Tierärztliche Hochschule Hannover Arbeitsgruppe Immunologie
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Tierärztliche Hochschule Hannover Arbeitsgruppe Immunologie _____________________________________________________________ Untersuchungen zur Beeinflussung funktioneller Eigenschaften von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten in der initialen Phase der bovinen Mastitis INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) vorgelegt von Sonja Meyer aus Wildeshausen Hannover 2008 Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. M. Hoedemaker Tag der mündlichen Prüfung: 21. Mai 2008 Gefördert im Rahmen des DFG-Projektes FOR585 (Pathogen-spezifische Abwehrmechanismen in der Milchdrüse) durch Personal- und Sachmittel Meiner Familie Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 1 Einleitung und Zielsetzung ............................................................................................. 13 2 Literaturübersicht............................................................................................................ 15 2.1 Die Mastitis des Rindes.................................................................................... 15 2.1.1 Definition und Einteilung ............................................................................ 15 2.1.2 Ätiologie und Pathogenese .......................................................................... 16 2.1.3 Erregerspezifische Mechanismen ................................................................ 17 2.2 Immunrelevante Zellen der Milchdrüse ........................................................... 21 2.2.1 Die funktionelle Relevanz der Leukozyten.................................................. 21 2.2.2 Zellpopulationen in der Milch einer gesunden Milchdrüse ......................... 33 2.2.3 Zellpopulationen in der Milch nach Infektion der Milchdrüse.................... 35 2.2.4 Die funktionelle Relevanz der Milchdrüsenepithelzelle für die Immunabwehr .............................................................................................. 36 2.3 Immunrelevante lösliche Faktoren in der Milch .............................................. 39 2.3.1 Zytokine ....................................................................................................... 39 2.3.2 Histamin....................................................................................................... 41 2.3.3 Andere lösliche Faktoren ............................................................................. 43 2.4 Formen des Zelltodes ....................................................................................... 43 3 2.4.1 Signalwege der Apoptose ............................................................................ 45 2.4.2 Modulation der Apoptose bei neutrophilen Granulozyten........................... 47 2.4.3 Die Rolle der Mitochondrien in der Apoptose............................................. 51 2.5 Mastitis-Infektionsmodelle............................................................................... 52 Geräte, Material und Methoden ...................................................................................... 55 3.1 Geräte ............................................................................................................... 55 3.2 Material ............................................................................................................ 56 3.2.1 Klinikbedarf ................................................................................................. 56 3.2.2 Laborbedarf.................................................................................................. 57 3.2.3 Reagenzien................................................................................................... 58 3.2.4 Versuchstiere................................................................................................ 60 3.2.5 Bakterienstämme.......................................................................................... 61 3.2.6 Antikörper für die Membranimmunfluoreszenz und zur Herstellung von Referenzzellen....................................................................................... 61 3.2.7 Antikörper und rekombinante Zytokine im ELISA ..................................... 63 3.2.8 Kulturmedien, Puffer und Lösungen............................................................ 63 3.3 Methoden.......................................................................................................... 70 3.3.1 Gewinnung von venösem Blut..................................................................... 70 3.3.2 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen ................................................. 70 3.3.3 Gewinnung neutrophiler Granulozyten........................................................ 71 3.3.4 Durchflusszytometrie................................................................................... 72 3.3.5 Vitalitätsbestimmung von Zellen ................................................................. 73 3.3.6 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode)............................................. 73 3.3.7 Herstellung von Referenzzellen................................................................... 74 3.3.8 Durchflusszytometrische Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen ........................................................................................................... 74 3.3.9 Experimentelle Infektion einzelner Euterviertel .......................................... 77 3.3.10 Erhebung und Beurteilung Euter-spezifischer und allgemein klinischer Parameter ..................................................................................................... 79 3.3.11 Bakteriologische Untersuchung der Milchproben ....................................... 80 3.3.12 Analyse der Milchzellen .............................................................................. 81 3.3.13 Gewinnung von Milchserumproben ............................................................ 84 3.3.14 Bestimmung des Histamingehaltes durch den Radioimmunoassay............. 84 3.3.15 Bestimmung des Zytokingehaltes durch den Enzyme-linked Immunosorbent Assay ................................................................................. 87 3.3.16 Methoden zur Untersuchung der Modulation der Apoptose durch Milchinhaltsstoffe in vitro............................................................................ 88 3.3.17 4 Gewinnung und Stimulation von primären bovinen Milchdrüsenepithelzellen............................................................................. 91 3.4 Statistische Verfahren ...................................................................................... 95 Ergebnisse....................................................................................................................... 98 4.1 Eutergesunde Tiere........................................................................................... 98 4.1.1 Klinische Symptome im Zeitverlauf............................................................ 98 4.1.2 Zellpopulationen in der Milch eutergesunder Tiere..................................... 99 4.1.3 Mediatoren in der Milch ............................................................................ 104 4.2 Infizierte Tiere................................................................................................ 106 4.2.1 Klinische Symptome im Zeitverlauf.......................................................... 106 4.2.2 Dynamik der Milchzellpopulationen nach Inokulation mit E. coli und S. aureus..................................................................................................... 109 4.2.3 Expression immunrelevanter Gene in infizierten und nicht-infizierten Kontroll-Eutervierteln................................................................................ 118 4.2.4 5 6 7 8 Zytokingehalte der Milch........................................................................... 120 4.2.5 Histamingehalte der Milch......................................................................... 123 4.3 Funktionelle Beeinflussung der Überlebenszeit neutrophiler Granulozyten.............................................................................................. 126 4.3.1 Etablierung des Apoptosenachweises ........................................................ 126 4.3.2 Modulierender Einfluss von Zytokinen ..................................................... 129 4.3.3 Modulierender Einfluss von Milchseren und deren Inhaltsstoffen............ 132 4.3.4 Regulation der Zellvitalität durch Histamin in vitro.................................. 137 4.3.5 Die Rolle der Milchdrüsenepithelzelle ...................................................... 139 Diskussion..................................................................................................................... 142 5.1 Das Tiermodell ............................................................................................... 142 5.1.1 Zelluläre Reaktionen nach Inokulation von E. coli ................................... 145 5.1.2 Zelluläre Reaktionen nach Inokulation von S. aureus ............................... 146 5.1.3 Lösliche Faktoren in der Milch.................................................................. 147 5.1.4 Beeinflussung benachbarter Euterviertel durch die Inokulation mit Erregern...................................................................................................... 149 5.2 In-Vitro-Untersuchungen zur Klärung des Einflusses von Milchinhaltsstoffen auf die Vitalität von neutrophilen Granulozyten ....... 151 5.2.1 Methodischer Ansatz ................................................................................. 152 5.2.2 Einfluss von Milchseren gesunder und infizierter Milchdrüsen ................ 153 5.2.3 Einfluss von Zytokinen .............................................................................. 155 5.2.4 Einfluss von Histamin................................................................................ 156 5.2.5 Einfluss aktivierter Milchdrüsenepithelzellen ........................................... 157 Zusammenfassung ........................................................................................................ 159 Summary....................................................................................................................... 162 Literaturverzeichnis ...................................................................................................... 165 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Abb. AIF Abbildung apoptosis inducing factor APAF 1 Aqua dest. apoptosis activating factor-1 Aqua destillata (destilliertes Wasser) Aqua tridest. ATP Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) Adenosin-5′-triphosphat bspw. bzw. beispielsweise beziehungsweise C3b C5a opsonisierendes Fragment der Komplementkomponente C3 opsonisierendes Fragment der Komplementkomponente C5 CD CMT CO2 cluster of differentiation California Mastitis Test Kohlenstoffdioxid cpm CXCL8 DISC DMSO DNA E. coli EDTA ELISA counts per minute (Zählereignisse pro Minute) Interleukin-8 death inducing signalling complex Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure Escherichia coli ethylendiamine-tetraacetic acid (Ethylendiamintetraacetat) enzyme linked immunosorbent assay (Enzym-gekoppelter Immunadsorbtionstest) et alii (lateinisch: und andere) fluorescence activated cell scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät) fragment cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy-terminales Fragment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung) Carbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazon flow cytometer (Durchflusszytometer) fetal calf serum (Fetales Kälberserum) Fluoresceinisothiocyanat Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz et al. FACScan® Fc FCCP FCM FCS FITC FL-1, -2, -3 FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FSC FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm forward scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® g G-CSF ggr. GM-CSF Gst h H2O HBSS HBSS+ hgr. HL HR HSP i.d.R. I10F+ ICAM IFN Ig IL iNOS JC-1 KbE L LBP LFA LMU LPS LTA LTB4 LTC4 m mAK Gramm granulocyte-colony stimulating factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) geringgradig granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (GranulozytenMakrophagen-Wachstumsfaktor) Goldstandard hora (lateinisch: Stunde) Wasser Hanks Balanced Salt Solution Hanks Balanced Salt Solution mit Antibiotikumzusatz hochgradig hinteres linkes Euterviertel hinteres rechtes Euterviertel heat shock protein (Hitze-Schock Protein) in der Regel Iscove®-Medium mit L-Glutamin, Antibiotikumzusatz und 10% fetalem Kälberserum intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül) Interferon Immunglobulin Interleukin induzierbare Stickoxid Synthetase 5, 5´, 6, 6´-Tetrachloro-1, 1´, 3, 3´-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid Kolonie-bildende Einheiten Liter lipopolysaccharid-binding protein leukocyte function antigen (Leukozyten Funktionsantigen) Ludwig-Maximimilians-Universität Lipopolysaccharid Lipoteichonsäure Leukotrien B4 Leukotrien C4 milli (x10-3) monoklonaler Antikörper MAPK mgr. mol mAk µ MEC MHC MIF Min. mm µm MMP MNC mRNA mV MW n n= NaCl NADPH NET NFΚB NGF NO NSB o.B. p PAF PAMP pbMEC PBS PECAM PGE2 mitogen-activated protein kinase (Serine/Threonin-spezifische Proteinkinase) mittelgradig Mol monoklonale(r) Antikörper mikro (x10-6) Milchdrüsenepithelzelle major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) Membranimmunfluoreszenz Minute(n) Millimeter Mikrometer Mitochondrienmembranpotential mononuclear cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes) messenger RNA Millivolt arithmetischer Mittelwert nano (x10-9) bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen Natriumchlorid Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat-Wasserstoff neutrophil extracellular trap nuclear factor-kappa B (Transkriptionsfaktor) nerve growth factor nitric oxide (Stickstoffmonoxid) nicht-spezifische Präzipitationsserum-Bindung ohne Befund Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen platelet activating factor pathogen associated molecular pattern (Molekulare Muster von Erregern) primäre bovine Milchdrüsenepithelzelle phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) platelet endothelial cell adhesion molecule Progesteron E2 PGF 2α Prostaglandin F 2α PGN p.i. PJ PMA PMN Peptidoglykan post infectionem Propidiumjodid Phorbol-12 Myristate-13 Acetate polymorphonuclear leukocytes (polymorphkernige neutrophile Granulozyten) pattern recognition receptor (Muster-Erkennungsrezeptor) Phosphatidylserin Radioimmunoassay (Radioimmuntest) RPMI-Medium mit Hepes, L-Glutamin, Antibiotikumzusatz und 10% fetalem Kälberserum reactive oxygen species (Reaktive Sauerstoffspezies) rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) Raumtemperatur Standardabweichung Staphylococcus aureus somatic cell count (Somatische Zellen in der Milch) soluble CD 14 (lösliches CD 14) Staphylococcus aureus Enterotoxin A standard error of the mean (Standardfehler des Mittelwertes) second mitochondria-derived activator of caspase/ direct IAP-binding protein with low pI (während Apoptose freigesetztes mitochondriales Protein) siehe oben so genannte(r) side scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® Streptococcus agalactiae Streptococcus dysgalactiae Streptococcus uberis Tabelle PRR PS RIA R10F+ ROS rpm RT s S. aureus SCC sCD 14 SEA SEM Smac/Diabolo s.o. sog. SSC Str. agalactiae Str. dysgalactiae Str. uberis Tab. TCRi-24 T-Cell Receptor i-24 (γδ-T-Zellrezeptor) Th1, Th2 TLR TNF TRAIL TRAMP bezeichnet den Phänotyp einer T-Helfer-Zelle 1 oder 2 toll-like-receptor (Toll-ähnlicher-Rezeptor) tumor necrosis factor (Tumornekrosefaktor) TNF-related apoptosis-inducing ligand TNF-receptor related apoptosis mediating protein u.a. v.a. vgl. VL VR xg v/v z.B. z.T. unter anderem vor allem vergleiche vorderes linkes Euterviertel vorderes rechtes Euterviertel multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²) Volumen pro Volumen zum Beispiel zum Teil 13 1 Einleitung und Zielsetzung Die bovine Mastitis ist eine der bedeutendsten Einzelerkrankungen in der Milchviehhaltung (MILLER et al. 1993). Jährlich erkranken etwa 30% der Kühe an einer Mastitis, die mit hohen Kosten bzw. Verdienstausfällen verbunden sind (SEEGERS et al. 2003). Beim Rind werden die Infektionen durch ein Spektrum unterschiedlicher Bakterien und Pilze hervorgerufen. Staphylococcus aureus und Escherichia coli sind die häufigsten Erreger der gram-positiven bzw. gram-negativen Bakterien, die klinische Mastitiden verursachen. Als gram-positiver Erreger führt Staphylococcus aureus oft zu subklinisch verlaufenden, chronischen Infektionen, bei denen sich die Erreger in das interstitielle Gewebe der Drüse einnisten (SUTRA u. POUTREL 1994). Diese chronischen Infektionen verursachen etwa 80% der wirtschaftlichen Gesamtschäden. Außerdem stellen sie im Hinblick auf AntibiotikaRückstände in der Milch ein Problem für die Lebensmittelsicherheit dar (TENHAGEN et al. 2006). Intramammäre Infektionen mit dem gram-negativen Pathogen E. coli rufen fast immer akute Mastitiden hervor, die meist durch einen schwerwiegenden Verlauf gekennzeichnet sind. In Einzelfällen kann es zur Septikämie und sogar Versterben des betroffenen Tieres kommen. Der immunologische Hintergrund für die unterschiedliche Abwehrfähigkeit des Wirtes gegenüber verschiedenen Pathogenspezies ist weitgehend ungeklärt. Generelles Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion zwischen Erregern, Milchdrüsenepithelzellen und somatischen Zellen der Milch in der frühen Entzündungsphase vergleichend zwischen Staphylococcus aureus und Escherichia coli zu untersuchen. Dafür sollte ein MastitisModellsystem etabliert werden, in dem Tiere definierten Alters, Laktationsstadiums und Milchzellzahl eingesetzt werden, um mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit initiale Signal- und Abwehrmechanismen erfassen zu können. Der vorliegenden Arbeit liegt die Annahme zu Grunde, dass Erkennungs- und Immunmechanismen in der frühen Phase der Milchdrüsen-Infektion von entscheidender Bedeutung sind. Die Analyse des Tiermodells sollte daher in einem zweiten Teil der Arbeit um funktionelle Analysen ergänzt werden, welche insbesondere die Rolle von Milchdrüsenepithelzellen und Mastzellen beleuchten. Die Erkennung von Pathogenen oder ihren Bestandteilen kann durch verschiedene Zellen erfolgen. Als sog. Sensorzellen kommen in der Milchdrüse Milchdrüsenepithelzellen und Mastzellen hypothetisch in Frage. Von beiden Zelltypen konnte gezeigt werden, dass sie entsprechende Erregerrezeptoren exprimieren und in der Lage sind, nach der Erkennung immunmodulatorische Mediatoren zu sezernieren (GOLDAMMER et al. 2003; WELLNITZ u. KERR 2004; YANG et al. 2008). Von Mastzellen ist überdies bekannt, dass sie in verschiedenen Infektionsmodellen eine überragende Funktion einnehmen (MARSHALL 2004). Die Funktionalität dieser Sensorzellen kann somit entscheidend für die 14 Anlockung und die Regulation der Haupteffektorzellen bei der bovinen Mastitis – die neutrophilen Granulozyten - sein. Insofern galt ein Hauptaugenmerk in dieser Arbeit der Regulation dieser Zellpopulation. Hier stand der Zelltod, sowohl die Apoptose als auch die Nekrose im Vordergrund, da die Modulation der Lebensspanne dieser Zellpopulation vor Ort von elementarer Bedeutung für die Homöostase des Systems, das Abklingen der Entzündung und letztlich für die funktionelle Kapazität dieser Haupteffektorzellpopulation ist. Um die Apoptose, vermittelt über Zytokine, Histamin und generelle Milchinhaltsstoffe, zuverlässig charakterisieren zu können, sollte ein sensitives Nachweisverfahren etabliert werden. 15 2 Literaturübersicht 2.1 Die Mastitis des Rindes 2.1.1 Definition und Einteilung Als Mastitis wird die Entzündung der Milchdrüse in der Gesamtheit ihrer milchbildenden, speichernden und ableitenden Abschnitte bezeichnet, die nahezu ausschließlich infektiös bedingt ist. Es sind sowohl akute als auch chronische, sowie klinische und subklinische Verläufe möglich. Eine scharfe Trennung zwischen einer gesunden und einer kranken Milchdrüse ist wie bei jedem anderen Organ nicht möglich. Um eine Orientierung dennoch zu ermöglichen, hat die Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft (DVG) auf Grundlage der Erkenntnisse von HESS und EGGER (1969) sowie REICHMUTH (1975) vier Kategorien der Eutergesundheit definiert, wobei für die Beurteilung zytologisch-mikrobiologische Befunde von Viertelanfangsgemelksproben festgelegt wurden (Tab. 1). Tab. 1 Beurteilung zytologischer und mikrobiologischer Befunde im Rahmen der Mastitis-Kategorisierung (DVG 1994). Euterpathogene Mikroorganismen Nicht nachgewiesen Nachgewiesen < 100.000 SCC/mL Normale Sekretion Latente Infektion > 100.000 SCC/mL Unspezifische Mastitis Mastitis Diese Definition gilt für die Untersuchung von Viertelgemelksproben, die zur üblichen Melkzeit aus dem Anfangsgemelk von Kühen in normaler Laktation entnommen wurden. Die Festlegung der Zellzahlen beruht auf Untersuchungen des Zellgehalts im Viertelanfangsgemelk ungeschädigter Euter von Erstkalbinnen (HESS u. EGGER 1969; REICHMUTH 1975; DOGGWEILER u. HESS 1983). Der Modalwert (Maximum der Häufigkeitsverteilung) betrug 20.000 Zellen/mL. Die zweifache Standardabweichung, die in der Medizin übliche Sicherheitsgrenze der Norm, umfasste als obersten Wert 100.000 Zellen/mL. 16 2.1.1.1 Verlaufsformen der Mastitis Euterentzündungen treten in unterschiedlichen Verlaufsformen und in Verbindung mit verschiedenartigen klinischen Symptomen auf (HAMANN u. FEHLINGS 2002). Subklinische Mastitiden sind Entzündungen des Euters ohne äußerlich erkennbare Symptome, aber mit Vorliegen von erhöhter Zellzahl und dem Nachweis von Mastitiserregern. Eine geringgradige klinische Mastitis liegt beim Auftreten von Flocken in der Milch, insbesondere im Vorgemelk, ohne zusätzliche klinische Symptome des Euters vor. Eine mittel- bis hochgradige klinische Mastitis besteht bei offensichtlichen Entzündungssymptomen des Euters wie erhöhte Temperatur, Schmerzen und Schwellung. Die Milch ist makroskopisch verändert und die Tiere zeigen häufig Fieber. Die Begriffe subakut, akut und chronisch beschreiben die zeitliche Dauer der Erkrankung. Eine chronische Mastitis ist durch ein nicht zur Ausheilung gekommenes langfristiges Erkrankungsgeschehen gekennzeichnet. Betroffene Euterviertel neigen zur Atrophie oder weisen zeitlebens anomale klinische oder subklinische Befunde auf. 2.1.2 Ätiologie und Pathogenese Die Mastitis wird durch Eindringen von pathogenen Mikroorganismen durch den Zitzenkanal und Vermehrung in der Milchdrüse hervorgerufen (BANNERMAN et al. 2004). Das Risiko einer Erkrankung kann durch traumatische, chemische und physiologische Einflüsse erhöht werden. Daher muss die Mastitis als eine multifaktorielle Erkrankung betrachtet werden, die durch das Rind als Wirt, dem Mikroorganismus als verursachendes Agens und durch Managementfaktoren beeinflusst wird (HOGAN u. SMITH 2003; OVIEDO-BOYSO et al. 2007). Von den über 135 verschiedenen Mikroorganismen, die aus bovinen intramammären Infektionen isoliert wurden, war ein großer Teil Bakterien, gefolgt von Pilzen (vor allem Hefen) und Algen (Prothoteken) (BRADLEY u. GREEN 2001). Der Nachweis von Viren ist schwer zu führen. Die DVG (1994) schlägt eine Einteilung nach Reservoiren der Mastitiserreger vor. Hier wird zum einen die infizierte Milchdrüse als Infektionsherd genannt, über den die Keime (z.B. S. aureus, Str. agalactiae oder Str. dysgalactiae) übertragen werden. Dies erfolgt in erster Linie über die Melkmaschinen in der Melkzeit oder über den Melker. Das zweite Reservoir ist die Umwelt, wozu E. coli, Str. uberis oder Klebsiellen zählen. Das Infektionsrisiko liegt hier vor allem in den Zwischenmelkzeiten. Im Falle von E. coli wird auch der hämatogene Infektionsweg diskutiert. Klinische Mastitiden werden überwiegend durch coliforme Keime, Streptokokken, Staphylokokken und Arcanobacterium pyogenes ausgelöst, subklinische Mastitiden werden durch Staphylokokken und Streptokokken verursacht (WIESNER u. RIBBECK 2000). 17 In der Trockenstehzeit und im peripartalen Zeitraum treten Mastitiden besonders häufig auf. Dies wird auf die massiven metabolischen und hormonellen Veränderungen in der peripartalen Phase zurückgeführt. In diesem Zusammenhang wird die pathogenetische Bedeutung erhöhter Plasmaketonkörper (SURIYASATHAPORN et al. 2000a) und die immunmodulatorische Kompetenz der peripartal stark veränderlichen Steroidhormone, wie Östrogene, Progesteron und Kortikosteroide diskutiert (WESSENDORF et al. 1998; SCHEIBL u. ZERBE 2000). Einen weiteren Einfluss auf die Anfälligkeit für Mastitis wird in der Zellzahl der Milch vermutet. Geringe Zellzahlen der Milch sollen die Anfälligkeit der Euter für Umwelterreger erhöhen (SURIYASATHAPORN et al. 2000b). 2.1.3 Erregerspezifische Mechanismen Da Staphylococcus aureus und Escherichia coli zu den häufigsten bovinen Mastitiserregern zählen (BARKEMA et al. 1998) und im experimentellen Mastitismodell diese Erreger eingesetzt wurden, fokussiert sich die folgende Darstellung auf diese beiden Keime. 2.1.3.1 Escherichia coli Escherichia coli (E. coli) ist ein säurebildendes, Laktose-fermentierendes, gram-negatives, stäbchenförmiges Bakterium, das zur Familie der Enterobacteriaceae gehört (HAHN et al. 2005). E. coli ist ein opportunistischer Mastitiserreger (BARROW u. HILL 1989; NEMETH et al. 1994). Im Gegensatz zu den enteropathischen und bakteriämischen Stämmen, die durch eine geringe Anzahl an E.-coli-Serotypen ausgelöst wird, gehören die aus bovinen klinischen Mastitiden isolierten E.-coli-Bakterien zu einer weiten Bandbreite an serologischen Gruppen. E.-coliSerotypen in Mastitismilch gleichen denen in Faeces (BURVENICH et al. 2003). In einer Studie konnten die für die Mastitis verantwortlichen Erreger im Darm desselben Tieres oder anderer Kühe und Kälber des Bestands gefunden werden (LINTON u. ROBINSON 1984). Eine intramammäre Infektion mit E. coli findet vermutlich überwiegend über das Eindringen durch den Zitzenkanal und eine Vermehrung im Lumen der Milchdrüse statt. Auch eine hämatogene Besiedlung des Euters ist möglich. Es bedarf weder einer Adhärenz am Drüsenepithel noch besonderer Virulenzfaktoren zur Manifestation einer intramammären Infektion mit E. coli (OPDEBEECK et al. 1988). Der Erreger besitzt die Eigenschaft, sich auch im Milchsekret zu vermehren. Voraussetzung ist die Laktoseverwertung und das Wachstum unter nahezu anaeroben Bedingungen. Zudem sind die Keime in der Lage, Milchinhaltsstoffe zu verstoffwechseln und können somit Populationsdichten von 108 Kolonie-bildenden Einheiten pro mL Milch erreichen (HOGAN et al. 1992) Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass 18 E. coli auch in der Trockensteherphase im Euter persistieren kann (BRADLEY u. GREEN 2001). 65% aller coliformen Mastitiden, die in den ersten zwei Monaten der Laktation auftreten, sollen auf eine Infektion in der Trockenstehphase zurückzuführen sein (SMITH et al. 1985). Im Sekret einer involutierenden Milchdrüse kann nur bedingt eine Vermehrung des Bakteriums stattfinden, da die limitierende nutritive Grundlage für E. coli, das Eisen, von hohen Konzentrationen Lactoferrin gebunden wird und den Bakterien nicht zur Verfügung steht (WELTY et al. 1976). Die Vermehrung des Keimes und die Störung des Allgemeinbefindens sind von der Effektivität und Schnelligkeit der Antwort der neutrophilen Granulozyten abhängig. Kapselproduzierende E.-coli-Stämme verursachen länger andauernde Euterinfektionen als E.