Zur Aussagekraft der HER2 Rezeptorexpression in caninen
Werbung
Aus der Abteilung Infektionspathologie des Deutschen Primatenzentrums Göttingen _______________________________________________________________________ Zur Aussagekraft der HER2 Rezeptorexpression in caninen Mammatumoren als diagnostischer und prognostischer Faktor INAUGURAL–DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Christiane Kott aus Salzgitter Hannover 2004 Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup 1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup 2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. I. Nolte Tag der mündlichen Prüfung: 13. Mai 2004 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ........................................................................................................................ 11 2 Literaturübersicht.......................................................................................................... 13 2.1 Mammatumoren beim Hund ........................................................................................ 13 2.1.1 Morphologische Vorbemerkungen....................................................................... 13 2.1.2 Epidemiologie der Mammatumoren..................................................................... 15 2.1.3 Ätiologie und Pathogenese................................................................................... 15 2.1.4 Lokalisation, Rezidive und Metastasen................................................................ 17 2.1.5 Therapie................................................................................................................ 18 2.1.6 Prognose ............................................................................................................... 20 2.1.7 Klassifikation ....................................................................................................... 20 2.1.7.1 Maligne Tumoren............................................................................................. 21 2.1.7.1.1 Nichtinfiltratives Karzinom...................................................................... 22 2.1.7.1.2 Komplexes Karzinom............................................................................... 22 2.1.7.1.3 Einfache Karzinome................................................................................. 22 2.1.7.1.4 Spezielle Karzinomtypen ......................................................................... 23 2.1.7.1.5 Sarkome.................................................................................................... 24 2.1.7.1.6 Karzinosarkom ......................................................................................... 25 2.1.7.1.7 Karzinom oder Sarkom in benignen Tumoren......................................... 25 2.1.7.2 Benigne Tumoren............................................................................................. 26 2.1.7.2.1 Adenome .................................................................................................. 26 2.1.7.2.2 Fibroadenom............................................................................................. 27 2.1.7.2.3 Benigne Mischtumoren ............................................................................ 27 2.1.7.2.4 Gangpapillom ........................................................................................... 27 2.2 HER2 Rezeptor ............................................................................................................ 28 2.2.1 Nachweismethoden (Hercep, FISH) .................................................................... 32 2.2.2 HER2 Rezeptor beim Mammatumor der Frau ..................................................... 34 2.2.3 HER2 Rezeptor beim Mammatumor der Hündin ................................................ 35 2.2.4 HER2 Rezeptor bei anderen Tumoren ................................................................. 36 2.2.5 3 HER2 als therapeutisches Ziel ............................................................................. 37 Eigene Untersuchungen ................................................................................................. 39 3.1 Material und Methoden ................................................................................................ 39 3.1.1 Untersuchungsmaterial......................................................................................... 39 3.1.2 Anfertigung der Gewebeschnitte.......................................................................... 39 3.1.3 Klassifizierung der Proben ................................................................................... 40 3.1.4 Immunhistochemische Reaktionen ...................................................................... 40 3.1.4.1 Hercep Test ...................................................................................................... 40 3.1.4.2 Ki 67................................................................................................................. 41 3.1.4.3 Der Multiblock ................................................................................................. 42 3.1.5 Auswertung und Dokumentation ......................................................................... 43 3.2 Ergebnisse .................................................................................................................... 47 3.2.1 Hercep Test .......................................................................................................... 47 3.2.2 Ki 67..................................................................................................................... 56 3.2.3 Der Multiblock ..................................................................................................... 62 4 Diskussion ....................................................................................................................... 67 4.1 Hercep Test .................................................................................................................. 67 4.2 Ki 67............................................................................................................................. 70 4.3 Multiblock .................................................................................................................... 72 5 Zusammenfassung.......................................................................................................... 73 6 Summary ......................................................................................................................... 75 7 Literaturverzeichnis....................................................................................................... 77 8 Anhang ............................................................................................................................ 89 8.1 Rezepte ......................................................................................................................... 89 8.1.1 Einbettungsprotokoll ............................................................................................ 89 8.1.2 Hämalaun-Eosin-Färbung (H.-E.) ........................................................................ 89 8.1.3 Versuchsprotokoll Hercep Test............................................................................ 90 8.1.4 Versuchsprotokoll Ki 67 ...................................................................................... 92 8.1.5 Citratpuffer ........................................................................................................... 95 8.1.6 Versuchsprotokoll Multiblock.............................................................................. 95 8.2 Tabellen........................................................................................................................ 96 8.2.1 Tabelle Untersuchungsmaterial gesamt ............................................................... 96 Abkürzungsverzeichnis A. Arteria A1 erster abdominaler Gesäugekomplex A2 zweiter abdominaler Gesäugekomplex Aa. Arterien Abb. Abbildung ADCC Antibody dependent cell mediated cytotoxicity AgNOR Argyophile Nucleolar Organizer Region Aqua bidest. 2fach destilliertes Wasser Aqua dest. destilliertes Wasser AR Amphiregulin BCG Bacillus Calmette-Guerin bcl-2 B-Zell-Leukämie-Lymphom-2-Gen bzw. beziehungsweise ca. circa CISH Chromogenic-in-situ-Hybridisation DAB Diaminobenzidin DNA Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DSH Deutscher Schäferhund DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft EGF Epidermal Growth Factor EGFR Epidermal Growth Factor Receptor ELISA enzyme-linked immuno sorbent assay et al. et alii ( und andere) Fa. Firma FDA Food and Drug Administration FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung g Gramm ggr. geringgradig G0-Phase nicht-zyklische Phase G1-Phase Phase, in der sich die Zelle zur DNA-Synthese vorbereitet G2-Phase Phase, in der sich die Zelle zur Mitose vorbereitet h Stunde(n) H.-E. Hämalaun und Eosin H2o2 Wasserstoffperoxid HER2 Human epidermal growth factor receptor-2 hgr. hochgradig HRG Heregulin (α und β) I inguinaler Gesäugekomplex IHC Immunhistochemie kD Kilodalton KHT Kurzhaarteckel LHT Langhaarteckel L-MTP-PE Liposomenumhülltes Muramyltripeptidphosphatidylethanolamin Lsg. Lösung MAb Monoklonale Antikörper mgr. mittelgradig min Minute(n) ml Milliliter mm Millimeter mRNA messenger ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) NaCl Natriumchlorid Nl. / Nll. Nodus lymphaticus / Nodi lymphatici (Lymphknoten) NSCLC non-small cell lung cancer (nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom) o. A. ohne Angaben PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PCNA Proliferating cell nuclear antigen PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion) RHT Rauhaarteckel RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction SABC/SAB Streptavidin-Biotin-Complex sec Sekunde(n) sog. sogenannte S-Phase Synthese-Phase, Phase, in der die Zelle DNA synthetisiert T1 erster thorakaler Gesäugekomplex T2 zweiter thorakaler Gesäugekomplex Tab. Tabelle TGF-α Transforming Growth Factor-α u. und Westi Westhighland-White-Terrier WHO World Health Organisation z. B. zum Beispiel z. T. zum Teil °C Grad Celsius µl Mikroliter µm Mikrometer Einleitung 1 11 Einleitung Das Mammakarzinom ist eine häufige Todesursache bei Frauen. Trotz vielseitiger Therapiemöglichkeiten wird es weiterhin als unheilbar angesehen (McKEAGE u. PERRY 2002). Ca. 20-30 % der Patientinnen mit invasivem Mammakarzinom weisen eine HER2 Rezeptorüberexpression auf. Ein positiver HER2 Status gilt als prognostischer Indikator für einen schlechten Krankheitsverlauf und ist ein prädiktiver Faktor, da er mit besonders aggressivem Tumorwachstum und einem z. T. schlechten Ansprechen auf bestimmte Chemotherapieprotokolle einhergeht (SLAMON et al. 1987, 1989; BLOOM et al. 2001; McKEAGE u. PERRY 2002). Aber genau dieser Rezeptor bietet auch einen neuen Therapieansatzpunkt. In den letzten Jahren wurden in der Humanmedizin mehrere Nachweisverfahren für das HER2 Protein bzw. HER2 Gen entwickelt. Ein positiver HER2 Status bildet die Voraussetzungen für eine Herceptin-Therapie bei Patientinnen mit metastasierendem Mammakarzinom. Herceptin ist ein neues Agens, das bei HER2 positiven Mammakarzinomen die Proliferation hemmt und so einen positiven Einfluß auf den weiteren Krankheitsverlauf hat (KAUFMANN u. KANZ 2000; GOEL et al. 2002). Die Mammatumoren des Hundes gehören zu den am häufigsten bei dieser Tierart diagnostizierten neoplastischen Erkrankungen (BRODEY et al. 1983). Die Vielfalt an möglichen Tumordiagnosen, sowie das häufige Fehlen makroskopischer Hinweise bezüglich der Malignität machen histopathologische Untersuchungen notwendig, um eine Prognose stellen zu können. Als Ergänzung zu den routinemäßigen Methoden, wie z. B. die Diagnosestellung am H.-E. Schnitt, hat sich in den letzten Jahren die Immunhistochemie bewährt. Anhand dieser Technik lassen sich Proteinstrukturen wie z. B. Hormonrezeptoren, Proliferationsmarker oder Zellmarker im neoplastischen Gewebe darstellen (GERDES et al. 1986; DONNAY et al. 1993; MANZEL 1995; DONNAY et al. 1996). Ziel dieser Studie ist die Prüfung einer möglichen Aussagekraft der HER2 Rezeptorexpression in caninen Mammatumorgewebe als diagnostischer und prognostischer Faktor. Das immunhistochemische Nachweisverfahren, bei dem der Grad der HER2 Proteinüberexpression im Tumorgewebe bestimmt werden soll, ist in der Humanmedizin bei 12 Einleitung Patientinnen mit metastasierendem Brustkrebs etabliert und dient als Entscheidungshilfe für den Einsatz der Herceptintherapie. Der immunhistochemische Hercep Test der Firma DakoCytomation sollte in der vorliegenden Arbeit auf seine Anwendbarkeit beim Hund getestet werden. Zu den beschriebenen immunhistochemischen Methoden zum Nachweis von HER2 sollte dessen Anwendbarkeit am Multiblocksystem evaluiert und mit einem lange etablierten Proliferationsmarker (Ki 67) an caninen Mammatumorgeweben verglichen werden. Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Mammatumoren beim Hund 2.1.1 Morphologische Vorbemerkungen 13 Anatomie und Histologie der Mamma Das Gesäuge der Hündin besteht aus zwei Leisten, die sich beiderseits an der ventralen Bauchwand von thorakal bis inguinal erstrecken und in der Medianen durch den Sulcus intermammarius getrennt sind. In der Regel sind beim Hund beiderseits 5, seltener 4 oder 6 Drüsenkomplexe vorhanden. Die Anzahl der Komplexe kann auf beiden Seiten unterschiedlich sein. Die Komplexe werden von kranial nach kaudal folgendermaßen bezeichnet: kranialer thorakaler (T1), kaudaler thorakaler (T2), kranialer abdominaler (A1), kaudaler abdominaler (A2) und inguinaler (I) Komplex (CHRISTENSEN 1979; MANN 1984; HABERMEHL 1996). Ein Mammakomplex besteht aus dem Corpus mammae (Drüsenkörper) und der Papilla mammae (Zitze), die unmittelbar als sog. Eversionszitze aus dem Drüsenkörper hervorgeht. Die Milchdrüse ist eine zusammengesetzte, modifizierte, apokrine Schweißdrüse, deren Aufbau tubuloalveolär ist. Ihr Parenchym besteht aus Drüsenepithelien und dem interparenchymatösen Bindegewebe, welches sie in Lobuli unterteilt. Das Hohlraumsystem läßt sich einteilen in die Alveolen als Ort der Milchbildung und Milchabgabe. Darauf folgen die vom Drüsengewebe umhüllten interlobulären Ausführungsgänge (Ductus lactiferi), die sich zu größeren Milchgängen vereinigen und schließlich an der Zitze direkt in die Milchzysternen (Sinus lactiferi) münden. Hieran schließen sich die 6 - 20 Strichkanäle (Ducti lactiferi), die mit ihren Zitzenöffnungen (Ostia papillaria) direkt auf der Zitzenkuppe enden. Hauptbestandteil der Alveolenwand ist ein einschichtiges Epithel aus kubischen, im Stadium der Milchspeicherung abgeplatteten und kurz nach dem Milchentzug auch leicht hochprismatischen Zellen. Die Deckzellen der Alveolarwand werden außen von Myoepithelzellen umgeben, die die Funktion glatter Muskelzellen erfüllen. Sie weisen oberflächlich Oxytocinrezeptoren auf, deren Aktivierung eine Kontraktion der Zelle und 14 Literaturübersicht damit eine Verengung der Alveole einleiten. Den Myoepithelien liegt außen die Basalmembran an. Sämtliche Milchgänge werden außen ebenfalls von einem lockeren Netz aus Myoepithelien umgeben, die der Ausschüttung und Weiterleitung der Milch dienen. Wachstum und Funktion der Drüsenzellen unterliegen hormonellen Einflüssen. Hierbei spielen Östrogene, das Wachstumshormon, Prostaglandine (Wachstum), Progesteron und Prolaktin (Funktion) eine Rolle (CHRISTENSEN 1979; MOSIMANN u. KOHLER 1990; LIEBICH 1993; HABERMEHL 1996). Gefäßversorgung Arteriell versorgt werden die Drüsenkomplexe durch die Rami mammarii der A. thoracica interna und der Aa. intercostales (T1 und T2), der A. epigastrica cranialis superficialis (T2 und A1), der A. epigastrica caudalis superficialis, der A. abdominalis cranialis sowie dem Ramus labialis ventralis der A. pudenda externa (A1, A2 und I). Die Komplexe T1, T2 und A1 führen ihr venöses Blut über die Venae perforantes oder die Vena epigastrica cranialis superficialis in die Vena thoracica interna, die in die Vena cava cranialis mündet. A1, A2 und I entsenden ihr venöses Blut über die Vena epigastrica caudalis superficialis zur Vena pudenda externa, wo es via Vena pudendoepigastrica, Vena iliaca externa und Vena iliaca communis in die Vena cava caudalis gelangt (MICHEL 1994; WAIBL et al. 1996). Die Lymphdrainage des Gesäuges ist bilateral symmetrisch und hat als Metastasierungsweg primäre Bedeutung. Der Lymphabfluß der ersten drei Komplexe erfolgt über das Lymphocentrum axillare (Nl. axillaris proprius und Nl. axillaris accessorius) in den Truncus jugularis oder Ductus thoracicus oder direkt in den Venenwinkel und in den vorderen Brustbeinlymphknoten (Nl. sternalis cranialis). Das Lymphocentrum inguinale superficiale (Nll. inguinales superficiales) entsorgt die beiden kaudalen Komplexe und teilweise auch den abdominalen kranialen Komplex. Von hier gelangt die Lymphe über die Nll. iliaci mediales und die Nll. lumbales aortici in den Truncus lumbalis. Dieser mündet in die Cysterna chyli und weiter in den Ductus thoracicus. Zwischen beiden Abflußgebieten bestehen Anastomosen (CHRISTENSEN 1979; MICHEL 1994; VOLLMERHAUS 1996). Literaturübersicht 2.1.2 15 Epidemiologie der Mammatumoren Mammatumoren sind mit über 50 % (BRODEY et al. 1983; MANN 1984; BOSTOCK 1986; BOSTEDT u. TAMMER 1995; GUTBERLET et al. 1998; RAVIKUMAR et al. 2000) die häufigste neoplastische Erkrankung der Hündin. Vergleichend dazu stellt der Anteil der Mammatumoren bei der Frau 27 % aller Neoplasien dar (BRODEY et al. 1983; RAVIKUMAR et al. 2000). Bei männlichen Hunden sind Mammatumoren sehr selten (FRESE et al. 1989; BOSTEDT 1994). Die Häufigkeitsangaben schwanken zwischen 0,4 und 2,7 % der Mammatumorfälle (ESKENS 1983). Am häufigsten treten Mammatumoren bei der Hündin in einem Alter zwischen 7-13 Jahren, selten unter 5 Jahren auf. Das Durchschnittsalter liegt bei ca. 9,5 Jahren (DAHME u. WEISS 1958; BOSTEDT u. TAMMER 1995; SIMON et al. 1996; GUTBERLET et al. 1998). Die Ursache für das ab dem 5. Lebensjahr vermehrt auftretende unkontrollierte Wachstum im Gesäuge kann in der für die Hündin eigenen Zyklizität gesehen werden. Lange Östrogen-, Progesteron- und Prolaktinphasen scheinen einen Einfluß auf die Tumorinzidenz zu haben. Durch die in den Mammakomplexen konzentrierten Progesteron- und Östrogenrezeptoren ist es denkbar, dass die Proliferationsvorgänge in Abhängigkeit von der Hormonlage und Rezeptorenfunktion entarten können und dadurch chronisch zu einer Tumorbildung führen (BOSTEDT u. TAMMER 1995). Eine Rassedisposition ist nicht eindeutig festzustellen. Jedoch ist zu erkennen, dass vorwiegend kleine Rassen erkranken, z. B. Dackel, Pudel, Spaniel und Terrier. Große Hunde hingegen sind seltener betroffen, wobei die Angaben über den Deutschen Schäferhund, Boxer und Mischlinge in der Literatur deutlich differieren (DAHME u. WEISS 1958; BOMHARD u. DREIACK 1977; SIMON et al. 1996; MacEWEN u. WITHROW 1996; GUTBERLET et al. 1998). 