Differenzeirung dendritischer Zellen - Ruhr

Aus der
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
im St. Josef-Hospital Bochum
-Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. E. Hamelmann
Differenzierung dendritischer Zellen –
Modulation durch den Toll-like Rezeptor-Agonisten LPS
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Rabea Rehman
aus Lünen
2012
Dekan:
Referent:
Koreferent:
Prof. Dr. med. K. Überla
Prof. Dr. med. U. Schauer
Fr. Prof. Dr. rer. nat. N. Prochnow
Tag der Mündlichen Prüfung: 14.05.2013
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ............................................................................ 4
1.1 Dendritische Zellen ................................................................................. 4
1.1.1 Bedeutung .................................................................................................... 4
1.1.2 Stellenwert in der Forschung ....................................................................... 5
1.1.3 Gewinnung ................................................................................................... 5
1.1.4 Entwicklung dendritischer Zellen ................................................................ 5
1.1.5 Heterogenität der Subpopulationen .............................................................. 6
1.1.6 Dendritische Zellen und das Monozyten/Makrophagen–System ................ 7
1.2 Reifung dendritischer Zellen unter Stimuli ............................................. 8
1.3 Die Toll-like Rezeptoren ......................................................................... 9
1.4 LPS-Erkennung durch TLR-4 ............................................................... 11
1.5 Hemmende Eigenschaften von Lipopolysacchariden ........................... 13
1.6 Fragestellung ......................................................................................... 14
2 MATERIAL UND METHODEN .......................................... 15
2.1 Probanden .............................................................................................. 15
2.2 Gewinnung mononukleärer Zellen aus Nabelschnurblut ...................... 15
2.3 Isolierung der CD34+-Stammzellen ...................................................... 17
2.4 Anzucht dendritischer Zellen bis Tag 7 (gemischte Population) .......... 18
2.5 Anzucht ausgewählter Subpopulationen ............................................... 19
2.6 Herstellung von monozytären dendritischen Zellen ............................. 20
2.7 Standard-LPS und hochgereinigtes LPS ............................................... 20
2.7.1 Stimulation der monozytären DCs mit LPS ............................................... 20
2.7.2 Monozytäre DCs in verschiedenen Zelldichten ......................................... 21
2.8 Kulturen mit dendritischen Zellen ........................................................ 21
2.8.1 LPS-Effekt bei dendritischen Zellen ohne IL-4 ......................................... 22
2.8.2 DCs mit IL-4 unter verschiedenen LPS-Konzentrationen ......................... 22
2.9 Durchflusszytometrische Messung ....................................................... 22
2.9.1 Färbung der Oberflächenantigene .............................................................. 22
2.9.2 Datengewinnung und Auswertung ............................................................. 23
2.10 Statistische Auswertung ...................................................................... 25
2.11 Herstellernachweis .............................................................................. 26
1
3 ERGEBNISSE .......................................................................... 29
3.1 Kulturen mit dendritischen Zellen aus Monozyten ............................... 29
3.1.1 Einfluss verschiedener LPS-Präparation und -Konzentrationen ................ 29
3.1.2 Abhängigkeit der LPS-vermittelten Effekte von der Zelldichte ................ 32
3.1.3 Die CD86-Expression bei monozytären DCs ............................................ 34
3.2 Kulturen mit dendritischen Zellen aus CD34+- Stammzellen .............. 35
3.2.1 LPS-Wirkung auf dendritische Zellen ....................................................... 35
3.2.2 LPS-Wirkung auf dendritische Zellen mit IL-4 ......................................... 37
3.2.2.1 Die Expression von CD1a und CD14 ......................................... 37
3.2.2.2 Die Expression von CD86 ........................................................... 39
4 DISKUSSION .......................................................................... 41
4.1 Die LPS-Wirkung auf monozytäre dendritische Zellen ....................... 42
4.1.1 LPS-Präparation und -Dosis .................................................... 43
4.1.2 Die Zellzahl als Kultivierungsfaktor........................................ 45
4.2 Stammzellen-generierte DCs und die Rolle des IL-4 ........................... 46
4.3 Die Rolle der Signaltransduktion .......................................................... 48
4.4 Klinische Relevanz................................................................................ 49
5 ZUSAMMENFASSUNG......................................................... 51
6 LITERATURVERZEICHNIS ............................................... 53
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
2
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
CD
Cluster of differentiation
CPD
Citrat-Phosphat-Dextroselösung
DC
Dendritische Zelle
DMSO
Dimethylsulfoxid
FCS
fetales Kälberserum
FITC
Fluorescein Isothiocyanat
g
gravity (Beschleunigung bei der Zentrifugation)
GM-CSF
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
h
Stunden
IL-4
Interleukin 4
LPS
Lipopolysaccharid(e)
MACS
magnet-associated cell sorting
MFI
mittlere Fluoreszenzintensität
Min
Minuten
ml
Milliliter
mW
Milliwatt
ng
Nanogramm
nl
Nanoliter
PBMC
peripheral blood mononuclear cells
PBS
phosphate buffered saline (Puffer)
PE
Phycoerythrin
RPMI
Roswell Park Memorial Institute (Kulturmedium)
TNF-alpha
Tumornekrosefaktor alpha
upLPS
ultrapure LPS
3
1 Einleitung
Der menschliche Organismus hat ständig Kontakt mit einer Vielzahl von Pathogenen. Zum
Schutz gegen Mikroorganismen, Parasiten und Tumorzellen hat sich das Immunsystem
entwickelt. Seine löslichen und zellulären Komponenten werden einer angeborenen/
natürlichen und einer erworbenen/ adaptiven Form zugeordnet.
Makrophagen und dendritische Zellen als Bestandteile der angeborenen Immunabwehr
bilden die erste zelluläre Front gegen Pathogene. Für die Erkennung von eingedrungenen
Mikroorganismen besitzen sie spezielle Rezeptoren, sog. Pathogen-recognition receptors
(PRRs), unter denen die Toll-like Rezeptoren (TLRs) eine Schlüsselrolle spielen. Ihre
Aktivierung führt bei Makrophagen zur Phagozytose und Freisetzung antimikrobieller
Substanzen. Bei dendritischen Zellen kommt es zur Migration in Lymphknoten, AntigenPräsentation, Zytokinsekretion und nachfolgender Aktivierung von Effektorzellen. Sie
bilden das zentrale Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität (Murphy
et al., 2009).
1.1 Dendritische Zellen
1.1.1 Bedeutung
Dendritische Zellen sind Leukozyten, die eine Schlüsselrolle als Wächterzellen des
Immunsystems spielen. Sie stammen von hämatopoetischen Präkursorzellen aus dem
Knochenmark ab und sind hoch spezialisiert zur Stimulation von T-zellabhängigen
Immunreaktionen und damit zur Initiierung adaptiver Immunantworten (Banchereau and
Steinman, 1998). Diese potenten Antigen-präsentierenden Zellen wurden 1868 erstmals als
Langerhans-Zellen in der Haut beschrieben – erst ein Jahrhundert später fing man an, ihre
Bedeutung für immunologische Prozesse zu erkennen: Steinman und Cohn beschrieben
1973 diese Zellen in der Milz von Mäusen und nannten sie aufgrund ihrer astartigen
Ausläufer „dendritische“ Zellen (Steinman and Cohn, 1973).
Es sind drei Subpopulationen humaner dendritischer Zellen mit charakteristischen
Merkmalen und Funktionen bekannt: die Langerhans-Zellen der Haut, die myeloiden und
die plasmazytoiden DCs (Palucka and Banchereau, 1999). Dendritische Zellen sind die
einzigen Zellen des Organismus‘, die primäre Immunreaktionen einleiten können.
4
1.1.2 Stellenwert in der Forschung
Die Tatsache, dass dendritische Zellen eine Schlüsselposition am Beginn jeder primären
Immunantwort inne haben, macht sie interessant für Forschung im Bereich der
Immuntherapie. Seit einiger Zeit werden sie in der Tumorimmunologie als Träger
gerichteter Vakzinierungen eingesetzt. Hier sind vor allem die myeloiden DCs interessant,
da sie eine sehr hohe Kapazität zur Antigenaufnahme besitzen (Dubsky et al., 2005). Auch
in dieser Arbeit stehen myeloide dendritische Zellen im Vordergrund.
Desweiteren sind dendritische Zellen auch im Bereich der allergischen Erkrankungen von
Interesse. So wird zurzeit untersucht, wie die Funktion von DCs durch Arabinogalaktan
über die Bindung an PRRs moduliert werden kann. Für dieses aus Stallstaub extrahierte
Polysaccharid konnte eine allergieprotektive Wirkung nachgewiesen werden (Peters and
Bufe, 2011).
1.1.3 Gewinnung
Isolation und Kultivierung dendritischer Zellen sind aufwendig und schwierig. In vivo
kommen diese nur in sehr geringen Mengen vor: sie machen weniger als 1% der
zirkulierenden peripheren mononukleären Zellen des Blutes aus. Plasmazytoide DCs
entstehen aus lymphoiden Vorläufern. Myeloide dendritische Zellen können in vitro zum
einen
aus
CD34+
hämatopoetischen
Vorläuferzellen
im
Knochenmark
oder
Nabelschnurblut und zum anderen aus peripheren Blutmonozyten (CD14+-Zellen)
hervorgehen (Cella et al., 1997). Die Gewinnung aus Nabelschnurblut hat sich als
einfachste und vergleichsweise effektivste Methode etabliert (Caux et al., 1992).
1.1.4 Entwicklung dendritischer Zellen
Dendritische Zellen entwickeln sich in vivo in 4 Schritten an jeweils 4 verschiedenen
Orten: Myeloide Präkursorzellen aus dem Knochenmark gelangen über das Blut in
periphere Gewebe; ihre Hauptaufgabe ist die Phagozytose von Pathogenen. Über das
Interagieren von inflammatorischen Stimuli und ihrer Oberflächenrezeptoren werden sie in
entzündetes Gewebe gelockt (Chemotaxis), wo sie sehr effizient Antigene aufnehmen und
5
prozessieren (Dieu et al., 1998). Sie wandern dann als beladene unreife dendritische Zelle
in die sekundären lymphatischen Organe ein. Hier treten sie in Kontakt mit den THelferzellen, was die vollständige Ausreifung induziert (Sallusto and Lanzavecchia, 1994):
sie verlieren ihre chemotaktischen Rezeptoren, exprimieren u.a. MHC Klasse I und II und
akzessorische Kostimulationsmoleküle wie CD40 und CD80. Außerdem wird die
Produktion proinflammatorischer Zytokine stimuliert und CD83 hochreguliert, ein
spezifischer dendritischer Marker, der als wichtiger Indikator für reife DCs gilt (Zhou and
Tedder 1995). Im Zuge der Aktivierung kommt es zu einer Reduktion der
Endozytosefähigkeit, zum Verlust der Aktivierbarkeit und zu einer gesteigerten Expression
des kostimulatorischen Moleküls CD86, welches ebenfalls als Reifungsmarker gilt
(Banchereau et al, 2000). Neben funktionellen Veränderungen unterliegen dendritische
Zellen aber auch phänotypischen Veränderungen: es bilden sich vermehrt Zellausläufer aus
und die Größe und Anzahl der Granula nimmt zu. Die Ausläufer reifer dendritischer Zellen
dienen der effizienten Zell-Zell-Interaktion, denn durch die Vergrößerung der
Zelloberfläche kann eine große Anzahl an Zellen gleichzeitig durch eine dendritische Zelle
aktiviert werden.
Die Aktivierung der DCs und somit die Umwandlung in reife Zellen kann durch eine
Vielzahl unterschiedlicher Stimuli bewirkt werden, wie z.B. mikrobielle Bestandteile, Tzell-abhängige Signale oder inflammatorische Mediatoren (Cella et al., 1996; Jonuleit et
al., 1997), die über verschiedene Rezeptoren erkannt werden. Während unreife DCs auf die
Antigenaufnahme und -präsentation spezialisiert sind (Banchereau et al, 2000; Cella et al.,
1997), haben erst vollaktivierte DCs die einzigartige Fähigkeit eine spezifische TImmunantwort zu initiieren (Shortman and Heath, 2001). Zusammenfassend kann man
festhalten, dass Stimulation und Aktivierung dendritischer Zellen immer auch mit einem
Differenzierungsprozess einhergehen (Satthaporn and Eremin, 2001), wobei das Stadium
der Differenzierung ihre weitere Funktion determiniert.
Sowohl reife als auch unreife DCs bilden stabile Populationen, die sich nicht mehr teilen.
1.1.5 Heterogenität der Subpopulationen
Dendritische Zellen stellen keine homogene Population dar, sondern unterscheiden sich
hinsichtlich ihres Ursprungs sowie den Stadien der Differenzierung und besitzen
unterschiedliche spezifische Funktionen und migratorische Profile. Im Maus-Modell
werden Subtypen dendritischer Zellen z.B. anhand der Oberflächenmarker oder nach dem
6
Kriterium Phänotyp und Organspezifität (Shortman and Liu, 2002) fest gemacht. Auch
humane dendritische Zellen umfassen Subpopulationen mit teilweise fließenden
Übergängen. Die verschiedenen Subpopulationen erfüllen je nach Lokalisation und
Differenzierungsgrad
unterschiedliche
Aufgaben.
Ihre
heterogen
exprimierten
Oberflächenmarker zeigen dabei vielmehr den Aktivitätsstatus der Zelle an, als die
Zuordnung zu bestimmten Untergruppen (Hart, 1997). Dies ist der Grund, warum noch
heute erhebliche Schwierigkeiten bezüglich der genauen Definierung einer dendritischen
Zelle bestehen und eine präzisere Abgrenzung der einzelnen Differenzierungsstufen und
Entwicklungswege voneinander nicht möglich ist.