-coli-Stämme, die keine Kapselbildung aufweisen (HILL et al. 1983). Intramammäre Infektionen mit E. coli führen fast immer zu akuten Mastitiden, die meistens durch einen schwerwiegenden Verlauf gekennzeichnet sind. Häufig wird eine hochgradige Störung des Allgemeinbefindens beobachtet. Die intramammäre Infektion mit E. coli kann zur Septikämie und vereinzelt zu Todesfällen führen. Ebenso wie das rasche Auftreten, findet aber auch oftmals eine zügige Heilung statt (HOGAN u. SMITH 2003). So dauert eine „ColiMastitis“ in der Regel während der Laktation weniger als zehn Tage (TODHUNTER et al. 1991) und wird durch den Einsatz von Antibiotika nicht wesentlich verkürzt (SMITH et al. 1985). Allerdings werden auch euteradaptierte E.-coli-Stämme gleicher Serotypen (LINTON u. ROBINSON 1984) und Genotypen bei wiederkehrenden Erkrankungen beschrieben (LIPMAN et al. 1995; BRADLEY u. GREEN 2001). Stämme, die rekurrente Mastitiden verursachen, vermochten in vitro schneller und in größerer Anzahl in Epithelzellen einzudringen als Stämme, die nur gelegentlich Mastitiden hervorrufen (DOPFER et al. 2000). 2.1.3.2 Lipopolysaccharid Lipopolysaccharid (LPS) ist der primäre Virulenzfaktor der gram-negativen Bakterien. Dieses Strukturmotiv ist charakteristisch für E. coli und phylogenetisch hoch konserviert. Aufgrund dieser Eigenschaften wird es den Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (engl. Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) zugeordnet. PAMPs werden durch pattern recognition receptors (PRRs) erkannt, die bei Immunzellen weit verbreitet sind. Eine Untergruppe der PRRs, die Toll-like-Rezeptoren, spielt eine wichtige Rolle bei der Auslösung einer Entzündungsreaktion. TLR4 ist der signaltransduzierende Rezeptor für LPS. Hierzu muss sich TLR4 gemeinsam mit CD14 und einem weiteren Molekül, dem MD2, zu einem trimolekula- 19 ren Komplex zusammenfügen, bevor LPS gebunden und die entsprechenden Aktivierungssignale transduziert werden können. Neben Phospholipiden und weiteren Membranproteinen ist LPS ein Bestandteil der äußeren Zellmembran von E. coli. Es besteht aus dem lipophilen Lipid A, dem Lipopolysaccharidkern und sich wiederholenden Polysaccharid-Einheiten, so genannten 0-Antigenen, die außen liegen (CULLOR u. TYLER 2001). Das Lipid A von dem der toxische Effekt des LPS ausgeht (TYLER et al. 1992) dient der Interaktion zwischen LPS und dem Lipopolysaccharidbindenden-Protein (LBP) und der Interaktion mit Lipoproteinen, sowie der Aktivierung des Komplementsystems (CULLOR u. TYLER 2001). Das an das LBP gebundene LPS wird CD14-abhängig durch den Toll-like-Rezeptor 4 der PMN und Epithelzellen der Milchdrüsen erkannt (STRANDBERG et al. 2005). Das LPS wird bei der Vermehrung der Bakterien und mit dem Tod der Zelle aus der Zellwand freigesetzt und initiiert eine entzündliche Reaktion. Die Milchdrüse reagiert sehr empfindlich auf LPS und eine Mastitis kann schon durch geringe LPS-Konzentrationen induziert werden. Es schädigt die sekretorischen Milchdrüsenepithelzellen nicht direkt, sondern es unterbricht den Blutfluss (SHUSTER et al. 1991). Systemische Effekte wie Anorexie, Fieber, Dehydration und Diarrhoe werden ebenfalls durch LPS verursacht. Die Reduktion der Milchproduktion wird direkt und indirekt auf die lokalen und systemischen LPS-Effekte zurückgeführt. 2.1.3.3 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (S. aureus) ist ein kugelförmiges, gram-positives Bakterium, das häufig in Traubenform angeordnet ist (sog. Haufenkokken). Seinen Namen verdankt es der häufig goldfarbenen Pigmentierung der Kolonien (BLOBEL et al. 1980). Staphylokokken sind unbeweglich und bilden keine Sporen. Die Größe des Bakteriums liegt üblicherweise zwischen 0,8–1,2 µm. S. aureus gehört zu den gram-positiven, fakultativ pathogenen Bakterien, die als Kommensalen auf Haut und Schleimhäuten vorkommen, jedoch auch lebensbedrohliche Erkrankungen wie beispielsweise Wundinfektionen, Toxisches Schocksyndrom, Endokarditis oder Sepsis auslösen können. Somit können als Ansteckungsherd für S.-aureus-Infektionen neben der Übertragung von Tier zu Tier durch das Melkgeschirr auch Wunden in der Euterund Zitzenhaut dienen. Die Pathogenität von S. aureus beruht auf der Wirkung verschiedener Virulenzfaktoren (BLOBEL et al. 1980). Dazu gehört eine Polysaccharidkapsel (Biofilm) mit Protein A, die das Bakterium vor Phagozytose schützt. Das Protein A bindet Antikörper über deren Fc-Teil, und verhindert damit eine effektive Opsonisierung. Die Koagulase und der Clumpingfaktor bewirken die Ausbildung eines Fibrinwalls, der eine Erkennung von S. aureus durch Faktoren und Zellen des Immunsystems erschwert oder verhindert. Erst wenn sich der Keim stark vermehrt, wird mit Hilfe von Staphylokinase Fibrinolysin gebildet und 20 der Wall aufgebrochen. Mittels der Hyaluronidase, DNAsen, Lipasen und dem Hämolysin ist S. aureus im Stande, interzelluläres Bindegewebe und Parenchymzellen zu lysieren und invasiv in den Wirtsorganismus vorzudringen. Leukocidine helfen dabei, die zellulären Bestandteile der Immunantwort (Granulozyten und Makrophagen) zu schädigen. S. aureus kann, je nach Stamm, einzelne oder verschiedene Enterotoxine (ETC) produzieren. Diese wirken als Superantigene, indem sie an MHC-Klasse-II-Moleküle binden und nach Kreuzvernetzung TZellen zur Produktion von Zytokinen stimulieren (NOVICK 2003). Zu den Pathogenitätsfaktoren gehören zudem die Zellwandbestandteile Lipoteichonsäure (LTA) und Peptidoglykan (PGN) (MORATH et al. 2002b). Obwohl der Wirkmechanismus einzelner Virulenzfaktoren bereits bekannt ist, sind ihr Zusammenspiel und ihre Regulation bisher wenig verstanden (NOVICK 2003). S. aureus kann den Zitzenkanal aktiv passieren, wodurch eine galaktogene Infektion begünstigt wird (HOEDEMAKER et al. 2001). Eine Infektion wird durch die Bildung von antiphagozytotischer Faktoren (Polysaccharidkapsel, Protein A) begünstigt (SUTRA u. POUTREL 1994; HENSEN et al. 2000b). Die Fähigkeit dem Immunsystem zu entkommen und in verschiedenen Zellen zu überleben ist für die Persistenz der Erreger essentiell. S. aureus vermag an Epithelzellen des Euters zu adhärieren, in diese einzudringen, sich in ihnen zu vermehren und zu persistieren (CIFRIAN et al. 1994b; ALMEIDA et al. 1996; HENSEN et al. 2000b). Überdies besitzt S. aureus die Fähigkeit in Makrophagen (HEBERT et al. 2000) zu überleben. Darüber hinaus vermag Staphylokinase (SAK) an α-Defensine zu binden und deren bakterizide Wirkung zu blockieren (TARGOWSKI 1983) Außerdem hemmt die SAK die Opsonisierung, da sie Plasminogen zu Plasmin transformiert, welches IgG und C3b bindet. Neben Streptococcus agalactiae und Streptococcus dysgalactiae ist S. aureus ein überaus wichtiger Erreger von subklinischen Mastitiden. Er ist der häufigste Auslöser der Mastitis beim Rind (SOBIRAJ et al. 1997; DE HAAS et al. 2004) und ist neben der großen Anzahl subklinischer Fälle auch ursächlich für klinischen Fälle (LAM et al. 1996). Im Gegensatz zur intramammären Infektion mit E. coli verlaufen die durch S. aureus hervorgerufenen Mastitiden meist weniger schwer, resultieren aber sehr häufig in chronischen, bisweilen lebenslangen Infektionen (SUTRA u. POUTREL 1994). Dabei kommt es nicht selten zu subklinischen Mastitiden, die im Gegensatz zu den klinisch manifesten Verlaufsformen nicht durch eine grobsinnliche Symptomatik, jedoch durch bakteriologisch positive Befunde und erhöhte Milchzellzahlen (SCC, somatic cell count) gekennzeichnet sind (HAMANN u. FEHLINGS 21 2002). Betroffene Tiere stellen somit ein ständiges Erregerreservoir in der Herde dar (ROBERSON et al. 1994). 2.1.3.4 Lipoteichonsäure Die Lipoteichonsäure (LTA, lipoteichonic acid) gilt als Pendant zum LPS der gram-negativen Bakterien, da sie ähnlich dem LPS immunmodulatorische Prozesse induziert (MORATH et al. 2002b; VON AULOCK et al. 2003). Lipoteichonsäuren bestehen aus einer hydrophilen Kette aus Alditolphosphaten und einem amphiphilen Glycolipid, das als Membrananker fungiert. Andere Teichonsäuren haben im Gegensatz zu LTA keinen Lipidanker (GHUYSEN et al. 1994). Die physiologische Funktion von LTA ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Es wird vermutet, dass LTA bei der Bindung von Metallionen und bei der Regulation der Aktivität von autolytischen Enzymen eine Rolle spielen könnte (FISCHER 1994). Die Rolle von LTA im Immunsystem des infizierten Wirtes ist vielfältig. Beispielsweise fördert es die Induktion bestimmter Transkriptionsfaktoren und folglich die Produktion und Sekretion von Zytokinen und Chemokinen (VON AULOCK et al. 2004). Die Erkennung von LTA erfolgt hauptsächlich von Makrophagen über CD14Rezeptoren, teilweise vermittelt durch das LBP (Lipopolysaccharid-Binding Protein) (HERMANN et al. 2002). Unterschiedliche Angaben gibt es über die Beteiligung der Tolllike-Rezeptoren TLR2 und TLR4. Zum einen berichten einige Arbeitsgruppen über einen TLR4-abhängigen Erkennungsweg (YANG et al. 2001; UEHARA et al. 2002). Andere haben festgestellt, dass die LTA-Erkennung TLR2-abhängig ist (LEHNER et al. 2001; OPITZ et al. 2001; MORATH et al. 2002b). Für die Persistenz der Keime könnte eine Modifikation der LTA verantwortlich sein. Geringe Veränderungen dieser Strukturen können die Erkennung über TLRs deutlich vermindern. Der Verlust von D-Alanylresten der LTA mindert bspw. die pro-inflammatorische Zytokinfreisetzung drastisch (MORATH et al. 2002a). 2.2 Immunrelevante Zellen der Milchdrüse 2.2.1 Die funktionelle Relevanz der Leukozyten Die Abwehr in der Milchdrüse beruht auf zwei komplexen Systemen, die miteinander gekoppelt sind. Sie werden als „unspezifisch/angeboren“ und als „spezifisch/erworben“ bezeichnet. Das Zusammenspiel dieser Systeme sorgt für eine effektive Abwehr und Elimination von Pathogenen. 22 Die zentrale Funktion des angeborenen Immunsystems ist darauf ausgerichtet, Erreger zu beseitigen und – im Bedarfsfall – die Rekrutierung von antigenspezifischen Effektorzellen des spezifischen Immunsystems an den Ort der Infektion zu veranlassen. Es bedarf keiner vorausgehenden Erregerexposition, um antigenunspezifische Effektorzellen zu aktivieren. Lösliche und zelluläre Bestandteile der angeborenen Immunität werden i.d.R. konstitutiv bereitgestellt. Die Erkennung der Erreger kann entweder über präformierte, zellständige oder lösliche Rezeptoren erfolgen (HOLLÄNDER 2006). Diese können eine große Anzahl an Pathogenen über deren konservierte PAMPs erkennen. Solche Motive sind zum Beispiel Zellwandbestandteile, Lipopolysaccharide (LPS), Peptidoglykan (PGN), unmethylierte Oligonucleotide mit einem zentralen Cytosin-Guanosin-Motive (CpG-Motive) und Lipoteichonsäure (LTA) (GOLDAMMER et al. 2004). Diese ermöglichen dem angeborenen Immunsystem mit einem limitierten Repertoire an wirtsspezifischen Erkennungsmechanismen auf ein breites Erregerspektrum zu reagieren (BANNERMAN et al. 2003). Die im Rahmen von bakteriellen Infektionen wichtigen Zelltypen der Immunabwehr sind diejenigen, welche das Vorliegen des Pathogens erkennen und nach dessen Bindung modulierende Signale aussenden (dendritische Zellen, Makrophagen, Mastzellen, Milchdrüsenepithelzellen). Ziel dieser Signalgebung ist es, die Rekrutierung maßgeblicher Effektorzellen einzuleiten, von denen neben Makrophagen (differenziert aus angelockten Monozyten) die neutrophilen Granulozyten die wichtigste Population darstellen. 2.2.1.1 Neutrophile Granulozyten Neutrophile Granulozyten (PMN, polymorphonuclear cells) sind hoch spezialisierte, kurzlebige Phagozyten, deren Hauptaufgabe darin besteht, mikrobielle Erreger zu phagozytieren und abzutöten. Sie gelten als Haupteffektorzellen des angeborenen Immunsystems bei bakteriellen Infektionen der Milchdrüse (PAAPE et al. 2003). Bovine neutrophile Granulozyten sind sowohl funktionell als auch morphologisch denen anderer Spezies zwar ähnlich, aber nicht identisch. Sie bilden neben den Lymphozyten die zweithäufigste Fraktion (25-45%) des Differentialblutbildes (TIZARD 2004). Sie sind 916 µm groß und sind durch ihren gelappten Zellkern aus zwei bis fünf untereinander verbundenen Segmenten gekennzeichnet. Durch diese Lappung ist es Granulozyten möglich, schnell durch die endotheliale Barriere zu migrieren (PAAPE et al. 2003). Der Nukleus ist entweder zentral oder exzentrisch in einem mit Granula beladenen Zytoplasma gelegen. Ausgereifte PMN besitzen drei unterschiedliche Typen von Granula, die Proteine enthalten, welche der Tötung der Mikroorganismen dienen. Die primären Granula, auch azurophile Granula bezeichnet, enthalten Myeloperoxidase, α-Defensine, Bactericidal permeability inducing Protein (BPI), Lysozym und Serinproteasen wie Kathepsin G. Allen diesen Molekülen ist eigen, dass 23 sie eine ausgeprägte mikrobizide Wirkung besitzen (RAUSCH u. MOORE 1975). Die sekundären Granula werden auch spezifische Granula genannt und entstehen in der myelozytären Phase (JAIN 1967; BAINTON et al. 1971). Diese Granula sind charakteristischerweise mit Wright-Giemsa-Färbung anzufärben und sind Peroxidase-negativ. Sie enthalten die Enzyme Lysozym, Histaminase, Gelatinase und Kollagenase. Mit Hilfe dieser Enzyme können neutrophile Granulozyten durch das Gewebe an den Ort der Entzündung gelangen. Zusätzliche Granulainhaltsstoffe stellen Indolicin und β-Defensin dar (SELSTED et al. 1992a; SELSTED et al. 1992b). In neutrophilen Granulozyten von Schaf, Ziege und Rind kommt eine dritte Gruppe von Granula vor (GENNARO et al. 1983). Diese Granula sind größer als die beiden anderen Granulatypen und sind beim Rind der dominierende Granulatyp (BAGGIOLINI et al. 1985). Sie enthalten den Großteil an anti-mikrobiellen Proteinen, wie zum Beispiel Lactoferrin und eine Gruppe von kationischen Polypeptiden, die Baktenecine genannt werden (ROMEO et al. 1988). Ausschließlich in diesen Granula sind sauerstoffunabhängige bakterizide Substanzen wie β-Defensine enthalten, die gegen gram-positive, gram-negative und anaerobe Bakterien sowie Pilze und Viren wirken (SAVOINI et al. 1984). Dieser Mechanismus ist in der Milchdrüse besonders wichtig, da im Euter der Sauerstoffgehalt gering ist. Drei verschiedene β-Defensine konnten in diesen Granula nachgewiesen und charakterisiert werden (YOUNT et al. 1999). Diese kationischen und bakteriziden Granula-Proteine unterscheiden sich von denen, die für andere Spezies beschrieben werden. Für sie wird eine anti-mikrobielle Wirkung gegenüber S. aureus und E. coli beschrieben (SELSTED et al. 1992a; SELSTED et al. 1992b). Neutrophile Granulozyten entwickeln sich im Knochenmark aus Stammzellen unter der koordinierenden Wirkung hämatopoetischer Wachstumsfaktoren wie Granulozyten-MakrophagenKolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Interleukin-3 und Granulozyten-Koloniestimulierender Faktor (G-CSF) über mehrere Entwicklungsstufen (Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten). Sie liegen zunächst als jugendliche Zellform als stabkernige neutrophile Granulozyten vor, deren länglicher Kern noch nicht segmentiert ist. Erst mit zunehmender Alterung der Zelle zerfällt er in mehrere über Chromatinstege verbundene Segmente (LIEBICH 1993). Nach der Freisetzung aus dem Knochenmark zirkulieren die PMN im Blutstrom, wobei sie besonders im Kapillargebiet engen Kontakt zum Endothel haben. Dieser Kontakt zu Endothelzellen wird über Adhäsionsmoleküle vermittelt. Granulozyten gehören mit zu den Immunzellen, die als erste am Ort eines Infektionsgeschehens erscheinen. Entzündungsmediatoren (u.a. CXCL8, LTB4, C5a) wirken 24 chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten und induzieren auf Endothelzellen die Expression von Adhäsionsmolekülen. Innerhalb weniger Minuten wird das adhäsive P-Selektin exprimiert. Ein weiteres Selektin (E-Selektin) erscheint erst einige Stunden nach Aktivierung. Diese Selektine erkennen Kohlenhydratepitope verschiedener Glykoproteine auf Leukozyten. Das auf der Seite der Leukozyten exprimierte L-Selektin unterstützt das „Rollen“ der Zellen entlang der Gefäßwand. Diese Wechselwirkungen führen zu einer reversiblen Anheftung der Neutrophilen an die Gefäßwand. Im Wirkungsgebiet von Entzündungsmediatoren wird somit die Geschwindigkeit der PMN im Blutstrom bei der Annäherung an aktiviertes Endothel abgebremst (Margination). Diese Form der Adhäsion ermöglicht die folgenden, stärkeren Interaktionen, welche letztlich zur Extravasation der Granulozyten führen. Der Prozess der Extravasation setzt eine hochkoordinierte und dynamische Interaktion zwischen verschiedenen Adhäsionsmolekülen von PMN und den Zellen des Gefäßendothels voraus (SMITH u. ANDERSON 1991). Dieser Schritt ist abhängig von Wechselwirkungen zwischen den Leukozyten-Integrinen LFA-1 (Leukozyten-Funktionsassoziiertes-Antigen-1, CD11a/CD18) und CR3 (Complementrezeptor-3, CD11b/CD18, auch MAC-1 genannt) und interzellulären Zelladhäsionsmolekülen (intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1) auf Endothelzellen. Die Verbindung von LFA-1 und CR3 mit ihren Liganden ist physiologischerweise nur schwach. Das von Endothelzellen und Immunzellen im Entzündungsbereich sezernierte CXCL8 bewirkt jedoch auf Leukozyten eine Konformationsänderung des LFA-1 und des CR3, wodurch die Affinität dieser Moleküle für ihre Liganden deutlich erhöht wird. Als Folge davon werden die Zellen an dieser Stelle des Endothels immobilisiert. Weitere adhäsive Wechselwirkungen werden über das Immunglobulin-ähnliche Molekül CD31 (auch PECAM: platelet endothelial cell adhesion molecule) vermittelt, das sowohl auf Leukozyten als auch an den Verbindungsstellen zwischen den Endothelzellen exprimiert wird (JANEWAY u. MEDZHITOV 2002). Die folgende Transmigration findet bevorzugt zwischen den Kontaktstellen von drei Endothelzellen („tricellular corners“) statt. Die PMN durchstoßen die Basalmembran mit Hilfe proteolytischer Enzyme, transmigrieren und gelangen entlang eines Konzentrationsgradienten von Entzündungsmediatoren in das betroffene Gewebe. Die Erkennung von Pathogenen durch neutrophile Granulozyten erfolgt in erster Linie über Toll-like-Receptors (TLR). TLR sind so genannte Mustererkennungsmoleküle (PRR) des natürlichen Immunsystems, welche das Vorhandensein einer Infektion signalisieren. Diese Rezeptoren sind entweder auf der Oberfläche oder im Zytoplasma exprimiert und stimulieren bei entsprechender Liganden-Bindung die Zelle zur anti-mikrobiellen Abwehr. Neutrophile exprimieren konstitutiv alle TLR außer TLR3 (O'MAHONY et al. 2008). In Folge einer Bin- 25 dung von Antigen an TLR werden Gene exprimiert, die direkt bei der Entzündungsreaktion beteiligt sind. Hierzu gehören TNF-α, IL-1, CXCL8, IL-12, E-Selektin (CD62E) und unterschiedlicher Proteine, die beim Abtöten von intrazellulär gelegenen Mikroorganismen eine wesentliche Rolle spielen. Dies führt zur Phagozytose und ROS-Bildung. Des Weiteren wird Antigen über Rezeptoren für Immunglobuline (CD16 und CD32) erkannt. Die Produktion und Freisetzung von Zytokinen werden durch IL-1, IL-2, TNF oder GM-CSF stimuliert (LLOYD u. OPPENHEIM 1992). Außerdem können Granulozyten am Ort der Entzündung sowohl die für die Phagozytoseleistung nötigen Moleküle wie zum Beispiel Aktin, Fcγ-Rezeptoren und Komplementrezeptoren synthetisieren als auch wichtige Mediatoren für die Entzündungsreaktion (Interferon α, Platelet activating factor (PAF) und LTB4) bilden und freisetzen. Über diese Fähigkeit, aktivierungsabhängig Zytokine und Chemokine zu sezernieren, beeinflussen PMN unmittelbar Mechanismen der adaptiven Immunantwort (CASSATELLA 1999). Ein aktivierter Granulozyt des Blutes vermag bis zu zwanzig Bakterien zu phagozytieren und zu töten. In der Milch ist diese Leistung allerdings herabgesetzt, da die Zellen 38% weniger Glykogenreserven haben als Blut-PMN (NEWBOULD 1973). Außerdem benötigen sie für die Phagozytose eine große Membranfläche, die zur Bildung von Pseudopodien dient, die die Bakterien fangen und umschließen sollen. Durch die Aufnahme von Milchfettglobuli und Kasein wird Membran internalisiert und somit die Phagozytoseleistung reduziert (PAAPE et al. 1975; PAAPE u. GUIDRY 1977). Pathogene werden mit Hilfe reaktiver Sauerstoffmetabolite und bakterizider lysosomaler Enzyme nach Verschmelzung der Phagosomen mit den Lysosomen zu Phagolysosomen inaktiviert (KARNOVSKY u. BADWEY 1986; BELAAOUAJ et al. 1998). Ein namhafter Teil der von bovinen Granulozyten gebildeten Metaboliten gelangt durch Exozytose auch in das umliegende Gewebe (LEINO u. PAAPE 1993). Eine längere Exposition durch Neutrophile resultiert in erheblichen Schäden am sekretorischen Epithel, welche zur dauerhaften Reduktion der Milchproduktion führen (SORDILLO u. BABIUK 1991). Deswegen ist eine schnelle Elimination der PMN nach erfolgter Neutralisation der Bakterien durch die Makrophagen sehr wichtig, um die Schäden in der Milchdrüse zu minimieren. Für Granulozyten ist in Kälbern eine Halbwertzeit von 8,9 Stunden beschrieben (CARLSON u. KANEKO 1975). Durch die Wirkung lokal produzierter Zytokine im Entzündungsgebiet verlängert sich die Lebenszeit dieser relativ kurzlebigen Zellen (BLISS et al. 1999). Die spontane Apoptose bei Neutrophilen verzögert sich (WATSON et al. 1997). In Untersuchungen von VAN OOSTVELDT et al. (2002) war die Apoptose nach Migration 26 durch Kalbhautmembranen erhöht und konnte durch einen Epithelzellmonolayer aufgehoben werden. 2.2.1.2 Makrophagen Makrophagen werden in der Literatur als der dominierende Zelltyp in der gesunden involuten und laktierenden Milchdrüse beschrieben (JENSEN u. EBERHART 1981; SORDILLO et al. 1987). Sie sind in der Regel organständige Effektorzellen, welche in vielen Geweben angesiedelt sind und sich dort durch ihre Fähigkeit zur Phagozytose auszeichnen. Die Vorläuferzellen der Makrophagen sind Monozyten, die sich im Knochenmark entwickeln. Anschließend wandern sie in die Blutgefäße, in denen sie im Blutstrom durch den Körper zirkulieren. Kommen sie während dessen in Kontakt mit Infektionen, sind sie wie neutrophile Granulozyten in der Lage, verstärkt in das betroffene Gewebe einzuwandern. Dort differenzieren sie unter Einfluss von Zytokinen und Erreger-Substanzen in Makrophagen (TIZARD 2004). Makrophagen enthalten eine Vielzahl hydrolytischer Enzyme. Lysozym, β-Glucuronidase, saure Phosphatase, Kathepsin, Hydrolasen, Esteroproteasen, neutrale Proteasen, Ribonucleasen und Lipasen können zum Teil als Antwort auf aktivierende Signale durch Fc- und Komplement-Rezeptoren, sowie nach Zytokinstimulation sezerniert werden. Makrophagen besitzen spezifische Rezeptoren für IFN-γ, IL-4, GM-CSF und TNF-α. Durch rezeptorvermittelte Erkennung von IL-10 können sie suprimiert werden. Sie selbst sezernieren proinflammatorische Zytokine (z.B. IL-1, IL-6, CXCL8, GM-CSF und TNF-α) und fördern somit die Mobilisation von Neutrophilen aus dem Knochenmark und deren Anlockung. Außerdem bewirken diese Zytokine die Produktion von Akut-Phase-Proteinen in der Leber, die am Infektionsort die Opsonisierung und die Elimination der Erreger fördern. Makrophagen sind aktiv phagozytierende Zellen der Milchdrüse (SORDILLO u. STREICHER 2002). Makrophagen erkennen PAMPs unter anderem über Mannose-Rezeptoren, Scavenger-Rezeptoren, CD14 und Toll-like-Rezeptoren. Die Expressionsstärke der TLRs kann über Zytokine (z.B. IFN-γ, GM-CSF) deutlich gesteigert werden (O'MAHONY et al. 2008). Für die indirekte Erkennung von Erregern verfügen Makrophagen über Komplementund Fc-Rezeptoren. Durch opsonisierende Antikörper und nach Komplementaktivierung kann die Phagozytoseleistung der Makrophagen bedeutend erhöht werden (SORDILLO u. STREICHER 2002). Zusätzlich zu Pathogenen können Makrophagen auch Zelldebris und Milchkomponenten verdauen (SORDILLO et al. 1987). Allerdings verringert sich durch die Aufnahme von Fett, Kasein und anderen Milchkomponenten die Erreger-Phagozytose (PAAPE et al. 1975; PAAPE u. GUIDRY 1977). Besonders in der peripartalen Zeit sind die phagozytotische und die bakte- 27 rizide Leistung herabgesetzt (WEBER et al. 1983). Dies könnte damit zusammenhängen, dass die opsonisierende Aktivität dieses Milchserums herabgesetzt ist (WALLER 2000). Da ihre Anzahl im Infektionsgeschehen gering ist, wird vermutet, dass die Phagozytosefunktion der Makrophagen in der Milchdrüse weniger wichtig ist als die der Neutrophilen. Wahrscheinlich hat die Fähigkeit, die Migration und bakterizide Aktivität der neutrophilen Granulozyten zu fördern, eine größere Bedeutung (VAN KAMPEN u. MALLARD 1997; KEHRLI et al. 1999). Als weitere wichtige Funktionen der Makrophagen sind die Elimination von gealterten, zerstörten sowie apoptotischen körpereigenen Zellen und die Gewebeheilung durch Narbenbildung (Granulationsgewebe) und Angiogenese zu nennen. 2.2.1.3 Lymphozyten In der Literatur findet man zahlreiche Studien über zelluläre Reaktionen nach intramammärer Infektion. Viele dieser Arbeiten fokussieren auf die unspezifische Immunabwehr in der Milchdrüse, namentlich die Funktion von Neutrophilen und Makrophagen. Seltener wurde die Rolle der Lymphozyten zum Schutz der Milchdrüse gegen Infektionen untersucht. Lymphozyten kommen in signifikanter Anzahl in der Milchdrüse und Milch sowie in den Sekreten von trockenstehenden Milchdrüsen von Wiederkäuern vor (SORDILLO u. NICKERSON 1988; PARK et al. 2004). Es konnte gezeigt werden, dass die Größe dieser Zellpopulationen entscheidend für die Entwicklung einer effektiven Immunantwort nach intramammärer Infusion von Bakterien war (LEE u. LASCELLES 1970). αβ-T-Lymphozyten αβ Diese T-Zellen exprimieren einen T-Zellrezeptor der aus einer α- und einer β-Kette besteht. Beim Rind exprimieren reife T-Zellen entweder den Co-Rezeptor CD4 oder CD8 (CD4+-TZellen, CD8+-T-Zellen). CD4+-T-Zellen gelten funktionell in der Regel als T-Helferzellen und besitzen einen Rezeptor, welcher Antigene im Kontext von MHC-Klasse-II-Molekülen von speziellen Antigen-präsentierenden Zellen (dendritische Zellen, Makrophagen, BLymphozyten) erkennt. Aktivierte CD8+-T-Zellen fungieren als zytotoxische T-Zellen und erkennen ihr antigenes Peptid MHC-Klasse-I-restringiert. Obwohl diese funktionelle Unterscheidung weitestgehend zutrifft, kennt man ebenso zytotoxische CD4+-T-Zellen und CD8+T-Helferzellen (HOLLÄNDER 2006). T-Helferzellen zeigen eine funktionelle Dichotomie, indem sie nach Aktivierung eher prooder eher anti-inflammatorische Zytokine sezernieren (BROWN et al. 1998). 