Einfluss einer zielgerichteten Aufnahme von Impfantigenen durch

Dissertation
Einfluss einer zielgerichteten Aufnahme
von Impfantigenen durch dendritische
Zellen auf die Aktivierung von T-Zellen
Zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Naturwissenschaft (Dr. rer. nat.)
Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie
Prof. Dr. med. K. Überla
Institute für Hygiene und Mikrobiologie
Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Thomas Niezold
Bochum, 1. Dezember 2014
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Danksagung
iv
Abkürzungsverzeichnis
v
1 Zusammenfassung
1
2 Einleitung
2.1 Das Immunsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2 Die Rolle der dendritischen Zellen . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.1 Subpopulationen der dendritischen Zellen . . . . . .
2.2.2 Induktion einer Antigen-spezifischen Immunantwort
2.2.3 Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz . . . . . .
2.3 DZ adressierende Vakzine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.1 Protein-basierende Vakzine . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.2 Gen-basierende Vakzine . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4 Regulatorische T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.1 Allgemeine Funktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.2 Rolle bei viralen Infektionen . . . . . . . . . . . . . .
2.5 Zielsetzung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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3 Materialien
3.1 Versuchstiere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Bakterienstämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4 Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.2 Oligonukleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5 Peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6 Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6.1 Antikörper für ELISA, Western Blot und Zellseparation
3.6.2 Antikörper für FACS basierende Analysen . . . . . . .
3.7 Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.8 Protein-Größenstandards und DNA-Längen-Standards . . . .
3.9 Reagenzien und Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.10 Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Inhaltsverzeichnis
3.10.1 Molekularbiologische Lösungen
3.10.2 Medien in der Zellkultur . . . . .
3.11 Reagenzsysteme . . . . . . . . . . . . . .
3.12 Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . .
3.13 Technische Ausstattung . . . . . . . . .
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4 Methoden
4.1 Molekularbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.1 Polymerase-Ketten-Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.2 Hitzeschocktransformation von Bakterien . . . . . . . . . . .
4.1.3 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien . . . . . . . . .
4.1.4 Konzentrationsbestimmung von DNA . . . . . . . . . . . . .
4.1.5 Restriktionsverdau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.6 Ligation von DNA Fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.7 Agarose-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.8 Gelextraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.9 Bestimmung des Endotoxingehalts von Plasmid-Präparationen
4.2 Proteinbiochemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.1 SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.2 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.3 Antikörperaufreinigung aus Zellkulturüberständen . . . . .
4.3 Zytologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.1 Kultivierung von Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.2 Einfrieren und Auftauen von Zelllinien . . . . . . . . . . . .
4.3.3 Transfektion mit Polymeren . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.4 Durchflusszytometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.5 Bindungstest der DEC205-spezifischen Einzelkettenantikörper
4.3.6 Anzucht und Infektiösitätsanalyse des Influenza A Stamms
PR/8/34 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4 Immunologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.1 Immunisierung von Mäusen . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.1.1 DNA-Elektroporation . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.1.2 Peptid-Immunisierung . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.2 Asthma-Modell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.3 Lungenfunktionsanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.4 DEREG-Modell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.5 Blutentnahme und Serumisolation . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.6 Isolierung von Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.6.1 Aus der Milz und Lymphknoten . . . . . . . . . . .
4.4.6.2 Aus dem Blut . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.6.3 Aus der Lunge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.7 Intrazelluläre Zytokinfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.8 Detektion von regulatorischen T-Zellen . . . . . . . . . . . .
4.4.9 T-Zellproliferationsnachweis in vitro mittels CFSE Färbung .
4.4.10 Magnetische Zellseparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Inhaltsverzeichnis
4.4.11
4.4.12
4.4.13
4.4.14
Diabetes-Modell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Durchflusszytometrischer Antikörpernachweis . . . . . . .
Mikroneutralisationstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.14.1 ELISA zur Antikörperbestimmung . . . . . . . . .
4.4.14.2 ELISA zur Zytokinbestimmung . . . . . . . . . . .
4.4.15 Influenza A Virus-Infektionsmodell . . . . . . . . . . . . . .
4.4.16 Influenza-Nachweis mittels quantitativer reverser Transkriptase PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4.17 Histologische Färbung von Lungenschnitten . . . . . . . . .
5 Ergebnisse
5.1 DEC205 Adressierung des Antigens beeinflusst T-Zellaktivierung .
5.1.1 Analyse der verwendeten Expressionsplasmide . . . . . . .
5.1.2 Der Einfluss der direkten Adressierung des Antigens auf die
Immunantwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.3 Koapplikation eines genetischen Adjuvans zur Modulation
der Immunantwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.4 Direkte Adressierung des Antigens im transgenen Maus Modell
5.1.5 Analyse der suppressiven Eigenschaften von induzierten Treg
5.1.6 Analyse der suppressiven Eigenschaften von induzierten
Treg im Diabetes-Modell in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.7 Schicksal von transferierten Antigen-spezifischen T-Zellen .
5.1.8 Modulation von Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen und deren Einfluss auf die Aktivierung von Effektor T-Zellen in
vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.9 Prophylaktische und therapeutische DNA-Immunisierung
in einem Asthma-Modell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.9.1 Verifizierung der reduzierten Immunantwort mit
dem gekoppelten OVA Antigen . . . . . . . . . . .
5.1.9.2 Einfluss der direkten Adressierung des Antigens
auf die Ausprägung eines asthmatischen Phänotyps
5.2 Einfluss von Treg auf die Immunantwort nach einer IAV Infektion .
5.2.1 Der Einfluss einer subletalen IAV Infektion auf die Funktion
der Treg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2 Auswirkung der Treg Depletion auf die Immunantwort nach
einer IAV Infektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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6 Diskussion
87
Abbildungsverzeichnis
97
Literaturverzeichnis
99
Lebenslauf
126
iii
Danksagung
Danksagung
Mein ganz besonderer Dank geht an Prof. Matthias Tenbusch für die nie endende
Geduld und Hilfsbereitschaft. Seine Unterstützung bei der Verwirklichung von
eigenen Ideen sowie seine Diskussionsbereitschaft trugen zu einer deutlichen Bereicherung dieser Arbeit bei.
Für die Vergabe des interessanten Themas und dem Interesse an dem steten
Fortschritt der Arbeit möchte ich Herrn Professor Klaus Überla danken.
Ebenfalls möchte ich mich bei meinem Korreferenten, Prof. Albrecht Bufe, für
die Übernahme dieser Verantwortung bedanken.
Was die zahlreichen Tiefs dieser Arbeit erst erträglich machte, waren die vielen schönen Abende beim Doppelkopf spielen, auf dem Weihnachtsmarkt, beim
Grillen, auf Entspannungstour im Sauerland oder einfach nur ein kühles Feierabendbier nach einem frustrierendem Tag. Vielen lieben Dank speziell an Bianca,
Lena, Bettina, Anna, Camilla, Michael, André und Bastian.
Weiterhin möchte ich mich bei André, Michael, Manuela, Camilla und Alexa
bedanken, die sich mit meinem außergewöhnlichen Schreibstil auseinandergesetzt
haben und es trotz dessen nicht Leid waren Passagen mehrfach zu lesen. Durch
eure Anmerkungen und Verbesserungsvorschläge konnte die Arbeit überhaupt
erst in dieser vorliegenden Form zu Papier gebracht werden.
Vielen Dank natürlich auch an alle anderen Mitarbeiter des Lehrstuhls für das
tolle und konstruktive Arbeitsklima. Dabei möchte ich Klaus, Regina, Martina,
Rosemarie, Heike, Annika und Ulrich besonders hervorheben, die durch ihre produktive Unterstützung mir so manchen Arbeitstag ungemein erleichterten.
Auch möchte ich einen Dank an meine Freunde aussprechen, insbesondere Eva,
Christina, Frank, Bianca, Camilla und Silke, die mich in meiner Freizeit von der
Arbeit ablenken konnten, wodurch ich neue Kraft und Motivation schöpfte.
An dieser Stelle möchte ich mich bei meiner immer größer werdenden Familie
bedanken, die mich während dieser Zeit immer moralisch unterstützten und am
Fortschritt dieser Arbeit interessiert waren, auch wenn sie nicht alles verstanden.
iv
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
depletion of regulatory T cells
µ . . . . . . . Mikro
DEREG
(v/v) . . . Volumenprozent
DMEM . Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
(w/v) . . Gewichtsprozent
DMSO . Dimethylsulfoxid
% . . . . . . Prozent
ds . . . . . . doppelsträngig
E. coli . . Escherichia coli
DT . . . . . Diphtherietoxin
et al. . . . . und andere
aM . . . . . alveolare Makrophagen
DZ . . . . . dentrische Zellen
ANOVA analysis of variance
EAE . . . experimentelle allergische
Enzephalomyelitis
APC . . . Allophycocyanin
EDTA . . Ethyldiamintetraessigsäure
APS . . . . Ammoniumperoxidsulfat
ELISA . enzyme linked
sorbent assay
ATP . . . . Adenosintriphosphat
AU . . . . verfahrensdefinierte
heit
Ein-
immuno-
ER . . . . . endoplasmatisches Retikulum
B . . . . . . . Blutentnahme
EZ . . . . . extrazelluläre
BAL . . . Bronchoalveoläre Lavage
FACS . . fluorecence-activated cell sorter
BSA . . . . Bovine Serum Albumin
C . . . . . . Challenge
c . . . . . . . Zenti
CD . . . . . cluster of differentiation
FCS . . . . Fetal Calf Serum
FITC . . . Fluoresceinisothiocyanat
g . . . . . . . Gramm
cDNA . . komplementäre DNA
GFP . . . . Grün-fluoreszierendes Protein
CFSE . . . Carboxyfluoresceinsuccinimidylester
GL . . . . . Glukoselevel
CHO . . . chinese hamster ovary
CIP . . . . calf instestine phosphatase
DA . . . . Depletionsanalyse
h . . . . . . . Stunde
H&E . . . Hämatoxylin & Eosin
HA . . . . Hämagglutinin
Da . . . . . Dalton
HBSS . . Hank Balanced Salt Solution
DEAE . . Diethylaminoethylcellulose
HEK . . . human embryo kidney
v
Abkürzungsverzeichnis
HEPES . 2-Ethansulfonsäure
PD-1 . . . programmed death-1
IAV . . . . Influenza A Virus
PE . . . . . Phycoerythrin
ICOS . . . induzierbarer Kostimulator
PEI . . . . Polyethylenimin
ICS . . . . intracellular cytokine staining
PerCP . . Peridinin-Chlorophyll
Ig . . . . . . Immunglobulin
PFU . . . . Plaque-bildende Einheit
IVR . . . . in vitro Restimulation
qRT . . . . quantitative Reverse Transkriptase
IZ . . . . . . intrazelluläre
k . . . . . . . Kilo
l . . . . . . . Liter
LB . . . . . lysogeny broth
LuFu . . . Lungenfunktionsmessung
m . . . . . . Meter
m . . . . . . Milli
RSV . . . . respiratorischer Synzytial
Virus
S . . . . . . . Sensibilisierung
SDS . . . . Natriumdodecylsulfat
TAE . . . . TrisAcetat-EDTA
TBE . . . . Tris-Borat-EDTA
MDCK . Madin-Darby canine kidney
TEMED N,N,N’,N’,-Tetramethylethylendiamin
MDSC . myeloid-abstammende
Suppressorzelle
TfH . . . . follikuläre T-Helferzellen
MHC . . Haupthistokompatibilitätskomplex
Th . . . . . T-Helferzellen
TLR . . . . Toll-like Rezeptor
min . . . . Minuten
TM . . . . transmembran
MTT . . . 3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid
TNF . . . Tumornekrosefaktor
n . . . . . . . Nano
OVA . . . Ovalbumin
P . . . . . . . Präparation
PAGE . . Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Treg . . . . regulatorische T-Zellen
TZA . . . T-Zellanalyse
TZR . . . . T-Zellrezeptor
u.a. . . . . unter anderem
UV . . . . . ultraviolett
V . . . . . . Volt
PAMP . . Pathogen-assoziierte Molekülstruktur
VB . . . . . virale Beladung
PAS . . . . Periodic Acid Schiff
ZA . . . . . Zellanalyse
PBS . . . . Phosphat Buffered Saline
ZT . . . . . Zelltransfer
PCR . . . Polymerase-Ketten-Reaktion
°C . . . . . Grad Celsius
vi
xg . . . . . . fache Zentrifugalkraft
1 Zusammenfassung
1 Zusammenfassung
Dendritische Zellen (DZ) spielen eine Schlüsselrolle bei der Induktion einer Immunantwort. Die direkte Adressierung eines Antigens an den Endozytoserezeptor
DEC205 auf DZ führt zu einer verbesserten Antigenpräsentation. Durch die Kombination eines Protein-gekoppelten αDEC Antikörpers mit einem Reifungsstimulus
für DZ wird eine starke Pathogen-spezifische Immunantwort stimuliert, während
in Abwesenheit eines Adjuvans die periphere Toleranz induziert wird. Da bisher
nur wenig über DNA Vakzine, die für DEC205-spezifisch Antigen kodieren, bekannt ist, soll in dieser Arbeit deren Einfluss auf das Schicksal Antigen-spezifischer
T-Zellen und deren Beteiligung an der Immunität untersucht werden.
Die Kopplung von Hämagglutinin an einen Einzelkettenantikörper (EAk), der
gegen DEC205 gerichtet ist, führte zu einer erhöhten MHC-II Präsentation und
einer verstärkten Proliferation von Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen. Die Präsentation auf MHC-I war ebenfalls erhöht, zeigte aber keine Verbesserung in der
Immunantwort gegenüber dem Kontrollkonstrukt.
Trotz erhöhter Antigenpräsentation induzierte die DZ-gerichtete DNA-Immunisierung eine geringere zelluläre Immunantwort als das Kontrollkonstrukt. Selbst
die Koapplikation des Th1 stimulierenden Zytokines IL-12 hatte keinen Einfluss auf
die reduzierten T-Zellantworten. Die induzierten Antikörper aus beiden Gruppen
zeigten unabhängig von der IL-12 Koapplikation keine neutralisierenden Eigenschaften auf. Auf Grund der Infiltration von aktivierten T-Lymphozyten in das
Lungengewebe entwickelte die Kontrollgruppe deutlich höhere Immunantworten
gegen eine Infektion mit dem homologen Influenza A Virus, als die DEC-Gruppe,
die zwar die virale Beladung reduzieren konnte aber trotzdem einen vergleichbaren
Krankheitsverlauf besaß, wie die naive Gruppe.
Sowohl in TCR-transgenen Mäusen, als auch nach einem adoptiven Transfer von
Antigen-spezifischen T-Zellen, konnte eine Induktion von regulatorischen T-Zellen
nach DZ-gerichteter Immunisierung beobachtete werden. Dieser Effekt war lokal
begrenzt und nahm mit zunehmender Entfernung zur Immunisierungsstelle ab.
Dabei konnten die suppressiven Eigenschaften nicht auf das verwendete Diabetes
Modell übertragen werden.
Hingegen konnte die prophylaktische DNA-Immunisierung mit den EAk-Konstrukten im Asthma Modell die Ausbildung des asthmatischen Phänotyps unterdrücken, wobei die unterschiedlichen Konstrukte vermutlich auf verschiedene
Arten wirken. Im Gegensatz dazu hat die therapeutische Applikation keinen detektierbaren Einfluss auf die bereits differenzierten Th2 Zellen und den asthmatischen
Phänotyp.
Die Arbeit zeigt, dass die DNA-Immunisierung mit DZ-gerichteten Konstrukten
1
1 Zusammenfassung
eher Mechanismen der peripheren Toleranz aktiviert, als eine starke Immunogenität besitzt. Dabei bietet die prophylaktische Immunsierung eine Möglichkeit
krankheitsbedingte Symptome im Asthma Modell zu lindern.
2
2 Einleitung
2 Einleitung
2.1 Das Immunsystem
Das Immunsystem hindert Krankheitserreger daran, in den Organismus höherer
Lebewesen einzudringen und entfernt Fremdorganismen sowie eigene fehlerhafte
Zellen aus dem Körper. Dabei wird zwischen dem unspezifischen angeborenen
und dem spezifischen adaptiven Immunsystem unterschieden. Zudem gibt es
die dendritischen Zellen (DZ), die eine Brücke zwischen der angeborenen und
adaptiven Immunantwort bilden.
Das angeborene Immunsystem bildet die erste Front gegen Pathogene, wobei die
erste Verteidigungslinie aus Epithelzellen besteht, die eine physiko-chemische Barriere bilden [97]. Nach Überwindung dieser Barriere werden die Pathogene von patrouillierenden Makrophagen/Monozyten anhand von Pathogen-assoziierten Molekülstrukturen (PAMP) erkannt [155]. Durch Bindung an den Pathogen-erkennenden Rezeptor (PRR) kommt es zu einer Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden, die eine Ausschüttung von inflammatorischen Zytokinen zur Folge haben
[155, 104]. Dadurch werden neutrophile Granulozyten zum Infektionsherd gelockt,
die diese Pathogene phagozytieren können. Wenn das angeborene Immunsystem
die Infektion nicht bekämpfen kann, sorgt es durch die Bildung eines inflammatorischen Milieus für eine Eindämmung der Infektion und gleichzeitig für eine
Aktivierung des adaptiven Immunsystems.
Im Gegensatz zu der unspezifischen Erkennung von Pathogenstrukturen des angeborenen Immunsystems [95] ist das adaptive Immunsystem in der Lage zwischen
einer Vielzahl von Pathogenen spezifisch zu unterscheiden, wodurch ein fein
abgestimmtes Netzwerk an Immunzellen je nach Pathogen aktiviert wird. Die
Schlüsselrolle spielen dabei die DZ. Dabei kann die Immunantwort nochmal in eine zelluläre und eine humorale Reaktion unterteilt werden. Durch die Aktivierung
und Differenzierung von naiven CD4 T-Helferzellen (Th) findet je nach Pathogen
eine Verschiebung der Immunantwort zu einer der beiden zuvor genannten Reaktionen statt. Dabei helfen ausdifferenzierte CD4 Th bei der Aktivierung von
zytotoxischen CD8 T-Zellen, die wiederum infizierte Zellen erkennen und direkt
eliminieren können [71, 72]. Hingegen stimuliert ein anderer CD4 T-Helferzelltyp
hauptsächlich die Reifung von B-Zellen, die eine humorale Reaktion prägen und
durch die Produktion von Pathogen-spezifischen Antikörpern einen indirekten
Einfluss auf die Beseitigung des Eindringlings nehmen können.
Im Gegensatz zur Aktivierung und Beseitigung eines eindringenden Pathogens
besitzt das Immunsystem ebenfalls Mechanismen, Abwehrreaktionen gegen körpereigene Strukturen zu unterbinden. Die Eliminierung autoreaktiver T- und B-
3
2 Einleitung
Zellen während ihrer Entwicklung wird als zentrale Toleranz bezeichnet [75]. Die
Erkennung von präsentierten körpereigenen Antigenen durch sich entwickelnde
T-Zellen im Thymus führt zum programmierten Zelltod der Zellen [114]. Diese negative Selektion gewährleistet eine Reifung von T-Zellen, die nicht durch Proteine
des eigenen Organismus aktiviert werden. Während sich die Selektion der T-Zellen
im Thymus ereignet, werden die autoreaktiven B-Zellen anhand ihrer Antikörperspezifität im Knochenmark selektioniert [83]. Durch Krankheiten oder genetische
Defekte können autoreaktive Zellen der Selektion entkommen und in die Peripherie abgegeben werden. Um weiterhin den Organismus gegen diese autoreaktiven
Zellen zu schützen, hat das Immunsystem periphere Toleranzmechnismen entwickelt. Dabei können die autoreaktiven Zellen z.B. in einen unreaktiven Zustand
versetzt oder durch die Induktion von regulatorischen T-Zellen (Treg) supprimiert
werden.
2.2 Die Rolle der dendritischen Zellen
2.2.1 Subpopulationen der dendritischen Zellen
Die dendritischen Zellen haben die Aufgabe der Antigenaufnahme und Steuerung
der adaptiven Immunantwort durch Aktivierung der T-Zellantwort. Auf Grund
der großen Bandbreite an unterschiedlichen DZ, die sich in Abhängigkeit ihrer
Funktion, Expression von Oberflächenmarkern, Abstammung, Fähigkeit sich im
Organismus zu bewegen oder des Vorkommens unterscheiden lassen, wird hier
nur eine grobe Übersicht geschaffen. Die Hauptunterteilung erfolgt dabei anhand
der Abstammung der DZ, wobei zwischen plasmazytoiden und konventionellen
DZ unterschieden wird. Zusätzlich können durch Infektion de novo inflammatorische Monozyten-abstammende DZ ausgebildet werden [132].
Bei den konventionellen DZ wird weiterhin zwischen wandernden und örtlich
begrenzten unterschieden [204]. Des Weiteren werden die DZ nach ihrem Vorkommen eingeteilt, wobei die epidermalen Langerhans-Zellen und dermale DZ in der
Haut vorkommen, während die in den peripheren Lymphknoten und der Milz
befindlichen DZ anhand der Expression von CD8α unterschieden werden [236].
Während für die Langerhans-Zellen die Beteiligung an einer Immunität gegen
Pathogene noch nicht vollständig geklärt ist [235, 113], sind die Eigenschaften der
CD8α positiven und negativen DZ besser untersucht und verstanden.
Studien zeigten eine Induktion der CD4 und CD8 T-Zellantworten durch CD8α+
DZ während einer bakteriellen oder parasitären Infektion [22, 150]. Des Weiteren sind CD8α+ DZ hoch effizient im Prozessieren und Präsentieren über MHC-I
[199, 61, 52], wodurch sie größtenteils an der Induktion von CD8 T-Zellantworten
bei viralen Infektionen beteiligt sind [6, 7, 245]. Die hohe Effizienz exogene Antigene auf MHC-I zu präsentieren, kann durch die Expression von C-Typ Lektin
Antigen-Rezeptoren gewährleistet werden, wie z.B. DEC205 [61], CD36 [217] oder
4
2 Einleitung
DNGR-1 [194].
Im Gegensatz zu den CD8α+ DZ sind CD8α- sehr effizient in der Phagozytose
und Endozytose von exogenen Pathogenen, sowie deren Präsentation auf MHC-II
[236]. Sie sind nicht in der Lage apoptotische Zellen zu internalisieren und mittels
Kreuzpräsentation Antigen-spezifische CD8 T-Zellen zu aktivieren [52, 96].
2.2.2 Induktion einer Antigen-spezifischen Immunantwort
Im unreifen Zustand sind die meisten DZ in peripheren Geweben lokalisiert und
nehmen Antigene in Form von Mikroben und Partikeln [92, 162, 182, 215] durch
direkte Bindung an einen PRR [188] oder indirekt durch Bindung an Fc-Rezeptoren
(Fcγ, Fce [192]) auf. Eine weitere Möglichkeit der Antigenaufnahme stellt die
Makropinozytose dar, wobei extrazelluläre Flüssigkeiten und Lösungen durch
Bildung großer pinozytotischer Vesikel aufgenommen werden [193]. Durch die
Interaktion mit dem Mannose-bindenden Lektin [193] oder dem endozytotischen
DEC-205-Rezeptor [98] erfolgt eine Rezeptor-vermittelte Aufnahme des Antigens.
Auf Grund dieser unterschiedlichen Mechanismen kann eine sehr effektive Antigenaufnahme gewährleistet werden, wobei eine Antigenkonzentration im pikobis nanomolaren Bereich ausreicht.
Exogene Proteine, wie z.B. von replizierenden Mikroben [23], sterbenden oder
infizierten Zellen [5], werden durch Endozytose aufgenommen und innerhalb des
endosomalen Proteasoms prozessiert. Im gleichen Vesikel erfolgt dann die Beladung des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC)-II. Anschließend werden
diese MHC-Peptid-Komplexe auf der Zelloberfläche präsentiert. Im Gegensatz
dazu werden die endogenen Proteine, wie z.B. synthetisierte virale Proteine nach
einer Infektion, aktiv durch das Proteasom im Zytosol in das endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert. Im ER werden die MHC-I Komplexe mit jeweils einem
der entstandenen Peptide beladen. Dieser MHC-Peptid-Komplex wird ebenfalls
zur Präsentation an die Zelloberfläche transportiert. Zusätzlich sind bestimmte
DZ in der Lage über Endozytose aufgenommene Antigene ebenfalls auf MHC-I
Komplexen zu präsentieren [61]. Dieser Mechanismus wird als Kreuzpräsentation
bezeichnet.
Bereits 1976 wurde der Mechanismus der Kreuzpräsentation beobachtet [27, 28],
wobei noch keine Aussage über den ausübenden Zelltyp getroffen werden konnte. Später wurde diese Eigenschaft den DZ und Makrophagen zugeschrieben
[120, 202, 119]. Durch die fehlende Induktion von CD8 T-Zellantworten nach selektiver Depletion von CD11c+ DZ, bewiesen Jung und Kollegen einen direkten
Einfluss von konventionellen DZ auf die Kreuzpräsentation [102]. Der bisherige
Stand der Forschung verknüpft die Kreuzpräsentation mit CD11c+ konventionellen
DZ, die eine hohe Expression von CD8α [53, 20, 53, 205, 21, 6] oder CD103 [17, 59]
aufweisen. Des Weiteren besitzen CD8α+ DZ, die eine hohe Dichte des C-Typ ähnlichen Lektins DEC205 auf der Oberfläche zeigen, eine starke Spezialisierung in
der Aufnahme von sterbenden Zellen und spielen eine essentielle Rolle im Schutz
5
2 Einleitung
gegen einige virale Infektionen, durch MHC-I Präsentation [6, 52, 96]. Außerdem
wurde gezeigt, dass DZ, die über den endozytotischen DEC205-Rezeptor Antigene
aufgenommen haben, sowohl CD4 als auch CD8 T-Zellen aktivieren können [61].
Neben den konventionellen CD8α+ DZ können auch durch Infektion induzierte inflammatorische Monozyten-abstammende DZ eine Kreuzpräsentation aufweisen.
Die Aktivierung von dendritischen Zellen erfordert neben der Antigenaufnahme ebenfalls die Erkennung eines PAMP durch PRR. Die PRR unterteilen sich
unter anderem in die RIG-I-ähnlichen (RLR), die NOD-ähnlichen (NLR), die Tollähnlichen (TLR) und die C-Typ Lektin Rezeptoren (CLR). Während sich die CLR
ausschließlich in der Plasmamembran befinden, kommen die RLR und NLR ausschließlich im Zytoplasma vor. Die TLR Familie ist die am Besten charakterisierte
Klasse von PRR. Sie besteht aus 10 bis 15 Rezeptoren, die sich auf das Endosom
und die Plasmamembran verteilen [220]. Während die TLR 1, 2, 4, 5 und 6 auf
der Plasmamembran lokalisiert und auf die Erkennung von bakteriellen Produkten spezialisiert sind, erkennen die im Endosom befindlichen TLR 3, 7, 8 und 9
virale Nukleinsäuren [152, 54, 87, 141, 130, 142]. Die Bindung an einen TLR induziert eine MyD88-abhängige Signalkaskade [198], die zu einer Aktivierung des
Transkriptionsfaktors NF-κB [4] und somit zu einer Expression von Zytokinen
führt. Durch die Rekrutierung eines anderen Adaptorproteins (TRIF) sind die TLR
3 und 4 in der Lage einen MyD88-unabhängigen Signalweg zu aktivieren, der
zur Translokation von IRF-3 führt und die Expression von IFNα/β, sowie IFNinduzierbarer Gene stimuliert [249, 241]. Neben den TLR sind auch die RLR in
der Lage Genome von dsRNA Viren zu detektieren und Typ I IFN zu induzieren.
NLR Rezeptoren erkennen hingegen bakterielle Peptidoglykane und induzieren
dadurch synergistisch mit den TLR die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen. Neben der Bindung des Pathogens an die PRR können DZ auch durch die
Bindung des CD40-Liganden zur Reifung angeregt werden [40, 41]. Auch werden
Kombinationen aus den proinflammatorischen Zytokinen IL-1β, IL-6 und dem
Tumornekrosefaktor (TNF)-α verwendet, um reife DZ für in vitro Studien oder
klinische Immunisierungsstudien zu erhalten [99]. In der Reifungsphase wandern
die DZ vom peripheren Gewebe in die sekundären lymphatischen Organe (z.B.
Lymphknoten, Milz), um dort vollständig auszureifen. Die Reifung der DZ führt
zu einer erhöhten Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle (z.B. CD80,
CD86), während die Rezeptoren zur Antigenaufnahme runterreguliert werden.
Die ausgereiften DZ präsentieren in den T-Zellarealen der Lymphknoten die unterschiedlichen MHC-Peptid-Komplexe. Mit Hilfe des T-Zellrezeptors (TZR) werden
in den Komplexen präsentierte Peptide von T-Zellen überprüft. Die vollständige Aktivierung einer T-Zelle besteht aus mehreren Signalen. Zu Beginn sollte
die Spezifität des TZR mit dem präsentierten Peptid übereinstimmen. Außerdem sollte die Bindung der Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle (CD4 oder CD8) an den
MHC-Komplex möglich sein. Dabei kann das CD8 Molekül ausschließlich an den
MHC-I und das CD4 Molekül ausschließlich an den MHC-II Komplex binden.
Um die T-Zelle vollständig zu aktiveren, werden kostimulatorische Signale an die
T-Zelle über Liganden-Rezeptor-Interaktionen, wie z.B. CD40 Ligand/CD40 oder
6
2 Einleitung
CD28/CD80(CD86), und eine Zytokinausschüttung gesendet. In Abhängigkeit der
ausgeschütteten Zyokine erfolgt die Differenzierung der naiven CD4 Th-Zellen
sowie die Aktivierung der CD8 T-Zellen.
Durch den direkten Kontakt mit DZ kommt es zu einer Ausprägung von zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL). Diese CD8 Effektorzellen sind in der Lage infizierte
Zellen anhand der Präsentation von Pathogen-abgeleiteten Peptiden in MHC-I
Molekülen auf der Zelloberfläche zu erkennen und durch Freisetzung von Granzymen und Perforinen eine Apoptose in der Zielzelle zu induzieren, um diese zu
eliminieren [228, 161]. Zusätzlich werden proinflammatorische Zytokine sezerniert,
die eine Virusreplikation hemmen und gleichzeitig die lytische Aktivität von NK
und CD8 T-Zellen erhöhen [125].
Abbildung 2.1: Mögliche Differenzierung von naiver CD4 T-Helferzelle nach Interaktion mit Antigenpräsentierenden DZ. Quelle: Adaptiert von [173]
Neben der Aktivierung der CD8 T-Zellen kommt es zu einer Differenzierung
von naiven CD4 T-Zellen (Abb. 2.1). Dabei hängt die Induktion des Subtyps von
dem umgebenden Zytokinmilieu, den Antigen-präsentierenden Zellen, sowie den
kostimulatorischen Molekülen ab [223, 9]. Für die Ausbildung von Th1 Zellen
sind IL-12 und IFN-γ essentiell [230]. Dabei wird IL-12 von den APZ sezerniert,
welches wiederum NK Zellen zur Produktion von IFN-γ anregt. Th1 Zellen sind
an der Beseitigung von intrazellulären Pathogenen, sowie an Organ-spezifischer
Autoimmunität beteiligt [49]. Hauptsächlich produzieren sie IFN-γ, IL-2 und Lymphotoxin α. Während die IFN-γ Produktion essentiell für die Aktivierung von
mononukleären Phagozyten und die dadurch erhöhte phagozytotische Aktivität
ist [167], wird IL-2 für die Expansion von CD8 Effektorzellen mit zytolytischer
Aktivität [107, 73] und die Ausbildung von CD8 Gedächtniszellen [244] benötigt.
Zusätzlich wird das sezernierte IL-2 auch von Treg für das Überleben und die
Aktivierung benötigt [248]. Im Gegensatz zu den anderen sezernierten Molekülen
7
2 Einleitung
kann die erhöhte Prodution von Lymphotoxin α, welches zur TNF Superfamilie
gehört, zur Entwicklung einer experimentellen autoimmunen Encephalopathie
führen [45, 212].
Die Aufnahme von extrazellulären Parasiten durch die DZ führt zu einer Differenzierung der naiven T-Zellen zu Th2 Zellen [49]. Dieser Subtyp von CD4 T-Zellen
sorgt für eine bevorzugte Aktivierung der humoralen Immunantwort [166, 172].
Für die Ausprägung sind die Zytokine IL-4 und IL-2 von absoluter Notwendigkeit.
Zusätzlich fördert die Sezernierung von IL-6 durch APZ die Th2 Differenzierung
und hemmt gleichzeitig den Th1 Typ [56, 55]. Die ausgeprägten Th2 Zellen spielen
eine Hauptrolle in der Induktion und Persistenz von allergischen Erkrankungen
[207]. Dazu werden die Zytokine, wie IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 und IL-25, produziert.
Den größten Einfluss auf die Ausprägung eines allergischen Phänotyps hat dabei IL-4. Es ist unter anderem an der Produktion von IgE durch B-Zellen und
der Freisetzung von aktiven Metaboliten, wie Histamin und Serotonin, beteiligt
[209]. Zusätzlich induziert IL-4 weitere proinflammatorische Moleküle, wie z.B.
