Zellkultur

Zellkultur
Zellkultur
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Kultivierung tierischer oder pflanzlicher Zellen in einem
Nährmedium außerhalb des Organismus
Zelllinien sind Zellen einer Gewebeart, die sich im Lauf dieser
Zellkultur unbegrenzt fortpflanzen können (Permanente
Zelllinien)
Es werden sowohl immortalisierte (unsterbliche) Zelllinien als
auch primäre Zellen kultiviert (Primärkultur)
Primärkultur = eine nicht immortalisierte Zellkultur, die direkt
aus einem Gewebe gewonnen wurde
Zelllinien
Zelllinie Herkunft
Spezies
Gewebe
Morphologie
HEK-293 human embryonic
Kidney
Mensch
Niere
Epithel
HeLa
Henrietta Lacks
Mensch
Zervixkarzinom Epithel
CHO
Chinese hamster
ovary
Spodoptera
frugiperda
Hamster
Ovarien
brain endothelial
Maus
Sf-9
bEnd.3
Insekt
Ovar
(Nachtfalter)
Epithel
Epithel
Gehirn/Cortex Endothel
Zelllinien
HEK-293 Zellen
Adhärente CHO-Zellen
HeLa-Zellen
Sf-9-Zellen
Zellkulturlabor und Einrichtung
Zellkulturmedien
Zusammensetzung von Standardmedien:
anorganische Salze
Aminosäuren
Kohlenhydrate
Vitamine
Peptide und Proteine
Lipide und Fettsäuren
Spurenelemente
Medienzusätze
L-Glutamin
Natriumpyruvat
Nichtessentielle Aminosäuren
Natriumbicarbonat
Phenolrot
Serum/ fetales Kälberserum
Zellkulturmethoden zum Nachweis von
Virusinfektionen
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Als obligat intrazelluläre Erreger können Viren nur in
Zell – oder Organkulturen (sowie in Versuchstieren)
angezüchtet werden!
•
Konsequenzen einer viralen Infektion für die
Wirtszelle hängen von Vermehrungstrategie
(Replikationsstrategie) des Virus ab
Konsequenzen
• Latente Persistenz episomaler Genome (HSV)
• Zelltod (Nekrose, Apoptose) (Poliovirus)
• Immortalisierung durch Deregulierung des Zellzyklus
(Papillomviren)
Zellkulturtechniken in der virologischen
Diagnostik
Methode
Erreger
Erregerbestandteil
Material
Virus-
fast alle Viren
isolation
infektiöse
Abstrich,
Partikel
alle Viren
Genabschnitte
Biopsie,
Liquor,
Urin
PCR
AntigenRespiratorische virale Antigene
nachweis Viren
(Immunfluoreszenz)
Serum, Plasma,
Vollblut, Liquor,
Biopsien, Urin,
Abstriche, etc.
zellhaltiges Material
(z.B. Abstriche)
Zellkulturtechniken in der virologischen
Diagnostik
Methode
Erreger
Erregerbestandteil
Material
IFA
Respirationstrakt-Viren
einzelne Strukturproteine
Exfolierte Zellen in
Abstrichen,Sekreten,
Rachenspühlwasser
ELISA
HBV, HCV, HIV
z.B. HBs-Antigen,
HBe-Antigen,
p24-Antigen
Serum
Viruspartikel
Stuhlprobe
Bläscheninhalt
Elektronen- Gastroenteritis-,
mikroskopie Herpes- und
Poxviren
Goldstandard - Virusanzucht
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Virusisolation = aufwendiges Verfahren
hoher Zeitaufwand
hohe apparativer und raumtechnischer Aufwand
einige Viren nur sehr schwer und unter
eingeschränkten Bedingungen anzüchtbar (HBV,
Parvovirus B19, best. Adenoviren)
• einige können gar nicht in Zellen kultiviert werden
(HCV, Papillomviren, Noroviren)
Häufig für Virusisolation verwendete Zellkulturen
Wirt
Virus
Primäre Zellkulturen
Affennierenzellen
Kaninchen-Nierenzellen (RK 13)
Humane embryonale
Nierenzellen (HEK)
Influenza-, Parainfluenza-, Enteroviren
HSV
Adenoviren, Enteroviren
Diploide Zellkulturen
Humane Fibroblaten (MRC-5
oder WI-38)
CMV, VZV, HSV, Rhinoviren,
einige Enteroviren, Adenoviren, RSV
Häufig für Virusisolation verwendete Zellkulturen
Wirt
Permanente Zelllinien
Hep 2 (humanes Epidermoidkarzinom des Larynx)
Virus
RSV, Adenovirus, HSV,
Masernvirus, einige
Parainfluenza und Enteroviren
A549 (humanes Lungenkarzinom) HSV, Adenoviren, Enteroviren
MDCK (Hundenierenzellen)
Influenzaviren
LLC-MK2 (Rhesusaffen-Nierenzellen)
Parainfluenza
Rhabdomyosarkom (RD)
Echoviren
Verozellen (African green monkey Coxsackie-, Masern, Mumpsviren
kidney)
HeLa (humanes Zervixkarzinom)
Adenoviren
Host – shut - off
1.