2.1.3 Ätiologie und Pathogenese Ätiologisch handelt es sich um ein multifaktorielles Geschehen, wobei offensichtlich hormonelle Einflüsse im Vordergrund stehen. Von den Geschlechtshormonen schreiben die meisten Autoren dem Progesteron (endo- oder exogener Herkunft) den größten Einfluß auf 16 die Literaturübersicht Mammatumorbildung zu. Die Applikation von Progesteronpräparaten zur Läufigkeitsunterdrückung kann, abhängig von dem Wirkstoff, der Dosis und der Behandlungsdauer, benigne Mammatumoren induzieren. Zum Einfluß auf die Genese maligner Geschwülste gibt es in der Literatur jedoch kontroverse Meinungen (GUTBERLET et al. 1998; NOLTE u. NOLTE 2000). Desweiteren wird eine Beteiligung von Prolaktin und dem Wachstumshormon Somatotropin an der Tumorgenese angenommen. So verkleinern sich laut GUTBERLET et al. (1998) unter Einsatz von Prolaktin-Hemmern zur Unterdrückung der Pseudogravidität klinisch manifeste Neoplasien der Mamma. Es ist beschrieben, dass während der ersten wenigen Geschlechtszyklen kleine Klone von präneoplastischen epithelialen Zellen entstehen, die sich nach einigen Jahren zu echten Tumoren entwickeln können (BOSTOCK 1986). Somit senkt eine Ovarektomie vor dem ersten Zyklus das Gesäugetumorrisiko auf 0,5 %, nach dem ersten Zyklus auf 8 % und wird sie erst nach dem zweiten Zyklus durchgeführt, auf 26 %. Bei späterer Kastration (ab 2,5 Jahren) ist kein protektiver Einfluß mehr festzustellen (BRODEY et al. 1983; MANN 1984; BOSTOCK 1986; MOULTON 1990; GUTBERLET et al. 1998). Weitere Faktoren sind genetische Prädisposition, virale, immunologische, diätische und umweltbedingte Einflüsse, Zyklusunregelmäßigkeiten und andere cancerogene Faktoren, welche im Einzelnen noch nicht abgeklärt sind (MANN 1984; GUTBERLET et al. 1998). Pathogenese Zu Beginn der Tumorgenese steht die Mutation eines Gens, die spontan, durch Einwirkung von chemischen Karzinogenen und physikalischen Noxen oder durch Viren bedingt sein kann. Die Mutation muß ein sogenanntes Proto-Onkogen betreffen, das normalerweise für ein die Zellteilung oder Zelldifferenzierung beeinflussendes Signalprotein kodiert. Ist ein ProtoOnkogen einmal mutiert bzw. aktiviert, so kann es nicht mehr deaktiviert werden und z. B. eine Zellteilung unkontrolliert fortsetzen. Normalerweise werden zur Unterdrückung der Onkogenwirkung in einer mutierten Zelle Tumorsuppressorgene aktiviert, die entweder durch anhaltende Stimulierung ein unkontrolliertes Wachstum verhindern oder die Apoptose der mutierten Zelle einleiten. Diese Suppressorgene können jedoch infolge einer Mutation inaktiviert werden, weshalb sie eine Umwandlung einer mutierten Zelle zu einer Tumorzelle nicht mehr verhindern können (MEURER 1999; SUTER 2001). 17 Literaturübersicht Die Besonderheit bei der Entstehung von caninen Mammatumoren besteht in der häufigen Beteiligung myoepithelialer Zellen an der neoplastischen Proliferation. Dieser Zustand ist bei Mammatumoren anderer Haustiere oder des Menschen seltener zu beobachten (FRESE et al. 1989; BOSTEDT 1994). Klinisch können die Neoplasien der Mamma bei der Hündin einzeln (∼75 %) oder multipel (∼25 %) vorkommen und variieren im Durchmesser. Bei der Palpation erscheinen sie meist als nicht schmerzhafte Gebilde und können als weich-fluktuierend bei zystischen Veränderungen auftreten, sind aber häufiger von derber Konsistenz mit glatter oder unregelmäßig höckriger Oberfläche (MacEWEN u. WITHROW 1996; GUTBERLET et al. 1998; ARNOLD 2001; SIMON et al. 2001 b). 2.1.4 Lokalisation, Rezidive und Metastasen Die Tumorhäufigkeit (über 80 % der Tumoren treten in den letzten drei, über 60 % in den letzten beiden Komplexen auf) und das Gewicht der Drüsenkomplexe nehmen von thorakal nach inguinal zu. Die bevorzugte Lokalisation in den hinteren Komplexen hängt möglicherweise mit den während des Zyklus größeren morphologischen Umbauprozessen zusammen (KÄLIN et al. 1985; GUTBERLET et al. 1998; SIMON et al. 2001 b). Laut ZANINOVIC und SIMCIC (1994) sind die kranial gelegenen Tumoren meist kleiner als Tumoren der kaudalen Komplexe und stellen eine größere Anzahl benigner und nicht neoplastischer Läsionen dar. Eine Seitendifferenz besteht nicht (GUTBERLET et al. 1998). Die prozentuale Beteiligung einzelner Mammakomplexe schwankt in der Literatur jedoch erheblich (ESKENS 1983): 1. Kranialer thorakaler Komplex: 3,0 – 14,3 % 2. Kaudaler thorakaler Komplex: 7,0 – 15,6 % 3. Kranialer abdominaler Komplex: 2,0 – 20,0 % 4. Kaudaler abdominaler Komplex: 4,0 – 32,7 % 5. Inguinaler Komplex: 17, 8 – 41,0 % ► Multiple Tumoren: 18,8 – 37,0 % 18 Literaturübersicht Die Neoplasien der Mamma können hämatogen, lymphogen oder lymphohämatogen metastasieren, wobei es primär zur lymphogenen Ausbreitung kommt. Vor allem Karzinome sowie der karzinomatöse Metastasenbildung Anteil (ARNOLD von 2001). malignen Nach einer Mischgeschwülsten tendieren Literaturzusammenstellung zu von MOULTON (1990) sind von metastasierenden Mammatumoren der Hündin folgende Organe betroffen: regionäre Lymphknoten (64 %), Lunge (53 %), Gehirn (15 %), Leber (13 %), Niere (11 %), Herz (11 %) und Skelett (10 %). Als Rezidive werden neugebildete, histologisch gleichwertige Tumoren bezeichnet, die an der selben Stelle entstehen, sie treten in ca. 20 % der operierten Fälle auf (KÄLIN et al. 1985). Ungefähr die Hälfte der rezidivierenden Tumoren wird als gutartig beurteilt, und eine Reoperation ist zu empfehlen (ARNOLD 2001). 2.1.5 Therapie Die derzeitigen Methoden der Mammatumorbehandlung erstrecken sich, ähnlich wie in der Humanmedizin, von operativen Maßnahmen über radiologische, immunologische und hormonelle Therapieformen bis hin zur Chemotherapie. In jedem Fall sollte vor Therapiebeginn röntgenologisch das Vorhandensein von Metastasen in der Lunge durch rechts- und linksanliegende latero-laterale sowie eine ventro-dorsale Aufnahme des Thorax abgeklärt werden. Die chirurgische Exstirpation des betroffenen Mammakomplexes oder der gesamten Gesäugeleiste wird nach wie vor als Therapie der Wahl angesehen, sollte aber nur durchgeführt werden, wenn keine Fernmetastasierung besteht (BOSTOCK u. OWEN 1976; BOSTEDT 1994, GUTBERLET et al. 1998, NOLTE u. NOLTE 2000). In der Humanmedizin ist die Strahlentherapie nach der Chirurgie die zweitwichtigste Behandlungsform von Neoplasien. Das Ziel ist es, den Tumor bei maximaler Schädigung möglichst selektiv zu treffen und das umgebende gesunde Gewebe zu schonen (MANN 1984; KASER-HOTZ 2001). Bei der Entwicklung des Strahleneffektes im Gewebe spielen Anregung und Ionisation von Molekülen und Bildung von Radikalen eine wesentliche Rolle, wobei die Schädigung der DNS für die Zellabtötung entscheidend ist (KASER-HOTZ 2001). Diese lokale Tumorbehandlung kann alleine oder in Kombination mit der Chirurgie oder der Literaturübersicht 19 Chemotherapie angewendet werden (HIRSCHFELD et al. 2001; SIMON et al. 2001 a). In der Veterinärmedizin wird die Radiotherapie nicht routinemäßig zur Behandlung von Mammatumoren genutzt, jedoch ist ein palliativer Einsatz bei inoperablen oder stark entzündlich veränderten Neoplasien der Mamma möglich (SIMON et al. 2001 b). Bei sehr invasiven Tumoren kann die Prognose der chirurgischen Therapie durch eine präoperative Bestrahlung verbessert werden (HIRSCHFELD et al. 2001). Die Immuntherapie umfaßt einerseits die Stimulation des unspezifischen Immunsystems und andererseits die Elimination von Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen aus dem Serum der erkrankten Patienten. Dadurch wird die Effektivität der natürlichen Immunantwort und somit die Tumorabwehr gesteigert (FERGUSON 1985; LOAR 1986; KURTH et al. 2000). Allerdings brachten Untersuchungen, beispielsweise mit dem unspezifischen Immunstimulator Levamisol und der bakteriellen Vakzine aus Bacillus Calmette-Guerin (BCG), im Vergleich zu alleiniger chirurgischer Versorgung der caninen Mammatumoren, keine besseren Ergebnisse. Auch dem liposomenumhüllten Muramyltripeptidphosphatidylethanolamin (L-MTP-PE), eine bakterielle Zellwandeinheit mit makrophagenstimulierender Aktivität, konnte beim Mammatumor des Hundes bisher kein Effekt nachgewiesen werden (LOAR 1986; SIMON 2001 b). Die häufig in der Humanmedizin angewandte Hormontherapie mit dem nicht steroidalen Antiöstrogen Tamoxifen hat bisher keine überzeugende Wirkung am Hund gezeigt. Das liegt einerseits daran, dass höher maligne canine Mammatumoren häufig rezeptornegativ sind, da mit zunehmender Größe und Entdifferenzierung der Tumoren der Hormonrezeptorstatus sinkt. Somit fehlt gerade bei den höher malignen Tumoren, bei denen zur Chirurgie eine zusätzliche Therapie wünschenswert wäre, der Ansatzpunkt. Andererseits besteht die Gefahr starker Nebenwirkungen wie Harninkontinenz, Infektionen der abführenden Harnwege, Verhaltensänderungen, Alopezien, Vaginalschwellungen, -ausfluß und -blutungen mit dem Risiko einer Pyometra (BOSTEDT 1994; GUTBERLET et al. 1998; WEY et al. 2000; NOLTE u. NOLTE 2000; SIMON et al. 2001 b). Bisher gibt es wenig klinische Studien, die die Wirksamkeit einer Chemotherapie bei Hunden mit Gesäugetumoren belegen (FERGUSON 1985; MacEWEN u. WITHROW 1996; RAVIKUMAR et al. 2000). So wurde die Chemotherapie zur Behandlung caniner 20 Literaturübersicht Mammatumoren bisher nur palliativ meist bei inoperablen, metastasierenden Tumoren eingesetzt (NOLTE u. NOLTE 2000; HIRSCHBERGER 2001). Die kurative Therapie, wie sie in der Humanmedinzin durchgeführt wird, ist laut HIRSCHBERGER (2001) hochtoxisch, intensivmedizinisch sehr aufwendig und so bei Hunden schlecht möglich. Doxorubicin, Cyclophosphamid oder Cisplatin sind Wirkstoffe, bei denen eine minimale antitumorale Aktivität bei Hunden mit Gesäugetumoren festgestellt wurde (LOAR 1986; MacEWEN u. WITHROW 1996; RAVIKUMAR et al. 2000; NOLTE u. NOLTE 2000; SIMON et al. 2001 b). Therapiepläne, die zu einer definitiven Remission oder Lebenszeitverlängerung führen, gibt es gegenwärtig noch nicht. Derzeit laufen Studien der Fachgruppe Kleintierkrankheiten der DVG zur adjuvanten postoperativen Chemotherapie von Hunden mit malignen invasiven Mammatumoren mit den Substanzen Doxorubicin und Docetaxel (SIMON et al. 2001 b). 2.1.6 Prognose Wichtige Kriterien für die Prognose in der Humanmedizin sind Tumorgröße, Metastasierung in regionäre Lymphknoten sowie das Vorhandensein von Fernmetastasen. Ähnlich wie beim Menschen gibt es auch beim Hund eine signifikante Korrelation zwischen Größe des Primärtumors und der Überlebenszeit. Die weiteren Faktoren zur prognostischen Einschätzung beim Hund sind Anzahl, Lokalisation, histologischer Tumortyp, -größe, -stadium, -grad, steigendes Lebensalter, Lymphknotenbefall und Veränderungen der Haut wie Rötung oder Ulzeration. Demzufolge haben Hündinnen mit kleinen (< 3 cm), gut abgesetzten und differenzierten Tumoren ohne Lymphknotenmetastasen bei positivem Östrogen- oder Progesteronrezeptornachweis eine gute Prognose. Ungünstig sind dagegen schnell wachsende, große, lokal infiltrierende Tumoren mit einer Differenzierungsabnahme der Zellen, Nekrose, Lymphknotenbefall und Ulzeration (MANN 1984; FRESE et al. 1989; MacEWEN u. WITHROW 1996; GUTBERLET et al. 1998; NOLTE u. NOLTE 2000). 2.1.7 Klassifikation Klinisch lassen sich Mammatumoren nur vage beurteilen. Da sie in vielen verschiedenen morphologischen und histologischen Erscheinungsformen auftreten können, ist eine eindeutige Einteilung anhand klinischer Kriterien schwer. Vergleichsschwierigkeiten bestehen unter anderem auch darin, dass es von verschiedenen Autoren unterschiedliche 21 Literaturübersicht Klassifikationssysteme gibt. Eine einheitliche Tumorklassifikation ist sinnvoll, um z. B. Diagnosen von verschiedenen Untersuchern miteinander vergleichen zu können (SCHOENBAUER 1984; REINACHER 2001). Die vorliegende Arbeit orientiert sich an der neuen Klassifikation der WHO (World Health Organisation) (MISDORP et al. 1999). Nachfolgend werden die einzelnen Tumoren kurz beschrieben, wobei die Tumoren, die in die vorliegende Studie einbezogen wurden, mit * gekennzeichnet sind. 2.1.7.1 Maligne Tumoren Die malignen Tumoren lassen sich wie folgt unterteilen (MISDORP et al. 1999): - epithelial: - Nichtinfiltratives Karzinom (2.1.7.1.1) - Komplexes Karzinom* (2.1.7.1.2) - Einfaches Karzinom (2.1.7.1.3): Tubulopapilläres Karzinom* Solides Karzinom* Anaplastisches Karzinom - Spezielle Karzinomtypen (2.1.7.1.4): Spindelzellkarzinom Plattenepithelkarzinom* Muzinöses Karzinom Fettreiches Karzinom - mesenchymal: - Sarkom (2.1.7.1.5): Fibrosarkom Osteosarkom andere Sarkome - Mischformen: - Karzinosarkom (2.1.7.1.6) - Karzinom oder andere Sarkome in benignen Tumoren (2.1.7.1.7) 22 Literaturübersicht 2.1.7.1.1 Nichtinfiltratives Karzinom Hierbei handelt es sich um eine epitheliale Neubildung, deren neoplastische Zellen nicht bis auf die Basalmembran vordringen. Diese häufig multizentrischen Läsionen können in Gänge oder Lappen, oder in dilatierte Gänge oder Zysten einwachsen. Die Tumorzellen können in verschiedenen Mustern angeordnet sein. Beschrieben sind siebförmige oder solide Wuchsformen mit und ohne zentrale Nekrose sowie enganliegend an den Basalmembranen ausgerichtete Tumorzellen. 2.1.7.1.2 Komplexes Karzinom Das komplexe Karzinom ist aus zwei Komponenten zusammengesetzt, der luminal epithelialen und der myoepithelialen. Die luminalen Epithelzellen können tubulopapillär oder solide angeordnet sein. Die Myoepithelzellen, meist vom Spindelzelltyp, sind häufig in mehr oder weniger sternförmigen, netzartigen Mustern ausgerichtet. Schuppenförmige Metaplasien kommen gelegentlich vor. Expansives, lobuliertes Wachstum ist ganz häufig, wohingegen Einbrüche in Lymphgefäße eher selten sind. Die Unterscheidung zwischen hochdifferenzierten komplexen Karzinomen und komplexen Adenomen kann sehr schwer sein. Das Fehlen einer Kapsel, infiltratives Wachstum, hohe Zellrate, Nekroseherde und hohe Mitoseraten sind Indikatoren für Malignität. Dieser Tumortyp kommt relativ häufig bei Hunden vor. 2.1.7.1.3 Einfache Karzinome Unter einem einfachen Karzinom werden die Tumortypen zusammengefaßt, die nur aus einem Zelltyp zusammengesetzt sind. Dies können luminale Epithelzellen oder Myoepithelzellen sein. Die Stromamenge kann dabei erheblich schwanken. Um den Tumor herum treten Lymphozytenansammlungen, in Verbindung mit oder ohne Nekrose auf. Diese Tumoren haben eine starke Tendenz, umliegende Gewebe und Gefäße zu infiltrieren. Basierend auf ihrer Differenzierung und ihrem biologischen Verhalten, können einfache Karzinome in Kategorien mit steigender Malignität eingestuft werden: tubulopapillär – solide – anaplastisch. Literaturübersicht 23 Tubulopapilläres Karzinom: Dieser Karzinomtyp ist charakterisiert durch die Anordnung von tubulären und/oder papillären Wuchsformen. Diese Gruppe kann unterteilt werden in tubuläre Karzinome, welche keine papillären Elemente besitzen und papilläre Karzinome, welche ohne tubuläre Komponenten sind. Beim Hund kann das tubuläre Karzinom von Wucherungen aus Bindegewebs-Fibroblasten begleitet sein. Der papilläre Typ, bei dem der bindegewebige Anteil normalerweise gering ist, kommt häufig beim Hund vor. Solides Karzinom: Das solide Karzinom ist durch die Anordnung von Tumorzellen in soliden Platten, Strängen oder Nestern charakterisiert. Der Anteil des Bindegewebes reicht von gering- bis mittelgradig. Einige solide Karzinome sind aus Zellen mit stark vakuolisiertem Zytoplasma zusammengesetzt. Dieser Tumor kommt sehr häufig bei Hunden vor. Anaplastisches Karzinom: Ein anaplastisches Karzinom ist ein hochinfiltratives Karzinom aus pleomorph neoplastischen Zellen, welches nicht in eine von den anderen Karzinomgruppen eingeordnet werden kann. Das histologische Bild entspricht einer diffusen infiltrativen Neoplasie, die zusammengesetzt ist aus großen pleomorphen Zellen, meist mit bizarren chromatinreichen Zellen. Das Auftreten von mehrkernigen Zellen ist für diesen Tumor nicht ungewöhnlich. 2.1.7.1.4 Spezielle Karzinomtypen Spindelzellkarzinom: Ein maligner Tumor, der aus Spindelzellen zusammengesetzt ist, die häufig in epithelialen Mustern angeordnet sind. Einige Spindelzellen sind solide angeordnet, während andere auch Kanälchen einschließen können. Es ist wahrscheinlich, dass einige Spindelzellkarzinome myoepithelialen Ursprungs sind. Dieser Tumor ist relativ selten bei Hunden. Plattenepithelkarzinom: Ein Plattenepithelkarzinom besteht aus soliden Platten und Strängen epithelialer Zellen, die fokale Differenzierung zu Keratinlamellen und Hornperlen aufweisen. Basalzellen sind 24 Literaturübersicht überwiegend in den peripheren Teilen der Platten. Der zentrale Teil besteht aus lamellenartigem Keratin mit erkennbaren, nekrotischen Tumorzellen. Die meisten Plattenepithelkarzinome sind vom hochinfiltrativen Typ, lymphatische Einbrüche sind häufig. Einige der Plattenepithelkarzinome scheinen vom Strichkanal auszugehen. Da Plattenepithelkarzinome auch eine starke Infiltration mit Neutrophilen aufweisen können, müssen sie von schuppigen Metaplasien der großen Gänge, verursacht durch Entzündungen, unterschieden werden. In der peripheren Zellschicht der Karzinome finden sich häufig atypische Zellen, die in das Nachbargewebe eindringen. Muzinöses Karzinom: Das muzinöse Karzinom kommt als einfacher oder komplexer Typ vor und ist durch reichlich Muzinproduktion charakterisiert, die oft schon makroskopisch erkennbar ist. Der Schleimanteil kann hierbei epithelialer oder myoepithelialer Natur sein. Dieser Tumor kommt selten bei Hunden vor. Fettreiches Karzinom: Dieser Karzinomtyp ist durch das Auftreten von Zellen mit reichlich vakuolisiertem Zytoplasma, das eine große Menge von neutralem Fett beinhaltet, charakterisiert. Es handelt sich um einen bei Hunden seltenen Tumortyp. 