GM-CSF oder IL6 [58]. IL-5 aktiviert eosinophile Granulozyten [151], während
IL-9 einen generellen Einfluss auf Mastzellen, B-Zellen, neutrophile, sowie eosinophile Granulozyten ausübt und durch Attraktion mittels Chemokinen an der
allergischen Atemwegsentzündung beteiligt ist [135]. IL-13 ist an der Beseitigung
von intrazellulären Pathogenen, wie z.B. Leishmania, beteiligt, führt aber auch
zur Aktivierung von eosinophilen Granulozyten, erhöhter Mucinproduktion und
einer Hyperreaktivität der Atemwege. Die Sezernierung von IL-25 fördert die Th2
Differenzierung und inhibiert zugleich die Ausprägung von Th17 Zellen durch
erhöhte IL-13 Expression, wodurch die Entwicklung von autoimmunen Erkrankungen zunehmen kann [115]. Ebenfalls ist IL-25 bei der Ausbildung allergischer
Reaktionen durch Aktivierung von eosinophilen Granulozyten, bei der verstärkten
Mucinproduktion und bei der Induktion des IgE Isotyps involviert. Neben der
Ausprägung einer allergischen Erkrankung können Th2 Zellen ebenfalls IL-10
produzieren, das als antiinflammatorisches Zytokin bekannt ist. Es sorgt für die
Erhaltung der Homöostase angeborener Immunzellen, sowie für die Suppression
von Th1 Zellen nach der Beseitigung des Pathogens [47].
Zur Beseitigung von intrazellulären Bakterien und Pilzen können naive CD4 TZellen zu Th17 Zellen differenzieren [211, 106, 158]. Die Ausbildung dieses Zelltyps
findet in drei Phasen statt und benötigt geringe Mengen TGF-β in der Anwesenheit
von IL-6 zur Induktion der Differenzierung. Dadurch wird die Expression des
IL-23 Rezeptors hochreguliert und die Sezernierung von IL-21 zur eigenständigen
Vermehrung induziert. Die Stabilisierung der Zelllinie wird durch die Bindung von
APZ sekretiertem IL-23 erreicht. Die sekretierten Zytokine IL-17A und IL-17F führen zur Induktion von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen [94, 165].
IL-21 dient der Aktivierung von T-Zellen und NK Zellen sowie der Induktion der
Differenzierung von B-Zellen in Plasmazellen oder Gedächtniszellen [118, 133]. Die
Expression von IL-22 kann eine inflammatorische Antwort auslösen oder verstärkt
den mukosalen Schutz gegen bakterielle Pathogene durch antimikrobielle Peptide
und erhöhte Zellproliferation [11].
8
2 Einleitung
Durch die Anwesenheit von TGF-β und die Aktivierung über den TZR werden
regulatorische T-Zellen (Treg) induziert [203, 191, 101, 43]. Sie dienen zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz gegenüber körpereigenen und fremden
Antigenen. Nach Beseitigung des Pathogens supprimieren sie die Immunantwort
und schützen so vor zu starker Immunpathologie [69, 190]. Die hauptsächlich
exprimierten Zytokine sind IL-10, IL-35 und TGF-β. IL-10 ist ein immunsupprimierendes Zytokin und limitiert den Gewebeschaden durch inflammatorische Prozesse
[47, 10, 175]. In Kombination mit TGF-β supprimieren sie die IgE Produktion und
schwächen somit allergische Entzündungen ab [103].
Einen weiteren Subtyp der CD4 T-Zellen stellen die follikulären Th (TfH) Zellen
dar [65, 255]. Sie werden durch IL-6 und IL-21 induziert [237, 171], wobei für die
Ausprägung zusätzlich der induzierbare Kostimulator (ICOS) benötigt wird [32, 3].
TfH sind an der Expansion und Differenzierung von B-Zellen beteiligt [82, 86]. Auf
Grund ihrer Zytokinexpression werden sie als TfH1, TfH2 und TfH10 bezeichnet.
Dabei exprimiert TfH1 IFNγ und produziert IgG2a, TfH2 sezerniert IL-4 und induziert sowohl IgG1 als auch IgE, während TfH10 IL-10 produziert und IgA induziert
[65].
Die adaptive Immunantwort ist nicht nur durch die Aktivierung von T-Lymphozyten gekennzeichnet. Zusätzlich werden B-Zellen durch die Interaktion mit ausdifferenzierten CD4 T-Helferzellen aktiviert. Dabei werden zu Beginn große Mengen
an IgM produziert, die nach Bindung mit geringer Affinität zur Aktivierung des
Komplementsystems führen. Da diese Antikörper als erstes ausgeschüttet werden,
bezeichnet man sie auch als natürliche Antikörper. Je nach Pathogen sezernieren die T-Helferzellen unterschiedliche Zytokine, die den Isotyp des Antikörpers
wechseln. Während der Differenzierung zu einer Plasmazelle führt die somatische
Hypermutation des variablen Bereichs des Antikörpers zu einer erhöhten Affinität
zum Antigen. Durch den Wechsel des Isotyps wird hauptsächlich IgG ausgeschüttet. Der IgG Isotyp setzt sich im Menschen aus den Subklassen IgG1, IgG2, IgG3
und IgG4 zusammen und besitzt ein breites Spektrum an Funktionen, wie z.B. das
Neutralisieren von Viren, das Opsonieren von Pathogenen oder die Aktivierung
des Komplementsystem. Des Weiteren kann es zur Sezernierung von IgA kommen,
das für den Schutz gegen Toxine auf mukosalen Oberflächen verantwortlich ist.
Einen der selteneren Isotypen stellt IgE dar. Es sorgt für eine Sensibilisierung von
Mastzellen und wird in Folge einer allergischen Reaktion vermehrt produziert.
[97, 200]
2.2.3 Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz
Im Gegensatz zur Induktion einer schützenden Immunität sind DZ ebenfalls in
der Lage, periphere Toleranzmechanismen zu aktiveren (Abb. 2.2). Die Induktion
der peripheren Toleranz dient als Schutzmechanismus des Immunsystems, um
unerwünschte autoreaktive T-Zellantworten zu unterdrücken oder zu beseitigen.
Diese autoreaktiven T-Zellen können der Selektion im Thymus entgangen sein
9
2 Einleitung
[33] oder eine negative Selektion im Thymus gar nicht erst erfahren haben, da
die körpereigenen Antigene zur Präsentation den Thymus nicht erreichte haben
[153]. In der Peripherie führt die Aufnahme eines körpereigenen Antigens, z.B.
von apoptotischen Zellen, zu einer partiellen Reifung der DZ. Dabei kommt es
zu einer vermehrten Präsentation von Peptid-MHC-Komplexen, aber ohne die
Expression von kostimulatorischen Molekülen wie CD40 oder CD80/CD86 zu
induzieren. Die Interaktion Antigen-spezifischer T-Zellen mit partiell gereiften
DZ in Abwesenheit kostimulatorischer Signale führt z.B. zur Deletion dieser TZellen oder zur Induktion eines anergen Status [66, 84]. Ein weiterer Mechanismus
der peripheren Toleranz ist die Induktion von suppressiven Treg, die Antigenspezifische Immunantworten hemmen können.
Abbildung 2.2: Einfluss des Reifestadiums einer Antigen-präsentierenden DZ auf die Differenzierung der naiven T-Zellen. Quelle: modifiziert Abbildung [97]
Die Interaktion von T-Helferzellen mit unreifen DZ kann zur Deletion dieser
T-Zellpopulation führen [163, 29, 185, 48]. Durch in vitro Untersuchungen wurde herausgefunden, dass Antigen-spezifische T-Zellen nach Restimulation ohne
Kostimulus die Expression von Genen, die für das Überleben der Zelle notwendig sind, herunterregulieren und einen programmierten Zelltod induzieren [233].
Auch in vivo wurde gezeigt, dass APZ aus dem Knochenmark in der Lage sind
T-Zelltoleranz durch Deletion von Antigen-präsentierenden Zellen in Mäusen zu
induzieren [124, 2]. Ebenfalls konnte, nach einer direkten Adressierung eines Antigens an unreife DZ, eine Deletion von CD4 und CD8 T-Lymphozyten beobachtet
werden [29, 84].
10
2 Einleitung
Im Gegensatz zur Deletion können die T-Helferzellen nach der Interaktion mit den
unvollständig gereiften DZ auch in einen anergen Zustand verfallen [208, 84, 85,
176, 128, 170]. Dabei konnte herausgefunden werden, dass es durch diese Interaktion zu einer erhöhten Expression des Effektormoleküls CD5 auf den T-Zellen
kommt [85]. Des Weiteren wurde beobachtet, dass die eigentliche Kostimulation
von T-Zellen sehr viel komplizierter ist, als zuvor angenommen. Neben der bekannten aktivierenden Interaktion zwischen dem CD28 Rezeptor auf der T-Zelle und
den CD80/CD86 Molekülen auf den APZ, kann durch die Interaktion zwischen
dem CD28 homologen CTLA-4 mit dem CD80/CD86 Molekülen ein inhibierendes
Signal auf die T-Zelle übertragen werden [176]. Ein weiteres wichtiges Molekül zur
Regulation der peripheren Toleranz stellt programmed death 1 (PD-1) dar. Es besitzt
Homologien zum CD28 Rezeptor und übermittelt nach Interaktion mit PD-L1,
einem der B7 Familie homologen Molekül, eine negative Stimulation an die T-Zelle
[170, 128].
Ein weiterer Mechanismus der peripheren Toleranz ist die Induktion von suppressiven Treg, die eine Untergruppe der CD4 T-Zellen bilden. Sie werden in natürliche
und induzierbare Treg unterteilt. Die Eigenschaften dieser Populationen sowie
deren Einfluss auf eine virale Infektion wird im Folgenden weiter ausgeführt (vgl.
2.4.2).
Die natürlichen Treg spielen nicht nur ein Rolle in der peripheren Toleranz zur
Unterdrückung von unerwünschten autoreaktiven T-Zellen, sie werden auch von
unterschiedlichsten Pathogenen induziert, um einer eliminierenden Immunantwort zu entkommen und persistent im Wirt zu leben. Dabei reicht das Spektrum
an infektiösen Pathogenen in Mäusen von Bakterien, z.B. Heliobacter pylori [180],
über Pilze, z.B. Pneumocistis carinii [90], und Protozoen, z.B. Leishmania major [19],
bis hin zu Viren, z.B. Friend Virus [57] und Herpes simplex Virus [213]. Auch im
Menschen konnte der suppressive Einfluss der Pathogen-induzierten natürlichen
Treg auf eine spezifische Immunantwort beobachtet werden [144, 174, 1]. Neben
den natürlichen Treg spielen auch die induzierbaren Treg eine große Rolle in der
Inhibierung einer Pathogen-spezifischen Immunantwort. Dabei produzieren sie
große Mengen des immunmodulatorischen Zytokins IL-10, wodurch es zu einer
reduzierten Th1 Differenzierung kommt.
2.3 DZ adressierende Vakzine
2.3.1 Protein-basierende Vakzine
Die DZ vereinen die Fähigkeit der Aktivierung einer peripheren Toleranz, sowie
die Induktion einer schützenden Immunität (vgl. 2.2.2). Nach der Endozytose von
Protein-basierenden Vakzinen kommt es in der Regel zu einer MHC-II Präsentation
und zur vorrangigen Induktion der humoralen Immunantwort. Da ebenfalls eine
zelluläre Immunantwort für einen Schutz gegen viele Pathogene notwendig ist,
11
2 Einleitung
wurde nach einer Methode gesucht um ZTL effektiv durch Proteinvakzine zu
stimulieren. Dabei zeigten die ersten Experimente, dass sich durch die direkte
Adressierung von APZ die benötigte Menge an Antigen gegenüber einer herkömmlichen Protein-Immunisierung deutlich reduziert [206]. Zusätzlich zeigte die
Adressierung des Antigen an den Fcγ Rezeptor, an MHC-II oder an CD40 eine
verbesserte zelluläre, wie auch humorale Immunantwort [39, 206, 68]. Im Laufe
der Zeit wurde verstärkt an einer direkten Adressierung von Antigenen an DZ
geforscht. Dafür wurden immer mehr potentielle Rezeptoren zur Adressierung
von DZ entdeckt [15]. Viele der bisher untersuchten Rezeptoren, wie z.B. CD205
[30, 29], CD206 [105], Clec9A [38, 91] oder DC-SIGN [88], gehören zur Familie der
C-Typ Lektine. Die Adressierung dieser Rezeptoren gewährleistet eine Aufnahme,
Prozessierung und Präsentation des Antigens auf APZ.
DEC205 ist von den hier genannten der am besten charakterisierte Rezeptor. Er
hebt sich durch seine hohe Expression auf den DZ des lymphoiden Gewebes
[81, 121, 246] sowie durch eine schnelle Antigenpräsentation nach Aufnahme des
Antigens [30, 98, 147] deutlich von den Anderen ab. Die Adressierung des Rezeptors erfolgt über einen DEC205-spezifischen Antikörper. Dieser ermöglicht
hauptsächlich eine Adressierung von DZ in den T-Zellarealen [121, 246], trotz
der Expression des DEC205-Rezeptors auf anderen Leukozyten [93, 246]. Durch
die Kopplung eines Antigens an den Antikörper kann dieses spezifisch an DZ
in vivo adressiert werden, wodurch es zur Rezeptor-vermittelten Aufnahme, Prozessierung und Komplexierung von Antigen-spezifischen Peptiden auf MHC-II
kommt. Auf Grund der Fähigkeit von CD8α+ DEC205+ DZ exogene Antigene mittels Kreuzpräsentation auf MHC-I zu präsentieren, ist ebenfalls eine Aktivierung
von Antigen-spezifischen CD8 T-Zellen durch die Adressierung dieser DZ Subpopulation möglich [61].
Es wurde beobachtet, dass nach einer Protein-Immunisierung mit einem OVAkonjugierten anti-DEC205 Antikörper die Beladungseffizienz [29] und Präsentationsdauer [30] für MHC-I Komplexe größer als für MHC-II Komplexe war.
Außerdem wurde festgestellt, dass eine subkutane Protein-Vakzinierung mit dem
OVA-konjugierten anti-DEC205 Antikörper zu einer partiellen Reifung der adressierten DZ führte [29, 30]. Diese DZ konnten eine kurzzeitige OVA-spezifische
T-Zellproliferation anregen, wonach sie auf Grund des fehlenden Kostimulus anschließend in einen anergen Zustand verfielen [29]. In transgenen Mausmodellen
wurde zudem gezeigt, dass die subkutane Applikation von Fusionsproteinen aus
dem anti-DEC205 Antikörper und den Antigenen OVA [148] oder HA [35, 122]
zu einer Induktion von Antigen-spezifischen Treg führte, die eine erhöhte Expression von Foxp3 oder CTLA-4 aufwiesen [35]. In einem Diabetes-Modell konnte
ferner die Rate an erkrankten Mäusen durch die Hemmung von autoreaktiven
CD4 T-Zellen nach Induktion von Antigen-spezifischen Treg gesenkt werden [35].
Ebenfalls konnten die Ausprägung einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) durch die direkte Adressierung des Antigens an DZ, mit Hilfe
eines DEC205-spezifischen Antikörpers, verhindert werden [183].
Die Anergie der T-Zellen konnte durch die Koapplikation eines Adjuvans (z.B. anti-
12
2 Einleitung
CD40 Antikörper [84] und/oder poly IC [31]) mit dem gekoppelten Antikörper
umgangen werden. Dabei sorgt das Adjuvans für eine vollständige Reifung der
adressierten DZ. Während die Reifung keinen Einfluss auf die Proliferation der
interagierenden Zellen hat, konnten Antigen-spezifische T-Zellen durch die Interaktion mit gereiften DZ zu Effektor- und Gedächtniszellen ausdifferenzieren [30].
Durch die Kombination des konjugierten Antikörpers mit einem anti-CD40 Antikörper konnten effektiver IFN-γ produzierende CD8 T-Zellen induziert werden
[29] als mit anderen Immunisierungsansätzen, wie z.B. freie Antigene in komplettem Freund-Adjuvans [129] oder ex vivo Reifung und Beladung von DZ aus der
Milz [140, 154]. Durch die zusätzliche Verwendung von Reifungsstimuli (anti-CD40
und polyIC) konnte ebenfalls eine breite und langzeitige humorale Immunantwort
induziert werden [31]. Die Applikation von HIV Gag p24-konjugierten DEC205Antikörpern in Kombination mit anti-CD40 und polyIC induzierte einen mukosalen Schutz gegen ein HIV Gag exprimierendes Vaccinia Virus [231]. Durch die
direkte Adressierung eines Melanoma-Antigens in Kombination mit CpG konnte
ebenfalls eine Antigen-spezifische CD4 und CD8 T-Zellantwort induziert werden,
die zu einem Schutz führte [149].
2.3.2 Gen-basierende Vakzine
Neben der Protein-Immunisierung besteht auch die Möglichkeit, die benötigten
Konstrukte in einem Expressionsplasmid zu kodieren und mit der DNA zu immunisieren. Dadurch wird eine kontinuierliche, langzeitige Expression des Antikörperkonstrukts in situ gewährleistet [247], was eine mehrfache Applikation
überflüssig macht. Dabei war die Effektivität des Transfers der DNA in die Zellen
recht gering. Erst durch das Anlegen eines elektrischen Feldes, mit Hilfe von elektrischen Pulsen einer geringen Intensität, konnte sehr viel effektiver die DNA in
die Zellen eingebracht werden [159]. Dabei permeabilisieren die elektrischen Pulse
die Zellmembran und die Plasmid-DNA wird entlang des elektrischen Feldes in
die Zelle transportiert [36, 116, 196]. Die Erhöhung der Intensität der elektrischen
Impulse führte zwar zu einer verbesserten Genexpression aber auch zu einer stärkeren Zerstörung des Muskelgewebes [239, 240]. Ein weiterer Vorteil gegenüber
den Proteinimpfstoffen liegt in der einfachen Herstellung des Expressionsvektors in großen Mengen unter standardisierten Bedingungen und unabhängig vom
verwendeten Antigen. Im Gegensatz dazu ist die Produktion des konjugierten
anti-DEC205 Antikörpers für eine Protein-Vakzinierung mit mehr Aufwand verbunden. Während die Protein-Vakzinierung zusätzliche Reifungsstimuli für DZ
benötigt [30, 31, 84, 231], kann die DNA-Immunisierung ohne zugegebenen Kostimulus eine Immunität induzieren [51, 168]. Es wurde gezeigt, dass die DNA
selbst mikrobielle CpG Motive als Reifungssignal für DZ enthalten kann [219] oder
die Elektroporation selbst eine Inflammation auslöst [136], wodurch die DZ zur
Reifung stimuliert werden.
Nchinda et al. zeigte, dass die Immunisierung mit einer DNA, die für einen OVA-
13
2 Einleitung
konjugierten DEC205-spezifischen Antikörper kodierte, zu einer hohen Antigenpräsentation sowohl auf MHC-I als auch auf MHC-II führte [168]. Zusätzlich
wurde die Struktur des DEC205-spezifischen Antikörpers soweit verändert, dass
anstatt eines vollständigen Antikörpers ausschließlich die variablen Regionen
der leichten und schweren Kette mit einem Peptidlinker miteinander verbunden
wurden. Dieses als Einzelkettenantikörper (EAk) bezeichnete Konstrukt besitzt
gegenüber den vollständigen Konstrukten einige Vorteile. Durch die reduzierte
Größe können die EAk einfacher ins Gewebe einwandern [16] und es ist aufgrund
der fehlenden Fc Domäne eine mehrfache Applikation möglich, ohne eine neutralisierende Antikörperantwort im Empfänger zu induzieren [51]. Außerdem
wird dadurch ein unspezifisches Abfangen der EAk durch Fc Rezeptoren unterbunden. Neben der verbesserten Antigenpräsentation konnte Nchinda ebenfalls
zeigen, dass die direkte Adressierung von HIV Gag p41 an DZ durch eine einmalige DNA-Elektroporation ausreichte, um eine schützende Immunantwort gegen
ein rekombinantes Gag-exprimierendes Vaccinia Virus in Mäusen zu induzieren
[168]. Tenbusch und Kollegen erreichten in Rhesusaffen eine Adressierung des HIV
Gag p41 Fragmentes an unreife (CD1a+ ) und reife (CD83+ ) myeloide DZ durch
DEC205-spezifische Antikörper [225]. Trotz zweimaliger DNA-Immunisierung
und Adressierung mit Gag abgeleiteter Antigene an DZ konnten sie keine erhöhte
Immunantworten im Affen induzieren. Im Einklang mit der schlechten Immunantwort nach zweimaliger DNA-Immunisierung in Rhesusaffen, beobachtete
Grossmann et al. (2009) ebenfalls eine reduzierte Antigen-spezifische Immunantwort nach einer DNA-Prime/Adeno-Boost Immunisierung im OVA-Modell [79].
Erst die Zugabe der Adjuvanzien polyI:C und CpG zu der DNA induzierte eine
deutlich verbesserte Immunantwort. Die Verwendung von nicht-replizierenden
viralen Vektoren stellt eine weitere Möglichkeit dar, effektiv DNA in eine Zelle
zu transferieren. Tenbusch und Kollegen zeigten, dass die Verwendung von adenoviralen Vektoren, die für DEC205-spezifische OVA-konjugierte EAk kodieren,
zu einer verstärkten Präsentation auf MHC-I und MHC-II führte, sowie zu einer
erhöhten Induktion von polyfunktionalen CD8 T-Zellen [226]. Ähnlich zu den
Ergebnissen in der Primatenstudie [225] konnte trotz erhöhter Antigenpräsentation und CD8 T-Zellantworten keine Verbesserung im Tumor-Modell oder nach
Infektion mit einem rekombinanten OVA-exprimierenden Vaccinia Virus erreicht
werden. Ähnlich zum adenoviralen Vektorsystem war das Vektorsystem des Newcastle Disease Virus ebenfalls in der Lage, eine erhöhte Antigenpräsentation und
verbesserte Antigen-spezifische CD8 T-Zellantworten zu induzieren [145]. Aber
im Gegensatz zu der adenoviralen Immunsierung war durch die Verwendung des
Newcastle Disease Virus ein Schutz gegen eine Infektion mit Gag-exprimierendem
Vaccinia Virus beobachtet worden.
14
2 Einleitung
2.4 Regulatorische T-Zellen
2.4.1 Allgemeine Funktion
Die regulatorischen T-Zellen unterteilen sich in natürliche und induzierbare Treg.
Natürliche CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg reifen im Thymus heran und dienen zur
Supprimierung unerwünschter autoreaktiver Immunantworten in der Peripherie
[224, 24, 67, 100]. Für die Aktivierung von Treg werden zwei Signale benötigt,
Zellkontakt und Antigenerkennung [189, 227, 238]. Es wurde beobachtet, dass
Antigen-spezifische Treg effizienter in der Regulation von Toleranz bei Transplantationen [78] oder Autoimmunantworten [221, 224] sind, als Treg mit einer breiten
Spezifität. Treg sind außerdem für die Homöostase von Immunzellen unverzichtbar. Eine Depletion von Foxp3+ Treg in erwachsenen Mäusen führte zu ihrem
Tod durch hohe Proliferation von lymphoiden Zellen und der Ausprägung einer
schweren Immunpathologie binnen drei Wochen [110].
Die Treg sind in der Lage Effektorzellen durch eine direkte Interaktion oder indirekt über den Einfluss auf APZ zu supprimieren [227, 218, 222]. Die Suppression
kann dabei durch einen Zell-Zellkontakt [74, 253] oder die Freisetzung von Zytokinen [10, 46] erfolgen. Zum Beispiel führt die Expression des CD4 homologen
LAG-3 und Interaktion mit MHC-II auf unreifen DZ zu einer Inhibierung der
Reifung [134]. Des Weiteren führt die Interaktion zwischen Treg und DZ über die
auf Treg exprimierten Oberflächenproteine CTLA-4 [14] oder TIGIT [250] zu einer
Freisetzung von immunsupressiven Molekülen wie IL-10, TGF-β oder IDO.
Neben den im Thymus gereiften Treg kann unter bestimmten Bedingungen die
Expression von Foxp3 aber auch in der Peripherie in vivo induziert werden, z.B.
durch die systemische Applikation von subimmunogenen Dosen eines Antigens
[122, 234, 123] oder durch ein starkes TZR-Signal in Kombination mit einer suboptimalen Kostimulation und großen Mengen an TGF-β [122, 254, 43]. Neben der
Konvertierung von naiven CD4+ CD25- T-Zellen in Foxp3+ exprimierende Treg,
können auch weitere induzierbare Treg in der Peripherie entstehen, die keinen
klassischen Phänotyp besitzen und nur anhand ihrer exprimierten Zytokine unterschieden werden. Dabei unterscheidet man zwischen den IL-10 [186, 44] (Tr1) und
TGF-β [64, 80] (Th3) produzierenden induzierbaren Treg. Auf Grund der fehlenden
Oberflächenproteine, wie sie von natürlichen Treg exprimiert werden, führen diese
Zellen ihre inhibitorische Funktion über lösliche Faktoren aus [179].
2.4.2 Rolle bei viralen Infektionen
Wie schon zuvor bereits beleuchtet (vgl. 2.2.3), kann es durch eine virale Infektion
zur Induktion von Treg in Mäusen und im Menschen kommen. Sie sorgen sowohl
für eine Orchestrierung der Immunzellen [143] als auch für einen Schutz des Gewebes vor einer Virus-induzierten Immunpathologie [157]. Dabei wirken sich die
suppressiven Effekte auf annähernd jeden Zelltyp aus, der an einer antiviralen
15
2 Einleitung
Immunantwort beteiligt sein könnte, wie z.B. DZ [160], Monozyten/Makrophagen
[216], NK Zellen [232, 181] und CD8 T-Zellen [1, 57]. Durch die Induktion der Treg
haben hauptsächlich persistierende Viren, wie z.B. HIV [243], HCV [37] oder HSV
[214], einen Mechanismus gefunden die spezifische Immunantwort zu umgehen
bzw. zu inhibieren. Es ist bisher noch nicht vollständig geklärt, ob die Suppression
ein aktiver Mechanismus des Virus ist um den Wirt zu schwächen oder ob es sich
um einen Nebeneffekt des Immunsystems handelt. Durch die recht frühe Induktion
des inhibierenden Zelltyps, oftmals schon während der akuten Phase von persistierenden Viren, kann sich keine CD8 T-Zellantwort ausbilden, die ausschlaggebend
für die Beseitigung des Virus wäre [63, 177].
Durch die Depletion von Treg konnte der suppressive Einfluss auf eine Virusspezifische Immunantwort in HIV-ausgesetzten Kleinkindern beobachtet werden [131]. In Mäusen wurde ebenfalls eine verbesserte Virus-spezifische CD8
T-Zellanwort nach selektiver Depletion von Treg während der akuten Infektionsphase eines Retrovirus erhalten [252, 251]. Ebenso wurde im RSV-Modell eine
verbesserte Funktion von Effektorzellen nach Depletion der Treg beobachtet, was
zwar zu einer schnellen Reduktion der viralen Beladung in der Lunge führte,
aber auch zu einer erhöhten Inflammation und einem schweren Krankheitsverlauf
[139]. Neben der bereits erwähnten Suppression der antiviralen Immunantwort
zur Reduktion der Immunpathologie können Treg auch eine frühe Koordination
der Immunzellen übernehmen. Lund et al. zeigte, dass die Reduktion der Treg
während einer mukosalen HSV Infektion in Mäusen zu einem schnelleren und
tödlicheren Krankheitsverlauf führte [143]. Trotz vermehrter IFN-γ Produktion
in den Lymphknoten wurde erhöhte virale Beladung in der Mukosa sowie eine
verzögerte Einwanderung von Immunzellen in der Infektionsstelle beobachtet.
Auf Grund der unterschiedlichen Eigenschaften, die Virus-induzierte Treg besitzen
können, wäre es von großen Interesse den Einfluss von Influenza A induzierten
Treg auf die Immunantwort zu untersuchen.
2.5 Zielsetzung der Arbeit
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Immunisierung mit einer DNAVakzine, die für DEC-gerichtete Antigene kodiert, eine erhöhte Immunogenität
induziert oder es zur Aktivierung von Toleranzmechanismen kommt. Dafür sollte
das Hämagglutinin (HA) als gekoppeltes Antigen verwendet werden, da es sowohl in einem Influenza A Virus Infektionsmodell genutzt werden kann, um die
Immunogenität zu testen, als auch in transgenen Modellen, um das Schicksal von
Antigen-spezifischen T-Zellen näher zu beleuchten.
Zu Beginn sollte die Antigenpräsentation von HA-spezifischen Epitopen auf den
MHC-Komplexen anhand der Proliferation von transferierten T-Zellrezeptor transgenen Zellen untersucht werden. In bereits einer Vielzahl von Berichten wurde
gezeigt, dass unter anderem die Adressierung von OVA an DZ zu einer erhöhten
Antigenpräsentation führte. Außerdem war von Interesse, ob die verstärkte MHC-I
16
2 Einleitung
Präsentation von OVA ebenfalls auf HA zutraf.
Da die Berichte in der Literatur über die Immunogenität einer DEC-gerichteten
DNA Vakzine stark auseinander gehen, sollte anschließend die Induktion einer
HA-spezifischen Immunität nach zweimaliger DNA-Immunisierung anhand der
Zytokinexpression in Lymphozyten untersucht werden. Neben der Aktivierung
der zellulären Immunantwort, sollte auch die Produktion von Antikörpern mittels Durchflusszytometrie und deren Subtypenverteilung durch ELISA bestimmt
werden. Ebenfalls sollte die Virus-neutralisierende Eigenschaft der induzierten
Antikörper über einen Mikroneutralisationstest bestimmt werden. Neben der Analyse der Quantität der Immunantwort, sollte auch die Qualität durch eine virale
Infektion untersucht werden.
Weiterhin war von Interesse, ob durch die zusätzliche Applikation eines Adjuvans
ein Einfluss auf die Differenzierung der T-Helferzellen genommen werden könnte.
Aus der Literatur ist bekannt, dass die Koapplikation eines IL-12 Expressionsplasmids eine Verschiebung der T-Zelldifferenzierung in Richtung Th1 ermöglicht,
sowie zytotoxische T-Lymphozyten aktiviert. Um diesen stimulatorischen Effekt
der IL-12 Koapplikation auf die direkte Adressierung der Epitope an dendritische
Zellen durch DNA Immunisierung zu untersuchen, sollte das Blut nach den beiden
Immunisierungen auf Antigen-spezifische Th1 differenzierte CD4 T-Zellen sowie
auf eine Veränderung des Verhältnisses zwischen den Antikörpersubtypen IgG1
und IgG2a analysiert werden. Durch eine Infektion mit dem homologen Influenza
A Virus sollte die Qualität der induzierten Immunantwort untersucht werden.
Dabei sollten der Gewichtsverlauf, die viralen Beladung in BAL und Lunge, sowie
die Zellkomposition in der BAL einen Aufschluss über den Einfluss von IL-12 auf
die Immunantwort geben.
Die Betrachtung der Immunantwort nach Applikation der verwendeten Konstrukte stellt dabei nur eine Möglichkeit dar zu untersuchen, wie unreife adressierte
dendritische Zellen reagieren können. Aus der Literatur ist außerdem bekannt,
dass die direkte Adressierung des Antigens an unreife dendritische Zellen in
Abwesenheit eines Reifungssignals die Induktion peripherer Toleranzmechanismen gegenüber einer schützenden Immunität bevorzugt. Um das Schicksal von
Antigen-spezifischen T-Zellen nach einer DZ-gerichteten DNA-Immunisierung zu
untersuchen, sollten T-Zellrezeptor transgene Mäuse immunisiert werden. Dabei
sollen die Antigen-spezifischen T-Zellen im Blut zu unterschiedlichen Zeitpunkten
auf die Induktion peripherer Toleranzmechanismen untersucht werden. Auf Grund
dieser eher oberflächlichen Analysemethode sollte anschließend eine definierte
Menge an Antigen-spezifischen T-Zellen in Wildtyp Mäuse transferiert und deren Verbleib nach DNA-Immunisierung untersucht werden. Wäre eine Induktion
peripherer Toleranzmechanismen feststellbar, könnte eine genauere Analyse des
Potentials in einem OVA-induzierten asthmatischen Allergie Modell untersucht
werden.
17
3 Materialien
3 Materialien
3.1 Versuchstiere
Wildtyp Balb/cJ Mäuse (kommerziell erworben von Janvier, Frankreich)
Sie waren weiblich und in einem Alter von ca. sechs Wochen. Nach einer Eingewöhnungsphase von zwei Wochen wurden sie für experimentelle Zwecke verwendet.
DEREG Balb/c Mäuse (von Prof. Sparwasser, Hannover [127])
enthalten die Insertion eines Fusionsproteins, bestehend aus dem DiphtherieRezeptor und einem Grün-fluoreszierenden Protein, unter dem Foxp3 Genlokus.
Tiere wurden auf dem genetischen Balb/c Hintergrund gezüchtet.
INS-HA/RAG-/- Mäuse (von Prof. Hansen und Prof. Buer, Essen [138])
exprimieren auf den β-Zellen im Pankreas Hämagglutinin. Zusätzlich RAG-1 Deletion unterbindet die Ausbildung von reifen T- und B-Zellen in einem frühen
Stadium. Benötigte Tiere wurden für die Versuche bereitgestellt
TCR-HA Balb/cJ (von Prof. Hansen und Prof. Buer, Essen [111])
ein Teil der CD4 T-Zellen besitzen einen transgenen T-Zellrezeptor, der spezifisch
für das CD4 HA-Epitop des Influenza A Virus PR/8/34 ist. Tiere wurden auf dem
genetischen Balb/c Hintergrund gezüchtet.