28 TH1-Zellen sezernieren IFN-γ und IL-2. Dadurch werden Makrophagen aktiviert, und die MHC-Klasse-II-Expression wird gesteigert. Diese Zytokine fördern die Bildung zytotoxischer T-Zellen und die Produktion von Antikörper-Isotypen, die besonders gut Komplement fixieren können. Gleichzeitig hemmen diese Zytokine eine TH2-Antwort. Zur Bildung von TH1Zellen kommt es im Rahmen der Antigenpräsentation dann, wenn dendritische Zellen bei der Antigenpräsentation IL-12 sezernieren. Darüber hinaus sind TH1-Zellen in der Lage Infektionen zu bekämpfen, die durch Bakterien hervorgerufen werden, welche sich in den Vesikeln von Makrophagen vermehren. TH2-Zellen sezernieren vorwiegend TNF-β, IL-4 und IL-10. Diese Zytokine hemmen die Bildung von TH1-Zellen. Sie fördern besonders den Isotypwechsel bei Antigen-aktivierten B-Zellen und führen zur Bildung vorwiegend neutralisierender Antikörper. Überdies hemmt IL-10 die Aktivierung von Makrophagen. Die Aktivität CD8+ zytotoxischer T-Zellen (CTL) richtet sich im Allgemeinen gegen infizierte Zellen, Tumorzellen und histoinkompatible Transplantate. Werden zytotoxische CD8+T-Zellen durch Bindung an eine MHC-I-tragende Zelle, welche ein fremdes Antigen präsentiert, aktiviert, so schütten sie Perforine und Granzyme aus. Diese induzieren in den MHC-Itragenden Zellen die Apoptose. Zudem produzieren und sezernieren aktivierte CTL auch IFN-γ, welches in vielen anderen Zellen vor allem anti-virale Wirkungen entfaltet und sowohl Makrophagen als auch neutrophile Granulozyten aktiviert. Die relativen Verhältnisse von CD4+-zu CD8+-T-Zellen können je nach Lokalisation und Laktationsstadium sehr unterschiedlich sein. Im Blut überwiegen die CD4+-T-Zellen, das Verhältnis von CD4+-zu CD8+-T-Zellen liegt laut Literatur zwischen 1,52 und 3,35 (PARK et al. 1992; TAYLOR et al. 1997; ASAI et al. 1998; ASAI et al. 2000). Auf die Bedeutung im Gewebe und in der Milch gesunder Milchdrüsen wird in 2.2.2 näher eingegangen. γδ− γδ−T-Zellen Eine kleine Population von T-Zellen zeichnet sich dadurch aus, dass sie einen Antigenrezeptor exprimieren, der sich aus schwach polymorphen γ- und δ-Ketten zusammensetzt. Diese so genannten γδ-T-Zellen bilden neben αβ-T-Zellen und den B-Zellen die dritte Lymphozytenfraktion, die bei Vertebraten nachgewiesen werden konnte. Morphologisch können einige der γδ-T-Zellen als „Large Granular Leukocytes“ (LGL) ausgewiesen werden, da in ihrem Zytoplasma viele Granula vorkommen. Ungeachtet dieser morphologischen Eigenheiten ist der größte Teil der γδ-T-Lymphozyten durch ihre Zellform und Größe von konventionellen Lymphozyten nicht zu unterscheiden. Obwohl γδ-T-Zellen viele zellständige Moleküle und Effektorfunktionen einschließlich der Zytokinproduktion und der zytotoxischen Aktivität mit den 29 αβ-T-Zellen gemeinsam haben, gibt es bezüglich der biologischen Eigenschaften etliche bemerkenswerte Unterschiede zwischen diesen beiden Zellgruppen. γδ-T-Lymphozyten dienen generell der Überwachung epithelialer Oberflächen (HOLLÄNDER 2006). Rinder weisen im Vergleich zu anderen Spezies einen sehr hohen Gehalt an γδ-T-Lymphozyten auf, der im juvenilen Organismus bei 60% der T-Zellen liegt. Außerdem ist die γδ-T-Zell-Rezeptordiversität in Rind und Schaf sehr hoch (TIZARD 2004). Dieser Zelltyp migriert zu epithelialen Geweben wie Haut, Darmmukosa, Reproduktionstraktes und Milchdrüse und wird dort in hoher Frequenz (bis zu 50% der Leukozyten) gefunden (ALLISON u. HAVRAN 1991; MACKAY u. HEIN 1991). Besonders bei Wiederkäuern findet man γδ-T-Zellen in Milchdrüsensekreten und Milchdrüsengeweben in höheren Anteilen als im Blut (SHAFER-WEAVER et al. 1996). γδ-T-Zellen erkennen Antigen in einer Weise, die sich grundlegend von der Antigendetektion bei αβ-T-Zellen unterscheidet. Sie können an eine große Vielfalt von unterschiedlichen Antigenen unverzüglich binden, da diese weder prozessiert noch von konventionellen MHCMolekülen präsentiert werden müssen. Sie sind in der Lage einerseits konstitutiv exprimierte Antigene auf körpereigenen Zellen und auf mikrobiellen Erregern zu erkennen. Andererseits detektieren sie induzierte Antigene, die von transformierten, geschädigten und/oder gestressten körpereigenen Zellen exprimiert werden. Hierzu gehören die ubiquitären und phylogenetisch stark konservierten Heat-shock-Proteine (hsp), welche bei Zellstress infolge von Infektionen, Entzündungen und/oder Transformation freigesetzt werden (HOLLÄNDER 2006). Sie können zum einen durch ihr zytotoxisches Potential veränderte epitheliale Zellen zerstören (MACKAY u. HEIN 1991; YAMAGUCHI et al. 1999). Zum Beispiel waren unter IL-2 Einfluss kultivierte γδ-T-Zellen in der Lage, humane maligne Mammakarzinomzelllinien zu erkennen und zu lysieren (MIESCHER et al. 1990). Zum anderen spielen γδ-T-Zellen in der Abwehr von bakteriellen Infektionen eine wichtige Rolle. Sie vermögen Zytokine zu sezernieren, sowie γδ-T- und B-Lymphozyten zu regulieren. Die von den αβ-T-Zellen bekannte funktionelle Dichotomie in TH1- und TH2-polarisierten Zellen gilt auch für die Population der γδ-T-Zellen (HOLLÄNDER 2006). Durch ihre bevorzugte Lage in unmittelbarer Nähe zu Epithelien sind γδ-T-Zellen befähigt, vor allem in der Mukosa eine schnelle Immunantwort gegen Erreger zu leisten. Es konnte gezeigt werden, dass in Phasen erhöhter Mastitisempfänglichkeit der Anteil der γδ-T-Zellen im mammären Parenchym signifikant reduziert war (SHAFER-WEAVER et al. 1996). Dies lässt vermuten, dass γδ-T-Zellen eine wichtige Rolle in der mammären Infektionsabwehr spielen. 30 B-Lymphozyten B-Lymphozyten sind als einzige Zellen in der Lage Antikörper zu bilden. Im Gegensatz zu den T-Lymphozyten ist der Anteil B-Zellen während der verschiedenen Laktationsstadien relativ konstant (SHAFER-WEAVER et al. 1996). Werden B-Zellen durch Antigene aktiviert, können sie sich, entsprechende T-Zell-Hilfe vorausgesetzt, zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen und Gedächtniszellen differenzieren. Lösliche Antikörper fungieren als Opsonine und neutralisieren sowohl bakterielle Toxine als auch die Adhäsionsfähigkeit von Bakterien (TARGOWSKI 1983; CONCHA 1986; SORDILLO et al. 1997). Eine Antikörperproduktion konnte für Plasmazellen aus der Milch nachgewiesen werden (CONCHA 1986). 2.2.1.4 Mastzellen Mastzellen sind gewebeständige Sensor- und Effektorzellen des angeborenen Immunsystems. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnten Mastzellen in der Milchdrüse nahe den Epithelzellen nachgewiesen werden (LUDEWIG 1996). Durch ihre Fähigkeit präformierte Mediatoren nach Aktivierung freizusetzen und Entzündungsmediatoren neu zu bilden, nehmen sie an initialen Abwehrmechanismen nach Erregerkontakt teil, steigern die Effektorzell-Rekrutierung und steuern Induktionsprozesse adaptiver Immunantworten. Der Mastzell-Phänotyp hängt von der Gewebelokalisation ab. Die Zellen lassen sich in zwei Subtypen unterteilen: Mastzellen, welche Tryptase (MZt) und solche, die Tryptase und Chymase (MZtc) in ihren Granula aufweisen. Chymase-positive Mastzellen befinden sich in der duodenalen Lamina propria, um Bronchioli herum und in den alveolären Septen sowie in der Haut. MZt sind generalisiert zu finden und haben beim Rind einen besonders hohen Gehalt an Tryptase (JOLLY et al. 2000). Die beiden Hauptproteasen sind in der Lage neben Gewebsumbildungen auch die Immigration von Leukozyten zu fördern (HUANG et al. 1998). Auf das in den Granula vorhandene Histamin wird weiter unten gesondert eingegangen. Aktivierte Mastzellen setzten zusätzlich zum Inhalt ihrer Granula auch noch andere biologisch aktive Moleküle frei, die sowohl auf die Früh- als auch auf die Spätphase der Entzündungsreaktion Einfluss nehmen. Durch die Freisetzung der Lipidmediatoren Leukotrien C4 (LTC4) und Leukotrien B4 (LTB4) wird die Vasopermeabilität gesteigert und die Immigration von Granulozyten gefördert. Mukosale MZ bilden mehr LTC4 wodurch verstärkt Eosinophile Granulozyten angezogen werden und Bindegewebs-Mastzellen bilden LTB2, wodurch Neutrophile angelockt werden (MARSHALL 2004). Mastzellen produzieren zahlreiche Zytokine und Chemokine. Zu ihnen gehören die klassischen pro-inflammatorischen Zytokine wie TNF-α oder IL-1β und anti-inflammatorische 31 bzw. immunmodulatorische Zytokine wie IL-10 und TGF-β. Obwohl Mastzellen hauptsächlich als Quelle für T-Helfer 2 (TH2)-Typ Zytokine, wie IL-4, IL-5, IL-13, beschrieben werden, können sie auch Zytokine des TH1-Typs, wie IFN-γ, IL-12 oder IL-18 produzieren. Auch CXCL8 und CXCL10 als Chemokine des TH1-Typs werden von Mastzellen gebildet (DI NARDO et al. 2003). Wie differenziert diese Zytokine freigesetzt werden können, zeigt ein Nagermodell. Auf einen LPS-Stimulus hin, wurde selektiv TNF-α, IL-1β, GM-CSF und IL-6 freigesetzt. Eine Degranulation blieb aus. Eine Stimulation mit Peptidoglykan, einem Zellwandbestandteil der gram-positiven Bakterien, führte hingegen zur Freisetzung von anderen Zytokinen (IL-4, IL-, IL-6 und GM-CSF) bei gleichzeitiger Degranulation (SUPAJATURA et al. 2001). Die Mastzellen tragen zahlreiche Rezeptoren auf ihrer Oberfläche (Abb. 1, A und B). Unter anderem exprimieren sie den für die Erkennung von LPS, dem PAMP gram-negativer Bakterien, den TLR4 (MCCURDY et al. 2001; SUPAJATURA et al. 2001) (Abb. 1, A). In humanen und murinen Mastzellen konnte ebenfalls eine Expression von TLR2 nachgewiesen werden und man vermutet das dieser Rezeptor für die Erkennung von Peptidoglykan (PGN) verantwortlich ist (SUPAJATURA et al. 2002). Mastzellen exprimieren zudem einen hoch affinen Rezeptor für IgE und einen mäßig affinen Rezeptor für IgG. Nach IFN-γ-Stimulation exprimieren sie zudem hoch affine Rezeptoren für IgG (WOOLHISER et al. 2001). Mit diesen Antikörperrezeptoren sind sie ebenfalls in der Lage, indirekt die Gegenwart von Bakterien zu erkennen und darauf zu reagieren (Abb. 1, B). Ein weiterer Weg die Effektorfunktion von Mastzellen zu stimulieren, ist die Bindung von Anaphylatoxinen wie C3a und C5a und dem Nerve Growth-factor (NGF) (Abb. 1, C). Dabei entscheiden sowohl deren Konzentrationen als auch das Muster der freigesetzten Entzündungsmediatoren über die Stärke des Signals und die Wirkung auf Mastzellen (HOLLÄNDER 2006). Eine Übersicht der Zellen in der Milchdrüse wird in Tab. 2 aufgeführt. 32 A: Direkte Interaktionen Abb. 1 B: Fc-Rezeptor vermittlelte Aktivierung C: Komplement-Rezeptor vermittelte Aktivierung Die wichtigsten Aktivierungspfade von Mastzellen in Folge von Interaktionen mit Pathogenen nach MARSHALL (2004). Mastzellen können sowohl direkt als auch indirekt nach Pathogen-Exposition aktiviert werden. A: Über TLRs können Mastzellen direkt mit dem Erreger interagieren. Dies führt zur Zytokinproduktion, aber nicht zur Degranulation. B: Die Fc-Rezeptor vermittelte Aktivierung (indirekte Erkennung) führt zur Degranulation von Mastzellen und der Produktion neuer Mediatoren. C: Die KomplementRezeptor vermittelte Aktivierung (indirekte Erkennung) wird über mehrere Komplementrezeptoren vermittelt, wie z.B. CR3 (Rezeptor für C3b). Dies führt vornehmlich zur Zytokinproduktion oder Rezeptorenexpression für die Komplement-Spaltungsprodukte, wie z.B. CR5a (Rezeptor für C5a), die in den meisten Fällen zur Degranulation führen. 33 Tab. 2 Übersicht der Zellen in der Milchdrüse modifiziert nach SORDILLO und STREICHER (2002). Zellart Biologische Funktion Neutrophile Granulozyten Phagozytose und intrazelluläres Töten von Bakterien, Sekretion anti-bakterieller Faktoren Makrophagen Phagozytose und intrazelluläres Töten von Bakterien, Antigen-Präsentation über MHC-Klasse-II-Moleküle; Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine T-Lymphozyten CD4+ Produktion von Zytokinen nach Erkennung von Antigen über MHC-Klasse-II CD8+ Lyse von veränderten oder beschädigten körpereigenen Zellennach Erkennung von Fremd-Antigen über MHC-Klasse-I; Produktion von Zytokinen mit direkten bzw. indirekten zytolytischen Effekten (TNF-α und IFN-γ) oder zur Unterstützung der humoralen Antwort (IL-4) γδ-T-Zellen Biologische Rolle ist in der Milchdrüse noch nicht hinreichend geklärt B-Lymphozyten Reife B-Zellen Antigen-Präsentation durch membrangebundene Antikörper Ausbildung von Gedächtniszellen Plasmazellen Terminal differenzierte B-Lymphozyten, die Antigenspezifische Antiköper synthetisieren und sezernieren Mastzellen Induktion angeborener Immunantworten und Steigerung der Effektorzell-Rekrutierungen. Biologische Rolle in der Milchdrüse noch nicht hinreichend geklärt 2.2.2 Zellpopulationen in der Milch einer gesunden Milchdrüse Ein somatischer Zellgehalt (SSC) zwischen 20.000 und 100.000 Zellen pro mL Milch wird als physiologischer Zellgehalt angesehen (HAMANN u. FEHLINGS 2002). Die Angaben über die Anteile der Zellpopulationen variieren in der Literatur. Für Makrophagen werden Anteile von 13% bis 95% der Gesamtleukozytenzahl beschrieben. Für Granulozyten variieren die Werte zwischen 0% und 37% sowie für lymphoide Zellen zwischen 5% und 28% (PAAPE et al. 1981; CONCHA 1986; WEVER u. EMANUELSON 1989; LEITNER et 34 al. 2000b). Auch für die lymphozytären Subpopulationen in der Milch findet man sehr unterschiedliche Angaben (PAAPE et al. 2000; PARK et al. 2004), die darüber hinaus in der peripartalen Zeit stark schwanken (SHAFER-WEAVER et al. 1996). Die B-Lymphozyten sind in der peripartalen Phase zu 25% vertreten. Ihr Anteil fällt zum Ende der Laktation auf 7% der lymphoiden Zellen ab. Der Anteil der T-Lymphozyten liegt in der peripartalen Phase bei nur 16% der Gesamtlymphozyten und steigt zum Ende der Laktation auf 62% an. Davon repräsentieren γδ-T-Lymphozyten nur einen kleinen Anteil der Lymphozytenfraktion (TAYLOR et al. 1997). αβ-T-Lymphozyten sind überwiegend CD8+-T-Zellen (TAYLOR et al. 1997; PARK et al. 2004). Die funktionelle Relevanz der erhöhten Zahl von CD8+-T-Zellen in der Milch gesunder Tiere ist noch nicht hinreichend geklärt. Es wird vermutet, dass zytotoxische T-Zellen eine das Epithel schützende Funktion inne haben, indem sie MHC-Klasse-I-vermittelt alte oder beschädigte sekretorische Zellen beseitigen (TARGOWSKI 1983). Bisher wurde im Euter jedoch noch keine Aktivität zytotoxischer T-Zellen beobachtet (BURVENICH et al. 1999). Das Verhältnis CD4+/CD8+-T-Zellen in der Milch gesunder Milchdrüsen liegt bei 0,8 ± 0,6. Es konnte allerdings gezeigt werden, dass die immunregulatorischen Eigenschaften von dem Laktationsstadium abhängen. In der Mitte der Laktation befindliche Kühe wiesen CD8+T-Zellen mit hoher zytotoxischer Aktivität auf. In der postpartalen Phase war die zytotoxische Aktivität reduziert, während die Expression von IL-4 mRNA (als Anzeichen einer TH2Antwort) hochreguliert war (SHAFER-WEAVER u. SORDILLO 1997). PARK et al. (1992) und TAYLOR et al. (1997) vermuten einen Zusammenhang zwischen dem erhöhten Mastitisrisiko der peripartalen Phase und dem herabgesetzten CD4+/CD8+-Verhältnis. Obwohl diese Ergebnisse vermuten lassen, dass die Anteile dieser Lymphozytensubpopulationen die Immunabwehr der Milchdrüse beeinflussen, konnte ihre funktionelle Relevanz noch nicht hinreichend geklärt werden. Des weiteren befinden sich in der Milch noch Epithelzellen (2%), eosinophile Granulozyten, Monozyten und Plasmazellen, deren zahlenmäßiger Anteil jedoch so gering ist, dass er bei einer quantitativen Betrachtung außer Acht gelassen werden kann (HAMANN 1992). Der Zellgehalt der Milch ist von verschiedenen Faktoren abhängig. Mit steigender Anzahl an Laktationen steigt im Mittel auch die Zellzahl, was v.a. durch einen Anstieg an PMN verursacht wird (BURVENICH et al. 1994). Auch mit fortschreitendem Laktationsstadium nimmt die Zellzahl zu, wobei hier jedoch eine Zunahme aller Zellarten festgestellt wurde (DOGGWEILER u. HESS 1983). Auch das Melkintervall hat einen Einfluss auf die Zellzahl. Ein Melkintervall von 4 Stunden verursacht einen signifikant höheren Zellgehalt im Viertelanfangsgemelk als ein Melkintervall von 12 Stunden (HAMANN et al. 1997). Unterschiedliche Rassen wie Braunvieh, Simmentaler, Fleckvieh und Schwarzfleckvieh zeigen zwar di- 35 vergierende Modalwerte für den Zellgehalt, die Differenzen sind aber für die Festlegung eines Grenzwertes zwischen physiologischem und pathologischem Zellgehalt ohne Bedeutung (DOGGWEILER u. HESS 1983). Exogene Stressfaktoren lösen in gesunden Eutervierteln keinen Zellzahlanstieg aus, während in bereits vorgeschädigten Eutervierteln deutliche zytologische Reaktionen beobachtet werden können (WEGNER et al. 1976). Die Bedeutung der Zellpopulationszusammensetzung vor Erregerkontakt ist noch nicht hinreichend geklärt. Ihr Vorhandensein und ihre Zusammensetzung kann als Ausdruck der Aktivität residenter Milchdrüsenepithelzellen oder Makrophagen angesehen werden, die möglicherweise über physiologische Faktoren (z.B. Hormone) gesteuert wird (SURIYASATHAPORN et al. 2000b). 2.2.3 Zellpopulationen in der Milch nach Infektion der Milchdrüse Nachdem das Pathogen die physikalische Barriere des Zitzenkanals überwunden hat, trifft es auf die Milchdrüsenepithelzellen und auf Milch- und Gewebsmakrophagen, die Mechanismen des angeborenen Immunsystems initiieren. Die Frühphase der Immunabwehr der Milchdrüse kann in drei Abschnitte eingeteilt werden: 1) sofortige Elimination des Erregers, 2) Freisetzung von pro-inflammatorischen Mediatoren, insbesondere Chemokine, und 3) die Migration von neutrophilen Granulozyten in das infizierte Eutergewebe (SURIYASATHAPORN et al. 2000a). Nach dem Eindringen des Erregers durch die Zitze erkennen initial vorhandene Milch- oder Gewebemakrophagen das eingedrungene Pathogen über ihre membranständigen Erregerrezeptoren, insbesondere über Toll-like-Rezeptoren. Im Falle einer Infektion mit gramnegativen Bakterien geschieht dies über TLR4 (BEUTLER 2004), gram-positive Bakterien werden über TLR2 erkannt (MORATH et al. 2002a). Die Bakterien werden daraufhin von Makrophagen phagozytiert. Folglich werden Zytokine wie TNF-α und IL-β, welche die bakterizide Aktivität von Neutrophilen erhöhen, Prostaglandine und Leukotriene, welche die lokale Entzündung verstärken, und Chemokine, die auf neutrophile Granulozyten chemotaktisch wirken, produziert. In der gesunden Milchdrüse liegt der Zellgehalt bei <105 Zellen/mL Milch. Während einer bakteriellen intramammären Infektion steigt der Zellgehalt innerhalb weniger Stunden auf bis zu >106 Zellen/mL Milch an (PERSSON et al. 1992; KREMER et al. 1993). Innerhalb von 2 bis 4 Stunden steigt der Anteil von neutrophilen Granulozyten stark an, die folglich in der infizierten Milchdrüse die dominierende Zellfraktion darstellen (KREMER et al. 1993; CAS- 36 SATELLA 1999). Angaben über Anteile an Neutrophilen erstrecken sich von 86% (LEITNER et al. 2000a) bis über 96% (RIOLLET et al. 2000b). Von diesen Zellen hängt die Effektivität der Immunabwehr in der Milchdrüse entscheidend ab. HEYNEMANN (1990) und ZECCONI (1994) konnten zeigen, dass eine verminderte ROS-Bildungs-Leistung zu einer höheren Inzidenz von E.-coli-Mastitiden führt. Der Schweregrad der Mastitis hängt von der Geschwindigkeit der Rekrutierung und von der Phagozytoseleistung ab (HILL 1981). Eine ungenügende Funktion der PMN kann ebenso deutlich mit Mastitiden im peripartalen Zeitraum in Verbindung gebracht werden (CAI et al. 1994). Die Anteile der Lymphozytensubpopulationen verändern sich nach Infektion mit S. aureus mit Ausnahme der γδ-T-Zellen. Liegt das CD4+:CD8+-Verhältnis in der Milch vor der Infektion bei 0,8 ± 0,6 , so steigt es in der akuten Phase auf 2,7 ± 3,1 und in der chronischen Phase auf 1,8 ± 1,2 (GRONLUND et al. 2006). Damit dominieren die CD4+-T-Zellen sowohl in der akuten als auch in der chronischen Phase einer S.-aureus-Mastitis (TAYLOR et al. 1997; RIVAS et al. 2000; RIOLLET et al. 2001). Nach 24 h post infectionem (p.i.) wurde ein Rückgang der CD4+- und CD8+-Populationen beobachtet. Dies könnte mit einem selektiven Zelltod der nichtspezifischen T-Zellen in der Phase der akuten Infektion zusammenhängen (JIANG et al. 2003). Obwohl der Einstrom von neutrophilen Granulozyten nach der Infektion mit E. coli dominiert, ist auch eine differentielle Migration von Lymphozyten zu verzeichnen (PAAPE et al. 2000; BURVENICH et al. 2003). Die Anzahl von CD8+-T-Zellen steigt. Dies spiegelt sich in CD4+/CD8+-Verhältnissen wider, die transient von 0,7 auf 0,4 abfallen und 24 h p.i. wieder auf Werte von 1,5 ansteigen (MEHRZAD et al. 2008). Der Anteil von B-Lymphozyten hingegen steigt in akut und chronisch infizierten Eutervierteln wahrscheinlich durch stärkere Rekrutierung, da keine Teilung dieser Zellen im Parenchym zu beobachten war (NICKERSON u. HEALD 1982). 2.2.4 Die funktionelle Relevanz der Milchdrüsenepithelzelle für die Immunabwehr Größte Bedeutung für den Schutz des Euters haben lokale Barrieren, die den ersten Schutz vor schädlichen Einflüssen darstellen. Die physiologische Rolle der Milchdrüsenepithelzellen (MEC) bei der Immunantwort auf die verschiedenen Erreger ist noch immer nicht vollständig geklärt. Im Milchdrüsengewebe mit den darin enthaltenden neutrophilen Granulozyten konnte unmittelbar nach gesetzter Infektion die Expression von IL-1β, IL-6, CXCL8 und TNF-α nachgewiesen werden (SHUSTER et al. 1997; RIOLLET et al. 2000c; ALLUWAIMI et al. 2003). 37 YANG et al. (2008) führten Untersuchungen an Milchdrüsengeweben nach experimenteller Infektion mit E. coli und S. aureus durch. Dabei wies die Genexpression im Milchdrüsengewebe deutliche Unterschiede nach der Stimulation mit E. coli und S. aureus auf, was auf verschiedene Aktivierungspfade durch gram-positive und gram-negative Bakterienzellwandbestandteile schließen lässt. S. aureus vermochte nur eine geringe Expressionssteigerung der pro-inflammatorischen Zytokine zu induzieren (YANG et al. 2008). Die experimentelle Infektion der Milchdrüse von Probanden mit E. coli induzierte deutlich eine CXCL8- und TNF-αGenexpression schon nach 12 h p.i. und IL-10 und IL-12 nach 24 h p.i.. In Gewebeproben aus In-vivo-Modellversuchen ist es sehr schwer, zwischen der Beteiligung der Milchdrüsenepithelzelle und den infiltrierenden Leukozyten an der Immunantwort nach intramammärer Infektion zu differenzieren. Somit blieb von vielen Zytokinen und anderen inflammatorischen Faktoren, die während einer intramammären Infektion in der Milch nachweisbar waren, lange Zeit unklar, von welchen Zellen sie produziert wurden. Verschiedene Studien deuten darauf hin, dass die Milchdrüsenepithelzelle (MEC) selbst fähig ist, die initiale Immunantwort zu beeinflussen und zu verstärken (PHILPOTT et al. 2001; RAMBEAUD et al. 2003; GOLDAMMER et al. 2004). Jedoch ist weiterhin unklar, in welchem Ausmaß sie diese Fähigkeit besitzt. Daher werden derzeit verstärkt In-vitro-Zellmodelle eingesetzt, um die Immunantwort von primären bovinen Milchdrüsenepithelzellen (pbMEC) zu prüfen. Zahlreiche Zellmodelle verwendeten die gram-positiven und gram-negativen Bakterienzellwandbestandteile LPS und LTA als Stimulus (PHILPOTT et al. 2001; SCHMITZ et al. 2004; STRANDBERG et al. 2005). So steigert eine Behandlung einer pbMEC-Zellkulturlinie mit LPS die Expression von einer ganzen Reihe anti- und pro-inflammatorischen Zytokine wie TNF-α , IL-1α, IL-1β und IL-6 sowie die Chemokine CXCL8, CXCL2 und CXCL6 (STRANDBERG et al. 2005). Außerdem initiierten LPS und hitzegetötete E. coli eine erhöhte Expression von TLR2 und TLR4 sowie eine gesteigerte Expression von NFКB und MyD88, die eine TLR-Rezeptoraktivierung anzeigen (YANG et al. 2008). Eine Stimulation von primären Epithelzellkulturen mit S. aureus steigert die Produktion von CXCL8 und Lactoferrin dosisabhängig (WELLNITZ u. KERR 2004). Es konnte ebenfalls eine erhöhte Expression von TLR2 und TLR4 festgestellt werden, allerdings blieb eine Konzentrationssteigerung von NFКB und MyD88 aus. LPS konnte länger anhaltende und stärkere Effekte induzieren, welches die vermehrt akut verlaufende Natur von E.-coli-Mastitiden reflektiert. Das Fehlen eines deutlichen Effektes lässt eine Toleranz der pbMEC auf S. aureus und LTA vermuten und könnte ein weiterer Fak- 38 tor sein, der zu einem chronischen Verlauf von S.-aureus-induzierten Mastitiden führt (WELLNITZ u. KERR 2004). MEC-Zellmodelle Erstmalig wurden 1961 bovine Euterepithelzellen in vitro als Zellkulturen zum Wachstum gebracht (EBNER et al. 1961). Seitdem haben zahlreiche Gruppen die Epithelzellen als Organkulturen (COLLIER et al. 1977; GERTLER et al. 1983) oder Zellkulturen (TUMILOWICZ u. SHIRAHAMA 1969; MCGRATH 1987; CIFRIAN et al. 1994a) etabliert. Zur Gewinnung von Milchdrüsenepithelzellen aus dem Eutergewebe für primäre Zellkulturen sind bisher zwei Techniken in bovinen Systemen bekannt. In der von BUEHRING (1990) beschriebenen Methode wurden aus Rohmilch die somatischen Zellen gewonnen und anschließend in einer Gewebekulturplatte in Medium kultiviert. Die am häufigsten durchgeführte Methode ist die Gewinnung von Milchdrüsenepithelzellen durch den enzymatischen Verdau von Drüsengewebe, das durch Biopsie oder nach der Schlachtung entnommen wurde. Häufig wird hierfür die Methode von CIFRIAN (1994a) in modifizierter Form angewendet (RIOLLET et al. 2000a; KERR u. WELLNITZ 2003; WELLNITZ u. KERR 2004; LAHOUASSA et al. 2007). Um eine bessere Vergleichbarkeit der pbMEC-Kulturansätze zu erreichen, postulierten WELLNITZ und KERR (2004), dass MEC vor der Kultivierung zunächst eingefroren werden sollten. Um individuelle Unterschiede in den Milchdrüsenepithelzell-Modellen zu reduzieren, wurden transformierte Zelllinen wie MAC-T, BME-UV oder L1 Zellen entwickelt und eingesetzt (HUYNH et al. 1991; ZAVIZION et al. 1996; GERMAN u. BARASH 2002). Diese Zelllinien wurden aus Tumor gewonnen, mit Karzinogenen behandelt oder mit Onkogenen transfiziert. Morphologisch können Milchdrüsenepithelzellen im Mikroskop als Pflasterstein-ähnliche Zellen in kreisförmigen Kolonien charakterisiert werden (ZAVIZION et al. 1996; DELABARRE et al. 1997). Außerdem kann Keratin histochemisch nachgewiesen werden. Bei der Kultivierung der Milchdrüsenepithelzellen in Zellkulturplatten konnten Veränderungen in der Morphologie und der Funktion der Zellen beobachtet werden. Insbesondere ist die Lactogenese von diesen Veränderungen betroffen (ROSE et al. 2002). Daher wurde von RABOT et al. (2007) ein Explantat-Modell entwickelt. Hier wurde aus dem Drüsengewebe geschlachteter Tiere ein Stück von 1,6 cm Länge und 2 mm Durchmesser entnommen und in Zellkulturplatten kultiviert. 39 2.3 Immunrelevante lösliche Faktoren in der Milch 2.3.1 Zytokine Die Aktivität der Zellen des Immunsystems wird durch pro- und anti-inflammatorische Zytokine reguliert. Pro-inflammatorische Zytokine und Chemokine erhöhen die bakterizide Aktivität von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, fördern Immigration von Neutrophilen in das infizierte Gewebe, induzieren die Reifung von dendritischen Zellen und kontrollieren die Antwort des erworbenen Immunsystems (SORDILLO et al. 1991; HORNEF et al. 2002). In der Literatur werden für die gesunde und infizierte Milchdrüse eine große Bandbreite an Zytokinen, wie Interleukine (IL-1β, IL-2, IL-6, IL-12), Chemokine (CXCL2, 6, 8), Colony-stimulating factors (CSF), Interferon-γ (IFN-γ) und TNF-α erwähnt. Im Folgenden wird deren Bedeutung in Hinblick auf die Mastitis besprochen und in Tab. 3 zusammenfassend dargestellt. TNF-α wird von Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und Milchdrüsenepithelzellen gebildet. Dieses Zytokin wirkt Migrations-fördernd auf Neutrophile, da es die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen fördert. Das zelluläre Adhäsionsmolekül (ESelektin), das interzelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM-1) und das vaskuläre Adhäsionsmolekül (VCAM-1) werden folglich auf der Oberfläche der Gefäßendothelien exprimiert. Dies ermöglicht die Bindung von neutrophilen Granulozyten an das Endothel, die Migration der Neutrophilen durch die epitheliale und subepitheliale Matrix und ihre Immigration ins Zentrum der Infektion. TNF-α ist das Hauptzytokin in der frühen Phase der Infektion und ist für den endotoxischen Schock bei einem perakuten Mastitisverlauf verantwortlich (SLEBODZINSKI et al. 2002; PERSSON WALLER et al. 2003). IFN-γ wird nach mitogenen und antigenen Stimuli von CD4+- und CD8+-Lymphozyten sowie NK-Zellen produziert. Funktionell steht die Stimulation der Makrophagen durch IFN-γ im Vordergrund, wodurch wichtige pro-inflammatorische Zytokine und Chemokine bereitgestellt werden. Außerdem wird die phagozytotische Leistung der neutrophilen Granulozyten und NK-Zellen gesteigert sowie die Differenzierung von zytotoxischen T-Zellen gefördert. Zudem aktiviert es die Bildung von IL-12 durch Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen (NONNECKE et al. 2003). IL-1β reguliert in der inflammatorischen Reaktion ähnlich wie TNF-α die Expression von Adhäsinen auf Endothelzellen des Gefäßsystems und wirkt indirekt chemotaktisch auf Neu- 40 trophile. Es stimuliert die Synthese von CXCL8 und IL-6 in neutrophilen Granulozyten und Monozyten, wodurch eine Amplifikation der Entzündung begünstigt wird (HOLLÄNDER 2006). Nach der Stimulation mit bakteriellen Endotoxinen (LPS) und Lektinen wird dieses Zytokin von Milchdrüsenepithelzellen und Monozyten bzw. Makrophagen gebildet. Bei Infektionen mit S. aureus hat IL-1β nur in der frühen Phase der Infektion eine Bedeutung (YAMANAKA et al. 2000). IL-2 reguliert die erworbene Immunität, indem es das Wachstum und die Proliferation von BLymphozyten stimuliert, die NK-Zellen aktiviert und T-Lymphozyten-Aktivierung induziert. Es wird von CD4+-T-Lymphozyten produziert. Es konnte gezeigt werden, dass eine Verminderung der IL-2-Produktion zu einer reduzierten Immunkompetenz führt, welche die Anfälligkeit für Erkrankungen erhöht. Kolostrumproben, die in der letzten Trächtigkeitswoche gewonnen wurden, wiesen geringe IL-2-Gehalte auf, die mit einer reduzierten Funktion der Immunzellen korrelierte und die Anfälligkeit für Mastitiden erhöhte. Auf Grund von In-vitround In-vivo-Studien wird vermutet, dass IL-2 die funktionelle Kompetenz der lymphoiden Zellpopulationen steigern kann (DALEY et al. 1991; SORDILLO et al. 1991). IL-6 ist ein pro-inflammatorisches Zytokin und wird im Wesentlichen von Makrophagen gebildet. Es kann bei akuten coliformen oder S.