1.1.6 Dendritische Zellen und das Monozyten/Makrophagen-System
Ein weiteres Charakteristikum ist die enge Verwandtschaft der dendritischen Zellen zu den
Monozyten / Makrophagen. Neben der Tatsache, dass sie sich aus einer gemeinsamen
Prekursorzelle entwickeln können, sind sie unter bestimmten Bedingungen in der Lage
wechselseitig zu interkonvertieren: Monozyten polarisieren in Abhängigkeit von externen
Zytokinstimuli entweder zu DCs oder zu Makrophagen (Kumar and Jack, 2006). Es konnte
gezeigt werden, dass Monozyten sich durch zwei Schritte, Differenzierung und
Aktivierung, in fertig ausgereifte DCs umwandeln, wohingegen unreife DCs sich bei
fehlendem Zytokineinfluss wieder in Makrophagen zurückverwandeln können (Palucka et
al., 1998).
In vitro können unreife dendritische Zellen aus nicht-proliferierenden CD14+-Monozyten
des peripheren Blutes durch die Zugabe von Zytokinen wie Interleukin-4 (IL-4) und GMCSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating-factor) generiert werden (Chapuis et al,
1997). Diese sind phänotypisch dadurch charakterisiert, dass sie den Monozytenmarker
CD14 auf ihrer Oberfläche nicht mehr exprimieren, dafür aber das für dendritische Zellen
typische CD1a. Unter dem Einfluss von Stimuli wie LPS oder TNF-α verändern sich
sowohl Phänotyp als auch funktionelle Eigenschaften der Zelle (Banchereau et al., 2000;
Sallusto and Lanzavecchia, 1994) hingehend zur völlig funktionsfähigen, reifen
dendritischen Zelle, die alle Eigenschaften zur Induktion einer effizienten adaptiven TZell-Immunantwort aufweist, sich jedoch nur im unreifen Zustand in Monozyten zurück
verwandeln kann. Somit können DCs und Makrophagen als zwei Pole eines gemeinsamen
regulatorischen Systems angesehen werden.
7
1.2 Reifung dendritischer Zellen unter Stimuli
Der Reifungsprozess dendritischer Zellen – ein Schlüsselereignis in der Lebensspanne
dieser Zellen – ist ein kontinuierlicher Vorgang, in dem aus einer Antigen-aufnehmenden
eine Antigen-präsentierende Zelle wird, mit der Fähigkeit zur Induktion adaptiver
Immunantworten. Er beginnt in der Peripherie durch Kontakt mit Antigenen und
inflammatorischen Zytokinen und wird während der Interaktion mit TH-Zellen
komplettiert. Damit einher gehen phänotypische und funktionelle Veränderungen (siehe
Abschnitt 1.1.2). Festhalten lässt sich, dass die „Reifung“ dendritischer Zellen von der
„Aktivierung“ nur schwerlich getrennt betrachtet werden kann.
Verschiedene Stimuli wirken auf DCs während ihrer Wachstums- und Ausreifungsphase.
So kontrollieren verschiedene Zytokine neben der Hämatopoese auch ihre Differenzierung.
Neben TNF-α sind IL-4 und GM-CSF klassischerweise zu nennen, die auch in vitro zur
Herstellung von DCs genutzt werden. GM-CSF beeinflusst generell die Reifung und
Proliferation myeloischer Vorläufer wie Granulozyten und Monozyten positiv (Caux et al.,
1992; Lardon et al., 1997). IL-4 ist essentiell für die Entwicklung humaner Monozyten zu
dendritischen Zellen, zugleich inhibiert es die Makrophagen-Differenzierung (Romani et
al., 1994). Andere Stimuli können die Reifung dendritischer Zellen unterbinden: IL-10
zum Beispiel blockiert den Reifungsprozess und IFN-γ moduliert ihn dahingehend, dass
Monozyten zu Makrophagen anstatt zu DCs werden (Delneste et al., 2003).
Neben der Antigen-Aufnahme gibt es weitere wichtige Reifungsstimuli, die über
spezifische Rezeptoren eine endgültige Ausreifung bewirken: bakterielle Bestandteile wie
Lipopolysaccharide (LPS) über Toll-like-Rezeptoren, proinflammatorische Zytokine über
Zytokinrezeptoren oder über die TNF-Rezeptorfamilie, der CD40Ligand auf T-Zellen über
den CD40-Rezeptor (Guermonprez et al., 2002).
Erkennen dendritische Zellen Pathogene über ihre Oberflächenrezeptoren, führt dies bei
unreifen DCs zur Differenzierung, bei reifen DCs zur Aktivierung. Dabei bestimmt die Art
des Stimulus das Programm der weiteren Differenzierung. So existieren neben den Tolllike Rezeptoren auch TLR-unabhängige Wege der Reifungstriggerung z.B. über Natürliche
Killer-Zellen oder Interaktion mit T-Lymphozyten (Münz et al., 2005). Ebenso fördert die
Stimulierung von Rezeptoren für den Fc-Teil von Immunglobulinen die Reifung und
Antigen-Prozessierung (Regnault et al., 1999).
Bisher wurden verschiedene Gruppen von Transkriptionsfaktoren entdeckt, die am
Reifungsprozess von DCs beteiligt sind und deren Signalwege durch inflammatorische
Mediatoren moduliert werden können: das NFĸB (nuclear factor) wird z.B. durch TLR8
Signale wie das LPS aktiviert (Rescigno et al., 1998). Die Signalvermittlung läuft u. a.
über die MAP-Kinasen-Kaskade. Weitere Transkriptionsfaktoren, die eine besondere
Bedeutung für die Entwicklung dendritischer Zellen haben, sind die „STATs“ (signal
transducers and activators of transcription), die extrazelluläre Signale zum Zellkern über
den Jak-STAT-Signalweg übermitteln. Dieser wiederum unterliegt einer FeedbackRegulation durch Supressoren der Zytokinsignalgebung, den SOCS-Proteinen (Suppressors
of cytokine signaling) (Jackson et al., 2004). Es sind noch nicht alle Signalkaskaden und
Transkriptionsfaktoren vollständig ermittelt, die an der Reifung dendritischer Zellen
beteiligt sind, jedoch weiß man, dass überlappende Signalwege synergistisch bezüglich der
Induktion von Genen wirken (Richards et al., 2002).
1.3 Die Toll-like Rezeptoren
Ein funktionierendes Überwachungssystem zeichnet sich durch die Fähigkeit aus, eine
Vielzahl von Gefahrensignalen schnell und spezifisch zu erkennen. Zu diesem Zweck
tragen dendritische Zellen ein komplexes Muster an Rezeptoren auf ihrer Oberfläche
(Pezzutto et al., 2006). Dazu zählen u.a. die Toll-like Rezeptoren (TLRs), eine der ältesten
Mechanismen der Wirtsabwehr in Insekten, Pflanzen und Säugetieren. Von den bekannten
Rezeptorfamilien zur Pathogenerkennung (PRRs) sind sie bislang am besten charakterisiert
(Rock et al., 1998); 13 verschiedene Familienmitglieder wurden bereits bei Säugetieren
gefunden. Wie der Name andeutet, weisen sie eine große Homologie zum Toll-Protein der
Fruchtfliege Drosophila melanogaster auf, welches selbst im niederen Pflanzen- und
Tierreich eine wichtige Funktion bei der Immunantwort inne hat (Medzhitov et al., 1997).
Toll-like Rezeptoren stellen ein integrales Typ I Transmembranprotein dar. Sie bestehen
aus einer extrazellulären Leucin-reichen Domäne zur Ligandenbindung und einer
intrazellulären
TIR-Domäne
(Toll-/IL-1
Rezeptor)
zur
zytoplasmatischen
Signalweiterleitung – so genannt wegen ihrer Sequenzhomologie zum Interleukin-1
Rezeptor (Bowie and O’Neill, 2000). Ihre jeweilige Lokalisation hängt von der Molekülstruktur ihrer Liganden ab. TLR-1, -2, -4, -5, -6, -10 und -12 erkennen extrazelluläre
Bestandteile wie Lipopeptide, Lipopolysaccharide und Flagellin und sind daher auf der
Zelloberfläche lokalisiert. TLR-3, -7, -8, -9 und 11 hingegen finden sich aufgrund ihrer
Spezifität für RNA und DNA in endosomalen Kompartimenten (Kawai and Akira, 2006).
9
Jüngste Ergebnisse zeigen, dass Toll-like Rezeptoren mikrobielle Bestandteile von
Bakterien über Protozoen bis hin zu Viren und Pilzen detektieren (Uematsu and Akira,
2008). Die Ligandenbindung erfolgt sehr spezifisch, z.B. erkennt TLR-3 vorwiegend
doppelsträngige RNA und ist damit bei viralen Infektionen involviert. Hingegen wird bei
bakteriellen Erkrankungen frei werdendes LPS nur von TLR-2 und -4 erkannt. Die Tolllike Rezeptoren unterscheiden sich stark in ihrer zellulären Verteilung – so zeigen die
Subpopulationen dendritischer Zellen jeweils unterschiedliche Expressionsmuster der
TLRs: monozytäre DCs exprimieren kein TLR-9, das jedoch auf plasmazytoiden DCs zu
finden ist (Kadowaki et al., 2001). Der ursprünglich in Drosophila gefundene „Toll
Rezeptor“ (heute TLR-4 genannt) induziert die Expression von Genen, die bei
Inflammationsprozessen beteiligt sind und ist essentiell für die LPS-Detektion (Uematsu
and Akira, 2008). TLR-4 wird auf allen Antigen-präsentierenden Zellen exprimiert.
Allen Toll-like Rezeptoren gemeinsam ist die Vernetzung von Ereignissen an der
Zelloberfläche
mit
nukleären
Mechanismen
der
Signaltransduktion.
Nach
Pathogenerkennung wird eine Kaskade über Adaptermoleküle initiiert, die zur Aktivierung
von
Transkriptionsfaktoren
wie
NF-κB
führt
und
somit
zur
Synthese
von
Effektorproteinen. Durch die nun produzierten proinflammatorischen Zytokine wie TNF-α
oder IL-6 resultiert eine effektive Bekämpfung der Infektion (Janeway and Medzhitov,
2002). Die Toll-like Rezeptor Signaltransduktion und -beteiligung muss gut kontrolliert
werden, da eine übermäßige Aktivierung zur Pathogenese vieler Erkrankungen beiträgt
(Wang et al., 2009).
Die Funktion der Toll-like Rezeptoren scheint sehr reguliert und vielschichtig zu sein: so
konnte gezeigt werden, dass auch Zellen, die nicht zum Immunsystem gehören, TLRs
exprimieren (z.B. Mempel et al., 2003). Vor kurzem wurden antagonistische TLRLiganden beschrieben (Macagno et al., 2006) und zudem scheinen sie zur Inhibierung der
Immunantwort über SOCS-Proteine fähig zu sein. Welche genauen, weiteren Moleküle zur
Ligandenerkennung nötig sowie an der Signaltransduktion beteiligt sind, konnte bislang
noch nicht gänzlich in allen Details geklärt werden. Aufgrund des spezifischen
Expressionsmusters der Toll-like Rezeptoren auf dendritischen Zellen liegt jedoch der
Gedanke nahe, diese Signalwege für therapeutische Zwecke gezielt durch Moleküle zu
modulieren (Steinman and Banchereau, 2007). Da diese Rezeptoren eine extrem wichtige
Rolle bei der Erkennung mikrobieller Strukturen spielen, könnte ihre Regulierung
maßgeblich die Antwort auf Pathogene beeinflussen.
10
1.4 LPS-Erkennung durch TLR-4
Das Glykoprotein LPS (Lipopolysaccharid) wird als Hauptbestandteil der Zellwand
gramnegativer Bakterien bei bakteriellen Infektionen freigesetzt. Das stark immunogene
und thermostabile Endotoxin besteht von außen nach innen aus dem O-Antigen, dem CorePolysaccharid und dem toxisch wirkenden Lipid A, das als hydrophober Membrananker
dient und für die biologische Aktivität des LPS verantwortlich ist (Schletter et al., 1995).
Im Serum ist LPS an LBP (LPS-Bindeprotein) gebunden. Wie bereits erwähnt, erkennt
TLR4 den Lipid A-Anteil von LPS. Eine komplexe Formation aus TLR4, MD2, und CD14
ist dafür notwendig (Triantafilou and Triantafilou et al., 2002), wie sie u.a. auf
Makrophagen und dendritischen Zellen zu finden ist. Zur Anlagerung an CD14, einem
Membranprotein, konvertiert LBP das Oligomer LPS in Monomere. CD14 ist
verantwortlich für die Übertragung des LPS an den TLR4/MD2 Komplex. Das
Glykoprotein MD2 bildet zusammen mit je zwei TLR-4-Einheiten den funktionellen
Transduktionskomplex für das LPS-Signal. Zwar ist auch über die Mitbeteiligung von
TLR2 an der LPS-Erkennung von einigen nicht-enterobakteriellen Erregern berichtet
worden, hierbei handelt es sich allerdings um atypisches LPS, anders als bei
gramnegativen Erregern (Netea et al 2002).
Durch die Bindung des extrazellulären LPS an den TLR-4/MD2-Komplex wird eine
intrazelluläre Signalkaskade initiiert (veranschaulicht durch Abbildung 1), die letztendlich
zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappa B führt, dem Schlüsselmediator für
die Transkription von Zielgenen.
11
Abb. 1: Die LPS-induzierte Signaltransduktion von TLR-4 läuft über einen MyD88-abhängigen
und über einen TRIF-abhängigen Signalweg (nach Takeda and Akira, 2004).
Dabei wird TLR4-vermittelt ein MyD88 (Myeloid Differentiation Primary Response Gene
88) und ein TRIF (TIR Domain-Containing Adaptor Inducing Interferon) -abhängiger
Signalweg induziert (Schletter et al., 1995). Am Ende dieser Kette steht die Produktion von
inflammatorischen Effektorproteinen wie Zytokine.
Die komplexen Regulationsmechanismen bei der TLR-Signalgebung sind Gegenstand
vieler
Untersuchungen.