TCR-HA/Thy1.1 Balb/cJ
Kreuzung der TCR-HA Balb/c Zucht mit der Thy1.1 Balb/c Zucht, zur Expression des genetischen Oberflächenmarkers CD90.1 (Thy1.1) auf CD4 T-Zellen, die
einen transgenen T-Zellrezeptor gegen das CD4 HA-Epitop des Influenza A Virus
PR/8/34 besitzen. Tiere wurden auf dem genetischen Balb/c Hintergrund gezüchtet.
Thy1.1 Balb/cJ (von Prof. Hansen und Prof. Buer, Essen [76])
exprimieren den genetischen Oberflächenmarker CD90.1 (Thy1.1) an Stelle des
CD90.2 (Thy1.2), der zur vereinfachten Detektion und Diskriminierung von Zellpopulationen dient. Tiere wurden auf dem genetischen Balb/c Hintergrund gezüchtet.
18
3 Materialien
3.2 Bakterienstämme
Alle verwendeten Bakterienstämme sind Subtypen von Escherichia .choli
BJ5183 (Stratagene)
endA1sbcBC racBC galK met thi-1 bioT hsdR (StrR )
DH5α (NEB)
fhuA2 ∆(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 φ80 ∆(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1
thi-1 hsdR17
DH-10β (NEB)
∆(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ∆lacX74 galK16 galE15 e14- φ80dlacZ∆M15 recA1 relA1
endA1 nupGrpsL (StrR ) rph spoT1 ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC)
3.3 Zelllinien
CHOneo
CHOmDEC205
HEK 293A-Zellen
HEK 293T-Zellen
MDCK II
“chinese hamster ovary“-Zelllinie, enthält ein NeomycinResistenzgen
“chinese hamster ovary“-Zelllinie, exprimiert den murinen
DEC205-Rezeptor
“human embryo kidney“-Zelllinie, transformiert mit dem
Adenovirus Serotyp 5, enthält das E1-Gen [77]
“human embryo kidney“-Zelllinie, transformiert mit dem
Adenovirus Serotyp 5, enthält das E1-Gen und das große
T-Antigen des Simian Virus 40 [60]
“Madin-Darby canine kidney“-Zelllinie, Epitheliumähnliche Morphology, isoliert aus der Niere eines
weiblichen Cocker Spaniels. [146] Zur Verfügung gestellt
von der Dr. Ehrhardt aus der Molekularen Virologie in
Münster.
3.4 Nukleinsäuren
3.4.1 Plasmide
pORF-mIL-12 (kommerziell erworben von InvivoGen, San Diego, USA)
exprimiert das murine Interkleukin 12.
pORF-mTGF-β (kommerziell erworben von InvivoGen, San Diego, USA)
kodiert für den murinen transformierenden Wachstumsfaktor β.
pORF5-mIL-10 (kommerziell erworben von InvivoGen, San Diego, USA)
19
3 Materialien
enthält eine Expressionskassette für das murine Interleukin 10.
pMK-HAopt (kommerziell erworben bei GenArt® Gene Synthesis, Deutschland)
kodiert eine Kodon-optimierte Expressionskassette des Oberflächenproteins Hämagglutinin 1 vom Influenza A Stamm PR/8/34.
pV-GL117-OVA (zur Verfügung gestellt von Prof. Tenbusch, AG Tenbusch)
kodiert für ein Fusionsprotein aus einem Einzelkettenantikörper spezifisch gegen
β-Galaktosidase und dem gekoppelten Ovalbumin (OVA)
pV-mDEC-OVA (zur Verfügung gestellt von Prof. Tenbusch, AG Tenbusch)
enhält eine Expressionskassette für ein Fusionsprotein aus einem Einzelkettenantikörper, der gegen den murinen DEC205 Rezeptor gerichtet ist, und Ovalbumin
(OVA)
pV-HAopt -OLLA
hergestellt durch die Restriktion des gekauften pMA-PR8-HAopt und des Zielvektors. Nach Ligation kodiert der pV-Vektor for das codon-optimierte Hämagglutinin
des Influenza A Virusstammes PR8 und einen OLLAS-Tag am Ende
pDsRed-Monomer-N1 (zur Verfügung gestellt durch die AG Hahn)
ist ein Reporterplasmid, das für das rot fluoreszierendes Protein DsRed der Scheibenanemone (Discosoma sp.) kodiert
pV-GL117-HACD8-OLLA (hergestellt während Masterarbeit, AG Überla)
enhält eine Expressionskassette für ein Fusionsprotein aus dem Einzelkettenantikörper, der als interne Kontrolle dient und gegen den β-Galaktosidase Rezeptor
gerichtet ist, und dem immundominanten CD8 Epitop von Hämagglutinin (HA)
und einem OLLAS-Tag am Ende
pV-GL117-solHA-OLLA(hergestellt während Masterarbeit, AG Überla)
exprimiert ein Fusionsprotein aus dem Kontroll-Einzelkettenantikörper, der gegen
den β-Galaktosidase Rezeptor gerichtet ist, und der extrazelluläre Domaine von
Hämagglutinin (HA) und einem OLLAS-Tag am Ende
pV-mDEC-solHA-OLLA (hergestellt während Masterarbeit, AG Überla)
enhält eine Expressionskassette für ein Fusionsprotein aus dem Einzelkettenantikörper, und der gegen den murinen DEC205 Rezeptor gerichtet ist, der extrazelluläre Domaine von Hämagglutinin (HA) und einem OLLAS-Tag am Ende
pV-mDEC-HACD8-OLLA (hergestellt während Masterarbeit, AG Überla)
kodiert für ein Fusionsprotein aus dem Einzelkettenantikörper, der gegen den
murinen DEC205 Rezeptor gerichtet ist, und dem immundominaten CD8 Epitops
von Hämagglutinin (HA) und einem OLLAS-Tag am Ende
20
3 Materialien
3.4.2 Oligonukleotide
qRT-PCR zur Bestimmung von viralen RNA Kopien eines Influenza A Virusstammes
AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA
M253R
M52C
TTCTAACCGAGGTCGAAACG
Interne Kontrolle bei allen Genotypisierung von Nachkommen aus allen Mauszuchten
CAAATGTTGCTTGTCTGGTG
oIMR015
oIMR016
GTCAGTCGAGTGCACAGTTT
Zur Genotypisierung der Nachkommen aus DEREG Zuchten
CCCAGGTTACCATGGAGAGA
P442
P443
GAACTTCAGGGTCAGCTTGC
Zur Genotypisierung der Nachkommen von TCR-HA Zuchten
Kirv5915
CCTGAACTGGGGATTCTACTCTTCC
Kir 5916
AGTCAGCTTATTATTGCCTCCACTC
Zur Analyse der Nachkommen auf den genetischen Oberflächenmarker Thy1.1
aus den entsprechenden Zuchten
oIMR4149
GAGGAAGGAGGAGAGAATGAAA
oIMR4150
CGTCTGGTCTCATGGGCAACGT
3.5 Peptide
Bezogen von Dr. Rudolf Volkmer, Medizinische Immunologie an der Charité in
Berlin
Ovalbumin CD4-Epitop323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR)
Bezogen von Dr. Rudolf Volkmer, Medizinische Immunologie an der Charité in
Berlin
Hämagglutinin CD4-Epitop110-120 (SFERFEIFPKE) vom A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
und Hämagglutinin CD8-Epitop518-526 (IYSTVASSL) vom A/Puerto Rico/8/34
(H1N1)
21
3 Materialien
Firma
BD Bioscience:
Dako:
eigene Aufreinigung:
Ursprung
Ratte
Ratte
Kaninchen
Kaninchen
Ratte
Ratte
Ratte
Ratte
Ratte
Ratte
Ratte
Ratte
Ratte
Ratte
Spezifität
anti-Maus IgG1
anti-Maus IgG2a
anti-Ratte IgG
anti-Maus IgG
anti-B220
anti-CD4
anti-CD8
anti- CD25
anti-CD161
anti-F4/80
anti-HA
anti-MHCII
anti-OLLAS
anti-TCR-HA
Markierung
HRP
HRP
HRP
HRP
3.6 Antikörper
3.6.1 Antikörper für ELISA, Western Blot und Zellseparation
3.6.2 Antikörper für FACS basierende Analysen
BioLegend:
BD Bioscience:
eBioscience:
Life Technology:
selbst markiert:
CD43-AlexaFluor488, Helios-AlexaFluor488, Thy1.1AlexaFlour488, Thy1.1-PE-Cy7
CD3-BV510, CD4-APC, CD4-PE, CD4-PE-Cy7, CD4PerCP, CD8-PerCP, CD8-FITC, CD8-PacificBlue, CD11bAPC-Cy7, CD11b-APC, CD11c-BV450, CD11c-PE, CD19PE-Cy7, CD25-APC, CD45-PerCP-Cy5.5, CD62L-PE,
CD107a-FITC, IFNγ-PE, IFNγ-PE-Cy7, mouseIgG-FITC,
IL2-APC, TNFα-AlexaFlour488, TNFα-PE-Cy7
CD4-PerCP-eFlour710, CD8-PerCP-eFlour710, CD11beFlour450, CD49b-APC, CD49b-PE, F4/80-APC, Fixable
Viability Dye-eFlour780, Foxp3-AlexaFlour488, Foxp3PE, IL10-PE, Ly6G-AlexaFluor488, Thy1.2-APC
GranzymeB-APC, GranzymeB-PE
6.5-FITC, OLLAS-APC
3.7 Enzyme
CIP
Expand Taq (HIFI) Polymerase
Restriktionsenzyme
22
New England Biolabs, Ipswich, England
Roche, Basel, Schweiz
New England Biolabs, Ipswich, England
3 Materialien
3.8 Protein-Größenstandards und
DNA-Längen-Standards
Für die Agarose-Gelelektrophorese im TAE-Puffer wurde der GeneRulerTM 1kb
Plus DNA Ladder von Fermentas verwendet. Er zeigt 15 Banden und deckt den
Bereich von 20000 -75 bp ab. Des Weiteren besitzt er drei Referenzbanden mit hoher
Intensität bei 500, 1500 und 5000 bp.
Als Proteinmarker für die SDS-PAGE wurde der Pricision Plus Protein dual color
standard von BioRad eingesetzt. Er besitzt innerhalb eines Bereichs von 250 kDa bis
10 kDa 10 Banden. Die rötlich gefärbten Referenzbanden befinden sich bei 75 und
25 kDa.
3.9 Reagenzien und Lösungen
ACK Lysepuffer
Acrylamid-Lösung 30%
Agar
Agarose
Ammoniumperoxodisulfat
Ammoniumsulfat
Ampicillin
Bovines Serum-Albumin
Bovines Serum-Albumin 35%
Bromphenolblau
Calziumchlorid
CFSE
Chlorwasserstoffsäure
Ciprofloxazin
Collagenase
DEAE-Dextran
Dimethylsulfoxid
DMEM
DMEM-Pulver (10x)
DNase I
dNTPs
Dynabeads® Sheep anti-Rat IgG
EDTA
Essigsäure
Ethanol
Bio Whittaker
AppliChem
AppliChem
Biozyme
Roth
J.T. Baker
Roth
Sigma
PAA
Fluka
AppliChem
Invitrogen
J.T. Baker
Bayer
Sigma-Aldrich
Sigma
J.T. Baker
Gibco/Invitrogen
Gibco/Invitrogen
AppliChem
Amersham Biosciences
Invitrogen
Sigma
J.T. Baker
Riedel-de Haen
23
3 Materialien
Ethidiumbromid-Lösung
fetal calf serum
Glycerin
Glycin
L-Glutamin
HBSS
Hefeextrakt
Heparin
HEPES
para-Hydroxycoumarinsäure
Imject Alum Adjuvant
Inkomplettes Freund-Adjuvans
Isopropanol
Isofluran
Kaliumchlorid
Kaliumdihydrogenphosphat
Kanamycinsulfat
Ketamin (10%)
Kristallviolett
Luminol
Magermilchpulver
Magnesiumchlorid
2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
Methanol
β-Mercaptoethanol
Monensin
MTT
NaCl-Lösung (0,9%)
Natriumacetat
Natriumazid
Natriumkarbonat
Natriumchlorid
Natriumdodecylsulfat
Natriumhydrogenkarbonat
di-Natriumhydrogenphosphat
Natriumhypochlorid
Ovalbumin
Oxoid-Agar
Paraformaldehyd
24
AppliChem
Gibco
J.T. Baker
Roth
Invitrogen
Gibco/Invitrogen
AppliChem
AppliChem
Applichem
Sigma
Thermo Scientific
Sigma-Aldrich
Merck
Baxter
J.T. Baker
J.T. Baker
AppliChem
CP-Pharma
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Heirler
J.T. Baker
BioMol
Sigma-Aldrich
Gibco/Invitrogen
Sigma-Aldrich
AppliChem
SteriPharm
Sigma-Aldrich
AppliChem
J.T. Baker
J.T. Baker
AppliChem
J.T.Baker
J.T. Baker
AppliChem
Sigma-Aldrich
ThermoScientific
J.T. Baker
3 Materialien
PBS 10x
Penecillin/Streptomycin
Polyethylenimin
RPMI1640
Saponin
Sukrose
Syber Green (10000x)
TAE 50x
TBE 5x
TEMED
Trizma Base
Tris HCl
Trypsin solo
Trypsin/EDTA (10x)
Trypton
Tween20
Wasser
Wasserstoffperoxid
Xylavet (2%)
Xylol
Gibco/Invitrogen
Gibco
Sigma-Aldrich
Gibco/Invitrogen
Sigma-Aldrich
J.T. Baker
Molecular Probes
AppliChem
AppliChem
Merck
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Gibco/Invitrogen
Gibco/Invitrogen
AppliChem
AppliChem
B. Braun
J.T. Baker
CP-Pharma
J.T. Baker
3.10 Lösungen
3.10.1 Molekularbiologische Lösungen
Agarosegel
1 % (w/v)
0,01 % (v/v)
Agarose
Ethidiumbromid
in TAE (1x)
AK-Elu
500 mM
20 mM
Ammoniumsulfat
Kaliumdihydrogenphosphat
in Wasser auf pH 6,7
AK-Wasch
25 mM
Alkalische Lyse Puffer
10 M
0,5 M
2-(NMorpholino)ethansulfonsäure
in Wasser auf pH 4
Natriumhydroxid
Natrium-EDTA
in Wasser
CaMg-Lösung (100x)
1 % (w/v)
Magnesiumchlorid
25
3 Materialien
1 % (w/v)
Calziumchlorid
in Wasser
DEAE-Dextran
10 % (w/v)
DEAE-Dextran
in Wasser
DNA-Probenpuffer (6x)
0,25 % (w/v)
0,25 % (w/v)
30 %
Bromphenolblau
Xylol
Glycerin
in Wasser
ELISA-Blockpuffer
5 % (w/v)
Magermilchpulver
in ELISA-Waschpuffer
ELISA-Beschichtungspuffer
100 mM
35 mM
Natriumhydrogenkarbonat
Natriumkarbonat
in Wasser
Karbonatlösung auf pH = 9,5
0,1 M
ELISA-Verdünnungspuffer
2 % (w/v)
Magermilchpulver
in PBS-T0,05
Ethidiumbromid-Lösung
10 mg/ml
Ethidiumbromid
in Wasser
HBS (2x)
1,4 M
250 mM
10 mM
Natriumchlorid
HEPES
diNatriumhydrogenphosphat
in Wasser auf pH = 7,12
HEPES-Puffer
1M
HEPES
in Wasser
ICS-Permeabilisierungspuffer
5 % (v/v)
Saponin-Lösung
in PBS/BSA/Azid
Infektions-PBS
1 % (v/v)
1 % (v/v)
Penecilin/Streptomycin
100x CaMg-Lösung
26
3 Materialien
0,6 % (v/v)
Bovines Albumin (35 %)
in PBS (1x)
Kristallviolett-Arbeitslösung
13,3 %
26,7 %
Stocklösung
Methanol
in Wasser
Kristallviolett-Stocklösung
1 % (w/v)
20 % (v/v)
Kristallviolettpulver
Ethanol
in Wasser
Narkotikum
0,525 % (w/v)
0,33 % (v/v)
2,5 % (v/v)
Natriumchlorid-Lösung
Xylazin-Lösung
Ketamin-Lösung
Neutralisations-Reagenz
1M
Tris
in Wasser
Paraformaldehyd (4%)
750 mM
Paraformaldehyde
in PBS (1x) pH = 7,4
PBS (10x)
1,37 M
0,043 M
0,027 M
0,014 M
Natriumchlorid
Dinatriumhydrogenphosphat
Kaliumchlorid
Kaliumdihydrogenphosphat
in Wasser pH = 7,4
PBS/BSA/Azid
0,1 % (v/v)
1 mM
BSA
Natriumazid
in PBS (1x)
PBS-T0,05
0,05 % (v/v)
Tween20
in PBS (1x)
PBS-T0,1
0,1 % (v/v)
Tween20
in PBS (1x)
Saponin-Lösung
10 % (w/v)
Saponin
in PBS
27
3 Materialien
SDS-PAGE Laufpuffer
25 mM
190 mM
0,1 %
Trisma Base
Glycin
SDS
in Wasser
SDS-PAGE Probenpuffer (2x)
150 mM
30 % (v/v)
1,2 % (v/v)
0,0018 % (w/v)
15 % (v/v)
TrisCl (pH = 6,7)
Glycerin
SDS
Bromphenolblau
β-Mercaptoethanol
in Wasser
SDS-PAGE Transferpuffer
20 mM
152 mM
20 % (v/v)
Trisma Base
Glycin
Methanol
Trypsin/EDTA
0,05 % (w/v)
0,02 % (w/v)
Trypsin
EDTA
in 10x PBS
Western Blot Blockpuffer
5 % (w/v)
Magermilchpulver
in PBS-T0,1
DMEM (2x)
0,6 % (v/v)
1 % (v/v)
0,1 % (v/v)
0,74 % (w/v)
2,68 % (w/v)
Bovines Albumin (35 %)
Penicilin/Streptomycin
DEAE-Dextran (10 %)
Natriumhydrogencarbonat
DMEM (10x)
in Wasser
DMEM (10 %)
10 % (v/v)
1 % (v/v)
FCS
Penicilin/Streptomycin
LB-Medium
1 % (w/v)
170 mM
0,5 %
Trypton
Natriumchlorid
Hefeextrakt (pH = 7,2 . 7,5)
LB-Agar
1,5% (w/v)
Agar
in LB-Medium
3.10.2 Medien in der Zellkultur
28
3 Materialien
Infektionsmedium
0,6 %
1%
1,2 µl/ml
Bovines Albumin (35 %)
Penicillin/Streptomycin
Trypsin solo
in DMEM
Oxoid-Agar (3 %)
3 % (w/v)
Oxoid-Agar
in Wasser
Plaque-Medium
30 % (v/v)
70 % (v/v)
1,2 µl/ml
10 µl/ml
Oxoid-Agar (3 %)
DMEM (2x)
Trypsin solo
CaMg (100x)
R10H für Hybridoma Zellen
10 % (v/v)
1 % (v/v)
2 mM
10 mM
FCS
Penicillin/Streptomycin
L-Glutamin
HEPES
in RPMI 1640
R10L für Lymphozyten
10 % (v/v)
1 % (v/v)
2 mM
10 mM
0,1 % (v/v)
FCS
Penicillin/Streptomycin
L-Glutamin
HEPES
β-Mercaptoethanol
in RPMI 1640
S.O.C. - Medium
(Invitrogen)
2 % (w/v)
0,5 % (w/v)
20 mM
10 mM
10 mM
10 mM
2,5 mM
Trypton
Hefeextrakt
Glukose
Natriumchlorid
Magnesiumchlorid
Magnesiumsulfat
Kaliumchlorid
29
3 Materialien
3.11 Reagenzsysteme
ECL Chemiglow
FITC anti-mouse/rat Foxp3 staining kit
Human/Mouse TGF-beta 1 ELISA Ready-SET-Go!®
Jet quick - DNA clean-up Spin Kit
DNA Ligationskit V2.1
Limulus Amebocyte Lysat QCL-1000
Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit
Mouse IFNγ ELISA Ready-SET-Go!®
Mouse IL-4 ELISA Ready-SET-Go!®
Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go!®
Mouse IL-10 ELISA Ready-SET-Go!®
Mouse IL-13 ELISA Ready-SET-Go!®
Nucleobond® PC 500 EF
Nucleobond® PC 2000 EF
Nucleobond® PC 10000 EF
NucleoSpin Plasmid QuickPure
PE anti-mouse/rat Foxp3 staining kit
QIAamp Viral RNA Mini Kit
QIAquick® Gel extraction Kit
QuantiTect Probe RT-PCR Kit
Alpha Innotech
eBioscience
eBioscience
Genomed
TaKaRa
Lonza
Miltenyi Biotech
eBioscience
eBioscience
eBioscience
eBioscience
eBioscience
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
eBioscience
Qiagen
Qiagen
Qiagen
3.12 Verbrauchsmaterialien
96-Loch-Mikrotiterplattern
Bakerbond wide pore
Jelco® I.V. Catheters
Gel-Blot-Papier
Nitrocellulose Transfer membran
Plastikwaren
Snakeskin
Sterilfilter (0,22 µm, 0,44 µm)
Zellkulturplatten (6-Loch, 24-Loch)
Zellkulturflaschen (25 cm2 , 75 cm2 , 175 cm2 )
Zellkulturflaschen (300 cm2 )
Zellsiebe (70 µm, 40 µm)
30
Nunc
Sarstedt
Baker
Smiths Medical
Schleicher & Schuell
Schleicher & Schuell
Eppendorf
Nunc
Sarstedt
Starlab
Pierce
Roth
Sarstedt
Sarstedt
Greiner
TPP
Falcon
3 Materialien
3.13 Technische Ausstattung
Analysewaage SPB64
BioPhotometer
Brutschränke HS12
Dampfsterilisator 75 S / 135 S
Elektroporator GenePulser Xcell
ELISA Plattenleser
FACS Calibur®
FACS Canto II
Geldokumentationskammer
GentleMACSTM Dissociator
GHPR 1400A digital-pH Meter
Ichor TDS
Lichtmikroskop TMS
Licht- und Fluoreszenzmikroskop Axiovert 100
Luminometer
Mikrowelle R-220A
PARI TurboBOY® SX
Pipetten
Pipettierhilfe Pipetus® akku
Portabel Scout II Balance
Präzisionswaage SBA 31
Rotoren SW41
Rotor-Gen 3000
Schüttelapparatur Rockomat
SDS-PAGE Mini-Protean® 3 Gel
Sterilbank HERsafe HS
Thermomixer comfort
Tiefkühlschrank (-80 °C) MDF-U50V
Ultrazentrifuge Optima L-70K
Vortex Genie 2
Wasserbad
Whole body Plethysmograph
Zellzähler Z2
Zentrifugen (5415R, 5415C, 5415D)
Zentrifuge 6K15
Zentrifuge Ratna 420R
Zentrifuge AvantiTM J-25 centrifuge
Zentrifuge X-15R
SCALTEC SPB64
BioRad
Heraeus Instruments
H + P Labortechnik GmbH
BioRad
Tecan
Beckton Dickenson
Beckton Dickenson
Biozym
Miltenyi Biotec
Greisinger electronic
Ichor medical systems
Nikon
Zeiss
Hamamatsu Photonics
Sharp
PARI
ABIMED, Eppendorf, Greiner, FIN
Hirschmann Laborgeräte
Ohaus
SCALTEC SBA31
Beckmann
Corbett Research
Technomara
BioRad
Heraeus
Eppendorf
Sanyo
Beckmann
Scientific Industries
Memmer
Buxco
Beckman Coulter
Eppendorf
Sigma
Hettich
Beckmann
Beckmann Coulter
31
4 Methoden
4 Methoden
4.1 Molekularbiologische Methoden
4.1.1 Polymerase-Ketten-Reaktion
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) dient der Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Abschnitts, wozu zwei Oligonukleotide benötigt werden, die komplementär zu dem 5’- bzw. 3’-Ende des zu amplifizierenden Fragmentes sind. Unter
anderem wurde diese Methode auch zur Genotypisierung von Nachkommen aus
den Mauszuchten verwendet. Für einen allgemeinen PCR-Ansatz wurden folgende
Substanzen zusammen gegeben und gemischt:
10x PCR-Puffer
dNTP-Mix (10mM je NTP)
vorwärts Primer (10 µM)
rückwärts Primer (10 µM)
Taq-Polymerase
Wasser
Ausgangs-DNA (200 ng)
2 µl
0,5 µl
2 µl
2 µl
0,2 µl
11,3 µl
2 µl
4.1.2 Hitzeschocktransformation von Bakterien
Die Hitzeschocktransformation ist eine Methode um fremde DNA in Bakterien
einzubringen. Nach Zugabe der DNA zu den Bakterien und Inkubation auf Eis,
erfolgt der Hitzeschock mit einer folgenden Erholungsphase. Nach einer Inkubationszeit werden die Bakterien auf LB-Platten mit einem Selektionsantibiotikum
ausgestrichen. Durch den Selektionsdruck wachsen nur die Bakterien, die die DNA
aufgenommen haben und damit eine Resistenz gegen das verwendete Antibiotikum besitzen.
Für die Transformation wurden 50 µl der kompetenten Bakterien für 10 min auf Eis
aufgetaut. Danach wurden 2,5 µl der fremden DNA mit den kompetenten Bakterien vermischt und für 20 min auf Eis inkubiert. Daraufhin folgte der Hitzeschock
bei 42 °C für 50 s. Die folgende Erholungsphase betrug 2 min zur Abkühlung auf
Eis. Nach der Zugabe von 250 µl S.O.C.-Medium und einer Inkubation bei 37 °C
für 1 h im Brutschrank folgte das Ausplattieren des gesamten Ansatzes auf eine
LB-Platte mit dem benötigten Selektionsantibiotikum, die über Nacht bei 37 °C im
Brutschrank inkubiert wurde.
32
4 Methoden
4.1.3 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien
Die Aufreinigung von Plasmiden in einem analytischen Maßstab wurde mit Hilfe
der Plasmid Miniprep Spin Kits von Genomed, sowie dem NucleoSpin Plasmid
QuickPure Kit von Macherey-Nagel durchgeführt. Dabei wurde eine Übernachtkultur von 5 ml verwendet und für die Aufreinigung nach den Anweisungen der
Kits vorgegangen.
Die Aufreining von Plasmiden in einem quantitativen Maßstab zur späteren Transfektion und Klonierung wurde nach den Anweisungen des NucleoBond® PC 500
EF Kits von Macherey-Nagel verfahren. Es wurden 300 ml einer Übernachtkultur
von Bakterien verwendet.
Für die Aufreinigung von quantitativen Mengen Endotoxin-reduzierter Plasmide
zur späteren Immunisierung wurde nach den Anweisungen des NucleoBond®
PC 10000 EF Kits von Macherey-Nagel verfahren. In diesem Fall wurden 2 l einer
Übernachtkultur verwendet.
4.1.4 Konzentrationsbestimmung von DNA
Um die Konzentration einer DNA-haltigen Lösung zu bestimmen, wurde die
Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Dabei wurde folgende
Formel zur Umrechnung in eine Konzentration angesetzt:
1 OD260 = 50 µg/ml ds-DNA
Um die Reinheit der Lösung zu überprüfen, wurde zusätzlich die Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. Der Wert des Quotienten aus
OD260 /OD280 sollte im Bereich von 1,8 - 2,0 liegen. Bei kleineren Werten war die
Probe durch Proteine verunreinigt, während bei größeren Werten eine große Menge
an Salzen vorlag.
4.1.5 Restriktionsverdau
Bei der Laborarbeit mit Restriktionsenzymen ist darauf zu achten, dass die Enzym
nach Herstellervorgaben eingesetzt werden, da sonst sogenannte Star Aktivitäten
auftreten können und die Enzyme die DNA unspezifisch schneiden. Darüber hinaus ist es wichtig die Angabe des Puffers, welcher vom Hersteller mitgeliefert wird,
zu beachten. Teilweise benötigen Enzyme Rindeserumalbumin (BSA, 100 ng/µl).
Der typische Kontrollverdau zur qualitativen Analyse bestand aus 5 µl Probe, 0,25
µl Restriktionsenzym, 1 µl zugehöriger Puffer, nach Bedarf 0,1 µl BSA und aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 µl. Dieser Ansatz
wurde dann für 1 h bei optimaler Temperatur des Enzyms inkubiert. Das Ergebnis
wurde dann mit Hilfe einer Agarose-Gelelektrophorese (4.1.7) ausgewertet.
33
4 Methoden
4.1.6 Ligation von DNA Fragmenten
Bei der Ligation werden zwei DNA-Fragmente miteinander verbunden, wobei in
den meisten Fällen die Ligase aus der T4 Phage verwendet wird. Dazu werden
spezielle Kofaktoren für die T4–Ligase benötigt wie Mg2+ -Ionen und ATP. Um
zwei DNA-Fragmente zu verbinden, müssen diese ein 5’-Phosphat- und ein 3’Hydroxyl-Ende besitzen.
Für die Ligation wurde das DNA Ligationskit V2.1 von TaKaRa verwendet und
nach den Anweisungen Herstellers verfahren. Dabei lag ein Mengenverhältnis
von 4:1 zwischen kleinerem und größerem DNA Fragment vor. Zusätzlich zu den
DNA-Fragmenten wurde das gleich Volumen an Ligase im zugehörigen Puffer
zugeben. Der gesamte Ansatz wurde für 1 h bei 16°C inkubiert und anschließend
direkt für die Hitzeschocktransformation (4.1.2) verwendet.
4.1.7 Agarose-Gelelektrophorese
Um unterschiedlich lange DNA-Fragmente auftrennen zu können, wurde eine
Agarose-Gelelektrophorese verwendet. Bei dieser Methode wird ein elektrisches
Feld angelegt, in dem sich die Fragmente auf Grund ihres negativ geladenen Phosphatrückgrats unterschiedlich schnell durch das vernetzte Agarose-Gel bewegen.
Zur Visualisierung von DNA Fragmenten wurde zu der warmen Agaroselösung
Ethidiumbromidlösung hinzu gegeben, damit dieses in die DNA interkalieren und
durch UV-Licht zur Fluoreszenz angeregt werden kann.
Durch das Aufheizen von 1 g Agarose in 100 ml TBE-oder TAE-Puffer wurde eine
homogene Lösung erzeugt, die mit 0,001 % Ethidiumbromid versetzt und in die
vorgesehene Form gegossen wurde. Zur Ausbildung der Taschen wurde ein Kamm
in die warme Lösung hineingesteckt. Nachdem das Gel erstarrte und der Kamm
entfernt war, wurde die Kammer mit Laufpuffer befüllt, die Proben aufgetragen
und eine Spannung von 140 V angesetzt.
4.1.8 Gelextraktion
Bei einer Gelextraktion geht es darum, die gewünschte DNA aus einem Agarosegel
zu extrahieren.
Dabei wurde die gewünschte Bande unter schwachem UV-Licht aus dem Gel ausgeschnitten, in Bindungspuffer verflüssigt und auf eine Silikagel-Säule aufgetragen.
Nach Entfernung von Verunreinigungen konnte die DNA von der Säule eluiert
werden. Danach wurde eine Konzentrationsbestimmung der eluierten DNA durchgeführt (4.1.4). Bei der Durchführung wurde nach dem Protokoll vom QIAquick®
Gel Extraction Kit von der Firma Quiagen vorgegangen.
34
4 Methoden
4.1.9 Bestimmung des Endotoxingehalts von Plasmid-Präparationen
Diese Methode dient zur Überprüfung der isolierten DNA auf Endotoxine. Im Falle
einer DNA-Immunisierung können Endotoxine eine ungewollte Immunantwort
induzieren.
Zur Bestimmung des Endotoxinanteils in den DNA Lösungen wurde nach den
Anweisungen des Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000® Kits von Lonza vorgegangen.
4.2 Proteinbiochemische Methoden
4.2.1 SDS-PAGE
Die SDS-PAGE ist eine spezielle Elektrophorese zur Trennung von Proteinen nach
ihrem Molekulargewicht. Dabei ist die Beweglichkeit der Moleküle im elektrischen
Feld proportional zum Molekulargewicht.
Acrylamidlösung (30 %)
2 M Tris (pH 8,8)
0,5 M Tris (pH 6,8)
Wasser
SDS (10 % in Wasser)
TEMED
APS (10% in Wasser)
Trenngel
4 ml
6 ml
1,8 ml
120 µl
10 µl
120 µl
Sammelgel
560 µl
2 ml
1,4 ml
40 µl
6 µl
40 µl
Für die Herstellung eines 10 % igen SDS-Trenngels wurden die oben aufgeführten Lösungen zusammen gegeben, gemischt, auf zwei Gießkammern verteilt
und mit 1 ml Isopropanol überschichtet. Nach vollständiger Polymerisation des
Trenngels wurde das Isopropanol abgegossen, die Substanzen für das Sammelgel
vereint, gemischt, auf das Trenngel der beiden Kammer verteilt und der Kamm
eingesetzt. Die fertigen Gele wurden in eine Elektrophorese-Kammer eingesetzt,
die Kammer mit Laufpuffer gefüllt und die Kämme entfernt. Danach erfolgte die
Auftragung von jeweils 25 µl der Proben (1:1 verdünnt in Probenpuffer) und 5 µl
Marker. Die Kammer wurde an die Stromquelle angeschlossen und eine Spannung
von 120 V angelegt bis die Lauffront aus dem Gel gelaufen war.
