Nachweis und Anreicherung IL-17-sezernierender T

298_374_BIOsp_0310.qxd
316
21.04.2010
14:21 Uhr
Seite 316
MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
Durchflusszytometrie
Nachweis und Anreicherung
IL-17-sezernierender T-Zellen
MICHAELA NIEMÖLLER, ANNA FOERSTER, CLAUDIA ZYNTEK, MARIO ASSENMACHER,
ANNE RICHTER
MILTENYI BIOTEC GMBH, BERGISCH GLADBACH
Extrem seltene Populationen lebender Interleukin(IL)-17-sezernierender
Zellen aus humanen und murinen Geweben können mithilfe des von uns
entwickelten IL-17 Secretion Assay sowohl durchflusszytometrisch analysiert als auch magnetisch angereichert werden.
We have developed an IL-17 Secretion Assay that allows the flow cytometric analysis and magnetic enrichment by MACS Technology of
extremely rare, viable interleukin(IL)-17–secreting cells from mouse or
human tissues, including human antigen-specific T cells.
ó Wie unlängst nachgewiesen wurde, spielt
eine bestimmte Linie der T-Helferzellen, die
TH17-Zellen, eine wichtige Rolle in der Abwehr des Wirtsorganismus von extrazellulären Pathogenen wie unter anderem Bakterien
und Pilzen [1, 2]. Diese TH17-Zellen sind insbesondere durch ihre Sekretion von IL-17A,
IL-17F und IL-22 infolge Antigenaktivierung
gekennzeichnet. Auch andere jüngere Studien belegen die Bedeutung des IL-17 nicht
nur in der Immunantwort auf Infektionen,
sondern auch in atopischen und chronisch
entzündlichen Erkrankungen wie z. B.
bestimmten Autoimmunerkrankungen [3, 4].
Wir haben ein neuartiges Verfahren zur Markierung von IL-17-sezernierenden Zellen ent-
IL-17
Anti-PE
MicroBeads
IL-17 Catch
Reagent
IL-17 Detection
Antibody (PE)
IL-17–sezernierende Zelle
wickelt und beschreiben hier, wie sich dieses
zum Nachweis und zur Isolierung lebender
Zellen sowohl aus humanen als auch aus
murinen Geweben nutzen lässt [5].
Material und Verfahren
Der IL-17 Secretion Assay nutzt eine bispezifische CD45/IL-17A-Antikörper-Affinitätsmatrix (IL-17 Catch Reagent) zum Immobilisieren des IL-17 unweit der Zelloberfläche der
IL-17-sezernierenden CD45-positiven Zellen
(Abb. 1). Es wurden Zellen aus Mäusemilzen
bzw. humane periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) verwendet. Sowohl die Milz
als auch PBMCs enthalten wichtige Immunzellen, wie z. B. Lymphozyten und Monozyten.
• Das IL-17 Catch Reagent heftet sich an
lebende CD45-positive Zellen und bindet das
sezernierte IL-17
• Das immobilisierte IL-17 wird mit einem an ein
Fluorophor (PE) konjugierten Anti-IL-17Antikörper markiert und die Zellen werden
durchflusszytometrisch analysiert
• Die mit dem zweiten Antikörper als IL-17sezernierend markierten Zellen können nach
weiterer Markierung mit Anti-PE-MicroBeads
mittels MACS-Separation isoliert werden
˚ Abb. 1: Prinzip des IL-17 Secretion Assays.
BIOspektrum | 03.10 | 16. Jahrgang
298_374_BIOsp_0310.qxd
21.04.2010
14:21 Uhr
Seite 317
317
A
Nicht stimuliert
Ionomycin + PMA
Nachweis und Anreicherung
in murinen Geweben
BIOspektrum | 03.10 | 16. Jahrgang
10
1
0.3
0.2
0.1
0
CD4+
CD8+
γδTCR+
NKT
T-Zell-Subpopulation
B
Vor Anreicherung
Nach Anreicherung
0.003% *
0.56% *
0.36% *
60.76% *
Ohne
Stimulation
CD4
Aus der Milz von BALB/c-Mäusen wurden
Einzelzellsuspensionen präpariert und entweder unbehandelt oder nach 3-stündiger Stimulation mit einer Kombination aus dem Kalzium-Ionophor Ionomycin und dem Phorbolester PMA auf IL-17-Sekretion hin untersucht.