-aureus-Mastitiden zum septischen Schock beitragen. Es ermöglicht auch, dass die Anzahl von Neutrophilen in der infizierten Milchdrüse reduziert wird und die Anzahl der MNC steigt. Darüber hinaus ist IL-6 eines der wichtigsten Zytokine, welches die Akute-Phase-Protein-Produktion in Hepatozyten steuert (SLEBODZINSKI et al. 2002; PERSSON WALLER et al. 2003). CXCL8 (IL-8) ist ein Chemokin, das von Makrophagen, Monozyten, T-Lymphozyten sowie von Milchdrüsenepithelzellen und Endothelzellen produziert wird. Bei Mastitiden nach E.-coli-Infektion kann CXCL8 nachgewiesen werden, bei Infektionen mit S. aureus ist es nur in geringen Konzentrationen vorhanden (PERSSON WALLER et al. 2003; ALLUWAIMI 2004; BANNERMAN et al. 2004; STRANDBERG et al. 2005). IL-12 wird von Monozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen, B-Lymphozyten und neutrophilen Granulozyten gebildet. Als Hauptfunktion induziert IL-12 die Bildung von IFN-γ. Gemeinsam mit anderen Kostimulatoren fördert es die T-Zell- und die NK-Zell-Proliferation und stimuliert in beiden Zelltypen die Ausreifung zu zytotoxischen Effektorzellen (HORNEF et al. 2002; HOLLÄNDER 2006). 41 Tab. 3 Übersicht über die Wirkungsweise der Zytokine modifiziert nach OVIEDOBOYSO (2007). Zytokine Quelle Funktion Mastitistyp und Erreger IL-1β Makrophagen und MEC Rekrutierung von PMN Klinische Mastitis durch E. coli Subklinische Mastitis durch S. aureus IL-2 CD4+-T-Lymphozyten Induziert Zellteilung und Differenzierung von B-Lymphozyten Aktiviert NK-Zellen Aktiviert CD8+T-Lymphozyten Nicht definiert IL-6 Makrophagen Reguliert die Akute-PhaseProtein-Produktion Fördert den Influx von Monozyten in die Milchdrüse Klinische Mastitis durch E. coli CXCL8 Makrophagen, Monozyten, TLymphozyten, MEC und Endothelzellen Rekrutierung von PMN in die Milchdrüse Klinische Mastitis durch E. coli Subklinische Mastitis durch S. aureus IL-12 Dendritische Zellen und TLymphozyten Reguliert die Differenzierung von T-Lymphozyten Nicht definiert IFN-γ CD4+-T-Lymphozyten, CD8+T-Lymphozyten und NK-Zellen Aktiviert T-Lymphozyten Induziert Produktion von IL-12 Steigert die phagozytotische Leistung der PMN Nicht definiert TNF-α Makrophagen, PMN und MEC Fördert die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen Klinische Mastitis durch E. coli 2.3.2 Histamin Seit Anfang der achtziger Jahre ist bekannt, dass in der bovinen Milchdrüse ein erhöhter Gehalt an Histamin nach Infektion mit E. coli gemessen werden kann (AURAND et al. 1980). Seither wird die Bedeutung dieses Amins in der Milchdrüse untersucht und diskutiert. Histamin nimmt in vielerlei Hinsicht Einfluss auf physiologische und pathologische Vorgänge, wie zum Beispiel auf die Kontraktion der glatten Muskulatur, die Sekretion der Magensäure, die Neurotransmission, das Zellwachstum und die Entzündung (CORUZZI et al. 2001). Histamin wird aus L-Histidin von einer L-Histidin-Decarboxylase (HDC) synthetisiert. Inaktiviert wird es hauptsächlich durch zwei Enzyme: Histamin N-Acetyltransferase (HMT) über 42 eine Methylierung (im zentralen Nervensystem und in der Peripherie) und Diamin-Oxidase (DAO) über die oxidative Deamination (nur in der Peripherie) (MASLINSKI 1975b; a). Der Effekt von Histamin wird über Rezeptoren vermittelt, die G-Protein gekoppelt sind: H1, H2, H3 und H4. Histamin ist in Mastzellen, basophilen Granulozyten, enterochromaffinen Zellen und Neuronen enthalten. Zusätzlich konnten Histamin-Systeme auch in Endothelzellen des Blutgefäßsystems (YAMAKAMI et al. 2000) und in Milchdrüsenepithelzellen der Ratte nachgewiesen werden (CRICCO et al. 1994; DAVIO et al. 1995; WAGNER et al. 2003). Der Histamingehalt in der Milchdrüse der Maus schwankt stark während des Zyklus und der Trächtigkeit. Am Anfang der Trächtigkeit liegt der Gehalt vierfach höher als in ruhenden Michdrüsengeweben und wie auch zu Beginn der Laktation (WAGNER et al. 2003). Die wichtigste immunreaktive Quelle von Histamin in der Milchdrüse ist die Mastzelle, aber auch Epithelzellen sollen Histamin bilden können (KIERSKA et al. 1997). Histamin inhibiert die T-Lymphozyten- und die NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität. Es hemmt die chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten und deren Superoxid-Bildung (SELIGMANN et al. 1983). Die Apoptose von humanen neutrophilen Granulozyten wird durch Konzentrationen von 10 mmol/L Histamin (entspricht 1,8 µg/mL) beschleunigt, was über den H1- Rezeptor vermittelt wird (HUR et al. 2003). Auch für peritoneale Makrophagen der Maus konnte eine Inhibition der Chemotaxis und eine Inhibition der SuperoxidProduktion bei Histaminkonzentrationen von 1 nmol/L und 100 nmol/L nachgewiesen werden (AZUMA et al. 2001). Außerdem wurden durch Histaminkonzentrationen von 1 nmol/L und 100 nmol/L (entspricht 18,4 ng/mL) eine reduzierte Phagozytoseleistung sowie eine geringere Produktion von IL-12 und TNF-α beobachtet. In humanen neutrophilen Granulozyten wurde eine verminderte Leukotrien-Biosynthese durch eine Histaminkonzentration von 30 nmol/L (entspricht 5,5 ng/mL) und 1 µmol/L (entspricht 184 ng/mL) festgestellt. Diese Effekte werden über den H2-Rezeptor vermittelt. Hieraus ergibt sich folglich, dass Histamin das Potential hat, die initiale Phase der Milchdrüsenentzündung zu modulieren (FLAMAND et al. 2004). In der Milchdrüse der Ratte wurde Histamin als Wachstumsfaktor für Karzinomazellen identifiziert (RIVERA et al. 1994). Histamin war auch in der Lage, allein oder in der Anwesenheit von Oxytocin die Milchsekretion bei Ziegen in vitro und in vivo zu erhöhen (ERIKSSON et al. 1999). Im humanen Zellmodell modulierte Histamin die Prolaktin-Freisetzung autokrin und parakrin (BUHIMSCHI 2004). Der Gehalt an Histamin nach klinischer Klebsiellen-Infektion lag zwischen 44 ± 12 ng/mL bis 312 ± 104 ng/mL in den infizierten Eutervierteln und bei 72 ±24 ng/mL in der Milch von Kontroll-Eutervierteln (ZIA et al. 1987). 43 2.3.3 Andere lösliche Faktoren Zu den unspezifischen bakteriostatischen Faktoren der Milchdrüse gehört Lactoferrin, ein Eisen-bindendes Protein aus der Transferrin-Familie. Es wird von den Epithelzellen, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten gebildet. In den Neutrophilen ist Lactoferrin in den sekundären Granula lokalisiert und kann im Milchsekret nachgewiesen werden. Da es weit reichende anti-bakterielle Eigenschaften hat, zählt es zu einem der wichtigen Komponenten der unspezifischen Abwehr der Schleimhäute (BROCK 2002; WARD et al. 2002). Es bindet freies Eisen in der Milchdrüse und macht es somit unzugänglich für Bakterien wie z.B. E. coli, die dieses Element für ihren Stoffwechsel oder als Wachstumsfaktor brauchen (KUTILA et al. 2004). Lactoferrin kann auch an die äußere Membran von gram-negativen Bakterien binden, was zur Freisetzung von LPS führt und somit die Integrität der Zellmembran schädigt (ELASS-ROCHARD et al. 1995). Darüber hinaus ist Lactoferrin in der Lage, die LPS-induzierte Zytokinausschüttung in vitro und in vivo zu reduzieren (HAVERSEN et al. 2002). Die Konzentration von Lactoferrin im Sekret der trockenstehenden Milchdrüse und des Kolostrums ist deutlich höher als die von Milch gesunder Milchdrüsen (0,02 bis 0,45 mg/mL) (WELTY et al. 1976). Der Gehalt nach intramammärer Infektion ist ebenfalls höher (KAWAI et al. 1999; HAGIWARA et al. 2003). Das bovine Komplement-System übernimmt auch in der Milchdrüse wichtige Aufgaben bei der Infektabwehr. Die Proteine des Komplementsystems werden hauptsächlich von Hepatozyten, aber auch von Monozyten und Makrophagen produziert. Sie wirken chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten, opsonisieren und lysieren Bakterien. Gram-negative Bakterien (wie E. coli) können durch Komplementproteine lysiert werden, während gram-positive Bakterien (wie S. aureus) durch C3b und C3bi opsonisiert werden können. Die bakteriziden Fähigkeiten von Komplementproteinen sind in entzündeten Eutervierteln gesteigert. Es ist bekannt, dass die C3-Konzentration in infizierten Milchdrüsen höher ist als in gesunden Milchdrüsen (KORHONEN et al. 2000; BARRIO et al. 2003; RAINARD 2003). 2.4 Formen des Zelltodes Der Zelltod ist ein physiologischer Bestandteil komplexer biologischer Systeme und spielt deshalb auch innerhalb des Immunsystems eine wesentliche Rolle. Aufgrund ihrer einzigartigen morphologischen Kriterien können 4 Arten von Zelltod unterschieden werden: Autophagie, Nekrose, Apoptose, NET-Formation (NET, neutrophil extracellular traps). 44 Die Autophagie entspricht einem wesentlichen Prozess, bei welchem zelleigene Proteine und Organellen in Lysosomen degradiert werden, um auf diese Weise bei Mangel Energie für die Zelle zu erzeugen und Zellbestandteile wieder verwenden zu können. Unter gewissen Umständen kann Autophagie auch zum Zelltod führen. Diese Art von Zelltod wird für die neutrophilen Granulozyten ausgeschlossen, da der Zelltod durch einen Inhibitor der Autophagie nicht verhindert werden konnte (TSUJIMOTO u. SHIMIZU 2005; LUO u. LOISON 2008). Die Nekrose ist ein durch exogene physikalische oder chemische Einflüsse induzierter Zelltod. Es handelt es sich um einen Vorgang, bei dem Zellbestandteile nicht nur enzymatisch degradiert werden, sondern auch in ihrer Umgebung zu einer lokalen Entzündungsreaktion mit nachfolgender Zell- und Gewebeschädigung führen. Die an der Nekrose beteiligten molekularen Mechanismen sind zurzeit noch ungenügend bekannt (KANDUC et al. 2002; HOLLÄNDER 2006). Die NET-Formation stellt eine besondere Form des Zelltodes dar, die einzig für neutrophile Granulozyten beschrieben wurde (FUCHS et al. 2007). Neutrophile Granulozyten bilden hierbei extrazelluläre Netze, die Pathogene binden und töten können. Diese Netze bestehen aus DNA, in die anti-mikrobielle Peptide und Enzyme (Elastase und Myeloperoxidase) aus den Granula der neutrophilen Granulozyten eingebettet sind. Es konnte gezeigt werden, dass NETs ausschließlich von reifen neutrophilen Granulozyten nach Aktivierung gebildet werden. Die NET-Bildung konnte durch CXCL8, Phorbol Myristat Acetat (PMA), LPS sowie S. aureus induziert werden und erwies sich als abhängig von der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (BRINKMANN et al. 2004; FUCHS et al. 2007). Auf Grund von In-vitro-Studien wurde vermutet, dass Interferone vom Typ I und II reife neutrophile Granulozyten „primen“ und die Bildung von NETs nach Stimulation mit Komplementfaktor 5a (C5a) ermöglichen (MARTINELLI et al. 2004). Zudem wird vermutet, dass Fc- und Toll-like-Rezeptoren in diesen Vorgang involviert sind (URBAN et al. 2006). Durch die Unterschiede bezüglich der morphologischen und biochemischen Vorgänge in den Zellen ist die NET-Formation klar von der Apoptose und Nekrose zu unterscheiden (FUCHS et al. 2007). Außerdem läuft dieser Vorgang schneller ab, denn NET-Formationen können schon innerhalb von 10 Min. nach dem Einwirken des Stimulus beobachtet werden (BRINKMANN et al. 2004; BUCHANAN et al. 2006). Die Apoptose ist die häufigste Form des Zelltodes bei Eukaryonten und wird auch „der programmierte Zelltod“ genannt. Er ist bei der embryonalen Entwicklung sowie zur Aufrechterhaltung eines homöostatischen Gleichgewichtes im Körper unabdingbar (JANEWAY et al. 45 2005). Im Rahmen der Apoptose werden im Gegensatz zur Nekrose Zellbestandteile nicht in den Extrazellularraum abgegeben, sondern in geschlossenen Vesikeln aus der toten Zelle ausgeschleust (KANDUC et al. 2002). Morphologisch zeichnet sich die Apoptose durch Kondensation des Zytoplasmas, der intrazellulären Organellen und des Chromatins aus sowie durch die Bildung und Abschnürung von Zellausstülpungen, die fragmentierte Zellbestandteile beinhalten können (MAIANSKI et al. 2004a; MAIANSKI et al. 2004b). Ein frühes Ereignis nach Induktion der Apoptose ist die Aufhebung der Phospholipidasymmetrie der Zellmembran. Das ursprünglich innen gelegene Phosphatidylserin wird bei apoptotischen Zellen an der Oberfläche exprimiert (PAYNE et al. 1994). Dies führt zu einer verstärkten Bindung an Makrophagen über ihren Phosphatidylserin-Rezeptor und zur Phagozytose der apoptotischen Vesikel („apoptotic bodies“) (MCEVOY et al. 1986). 2.4.1 Signalwege der Apoptose Die Apoptose wird über zwei unterschiedliche Signaltransduktionswege reguliert. Einerseits führen extrinsische Signale über membranständige Todesrezeptoren zur Apoptose, andererseits sind es intrinsische Signale, welche in der Regel über Mitochondrien zu dieser Form der Apoptose führen. Die Induktion über den extrinsischen Pfad (Abb. 2, linke Seite) erfolgt in Lymphozyten durch Ligandenbindung eines der sechs bekannten „Todesrezeptoren“. Sie sind in der Lage nach Bindung entweder zur Zellaktivierung, Zelldifferenzierung oder zum Zelltod zu führen. Nach der Bindung des Liganden wird der Rezeptor oligomerisiert und das Adapterprotein an die Todesdomäne gebunden. Dieser Komplex wird zum intrazellulären „Death Inducing Signalling Complex“ (DISC). Bisher bekannte Todesrezeptoren sind der TNF-Rezeptor-1, das TNFreceptor related apoptosis mediating protein (TRAMP), der TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor 1, der TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor 2 und das CD95 (alt: Fas oder APO-1) (SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998). Der DISC induziert eine Kaskade von Proteinasen, die Caspasen. Dies sind Cystein-CProteinasen, die typischerweise ihre Zielproteine nach der Asparaginsäure (Asp) spalten. Die Spaltung von Caspase 8 wird durch DISC aktiviert und initiiert somit die Effektor-Caspasen wie Caspase 3, die schließlich die finalen Schritte des Apoptoseprogramms einleiten. Aktivierte Caspase 3 kann ihrerseits proapoptotische Caspasen aktivieren und verstärkt somit das Apoptosesignal (siehe gestrichelte Linien in der Abb. 2) (GREEN u. EVAN 2002). In neutrophilen Granulozyten sind TNF-α und Fas-Ligand die zwei bedeutendsten Liganden, die zur Apoptose von neutrophilen Granulozyten führen (YAMASHITA et al. 1999; MAIANSKI et al. 2003). 46 Der intrinsische Pfad der Apoptose wird durch Stressreize hervorgerufen, die biochemische Veränderungen im Bereich der Mitochondrien auslösen. Als Signale hierfür gelten sowohl die Schädigung der DNA, als auch Glukokortikoide, oxidativer Stress und Entzug von Wachstums- und Differenzierungsstimuli. So kann das spezifische Fehlen von Zytokinen oder das Ausbleiben von kostimulatorischen Signalen bei Lymphozyten diese Form der Apoptose initiieren (HOLLÄNDER 2006). Außerdem besteht eine Verbindung zum extrinsischen Pfad der Apoptose, da es durch die Aktivierung von Caspase-8 ebenfalls zur Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien kommt (Abb. 2). Dieser Vorgang leitet die Apoptose der Zellen ein. Die Rolle der Mitochondrien wird in 2.4.3 näher beleuchtet. 47 Extrinsischer Pfad Intrinsischer Pfad (Abhängig vom Todesrezeptoren) (mitochondrial / Stress induziert) TNF-α/FasL Mitochondrien Aktivierung der Caspase 8 Amplifikation Freisetzung proapoptotischer Proteine (z.B. Bax, Bak, Bid ) Cytochrom C Smac/Diabolo Caspase 9 Aktivierung Deaktivierung der IAP Caspase 3 Aktivierung Apoptose Abb. 2 Signaltransduktionswege der Apoptose modifiziert nach MAIANSKI (2004). Durch die Bildung des DISC nach Aktivierung der Todesrezeptoren wird Caspase 8 gespalten und initiiert somit die Effektor Caspasen wie Caspase 3, die schließlich die finalen Schritte des Apoptoseprogramms einleiten (linke Seite der Abb. 2). Aktivierte Caspase 3 kann ihrerseits pro-apoptotische Caspasen aktivieren und verstärkt somit das Apoptosesignal (gestrichelte Linie). Beim intrinsischen Apoptosepfad kommt es zu einer Zunahme der Permeabilität der Mitochondrienmembranen und einer Freisetzung von Cytochrom C sowie anderen Peptiden ins Zytoplasma, wie Smac/Diabolo und AIF (Apoptosis inducing factor). Smac/Diabolo deaktiviert die IAP (Inhibitors of Apoptosis). Cytochrom C bildet folglich mit dem APAF1 (apoptosis activating factor-1) einen Komplex, das so genannte Apoptosom, der Pro-Caspase 9 in Caspase 9 umwandelt, die wiederum über Caspase 3 die finalen Schritte zum Zelltod einleitet (rechte Seite der Abb. 2.). 2.4.2 Modulation der Apoptose bei neutrophilen Granulozyten Bei inflammatorischen Prozessen kann es von Vorteil sein, dass die Lebensdauer neutrophiler Granulozyten verlängert wird, damit bakterielle Erreger effizienter phagozytiert und getötet werden können. Durch ihre ROS-Bildung und Enzyme sind sie allerdings auch in der Lage, umliegendes Gewebe zu beschädigen. Die Apoptose von Neutrophilen ist die effektivste 48 Möglichkeit, Zellen ohne pro-inflammatorische Wirkung durch Freisetzung der aktiven Sauerstoffradikale und Enzyme zu eliminieren. Die Apoptose kann somit als regulativer Kontrollmechanismus angesehen werden, der für eine ausgewogene Balance zwischen der Funktion und der sicheren Elimination von neutrophilen Granulozyten sorgt (FANNING et al. 2002; LUO u. LOISON 2008). Die Apoptose der Neutrophilen wird u.a. über Zytokine und Chemokine gesteuert (TSUCHIDA et al. 1995). Auch eine Induktion der Apoptose durch direkten Zellkontakt mit Makrophagen wurde beschrieben (ALIPRANTIS et al. 1999). Für TNF-α wurde sowohl eine pro-apoptotische als auch eine anti-apoptotische Wirkung festgestellt. In geringen Konzentrationen wirkt TNF-α anti-apoptotisch, während hoch dosiertes TNF-α den Zelltod einleitet (VAN DEN BERG et al. 2001; AKGUL u. EDWARDS 2003). LILES et al. (1996) beschrieben die Möglichkeit des autokrinen Todes von Neutrophilen durch die konstitutive Koexpression von CD95 (Fas) und Fas-Ligand auf ihrer Zelloberfläche. Neutrophile sind hochempfindlich gegenüber einer Induktion einer Fas-vermittelten Apoptose in vitro nach Stimulation mit einem Antikörper gegen Fas. Durch die Inkubation mit z.B. G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α oder Dexamethason kann die Fas-vermittelte Apoptose gehemmt werden (LILES et al. 1996). Arachidonsäure und verschiedene Arachidonsäure-Metaboliten (Leukotriene und Prostaglandine) wirken anti-apoptotisch auf neutrophile Granulozyten (KOLLER et al. 1997). Für PGE2 wurde ein anti-apoptotischer Effekt für neutrophile Granulozyten beobachtet (WALKER et al. 1997). Für Stickoxid (NO) sind verschiedene Effekte bei unterschiedlichen Spezies beschrieben (ADLER et al. 1995), wohingegen von FORTENBERRY (1998) dem NO ein proapoptotischer Effekt auf humane Granulozyten zugewiesen wurde. Es wird vermutet, dass in neutrophilen Granulozyten der intrinsische Apoptosepfad von großer Bedeutung ist, da neutrophile Granulozyten spontan einen raschen Zelltod ohne externe Einflussfaktoren durchlaufen. Allerdings ist dieser Apoptoseweg noch nicht hinreichend geklärt (MAIANSKI et al. 2004b). Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies führt zur Apoptose von neutrophilen Granulozyten, da vermutlich durch die Generierung von NADPH die Gehalte an Cytochrom C in der Zelle sehr gering sind. Folglich wird die Aktivität der respiratorischen Kette reduziert und es kommt zu einer Akkumulation von Elektronen, und einem daraus resultierenden Zusammenbruch des Mitochondrienmembranpotentials (MMP) (MAIANSKI et al. 2004b). SCHEELTOELLNER et al. (2004) konnten allerdings zeigen, dass ausschließlich die nichtphagosomale Generation von ROS, die durch an der Zelloberfläche anhaftenden Bakterien hervorgerufen wird, die Apoptose einleitet und somit für die Lokalisation der ROS-Produk- 49 tion entscheidend ist. Die Bildung von ROS hat direkten Einfluss auf die Aktivität von NFКB und MAPK, die eine tragende Rolle in der Signaltransduktion (Überlebens-/Todessignale) spielen (FORTENBERRY et al. 2001; KWON et al. 2003). Außerdem ist die Aktivität von Calpainen entscheidend für die Einleitung des intrinsischen Apoptosepfades. Calpaine gehören zu der Familie der Nicht-Caspase-Proteasen und sind konstitutiv in frisch isolierten Neutrophilen nachzuweisen (KNEPPER-NICOLAI et al. 1998). Beim Absterben der Zelle reduziert sich der Gehalt von Calstatin, einem hochspezifischen Calpain-Inhibitor, was zu einer verstärkten Calpain-Aktivität führt. Aktiviertes Calpain führt zur Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien, zur Aktivierung von Caspase 3 und schließlich zum Zelltod. Sowohl beim intrinsischen als auch bei dem extrinsischen Pfad sind Caspasen beteiligt. Sie liegen als Proenzyme vor. Die im Aktivierungspfad proximal gelegenen Signal-Caspasen (Caspase -2, -8, -9, -10) werden durch Dimerisierung und die im Aktivierungspfad distal positionierten Effektor-Caspasen (Caspase-3, -6, -7) werden durch proteolytische Spaltung aktiviert. Die Mitglieder der Familie der BcL-2 Moleküle modulieren Vorgänge der Apoptose entweder über die Wirkung als pro-apoptotische Proteine (Bax, Bak, Bid, Bad, Bim und andere) oder als anti-apoptotische Proteine (Bcl-2, Bcl-xL) (HOLLÄNDER 2006). Als Folge der Apoptose sind insbesondere die rezeptorvermittelten Funktionen der neutrophilen Granulozyten herab reguliert. Sie verlieren ihre Fähigkeit zur Chemotaxis, zur Phagozytose, zur Degranulation und zur ROS-Bildung (MAIANSKI et al. 2004b). Eine Übersicht über intrazelluläre und extrazelluläre Modulatoren der Apoptose neutrophiler Granulozyten wird in Tab. 4 dargestellt. 50 Tab. 4 Intrazelluläre und extrazelluläre Modulatoren der Apoptose neutrophiler Granulozyten modifiziert nach LUO und LOISON (2008). Modulatoren Mechanismen Intrazelluläre Modulatoren Reaktive Sauerstoffspezies DNA-Schädigung, Aktivierung von NFКB und MAP-Kinase Caspasen Aktivierung der Caspase-Kaskade und folgender DNA-Spaltung BcL-2 Familie Reguliert die Mitochondrienmembran-Permeabilität und folgende Cytochrom C-Freisetzung und Caspase-Aktivierung Calpain Aktiviert den pro-apoptotischen Faktor Bax, deaktiviert den Apoptoseinhibitor (IAP) Extrazelluläre Modulatoren Pro-apoptotische Stimuli Fas-Ligand (Fas L) Verstärkte Permeabilität der Mitochondrien und der CaspaseAktivität TNF-related apoptosis ligand (TRAIL) Verstärkte Permeabilität der Mitochondrien und der CaspaseAktivität durch TRAIL-Rezeptoren Phagozytose ROS-Produktion, Caspase-Aktivierung, Genexpression von proapoptotischen Faktoren TNF-α (hochdosiert) ROS-Produktion, Aktivierung MAP-Kinase, Calpain-Aktivierung NO pro-apoptotisch Anti-apoptotische Stimuli Interferone vom Typ I und II Verstärkte Expression von „cellular inhibitor of apoptosis“ cIAP2 TNF-α (gering dosiert) CXCL8-Sekretion, Expression von Überlebensfaktoren, Hemmung von pro-apoptotischen Faktoren G-CSF und GM-CSF Anti-apoptotisch LPS Hochregulation von lebensverlängernden Faktoren, Hemmung von pro-apoptotischen Faktoren Zelladhäsion Aktivierung von Überlebenssignalen TNF-α (gering dosiert) Aktivierung von PI3-Kinase,CXCL-8-Sekretion, Expression von Überlebensfaktoren IL-4, IL-6, CXCL8, IL-15, IFN-γ Anti-apoptotisch LTB4 Anti-apoptotisch PGE2 Anti-apoptotisch 51 2.4.3 Die Rolle der Mitochondrien in der Apoptose Die Aufgabe der Mitochondrien besteht hauptsächlich darin, sowohl über die Glykolyse als auch mit Hilfe der oxidativen Phosphorylierung ATP-Moleküle zu synthetisieren (STARK u. RODEN 2007). Nicht zuletzt haben sie eine wichtige Funktion im Rahmen des Zelltodes (NEWMEYER u. FERGUSON-MILLER 2003). Der Mitochondrienaufbau zeichnet sich durch zwei voneinander getrennte Membransysteme aus. Eine glatte äußere und eine innere, stark gefaltete Membran, welche die Mitochondrienmatrix umschließt. Bei der oxidativen Phosphorylierung (Atmungskette) kommt es zur Ausschleusung von Protonen aus der Mitochondrienmatrix und an der inneren Mitochondrienmembran entsteht ein elektrochemischer Gradient der als Mitochondrienmembranpotential (MMP) bezeichnet wird (LEHNINGER et al. 2001). Das MMP funktionstüchtiger Mitochondrien liegt zwischen -180 mV und -200 mV. Dieser elektrochemische Gradient zwischen Innen- und Außenseite der inneren Mitochondrienmembran dient der Synthese der ATPMoleküle, wodurch sich über die Höhe des MMPs Rückschlüsse auf die Mitochondrienfunktion und den Energiestatus von Zellen ziehen lassen (COSSARIZZA 1996) Der Verlust des Mitochondrienmembranpotentials (MMP) ist ein sehr frühes Ereignis des Zelltodes, der noch vor den morphologischen Veränderungen einer Zelle erfasst werden kann. Ist das Membranpotential gestört, werden Proteine in das Zytosol freigesetzt, die den Zelltod induzieren oder verstärken können. Cytochrom C spielt eine Schlüsselrolle in der Bildung des Apoptosoms, welches die Signalkaskade zum Zelltod initiiert. Für weitere mitochondriale Proteine wie AIF und Smac/Diabolo sind bisher nur pro-apoptotische Funktionen nachgewiesen worden (NEWMEYER u. FERGUSON-MILLER 2003). Bis in die achtziger Jahre wurde das Vorkommen und die Rolle von Mitochondrien in neutrophilen Granulozyten diskutiert, denn man vermutete, dass diese Zellen keine oder nur sehr wenige Mitochondrien beinhalten, die außerdem funktionell zu vernachlässigen wären. Elektronenmikroskopisch konnten nur wenige Mitochondrien identifiziert werden (FOSSATI et al. 2003) und Cyanide, mitochondriale Gifte, waren nicht im Stande zelluläre Funktionen zu beeinflussen (BORREGAARD u. HERLIN 1982). Auch die mitochondriale Respiration konnte in Neutrophilen nur im geringen Umfang nachgewiesen werden (FOSSATI et al. 2003). Allerdings konnten durch fluoreszierende Farbstoffe Mitochondrien in neutrophilen Granulozyten als tubuläres Netzwerk dargestellt werden (MAIANSKI et al. 2002; FOSSATI et al. 2003). Zudem wiesen neutrophile Granulozyten, deren Apoptose spontan verlief oder induziert wurde, Mitochondrien-Cluster auf (PRYDE et al. 2000; MAIANSKI et al. 2003). Dieser Vorgang ist eine Folge des Verlustes des Mitochondrienmembranpotentials (MMP). Die Mitochondrien neutrophiler Granulozyten sind also sowohl zur Aufrechterhaltung physiologi- 52 scher Zellfunktionen als auch für die Regulation des Zelltodes und damit der Lebensspanne von zentraler Bedeutung. 2.4.3.1 Bestimmung des Mitochondrienmembranpotentials (MMP) Das lipophile Kation 5, 5´, 6, 6´-Tetrachloro-1, 1´, 3, 3´-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid (JC-1) ist ein membranpermeables Cyanid mit einer delokalisierten positiven Ladung (REERS et al. 1995). Dieser metachromatische Farbstoff kann sowohl in monomerer Form vorliegen oder reversibel in Aggregatform übergehen. JC-1-Monomere werden in die Mitochondrienmatrix eingeschleust (COSSARIZZA 1996). Da es sich um ein positiv geladenes Molekül handelt, ist der Einstrom umso stärker, je höher das Mitochondrienmembranpotential ist. Ab einem Schwellenwert des MMP von –80 mV bis –100 mV werden reversibel JC-1Aggregate gebildet. Nach einer Laseranregung (488 nm) fluoresziert die monomere Form von JC-1 mit einer Wellenlänge von 527 nm grün, während es in Aggregatform bei 590 nm oranges Licht emittiert (REERS et al. 1995). Folglich lassen sich mit Hilfe dieser Färbung und anschließender durchflusszytometrischer Auswertung neutrophile Granulozyten mit hohem MMP, deren Mitochondrien orange fluoreszieren, von denen mit niedrigem MMP, deren Mitochondrien grün fluoreszieren, unterscheiden (COSSARIZZA 1996). 2.5 Mastitis-Infektionsmodelle In den letzten Jahrzehnten wurden zahlreiche modellhafte Untersuchungen zu pathogenetischen Fragestellungen sowie Erfolgsaussichten prophylaktischer und therapeutischer Ansätze bei der Mastitis durchgeführt (SCHALM et al. 1964). Physiologische Vorgänge können die Entstehung von Mastitiden beeinflussen. Insbesondere in der peripartalen Phase treten massive metabolische und hormonelle Veränderungen auf. Die Rolle des Energiestatus der Kuh (SURIYASATHAPORN et al. 2000a) und die immunmodulatorische Kompetenz der peripartal stark veränderlichen Steroidhormone wie Östrogene, Progesteron und Kortikosteroide werden diskutiert (WESSENDORF et al. 1998; SCHEIBL u. ZERBE 2000). Die Auswahl der Tiere folgte sehr variablen Gesichtspunkten. In wenigen Fällen wurden die Versuchtiere streng nach Laktationszeitpunkt, Anzahl bisheriger Laktationen, niedriger Zellzahl und wiederholt bakteriologisch negativen Befunden ausgewählt (SCHUKKEN et al. 1999). Die Angaben über Infektions- und Versuchsdauer differieren von 96 Stunden (KORNALIJNSLIJPER et al. 2003) bis zu 21 Tagen (LOHUIS et al. 1990) für E. coli und 72 Stunden bis 48 Tage für S. aureus (SHOSHANI et al. 2000; MIDDLETON et al. 2004). 