2.1.7.1.5 Sarkome Fibrosarkom: Hierbei handelt es sich um einen von Fibroblasten ausgehenden malignen Tumor, der eine variable Kollagenmenge enthalten kann. Solche Tumortypen sind aus Spindelzellen zusammengesetzt, die Retikulin- und Kollagenfasern bilden. Die Fasern können parallel oder willkürlich angeordnet sein. In einigen Tumoren sind konzentrische Anordnungen der Fasern um proliferierte Blutgefäße, ähnlich dem Hämangiopericytom, zu sehen. Fibrosarkome und Osteosarkome sind die häufigsten bei Hunden vorkommenden Mammasarkome. 25 Literaturübersicht Osteosarkom: Ein Sarkom ist charakterisiert durch neoplastische Zellen in Osteoid- und/oder Knochenformation. Diese Sarkome sind entweder nicht kombinierte reine Osteosarkome oder kombinierte Tumoren, die aus malignen knöchernen und knorpeligem Gewebe zusammengesetzt sind. Außerdem kann malignes fibröses Gewebe und/oder adipöses Gewebe vorhanden sein. Im allgemeinen erscheint das Zentrum der Matrix dicht, während die zellreichen Bereiche in der Peripherie lokalisiert sind. Pleomorphismus und mitotische Aktivität stehen hier im Vordergrund. Andere Sarkome: Reine Chondrosarkome und Liposarkome sind in der Mamma sehr selten. 2.1.7.1.6 Karzinosarkom Ein Karzinosarkom ist ein morphologisch sowohl durch maligne epitheliale Komponenten (luminal und/oder myoepithelial) als auch durch maligne mesenchymale Anteile charakterisierter Tumor. Ein Gemisch von allen Arten von karzinomatösen und sarkomatösen Komponenten kann vorkommen. Dieser Tumor zeigt eine starke Variabilität sowohl seiner epithelialen als auch der mesenchymalen Anteile. 2.1.7.1.7 Karzinom oder Sarkom in benignen Tumoren Hierbei handelt es sich um Tumoren mit maligne erscheinenden Zellherden oder einzelnen Knoten von solchen Zellen, die in benignen Mischtumoren vorkommen. Häufig ist schwer zu unterscheiden, ob die maligne Komponente aus einem benignen Tumor entstanden ist oder in diesen eingebrochen ist. Die Malignität kann zum Zeitpunkt der histologischen Untersuchung den benignen Tumor größtenteils ersetzt haben. 26 Literaturübersicht 2.1.7.2 Benigne Tumoren Die benignen Tumoren lassen sich wie folgt unterteilen (MISDORP et al. 1999): - epithelial: - Adenom (2.1.7.2.1): Einfaches Adenom* Komplexes Adenom* Basaloides Adenom - Mischformen: - Fibroadenom (2.1.7.2.2): zellarmes Fibroadenom zellreiches Fibroadenom - Benigne Mischtumoren* (2.1.7.2.3) - Gangpapillom (2.1.7.2.4) 2.1.7.2.1 Adenome Einfaches Adenom: Ein einfaches Adenom stellt eine benigne Neoplasie aus gut differenzierten luminalen Epithelzellen vom einfach tubulären Typ oder aus myoepithelialen Zellen dar. Komplexes Adenom: In komplexen Adenomen hingegen bestimmen luminale epitheliale Zellen und myoepitheliale Zellen das Zellbild. Komplexe Adenome kommen häufiger vor als einfache und stellen oft Übergangsformen zu benignen Mischtumoren dar. Sie sind schwierig gegenüber Hyperplasien, Papillomen und malignen Mischtumoren abzugrenzen. Basaloides Adenom: Basaloide Adenome bestehen aus einheitlichen basalen Epithelzellen, die in gleichförmigen Strängen und Nestern angeordnet sind. Die peripheren Zellen sind palisadenartig an der dünnen Basallamina orientiert, während die zentral liegenden Zellen schuppige und drüsige Differenzierungen zeigen können. Diese Tumoren sind normalerweise klein, gut umschrieben und neigen nicht zur Metastasierung. Literaturübersicht 27 2.1.7.2.2 Fibroadenom Ein aus einem Gemisch von luminalen epithelialen Zellen und Bindegewebszellen bestehender benigner Tumor, dem manchmal myoepitheliale Zellen beigemischt sein können. Diese peri- und intrakanalikulären Tumoren sind relativ selten. 2.1.7.2.3 Benigne Mischtumoren Dieser Tumor ist zusammengesetzt aus benignen Zellen mit morphologisch gleichen epithelialen Komponenten (luminalen und/oder myoepithelialen) und mesenchymalen Zellen, die Knorpel und/oder Knochen und/oder Fett eventuell in Kombination mit fibrösem Gewebe produzieren. Sie wachsen langsam und sind im allgemeinen von einer bindegewebigen Kapsel umgeben. 2.1.7.2.4 Gangpapillom Ein Gangpapillom ist ein in einem dilatierten Gang vorkommender, verzweigter oder lobulierter, einfacher oder komplexer benigner Tumor. Diese Tumoren kommen nicht sehr häufig vor. 28 2.2 Literaturübersicht HER2 Rezeptor Das Proto-Onkogen HER2 (Humaner Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2), auch als cerbB-2 oder HER2/neu-Gen bezeichnet, wurde zuerst in Neuroblastomen der Ratte nachgewiesen, daher die Bezeichnung neu. Beim Menschen ist es auf dem Chromosom 17 q11.2-q21 lokalisiert (POPESCU et al. 1989; NAKOPOULOU et al. 1996) und kodiert für den membranständigen Rezeptor HER2, der von zahlreichen epithelialen Zellen exprimiert wird. Hierbei handelt es sich um ein transmembranes Glykoprotein mit einer Größe von 185 Kilodalton (kD), das aus einer äußeren cysteinreichen Domäne, einer einzelnen lipophilen Transmembrandomäne und einer intrazellulären Domäne mit Tyrosinkinaseaktivität besteht. Der Rezeptor ist für die Regulation verschiedener Aspekte des Zellwachstums verantwortlich, und gilt als ein Verstärker epithelialer Wachstumsfaktoren und wichtiger Regulator der Proliferation und Differenzierung epithelialer Zellen. Er gehört zur EGFR-Familie (Epidermal Growth Factor Receptor), die aus 4 Mitgliedern besteht: EGFR/erbB-1/HER1, erbB2/neu/HER2, erbB-3/HER3 und erbB-4/HER4. Alle Mitglieder sind transmembrane Tyrosinkinase-Rezeptoren, die als Monomere in der Plasmamembran existieren und wichtige Regulatoren für Zellwachstum, Überleben, Differenzierung und Migration der Zellen sind. Die HER-Aktivierung ist gewöhnlich von der Präsenz von sog. Liganden und anderen Rezeptoren der HER-Familie abhängig. Nach der Ligandenbindung können die vier Rezeptoren untereinander zehn unterschiedliche Rezeptor-Dimere bilden, entweder Homodimer (z. B. HER1-HER1) oder Heterodimer (z. B. HER1-HER2). Trotz der strukturellen Homologie haben die Mitglieder der HER-Familie unterschiedlich spezielle Liganden. HER1 bindet hauptsächlich EGF, TGF-α und AR, während HER3 und HER4 überwiegend HRG und seine Isoformen binden. Ein Ligand, der speziell mit HER2 interagiert ist bisher nicht identifiziert (AKIYAMA et al. 1986; SLAMON et al. 1987; HYNES u. STERN 1994; NAKOPOULOU et al. 1996; KAUFMANN u. KANZ 2000; KLAPPER et al. 2000; WANG u. HUNG 2001; KUMAR u. YARMAND-BAGHERI 2001; YARDEN 2001; CIARDIELLO u. NORMANNO 2002; MENARD et al. 2003). 29 Literaturübersicht Definition von HER2: In der Literatur findet sich keine einheitliche Nomenklatur für das HER2 Gen und Protein. Eine Aufstellung der gebräuchlichen Bezeichnungen ist in Tabelle 1 dargestellt. In dieser Arbeit wird nicht die jeweils vom Autor der zitierten Literaturstelle verwendete Nomenklatur benutzt, sondern die einheitliche Bezeichnung HER2 Gen und HER2 Protein bzw. HER2 Rezeptor verwendet. Tabelle 1: Gebräuchliche Bezeichnungen für HER2 Gen und Protein HER2 Gen HER2 Protein HER2 Proto-Onkogen HER2 Rezeptor HER2/neu HER2 c-erbB-2 ErbB-2 neu Neu p185HER2 HER2 Wirkmechanismus: Die HER-Liganden sind bivalente Moleküle. Sie haben eine N-terminale Seite, die mit einer hohen Affinität und engen Spezifität direkt an die Rezeptoren HER1, HER3 oder HER4 bindet. Während die C-terminale Seite mit einer niedrigen Affinität und geringen Spezifität ein Homo- oder Heterodimerisationspartner rekrutiert, welches in den meisten Fällen HER2 ist (YARDEN 2001). Durch die Interaktion des extrazellulären Teils des Rezeptors mit dem Liganden (z. B. EGF, AR) kommt es zu einer Dimerisierung zweier Rezeptoren und zu deren Aktivierung. Daraufhin werden in der Zelle Transkriptionsfaktoren aktiviert, die die normale Zellproliferation beeinflussen (Abb. 1). HER1 kann sowohl mit dem HER1 Rezeptor interagieren und diesen homodimerisieren, als auch mit HER2, HER3 oder HER4 zu einem Heterodimer führen. Hierbei gibt es eine Präferenz für die Interaktion mit HER2 als Bindungspartner für alle anderen HER Rezeptoren. Diese Präferenz für HER2 als Co-Rezeptor für ein Heterodimer hängt mit der 30 Literaturübersicht geringen Spezifität des Rezeptors und der Abwesenheit von HER2 spezifischen Liganden zusammen. HER2 als Bindungspartner eines solchen Heterodimers zeichnet sich durch besondere Stabilität aus, da der Ligand langsamer vom Komplex abdissoziiert und dadurch die Signalgebung deutlich stärker ist und länger dauert, als Signale aus einem HER1 Rezeptor-Homodimer (KAUFMANN u. KANZ 2000; KLAPPER et al. 2000; BLOOM et al. 2001; WANG u. HUNG 2001; YARDEN 2001; YU 2001; CIARDIELLO u. NORMANNO 2002). Abb. 1: HER – Rezeptor Signalübertragungsweg. Durch die Bindung des Liganden an den extrazellulären Teil des Rezeptors kommt es zu einer Dimerisierung zweier Rezeptoren und damit zu deren Aktivierung. Daraufhin werden in der Zelle Transkriptionsfaktoren aktiviert, welche die normale Zellproliferation beeinflussen. Nachdem der Ligand an den Rezeptor gebunden ist und die Signalübertragung stattgefunden hat, wird das Rezeptordimer in die Zelle aufgenommen und dieses Vesikel bildet das erste Endosom. Im Endosom wird der Ligand vom Rezeptor getrennt, entweder gelangt der Rezeptor nun zurück zur Zelloberfläche, oder er wird mit dem Ligand zum Lysosom transportiert und dort abgebaut. Ein HER1/HER2 Heterodimer dissoziiert leicht in einem Endosom bei einem pH-Wert von 5,5 und ermöglicht dadurch eine schnelle Wiederkehr des Rezeptors an die Zelloberfläche. Ein HER1/HER1 Homodimer dagegen besitzt eine größere Stabilität unter diesen Bedingungen und wird dann im Lysosom abgebaut (KLAPPER et al. 2000). 31 Literaturübersicht Unter normalen Bedingungen arbeitet das HER-Signal wie ein Netzwerk, welches die Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen vermittelt, wie z. B. die Wechselwirkung zwischen Neuron und Muskelzelle an der neuromuskulären Synapse. Diese Interaktion ist im untergehenden maligne transformiertem Gewebe unkontrolliert. Der HER1 Rezeptor ist im Verhältnis zum HER2 Rezeptor in Tumorzellen häufig unterpräsentiert, was dazu führt, dass HER2 häufiger in ein Dimer rekrutiert wird und demzufolge ein stärkeres Signal entsteht, welches den Zellzyklus antreibt (KLAPPER et al. 2000; KAUFMANN u. KANZ 2000). Gründe für eine HER2 Überexpression: Die Mehrheit der Mammakarzinompatientinnen mit einer HER2 Proteinüberexpression zeigt auch eine HER2 Genamplifikation. Allerdings kommt bei ca. 3-5 % dieser Patientinnen mit HER2 Proteinüberexpression keine HER2 Genamplifikation vor, was auf eine transkriptionale oder posttranskriptionale Dysregulation hinweisen würde (SLAMON et al. 1989; BLOOM et al. 2001). Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die zu einer Überexpression des HER2 Proteins führen können. Auf genetischer Ebene kann es z. B. durch Mutation zu einer Vermehrung des HER2 Gens (Genamplifikation) kommen. Das bedeutet, dass im Nukleus mehr als die üblichen zwei Kopien des HER2 Gens zu finden sind, wodurch es dementsprechend zu einer höheren Konzentration von mRNA kommt und damit zu einer verstärkten Synthese und Überexpression des Rezeptors an der Zelloberfläche. Auch eine transkriptionale Aktivierung (verstärkte Aktivierung des HER2 Gens/Genexpression) ohne genetische Veränderungen ist möglich, bei der es aufgrund eines Transkriptionfaktors zu einer gesteigerten Transkription kommt. Hierbei wird mehr mRNA als üblich produziert, woraufhin mehr HER2 Rezeptoren synthetisiert werden können. Als metabolischen Grund könnte man hier noch die schon erwähnte schnellere Wiederkehr des Rezeptors nach der Signalübertragung zur Zelloberfläche anführen, was allerdings keine Überexpression im eigentlichen Sinne darstellt (SLAMON et al. 1989; HYNES u. STERN 1994; KLAPPER et al. 2000; BLOOM et al. 2001; NEVE et al. 2001; VAN DE VIJVER 2001). 32 2.2.1 Literaturübersicht Nachweismethoden (Hercep, FISH) Die HER2-Überexpression lässt sich auf allen Ebenen nachweisen, von der genomischen Ebene über die Transkription und Translation bis zum funktionsfähigen Rezeptor. Die Genamplifikation kann durch Southern blot (SLAMON et al. 1989), PCR (OKUYAMA et al. 1999), FISH (PAULETTI et al. 1996; FIELD et al. 2001; LEHR et al. 2001) und CISH (TANNER et al. 2000) bestimmt und hohe mRNA-Level durch Northern blot (SLAMON et al. 1989) und RT-PCR (BIECHE et al. 2003) erkannt werden. Die Rezeptorexpression kann durch Western blot (SLAMON et al. 1989; LEITZEL et al. 1992) oder durch die Immunhistochemie (FIELD et al. 2001; LEHR et al. 2001) bestimmt werden. Fragmente des Rezeptors lassen sich mittels ELISA (LEITZEL et al. 1992; VAN DE VIJVER 2002) im Serum feststellen. Indikatoren für den HER2 Status demonstriert Abb. 2 (SLAMON et al. 1989; JARDINES et al. 1993; ROSS u. FLETCHER 1999; DIAZ 2001; HANNA 2001; ONODY et al. 2001; VAN DE VIJVER 2001; YAMAUCHI et al. 2001; BILOUS et al. 2003). (modifiziert nach VAN DE VIJVER 2001) Abb. 2: HER2 Status. Darstellung einer normalen und einer Zelle mit Amplifikation des HER2 Gens, erhöhter Konzentration der HER2-mRNA und Überexpression des HER2 Rezeptors. Literaturübersicht 33 Im Folgenden werden die zur Zeit in der Humanmedizin gängigen HER2 Nachweismethoden näher erläutert. Immunhistochemische Methode: Der Hercep Test Bei der Immunhistochemie (IHC) werden farbmarkierte Antikörper eingesetzt, um die HER2Überexpression auf den Tumorzellen im Gewebe zu zeigen. Anschließend wird die Intensität der Membranfärbung sowie die Anzahl der angefärbten Zellen mikroskopisch beurteilt. Die Lokalisation des Rezeptors auf der Zelloberfläche bildet dabei die Basis für dieses Verfahren. Ein zur Zeit kommerziell verfügbarer und von der FDA zugelassener Test für diese immunhistochemische Methode ist der standardisierte Hercep TestTM-Kit der Firma DakoCytomation. Dieser Kit ist ein semi-quantitatives immunohistochemisches Testsystem zur Bestimmung der Überexpression des HER2 Proteins im unzerstörten Tumorgewebe. Hierbei handelt es sich um eine indirekte Nachweismethode der HER2 Proteinüberexpression, bei der der enzymkonjungierte sekundäre Antikörper die Position des unkonjungierten Primärantikörpers im Gewebe markiert. Der Vorteil der IHC gegenüber anderen Testverfahren ist die Tatsache, dass sie leicht an formalinfixiertem, in Paraffin eingebetteten Geweben durchgeführt werden kann, und dies auch der üblichen Probenverarbeitung und -aufbewahrung entspricht (HANNA 2001; DIAZ 2001). Ein positives Ergebnis der Tests bildet die Voraussetzung für eine Therapie mit Herceptin. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) Hierbei wird die HER2 Genamplifikation mit Hilfe von Antikörpern nachgewiesen, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind. Bei dieser Methode lässt sich feststellen, ob im Zellkern die üblichen zwei Kopien des HER2 Gens oder aber eine Vielzahl von HER2 Genkopien vorkommen. Jede Kopie des HER2 Gens ist als fluoreszierendes Signal nach der Färbereaktion unter dem Fluoreszenzmikroskop zu erkennen. Bei dieser Technik muß die Ziel-DNA, die im Präparat erkannt werden soll, als Einzelstrang vorliegen, was durch Hitzedenaturierung erreicht wird. Im folgenden Renaturierungsschritt wird die Ziel-DNA mit der durch Markermolekülen markierten Sonden-DNA wieder zu einem Doppelstrang vereint. Die markierten Nukleotide werden dann durch speziell für diese 34 Literaturübersicht Markermoleküle spezifischen Antikörper sichtbar gemacht (FIELD et al. 2001; LEHR et al. 2001). Diese Methode kann notwendig werden, wenn die immunhistochemischen Ergebnisse nicht eindeutig sind oder wenn die Ursachen genau bestimmt werden sollen. 2.2.2 HER2 Rezeptor beim Mammatumor der Frau Brustkrebs kommt bei ca. jeder achten Frau in den USA vor und ist eine häufige Todesursache. Seit 1987 ist in den USA und Großbritannien zwar eine deutliche Abnahme der Mortalitätsraten des Mammakarzinoms zu beobachten, was vermutlich auf frühzeitigere Diagnose und verbesserte Behandlungsmethoden zurückzuführen ist. Dennoch steht es in der Todesursachenstatistik der Frauen in den USA an zweiter Stelle hinter dem Lungenkrebs (JARDINES et al. 1993; NAKOPOULOU et al. 1996; McKEAGE u. PERRY 2002). Das HER2 Protein ist an der normalen Brustentwicklung und am Brustwachstum beteiligt (MENARD et al. 2001 b). In normalen epithelialen Zellen ist die HER2 Expression gering, aber eine Reihe von verschiedenen epithelialen Tumoren zeigen eine bemerkenswert zunehmende Rezeptor-Expression bis zu dem 100-fachen Normalwert (KLAPPER et al. 2000; NEVE et al. 2001). Die normale Expression auf der Zelloberfläche einer Mammaepithelzelle liegt zwischen 20.000 – 100.000 Rezeptoren/Zelle (BLOOM et al. 2001). Bei 20-30 % der Patientinnen mit invasivem Mammakarzinom läßt sich eine Überexpression des HER2 Proteins an den Tumorzellen nachweisen (SLAMON et al. 1987, 1989; BLOOM et al. 2001; KUMAR u. YARMAND-BAGHERI 2001). Die Überexpression des HER2 Proteins und die HER2 Genamplifikation sind sowohl für den Krankheitsbeginn als auch den –verlauf verantwortlich. Ein positiver HER2 Status gilt als ein unabhängiger prognostischer Indikator für einen schlechteren Krankheitsverlauf und ist ein prädiktiver Faktor. So geht er mit besonders aggressivem Tumorwachstum und einem z. T. schlechteren Ansprechen auf bestimmte Chemotherapieprotokolle einher. Aufgrund dessen haben Patientinnen mit solchen Tumoren eine verkürzte Gesamtüberlebenszeit und damit eine schlechtere Prognose (SLAMON et al. 1987, 1989; HYNES u. STERN 1994; BLOOM et al. 2001; SCHOLL et al. 2001; WANG u. HUNG 2001; McKEAGE u. PERRY 2002). Speziell für solche Patientinnen mit metastasierendem Brustkrebs wurde in der Humanmedizin der Hercep Test zum HER2 Rezeptornachweis entwickelt und dient als 35 Literaturübersicht Entscheidungshilfe für eine Herceptintherapie. Zahlreichen Studien zufolge profitieren Patientinnen mit einer HER2-Überexpression vom Grad 3+ im IHC-Test oder einem positiven HER2 Ergebnis im FISH-Test mehr von einer Trastuzumab-Therapie, als Patientinnen mit einer Überexpression vom Grad 2+ ohne HER2 Genamplifikation (VOGEL et al. 2001; McKEAGE u. PERRY 2002; BILOUS et al. 2003). 