So
konnten
Mitglieder
der
IRF-Familie
(Interferon-
Regulationsfaktor) als Negativregulator der Toll-like Signalgebung identifiziert werden
(Negishi et al., 2005). LPS-Signalgebung induziert auch solche Transkriptionsfaktoren, die
im Rahmen einer Feedback-Schleife inhibitorisch auf Inflammationsprozesse wirken und
somit überschießende Immunreaktionen verhindern (Gilchrist et al., 2008). Aber nicht nur
Transkriptionsfaktoren in der Signalkaskade, auch die Oberflächenexpression von TLR-4
kann durch Zytokine moduliert werden (Mita et al., 2002).
12
1.5 Hemmende Eigenschaften von Lipopolysacchariden
1945 identifizierte und charakterisierte Otto Westphal mit Kollegen erstmals bakterielle
Lipopolysaccharide und beschrieb seine Rolle als pyrogenes Toxin bei Infektionen. LPS
stellt sowohl in vivo als auch in vitro ein potentes Aktivierungs- und Reifungsagenz für
dendritische Zellen dar. Es stimuliert sie über den Toll-like Rezeptor 4, dies führt zur
Aktivierung verschiedener Kinasen (wie ERK und MAPKs) und dem Transkriptionsfaktor
NFĸB (Rescigno et al., 1998; Ardeshna et al., 2000). Ein halbes Jahrhundert lang gab es
keinen Grund, diese Rolle in Frage zu stellen.
In neueren Arbeiten gibt es allerdings Hinweise dafür, dass bakterielle Lipopolysaccharide
auch gegenteilige Effekte auf die Entwicklung von DCs haben können. 1996 berichten De
Smedt et al. zwar von der Ausreifung dendritischer Zellen als Antwort auf LPS, dennoch
fanden sie abweichende Effekte, die nicht in Übereinstimmung mit bisherigen Befunden
waren. So nahm die Zahl an DCs 48h nach LPS-Injektion unerwarteterweise ab; dies
korrelierte mit eingeschränkter Zellfunktion naive T-Lymphozyten in vivo zu aktivieren.
Sie erklärten sich die schädigende Wirkungskomponente des LPS mit der Endotoxinvermittelten Depression von Immunfunktionen, die oft mit einem septischen Schock
assoziiert ist. Ihre Hypothese, dass eine negative Feedback-Hemmung des LPS bezüglich
DCs zum Schutz vor überschießender Gewebszerstörung wichtig ist (De Smedt et al.,
1996), dient noch heute als gültiges Erklärungsmodell.
Doch auch andere Autoren beschreiben eine alternative Funktion des LPS hinsichtlich der
Differenzierung von dendritischen Zellen. Xie et al. (2003) gingen ebenfalls jenen LPSAuswirkungen nach, die im Gegensatz zu den bisher allgemein anerkannten positiven
Effekten auf DCs standen. Die Anwesenheit von LPS in der Kultur retardierte die
Generierung von unreifen dendritischen Zellen aus Monozyten und beeinträchtigte nicht
nur die Morphologie und Ausbeute der kultivierten Zellen, sondern inhibierte auch die
Heraufregulation der Oberflächenexpression von typischen Populationsmarkern sowie
kostimulatorischen Molekülen; die Antigenpräsentationskapazität der vorbehandelten
Zellen war reduziert. Die Veränderungen ließen sich auch auf molekularer Ebene
wiederfinden. Wegweisend war dabei die Feststellung, dass während der LPS-induzierten
Reifung ein anderer Signalweg aktiv ist, als bei der Hemmung. Insgesamt identifizierten
sie also das Endotoxin als einen möglichen Inhibitor in der Differenzierung monozytärer
DCs (Xie et al., 2003).
Heute vermutet man, dass SOCS-Proteine die LPS-Signalgebung inhibitorisch modulieren
(Hu et al., 2009). Diese Supressoren der Zytokinsignalgebung haben eine entscheidende
Rolle bei der Regulation TLR-vermittelter Wege in Makrophagen und DCs.
13
Die Arbeitsgruppe Bartz und Dalpke untersuchte die Auswirkungen der TLR-Stimulation
durch Antagonisten wie das LPS während der GM-CSF vermittelten in vitro Generation
von unreifen DCs aus Vorläufern und zeigte, dass TLR-Triggerung während des
Reifungsprozesses zu abweichender phänotypischer und funktioneller Differenzierung von
CD14+ Monozyten in CD1a+ dendritische Zellen führt. Diese inhibitorischen Effekte waren
unabhängig von löslichen Faktoren. Als zugrunde liegenden Mechanismus beschreiben
auch sie die Induktion von Proteinen der SOCS-Familie durch TLR-Stimulierung in
Vorläuferzellen. Insgesamt zeigen ihre Resultate, dass TLR-Aktivierung während der
Generierungsperiode dendritischer Zellen mit ihrer Differenzierung interferiert und dass
diese Effekte v.a. durch SOCS-1 getragen sind. Ähnliche Ergebnisse fanden sie bei
murinen myeloiden DCs aus Knochenmarkszellen (Bartz et al., 2006).
Doch ist bisher nicht ausreichend untersucht, inwieweit sich diese Aussagen auf nichtmonozytäre, stammzellgenerierte DCs übertragen lassen.
1.6 Fragestellung
In der vorliegenden Arbeit soll dieser Ansatz aufgegriffen werden: Zum einen wird
untersucht, unter welchen Kultivierungsbedingungen die Ergebnisse der oben genannten
Forschergruppe bei Monozyten-generierten dendritischen Zellen zu finden sind. Zum
anderen wird geprüft, ob die Aussagen bezüglich der hemmenden Wirkung des LPS‘ auf
die Differenzierung auch für DCs aus Nabelschnurblut-Stammzellen als Stellvertreter einer
anderen Subpopulation gelten können.
Dafür war es zunächst nötig, das Zellmodell von Bartz nachzustellen und die Bedingungen
seiner Gültigkeit auszutesten, um dann das Untersuchungsschema auf die von uns
generierten DCs einer anderen Ausgangspopulation zu übertragen.
Folgende Aspekte sollen genauer betrachtet werden:
-
Ist der Inhibitionseffekt spezifisch für Monozyten-generierte dendritische Zellen
oder reproduzierbar für Abkömmlinge aus Nabelschnurblut-Stammzellen?
-
Wie wird die Expression von Reifungsmarkern beeinflusst, als Hinweis einer
Modulation der Subpopulationsverteilung Monozyten: DCs?
-
Inwieweit nehmen Faktoren wie die LPS-Qualität und -dosis einen Einfluss?
-
Besteht ein Zusammenhang zu anderen Kultivierungsfaktoren wie der Zelldichte?
14
2.
Material und Methoden
2.1
Probanden
Das Nabelschnurblut wurde von gesunden Neugeborenen des Augusta-Krankenhauses
Bochum und des St. Elisabeth-Hospitals Bochum nach Einverständniserklärung der Eltern
gewonnen.
Die Buffy Coats zur Isolierung monozytärer Zellen stammten von gesunden Spendern der
Blutbank Dortmund, die der weiteren Verwendung ihres Blutes zugestimmt hatten
(Klinikum Dortmund, Institut für Transfusionsmedizin).
2.2
Gewinnung mononukleärer Zellen aus Nabelschnurblut
Das Nabelschnurblut wurde nach Abnabelung aus der Vena umbilicalis gewonnen und in
50ml-Reagenzröhrchen gegeben. Diese enthielten bereits 7ml einer Pufferlösung (siehe
unten) mit Zusätzen zur Hemmung der Gerinnung sowie des Keimwachstums, und damit
zur Ermöglichung einer mittelfristigen Lagerung bei Raumtemperatur.
Die Pufferlösung wurde hergestellt aus 300ml Citrat-Phosphat-Dextroselösung, 1ml
Hydroxyethyl-piperacinethan-sulfonsäure (Hepes), 1ml Kanamycin, und 1ml Partricin.
Es wurde nur Material berücksichtigt, dass weniger als 24h alt war und welches keine
sichtbaren Koagel aufwies. Das Nabelschnurblut wurde ungekühlt und unter sterilen
Bedingungen aufbereitet.
Je 7-8 ml Blut wurden mit gekühltem PBS-CPD (= PBS Dulbecco-Lösung mit 0,6% CPDZusatz) auf 35 ml (Verhältnis 1:4) verdünnt und dann mit 15 ml Ficoll-IsopaqueSeparationslösung (spezif. Gewicht: 1,077) langsam unterschichtet. Diese Mischung wurde
30 Min bei 10°C mit 400g ohne Abbremsung zentrifugiert.
Die Isolierung von mononukleären Zellen aus dem Nabelschnurblut erfolgte somit mittels
Dichtegradientenzentrifugation, um die dichteren Erythrozyten und die polymorphkernigen
Leukozyten (= Granulozyten) von den Monozyten und Lymphozyten abzutrennen
(Verfahren nach A. Boyum, 1968). Dabei trennt sich das Plasma vom Puffer und dem
dichteren Ficoll (synthetisches Polymer aus Saccharose) unter Bildung einer Grenzschicht,
die die mononukleären Zellen enthält (siehe Abb. 2).
Diese Interphase wurde mit einer Pipettierhilfe vorsichtig abgesaugt, in einem Röhrchen
mit PBS-CPD auf 50ml aufgefüllt und bei 300g 10 Min zentrifugiert (Raumtemperatur).
15
Abb. 2: Isolierung von mononukleären Zellen mittels Ficoll-Paque® Dichtegradientenzentrifugation
und Darstellung der Interphase; die Thrombozyten befinden sich in der gleichen Schicht wie die
Erythrozyten. Verfahren nach einer von A. Boyum 1968 beschriebenen Methode.
Nach diesem ersten Waschen wurde der Überstand verworfen, das sich am Boden
befindende Pellet resuspendiert und alle Zellen abermals mit gekühltem Puffer gemischt.
Um die Thrombozyten zu eliminieren, wurde bei 200g und Raumtemperatur 15 Min lang
zentrifugiert.
Das gewonnene Zellpellet wurde nun gut im Puffer resuspendiert, anschließend über einer
angefeuchteten
Membran
(Nylon-Zellsieb
40
µm)
von
Zelltrümmern,
Nabelschnurbestandteilen und externen Partikeln getrennt. Nach Auffüllen mit Puffer auf
ein Volumen von 15-25 ml (je nach Ausgangsmenge) wurde eine repräsentative Probe von
10 µl entnommen und der Rest erneut gewaschen (300g, 10 Min). Die Zellprobe wurde
1:10 in Türkscher Lösung verdünnt und nach diesem Anfärben in einer NeubauerZählkammer unter einem Durchlichtmikroskop ausgezählt.
In den nachfolgenden Schritten wurde ebenfalls darauf geachtet, dass sich die Pufferlösung
im gekühlten Zustand befindet. Alle Arbeitsschritte fanden so steril wie möglich unter
einer Werkbank mit Abzugshaube statt.
16
2.3
Isolierung der CD34+-Stammzellen
Aus den mononukleären Zellen des Nabelschnurblutes sollten im nächsten Schritt gezielt
die CD34+ Stammzellen zur Anzucht dendritischer Zellen separiert werden. Dazu wurden
nach dem Zentrifugieren und Resuspendieren des Zellpellets pro 1 x 108 Zellen zuerst 100
µl gekühlter Puffer (PBS-CPD) zugefügt, dann in der Reihenfolge je 100 µl Fc - Rezeptor
Blockingreagenz
und
AntiCD34-Microbeads
(magnetisch
markierte
monoklonale
Antikörper) sowie PBS-Puffer, sodass sich insgesamt ein Volumen von 500 µl Flüssigkeit
pro 1 x 108 Zellen ergab (dabei wird das Pellet mit 200 µl berücksichtigt). Das Blockingreagenz wurde zuerst dazu gegeben, damit die Microbeads-beladenen Antikörper nicht
unspezifisch am Fc - Rezeptor vorhandener Makrophagen binden.
Nach 30minütiger Inkubation im Kühlschrank bei 4°C erfolgte die Zellseparation manuell
per MACS-System (magnet-associated cell sorting) nach Herstellerangaben mit MiniMACS Säulen, hierbei handelt es sich um eine einfach-positive Selektion (Miltenyi et al.
1990).
Dazu wurden erst die nichtgebundenen Antikörper mit 5-10fachem Überschuss an PBSCPD von den Zellen gewaschen (10 Min, 300g). Währenddessen wurden die gekühlten
Mini-MACS-Säulen mit 500 µl Puffer vorgespült. Nach dem Dekantieren des
zentrifugierten Überstandes wurden die resuspendierten Zellen in 1ml
Puffer
aufgenommen, über die magnetisierte Sortiersäule pipettiert und 2x mit 500 µl Puffer
nachgespült. Die Zellsuspension durchlief dabei die magnetischen Säulen und tropfte in ein
Auffangröhrchen: es ergab sich so die CD34-depletierte Fraktion.
Das Prinzip des Separators bestand darin, dass beim Durchlaufen des magnetischen Feldes
die mit den Microbeads markierten Zellen in den Säulen mit Stahlwolle hängen blieben
(CD34+- Fraktion); diese konnten nach Entfernen des Feldes mit Medium eluiert werden
(siehe Abb. 3) Dazu wurden die Antikörper-markierten Stammzellen mit einem Stempel
und 1 ml Puffer durch die Säule gepresst.
Die Separation der magnetisch markierten CD34+-Zielzellen von den CD34- -Zellen wurde
nochmals mit einer zweiten, vorgespülten MiniMACS-Säule wiederholt, um eine
größtmögliche Reinheit zu erzielen und keine falsch-positiven Zellen zu erhalten. Diesmal
wurden die CD34+ -Zielzellen jedoch mit 1 ml Kulturmedium (siehe unten) aus der Säule
eluiert, darauf folgte die Zellzahlermittlung in einer Fuchs-Rosental-Kammer.