4.2.2 Western Blot
Mit Hilfe des Western Blots können Proteine spezifisch nachwiesen werden. Zu
Beginn werden die durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteine auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Inkubation der Nitrozellulosemembran mit einem
35
4 Methoden
primären Antikörper sorgt für eine Protein-spezifische Bindung. Zur Visualisierung der Bindung der primären Antikörper werden Enzym-gekoppelte sekundäre
Antikörper eingesetzt, die gegen den primären Antikörper gerichtet sind. Durch
Inkubation mit einem Substrat wird eine Farb- oder Chemolumineszenzreaktion
ausgelöst, die eine Lokalisierung und teilweise sogar Quantifizierung des nachzuweisenden Proteins ermöglicht. Durch die Auftragung des Markers mit standardisierten Proteinlängen kann eine Größenzuordnung der erhaltenen Bande erfolgen.
Zur Auftrennung der Proteine wurde die SDS-PAGE verwendet (vgl. 4.2.1). Zur
Übertragung der Proteine aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran wurde
eine Blot-Kassette zusammengebaut, wobei die einzelnen Komponenten in Transferpuffer getränkt wurden (Abb. 4.1).
Abbildung 4.1: Aufbau der Blot-Kassette
Die zusammengebaute Blot-Kassette wurde in eine Blot-Kammer eingesetzt
und mit Transferpuffer aufgefüllt. Zusätzlich erfolgt eine Kühlung mit Eis. Der
Transfer erfolgte bei 100 V für 1,5 h. Nach vollendetem Transfer wurde die Nitrozellulosemembran aus der Kassette entnommen und in Blockpuffer für 2 h bei
Raumtemperatur geschüttelt. Die anschließende Inkubation mit dem primären
Antikörper erfolgte über Nacht bei 4 °C auf dem Schüttler. Danach wurde die
Membran fünfmal für je 5 min mit PBS-T0,1 gewaschen bevor die Inkubation mit
dem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 2 h auf dem Schüttler erfolgte. Nach weiteren fünf Waschschritten à 5 min mit PBS-T0,1 wurde durch die
Inkubation mit den Lösungen des Chemiglow Kits von Alpha Innotec eine Chemolumineszenzreaktion induziert, die dann mit einem Hamamatsu Luminometer
detektiert wurde.
4.2.3 Antikörperaufreinigung aus Zellkulturüberständen
Für diese Methode werden Zellkulturüberstände von Hybridomzelllinien verwendet, die einen monoklonalen Antikörper produzieren. Das Prinzip der Aufreinigung beruht auf der Bindung von Immunglobulinen an ein Harz (Bakerbond wide
36
4 Methoden
pore) unter bestimmten Salzkonzentrationen, die dann gewaschen und anschließend durch Veränderung der Salzkonzentration vom Harz wieder eluiert werden
können.
Zu Beginn wurde zu je 50 ml Zellüberstand 150 ml AK-Wasch und 0,5 g Harz hinzugegeben und über Nacht bei 4 °C geschüttelt. Danach wurde das Harz pelletiert
(500 xg, 10 min, 4 °C), der Überstand vorsichtig dekantiert und das Pellet in 100
ml AK-Wasch resuspendiert. Anschließend wurde das Harz fünf weitere Male
mit AK-Wasch gewaschen (300 xg, 5 min, 4 °C), wobei das Harz durch starkes
schütteln resuspendiert wurde. Nach der letzten Zentrifugation wurde der AKWasch abgenommen und das Pellet in 1,5 ml AK-Elu zu je 50 ml des ehemaligen
Zellüberstandes durch kräftiges vortexen resuspendiert. Nach dreimaliger Elution
wurden die Fraktionen vereinigt, die eine höhere Proteinkonzentration als 1 mg/ml
besaßen. Anschließend wurde der Pool in PBS (1x) über Nacht bei 4 °C dialysiert
und am nächsten Tag in 1 ml Aliquots aufgeteilt.
4.3 Zytologische Methoden
4.3.1 Kultivierung von Zelllinien
Die verwendeten Zelllinien wurden bei 37 °C und 5 % CO2 in einem Brutschrank
aufbewahrt.
Das Passagieren der adhärenten Zellen erfolgte bei einer ca. 80-90 %igen Konfluenz.
Dazu wurde das Medium dekantiert, die Zellen mit PBS gewaschen und durch
Zugabe von Trypsin/EDTA vom Boden gelöst. Nach dem vollständigen Ablösen
wurden die Zellen in einem Endvolumen von 10 ml mit 10 % DMEM resuspendiert,
1:10 aufgeteilt und frisches Medium zugegeben.
Zum Passagieren der Suspensionszellkultur wurde diese in ein 50 ml Plastikröhrchen überführt, pelettiert (10 min, 235 xg, 4 °C) und beim Resuspendieren sowie
Ausplattieren genauso verfahren, wie bei den adhärenten Zellen.
4.3.2 Einfrieren und Auftauen von Zelllinien
Für eine längere Lagerung können die Zelllinien in flüssigem Stickstoff aufbewahrt
werden.
Dafür wurden die Zellen zunächst trypsiniert und pelletiert (235 xg, 10 min, 4 °C).
Anschließend wurden die Zellen in Zellkulturmedium, versetzt mit 10 % DMSO,
resuspendiert und in 1 ml Aliquots bei zunächst -80 °C eingefroren und später in
flüssigem Stickstoff gelagert.
Für die Reaktivierung von Zellen wurden diese bei 37 °C aufgetaut und in Medium
aufgenommen, einmal mit frischem Medium gewaschen bevor sie in neuem Medium resuspendiert und in einer Zellkulturflasche (25 cm2 ) ausplattiert wurden.
37
4 Methoden
4.3.3 Transfektion mit Polymeren
Bei einer Transfektion wird fremde DNA in eine Zielzelle eingebracht. Das Ergebnis einer Transfektion sind transgene Zellen, die ihren Geno- und Phänotyp
verändern. Für die Einbringung von Nukleinsäuren gibt es unterschiedliche Verfahren: mechanische, physikalische, chemische und biologische.
Bei dieser Art der Transfektion werden Polymere, z.B. Polyethylenimin (PEI), verwendet, welche die DNA in einen Komplex einbetten und somit das Einschleusen
in die Zielzelle ermöglichen. Der PEI-DNA-Komplex wird durch Endozytose in
die Zelle aufgenommen und verschmilzt mit dem Lysosom. Der niedrige pH Wert
im Lysosom führt zu einem Aufquellen des Polymers und dies wiederum zur
Zerstörung des Lysosoms. Durch diesen Vorgang wird die Fremd-DNA in der
Zelle freigesetzt.
Es wurden 10 µg des gewünschten Plasmids in 200 µl DMEM Medium ohne FCS
mit 10 µl PEI (1 µg/µl) gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
der Inkubation wurde der Ansatz zu 1x106 Zielzellen in eine 25 cm2 Zellkulturflasche mit frischem Medium gegeben.
4.3.4 Durchflusszytometrie
Bei der Durchflusszytometrie werden die Zellen an Hand ihrer spezifischen Oberflächenproteinen mit fluoreszierenden Antikörpern markiert. Durch das Anlegen
eines Überdrucks werden die markierten Zellen durch eine enge Kapillare gepreßt, wodurch es zur Auflösung von Aggregaten kommt und die Zellen sich
durch die hydrodynamische Fokussierung zu einer „Perlenkette“ anordnen. Dabei durchwandern sie Laserstrahlen, während nachgeschaltete Detektoren die
Lichtstreuung und die Fluoreszenz messen. Bei der Lichtstreuung unterscheidet
man zwischen dem vorwärts Streulicht (FCS), welches Auskunft über die Größe
der Zellen gibt, und dem seitwärts Streulicht (SSC), das Informationen über die
Granularität der Zelle enthält. Durch die Messung der Fluoreszenz-gekoppelten
Marker-spezifischen Antikörper können Rückschlüsse über Zellpopulation und
zellspezifische Expression gezogen werden.
4.3.5 Bindungstest der DEC205-spezifischen Einzelkettenantikörper
Mit Hilfe dieses Nachweises kann überprüft werden, ob die konstruierten Einzelkettenantikörper auch spezifisch an den dafür vorgesehenen Rezeptor binden.
Dafür wurden HEK 293T Zellen mit dem jeweiligen Konstrukt transfiziert (vgl. ??).
Nach zwei Tagen wurden die CHONEO und CHODEC205 Zellen mit PBS gewaschen
und durch Zugabe einer EDTA-Lösung vom Boden gelöst. Die gelösten Zellen
wurden in 10 ml PBS aufgenommen, abzentrifugiert (10 min bei 300 xg) und in
einer Dichte von 2x105 Zellen je Depot ausplattiert. Nachdem die Zellen in der
38
4 Methoden
Platte durch Zentrifugation (3 min, 400 xg, 4 °C) ein weiteres Mal pelletiert und
der Überstand verworfen wurde, resuspendierte man die CHO Zellen in 200 µl
der Überstände der transfizierten HEK 293T-Zellen und inkubierte für 20 min
bei 4 °C. Danach wurden die Zellen zentrifugiert (400 xg, 3 min), der Überstand
verworfen und die Zellen zweimal mit PBS/BSA/Azid gewaschen. Anschließend
wurde im Dunkeln mit 100 µl des anti-OLLA Antikörpers (1:200 in PBS/BSA/Azid)
für 20 min bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Depots mit weiteren 100 µl von PBS/BSA/Azid befüllt, pelletiert und weitere zwei Male mit
200 µl PBS/BSA/Azid gewaschen. Zum Abschluss wurden die Zellen in 250 µl
PBS/BSA/Azid resupendiert und mittels FACS analysiert.
4.3.6 Anzucht und Infektiösitätsanalyse des Influenza A Stamms
PR/8/34
Zur Vermehrung des Influenza A Virus PR8/34 wurden MDCK-II Zellen einer
dicht bewachsenen 75 cm2 Zellkulturflasche einmal mit Infektions-PBS gewaschen
und anschließend mit 1x106 PFU in 5 ml Infektions-PBS für 30 min im Brutschrank
inkubiert. Anschließend wurde die Viruslösung abgenommen, 12 ml Infektionsmedium hinzugegeben und bei 37 °C im Brutschrank für bis zu zwei Tage inkubiert.
Durch eine regelmäßige optische Kontrolle unter dem Lichtmikroskop wurde der
Zeitpunkt der Ernte so gewählt, dass die Zellen einen starken zytopathischen Effekt
aufwiesen. Nach einer Zentrifugation wurde der Zellkulturüberstand aliquotiert
und bei -80 °C gelagert.
Um die Infektiösität des eingefrorenen Zellkulturüberstandes zu bestimmen, wurde ein Plaque-Test durchgeführt. Dazu wurden 2x105 MDCK-II Zellen je Depot
einer 6-Depot-Platte in einem Gesamtvolumen von 1,5 ml Zellkulturmedium ausgesät und über Nacht im Brutschrank bei 37 °C aufbewahrt. Am nächsten Tag
wurde 2fach DMEM auf 37 °C vortemperiert sowie eine 3 %ige Oxoid-Agar Lösung
aufgeheizt um eine homogene Lösung zu erhalten und anschließend bei 46 °C im
Wasserbad zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die MDCK-II Zellen wurden
einmal mit Infektions-PBS gewaschen und anschließend mit je 750 µl einer Virusverdünnung in Infektions-PBS bei 37 °C im Brutschrank für 30 min inkubiert. Die
Viruslösung wurde verworfen und je 2 ml Plaque-Medium auf die Zellen gegeben.
Nach dem Aushärten des Agars wurden die Platten mit dem Boden nach oben im
Brutschrank bei 37 °C für weitere fünf Tage inkubiert. Nach Inkubation mit 250
µl einer 4 mg/ml MTT-Lösung für 1 h im Brutschrank, wurden die entstandenen
Plaques ausgezählt und die Infektiösität in PFU angegeben.
39
4 Methoden
4.4 Immunologische Methoden
4.4.1 Immunisierung von Mäusen
4.4.1.1 DNA-Elektroporation
Bei allen Immunisierungsexperimenten wurden weibliche Mäuse verwendet. Die
gekauften Mäuse des Stammes Balb/cJ (Janvier) waren ca. 8 Wochen bei Beginn des
Experimentes, während die Mäuse aus eigener Zucht ein unterschiedliches Alter
aufwiesen. Als Immunisierungsmethode wurde die in vivo Elektroporation gewählt.
Dafür wurden die Tiere vor der Immunisierung durch eine Ketamin/XylazinNarkoselösung sediert und die Wade rasiert. Dann erfolgte die intramuskuläre
DNA Injektion in die Wade über die zentrierte Spritze in der TriGrid Eletrodenanordnung (Ichor Meical Inc.), gefolgt von kurzen elektrischen Impulsen von 63 V
mit einer Gesamtdauer von 40 ms. Jedes Tier wurde mit 20 µg DNA des jeweiligen
Plasmids immunisiert, wobei sich das Volumen auf 50 µl je Bein aufteilte.
4.4.1.2 Peptid-Immunisierung
Bei der Peptid-Immunisierung wurden die Tiere mit einer Xylazin/KetaminLösung narkotisiert und 50 µl einer Emulsion subkutan in beide rasierte Flanken
appliziert. Zur Herstellung der Emulsion wurden gleiche Volumina des in isotonischer Kochsalzlösung immundominanten CD4 Peptids von Hämagglutining
(IYSTVASSL, 2 mg/ml) mit dem inkompletten Freund-Adjuvans gemischt.
4.4.2 Asthma-Modell
Bei der Protein-Immunisierung (Sensibilisierungsphase) wurden 20 µg Ovalbumin
und 2,2 mg Alum in 200 µl in sterilem PBS gelöst und anschließend intraperitoneal
in die Maus appliziert. Diese Applikation wurde zur Sensibilisierung gegen OVA
verwendet und erfolgte zweimal in einem Abstand von zwei Wochen.
Zur Induktion des asthmatischen Phänotyps wurde zu OVA-immunisierten Mäusen (vgl. 4.4.1.2) in einer Plexiglaskammer für 20 Minuten ein Aerosol aus einer 1
%igen OVA-Lösung (in PBS) eingeleitet, welches von den Mäusen inhaliert wurde.
Die Erzeugung des Aerosols erfolgte durch den PARI TurboBoySX® der Firma Pari.
Dieser Vorgang wurde zweimal in einem Intervall von zwei Wochen durchgeführt.
4.4.3 Lungenfunktionsanalyse
Nach der Sensibilisierungs- und Challenge-Phase zur Erhaltung eines asthmatischen Phenotyps (vgl. 4.4.2) wurden die Tiere in eine Messkammer gesetzt und
mit einer ansteigenden Dosis an Metacholin begast. Dabei wurde der Penh bei den
40
4 Methoden
Mäuse gemessen, welcher ein Indikator für den Atemwegswiderstand ist.
4.4.4 DEREG-Modell
Zur Depletion von regulatorischen T-Zellen wurden Mäuse des transgenen DEREGStammes mit Balb/c Hintergrund verwendet. Die Insertion einer Expressionskassette für ein Fusionsprotein, bestehend aus dem Diphtherietoxin-Rezeptor und
einem Grün-fluoreszierenden Protein (GFP), unter der Kontrolle des Foxp3 Lokus ermöglicht die selektive Depletion von Foxp3 exprimierenden T-Zellen [127].
Durch die Applikation des bindenden Diphtherie-Toxins (DT) wird eine Apoptose
in den Rezeptor-exprimierenden Zellen induziert.
Die Depletionen erfolgten an fünf aufeinanderfolgenden Tagen durch eine intraperitoneale Applikation von 100 µl einer Diphterietoxin-PBS-Lösung (5 ng/µl).
4.4.5 Blutentnahme und Serumisolation
Zur Blutentnahme wurde den Tieren, unter Einwirkung eines Inhalationsnarkotikums, ca. 200 µl Blut retroorbital mit einem heparinisierten Mikro-Haematokritröhrchen entnommen und in ein Reaktionsgefäß überführt. Um aus dem Blut das
Serum zu gewinnen, wurde es bei 2300 xg für 5 min zentrifugiert. Das Serum
wurde für weitere Verwendungen bei -20 °C gelagert.
4.4.6 Isolierung von Lymphozyten
4.4.6.1 Aus der Milz und Lymphknoten
Zur Isolierung der Lymphozyten von Mäusen wurden diese durch zervikale Dislokation getötet, die Milz entnommen und diese in eine 6-Depot-Platte mit 5 ml
HBSS überführt. Mit Hilfe eines Zellsiebs wurden die Zellen vereinzelt und vom
Bindegewebe gelöst. Das Zellsieb wurde mit weiteren 5 ml HBSS gespült und die
Zellen bei 4 °C und 400 xg für 5 min zentrifugiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes wurde das Zellpellet in 1 ml ACK-Lysepuffer resuspendiert und für 5 min
bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Abstoppen der Lyse von Erythrozyten
durch Zugabe von 9 ml HBSS, wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 400 xg
bei 4 °C für 5 min pelletiert. Im Anschuss wurde das Pellet in 1 ml R10L Medium
aufgenommen, die Zellen gezählt und auf eine Konzentration von 1x107 Zellen je
Milliliter eingestellt.
41
4 Methoden
4.4.6.2 Aus dem Blut
Zur Isolierung der Lymphozyten aus dem Blut, wurde den Mäusen zehn Tropfen
Blut entnommen (vgl. 4.4.5) und mit 2,5 U Heparin in einem Reaktionsgefäß gemischt. Nach Zentrifugation bei 2300 xg für 5 min wurde das Serum entnommen,
das Plasma in ein 15 ml Falcon-Gefäß überführt und die roten Blutkörperchen mit
Hilfe von 5 ml ACK-Lysepuffer zerstört. Nach der 10 minütigen Inkubation, der
Zugabe von 9 ml HBSS zum Abstoppen und einer weiteren Zentrifugation bei 400
xg für 6 min wurde der Überstand verworfen und das Zellpellet in 200 µl R10L Medium gelöst. Die Lösung wurde auf zwei bis drei Proben in einer Mikrotiterplatte
aufgeteilt und einmal mit 180 µl R10L Medium gewaschen.
4.4.6.3 Aus der Lunge
Zur Isolierung der Lymphozyten aus der Lunge, wurden die Mäuse durch eine
Überdosis des Inhalationsnarkotikums Isofluran getötet, die Lunge entnommen,
in Stücke geschnitten und in eine 6-Depot-Platte mit 2 ml R10L Medium (+500 U
Collagenase D und 160 U DNase I) überführt. Nach einer Inkubation für 45 min
bei 37 °C wurden die Zellen mit Hilfe eines Zellsiebs vereinzelt, das Zellsieb mit
weiteren 8 ml HBSS gewaschen und die Zellsuspension bei 4 °C und 400 xg für 6
min zentrifugiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes wurde das Zellpellet in
1 ml ACK-Lysepuffer resuspendiert und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach dem Abstoppen der Lyse durch Zugabe von 9 ml HBSS wurden die Zellen
durch Zentrifugation bei 400 xg 4 °C und 6 min pelletiert. Im Anschluss wurde
das Pellet in 0,5 ml R10L Medium aufgenommen und auf die benötigte Menge an
Proben in einer Mikrotiterplatte aufgeteilt.
4.4.7 Intrazelluläre Zytokinfärbung
Die intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) dient zur Detektion von Antigen-spezifisch
aktivierten T-Zellen. Dabei unterscheiden sie sich in der Ausschüttung von spezifischen Zytokinen, die durch Antikörper markiert und mittels FACS identifiziert
werden.
Die Aktivierung der Lymphozyten wurde durch die Inkubation mit HA-spezifischen Peptiden erreicht. Zusätzlich zu den HA Peptiden, wurden die Lymphozyten
mit Monensin inkubiert, das die Ausschüttung der produzierten Zytokine verhinderte. Ein Marker für ZTL ist die Degranulation und Präsentation von CD107a auf
der Oberfläche. Die isolierten Lymphozyten (4.4.6) wurden in einem Gemisch mit
Monensin (2 µM), HA (2 µg/ml), anti-CD28 (0,5 µg/ml) und im Fall einer CD8
T-Zellfärbung mit anti-CD107a (1:100) für 6 Stunden im Brutschrank inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Zellen (3 min, 400 xg, 4 °C) pelletiert und mit je
180 µl kaltem PBS/BSA/Azid-Puffer gewaschen. Das Zellpellet wurde in 100 µl
42
4 Methoden
einer Antikörper-Lösung zur Oberflächenfärbung (anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25,
Fixable Viability Dye in PBS/BSA/Azid) resuspendiert und für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit 180 µl PBS
wurden die Zellen in 100 µl PBS aufgenommen, 100 µl 4 % Paraformaldehyde zugegeben, gemischt und für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach
dem Pelletieren und einem weiteren Waschschritt mit PBS/BSA/Azid wurden die
Zellen in 150 µl Permeabilisierungspuffer mit je 0,5 µl Fc-Block resuspendiert und
bei Raumtemperatur für 10 min im Dunkeln inkubiert. Dann wurden die Zellen erneut pelletiert, in 100 µl Antikörper-Lösung (anti-IFN-α, anti-TNF-β und anti-IL-2
in Permeabilisierungspuffer) resuspendiert und für 30 min bei Raumtemperatur im
Dunkeln inkubiert. Danach wurden die Depots dreimal mit Permeabilisierungspuffer und einmal mit PBS/BSA/Azid gewaschen. Anschließend konnten die Zellen
für die FACS-Analyse verwendet werden, nachdem sie in 250 µl PBS/BSA/Azid
resuspendiert wurden.
4.4.8 Detektion von regulatorischen T-Zellen
Zur Analyse der regulatorischen T-Zellen ist eine Markierung des Transkriptionsfaktors Foxp3 unabdingbar.
Dazu wurden 1x106 Lymphozyten je Depot einer Mikrotiterplatte aus dem Blut
(4.4.6.2), aus der Milz, den Lymphknoten (4.4.6.1) oder der Lunge ausplattiert. Im
Anschluss wurde nach den Anweisungen des PE anti-mouse/rat Foxp3 staining
kit von eBioscience vorgegegangen.
4.4.9 T-Zellproliferationsnachweis in vitro mittels CFSE Färbung
Die verwendeten Lymphozyten wurden aus der Milz und den Lymphknoten isoliert (vgl. 4.4.6). Jeder Probe wurde auf drei Depots einer Mikrotiterplatte aufgeteilt
und einmal mit PBS gewaschen (3 min, 400 xg, 4 °C). Anschließend wurden die
Zellen in 100 µl PBS mit CFSE (5 µM) aufgenommen und für 8 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Stoppen der Reaktion, durch die Zugabe von 150 µl
R10L Medium, wurden die Zellen pelletiert (3 min, 400 xg, 4 °C) und ein weiteres
Mal mit R10L Medium gewaschen. Danach wurden die CFSE-markierten Zellen in
250 µl R10L Medium mit den gewünschten Stimuli (HA: 5 µg/ml, CD3: 2µg/ml,
CD28: 4µg/ml) resuspendiert und für 72 h im Brutschrank inkubiert. Nach der
Inkubation wurden die Zellen mit PBS/BSA/Azid gewaschen und anschließend
mit einer Antikörper-Lösung (anti-CD4, anti-CD25, anti-CD45 in PBS/BSA/Azid)
für 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS
wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert (vgl. 4.4.7). Nach dem Pelletieren
(3 min, 400 xg, 4 °C) wurden die Zellen zwei weitere Male mit PBS/BSA/Azid
gewaschen, bevor sie mittels Durchflusszytometer analysiert werden konnten.
43
4 Methoden
4.4.10 Magnetische Zellseparation
Mit Hilfe dieser Methode wurden CD4 oder CD8 T-Zellpopulationen isoliert, wobei
andere Zelltypen (z.B. Makrophagen, natürliche Killerzellen und/oder B-Zellen)
entfernt werden.
Dazu wurde aus den Milzen und den Lymphknoten von Mäusen eine Zelllsuspension hergestellt (4.4.6). Nach Bestimmung der Zellzahl wurde die Zellsuspension
auf eine Konzentration von 2x107 Zellen je Milliliter mit Hybridomaüberstanden
eingestellt, die Antikörper gegen die zu entfernenden Zelltypen enthielt. Für eine
CD4 T-Zellisolation wurden die Überstände gegen CD8, F4/80, B220, MHC-II
und NK1.1 gemischt, während für eine CD8 T-Zellisolation die selben Überstände
verwendet außer der Hybridomaüberstand gegen CD8 wurde mit dem gegen CD4
ausgetauscht. Alle Hybridomaüberstande wurden in gleichen Volumenverhältnis
gemischt. Die Hybridomaüberstand-Zell-Suspension wurde für 30 min bei 4 °C auf
einem Schüttler inkubiert bevor die Zellen mit R10L Medium zweimal gewaschen
wurden. Das Volumen an magnetischen Beads zur negativen Selektion der unmarkierten Zellen errechnete sich aus der Zellanzahl geteilt durch 2x108 . Während der
Inkubation wurden die magnetischen Beads dreimal mit R10L Medium gewaschen.
Nach der Inkubation der Zellen mit den Antikörpern und dem anschließenden
waschschritt, wurden die Zellen mit den magnetischen Beads vereinigt und für
30 min bei 4 °C auf dem Schüttler inkubiert. Mit Hilfe eines Magneten fixierte
man die magnetischen Beads an der Gefäßwand, während der Überstand mit den
gewünschten nicht markieten Zellen in ein neues Reaktionsgefäß überführt wurde.
Nach dreimaliger Separation der Beads vom Überstand, wurde dieser abzentrifugiert, gezählt und mit PBS auf eine Dichte von 1x107 Zellen je Milliliter für weitere
Behandlungen eingestellt.
4.4.11 Diabetes-Modell
Dieses Modell verwendet INS-HA/RAG-/- Mäuse, die Hämagglutinin auf den
β-Zellen im Pankreas exprimieren. Die β-Zellen dienen zur Produktion von Insulin,
welches den Abbau von Zucker im Organismus fördert. Durch einen Transfer von
HA-spezifischen Lymphozyten kommt es zu einer Zerstörung dieser Zellen und
der Ausbildung von Diabetes, da das benötigte Insulin nicht mehr produziert werden kann. Der Transfer eines Zellgemischs aus Effektorzellen und Suppressorzellen
ermöglicht in vivo Analyse des Potenzials der Suppressorzellen eine Verzögerung
oder Unterdrückung der Entwicklung des Diabetes zu erreichen.
Für diesen Versuch wurden TCR-HA Mäuse mit 20 µg der Einzelkettenantikörperkonstrukte immunisiert (vgl. 4.4.1.1), die an den extrazellulären Bereich von
HA gekoppelt sind. Nach sieben Tagen wurden die CD4 T-Zellen aus den Lymphknoten und der Milz mit Hilfe des mouse CD4+ T Cell Isolation Kits (Miltenyi
Biotec) und nach Anweisungen des Herstellers isoliert. Die isolierten Zellen wurden gezählt und 5x104 Zellen in eine Mikrotiterplatte ausgesät um die Reinheit und
Menge an HA-spezifischen CD4 T-Zellen durchflusszytometrisch zu bestimmen
44
4 Methoden
(vgl. 4.3.4). Dazu wurden die ausplattierten Zellen einmal mit PBS/BSA/Azid
gewaschen und anschließend mit einer Antikörper-Lösung (anti-CD4 und 6.5 in
PBS/BSA/Azid) für 10 min bei 4 °C inkubiert. Nach weiteren zwei Waschschritten
wurden die Proben im Durchflusszytometer analysiert und die Ausgangsproben
auf 2x105 CD4 und 6.5 positive T-Zellen je Maus eingestellt. Die Applikation der
Zellen in die INS-HA/RAG-/- Mäuse erfolgte intravenös über die Schwanzvene.
Durch regelmäßige Analyse des Blutzuckers mit Hilfe des Accu-Chek Sensors (Roche) wurde der Zeitpunkt des Ausbruchs der Zuckerkrankheit erkannt. Mit dem
Ausbruch des Diabetes wurde der Pankreas und die Milz entfernt und die Zellen
isoliert (vgl. 4.4.6.1). Die isolierten Zellen wurden anschließend in einer Mikrotiterplatte ausgesät, wobei eine Färbung von regulatorischen T-Zellen (vgl. 4.4.8), sowie
mit den Antikörper CD62L und CD43 nach dem Schema der Oberflächenfärbung
vor der intrazellulären Zytokinfärbung (vgl. 4.4.7) erfolgte. Anschließend wurden
die gefärbten Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert.
4.4.12 Durchflusszytometrischer Antikörpernachweis
Dieser Antikörpernachweis basiert auf der Expression von gewünschten Antigen
auf der Oberfläche von transfizierten HEK 293T Zellen. Nach einer Inkubation
der Zellen mit den Seren kann, an Hand der zusätzlichen Transfektion mit einem
fluoreszierenden Protein, die Bindung von Antikörpern aus dem Serum an die
Antigen-exprimierenden Zellen mit Hilfe eines sekundären fluoreszierenden Antikörpers und der Durchflusszytometrie untersucht werden.
Es wurden 1x106 HEK 293T Zellen mit 2 µg pV-HAopt -OLLA und 8 µg pDsRedMonomer-N1 transfiziert (vgl. 4.3.3). Von den transfizierten Zellen wurden 2x105 je
Depot in eine Mikrotiterplatte ausplattiert und einmal mit 180 µl PBS/BSA/Azid
gewaschen (400 xg, 3 min, 4 °C). Anschließend wurden die Zellen mit Komplementinaktivierten Seren (56 °C, 30 min) in bestimmten Verdünnungen für 30 min bei
4 °C inkubiert. Nach zwei weiteren Waschschritten wurde zur Detektion der an
das Antigen gebundenen Antikörper aus dem Serum mit 100 µl einer anti-MausIgG-FITC Lösung (1:300 in PBS/BSA/Azid) für 30 min bei 4 °C inkubiert. Nach
zwei Waschschritten erfolgte die Aufnahme der Proben in 250 µl PBS/BSA/Azid
und eine Analyse im FACS. Durch den Überschuss von DsRed bei der Transfektion konnte davon ausgegangen werden, dass die DsRed positiven Zellen auch
das kotransfizierte Antigen exprimieren. Somit wurde bei der Auswertung der
Ergebnisse ein Histogramm des FITC Kanals von lebenden und DsRed positiven
Zellen erstellt und die Veränderung der mittleren Fluoreszenzintensität analysiert.
4.4.13 Mikroneutralisationstest
Der Mikroneutralisationstest dient zur Bestimmung von neutralisierenden Antikörper, die durch Bindung an den Virus ein eine Infektion von Zellen verhindern
45
4 Methoden
können.
Zu Beginn wurden 5x104 MDCK-II Zellen je Depot einer Mikrotiterplatte in 10 %
DMEM ausplattiert und über Nacht im Brutschrank bei 37 °C aufbewahrt. Nach
Inaktivierung des Komplements in den Seren durch Inkubation für 30 min bei
56 °C, wurden diese nach einer 1:10 Verdünnung in Infektionsmedium in einer
Mikrotiterplatte weiter seriell 1:2 verdünnt. Anschließend wurden 50 µl der Serumsverdünnung mit dem gleichen Volumen einer Viruslösung, die 2x103 PFU
der Influenza A Virus PR8/34 enthielt, für eine Stunde im Brutschrank bei 37 °C
inkubiert. Das Medium auf den Zellen wurde verworfen und die Zellen mit 100 µl
des Serum-Virus-Gemisches für 90 min im Brutschrank inkubiert. Nach Zugabe
von weiteren 150 µl Infektionsmedium inkubierte die Platte für vier weitere Tage
im Brutschrank bei 37 °C, wobei täglich eine optische Kontrolle mittels Lichtmikroskop durchgeführt wurde, um den Fortschritt der Infektion durch Bildung von
Plaques im Zellrasen zu erkennen. Nach den vier Tagen wurden die Zellkulturüberstände verworfen und der Zellrasen durch eine Inkubation für 10 min mit 100
µl Kristallviolett-Arbeitslösung gefärbt. Nach dem Auswaschen der Lösungsreste
wurden die Platten getrocknet und die höchste Serum-Verdünnung bestimmt, bei
der eine vollständige Neutralisation der Infektion und somit ein intakter Zellrasen
erkennbar war.
4.4.14 ELISA
4.4.14.1 ELISA zur Antikörperbestimmung
Dieser Test dient zum Nachweis von Antigen-bindenden Immunglobulinen und
deren Subtypen.
Für die Beschichtung der 96-Depot-Platte wurde der Beschichtungspuffer mit 2
µg/ml Hämagglutinin oder mit 5 µg/ml Ovalbumin versetzt, jedes Depot mit 100
µl befüllt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Für die Bestimmung der Menge an
OVA-spezifischen Antikörpern wurde vereinigtes Serum von Tieren mit einem asthmatischen Phänotyp in einer seriellen 1:3 Verdünnung aufgetragen. Anschließend
wurden die Depots dreimal mit 200 µl PBS-T0,05 gewaschen, bevor die Nachbeschichtung für 1 h bei Raumtemperatur mit 250 µl 5 % Magermilchpulver-Lösung
je Depot erfolgte. Nach zweimaligem Waschen mit PBS-T0,05 wurden je 100 µl der
Probenverdünnungen in jedes Depot gegeben und für 1 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurde jedes Depot mit 100 µl des anti-IgG1Antikörper bzw. anti-IgG2a-Antikörers (1:1000 Verdünnung in Verdünnungspuffer)
befüllt und erneut für 1 h inkubiert. Nach weiteren drei Waschschritten wurde zu jedem Depot 50 µl der ECL-Lösung zugegeben, 5 min bei Raumtemperatur inkubiert
und dann in einem Luminometer die RLU bestimmt. Um die OVA-spezifischen
Antikörpermengen zu vergleichen, wurde die verfahrensdefinierte Einheit (AU)
festgelegt, die durch 107 AU/ml IgG1, 105 AU/ml IgG2a und 103 IgE im zusätzlich
aufgetragenen vereinigten Serum enthalten sind.