2.
3.
4.
5.
Interaktion mit Transkriptionsapparat
Interaktion mit zellulärer RNA-Prozessierung
Interaktion mit Translationapparat
Interaktion mit DNA-Synthese
Modifikation zellulärer Proteine
Zytopathischer Effekt (CPE)
Intrazelluläre Vorgänge werden in einem begrenzten
Spektrum an morphologischen Veränderungen
sichtbar
CPE
Rundzellige, traubenförmige
Zelldegeneration
bei Viren, die sich vornehmlich
von Zelle zu Zelle, nicht aber
über das Zellkulturmedium ausbreiten
Rundzellige, diffuse Degeneration
uniformer Zellen, die sich über die gesamte
Kultur ausbreiten
Polymorphzellige, diffuse Zellgeneration
mit Ausbildung von sich aus dem Gewebeverband
ablösenden Zellen
CPE
Mehrkernige Riesenzellen und Synzytien
des RSV-Fusionsproteins in das bhPIV3-Virus
CPE
vakuolige (schaumzellartige) Zellveränderung
kommt im Frühstadium der Ausbildung eines CPE bei
zahlreichen Viren vor
Zellveränderungen sind nicht virusspezifisch und
lediglich ein Hinweis auf die Infektion mit Viren!
Aus dem CPE kann nicht eindeutig auf die Identität des
verursachenden Virus geschlossen werden
CPE
Identifizierung: Immunfluoreszenz,
Immunperoxidasetechniken
Einige Viren rufen CPE bereits nach 24 h hervor, andere
erst nach Tagen bis Wochen
Beispiel HSV auf Verozellen
Lichtmikroskopische Aufnahme
Immunfluoreszenz
Störfaktoren in der Zellkultur
Kontamination durch Mykoplasmen stellt
Hauptproblem dar!
Zellkerne Verozellen
Mykoplasmen positive Verozellen
Hoechst-Färbung
Mykoplasmen DNA
(im Cytoplasma)
Mykoplasmen
•
•
•
•
•
können Bakterienfilter (0,22 µm Porengröße) passieren
kleinste Vertreter der Prokaryoten
gelten als Bakterien (Klasse: Mollicutes)
haben Fähigkeit der Zellwandbildung verloren
~ 40 % aller Zellkulturen sind in Deutschland mit
Mykoplasmen infiziert sein
• Hauptkontaminationsquelle: Mensch! (Rinder)
Auswirkungen eines Mykoplasmenbefalls auf Zellkultur
ändern Parameter des Zellstoffwechsels
Auswirkung auf:
Validität
Reproduzierbarkeit
Signifikanz von Forschungsarbeiten
Auswirkungen auf Zelle:
verlangsamtes Zellwachstum
Verminderung der Zellproliferation
starke Ansäuerung des Mediums
Absterben und Auflösung der Zellen
Veränderung Membranintegrität
Begünstigung von Viruswachstum und Infektionsrate
u.v.m.
Störfaktoren in der Zellkultur
Bakterien stellen den weitaus größten Teil der
Kontaminationen im Zellkulturlabor dar
Meist auf Missachtung bzw. Vernachlässigung der
sterilen Arbeitstechniken oder auf Mängel in der
Gerätewartung zurückzuführen
Regelmäßige Kontrolle der Kulturen!
Bakterien
Antibiotika
Lagerung, Haltbarkeit, Stabilität und Konzentration
beachten!
in der Zellkultur häufig verwendet:
Penicillin – G
Streptomycin
(Tylosin)
Gentamycin
Störfaktoren in der Zellkultur
Pilze und Hefen
Optische Identifizierung
Antimycotika:
Amphoterzin-B
Nystatin
Scanning electron micrograph of the
budding yeast Saccharomyces cerevisiae
Fadenpilz