17
Abb. 3: Das Prinzip der magnetisch aktivierten ZelIsortierung (MC = mononukleäre Zellen, N=
magnetischer Nordpol, S= magnetischer Südpol) (entnommen aus: R. Tripmacher, 2005)
Die CD34- -Fraktion wurde in einer Neubauer-Kammer ausgezählt, nach einer weiteren
Zentrifugation (10 Min bei 300g) mit kaltem Einfriermedium (1 ml pro 2,0 x 107 Zellen)
resuspendiert und in vorgekühlten Kryotubes bei -80°C zwischengefroren, um
abschließend in Flüssigstickstoff endgelagert zu werden. Das Einfriermedium bestand aus
45% FCS (fetales Kälberserum), 44% RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute –
Medium), 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) und 1% Kanamycin.
Fetales Kälberserum enthält eine Mischung aus verschiedenen wachstumsfördernden
Substanzen wie Polypeptide, Lipide und Spurenelemente, die für die Zellproliferation
notwendig sind. Das Antibiotikum Kanamycin soll in die Kulturen gelangte Bakterien
abtöten.
2.4
Anzucht dendritischer Zellen bis Tag 7 (gemischte Population)
Die erhaltenen CD34+ -Stammzellen wurden in so viel Kulturmedium aufgenommen, dass
sich eine Zellkonzentration von mindestens 1,5 x 105 Zellen pro ml einstellt. Das
Kulturmedium bestand aus einer keimhemmenden und nährstoffreichen Lösung: 500 ml
RPMI 1640 (Roosevelt Park Memorial Institute – Medium), 57 ml FCS (fötales
18
Kälberserum) und 10 ml Kanamycin wurden zusammen vermischt mit je 5,75 ml LGlutamin, Na+-Pyruvat und einer Mischung aus nicht-essentiellen Aminosäuren als
Nährstoffe für die Proteinsynthese und den Energiestoffwechsel.
Es erfolgte nun die Zugabe der Stimuli zur Ausdifferenzierung von dendritischen Zellen:
100 ng/ml GM-CSF, 100 ng/ml Stammzellfaktor und 2,5 ng/ml TNF-α (1:100
vorverdünnt).
Die Zellsuspension wurde mit 1ml Inhalt pro Well in eine 24-Lochplatte (Multiwellplatte
mit Flachboden) pipettiert und 7 Tage lang im Brutschrank bei 37°C begast mit 5% CO2
inkubiert. Dabei wurden die Zellen regelmäßig geteilt und bei Bedarf frisches
Kulturmedium zugesetzt, um optimale Wachstumsbedingungen zu bieten. Wells mit
Pilzbefall wurden verworfen. Ein Wasserreservoir im CO2-Schrank sorgte hierbei für eine
hohe relative Luftfeuchte, das CO2 für einen optimalen pH-Wert.
Am 7. Tag wurden die Zellen auf Eis geerntet, gewaschen (10 Min, 300g), in einer
Neubauer-Zählkammer gezählt, erneut gewaschen und wie oben beschrieben in Kryotubes
mit Einfriermedium (1ml pro 2,0 x 107 Zellen) über Nacht tiefgefroren bei -80°C. Am
nächsten Tag wurden sie zur längerfristigen Aufbewahrung in flüssigem Stickstoff
gelagert, um eine bessere Verfügbarkeit für spätere Verwendungen zu gewährleisten.
2.5
Anzucht ausgewählter Subpopulationen
Die Zellansätze von Tag 7 wurden nach dem Auftauen je nach gewünschter Subpopulation
abermals stimuliert. Für die Anzucht von heterogenen dendritischen Zellen erfolgte die
Restimulation wie oben beschrieben mit GM-CSF und TNF-α. Für die Anzucht von mit
IL-4 generierten dendritischen Zellen wurden GM-CSF, TNF-α und IL-4 dazu gegeben.
Die restimulierten Ansätze wurden abermals im Wärmeschrank kultiviert – die Dauer
variierte je nach Versuch. Im Folgenden werden die weiteren Stimuli und
Verarbeitungsschritte der Untergruppen im Detail aufgeführt. Parallel zu den gezüchteten
dendritischen Zellen aus Nabelschnurblut wurden auch monozytäre dendritische Zellen
separiert, um das Zellmodell von Bartz nachzustellen.
Die unterschiedlichen Populationen wurden später zur funktionellen Beschreibung ihrer
Oberflächenantigene im Durchflusszytometer erfasst.
19
2.6
Herstellung von monozytären dendritischen Zellen
Zur Gewinnung von mononukleären Zellen wurden aus Vollblut aufbereitete Buffy Coats
verwendet (nach Zentrifugation entstehende Trennschicht ohne Erythrozyten) und
nachfolgend die Thrombozyten depletiert (wie bereits beschrieben). Mittels Dichtegradientenzentrifugation wurden die CD14+- von den CD14--Zellen per MicrobeadMarkierung getrennt. Dies erfolgte nach Herstellerangaben der Firma Miltenyi per AutoMACS-Seperator. Die so erhaltenen Monozyten aus peripherem Blut wurden je nach
Verwendung in verschiedenen Ansätzen weiter kultiviert bis Tag 6 (im Folgenden jeweils
aufgeführt). Falls nicht anders erwähnt, wurden 10 ng/ml (500 IU) GM-CSF und 500
IU/ml IL-4 als Standard-Stimuli an Tag 0 verwendet, um monozytäre dendritische Zellen
zu erhalten, sowie LPS in 2 verschiedenen Präparaten mit jeweils unterschiedlichen
Konzentrationen (wie unten aufgeführt). Es folgt die Analyse der Zellen hinsichtlich der
Oberflächenexpression.
2.7 Standard-LPS und hochgereinigtes LPS
Um den Einfluss der LPS-Qualität zu untersuchen, wurden zwei verschiedene LPSPräparate mit unterschiedlicher Reinheit verwendet (Sigma-Aldrich). Im Folgenden
werden die Begriffe „Standard-LPS“ und „hochgereinigtes“ LPS verwendet.
E. coli O127:B8
Standard-LPS:
per Phenol-Extraktion gereinigt, <3% Proteine + 60% RNA
Hochgereinigtes LPS:
per Gelfiltrationschromatografie gereinigt, Proteine <1%
2.7.1 Stimulation der monozytären DCs mit LPS
Aus Spenderblut wurden die mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) isoliert
wie bereits beschrieben per Ficoll–Dichtegradientenzentrifugation, mit antiCD14Microbeads markiert und im magnetischen Zellsortierer separiert (s. oben) mit einer
Reinheit von 95%. Nur die CD14+- Fraktion wurde in weiteren Versuchen zur Herstellung
von monozytären DCs verwendet.
20
Es wurden 5 Kulturen à 2 x 106 Zellen /ml angesetzt und wie bisher IL-4 500 IU/ml sowie
GM-CSF 500 U/ml zugesetzt. Sodann erfolgte die Überführung in Gruppen nach
folgendem Schema:
1. ohne LPS
2. mit 30 ng/ml und
3. 10 µg/ml Standard-LPS
4. sowie mit 10 ng/ml bzw.
5. 30 ng/ml hoch aufgereinigtem LPS
Diese wurden weiter kultiviert bis Tag 6. Wenn nötig, erfolgte die Zugabe von
Kulturmedium (RPMI mit Zusätzen). An Tag 6 wurde durchflusszytometrisch die
Expression der Oberflächenmarker CD1a und CD14 zur Subgruppentypisierung gemessen.
2.7.2 Monozytäre DCs in verschiedenen Zelldichten
Das vorherige Experiment wurde im ersten Teil wiederholt, diesmal stand der Einfluss der
Zelldichte im Vordergrund.
Die isolierten Zellen wurden in 2 Gruppen mit verschieden hoher Zellzahl überführt:
a) 2 x 106 Zellen /ml sowie
b) 5 x 105 Zellen /ml.
Beide Ansätze wurden mit IL-4 500 IU/ml und GM-CSF 500 IU/ml als Zusätze versehen
und dann mit entweder 10 µg/ml Standard-LPS oder 30 ng/ml hoch aufgereinigtem LPS
stimuliert, eine Kokultur blieb LPS-frei. In jeder Gruppe wurde die CD1a, CD14 und die
CD86-Expression per Durchflusszytometrie gemessen.
2.8
Kulturen mit dendritischen Zellen
In der ersten Hälfte der durchgeführten Experimente wurde mit monozytären DCs
gearbeitet; es sollte nun der Frage nachgegangen werden, ob ähnliche LPS-Effekte sich
auch bei den aus den Nabelschnur-Stammzellen gewonnenen DCs finden lassen.
21
2.8.1 LPS-Effekt bei dendritischen Zellen ohne IL-4
Die eingefrorenen CD34+-DCs vom Tag 7 (siehe 2.3) wurden durch langsames
Aufpipettieren mit Puffer aufgetaut, 3x gewaschen und danach gezählt. Es wurden nun
GM-CSF und TNF-α (in der gewohnten Konzentration) zur Nachstimulation zugegeben
und 2 Zellkonzentrationen mit Kulturmedium eingestellt: 5 x 105 Zellen sowie 2 x 106 pro
ml. In beiden Gruppen wurden folgende Ansätze gefertigt:
1. ohne LPS
2. 10 µg/ml Standard-LPS
3. 30 ng/ml aufgereinigtes LPS
Es folgte die Messung der CD1a und CD14 Expression (in einer korrelierten 4-Felder
Darstellung) nach weiterer 7-tägiger Kultivierung. Falls erforderlich, wurde frisches
Kulturmedium zugegeben.
2.8.2 DCs mit IL-4 unter verschiedenen LPS-Konzentrationen
Dendritische Zellen, die zuvor an Tag 7 aufgetaut und neben GM-CSF und TNF-α auch
mit IL-4 nachstimuliert worden waren, wurden (wie bereits in 2.6.1) auf zwei
Zellkonzentrationen eingestellt: 5 x 105 und 2 x 106 Zellen pro ml. Zu je einem Ansatz
wurden dann abermals hinzugefügt:
1. kein LPS
2. 10 µg/ml Standard-LPS
3. 30 ng/ml aufgereinigtes LPS
Nach Kultivierung bis Tag 14 erfolgte die Ernte auf Eis sowie die durchflusszytometrische
Messung: CD1a, CD14, CD86 in Dot-plot-Darstellung und CD86 als mittlere
Fluoreszenzintensität im Histogramm angegeben.
2.9
Durchflusszytometrische Messung
2.9.1 Färbung der Oberflächenantigene
Die Fluoreszenzfarbstoffe für die Durchflusszytometrie waren an monoklonale Antikörper
gekoppelt, die sich spezifisch gegen die zu untersuchenden Oberflächenantigene richten.
Bei jeder Messung diente eine Probe der ungefärbten Kontrolle. Diese wurde mitgeführt,
22
um die Eigenfluoreszenz zu erfassen, welche als Nullwert festgelegt wird, alle weiteren
Messdaten wurden darauf bezogen.
Je nach zu bestimmendem Subpopulationsmarker wurde der entsprechende konjugierte
Antikörper den Zellen für die FACS-Analyse zugegeben (nach Herstellerhinweis) und 15
Min bei 4°C inkubiert. Es folgte die Auswaschung der nichtgebundenen Antikörper (mit
1000 µl PBS-Puffer) 10 Min lang bei 300g und die Übernahme in 250 µl frischen Puffer
für die Messung.
Der Farbstoff FITC (Fluorescein Isothiocyanat, grün) mit einem Emissionsmaximum bei
518 nm diente zur Detektion von CD1a, der Farbstoff PE (Phycoerythrin, orange) mit
einem Emissionsmaximum bei 575 nm zur Markierung von CD14 und CD86.
2.9.2 Datengewinnung und Auswertung
Die Quantifizierung der Oberflächenexpression verschiedener Marker auf zuvor
stimulierten Zellgruppen erfolgte anhand eines 15 mW FACScan-Durchflusszytometers
(Argonlaser,
Anregungswellenlänge:
488nm)
erfasst
als
mittlere
gemessene
Fluoreszenzintensität MFI, die die zuvor gefärbten Zellen emittieren (in Histogrammen =
Ein-Parameterdarstellung) oder in Prozent der exprimierenden Zellen (Dot-plots = ZweiParameterdarstellung). Dabei wird die interessierende Zellpopulation zuvor anhand ihrer
Streulichtsignale ausgewählt, dieses „Setzen von Fenstern“ wird auch als „Gating“
bezeichnet. Die Durchflusszytometrie erlaubt also die simultane Erfassung mehrerer
Zelleigenschaften an ausgewählten Zellen und ermöglicht so die Differenzierung in
Subpopulationen. In unseren Versuchen wurden jeweils zwischen 20.000 und 50.000
Zellereignisse gesammelt (angegeben als „gated events“).
Die Daten wurden in den „5-Parameter LIST-MODE“ aufgenommen, die Auswertung lief
über die Software „Cell Quest“. Anhand der Scattereigenschaften der Zellen wurde jeweils
die zu analysierende Region festgelegt. Dabei werden die intakten Zellen manuell
eingegrenzt als „Region R1“, kleine Partikel werden somit von der Messung
ausgeschlossen (s. Abb. 4). Je nach gewünschter Angabe können entweder 2 gemessene
Merkmale gegeneinander aufgetragen werden, dargestellt in einer Punktwolken-Matrix
(Abb. 5), oder die Fluoreszenz eines Merkmals der Zielzellen wird graphisch abgebildet (s.
Abb. 6).
23
Abb. 4: Anhand morphologischer Kriterien wurden die Zielzellen identifiziert. Analysefenster R1 =
„Region of interest 1“ dient zur Abgrenzung von Zelldebris. Es erfolgt die Quantifizierung von
Oberflächenmolekülen nach Markierung mit Farbstoffen.
Abb. 5: Dotplot mit Anfärbung von CD1a und CD14 auf den zuvor eingegrenzten Zellen. Die
CD14 bzw. CD1a exprimierenden Zellen können von den CD14-- bzw. CD1a--Zellen getrennt
werden; automatische Angabe der prozentualen Anteile in jedem Feld (z.B. rechter oberer
Quadrant: 1,4%).