53 Ein wichtiges Kriterium für die Auswahl der Tiere und der Euterviertel stellt die Zellzahl in der Milch (SSC) dar. In der Praxis ist der SCC ein wichtiger Indikator für die Eutergesundheit (PYÖRÄLÄ 2002). Die Angaben über prä-experimentelle SCC-Werte variieren von <20.000 somatische Zellen/mL Milch (HENSEN et al. 2000a) bis <600.000 somatische Zellen/mL Milch (EBLING et al. 2001) für S. aureus und <30.000 bis <500.000 für E. coli (SCALETTI et al. 2003; BANNERMAN et al. 2004). Üblicherweise liegt die obere Grenze jedoch zwischen <150.000 und <250.000 (KREMER et al. 1993; PERSSON WALLER et al. 2003; KORNALIJNSLIJPER et al. 2004; VANGROENWEGHE et al. 2004). Es wurde festgestellt, dass ab einem Wert von >100.000 Zellen/mL davon auszugehen ist, dass die normale zelluläre Abwehr in eine entzündliche Reaktion übergeht (HESS u. EGGER 1969; REICHMUTH 1975; DOGGWEILER u. HESS 1983). PETZL (2005) beobachtete starke interindividuelle Unterschiede im Differentialzellbild der Milch bereits bei einem SCC-Wert <100.000 Zellen/mL und postulierte, dass zukünftig die Maximalgrenze auf 50.000 Zellen/mL herabgesetzt werden sollte. Somit könnte eine größtmögliche Freiheit von entzündlichen Veränderungen garantiert werden. Auch KÖß (2004) konnte feststellen, dass sich das Differentialzellbild in der Milch bereits ab 50.000 Zellen/mL zugunsten der PMN verschiebt. Über die Auswahl von Bakterienstämmen und Infektionsdosen für die Infektionen sind unterschiedliche Angaben in der Literatur zu finden. Für die E.-coli-Mastitis konnte gezeigt werden, dass der Stamm für die Schwere des Mastitisverlaufs nebensächlich ist (BRAMLEY 1991; WENZ et al. 2006). Außerdem handelt es sich um ubiquitär vorkommende Umweltkeime, die über die Faeces der Tiere ausgeschieden werden (JONES 1990) und als Opportunisten eine Infektion jederzeit möglich machen (LINTON u. ROBINSON 1984). Die Infektionsdosis schwankt zwischen 30 und 10.000 KbE/Euterviertel (KORNALIJNSLIJPER et al. 2004; VANGROENWEGHE et al. 2004). Während bei der Untersuchung von S.-aureus-Infektionen in den meisten Modellen die natürliche Barriere des Strichkanals umgangen und direkt intrazisternal infiziert wurde, wurden entsprechend der Fragestellungen Versuchsanordnungen verwendet, bei denen die Erreger lediglich mit der Zitzenhaut in Berührung kommen (BODDIE u. NICKERSON 2002; LESLIE et al. 2005). In den meisten Untersuchungen wurde angegeben, dass die gängigen bakteriellen Mastitiserreger in den eingesetzten Eutervierteln nicht nachgewiesen werden konnten. In dem von PETZL (2005) etablierten Mastitis-Modell wurde stets ein bakteriologischer Nachweis des Erregers in der Milch der infizierten Milchdrüse mitgeführt. Außerdem wurde in diesem Mastitis-Modell erstmalig eine sequentielle Inokulation mehrerer Euterviertel eines Tieres durchgeführt. Dazu wurden den Eutervierteln 24 h, 12 h und 6 h vor der Sektion der Tiere E.-colioder S.-aureus-Bakterien injiziert. Zusätzlich wurden weitere Tiere 72 h und 12 h vor der 54 Sektion mit S. aureus infiziert. Es zeigte sich, dass zuerst inokulierte Euterviertel Einfluss auf die Dynamik der Zellzahl-Entwicklung nachfolgend infizierter Euterviertel nahmen. Diese Beobachtung legte nahe, dass sich die Euterviertel im Rahmen der Infektion gegenseitig durch Mediatoren beeinflussen. Die Mastitis-Modelle wurden zur Bearbeitung unterschiedlichster Fragestellungen eingesetzt, wie beispielsweise die Effekte auf die Milchleistung, den klinischen Verlauf der Erkrankung, die Bakterienvermehrung und die somatischen Zellzahlen. Dazu kommt eine ganze Reihe von Messparametern auf der Ebene humoraler oder zellulärer Immunkomponenten in der Milch und im peripheren Blut, wie die Funktionalität und der Immunphänotyp von Blut- und Milchleukozyten sowie die Zytokinprofile und Enzymaktivitäten in Serum und Milch. MastitisModelle dienten weiterhin zur Evaluierung von Vakzinierungs- (TOMITA et al. 1998) und Therapiekonzepten (KUTILA et al. 2003; PERSSON WALLER et al. 2003) sowie zur Analyse von genetischen Einflüssen auf das Mastitisrisiko (SCHUKKEN et al. 1994). 55 3 Geräte, Material und Methoden 3.1 Geräte Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anlage, „Typ RO 50/14SMB Typ I“ (Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel) Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“ (Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel) Autoklav Typ GE406 (Getinge AB, Getinge/Schweden) Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 (Heraeus, Hanau) Bunsenbrenner mit automatischer Zündung (Wartewig (6.001.000), Göttingen) Centricon®– Filtrationssystem (Amicon, Beverly/MA, USA) CO2-Flasche zur Sterilfiltration (Kohlensäurewerke Hannover, Hannover) Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless steel pressure vessel“ (Alloy Products (XX670053) Wisconsin, USA) Eismaschine Typ UBE 30-10 (Ziegra, Isernhagen) ELISA-Platten Waschgerät (Dynatech, Denkendorf) ® Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell FACScan , mit angeschlossener Computereinheit (Becton Dickinson, Heidelberg) Fluoreszenzmikroskop mit Ploemilluminator und Phasenkontrasteinrichtung (Zeiss (476250-9901), Oberkochen) LKB Wallac 1273 Clinigamma (Gamma-Counter) (Ehem. Wallac Oy, Turku, Finnland, Perkin Instruments, Rodgau) Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ (Heraeus, Hanau) Invertmikroskop (Zeiss, Oberkochen) Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C) (Einzelhandel) Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor, Hochgeschwindigkeitsaufsatz und Mikrotiterplattenrotor (Heraeus Instruments, Osterode) Laborfeinwaage „B6“ (Mettler, Zürich/Schweiz) Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ (Knick, Berlin) Laborwaage „BL310“ (Sartorius GmbH, Göttingen) LightCycler® (Roche Diagnostics, Mannheim) Magnetrührer mit Heizplatte (Janke und Kunkel, Staufen) Mikrotiterplatten-Filterphotometer ELISA-Reader Dynatech MR 5000 (Dynatech, Denkendorf, Kontakt: Dynex Technologies, USA) NanoDrop®, ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen) 56 Photometer Dynatech MR 5000 (Eppendorf, Hamburg) Pinzette, gebogen, anatomisch (Eickemeyer (170710), Tuttlingen) Pipette, einstellbar „Transferpette®“ (2-20 µL) (Brand (09U2539), Wertheim) Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µL, 10-100 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL) (Gilson, Villers Le Bel/Frankreich) Pipettierhilfe „accu-jet®“ (Brand (26404), Wertheim) Plastikbox mit Gittereinsatz (Einzelhandel) Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS) (Heraeus-Christ. Osterode) Reinwerkbank Laminair HL2448 (Heraeus-Christ, Hanau) Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“ (Dynatec, Zug/Schweiz) Schlauchpumpe zum Absaugen von Flüssigkeiten „Rumo100“ (Heidolph (52100), Schwabach) Schüttelinkubator RS 90-4 UF (SG Barsbüttel) Tiefkühltruhe -80°C (Kendro, Hanau) Tischzentrifuge „Chemico“ mit Winkelmotor (Wifug (10209), Bradford/England) Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ (Hermle, Gosheim) Wasserbad mit Temperaturregelung „Typ 1003“ (GFL, Hannover) Zählkammer nach Bürker (Brand, Wertheim) Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ (Heraeus Instruments, Osterode) 3.2 Material 3.2.1 Klinikbedarf Dalmazin®, Cloprostenol-Natriumsalz (Fatro, Ozzano Emilia/Italien) CMT-Test (WDT, Garbsen) Kanülen 1,80 x 40 mm, steril „TSK STERIJECT“ (TSK-Supra, Tochigi/Japan) Staukette nach Witte (Eickemeyer (442015), Tuttlingen) Vacutainer Brand Luer Adapters (Becton Dickinson (367300), Heidelberg) Vacutainerröhrchen, 10 mL, EDTA-K2 (18 mg) (Becton Dickinson (367525), Heidelberg) Vacutainerröhrchen, 10 mL, Heparin (170 IU) (Becton Dickinson (368480), Heidelberg) Vacutainerröhrchen, 10 mL, ohne Zusatz (Becton Dickinson (368430), Heidelberg) 57 3.2.2 Laborbedarf Combitips, 1,25 mL (Eppendorf (0030069.420), Hamburg) Combitips, 2,5 mL (Eppendorf (0030069.447), Hamburg) Cryo-Freezing-Container (Nalgen Co., Rochester,. U.S.A.) Einmal-Filter, Celluloseacetate Membrane, 0,2 µm, steril (Renner (26146040), Dannstadt) Einmal-Küvetten 2,5 mL makro PMMA (Brand, Wertheim) Einmal-Pasteurpipetten aus Pe-Ld (Merck (612F1767), Darmstadt) Eppendorf-Reaktionsgefäß, 0,5 mL (Sarstedt (72699), Nürnbrecht) Eppendorf-Reaktionsgefäß, 1,5 mL (Greiner (616201), Frickenhausen) Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 96 Vertiefungen (Biochrom (P92960), Berlin) Flachboden–Mikrotiterplatten, Nunc Immuno Plate, ELISA (Nunc (363-401), Wiesbaden) Laborflaschen mit Gewinde, 500 mL (VWR international (215L1516), Hannover) Mikrobank-System Cryobank™ (Mast Diagnostika (291609), Reinfeld) Neutralit®- pH 5-10, pH-Indikatorstäbchen nicht blutend (Merck (1.09533), Darmstadt) Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas (Brand (747720), Wertheim) Petrischalen 94 mm Durchmesser (Greiner(616222),, Frickenhausen) Pipettenspitzen, gelb und blau (Sarstedt (70/762002) (70/760002), Frickenhausen) Polycarbonat-Membran 25 x 80 mm, 3 µm Porengröße, PVP Membranen (Cytogen (155812), Ober-Mörlen) Polystyrolröhrchen (Nerbe Plus (62 161 0000) Winsen/Luhe) Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 mL (Becton Dickinson (352008), Heidelberg) Rundboden-Mikrotiterplatten mit Abdeckung; steril, 96 Vertiefungen (Gechno Plastic Products TPP®, Trasadingen/Schweiz) Saugpipetten, 10 mL (Sarstedt (86.1254.01), Nürnbrecht) Zellkulturflaschen, 200 mL (Nunc (156499), Wiesbaden) Zellkulturflaschen, 75 mL (Nunc (136196), Wiesbaden) Zentrifugenröhrchen, 50 mL aus Polypropylen (Falcons, steril) (Corning (430829), Wiesbaden) Zentrifugenröhrchen, 15 mL aus Polypropylen (steril) (Sarstedt (62.554.502), Nürmbrecht) 58 3.2.3 Reagenzien Accutase (PAA (L11-007), Linz/Österreich) Acridin-Orange (Sigma-Aldrich (A-6014), Steinheim) Albumin Fraktion V, bovine, pulv. 98% (Roth (8076.2), Karlsruhe) Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) (Sigma-Aldrich (D-5758), Steinheim) Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) (Sigma-Aldrich (S-0876), Steinheim) Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich (D-5879), Steinheim) donkey-anti-goat IgG, polyklonal (Scantibodies (3AD497), Villebon, Yvette/ Frankreich) Collagenase (BioChrom (CI-22), Berlin) Ethanol 641, absolut, vergällt (CG Chemikalien, Laatzen) Ethidiumbromid (Sigma-Aldrich (E87A51), Steinheim) EDTA (Ethylendiamine-Tetraacetic Acid) (Sigma-Aldrich (ED2SS), Steinheim) FCCP (Carbonylcyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) (Sigma-Aldrich (C-2920), Steinheim) Fetales Kälberserum (FCS), Virus und Mykoplasmen getestet (Biochrom (S0 113/431B), Berlin) FITC (Fluoreszein Isothiocyanate) (Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim) Formaldehyd 37%, p.a., ACS, Rotiuran® (Roth (49794.1), Karlsruhe) 125 Jod-Histamin-Tracer, (<130 kBq 1 Flasche, Lyophilisat (LDN Nordhorn, Nordhorn) gelöst in 5,5 ml A.dest. Histamin, free base (Sigma (H7125), Steinheim) Interleukin-1-Beta, bovin, rekombinant (rbIL-1β) (Serotec (PBP 007), Oxford, UK) Interferon-gamma, bovin, rekombinant (rbIFN-γ) (Serotec (PBP 007), Oxford, UK) ® Iscove DMEM mit L-Gluthamin (PAA Laboratories (E15-819), Linz/Österreich) Kaliumchlorid (KCl), kristallin (Biochrom (T046-10), Berlin) Kaliumhydrogencarbonat reinst (KHCO3) (Merck (3852), Darmstadt) Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat (Roth (8174.1), Karlsruhe) L-Arginin (Sigma-Aldrich (A5131), Steinheim) L-Glutamin (Biochrom (K0283), Berlin) L-Histidin (Sigma-Aldrich (8776), Steinheim) Lipopolysaccharid von Escherichia coli Serotyp O55:B5 (Sigma-Aldrich (L-2637), Steinheim) Lymphozytenseparationsmedium (PAA Laboratories (J15-004), Linz/Österreich) Natriumazid (NaN3), 10%ig (Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim) 59 Natriumcarbonat (Na2CO3) (Sigma-Aldrich (S-2127), Steinheim) Natriumchlorid (NaCl) (Roth (9265.2), Karlsruhe) Natriumhydrogencarbonat (NaHCO2) (Sigma-Aldrich (S-63295), Steinheim) Natriumhypochlorid (NaClO) (Sigma-Aldrich (425044)Steinheim) Penicillin-Streptomycin-Glutamine-Lösung liquid 100fach (Invitrogen (10378-016), Karlsruhe) konzentriert PercollTM (spezifisches Gewicht: 1,130 g/ml) (Amersham Bioscience (170-89101), Uppsala/Schweden) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Dulbecco, ohne (Biochrom (L18210), Berlin) Ca++/Mg++ Propidiumiodid (PJ) (Calbiochem (537059), Bad Soden) RPMI liquid mit Hepes und L-Gluthamin (Calbiochem (537059), Bad Soden) Salzsäure (HCl), konzentriert (37%) (Baker 6081), Deventer/Holland) Schwefelsäure (H2SO4) (Baker (6081), Deventer/Holland) Sybr Green ® (Quiagen (204141), Hilden) Tetramathylbenzidin (TMB) (Biochrom (A331-27), Berlin) Tumor Nekrose Faktor-alpha, bovin, rekombinant (rbTNF-α) (Sigma-Aldrich (S-2885), Steinheim) Tri-Natriumcitrat (2 x H2O) (Serotec (PBP 005), Oxford, UK) Tris (Sigma-Aldrich (S-4641), Steinheim) Triton X-100 (Sigma-Aldrich (T-5941), Steinheim) Trizol LS Reagent (Sigma-Aldrich (T-8532), Steinheim) Trypsin-EDTA (10 x konzentriert) (Biochrom (L2153), Berlin) Tween 20 (Invitrogen (15596-026), Karlsruhe) Wasserstoffperoxid (H2O2) (Sigma-Aldrich (P 1379), Steinheim) 60 3.2.4 Versuchstiere 3.2.4.1 Spendertiere zur Blutgewinnung Bei den Tieren, denen Blut zur Zellgewinnung entnommen wurde, handelte es sich um ausschließlich weibliche Tiere der Rasse „Deutsche Schwarzbunte“, Typ Holstein-Friesian. Das Alter lag zwischen 1,5 und 7 Jahren. Alle verwendeten Tiere waren klinisch gesund und stammten entweder aus der Klinik für Rinder oder der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. 3.2.4.2 Spendertiere zur Gewinnung von primären bovinen Milchdrüsenepithelzellen Zur Gewinnung von primären bovinen Milchdrüsenepithelzellen wurden im Schlachthaus des Forschungsinstituts für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere in Dummerstorf von 2 Kühen Milchdrüsengewebe gewonnen. Diese Kühe waren klinisch gesund, 26 und 30 Monate alt, in der 1. Laktation, und hatten 3 bzw. 5 Monate zuvor gekalbt. Sie stammten aus einer Herde des Forschungsinstituts für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Dummerstorf. 3.2.4.3 Spendertiere für die experimentelle Infektion mit E. coli und S. aureus Der Infektionsversuch wurde in der Klinik für Wiederkäuer in der veterinärmedizinischen Fakultät der LMU München durchgeführt. Die Tiere waren zweieinhalb Jahre alte Kühe der Rasse „Deutsche Schwarzbunte“, Typ Holstein-Friesian, bei denen vorberichtlich keine Mastitiserkrankung bekannt war und die sich in der Mitte ihrer ersten Laktation (3-5 Monate post partum) befanden. Die Probanden wurden mindestens 3 Wochen vor Versuchsbeginn in die Klinik eingestellt. Im Milchleistungsprüfungsbericht durfte eine Zellzahl von 50.000 Zellen/mL im Gesamtgemelk in den 3 Monaten vor dem Einstellen in die Klinik nicht überschritten werden. Die Tiere wurden im Abstand von 7 Tagen klinisch untersucht und es wurden Milchproben zur Zellzahlanalyse sowie zur mikrobiologischen Untersuchung entnommen. Innerhalb dieses Zeitraumes mussten alle vier Euterviertel klinisch gesund und bakteriologisch negativ sein und durften einen SCC-Wert von 50.000/mL auf mindestens drei Eutervierteln nicht überschreiten, wobei auch das vierte Euterviertel unter 100.000 Zellen/mL in der Milch aufweisen sollte. Die Laktationsleistung sollte zwischen 15 und 25 l/Tag betragen. Zur Vermeidung möglicher zyklusabhängiger Einflüsse wurden die Tiere zyklussynchronisiert. Hierzu wurden die Probanden mit Hilfe von zweimaliger Injektion des Prosta- 61 glandin-F2α (PGF2α)-Analogons Cloprostenol-Natriumsalz (Dalmazin®, 3.2.1) im Abstand von 12 Tagen synchronisiert und im brunstnahen Zeitraum infiziert. Für die Infektionsversuche mit E. coli und S. aureus sind jeweils 5 Tiere eingesetzt worden. Außerdem wurden jeweils 5 Kontrolltiere eingesetzt (Gst, Goldstandardtiere), die über 24 Stunden bzw. 72 Stunden beobachtet wurden. Im Anschluss an den Beobachtungszeitraum wurden die Versuchstiere in der Pathologie der LMU München für die Entnahme von Gewebeproben getötet. Die Gewebeproben dienten als Grundlage für Transkriptomanalysen (Genzentrum München) und für die Analyse der mRNA-Expression selektierter Kanditatengene (siehe 4.2.3). 3.2.5 Bakterienstämme Die verwendeten Stämme E. coli 1303 und S. aureus 1027 wurden jeweils aus dem Eutersekret von an klinischer Mastitis erkrankten Kühen in der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover isoliert. Diese Bakterienstämme wurden schon zur Etablierung des Mastitis-Modells von PETZL (2005) eingesetzt. Der E.-coli-Stamm wurde nach der für Enterobacteriaceae zusammengestellten „Bunten Reihe“ (BURKHARDT 1992) charakterisiert (Details der Charakterisierung bei PETZL (2005). Bei dem S. aureus-Stamm 1027 konnte kulturell-biochemisch die Mannitspaltung, der Clumping Faktor (gebundene Koagulase) und die freie Koagulase (Röhrchenkoagulase) nachgewiesen werden. Zu den biochemischen Eigenschaften wurden zusätzlich AntibiotikaResistenztests in der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt (Details der Charakterisierung bei PETZL (2005). 3.2.6 Antikörper für die Membranimmunfluoreszenz und zur Herstellung von Referenzzellen 3.2.6.1 Monoklonale Antikörper (Primärantikörper) Die Zellen der Milch wurden mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern charakterisiert (Tab. 5). Des Weiteren wurde der Antiköper Bo 1 zur Herstellung von Referenzzellen eingesetzt (3.3.7). 62 Tab. 5 Monoklonale Antikörper zur Charakterisierung zellulärer Oberflächenstrukturen in der Membranimmunfluoreszenz und zur Herstellung von Referenzzellen für die absolute Zellzahlbestimmung. Name (Laborcode) Spezifität Donor/Isotyp Finale Verdünnung Referenz mAk IL-A11 (ILRI) bovines CD4 Maus/IgG2a 1:20.000 HOWARD et al. (1991) HOWARD und NAESSENS (1993) mAk CC63 (IAHC) bovine CD8α Maus/IgG2a 1:10 NAESSENS und HOPKINS (1996) mAk GB21A (WSU) TCRi-24 Maus/IgG2b 1:10 NAESSENS und HOPKINS (1996) mAk Co-33B3 (FVC) bovine CD43 (Leukosialin) Maus/IgG1 1:2 NAESSENS und HOPKINS (1996) CDSW3# 77 keine1 Maus/IgG1 1:10 HAVERSON (2001) CDSW3# 78 keine1 Maus/IgG2b 1:10 HAVERSON (2001) Bo 1 anti MHC-I Maus/IgG1 1:1 SCHUBERTH (1991) 1 Die beiden monoklonalen Antikörper ohne erkennbare Spezifität für Zelloberflächenstrukturen wurden im Rahmen des 3rd International Swine CD Workshops an teilnehmende Einrichtungen versandt (HAVERSON 2001). 3.2.6.2 Konjugierte Antikörper Als Sekundärantikörper für die indirekte Membranimmunfluoreszenz (3.3.12.2 ) und für die Herstellung von Referenzzellen (3.3.7) diente ein affinitätschromatographisch gereinigter, polyklonaler Antikörper: Ziege-anti-Maus IgG und IgM (schwere und leichte Ketten). Er lag mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) konjugiert (3.2.3) vor und war gegen Human-, Rinderund Pferdeserumproteine absorbiert. Die eingesetzte Verdünnung betrug 1:100 (in MIFPuffer, 3.2.8.4). Zur Herstellung von Referenzzellen (3.3.7) wurde der Antikörper 1:40 verdünnt. 63 3.2.7 Antikörper und rekombinante Zytokine im ELISA Zur Quantifizierung der Zytokingehalte in der Milch wurden in einem Sandwich-ELISA folgende Antikörper eingesetzt. Tab. 6 Antikörper zur Bestimmung der Zytokinkonzentration in der Milch. Name Isotyp Klon-Bezeichnung Konzentration Maus-anti-boIFN-γ IgG1 CC330 (MCA2112) AbD Serotec 2 µg/mL Kaninchen-anti-boIL-1β polyklonal (AHP 851Z) AbD Serotec 7,5 µg/mL Maus-anti-boIFN-γ IgG1 CC302 (MCA1783B) AbD Serotec 2 µg/mL Kaninchen-anti-boIL-1β polyklonal (AHP851B) AbD Serotec 5 µg/mL Coating-Antikörper Nachweis-Antikörper Die im ELISA eingesetzten Antikörper wurden bereits erfolgreich von der Arbeitsgruppe BANNERMAN et al. (2004) zum Nachweis von Zytokinen in der Milch verwendet. 3.2.8 Kulturmedien, Puffer und Lösungen Alle Kulturmedien, Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua tridest. angesetzt. Die Einzelreagenzien sind unter 3.2.3 aufgeführt. 3.2.8.1 Zellkulturmedien und Zusätze Für die Kultivierung von Leukozyten wurden die Medien RPMI und Iscove (3.2.3) verwendet. Um Komplementaktivität auszuschließen und eventuell vorhandene Mykoplasmen abzutöten, wurde das eingesetzte fetale Kälberserum (FCS, 3.2.3) bei 56°C für eine Stunde inkubiert. Ein mit Penicillin-Streptomycin-Lösung (3.2.3) versetztes Medium wurde mit einem hochgestellten ‚+‘-Zeichen gekennzeichnet 64 Iscove®-Medium mit 10% (v/v) fetalem Kälberserum (I10F+) (3.2.3): Iscove® DMEM mit L-Glutamin 500 mL Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 10 % (v/v) Penicillin-Streptomycin-Lösung 10 mg RPMI-Medium mit 10% (v/v) fetalem Kälberserum (R10F+) (3.2.3): RPMI liquid mit Hepes u. L-Glutamin Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) Penicillin-Streptomycin-Lösung 500 10 10 mL % (v/v) mg RPMI-Kulturmedium für die pbMEC-Kulturen Für die Kultivierung von pbMEC-Kulturen wurde das Medium RPMI (3.2.3) nach (HENSEN et al. 2000b) modifiziert. RPMI 1640 450 mL L-Methionin (200mM) 0,1 mmol/L L-Lysine (1M) 0,4 mmol/L Natriumpyruvat (100mM) 0,01 mmol/L Prolaktin (Sigma) (5mg/mL) 1 µg/mL Hydrocortison (1mg/mL) 1 µg/mL Insulin (5mg/mL) 1 µg/mL Glutamin (200mM) 1 µmol/L Penicillin-Streptomycin-Lösung 1 % (v/v) Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 10 % (v/v) Collagenaselösung für den Verdau von Milchdrüsengewebe Für die Aufarbeitung von 200 g Milchdrüsengewebe wurden 2,5 L der Collagenaselösung kurz vor der Verwendung vorbereitet. HBSS 2500 mL HEPES 1 mol/L Collagenase-Lösung (20000 U/mL) 50 mL HBSS+ (Hanks Balanced Salt Solution mit Antibiotikumzusatz) HBSS 500 mL HEPES 1 mol/L Penicillin-Streptomycin-Lösung 10 mL 65 Gefrierlösung zum Einfrieren der pbMEC Die Zellen wurden nach der Gewinnung und Aufreinigung in FCS aufgenommen und zum Einfrieren mit einem gleichen Volumen Gefrierlösung versetzt (3.3.17). Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 20% DMSO 8 2 mL mL Trypsinlösung Das wie im Folgenden beschriebene vorbereitete Trypsin wurde in Aliquots zu 2 mL bei 20°C gelagert. Zum Reinigen der pbMEC-Kulturen wurde diese Lösung 1:2 mit PBS verdünnt. Trypsin-EDTA (Ausgangskonz. 0,5%) Aqua dest. 1 9 mL mL LPS-Stammlösung Stocklösungen von LPS wurden in I10F+ auf die siebenfache Finalverdünnung (7 µg/mL) eingestellt. Diese Stocklösungen wurden in aliquoten Mengen von 100-500 µL bei -20°C gelagert. PAMP-Stammlösung für pbMEC-Stimulationsansätze Die LTA vom Stamm S. aureus 1027 und das LPS vom Stamm E. coli 1303 wurde von Sonja von Aulock (Biochemische Pharmakologie, Universität Konstanz, Fach M665) hochrein hergestellt und zur Verfügung gestellt. LTA-Stocklösungen lagen in einer Konzentration von 5 mg/mL und LPS Stocklösungen in einer Konzentration von 1 mg/mL in RPMI 1640 (3.2.3) vor. Diese Stocklösungen wurden in aliquoten Mengen von 500 µL bei -20°C gelagert. Hitzegetötete Erreger-Stammsuspensionen für pbMEC-Stimulationsansätze Die Stocksuspensionen von E.-coli-Stamm 1303 (3.2.5), hitzegetötet und S.-aureus-Stamm 1027 (3.2.5), hitzegetötet, lagen in einer Konzentration von 5 x 108/mL in RPMI 1640 vor. Diese Stocksuspensionen wurden in aliquoten Mengen von 500 µL bei -20°C gelagert. 66 3.2.8.2 Material für die Separation von Zellen Lymphozytenseparationsmedium Das Lymphozytenseparationsmedium (3.2.3) ist eine isotone, wässrige Lösung aus Natriumdiatrizoat und einem hochmolekularen Zucker mit einem Zusatz des Röntgenkontrastmittels Isopaque. Bei 10°C besitzt das Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/mL. In dieser Arbeit wurde das Lymphozytenseparationsmedium unverdünnt verwendet. Percoll Bei Percoll (3.2.3) handelt es sich um ein synthetisches Sol aus Polyvinyl-Pyrolidonbeschichteten Silikatpartikeln mit einem spezifischen Gewicht von 1,130 g/mL bei 20°C. Durch Zugabe von 0,9 g NaCl pro Liter Percoll wurde die Isotonie erreicht (100%-iges, isotones Percoll). Für die Separation reiner PMN (3.3.3) wurde die 100%ige Stammlösung mit PBS (0,9%-ig) zu einer 70%-igen Lösung verdünnt. Natriumchloridlösung, 0,9% NaCl Aqua tridest. ad 8,77 g 1000 mL Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ohne EDTA Die PBS-Trockensubstanz (3.2.3) wurde in Aqua tridest. gelöst. Es wurden folgende Bestandteile eingewogen: NaCl 8,0 g KCl 1,24 g Na2HPO4 0,2 g KH2PO4 0,2 g Aqua tridest. ad 1000 mL Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Phosphatpuffer, doppelt konzentriert (2 x PBS) Zur Herstellung wurde die doppelte Menge an PBS-Trockensubstanz eingesetzt (3.2.3) und mit Aqua tridest. auf 1000 mL ergänzt. 67 Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer) bovines Serumalbumin 5,0 g Natriumazid (NaN3) 0,1 g PBS ad 1000 mL Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 3.2.8.3 Lösungen zum Fixieren und Quantifizieren von bovinen Zellen Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Referenzzellen Paraformaldehyd 40 PBS ad Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 1000 mg mL Acridin-Orange-Ethidiumbromid-Lösung für die lichtmikroskopische Zellzählung Acridin-Orange 250 mg Ethidiumbromid 250 mg PBS ad 100 mL Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 3.2.8.4 Lösungen für die Durchflusszytometrie Zur Reinigung des Gerätes wurde das Messkanalsystem nach den Messungen mit steril filtriertem Aqua tridest. und 1%-iger Natriumhypochlorit-Lösung (3.2.3) gespült. Trägerflüssigkeit Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung wurde steril filtriertes (0,2 µm) PBS mit 0,1 mg/mL NaN3 (Natriumazid) verwendet (3.2.3). Propidiumjodid-Stammlösung Die Stammlösung von 100 µg/mL Propidiumjodid (3.2.3) gelöst in Trägerflüssigkeit wurde in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen wurden der Trägerflüssigkeit entsprechende Teile der Stammlösung zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2 µg/mL zu erreichen. 68 JC-1-Stammlösung Der für die Apoptosebestimmung verwendete Farbstoff 5, 5´, 6, 6´-Tetrachloro-1, 1´, 3, 3´Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid (JC-1) (3.2.3) wurde in einer Stockkonzentration von 2 mol/L in DMSO (3.2.3) aufgenommen und in Aliquoten von 20 µL bei -20°C eingefroren. JC-1 wurde mit PBS verdünnt und in einer Konzentration von 7 µmol/L eingesetzt. 3.2.8.5 Materialien für die Histaminbestimmung Kontroll-Puffer (Pipes B) Es handelt sich um eine gepufferte Lösung die nach einem Grundrezept von MAASCH et al. (1984) modifiziert wurde. Aqua tridest NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 CaCl2 MgCl2 100 mL 13,7 mmol/L 0,27 mmol/L 0,81 mmol/L 0,112 mmol/L 2 mmol/L 2 mmol/L Vor der Verwendung wurde diese Lösung auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Tris-Puffer Der Tris-Puffer (0,5 mol/L, (3.2.3) dient der Pufferung der Acylierungsreaktion. Zur besseren Verteilung der Lösung im RIA-Röhrchen wurde Tween 20 (3.2.3) in einer Konzentration von 0,02% zugesetzt. Histamin-Standards Die Histamin-Standard-Reihe wurde mit Lösungen der Endkonzentrationen 0,3 ng/mL, 1 ng/mL, 3 ng/mL, 10 ng/mL in 0,1 N Salzsäure (HCl) angesetzt. Zur Herstellung des Standards wurde das als freie Base in kristalliner Form vorliegende Histamin auf der Laborwaage abgewogen und in 0,1 N HCl gelöst. Pro Standard wurden 10 mL hergestellt und in Aliquots zu 1 mL bei einer Temperatur von 20°C gelagert. Die jeweils in Gebrauch befindlichen Aliquots wurden bei einer Temperatur von 4°C aufbewahrt. Acylierungsreagenz NHS-Biotin (3.2.3) wurde in einer Konzentration von 50 mg/mL in DMSO (3.2.3) angesetzt und in Aliquots zu 1 mL bei -20°C gelagert. Für das Acylierungsreagenz wird es 1:25 mit 69 Pipes-A (3.2.3) verdünnt. Dieses Acylierungsreagenz dient der chemischen Umwandlung des nativen Histamins in N-Acyl-Histamin. Das native Ziege-anti-Acylhistamin-Serum wurde in einer Verdünnung von 1:200 in PBS bei einer Temperatur von -20°C gelagert. Im RIA wurde das Serum in einer Endverdünnung von 1:10.000 im folgenden Reaktionsansatz eingesetzt: PBS 96 mL Ziege-anti-Acylhistamin-Nativserum 1:100 2 mL Ziegenserum, normal 1 mL Natriumazid, 10% 0,2 mL Präzipitationslösung Die im RIA gebildeten Immunkomplexe aus N-Acyl-Histamin bzw. 125 Jod markiertem Tracer-Histamin und Anti-Histamin-Antikörpern des Ziegenserums wurden mit Hilfe eines Ziegen-IgG-spezifischen, polyklonalen Eselserums (donkey-anti-goat IgG (3.2.3) präzipitiert. Die Präzipitationslösung war wie folgt zusammengesetzt: PBS 500 mL Donkey-anti-goat-Serum 2,5 mL Polyethylenglycol (PEG) 8000 25 g Triton X 100, 25% 1 mL Natriumazid, 10% 1 mL Die genannten Reagenzien wurden, wenn nicht anders angegeben, bei einer Temperatur von 4°C gelagert. 