2.2.3 HER2 Rezeptor beim Mammatumor der Hündin Das HER2 Protein wurde bereits in früheren Studien bei epithelialen Tumorzellen in caninen Mammatumoren nachgewiesen. AHERN et al. (1996) untersuchte bei caninen Mammatumoren mit Hilfe eines Nukleinsäure Dot Blots, ob Malignität mit oder ohne lokale Invasion oder regionale Metastasen in Verbindung mit einer Mammatumorgewebeproben HER2 als Genüberexpression auch stehen. Mammatumorzelllinien Es in wurden die sowohl Untersuchung einbezogen, um den potentiellen Nutzen einer HER2 Genexpressionsmessung, durch Bestimmung der mRNA Menge, als diagnostisches Hilfsmittel oder prognostischen Indikator bezüglich der Malignität zu prüfen. Der HER2 mRNA Level wurde durch die Anlagerung einer radioaktiven Sonde über einen Dot Blot bestimmt und mittels autoradiographischer Dichtemessung quantifiziert. Eine Genüberexpression, bzw. erhöhter mRNA Level wurde bei 17 von 23 malignen Tumoren, 0 von 5 benignen und 2 von 7 Mammatumorzelllinien entdeckt. So konnte eine Beziehung zwischen der HER2 Genüberexpression und der Malignität, aber keine zwischen HER2 Genüberexpression und lokaler Invasion oder regionalen Metastasen festgestellt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine HER2 Genüberexpression vor der Entstehung von Metastasen vorkommt und eine Rolle bei der Entwicklung der Malignität spielt. Die Tatsache, dass bei einigen malignen Tumoren keine HER2 Genüberexpression festgestellt wurde, spricht dafür, dass auch eine maligne Transformation unabhängig von einer HER2 Genüberexpression vorkommen kann. RUNGSIPIPAT et al. (1999) hingegen führte immunhistochemische Untersuchungen durch. Er benutzte eine modifizierte SABC-Methode, bei der polyklonale Antikörper (Kaninchen Anti-Human HER2) gegen das HER2 Protein eingesetzt wurden. Auf einer Skala von 1+ bis 36 Literaturübersicht 4+ fand anschließend eine Bewertung der Membranfärbung statt. Es wurde bei 79 untersuchten Mammatumoren eine HER2 Überexpression bei 50 % der benignen und 19,1 % der malignen Tumoren festgestellt. Der Prozentsatz der caninen malignen Tumoren, die in dieser Studie eine Überexpression zeigten, ist gleich dem der humanen Mammatumoren (2030 %), aber geringer als bei caninen Mammatumoren, die von anderen Arbeitsgruppen beschrieben wurden (AHERN et al. 1996; MOKBEL u. HASSANALLY 2001). Über die Lokalisation des HER2 Gens beim Hund gibt es in der Literatur im Gegensatz zum Menschen allerdings unterschiedliche Aussagen. Laut TAP et al. (1998) ist das canine HER2 Gen auf Chromosomen 23 lokalisiert. YANG et al. (1999) stellte eine Homologie zwischen dem humanen Chromosom 17, auf welchem das HER2 Gen lokalisiert ist, und den caninen Chromosomen 5 und 9 fest. ESCOBAR et al. (2001) hingegen konnte aufgrund seiner FISH Untersuchungen keine Signale an diesen Chromosomen entdecken. Er lokalisierte das HER2 Gen auf Chromosom 1q13.1, für das YANG et al. (1999) jedoch keine Homologie zum humanen Chromosom 17 nachweisen konnte. 2.2.4 HER2 Rezeptor bei anderen Tumoren Eine HER2 Überexpression wird in unterschiedlicher Häufigkeit auch bei anderen epithelialen Tumoren, wie in Tabelle 2 dargestellt, beobachtet. Zum Beispiel bei dem WilmsTumor, dem nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) oder dem Ovarial-, Blasen-, Speicheldrüsen-, Endometrium-, Gastrointestinal- und Pankreaskarzinom. Laut MENARD et al. (2001 a) zeigt der Wilms-Tumor mit 51 % die höchste HER2 Expressionsrate. Der Tumor mit der größten Anzahl an HER2 Scorewerten vom Grad 3+ ist laut KOEPPEN et al. (2001) das infiltrative duktale Mammakarzinom. Bei den Brust-, Eierstocks- und Magenkarzinomen korreliert die Häufigkeit der HER2 Genamplifikation gut mit dem HER2 mRNA Level und der HER2 Proteinüberexpression. Bei den anderen epithelialen Tumoren ist der Level der HER2 Genamplifikation gewöhnlich niedriger als die HER2 Proteinüberexpression. Die Beziehung zwischen HER2 Genamplifikation/Rezeptorüberexpression und einer schlechten Prognose ist nicht nur auf den Brustkrebs begrenzt. Basierend auf der beschriebenen Wirksamkeit der anti-HER2 MAbTherapie bei Brustkrebspatientinnen und den zunehmenden Beweisen, die zeigen, dass das 37 Literaturübersicht HER2 Gen eine signifikante Rolle in der Pathogenese anderer epithelialer Tumoren spielt, ist anzunehmen, dass die anti-HER2 MAbs auch eine therapeutische Wirksamkeit bei den anderen Tumortypen besitzen (KLAPPER et al. 2000; SCHOLL et al. 2001). Tabelle 2: HER2 Überexpression bei verschiedenen Tumortypen Tumortyp HER2 Überexpression Wilms-Tumor 51 % Blase 44 % Pankreas 26 % Brust 25 % Lunge (NSCLC) 14 % Ovar 14 % Endometrium 14 % (nach MENARD et al. 2001 a) 2.2.5 HER2 als therapeutisches Ziel Der HER2 Rezeptor ist ein idealer therapeutischer Ansatzpunkt, da er außen an der Zelloberfläche sitzt und somit leicht zugänglich ist. Außerdem wird er nur von Tumorzellen überexprimiert. Damit bieten nur Tumorzellen ein Ziel und normale, bzw. gesunde Zellen werden nicht beschädigt. Die Erkenntnis, dass HER2 ein Hauptregulator der zur Epithelzellproliferation führenden Signalkette ist, macht dieses Protein als ein Ziel für eine Krebstherapie interessant. Ein neuartiges Agens (Herceptin) wurde speziell mit dem Ziel entwickelt, die Funktion der HER2 Rezeptoren in HER2 positiven Tumoren zu antagonisieren. Der Hauptbestandteil von Trastuzumab (Herceptin) ist ein rekombinanter, humanisierter (95 % humane Proteine), monoklonaler Antikörper, der mit hoher Spezifität an die extrazelluläre Domäne des HER2 Rezeptors bindet. Er hemmt die Proliferation von humanen Tumorzellen, die eine 38 Überexpression Literaturübersicht des HER2 Proteins aufweisen, durch eine Veränderung der rezeptorabhängigen Signaltransduktion. Darüber hinaus stimuliert er eine zellvermittelte Toxizität (ADCC: antibody dependent cell mediated cytotoxicity), die zur Vernichtung der Tumorzelle führt. Herceptin wird bei Patientinnen mit metastasierendem Mammakarzinom eingesetzt, wenn auf den Tumorzellen eine HER2 Überexpression nachgewiesen werden kann. Gegenwärtig kann Trastuzumab als Monotherapeutikum bei Patientinnen mit einer vorangegangenen erfolglosen Chemotherapie oder in Kombination mit Paclitaxel (Taxol) bei Patientinnen, die noch nicht mit einem Chemotherapeutikum vorbehandelt sind, eingesetzt werden (SHEPHARD et al. 1991; KLAPPER et al. 2000; LEYLAND-JONES u. SMITH 2001; MOKBEL u. HASSANALLY 2001; SCHOLL et al. 2001; YU 2001; RENNER et al. 2002; GOEL et al. 2002; MENARD et al. 2003). Die Zugabe von Trastuzumab zu einem Behandlungsschema bewirkt eine signifikante Verlängerung der Zeit bis zum Fortschreiten der Erkrankung. Bei mit Trastuzumab behandelten Patientinnen wurde darüber hinaus eine höhere objektive Ansprechrate (Volloder Teilremission), eine längere Ansprechdauer und eine längere Überlebenszeit sowie eine niedrigere Mortalitätsrate innerhalb des ersten Jahres beobachtet, als bei den ausschließlich chemotherapeutisch behandelten Patientinnen. Die objektiven Ansprechraten gegenüber einer Trastuzumab-Therapie bei unvorbehandelten Patientinnen fallen höher aus als bei Patientinnen, die bereits eine umfangreiche Chemotherapie erhalten haben (KAUFMANN u. KANZ 2000; BASELGA 2001; McKEAGE u. PERRY 2002). Laut MENDELSOHN u. BASELGA (2000) steigert Trastuzumab die antitumorale Aktivität von Paclitaxel und Doxorubicin, sowie die zytotoxischen Effekte einer Radiotherapie. Ausblick in die veterinärmedizinische Nutzung: Da es bisher nur wenig klinische Studien über die Wirksamkeit von Chemotherapien bei Hunden mit Gesäugetumoren gibt, wäre Trastuzumab als ein neues Agens eine interessante Perspektive. Gerade bei inoperablen, metastasierenden hormonrezeptornegativen Tumoren mit einem schlechten Ansprechen auf die in der Veterinärmedizin üblichen Therapien, gäbe es hier sicher einen neuen Ansatzpunkt. Eigene Untersuchungen 3 Eigene Untersuchungen 3.1 Material und Methoden 3.1.1 Untersuchungsmaterial 39 Insgesamt wurden 91 Mammatumorgewebeproben aus dem Einsendematerial der umliegenden Göttinger Tierarztpraxen untersucht. Die Proben wurden zur histologischen Untersuchung in einem Zeitraum von 1994 bis 2004 in die Abteilung Infektionspathologie (früher Tiermedizin und Primatenhaltung) des Deutschen Primatenzentrums in Göttingen (Leiter: Prof. Dr. F.-J. Kaup) gesandt. Es handelt sich hierbei um weibliche Tiere, die zum Zeitpunkt der Probenentnahme zwischen 2 und 15 Jahren alt waren. Genauere Angaben zu den Tieren siehe Anhang Tabelle 1. Diese Proben wurden nach laborüblichem Protokoll in Paraffin eingebettet, geschnitten und gefärbt. Anhand der Hämalaun und Eosin (H.-E.) gefärbten Schnittpräparate wurde eine morphologische Diagnose erstellt und eine Einteilung nach der neuen WHO Klassifikation (MISDORP et al. 1999) vorgenommen. 3.1.2 Anfertigung der Gewebeschnitte Die Proben wurden nach Eingang im Labor zugeschnitten und in Einbettkassetten gelegt. Die Entwässerung und Einbettung erfolgte dann mit Hilfe eines Gewebeeinbettungsautomaten (Hypercenter XP, Fa. Shandon, Frankfurt am Main) nach dem im Anhang unter Punkt 8.1.1 aufgeführten Protokoll. Mit dem Schlittenmikrotom HM 400 (Fa. Microm, Walldorf) wurden 3-4 µm dicke Schnitte angefertigt, die mit Hilfe eines im Eiswasser angefeuchteten Durchschlagpapierstreifens aufgenommen und dann in einem 40° C warmen Wasserbad gestreckt wurden. Von dort wurden sie auf Adhäsionsobjektträger (HistoBond, Fa. Marienfeld) aufgezogen. Anschließend fand über Nacht eine Trocknung der Schnitte bei 37° C statt. 40 Eigene Untersuchungen Zur histologischen Beurteilung wurde von jeder Probe ein Paraffinschnitt im Färbeautomaten VaristainGemini (Fa. Shandon, Frankfurt am Main) mit Hämalaun und Eosin gefärbt (Protokoll siehe Anhang Punkt 8.1.2). 3.1.3 Klassifizierung der Proben Die mit Hämalaun und Eosin gefärbten Präparate wurden mit Hilfe eines Standard-BiokularLichtmikroskop „Axioskop“ (Fa. Zeiss, Oberkochen) pathohistologisch beurteilt und nach der derzeit gültigen WHO Klassifikation (MISDORP et al. 1999) in sechs verschiedene Tumorgruppen eingeteilt, wie in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Untersuchte Tumorgruppen Einfaches Adenom 12 Komplexes Adenom 14 Benigne Mischtumoren 16 Plattenepithelkarzinom 12 Einfaches Karzinom (tubulopapillär, solide) 24 Komplexes Karzinom 13 3.1.4 Immunhistochemische Reaktionen 3.1.4.1 Hercep Test benigne Probenanzahl maligne Tumor Bei dem Hercep Test handelt es sich um eine indirekte Nachweismethode der HER2 Proteinüberexpression im Tumorgewebe. Der enzymkonjugierte sekundäre Antikörper (Detektionsreagenz) markiert hierbei die Position des unkonjungierten Primärantikörpers 41 Eigene Untersuchungen (Kaninchen Anti-Human HER2) direkt im Gewebe. Die zur Durchführung dieses manuellen Testes benötigten Reagenzien sind, einschließlich positiver Zelllinien, die zur Validierung und Kontrolle der Färbeprozedur dienen sowie ein genaues Färbeprotokoll, im Hercep TestTM – Kit (No. K5204) der Firma DakoCytomation enthalten. Die Vorversuche wurden an acht Mammatumoren nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Nach erfolgreicher Durchführung wurde eine kleine Änderung des Protokolls vorgenommen, die den Versuchsablauf vereinfachte, aber gleiche Ergebnisse brachte. An Stelle der feuchten Kammer wurden die Objektträger in Coverplates (Fa. Shandon, Frankfurt am Main) eingelegt, wodurch ein Austrocknen der Schnitte, welchen Effekt die feuchte Kammer haben sollte, ebenfalls verhindert wurde. Unter Verwendung der Coverplates konnten allerdings innerhalb der vorgeschriebenen Zeitintervalle zwischen den Testschritten mehr Proben untersucht werden als in der feuchten Kammer. Der Hercep Test wurde nach den Angaben des Herstellers (Protokoll siehe Anhang Punkt 8.1.3) an entparaffinierten und rehydrierten Schnitten durchgeführt. Für jeden Versuchsdurchlauf wurden je zwei Schnitte pro Patient (pos.- und neg.-Probe) und ein Kontrollschnitt (mit drei Zelllinien 0, 1+, 3+) (Abb. 3 a - c) aus dem Test benötigt. So konnten pro Versuchsdurchlauf neun Patientenproben à zwei Objektträger untersucht werden. Zur Antigen-Demaskierung wurden die Schnitte zuerst in der Epitope Retrieval-Lösung einer Hitzevorbehandlung im Wasserbad unterzogen. Die anschließende Blockierung der endogenen Peroxidase diente der Vermeidung falsch positiver Ergebnisse. Danach wurde der Primärantikörper (wie im Kit vorliegend), bzw. für die Negativkontrolle das Negativ-Reagenz aufgetropft. Im nächsten Schritt folgte der Sekundärantikörper und danach die DAB SubstratChromogenlösung. Abschließend wurde für 30 sek. eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin durchgeführt. 3.1.4.2 Ki 67 An ausgewählten Proben wurde eine Ki 67 Untersuchung durchgeführt. Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen das Ki-67 Antigen sollten die Kerne proliferationsaktiver Zellen in den Mammatumoren immunhistochemisch dargestellt werden. Unter Verwendung 42 Eigene Untersuchungen des monoklonalen Antikörpers CONFIRMTM Anti-Ki67 (Clone K-2) von der Firma VENTANA wurden die Proben im NexES-IHC-Färbemodul der Firma VENTANA markiert. Der Antikörper Ki 67 Test wurde nach den Angaben des Herstellers (Protokoll siehe Anhang Punkt 8.1.4) an entparaffinierten und rehydrierten Schnitten durchgeführt. Zur AntigenDemaskierung wurden die Schnitte in Citratpuffer (siehe Anhang Punkt 8.1.5) im Schnellkochtopf einer Hitzevorbehandlung unterzogen. Anschließend wurden die Schnitte ins NexES-IHC-Färbemodul eingespannt, wo alle weiteren Reaktionen stattfanden. Pro Versuchsdurchlauf wurden 18 Proben (ein Schnitt pro Patient), sowie eine Positiv- und eine Negativkontrolle im NexES-IHC-Färbemodul untersucht. Als Positivkontrolle wurde eine Tonsille vom Hund verwendet, da in lymphatischen Geweben regelmäßig Proliferationsaktivität anzutreffen ist. 3.1.4.3 Der Multiblock Als Multiblock bezeichnet man einen Paraffinblock, der multiple Gewebeproben enthält. Anhand dieses Paraffinblocks ist dann eine gleichzeitige Untersuchung vieler verschiedener Gewebeproben möglich. Dadurch werden nicht nur Reagenzien und Zeit gespart, sondern auch die Vergleichsmöglichkeiten der einzelnen Proben untereinander verbessert. Darüber hinaus liegen standardisierte Bedingungen für alle Proben vor. Dieses Verfahren wurde etabliert und hinsichtlich seiner Anwendbarkeit evaluiert. Zur Erstellung eines Multiblocks wurde bei jedem Tumor eine repräsentative Stelle auf dem H.-E.-Schnitt markiert und diese Markierung auf den Paraffinblock übertragen. Danach wurde aus diesem Bereich ein Gewebezylinder mit Hilfe einer Stanze (∅ 3mm) ausgestanzt und zusammen mit den anderen Gewebezylindern in einem neuen Paraffinblock ausgegossen (Protokoll siehe Anhang Punkt 8.1.6). Anschließend wird wie oben beschrieben eine H.-E. Färbung, der Hercep Test und der Ki 67 Test durchgeführt. 43 Eigene Untersuchungen 3.1.5 Auswertung und Dokumentation Die Auswertung des Hercep Tests wurde mit Hilfe des Fotomikroskops „Axiophot“ (Fa. Zeiss, Oberkochen) durchgeführt. Als Leitfaden zum HER2-Scoring der Proben diente der Atlas for Interpretation of Hercep TestTM Staining (DakoCytomation-Broschüre Nr. 20210), in dem von 0 bis 3+ gewertet wird. Die Scorewerte 0 und 1+ gelten als negativ, 2+ und 3+ als positiv. Es wurde sowohl die Anzahl der gefärbten Tumorzellen (mehr oder weniger als 10 %), als auch die Vollständigkeit (unvollständig oder komplett) und die Stärke der Färbung beurteilt. Bewertet wurden hierbei nur die Markierungen der Zellmembran, Zytoplasmafärbungen wurden nicht berücksichtigt. Intraduktale Anfärbungen wurden ebenfalls nicht bewertet. Sie sind für die Bewertung irrelevant, da diese Strukturen nicht auf eine Herceptintherapie ansprechen. In der Übersicht galten also folgende Kriterien: 0: Keine Färbung, oder weniger als 10 % der Tumorzellen zeigen eine membranständige Färbung. 1+ : Eine schwache, oder kaum sichtbare Membranfärbung ist in mehr als 10 % der Tumorzellen zu sehen. Die Zellen zeigen eine unvollständige Membranfärbung. 2+ : Eine schwache bis moderate komplette Membranfärbung wird in mehr als 10 % aller Tumorzellen festgestellt. 3+ : Eine starke, die komplette Membran umfassende Färbung, wird in mehr als 10 % aller Tumorzellen beobachtet. Die Bewertung des Ki 67 wurde ebenfalls am Fotomikroskop „Axiophot“ (Fa. Zeiss, Oberkochen) durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde hier die Tonsille des Hundes, bzw. als Negativkontrolle normales Mammagewebe benutzt. Anhand einer Skala von - bis +++ konnte dann die Markierung der Kerne proliferationsaktiver Zellen beurteilt werden. -: keine, oder kaum positive Zellen +: geringgradige Anzahl positiver Zellen ++ : mittelgradige Anzahl positiver Zellen 44 Eigene Untersuchungen +++ : hochgradige Anzahl positiver Zellen Die fotografische Dokumentation wurde mit Hilfe des Fotomikroskops „Axiophot“ (Fa. Zeiss, Oberkochen) unter Verwendung von Farbfilmen des Typs Kodak Ektachrome 160T durchgeführt. Zusätzlich wurden Bilder mit dem Digitalkameraaufsatz Olymps DP 50 (Fa. OLYMPUS Optical, Hamburg) angefertigt, in den PC übertragen und mit dem Programm analySIS (Fa. SIS, Münster) bearbeitet. Der Multiblock wurde, wie oben beschrieben, im Hercep Test und Ki 67 Test beurteilt. Anschließend fand ein Vergleich zwischen den Ergebnissen des Multiblocks und denen des Hercep Tests und Ki 67 Tests am Gesamttumorschnitt statt. Eigene Untersuchungen 3a 3b 45 46 Eigene Untersuchungen 3c Abb. 3 a - c: Kontrollschnitt aus dem Hercep Test mit drei humanen Brustkrebszelllinien. (Scalebar = 50 µm). a) Score 0: Keine Färbung oder weniger als 10 % der Tumorzellen zeigen eine membranständige Färbung. b) Score 1+: Eine schwache oder kaum sichtbare unvollständige Färbung (Pfeile) ist in mehr als 10 % der Tumorzellen zu sehen. c) Score 3+: Eine starke, die komplette Membran umfassende Färbung wird in mehr als 10 % aller Tumorzellen beobachtet. 47 Eigene Untersuchungen 3.2 Ergebnisse Alle 91 Mammatumorproben wurden pathohistologisch untersucht und in sechs Tumorgruppen unterteilt, wobei 42 (46,15 %) als benigne und 49 (53,85 %) als maligne eingestuft wurden. Das unterschiedliche Wachstum der caninen Mammatumoren mit fokalen Herden, die sich hinsichtlich Malignität und Morphologie stark voneinander unterscheiden, erschwerte die Auswertung des Hercep Tests. So zeigte sich im Gegensatz zu dem invasiven Mammakarzinom der Frau bei den caninen Mammatumoren ein eher heterogenes Bild. Die lichtmikroskopisch an H.-E. Schnitten ermittelten Diagnosen beruhten auf den in der WHO Klassifikation festgelegten morphologischen Kriterien. Es handelt sich dabei um die in Tabelle 4 aufgeführten Tumorentitäten. Auf eine ausführliche Beschreibung der morphologischen Veränderungen, die zu der jeweiligen Tumordiagnose geführt hatten, wurde verzichtet, da sie der oben aufgeführten und im Literaturteil dargestellten WHO Klassifikation entsprachen. Einzelne Abweichungen werden allerdings in der nachfolgenden Ergebnisdarstellung berücksichtigt. 