24
Abb. 6: Darstellung der Fluoreszenzeigenschaften der Zielzellen im Histogramm. Die x-Achse
stellt die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) dar und wird als „Mean“ angegeben, die y-Achse
bildet die relative Zellhäufigkeit ab (hier im Beispiel sind mit CD86 PE gefärbte monozytäre DCs
aufgeführt in einer Konzentration von 2 x 106 ohne LPS-Einfluss).
Innerhalb der „Region of interest“ (R1), also der festgelegten Zellpopulation wird der
prozentuale Anteil jener Zellen bestimmt, die das betreffende Oberflächenantigen
exprimieren bzw. die MFI aller aufgelisteten Zellen als Mittelwert angegeben. Die
gemessenen Signale werden dabei verstärkt – die Fluoreszenz logarithmisch, die
Lichtstreuungseigenschaften linear (Raffael, 1987).
2.10 Statistische Auswertung
Die weitere statistische Auswertung und graphische Darstellung erfolgte mit dem
Programm „Graph Pad Prism“, in dem der Kruskal-Wallis-Test und nachgeschaltet der
Dunn‘s-Post-Test benutzt werden. Dabei handelt es sich um verteilungsfreie Tests. Der
Kruskal-Wallis-Test testet im Rahmen einer Rangvarianzanalyse, ob die Verteilungen aller
untersuchten Gruppen bezüglich eines Lokationsparameters identisch auf Populationsebene sind oder ob sich mindestens zwei der Gruppen hinsichtlich ihrer zentralen Tendenz
in den Subpopulationen unterscheiden (Eid et al., 2011). Es wird keine Normalverteilung
vorausgesetzt, allerdings werden die Verteilungen bis auf Verschiebung bzw. bis auf einen
Lokationsparameter als gleich angenommen (Kruskal and Wallis, 1952). Wird ein
Unterschied festgestellt, wird der Post-hoc-Test von Dunn’s nachgeschaltet, um zu
25
überprüfen, welche Gruppen bezüglich des Lokationsparameters signifikant voneinander
abweichen. Der Dunn’s-Post-Test testet auf diese Nullhypothese für individuelle
Paarvergleiche.
Für eine einfache Interpretation wurde auf eine α-Adjustierung verzichtet und ein
signifikantes Testergebnis bei α < 0,05 festgelegt. Zur graphischen Darstellung der
Ergebnisse (über Mittelwert und Standardabweichung) wurde zudem angenommen, dass
von einer unimodalen, annähernd symmetrischen Verteilung ausgegangen werden kann.
2.11 Herstellernachweis
Verwendetes Material und Geräte
Hersteller
AutoMACS
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
Arbeitsbank Heraeus Tamin Air
Heraeus Istr., Düsseldorf
Brutschrank (CO2-Inkubator)
Heraeus Istr., Düsseldorf
CD1a PE Antikörper
BD, Biosciences Pharmingen, Cat.: 555807
CD14 FITC Antikörper
Becton Dickinson, Cat.: 347493
CD40 FITC Antikörper
BD, Biosciences Pharmingen, Cat.: 555588
CD80 FITC Antikörper
BD, Biosciences Pharmingen, Cat.: 33514X
CD86 PE Antikörper
BD, Biosciences Pharmingen, Cat.: 555658
CD14 Microbeads
Miltenyi Biotec, Order no.: 130-050-201
CD34 MicroBead Kit human (mit Fc Rezeptor-Blocking Reagenz humanIgG)
Miltenyi Biotec, Order no.:130-046-702
Citrat-Phosphat-Dextrose Lösung (CPD)
SIGMA-Aldrich Chemie GmbH Steinheim
Cryo Tube Vials 1ml
Nunc AIS, Dänemark, Cat.no.: 363401
26
Dimethylsulfoxid (DMSO)
SIGMA-Aldrich, Ec-No.: 200-664-3
Durchflusszytometer FACScan®
Becton Dickinson, Heidelberg
Durchlichtmikroskop
Zeiss, Jena
Fetales Kälberserum (FCS)
Biochrom AG, Berlin, Cat.no.: S0115
Ficoll Seperating Solution
Biochrom AG, Berlin, Cat.no.: L6115
Gefriertruhe (-88°C)
Profiline, National Lab., Mölln
GM-CSF rHu
Promo Cell GmbH, Cat.no.: B-60480
von Promokine
GraphPad Prism Version 4, Software für GraphPad Software Incorporated, San
Windows
Diego, USA
HLA-DR PE Antikörper
BD, Biosciences Pharmingen, Cat.: 555812
Hepes-Puffer (1M)
Biochrom AG, Berlin, Cat.no.: L1613
Interleukin 4 (IL-4)
TEBU Frankfurt, Cat.: 200-04
Kanamycin 5mg/ml
Biochrom AG, Berlin, Cat.no.: A 2512
Kühlschrank
Liebherr GmbH, Ochsenhausen
L-Glutamin 200mM
Biochrom AG, Berlin, Cat.no.: K 0282
LPS (E. coli, Serotyp O127:B8)
Sigma-Aldrich Kat.Nr: L3129, L3137
MACS® Cell-Seperator
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
MACS Seperation Columns MS
Miltenyi Biotec, Order no.:130-042-201
Multiwell-24 Lochplatte mit Flachboden
Falcon, Becton Dickinson, Ref.:353047
Natrium-Pyruvat
Biochrom AG, Berlin, Cat.no.: L0473
Nicht-essentielle Aminosäuren
Biochrom AG, Berlin, Cat.no.: K0293
Partricin
Biochrom AG, Berlin, Cat.no.: A2812
PBS-Dulbecco
Biochrom AG, Berlin, Cat.no.: L1825
27
Pipettierhilfe Pipetus®
Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt
15ml-Röhrchen Falcon
Becton Dickinson, Ref.:352096
50ml-Röhrchen Falcon
Becton Dickinson, Ref.:352070
Stammzellfaktor rHu TEBU
PeproTech Inc., Frankfurt, Cat.: 300-07
TNF-α rHu
R&D Systems, Cat.no.: 210-TA
Türksche Lösung 93770, RA 15395
SIGMA-Aldrich Chemie GmbH Steinheim
VLE RPMI 1640 Flüssigmedium
Biochrom AG, Berlin, Cat.no.: F1415
Zellsieb = cell strainer 40µm
BD Falcon, Ref.:352340
Zentrifuge Varifuge K und
Megafuge 1.0 R
Heraeus Christ
Firma Heraeus, Düsseldorf
28
3 Ergebnisse
Die im Folgenden dargestellten Ergebnisse zeigen, wie dendritische Zellen auf LPSEinwirkung während der Entwicklung reagieren – gemessen anhand der Oberflächenexpression ihrer Reifungsmarker. In einem kleinen Versuchsteil wurde auch die
Expression von CD86 nach Stimulation mit und ohne LPS untersucht, zur Analyse der
Regulation kostimulatorischer Moleküle. Es wurden dendritische Zellen monozytären
Ursprungs sowie aus CD34+-Stammzellen generierte DCs verwendet. Dargestellt ist
jeweils der Mittelwert mit Standardabweichung (n=6). In Vorversuchen war bereits die
Abhängigkeit von einigen anderen Differenzierungsstimuli und Kultivierungsbedingungen
untersucht worden, die in konventionellen Protokollen zum Einsatz kommen – Variationen
hierbei (GM-CSF- und IL-4 -Dosis, Zeitspanne von der Gewinnung bis zur Zellaufbereitung) waren nicht wegweisend. Signifikante Unterschiede ergaben sich lediglich
hinsichtlich verschiedener Zelldichten bei der Kultivierung und verschiedenen LPSPräparaten. Im Folgenden ist mit „LPS“ das Standard-LPS gemeint. Das aufgereinigte LPS
wird als „ up LPS“ (ultra-pure) bezeichnet.
3.1 Kulturen mit dendritischen Zellen aus Monozyten
3.1.1 Der Einfluss verschiedener LPS-Präparate und -Konzentrationen
Das erste Experiment diente zur Prüfung, inwieweit die Qualität und Quantität des LPSEinflusses während der Differenzierung eine Rolle spielt. Dafür wurden monozytäre DCs,
die mit IL-4 und GM-CSF kultiviert wurden, unterschiedlichen LPS-Präparationen in je 2
verschiedenen Konzentrationen ausgesetzt (Abb. 7-9).
Es zeigt sich, dass LPS generell zu einer signifikanten Hemmung der CD1a- Expression
einerseits und deutlichen Heraufregulation der CD14-Expression andererseits führt. Es
reifen insgesamt weniger doppelt-pos. Zellen unter LPS-Einfluss heran.
Diese Ergebnisse sind abhängig von der benutzten LPS-Dosis und dem Präparat: bei einer
Konzentration von 10µg statt 30ng (LPS) bzw. 30ng statt 10ng (up LPS) ist die
beschriebene Expressionsänderung stärker.
Insgesamt fiel die CD1a–Expression auf der Zelloberfläche unter LPS-Einfluss unabhängig
von der Dosis oder Art des LPS: durchschnittlich von 51,8% auf minimal 13% (LPS) bzw.
12,5% bei dem hochgereinigten LPS. Die CD14-Expression nahm zu, in diesem
Experiment von durchschnittlich 38% auf maximal 70% (LPS) bzw. 77% (up LPS). Der
29
Zellanteil, der eine doppelt-positive Ausprägung von sowohl CD1a als auch CD14 zeigte,
verminderte sich durchschnittlich von 7,9 auf minimal 1,0% bzw. 1,7%.
Expression [%]
CD1a
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Kontrolle
P < 0.05
P > 0.05
30 ng 10 µg
10 ng 30ng
LPS
ultra pure LPS
Abb. 7: Monozytäre DCs nach Kultivierung mit zwei verschiedenen LPS-Präparaten. Dargestellt
ist die prozentuale Verteilung der CD1a+-Subpopulation nach durchflusszytometrischer Messung.
30
CD14
90
P > 0.05
P > 0.05
80
Expression [%]
70
60
50
40
30
20
10
0
30 ng 10 µg
Kontrolle
LPS
10 ng 30ng
ultra pure LPS
Abb. 8: Monozytäre DCs nach Kultivierung mit LPS, dargestellt ist die prozentuale Verteilung der
CD14+-Subpopulation.
CD1a/CD14
10.0
Expression [%]
7.5
5.0
P < 0.05
P > 0.05
2.5
0.0
Kontrolle
30 ng 10 µg
10 ng 30ng
LPS
ultra pure LPS
Abb. 9: Monozytäre dendritische Zellen nach Kultivierung mit zwei verschiedenen LPSPräparaten. Dargestellt ist die prozentuale Verteilung der CD1a+-/CD14+-Subpopulation.
31
3.1.2 Abhängigkeit der LPS-vermittelten Effekte von der Zelldichte
Es wurde nun untersucht, ob durch eine veränderte Zellkonzentration bei dem Ansetzen
der Kulturen die LPS-vermittelten Effekte bezüglich der CD1a- und CD14-Expression
deutlicher hervortreten. Die monozytären dendritischen Zellen wurden in 2 Gruppen
unterschiedlicher Zelldichte aufgeteilt: 5 x 105 Zellen/ml und 2 x 106 Zellen/ ml. Als
repräsentativer Stimulus dient das gereinigte LPS, da bei dem Standard-Präparat weniger
deutliche Ergebnisse erzielt wurden (hier ohne Darstellung).
Wie im vorherigen Experiment gezeigt, finden sich eine Hemmung der CD1a-Expression
sowie eine Steigerung der CD14-Expression durch LPS-Einfluss in beiden Gruppen. Dabei
ist der Effekt bei höherer Zelldichte ausgeprägter, signifikant für CD1a und CD14 in der
Gruppe mit 2 x 106 Zellen/ml (siehe Abb. 10). Eine Ausnahme bilden die doppelt-positiven
Zellen.
Expression [%]
CD1a 90
P= 0.1563
P= 0.0313
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Kontrolle
30 ng LPS
5 x 105 /ml
Kontrolle 30 ng LPS
2 x 106 /ml
32
Expression [%]
CD14
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
P= 0.0156
Kontrolle
P= 0.0156
30 ng LPS
5 x 105 /ml
Expression[%]
CD1a/CD14 10.0
P= 0.0156
Kontrolle 30 ng LPS
2 x 106 /ml
P= 0.0781
7.5
5.0
2.5
0.0
Kontrolle
30 ng LPS
5 x 105 /ml
Kontrolle 30 ng LPS
2 x 106 /ml
Abb. 10: Monozytäre dendritische Zellen nach Stimulierung mit LPS in zwei verschiedenen
Zellkonzentrationen. Die y-Achse stellt die prozentuale Verteilung der Zellen je nach Oberflächenmolekülexpression dar. In diesem Versuchsteil wurde nur das hochgereinigte LPS verwendet.
33
3.1.3 Die CD86-Expression bei monozytären DCs
Im einem weiteren Ansatz wurde die Expression des CD86 als Maß für die Aktivierung der
monozytären Zellen unter LPS-Einfluss untersucht: in den bereits beschriebenen Zellkonzentrationen 5 x 105 und 2 x 106 Zellen/ml mit Zugabe von LPS und hochgereinigtem
LPS. Auch hier zeigen sich Unterschiede bei der Art des benutzten Präparates. Eine
verringerte CD86-Expression fand sich nur bei Verwendung des ultra-puren LPS‘. In der
Gruppe der höheren Zelldichte (2 x 106 Zellen/ml) fiel die mittlere Fluoreszenzintensität
von initial 306 auf 130 (um 58%) bzw. in der Gruppe mit der niedrigeren Zellzahl (5 x 105)
von 657 auf minimal 348 (Abfall um 53%). Eine Ausnahme bildet die Subgruppe „5 x 105
Zellen/ml unter dem Einfluss von 10µg Standard-LPS“: die erwartete Hemmung ist nicht
vorhanden, sondern es findet sich im Gegenteil eine Steigerung der CD86-Expression von
657 auf 1365 (Abb. 11), angegeben als MFI (relative Einheiten).