46
4 Methoden
4.4.14.2 ELISA zur Zytokinbestimmung
Im Gegensatz zur Antikörperbestimmung kann ein ELISA auch zur Detektion von
Zytokinen eingesetzt werden. In diesem Fall handelt es sich um einen SandwichELISA und erfolgt durch die Beschichtung mit Zytokin-spezifischen Antikörpern,
anstatt des Proteins.
Zur Bestimmung des Zytokinprofils von in vitro restimulierten Lymphozyten aus
der Lunge und Milz wurden diese nach den zuvor beschriebenen Methoden isoliert
(vgl. 4.4.6.3 & 4.4.6.1). Von den isolierten Proben wurden Triplikate zu je 5x106
Zellen in einer 48-Depot-Platte ausgesät. Die in vitro Restimulation erfolgte im
Brutschrank für 48 h in 500 µl R10L Medium ohne Zusatz, mit 50 µg/ml Ovalbumin
oder mit 30 ng/ml PMA und 500 ng/ml Ionomycin. Nach der Inkubation wurden
die Zellen pelletiert (3 min, 400 xg, 4 °C) und der Zellkulturüberstand abgenommen.
Im Anschluss wurden die Zytokine in den Zellkulturüberstanden mit Hilfe der
mouse ELISA-Kits (eBioscience) bestimmt, wobei sich an die Anweisungen des
jeweiligen Kits gehalten wurde. In Abhangigkeit des verwendeten ELISA-Kits
wurden die Zellkulturüberstände unterschiedlich stark verdünnt (1:2 für IL-4, 1:3
für IFN-γ, IL-10, TGF-β, 1:5 für IL-5 und 1:10 für IL-13).
4.4.15 Influenza A Virus-Infektionsmodell
Bei der Infektion von Mäusen wurde die benötigte Menge an Virus in PBS verdünnt.
Nach Sedierung der Tiere mit Hilfe eines Xylazin/Ketamin Narkotikums wurden
50 µl der Viruslösung tropfenweise über die Nase aufgenommen. Am Tag der
Infektion, sowie an den darauf folgenden Tagen wird das Gewicht, das Aussehen
und das Verhalten der infizierten Tiere beurteilt um den Verlauf der Krankheit
zu ermitteln. Bei einem Verlust von mehr als 25 % des Ausgangsgewichts über
einen längeren Zeitraum als zwei Tage müssen die Tieren nach den Richtlinien
des bewilligten Tierversuchsantrags aus dem Versuch entnommen und euthanasiert werden. Je nach Versuchsaufbau kann zu einem bestimmten Zeitpunkt nach
der Infektion die Lunge und BAL auf bestimmte Merkmale oder das Überleben
untersucht werden.
4.4.16 Influenza-Nachweis mittels quantitativer reverser
Transkriptase PCR
Zur Bestimmung der viralen Beladung in den Lungen und der BAL wurde die
virale RNA aufgereinigt und die Menge mittels qRT-PCR bestimmt. Eine qRT-PCR
besteht aus drei Abschnitten und beginnt mit der reversen Transkription der RNA
in eine komplementäre DNA (cDNA). Die cDNA wird im zweiten Teil durch eine
PCR amplifiziert, wobei nach jedem Schritt die Fluoreszenz eines interkalierenden
Farbstoffs oder einer Sonde gemessen wird. Dabei korreliert die Zunahme der
47
4 Methoden
viralen Transkripte mit dem Anstieg der gemessenen Fluoreszenz nach jedem
Elongationsschritt. Durch den Vergleich der erhaltenen Werte mit den eingesetzten
Standardproben, welche definierte Mengen an viraler RNA besitzen, ist eine Quantifizierung der ursprünglich eingesetzten RNA Menge möglich. Zum Abschluss
wird eine Schmelzkurve erstellt um die Transkripte von Primer-Dimeren zu unterscheiden und falsch positive Signale auszuschließen. Die verwendeten Primer für
die PCR sind komplementär zu einem konservierten Bereich im Matrix-Protein,
um potentielle Mutationsvarianten mitbestimmen zu können.
Zur Aufreinigung der viralen RNA wurde das Lungengewebe mit dem GentleMACS in 2 ml PBS homogenisiert. Anschließend wurden die BAL und das
Lungenhomogenat bei 2300 xg für 5 min abzentrifugiert und 140 µl des Überstands
für die Aufreinigung eingesetzt. Mit Hilfe des QIAamp viral RNA Mini Kits von
Qiagen wurde nach Anweisungen des Herstellers 50 µl virale RNA eluiert.
Ansatz
2x PCR-Puffer
M253R (10 µM)
M52C (10 µM)
Sybr Green (2x)
Enzyme
RNase-freies Wasser
Eluat der viraler RNA
Aufreinigung
10 µl
1 µl
1 µl
1 µl
0,2 µl
1,8 µl
5 µl
qRT-PCR Programm
reverse Transkription 20 min
50 °C
Enzymaktivierung
15 min
95 °C
PCR (46 Zyklen)
Denaturierung
10 s
95 °C
Anealing
1 min
61 °C
Elongation
30 s
72 °C
Quantifizierung
15 s
81 °C
Schmelzkurve
Startpunkt
5s
50 °C
Messung
1 °C je Sekunde
Der aufgeführte qRT-PCR Ansatz bestand hauptsächlich aus den Komponenten
des QuantiTect Probe PCR Kits von Qiagen, wobei die Quantifizierung mit SybrGreen erfolgte. Nach sorgfälltigem Mischen der Proben sowie der Standardproben
wurden die Ansätze im RotorGen-3000 mit dem aufgelisteten Programm gemessen.
Nach dem Abschluss des Programms wurde die Menge eines Ansatzes mit der
Rotor-Gene 6000 Software bestimmt und auf Kopien je Milliliter umgerechnet.
4.4.17 Histologische Färbung von Lungenschnitten
Die Anfertigung von histologischen Schnitten ermöglicht die Betrachtung des Gewebes zu einem bestimmten Zeitpunkt. Dabei können verschiedenen Färbungen
des Gewebes durchgeführt werden, um unterschiedliche Parameter zu analysiert.
Die zu färbenden Lungenhälften wurden zum jeweiligen Zeitpunkt der Präparation den Tiere entnommen und für 48 h in 5 %ige Paraformaldehyd-Lösung gelegt.
Anschließend wurde die Lösung ein weiteres Mal gewechselt, bevor die Proben
zu einem Kooperationspartner gingen, der die Lungenschnitte anfertigte, die Fäbungen durchführte und die Proben versiegelte. Nach dem Erhalt der gefärbten
48
4 Methoden
Schnitte wurde diese unter einem Mikroskop betrachtet und markante Ausschnitte
fotografiert und dargestellt. Zur Analyse der Infiltration von lymphoiden Zellen in
eine infizierte Lunge wurde eine H&E-Färbung angefertigt, während die Bildung
von Mucin bzw. die Ansammlung von Becherzellen um den Bronchus durch eine
PAS-Reaktion sichtbar gemacht wurde.
49
5 Ergebnisse
5 Ergebnisse
5.1 DEC205 Adressierung des Antigens beeinflusst
T-Zellaktivierung
5.1.1 Analyse der verwendeten Expressionsplasmide
In dieser Doktorarbeit wurden Plasmide mit Expressionskassetten verwendet,
die für unterschiedliche Fusionsproteine kodieren. Allgemein bestanden diese
Fusionsproteine aus einem Einzelkettenantikörper (EAk) und einem daran gekoppelten Antigen. Im Vergleich zu herkömmlichen Antikörpern bestand der EAk
ausschließlich aus den variablen Teilen der schweren und leichten Kette, wobei
diese durch einen Peptidlinker miteinander verknüpft waren. Auf Grund der
DEC205-Spezifität des Antikörpers war eine direkte Adressierung von DZ möglich.
Durch die Kopplung eines Antigens konnte eine spezifische Immunantwort gegen
das verwendete Antigen induziert werden.
Während der vorangegangenen Masterarbeit wurden Expressionsplasmide für
Fusionsproteine konstruiert (Abb. 5.1), die aus Hämagglutinin (HA)-gekoppelten
EAk bestehen und gegen den murinen DEC205-Rezeptor oder β-Galaktosidase
gerichtet sind. Eine Kopplung des gesamten HAs an einen EAk war nicht möglich,
da die vorhandene transmembrane (TM) Domäne eine Sekretion des Fusionsproteins verhinderte und es zu einer Ansammlung der gekoppelten EAk in der
Zellmembran kam. Daher wurden die immundominanten Epitope auf jeweils zwei
Plasmide verteilt.
Abbildung 5.1: Die verwendeten Expressionskassetten mit dem jeweiligen gekoppelten Antigen.
CMV bezeichnet den immediate early Promotor des Zytomegalievirus, mDEC bezeichnet die Sequenz
für den EAk gegen den murinen DEC205 Rezeptor, GL117 bezeichnet die Sequenz für den Kontrolleinzelkettenantikörper spezifisch für β-Galaktosidase, solHA bezeichnet den extrazellulären
(EZ) Bereich von Hämagglutinin, HACD8 bezeichnet das immundominate CD8 Epitop von HA
als Teil der TM Domäne, OLLAS beschreibt eine Peptidsequenz zur Detektion in unterschiedlichen
Analysen und IZ bezeichnet den intrazellulären Bereich von HA.
Mittels Western Blot konnte eine Expression der kodierten Konstrukte in den
50
5 Ergebnisse
Zellkulturüberständen von transient transfizierten HEK293T Zellen in vitro detektiert werden. Im nächsten Schritt soll die Antigenpräsentation nach direkter
Adressierung der DZ in vivo anhand der Proliferation von transferierten Antigenspezifischen T-Zellen untersucht werden. Dazu wurden Mäuse immunisiert, wobei
die DNA jeweils nur für das MHC-II oder MHC-I restringierte Peptid kodierte.
Nach vier Tagen wurden CFSE-markierte, Rezeptor-transgene T-Zellen appliziert
und deren Proliferation nach drei weiteren Tagen mittels Durchflusszytometrie
untersucht (Abb. 5.2A).
Abbildung 5.2: In vivo Präsentation von adressierten Antigenen nach DNA-Immunisierung. TZA
= T-Zellanalyse. B) Durchflusszytometrische Auswahlstrategie zur Analyse der T-Zellproliferation
drei Tage nach dem Transfer. C) Graphische Darstellung von zwei unabhängigen Experimenten
mit sechs bis acht Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler.
Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; # signifikant
zu nicht-adressiert; * = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001. Quelle der Daten: Masterarbeit [169]
Es zeigte sich, dass eine direkte Adressierung des MHC-II restringierten Peptids
von HA an DZ eine stärkere Proliferation der transferierten Zellen stimulierte, als
die Verwendung des Kontrollkonstruktes (Abb. 5.2C links). Dieser Effekt war in
51
5 Ergebnisse
beiden untersuchten lymphatischen Organen erkennbar, wobei er in den Lymphknoten nahe der Immunisierungsstelle am stärksten auftrat. Im Gegensatz dazu
zeigte die direkte Adressierung des MHC-I restringierten Peptids von HA gegenüber dem nicht-adressierten Konstrukt keine Verbesserung in der Stimulation einer
Proliferation der transferierten HACD8-spezifischen T-Zellen (Abb. 5.2C rechts).
Aus diesen Daten kann abgeleitet werden, dass die direkte Adressierung zu einer
erhöhten Antigenpräsentation auf MHC II führt, während die Präsentation auf
MHC I zwar deutlich erhöht ist aber keinen Unterschied zwischen beiden Konstrukten festzustellen ist.
5.1.2 Der Einfluss der direkten Adressierung des Antigens auf die
Immunantwort
Auf Grund der verbesserten Antigenpräsentation durch die DNA-Immunisierung
mit den EAk-Konstrukten sollte nun die Induktion einer Antigen-spezifischen
Immunantwort untersucht werden. Dazu wurden die zellulären Immunantworten
14 Tage nach der ersten und der zweiten Immunisierung mittels ICS bestimmt
(Abb. 5.4A). Die Induktion von Antikörpern und deren Subtypen wurde fünf
Wochen nach der ersten und zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung im
Serum mit Hilfe eines FACS-basierenden Antikörpertests (Abb. 5.5A), sowie ELISA
untersucht. Durch eine abschließende Infektion mit dem homologen Influenza A
Virusstamm Peurto Rico/8/34 wurde die Qualität der induzierten Immunantwort
ermittelt.
Abbildung 5.3: Analyse der Immunantwort nach einer zweimaligen DNA-Immunisierung. ICS =
intrazelluläre Zytokinfärbung; AK = Antikörperanalyse aus dem Serum; VB = virale Beladung in der
Lunge und BAL; Ü = Überlebensexperiment.
Die nicht-adressierten Konstrukte (GL117-HA) induzierten deutlich höhere CD4
T-Zellantworten nach der ersten DNA-Immunisierung als die anderen beiden
Gruppen (Abb. 5.4B). Dies traf sowohl auf mono- als auch auf polyfunktionale
CD4 T-Zellen zu. Hingegen erreichte die Behandlung mit den DEC205-adressierten
Konstrukten (DEC-HA) kaum höhere Mengen an Zytokin-produzierenden CD4
T-Zellen als die naive Gruppe. Nach der zweiten Immunisierung wurde kein Unterschied mehr in der induzierten CD4 T-Zellantwort zwischen GL117-HA und
DEC-HA festgestellt (Abb. 5.4D). Dabei wiesen beide behandelten Gruppen eine
signifikant höhere Menge an mono- wie auch polyfunktionalen CD4 T-Zellen auf,
als die unbehandelte Gruppe. Während es in der DEC205-adressierten Gruppe zu
52
5 Ergebnisse
Abbildung 5.4: Zelluläre Immunantworten nach den jeweiligen DNA-Immunisierungen bestimmt
mittels ICS. A) Auswahlstrategie zur Analyse der Antigen-spezifischen IFN-γ, IL-2 und TNF-α
Expression. Zytokinexpression von CD4 (B) und CD8 (C) T-Zellen 14 Tage nach der ersten Immunisierung, sowie der CD4 (D) und CD8 (E) T-Zellen 14 Tage nach der zweiten Immunisierung. Daten
von zwei unabhängigen Experimenten mit insgesamt acht bis zwölf Tieren je Gruppe. Darstellung
der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und
Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; + = signifikant zu adressiert; * = p<0,05; ** = p<0,01; *** =
p<0,001.
einer drastischen Erhöhung durch die zweite Immunisierung kam (z.B. IFN-γ: von
0,015 % auf 0,073 %), zeigte die nicht-adressierte Gruppe maximal eine Verdopp-
53
5 Ergebnisse
lung in der Menge an Zytokin-produzierenden T-Zellen.
Ähnlich zu der CD4 T-Zellantwort nach der ersten Immunisierung, induzierte
GL117-HA ebenfalls eine signifikant höhere Menge an mono- und polyfunktionalen CD8 T-Zellen (Abb. 5.4C) als DEC-HA. DEC-HA hingegen konnte nur eine
leichte Erhöhung der Menge an Zytokin-produzierenden CD8 T-Zellen gegenüber
der naiven Gruppe erreichen. Selbst durch die zweite Immunsierung konnte keine
Verbesserung der CD8 T-Zellantwort in der DEC-Gruppe beobachtet werden (Abb.
5.4D). Erneut zeigte sich, dass die CD8 T-Zellantworten nur minimal über den
Antworten der naiven Gruppe lagen (z.B. IFN-γ: naiv 0,24 % und DEC-HA 0,48
%), während die zweite Behandlung mit GL117-HA eine Verdopplung der Menge
an restimulierbaren CD8 T-Zellen induzierte.
Abbildung 5.5: HA-bindende Antikörper nach den jeweiligen DNA-Immunisierungen. A) Auswahlstrategie zur durchflusszytometrischen Bestimmung von HA-bindenden Antikörpern durch die
Verschiebung der mittleren Fluoreszenzintensität im Histogramm. B) Graphische Darstellung der
HA-bindenden Immunglobuline fünf Wochen nach der ersten und zwei Wochen nach der zweiten
Immunisierung. Daten repräsentieren zwei unabhängige Experimente mit insgesamt zwölf Tieren je
Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels
1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; # = signifikant zu nicht-adressiert; + =
signifikant zu adressiert, *** = p<0,001.
Zusätzlich zu den EAk-Konstrukten wurde eine Kontrollgruppe mitgeführt,
die mit dem Expressionsplasmid des kompletten HAs (HA-DNA) immunisiert
54
5 Ergebnisse
wurde. Mit Hilfe des FACS-basierenden Antikörpertests wurden die Seren auf
induzierte Immunglobuline untersucht, die an HA-präsentierenden, transient
transfizierten Zellen binden konnten (Abb. 5.5A). Dabei wurde fünf Wochen nach
der ersten Immunisierung mit den EAk-Konstrukten eine deutlich geringere Menge an HA-bindenden Antikörpern induziert als mit HA-DNA (Abb. 5.5B). In
beiden Fällen wiesen die EAk-behandelten Gruppen vergleichbare Mengen an
Antikörpern zu der naiven Gruppe auf. Nach der zweiten Immunisierung mit
den EAk-Konstrukten konnten die Antikörpermengen gegenüber dem ersten Zeitpunkt erhöht werden (z.B. adressiert: von 7,4 auf 19,7 MFI), wobei DEC-HA etwas
geringere erzielte als GL117-HA (adressiert 19,7 MFI und nicht-adressiert 27,9
MFI; Abb. 5.5B). Trotz höherer Antikörpermengen, lagen diese noch deutlich unter
denen, die mit der HA-DNA erreicht wurden.
Abbildung 5.6: Antikörpersubtypen und neutralisierende Eigenschaften nach den jeweiligen DNAImmunisierungen. Antikörpersubtypen untersucht im ELISA fünf Wochen nach der ersten (A) und
zwei Wochen nach der zweiten (B) Immunisierung. C) Neutralisierende Antikörper zwei Wochen
nach der zweiten Immunisierung mittels Mikroneutralisationstest bestimmt. Daten repräsentieren
ein Experiment mit sechs Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; # =
signifikant zu nicht-adressiert; + = signifikant zu adressiert; * = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001.
Bei der Betrachtung der Antikörpersubtypen konnten ähnliche Ergebnisse zwischen den Behandlungen festgestellt werden (Abb. 5.6A). DEC-HA induzierte eher
ein Gleichgewicht zwischen dem IgG1 und dem IgG2a Subtyp, während GL117HA und HA-DNA bevorzugt den IgG2a Subtyp stimulierten. Auch bei dieser
Analyse wurden deutlich höhere Mengen an Antikörpern durch die Verwendung
von HA-DNA induziert, als durch die EAk-Konstrukte. Nach der zweiten Immu-
55
5 Ergebnisse
nisierung konnten deutlich höhere Werte in den mit EAk-behandelten Gruppen
detektiert werden. Ebenfalls induzierte DEC-HA gleiche Mengen an IgG1 und
IgG2a, während GL117-HA und HA-DNA einen Überschuss an IgG2a induzierte
(Abb. 5.6B). Mit Hilfe eines Mikroneutralisationstests sollte festgestellt werden,
ob die induzierten Antikörper in der Lage wären eine virale Infektion zu neutralisieren. Dabei wurde beobachtet, dass eine zweimalige Immunisierung mit
den EAk-Konstrukten kaum neutralisierende Antikörper induzierte, während die
Immunisierung mit dem HA-Expressionsplasmid einen Titer von 380 aufwies (Abb.
5.6C).
Nach der Feststellung des stimulatorischen Effekts der zweiten Behandlung auf
die induzierte Immunantwort, durch die vorangegangenen Analysen, wurden
die Mäuse mit 250 PFU (ca. das 50fache der LD50 ) des homologen IAV PR/8/34
(H1N1) infiziert und der Krankheitsverlauf dokumentiert.
Abbildung 5.7: Krankheitsverlauf nach zweimaliger DNA-Immunisierung und anschließender
homologer Virusinfektion. Gewichtsverlauf (A) und Überlebensrate (B) als klinische Zeichen des
Krankheitsverlaufs. Virale Beladung von Lunge und BAL (B), ermittelt durch qRT-PCR. Mikroneutralisationstest zur Detektion von neutralisierenden Antikörpertitern im Blut sechs Tage nach der
Infektion (D). Daten repräsentieren jeweils ein Experiment mit sechs Tieren je Gruppe. Darstellung
der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; # = signifikant zu nicht-adressiert; + = signifikant zu adressiert;
* = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001.
Ein starker und kontinuierlicher Gewichtsverlust, beginnend am zweiten Tag
nach der Infektion, wurde in den mit EAk-Konstrukten behandelten und unbehandelten Gruppen beobachtet, während die HA-DNA immunisierten Tiere keinen
Gewichtsverlust aufwiesen (Abb. 5.7A). Der Scheitelpunkt des Gewichtsverlaufs
erfolgte als erstes in der DEC-Gruppe sieben Tage nach der Infektion, gefolgt von
56
5 Ergebnisse
der naiven Gruppe einen Tag später. Die Verwendung von GL117-HA zeigte keinen Vorteil beim Krankheitsverlauf auf, trotz Induktion einer höheren zellulären
und humoralen Immunantwort. Trotz früherer Regeneration vom Gewichtsverlust,
zeigte die adressierte Gruppe eine schlechtere Reduktion der viralen Beladung
in der BAL als die GL117-Gruppe, während die HA-Gruppe eine Reduktion der
virale Beladung um 4 log-Stufen aufwies. Trotz signifikanter Reduzierung der
viralen Beladung, zeigte das Überlebensexperiment eine höhere Mortalität für die
mit EAk-Konstrukten behandelten Tiere, als die naive Gruppe (Abb. 5.7C). Des
Weiteren bestätigten sich die Ergebnisse aus dem Gewichtsverlauf, dass trotz hoher
Immunantworten und geringerer viraler Beladung, die GL117-HA behandelten
Tiere eine höhere Sterblichkeit aufwiesen, als die der adressierten Gruppe (nichtadressiert: 83,3 % gegenüber adressiert: 66,6 %). Ebenfalls im Einklang mit den
vorangegangenen Ergebnissen ist die 100 prozentige Überlebensrate durch die
Behandlung mit dem HA-Expressionsplasmid. Bei der Analyse der neutralisierenden Antikörpertiter sechs Tage nach Infektion erreichten die unbehandelten, sowie
die mit EAk-Konstrukten behandelten Tiere einen Titer nur nach der Infektion als
zusätzliche Immunstimulation, während die mit HA immunisierten Tiere schon
vor der Infektion sehr hohe Titer aufwiesen (vgl. Abb. 5.7D).
Dieses Experiment zeigt, dass die nicht-adressierten Konstrukte eine deutlich
stärkere Immunantwort induzieren, als die DEC-spezifischen Konstrukte. Des
Weiteren induziert die Adressierung ein Gleichgewicht in den Immunglobulinsubtypen IgG1 und IgG2a, während GL117-HA bevorzugt IgG2a stimuliert. Trotz
erhöhter Immunantworten auf zellulärer und humoraler Ebene nach der zweiten Behandlung schützen die EAk-Konstrukte nicht gegen eine Virus Infektion.
Die Betrachtung der neutralisierenden Antikörpertiter nach Infektion läßt darauf
schließen, dass die schützenden Immunglobuline erst durch Infektion gebildet
werden müssen und kein anamnestischer Effekt durch die Immunisierung besteht.
5.1.3 Koapplikation eines genetischen Adjuvans zur Modulation der
Immunantwort
Es stellte sich heraus, dass die DNA-Immunisierung mit DEC-HA zu einer reduzierten zellulären Immunantwort führte, wobei sich die induzierten Antikörper
zu gleichen Teilen aus den Subtypen IgG1 und IgG2a zusammensetzten. In diesem Experiment soll analysiert werden, ob die Koapplikation des genetischen
Adjuvans IL-12 zusätzlich zu den EAk-Konstrukten eine Verschiebung der Immunantwort in Richtung Th1 bewirken kann. Diese Verschiebung wurde mittels
Antigen-spezifischer Zytokinexpression von CD4 und CD8 T-Zellen aus dem Blut,
19 Tage nach der ersten und 12 Tage nach der zweiten Immunisierung, in einer
ICS untersucht. Zu den selben Zeitpunkten wurde zusätzlich das Gleichgewicht
zwischen den Immunglobulinsubtypen IgG1 und IgG2a analysiert, wobei die Dominanz von IgG2a auf eine Th1-Verschiebung hinweisen könnte. Abschließend
wurden die schützenden Eigenschaften der induzierten Immunantworten, durch
57
5 Ergebnisse
Koapplikation des Adjuvans, durch eine virale Infektion verifiziert. Neben der
Quantifizierung der viralen Beladung wurden infiltrierende Lymphozyten und
deren Aktivierung durchflusszytometrisch charakterisiert (Abb. 5.8).
Abbildung 5.8: Versuchsablauf zur Analyse des Einflusses der Koapplikation eines IL-12 Expressionsplasmids auf die Immunantwort. B-ICS = zelluläre Immunantwort aus dem Blut; AK = Antikörperanalyse; VB = virale Beladung in BAL und Lunge; ZK = Analyse der Zellkomposition in BAL und
Lunge.
Die Behandlung mit den adressierten Konstrukten induziert eine geringere CD4
und CD8 T-Zellantwort als die nicht-adressierten Konstrukte. Durch die Koapplikation des IL-12 Expressionsplasmids konnte ein stimulatorischer Effekt auf die CD4
T-Zellantwort beobachtet werden. Dabei erhöhte sich die Menge an polyfunktionalen CD4 T-Zellen um ein Vielfaches (IFN-γ+TNF-α: nicht-adressiert von 0,003 %
auf 0,066 % und adressiert von 0,002 % auf 0,030 %). Trotz des Anstiegs in der Menge an Zytokin-produzierenden Zellen in der DEC-Gruppe, blieb der Unterschied
zur GL117-Gruppe weiterhin bestehen (z.B. IFN-γ+IL-2+TNF-α: adressiert+IL-12
0,011 % und nicht-adressiert+IL-12 0,050 %; Abb. 5.9A). Im Gegensatz zu den
polyfunktionalen CD4 T-Zellen war dieser stimulatorische Effekt des Adjuvans
weder bei den monofunktionalen CD4 T-Zellen noch bei den CD8 T-Zellen deutlich
zu erkennen (Abb. 5.9B). Während kein Einfluss der Koapplikation auf die CD8
T-Zellantwort nach Adressierung des Antigens detektiert wurde, kam es bei der
nicht-adressierten Gruppe durch die Koapplikation zu einer Verdopplung der
Menge an degranulierenden IFN-γ und an TNF-α produzierenden CD8 T-Zellen
(von 0,8 % auf 2,2 %).
Nach der zweiten DNA-Immunisierung in Kombination mit dem Adjuvans ging
der zuvor beobachtete stimulatorische Effekt verloren. In wenigen Ausnahmen
erhöhte die Koapplikation von IL-12 mit den adressierten Konstrukten die Menge
an Zytokin-produzierenden CD4 T-Zellen (z.B. IFN-γ+IL-2+TNF-α: von 0,012 %
auf 0,052 %; Abb. 5.9C). Hingegen wurde bei den nicht-adressierten Konstrukten
keine Verbesserung der CD4 T-Zellantworten durch die Koapplikation erzielt. Die
Antigen-spezifischen CD8 T-Zellantworten in der GL117-Gruppe waren deutlich
erhöht gegenüber denen der DEC-Gruppe, trotz zusätzlicher Applikation von
IL-12 (Abb. 5.9D).
Nach der ersten Immunisierung wurden kaum induzierte Antikörper detektiert.
Eine weitere Behandlung erhöhte die Menge an HA-bindenden Antikörpern (Abb.
5.10A). Dabei führte die Behandlung mit GL117-HA zu höheren Antikörpermen-
58
5 Ergebnisse
Abbildung 5.9: Zelluläre Immunantwort nach den jeweiligen DNA-Immunisierungen und der
Koapplikation eines IL-12 Expressionsplasmids. Bestimmung Antigen-spezifischer Expression von
IFN-γ, IL-2 und TNF-α von CD4 (A, C) und CD8 (B, D) T-Zellen 19 Tage nach der ersten, sowie 12
Tage nach der zweiten Immunisierung mittels ICS. Daten repräsentieren ein Experiment mit sechs
Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse
mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; + = signifikant zu adressiert; ° =
signifikant zur selben Gruppe ohne IL-12; * = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001.
gen als DEC-HA (nicht-adressiert: 750 MFI und adressiert: 350 MFI). Hingegen
tendierte die Koapplikation von IL-12 zu einer Reduktion der Menge an HAspezifischen Antikörpern, unabhängig in welcher Kombination. Kein Effekt der
Koapplikation konnte bei der Ausbildung der Immunglobulinsubtypen festgestellt
werden (vgl. 5.10B). Hingegen war erneut die erhöhte Menge an IgG2a durch die
Immunisierung mit GL117-HA detektiert worden.
Nach Bestimmung der zellulären und humoralen Immunantworten wurden die
Tiere mit 100 PFU (ca. das 20fache der LD50 ) des homologen IAV PR/8/34 (H1N1)
infiziert und der Krankheitsverlauf anhand des Gewichtsverlustes dokumentiert.
Zum Zeitpunkt der höchsten Aktivität des Immunsystems wurde die Menge an
viralen RNA Kopien sowie die zelluläre Verteilung in BAL und Lunge bestimmt.
Konsistent mit den Experimenten zuvor (vgl. Abb. 5.6A), begannen alle Gruppen
am zweiten Tag nach der Infektion Gewicht zu verlieren. Im Gegensatz zu den
Gruppen die mit GL117-HA behandelt wurden, verloren die restlichen Gruppen
bis zum sechsten Tag nach der Infektion 25 % ihres anfänglichen Körpergewichts.
Dabei erzielte die Koapplikation des IL-12 Expressionsplasmids keine Verbesserung des Gewichtsverlaufs in Kombination mit den adressierten Konstrukten,
während die Kombination mit den GL117-Konstrukten zu einer Reduktion des
59
5 Ergebnisse
Abbildung 5.10: Antikörperantworten nach zweimaliger DNA-Immunisierung und Koapplikation des IL-12 Expressionsplasmids. Durchflusszytometrische Bestimmung von HA-bindenden
Immunglobulinen aus dem Serum zwölf Tage nach der zweiten Immunisierung (A), sowie die
Auftrennung dieser in Subtypen im ELISA (B). Daten repräsentieren ein Experiment mit sechs Tieren
je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels
1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; * = p<0,05; ** = p<0,01.
Gewichtsverlustes um ca. 3 Prozentpunkte führte.
Die Immunisierung mit DEC-HA führte zu einer Reduktion der viralen Beladung
in BAL und Lunge (Abb. 5.11C). Diese Reduktion war nicht so deutlich wie nach
der Behandlung mit GL117-HA. Die zusätzliche Applikation des IL-12 Expressionsplasmids erzielte in beiden Gruppen eine weitere Reduktion der viralen Beladung
in Lunge und BAL, wobei IL-12 allein keinen Einfluss auf die virale Beladung
hatte.
Die Analyse der Zellkomposition in der Lunge und der BAL sechs Tage nach
der Infektion soll einen Einblick über die Infiltration und Aktivierung anti-viraler
Effektorzellen liefern. Des Weiteren kann dadurch die Auswirkung der Koapplikation des IL-12 Expressionsplasmids beobachtet werden, da IL-12 zur Stimulation
von Th1 differenzierten CD4 T-Zellen führen soll, sowie zu einer Aktivierung von
ZTLs und NKs. Die Koapplikation von IL-12 hat keinen offensichtlichen Effekt auf
CD4 und CD8 T-Zellen oder NKs (Abb. 5.11D). In den Lungen der GL117-Gruppe
wurden erhöhte Mengen der beobachteten Lymphozyten detektiert, während in
der BAL ausschließlich die T-Lymphozyten vermehrt auftraten (Abb. 5.11E). Im
Gegensatz dazu waren die Mengen an infiltrierenden Lymphozyten in der Lunge
und der BAL nach Behandlung mit DEC-HA und Infektion vergleichbar mit denen
in naiven infizierten Tieren. Die deutlich erhöhten Mengen an ZTL in der GL117Gruppe ging einher mit erhöhter Expression des Aktivierungsmarkers CD43.
Dieser Versuch beweist, dass die Koapplikation des genetischen Adjuvans IL-12
keinen signifikanten Einfluss auf die induzierte Immunantwort nimmt. Zwar zeigt
die erste Immunisierung einen stimulatorischen Effekt auf die Zytokinproduktion
aber dieser ging schon nach der zweiten Immunisierung wieder verloren. Des
Weiteren hatte die IL-12 Koapplikation keinen Einfluss auf die humorale Immunantwort oder auf die Menge an infiltrierenden Lymphozyten in die Lunge nach
viraler Infektion. Trotzdem zeigte sich eine zusätzliche Reduzierung der viraler
60
5 Ergebnisse
Abbildung 5.11: Krankheitsverlauf in Influenza-infizierten Mäusen nach DNA-Immunisierung und
IL-12 Koapplikation. (A) Durchflusszytometrische Auswahlstrategie zur Bestimmung von Lymphozyten in der Lunge (D) und in der BAL (E) sechs Tage nach der Infektion. Gewichtsverlauf als
Zeichen für den Krankheitsverlauf (B). Bestimmung der viralen Beladung in Lunge und BAL sechs
Tage nach der Infektion mittels qRT-PCR (C). NK = natürliche Killer Zellen. Daten repräsentieren
ein Experiment mit sechs Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; + =
signifikant zu adressiert; * = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001.