3.2.8.6 Materialien für die Zytokinbestimmung Beschichtungspuffer (A-Puffer), pH 9,6 Na2CO3 NaHCO3 Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 5 35 mmol/L mmol/L 70 Wasch- und Verdünnungspuffer (B-Puffer), pH 7,2 NaH2PO4 x H2O 2,5 mmol/L 7,5 mmol/L Na2 HPO4 NaCl 145 mmol/L Tween 20 0,1 % (v/v) Der Puffer wurde als 10-fach konzentrierte Stocklösung angesetzt und vor der Verwendung auf die Gebrauchskonzentration eingestellt. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Substratpuffer (C-Puffer), pH 5,0 Citrat 33,3 mmol/L Na2 HPO4 66,7 mmol/L Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Alle Puffer wurden in Aqua dest. angesetzt und mit 1 mmol/L HCL bzw. 3 mmol/L NaOH (3.2.3) auf den jeweiligen pH-Wert eingestellt. Substratlösung TMB in DMSO 15 mmol/L H2O2 5 mmol/L Die Lagerung von TMB erfolgte bei einer Temperatur von -20°C. Die Substanzen wurden unmittelbar vor der Verwendung in C-Puffer gelöst. 3.3 Methoden 3.3.1 Gewinnung von venösem Blut Das Blut wurde durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen Kautelen nach Stauung des Gefäßes mit einer Staukette nach Witte (3.2.1) gewonnen. Zur Blutentnahme wurde das Vacutainersystem mit heparinisiertem (Natrium-Heparinat) Vacutainern (3.2.1) für die Gewinnung von Blutleukozyten eingesetzt. 3.3.2 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen Das frisch gewonnene heparinisierte Blut wurde im Verhältnis 1:2 mit PBS verdünnt und in 50 mL Röhrchen auf Lymphozytenseparationsmedium® (3.2.3) geschichtet. Die anschließende Zentrifugation (30 Min., 4°C) wurde bei 1100 x g ohne Bremse durchgeführt. Bei der hier angewendeten Dichteseparation trennen sich die einzelnen Zellpopulationen aufgrund ihrer 71 spezifischen Dichte auf. Die oberste Schicht wurde durch das Plasma gebildet. Zwischen dem Plasma und dem Lymphozytenseparationsmedium befand sich die so genannte Interphase mit mononukleären Zellen (MNC; lymphoide Zellen und Monozyten) sowie Anteilen der Thrombozytenfraktion. Unterhalb des Lymphozytenseparationsmediums® lagen die gepackten Erythrozyten und die polymorphkernigen Granulozyten. Die Interphase wurde mit einer weitlumigen Pipette abgesaugt und in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit vorgelegtem PBS (10 mL) überführt. Nach Auffüllen mit PBS auf 30 mL schlossen sich drei Waschschritte an (je 10 Min., 4°C; 500 x g, 250 x g und 180 x g), um die Thrombozyten weitestgehend zu entfernen. Zwischen den einzelnen Zentrifugationsschritten wurden die Zellen durch Aufschütteln aus dem Pellet gelöst und in 40 mL PBS resuspendiert. Mit dieser Methode konnten zwischen 1,5 und 3 x106 MNC/mL Vollblut gewonnen werden. 3.3.3 Gewinnung neutrophiler Granulozyten Separation mittels Lymphozyten-Separationsmediums Die Dichtegradientenseparation wurde wie unter 3.3.2 durchgeführt. Das Plasma, die Interphase und das Lymphozytenseparationsmedium® wurden mit einer weitlumigen Pipette abgesaugt und verworfen. Aus der verbleibenden Phase mit den polymorphkernigen Granulozyten wurden die Erythrozyten durch zweimalige hypotone Lyse entfernt: Nach Zugabe von 20 mL Aqua tridest. erfolgte eine Inkubation für 20 Sek. (erste Lyse) unter ständigem Schwenken. Um die Lyse zu stoppen, schloss sich die Zugabe der gleichen Menge an zweifach konzentriertem PBS an. Die Zellsuspension wurde für 10 Min. bei 600 x g bei 4°C mit Bremse zentrifugiert. Der Überstand wurden dekantiert, die Zellpellets durch Rütteln der Röhrchen gelöst und unter Zugabe von 10 mL Aqua tridest ein zweites Mal wie oben beschrieben hypoton lysiert. Es schloss sich ein erster Waschschritt mit 20 mL PBS bei 300 x g (4°C, 8 Min.) und ein zweiter Waschschritt mit 20 mL PBS bei 180 x g (4°C, 8 Min.) an. Das letzte Zellpellet wurde in Kulturmedium (I10F+) aufgenommen, die Zellen gezählt und auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Durch dieses Verfahren konnten Populationen neutrophiler Granulozyten mit 80 bis 95%-iger Reinheit separiert werden. Lag der Anteil kontaminierender MNC an den kernhaltigen Zellen bei >10% wurde die Zellsuspension nicht verwendet. Separation mittels Percoll Der Anteil eosinophiler Granulozyten an den Granulozyten konnte nach Separation mit dem Lymphozyten-Dichtegradienten bis zu 40% betragen. Lag der Anteil kontaminierender eosi- 72 nophiler Granulozyten an den polymorphkernigen Zellen bei >10%, wurde die Zellsuspension über eine folgende Separation mit Percoll (3.2.3) aufgereinigt. Die aus der Separation mittels Lymphozyten-Separationsmedium gewonnene Zellsuspension wurde in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen über ein Volumen von 4 mL einer 70%-igen Percoll-Lösung geschichtet. Die Röhrchen wurden bei 750 x g und 20°C für 25 Min. ohne Bremse zentrifugiert. Die neutrophilen Granulozyten wanderten dabei durch das Percoll auf den Röhrchenboden, während sich MNC und eosinophile Granulozyten in der Interphase zwischen Percoll und Kulturmedium sammelten. Abschließend wurden die Zellen zwei Mal mit PBS gewaschen (150 x g, 4°C, 8 Min., dekantieren und resuspendieren in frischem PBS) und im Anschluss daran in Kulturmedium (I10F+) resuspendiert. 3.3.4 Durchflusszytometrie Bei dieser Methode werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem Laserstrahl vorbei geleitet. Gestreutes Licht einer speziellen Wellenlänge (hier 488 nm) wird in Richtung des Strahls als so genanntes Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) oder im 90° Winkel dazu, als Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC), erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die Größe des Partikels und dessen Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert. Die Signale werden aufgefangen und an den angeschlossenen Computer weitergeleitet. Mit Hilfe dieses Computers werden die Geräteeinstellungen kontrolliert, Messereignisse erfasst und gespeichert (ORMEROD 1990; RADBRUCH 1992). Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein FACScan-Gerät (3.1) mit einem Argonlaser, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren Fluoreszenzlicht-Emissionen in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen (FL-1 = Grünfluoreszenz: 515-545 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz: 564-606 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz: >650 nm). Jedes Messereignis wird damit durch fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3) charakterisiert. Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ (TROTTER 1999) erfolgte die computergestützte Auswertung der Daten. Ergebnisse wurden mehrparametrisch als korrelierte Punkteoder Dichtediagramme dargestellt. Da die Werte einzelner Parameter stark von den Einstellungen für FSC, SSC und Fluoreszenzdetektoren abhängen, wurden nur solche Messungen miteinander verglichen, die mit identischen Geräteeinstellungen erfasst wurden. Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse („Events“) wurden nach der Messung softwaregestützt elektronische „Fenster“ (sog. „Gates“) gesetzt und zum Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft. 73 3.3.5 Vitalitätsbestimmung von Zellen Mikroskopische Vitalitätsbeurteilung und Quantifizierung nach AcridinOrange/Ethidiumbromid-Färbung Zellsuspensionen wurden zu gleichen Teilen mit einer Acridin-Orange/EthidiumbromidLösung (3.2.3) versetzt, in einer Bürker-Zählkammer gezählt und ihre Vitalität beurteilt. Acridin-Orange dringt in die Zelle ein und interkaliert mit der doppelsträngigen DNA. Der Kern erscheint unter Zuhilfenahme eines Fluoreszenzmikroskops (3.1) mit UV-Anregung grün-fluoreszierend. Das rot-fluoreszierende Ethidiumbromid kann nur in Zellen mit geschädigter Membran eindringen, wo es dann ebenfalls mit der DNA interkaliert. Die Rotfluoreszenz des Ethidiumbromids überlagert in toten Zellen die Grünfluoreszenz des AcridinOrange. Beurteilung der Zellvitalität mit der Durchflusszytometrie Weist die Zellmembran Schädigungen auf, so kann das Fluorochrom Propidiumjodid (PJ) in die Zelle eindringen und mit der DNA interkalieren. Tote Zellen sind nach durchflusszytometrischer Analyse im FL-3-Kanal (Rotfluoreszenz) erfassbar und können dadurch von ungeschädigten Zellen unterschieden werden. Zellen wurden nach Separation oder Kultivierung in Durchflusszytometerröhrchen überführt, in denen Trägerflüssigkeit mit PJ (2 µg/mL Endkonzentration) vorgelegt war. 3.3.6 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode) Aufgrund von Kulturbedingungen und stimulierender Substanzen wird im Laufe der Inkubation ein Teil der in vitro eingesäten Zellen nekrotisch. Daraus resultiert eine ungekannte Anzahl von vitalen Zellen, die durch die Referenzzellmethode erfasst werden kann. Das Prinzip besteht darin, eine definierte Anzahl Partikel (Referenzzellen, 3.3.7), die sich bei gleichen Geräteeinstellungen von den zu untersuchenden vitalen Zellen unterscheiden, den Proben zuzugeben. Werden die gemessenen Referenzzellen und die vitalen Zellen ins Verhältnis gesetzt, kann die absolute Zahl vitaler Zellen pro Ansatz ermittelt werden. Üblicherweise wurden kultivierte Zellen aus den Vertiefungen einer Mikrotiterplatten vollständig entnommen und in Durchflusszytometerröhrchen überführt, in dem 100 µL Trägerflüssigkeit mit PJ (2 µg/mL) vorgelegt waren. Dazu wurden 50 µL einer Suspension mit 5 x104 Referenzzellen pipettiert. Angestrebt wurde ein Verhältnis von Referenzzellen zu Kulturzellen von ca. 1:1. Waren höhere oder niedrigere Zahlen der Kulturzellen zu erwarten, 74 wurde die Zahl eingesetzter Referenzzellen entsprechend angepasst. Nach durchflusszytometrischer Erfassung errechneten sich die Zahlen vitaler Kulturzellen nach der Formel: gemessene Ereignisse Kulturzellen x eingesetzte Zahl Referenzellen Anzahl Kulturzellen = gemessene Ereignisse Referenzzellen Als Referenzzellen dienten bovine mononukleäre Zellen des Blutes, die mit einem monoklonalen Antikörper gegen bovine MHC-Klasse-I-Moleküle (mAk Bo1, 3.2.6.1) markiert und indirekt mit einem Fluorochrom-gekoppelten Ziege-Anti-Maus-Antikörper (3.2.6.2) gefärbt wurden, so dass sie im Durchflusszytometer von unmarkierten Zellen zu unterscheiden waren. 3.3.7 Herstellung von Referenzzellen Zur Färbung wurden jeweils 2 x107 frisch separierte bovine mononukleäre Zellen des Blutes in ein 15 mL Röhrchen gegeben und bei 80 x g für 5 Min. sowie 4°C zentrifugiert. Nach dem Abgießen des Überstandes wurde das Zellpellet in 100 µL PBS resuspendiert und mit demselben Volumen des unverdünnten monoklonalen Antikörpers Bo1 (3.2.6.1) für 15 Min. bei 4°C inkubiert. Anschließend erfolgte ein Waschschritt mit 5 mL MIF-Puffer (3.2.8.2) und ein Zentrifugationsschritt (7 Min., 80 x g, 4°C). Der Überstand wurde verworfen und das resuspendierte Zellpellet wurde mit 100 µL des 1:40 verdünnten FITC-konjugierten Ziege-AntiMaus Antikörpers (3.2.6.2) versetzt und 20 Min. unter Lichtabschluss bei 4°C inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen in 50 mL PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert. Zur Fixierung wurden die Zellen in 30 mL einer 4%-igen ParaformaldehydLösung (3.2.8.3) resuspendiert. Nach einer Inkubation für 24 h bei 4°C unter Lichtabschluss wurden sie für 15 Min. bei Raumtemperatur zentrifugiert, dekantiert und ein zweites Mal in PBS gewaschen. Dieses nun gewonnene Zellpellet wurde in der PJ-haltigen Trägerflüssigkeit aufgenommen (2 µg/mL PJ) und auf 4 x105 Zellen/mL eingestellt. Die Konzentration wurde vor Einsatz kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert. Referenzzellen waren charakterisiert durch ihre Morphologie (mononukleäre Zellen) sowie ihre Rotfluoreszenz und ihre Grünfluoreszenz. 3.3.8 Durchflusszytometrische Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen Nachweis des intrinsischen Pfades der Apoptose mit JC-1 Die Bestimmung des Mitochondrienmembranpotentials (MMP) erfolgte mit dem Fluorochrom 5, 5´, 6, 6´-Tetrachloro-1, 1´, 3, 3´-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid (JC-1) 75 (FOSSATI et al. 2003). Bei JC-1 handelt es sich um ein metachromatisches Fluorochrom. Durch seine Eigenschaft als lipophiles Kation kann es durch die Membranen von vitalen Zellen diffundieren. Das Kation aggregiert in funktionstüchtigen Mitochondrien vitaler Zellen, da diese ein MMP von -180 mV bis -200 mV aufweisen (Abb. 3, A und B, 1). Nach Anregung mit Licht einer Wellenlänge von 488 nm emittiert dieser Farbstoff Licht mit einer Wellenlänge von 590 nm und kann somit im Durchflusszytometer in dem Detektor für oranges Licht (FL-2- Detektor) erfasst werden. Fällt das MMP einer Zelle in Folge von Apoptose über den intrinsischen Pfad auf Werte unter -80 mV bis – 100 mV ab, diffundieren die Aggregate von JC-1 in das Zytoplasma und gehen dort in die monomere Form über (Abb. 3, A und B, 2). Es verändert sich folglich die Wellenlänge des emittierten Lichtes auf 527 nm und wird somit von dem FL-1 Detektor für grünes Licht erfasst. A B 3 3 1 1 2 Abb. 3 2 Neutrophile Granulozyten in verschiedenen Stadien der Vitalität nach JC-1 Färbung. Dargestellt sind neutrophile Granulozyten (40x Vergrößerung) nach Anfärbung mit JC-1 und Stimulation mit FCCP (5 µmol/L, 15 Min., 37°C). A) Aufnahme mit einem Filter für Rot-Fluoreszenz. B) Aufnahme mit einem Filter für Grünfluoreszenz. 1: vitale Zelle, JC-1 aggregiert in den Mitochondrien, das tubuläre Netzwerk der Mitochondrien ist sichtbar; 2: apoptotische Zelle, deren MMP depolarisiert ist. JC-1-Molküle liegen in monomerer Form im Zytoplasma vor und sind stark grün-fluoreszierend. 3: Zelle in einem intermediären Zustand; JC-1 Moleküle diffundieren in den extrazellulären Raum und leuchten daher weniger stark in der FL-1. 76 Die Messungen wurden am Durchflusszytometer durchgeführt. Es wurden stets 20.000 Ereignisse erfasst. Bei der Erhebung der Daten wurde ein Fenster („Gate“) im Seitwärtsstreulicht (SSC) gegen Vorwärtsstreulicht (FSC) auf neutrophile Granulozyten (Abb. 4, A) und in einem zweiten Fenster („Gate“) im FL3/SSC Punktediagramm auf PJ-negative Ereignisse gesetzt (Abb. 4, B), um nekrotische Zellen nicht zu erfassen. Somit konnte im SSC/FL-1 die Veränderung des Anteils der Zellen mit Grünfluoreszenz, also Verlust des MMPs dargestellt werden. Für die Auswertung wurden 3 Zustände unter den vitalen Zellen unterschieden: vitale, nicht apoptotische Zellen (Abb. 4, C, 1), apoptotische Zellen, deren MMP depolarisiert ist und somit nach JC-1-Färbung im oberen linken Quadranten erscheinen (Abb. 4, C, 2) und intermediäre Zellen (Abb. 4, C, 3). Die Membran von intermediären Zellen ist in ihrer Integrität gestört. Somit kann PJ in die Zelle eindringen und die JC-1-Molküle können aus dem Zytosol in den extrazellulären Raum entweichen. Folglich ist die Grünfluoreszenz herabgesetzt. Außerdem kann der Anteil der nicht vitalen also nekrotischen Zellen von der Gesamtheit der Kulturzellen ermittelt werden (Abb. 4, B). Zur Vereinfachung der Nomenklatur werden Zellen, deren MMP depolarisiert ist in den folgenden Ausführungen apoptotische Zellen genannt. Es sei darauf hingewiesen, dass es sich hierbei um den intrinsischen Pfad der Apoptose handelt. Durch die Verrechnung der absoluten Anzahl der Kulturzellen (siehe Referenzzellmethode 3.3.6) mit den Anteilen von vitalen, apoptotischen und intermediärer Zellen, können für diese Zellen auch absoluten Zahlen angegeben werden. Durchführung der Färbung mit JC-1 Um den Anteil der apoptotischen Zellen in einer in vitro kultivierten Suspension zu bestimmen, wurden die 96-well-Zellkulturplatten mittels einer Plattenzentrifuge 250 x g bei 20°C für 4 Min. zentrifugiert und der Überstand abgeschlagen. Um die Zellen zu waschen, wurden diese resuspendiert und in 100 µL PBS aufgenommen. Anschließend wurden die Kulturplatten in einer Plattenzentrifuge zentrifugiert (250 x g, 20°C, 4 Min.). Nach dem Resuspendieren wurden 100 µL JC-1-Lösung in einer Konzentration von 7 µM zu den Zellen gegeben. Es folgte eine Inkubation von 15 Min. im Brutschrank bei 37°C. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen in 200 µL Trägerflüssigkeit (2 µg/mL PJ) aufgenommen, in FCMRöhrchen überführt und durchflusszytometrisch erfasst. Komplexität (SSC) SSC-H 77 A B 1024 1024 768 768 512 512 256 256 0,29% 0 0 0 256 512 768 1024 FSC-H Größe (FSC) 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 Rotfluoreszenz (FL-3) Rotfluoreszenz (FL-3) C 10 4 9,81% 0,47% 2 10 10 10 10 3 3 2 1 1 88,73% 0 0 10 1 10 2 10 FL3-H 3 10 4 10 Grünfluoreszenz (FL-1) Abb. 4 Auswertungsstrategie nach JC-1-Färbung von Blutleukozyten. Blutleukozyten nach hypotoner Lyse wurden mit JC-1 gefärbt und durchflusszytometrisch erfasst (A, B: Punktediagramme, C: Dichteplot nach der Erfassung von 20.000 Ereignissen). A) Gate auf morphologisch als PMN identifizierte Ereignisse. B) Gate auf vitale, PJ-negative PMN. C) Korrelierte Darstellung der Grün- und Rot-Fluoreszenz vitaler PMN (1, vitale Zellen; 2 apoptotische Zellen; 3, intermediäre Zellen. 3.3.9 Experimentelle Infektion einzelner Euterviertel Präparationen der für die Infektionsversuche eingesetzten E.-coli- und S.-aureus-Stämme wurden aus dem Milchsekret klinisch an Mastitis erkrankter Kühe (Patienten der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) isoliert (PETZL 2005) und lagen kryokonserviert vor (Mikrobank-System Cryobank™, 3.2.2). Die ersten ca. 5 mL des Milchsekrets (Vorgemelk) wurden aus dem grob gereinigten Euterviertel in eine Schale ermolken. Nach makroskopischer Begutachtung und Durchführung eines CMT-Tests wurde diese unschädlich entsorgt. Es folgte eine gründliche Reinigung und 78 Desinfektion der Zitzen mit in 70%-igem Ethanol (3.2.3) getränktem Haushaltspapier und die Entnahme der Milchproben für die bakteriologische Untersuchung und die Bestimmung des SCC. Das Euter wurde zunächst maschinell und anschließend manuell sorgfältig ausgemolken. Die Infektionsdosis in einem Volumen von 2 mL physiologischer Kochsalzlösung (E. coli 500 KbE und S. aureus 10.000 KbE) wurde mittels einer Einwegspritze und einer Zitzenkanüle in die Zitzenzisterne vorzugsweise in das hintere rechte Euterviertel instilliert und einmassiert. Außerdem wurden 2 mL physiologischer Kochsalzlösung als Placebo in das hintere linke Euterviertel gegeben. Die beiden vorderen Euterviertel wurden nicht behandelt und dienten als Kontrolle (Abb. 5). Abb. 5 VL: VR: Kontrolle Kontrolle HL: HR: Placebo Infiziert Schema der experimentellen Infektion modifiziert nach PETZL (2005). In das hintere rechte Euterviertel (HR) wurde die Infektionsdosis (E. coli 500 KbE und S. aureus 10.000 KbE) in 2 mL 0,09% NaCL-Lösung mittels einer Einwegspritze und einer Zitzenkanüle in die Zitzenzisterne eingebracht. Das Placebo-Euterviertel (HL, hinten links) erhielt 2 mL 0,09% NaCLLösung. Die beiden vorderen Euterviertel (VL und VR) dienten als Kontrolle. 79 3.3.10 Erhebung und Beurteilung Euter-spezifischer und allgemein klinischer Parameter Der klinische Status der Tiere wurde regelmäßig mindestens alle 12 Stunden von unmittelbar vor einer Infektion bis zum Versuchsende untersucht. Dies umfasste im Einzelnen die Parameter Körpertemperatur, Milchleistung, Sekretbeschaffenheit, Euterpalpationsbefund und Allgemeinbefinden. Körpertemperatur: Vorausgesetzt wurde für alle Versuchstiere, dass vor Versuchsbeginn die Körpertemperatur innerhalb des physiologischen Bereichs (37,8-39,2°C) lag. Im Verlauf des E.-coli-Infektionsversuches wurde die Körpertemperatur alle 3 Stunden und bei den S. aureus- Infektionsversuchen alle 12 Stunden zu den Melkzeiten gemessen und dokumentiert. Milchleistung und -beschaffenheit: Die Sekretbeschaffenheit der einzelnen Viertelanfangsgemelke wurde grobsinnlich und mit Hilfe des California-Mastitis–Tests (CMT) beurteilt (Tab. 8). Die Milchleistung wurde zu jeder Melkzeit dokumentiert. Euterpalpation: Die manuelle Palpation des Eutergewebes als Hinweis auf entzündliche Veränderungen wurde ab Versuchsbeginn jeweils am ausgemolkenen Euter zu jeder Melkzeit (alle 12 Stunden) durchgeführt. Die in Tab. 7 dargestellte Einteilung diente dazu, den Grad der Veränderungen in Stufen einzuteilen. Eine Veränderung des Palpationsbefundes von beispielsweise Grad II zu V würde 3 Stufen entsprechen. Tab. 7 Dokumentation des Euterpalpationsbefundes (GRUNERT 1990). o.B. Insgesamt feinkörnig und weich (ausgemolken) I Insgesamt grobkörnig, aber weich II Allgemein grobkörnig-derb mit einzelnen Knoten III Allgemein grobknotig IV Grobknotig mit einzelnen diffusen Verhärtungen V Insgesamt diffus verhärtet VI Akut geschwollen, vermehrt warm und schmerzhaft VII Abkalbebedingtes Euterhautödem, Eutergewebe nicht palpierbar, bis 10. Tag post partum physiologisch 80 Zur Objektivierung wurden die erhobenen Befunde bezüglich Euterpalpationsbefund und Milchsekretbeschaffenheit nach einem dafür vorgesehenen Schema (Tab. 8) abschließend beurteilt. Tab. 8 Punkteschema zur Feststellung der Ausprägung ausgesuchter klinischer Parameter nach experimentell induzierter Mastitis. Veränderung keine Punkte: 0 Grobsinnlicher o.B. Sekretbefund ggr. mgr. hgr. 1 2 3 Milchcharakter erhalten, einige kleine bis wenige grobe Flocken Milchcharakter erhalten, viele kleine und grobe Flocken Verlust des Milchcharakters Befund des CMT keine Ver- geringe Schlierenänderungen bildung deutliche Schlierenbildung das Gemisch aus Milch und Testflüssigkeit fließt nicht auseinander Euterpalpationsbefund1 0 2-3 >4 1 1 graduelle Abweichung vom Palpationsbefund vor der Infektion (Tab. 7). Bewertet wurde jeweils die maximale Ausprägung einer klinischen Veränderung pro Tier während einer 24- oder 72-stündigen Versuchsdauer. 3.3.11 Bakteriologische Untersuchung der Milchproben Die mikrobiologische Untersuchung wurde im mikrobiologischen Labor der Klinik für Wiederkäuer der LMU München durchgeführt. Nach Durchmischung der Probe wurden mit einer Einmalöse 10 µL Milch auf einer halben Blutagarplatte mit Äskulinzusatz ausgestrichen. Die Platten wurden nach 24 und 48 Stunden beurteilt. Wenn es für die Differenzierung nötig war, wurden Subkulturen einzelner Bakterienkolonien angelegt. Hierdurch wurde kontrolliert, ob die Infektion erfolgreich verlief und keine unspezifischen Erreger Auslöser für die Infektion waren. Die Bestimmung der somatischen Zellzahl (SCC, somatic cell count) in der Milch erfolgte mit dem Gerät Fossomatic®5000 durch den Milchprüfungsring Bayern, Wolnzach (akkreditiertes Prüflabor nach Din EN ISO/IEC 17025). Die Daten wurden von der Klinik für Wiederkäuer, Oberschleißheim, zur Verfügung gestellt. 81 3.3.12 Analyse der Milchzellen 3.3.12.1 Gewinnen der Milchproben für die Milchzellanalyse Nach dem maschinellen Ausmelken mit einem Einzelviertelmelker wurden 50 mL Milch von jedem Euterviertel in ein steriles 50 mL Zentrifugenröhrchen gegeben und gekühlt. Die Milch wurde mit PBS 1:2 verdünnt und bei 400 x g, 10 Min., 4°C ohne Bremse zentrifugiert. Anschließend wurde der abgesetzte Rahm vorsichtig entfernt und der flüssige Überstand unter Schonung des Zellpellets abgenommen. Das Zellpellet wurde in 30 mL PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert (400 x g, 10 Min., 4°C, ohne Bremse). Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen in 800 µL PBS resuspendiert und die Zellsuspensionsdichte mittels Bürker-Zählkammer bestimmt. Die Zellsuspensionen wurden auf ca. 3 x106 Zellen/mL PBS eingestellt. 3.3.12.2 Milchzellcharakterisierung durch indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) Die MIF ist ein Verfahren zum Nachweis der Expression von Oberflächenstrukturen auf Zellen. Hierbei binden spezifische Antikörper an Strukturen, die ihrerseits von einem zweiten Fluorochrom-markierten Antikörper erkannt werden. Die Aufarbeitung der Milchzellproben erfolgte stets auf Eis und unmittelbar nach ihrer Gewinnung. Für die indirekte MIF wurden für jeden Antikörperansatz 3 x105 Zellen der separierten Zellen in Vertiefungen einer 96-well Mikrotiterplatte gegeben und bei 260 x g, 4°C, 4 Min. zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und das Zellpellet resuspendiert. Es folgte ein Waschschritt mit 150 µL auf 4°C gekühltem MIF-Puffer (3.2.8.2). Nach Zentrifugation bei 260 x g, 4°C, für 4 Min. wurden die Zellpellets resuspendiert. Jeweils 25 µL der Antikörperlösung (3.2.6.1) wurden in die jeweiligen Vertiefungen gegeben und 30 Min. bei 4°C auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellsuspensionen zwei Mal mit 150 µL gekühltem MIF-Puffer gewaschen und nach dem Resuspendieren mit 25 µL des FITC-gekoppelten Ziege-anti-MausAntikörpers (3.2.6.2) unter Lichtabschluss bei 4°C für 20 Min. inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen in 200 µL Trägerflüssigkeit (2 µg/mL PJ) aufgenommen, in FCM-Röhrchen überführt und durchflusszytometrisch erfasst. Da es zu unspezifischen Bindungen des sekundären Antikörpers kommen kann, wurden sowohl Konjugat- als auch Isotypkontrollen durchgeführt, bei denen den Zellen an Stelle des spezifischen Antikörpers 25 µL MIF-Puffer oder ein irrelevanter monoklonaler Antikörper (mAk) des selben Isotyps zugesetzt wurde. 82 Um die Zahl nicht kernhaltiger Partikel in der Milch bei der Erfassung zu minimieren, wurden die Proben zunächst im Seitwärtsstreulicht (SSC) gegen Vorwärtsstreulicht (FSC) erfasst und ein Fenster (live-gate) gesetzt, das leukozytäre Zellen anhand ihrer Morphologie erfasst (Abb. 6, A). Zusätzlich wurde ein live-gate im FL3/SSC-Punktediagramm auf Propidiumjodidnegative Ereignisse gesetzt (Abb. 6, B), um nekrotische Zellen nicht zu erfassen. Einzelne Zellsubpopulationen wurden anhand der Grünfluoreszenz im Kanal FL-1 erfasst und relativ quantifiziert (Abb. 6, D). Aus der Verrechnung mit der Zahl somatischer Zellen (SCC) wurden die absoluten Zahlen der einzelnen Zellpopulationen pro mL Milch ermittelt. A B 1024 1024 R2 SSC R1 768 768 512 512 256 256 0 FL-3 0 0 256 512 768 1024 0 10 1 10 FSC 3 10 C D 1024 R3 R4 768 768 512 512 256 256 0 0 R6 R5 0 10 1 10 2 10 FL1-H FL-1 Abb. 6 4 10 FL-3 1024 SSC 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 R7 2 10 3 10 4 10 FL-1 Durchflusszytometrische Bestimmung einzelner vitaler Milchzellpopulationen nach indirekter Membranimmunfluoreszenz. Punktediagramme nach durchflusszytometrischer Erfassung von 20.000 Ereignissen. A) Milchzellen eines Euterviertels, 12 h nach Inokulation mit S. aureus. Durch die Region 1 (R1) wird die Erfassung von Debris (Partikel mit niedrigem FSC und SSC) minimiert. B) Setzen einer Region (R2) auf Propidiumjodid-negative (vitale) Ereignisse. C) Durch Setzen einer Region auf positive Zellen nach Markierung mit mAk 33B3 (anti-bo CD43, Leukosialin) wird die Gesamtheit der Leukozyten dargestellt. D) Identifizierung zellulärer Subpopulationen nach Setzen eines logischen gates (R1+R2+R3); R4: polymorphkernige Granulozyten; R5: Monozyten; R6: Makrophagen; R7: lymphoide Zellen). 83 Zur Ermittlung der T-Zellsubpopulationen wurde anhand morphologischer Kriterien (in FSC/SSC-Dotplots) die Fraktion der lymphoiden Zellen identifiziert (Abb. 7, A). Unter diesen wurden die Anteile der Zellen bestimmt, die sich mit den Primärantikörpern gegen CD4, CD8 oder den γδ-T-Zell-Rezeptor anfärben ließen (Abb. 7, B). A 1024 1 SSC 768 512 256 0 0 256 512 768 1024 FSC B 1024 1024 1024 31,35% 27,34% 40% 26% 512 256 768 SSC-H 768 SSC-H SSC-H SSC 768 512 256 0 1 10 2 10 3 10 0,00% CD8+ (FL-1) 4 10 512 256 0 0 10 Abb. 7 22,35% 32% 0 0 10 1 10 2 10 3 10 0,00% CD4+ (FL-1) 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0,00% γδ− γδ−TCR (FL-1) Durchflusszytometrische Differenzierung lymphoider Zellen in der Milch. Punktediagramme nach durchflusszytometrischer Erfassung von 20.000 Ereignissen. A) Identifizierung der lymphoiden Zellen unter den vitalen (Propidiumjodid-negativen) Zellen im (FSC/SSCDotplot). B) Von dieser Population wird der Anteil an CD8+-T-Zellen, CD4+-T-Zellen und γδ-TZellen, nach indirekter Membranimmunfluoreszenz mit spezifischen Primärantikörpern bestimmt. Die Antikörpermarkierung resultierte für alle Subpopulationen in einer zweigipfligen Verteilung. Die Bestimmung des Anteils der jeweiligen Zellpopulation, jeweils rechts in den Dotplots, erfolgte durch Setzen eines Quadranten. 