CD86
10000
MFI
1000
100
10
Kontrolle
10 µg
LPS
30 ng
up LPS
5 x 105 /ml
Kontrolle
10 µg
LPS
30 ng
up LPS
2 x 106 /ml
Abb. 11: Expression des Aktivierungsmarkers CD86 auf monozytären dendritischen Zellen in
Gruppen mit verschieden hoher Zellkonzentration und zwei verschiedenen LPS-Präparaten
(benutzt wurden die LPS-Dosierungen, die sich bereits als repräsentativ erwiesen hatten). Die
Ergebnisse sind in mittlerer Fluoreszenzintensität (MFI) angegeben. Es wurde auf alle CD1a+Zellen gegatet.
34
3.2 Kulturen mit dendritischen Zellen aus CD34+-Stammzellen
3.2.1 LPS-Wirkung auf dendritische Zellen
Um die bisher an monozytären dendritischen Zellen getestete LPS-Wirkung auch bei
stammzellgenerierten dendritischen Zellen zu untersuchen, dienen in den nächsten
Experimenten DCs aus CD34+-Vorläufern als Ausgangszellen. Die dendritischen Zellen
waren an Tag 7 mit GM-CSF, TNF-α und LPS nachstimuliert worden. Die Einteilung in
verschiedene Ansätze wurde wie im Experiment zuvor beibehalten (3.1.3).
In diesem Versuchsteil zeichnete sich diesmal keine Tendenz ab, in welche Richtung der
LPS-Effekt geht, also ob LPS die Expression der untersuchten Moleküle CD1a und CD14
auf der Zelloberfläche hemmt, fördert oder unbeeinträchtigt lässt. Die Zellzahl und der
Reinigungsgrad des LPS‘ hatten keinen signifikanten Einfluss auf die Expression beider
Oberflächenmoleküle bzw. auf die Populationsverteilung. Im Durchschnitt ergab LPSStimulierung weder eine Steigerung noch eine Verminderung der Expression, d.h. das
Verhältnis von dendritischen zu monozytären Zellen (CD1a:CD14) blieb ungefähr gleich.
Insgesamt fällt ein niedrigerer prozentualer Anteil an der Zellverteilung im Dotplot für
CD1a auf (durchschnittlich < 10%). Außerdem ist die Streuungsbreite bei niedriger
Zellzahl und Verwendung von hochgereinigtem LPS durchgehend größer als in den
anderen Gruppen. Bei der Verteilung der doppelt-positiven Zellen gibt es ebenfalls starke
Schwankungen (in Abb. 12 graphisch dargestellt).
Wie durch die Kultivierung zu erwarten, ist ein Großteil der Zellen vor allem CD14-positiv
(ca. 30%) und zeigt zu einem nur geringen Prozentsatz CD1a auf ihrer Oberfläche.
Zusammenfassend lassen sich also bezüglich der hier untersuchten Subpopulationsmarker
bei Stammzell-generierten dendritischen Zellen weder vom LPS-Präparat noch von der
Zelldichte abhängige Effekte zeigen.
35
Expression [%]
CD1a
20
10
0
Kontrolle
10 µg
LPS
30 ng
up LPS
5 x 105 /ml
Expression [%]
CD14
Kontrolle 10 µg
LPS
30 ng
up LPS
2 x 106 /ml
40
30
20
10
0
Kontrolle
10 µg
LPS
30 ng
up LPS
5 x 105 /ml
Kontrolle 10 µg
LPS
30 ng
up LPS
2 x 106 /ml
36
Expression [%]
CD1a/CD14 40
30
20
10
0
Kontrolle
10 µg
LPS
30 ng
up LPS
Kontrolle 10 µg
LPS
5 x 105 /ml
30 ng
up LPS
2 x 106 /ml
Abb. 12: Expression von Subpopulationsmarkern bei dendritischen Zellen aus CD34+-Stammzellen, die ohne IL-4 kultiviert wurden. Dargestellt ist die prozentuale Expression der
Oberflächenmoleküle, getrennt nach Zelldichte und LPS-Art. Es ist weder ein rein hemmender
noch ein rein fördernder Effekt von LPS-Stimulierung auf die Expression von CD1a und CD14
erkennbar.
3.2.2 LPS-Wirkung auf dendritische Zellen mit IL-4
3.2.2.1 Die Expression von CD1a und CD14
Der vorherige Versuch wurde wiederholt, diesmal mit dendritischen Zellen, die zusätzlich
mit IL-4 stimuliert worden waren, um die CD1a/CD14-Verteilung der Zellen zu
polarisieren. Auch hier sieht man keine Änderung der Zellverteilung hinsichtlich ihrer
Expression in Anwesenheit von LPS (Abb. 13). Beim Vergleich der beiden LPSPräparationen und der Gruppen mit unterschiedlicher Zelldichte zeigen sich keine
signifikanten Differenzen sowie aufgrund der zum Teil starken Streubreiten keine
wegweisenden Aussagen. Zum Teil erhöhte die Zugabe von 10µg des Standard-LPS die
CD14-Expression (bei einer Zellzahl von 5 x 105 /ml), bei den Kulturen mit höherer
Zelldichte war die CD14-Expression dagegen gemindert. Auch bei Verwendung des
hochgereinigten LPS‘ gab es keinen Zusammenhang zwischen den Kontrollen und den
LPS-Kulturen. In diesem Versuchsansatz blieben die Zellen v.a. doppelt-negativ. Wie
durch IL-4 Zugabe zu erwarten, war der Prozentsatz an CD1a-positiven Zellen um ein
37
Vielfaches höher als im Vorexperiment (40% statt 10%) und der Anteil an CD14-positiven
Zellen äußerst gering (1% statt 30%).
Die CD86-Expression wurde bei den Zellen ebenfalls bestimmt (siehe nächster Abschnitt).
Expression [%]
CD1a
60
50
40
30
20
10
0
Kontrolle
10 µg
LPS
30 ng
up LPS
5 x 105 /ml
Expression [%]
CD14
Kontrolle 10 µg
LPS
30 ng
up LPS
2 x 106 /ml
2
1
0
Kontrolle
10 µg
LPS
30 ng
up LPS
5 x 105 /ml
Kontrolle 10 µg
LPS
30 ng
up LPS
2 x 106 /ml
38
Expression [%]
CD1a/CD14
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Kontrolle
10 µg
LPS
30 ng
up LPS
5 x 105 /ml
Kontrolle 10 µg
LPS
30 ng
up LPS
2 x 106 /ml
Abb. 13: Expression von Subpopulationsmarkern bei dendritischen Zellen aus CD34+-Stammzellen, die mit IL-4 kultiviert wurden. Der Anteil an Zellen, die CD1a, CD14 oder beides
exprimieren, wird durch LPS nicht in eine bestimmte Richtung verändert, sodass sich keine
ableitbaren Aussagen hinsichtlich Förderung oder Hemmung ergeben.
3.2.2.2 Die Expression von CD86
Im zweiten Teil des vorherigen Experiments wurde bei den mit IL-4 kultivierten DCs die
mittlere Fluoreszenz des exprimierten CD86 als Maß für die Aktivierung der
herangereiften dendritischen Zellen gemessen – in Gruppen eingeteilt nach den bereits
genannten Parametern. Die Abbildung demonstriert die angedeutete Abnahme der
durchschnittlichen CD86-Expression unter LPS (mit einer Ausnahme bei der
Zellkonzentration von 2 x 106 Zellen/ml bei dem Zusatz von 10µg des Standard-LPS).
Dies korreliert mit der Reinheit der LPS-Präparation sowie steigender Zellkonzentration.
Die Abnahme der CD86–Expression ist bei kombiniertem Vorliegen dieser beiden
Faktoren (Zelldichte 2 x 106, 30ng ultra-pures LPS) eindeutiger. Bei Verwendung von
gereinigtem LPS zeigt sich ein Abfall der mittleren Fluoreszenzintensität von 143 auf 114
(um 20,3%) in der Gruppe mit einer Zellzahl von 5 x 105 /ml und ein Abfall von 98 auf 69
(um 29,5%) in der Gruppe mit einer höheren Zellzahl von 2 x 106. Insgesamt wird nur
wenig CD86 von den Zellen exprimiert.
39
MFI
CD86 1000
100
10
Kontrolle
10 µg
LPS
30 ng
up LPS
5 x 105 /ml
Kontrolle 10 µg
LPS
30 ng
up LPS
2 x 106 /ml
Abb. 14: CD1a+-dendritische Zellen, mit IL-4 und LPS kultiviert, wurden bezüglich der CD86
Expression untersucht. Darstellung der quantitativen Fluoreszenz. Es zeigt sich eine geringfügig
verringerte Aktivierung nach LPS-Stimulation. Die markierten Zellen exprimieren insgesamt nur
wenig CD86.
40
4. Diskussion
Dendritische Zellen, als potenteste Antigen-präsentierende Zellen, stellen ein wichtiges
Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunabwehr dar. Sie erkennen
Antigene über Pathogen-recognition receptors (PRRs), zu denen u.a. die Toll-like
Rezeptoren gehören. Wirken bakterielle Membranbestandteile wie LPS und andere Stimuli
auf unreife dendritische Zellen ein, so wird ihre Ausreifung über zelluläre Signalwege
gefördert (Chapuis et al., 1997; Cella et al., 1997).
Seit langem ist bekannt, dass LPS dendritische Zellen stimuliert, also bei reifen DCs
aktivierend auf sie einwirkt und bei unreifen DCs die Ausreifung fördert. Die Ergebnisse
verschiedener Autoren lassen jedoch vermuten, dass Lipopolysaccharide auch hemmende
Effekte bei der Differenzierung dendritischer Zellen ausüben können. Die Arbeitsgruppe
Bartz et al. zeigte, dass die Ausreifung monozytärer DCs aus CD14+ Monozyten unter
LPS-Einfluss inhibiert wird (Bartz et al., 2006). Die vorliegende Arbeit setzt an diesen
Ergebnissen an. Es sollte geklärt werden, wie LPS-Triggerung während der
Differenzierung monozytärer dendritischer Zellen sich auf die Oberflächenexpression
auswirkt und vor allem, ob der von Bartz et al. beschriebene hemmende LPS-Effekt auch
bei dendritischen Zellen aus Nabelschnurblut-Stammzellen beobachtbar ist.
Zur näheren Charakterisierung des beschriebenen Effekts, war es zunächst nötig die
Parameter, unter welchen der hemmende Effekt von LPS auftritt, genauer zu untersuchen.
Es zeigte sich zum einen, dass die Ergebnisse der Arbeitsgruppe Bartz et al. nur unter
bestimmten Kultivierungsbedingungen gelten; zum anderen, dass die Hemmung der
Differenzierung der DCs durch LPS nicht bei Stammzell-generierten Subpopulationen zu
finden ist. Somit sind nur bedingt Rückschlüsse auf andere Vertreter dieser Zellart
möglich. Unsere Ergebnisse sprechen für einen Sonderfall, den Bartz et al. zeigen konnten,
von einem universalen Prinzip kann nicht ausgegangen werden. Als Begründung kann
Folgendes angeführt werden: Die auftretenden Untergruppen dendritischer Zellen stellen
eigenständige Populationen dar. Gewonnene Erkenntnisse in Bezug auf eine Population
können nicht bedingungslos auf andere Subtypen übertragen werden (Hapel and Stanley,
2004).
41
4.1 Die LPS-Wirkung auf monozytäre dendritische Zellen
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die LPS-Wirkung auf die Oberflächenexpression
von typischen Populationsmarkern in der Phase der Differenzierung. Während sich bei den
Stammzell-generierten DCs kein LPS-Einfluss nachweisen ließ, konnte bei den
monozytären
DCs
der
von
Bartz
beschriebene
Effekt
mit
Einschränkungen
wiedergefunden werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass LPS nicht nur fördernd, sondern unter
bestimmten Bedingungen auch inhibitorisch auf die Entwicklung von DCs aus
monozytären Vorläufern wirken kann. Die nach Kultivierung auftretende Zellpopulation
weist mehr Ähnlichkeiten mit monozytären Zellen auf als mit dendritischen Zellen.
Hieraus kann man ableiten, dass ein hemmender Mechanismus zum Tragen kommt.
Änliches berichten Bartz et al. (2006): Die monozytären Vorläuferzellen erschienen in
ihrer Entwicklung hin zur dendritischen Zelle gehemmt. Unter LPS-Einfluss war die
Polarisation „Monozyt versus DC“ zugunsten der monozytären Entwicklung verschoben.
Auch Palucka et al. konnten beobachten, dass LPS das Potential von Monozyten sich zu
DCs zu entwickeln, blockiert (1999).
Bei Bartz et al. zeigten die Zellen eine niedrige Expression von kostimulatorischen
Molekülen unter LPS-Einfluss. Auch dies ist ungewöhnlich, ist doch bekannt, dass LPS
eine Aktivierung dendritischer Zellen bewirkt und damit die Expression von
kostimulatorischen Molekülen herauffährt (z.B. Banchereau et al., 2000). In dieser Arbeit
hingegen war die Expression des kostimulatorischen Moleküls CD86 nur leicht gehemmt,
die inhibitorische Wirkung von LPS auf die Aktivierung war bei uns also schwächer
ausgeprägt als bei Bartz et al. nachgewiesen wurde. Dennoch zeigte sich, dass die Zellen
nach LPS-Stimulation keineswegs mehr CD86 exprimierten als ohne LPS-Stimulation, was
gegen einen aktivierenden Effekt spricht.
Der hemmende Effekt von LPS auf monozytäre DCs war außerdem nicht immer
nachweisbar: Von Bedeutung waren die Konzentration und Reinheit des benutzten LPS
sowie die ursprüngliche Zelldichte beim Ansetzen der Kulturen. Höhere LPSKonzentrationen, ein stärker aufgereinigtes LPS und eine größere Zelldichte begünstigten
das Auftreten des hemmenden LPS-Effekts bei den monozytären dendritischen Zellen. Im
Folgenden wird auf die Abhängigkeit von den vorherrschenden Kultivierungsbedingungen
eingegangen.