Beladung in BAL und Lunge durch die Koapplikation von IL-12. Die induzierte
Th1-lastige Immunantwort nach Immunisierung mit GL117-HA ist auf Grund der
geringen Infektionsdosis in der Lage die Infektion durch die Infiltration hoher
61
5 Ergebnisse
Mengen an aktivierten CD4 und CD8 T-Zellen in die Lunge zu bekämpfen und
somit einen geringeren Gewichtsverlust, sowie eine stärkere Reduzierung der
viralen Beladung zu erreichen.
5.1.4 Direkte Adressierung des Antigens im transgenen Maus Modell
Bisher wurde gezeigt, dass die direkte Adressierung eines Antigens zu einer erhöhten MHC-II Präsentation führte, wodurch transgene T-Zellen zu einer verstärkten
Proliferation angeregt wurden. Im Gegensatz dazu konnten nur deutlich reduzierte Immunantworten gegen das adressierte Antigen in Wildtyp Mäusen induziert
werden. Daher sollte nun mit Hilfe dieses Experiments der Einfluss der direkten
Adressierung auf Antigen-spezifische T-Zellen untersucht werden. Die Verwendung von T-Zellrezeptor transgenen Mäusen ermöglichte die Erhöhung des Pools
an Antigen-spezifischen T-Zellen. Von den verwendeten transgenen Mäusen exprimierten ca. 15 % der CD4 T-Zellen einen HA-spezifischen T-Zellrezeptor. Um
das Schicksal der Antigen-spezifischen T-Zellen zu untersuchen, wurden die Mäuse immunisiert und die Lymphozyten im Blut zu unterschiedlichen Zeitpunkten
analysiert (Abb. 5.12).
Abbildung 5.12: Versuchsablauf zur Analyse des Einflusses der direkten Adressierung des Antigens
auf Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen. Durchflusszytometrische Analyse der Lymphozyten im Blut
zu unterschiedlichen Zeitpunkten (BA).
Durch die Immunisierung mit dem adressierten Konstrukt wurde ein Anstieg
im Blut von Antigen-spezifischen Treg von 2,9 auf 3,7 % im Zeitraum von vier
bis sieben Tagen nach Immunisierung beobachtet, wobei dieser Anstieg in den
Kontrollgruppen nicht zu detektieren war (Abb. 5.13B). Die Induktion der Antigenspezifischen Treg war nur temporär und konnte zehn Tage nach Immunisierung
im Blut nicht mehr nachgewiesen werden.
Trotz höherer Werte, zeichneten sich ähnliche Tendenzen wie im Wildtyp Modell
ab. Durch die direkte Adressierung des CD4 Peptids wurde eine geringere Menge
an Zytokin-produzierenden CD4 T-Zellen induziert, als durch die Verwendung
von GL117-HA. Diese Reduktion traf dabei auf alle untersuchten Zytokine zu
(IFN-γ, IL-2 und TNF-α).
Dieses Experiment zeigt, dass die direkte Adressierung zu einer Induktion von
Treg der gleichen Antigenspezifität führt. Des Weiteren wird deutlich, dass dieser
Effekt nur temporär im Blut detektierbar ist, bevor die Zellpopulation wieder auf
ihr Ausgangslevel zurückfällt.
62
5 Ergebnisse
Abbildung 5.13: Einfluss der Adressierung des Antigens an DZ auf Antigen-spezifischen T-Zellen.
Durchflusszytometrische Analyse der Lymphozyten aus dem Blut auf Induktion von Antigenspezifischen Treg zu den dargestellten Zeitpunkten nach der Immunisierung (A). Antigen-spezifische
Zytokinexpression von CD4 T-Zellen 14 Tage nach der Immunisierung mittels ICS untersucht (B).
Darstellung eines repräsentativen Experiments von zwei unabhängig durchgeführten Experimenten.
Daten von einem Experiment mit vier Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem
Standardfehler.
5.1.5 Analyse der suppressiven Eigenschaften von induzierten Treg
Durch die Erkenntnis, dass die DNA-Immunisierung mit DEC-HA zu einer Induktion von Antigen-spezifischen Treg führte, sollte nun geklärt werden, ob diese
gebildeten Zellen auch eine suppressive Eigenschaft aufweisen oder die reduzierte
Immunantwort einem anderen Mechanismus unterliegen könnte. Dazu wurden
die Rezeptor-transgenen TCR-HA Mäuse immunisiert und eine Woche später
die poplitealen und inguinalen Lymphknoten, sowie die Milz entnommen. Die
Immunzellen wurden aus den lymphatischen Organen isoliert, mit einem Proliferationsmarker markiert und in vitro restimuliert (Abb. 5.14). Bei einer Induktion
von suppressiven Treg durch die Immunisierung sollte es zu einer reduzierten
Proliferation der restimulierten CD4 T-Zellen kommen.
Die aus unterschiedlichen lymphatischen Organen isolierten Zellen wurden
vor der in vitro Restimulation auf deren Mengen an Antigen-spezifischen CD4
T-Zellen und Treg untersucht (Abb. 5.15A, B). Die DNA-Immunisierung mit DECHA führte zu einem Anstieg an Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen (adressiert
2,2x106 Zellen, nicht-adressiert 1,5x106 Zellen und naiv 0,9x106 Zellen) und Treg
in beiden untersuchten Lymphknoten als die Verwendung von GL117-HA. Im
Gegensatz dazu konnte in der Milz kein klarer Einfluss der direkten Adressierung
auf die untersuchten Zellpopulationen detektiert werden, unabhängig von den
63
5 Ergebnisse
Abbildung 5.14: Versuchsaufbau zur Analyse der induzierten Treg auf ihre suppressive Eigenschaft
in vitro. PA = Proliferationsinhibitionsanalyse.
EAk-Konstrukten (adressiert 1,7x106 Zellen, nicht-adressiert 1,8x106 Zellen und
naiv 1,4x106 Zellen).
Die Immunisierung mit DEC- HA reduzierte gegenüber GL117-HA die Menge an
proliferierenden Zellen (adressiert 26,0 %, nicht-adressiert 35,9 % und naiv 47,9
%) sowie die Anzahl an Proliferationsschritten in den poplitealen Lymphknoten
(Abb. 5.16B). Die Reduzierung der Proliferationsschritte kann neben der Menge
an proliferierenden Zellen ein Anzeichen für Suppression sein. In den inguinalen Lymphknoten traf der zuvor beobachtete Effekt nur noch auf die Anzahl an
Proliferationszyklen zu (adressiert 3, nicht-adressiert 5 und naiv 5), während sich
die Anzahl an proliferierenden Zellen zu den anderen Gruppen ähnliche verhielt
(naiv 22,7 %, nicht-adressiert 28,6 % und adressiert 29,3 %). Interessanterweise
konnten in der Milz Ähnlichkeiten zwischen der naiven und der adressierten
Gruppe beobachtet werden (naiv 59,3 % und adressiert 66,4 %), während in der
nicht-adressierten Gruppe eine geringere Prozentzahl an proliferierenden Zellen
detektiert wurde (39,7 %).
Abbildung 5.15: Einfluss der direkten Adressierung auf Antigen-spezifische T-Zellen. Durchflusszytometrische Bestimmung der Menge an Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen (A) und Treg (B) in
den poplitealen Lymphknoten (LKpop ), den inguinalen Lymphknoten (LKingu ) und der Milz. Daten
repräsentieren ein Experiment mit vier Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant
zu naiv; * = p<0,05.
64
5 Ergebnisse
Abbildung 5.16: Direkte Adressierung des Antigens führt zur supprimierten Antigen-spezifischen
CD4 T-Zellproliferationen in vitro. Auswahlstrategie zur Proliferationsanalyse von CFSE-markierten
CD4 T-Zellen im FACS (A). Proliferationsanalyse von isolierten Peptid-restimulierten CD4 T-Zellen
eine Woche nach Immunisierung mittels Durchflusszytometrie (B). Daten repräsentieren ein Experiment mit vier Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler.
5.1.6 Analyse der suppressiven Eigenschaften von induzierten Treg
im Diabetes-Modell in vivo
Nachdem gezeigt wurde, dass die DNA-Immunisierung mit DZ-gerichteten Antigen zur Induktion Antigen-spezifischer Treg führte, ist es im weiteren Verlauf
von Interesse die Eigenschaften der generierten Treg in einem in vivo Modell zu
analysieren. Das verwendete Diabetes-Modell basiert auf transgenen Mäusen, die
HA auf den β-Zellen der Langerhans-Inseln exprimieren. Dabei sind die β-Zellen
65
5 Ergebnisse
essentiell für die Synthese des Blutzucker-regulierenden Hormons Insulin. Um die
Ausprägung von autoreaktiven HA-spezifischen T-Zellen zu verhindern, ist bei
diesen Mäusen die Entwicklung von Lymphozyten genetisch blockiert worden.
Durch den Transfer von HA-spezifischen T-Zellen in INS-HA Mäuse kommt es zu
einer Zerstörung der β-Zellen und der Ausbildung von Diabetes, was an einem
unkontrollierten Anstieg der Glukosekonzentration im Blut zu erkennen wäre.
Der Transfer einer Zellsuspension, bestehend aus HA-spezifischen Effektorzellen
und aus induzierten Treg, sollte die Möglichkeit eröffnen, die suppressiven Eigenschaften der Treg in vivo zu testen. Bei einer Ausbildung des Diabetes, war
das immunmodulatorische Potential der Treg nicht stark genug um die β-Zellen
vor HA-spezifischen T-Zellen durch Suppression zu schützen. Außerdem kann
das Verhältnis zwischen Effektor- zu Suppressorzellen so stark zugunsten der
Effektorzellen verschoben sein, sodass der inhibitorische Effekt ebenfalls verloren
geht. Um das zuvor in vitro getestete suppressive Potential der ausgeprägten Treg
in diesem Modell zu testen, wurden erneut TCR-HA Mäuse immunisiert. Nach
einer Woche wurden die CD4 T-Zellen aus den lymphatischen Organen isoliert
und die Menge an Antigen-spezifischen T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt.
Anschließend wurde eine definierte Menge an Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen
intravenös in INS-HA/RAG-/- Mäuse transferiert. Nach dem Transfer wurde zu
bestimmten Zeitpunkten das Blut auf ein erhöhtes Glukoselevel untersucht (Abb.
5.17).
Abbildung 5.17: Versuchsaufbau zur Analyse der suppressiven Eigenschaft induzierter Treg im
Diabetes-Modell in vivo. Transfer von 2x105 naiven HA-spezifischen CD4 T-Zellen aus immunisierten
TCR-HA Mäusen in INS-HA/RAG-/- Mäuse. GL = Glukoselevel im Blut; ZA = Zellanalyse.
Es stellte sich heraus, dass die isolierten Zellen aus der Milz der Mäuse die
mit DEC-HA immunisiert wurden, die Ausbildung der Krankheit um einen Tag
beschleunigten (Abb.5.18A). Hingegen verzögerten die isolierten Zellen aus den
poplitealen Lymphknoten derselben Mäuse den Kranheitsverlauf um einen Tag.
In einem weiteren Experiment wurde das adressierte Konstrukt mit dem nichtadressierten verglichen, wobei die Zellen in beiden Fällen aus den poplitealen
Lymphknoten isoliert wurden. Es konnte keine Verzögerung oder Beschleunigung
in der Ausprägung des Diabetes in den Mäusen festgestellt werden (Abb. 5.18B).
Alle drei Gruppen, ob unbehandelt oder behandelt, entwickelten die Krankheit
neun Tage nach dem Transfer der Zellen.
Nach dem Erreichen des Abbruchkriteriums für diesen Versuch, wurden Pankreas und Milz auf den Aktivierungstatus von Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen
und die Anwesenheit von Treg untersucht. Dabei konnte kein Unterschied in der
66
5 Ergebnisse
Abbildung 5.18: Analyse der suppressiven Eigenschaft von induzierten Treg nach direkter Adressierung des Antigens an DZ im Diabetes-Modell in vivo. A) Darstellung der Entwicklung des
Glukose-Levels nach dem Transfer von isolierten CD4 T-Zellen aus unterschiedlichen lymphatischen
Organen DEC-HA immunisierter Tiere. B) Darstellung der Entwicklung des Glukose-Levels nach
dem Transfer von isolierten CD4 T-Zellen aus den poplitealen Lymphknoten mit unterschiedlicher
Behandlung. C) Analyse von Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen auf ihren Aktivierungsstatus aus
der Milz und dem Pankreas. D) Darstellung der Menge an Treg in Milz und Pankreas von INS-HA
Mäusen. Daten von einem Experiment mit vier Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit
zugehörigem Standardfehler.
Expression des Aktivierungs- und Oberflächenmarkers CD43 zwischen den Gruppen beobachtet werden (Abb. 5.18C), weder im Pankreas noch in der Milz. Ähnlich
dazu verhielt sich der Verlust des Oberflächenmarkers CD62L, der in keiner Gruppe, sowie keinem untersuchten Organ deutlich reduziert war.
Im Gegensatz zu dem vorherigen Ergebnis (vgl. Abb. 5.15) konnten deutlich geringere Menge an Treg im Pankreas von INS-HA Mäusen nach dem Transfer
aus DEC-behandelten Tieren wiedergefunden werden, als nach demTransfer aus
unbehandelten oder GL117-behandelten Tieren (adressiert 0,2x105 Zellen, nichtadressiert 1,6x105 Zellen und naiv 0,6x105 Zellen; Abb. 5.18D). Hingegen wurde in
der Milz kein Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt. Zusätzlich zu der
Menge wurde auch die Produktion von Granzym B in den Treg untersucht, wobei
ähnliche Tendenzen wie bei den Treg zu erkennen waren.
Trotz induzierter Suppression der Proliferation von Antigen-spezifischen T-Zellen
durch die Immunisierung mit DEC-HA konnte dieses Ergebnis nicht auf das
Diabetes-Modell in vivo übertragen werden. Dabei war der Anstieg des Glukosele-
67
5 Ergebnisse
vels im Blut unabhängig von der Vorbehandlung der transferierten Zellen.
5.1.7 Schicksal von transferierten Antigen-spezifischen T-Zellen
Durch die Immunisierung von Rezeptor-transgenen Mäusen mit DEC-HA konnte
zuvor eine Induktion von Antigen-spezifischen Treg gezeigt werden. Des Weiteren zeigten die Lymphozyten aus den poplitealen Lymphknoten dieser Gruppe
eine deutliche Reduktion in ihrer Proliferation nach Restimulation in vitro. Neben
der Induktion von Treg sind in der Literatur weitere Mechanismen im Rahmen
der peripheren Toleranz beschrieben, die zu einer reduzierten Aktivierung führen können. Da die Immunisierung von Rezeptor-transgenen Mäusen eine recht
oberflächliche und artifizielle Methode repräsentiert, wurde ein Wildtyp Modell
gewählt, in dem in jede Maus die gleiche Menge an Rezeptor-spezifischen T-Zellen
transferiert wurde. In diesem Experiment sollte das Schicksal der transferierten
Antigen-spezifischen T-Zellen in Wildtyp Tieren nach Adressierung des Antigens
untersucht werden. Dazu wurden Mäuse einen Tag nach dem Transfer von Antigenspezifischen CD4 T-Zellen immunisiert und der Verbleib der transferierten Zellen
eine Woche später analysiert (Abb. 5.19). Zusätzlich wurde der Einfluss der transferierten Zellen auf die induzierte Peptid-spezifische zelluläre Immunantwort mittels
ICS untersucht.
Abbildung 5.19: Versuchsablauf zur Analyse des Einflusses der direkten Adressierung des Antigens
an DZ auf Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen. Transfer von 1x106 CD4 T-Zellen isoliert aus TCR-HA
Mäusen. TZA = T-Zellanalyse.
Bei der Analyse der lymphatischen Organe stellte sich heraus (Abb. 5.20A), dass
die Immunisierung mit dem DEC205-spezifischen EAk-Konstrukt zu einer Akkumulation/Expansion von Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen in den poplitealen
Lymphknoten nahe der Immunisierungsstelle führte (2,8x105 Zellen), während
die Behandlung mit dem nicht-adressierten EAk-Konstrukt einen deutlich kleineren Effekt auf die untersuchte Zellpopulation hatte (naiv 8,4x103 Zellen und
nicht-behandelt 4,4x104 Zellen). Dieser stimulatorische Effekt der Adressierung des
Antigens konnte weiterhin in den inguinalen Lymphknoten beobachtet werden,
wobei sich mit Zunahme der Distanz des untersuchten lymphatischen Organs zur
Immunisierungsstelle dieser Effekt reduzierte. Im Einklang mit dieser Beobachtung konnte in der Milz kein Unterschied in der Menge an Antigen-spezifischen
CD4 T-Zellen zwischen den Gruppen detektiert werden (naiv 3,6x104 Zellen, nichtadressiert 6,0x104 Zellen und adressiert 5,8x104 Zellen).
68
5 Ergebnisse
Abbildung 5.20: Schicksal von transferierten Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen nach DZAdressierung des Antigens. Auswahlstrategie zur durchflusszytometrischen Bestimmung von Treg
(A). Menge an Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen (B) und Treg (C) sieben Tage nach der Immunisierung in den poplitealen (LNpop ), sowie den inguinalen (LNingu ) Lymphknoten und der Milz.
Ermittelte Antigen-spezifische IFN-γ, IL-2 und TNF-α Expression von CD4 T-Zellen aus der Milz
sieben Tage nach der Immunisierung, durchflusszytometrisch erfasst. Daten repräsentieren drei
unabhängige Experimente mit acht bis zwölf Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit
zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * =
signifikant zu naiv; # = signifikant zu nicht-adressiert; * = p<0,05; ** = p<0,01.
Ein ähnlicher Effekt konnte bei der Analyse der Antigen-spezifischen Treg beobachtet werden (Abb. 5.20C). Auch in diesem Fall induzierte die direkte Adressierung des Antigens eine Akkumulation/Expansion der Treg in den lymphatischen
Organen nahe der Immunisierungsstellen (adressiert 1x104 Zellen, nicht-adressiert
1,5x103 Zellen und naiv 0,9x103 Zellen). Ebenfalls wurde beobachtet, dass die Induktion der Treg durch die direkte Adressierung mit zunehmender Distanz zur
Injektionsstelle abnahm, wodurch keine Unterschiede zwischen den Gruppen in
der Milz detektierbar waren.
Durch den Transfer von Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen wurden die zuvor
beobachteten Tendenzen von Zytokin-exprimierenden CD4 T-Zellen nach Immu-
69
5 Ergebnisse
nisierung nicht verändert (Abb. 5.20D). Durch die Immunisierung mit DEC-HA
wurde, wie bereits schon mehrfach gezeigt, nach Restimulation in vitro eine geringere Menge an Zytokin-produzierenden CD4 T-Zellen detektiert, als nach einer
unspezifischen Adressierung. Der stärkste Effekt war bei den polyfunktionalen
CD4 T-Zellen zu beobachten, die IFN-γ, IL-2 und TNF-α produzieren (z.B. adressiert 2,2x103 Zellen, nicht-adressiert 6,1x103 Zellen und naiv 7,0x102 Zellen). Diese
reduzierte Zytokinexpression nach Adressierung des Antigens traf auf alle untersuchten Zytokinkombinationen zu.
Dieses Experiment zeigt nach Behandlung mit DEC-HA eine Akkumulation/Expansion der transferierten Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen, sowie eine lokale
Expansion der Treg. Trotz des positiven Effektes auf die Antigen-spezifischen
T-Zellen in den Lymphknoten, induziert DEC-HA in der Milz eine deutlich geringe Menge an Zytokin-produzierenden CD4 T-Zellen als die Immunisierung mit
GL117-HA.
5.1.8 Modulation von Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen und deren
Einfluss auf die Aktivierung von Effektor T-Zellen in vivo
Die beobachtete induzierte Suppression von Antigen-spezifischen T-Zellen im
TCR-HA Modell in vitro durch DZ-Adressierung, konnte nicht auf das klinisch
relevante Diabetes Modell in vivo übertragen werden. Nach dem Transfer von
Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen in Wildtyp Mäuse und anschließender Immunisierung mit DEC-HA konnte eine Induktion von Treg beobachtet werden. In diesem
Versuch sollte der Einfluss von modulierten Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen
auf die Aktivierung von Effektorzellen untersucht werden. Dazu wurde einen
Tag vor der DNA-Immunisierung ein Zelltransfer durchgeführt, um die Menge
an Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen zu erhöhen (Abb. 5.21). Nach drei Wochen
wurden genetisch markierte Antigen-spezifische CD4 Effektorzellen transferiert
und durch eine subkutane Applikation des HA CD4 Peptids in inkomplettem
Freund-Ajuvans aktiviert. Diese Aktivierung sollte durch die induzierten suppressiven Treg inhibiert werden, wobei die Effektorzellen nach weiteren fünf Tagen im
Durchflusszytometer untersucht wurden.
Die Menge an transferierten Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen, sowie transferierten Treg wies keinen deutlichen Unterschied zwischen den Gruppen in den
unterschiedlichen lymphatischen Organen auf (Abb. 5.22A, B).
Bei der Betrachtung der transferierten Zellen stellte sich heraus, dass nach der
DNA-Immunisierung mit DEC-HA, es zu einer geringeren Menge an TNF-α produzierenden CD4 T-Zellen kam als bei Verwendung von GL117-HA (adressiert
1,9x102 Zellen und nicht-adressiert 3x102 Zellen; Abb. 5.22C). Ebenfalls wurde
beobachtet, dass sich die transferierten Zellen vorwiegend in der Milz ansammelten und die Menge an Zytokin-produzierenden CD4 T-Zellen mit der Nähe zur
Immunisierungsstelle abnahm.
Im Gegensatz zu den transferierten CD4 T-Zellen, zeigten die endogenen Zellen
70
5 Ergebnisse
Abbildung 5.21: Versuchsaufbau zur Analyse des Einflusses von modulierten Antigen-spezifischen
CD4 T-Zellen auf die Aktivierung von Effektorzellen. Transfer von 1x106 CD4 T-Zellen, isoliert
aus naiven TCR-HA Tieren, in Wildtyp Mäuse. Zweiter Zelltransfer von 2x105 CD4+ CD25- Thy1.1+
Effektorzellen isoliert aus naiven TCR-HA Tieren mit gleichzeitiger subkutaner Applikation des
HACD4 Peptids in inkomplettem Freund-Adjuvans in die Flanke. TZA = T-Zellanalyse.
Abbildung 5.22: Einfluss der modulierten Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen auf die Aktivierung
von exogenen Effektorzellen. Durchflusszytometrische Analyse der Menge an Antigen-spezifischen
CD4 T-Zellen (A) und Treg (B) in den poplitealen (LKpop ), sowie den inguinalen (LKingu ) Lymphknoten. ICS-basierende Analyse der Antigen-spezifischen IFN-γ, IL-2 und TNF-α Expression der
transferierten Thy1.1+ CD4 T-Zellen (C), sowie der Thy1.1- endogenen CD4 T-Zellen (D) und Detektion mittels Durchflusszytometrie. Daten von einem Experiment mit vier Tieren je Gruppe. Darstellung
der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und
Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; + = signifikant zu adressiert; * = p<0,05; ** = p<0,01.
nach Immunisierung mit DEC-HA eine aktive Reduktion ihrer Zytokinexpression (Abb. 5.22D). Die Lymphozyten aus den poplitealen Lymphknoten der DECimmunisierten Tiere wiesen deutlich geringere TNF-α Produktion auf, als die
unbehandelte Gruppe (adressiert 0,5x103 Zellen und naiv 1,2x103 Zellen). Dieser
71
5 Ergebnisse
Effekt verlor sich mit der Zunahme der Distanz zur Immunisierungsstelle, wodurch sich in der Milz das bereits bekannte Ergebnis präsentierte.
Dieses Experiment zeigt die DEC-spezifische Induktion eines anergen Status in
den endogenen Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen, der lokal begrenzt ist.
5.1.9 Prophylaktische und therapeutische DNA-Immunisierung in
einem Asthma-Modell
5.1.9.1 Verifizierung der reduzierten Immunantwort mit dem gekoppelten
OVA Antigen
Durch die DNA-Immunisierung mit DEC-HA wurde zuvor gezeigt, dass die
induzierte Immunantwort gegenüber einer unspezifischen Adressierung deutlich
reduziert war. In diesem Versuch wurde der Einfluss des gekoppelten Antigens
Ovalbumin (OVA) auf die Immunantwort nach direkter Adressierung untersucht.
Dazu wurde das DNA-Konstrukt pSC-mDEC-OVA, und die Kontrolle, pSC-GL117OVA, verwendet. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die Konstrukte in einem
weiteren Krankheitsmodell, dem OVA-induzierten Asthma-Modell, getestet. Nach
der Immunisierung wurde die induzierte zelluläre Immunantwort mit Hilfe einer
ICS erfasst, wobei parallel Lymphozytenansätze für 48 Stunden in vitro restimuliert
wurden, um ein Expressionsprofil der sekretierten Zytokine zu ermitteln (Abb.
5.23).
Abbildung 5.23: Versuchsaufbau zur Verifizierung der reduzierten Immunantwort mit dem gekoppelten OVA Antigen. Immunisiert wurde mit 20 µg des jeweiligen Plasmids. Analyse der Immunantwort mittels ICS zwei Wochen nach Immunisierung, sowie Langzeitrestimulation (IVR) von
Lymphozyten in vitro für 48 h. Analyse sekretierter Zytokine der langzeitrestimulierten Lymphozyten
erfolgte mittels ELISA.
Bei der induzierten OVA-spezifischen, zellulären Immunantwort zwei Wochen
nach der Immunisierung wurde eine ähnliche Menge an IL-2 oder TNF-α exprimierenden CD4 T-Zellen nach einer ICS im Durchflusszytometer detektiert, unabhängig von der Adressierung (z.B. IL-2: nicht-adressiert 0,019 % und adressiert
0,024 %; Abb 5.24).
Hingegen wurde eine geringere Menge an IFN-γ produzierenden CD4 T-Zellen
durch die direkte Adressierung induziert (adressiert 0,004 % und nicht-adressiert
0,013 %). Ebenfalls waren Unterschiede bei den polyfunktionalen CD4 T-Zellen
zu beobachten. Während DEC-HA eine größere Mengen an Zellen induzierte, die
IL-2 und TNF-α produzierten (adressiert 0,014 % und nicht-adressiert 0,004 %),
72
5 Ergebnisse
Abbildung 5.24: Zelluläre Immunantwort nach direkter Adressierung von OVA 14 Tage nach Immunisierung. Bestimmung der Antigen-spezifischen Zytokinexpression (IFN-γ, IL-2, TNF-α) von
CD4 T-Zellen mittels ICS. Daten von einem Experiment mit vier Tieren je Gruppe. Darstellung der
Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und Tukey
Post-Test, * = signifikant zu naiv; # = signifikant zu nicht-adressiert; + = signifikant zu adressiert; * =
p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001
konnten mehr CD4 T-Zellen nach GL117-HA Behandlung detektiert werden, die
IFN-γ, IL-2 und TNF-α produzierten (adressiert 0,003 % und nicht-adressiert 0,008
%).
Die Langzeitrestimulation der Milzzellen zeigte keine hervorstechende Produktion
eines der analysierten Zytokine, im Vergleich zu der unbehandelten Gruppe (Abb.
5.25). Ebenfalls konnte kein Unterschied in der Zytokinexpression zwischen den
behandelten Gruppen beobachtet werden, mit Ausnahme der IFN-γ Expression.
Durch die Immunisierung mit pSC-GL117-OVA und die Langzeitrestimulation der
Milzzellen mit OVA, wurde eine deutlich höhere IFN-γ Produktion induziert, als
durch das direkte Adressieren von OVA (adressiert 40 pg/ml und nicht-adressiert
270 pg/ml). Durch die T-Zellrezeptor unabhängige zellunspezifische Restimulation
mit PMA/Ionomycin sollte sichergestellt werden, dass sich alle Gruppe ähnlich
stark stimulieren lassen können.
5.1.9.2 Einfluss der direkten Adressierung des Antigens auf die
Ausprägung eines asthmatischen Phänotyps
Das vorangegangene Experiment zeigte, dass die Kopplung von OVA an die verwendeten EAk-Konstrukte keine deutlichen Unterschiede in der Immunantwort
hervorrief, mit Ausnahme der erhöhten IFN-γ Produktion bei Verwendung des
nicht-adressierten Konstruktes. In diesem Experiment sollte die Stimulation der
peripheren Toleranz und deren Einfluss auf OVA-spezifische T-Zellen nach direkter Adressierung des Antigens an DZ untersucht werden. Des Weiteren sollte
73
5 Ergebnisse
Abbildung 5.25: Einfluss der direkten Adressierung von OVA auf die Zytokinexpression von
Antigen-spezifischen Lymphozyten. Darstellung des Zytokinprofils von 48 h unstimulierten Lymphozyten aus der Milz (A), restimuliert mit OVA (B) oder mit PMA/Ionomycin in vitro (C). Daten
von einem Experiment mit vier Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem
Standardfehler. Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test; + = signifikant zu
adressiert; + = p<0,05.
festgestellt werden, ob der Zeitpunkt der Immunisierung einen Einfluss auf die
Ausprägung einer OVA-spezifischen Toleranz hat. Dazu wurden die Tiere zwei
Wochen vor (vgl. Abb. 5.26A) oder nach (vgl. Abb. 5.26B) der Sensibilisierungsphase immunisiert. Dabei diente die Sensibilisierung zur Induktion und Aktivierung
von OVA-spezifischen T-Zellen, sowie einer Th2 Verschiebung der Immunantwort.
Durch die anschließenden Aerosol-Challenges kam es zur Induktion eines OVAinduzierten asthmatischen Phänotyps. Zur Detektion der Th2 Verschiebung wurde
zu unterschiedlichen Zeitpunkten das Serum auf IgG1 und IgG2a untersucht, sowie auf den Allergie-assoziierten Isotyp IgE. Die physiologische Auswirkung des
induzierten asthmatischen Phänotyps, wurde durch die Messung der Lungenfunktion vorgenommen, sowie die Analyse der Lunge und BAL auf infiltrierende
Zellpopulationen. Außerdem wurden die infiltrierenden Lymphozyten aus der
Lunge isoliert, OVA-spezifisch restimuliert und die sezernierten Zytokine mittels
ELISA analysiert, um die Differenzierung anhand Th1-assozierter Zytokine zu
belegen.
Bei der Ausprägung des induzierten asthmatischen Phänotyps spielten die OVAspezifischen T-Zellen eine essentielle Rolle. Zusätzlich ist der Phänotyp durch eine
74
5 Ergebnisse
starke Infiltration von eosinophilen Granulozyten in die Lunge geprägt, was zu
einer starken Inflammation im respiratorischen Trakt führt. Eine Folge der hohen
Inflammation ist die hohe Mucinproduktion der Becherzellen im Atemwegsepithelgewebe zum Schutz der Atemwege. Dabei kommt es zur Verengung dieser und
einer erschwerten Atmung, was anhand einer Lungenfunktionsmessung erkannt
werden kann. Ein weiteres Merkmal ist die Differenzierung von CD4 T-Helferzellen
in Richtung Th2, wodurch eine hohe Ausschüttung an Th2-assoziierten Zytokinen
(z.B. IL-4, IL-5 oder IL-13) detektiert werden kann.
Abbildung 5.26: Versuchsaufbau zur Analyse des Einflusses der prophylaktischen oder semitherapheutischen DNA-Immunisierung auf die Ausbildung eines OVA-induzierten asthmatischen
Phänotyps. Die prophylaktische (A) findet vor und die semi-therapeutische (B) Immunisierung
nach der Sensibilisierung statt. DNA-Elektroporation mit 20 µg des jeweiligen Plasmids. Sensibilisierung (S) erfolgte durch intraperitoneale Applikation von 20 µg OVA in Alum. Blutentnahme (B)
erfolgte zur Bestimmung von Antikörpern im Serum. Challenge (C) bezeichnet eine 20 minütige
Begasung der Mäuse mit einem Aerosol, hergestellt aus einer Lösung von 1 % (w/v) von OVA in PBS.
Lungenfunktionsanalyse (LuFu) erfolgte mit Hilfe eines Plethysmographen. Mittels Präparation (P)
von Lunge und BAL wurde die zelluläre Komposition untersucht. Nach Langzeitrestimulation der
Lymphozyten aus der Lunge wurde das Expressionsprofil der Zytokine mittels ELISA untersucht.
Als Indikator für die Ausprägung des Asthma-Phänotyps wurde nach dem
Aerosol-Challenge die Zellkomposition in der BAL gemessen (Abb. 5.27A). Durch
die prophylaktische Immunisierung mit den OVA-gekoppelten EAk-Konstrukten,
konnte die Menge an eosinophilen Granulozyten in der BAL um 25 Prozentpunkte
gegenüber der Asthma-Gruppe reduziert werden (Asthma 69 %, nicht-adressiert
43 % und adressiert 40 %), womit auf einen der maßgeblichen Parameter des
asthmatischen Phänotyps Einfluss genommen werden konnte. Durch die hohe
Infiltration von eosinophilen Granulozyten und Lymphozyten kam es unabhängig
von der Behandlung zu einem signifikanten Verlust des Anteils an alveolaren
Makrophagen, während die neutrophilen Granulozyten unverändert blieben.