3.2.1 Hercep Test Von den untersuchten Mammatumorproben sind im Hercep Test insgesamt 78 Proben negativ und 13 positiv bewertet worden, wobei die negativen Proben entweder keine (Abb. 4 a/b) oder nur eine geringgradige Markierung aufwiesen (0, 1+). Bei den positiven Proben zeigten sich Markierungen von 2+ bis 3+, wie in Tabelle 4 dargestellt. Der Prozentsatz der caninen malignen Tumoren (20,41 %), die hier eine Überexpression des HER2 Proteins zeigen, entspricht dem der humanen Mammatumoren (20-30 %), allerdings zeigten auch die benignen Tumoren (7,41 %) eine geringe Menge an HER2 in den Arealen der beginnenden Entdifferenzierung. 48 Eigene Untersuchungen Tabelle 4: Auswertung Hercep Test Tumor 0 1+ negativ negativ 2+ positiv 3+ positiv Summe Gesamt positiv % Einfaches Adenom 11 1 - - 12 0 Komplexes Adenom 9 3 2 - 14 14,3 Benigne Mischtumoren 13 2 1 - 16 6,3 Plattenepithelkarzinom 8 1 1 2 12 25 Einfaches Karzinom (tubulopapillär, solide) 14 5 4 1 24 20,8 Komplexes Karzinom 10 1 2 - 13 15,4 Grundsätzlich wiesen in der Mamma nur die Epithelzellen eine positive Markierung auf. Allgemein stellte sie sich als brauner Saum um die Epithelzellen dar, der in Farbintensität von hellbraun bis dunkelbraun, sowie von unvollständiger bis kompletter Membranfärbung variieren konnte. Zytoplasmafärbungen wurden dabei nicht berücksichtigt, da es sich hier um Hintergrundfärbungen handelt, die keine Rezeptoren markieren. Die jeweiligen Bewertungen im Hercep Test für die nachfolgend aufgeführten Tumoren können Tabelle 7 entnommen werden. Benigne Tumoren Bei den einfachen Adenomen zeigte sich nur in einer Probe (P185/94) eine schwache unvollständige Membranfärbung der epithelialen Zellen, die mit 1+ bewertet wurde. Innerhalb dieses Tumors fanden sich Areale mit beginnender Entdifferenzierung, sowie an einer umschriebenen Lokalisation erste morphologische Hinweise auf maligne Wuchsformen. Genau in diesen Bereichen konnten immunhistochemisch schwache Membranmarkierungen dargestellt werden. 49 Eigene Untersuchungen Unter den 14 komplexen Adenomen konnten bei fünf Proben Membranfärbungen der epithelialen Zellen festgestellt werden. Drei (P696/01, P826/01, P986/01) davon wurden mit 1+ bewertet (Abb. 5 a/b). Auch hier waren wieder die Bereiche mit beginnenden Entdifferenzierungen, die in allen drei Tumoren in der H.-E. Färbung zu erkennen waren, in der IHC markiert. Die anderen zwei Proben (P848/01, P58/01) erhielten die Scorewerte 2+, sie zeigten eine schwache bis moderate komplette Membranfärbung in mehr als 10 % der epithelialen Tumorzellen. Die Probe P848/01 setzte sich aus überwiegend gut differenzierten epithelialen Tumorzellen zusammen, die unter Beteiligung myoepithelialer Komponenten proliferierten. Daneben fanden sich auch undifferenzierte spindelige, epitheliale Tumorzellen. Auch hier waren die Markierungen überwiegend in Arealen des pleomorphen Zellwachstums zu finden. Der Tumor P58/01 (Abb. 6 a/b) bestand aus gut differenzierten, in Nestern angeordneten epithelialen Tumorzellen, die in vielen Bereichen eine beginnende Entdifferenzierung zeigten und im Hercep Test positiv markiert wurden. Dazwischen waren breite proliferierende mesenchymale Anteile zu erkennen. Es bestanden klare Übergänge zu gesunden Gewebestrukturen. Von den benignen Mischtumoren wiesen drei Proben eine Membranfärbung der epithelialen Tumorzellen auf, die in zwei Fällen (P703/97, P160/04) mit 1+ bewertet wurden. Beide Proben zeigten in den Lokalisationen mit wenig differenzierten epithelialen Zellen Membranmarkierungen. Dies galt auch für den Tumor P707/97, der neben Anteilen eines Osteoms und Chondroms ebenfalls epitheliale Herde mit ersten Malignitätskriterien enthielt, welche im Hercep Test eine positive Reaktion zeigten. Insgesamt wurde er mit 2+ beurteilt. Grundsätzlich wurden positive Reaktionen bei den benignen Mischtumoren nur an den epithelialen Zellen beobachtet, mesenchymale Bereiche sowie chondroide und osteoide Areale stellten sich negativ dar. Maligne Tumoren Bei den 25 verhornenden Plattenepithelkarzinomen waren bei vier Proben Membranmarkierungen zu beobachten (Tab. 7). Eine Probe (P998/99) hatte eine schwache membranständige Färbung, die mit 1+ bewertet wurde. Dieser Tumor bestand aus einer Ansammlung von epithelialen Tumorzellen, die meist kompakt lagen und herdförmige, teils ausgeprägte Keratinisierungsvorgänge zeigten. Die Markierungen fanden sich innerhalb der 50 Eigene Untersuchungen kompakten Tumorzellansammlungen, sowie in den Arealen der Keratinisierung. Eine weitere Probe (P86/94) mit soliden, nicht verhornenden Karzinomzellnestern, die fokal zu verhornendem Plattenepithel differenzierten, wies eine moderate komplette Membranfärbung auf, die mit 2+ beurteilt werden konnte. Die Markierung bestätigt die in der H.-E. Färbung getroffene Aussage über das invasive Wachstum des Tumors. Bei den anderen beiden Proben (P487/97, P118/98) war eine starke, die komplette Membran der epithelialen Tumorzellen umfassende Färbung zu erkennen, die mit 3+ bewertet wurde. Der Tumor P487/97 bestand aus einer Ansammlung von epithelialen Tumorzellen, die teilweise zu einem verhornenden Plattenepithel differenzierte. In einer Lokalisation war eine ausgeprägte Lymphknotenmetastase zu finden, die in der Immunhistochemie eine deutliche Reaktion zeigte. Die Markierung betraf die epithelialen Tumorzellen sowie die Areale des verhornenden Plattenepithels und war über den gesamten Tumor verteilt. Die Probe P118/98 zeigte eine ausgeprägte Ansammlung von überwiegend undifferenzierten, epithelialen Tumorzellen in dichter Lagerung, sowie einzelne verhornende Tumorzellareale. Die Membranfärbung zeigte sich auch hier an den epithelialen Tumorzellen, am verhornendem Plattenepithel und durchzog den gesamten Tumor. Von den 24 einfachen Karzinomen (tubulopapillär und solide) konnten bei insgesamt 10 Proben Membranmarkierungen festgestellt werden (Tab. 7). Fünf dieser Proben (P69/94, P912/96, P951/98, P520/01, P928/01) wiesen eine schwache unvollständige Membranfärbung auf, die mit 1+ bewertet wurde. Bei vier weiteren Proben (P966/98, P501/02, P441/97, P482/97) konnte eine moderate komplette Membranfärbung in mehr als 10 % der epithelialen Tumorzellen beobachtet werden, die mit 2+ bewertet wurde. Die Probe P966/98 bestand aus einer nicht abgegrenzten Ansammlung von heterogen wachsenden epithelialen Tumorzellen, wobei eine hohe Mitosezahl auffiel. Der Tumor P501/02 zeigte epitheliale Tumorzellen, die überwiegend in adenoiden Nestern mit Übergängen zu solidem Wachstum lagen und teilweise infiltrativ wuchsen (Abb. 9 a). Daneben fanden sich einzelne Herde mit stark entdifferenzierten Tumorzellansammlungen. Die Markierungen dieser zwei Tumoren betrafen überwiegend die Zellen, die pleomorphes Zellwachstum zeigten. Die Probe P441/97 setzte sich aus epithelialen Tumorzellherden zusammen, die teils umschrieben solide, teils infiltrativ wuchsen. Daneben waren zahlreiche Lymphgefäßeinbrüche zu erkennen. Die Probe P482/97 bestand aus multifokal infiltrativ wachsenden, teils spindelzellig, teils solide angeordneten Eigene Untersuchungen 51 epithelialen Tumorzellen. Es waren keine klaren Übergänge zu gesunden Gewebestrukturen zu erkennen. In beiden Fällen waren die Markierungen über den gesamten Tumor verteilt und bestätigten das invasive Wachstum. Der Tumor P539/00 (Abb. 7 a/b) zeigte eine starke, die komplette Membran umfassende Färbung aller epithelialer Tumorzellen und konnte mit 3+ bewertet werden. Er bestand aus multiplen, infiltrativ wachsenden, teilweise in Nestern arrangierten epithelialen Tumorzellen, die herdförmig von ausgeprägten Ansammlungen lymphoider Zellen begleitet wurden. In einigen Lokalisationen waren Einbrüche in Lymphgefäßstrukturen sichtbar. Die Markierung betraf den gesamten Tumor und war von allen Proben hier am intensivsten. Unter den komplexen Karzinomen waren drei markierte Proben zu finden (Tab. 7). Eine Probe (P158/04) konnte mit 1+ beurteilt und zwei Proben (P702/97, P412/95), die eine schwache bis moderate komplette Membranfärbung zeigten, mit 2+ bewertet werden. 52 Eigene Untersuchungen 4a 4b Abb. 4 a, b: Einfaches Adenom (P151/00) mit tubulär proliferierenden Tumorzellen in gleicher Lokalisation vergleichend in der H.-E. Färbung (a) und der IHC (b) dargestellt. Im Hercep Test mit Score 0 bewertet, es zeigen sich keine Membranmarkierungen. (Scalebar = 50 µm). Eigene Untersuchungen 53 5a 5b Abb. 5 a, b: Komplexes Adenom (P986/01), das sich aus adenoid und tubulär proliferierenden epithelialen, sowie fibroid formierenden mesenchymalen Tumorzellen zusammensetzt; in gleicher Lokalisation vergleichend in der H.-E. Färbung (a) und IHC (b) dargestellt. Im Hercep Test mit Score 1+ bewertet, es zeigt sich im Bereich der epithelialen Zellen eine schwache unvollständige Membranfärbung (Pfeile). (Scalebar = 50 µm). 54 Eigene Untersuchungen 6a 6b Abb. 6 a, b: Komplexes Adenom (P58/01), das sich aus gut differenzierten, in Nestern angeordneten epithelialen Tumorzellen zusammensetzt, zwischen denen breite proliferierende mesenchymale Anteile zu erkennen sind; in gleicher Lokalisation vergleichend in der H.-E. Färbung (a) und der IHC (b) dargestellt. Im Hercep Test mit Score 2+ bewertet zeigt sich eine moderate komplette Membranfärbung (Pfeile) der epithelialen Zellen. (Scalebar = 50 µm). Eigene Untersuchungen 55 7a 7b Abb. 7 a, b: Einfaches Karzinom (P539/00), das sich aus multiplen, infiltrativ wachsenden epithelialen Tumorzellen zusammensetzt; in gleicher Lokalisation vergleichend in der H.-E. Färbung (a) und der IHC (b) dargestellt. Im Hercep Test mit Score 3+ bewertet, es zeigt sich eine starke, die komplette Membran umfassende Färbung. (Scalebar = 50 µm). 56 Eigene Untersuchungen 3.2.2 Ki 67 Der Ki 67 Test wurde insgesamt an 44 Tumorproben durchgeführt, um die Proliferationsaktivität auszuwerten und mit den Ergebnissen des Hercep Tests zu vergleichen. Davon zeigten 37 Proben eine positive und sieben keine, oder kaum eine Reaktion. Die positiven Proben gliedern sich von + bis +++, wie in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5: Auswertung Ki 67 Tumor - + ++ +++ Summe Einfaches Adenom 1 2 - - 3 Komplexes Adenom 3 3 2 - 8 Benigne Mischtumoren 2 3 2 1 8 Plattenepithelkarzinom 1 1 2 2 6 Einfaches Karzinom (tubulopapillär, solide) - 4 4 4 12 Komplexes Karzinom - 5 2 - 7 Grundsätzlich zeigte sich die Immunreaktion als braune Kernfärbung bei proliferationsaktiven Zellen. Die Farbintensität war bei allen Schnitten gleich und deutlich erkennbar und wurde über entsprechende positive Kontrollschnitte überprüft. Benigne Tumoren Die benignen Veränderungen (68,42 %) zeigten insgesamt weniger positive Zellen als die malignen Tumoren (96 %). Unter den vier einfachen Adenomen waren bei zwei Proben (P185/94, P813/97) in den Bereichen wenig differenzierter Tumorzellen schwache positive Reaktionen zu erkennen. Bei den acht komplexen Adenomen zeigten fünf Tumoren Zellkernmarkierungen, wobei drei Proben (P696/01, P826/01, P986/01) eine geringe Anzahl an positiv markierten Zellen aufwiesen (Abb. 8), und zwei Proben (P848/01, P57/01) eine Eigene Untersuchungen 57 mittlere Anzahl markierter Zellkerne zeigten. Von den acht benignen Mischtumoren konnten bei sechs Tumoren positive Reaktionen festgestellt werden. Drei (P883/96, P703/97, P160/04) zeigten nur wenig, zwei (P441/95, P857/96) eine mittelgradige und ein Tumor eine starke Immunreaktion. Die meisten markierten Zellkerne wurden in den epithelialen Tumorarealen beobachtet, während die Reaktionen in den mesenchymalen Bereichen weniger ausgeprägt waren und chondroide und osteoide Areale sich negativ darstellten (Tab. 6). Maligne Tumoren Unter den sechs Plattenepithelkarzinomen zeigten fünf positive Reaktionen. Der Tumor P179/94 ließ überwiegend in der Peripherie der verhornenden Epithelzellen eine geringe Anzahl an markierten Zellkernen erkennen. Bei zwei Proben konnte eine mittelgradige Zahl positiver Zellen beobachtet werden, die bei einem Tumor (P998/99) diffus im Tumorgeschehen verteilt waren und bei der anderen Probe (P86/94) überwiegend die epithelialen Zellen betrafen. Die Tumoren P487/97 und P118/98 zeigten diffus über den gesamten Tumor verteilt eine hochgradige Anzahl an markierten Zellen. Bei den 12 einfachen Karzinomen wiesen vier Proben (P69/94, P539/00, P832/01, P441/97) eine schwache Markierung auf. Vier weitere Tumoren (P912/96, P520/99, P877/01, P928/01) zeigten eine mittlere Zahl markierter Zellen und die anderen vier Karzinome (P951/98, P966/98, P501/02, P482/97) ließen eine hochgradige Zahl positiver Zellen in diffuser Verteilung erkennen (Abb. 9 a/b). Von den sieben komplexen Karzinomen zeigten fünf Proben (P702/97 1, P412/95, P596/00, P606/00, P860/01) eine geringe Zahl positiver Reaktionen und zwei Tumoren (P264/98, P158/04) eine mittlere Anzahl markierter Zellkerne. In der Gegenüberstellung zum Hercep Test entsprach der Proliferationsmarker Ki 67, bis auf wenige Ausnahmen, den HER2 Scorewerten. Das heißt, hohe Scorewerte spiegelten sich in einer hohen Anzahl markierter Kerne proliferationsaktiver Zellen wider. Desgleichen zeigten Tumoren mit niedrigen Scorewerten eine geringe Zahl markierter Zellkerne. Einige Ausnahmen waren unter den benignen Mischtumoren und Karzinomen zu finden. In fünf Fällen (P441/95, P857/96, P951/98, P877/01, P264/98) waren die Scorewerte deutlich niedriger als die Anzahl Ki 67 markierter Zellen. In einem Fall war es genau umgekehrt, ein Tumor (P539/00) mit einem hohen HER2 Scorewert zeigte nur eine geringe Anzahl markierter Zellkerne. Genauere Angaben sind in Tabelle 6 dargestellt. 58 Eigene Untersuchungen Tabelle 6: Vergleich HER2 zu Ki 67-Proben Tumor Einfaches Adenom Komplexes Adenom Benigne Mischtumore Plattenepithelkarzinom P-Nr. HER2* Ki 67** P185/94 1+ + P813/97 0 + P436/98 0 - P702/97 2 0 - P500/00 0 - P696/01 1+ + P718/01 0 - P826/01 1+ + P848/01 1 2+ ++ P986/01 1+ + P58/01 2+ ++ P201/94 0 - P441/95 0 ++ P818/96 0 - P857/96 0 ++ P883/96 0 + P703/97 1+ + P707/97 2+ +++ P160/04 1+ + P86/94 2+ ++ P179/94 0 + P487/97 3+ +++ P118/98 3+ +++ P998/99 1+ ++ P516/00 0 - 59 Eigene Untersuchungen Tabelle 6: Fortsetzung Tumor Einfaches Karzinom (tubulopapillär, solide) Komplexes Karzinom P-Nr. HER2* Ki 67** P69/94 1+ + P912/96 1+ ++ P951/98 1+ +++ P966/98 2+ +++ P501/02 2+ +++ P520/99 1+ ++ P539/00 3+ + P832/01 0 + P877/01 0 ++ P928/01 1+ ++ P441/97 2+ + P482/97 2+ +++ P702/97 1 2+ + P412/95 2+ + P264/98 0 ++ P596/00 0 + P606/00 0 + P860/01 0 + P158/04 1+ ++ * Scorebewertung nach Herstellerangaben ** + geringe Anzahl positiver Zellen ++ mittlere Anzahl positiver Zellen +++ hohe Anzahl positiver Zellen 60 Eigene Untersuchungen 8a 8b Abb. 8 a, b: Komplexes Adenom (P986/01) mit adenoid und tubulär proliferierenden epithelialen und fibroid formierenden mesenchymalen Tumorzellen, in gleicher Lokalisation vergleichend in der H.-E. Färbung (a) und der IHC (b) dargestellt. Im Ki 67 Test mit + bewertet, es ist eine geringgradige Anzahl positiv markierter Kerne proliferationsaktiver Zellen (Pfeile) zu sehen. (Scalebar = 50 µm). Eigene Untersuchungen 61 9a 9b Abb. 9 a, b: Einfaches Karzinom (P501/02) mit überwiegend adenoid proliferierenden Tumorzellen, die Übergänge zu solidem Wachstum zeigen, in gleicher Lokalisation vergleichend in der H.-E. Färbung (a) und der IHC (b) dargestellt. Im Ki 67 Test mit +++ bewertet, es zeigt sich eine hochgradige Anzahl positiv markierter Kerne proliferationsaktiver Zellen (Pfeile). (Scalebar = 50 µm). 62 3.2.3 Eigene Untersuchungen Der Multiblock Für den Multiblock wurden insgesamt 30 Proben aus jeder Tumorgruppe von 0 bis 3+ ausgewählt. Von dem Mammatumor P539/00 wurden zwei Proben entnommen. Anschließend fand anhand der H.-E.-Färbung des Multiblocks eine histologische Beurteilung als Vorscreening statt (Abb. 10 und 12). Nach Durchführung des Hercep Tests und Ki 67 wurden die Proben wie oben beschrieben ausgewertet. Die 3 mm Stanzen entsprachen sowohl im Hercep Test als auch im Ki 67 bis auf wenige Ausnahmen den Auswertungen des Gesamttumors. Genauere Angaben sind in Tabelle 7 dargestellt. Bei dem Hercep Test fand bei zwei Proben (P702/97, P412/95), die bei der Beurteilung des Gesamttumors eine 2+ erhielten, keine Reaktion statt. Drei weitere Proben waren nicht auswertbar, da Teile der Probe/Stanze zerstört, bzw. abgeschwommen waren. Ein Beispiel für eine aussagekräftige positive Reaktion im Hercep Test im Vergleich zum H.-E. gefärbten Präparat ist in Abb. 11 dargestellt. Die Farbintensität der Immunreaktion des Ki 67 Tests fiel bei acht Proben insgesamt schwächer aus als bei den Gesamttumorschnitten. In diesen Fällen zeigten die Zellkerne eine schwächere Braunfärbung bei der SABC-Technik unter Verwendung von DAB. Vier Tumoren waren nicht zu beurteilen, da Teile der Probe/Stanze zerstört, bzw. abgeschwommen waren. In Abbildung 13 ist die positive Ki 67 Reaktion dem H.-E. gefärbten Präparat gegenübergestellt. 63 Eigene Untersuchungen Tabelle 7: Vergleich HER2 und Ki 67-Proben zum Multiblock Tumor Einfaches Adenom Komplexes Adenom Benigne Mischtumore Plattenepithelkarzinom P-Nr. HER2* Ki 67** Multiblock HER2 / Ki 67 P185/94 1+ + 1+ fehlt P813/97 0 + fehlt fehlt P702/97 2 0 - 0 - P696/01 1+ + 1+ + P826/01 1+ + 1+ + P848/01 1 2+ ++ 2+ ++ P986/01 1+ + 1+ + P58/01 2+ ++ fehlt fehlt P703/97 1+ + 1+ + P707/97 2+ +++ 2+ ++ P160/04 1+ + 1+ + P86/94 2+ ++ 2+ ++ P179/94 0 + 0 fehlt P487/97 3+ +++ 3+ ++ P118/98 3+ +++ 3+ ++ P998/99 1+ ++ 1+ ++ 64 Eigene Untersuchungen Tabelle 7: Fortsetzung Tumor Einfaches Karzinom (tubulopapillär, solide) Komplexes Karzinom P-Nr. HER2 Ki 67 P69/94 1+ + 1+ - P912/96 1+ ++ 1+ ++ P951/98 1+ +++ 1+ + P966/98 2+ +++ 2+ +++ P501/02 2+ +++ 2+ +++ P520/99 1+ ++ fehlt fehlt P539/00 3+ + 3+ + P928/01 1+ ++ 1+ - P441/97 2+ + 2+ - P482/97 2+ +++ 2+ ++ P702/97 1 2+ + 0 + P412/95 2+ + 0 + P158/04 1+ ++ 1+ ++ * Scorebewertung nach Herstellerangaben ** + geringe Anzahl positiver Zellen ++ mittlere Anzahl positiver Zellen +++ hohe Anzahl positiver Zellen Multiblock HER2 / Ki 67 65 Eigene Untersuchungen 10a 11a 10b 11b Abb. 10 a, b: Multiblock, H.-E. Färbung. Einfaches Karzinom (P539/00), das sich aus infiltrativ wachsenden und teilweise in Nestern gelegenen epithelialen Tumorzellen zusammensetzt, die von herdförmigen Ansammlungen lymphoider Zellen (Stern) begleitet werden. Scalebar = 1 mm (a) und Ausschnittsvergrösserung Scalebar = 50 µm (b). Abb. 11 a, b: Multiblock, IHC. Einfaches Karzinom (P539/00). Im Hercep Test (3+) zeigt sich eine starke komplette Membranfärbung bei mehr als 10 % der Tumorzellen (b, Pfeile), auch Metastasen in Lymphgefäßstrukturen sind gut zu erkennen (a, Pfeile). Scalebar = 1 mm (a) und Ausschnittsvergrösserung Scalebar = 50 µm (b). 