42
In den Versuchen wurde bei den benutzten biologischen Präparaten (wie fetales
Kälberserum etc.) darauf verzichtet, die genaue Konzentration des LPS mit dem
klassischerweise angewandten Limulus-Amöben Test zu überprüfen. Artefakte durch
kontaminierendes LPS in den einzelnen Proben, die beim Kultivieren zum Einsatz
kommen, können nicht ausgeschlossen werden, sind jedoch als minimal zu betrachten und
daher vernachlässigbar.
Bei Bartz et al. wurde die Auswirkung von LPS-Kontakt auf die Differenzierung unreifer
DCs anhand verschiedener Kriterien überprüft. Im Gegensatz zu ihnen war die Messung
funktioneller
Parameter
(Zytokinsynthese,
T-Zellstimulationsverhalten
etc.)
nicht
Gegenstand unserer Versuche.
4.1.1 LPS-Präparation und -Dosis
In Vorversuchen mit einem Standard-LPS-Präparat war es zunächst nicht möglich eine
hemmende LPS-Wirkung nachzuweisen, daher verwendeten wir zusätzlich auch ein
hochgereinigtes LPS. Auf der Suche nach den optimalen Kultivierungsbedingungen unter
denen der hemmende LPS-Effekt zum Vorschein kommt, konnte also die Reinheit des LPS
als ein wichtiger Faktor identifiziert werden. Bei der Verwendung von hochgereinigtem
LPS trat die hemmende Wirkung auf die DCs deutlicher hervor.
Dies lässt sich folgendermaßen erklären: Der von Bartz et al. beschriebene hemmende
LPS-Effekt wird durch TLR-4 vermittelt. Diese Arbeitsgruppe verwendete ausschließlich
hochgereinigtes LPS. Es kann davon ausgegangen werden, dass LPS-Präparate, die nicht in
einem zusätzlichen Schritt aufgereinigt wurden, Kontaminationen enthalten, z.B. mit
Nukleinsäuren oder Lipopetiden /Lipoteichonsäure-Derivaten (Jarvis et al., 1997; David et
al., 2005; Tötemeyer et al., 2006). Diese Protein-Stimuli bewirken eine Aktivierung von
TLR-2. Zusätzlich kann die enthaltene RNA über TLR-3, -7 oder -8 eine Signalgebung
bewirken (Cristofaro and Opal, 2006). In Abschnitt 2.5.1 sind die Hersteller-Angaben der
LPS-Präparate zu eventuell vorhandenen Verunreinigungen angegeben (siehe Material und
Methoden). Durch die Verwendung von speziell aufgereinigtem LPS können
Verfälschungen der vorliegenden Ergebnisse über die Beteiligung von anderen Rezeptoren
außer TLR-4 weitestgehend ausgeschlossen werden (Hirschfeld/ Weis 2000).
Außerdem fiel eine Dosisabhängigkeit auf, also eine stärkere Hemmung der
Differenzierung von DCs bei höheren LPS-Konzentrationen. Verglichen mit Standard-LPS
43
waren niedrigere Dosen des gereinigten LPS‘ in der Lage, die gleiche oder teilweise sogar
stärkere Ausprägung des Effekts hervorzurufen. Dies kann als Hinweis für die Effektstärke
der einzelnen LPS-Präparate gesehen werden. Jedoch können beispielsweise 10µg des
Standard-LPS-Präparates nicht ohne Weiteres mit der Wirkung von 10µg des
aufgereinigten Präparates verglichen werden. Dafür müsste die TLR-4 bezogene Wirkung
beider Präparate mit einem geeigneten Verfahren quantifiziert werden, z.B. wie kürzlich
beschrieben (Peters, Fritz and Bufe, 2012).
Die Dosiserhöhung bei Standard-LPS ging mit einem relativ gesehen stärkeren Effekt
einher als bei gereinigtem LPS. Das heißt, eine Dosiserhöhung des aufgereinigten LPS‘
wirkte sich im Vergleich nicht so stark auf die ohnehin schon geminderte
Oberflächenexpression aus. Die absolute Hemmung der Expression war also beim
gereinigten LPS stärker, die relative Hemmung beim normalen LPS ausgeprägter. Es ist
davon auszugehen, dass bei niedrigen Konzentrationen des aufgereinigten LPS der
inhibitorische Effekt bereits nahe am Optimum liegt, sodass dieser durch die
Dosiserhöhung nicht mehr sonderlich verstärkt wird. Währenddessen lässt sich der
Unterschied bei der Verwendung des Standard-LPS‘ dadurch erklären, dass eine mögliche
Beteiligung anderer Signalwege (außer TLR-4) durch die höhere LPS-Dosis überdeckt
wird.
In vivo beinhalten bakterielle Infektionen immer zahlreiche Stimuli, die verschiedene
Rezeptoren aktivieren. Daher ist bei der Benutzung von gereinigtem LPS in vitro zu
beachten, dass es sich um eine künstlich geschaffene Situation handelt, da die DCs alleinig
nur mit LPS in Kontakt kommen.
Mit Blick auf den klinischen Bezug wäre es adäquater, auch die Verunreinigung mit
Lipopeptiden etc. zu berücksichtigen. Diese wirken ebenfalls auf die dendritische
Zellreifung (Michelsen, 2001). Dagegen empfiehlt sich aufgrund der besseren
Standardisierung das hochgereinigte LPS, falls in vitro ein LPS-abhängiger Mechanismus
zu betrachten ist.
44
4.1.2 Die Zellzahl als Kultivierungsfaktor
Als weitere Kultivierungsbedingung, die beeinflusst, ob LPS hemmend wirkt oder nicht,
konnten wir die Zellzahl identifizieren. Je höher die Dichte der Zellen beim initialen
Aussäen war, umso ausgeprägter war die hemmende Wirkung des LPS auf die Zellreifung.
In vitro ist die Zellzahl als Kultivierungsbedingung für die Proliferation humaner
Lymphozyten von Bedeutung (Moorhead et al., 1967; Hersh et al., 1970). Weitere Berichte
unterstreichen den Effekt der Zelldichte auf die Ausreifung dendritischer Zellen. Zum
Beispiel zeigten Thurnher et al., dass die Zelldichte die dendritische Entwicklung
entscheidend reguliert. Die Generierung der DCs wurde durch hohe Zellkonzentrationen
(5x106 Zellen/ml) erleichtert, während die Reifung zu aktiven DCs niedrige
Zellkonzentrationen (5x105/ml) erforderte. Bei hoher Zelldichte war die CD86-Expression
vermindert (Thurnher et al., 1997), unabhängig von LPS-Einwirkung. Dies konnten wir
bestätigen.
Bei dem beobachteten Zelldichte-Phänomen, welches nicht nur bei dendritischen Zellen,
sondern auch bei anderen Leukozyten zu finden ist, können viele Faktoren ursächlich sein
und wären somit auch für unsere Zellen denkbar: die Sekretion von löslichen Faktoren,
Zell-zu-Zell-Interaktionen (Ma and Wang, 2010), und/oder die zelluläre Modifikation des
Suspensionsmediums. Eine mögliche Konkurrenz der Zellen um Nährstoffe bei unseren
Versuchen scheint sehr unwahrscheinlich, da stets für optimale Kulturbedingungen gesorgt
wurde (ausreichend frisches Nährmedium, Aufteilen von gesättigten Kulturen). Das heißt,
die vor allem bei höherer Zellzahl stärker auftretende Hemmung der Differenzierung lässt
sich nicht auf gegenseitigen Substratverbrauch der Zellen zurückführen.
Dass hemmende Effekte generell deutlicher bei hoher Zellzahl zu finden sind, kann durch
Zell-Zellinteraktionen erklärt werden: dicht zusammen liegende Zellen üben gegenseitige
Wechselwirkungen indirekt über Mediatoren und/oder direkt z.B. über Gap junctions aus.
Diese Membranproteine bilden interzelluläre Kanäle und erlauben die Diffusion von
Metaboliten oder Second messenger-Molekülen direkt in die benachbarte Zelle. So können
Informationen, die elementare Zellvorgänge wie Metabolismus, Aktivierung oder
Apoptose betreffen, von einer Zelle zur anderen übertragen werden (Sandow et al., 2011).
Zwar sind Gap junctions v.a. bei Zellverbänden wie dem Epithel oder glatter Muskulatur
beschrieben (Goodenough and Paul, 2009), jedoch wird Connexin 43 als wichtiges Gap
junction-Protein auch auf Immunzellen und dendritischen Zellen exprimiert. Es wird
angenommen, dass diese Zell-Zellverbindungen eine Rolle bei der Antigen-Präsentation
und auch Reifung dendritischer Zellen spielen (Nguyen and Taffet, 2009). Eine andere
45
Arbeitsgruppe fand heraus, dass die Gap junction-mediierte interzelluläre Kommunikation
für eine effektive Aktivierung von DCs erforderlich ist (Matsue et al., 2006). Man könnte
schlussfolgern, dass bei höherer Zellkonzentration mehr Gap junction-Verbindungen
existieren.
Es bleibt festzuhalten, dass der Zelldichteeffekt unabhängig vom LPS-Einfluss bekannt ist;
dieser lässt sich womöglich nicht auf eine alleinige Ursache zurückführen. Ob ein lokaler
Feedback-Mechanismus oder parakrine Zelleffekte zusätzlich eine Rolle spielen, bleibt
noch ungeklärt.
4.2 Stammzellen-generierte DCs und die Rolle des IL-4
Die aus Stammzellen gewonnenen dendritischen Zellen wurden in zwei Gruppen
untersucht: zum einen gemäß konventionellen Kultivierungsprotokollen verarbeitet, zum
anderen
zusätzlich
mit
IL-4
(Interleukin-4)
stimuliert,
einem
potenten
antiinflammatorischen Zytokin, welches die weitere Ausreifung induziert. Beide Gruppen
wurden nach demselben Schema mit LPS stimuliert wie die monozytären DCs.
Bei den dendritischen Zellen, die ohne IL-4 kultiviert worden waren, ließ sich weder eine
eindeutig hemmende, noch eine stark fördernde LPS-Wirkung auf die Ausreifung
nachweisen, d.h. der Anteil an CD1a /CD14-positiven Zellen blieb gleich. Für die mit IL-4
kultivierten Zellen gilt das Gleiche: LPS veränderte die Zusammensetzung der
untersuchten Zellpopulation nicht und hemmte die Aktivierung der dendritischen Zellen
nur leicht. Insgesamt war es nicht möglich durch Variation der Kultivierungsbedingungen
(Verwendung von hochgereinigtem LPS, Erhöhung der LPS-Konzentration oder
Veränderung
der
Zelldichte)
einen
hemmenden
Effekt
von
LPS-Stimulierung
nachzuweisen.
Wie aus Voruntersuchungen bekannt ist, gehen aus den ursprünglich CD34-positiven
Vorläufern Zellen hervor, die sich durch Kultivierung mit GM-CSF und TNF-alpha in
dendritische
Zellen
differenzieren.
Diese
Zellgruppe
zeigt
eine
heterogene
Zusammensetzung, da sowohl doppelt negative, doppelt positive als auch einfach positive
Zellen in großer Zahl vorhanden sind (Caux et al., 1996). Normalerweise kommen CD1a
und CD14 getrennt vor: CD1a ist typisch für dendritische Zellen, CD14 wird vorwiegend
auf Makrophagen/ Monozyten gefunden (Banchereau et al., 2000; Andreesen et al., 1990).
Die simultane Expression beider Oberflächenmarker lässt somit vermuten, dass ein
46
endgültiger Zelltyp bei der heterogenen Population noch nicht festgelegt ist. Die
Population befindet sich in einem Vorläuferstadium. In ihr sind sowohl dendritische als
auch monozytäre Eigenschaften vereint. Eine endgültige Differenzierung lässt sich durch
Zugabe von Zytokinen erreichen (siehe Abbildung 15). Die Tatsache, dass LPS diese
Zusammensetzung der Zellpopulation nicht signifikant veränderte, deutet darauf hin, dass
die Stammzell-generierten DCs anders auf LPS reagieren als die monozytären und nicht
suszeptibel für die hemmende Wirkung von LPS sind.
Vorläuferzelle
IL-4
M-CSF
DC
Monozyt
CD1a+
CD14+
Abb. 15 zeigt die Polarität der Entwicklung zu dendritischen Zellen oder zu Monozyten, je nach
vorherrschendem Stimulationsfaktor.
Das modifizierte Kultivierungsprotokoll mit Zusatz von Interleukin-4 dient der verstärkten
Entwicklung von dendritischen Zellen. Dieses Zytokin induziert die Expression von CD1a
und hemmt die Makrophagenentwicklung (Rougier et al., 1998). Die resultierende
Zellpopulation kann als homogen angesehen werden, da die Zellen kein CD14 aufweisen
und doppelt-positive Zellen fehlen, wie unsere Versuche zeigten. Die CD1a-Expression
lässt vermuten, dass eine Differenzierung bereits stattgefunden hat.
Interessanterweise wurde die Verteilung beider Zellpopulationen (mit und ohne IL-4) unter
LPS nicht beeinflusst, d.h. die Expression der Populationsmarker blieb unverändert. Dass
LPS keinen Effekt auf die Ausreifung hatte, lässt darauf schließen, dass die Entwicklung
der Zellen durch das Kultivierungsprotokoll, also die zugegebenen Reifungszytokine
bestimmt wird. Lediglich bei der Aktivierung der Stammzell-generierten dendritischen
Zellen mit IL-4 zeigte sich eine leichte Hemmung durch LPS. Dies könnte dadurch erklärt
werden, dass es sich bei den Zellen um eine stabile Population handelt und sie eher
ausgereiften DCs entsprechen.