Die Lymphozyten aus der Lunge der Asthma-Gruppe zeigten eine signifikant höhere Sekretion von IL-4, IL-5 und IL-13 als die naive Gruppe (Abb. 5.27B). Durch die
Behandlung mit den EAk-Konstrukten kam es zu einer geringeren Produktion der
zuvor genannten Zytokine, wobei eine Signifikanz gegenüber der Asthma-Gruppe
75
5 Ergebnisse
Abbildung 5.27: Einfluss der prophylaktischen Immunisierung auf die zellulären Kompartimente
des asthmatischen Phänotyps. Durchflusszytometrische Bestimmung der Zellkomposition in der
BAL (A) und erhaltene Zytokinsezernierung nach Antigen-spezifischer Langzeitrestimulation von
Lymphozyten aus der Lunge mittels ELISA (B). Daten von einem Experiment mit sechs Tieren je
Gruppe. aM = alveoläre Makrophagen, N = neutrophile Granulozyten, E = eosinophile Granulozyten,
L = Lymphozyten. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse
mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; # = signifikant zu nicht-adressiert;
+ = signifikant zu adressiert; ** = p<0,01; *** = p<0,001
für die Zytokine IL-4 und IL-13 erreicht wurde. Im Gegensatz dazu wurde in keiner
Gruppe das Th1-assoziierte Zytokin IFN-γ oder das regulatorische Zytokin TGF-β
in nachweisbaren Mengen sekretiert. Bei der Betrachtung des immunregulatorischen und Th2-assoziierten Zytokins IL-10 wurden nach direkter Adressierung
vergleichbar geringe Level als in der unbehandelten Gruppe detektiert, während
die beiden anderen Gruppen höhere Werte aufwiesen.
76
5 Ergebnisse
Abbildung 5.28: Prophylaktische Immunisierung beeinflusst die humorale Immunantwort im induzierten Asthma-Modell. Bestimmung von Antikörpertiter von IgG1 (A), IgG2a (B) und IgE (C) im
Serum zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Versuchs mittels ELISA. Verhältnis der Antikörpersubtypen IgG1 zu IgG2a zu den unterschiedlichen Zeitpunkten (D). Daten von einem Experiment mit
sechs Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische
Analyse mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; # = signifikant zu
nicht-adressiert; ° = signifikant zu Asthma; * = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001
Die Mengen an IgG1 und IgE waren in den drei behandelten Gruppen zu jedem
Zeitpunkt gleich und signifikant höher als die der naiven Gruppe (Abb. 5.28A,
C). Eine deutliche Erhöhung dieser beiden Immunglobuline fand durch die Sensibilisierung statt, wobei sich die Menge an IgE durch die Challange-Phase ein
weiteres Mal erhöhte. Die Immunisierung mit DEC-OVA induzierte einen signifikanten Anstieg an IgG2a gegenüber den anderen Gruppen (Abb. 5.28B). Duch
die Sensibilisierungs- und Challenge-Phase kam es zu vergleichbaren Mengen an
Antikörpern in den beiden immunisierten Gruppen, die noch etwas höher lagen als
die Menge in der Asthma-Gruppe. Um einen Einblick auf die Differenzierung der
induzierten Immunantwort zu bekommen, wurde das Verhältnis zwischen IgG1
und IgG2a gebildet (Abb. 5.28D). Dadurch wurde offensichtlich, dass die Tiere
der Asthma-Gruppe zu allen drei untersuchten Zeitpunkten einen Überschuss
an IgG1 produzierten, während die Behandlung mit den EAk-Konstrukten ein
ausgeglichenes Verhältnis von IgG1 zu IgG2a nach Induktion des asthmatischen
77
5 Ergebnisse
Phänotyps aufwies.
Abbildung 5.29: Histologische Untersuchung des Einflusses der direkten Adressierung des Antigens
innerhalb einer prophylaktischen Immunisierungsstrategie auf die Ausbildung des asthmatischen
Phänotyps in der Lunge. Darstellung der 4fachen Vergrößerung zur Übersicht und 20fachen Vergrößerung für Details. Schnitte sowie Färbung wurde von einem Kooperationspartner durchgeführt.
Zur Analyse der Mucinproduktion durch Becherzellen in der Lunge wurden
Lungenschnitte mit anschließender PAS-Färbung angefertigt (Abb. 5.29). In der
vierfachen Vergrößerung der Lunge eines naiven Tieres konnten keine pathologischen Veränderungen des Lungengewebes erkannt werden. In der 20fachen
Vergrößererung war die intakte dünne Atemwegsepithelschicht eines Bronchiolus
terminalis zu erkennen. Im Gegensatz dazu konnte eine erhöhte Infiltration von
Zellen in die Lunge eines asthmatischen Tieres beobachtet werden, die sich dabei
um die Bronchien ansammelten. Bei der stärkeren Vergrößerung wurde deutlich,
dass die Becherzellen aus dem Atemwegsepithelgewebe des Bronchiolus verstärkt
Mucin produzierten und es in die Atemwege absonderten. Dabei war diese erhöhte
Aktivität der Becherzellen unregelmäßig in der Epithelschicht der Bronchien über
den gesamten Lungenausschnitt verteilt. Bei der Betrachtung der Lungenschnitte
der immunisierten Tiere wurde eine geringere Menge an infiltrierenden Zellen rund
um die Bronchien beobachtet. Ebenfalls hatte die Menge an Mucin-produzierenden
Becherzellen gegenüber der Asthma-Gruppe abgenommen, wobei auch weniger
Bronchien in den Lungenausschnitten betroffen waren. Ein deutlicher Unterschied
zwischen den beiden immunisierten Gruppen konnte jedoch nicht herausgestellt
werden.
Durch die semi-therapeutische DNA-Immunisierung konnte keine Reduzierung
78
5 Ergebnisse
an infiltrierenden eosinophilen Granulozyten in die BAL erreicht werden (Asthma 63 %, nicht-adressiert 55 % und adressiert 59 %, Abb. 5.30A). Der detektierte
signifikante Verlust des Anteils an alveolaren Makrophagen in allen behandelten
Gruppen gegenüber der naiven Gruppe hing mit der hohen Infiltration der eosinophilen Granulozyten zusammen. Ebenfalls war ein signifikant höherer Anteil an
Lymphozyten in der BAL aller behandelten Gruppen beobachtet worden.
Abbildung 5.30: Einfluss der semi-therapeutischen Immunisierung auf die zellulären Kompartimente des asthmatischen Phänotyps. Durchflusszytometrische Bestimmung der Zellkomposition in der
BAL (A) und erhaltene Zytokinsezernierung nach Antigen-spezifischer Langzeitrestimulation von
Lymphozyten aus der Lunge mittels ELISA (B). Daten von einem Experiment mit sechs Tieren je
Gruppe. aM = alveoläre Makrophagen, N = neutrophile Granulozyten, E = eosinophile Granulozyten,
L = Lymphozyten. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse
mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; # = signifikant zu nicht-adressiert;
+ = signifikant zu adressiert; * = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001
79
5 Ergebnisse
Die sekretierten Zytokine nach der Langzeitrestimulation von Lymphozyten aus
der Lunge zeigten keine klaren Unterschiede zwischen den drei behandelten Gruppen auf (Abb. 5.30B). Dabei war die Expression der untersuchten Th2-assoziierten
Zytokine in den behandelten Gruppen gleich hoch und deutlich erhöht gegenüber
der naiven Gruppe.
Abbildung 5.31: Semi-therapeutische Immunisierung beeinflusst die humorale Immunantwort
im induzierten Asthma-Modell. Bestimmung der Antikörpertiter von IgG1 (A), IgG2a (B) und
IgE (C) im Serum zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Versuchs mittels ELISA. Verhältnis der
Antikörpersubtypen IgG1 zu IgG2a zu den unterschiedlichen Zeitpunkten (D). Daten von einem
Experiment mit sechs Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigem Standardfehler.
Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test, * = signifikant zu naiv; * = p<0,05;
** = p<0,01; *** = p<0,001
Die Sensibilisierung induzierte erhöhte Level an IgG1 und IgG2a, wobei kein
Unterschied zwischen den behandelten Gruppen beobachtet wurde (Abb. 5.31A,
B). Selbst die semi-therapeutische DNA-Immunisierung und die Challenge-Phase
führten zu keiner Veränderung in der Menge an Antikörpern. Zudem wurden
keine Veränderungen in den Verhältnissen zwischen IgG1 und IgG2a zu den unterschiedlichen Zeitpunkten ersichtlich (Abb. 5.31D). Im Gegensatz zu den IgG
Antikörpern konnte die Tendenz eines Einflusses auf die Menge an IgE im Serum festgestellt werden (Abb. 5.31A, B). Durch die Sensibilisierung induzierte
80
5 Ergebnisse
IgE Titer konnten nicht durch die semi-therapeutische Immunisierung beeinflusst
werden, wobei nach der Challenge-Phase leicht erhöhte Mengen an IgE in der
GL117-Gruppe gegenüber der Asthma- und DEC-Gruppe detektiert wurden.
Aus technischen Gründen konnte keine verwertbare Lungenfunktionsmessung
durchgeführt werden.
Zusammenfassend wird festgestellt, dass sich durch die direkte Adressierung
des Antigens an DZ eine reduzierte Immunität ausbildet, trotz erhöhter Antigenpräsentation. Durch die Verwendung eines TCR-HA transgenen Maus Modells
konnte die Menge an Antigen-spezifischen T-Zellen erhöhte werden, wodurch
eine Induktion von Treg detektiert wurden. Der beobachtete suppressive Effekt in
vitro konnte nicht auf das transgene Diabetes Modell übertragen werden. In einem
Wildtyp Modell wird der suppressive Einfluss der direkten Adressierung auf die
Reaktivierbarkeit von endogenen T-Zellen herausgestellt, wobei die induzierten
Effekte eine lokale Begrenzung aufweisen. Des Weiteren werden durch die prophylaktische DEC-Adressierung die Antigen-spezifischen T-Zellen in einen anergen
Zustand versetzt, wodurch sich die Ausbildung eines asthmatischen Phänotyps
abschwächt. Hingegen zeigt der therapeutische Ansatz der direkten Adressierung
keinen Einfluss auf die Ausbildung des induzierten asthmatischen Phänotyps.
5.2 Einfluss von Treg auf die Immunantwort nach einer
IAV Infektion
Neben den Immunisierungsstudien soll zusätzlich der Einfluss der Treg auf den
Verlauf einer IAV Infektion in der Maus untersucht werden. Es ist bekannt, dass
Treg unterschiedliche Funktionen wärend einer viralen Infektion einnehmen können. Die Untersuchungen wurden indirekt durch die Depletion von Treg durchgeführt. Dafür wurden transgene Mäuse verwendet, die den Diphtherierezeptor
fusioniert an ein GFP unter der Kontrolle von Foxp3 exprimieren. Durch die Applikation von geringen Mengen des Diphtherietoxins kommt es zu einer selektiven
Depletion von Foxp3 positiven Treg.
5.2.1 Der Einfluss einer subletalen IAV Infektion auf die Funktion der
Treg
Um die Infektionsdosis den physiologischen Begebenheiten anzupassen, wurde
sie deutlich gesenkt. In diesem Experiment soll der Einfluss einer Influenza A
Infektion auf die Treg in DEREG Mäusen untersucht werden. Dazu wurden die
Tiere intranasal infiziert und eine Woche später die Treg in der BAL, Lunge sowie
Milz gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert (Abb. 5.32).
Die infizierten Mäuse begannen zwei Tage nach der Infektion langsam an Gewicht zu verlieren (Abb. 5.33A). Dabei stieg mit jedem vergangenen Tag die Geschwindigkeit der Gewichtsabnahme, wobei die Tiere sieben Tage nach Infektion
81
5 Ergebnisse
Abbildung 5.32: Versuchsaufbau zur Analyse des Einflusses einer subletalen IAV Infektion auf die
Menge an Treg im DEREG-Modell. Infektion wurde intranasal mit 17 PFU durchgeführt. Durchflusszytometrische Zellanalyse (ZA) von BAL, Lunge und Milz sieben Tage nach Infektion.
nur noch 85 % ihres Ausgangsgewichtes besaßen.
Durch die subletale IAV Infektion wurde eine erhöhte Menge an Treg in der BAL,
der Lunge und sogar der Milz gegenüber der naiven Gruppe detektiert. Dies legt
den Schluss nahe, dass die Induktion der Treg einen Einfluss auf die IAV haben
könnte.
Abbildung 5.33: Einfluss der IAV Infektion auf die Menge an Treg. (A) Gewichtsverlauf der Tiere
nach Infektion. (B) Bestimmung der Menge an Treg in BAL, Lunge und Milz sieben Tage nach
Infektion mittels FACS. Daten von einem Experiment mit vier Tieren je Gruppe. Darstellung der
Mittelwerte und zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels ungepaartem t-Test; *
signifikant zu naiv; * = p<0,05.
5.2.2 Auswirkung der Treg Depletion auf die Immunantwort nach
einer IAV Infektion
Nachdem sich im ersten Versuch gezeigt hatte, dass eine IAV Infektion Treg induzierte, wurde in diesem Experiment der Einfluss einer Treg Depletion während der
Infektion auf die Immunantwort untersucht und mit infizierten nicht depletierten
Tieren verglichen. Zur selektiven Depletion der regulatorischen T-Zellen wurde
das DEREG Modell verwendet. Die Depletion wurde täglich durchgeführt und
begann einen Tag vor der Infektion und endete vier Tage nach Infektion (Abb.
5.32). Durch die Analyse der Treg im Blut nach DT-Applikation wurde die Effizienz
der Depletion untersucht. Eine Woche nach Infektion wurden unterschiedliche
immunologische Parameter in den Tieren analysiert, während 17 Tage lang das
Überleben und der Gewichtsverlauf dokumentiert wurden.
Bei der Dokumentation des Körpergewichts stellte sich heraus, dass beide Gruppen (infizierte und depletiert+infizierte) zwei Tage nach Infektion begannen Körpergewicht zu verlieren und neun Tage nach Infektion an Körpergewicht wieder
82
5 Ergebnisse
Abbildung 5.34: Analyse des Einflusses der Treg Depletion auf die IAV Infektion im DEREG Modell.
Dokumentation des Gewichts während des gesamten Versuches. Depletion (DT) mit 500 µg/Maus.
Infektion erfolgte intranasal mit 5 PFU. Durchflusszytometrische Bestimmung der Depletionseffizienz (DA) fünf Tage nach Infektion, sowie der zellulären Kompartimente (ZA) sieben Tage nach
Infektion. Ermittlung der viralen Beladung (VB) in der Lunge mittels qRT-PCR.
zugenommen haben (Abb. 5.33A). Der erste Unterschied zwischen den beiden
infizierten Gruppen zeigte sich zwölf Tage nach Infektion, wobei die infizierte
Gruppe weiter an Gewicht zunahm, während die depletiert+infizierte Gruppe in
der Gewichtszunahme für vier Tage stagnierte.
Abbildung 5.35: Krankheitsverlauf nach einer subletalen IAV Infektion in Abwesenheit von Treg.
Dokumentation des Gewichtsverlaufs (A) und der Überlebensrate der infizierten Tiere (D) über
den gesamten Versuchszeitraum. Depletionseffizienz von Treg im Blut fünf Tage nach Infektion.
Virale Beladung der Lunge sieben Tage nach Infektion mittels qRT-PCR bestimmt. Daten von zwei
unabhängigen Experimenten mit insgesamt 4 bis 14 Tieren je Gruppe. Darstellung der Mittelwerte
mit zugehörigem Standardfehler. Statistische Analyse mittels 1-way ANOVA und Tukey Post-Test; *
= signifikant zu naiv; # = signifikant zu infiziert; * = p<0,05; ** = p< 0,01; *** = p<0,001.
Die Depletionsanalyse zeigte, dass durch die Applikation von DT die Menge an
Treg im Blut signifikant reduziert wurde (Abb. 5.33B).
Trotz deutlicher Reduktion an Treg während der akuten Phase der Infektion ,konnte kein Unterschied zwischen den beiden infizierten Gruppen, in ihrer viralen
Beladung in der Lunge, sieben Tage nach Infektion detektiert werden (Abb. 5.33C).
Im Einklang mit dem Verlauf des Körpergewichts zeigte sich auch bei der Überle-
83
5 Ergebnisse
benskurve kein Unterschied bis zum zehnten Tag nach der Infektion (Abb. 5.33D).
Ab diesem Zeitpunkt verstarben in der depletierten+infizierten Gruppe vermehrt
Tiere an den Folgen der Infektion. Zum Ende des Versuches waren 8 von 13 Tieren in der depletierten+infizierten Gruppe verstorben, während in der infizierten
Gruppe ausschließlich ein verstorbenes Tier vermerkt wurde.
Da die Anwesenheit von Treg nachweislich einen positiven Effekt auf die Erholung
und das Überleben der Tiere nach einer viralen Infektion hatten, wurde nun die Reaktion des Immunsystems auf die Depletion der Treg während einer IAV Infektion
ermittelt. Dafür wurden die Lungen sieben Tage und zehn Tage nach Infektion auf
infiltrierende Zellen untersucht (Abb. 5.34A, C). Da die Beseitigung einer Influenza
Infektion unter anderem durch die Lyse von infizierten, Virus-produzierenden
alveolaren Epithelzellen geprägt ist, wurden CD8 T-Zellen und NK Zellen auf die
Expression zytolytischer Marker wie CD107a, Granzym B oder IFN-γ ebenfalls zu
beiden Zeitpunkten untersucht.
Abbildung 5.36: Einfluss der Treg Depletion während der akuten Phase der Infektion auf die Immunantwort in der Lunge. Durchflusszytometrische Untersuchung der zellulären Infiltration in
die Lunge sieben (A) und zehn (C) Tage nach der Infektion. Markierung von inflammatorischen
und Zytolyse-assoziierten Molekülen (CD107, BzmB, IFNγ) sieben (B) und zehn (D) Tage nach
Infektion. Daten von einem Experiment mit vier Tieren je Gruppe. aM = alveoläre Makrophagen,
N = neutrophile Granulozyten, NK = NK Zellen. Darstellung der Mittelwerte mit zugehörigen
Standardfehlern. Statistische Analyse mittels 1-Way ANOVA und Tukey Post-Test; * = signifikant zu
naiv; # = signifikant zu infiziert; * = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001.
Dabei wurde beobachtet, dass sieben Tage nach der Infektion nur geringe Mengen an alveolaren Makrophagen oder neutrophilen Granulozyten in der Lunge
zu detektieren waren (Abb. 5.34A). Im Gegensatz dazu führte die virale Infektion
84
5 Ergebnisse
unabhängig von der Depletion der Treg zu einem Anstieg an NK Zellen. Hingegen
konnten die Auswirkungen der Depletion an der massiven Infiltration von CD4
und CD8 T-Zellen in die Lunge erkannt werden.
Durch die Depletion der Treg wurde in den CD8 T-Zellen in der Lunge sieben Tage
nach Infektion eine höhere Expression an Granzym B und dem Degranulationsmarker CD107a beobachtet (Abb. 5.34B). Außerdem wurde ebefalls eine größere
Menge des inflammatorischen Zytokins IFN-γ in der depletierten+infizierten Gruppe detektiert. Im Gegensatz zu den CD8 T-Zellen konnte bei den NK Zellen kein
Einfluss der Depletion der Treg auf die Expression der untersuchten Marker festgestellt werden. Interessanterweise kam es sogar zu einer signifikanten Reduktion in
der Expression und Präsentation des Degranulationsmarkers in beiden infizierten
Gruppen, während die Produktion von Granzym B anstieg.
Durch die Analyse der Lunge zehn Tage nach Infektion kristallisierte sich die
Auswirkung der Treg Depletion deutlich heraus. Dabei kam es neben der bereits
zuvor beobachteten Infiltration der CD4 und CD8 T-Zellen, ebenfalls zu einem
Anstieg der Menge an Zellen der angeborenen Immunantwort wie den neutrophilen Granulozyten und NK Zellen (Abb. 5.34C). Im Einklang mit der höheren
Infiltration von Immunzellen in die Lungen wurde auch eine erhöhte Expression der analysierten zytolytischen Marker in der depletierten+infizierten Gruppe
beobachtet (Abb. 5.34D).
Abbildung 5.37: Histologische Untersuchung der Auswirkung der Depletion von Treg auf die
Immunantwort nach einer Influenza Virusinfektion. Präparate stammen von Lungen sieben Tage
nach Infektion und wurden von einem Kooperationspartner angefertigt und H&E gefärbt.
Um die massive Infiltration von Immunzellen in die Lunge durch eine andere
85
5 Ergebnisse
Methode zu verifizieren, wurden Lungenschnitte mit anschließender H&E Färbung
von einem Kooperationspartner angefertigt.
Bei der Betrachtung der H&E gefärbten Lungenschnitte der naiven Gruppe wurden keine auffälligen pathologischen Veränderungen festgestellt (Abb. 5.35). Im
Gegensatz dazu zeigte sich bei den Lungen der infizierten Tiere eine deutliche
Infiltration von Lymphozyten in bestimmten Bereichen der Lunge. Des Weiteren
konnte bei dem ersten Tier in der Vergrößerung eine subakute Bronchiolitis obliterans beobachtet werden, mit einer partiellen Auflösung des Alveolarepithels
und der Ausbildung mehrer Exsudatspfropfe. Auch kommt es durch die Infektion
zu einer Schwellung der Basalmembran rund um die Bronchien. Im Gegensatz
zu der infizierten Gruppe wies die depletierte+infizierte Gruppe eine deutlich
höhere Infiltration von Lymphozyten in das Lungengewebe auf. Auch konnte nach
der Infektion ein Anschwellen der Basalmembran beobachtet werden. Ebenfalls
zeigten manche Bronchien eine Disruption des Alveolarepithels, jedoch mit dem
Unterschied, dass keine Exsudation beobachtet wurde.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Treg einen Einfluss auf den Verlauf der Infektion
haben. Dabei wird deutlich, dass der Einfluss sich nicht direkt auf die virale Beladung auswirkt, sondern eher auf die Kontrolle der Infiltration von Immunzellen in
die Lunge, sowie deren Aktivierung. Damit spielen die Treg eine wichtige Rolle im
Schutz gegen eine überschwengliche Immunpathologie als Antwort auf die virale
Infektion.
86
6 Diskussion
6 Diskussion
Dendritische Zellen spielen eine zentrale Rolle in der Induktion der Immunantwort
des Menschen. Sie schlagen eine Brücke zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunität. Neben der Induktion einer Pathogen-spezifischen Immunität,
sorgen die DZ ebenfalls für eine Unterdrückung von unerwünschten, autoreaktiven Immunantworten in der Peripherie. Dabei ist der Verlauf der Immunantwort
abhängig von deren Reifungsgrad.
Auf Grund der zentralen Rolle der DZ in der Induktion von Immunantworten
ist die direkte Adressierung von Antigenen an DZ eine vielversprechende Immunisierungsstrategie. Dazu werden Antigen-gekoppelte Antikörper verwendet,
die gegen ein Oberflächenprotein auf DZ gerichtet sind. Es zeigte sich, dass die
Immunisierung mit DZ-gerichteten Antigenen die notwendige Applikationsdosis gegenüber einer herkömmlichen Protein-Immunisierung deutlich reduzierte
[206]. Unter der großen Vielzahl an adressierbaren Rezeptoren auf DZ erwies
sich der endozytotische C-Typ Lektin Rezeptor, DEC205, auf Grund seiner hohen
Expression auf DZ im lymphoiden Gewebe [246] und seiner Fähigkeit zur Kreuzpräsentation [61], als geeigneter Kanidat. Die Kopplung eines Antigens an einen
DEC205-spezifischen Antikörper ermöglichte die direkte Adressierung der DZ in
vivo und führte zu einer verstärkten Antigenpräsentation auf MHC-I und MHC-II
[29]. Des Weiteren wurde beobachtet, dass die direkte Adressierung von DZ zur
Induktion von peripheren Toleranzmechnismen führen kann [148, 29], während
die Koapplikation von Adjuvanzien eine starke und schützende Immunogenität
induzierte [231, 42].
Das Ziel dieser Arbeit war die DZ-gerichtete Immunisierung mit einer DNAElektroporation zu kombinieren. DNA Impfstoffe vereinen viele Vorteile, wie eine
einfache und schnelle Konstruktion, sowie eine kostengünstige Produktion in
großem Maßstab. Daher wurden die verwendeten Einzelkettenantikörper, der
HA-gekoppelte Adressierungsantikörper spezifisch für DEC205 oder die Isotypkontrolle, in ein Expressionsplasmid kloniert. Durch eine DNA-Immunisierung
gefolgt von elektrischen Pulsen kann eine starke und lange Transgenexpression
gewährleistet werden [159]. Der Vorteil dabei ist die kontinuierliche de novo Produktion der Antikörperstrukte in vivo, was die Anzahl an notwendigen Applikationen
reduzieren würde. Des Weiteren ist die Anpassung des gekoppelten Antigens auf
DNA-Ebene, die Aufreinigung, sowie der Umgang mit DNA deutlich einfacher
und günstiger als bei Proteinen. Für die Studien wurde das Oberflächenprotein
Hämagglutinin des Influenza A Puerto Rico/8/34 (H1N1) Virus ausgewählt, da es
die Möglichkeit bietet mittels TCR-transgener Modelle das Schicksal von Antigenspezifischen T-Zellen und deren Einfluss auf eine Immunogenität zu untersuchen.
87
6 Diskussion
Durch die DZ-gerichtete DNA-Immunisierung konnte eine erhöhte Antigenpräsentation auf MHC-II beobachtet werden, die zu einer verstärkten Proliferation von
Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen führte (Abb. 5.2)[169]. Ebenfalls wurde eine
starke Proliferation von TCR-transgenen CD8 T-Zellen nach DNA-Immunisierung
induziert, die überraschenderweise aber unabhängig von der Adressierung und
somit vermutlich auch von der Kreuzpräsentation war. Während die Erhöhung der
MHC-II Präsentation mit den Ergebnissen von anderen Gruppen übereinstimmte, war die ausbleibende Verbesserung der CD8 T-Zellproliferation gegenteilig
zu den bereits publizierten Daten [168]. Selbst der adenoviralen Vektor, der das
Fusionsprotein aus DEC-spezifischen Antikörper und Antigen kodiert, war in
der Lage Antigen-spezifische CD4 und CD8 T-Zellen zur Proliferation anzuregen [225]. In den zuvor erwähnten Studien wurde allerdings das Modellantigen
OVA verwendet, während in der vorliegenden Arbeit der Fokus auf dem viralen
Oberflächenprotein HA lag. Während OVA, da es ein lösliches Protein formt, in
kompletter Form an die Antikörperkonstrukte gekoppelt werden konnte, musste
das HA CD8 Peptid aus der Transmembrandomäne entfernt werden, um einen konjugierten sezernierbaren Antikörper herstellen zu können. Möglicherweise spielt
die Einbettung des CD8-Epitops in dem gekoppelten Antigen eine große Rolle bei
der verbesserten spezifischen T-Zellantwort. Studien zeigten einen Einfluss der
flankierenden Regionen eines Epitops auf dessen Prozessierung und Präsentation
[156, 18, 50]. Des Weiteren wurde beobachtet, dass die Antigenpräsentation mit
zunehmender Entfernung zur Immunisierungsstelle abnahm. Möglicherweise werden die geringen Mengen an sezernierten Antikörpern nach DNA-Immunisierung
bereits durch ortsgebundene DZ in den nahegelegenen lymphatischen Organen
aufgenommen. Die Beobachtung von Ring el al., dass eine intravenöse Applikation
eines EAk zu einer systemweiten Immunantwort führt [183], unterstützt diese
These.
Trotz verbesserter MHC-II Präsentation wurde durch die DNA-Immunisierung
mit den DZ-gerichteren Konstrukten eine geringere Anzahl an Zytokin-produzierenden CD4 T-Zellen induziert als mit den Kontrollkonstrukten. Ebenfalls wurden
ausschließlich CD8 T-Zellantworten in der Kontrollgruppe stimuliert, obwohl zuvor in beiden Gruppen vergleichbare Proliferationsraten von TCR-transgenen CD8
T-Zellen beobachtet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind absolut gegensätzlich
zu bereits publizierten Daten. Nchinda et al. zeigten in Mäusen, dass durch die direkte Adressierung von HIV Gag p41 nach einer DNA-Immunisierung eine deutlich
bessere zelluläre Immunantwort induziert werden konnte als mit dem Kontrollkonstrukt [168]. Auch der Transfer der DZ-gerichteten Expressionskassette mittels
adenoviraler Partikel [226] oder dem New Castle Disease Virus [145] induzierte eine stärkere zelluläre Immunantwort als das entsprechende Kontrollkonstrukt. Die
Betrachtung der anderen Modelle zeigt einen starken Einfluss unterschiedlichster
Faktoren auf die Ausprägung einer starken Antigen-spezifischen Immunantwort.
Die hohe Variation der Parameter in den bisher durchgeführten Studien ermöglicht
es kaum eine definitive Aussage zu treffen, durch welches Antikörper-gekoppelte
Antigen (Survivin [42], Tyrosinase-ähnliches Protein [149], HIV Gag p24 [231]
88
6 Diskussion
oder OVA [226]), welche Applikationsvariante (New Castle Disease Vektorsystem
[145], adenovirales Vektorsystem [226], DNA-Immunisierung [168] oder ProteinImmunisierung [231]) oder in welchem Organismus (humanen DZ in vitro [34],
Primaten [225] oder Mäusen [226]) eine bestimmte Immunantwort induziert wird.
Unter Berücksichtigung dieser Tatsache müßte für jedes gekoppelte Antigen eine
Studie in den unterschiedlichen Modellen durchgeführt werden. Außerdem sollte
überdacht werden, ob die Analyse eines Mechanismus an Krankheits-irrelevanten
artifiziellen Modellantigenen durchgeführt werden muss, wenn die Ergebnisse so
deutlich zwischen den unterschiedlichen Antigenen variieren.
Die fehlende Antigen-spezifische CD8 T-Zellantwort könnte durch eine Depletion der Zellen nach Adressierung des spezifischen CD8 Epitops an unreife DZ vermittelt werden. Dieses Ergebnis wurde bereits nach einer Protein-Immunisierung
mit einem OVA-konjugierten DEC205-spezifischen Antikörper beobachtet [29].
Um die potentielle Induktion der peripheren Toleranz zu umgehen, bedarf es
eines starken stimulatorischen Reifungssignals für die DZ. Bisher wurde davon
ausgegangen, dass die Inflammation, die durch apoptotische Zellen nach einer
Elektroporation entstehen soll, ausreicht [13, 12], die adressierten DZ zur Reifung
anzuregen. Diese These wurde weiterhin durch die Beobachtungen von Nchinda
et al. gefestigt [168]. Hingegen deuten die Ergebnisse dieser Arbeit (Abb. 5.4 &
5.8) und einiger nicht publizierter Beobachtungen in unserem Lehrstuhl darauf
hin, dass die Elektroporation selbst als stimulatorisches Reifungssignal für DZ
nicht ausreicht. Um dies genauer zu verifizieren, könnten die DZ aus den nächstgelegenden lymphatischen Organen nach der Immunisierung isoliert werden und
deren Expression von kostimulatorischen Signal auf der Zelloberfläche analysiert
werden.
Da durch die Immunisierung keine neutralisierenden Antikörper induziert wurden, bietet eine Infektion mit dem homologen Influenza A Virus eine gute Möglichkeit die Qualität der induzierten T-Zellen zu untersuchen. Trotz induzierter
Immunantworten zeigten die EAk-behandelten Gruppen keinen Schutz und wiesen sogar einen stärkeren Gewichtsverlust, sowie eine erhöhte Sterblichkeit auf.
Die Induktion von Virus-neutralisierenden Antikörpern stellt dabei einen klaren
Vorteil dar (z.B. durch HA-DNA [184]), wodurch der größte Teil an initial applizierten Viren abgefangen werden kann und somit die Infektion mildert. Dabei konnte
keines der verwendeten EAk-Konstrukte neutralisierende Antikörper induzieren.
Möglicherweise entsteht durch die Kopplung an den Einzelkettenantikörper eine
Änderung oder Hinderung in der Konformation, was die Ausprägung der neutralisierenden Antikörper unterbindet. Erst nach der Infektion konnten Titer an
neutralisierenden Antikörpern detektiert werden, wobei kein anamnestischer Effekt durch die Immunisierung erkennbar war. Trotz allem war die Immunisierung
in der Lage die virale Beladung in Lunge und BAL signifikant gegenüber der
unbehandelten Gruppe zu reduzieren (vgl. Abb. 5.7B). Trotz induzierter zellulärer
Immunantworten nach einer Applikation von adenoviralen Vektoren, welche für
DZ-gerichtete OVA-gekoppelte Antikörper kodieren, wurde ein geringerer Schutz
gegen einen OVA-exprimierenden Virus oder Melanomazellen beobachtet als in
89
6 Diskussion
der nicht-adressierten Gruppe [226].
Im Gegensatz zu den DNA-basierten DZ-adressierten Vakzinen induzierten
die Protein-Immunisierungen durch zusätzliche Applikation von TLR-Agonisten
(z.B. CpG, polyIC) oder des CD40-Liganden eine schützende Immunantwort
[149, 231, 42]. Eine direkte Übertragung auf die DNA-basierende Immunisierung
erweist sich dabei als sehr schwierig, da neben der zeitlichen Abstimmung der
Injektion des Adjuvans auch die Route der Applikation, sowie die Menge des
Adjuvans eine große Rolle spielt. Grossmann et al. zeigten in einer Studie, dass eine
Applikation eines Gemisch aus polyIC, CpG und der DNA-Vakzine zu einem effektiven Priming der Immunantwort führte, wodurch stärkere CD8 T-Zellantworten
ausgebildet werden konnten [79]. Im Gegensatz zu den in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse, basieren die Beobachtungen von Grossmann et al. auf einer
subkutanen Immunsierung ohne Elektroporation im OVA Modell. Aus nicht publizierten Beobachtungen innerhalb der eigenen Arbeitsgruppe ging hervor, dass
eine Koapplikation von TLR-Liganden im Rahmen der Elektroporation zu einem
massiven Absterben der transfizierten Zellen führte.