66 Eigene Untersuchungen 12a 12b 13a 13b Abb. 12 a, b: Multiblock, H.-E. Färbung. Einfaches Karzinom (P966/98) mit einer hochgradigen, nicht abgegrenzten Ansammlung von heterogen wachsenden epithelialen Tumorzellen. Scalebar = 1mm (a) und Ausschnittsvergrösserung Scalebar = 50 µm (b). Abb. 13 a, b: Multiblock, IHC. Einfaches Karzinom (P966/98). Bei der Ki 67 Immunreaktion (+++) zeigt sich eine hochgradige Markierung der Kerne proliferationsaktiver Zellen (b, Pfeile). Scalebar = 1 mm (a) und Ausschnittsvergrösserung Scalebar = 50 µm (b). 67 Diskussion 4 Diskussion Diese Arbeit beschäftigt sich mit der diagnostischen und prognostischen Aussagekraft der HER2 Proteinexpression in caninem Mammatumorgewebe. Der Hercep Test der Firma DakoCytomation, der bereits in der Humanmedizin bei Patientinnen mit metastasierendem Mammakarzinom als Nachweis etabliert ist und dort als Entscheidungshilfe für den Einsatz bei der Herceptintherapie dient, wurde im Hinblick auf seine Anwendbarkeit beim Hund getestet. Zusätzlich wurde der Ki 67 Test zur Markierung der Kerne proliferationsaktiver Zellen durchgeführt. Gleichzeitig wurde ein Multiblock erstellt, anhand dessen sich eine bessere Vergleichsmöglichkeit der einzelnen Proben untereinander ergeben sollte und der das Verfahren einfacher und kostengünstiger machen sollte. 4.1 Hercep Test Das Mammakarzinom steht in der Todesursachenstatistik der Frauen in den USA an zweiter Stelle hinter dem Lungenkrebs. Bei den meisten Patientinnen mit primärem Mammakarzinom erfolgt eine lokale Therapie in Form eines chirurgischen Eingriffs mit Bestrahlung. Zusätzliche systemische Hormon- oder Chemotherapien können das Mortalitätsrisiko um 25 bis 50 % senken. Allerdings wird das metastasierende Mammakarzinom weiterhin als unheilbar angesehen. Da ca. 20-30 % der invasiven Mammakarzinome eine HER2 Überexpression aufweisen, bietet der HER2 Rezeptor hier einen neuen Therapieansatzpunkt (McKEAGE u. PERRY 2002). Die HER2 Amplifikation/Überexpression ist ein Marker für eine schlechte Prognose bei Patientinnen mit invasivem Mammakarzinom. Sie zeigen ein besonders aggressives Tumorwachstum und haben eine verkürzte rezidivfreie, bzw. Gesamtüberlebenszeit. Da Patienten mit solchen Tumoren schlecht auf gängige Hormon- oder Chemotherapien ansprechen, wurde ein Test zum HER2 Rezeptornachweis entwickelt, um speziell die Patienten mit einem hohen HER2 Wert zu identifizieren. Sie zeigen die beste Ansprechrate auf das Trastuzumab, deren therapeutischer Ansatzpunkt der HER2 Rezeptor ist. HER2 positive Tumoren weisen zusätzlich eine p53 Überexpression auf, tendieren dazu hormonrezeptor- und bcl-2-negativ zu sein, zeigen lymphoide Infiltrationen und eine hohe 68 Diskussion Mitoserate (NAKOPOULOU et al. 1996; CROISER et al. 1999; MENARD et al. 2001 b; RINGBERG et al. 2001). Auch KORKOLIS et al. (2001) konnte eine signifikante Korrelation zwischen HER2 und p53 nachweisen, deren Gene beide auf Chromosomen 17 lokalisiert sind, fand aber keine Beziehung zwischen HER2- und Hormonrezeptorstatus. Bei den Hunden gehören die Mammatumoren zu den häufigsten neoplastischen Erkrankungen. Zur Prüfung, ob dieser Rezeptor in ähnlicher Weise auch beim caninen Mammatumor vorkommt und nachweisbar ist, und um die Option für einen neuen Therapieansatz über das Herceptin zu bekommen, wurde der standardisierte Hercep Test angewandt. Die Untersuchung der 91 caninen Mammatumorproben zeigte eine positive HER2 Proteinüberexpression in 20,41 % der malignen und 7,41 % der benignen Tumoren. Der Prozentsatz der caninen malignen Tumoren entspricht dem der humanen Mammatumoren (20-30 %) (SLAMON et al. 1987, 1989), ist aber niedriger als bei früher beschriebenen Studien zu caninen Mammatumoren (74 %) (AHERN et al. 1996), bzw. höher als bei Studien von RUNGISPIPAT et al. (1999) (19,1 %) und DE LAS MULAS et al. (2003) (17,6 %). Die Menge an HER2 Protein bei den benignen Tumoren war bei dieser Studie stets in den Arealen der beginnenden Entdifferenzierung zu beobachten. Der Prozentsatz lag mit 7,41 % weit unter den Ergebnissen von RUNGISPIPAT et al. (1999), der bei 50 % der benignen Tumoren Markierungen nachwies. AHERN et al. (1996) und DE LAS MULAS et al. (2003) hingegen konnten bei ihren Untersuchungen keine positiven Reaktionen bei den benignen Mammatumoren feststellen. Für die unterschiedlichen Ergebnisse in der Literatur gibt es verschiedene Möglichkeiten. Ein Punkt kann dabei die wahrscheinlich unterschiedliche Vorbehandlung der Proben sein. Der Zeitpunkt der Fixation nach Entnahme der Probe und die Konzentration des Fixationsmittels haben z. B. einen großen Einfluß auf das Ergebnis. Probenmaterial wird normalerweise in 410 %igem Formalin ins Labor verschickt. Für die immunhistochemische Untersuchung ist jedoch 4 %iges Formalin als Fixationslösung am besten geeignet, da bei höheren Konzentrationen ein Verlust der Antigenität auftreten kann. Die vom Einsender verwendete Fixationslösung war in einem Großteil der Fälle nicht mehr festzustellen. Diskussion 69 Weiterhin sind von den Autoren verschiedene Nachweisverfahren benutzt worden und es fand eine individuelle Beurteilung der Ergebnisse statt. So hat AHERN et al. (1996) den mRNA Level von HER2 in caninen Mammatumoren bestimmt, während RUNGISPIPAT et al. (1999) die HER2 Rezeptorüberexpression über die Immunhistochemie bestimmt, aber eine Bewertungsskala von 1+ bis 4+ zu Grunde legt. So ist es relativ schwierig, ohne einheitliches Bewertungssystem und Verfahren die Daten untereinander zu vergleichen. Die Ergebnisse von DE LAS MULAS et al. (2003) hingegen lassen sich gut mit den vorliegenden Daten vergleichen. Er hat den gleichen Hercep Test der Firma DakoCytomation benutzt, wie er für diese Studie verwendet wurde. Zusätzlich führte er noch eine CISH zum Nachweis einer Genamplifikation durch, die sich als negativ darstellte. Auffällig ist, dass es ihm nicht gelang, positive Reaktionen bei benignen Tumorvarianten festzustellen. Der HER2 Rezeptor scheint nach Literaturangaben und aufgrund unserer Untersuchungen beim Hund ein guter Anhaltspunkt zur Beurteilung der Malignität von Mammatumoren zu sein. Aufgrund der deutlichen Zellmembranmarkierungen erhält man eine schnellere und bessere Übersicht, auch im Hinblick auf Metastasen, als bei einem H.-E. Schnitt (Abb. 10 a und 11 b). Allerdings waren nicht alle malignen Tumoren, bzw. malignen Bereiche eines Tumors markiert. Das kann natürlich einerseits an den unterschiedlichen Vorbehandlungen liegen. Andererseits müssen nicht alle proliferierenden Tumoren HER2 überexprimieren. Grundsätzlich lagen aber alle markierten Zellen in Bereichen mit malignen Wuchsformen oder befanden sich bei den benignen Tumorentitäten in Arealen mit beginnenden Entdifferenzierungen. Der Hercep Test bietet so eine ergänzende Methode bei der Beurteilung von caninen Mammatumoren. Metastasen lassen sich, sofern sie HER2 überexprimieren, leichter erkennen und die prognostische Einschätzung solcher Tumoren würde in Anlehnung an die Erfahrungen aus der Humanmedizin besser beurteilt werden können. Zu prüfen wäre nun, ob die Erfolge einer Trastuzumab Therapie auch auf den Hund übertragbar sind. Die Applikation von Trastuzumab erfolgt intravenös und kann entweder als Monotherapie oder in Kombination mit Paclitaxel versucht werden. 70 4.2 Diskussion Ki 67 Bei der Tumorklassifizierung ist die Darstellung und Beurteilung der Zellproliferation ein wichtiger Faktor. Mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen das Ki 67 Antigen lassen sich proliferationsaktive Zellen immunhistochemisch darstellen (GERDES et al. 1983). Darüber hinaus gibt es weitere Methoden zur Bestimmung der Proliferationsaktivität von Zellen, wie z. B. die AgNOR Methode und die PCNA (LÖHR et al. 1997; PENA et al. 1998). Die Proliferationsaktivität eines Tumors ist ein bedeutender prognostischer Faktor in der Humanmedizin. Patienten mit einem hohen prozentualen Anteil proliferierender Ki 67 positiver Zellen in einer Neoplasie, haben eine signifikant kürzere Überlebensdauer als solche mit einem niedrigen Anteil (GERDES et al. 1986). Der monoklonale Antikörper (CONFIRMTM Anti-Ki67) der Firma VENTANA lieferte eine gute Darstellung proliferationsaktiver Zellen in mesenchymalen und epithelialen caninen Mammatumoren. Die Anzahl der positiven Reaktionen stand dabei in direktem Zusammenhang mit der histologischen Tumordiagnose. Eine positive Reaktion konnte in 68,42 % der benignen und 96 % der malignen Tumoren festgestellt werden, wobei die ++ und +++ Reaktionen mit 56 % bei den malignen Tumoren mehr als doppelt so hoch ausfielen wie bei den benignen mit 26,31 %. Die Adenome zeigten in den weniger gut differenzierten Arealen positive Reaktionen und konnten so gut als Bereiche mit erhöhter Proliferationsaktivität identifiziert werden. Bei den benignen Mischtumoren wurden die positiven Zellreaktionen überwiegend in den epithelialen Tumorarealen beobachtet. Die Reaktionen in den mesenchymalen Bereichen waren weniger ausgeprägt, chondroide und osteoide Areale stellten sich negativ dar. Die Karzinome wiesen je nach Tumortyp unterschiedliche Reaktionszahlen und Verteilungsmuster auf. Insgesamt zeigten die benignen Veränderungen weniger positive Zellen als die malignen Tumoren. Der Ki 67 Test ist ein gutes Verfahren zur Darstellung proliferationsaktiver Zellen und eine ergänzende Methode, mit der die Beurteilung caniner Mammatumoren verbessert werden kann (KURTH 1998). Er wurde hier im Bezug zum Hercep Test durchgeführt, um einen Zusammenhang zwischen Rezeptorüberexpression und Ki 67 Antigen zu untersuchen. Im Vergleich zum Hercep Test entsprach der Proliferationsmarker Ki 67, bis auf wenige Diskussion 71 Ausnahmen, den HER2 Scorewerten. Tumoren mit hohen Scorewerten wiesen eine hohe Anzahl an markierten Zellkernen auf und Tumoren mit niedrigen Scorewerten zeigten eine geringe Zahl Ki 67 positiver Zellen. Die überwiegende Anzahl der HER2 positiven Areale innerhalb der Tumoren ließen auch Ki 67 positive Zellen erkennen. Aber teilweise zeigten sich schwach Ki 67 markierte Zellen in HER2 negativen Bereichen, d. h. hier lag eine Proliferation ohne HER2 Überexpression vor. In der Literatur existieren unterschiedliche Angaben über das Verhältnis von HER2 Proteinüberexpression und Ki 67 Level. GONZALEZ-VELA et al. (2001) konnte in seinen Untersuchungen keine statistische Beziehung zwischen HER2 und Ki 67 Index feststellen. CROSIER et al. (1999) und RINGBERG et al. (2001) stellten in ihren Studien jedoch fest, dass eine HER2 Überexpression zusammen mit einer hohen Anzahl von Ki 67 positiv markierten Zellen vorkommt. In unserem Material korrelierten in fünf Fällen niedrige HER2Scorewerte mit einer hohen Anzahl Ki 67 markierter Zellen. Daraus läßt sich schließen, dass proliferierende Zellen nicht zwangsläufig HER2 überexprimieren. Bei einer Probe lag der Fall genau umgekehrt. Der Tumor wies einen hohen HER2 Scorewert auf, zeigte aber nur eine niedrige Anzahl markierter Zellkerne. Das könnte darauf hindeuten, dass der Tumor in dem untersuchten Areal zwar noch HER2 Rezeptoren auf den Zellen sitzen hat, aber eine Proliferation nicht mehr stattfindet. Eine andere mögliche Erklärung wäre, dass sich zu diesem Zeitpunkt die Mehrzahl der Zellen in der G0-Phase des Zellzyklus befanden. Da das proliferationsassoziierte Ki 67 Antigen nur in den aktiven Phasen des Zellzyklus, d. h. in der G1-, S-, G2- und Mitosephase exprimiert wird, nicht aber in der G0-Phase (Ruhephase), würde also kein Ki 67 Antigen vorhanden sein (GERDES et al. 1984). Vor diesem Hintergrund erscheint der Einsatz beider Markierungsmethoden durchaus sinnvoll, auch wenn sich die überwiegende Zahl der Fälle in ihrem Reaktionsmuster entsprachen. Bei Tumoren mit hoher Proliferationsrate sind größere Erfolgschancen mit einer Chemo-, bzw. Radiotherapie zu erwarten, weil beide Therapieformen Tumorzellen nur in der aktiven Zellphase zerstören. Die zunehmende Bereitschaft der Patientenbesitzer im Hinblick auf eine Chemotherapie (SIMON et al. 1996) befürwortet diese Möglichkeit als ergänzende Methode in der Mammatumordiagnostik und –therapie. 72 4.3 Diskussion Multiblock Allgemein bietet der Multiblock neben Reagenzien- und Zeitersparnis die gleichzeitige Untersuchung vieler verschiedener Gewebeproben, wodurch die Vergleichsmöglichkeiten der einzelnen Proben untereinander verbessert werden können. Gut geeignet ist er z. B. für immunhistochemische Studien und In-situ-Hybridisierung bei Archivgeweben, sowie zur Antikörperaustestung. In verschiedenen Studien hat sich diese Technik bereits bewährt (CAMP et al. 2000; TORHORST et al. 2001; GINESTIER et al. 2002; ZHANG et al. 2003; MOBASHERI et al. 2004). Kommerziell wird er z. B. von der Firma CHEMICON, die Gewebearrays oder den Tissue Arrayer, mit dem man selbst Multiblöcke herstellen kann, angeboten, sowie von der Firma ZYTOMED, die aus bis zu 96 Gewebezylindern einen individuellen Multiblock erstellt. Speziell bei unseren Untersuchungen lagen die allgemeinen Vorteile, wie bessere Vergleichsmöglichkeit der Proben untereinander usw. ebenfalls vor. Ein weiterer Vorteil war hier die bessere Übersicht der einzelnen Probe und damit war eine einfachere Beurteilung, bzw. Auszählung der Markierungen möglich. Als nachteilig zu betrachten war hier allerdings, dass nur ein kleiner Ausschnitt des Gesamttumors beurteilt wurde, der möglicherweise nicht repräsentativ für das Gesamtbild war. Anzumerken ist hierbei auch, dass die Abschwimmrate der kleinen Proben größer war, als die des gesamten Tumors und dadurch für diese Proben dann keine Beurteilung mehr möglich war. Zusammenfassend kann man sagen, dass dieses Verfahren vor dem Hintergrund der besseren Vergleichsmöglichkeit der Proben untereinander und Bewertung der einzelnen Proben eine gute Methode ist. Allerdings stellt sich die Frage, ob sie für die Anwendung bei caninen Mammatumoren geeignet ist, da diese Tumoren oft ein sehr heterogenes Bild zeigen, so dass es schwer ist eine repräsentative Stelle zu finden, die für den Gesamttumor spricht. Außerdem ist die Gefahr, dass die kleinen Proben abschwimmen größer als bei dem gesamten Tumor. Dennoch denke ich, dass Routine und Erfahrung, sowie zwei bis drei Stanzen pro Tumor anstelle von einer einzelnen, diese negativen Aspekte in den Hintergrund treten lassen und der Vorteil dieses Verfahrens als zusätzliche Methode bei der Mammatumordiagnostik Verwendung finden könnte. Zusammenfassung 5 73 Zusammenfassung Der Nachweis des HER2 Rezeptors hat sich in den letzten Jahren bei der Behandlung des humanen invasiven Mammakarzinoms zu einem wichtigen prognostischen Indikator und prädiktiven Faktor entwickelt. Er bildet die Grundlage für die Tumorbehandlung mit Herceptin und hat den Krankheitsverlauf von Patientinnen mit entsprechendem Mammakarzinom signifikant positiv beeinflußt. Da die Mammatumoren zu den häufigsten neoplastischen Erkrankungen beim Hund zählen und eine zunehmende Bereitschaft der Hundebesitzer im Hinblick auf eine Chemotherapie zu verzeichnen ist, bildet der HER2 Status eine interessante Perspektive als Therapieansatz auch für die Veterinärmedizin. In dieser Studie wurde an 91 caninen Mammatumorproben die diagnostische und prognostische Aussagekraft der HER2 Proteinüberexpression mit Hilfe des Hercep Tests der Firma DakoCytomation immunhistochemisch getestet. Als vergleichender prognostischer Marker wurde der monoklonaler Antikörper Ki 67 eingesetzt, der proliferationsaktive Zellen markiert. Beide Markierungen wurden zusätzlich am Multiblocksystem getestet, um diese Methode hinsichtlich einer Vergleichsmöglichkeit für die Routinediagnostik zu evaluieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der HER2 Rezeptornachweis beim Hund gut mit dem in der Humanmedizin etablierten Hercep Test der Firma DakoCytomation durchführbar ist. Diese Methode ist einfach, wenig zeitaufwendig und liefert leicht auswertbare Ergebnisse. Sie ist gut in Kombination mit der histologischen Tumordiagnose am H.-E. Schnitt anwendbar. Auch Metastasen können detektiert werden. Die 91 Mammatumoren wurden pathohistologisch in 42 (46,15 %) benigne und 49 (53,85 %) maligne Tumoren eingeteilt. Unter den malignen Tumoren zeigten 20,41 % eine Überexpression des HER2 Proteins, darunter wiesen drei Plattenepithelkarzinome (25 %), fünf einfache Karzinome (20,8 %) und zwei komplexe Karzinome (15,4 %) positive Markierungen auf. Die benignen Tumoren ließen ebenfalls mit 7,41 % eine geringe Menge an HER2 Protein erkennen. Positive Markierungen waren hier jeweils in den Arealen der beginnenden Entdifferenzierung bei zwei komplexen Adenomen (14,3 %) und einem benignen Mischtumor (6,3 %) zu sehen. 74 Zusammenfassung In der Ki 67 Untersuchung konnten bei 68,42 % der benignen und 96 % der malignen Tumoren eine positive Reaktion festgestellt werden, wobei sich mittel und hochgradige Reaktionen mit 56 % bei den malignen und mit 26,31 % bei den benignen Tumoren darstellten. In der Gegenüberstellung zum Hercep Test korrelierten, bis auf wenige Ausnahmen, hohe Scorewerte mit einer hohen Anzahl Ki 67 markierter Zellen, so wie niedrige Scorewerte sich in einer geringe Zahl markierter Zellkerne widerspiegelten. Unter den benignen Mischtumoren und Karzinomen korrelierten in fünf Fällen niedrige Scorewerte mit einer hohen Anzahl Ki 67 markierter Zellen und bei einem einfachen Karzinom war es genau umgekehrt. Die Verwendung des Multiblocks ergab dabei vergleichbare Ergebnisse, so dass sich diese Methode für Laboratorien eignet, die eine große Anzahl von Proben zeit- und kostengünstig immunhistochemisch bearbeiten wollen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass auch bei caninen Mammatumoren der HER2 Rezeptor eine Rolle spielt und damit auch für den Hund eine entsprechende Herceptin-Therapie erfolgversprechende Ansätze bieten könnte. 