47
4.3 Die Rolle der Signaltransduktion
Die LPS-induzierte Hemmung findet sich vor allem bei monozytären DCs, nicht jedoch bei
von Stammzellen abstammenden DCs. Unterschiede in der Signaltransduktion beider
Zellarten könnten hierfür verantwortlich sein.
Bartz et al. weisen darauf hin, dass SOCS-Proteine (Abschnitt 1.5) ursächlich für die
hemmende
LPS-Wirkung
sind.
Ihre
unterschiedliche
Beteiligung
bei
der
Signaltransduktion von Monozyten versus dendritischen Zellen wäre ein möglicher
Ansatzpunkt bei der Erklärung, warum LPS bei monozytären DCs, nicht jedoch bei
Stammzell-generierten DCs hemmend wirkt. So induziert LPS v.a. SOCS-3 in Monozyten
und Makrophagen (Krebs and Hilton, 2000). Bei der Reifung dendritischer Zellen sind
neben SOCS-3 auch SOCS-1 und -2 beteiligt (Jackson et al., 2004).
Man muss beachten, dass der Vorgang der Signaltransduktion nicht linear abläuft, sondern
im Gegenteil ein Molekül oft mehrere Signalwege simultan in Gang setzt, die sich
wiederum untereinander beeinflussen. Auch wenn gleiche SOCS-Untertypen in
monozytären und Stammzell-generierten DCs vorkommen, so könnte es trotzdem sein,
dass geringe Unterschiede auf nachgeschalteten Ebenen vorliegen (z.B. Interferenz mit
einem weiteren Protein oder die Abhängigkeit der Aktivierung von einem zusätzlichen
Signal). Dies würde auf molekularer Ebene erklären, warum die untersuchten DCSubtypen unterschiedlich auf LPS reagieren. Aufgrund fehlender Daten kann hier jedoch
nur spekuliert werden.
Bisher stand der TLR-4 im Vordergrund der Betrachtungen, nicht zu vernachlässigen ist
jedoch die Rolle des CD14. Dieses wird vor allem auf monozytären Zellen exprimiert. Auf
der Zelloberfläche lokalisiert, sorgt es für die Bindung von LPS an TLR-4 (siehe Abschnitt
1.4). Zanoni et al. (2009) identifizierten kürzlich eine neue Funktion für dieses Molekül
während LPS-Exposition: die Regulation des Lebenszyklus‘ von terminal differenzierten
DCs. Sie zeigen, dass die Stimulation muriner DCs mit LPS nur CD14-abhängig (also
unabhängig von TLR-4) verschiedene Signaltransduktionswege aktiviert. Dabei sind
andere Moleküle beteiligt, als klassischerweise von TLR-4 bekannt.
Es ist anzunehmen, dass bei dendritischen Zellen monozytärer Herkunft der vermehrt
vorhandene Oberflächenmarker CD14 die Anlagerung von LPS an TLR-4 verstärkt. Ob
und wie sich das bezüglich einer hemmenden LPS-Wirkung auswirkt, ist bislang noch
nicht untersucht. Eventuell stellt das CD14 einen begünstigenden Faktor für das Auftreten
des inhibitorischen LPS-Effekts bei monozytären DCs dar, besonders vor dem
48
Hintergrund, dass die untersuchten Stammzell-generierten DCs wenig bis gar kein CD14
aufwiesen, wie allgemein bekannt ist.
4.4 Klinische Relevanz
Die hemmende Wirkung von LPS auf die Entwicklung dendritischer Zellen ist zum
Beispiel bei einer Sepsis von klinischem Interesse. Bei dieser Form der generalisierten
Entzündungsreaktion ist es wichtig, eine überschießende inflammatorische Immunantwort
einzudämmen. Die Hemmung dendritischer Zellen bei hohen LPS-Spiegeln im Blut könnte
somit als autogene Feedbackschleife verstanden werden.
Die Ergebnisse von Xie et al. unterstützen diese Interpretation. Sie zeigen, dass LPS zwei
biologisch wichtige Effekte auf dendritische Zellen hat: die Aktivierung bereits
existierender DCs zur Initiierung einer Immunabwehr sowie die Inhibierung der
Generierung neuer DCs zur Limitierung dieser Immunantwort (Xie et al, 2003).
Bartz et al. stellen ein Konzept vor, in dem abhängig von mikrobiellen Liganden im
weiteren Verlauf eine dendritische Zelle oder ein Makrophage aus der gemeinsamen
Vorläuferzelle entsteht. Folgende Vorstellung liegt dem zugrunde: Im gesunden Gewebe
wird normalerweise die Generierung unreifer DCs induziert, um v.a. die Erkennung
infektiöser Gefahrensignale zu erleichtern. Während einer Inflammation dagegen sorgt
TLR-Stimulierung dafür, dass die rekrutierten Monozyten nicht zu DCs heranreifen,
sondern
sich
mehr
Makrophagen-ähnlich
verhalten
und
mit
ihrer
hohen
Phagozytosefähigkeit für eine schnelle, effektive Abwehr sorgen, da die bereits im Gewebe
vorhandenen dendritischen Zellen für die Antigenpräsentation ausreichen.
Unsere Ergebnisse unterstreichen, dass es sich dabei um einen Spezialfall handelt. Es muss
festgehalten werden, dass es Hinweise für einen hemmenden Effekt auf die Entwicklung
von DCs aus Monozyten gibt – dieser wirkt aber nur begrenzt.
Das Phänomen der LPS-induzierten Hemmung muss von der Endotoxin-Toleranz
abgegrenzt werden: diese ist beschrieben als vorübergehende Nicht-Sensitivität eines
Wirtes auf wiederholten LPS-Kontakt (Wolk et al., 2000), wie anhand von Monozyten
gezeigt. Die Endotoxintoleranz kann als klinisches Korrelat zu dem von Bartz
beschriebenen Effekt gesehen werden, beim einmaligen LPS-Kontakt erfolgt jedoch eher
eine Aktivierung des Immunsystems, wie bereits viele Arbeiten berichten.
49
Auch Abdi et al. gingen der These nach, dass LPS-aktivierte DCs auf weitere Stimulation
durch Lipopolysaccharide refraktär sind. Sie zeigten, dass die dendritischen Zellen in
diesem Fall zwar ein vermindertes Ansprechen zeigen, jedoch weiterhin dazu fähig sind,
auf T-Zellsignale mit inflammatorischen Zytokinen zu antworten und ihre Plastizität
beibehalten (Abdi et al., 2012).
Die Literatur, die sich mit der LPS-Wirkung auf DCs beschäftigt, muss zum heutigen
Zeitpunkt als kontrovers bezeichnet werden. Der von Bartz und uns beschriebene Effekt ist
noch nicht ausreichend untersucht, z.B. ist noch ungeklärt, ob es sich um ein reines in
vitro-Phänomen handelt bzw. wo der Unterschied in vivo besteht. In weiterführenden
Experimenten müsste dies genauer untersucht werden, z.B. anhand von myeloischen DCs
aus peripherem Blut.
Die dämpfende Wirkung von LPS auf die Generierung dendritischer Zellen ließ sich bei
uns nur in Teilen bestätigen. Wenn überhaupt, ist es von den Kultivierungsbedingungen
abhängig, ob LPS hemmend wirkt oder nicht. In Übertragung auf nicht-monozytäre
sondern Stammzellen-generierte DCs konnte dieses Ergebnis jedoch trotzdem nicht
reproduziert werden, sodass sich zusammenfassend sagen lässt: Die Bartz’schen
Ergebnisse müssen mit Einschränkungen gesehen werden und sind nicht anwendbar auf
Subpopulationen aus CD34-positiven Stammzellen. Weitere Arbeiten sind nötig, um
Parameter zu testen, warum es sich am ehesten um einen Spezialeffekt handelt.
50
5. Zusammenfassung
Dendritische Zellen stellen die wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen des
Immunsystems
dar.
Es
ist
allgemein
bekannt,
dass
Stimuli
wie
bakterielle
Lipopolysaccharide ihre Ausreifung fördern. Diese werden unter anderem von Toll-like
Rezeptoren erkannt. Jedoch gibt es Hinweise dafür, dass LPS auch hemmende Effekte auf
die Differenzierung von DCs haben kann. Bartz et al. zeigten, dass LPS über TLR-4Stimulierung die Ausreifung dendritischer Zellen aus monozytären Vorläufern hemmt. Es
wurde untersucht, unter welchen Bedingungen diese inhibitorischen LPS-Effekte während
der in vitro Generierung auftreten und ob sich diese auch bei dendritischen
Subpopulationen aus Nabelschnurblut-Stammzellen finden lassen.
Dafür wurden DCs sowohl aus Monozyten des peripheren Blutes als auch aus CD34positiven Stammzellen des Nabelschnurblutes isoliert und zur Reifung mittels Stimuli wie
Stammzellfaktor und GM-CSF gebracht. Es wurden zwei verschiedene LPS-Präparate
eingesetzt: Standard-LPS und hochgereinigtes LPS. Die DCs aus dem Nabelschnurblut
wurden in Gruppen mit und ohne IL-4 stimuliert. Als Marker der Differenzierung und
Aktivierung wurde die Oberflächenexpression von CD1a, CD14 und CD86 mittels
Durchflusszytometrie gemessen. Es wurde sowohl die LPS-Dosis als auch die eingesetzte
Zellkonzentration variiert.
Bei den monozytären dendritischen Zellen führte LPS-Zugabe unter bestimmten
Kultivierungsbedingungen zu einer Hemmung der CD1a-Expression bzw. Steigerung der
CD14-Expression und damit zu einer Verschiebung der Ausdifferenzierung von
dendritischen hin zu monozytären Subpopulationen. Die Ergebnisse sind abhängig von der
LPS-Konzentration und dem benutzten Präparat – bei höherer LPS-Dosis und Verwendung
von hochgereinigtem LPS ist die Ausprägung des hemmenden Effekts stärker. Außerdem
scheint auch die Zellkonzentration eine Rolle zu spielen: bei höherer Zelldichte findet sich
eine stärkere Hemmung der Differenzierung durch LPS. Bei den DCs aus CD34 +Vorläufern hatten die Parameter Zellzahl und LPS-Art allerdings keinen Einfluss auf die
Expression von CD1a/CD14, sowohl bei den mit als auch ohne IL-4 kultivierten
Populationen. Lediglich bei der CD86-Expression (als Maß für die Aktivierung der Zellen)
fand sich eine leichte Minderung unter LPS.
51
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die inhibitorischen Effekte von LPS auf monozytäre
DCs sich nur unter bestimmten Kultivierungsbedingungen finden lassen. Vor allem die
Aufbereitung des LPS-Präparates (Reinheitsgrad) als auch die Konzentration dieses
Stimulus‘ sowie die Zelldichte scheinen eine Rolle zu spielen. Noch ist unklar, warum sich
bei den Stammzell-generierten DCs kein hemmender LPS-Effekt nachweisen ließ.
Eine Erklärung für die hemmende Wirkung von LPS über Toll-like Rezeptor 4 könnte die
Induktion von SOCS liefern; dies sind suppressiv auf die Signaltransduktion wirkende
Proteine, die die LPS-Signalgebung inhibitorisch modulieren. Die Tatsache, dass die
Differenzierung der DCs gehemmt wird, könnte bei inflammatorischen Prozessen einen
Mechanismus darstellen, eine überschießende immunologische Antwort unter dem
Einfluss bakterieller Endotoxine einzudämmen. Vorläuferzellen mit MakrophagenFunktion sorgen dann für eine ausreichende Phagozytosekapazität.
Allerdings lassen sich die von der Arbeitsgruppe Bartz et al. gefundenen Effekte nicht
ohne Weiteres auf andere Subpopulationen dendritischer Zellen übertragen. Dies kann man
damit begründen, dass DCs keine homogenen Populationen bilden, sondern eine
heterogene Zellart darstellen.
52
6. Literaturverzeichnis
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59
Danksagung
Nach 542 Absätzen, mehr als 2000 Zeilen, genau 13859 Wörtern und unendlichen
Gesprächen ist es endlich so weit:
Ich danke ganz besonders Herrn Schauer (für alles), Frau Baumeister und Frau Michel (für
Einführung in die Labormethoden), Herrn Dr. M. Trampisch (für die statistische Beratung)
und auch allen anderen, die mir mit Rat und Tat, ihrer Zeit und Geduld zur Seite standen.
Ebenso meiner besonderen Familie, ohne die das alles nicht möglich gewesen wäre.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Rehman
Vorname:
Rabea
Geburtsdatum, -ort:
13. Juli 1986, Lünen
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Berufliche Tätigkeit:
Seit 07.12.2009
Assistenzärztin im Gemeinschaftskrankenhaus
Herdecke, Abteilung für Frauenheilkunde und
Geburtshilfe
WS 2010/2011
Lehrauftrag als POL-Tutorin im Modellstudiengang
05/2010 – 08/2010
Wissenschaftliche Mitarbeiterin („Lehrärztin“) der
Medizinischen Klinik, Knappschaftskrankenhaus
Bochum (Uniklinikum Langendreer)
Studium
Seit SS 2011
BA-Studiengang „Management & Economics“, RUB
10.11. 2009
2. Staatsexamen (Note: 2,0)
07.09.2005
1. Staatsexamen (Note: 2,0)
WS 2003 – SS 2009
Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität
Bochum
Praktisches Jahr
04/2009
Chirurgie,
Marienhospital Witten
12/2008
Innere Medizin,
Marienhospital Witten
08/2008
Pädiatrie,
Marienhospital Witten
Schulische Bildung
27.06.2003
Abschluss: allgemeine Hochschulreife
1997 -2003
Friedrich-Harkort-Gymnasium Herdecke
Sonstiges
05/2010 – 08/2010
zahlreiche Fortbildungen zum Thema Hochschullehre
/ Teile des „Zertifikat Medizindidaktik NRW“
Seit 07/2011
Mitglied im Akademischen Börsenverein Bochum
e.V.