -C C AG A C A T C AC A Smad Binding Element A ctivin R esponse Element FAST verstärkt die Bindung des Smad-Komplexes an die DNA hat aber selbst keine transaktivierende Wirkung. Smad-abhängige Aktivierung der Transkription DNA-Bindungs-Kofaktoren Bekannte DNA-Bindungspartner für Smads sind FAST für Smad2 und Smad3 OAZ für Smad1, Smad5 und Smad8 Smad-abhängige Aktivierung der Transkription DNA-Bindungs-Kofaktoren Bekannte DNA-Bindungspartner für Smads sind - FAST für Smad2 und Smad3 - OAZ für Smad1, Smad5 und Smad8 DNA-Bindungspartner erhöhen die Signalspezifität - da nur Gene aktiviert werden, die SRE und Erkennungssequenzen für die Kofaktoren haben - da sie für eine bestimmte Gruppe von Smads und damit für eine Gruppe von Rezeptoren spezifisch sind - da sie zellspezifisch exprimiert werden Smad-abhängige Regulation der Transkription Coaktivatoren oder Repressoren Smad-abhängige Regulation der Transkription Coaktivatoren oder Repressoren PPXS -COO S O O C - SSX PP H2N- H2 N- H2N- 5' OCO C A GA C S mad B inding E lement 3' Coaktivator Smad-abhängige Regulation der Transkription Coaktivatoren oder Repressoren PPXS -COO S O O C - SSX Coaktivator OCO PP H2N- Histon-Acetyl-Transferase H2 N- H2N- 5' C A GA C S mad B inding E lement 3' Smad-abhängige Regulation der Transkription Coaktivatoren oder Repressoren PPXS -COO S O O C - SSX Coaktivator OCO PP H2N- Histon-Acetyl-Transferase H2 N- H2N- 5' C A GA C S mad B inding E lement 3' Histon Histon-Ac Smad-abhängige Regulation der Transkription Coaktivatoren oder Repressoren PPXS -COO S O O C - SSX Coaktivator OCO Histon PP H2N- Histon-Acetyl-Transferase H2 N- H2N- 5' C A GA C S mad B inding E lement 3' Histon-Ac Chromatinauflockerung Smad-abhängige Regulation der Transkription Coaktivatoren oder Repressoren PPXS -COO S O O C - SSX Coaktivator OCO Histon PP H2N- Histon-Acetyl-Transferase H2 N- H2N- 5' C A GA C S mad B inding E lement 3' Histon-Ac Chromatinauflockerung erhöhte Transkription Smad-abhängige Regulation der Transkription Coaktivatoren oder Repressoren PPXS -COO S O O C - SSX Coaktivator OCO Histon PP H2N- Histon-Acetyl-Transferase H2 N- H2N- 5' 3' C A GA C Chromatinauflockerung S mad B inding E lement erhöhte Transkription O O PP C XS S OO C - S SX OO -C PP H 2N - H2 N- H 2N- 5' C A GAC Smad Binding Element Histon-Ac 3' Repressor Smad-abhängige Regulation der Transkription Coaktivatoren oder Repressoren PPXS -COO S O O C - SSX Coaktivator OCO Histon PP H2N- Histon-Acetyl-Transferase H2 N- H2N- 5' 3' C A GA C Chromatinauflockerung S mad B inding E lement erhöhte Transkription O O PP C XS S OO C - S SX Repressor OO -C PP H 2N - Histon-Deacetylase H2 N- H 2N- 5' C A GAC Smad Binding Element Histon-Ac 3' Smad-abhängige Regulation der Transkription Coaktivatoren oder Repressoren PPXS -COO S O O C - SSX Coaktivator OCO Histon PP H2N- Histon-Acetyl-Transferase H2 N- H2N- 5' 3' C A GA C Chromatinauflockerung S mad B inding E lement erhöhte Transkription O O PP C XS S OO C - S SX Repressor OO -C PP H 2N - Histon-Deacetylase H2 N- H 2N- 5' C A GAC Smad Binding Element Histon-Ac 3' Histon-Ac Histon Chromatinkondensierung erniedrigte Transkription Aktivierung der TGFß-R/SMAD Signalkaskade führt bei epithelialen Zellen zu einem