Zuvor hatten wir ermittelt, dass die 3-stündige Stimulation die höchste IL-17-Sekretion
bewirkt (Daten nicht gezeigt). Die durchflusszytometrische Analyse von CD4-, CD8oder γδTCR-positiven T-Zellen und
CD3ε/CD49b-positiven NK(Natürliche Killer)T-Zellen ergab, dass ohne exogene Stimulation nur sehr wenige Zellen aus allen diesen
Zelltypen IL-17 sezernieren. Innerhalb der
Population der einzelnen Zelltypen stieg die
Zahl der IL-17-sezernierenden Zellen jedoch
nach Stimulation an. Besonders ausgeprägt
war diese Häufigkeitszunahme bei den NKTZellen und den γδTCR-positiven T-Zellen, die
einen relativ hohen Anteil IL-17-sezernierender Zellen gemessen an der Gesamtzahl dieser Zelltypen aufwiesen. IL-17-sezernierende
CD4-positive und CD8-positive Zellen hingegen waren selten (Abb. 2A). Nachdem bewiesen war, dass unser Assay sich für den Nachweis seltener Populationen lebender IL-17sezernierender Zellen eignet, prüften wir, ob
die an der Zelloberfläche gebundenen Immunkomplexe als Ziel für die spezifische immunomagnetische Anreicherung dieser Zellen
mittels MACS-Zellseparation genutzt werden
können. Vor der Anreicherung machten die
IL-17-sezernierenden Zellen unter den CD4positiven T-Zellen einen Anteil von 0,36 Prozent aus. Das entspricht einer theoretischen
Population von 3.600 Zellen in insgesamt 106
CD4-positiven T-Zellen. Mithilfe des IL-17
Secretion Assay isolierte IL-17-sezernierende CD4-positive Zellen wurden mit Erfolg auf
20
IL-17-sezernierende T-Zell-Population in%
Nach Aktivierung der Zellen wurden diese
mit der bispezifischen Affinitätsmatrix (über
Anheftung an CD45) markiert und anschließend 45 Minuten kultiviert, um die Bindung
des sezernierten IL-17 zu gestatten. Danach
wurden die Zellen mit einem Phycoerythrin(PE)-konjugierten Anti-IL-17-Antikörper
markiert und entweder durchflusszytometrisch analysiert oder zusätzlich mit an paramagnetischen MACS® MicroBeads konjugierten Anti-PE-Antikörpern markiert und
mittels MACS-Zellseparation getrennt. Die
Mäusemilz-Zellen und humanen PBMCs
wurden nach Standardverfahren gewonnen
(www.miltenyibiotec.com/protocols).
PMA/
Ionomycin
IL-17-Sekretion
* % unter CD4-positiven T-Zellen
˚ Abb. 2: Analyse und Isolierung von seltenen IL-17-sezernierenden murinen Zellpopulationen. A,
IL-17-sezernierende T-Zellen aus Mäusemilzen mit und ohne Aktivierung mit Ionomycin und PMA.
B, Anreicherung IL-17-sezernierender CD4-positiver Zellen mit dem Mouse IL-17 Secretion Assay –
Cell Enrichment and Detection Kit (PE). Zusätzlich wurden die Zellen mit CD4-APC-Antikörpern fluoreszenzmarkiert und durchflusszytometrisch auf IL-17-Sekretion und CD4-Expression analysiert.
eine Häufigkeit von über 60 Prozent angereichert (Abb. 2B). 1.444 lebende IL-17- sezernierende CD4-positive Zellen, das heißt
40 Prozent der theoretisch verfügbaren
Gesamtpopulation, wurden isoliert. Zusammengenommen belegen diese Daten, dass
sich der IL-17 Secretion Assay für die Anreicherung IL-17-sezernierender Zellen aus
Mischpopulationen, die aus murinen Gewe-
ben gewonnen wurden, eignet und weiterhin
dass IL-17 von verschiedenen Lymphozytenlinien des murinen Systems sezerniert wird.