84 3.3.13 Gewinnung von Milchserumproben Die Milch wurde kurz nach dem Melken bei 400 x g, 15 Min. in einer auf 4°C gekühlten Zentrifuge zentrifugiert, um den Rahm anschließend mit einem Spatel zu entfernen. Die Magermilch wurde vorsichtig abpipettiert. Die Magermilch, im Folgenden Milchserum genannt, wurde bei -95°C in 10 mL-Aliquoten eingefroren. Vor dem Gebrauch wurde das Milchserum im Wasserbad aufgetaut, jeweils 1 mL in 1,5 mL Reaktionsgefäße überführt und nochmals 5 Min. bei 21.000 x g, 4°C zentrifugiert. Die opaleszierenden Überstände wurden in einem 15 mL Röhrchen gesammelt und umgehend für die folgenden Untersuchungen verwendet. 3.3.13.1 Herstellung des Referenzmilchserums Das Referenzmilchserum wurde von einer allgemein- und eutergesunden Kuh gewonnen, deren Milch nach mikrobiologischer Untersuchung frei von Bakterien war und deren Zellgehalt in der Milch drei Wochen zuvor unter 50.000 SCC/mL lag. Die Bearbeitung der Milch erfolgte nach dem in 3.3.13 beschriebenen Protokoll. Es wurde vorausgesetzt, dass das Milchserum einen Histamingehalt von 25 ng/mL im RIA nicht überschritt, damit es als Referenzmilchserum eingesetzt werden konnte. Für den Versuchsteil „Beeinflussung der Apoptose durch Histamin“ (3.3.16.2) wurde Milch von Patienten der Rinderklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover ermolken, die klinisch keine Hinweise auf eine Infektion des Euters zeigten. Bakteriologisch wurde die Milch dieser Klinikkuh nicht untersucht. 3.3.14 Bestimmung des Histamingehaltes durch den Radioimmunoassay Um die Histamingehalte in den Milchproben aus den Infektionsversuchen (3.3.9) und in den Überständen aus den pbMEC-Stimulationsversuchen (3.3.17.1) zu ermitteln, wurde ein kompetitiver RIA durchgeführt. Dabei konkurriert das Histamin in den Proben mit einem radioaktiven, acylierten Histamin (Jod125-Histamin-Tracer, 3.2.3) um eine limitierte Zahl von Antikörper-Bindungsstellen. Da Histamin im Pflanzen- und Tierreich weit verbreitet und strukturell identisch ist, musste das Histamin in den zu untersuchenden Proben acyliert werden, um von Histaminspezifischen Antikörpern erkannt werden zu können. Die Antigen-Antikörperkomplexe werden mittels eines präzipitierenden Antikörpers gefällt, der Überstand verworfen und die Radioaktivität des Präzipitates im Gamma-Counter gemessen. Die Bindung zwischen Antigen und Antiköper im kompetitiven RIA unterliegt einem Gleichgewicht. Je mehr acyliertes Histamin in der Probe vorhanden ist, desto weniger acyliertes Tracer-Histamin wird gebunden. Die Intensität der Radioaktivität verhält sich damit um- 85 gekehrt proportional zur Konzentration an Probenhistamin. Der Gehalt an Probenhistamin wurde anhand einer der mitgeführten Standardreihe ermittelt. Testdurchführung Für die Erstellung einer Standardkurve wurden Histaminstandards (3.2.8.5) und eine Histamin-freie Probe (B0) angesetzt. Zur Kontrolle wurde eine Probe für nicht-spezifische Präzipitationsserum-Bindung (NSB) und eine Probe zur Bestimmung der Totalaktivität des 125JodHistamin-Tracers (T) angesetzt (Tab. 9). Es wurden stets Doppelbestimmungen durchgeführt. Für die Acylierung der Proben wurde das konzentrierte Acylierungreagenz (3.2.8.5) 1:25 mit TRIS-Puffer (3.2.8.5) verdünnt und nach dem in Tab. 9 aufgeführtem Schema zu den Ansätzen pipettiert. Die Ansätze wurden für 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 50 µL 125Jod-Histamin-Tracer hinzu gegeben. Außerdem wurde für die TracerKontrolle in zwei weitere Röhrchen 50 µL 125Jod-Histamin-Tracer pipettiert, um die Totalaktivität (T) zu bestimmen. Danach wurde das Ziege-anti-Acylhistamin-Serum hinzugefügt, die Proben gemischt und bei 4°C über Nacht inkubiert. Tab. 9 Übersicht der RIA-Ansätze. Ansatz Acylierungsreagenz 125 JodHistaminTracer Ziege-antiAcyl-Histamin-Serum Präzipitationsserum HistaminStandard 50 µL Std.-Lsg +50 µL Pipes B 50 µL 50 µL 50 µL 1 mL Histamin-freie Probe (B0) 50 µL 0,1N HCL +50 µL Pipes B 50 µL 50 µL 50 µL 1 mL Probe für nichtspezifische Bindung (NSB) 50 µL 0,1N HCL + 50 µL Pipes B 50 µL 50 µL Probe für Totalaktivität (T) ProbenMilchserum 1 mL 50 µL 100 µL Probe 50 µL 50 µL 50 µL 1 mL Abschließend wurde das Präzipitationsserum zugesetzt, die Proben gemischt und für 15 Min. bei 4°C inkubiert, bevor die Proben bei 1500 x g für 15 Min. bei Raumtemperatur zentrifu- 86 giert wurden. Außer bei den Totalaktivitäts-Kontrollen wurden die Überstände vollständig abgegossen. Die Radioaktivität der Proben wurde im Gamma-Counter (LKB Wallac 1273 Clinigamma) gemessen und die Ergebnisse in Zählimpulsen pro Minute (counts per minute, cpm) angegeben. Die Umrechnung erfolgte in mehreren Stufen: von den Doppelansätzen wurden Mittelwerte der cpm gebildet und davon der Mittelwert der NSB-Aktivität subtrahiert. Anschließend wurden alle Probenwerte (B) in Prozent des B0-Wertes ausgedrückt (B/B0%Wert). Zur Erstellung der Standardkurve wurde die Histaminkonzentration der Standards auf der logarithmisch eingeteilten Abszisse und die dazugehörigen B/B0%-Werte auf der linearen Ordinate aufgetragen. Anschließend wurde mit folgender Gleichung eine sigmoidale Anpassungsfunktion für die Standardkurve erstellt. y= A1 - A2 1 + (x / x0)p + A2 A1: obere Asymptote; A2: untere Asymptote; X0: Wendepunkt; P: Potenz; x: Histaminkonzentration; y: Extinktion. In Abb. 8 ist eine typische Standardkurve dargestellt. Anhand dieser Anpassungsfunktion wurden die B/B0%-Werte der Milchserumproben in Histaminkonzentrationen umgerechnet. B/B0 (%) 100 80 60 40 20 0 Messpunkte der Standards sigmoidale Anpassung 1 10 Histamin ng/ml Abb. 8 Typische Standardkurve für den RIA. B= Probenwert, B0= Histamin-freie Probe. 100 87 3.3.15 Bestimmung des Zytokingehaltes durch den Enzyme-linked Immunosorbent Assay Um die Zytokingehalte in den Milchproben aus den Infektionsversuchen (3.3.9) und in den Überständen aus den pbMEC-Stimulationsversuchen (3.3.17.1) zu ermitteln, wurde ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) durchgeführt. Der ELISA bezeichnet ein immunologisches Nachweisverfahren, das auf einer enzymatisch katalysierten Farbreaktion basiert. Die hier eingesetzte Sandwich-ELISA-Technik verwendet zwei spezifische Antikörper. Der erste Antikörper (coating-Antikörper) wird an eine feste Phase (hier: FlachbodenMikrotiterplatte) gebunden. Er bindet das nachzuweisende Antigen aus der Lösung. Im nächsten Schritt wird ein markierter Nachweis-Antikörper zugegeben, der ebenfalls spezifisch für das nachzuweisende Antigen ist. Im vorliegenden Fall wurden Biotin-gekoppelte NachweisAntikörper verwendet. Das Biotin wird von Streptavidin, an das Peroxidase gekoppelt ist, erkannt. Die Peroxidase setzt ein initial farbloses, leicht gelbliches Substrat in einen blauen Farbstoff um. Die Intensität der Farbe ist dabei proportional zur Konzentration des zu bestimmenden Antigens in der Probe. Testdurchführung Zur Beschichtung der Flachboden-Mikrotiterplatten wurden Antikörper mit der Spezifität gegen bovines IFN-γ (monoklonaler Maus-anti–bovine IFN-γ) und bovines IL-1β (polyklonales Serum: Kaninchen-anti-bovine IL-1β) eingesetzt. Der Maus-anti-bovine IFN-γ-Antikörper wurde in einer Konzentration von 2 µg/mL und Kaninchen-anti-bovine IL-1β in einer Konzentration von 7,5 µg/mL im Beschichtungspuffer aufgenommen und in einem Volumen von 150 µL je Vertiefung eingesetzt. Die Platte wurde bei Raumtemperatur zunächst eine Stunde auf dem Schüttler bei 500 rpm und anschließend über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Proben wurden wie in 3.3.13 beschrieben durch zentrifugieren vorbereitet und mit Waschpuffer 1:2, 1:8 und 1:32 verdünnt. Außerdem wurden Verdünnungsreihen für die rekombinanten Zytokine zwischen 0,1 ng/mL und 3,2 ng/mL in Schritten von 0,2 ng/mL angesetzt. Der Gehalt an Milchserumproteinen in diesen Verdünnungsreihen wurde mit einem äquivalenten Anteil Referenzmilchserum (Milchserum eines Euterviertels vom Tier M-30, das über 3 Wochen vor der Entnahme einen konstant niedrigen Zellgehalt (zwischen 15.000 und 22.000 Zellen/mL) aufwies, gewonnen. Nach dem Beschichten der Platten mit den unmarkierten Primärantikörpern wurden diese fünf Mal mit Waschpuffer gewaschen, bevor die Proben mit dem nachzuweisenden Antigen und die Verdünnungsreihen für die rekombinanten Zytokine in die Vertiefungen gegeben wurden. Danach wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden erneut ge- 88 waschen. Anschließend wurden 100 µL der Detektions-Antikörper Maus-anti-bovine IFN-γBiotin (2 µg/mL) oder Kaninchen-anti-bovine IL-1β–Biotin (5 µg/mL) in die jeweiligen Vertiefungen pipettiert und wiederum für eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Nach erneutem Waschen wurde 75 µL Substratlösung (TMB, 3.2.3) in jede Vertiefung pipettiert und für 20 Min. unter Lichtausschluss inkubiert. Gestoppt wurde die Farbreaktion mit je 50 µL Schwefelsäure. Die Farbreaktion wurde mit einem Plattenphotometer bei einer Absorption von 450 nm und 630 nm gemessen. Zur Überprüfung unspezifischer Bindungen wurde der Detektions-Antikörper direkt mit dem Beschichtungs-Antikörper inkubiert. Zur Prüfung der Bindung des Detektions-Antikörpers an freie Stellen auf der Mikrotiterplatte wurden zwei Vertiefungen nicht mit Beschichtungs-Antikörper bestückt. 3.3.16 Methoden zur Untersuchung der Modulation der Apoptose durch Milchinhaltsstoffe in vitro 3.3.16.1 Etablierung des Apoptosenachweises in bovinen neutrophilen Granulozyten Bovine neutrophile Granulozyten von 7 Tieren wurden wie unter 3.3.3 beschrieben separiert und in I10F+aufgenommen. Es wurden ca. 3 x105 Zellen in je eine Vertiefung einer 96-wellPlatte überführt. Nach dem Protokoll von FOSSATI et al. (2003) wurden die PMN zuerst mit JC-1 in den Endkonzentrationen 3,5 µmol/L, 7 µmol/L und 10 µmol/L bei 37°C für 15 Min. inkubiert. Die Zellen wurden in der Plattenzentrifuge bei 250 x g, 5 Min. und Raumtemperatur zentrifugiert und in I10F+ aufgenommen. Anschließend wurde der Stimulus FCCP in den finalen Endkonzentrationen von 0, 1, 5 und 10 µmol/l hinzu gegeben und die Zellen für 15 Min. bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. FCCP ist ein Protonophor (H+ Ionophore) und inhibiert die oxidative Phosphorylierung in Mitochondrien. FCCP vermag somit gezielt eine Depolarisierung der Mitochondrienmembran in vitro hervorzurufen (COLLINS et al. 2000; KEIJ et al. 2000). Abhängig von der Konzentration löst es in humanen Zellpopulationen eine partielle (100 mmol/L FCCP) oder eine vollständige (10 µmol/L FCCP) Depolarisierung aus (GAUTIER et al. 2000). Zusätzlich wurden Kontrollen mitgeführt, um eine Beeinflussung durch die Lösungsmittel für JC-1 (DMSO) und für FCCP (Ethanol) ausschließen zu können. Alle Ansätze erfolgten in Triplikaten. Die Zellen wurden in der Plattenzentrifuge bei 250 x g, 5 Min. und Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand verworfen und mit 100 µL PBS resuspendiert. Dies wurde zwei Mal wiederholt. Abschließend wurden die Zellen in 100 µL PBS aufgenommen und in ein FCM-Röhrchen überführt in dem 100 µL steril filtriertes PBS (2µg/mL PJ) vorgelegt war. Es folgte eine Analyse von 20.000 Ereignissen im Durchflusszytometer. 89 3.3.16.2 Beeinflussung der Apoptose durch Histamin In diesem Versuchsteil sollte untersucht werden, ob Histamin allein oder im Kontext mit Milchseruminhaltsstoffen einen Einfluss auf die Vitalität von neutrophilen Granulozyten hat. Aus dem Blut von acht Tieren wurden PMN (3.3.3) und MNC (3.3.2) separiert und in I10F+Medium aufgenommen. Ein Versuchsansatz wurde mit PMN Reinkulturen durchgeführt; ein weiterer mit PMN/MNC-Mischkulturen, in denen der Anteil beider Populationen jeweils 50% betrug. Es wurde Milch einer Kuh aus der Rinderklinik nach der Methode in 3.3.13.1 vorbereitet. Dieses Milchserum und das I10F+-Medium wurden mit 10, 50 und 100 ng/mL Histamin versetzt. Je 3 x105 Zellen beider Zellsuspensionen wurden in eine Vertiefung einer 96-wellPlatte pipettiert. Die prinzipiellen Zellkulturansätze (Triplikate) sind in Tab. 10 aufgeführt. Parallelen Ansätzen wurde zusätzlich 1 µg/mL LPS zugesetzt. Jeweils wurden Ansätze 1 h, 3 h und 24 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend folgte eine Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen mittels JC-1-Färbung. Nach 24 h wurde zusätzlich die Anzahl vitaler Zellen parallelen Ansätzen mit der Referenzzellmethode durchflusszytometrisch quantifiziert. Tab. 10 Zellkulturansätze zur Untersuchung des Einflusses von Histamin auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten. Histamin-Zusatz PMN PMN/MNC Medium 0 ng/mL 10 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL Milchserum (Kontrolle) Medium 0 ng/mL 10 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL (Kontrolle) Milchserum 3.3.16.3 Beeinflussung der Apoptose durch Zytokine Diese Untersuchung sollte die Frage klären, ob die Zytokine TNF-α, IL-1β und IFN-γ einen Effekt auf die Vitalität der neutrophilen Granulozyten haben. Außerdem sollte der modulierende Einfluss von Milchserum in verschiedenen Konzentrationen untersucht werden. Aus bovinem Blut wurden PMN mit einer Reinheit von 95% nach der in 3.3.3 aufgeführten Methode zuerst mit Lymphozyten-Separationsmedium® und 70%-iger Percoll-Lösung separiert und anschließend in I10F+ aufgenommen. Jeweils 3 x105 Zellen wurden in eine Vertiefung einer 96-well-Platte pipettiert. Die Ansätze mit den Zytokinen wurden in Medium I10F+, in I10F+ (mit Milchserum 1:7 verdünnt) und in I10F+ (mit Milchserum 1:70 verdünnt) durchgeführt. In Tab. 11 sind die finalen Zytokinkonzentrationen aufgeführt. Alle Ansätze erfolgten in Triplikaten. Inkubiert wurde für 24 h bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank. Es schloss 90 sich eine durchflusszytometrische Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mittels Referenzzellmethode (3.3.6) sowie eine Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen mittels JC-1Färbung (3.3.8.2) an. Tab. 11 Zytokin-Milieus zur Kultivierung von bovinen PMN in vitro. Konzentration (ng/mL) TNF-α α - 3 30 IL-1β β 0,1 0,8 30 IFN-g 0,1 0,8 30 Kontrolle (0) 3.3.16.4 Beeinflussung der Apoptose durch Milchseren verschiedener Infektionsstadien Hier wurde untersucht, wie Milchseren verschiedener Infektionsstadien der E.-coli–Mastitis die Vitalität von Leukozyten beeinflussen. Bovine PMN wurden wie unter 3.3.3 und MNCs wie unter 3.3.2 beschrieben separiert und in I10F+-Medium aufgenommen. Ein Versuchsansatz wurde mit PMN-Reinkulturen durchgeführt und ein anderer mit PMN/MNC-Mischkulturen, in denen der Anteil beider Populationen jeweils 50% betrug. Für einen Teil des Versuchs wurden Milchseren aus Milchproben des Versuchstieres M-08 gewonnen, dem im Rahmen des Infektionsversuches 500 KbE E. coli in das hintere rechte Euterviertel intrazisternal appliziert wurden. Die Milchproben wurden aus dem infizierten Euterviertel zum Zeitpunkt 0 h, 12 h und 24 h p.i. und von einem Kontroll-Euterviertel zum Zeitpunkt 0 h ermolken. Die Milchseren wurden wie in 3.3.13 beschrieben vorbereitet. Der pH-Wert der Milchproben wurde mittels Neutralit® pH-Indikatorstäbchen bestimmt (Tab. 12). Um den Einfluss des pH-Wertes beurteilen zu können wurden auch die Kontrollmedien auf die pH-Werte 6,5, 7 und 7,5 eingestellt Tab. 12 Übersicht über die pH-Werte der Milchseren von Versuchskuh M-08. Euterviertel M-08 Zeit p.i. pH-Wert HL (Kontroll-Euterviertel) 0h pH 6,5 HR (infiziertes Euterviertel) 0 h pH 6,5 12 h pH 7,0 24 h pH 7,5 91 Es wurden je drei 96-well-Platten mit PMN-Reinkulturen und PMN/MNC-Mischkulturen bestückt. In die Vertiefungen einer Rundboden-Mikrotiterplatte wurden 3 x105 PMN oder ein Gemisch aus PMN (1,5 x105) und MNC (1,5 x105) pipettiert und anschließend bei 250 x g, 5 Min., bei RT zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Zellpellets wurden resuspendiert und in 100 µL der Milchseren oder der Mediumkontrollen aufgenommen. Alle Ansätze erfolgten in Triplikaten. Parallele Ansätze wurden 2 h, 12 h und 24 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Es schloss sich eine durchflusszytometrische Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen mittels JC-1-Färbung (3.3.8) an. In einem weiteren Teil des Versuchs wurden die Milchseren der infizierten Euterviertel und eines Kontroll-Euterviertels aller Versuchstiere eingesetzt (Milchseren vor Infektion, 0 h; Milchseren 24 h p.i.). Die Zellkulturansätze erfolgten prinzipiell wie oben beschrieben. Die Milchseren wurden mit Kulturmedium 1:2 verdünnt. Die Ansätze wurden 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Abschließend wurden die vitalen Zellen mit der Referenzzellmethode quantifiziert (3.3.6) und der Anteil apoptotischer Zellen durch die JC-1 Färbung bestimmt. 3.3.17 Gewinnung und Stimulation von primären bovinen Milchdrüsenepithelzellen Zur Gewinnung von primären bovinen Milchdrüsenepithelzellen (pbMEC) wurde im Schlachthaus des Forschungsinstituts für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere in Dummerstorf von einer Kuh nach dem Schlachten das Euter abgetrennt. Unverzüglich wurden die Gewebeproben aus der Milchdrüse entnommen. Nach dem Reinigen des Euters mit 96% Ethanol wurde in dem Bereich der Zitze mit einem sauberen Schlachtermesser ein tiefer Saggitalschnitt gesetzt. Ca. 200 g wurden herausgelöst und in ein Becherglas mit vorgelegtem HBSS+ gegeben (3.2.8.1). Das Becherglas wurde mit steriler Aluminiumfolie verschlossen und auf Eis gestellt. Im Labor wurden alle weiteren Schritte unter einer Sterilbank der Klasse 2 getätigt. Vorbereitend wurden 12 L HBSS+ für die Aufarbeitung von vier Eutervierteln auf 37°C erwärmt. Zunächst wurde das Gewebe in 500 mL Flaschen mit 300 mL HBSS+ überführt und einmalig gespült. Das Stützgewebe und Blutgefäße wurden vom sekretorischen Gewebe mit einem Skalpell und Schere entfernt. Die Eutergewebestücke wurden auf ca. 2 cm3 große Stücke zugeschnitten. Diese wurden in einer Petrischale mit frisch vorgelegter HBSS+-Lösung in Scheiben geschnitten und zweimalig mit HBSS+ in einer 500 mL Flasche gewaschen. Anschließend wurden die Gewebestücke auf ein grobes Sieb gegeben und mit einem Trichter zurück in eine 500 mL Flasche mit jeweils 150-200 mL vorgelegter Collagenaselösung (3.2.8.1) gegeben. Für 30-40 Min. wurde die Flasche in ein auf 37°C vorge- 92 wärmtes Wasserbad gelegt und alle 5 Min. geschüttelt. Die Collagenaselösung wurde mit Hilfe eines Siebes über ein Becherglas abgegossen. Dieser erste Überstand wurde verworfen. Das Gewebe wurde in 500 mL-Flaschen mittels Trichter überführt und mit 200 mL HBSS (ohne Zusatz von Antibiotika) in einer 500 mL Flasche gewaschen. Anschließend wurde der Verdauungsvorgang drei Mal wiederholt. Die Überstände wurden nach jedem Schritt geerntet. Das verbleibende Gewebe wurde verworfen. Die Überstände wurden zuerst durch ein „feines Haushalts-Sieb“ passiert und in einem 50 mL Zentrifugen-Röhrchen aufgefangen. Es schloss sich ein Zentrifugationsschritt an (300 x g ohne Bremse, 5 Min., 20°C) Mit einer Pumpe wurde der Überstand abgesaugt, mit frischem R10F+-Medium aufgefüllt und erneut bei 250 x g ohne Bremse 5 Min. lang zentrifugiert. Beim Absaugen des Überstandes wurde darauf geachtet auch lose Bestandteile (mit rötlicher Farbe) mit abzusaugen oder durch leichtes Schwenken zu lösen. Das nun entstandene Pellet wurde in 40 mL HBSS resuspendiert, abermals gesiebt (Porengröße ~ 0,5 mm²) und erneut für 5 Min. bei 250 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde resuspendiert und durch ein Zellsieb (Porengröße 100 µm) (3.2.1) passiert. Ziel war es, einen klaren Überstand ohne Lyse-Produkte zu erhalten. Ein letztes Mal wurde für 5 Min. bei 250 x g zentrifugiert und das Zellpellet in R10F+ (3.2.3) aufgenommen. Alle drei Suspensionen wurden gepoolt und die Gesamtzellsuspension bei 250 x g für 5 Min. zentrifugiert. Die Zellen wurden auf eine Dichte von 5-10 x105 Zellen/mL in FCS eingestellt. Einfrieren und Auftauen von pbMEC Um die Behandlung der pbMECs zu standardisieren, wurden alle Aliquots zunächst bei -90°C in einer Gefrierlösung (3.2.8.1) eingefroren. Die pbMECs wurden hierfür auf eine Dichte von 1 x106 Zellen/mL in vorgekühltem fetalen Kälberserum (FCS) eingestellt und mit einem gleichen Volumen Gefrierlösung (3.2.8.1) zu Aliquots à 1 mL in ein 1,5 mL Reaktionsgefäß verbracht. Die Aliquots wurden in einen Cryo-Freezing-Container (3.2.2) überführt und auf -90°C herunter gekühlt. Zum Auftauen wurden die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff herausgenommen und sofort in einem 37°C warmen Wasserbad aufgetaut und anschließend auf Eis gestellt. Danach wurden die Zellen in 9 mL auf 4°C gekühltem R10F+-Medium aufgenommen. Die Zellsuspension wurde bei 150 x g für 5 Min. bei 15°C zentrifugiert. Das Pellet wurde wiederum in Kulturmedium mit 10% FCS und 50 µg/mL Penicillin-Streptomycin-Lösung resuspendiert. Die Zellsuspension wurde auf 9 cm-Durchmesser-Zellkulturschalen ausgebracht, die, wie im folgenden Absatz beschrieben, vorbereitet wurden. 93 Beschichtung der Kulturgefäße mit Collagen-Lösung Die Beschichtung der Kulturschalen dient der verbesserten Adhärenz der Zellen auf den Platten. Hierfür wurden die gamma-bestrahlten Zellkulturschalen mit Collagenlösung (4 mg/mL Aqua dest.) befüllt und unter der Laminair über Nacht getrocknet. Es folgte eine 15-minütige UV-Bestrahlung der Platte. Die Platten konnten maximal 2 Wochen gelagert werden. Reinigen und Passagieren der pbMEC Auf einer 9 cm-Durchmesser-Zellkulturschale wurde die Zellsuspension in einer Dichte von ca. 5 x105 Zellen ausgesät. Nach 24 h wurde das Medium ausgetauscht, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Anschließend wurde alle 48 h das Medium erneuert. Nach 6-7 Tagen wurden die Zellen gereinigt. Im Durchlichtmikroskop wurden drei pbMECKolonien (fleckenartige Anordnung, pflastersteinartig, Abb. 9B) markiert. Das Kulturmedium wurde abgenommen und der Zellrasen zwei Mal mit 5 mL PBS gewaschen. Dann wurde 1 mL Trypsin-EDTA 0,025% zugesetzt und bei 37°C 3 Min. inkubiert. Anschließend wurde unter Sichtkontrolle der Zeitpunkt abgewartet an dem Fibroblasten sich gelöst haben, die pbMEC aber noch an der Platte hafteten. Die Trypsin-EDTA-Lösung mit den Fibroblasten und nicht haftenden pbMEC wurde abgesaugt und der Zellrasen drei Mal mit 5 mL PBS gewaschen. Die pbMEC-Kolonien erreichten nach zwei weiteren Tagen im Brutschrank eine Konfluenz von 60-80%. Zum Passagieren der pbMEC wurde den Zellen 1 mL Trypsin-EDTA 0,25% zugefügt. Die Zellen wurden für etwa 20 Min. unter Sichtkontrolle inkubiert. Wenn unter Sichtkontrolle im Durchlichtmikroskop eine Loslösung beobachtet werden konnte, wurden die Zellen in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen überführt, mit 30 mL Medium versetzt und mit 150 x g 5 Min. bei 15°C zentrifugiert. Anschließend wurden pbMEC auf eine Dichte von ca. 3 x105 Zellen/mL eingestellt und in 1 mL auf 6-well-Zellkulturplatten ausgesät. 94 Abb. 9 A B C D pbMEC-Kulturen in verschiedenen Wachstumsstadien. A) Primäre bovine MEC-Kulturen in 10-facher Vergrößerung drei Tage nach dem Aussäen. Im Kreis liegen pbMEC-Kolonien und im Quadrat sind Fibroblastenkolonien anhand ihrer fischzugartigen Kolonie-Morphologie zu erkennen. B) Einige pbMEC-Kolonien wurden markiert, um diese bei der Reinigung mit Trypsin-EDTA-Verdünnungen zu erhalten (4-fache Vergrößerung). C) pbMEC kurz nach der Reinigung mit Trypsin-EDTA-Lösung (10-fache Vergrößerung). Nur noch vereinzelt finden sich Fibroblasten (Quadrat). D) Pflastersteinartige Morphologie der pbMEC 4 Tage nach der Reinigung (20-fache Vergrößerung). 3.3.17.1 Stimulation von pbMEC mit Bakterien und PAMPs Primäre bovine MEC (pbMEC) wurden, wie unter 3.3.17 beschrieben, bis zur Konfluenz kultiviert. Die Zellkulturen wurden zwei Mal mit PBS gewaschen und ein Mediumwechsel durchführt. Zu parallelen Ansätzen wurden folgende Stimuli gegeben: a) 1 x107/mL E.-coliBakterien (Stamm 1303), b) 1 x107/mL S.-aureus-Bakterien (Stamm 1027), c) 1 µg/mL LPS vom E.-coli-Stamm 1303 (3.2.8.1), d) 10 µg/mL LTA vom S.-aureus-Stamm 1027 (3.2.8.1). Die Kulturen wurden entweder 6 h oder 18 h in vitro stimuliert. Danach wurden zellfreie 95 Überstände gewonnen, in 15 mL Zentrifugenröhrchen überführt und umgehend bei -20°C eingefroren. Die Zellen wurden zwei Mal mit PBS gewaschen und anschließend deren mRNA präpariert. Präparation der mRNA Nach zweimaligem Waschen der pbMEC-Kulturen wurde in jede Vertiefung der 6-wellZellkulturschalen 1 mL Trizol (3.2.3) gegeben. Die Platten wurden 5 Min. auf einem Plattenschüttler bei 500 rpm inkubiert. Die Zellen wurden mit Hilfe eines Zellschabers von den Böden der Kulturschalen gelöst und in 1,5 mL Reaktionsgefäße (3.2.2) überführt. Durch die Zugabe von 200 µL Chloroform wurden die Proteine und Salze des Zelllysates gefällt, indem das Gemisch 3 Min. auf Eis stehen gelassen wurde. Es folgte ein Zentrifugationsschritt (15 Min., 14.000 x g, 4°C). Der klare RNA enthaltende Überstand wurde abgenommen und in ein neues 1,5 mL Reaktionsgefäß überführt. Durch die Zugabe von 500 µL Isopropanol und nach der Inkubation auf Eis für 10 Min. wurde die RNA gefällt und anschließend zentrifugiert (10 Min., 14.000 x g, 4°C). Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde resuspendiert und mit 1 mL Ethanol gewaschen (Zentrifugation 5 Min., 14.000 x g, 4°C). Der Überstand wurde wiederum verworfen. Das Pellet wurde unter der Sterilbank getrocknet und darauf folgend in 50 µL RNAse-freiem H2O (DEPC- behandelt, 3.2.3) aufgenommen. Von dieser Lösung wurde 1 µL in ein NanoDrop®-Gerät (3.1) gegeben, das durch die Messung der OD die Konzentration der RNA ermittelte. Die Reinheits- und Integritätsbestimmung wurde mit 1 µg RNA nach dem Protokoll von YANG et al. (2008) durchgeführt. 3.3.17.2 Quantitative reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion Um zu prüfen, ob die Stimulation der pbMEC-Kulturen erfolgreich war, wurde die Kopienzahl der kodierenden mRNA für TNF-α, TGF-β, CXCL8 und LAP gemessen. Die quantitative reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) erfolgte mit dem Sybr Green Fast Start Kit (3.2.3) in einem LightCycler (3.1) durch Abteilung für Molekularbiologie der FBN Dummerstorf unter Leitung von Hans-Martin Seyfert. Die Daten wurden für die Auswertung zur Verfügung gestellt. 3.4 Statistische Verfahren Die statistische Auswertung wurde mit Hilfe der Software SigmaStat Version 2.03 (SPSS Inc.) durchgeführt. Zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit von Differenzen zwischen Datengruppen wurde der zweiseitige Student´s t-Test oder der gepaarte t-Test, bei nicht normalverteilten Werten der signed-rank Test eingesetzt (STEEL u. TORRIE 1980). Es wurden fol- 96 gende Signifikanzstufen in Abhängigkeit von der Irrtumswahrscheinlichkeit p festgelegt: p ≤ 0,001 (hoch signifikant, ***); p ≤ 0,01 (signifikant, **), p ≤ 0,05 (schwach signifikant,*); p > 0,05 (nicht signifikant, n.s.). Die Interassayvarianz ist ein Maß für die Streuung der Messwerte eines Parameters in zeitlich verschiedenen Untersuchungen und beschreibt die Wiederholbarkeit der Ergebnisse von Test zu Test. Für ein biologisches System, dessen Reaktionslage in Abhängigkeit von vielen Faktoren prinzipiell inter- und intraindividuell zu Schwankungen neigt, war eine gute Reproduzierbarkeit der Werte für die einzelnen Parameter unterschiedlicher Tests nicht zu erwarten. Daher wurden in dieser Arbeit Interassayvarianzen nur punktuell bestimmt. Die Intraassayvarianz innerhalb einer Untersuchung ist ein Maß für die Streuung der Messwerte innerhalb desselben Probenansatzes. Dabei wird untersucht, wie stark die Messwerte bei mehrfacher Messung eines Parameters derselben Probe in Parallelansätzen voneinander abweichen. Für die mit der Referenzzellmethode ermittelte Gesamtzahl vitaler Zellen (3.3.6) ergab sich für die Einzelansätze von Triplikaten innerhalb eines Ansatzes ein Varianzkoeffizient zwischen 2% und 10%. Der Rang-Korrelationstest nach Spearman ist ein nicht-parametrischer Test, der verwendet wird, wenn eine Korrelation zwischen Ordinalwerten bzw. Werten, die nicht normalverteilt sind, bestimmt werden soll. Dabei werden die erhobenen Daten nach Rang geordnet und wie Messwerte betrachtet. Bei gleichen Werten innerhalb derselben Reihe werden mittlere Rangplätze zugeordnet. Mit Hilfe der Diskrepanz zwischen zwei Sets korrespondierender Rangierungen di = Xi – Yi berechnet sich der Rang-Korrelationskoeffizient wie folgt: rS = 1 − 6∑ d i2 n3 − n n: di: rS: Stichprobenumfang Diskrepanz zwischen zwei Rangierungen Xi und Yi Rang-Korrelationskoeffizient nach Spearman Signifikante Unterschiede können schon bei Werten für rS unter 0,5 bestehen, aber erst bei rSWerten über 0,5 ist von einer biologischen Relevanz eines Zusammenhangs zwischen zwei Werten auszugehen. Im Ergebnisteil werden einige Daten in Form von Boxplots dargestellt. Der Boxchart dient der Darstellung statistischer Auswertungen der Messwertverteilung. In Abb. 10 ist ein symbolischer Boxchart zur Erläuterung dargestellt. Das untere Kreuz zeigt den Minimalwert an und das untere Ende der vertikalen Linie bezeichnet die 5% Grenze. Die untere Begrenzung der Box markiert die 25%, die mittlere Linie die 50% und die obere Begrenzung die 75% Grenze. Innerhalb der Box liegen also 50% aller gemessenen Werte. Das Quadrat gibt das arithmetische Mittel aller Messwerte an. Das obere Ende der vertikalen Linie bezeichnet die 95% Grenze. Das obere Kreuz zeigt den maximalen Messwert an. Verteilung Messwert 97 Maximum 95 % Grenze 75 % Grenze Mittelwert 50 % Grenze 25 % Grenze 5 % Grenze Minimum Parameter Abb. 10 Exemplarischer Aufbau eines Boxcharts mit statistischen Kennzahlen. 