75 Summary 6 Summary In recent years the HER2 receptor proved to be an important prognostic indicator and predictive factor within the treatment of invasive breast carcinomas in humans. The detection of this receptor provides the basis for the Herceptin therapy, which significantly improves the course of disease in patients suffering from breast carcinomas. As mammary tumors are among the most common neoplasms in female dogs and chemotherapeutical treatment in dogs becomes more important, the HER2 status represents an interesting perspective as an therapeutical approach in veterinary medicine. In the present study the Hercep Test of DakoCytomation was tested for its diagnostic and prognostic significance concerning the HER2 overexpression in 91 specimen of canine mammary tumors. The monoclonal antibody Ki 67, which is selective for proliferating cells, served as comparative prognostic marker. We also tested both markers in a tissue array system to evaluate this method for its use in routine diagnostic. The detection of HER2 receptor in dogs can be carried out successfully with the Hercep Test of DakoCytomation, which represents an established test in human medicine. The method is easy and timesaving and provides analysable results. It can be applied in combination with histological diagnosis of the tumor and is also able to detect metastases. 91 mammary tumors were pathohistologicalls divided into 42 (46,15 %) benign and 49 (53,85 %) malignant tumors. 20,41 % of the malignant tumors showed an overexpression of HER2 protein. Among these there were three squamous cell carcinomas (25 %), five simple carcinomas (20,8 %) and two complex carcinomas (15,4 %) with positive markings. 7,41 % of the benign tumors also revealed a small amount of HER2 protein. The positive markings were located in areas of incipient dedifferentiation in two complex adenomas (14,3 %) and in one benign mixed tumor (6,3 %). The examination using the marker Ki 67 revealed a positive reaction in 68,42 % of the benign and 96 % of the malignant tumors. In comparison to the Hercep Test high scores correlated with a high degree of Ki 67 marked cells and low scores were associated with a small number of marked cellular nuclei in the majority of cases. 76 Summary The tissue array system showed comparable results and is therefore a suitable method for laboratories which want to carry out immunohistochemical examinations of a large number of probes at areasonable price. The present study shows that the HER2 receptor plays an important role in canine mammary tumors. For this reason the Herceptin therapy could be a promising approach. Literaturverzeichnis 7 Literaturverzeichnis AHERN, T. E., R. C. BIRD, A. E. CHURCH BIRD u. L. G. WOLFE (1996): Expression of the oncogene c-erbB-2 in canine mammary cancers and tumor-derived cell lines. Am. J. Vet. Res. 57, 693-696 AKIYAMA, T., C. SUDO, H. OGAWARA, K. TOYOSHIMA u. T. YAMAMOTO (1986): The product of the human c-erbB-2 gene: a 185-kilodalton glycoprotein with thyrosine kinase activity. Science 232, 1644-1646 ARNOLD, S. (2001): Erkrankungen der Milchdrüse. In: H. G. NIEMAND u. P. F. SUTER (Hrsg.): Praktikum der Hundeklinik. 9. Aufl., Verlag Parey, Berlin, S. 934-936 BASELGA, J. (2001): Herceptin alone or in combination with chemotherapy in the treatment of HER2-positive metastatic breast cancer: Pivotal trials. Oncology 61, 14-21 BIECHE, I., P. ONODY, S. TOZLU, K. DRIOUCH, M. VIDAUD u. R. LIDEREAU (2003): Prognostic value of ERBB family mRNA expression in breast carcinomas. Int. J. Cancer 106, 758-765 BILOUS, M., M. DOWSETT, W. HANNA, J. ISOLA, A. LEBEAU, A. MORENO, F. PENAULT-LLORCA, J. RÜSCHOFF, G. TOMASIC u. M. VAN DE VIJVER (2003): Current perspectives on HER2 testing: A review of national testing guidelines. Mod. Pathol. 16, 173-182 BLOOM, K. J., H. GOVIL, P. GATTUSO, V. REDDY u. D. FRANCESCATTI (2001): Status of HER-2 in male and female breast carcinoma. Am. J. Surg. 182, 389-392 BOMHARD, D. VON, u. J. DREIACK (1977): Statistische Erhebungen über Mammatumoren bei Hündinnen. Kleintier-Prax. 22, 205-209 BOSTEDT, H. (1994): Gesäugekrankheiten bei Hund und Katze. In: K. WENDT, H. BOSTEDT, H. MIELKE u. H. W. FUCHS (Hrsg.): Euter- und Gesäugekrankheiten. Verlag Fischer, Jena, Stuttgart, S. 492-509 77 78 Literaturverzeichnis BOSTEDT, H., u. I. TAMMER (1995): Kasuistischer Beitrag zur Prognose bei Mammatumoren des Hundes. Prakt. Tierarzt 10, 921-924 BOSTOCK, D. E. (1986): Canine and feline mammary neoplasms. Br. Vet. J. 142, 506-515 BOSTOCK, D. E., u. L. N. OWEN (1976): Milchdrüse. In: D. E. BOSTOCK u. L. N. OWEN (Hrsg.): Geschwülste bei Katze, Hund und Pferd. Verlag Schattauer, Stuttgart, New York, S. 54-61 BRODEY, R. S., M. H. GOLDSCHMIDT u. J. R. ROSZEL (1983): Canine mammary gland neoplasms. J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 19, 61-90 CAMP, R. L., L. A. CHARETTE u. D. L. RIMM (2000): Validation of tissue microarray technology in breast carcinoma. Lab. Invest. 80, 1943-1949 CHRISTENSEN, G. C. (1979): The mammae. In: H. E. EVANS u. G. C. CHRISTENSEN (Hrsg.): Millers anatomy of the dog. W. B. Saunders Company, Philadelphia, S. 101-106 CIARDIELLO, F., u. N. NORMANNO (2002): A growth industry. Epidermal growth factor receptors and cancer therapy. In: HELIX, AMGEN’S Magazine of Biotechnology. Habo DaCosta, Vianen, The Netherlands, S. 10-18 CROSIER, M., D. SCOTT, R. G. WILSON, C. D. M. GRIFFITHS, F. E. B. MAY u. B. R. WESTLEY (1999): Differences in Ki 67 and c-erbB2 expression between screen-detected and true interval breast cancers. Clin. Cancer Res. 5, 2682-2688 DAHME, E., u. E. WEISS (1958): Zur Systematik der Mammatumoren des Hundes. Dtsch. Tierärztl. Wochenschrift 65, 458-461 DE LAS MULAS, J. M., J. ORDAS, Y. MILLAN, V. FERNANDEZ-SORIA u. S. R. CAJAL (2003): Oncogene HER-2 in canine mammary gland carcinomas. Breast Cancer Res. Treat. 80, 363-367 Literaturverzeichnis DIAZ, N. M. (2001): Laboratory testing for HER2/neu in breast carcinoma: an evolving strategy to predict response to targeted therapy. Cancer Control 8, 415-418 DONNAY, I., N. DEVLEESCHOUWER, P. WOUTERS-BALLMAN, G. LECLERCQ u. J. VERSTEGEN (1996): Relationship between receptors for epidermal growth factor and steroid hormones in normal, dysplastic and neoplastic canine mammary tissues. Res. Vet. Sci. 60, 251-254 DONNAY, I., J. RAUIS, P. WOUTERS-BALLMAN, N. DEVLEESCHOUWER, G. LECLERCQ u. J. VERSTEGEN (1993): Receptors for estrogen, progesterone and epidermal growth factor in normal and tumorous canine mammary tissues. J. Reprod. Fertil. 47, 501-512 ESCOBAR, H. M., K. BECKER, J. BULLERDIEK u. I. NOLTE (2001): The canine ERBB2 gene maps to a chromosome region frequently affected by aberrations in tumors of the dog (Canis familiaris). Cytogenet. Cell Genet. 94, 194-195 ESKENS, U. (1983): Statistische Untersuchungen über nach den Empfehlungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) klassifizierten Geschwülste des Hundes unter besonderer Berücksichtigung der Mamma- und Hauttumoren. Gießen, Univ., Fachber. Veterinärmed., Diss. FERGUSON, H. R. (1985): Canine mammary gland tumors. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 15, 501-511 FIELD, A. S., N. L. CHAMBERLAIN, D. TRAN u. A. L. MOREY (2001): Suggestions for HER2/neu testing in breast carcinoma, based on a comparison of immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridisation. Pathology 33, 278-282 FRESE, K., B. DURCHFELD u. U. ESKENS (1989): Klassifikation und biologisches Verhalten der Haut- und Mammatumoren von Hund und Katze. Prakt. Tierarzt 9, 69-84 GERDES, J., R. J. LELLE, H. PICKARTZ, W. HEIDENREICH, R. SCHWARTING, L. KURTSIEFER, G. STAUCH u. H. STEIN (1986): Growth fractions in breast cancers determined in situ with monoclonal antibody Ki 67. J. Clin. Pathol. 39, 977-980 79 80 Literaturverzeichnis GERDES, J., H. LEMKE, H. BAISCH, H.-H. WACKER, U. SCHWAB u. H. STEIN (1984): Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki 67. J. Immunol. 133, 1710-1715 GERDES, J., U. SCHWAB, H. LEMKE u. H. STEIN (1983): Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int. J. Cancer 31, 13-20 GINESTIER, C., E. CHARAFE-JAUFFRET, F. BERTUCCI, F. EISINGER, J. GENEIX, D. BECHLIAN, N. CONTE, J. ADELAIDE, Y. TOIRON, C. NGUYEN, P. VIENS, M. J. MOZZICONACCI, R. HOULGATTE, D. BIRNBAUM u. J. JACQUEMIER (2002): Distinct and complementary information provided by use of tissue and DNA microarrays in the study of breast tumor markers. Am. J. Pathol. 161, 1223-1233 GOEL, S., S. MANI u. R. PEREZ-SOLER (2002): Tyrosine kinase inhibitors: a clinical perspective. Curr. Oncol. Rep. 4, 9-19 GONZALEZ-VELA, M. C., M. F. GARIJO, F. FERNANDEZ u. J. F. VAL-BERNAL (2001): MIB1 proliferation index in breast infiltrating carcinoma: comparison with other proliferative markers and association with new biological prognostic factors. Histol. Histopathol. 16, 399-406 GUTBERLET, K., N. WEY, R. RUDOLPH u. L. BRUNNBERG (1998): Mammatumoren der Hündin. In: E. WIESNER (Hrsg.): Handlexikon der tierärztlichen Praxis (202), Verlag Fischer, Stuttgart, S. 564zi-565a HABERMEHL, K. H. (1996): Haut und Hautorgane. In: K. H. HABERMEHL, B. VOLLMERHAUS, H. WILKENS u. H. WAIBL (Hrsg.): Lehrbuch der Anatomie der Haustiere. 3. Aufl., Verlag Parey, Berlin, Bd. 3, S. 443-576 HANNA, W. (2001): Testing for HER2 status. Oncology 61, 22-30 HIRSCHBERGER, J. (2001): Prinzipien der Chemotherapie beim Hund. Tierärztl. Prax. 29, 20-24 Literaturverzeichnis HIRSCHFELD, D., D. SIMON, D. SCHÖNROCK, K. CULMSEE, A. MELLIN u. I. NOLTE (2001): Strahlentherapie in der Kleintiermedizin. Prakt. Tierarzt 82, 16-21 HYNES, N. E., u. D. F. STERN (1994): The biology of erbB-2/neu/HER2 and its role in cancer. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer 1198, 165-184 JARDINES, L., M. WEISS, B. FOWBLE u. M. GREENE (1993): Neu (c-erbB-2/HER2) and the epidermal growth factor receptor (EGFR) in breast cancer. Pathobiology 61, 268-282 KÄLIN, S., M. SUTER u. G. LOTT-STOLZ (1985): Mammatumoren beim Hund: Beurteilung, Prognose und biologisches Verhalten. Schweiz. Arch. Tierheilkd. 127, 205-212 KASER-HOTZ, B. (2001): Strahlentherapie. In: H. G. NIEMAND u. P. F. SUTER (Hrsg.): Praktikum der Hundeklinik. 9. Aufl., Verlag Parey, Berlin, S. 1173-1175 KAUFMANN, M., u. L. KANZ (2000): Immuntherapie der Mammakarzinome mit Herceptin: Zweiter Expertenworkshop “Neue Entwicklungen bei der Therapie des metastasierten Mammakarzinoms”. Dtsch. Ärztebl. 97, A 844-847 KLAPPER, L. N., M. H. KIRSCHBAUM, M. SELA u. Y. YARDEN (2000): Biochemical and clinical implications of the ErbB/HER signaling network of growth factor receptors. Adv. Cancer Res. 77, 25-79 KOEPPEN, H. K. W., B. D. WRIGHT, A. D. BURT, P. QUIRKE, A. M. McNICOL, N. O. DYBDAL, M. X. SLIWKOWSKI u. K. J. HILLAN (2001): Overexpression of HER2/neu in solid tumours: an immunohistochemical survey. Histopathology 38, 96-104 KORKOLIS, D., A. ARDAVANIS, J. YOTIS, A. KYROUDI, V. GORGOULIS u. C. KITTAS (2001): HER2-/neu overexpression in breast cancer: an immunohistochemical study including correlations with clinicopathologic parameters, p53 oncoprotein and cathepsin-D. Anticancer Res. 21, 2207-2212 KUMAR, R., u. R. YARMAND-BAGHERI (2001): The Role of HER2 in angiogenesis. Seminars Oncol. 28, 27-32 81 82 Literaturverzeichnis KURTH, T. (1998): Beitrag zur prognostischen Aussagefähigkeit verschiedener immunhistologischer Marker bei caninen Mammatumoren. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. KURTH, T., S. NEUMANN u. E. REINHART (2000): Postoperative Nachbehandlung bei caninen Mammatumoren mit biologischen Präparaten. Prakt. Tierarzt 81, 276-291 LEHR, H.-A., T. W. JACOBS, H. YAZIJI, S. J. SCHNITT u. A. M. GOWN (2001): Quantitative evaluation of HER2/neu status in breast cancer by fluorescence in situ hybridization and by immunohistochemistry with image analysis. Am. J. Clin. Pathol. 115, 814-22 LEITZEL, K., Y. TERAMOTO, E. SAMPSON, J. MAUCERI, B. C. LANGTON, L. DEMERS, E. PODCZASKI, H. HARVEY, S. SHAMBAUGH, G. VOLAS, S. WEAVER u. A. LIPTON (1992): Elevated soluble c-erbB-2 antigen levels in the serum and effusions of a proportion of breast cancer patients. J. Clin. Oncol. 10, 1436-1443 LEYLAND-JONES, B., u. I. SMITH (2001): Role of Herceptin in primary breast cancer: views from North America and Europe. Oncology 61, 83-91 LIEBICH, H.-G. (1993): Haut und Hautorgane. In: H.-G. LIEBICH (Hrsg.):Funktionelle Histologie. Farbatlas und Kurzlehrbuch der mikroskopischen Anatomie der Haussäugetiere. 2. Aufl., Verlag Schattauer, Stuttgart, New York, S. 274-292 LOAR, A. S. (1986): The managment of canine mammary tumors. In: J. D. BONAGURA u. R. W. KIRK (Hrsg.): Current Veterinary Therapy IX – Small Animal Practice. W. B. Saunders Company, Philadelphia, S. 480-487 LÖHR, C. V., J. P. TEIFKE, K. FAILING u. E. WEISS (1997): Characterization of the proliferation state in canine mammary tumors by the standardized AgNOR method with postfixation and immunohistologic detection of Ki-67 and PCNA. Vet. Pathol. 34, 212-221 MacEWEN, E. G., u. S. J. WITHROW (1996): Tumors of the mammary gland. In: S. J. WITHROW u. E. G. MacEWEN (Hrsg.): Small animal clinical oncology. 2. Aufl., W. B. Saunders Company, Philadelphia, S. 356-372 83 Literaturverzeichnis MANN, F. A. (1984): Canine mammary gland neoplasia. Canine Practice 11, 22-26 MANZEL, O. (1995): Immunhistochemische Darstellung Gewebeschnitten des Hundes. Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss. der Östrogen- McKEAGE, K., u. C. M. PERRY (2002): Ein Überblick über die Anwendung in Mammakarzinoms bei HER2-Überexpression. Drugs 62, 209-248 der und Progesteronrezeptoren Behandlung des in metastasierten MENARD, S., P. CASALINI, M. CAMPIGLIO, S. PUPA, R. AGRESTI u. E. TAGLIABUE (2001 a): HER2 overexpression in various tumor types, focussing on its relationship to the development of invasive breast cancer. Ann. Oncol. 12, 15-19 MENARD, S., S. FORTIS, F. CASTIGLIONI, R. AGRESTI u. A. BALSARI (2001 b): HER2 as a prognostic factor in breast cancer. Oncology 61, 67-72 MENARD, S., S. M. PUPA, M. CAMPIGLIO u. E. TAGLIABUE (2003): Biologic and therapeutic role of HER2 in cancer. Oncogene 22, 6570-6578 MENDELSOHN, J., u. J. BASELAG (2000): The EGF receptor family as targets for cancer therapy. Oncogene 19, 6550-6565 MEURER, D. G. (1999): Pathologie des Tumorgeschehens. In: D. G. MEURER (Hrsg.): Allgemeine Pathologie. Kompendium Veterinärmedizin. Verlag Schattauer, Stuttgart, New York, S. 159-170 für die MICHEL, G. (1994): Anatomie der Milchdrüse. In: K. WENDT, H. BOSTEDT, H. MIELKE u. H. W. FUCHS (Hrsg.): Euter- und Gesäugekrankheiten. Verlag Fischer, Jena, Stuttgart, S. 17-63 MISDORP, W., R. W. ELSE, E. HELLMEN u. T. P. LIPSCOMB (1999): Histological classification of mammary tumors of the dog and the cat. Washington, D.C., Second series, Volume VII 84 Literaturverzeichnis MOBASHERI, A., R. AIRLEY, C. S. FOSTER, G. SCHULZE-TANZIL u. M. SHAKIBAEI (2004): Post-genomic applications of tissue microarrays: basic research, prognostic oncology, clinical genomics and drug discovery. Histol. Histopathol. 19, 325-335 MOKBEL, K., u. D. HASSANALLY (2001): From HER2 to Herceptin. Curr. Med. Res. Opin. 17, 51-59 MOSIMANN, W., u. T. Kohler (1990): Milchdrüse. In: W. MOSIMANN u. T. KOHLER (Hrsg.): Zytologie, Histologie und mikroskopische Anatomie der Haussäugetiere. Verlag Parey, Berlin, Hamburg, S. 288-294 MOULTON, J. E. (1990): Tumors of mammary gland. In: J. E. MOULTON (Hrsg.): Tumors of domestic animals. 3. Aufl., University of California Press, Los Angeles, USA, S. 518-552 NAKOPOULOU, L. L., A. ALEXIADOU, G. E. THEODOROPOULOS, A. C. LAZARIS, A. TZONOU u. A. KERAMOPOULOS (1996): Prognostic significance of the co-expression of p53 and c-cerbB-2 proteins in breast cancer. J. Pathol. 179, 31-38 NEVE, R. M., H. A. LANE u. N. E. HYNES (2001): The role of overexpressed HER2 in transformation. Ann. Oncol. 12, 9-13 NOLTE, I., u. M. NOLTE (2000): Tumoren der Haut und ihrer Anhangsorgane. In: I. NOLTE u. M. NOLTE (Hrsg.): Praxis der Onkologie bei Hund und Katze. Verlag Enke, Stuttgart, S.133-154 OKUYAMA, N., Y. HATANO, Y. PARK, S. SHIMATANI, S. SASAMOTO, N. KATOU, K. TAKAGI, S. YAMAZAKI, A. INOUE, H. HEMMI, H. SHIMATAKE, M. YANAGIDA u. M. MIURA (1999): Quantitation of c-erbB2 gene amplification in breast cancer tissue by competitive PCR. Tumour Biol. 20, 153-161 ONODY, P., F. BERTRAND, F. MUZEAU, I. BIECHE u. R. LIDEREAU (2001): Fluorescence in situ hybridization and immunohistochemical assays for HER-2/neu status determination. Arch. Pathol. Lab. Med. 125, 746-750 Literaturverzeichnis PAULETTI, G., W. GODOLPHIN, M. F. PRESS u. D. J. SLAMON (1996): Detection and quantitation of HER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene 13, 63-72 PENA, L. L., A. I. NIETO, D. PEREZ-ALENZA, P. CUESTA u. M. CASTANO (1998): Immunohistochemical detection of Ki-67 and PCNA in canine mammary tumors: Relationship to clinical and pathologic variables. J. Vet. Diagn. Invest. 10, 237-246 POPESCU, N. C., C. R. KING u. M. H. KRAUST (1989): Localization of the human erbB-2 gene on normal and rearranged chromosomes 17 to bands q12-21.32. Genomics 4, 362-366 RAVIKUMAR, K. P., M. S. VASANTH, C. L. SIRINIVAS, B. N. RANAGANATH u. S. M. JAYADEVAPPA (2000): Clinical evaluation of different chemotherapeutic agents for mammary tumors in canines. Indian Vet. J. 77, 522-524 REINACHER, M. (2001): Zur Tumorklassifikation. Tierärztl. Prax. 29, 1-4 RENNER, C., F. HARTMANN u. M. PFREUNDSCHUH (2002): Immuntherapeutische Strategien zur Behandlung solider Tumoren. Dtsch. Ärztebl. 99, A 850-858 RINGBERG, A., L. ANAGNOSTAKI, H. ANDERSON, I. IDVALL u. M. FERNOE (2001): Cell biological factors in ductal carcinoma in situ (DCIS) of the breast-relationship to ipsilateral local recurrence and histopathological characteristics. Eur. J. Cancer 37, 1514-1522 ROSS, J. S., u. J. A. FLETCHER (1999): HER2/neu (c-erb-B2) gene and protein in breast cancer. Am. J. Clin. Pathol. 112, 53-67 RUNGSIPIPAT, A., S. TATEYAMA, R. YAMAGUCHI, K. UCHIDA, N. MIYOSHI u. T. HAYASHI (1999): Immunohistochemical analysis of c-yes and c-erbB-2 oncogene products and p53 tumor suppressor protein in canine mammary tumors. J. Vet. Med. Sci. 61, 27-32 85 86 Literaturverzeichnis SCHOENBAUER, M. (1984): Zur Frage der Nomenklatur und Klassifikation tierischer Geschwülste anhand der derzeit anerkannten Klassifikationssysteme am Beispiel der Mammatumoren. Ein Beitrag zur vergleichenden Onkologie. Berl. Münch. Tierärztl. Wochenschr. 97, 245-251 SCHOLL, S., P. BEUZEBOC u. P. POUILLART (2001): Targeting HER2 in other tumor types. Ann. Oncol. 12, 81-87 SHEPARD, H. M., G. D. LEWIS, J. C. SARUP, B. M. FENDLY, D. MANEVAL, J. MORDENTI, I. FIGARI, C. E. KOTTS, M. A. PALLADINO, JR., A. ULLRICH u. D. SLAMON (1991): Monoclonal antibody therapy of human cancer: Taking the HER2 protooncogene to the clinic. J. Clin. Immunol. 