Nachweis und Anreicherung in
humanen Geweben
Eine ähnliche Analyse wurde an humanen
PBMCs vorgenommen. Die Zellen wurden mit
dem künstlichen Superantigen CytoStim (Mil-
298_374_BIOsp_0310.qxd
21.04.2010
14:21 Uhr
Seite 318
MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
318
A
Nicht stimuliert + CD40-Antikörper
IL-17-sezernierende T-Zellen in %
1
CytoStim + CD40-Antikörper
0.8
0.6
0.4
0.2
0
CD4 +
CD4 +CD161 –
CD4 +CD161 +
CD8 +
T-Zell-Subpopulation
B
Vor Anreicherung
Nach Anreicherung
0.004% *
0.000% *
0.123% *
98.415% *
CD4
Ohne
Restimulation
+ CD40-Antikörper
CytoStim
+ CD40-Antikörper
CD4-positive T-Zellen im Gate
90.045% **
CD154
0.113% **
IL-17-Sekretion
* % unter CD4-positiven T-Zellen
** % unter CD4/CD154-positiven T-Zellen
˚ Abb. 3: Analyse und Isolierung von seltenen IL-17-sezernierenden humanen Zellpopulationen.
A, IL-17-sezernierende Lymphozyten aus humanen PBMCs mit und ohne Aktivierung mit dem polyklonalen Aktivator CytoStim. B, Anreicherung IL-17-sezernierender CD4-positiver Zellen mit dem
IL-17 Secretion Assay – Cell Enrichment and Detection Kit (PE), human. Die Zellen wurden zusätzlich mit CD4-FITC- und CD154-APC-Antikörpern fluoreszenzmarkiert und durchflusszytometrisch
auf IL-17-Sekretion und CD4-Expression analysiert. CD4-positive Zellen wurden weiterhin auf
IL-17-Sekretion und CD154-Expression hin untersucht.
tenyi Biotec) behandelt, das T-Zell-Rezeptoren unspezifisch mit MHC(major histocompatibility complex)-Molekülen vernetzt, die
auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen vorhandenen sind. Des Weiteren wurden sie mit einem CD40-Antikörper
behandelt, um die Herunterregulierung von
CD154 durch CD40/CD154-Interaktionen zu
vermeiden. Eine PBMC-Probe wurde als Negativkontrolle nur mit dem CD40-Antikörper
inkubiert. In unbehandelten Proben stellen
IL-17-sezernierende CD4-positive und CD8positive T-Zellen extrem seltene Populationen dar. Die Häufigkeit der beiden IL-17-sezernierenden Populationen stieg infolge der Stimulation an (in der CD4-positiven Population
stärker ausgeprägt), dennoch blieben beide
gemessen an der Gesamtzellpopulation sehr
selten. Die meisten Zellen, die nach Stimulation IL-17 sezernieren, exprimierten CD4
sowie den humanen NK-Zellmarker CD161
(Abb. 3A).
Anschließend nutzten wir die MACS-Separation, um die sehr seltene Population der
infolge Superantigen-Aktivierung IL-17-sezernierenden Zellen spezifisch anzureichern. Die
Häufigkeit der IL-17-sezernierenden CD4-positiven Zellen in der stimulierten Probe betrug
vor der MACS-Separation 0,123 Prozent und
stieg auf über 98 Prozent an, wobei aus insgesamt 106 CD4-positiven Zellen bei einer Isolierungseffizienz von rund 50 Prozent insgesamt 696 Zellen gewonnen werden konnten.
Darüber hinaus ko-exprimierten 90 Prozent
der angereicherten humanen CD4-positiven
Zellen den Aktivierungsmarker CD154. Das
zeigt, dass spezifisch aktivierte und IL-17sezernierende Zellen isoliert wurden und dass
sich IL-17 nicht wesentlich im Kulturmedium
verbreitet und andere CD45-positive Zelltypen unspezifisch markiert hatte (Abb. 3B).
Um zu ermitteln, ob der IL-17 Secretion
Assay zur Isolierung antigenspezifischer
TH17-Zellen genutzt werden kann, behandelten wir zusätzlich humane PBMCs mit
einem aus Candida albicans gewonnenen
Lysat bzw. antigenen Peptid-Pool. Anschließend nutzten wir den IL-17 Secretion Assay
gefolgt von der MACS-Separation, um IL-17sezernierende Zellen zu isolieren, die dann
gegen CD4 und CD154 gegengefärbt wurden.