Zellzyklusarrest Wodurch ? Cyclin-abhängige Kinasen: Motoren und Schalter des Zellzyclus CDKs: Motoren des Zellzyklus Welche "Motorwirkung" haben CDKs im Zellzyklus ? Durch die Phosphorylierung welcher Substrate werden Zellzyklusphasen eingeleitet ? CDK Substrate: Initiation der S-Phase Bedeutung von CDKs bei der Initiation der S-Phase CDK Substrate: Initiation der S-Phase Retinoblastom-Protein (Rb) - Schlüsselsubstrat der S-Phase nucleäres Protein, 110 kDa NH2- A B -COOH CDK Substrate: Initiation der S-Phase Retinoblastom-Protein (Rb) - Schlüsselsubstrat der S-Phase nucleäres Protein, 110 kDa NH2- A B Bindung des Transkriptionsfaktors E2F -COOH CDK Substrate: Initiation der S-Phase Retinoblastom-Protein (Rb) - Schlüsselsubstrat der S-Phase nucleäres Protein, 110 kDa NH2- A B Bindung des Transkriptionsfaktors E2F E2F: zentraler Transkriptionsfaktor bei der Induktion von S-Phase Genen -COOH CDK Substrate: Initiation der S-Phase Retinoblastom-Protein (Rb) - Schlüsselsubstrat der S-Phase nucleäres Protein, 110 kDa P NH2- P P P P A P P P P P B Bindung des Transkriptionsfaktors E2F E2F: zentraler Transkriptionsfaktor bei der Induktion von S-Phase Genen -COOH CDK Substrate: Initiation der S-Phase Rb Rb E2F Repression E2F-kontrollierter Gene CDK Substrate: Initiation der S-Phase Cyclin E CDK 2 P P P Rb Rb Rb E2F Repression E2F-kontrollierter Gene E2F Induktion E2F-kontrollierter Gene E2F: Initiator der S-Phase Cyclin E E2F-kontrollierter Gene CDK 2 P P P DNA-Pol I Rb dNTP-Synth. E2F Regulation der CDK-Aktivität: Inhibitoren Cyclin Cyclin inaktiv CDK CDK Cyclinkonzentration CDK-Inhibitoren Cyclin CKI CDK T160 P CDK Phosphorylierung Dephosphorylierung Cyclin Pi P T14 CKI inaktiv ATP ATP aktiv T160 P P Y15 P inaktiv CDK inaktiv T160 P Regulation der CDK-Aktivität: Inhibitoren Beispiel: CKI p21 isosterische Hemmung durch Bindung im aktiven Zentrum Cyclin E CDK 2 CKI p21 G1 S-Phase Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß TGF-ß Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß TGF-ß p15, p21 Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß TGF-ß p15, p21 p27 Cyclin/CdK Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß TGF-ß p15, p21 p27 Cyclin/CdK Rb/E2F Rb-P Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß TGF-ß p15, p21 p27 Cyclin/CdK E2F Rb/E2F Rb-P S-Phase Gene Hemmung der Zellzyklusprogression durch TGF-ß TGF-ß myc p15, p21 p27 Cyclin/CdK E2F Rb/E2F Rb-P S-Phase Gene Zielgene des Transkriptionsfaktors c-myc (+) Cyclin D Vermehrte Bildung des CyclinD/Cdk4 Komplexes (+) Cyclin E Vermehrte Bildung des CyclinE/Cdk2 Komplexes (+) cdc25a-Phosphatase Enthemmung des CyclinD/Cdk4 Komplexes (+) p27-Sequestrierungsfaktor Enthemmung des CyclinE/Cdk2 Komplexes Beeinflussung des Zellzyklus durch Myc G1 Myc Cell cycle progression S Mögliche Angriffspunkte in der TGF-ßSignalkette bei Tumorerkrankungen • Aufhebung der TGF-ß-vermittelten Hemmung der Zellproliferation z. B. Defekte in TßR oder Smad • Ausschaltung der proapoptotischen Signalkaskaden z. B. Defekte in proapoptotischen Proteinen In späteren Stadien TGF-ß Sekretion und dadurch : • Immunsuppression • Epitheliale zu mesenchymaler Transdifferenzierung erhöhte Metastasierungsneigung • Vermehrte Neovaskularisation