11, 117-127 SIMON, D., K. CULMSEE, D. SCHOENROCK, A. MELLIN, M. EICKHOFF u. I. NOLTE (2001 a): Einsatz der Radiotherapie in der Veterinärmedizin. Tierärztl. Prax. 29, 92-97 SIMON, D., P. GORONZY, I. STEPHAN, A. MEYER-LINDENBERG, M. AUFDERHEIDE u. I. NOLTE (1996): Mammatumoren beim Hund: Untersuchung zu Vorkommen und Verlauf der Erkrankung. Prakt. Tierarzt 77, 771-782 SIMON, D., D. SCHOENROCK, S. UEBERSCHÄR, J. SIEBERT u. I. NOLTE (2001 b): Mammatumoren des Hundes: Diagnostik und Therapie. Tierärztl. Prax. 29, 47-50 SLAMON, D. J., G. M. CLARK, S. G. WONG, W. J. LEVIN, A. ULLRICH u. L. McGUIRE (1987): Human breast cancer: Correlation of relapse and survival with amplification of the HER2/neu Oncogene. Science 235, 177-182 SLAMON, D. J., W. GODOLPHIN, L. A. JONES, J. A. HOLT, S. G. WONG, D. E. KEITH, W. J. LEVIN, S. G. STUART, J. UDOVE, A. ULLRICH u. M. F. PRESS (1989): Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. Science 244, 707-712 SUTER, P. F. (2001): Tumorbiologie. In: H. G. NIEMAND u. P. F. SUTER (Hrsg.): Praktikum der Hundeklinik. 9. Aufl., Verlag Parey, Berlin, S. 1160-1163 Literaturverzeichnis TANNER, M., D. GANCBERG, A. DI LEO, D. LARSIMONT, G. ROUAS, M. J. PICCART u. J. ISOLA (2000): Chromogenic in situ hybridization: A practical alternative for fluorescence in situ hybridisation to detect HER-2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. Am. J. Pathol. 157, 1467-1472 TAP, O. T., G. R. RUTTEMAN, C. ZIJLSTRA, N. A. DE HAAN u. A. A. BOSMA (1998): Analysis of chromosome aberrations in a mammary carcinoma cell line from a dog by using canine painting probes. Cytogenet. Cell Genet. 82, 75-79 TORHORST, J., C. BUCHER, J. KONONEN, P. HAAS, M. ZUBER, O. R. KOCHLI, F. MROSS, H. DIETERICH, H. MOCH, M. MIHATSCH, O. P. KALLIONIEMI u. G. SAUTER (2001): Tissue microarrays for rapid linking of molecular changes to clinical endpoints. Am. J. Pathol. 159, 2249-2256 VAN DE VIJVER, M. (2001): Assessment of the need and appropriate method for testing for the human epidermal growth factor receptor-2 (HER2). Eur. J. Cancer 37, 11-17 VAN DE VIJVER, M. (2002): Emerging technologies for HER2 testing. Oncology 63, 33-38 VOGEL, C. L., M. A. COBLEIGH, D. TRIPATHY, J. C. GUTHEIL, L. N. HARRIS, L. FEHRENBACHER, D. J. SLAMON, M. MURPHY, W. F. NOVOTNY, M. BURCHMORE, S. SHAK u. S. J. STEWART (2001): First-line Herceptin monotherapy in metastatic breast cancer. Oncology 61, 37-42 VOLLMERHAUS, B. (1996): Lymphatisches System. In: K. H. HABERMEHL, B. VOLLMERHAUS, H. WILKENS u. H. WAIBL (Hrsg.): Lehrbuch der Anatomie der Haustiere. 3. Aufl., Verlag Parey, Berlin, Bd. 3, S. 276-422 WAIBL, H., H. WILKENS u. W. MÜNSTER (1996): Arterien, Venen. In: K. H. HABERMEHL, B. VOLLMERHAUS, H. WILKENS u. H. WAIBL (Hrsg): Lehrbuch der Anatomie der Haustiere. 3. Aufl., Verlag Parey, Berlin, Bd. 3, S. 74-275 WANG, S.-C, u. M.-C. HUNG (2001): HER2 overexpression and cancer targeting. Seminars Oncol. 28, 115-124 87 88 Literaturverzeichnis WEY, N., K. GUTBERLET, B. KOHN, R. RUDOLPH, H.-O. HOPPEN u. L. BRUNNBERG (2000): Mammatumore bei der Hündin: Hormonelle Abhängigkeit unter besonderer Berücksichtigung von 17ß-Östradiol und Progesteron. Kleintier-Prax. 45, 19-31 YAMAUCHI, H., V. STEARNS u. D. F. HAYES (2001): The role of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. Breast Cancer 8, 171-183 YANG, F., P. C. M. O’BRIEN, B. S. MILNE, A. S. GRAPHODATSKY, N. SOLANKY, V. TRIFONOV, W. RENS, D. SARGAN u. M. A. FERGUSON-SMITH (1999): A complete comparative chromosome map for the dog, red fox, and human and its integration with canine genetic maps. Genomics 62, 189-202 YARDEN, Y. (2001): Biology of HER2 and its importance in breast cancer. Oncology 61, 1-13 YU, D. (2001): Mechanisms of ErbB2-mediated Paclitaxel resistance and Trastuzumab-mediated Paclitaxel sensitization in ErbB2-overexpressing breast cancers. Seminars Oncol. 28, 12-17 ZANINOVIC, P., u. V. SMICIC (1994): Epidemiology of mammary tumors in dogs. Eur. J. Comp. Anim. Pract. 4, 67-76 ZHANG, D. H., M. SALTO-TELLEZ, L. L. CHIU, L. SHEN u. E. S. KOAY (2003): Tissue microarray study for classification of breast tumors. Life Sci. 73, 3189-3199 89 Anhang Anhang 8 8.1 Rezepte 8.1.1 Einbettungsprotokoll ¾ Spülen mit Aqua dest. für 2 h bei Zimmertemperatur ¾ Aufsteigende Alkoholreihe (50%ig, 70%ig, 80%ig, 96%ig, 96%ig, 100%ig, 100%ig) für je 45 min bei 35° C und Vakuum ¾ Zweimal Chloroform für 1 h 30 min bzw. 1 h bei Zimmertemperatur und Vakuum ¾ Zweimal Paraffin für je 1 h 30 min bei 60°C und Vakuum ¾ Die fertigen Paraffinblöcke werden anschließend bei Raumtemperatur aufbewahrt. 8.1.2 Hämalaun-Eosin-Färbung (H.-E.) ¾ Entparaffinierung und Rehydratisierung: ¾ Xylol unter dreimaligem Wechsel (5 min, 2 min, 2 min) ¾ absteigende Alkoholreihe(100%ig, 96%ig für je 2 min, 80%ig, 70%ig für je 1 min) ¾ Aqua dest. für 1 min ¾ Hämalaun nach Mayer (Fa. Merck, Darmstadt) für 3 min ¾ 10 min fließend wässern ¾ Eosin für 5 min ¾ 5 sek fließend wässern ¾ Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe: ¾ 70%iger, 80%iger, 96%iger, 100%iger Alkohol für 1 min ¾ 100%iger Alkohol für 2 min 90 Anhang ¾ Xylol unter dreimaligem Wechsel (1 min, 3 min, 3 min) ¾ Eindecken mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg) Eosin-Färbelösung: 35,6 g Instant Eosin (Fa. Shandon, Frankfurt am Main) ad 1000 ml Aqua dest. 8.1.3 Versuchsprotokoll Hercep Test Vorbereitungen: 1. Lösungen ansetzen ¾ Waschpuffer = 500 ml (50 ml Puffer + 450 ml Aqua dest.) ¾ Retrieval-Lsg. = 200 ml (20 ml Retrieval + 180 ml Aqua dest.) ¾ DAB = 2 x 1 ml (1 ml Substrat + 1 Tropfen Chromogen) 2. Schnitte entparaffinieren und rehydrieren ¾ Absteigende Alkoholreihe im Färbeautomaten VaristainGemini (Fa. Shandon, Frankfurt am Main) nach folgendem Protokoll: ¾ Heizstation 30 min, 60° C ¾ Xylol unter dreimaligem Wechsel (5 min, 2 min, 2 min) ¾ 100%iger Alkohol 2 min ¾ 96%iger Alkohol 2 min ¾ 80%iger Alkohol 1 min ¾ 70%iger Alkohol 1 min ¾ endet im Aqua dest. 91 Anhang Durchführung: 1. Wasserbad (zur Antigen-Demaskierung) ¾ Wasserbad auf 92-99° C erwärmen ¾ Plastik-Küvette mit Deckel und 200 ml Retrieval-Lsg. ins Wasserbad stellen und ebenfalls erwärmen ¾ Schnitte in der Plastik-Küvette im Wasserbad 40 min inkubieren ¾ Küvette herausnehmen und 20 min bei Raumtemperatur auskühlen lassen ¾ Schnitte mit Puffer abspülen und 5 min im Pufferbad stehen lassen 2. Feuchte Kammer bzw. Coverplates (Fa. Shandon, Frankfurt am Main) ¾ Peroxidaseblockierung ¾ Schnitte in Coverplates einlegen und 1x mit Puffer auffüllen ¾ 3 Tropfen (100µl) Peroxidase eintropfen und 5 min inkubieren ¾ mit Aqua dest. abspülen und 5 min im Pufferbad stehen lassen ¾ Primärantikörper ¾ Kontrolle + Patientenschnitt (pos.): 3 Tropfen Primärantikörper ¾ Patientenschnitt (neg.): 3 Tropfen Negativ-Reagenz ¾ 30 min inkubieren, anschließend mit Puffer abspülen und 5 min im Pufferbad stehen lassen ¾ Sekundärantikörper ¾ 3 Tropfen (100µl) Detektionsreagenz eintropfen und 30 min inkubieren ¾ mit Puffer abspülen und 5 min im Pufferbad stehen lassen ¾ DAB ¾ 3 Tropfen (100µl) DAB-Lsg. eintropfen und 10 min inkubieren 92 Anhang ¾ mit Aqua dest. abspülen, aus Coverplates nehmen und 5 min im Aqua dest. stehen lassen 3. Gegenfärbung ¾ Schnitte für 30 sek in Hämatoxylin stellen ¾ Schnitte kurz in Küvette mit Aqua dest. stellen und anschließend 8 min fließend mit Leitungswasser wässern 4. Dehydrierung ¾ Aufsteigende Alkoholreihe im Färbeautomaten VaristainGemini (Fa. Shandon, Frankfurt am Main) nach folgendem Protokoll: ¾ 70%iger, 80%iger, 96%iger und 100%iger Alkohol jeweils für 1 min ¾ 100%iger Alkohol für 2 min ¾ Xylol unter dreimaligem Wechsel (1 min, 3 min, 3 min) 5. Eindecken ¾ Anschließend werden die Objektträger mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg) eingedeckt 8.1.4 Versuchsprotokoll Ki 67 Vorbereitungen: 1. Schnitte entparaffinieren und rehydrieren ¾ Absteigende Alkoholreihe im Färbeautomaten VaristainGemini (Fa. Shandon, Frankfurt am Main) nach folgendem Protokoll: ¾ Heizstation 30 min, 60° C ¾ Xylol unter dreimaligem Wechsel (5 min, 2 min, 2 min) ¾ 100%iger Alkohol 2 min 93 Anhang ¾ 96%iger Alkohol 2 min ¾ 80%iger Alkohol 1 min ¾ 70%iger Alkohol 1 min ¾ endet im Aqua dest. 2. Schnellkochtopf (zur Antigen-Demaskierung) ¾ 1 Liter Citratpuffer im Topf zum Kochen bringen ¾ Paraffinschnitte in den kochenden Puffer stellen, Deckel schließen. Wenn der Maximaldruck im Topf erreicht ist, Schnitte noch 1 min kochen lassen ¾ Anschließend zum Druckausgleich kaltes Wasser über den Topf laufen lassen, Topf öffnen und Schnitte noch ca. 20 min im Puffer stehen lassen 3. NexES-IHC-Färbemodul vorbereiten ¾ Etiketten drucken und Reagenzienkarussell bestücken ¾ Waschpuffer und Öl auffüllen, sowie den Abfallbehälter kontrollieren ¾ Schnitte aus dem handwarmen Puffer entnehmen und in eine Küvette mit Aqua dest. stellen ¾ Barcodeetiketten auf die Objektträger kleben, im NexES einspannen und mit APKWaschpuffer bedecken Durchführung: ¾ Lauf starten. Ab jetzt läuft die immunhistochemische Reaktion voll automatisch im Gerät nach der SABC-Methode (Streptavidin-Biotin-Komplex) nach folgendem Protokoll ab: ¾ Objektträger werden auf 37° C erwärmt ¾ 4 min I-VIEW Inhibitor (3 % H2O2 zur Hemmung der endogenen Peroxidase) ¾ 10 min Option 1 (Ziegenserum 1:5 mit PBS verdünnt, zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen) 94 Anhang ¾ 32 min Ki 67 (Clone K-2, Primärantikörper) ¾ 2 min Fixative 1 (20µl Glutardialdehyd in 10 ml 0,9 % NaCl) ¾ 8 min I-VIEW Biotin Ig (Biotinylierter Sekundärantikörper, hierbei handelt es sich um einen sog. Multi-Link-Antikörper, der sowohl Mausals auch Kaninchenimmunglobuline erkennt) ¾ 8 min I-VIEW SA-HRP (Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Komplex) ¾ 8 min I-VIEW DAB und I-VIEW H2O2 (Enzymhistochemische Reaktion, DAB 2g/l als Chromogen und 0,04-0,08 % H2O2 ) ¾ 4 min I-VIEW Copper (Kupfersulfat 5g/l) ¾ 4 min Hämatoxylin (zur Gegenfärbung) ¾ 4 min Bluing Reagent (zum Bläuen) Allen Inkubationsschritten im NexES-IHC-Färbemodul folgen definierte Waschschritte mit dem APK-Waschpuffer von VENTANA (Cat. 250-042). ¾ Schnitte aus dem Gerät entnehmen, in einer Küvette mit Aqua dest. und Spülmittel schwenken, um das im NexES verwendete Öl zu entfernen, und anschließend in eine Küvette mit Aqua dest. überführen ¾ Aufsteigende Alkoholreihe im Färbeautomaten VaristainGemini (Fa. Shandon, Frankfurt am Main) nach folgendem Protokoll: ¾ 70%iger, 80%iger, 96%iger und 100%iger Alkohol jeweils für 1 min ¾ 100%iger Alkohol für 2 min ¾ Xylol unter dreimaligem Wechsel (1 min, 3 min, 3 min) ¾ Anschließend werden die Objektträger mit Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg) eingedeckt 95 Anhang 8.1.5 Citratpuffer Stammlösungen: A: 0,1 M Zitronensäure (C6H8O7 H2O) 21,01 g Zitronensäure in 1000 ml Aqua bidest. B: 0,1 M Natriumcitrat (C6H5Na3O7 2H2O) 29,41 g Natriumcitrat in 1000 ml Aqua bidest. Gebrauchslösung: 0,01 M pH 6,0 18 ml Stammlösung A 82 ml Stammlösung B 900 ml Aqua bidest. 8.1.6 Versuchsprotokoll Multiblock Der Multiblock wurde nach den Vorgaben der Firma ZYTOMED (Berlin) erstellt: 1. Repräsentative Stelle des Tumors auf dem H.-E.-Schnitt mit wasserfestem Stift markieren. 2. Markierung auf den Paraffinblock übertragen, indem man das ausgewählte Areal flächenhaft mit dem Stift einfärbt, so kann man gezielter stanzen und weiß, welches die Anschnittseite ist. 3. Stanze senkrecht auf den Block aufsetzen und mit sanftem Druck bis zum Anschlag der Kunststoffkassette stechen. Anschließend die Stanze mehrfach leicht hin und her drehen, um den Gewebszylinder in der Stanze vom Boden des Blocks zu lösen. Danach die Stanze wieder senkrecht herausziehen. 4. Durch Druck auf den Stempel die gewonnene Gewebestanze heraus schieben. 5. Gewebestanzen der Reihe nach in einen neuen Paraffinblock ausgießen. 96 Anhang 8.2 8.2.1 Tabellen Tabelle Untersuchungsmaterial gesamt Nr. P813/97 P436/98 P455/98 P837/99 P978/99 P151/00 P773/01 P827/01 P185/94 P398/95 P601/95 P83/99 P371/97 P646/97 P119/98 P50/99 P301/00 P500/00 P696/01 P718/01 P826/01 P848/01 1 P851/01 P986/01 P58/01 P702/97 2 P86/94 P179/94 P229/96 P417/97 P487/97 P118/98 P555/99 P998/99 P516/00 P672/01 P787/01 P94/01 Rasse o.A. o.A. Chihuahua Mischling KHT o.A. Yorkshire-Terrier Yorkshire-Terrier Mischling LHT Mischling o.A. Gordon-Setter Deutsch-Drahthaar o.A. o.A. Yorkshire-Terrier o.A. o.A. Yorkshire-Terrier Westi Westi o.A. DSH Deutsch-Kurzhaar Mischling Münsterländer Boxer Teckel DSH o.A. o.A. o.A. Bobtail Mischling o.A. Beagle Bobtail Alter 6 10 5 10 2 12 10 7 8 8 8 o.A. 7 9 5 10 12 5 9 11 8 11 5 7 5 6 10 9 3 12 9 11 10 12 13 6 11 6 Tumor Einfaches Adenom Einfaches Adenom Einfaches Adenom Einfaches Adenom Einfaches Adenom Einfaches Adenom Einfaches Adenom Einfaches Adenom Einfaches Adenom Einfaches Adenom Einfaches Adenom Einfaches Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom Komplexes Adenom verh. Plattenepithelkarzinom verh. Plattenepithelkarzinom verh. Plattenepithelkarzinom verh. Plattenepithelkarzinom verh. Plattenepithelkarzinom verh. Plattenepithelkarzinom verh. Plattenepithelkarzinom verh. Plattenepithelkarzinom verh. Plattenepithelkarzinom verh. Plattenepithelkarzinom verh. Plattenepithelkarzinom verh. Plattenepithelkarzinom HER2/neu 0 0 0 0 0 0 0 0 1+ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1+ 0 1+ 2+ 0 1+ 2+ 0 2+ 0 0 0 3+ 3+ 0 1+ 0 0 0 0 Ki 67 + * * * * * * + * * * * * * * * + + ++ * + ++ ++ + * * +++ +++ * ++ * * * 97 Anhang Nr. P201/94 P441/95 P458/95 P527/95 P541/95 P818/96 P857/96 P860/96 P883/96 P113/96 P895/97 P936/01 P459/97 P703/97 P707/97 P160/04 P69/94 P912/96 P698/97 P799/97 P933/98 P951/98 P966/98 P332/98 P357/98 P750/99 P540/00 P501/02 P865/97 P272/98 P520/99 P656/99 P104/00 P539/00 P650/01 P877/01 P928/01 P441/97 P482/97 P832/01 1 Rasse LHT Mischling Deutsche Wachtel Teckel Teckel RHT Cocker Setter o. A. Kerry Blue Terrier o. A. Cocker o. A. Deutsch-Kurzhaar Foxterrier Neufundländer Irish Setter RHT LHT o. A. o. A. o. A. o. A. o. A. o. A. DSH Mischling RHT o. A. o. A. o. A. o. A. Mischling Deutsch-Drahthaar o. A. Husky Yorkshire-Terrier Mischling Mischling RHT Alter 12 10 11 12 11 10 12 11 10 11 4 8 12 7 8 9 14 13 10 12 8 10 12 11 12 10 12 11 7 13 13 13 10 10 8 4 9 8 14 15 Tumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Mammamischtumor Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom Einfaches Karzinom HER2/neu 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1+ 2+ 1+ 1+ 1+ 0 0 0 1+ 2+ 0 0 0 0 2+ 0 0 1+ 0 0 3+ 0 0 1+ 2+ 2+ 0 Ki 67 ++ * * * ++ * + * * * * + +++ + + ++ * * * +++ +++ * * * * +++ * * ++ * * + * ++ ++ + +++ + 98 Anhang Nr. P702/97 1 P412/95 P457/95 P560/95 P79/96 P264/98 P495/00 P158/04 P111/96 P596/00 P606/00 P860/01 P917/01 Rasse Mischling RHT RHT Yorkshire-Terrier Setter o. A. Husky Pudel Beagle o. A. Münsterländer DSH Mischling Alter 6 12 11 8 11 8 10 10 12 o. A. 7 o. A. 8 Tumor Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom Komplexes Karzinom HER2/neu 2+ 2+ 0 0 0 0 0 1+ 0 0 0 0 0 Ki 67 + + * * * ++ * ++ * + + + * Göttingen, den 20.02.2004 Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel „Zur Aussagekraft der HER2 Rezeptorexpression in caninen Mammatumoren als diagnostischer und prognostischer Faktor“ selbständig verfaßt habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen und Hilfsmittel in Anspruch genommen: • Technisch-methodische Einweisungen durch technische Assistentinnen der Abteilung Infektionspathologie, Deutsches Primatenzentrum Göttingen. • Asserviertes Archivmaterial aus der Abteilung Infektionspathologie, Deutsches Primatenzentrum Göttingen. • Redaktionelle Überarbeitung durch wissenschaftliche Mitarbeiter und Leiter der Abteilung Infektionspathologie, Deutsches Primatenzentrum Göttingen. • Einführung in die HER2 Diagnostik bei humanen Mammakarzinomen durch Herrn Dr. Hofmann vom Institut für Pathologie, Klinikum Kassel. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Dissertation wurde in der Abteilung Infektionspathologie des Deutschen Primatenzentrums Göttingen unter der Leitung von Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup angefertigt und bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. Christiane Kott Danksagung Zum Abschluss möchte ich allen danken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater, Herrn Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup, für die Überlassung des Themas und die uneingeschränkte motivierende Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit und dessen kritischer Korrektur herzlich bedanken. Sehr herzlich bedanke ich mich bei Frau Dr. K. Mätz-Rensing für die wissenschaftliche Betreuung und Anregungen sowie für die Durchsicht dieser Arbeit. Ebenso danken möchte ich Herrn Prof. W. Bodemer für die Unterstützung auf molekularbiologischer Ebene und die Durchsicht meiner Arbeit. Mein besonderer Dank gilt auch Frau K. Kaiser-Jarry und Frau N. Knöchelmann für die gute methodische Einarbeitung in die Histologie und Immunhistochemie sowie für die jederzeit gewährte Hilfe und Tipps bei allen technischen Belangen. Ferner danke ich Frau M. Hampe für die Hilfe bei der Anfertigung des Bildmaterials. Ebenso danke ich Frau I. Roßbach für die Durchsicht des Manuskriptes. Nicht vergessen möchte ich natürlich die Firma DakoCytomation, insbesondere Herrn Dr. S. Linder, der stets großes Interesse an meiner Arbeit zeigte und mir Anregungen und den Kontakt nach Kassel vermittelte. Herrn Dr. M. Hofmann vom Klinikum Kassel danke ich für die Einführung in die HER2 Diagnostik bei humanen Mammatumoren, die sehr hilfreich für die Diagnostik beim Hund war. Herrn H. Brzezinka danke ich für die hilfreiche Unterstützung bei den anfänglichen Problemen in der Computerwelt. Ein großes Dankeschön geht auch an das Doktorandenzimmer. Frau A. Blankenburg, Herrn F. Runge u. Frau M. Zöller möchte ich für den rat- und tatkräftigen Beistand danken. Mein spezieller Dank gilt Frau M. Zöller für die engagierte Hilfe in allen fremdsprachlichen Belangen. Danken möchte ich auch meinem Freund für die Geduld und Hilfe bei allen Computerfragen sowie für seine aufbauenden Worte. Nicht zuletzt gilt mein herzlichster und besonderer Dank meiner Familie, speziell meinem Vater, der mich während meines Studiums unterstützte und für mich und meine Sorgen da war.
![16.de.PPT [Kompatibilis mód]](http://s1.studylibde.com/store/data/001039061_1-3773ce69dfc1d489efdf5ffc83a8a5c0-300x300.png)