Trotz einer ursprünglichen Populationshäufigkeit von gerade einmal 0,006 Prozent nach
der Behandlung mit dem Peptid-Pool war es
möglich, eine angereicherte Population aufzubauen, in der diese Zellen 65 Prozent der
Gesamtpopulation ausmachten. Dies entsprach einer Isolierungseffizienz von rund
BIOspektrum | 03.10 | 16. Jahrgang
298_374_BIOsp_0310.qxd
21.04.2010
14:21 Uhr
Seite 319
319
Zusammenfassung
Wir beschreiben hier, wie der IL-17 Secretion
Assay zum Nachweis und zur Isolierung
extrem seltener Populationen lebender IL-17sezernierender Zellen sowohl aus murinen
als auch aus humanen Geweben genutzt werden kann. Der Assay ist hoch empfindlich und
erlaubt die effektive Anreicherung lebender
antigenspezifischer TH17-Zellen, die in Mischpopulationen mit sehr geringer Häufigkeit
auftreten. Die angereicherten Zellpopulationen bleiben lebensfähig und können anschließend in weiteren Anwendungen verwendet
werden. Der Assay erleichtert die Anreicherung und Analyse der sehr seltenen TH17Zellen erheblich und sollte zu deutlich tieferen Einblicken in ihre immunregulierende
Rolle in diversen Immunprozessen verhelfen.
Danksagung
˘ Abb. 4: Anreicherung von sehr seltenen IL-17-sezernierenden humanen
antigenspezifischen
T-Zellen. Anreicherung von Candidaspezifischen CD4positiven Zellen mit
dem IL-17 Secretion
Assay – Cell Enrichment and Detection
Kit (PE), human nach
Stimulation mit
einem Peptid-Pool
oder einem Lysat
aus Candida albicans. Die Zellen
wurden zusätzlich
mit CD4-FITC- und
CD154-APC-Antikörpern fluoreszenzmarkiert. Die
durchflusszytometrische Analyse erfolgte mit
einem
MACSQuant® Analyzer. Die IL-17-Sekretion und CD154Expression wurde
innerhalb der CD4positiven Zellpopulation untersucht.
Vor Anreicherung
Nach Anreicherung
CD4-positive T-Zellen im Gate
<0.0006% *
14.810% *
Ohne Restimulation + CD40-Antikörper
0.006% *
64.520% *
CD154
33 Prozent der Gesamtzahl der theoretisch
verfügbaren Zellen. Bei einer Population
mit einer ursprünglichen Populationshäufigkeit von 0,038 Prozent nach der Behandlung
mit dem Lysat wurde eine Isolierungseffizienz
von rund 50 Prozent und eine Population
mit einer Reinheit von 87 Prozent erzielt
(Abb. 4).
C. albicans Peptid-Pool + CD40-Antikörper
0.038% *
Wir bedanken uns bei Maria Lexberg, Monika Winkels und Jürgen Schmitz für die Unterstützung bei der Entwicklung der IL-17 Secretion Assays.
ó
86.780% *
Literatur
[1] O’Quinn DB, Palmer MT, Lee YK et al. (2008) Emergence
of the Th17 pathway and its role in host defense. Adv
Immunol 99:115–163
[2] Martinez GJ, Nurieva RI, Yang XO et al. (2008) Regulation
and function of proinflammatory TH17 cells. Ann N Y Acad
Sci 1143:188–211
[3] Curtis MM, Way SS (2009) Interleukin-17 in host defence
against bacterial, mycobacterial and fungal pathogens.
Immunology 126:177–185
[4] Fouser LA, Wright JF, Dunussi-Joannopoulos K et al.
(2008) Th17 cytokines and their emerging roles in inflammation and autoimmunity. Immunol Rev 226:87–102
[5] Lexberg MH, Taubner A, Förster A et al. (2008) Th memory for interleukin-17 expression is stable in vivo. Eur J
Immunol 38:2654–2664
C. albicans Lysat + CD40-Antikörper
IL-17-Sekretion
* % unter CD4/CD154-positiven T-Zellen
Anne Richter, Michaela Niemöller, Anna Foerster, Claudia Zyntek, Mario Assenmacher (v. l. n. r.)
Korrespondenzadresse:
Dr. Anne Richter
Miltenyi Biotec GmbH
Forschungs- und Entwicklungsabteilung
Friedrich-Ebert-Straße 68
D-51429 Bergisch Gladbach
Tel.: 02204-83064485
Fax: 02204-83064488
[email protected]
BIOspektrum | 03.10 | 16. Jahrgang