Neben der Koadministration von stimulatorischen Molekülen sind auch genetische Adjuvanzien bekannt [197, 62], die ein inflammatorisches Signal induzieren
oder die Immunantwort in eine bestimmte Richtung verschieben können. Auf
Grund der schlechten CD8 T-Zellantworten und der Notwendigkeit beider TZellpopulation für die Beseitigung einer viralen Infektion wurde IL-12 ausgewählt.
IL-12 verstärkt die IFN-γ Sekretion und die zytolytische Aktivität von ZTL und NK
Zellen und ist in der Lage eine Th1 Differenzierung zu stimulieren [108, 109]. Die
zusätzliche Applikation des IL-12 Expressionsplasmids mit den EAk-Konstrukten
erhöhte unabhängig der Adressierung die Expression Th1-assoziierter Zytokine,
wie IL-2 oder IFN-γ, in CD4 T-Zellen. Die Anzeichen einer Th1 Differenzierung
der CD4 T-Zellen konnte aber nicht durch die Ausprägung einer verstärkten CD8
T-Zellantwort oder durch die Ausbildung einer IgG2a lastigen Antikörperantwort
bestätigt werden, wie es von Kim et al. beobachtet wurde [108]. Ausschließlich
in der nicht-adressierten Gruppe war ein positiver Effekt des Adjuvans auf die
Aktivierung der CD8 T-Zellen zu beobachten. Hierdurch hattes es den Anschein,
dass die CD8 T-Zellen schon sehr früh nach der DZ-gerichteten Immunisierung
in einen anergen Zustand verfallen und durch IL-12 auch keine Reaktivierung
erfolgen kann. Im Übrigen lässt sich aus den Ergebnissen ableiten, dass IL-12 als
genetisches Adjuvans ein starkes Priming ausübt, wobei nach der zweiten Immunisierung keine Veränderung durch eine intrazelluläre Zytokinfärbung detektierbar
war. Es stellte sich heraus, dass die induzierten CD8 T-Zellen in der Kontrollgruppe
einen starken Einfluss auf die antivirale Immunantwort hatten. Durch die Infiltration von aktivierten CD8 T-Zellen in die Lunge kam es zu einer Reduktion der
viralen Beladung, sowie zu einem milderen Krankheitsverlauf. Hingegen zeigten
die DEC-immunisierten Tiere unabhängig von der IL-12 Koapplikation denselben
Krankheitsverlauf wie die unbehandelten Tiere. Trotzdem war die DZ-gerichtete
Immunisierung ebenfalls in der Lage die virale Beladung gegenüber der naiven
Gruppe in BAL und Lunge zu reduzieren, während die Koapplikation von IL-12
90
6 Diskussion
zu einer weiteren Reduktion führte. Die alleinige Applikation des Adjuvans führte
hingegen zu keiner Veränderung der viralen Beladung. Anhand dieser Ergebnisse zeigt sich, dass die IL-12 Koapplikation antivirale Zelltypen beeinflusst, die
nicht durch die Analyse in dieser Arbeit erfasst wurden. Im Gegensatz zu den
Ergebnissen in dieser Arbeit induzierten Stobie et al. einen Schutz in Mäusen gegen eine Leishmania major Infektion durch die Koapplikation von IL-12 zu einem
nicht adressierten Antigen [210]. Dabei basierte der Schutz auf einer Induktion
von differenzierten Th1 Zellen. In einem Influenza A Modell konnte ebenfalls ein
vollständiger Schutz gegen eine tödliche Virusinfektion durch die Koapplikation
von IL-12 zu dem nicht-adressierten Nukleoprotein nach Elektroporation erreicht
werden [164]. Da die zelluläre Immunantwort gegen das Nukleoprotein dominiert [126] konnte durch die Koapplikation von IL-12 diese verstärkt werden, was
anhand des verbesserten Schutzes und der erhöhten IFN-γ festgemacht wurde
[164]. Im Gegensatz dazu zeigten Morrow et al., dass die Koapplikation eines IL-12
Expressionsplasmids bei einer DNA-Immunisierung gegen HIV-1 Gag nicht zu
einem Anstieg des Antigen-spezifischen IgG2a Titers führte. Dies ist im Einklang
mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit.
Wie bereits erwähnt, kann die direkte Adressierung eines Antigens an unreife DZ zu einer Aktivierung von peripheren Toleranzmechanismen führen. Dazu
zeigte Kretschmer et al., dass durch direkte Adressierung des HA an DZ Antigenspezifische CD4 T-Zellen in vivo in Treg konvertiert werden können [122]. Zudem können sich die induzierten Treg suppressiv auf allergische Reaktionen, wie
der CD4 T-Zell-gesteuerten verzögerte Hypersensibilitätsreaktion oder der CD8
T-Zell-gesteuerten Kontakthypersensibilität, auswirken [148]. Durch die DNAImmunisierung von TCR-HA Mäusen mit dem DZ-gerichteten EAk-Konstrukt
konnte in dieser Arbeit eine Erhöhung der Menge an Antigen-spezifischen Treg
im Blut vier bis sieben Tage nach der Immunisierung detektiert werden. Damit
waren die Ergebnisse vergleichbar mit denen von Kretschmer et al., die nach einem
Transfer von TCR-HA+ Effektorzellen und der Injektion von αDEC205-HA eine
Konvertierung zu Treg neun Tage nach Immunisierung beobachteten [122]. Ein
genauer Vergleich der beiden Ergebnisse ist nicht möglich, da sich die Tiermodelle,
die Immunisierungsmethode und die untersuchten Zellpopulationen voneinander
unterscheiden.
Die induzierten Treg könnten ein Grund für die im Rahmen dieser Arbeit beobachteten reduzierten Immunantworten darstellen. Daher wurden sie in einem in
vitro Proliferationstest auf ihr inhibierendes Potenzial überprüft. Dabei zeigten die
Zellen aus den poplitealen Lymphknoten, nahe der Immunisierungsstelle, nach
Immunisierung mit dem adressierten Antigen eine reduzierte Proliferation, während bei den Zellen aus den inguinalen Lymphknoten und der Milz dieser Effekt
mit zunehmender Entfernung vom Immunisierungsort abnahm. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass die DZ-gerichtete DNA-Immunisierung eine lokal begrenzte
Suppression induziert.
Nicht nur der Mechanismus der Suppression spielt eine Rolle, sondern auch
die Anwendbarkeit in einem relevanten Modell. Suppression spielt eine große
91
6 Diskussion
Rolle bei der Behandlung oder Vermeidung von allergischen oder autoimmunen Reaktionen. Ein etabliertes Modell zur Analyse induzierter Suppression von
Antigen-spezifischen T-Zellen stellt das Typ 1 Diabetesmodell in transgenen INSHA/TCR-HA/RAG-/- Mäusen dar [195]. Durch die Expression von HA auf den
β-Zellen des Pankreas und die Entwicklung von HA-spezifischen Effektorzellen
kommt es zu einer CD4 T-Zell-bedingten Autoimmunreaktion, wodurch die Zielzellen zerstört und die Insulitis, sowie später dann der Diabetes sich ausbildet.
Bruder et al. zeigten, dass bei neugeborenen Mäusen eine wiederholte Gabe des
HA-konjugierten DEC205-Antikörpers fast vollständig vor dem Ausbruch der
Insulitis schützte [35]. Da sich der Diabetes schon ab der vierten Woche in den
Tieren entwickelt [195], ist es auf Grund der gelativ großen Belastung nicht möglich
neugeborene Mäuse mittels DNA-Elektroporation zu behandeln. Daher wurde
ein anderes zur Verfügung stehendes Typ 1 Diabetes Modell verwendet. Die INSHA/RAG-/- Mäuse exprimieren ebenfalls HA auf den β-Zellen, wobei aber keine
HA-spezifische T-Zellen im Tier gebildet werden und somit die Entwicklung des
Diabetes vorerst ausbleibt. Ein Transfer von HA-spezifischen Effektorzellen führt
zu einer Zerstörung der β-Zellen und der Ausbildung des Diabetes. Hingegen kann
der Transfer eines Zellgemisches, bestehend aus Effektor- und Suppressorzellen, je
nach Aktivität der Suppressorzellen die Ausbildung der Krankheit inhibieren oder
verlangsamen. Um das Potential der induzierten Suppressorzellen zu überprüfen,
wurden TCR-HA Mäuse mit dem DZ-gerichteten EAk-Konstrukt und dem Kontrollkonstrukt immunisiert. Nach einer Woche wurden die CD4 T-Zellen aus den
poplitealen und inguinalen Lymphknoten und der Milz isoliert, von denen eine
definierte Menge an HA-spezifischen CD4 T-Zellen in die INS-HA/RAG-/- Mäuse
transferiert wurde. Die transferierte Zellsuspension bestand aus HA-spezifischen
Effektor- und Suppressorzellen, wobei Anzeichen für suppressive Effekte eine
Verzögerung oder Verhinderung der Ausbildung des Diabetes wären. Trotz des
induzierten supprimierenden Effekts auf die Antigen-spezifische Proliferation in
vitro konnte dieser Effekt nicht auf das Diabetes Modell in vivo übertragen werden.
Bereits nach elf Tagen kam es zur Entwicklung der Insulitis unabhängig von der
Behandlung der Tiere, aus denen die Zellen stammen. Dabei wurden die Zellen aus
dem lymphatischen Organ entnommen, dass bisher immer den größten Einfluss
durch die DNA-Immunisierung zeigte. Ein Grund für den Ausbruch des Diabetes
könnte das Verhältnis zwischen Effektor- und Suppressorzellen sein. Aber auch die
Immunisierung von TCR-HA Mäusen selbst, stellt eine recht artifizielle Methode
dar. Die hohe Abweichung in der Menge an TCR-HA+ T-Zellen zwischen den
Tieren stellt eine Fehlerquelle für den Versuch dar. In einem weiteren murinen Typ
1 Diabetes Modell (NOD) konnte ein schützendes Potenzial der DZ-gerichteten
Protein-Immunisierung gezeigt werden. Auf Grund einer fehlerhaften zentralen
Toleranz in den NOD Mäusen werden autoreaktive T-Zellen im Thymus nicht
depletiert und es kann sich spontan ein Typ 1 Diabetes entwickeln [112]. Da diese
Tiere in der Peripherie auch keinen funktionellen Toleranzmechanismen besitzen
um autoreaktiven T-Zellen zu supprimieren, kommt es im frühen Stadium der
Entwicklung zu einer Vielzahl an auftretenden Autoimmunkrankheiten [8]. Die
92
6 Diskussion
Applikation des m63-konjugierten DEC205-Antikörpers führte zu einer Induktion von Antigen-spezifischen Treg, die die Diabetesvorfälle deutlich reduzieren
konnten [178].
Um die Immunisierung von TCR-transgenen Tieren zu vermeiden, wurde eine definierte Menge an transgenen T-Zellen in Wildtyp Mäuse transferiert und
anschließend die DNA-Immunisierung mit den EAk-Konstrukten durchgeführt.
Dabei führte die Immunisierung in der DZ-adressierten Gruppe nach sieben Tagen
zu einer Akkumulation/Expansion sowohl von HA-spezifischen CD4 T-Zellen als
auch von HA-spezifischen Treg in den poplitealen Lymphknoten. Somit konnte
die Deletion von Antigen-spezifischen T-Zellen als möglicher Grund für die zuvor
beobachtete reduzierte Immunogenität nach DZ-gerichteter Immunisierung ausgeschlossen werden. Ähnliche Ergebnisse wurden von Mahnke et al. beobachteten,
die nach einer Applikation eines OVA-konjugierten αDEC205 Antikörpers eine spezifische Proliferation von CD4 T-Zellen, sowie die Induktion von Treg detektierten
[148].
Um zu überprüfen, ob die induzierten Treg einen suppressiven Einfluss auf
aktivierte Effektorzellen haben, wurde ein ähnliches Immunisierungsschema wie
von Kretschmer et al. verwendeten [122]. Dazu wurden TCR-transgene T-Zellen in
Wildtyp Mäuse transferiert und diese anschließend immunisiert. Das suppressive
Potenzial der induzierten Treg sollte anhand transferierter Antigen-spezifischen
Effektorzellen, die gleichzeitig durch eine Proteinimmunisierung aktiviert wurden,
ermittelt werden. Kretschmer et al. konnten zeigen, dass Tiere, denen zuvor αDECHA appliziert wurde, eine geringere Menge transferierter Effektorzellen in den
inguinalen Lymphknoten zeigten, sowie eine niedrigere IL-2 Produktion dieser
Zellen nach Proteinimmunisierung. Dieses suppressive Verhalten der transferierten
Effektorzellen nach einer Proteinimmunisierung deutet auf eine Anwesenheit von
aktiven Tregs hin. Hingegen führte die DZ-gerichtete DNA-Immunisierung in
der vorliegenden Arbeit zu keiner Veränderung der Mengen an exogenen Zellen
oder der IL-2 Produktion, weder in den inguinalen Lymphknoten noch in anderen
lymphatischen Organen. Überraschenderweise reduzierte sich die Produktion aller
untersuchten Zytokine in den endogenen CD4 T-Zellen aktiv, wodurch die Werte
in den poplitealen Lymphknoten deutlich unter denen der naiven Gruppe lagen.
Dadurch zeigte sich, dass durch die DNA-Immunisierung die T-Zellen in der
Peripherie bzw. nahe der Immunisierungsstelle in einen anergen Status verfallen
und sich nicht mehr zur Zytokinproduktion restimulieren lassen.
Um die Induktion der peripheren Toleranz und deren Effekt in einem allergischen Mausmodell zu untersuchen, wurden OVA-konjugierte EAk-Konstrukte
verwendet und die induzierte Immunantwort verifiziert. Nach einmaliger Immunisierung mit dem DZ-gerichteten Konstrukt wurde, ähnlich zum HA-Modell,
eine Reduktion der IFN-γ Produktion gegenüber der Kontrollgruppe in Milzzellen
detektiert. Diese Tendenz der erhöhten IFN-γ Produktion in der Kontrollgruppe
wurde durch die Analyse der Zellkulturüberstände nach einer in vitro Langzeitstimulation im ELISA bestätigt. Demnach scheint die Immunisierung mit dem
OVA-konjugierten Kontrollkonstrukt eine Th1 lastige Immunantwort zu induzie-
93
6 Diskussion
ren. Im Anschluss sollte der Einfluss der Konstrukte auf die Ausprägung eines
OVA-induzierte asthmatischen Phänotyps untersucht werden.
Der asthmatische Phänotyp ist durch eine dominante Th2 Differenzierung der
T-Zellen gekennzeichnet. Um den Phänotyp beeinflussen zu können, müsste entweder das Differenzierungsgleichgewicht der T-Helferzellen Richtung Th1 verschoben oder die OVA-spezifischen Th2 Zellen inhibiert werden. Durch die vorherigen
Experimente konnte gezeigt werden, dass die DZ-gerichtete DNA-Immunisierung
Antigen-spezifische T-Zellantworten supprimieren kann. Durch eine prophylaktische DNA-Immunisierung mit dem DZ-gerichteten Konstrukt und ebenfalls mit
dem Kontrollkonstrukt konnte ein Einfluss auf den asthmatischen Phänotyp genommen werden. Unter anderem konnte die Eosinophilie in der BAL reduziert
werden, das Verhältnis der Antikörpersubklassen IgG1 und IgG2a ausgeglichen
werden, die Produktion von Th2-assoziierten Zytokinen nach OVA-Restimulation
von Lymphozyten aus der Lunge reduziert, sowie die Aktivierung und Produktion
von Mucin durch Becherzellen inhibiert werden. Dabei konnte zu keinem Zeitpunkt ein Unterschied zwischen den Immunisierten Gruppen entdeckt werden,
was darauf schließen läßt, dass beide Konstrukte gleich effektiv den asthmatischen
Phänotyp durch eine prophylaktische Immunisierung beinflussen können. Dabei
bedienen sich die verwendeten Konstrukte möglicherweise unterschiedlicher Mechanismen. Während das Kontrollkonstrukt eine Th1 Differenzierung induziert um
somit die Th2 Verschiebung abzuschwächen, könnte das DZ-adressierte Konstrukt
die OVA-spezifischen T-Zellen in einen anergen Zustand versetzen.
Im Gegensatz zu der prophylaktischen Immunisierung konnte die therapeutische keinen Einfluss auf die bereits ausdifferenzierten Th2 Zellen nehmen. Dadurch
konnte bei keinem der analysierten Parameter des asthmatischen Phänotyps ein
Unterschied zwischen den immunisierten Gruppen und der Asthma Gruppe beobachtet werden. Die bereits ausdifferenzierten Th2 T-Zellen können vermutlich
nicht mehr verändert werden, da sie nicht mehr mit den adressierten DZ interagieren. Daher wäre ein therapeutischer Ansatz die Induktion von suppressiven
Treg oder die Verschiebung in Richtung Th1 durch einen starken Stimulus. Unterschiedliche Gruppen induzierten durch Applikation mit Lösungen, die Mikroben
oder mikrobielle Substanzen enthielten, wie z.B. Bacillus Calmette-Guérin [89]
oder das Typ 2 Allergen von Dermatophagoides pteronyssinus in Kombination
mit dem pilzartigen immunmodulatorischen Peptid [137], einen Wechsel der TZelldifferenzierung zu Th1. Eine zu starke Th1 Differenzierung kann neben der
erhöhten Inflammation auch zu einer starken Immunpathologie führen, die die
Struktur des Lungengewebes zerstört. Für den Schutz des Lungengewebes gegen
eine exzessive Immunantwort sorgen Treg, die versuchen eine Pathologie zu unterbinden. Diese Treg spielen sowohl bei einer allergischen Reaktion in der Lunge als
auch bei respiratorischen Infektionen eine große Rolle.
Ein möglicher Ansatz um die asthmatischen Symptome weiter zu reduzieren
wäre eine lokale Immunisierung in der Lunge. Die vorangegangenen Versuche
zeigten eindeutig, dass der stärkste suppressive Effekt in dem nächstgelegenen
lymphatischen Organ von der Immunisierungsstelle aus stattfindet. Da bei einem
94
6 Diskussion
DNA-Transfer in der Lunge keine Elektroporation möglich ist, gibt es andere
Verfahren wie die Verwendung von PEI als Träger für die DNA [229] oder auch
virale Vektorsysteme, wie z.B. adenovirale Vektoren [242]. Um einen eindeutigen
Unterschied zwischen den beiden verwendeten Konstrukten zu erhalten, könnte
der Einfluss der Immunisierung auf eine Th1-gesteuerte allergische Reaktion untersucht werden. Dadurch würde der immunmodulatorische Effekt des Kontrollkonstruktes eher zu einer Verstärkung der Reaktion führen, während das DZ-gezielte
Konstrukt weiterhin suppressiv auf die zelluläre Immunantwort wirken müßte.
Mögliche Modelle wären das experimentelle allergische Enzephalomyelitis Modell
[183] oder das Modell einer CD8 T-Zell-gesteuerterten Kontakthypersensibilität
[148].
Zusammenfassend läßt sich sagen, dass die DZ-gerichtete DNA-Immunisierung
zu einer reduzierten Immunantwort, sowie zu einer Induktion von Treg führte.
Während in einem transgenen Diabetes Modell kein suppressiver Effekt der induzierten Treg beobachtet werden konnte, führte die prophylaktische Immunisierung
in dem OVA-induzierten Asthma Modell zu einer Linderung der Krankheitssymptome. Weitere Untersuchungen, z.B. unter Verwendung von Expressionsplasmiden für Toleranz-fördernde Proteine oder die Koapplikation von Substanzen, sind
nötig, um eine verstärkte periphere Toleranz zu erreichen. Auf Grund der hohen
Flexibilität des Modells könnte es leicht für die Verwendung gegen immer häufiger
auftretenden unterschiedlichen allergischen Erkrankungen in industrialisierten
Ländern angepaßt werden.
In dem zweiten Projekt dieser Arbeit wurde der Einfluss der Treg auf eine Influenza A Virus Infektion untersucht. Aus der Literatur ist bekannt, dass Treg
unterschiedliche Eigenschaften übernehmen können. Für eine genauere Untersuchung der Eigenschaften wurden die Treg depletiert und die Auswirkungen
auf die Immunantwort analysiert. Die wenigen bisher durchgeführten Studien
verwenden für die Depletion der Treg bisher den αCD25 Antikörper, der nach
Bindung die Zelle inaktiviert [117] oder depletiert [201]. Der Nachteil dieses Antikörpers ist seine unspezifische Depletion von CD25 exprimierenden Effektorzellen.
Durch die Verwendung des DEREG Modells besteht die Möglichkeit natürlich
Treg seletiv zu depletieren. Die Expression des Fusionsproteins, bestehend aus
dem Diphtherietoxin-Rezeptor und einem grünfluoreszierenden Protein, unter der
Kontrolle des Foxp3 Lokus ermöglicht durch die Applikation von Diphtherietoxin
die Induktion von Apoptose in den Zellen [127]. Diese selektive Depletion der Treg
gewährt eine genauere Betrachtung der Immunantwort.
Die Depletion der Treg führt zu ekzessiven pulmonalen Entzündungen während
der Infektion mit dem respiratorischen Synzytial Virus (RSV) [70, 187]. Außerdem
zeigte sich durch die Depletion der Treg vor einer Herpes Simplex Virusinfektion
eine reduzierte Rekrutierung von Immunzellen, wodurch ein fataler Infektionsverlauf beobachtet wurde [143].
In dieser Arbeit konnte nach einer Influenza A Virusinfektion eine erhöhte
Menge an Treg in der BAL, Lunge und Milz sieben Tage nach der Infektion nach-
95
6 Diskussion
gewieser werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen die bereits publizierten
Beobachtungen von Betts et al. [25, 26].
Eine effiziente Depletion der Treg während der akuten Infektionsphase hatte
keinen Einfluss auf die virale Beladung, wobei sie sich aber negativ auf den Krankheitsverlauf, sowie die Überlebensrate auswirkte. Ähnliche Beobachtungen der in
der viralen Beladung wurden nach Depletion der Treg mit einem αCD25 Antikörper gemacht [25]. Hingegen liegt der fehlende Unterschied im Krankheitsverlauf
zwischen den depletierten und nicht-depletierten Tieren nach Infektion in der
Studie von Betts et al. möglicherweise an der αCD25 Depletion. Neben den Treg
depletiert der Antikörper auch CD25 präsentierende aktivierte Effektorzellen, was
zu einer vorrübergehenden Linderung der Immunpathologie führt und somit für
den ähnlichen Gewichtsverlauf sowie die gleiche Überlebensrate sorgt. Damit zeigt
sich, dass eine selektive Depletion der Treg von großem Vorteil ist um einen genaue
Reaktion des Organismus auf die virale Infektion zu untersuchen.
Der Grund für die unterschiedlichen Krankheitsverläufe liegt in der fehlenden
Suppression der Virus-induzierten Aktivierung der zellulären Kompartimente
in der Lunge. Die selektive Depletion der Treg sorgt für eine deutlich höhere
Mengen an infiltrierenden CD4 T- und CD8 T-Zellen, sowie NK Zellen in der
Lunge (vgl. Abb. 5.36) und für einen höheren Aktivierungsstatus der CD8 TZellen und NK Zellen. Diese Beobachtungen stimmen nur partiell mit denen
von Betts et al. überein. Betts et al. detektierten nur einen geringen Anstieg an
CD8 T-Zellen, während die Menge an an CD4 T-Zellen und NK Zellen sich kaum
veränderte. Dieser Unterschied ist vermutlich wieder auf die Art der Treg Depletion
zurückzuführen, da ebenfalls aktivierte, CD25-exprimierende, nicht-regulierende
CD4 T-Zellen durch die Applikation des αCD25 Antikörper depletiert werden [25].
Die erhöhte CD8 T-Zellantwort nach Depletion der Treg ist vergleichbar mit der
Situation im akuten Friend Virus Modell, in dem ebenfalls nach Treg Depletion im
DEREG Modell sich die CD8 Antworten verbesserten [251]. Dabei bestätigen die
H&E gefärbten Lungenschnitte die bereits im FACS gemessenen Tendenzen einer
massiven Infiltration von lymphoiden Immunzellen in das Lungengewebe.
Zusammenfassend läßt sich sagen, dass die Funktion der Treg bei einer Influenza
A Virus Infektion sich auf die Suppression der Virus-induzierten Immunantwort
beschränkt um eine schwere Immunpathologie zu unterbinden. Das Wissen über
das Gleichgewicht zwischen der Virus-induzierten Pathologie und der Immunpathologie wäre wichtig für die Entwicklung von antiviralen Therapien. Dabei
ist die Eliminierung des viralen Pathogens unter Berücksichtigung der Aktivierung der Immunsystems von großem Vorteil. Ebenfalls ist das Wissen essentiell
für Menschen, die sich mit dem hoch infektiösen Pathogen infizieren aber auf
Grund von genetischen Defekten oder fehlendem Thymus keine Treg besitzen.
Weitere Analysen wären von Vorteil, um die genaue Auswirkung der Abwesenheit
der Treg auf das Lungengewebe, sowie den Sauerstoffhaushalt des Organismus
festzustellen und potenzielle Folgeschäden abschätzen zu können.
96
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
2.1
Mögliche Differenzierung von naiver CD4 T-Helferzelle nach Interaktion mit Antigen-präsentierenden DZ. Quelle: Adaptiert von
[173] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Einfluss des Reifestadiums einer Antigen-präsentierenden DZ auf
die Differenzierung der naiven T-Zellen. Quelle: modifiziert Abbildung [97] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
4.1
Aufbau der Blot-Kassette . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
5.1
Die verwendeten Expressionskassetten mit dem jeweiligen gekoppelten Antigen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Expression der Konstrukte und Präsentation des gekoppelten Antigens in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Versuchsaufbau zur Analyse der Immunantwort nach einer zweimaligen DNA-Immunisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Induzierte zelluläre Immunantwort nach den jeweiligen DNA-Elektroporation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
HA-spezifische Antikörperantworten nach den jeweiligen DNAImmunisierungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Humorale Immunantwort nach den jeweiligen DNA-Immunisierungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Krankheitsverlauf nach Immunisierung und Infektion mit homologen Virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Versuchsaufbau zur Analyse des Einflusses der Koapplikation eines
IL-12 Expressionsplasmids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zelluläre Immunantwort nach den jeweiligen DNA-Immunisierungen
und der Koapplikation eines IL-12 Expressionsplasmids . . . . . .
Antikörperantwort nach zweimaliger DNA-Immunisierung und der
Koapplikation eines IL-12 Expressionsplasmids . . . . . . . . . . . .
Krankheitsverlaufes nach viraler Infektion von immunisierten und
IL-12 koapplizierten Mäusen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Einfluss der Adressierung des Antigens auf Antigen-spezifischen
T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Einfluss der Adressierung des Antigens auf die Immunantwort . .
Versuchsaufbau zur Analyse der induzierten Treg . . . . . . . . . .
2.2
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
5.10
5.11
5.12
5.13
5.14
7
50
51
52
53
54
55
56
58
59
60
61
62
63
64
97
Abbildungsverzeichnis
5.15 Einfluss der direkten Adressierung auf spezifischen T-Zellen . . . .
5.16 Direkte Antigen-Adressierung induziert supprimierte T-Zellproliferation in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.17 Versuchsaufbau zur Analyse der induzierter Treg auf ihre suppressiven Eigenschaften in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.18 Induzierte suppressiven Treg im in vivo Diabetes-Modell . . . . . .
5.19 Analyse des Einflusses auf Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen . . .
5.20 Schicksal von transferierten Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen nach
DZ-Adressierung des Antigens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.21 Versuchsaufbau zur Analyse des Einflusses von modulierten Antigenspezifischen CD4 T-Zellen auf die Aktivierung von Effektorzellen .
5.22 Einfluss der modulierten Antigen-spezifischen CD4 T-Zellen auf
Effektorzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.23 Versuchsaufbau zur Verifizierung der reduziert Immunantwort mit
dem gekoppelten OVA Antigen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.24 Zelluläre Immunantwort nach direkter Adressierung von OVA . .
5.25 Einfluss der direkten Adressierung von OVA auf das Zytokinprofil
von Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.26 Versuchsaufbau zur Untersuchung des Einflusses der direkten Adressierung von OVA auf die Ausprägung von Asthma . . . . . . . . .
5.27 Einfluss der prophylaktischen OVA-Adressierung auf den asthmatischen Phänotyp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.28 Prophylaktische Immunisierung beeinflusst die humorale immunantwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.29 Histologische Untersuchung des asthmatischen Phänotyps mittels
PAS gefärbten Lungenschnitten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.30 Einfluss der semi-therapeutisch OVA-Adressierung auf den asthmatischen Phänotyp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.31 Semi-therapeutische Immunisierung beeinflusst die humorale immunantwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.32 Veränderungen der Menge an Treg nach einer Influenza Infektion .
5.33 Einfluss der Influenza Virusinfektion auf die Menge an Treg . . . .
5.34 Einfluss der Treg Depletion auf die Influenza Infektion . . . . . . .
5.35 Krankheitsverlauf bei Abwesenheit von Treg während der akuten
Phase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.36 Einfluss der Treg Depletion auf die Immunantwort in der Lunge
nach Infektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.37 Histologische Untersuchung der Zellinfiltration nach Depletion von
Treg und Influenza Infektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
98
64
65
66
67
68
69
71
71
72
73
74
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76
77
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79
80
82
82
83
83
84
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125
b Emscherstr. 30
44791 Bochum
H +49 (0) 176 64201656
B [email protected]
Thomas Niezold
MSc der Biochemie
BSc der Biochemie
Persönliche Daten
Name:
Adresse:
Geburtstag:
Geburtsort:
Nationalität:
Thomas Niezold
Emscherstr. 30, 44791 Bochum
04.02.1984
Lübben
Deutsch
Studium und Promotion
12/2009
Promotion in der Biochemie, Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie, Ruhr-Universität, Bochum, Deutschland.
11/2009
Einfluss der Adressierung des Antigens durch Immunisierung mit DNA-kodierten
Einzelkettenantikörpern auf die Aktivierung von T-Zellen
MSc in Biochemie (1,3/sehr gut), Abteilung für Molekulare und Medizinische
Virologie, Ruhr-Universität, Bochum, Deutschland.
10/2007
09/2007
10/2004
DNA-Elektroporationsimmunisierung zur zielgerichteten Antigenaufnahme durch
Dendritische Zellen: Immunität oder Toleranz
BSc in Biochemie (2,6/befriedigend), Abteilung für zelluläre Physiologie, RuhrUniversität, Bochum, Deutschland.
Herstellung eines Tbx3-YFP Fusionsprotein-kodieren Expressionsvektors
Deutsche Bundeswehr
03-09/2004
Deutsche Bundeswehr, Panzergrenadier, Hagenow, Deutschland.
Schulische Ausbildung
06/2003
10/1996
09/1996
10/1993
09/1993
10/1991
09/1991
10/1990
Paul-Gerhardt-Gymnasium, Lübben, Deutschland.
Grundschule, Neu Lübbenau, Deutschland.
2. Grundschule, Lübben, Deutschland.
4. Oberschule, Lübben, Deutschland.
Veröffentlichungen
09/2014
• Overcoming a bias in the quality of the HIV-1 Env-specific antibody re-
sponse by intrastructural help, Storcksdieck genannt Bonsmann, Niezold et al.,
ready for submission.
08/2014
• DNA vaccines encoding DEC205-targeted antigens:
Immunity or Tolerance?, Niezold et al., submitted to Immunology, 2014 Aug 26.
08/2014
• Divergence of primary cognate B- and T-cell proliferative responses to sub-
cutaneous and intravenous immunization with virus-like particles of HIV,
Temchura, Kalinin, Nabi, Tippler, Niezold et al., Viruses, 2014 Aug 22.
08/2013
Protective efficacy and immunogenicity of a combinatory DNA vaccine
against Influenza A virus and the Respiratory Syncytial Virus, Stab, Nitsche,
Niezold et al., PLoS One, 2013 Aug 14.
04/2013
Comparison of polysterene nanoparticles and UV-inactivated antigendisplaying adenovirus for vaccine delivery in mice, Johrden, Tenbusch, Lietz,
Bonsmann, Niezold et al., Virol J., 2013 Apr 5.
•
•
04/2010
•
Codon-optimization of the hemagglutinin gene from the novel swine origin
H1N1 influenza virus has differential effects on CD4(+) T-cell responses and
immune effector mechanisms following DNA electroporation in mice., Tenbusch, Grunwald, Niezold et al., Vaccine, 2010 Apr 26.
Konferenzen
09/2013
•
Cellular unresponsiveness induced by DNA vaccines encoding DEC205targeted antigen, Poster, 43th Annual Meeting DGfI, Mainz, Deutschland.
•
Induction of antigen-specific regulatory T-cells by DNA vaccines encoding
DC-targeted antigens, Poster, Vaccine Congress, Shanghai, China.
10/2012
09/2011
•
Induction of antigen-specific regulatory T-cells by DNA vaccines encoding
DC-targeted antigen-coupled single-chain antibodies, Poster, Joint Annual
Meeting SIICA - DGfI, Riccione, Italien.
09/2010
The influence of targeting an encoded Influenza HA-protein to dendritic
cells on cellular and humoral immune responses to DNA vaccines, Poster,
2nd International Influenza Meeting, Münster, Deutschland.
09/2010
Cellular and humoral immune responses to DNA vaccines encoding dendritic cell targeted Influenza HA-protein, Poster, 40th Annual Meeting DGfI,
Leipzig, Deutschland.
•
•