98 4 Ergebnisse 4.1 Eutergesunde Tiere Das vorliegende Tiermodell schloss die umfassende Analyse von eutergesunden Tieren ein, die einen geringen Gehalt an somatischen Zellen (< 50.000 somatische Zellen/mL) in der Milch aufwiesen. Anhand dieser Tiere sollten die individuellen Ausgangssituationen auf Ebene der somatischen Zellen der Milch und auf genetischer Ebene erfasst werden, um diese mit den Reaktionen nach experimentell induzierter Mastitis zu vergleichen. 4.1.1 Klinische Symptome im Zeitverlauf Um zu gewährleisten, dass die untersuchten Tiere den Auswahlkriterien des Mastitis-Modells entsprachen, wurden je fünf Kühe über 24 h und über 72 h auf die Parameter Körpertemperatur, Milchleistung, Eutersekret-Beschaffenheit und Euterpalpationsbefund untersucht. Das Allgemeinbefinden der sogenannten Goldstandardtiere blieb über den Beobachtungszeitraum hinweg ungestört. Der Verlauf der Körpertemperaturen unterlag physiologischen Schwankungen (38,4 ± 0,11 °C). Die Milchleistungen der Tiere blieben im Mittelwert konstant zwischen 2,9 ± 0,08 und 3,3 ± 0,07 Liter pro Euterviertel. Die Sekretbeschaffenheit der Milch wies keine pathologischen Veränderungen auf. Das Eutergewebe war feinkörnig und weich (ohne Befund) bis grobkörnig, aber weich (I) (vergl. Tab. 7). Damit entsprachen die Goldstandardtiere den geforderten Kriterien für den Infektionsversuch. 99 B 39,0 Milch/Viertel (L) Temperatur (C°) A 38,5 38,0 0 12 24 36 48 60 72 3,5 3,0 2,5 0 12 24 36 48 60 72 Zeit (h) Zeit (h) Abb. 11 Körpertemperatur und Milchleistung der Euterviertel der Goldstandardkühe. Mittelwerte ± SEM der Körpertemperatur (A) zu jeder Melkzeit von Goldstandardtieren, die über einen Zeitraum von 24 h (n = 10) und 72 h (n = 5) beobachtet wurden. Die Mittelwerte ± SEM der Milchleistung der einzelnen Euterviertel (B) zeigten über einen Zeitraum von 24 h (n = 36, es fehlen Daten eines Tieres) und 72 h (n = 20) keine signifikanten Unterschiede. 4.1.2 Zellpopulationen in der Milch eutergesunder Tiere Die nicht-infizierten Kontrolltiere (Goldstandardtiere) wurden engmaschig untersucht und final geschlachtet. Der Schwerpunkt lag auf der Dokumentation klinischer Parameter und der Analyse somatischer Zellen der Milch. Im Beobachtungszeitraum von 72 h waren die Niveaus der somatischen Zellzahlen (SCC) im Mittel relativ konstant. Der SCC stieg von 40 ± 5 x103/mL auf 54 ± 10,8 x103/mL zum Zeitpunkt 12 h nach Versuchsbeginn an und fiel zum Ende des Beobachtungszeitraumes auf 26 ± 4 x103/mL ab (Abb. 12, A). Auf Ebene der Euterviertel waren die Zellzahlverläufe homogen (Abb. 12, B). 100 B 80 SCC (x10³/mL) SCC (x10³/mL) A 60 40 20 0 0 12 24 36 48 60 72 Zeit (h) HR HL VR VL 80 60 40 20 0 0 12 24 36 48 60 72 Zeit (h) Abb. 12 Gehalte somatischer Zellen in der Milch eutergesunder Tiere. Mittelwerte ± SEM der somatischen Zellzahlen (SCC) zu jeder Melkzeit über alle Tiere (A) und auf Ebene der Euterviertel (B). 0-24 h: n = 36 (es fehlen Daten eines Tieres); 36-72 h: n = 20. Es waren keine signifikanten Unterschiede zu beobachten. Die Zellzahlen einzelner Tiere und einzelner Euterviertel lagen auf unterschiedlichen Niveaus (Abb. 13, A und B). So war bei Tier M-31 ein Anstieg der Zellzahl 12 h nach Beginn des Beobachtungszeitraumes um das Dreifache zu beobachten (Abb. 13, B). 101 B Tier M14: SCC (x10³/mL) 250 200 HR HL VR VL 150 100 50 0 250 SCC (x10³/mL) A M24 M25 M31 200 150 100 50 0 0 12 Zeit (h) 24 0 12 24 36 48 60 72 Zeit (h) Abb. 13 Individuelle und Euterviertel-spezifische Unterschiede der Zellzahlniveaus. Dargestellt sind SCC-Werte auf der Ebene einzelner Euterviertel eines Tieres (A) sowie auf der Ebene verschiedener Tiere (B). Die größte Zellpopulation unter den Milchzellen bildeten neutrophile Granulozyten mit einem Anteil von 45 ± 7% an den Leukozyten. Lymphoide Zellen hatten einen Anteil von 39 ± 9%. Makrophagen und Monozyten stellten mit einem Anteil von 7 ± 2% bzw. 3 ± 1% die kleinste Population dar. Unter den lymphoiden Zellen konnten 50 ± 5% CD8+-T-Zellen, 19 ± 2% CD4+-T-Zellen und 27 ± 2,6% γδ-T-Zellen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). 102 B 5 50 γδ+ (x10³/mL) PMN (x10³/mL) A 40 30 20 10 0 1 0 12 24 36 48 60 72 8 CD8+ (x10³/mL) 6 4 2 0 6 4 2 0 0 12 24 36 48 60 72 E 0 12 24 36 48 60 72 F 4 3 2 1 0 0 12 24 36 48 60 72 Zeit (h) Zeit (h) Monozyten (x10³/mL) CD4+ (x10³/mL) 2 D 8 Makrophagen (x10³/mL) 3 0 0 12 24 36 48 60 72 C 4 4 3 2 1 0 0 12 24 36 48 60 72 Zeit (h) Abb. 14 Zellsubpopulationen in der Milch eutergesunder Tiere. Mittelwerte der Gehalte der Zellpopulationen (x10³/mL Milch) und ihre 95%-Konfidenzintervalle. Die Werte wurden aus der Verrechnung des SCC mit den relativen Anteilen der jeweiligen Zellpopulation an den Gesamtleukozyten der Milch ermittelt. 103 Die Anzahl an neutrophilen Granulozyten und ihre Dynamik während des Beobachtungszeitraumes war vergleichbar mit der Gesamtzellzahl in der Milch (vergleiche Abb. 14, A mit Abb. 12). Dies spiegelte sich auch in einer hohen Korrelation (r=0,939 und p<0,0001) zwischen der Anzahl PMN und den SCC-Werten wider (Abb. 15). Die Anzahl von Monozyten schwankte zwischen 2 x10³ und 0,1 x10³ Zellen/mL (Abb. 14, F) und Makrophagen zwischen 2 und 4 x10³ Zellen/mL. Während bei den lymphoiden Zellen die Anzahl der γδ-T-Zellen relativ konstant zwischen 2 ± 0,2 x10³ Zellen/mL und 3 ± 0,5 x10³ Zellen/mL lag, stieg die absolute Anzahl an CD4+und CD8+-T-Zellen gegen Ende des Beobachtungszeitraums deutlich auf das ca. Fünffache des Ausgangsniveaus an (Abb. 14 C bis E). PMN (x10³/mL) 120 r =0,939; p<0,0001 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 250 SCC (x10³/mL) Abb. 15 Korrelation zwischen der Zahl neutrophiler Granulozyten und dem somatischen Zellgehalt (SCC) der Milch. Die Daten basieren auf den Werten von 5 Tieren (20 Euterviertel, 7 Messzeitpunkte). Die PMN-Zahl wurde durchflusszytometrisch erfasst. Das Verhältnis von CD4+- und CD8+-T-Zellen blieb über 60 h konstant zwischen 0,37 ± 0,07 und 0,48 ± 0,13. Zum Ende des Beobachtungszeitraums fiel der Wert auf 0,28 ± 0,07 (nicht signifikant). Das CD4+/CD8+-Verhältnis korreliert zu den Messzeitpunkten schwach aber signifikant mit der Anzahl somatischer Zellen (Abb. 16, B). 104 A B 1,00 CD4+/CD8+ CD4+/CD8+ 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00 r =0,45; p<0,0001 0,75 0,50 0,25 0 12 24 36 48 60 72 Zeit (h) 0,00 0 20 40 60 80 100 SCC (x10³/mL) Abb. 16 Das Verhältnis von CD4+- und CD8+-T-Zellen und die Korrelation mit der Zellzahl. A) Verhältnis von CD4+- zu CD8+- T-Zellen auf Euterviertelebene im Beobachtungszeitraum 0-24 h: n = 36 Euterviertel (es fehlen Daten eines Tieres); 36-72 h: n = 20 Euterviertel. B) Korrelation des SCC mit dem CD4+/ CD8+-Verhältnis. 4.1.3 Mediatoren in der Milch 4.1.3.1 Histamingehalt im Milchserum Zu Beginn des Beobachtungszeitraumes lag der Histamingehalt im Milchserum im Mittel bei 25 ± 4 ng/mL und nahm in den folgenden 60 Stunden Werte zwischen 20 und 30 ng/mL an (Abb. 17, A). Nach 72 h fiel der Gehalt im Mittelwert auf 16 ± 2 ng/mL. Bei der Betrachtung der Einzeltierwerte fielen die Histamingehalte in der Milch von Tier M-31 auf, die über die ersten 48 h des Beobachtungszeitraumes auf einem hohen Niveau zwischen 45 und 75 ng/mL lagen (Abb. 17, B). Es konnte eine Korrelation zwischen dem SCC und dem Histamingehalt festgestellt werden (Abb. 17, C). 105 A B 100 Histamin (ng/mL) Histamin (ng/mL) 40 30 20 10 0 12 24 36 48 60 72 M21 M22 M24 M25 M31 75 50 25 0 Zeit (h) 0 12 24 36 48 60 72 Zeit (h) C Histamin (ng/mL) 100 r =0,63; p<0,0001 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 250 SCC (x10³/mL) Abb. 17 Histamingehalte im Milchserum von Goldstandardkühen. A) Mittelwerte ± SEM Euterviertelebene im Beobachtungszeitraum 0-24 h: n = 36 (es fehlen Daten eines Tieres); 36-72 h: n = 20. B) Individuelle Werte (Mittelwerte ± SEM der vier Euterviertel). C) Korrelation der Histamingehalte mit dem SCC aller untersuchten Euterviertel. 4.1.3.2 Zytokingehalte der Milch Der Gehalt an den Zytokinen Il-1β, IFN-γ und TNF-α wird unter 4.2.4 zusammen mit den Zytokingehalten in der Milch infizierter Tiere besprochen. 106 4.2 Infizierte Tiere 4.2.1 Klinische Symptome im Zeitverlauf Die Untersuchung der Probanden erfolgte im Abstand von 12 Stunden zu den Melkzeiten. Die Körpertemperatur der mit E. coli infizierten Tiere wurde alle 3 Stunden erfasst. Sie stieg 9 h p.i. auf 38,8 ± 0,44°C an und war 15 h p.i. am höchsten (41,1°± 1,13°C). Nach 18 h p.i. fiel die Temperatur auf 39,1 ± 0,91°C (Abb. 18, A). Die Köpertemperatur der mit S. aureus infizierten Tiere wurde zu den Melkzeiten alle 12 h gemessen und blieb im Mittelwert konstant zwischen 38,3 ± 0,2°C und 38,6 ± 0,5°C (Abb. 18, B). A B b 41,0 Temperatur (°C) Temperatur (°C) 41,0 a 40,5 40,0 39,5 c 39,0 38,5 38,0 40,5 40,0 39,5 39,0 38,5 0 6 12 18 Zeit p.i. (h) 24 38,0 0 12 24 36 48 60 72 Zeit p.i. (h) Abb. 18 Verlauf der Körpertemperatur nach Inokulation mit den Mastitiserregern E. coli und S. aureus. Jeweils 5 Tiere wurden experimentell zum Zeitpunkt 0 h in einem Euterviertel mit E. coli-Bakterien (A) oder mit S.-aureus-Bakterien (B) inokuliert. A) Im Vergleich zur 0 h-Temperatur ist nach 12 h ein schwach signifikanter Anstieg zu vermerken (a, p<0,05) und zum 9 h p.i. Wert ein signifikanter Anstieg (p<0,01). Der Vergleich der 15 h p.i. Temperatur zum 0 h-Zeitpunkt ist hochsignifikant (b, p<0,001). Im Vergleich zum 15 h p.i. Wert fällt die Temperatur zum 18 h p.i. Zeitpunkt schwach signifikant (c, p<0,05) ab. In den S.-aureus-Infektionsversuchen konnte keine signifikante Erhöhung der Körpertemperatur festgestellt werden. Nach einer Inokulation mit E. coli waren sowohl hochgradige Veränderungen des Eutersekretes (Flocken, Verlust des Milchcharakters) als auch eine starke entzündliche Schwellung betroffener Euterviertel bereits 12 h p.i. zu beobachten (Tab. 13). 107 Tab. 13 E. coli Klinische Veränderungen nach Inokulation der Erreger. M-08 M-12 M-15 M-16 M-19 S. aureus M-20 M-23 M-28 M-29 M-30 Infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo Sekretbefund CMT 2 3 0 2 0 0 0 1 Palpationsbefund 3 0 1 1 Sekretbefund CMT 2 3 0 0 0 1 0 1 Palpationsbefund 2 0 1 1 Sekretbefund 3 0 0 0 CMT Palpationsbefund 3 3 0 3 1 1 0 1 Sekretbefund 3 0 0 0 CMT 3 3 2 1 Palpationsbefund 3 0 0 0 Sekretbefund 3 0 0 0 CMT 3 2 1 0 Palpationsbefund 2 0 0 0 Sekretbefund 2 0 0 0 CMT Palpationsbefund 3 3 0 0 0 0 0 0 Sekretbefund 2 0 0 0 CMT 3 0 0 0 Palpationsbefund 2 1 1 1 Sekretbefund 0 0 0 0 CMT 2 0 0 0 Palpationsbefund 1 0 1 1 Sekretbefund 0 0 0 0 CMT Palpationsbefund 2 1 0 0 0 1 0 1 Sekretbefund 1 0 0 0 CMT 3 0 1 0 Palpationsbefund 1 1 1 1 Dargestellt sind die graduelle Veränderungen nach dem „Punkteschema zur Feststellung der Ausprägung ausgesuchter klinischer Pa-rameter nach experimentell induzierter Mastitis.“ (Tab. 8). Bewertet wurde jeweils die maximale Ausprägung einer klinischen Veränderung pro Tier während einer 24- oder 72-stündigen Versuchsdauer. 108 Die mit S. aureus infizierten Tiere zeigten geringgradige klinische Anzeichen einer Euterentzündung, die durch zunehmende Flockenbildung (bis ++ Flocken) in der Milch bei erhaltenem Milchcharakter geprägt waren. Die maximale Ausprägung einer klinischen Veränderung zeigten sich bei diesen Tieren 24 h p.i. (Tab. 13). Die Milchleistung in E. coli infizierten Eutervierteln fiel innerhalb der ersten 12 h p.i. signifikant von 4,6 ± 0,2 L auf 3,3 ± 0,2 L Viertelgemelksleistung ab (Reduktion auf 73%) (p<0,05). In den Kontroll-Eutervierteln reduzierte sich die Milchleistung von 3,7 ± 0,6 L bzw. 4 ± 1,2 L auf 2,7 ± 0,8 L bzw. 2,8 ± 0,6 L (Abb. 19, A). Allerdings lag hier keine Signifikanz vor. In dem mit Placebo behandelten Eutervierteln sank die Milchleistung signifikant von 3,6 ± 0,9 L auf 2,5 ± 0,9 L (p<0,05). 24 h nach der Inokulation mit E. coli fiel im infizierten Euterviertel die Milchleistung auf 1,8 ± 0,4 L (p<0,01). Dies entsprach einer Reduktion auf 53% der Ausgangsmilchleistung. In den Kontroll-Eutervierteln sank die Milchleistung auf 2,0 ± 0,8 L bzw. 2,2 ± 1,2 L (Kontroll-Euterviertel 1, p<0,01; Kontroll-Euterviertel 2, p>0,05). Im PlaceboEuterviertel war ein signifikanter Abfall der Milchleistung auf 2,0 ± 0,3 L festzustellen (p<0,01). Zwischen dem infizierten und den Kontroll- bzw. Placebo-Eutervierteln wurde kein signifikanter Unterschied sichtbar. Auch die Unterschiede zwischen dem infizierten und den Kontroll- bzw. PlaceboEutervierteln nach Inokulation mit S. aureus waren nicht signifikant (Abb. 19, B). 12 h p.i. fiel die Milchleistung im infizierten Euterviertel von 3,9 ± 0,5 L auf 3,09 ± 0,4 L (p>0,05). Insgesamt schwankte die Milchleistung zwischen 75% und 87% der Ausgangsmilchleistung. 109 B A 5 a 4 b 3 c Milch/Viertel (L) Milch/Viertel (L) 5 Infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo a b Infiziert Kontrolle 1 c c c c c 4 3 2 2 0 12 24 Zeit p.i. (h) Zeit p.i. (h) Viertel: infiziert 0 12 24 36 48 60 72 Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo Abb. 19 Einfluss einer experimentellen Inokulation mit E. coli und S. aureus auf die Milchleistung der Euterviertel. Die Milchleistung (L, Mittelwerte ± SEM) zu jeder Melkzeit wurde vor (0 h) und nach experimenteller Inokulation mit E. coli (n = 5) über einen Zeitraum von 24 h (A) und mit S. aureus (n = 5) über 72 h (B) ermittelt. A: a) Auf dem zu inokulierenden Euterviertel war die Milchleistung zum Zeitpunkt 0 h höher (p<0,05). b) Abfall der Milchleistung von 0 h zu 12 h (p<0,05) im Placebo- und infizierten Euterviertel. c) Im infizierten Euterviertel fällt die Milchleistung des 24 h-Gemelks hochsignifikant ab (p<0,001). In den übrigen Eutervierteln ist die gleiche Tendenz zu sehen, die allerdings nicht signifikant ist. B: a zu b) Der Abfall der Milchleistung ist 12 h p.i. in allen Eutervierteln schwach signifikant (p<0,05) und a zu c) blieb im Zeitverlauf im infizierten und im Kontrollviertel 1 auf signifikant niedrigerem Niveau (p<0,05). 4.2.2 Dynamik der Milchzellpopulationen nach Inokulation mit E. coli und S. aureus In Eutervierteln, die mit dem euterpathogenen Stamm E. coli 1303 infiziert waren, ließ sich ein signifikanter Anstieg (p<0,05) der somatischen Zellzahl 12 h p.i. von 19 ± 7 auf 1.619 ± 569 x103 SCC/mL feststellen (Abb. 20, A). Nach weiteren 12 h stieg die Zahl der somatischen Zellen zwar stark, aber nicht signifikant auf 7.232 ± 3171 x10³ SSC/mL an (Abb. 20, A). Individuell lagen große Unterschiede in der zellulären Reaktion vor. Bei zwei von fünf Individuen wurde ein moderater Zellinflux beobachtet. Die Milch von Tier M-08 und 110 M-11 enthielt nach 12 h 0,491 bzw. 0,049 x106 Zellen/mL und nach 24 h 1,0 bzw. 1,3 x106 Zellen/mL. Bei den Tieren M-15, M-16 und M-19 kam es zu einem stärkeren Zelleinstrom. Nach 12 h wiesen diese drei Tiere im Mittel einen Zellgehalt von 2,5 ± 0,2 x106 SCC/mL auf. So stieg dieser nach weiteren 12 Stunden bei M-15 und M-19 auf 7,0 bzw. 8,2 x106 SCC/mL (also 7x höher als bei M-08 und M-11). Bei der Kuh M-16 war ein Anstieg auf 18,5 x106 SCC/mL zu verzeichnen (Abb. 20, B). A B 25000 SCC (x10³/mL) SCC (x10³/mL) 25000 20000 15000 10000 * 5000 M08 M12 M15 M16 M19 20000 15000 10000 5000 0 0 0 12 Zeit p.i. (h) 24 0 12 24 Zeit p.i. (h) Abb. 20 Entwicklung der somatischen Zellzahl (SCC x10³/mL) nach experimenteller Inokulation von Eutervierteln mit 500 KbE E. coli über einen Zeitraum von 24 Stunden. A) Mittelwerte ± SEM der somatischen Zellzahlen (SCC) der Euterviertel, die mit E. coli infiziert wurden (n=5). Ein signifikanter Zellzahlanstieg konnte 12 h p.i. beobachtet werden (p<0,05). Die Erhöhung des SCC von 12 h p.i. zu 24 h p.i. war nicht signifikant. B) SCC-Werte in infizierten Eutervierteln einzelner Tiere. Nach Infektion mit S. aureus wurde 12 h p.i. ein transienter Anstieg des Zellgehaltes im Mittel aller inokulierten Euterviertel auf 289 ± 196 x10³ SCC/mL beobachtet, der 24 h p.i. mit 3.214 ± 1.140 x10³ SCC/mL seinen Höhepunkt erreichte. Anschließend sank die Zellzahl auf 1.873 ±500 x10³ SCC/mL zum Zeitpunkt 72 h p.i. (Abb. 21, A). Bei der Betrachtung der Einzeltiere wurden erhebliche individuelle Unterschiede deutlich (Abb. 21, B). Während bei drei Tieren 24 h nach Inokulation ein deutlicher, bis zu 3.000-facher Anstieg der Zellzahlen zu beobachten war, stieg dieser Wert bei zwei Tieren kaum oder erst 72 h p.i. an. 111 B A 5000 6000 * 4000 3000 * * 2000 * SCC (x10³/mL) SCC (x10³/mL) 6000 5000 4000 3000 2000 1000 1000 0 0 0 12 24 36 48 60 72 Zeit p.i. (h) M20 M23 M28 M29 M30 0 12 24 36 48 60 72 Zeit p.i. (h) Abb. 21 Entwicklung der somatischen Zellzahl (SCC x10³/mL) nach experimenteller Inokulation von Eutervierteln mit 10.000 KbE S. aureus über einen Zeitraum von 72 Stunden. A) Mittelwerte ± SEM der somatischen Zellzahlen (SCC) der Euterviertel, die mit S. aureus infiziert wurden (n=5). Ab 24 h nach Inokulation unterschieden sich die Zellzahlen schwach signifikant (* = p<0,05) vom SCC in der 0 h-Probe. B) SCC-Werte in infizierten Eutervierteln einzelner Tiere. Aus dem SCC-Wert und den relativen Anteilen zellulärer Subpopulationen wurden absolute Zahlen (pro mL Milch) für die einzelnen Zellsubpopulationen errechnet. Die Dynamik dieser Zellpopulationen wird im Folgenden besprochen. Neutrophile Granulozyten Ein großer Anteil somatischer Zellen wurde in beiden experimentell induzierten Infektionen durch den Einstrom von Neutrophilen bedingt. Nach Inokulation mit E. coli verliefen die SCC-Werte und die PMN-Zahl in den infizierten Eutervierteln vergleichbar (vgl. Abb. 20, A und Abb. 22, A). Der Anteil PMN an den Milchzellen stieg von initial 42 ± 14% nach 12 h p.i. auf 94 ± 1% (p<0,05) und blieb nach 24 h p.i. konstant hoch (Abb. 22, B). Bei der Betrachtung des Kontrollviertels 2 fiel ebenfalls ein PMN-Einstrom auf (Abb. 22, A). Die Anzahl an PMN stieg von initial 30 ± 19 x10³ PMN/mL Milch auf 1.732 ± 1.691 x10³ PMN/mL zum 12 h Zeitpunkt und blieb auf diesem Niveau. Nach Infektion mit S. aureus strömte im Vergleich zu E. coli eine geringere Zahl an Leukozyten ein (Abb. 22, C). Doch auch hier stieg der PMN-Anteil von 28 ± 4% vor der Inokulation 112 des Erregers signifikant auf 77 ± 10% (p<0,05) 12 h p.i an und blieb über den gesamten Beobachtungszeitraum (bis 72 h) konstant erhöht (Abb. 22, D). A B 10000 infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo 5000 * 100 * * 12 24 80 PMN (%) PMN (x10³/mL) 15000 60 40 20 0 0 12 0 24 Zeit p.i. (h) Zeit p.i. (h) C D 5000 4000 100 infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo * 3000 * 2000 * * 1000 0 80 PMN (%) PMN (x10³/mL) 0 *** * *** * ** ** 60 40 20 0 0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72 Zeit p.i. (h) Zeit p.i. (h) Abb. 22 Einstrom von neutrophilen Granulozyten nach experimenteller Inokulation mit E. coli oder S. aureus. Mittelwerte ± SEM der PMN-Zahl auf Euterviertelebene von je 5 Tieren nach intrazisternaler Applikation von 500 KbE E. coli (A) oder 10.000 KbE S. aureus (C). Relativer Anteil (Mittelwerte ± SEM) der PMN an den Gesamtleukozyten in der Milch des E.-coli-infizierten Euterviertels (B) oder des S.aureus-infizierten Euterviertels (D). (* = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001) 113 Monozyten/Makrophagen Der nicht signifikante Anstieg der Makrophagen- und Monozyten-Zahlen im E.-coliinfizierten Euterviertel (Abb. 23 A, C) beruhte auf einem massiven Zelleinstrom bei dem Tier M-19 (Einzeldaten nicht gezeigt). In den Kontroll-Eutervierteln (besonders Kontrolle 1) war der Monozyten-Einstrom 12 h p.i. deutlicher als in den infizierten Eutervierteln. Sowohl die Makrophagen- als auch die Monozyten-Zahlen wiesen eine hohe, signifikante Korrelation zu den SCC-Werten auf (Abb. 23 B, D). B 500 Makrophagen (x10³/mL) Makrophagen (x10³/mL) A infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo 400 300 200 100 0 0 12 1000 r =0,909; p<0,0001 100 10 24 100 Zeit p.i. (h) 10000 SCC (x10³/mL) C D 500 infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo 400 300 Monozyten (x10³/mL) Monozyten (x10³/mL) 1000 200 100 0 0 12 Zeit p.i. (h) 24 1000 r=0,947; p<0,0001 100 10 100 1000 10000 SCC (x10³/mL) Abb. 23 Veränderungen in der Makrophagen- und der Monozyten-Population nach experimenteller Inokulation mit E. coli. Mittelwerte ± SEM der Makrophagen (A) und Monozyten (C) in der Milch verschiedener Euterviertel von fünf Tieren. Korrelation zwischen dem SCC und der Anzahl der Makrophagen (B) sowie der Monozyten (D). 114 Nach Inokulation von S. aureus stiegen die Makrophagen-Zahlen 12 h p.i. an und lagen über dem gesamten Beobachtungszeitraum (bis 72 h) höher als in den Kontroll-Eutervierteln (Abb. 24, A). Die Monozyten-Zahlen verhielten sich vergleichbar. Der starke Anstieg 24 h p.i. war auf einen Einstrom dieser Zellen in den infizierten Eutervierteln der Tiere M-20 und M-23 zurückzuführen (Abb. 24, C), wodurch sich der Unterschied nicht signifikant darstellte. Während die Zahl der Monozyten mit den SCC-Werten signifikant korrelierte, war dies für die Zahl der Makrophagen nicht der Fall (Abb. 24 B, D). B 300 200 infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo * 100 0 Makrophagen (x10³/mL) Makrophagen (x10³/mL) A 300 r =0,603; p>0,05 200 100 0 0 12 24 36 48 60 72 0 Zeit p.i. (h) 4000 6000 SCC (x10³/mL) D 300 200 infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo 100 0 0 12 24 36 48 60 72 Zeit p.i. (h) Monozyten (x10³/mL) Monozyten (x10³/mL) C 2000 300 r =0,725; p<0,0001 200 100 0 0 2000 4000 6000 SCC (x10³/mL) Abb. 24 Veränderungen in der Makrophagen- und der Monozyten-Population nach experimenteller Inokulation mit S. aureus. Mittelwerte ± SEM der Makrophagen (A) und Monozyten (C) in der Milch verschiedener Euterviertel von fünf Tieren. Zum Zeitpunkt 60 h p.i.war die Anzahl der Makrophagen schwach signifikant erhöht (* = p<0,05). Korrelation zwischen dem SCC und der Anzahl der Makrophagen (B) sowie der Monozyten (D). 115 Lymphoide Zellen Bei der Betrachtung der absoluten Zellzahlen dieser Population zeigte sich ein starker Einstrom 12 h nach der Inokulation von E. coli. Vor der Inokulation lagen 15 ± 6 x10³ lymphoide Zellen/mL Milch vor. Die Anzahl lymphoider Zellen erhöhte sich zum Zeitpunkt 12 h p.i. auf 161 ± 127 x10³ Zellen/mL und stieg nach weiteren 12 h auf 693 ± 380 x10³ Zellen/mL (Abb. 25, A). Es konnten keine Signifikanz ermittelt werden. Die Korrelation zwischen SCC-Wert und Anzahl lymphoider Zellen war mit r = 0,817 (p<0,0001) (Abb. 25, B) relativ hoch. B 1200 Lymphozyten (x10³/mL) Lymphozyten (x10³/mL) A infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo 1000 800 1000 600 400 200 0 0 12 r =0,817; p<0,0001 100 10 24 100 Zeit p.i. (h) 10000 SCC (x10³/mL) 300 200 infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo 100 0 0 12 24 36 48 60 72 Zeit p.i. (h) Lymphozyten (x10³/mL) D C Lymphozyten (x10³/mL) 1000 300 r =0,738; p<0,0001 200 100 0 0 2000 4000 6000 SCC (x10³/mL) Abb. 25 Anzahl lymphoider Zellen in der Milch nach experimenteller Inokulation mit E. coli und Korrelation mit dem SCC-Wert. Mittelwerte ± SEM der Anzahl lymphoider Zellen nach Inokulation von E. coli (A) und nach Inokulation von S. aureus (C) auf Euterviertelebene von fünf Tieren. Die Korrelation zwischen dem SCC und der Anzahl lymphoider Zellen war in beiden Infektionsversuchen signifikant (B, D) (p<0,0001). 116 Nach der Inokulation von S. aureus war ein Einstrom lymphoider Zellen erst 24 h p.i. zu beobachten. 36 h p.i. war die Zahl dieser Zellen mit 108 ± 75 161 ± 127 x10³ Zellen/mL am höchsten und lag über den weiteren Beobachtungszeitraum (bis 72 h) höher (nicht signifikant) als in den Kontroll-Eutervierteln (Abb. 25, C). Der SCC-Wert korrelierte auch hier mit der Anzahl lymphoider Zellen r = 0,817 (p<0,0001) (Abb. 25, D). T-Zellsubpopulationen Die Dynamik einzelner Lymphozytensubpopulationen konnte nach intrazisternaler Applikation von 10.000 KbE S. aureus differenzierter betrachtet werden. Bei den E.-coliInfektionsversuchen war aus technischen Gründen eine Differenzierung der Subpopulationen nicht möglich. Die Zahl aller drei T-Zellsubpopulationen (γδ-T-Zellen, CD4+-T-Zellen, CD8+-T-Zellen) stieg 24 h p.i. signifikant an (Abb. 26, A, B, C). Die Zahl an γδ−T-Zellen blieb in den infizierten Eutervierteln bis zu 72 h p.i. relativ gleichmäßig hoch. Gleiches konnte für die CD4+- und CD8+-T-Zellen über die ersten 60 h p.i. beobachtet werden. 72 h p.i. stiegen die Zahlen dieser beiden Populationen nochmals an. Die Unterschiede in der Zellzahldynamik zwischen CD4+und CD8+-T-Zellen äußerten sich zum Zeitpunkt 72 h p.i. in einem deutlich höheren CD4+/CD8+-Verhältnis in den infizierten Eutervierteln gegenüber den nicht-infizierten Kontroll- und Placebo-Eutervierteln (Abb. 26, D). 117 B 30 60 50 CD4+- (x10³/mL) γδ γδ-T-Zellen (x10³/mL) A 20 10 40 30 20 10 0 0 0 12 24 36 48 60 72 0 12 24 36 48 60 72 Zeit p.i. [h] Zeit p.i. (h) C D CD4+/CD8+ -Verhältnis 60 50 CD8+- (x10³/mL) Zeit p.i. (h) 40 30 20 10 0 1,25 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00 0 12 24 36 48 60 72 infiziert 0 12 24 36 48 60 72 Zeit p.i. (h) Zeit p.i. (h) Viertel: infiziert Kontrollen (gesamt) Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo Abb. 26 Zeitdynamik von T-Zellsubpopulationen nach experimenteller Inokulation eines Euterviertels mit S. aureus. Mittelwerte ± SEM /mL Milch von γδ− T-Zellen (A), CD4+-T-Zellen (B) und CD8+-T-Zellen (C) auf Euterviertelebene von fünf Tieren. D) Aus den absoluten Werten für CD4+- und CD8+-T-Zellen wurde das CD4/CD8-Verhältnis errechnet. Für die Darstellung wurden die Werte der beiden Kontrollviertel und des Placebo-Euterviertels zusammengefasst und mit den Werten für die infizierten Eutervierteln vergleichend dargestellt, da zwischen ihnen keine signifikanten Unterschiede auftraten (Daten nicht gezeigt). 118 4.2.3 Expression immunrelevanter Gene in infizierten und nicht-infizierten Kontroll-Eutervierteln Die Infektion eines Euterviertels induziert Prozesse, die sich auf benachbarte Euterviertel (hier Kontroll-Euterviertel, Placebo-inokuliertes Euterviertel) erstrecken können. Im Folgenden wurde dies anhand der mRNA-Expression ausgewählter, immunrelevanter Gene (Abb. 27) untersucht. Als Basis diente die Expressionsstärke im Milchdrüsengewebe nichtinfizierter Goldstandardkühe. Die mRNA-Kopienzahl/75 ng RNA ist in Tab. 14 dargestellt. 24 h nach Inokulation mit E. coli konnte für die Mehrzahl der untersuchten Gene eine bis zu 1285-fache Expressionssteigerung festgestellt werden. Einzelne Gene (CCL5, 5-fach) wurden nur schwach hochreguliert. Als einziges nicht reguliertes Gen erwies sich TGF-β. Tab. 14 Expressionsstärke der mRNA immunrelevanter Gene in Milchdrüsengewebe nicht-infizierter Goldstandardtiere und im Gewebe E.-coli-infizierter Euterviertel 24 h p.i. Gen E.-coli-infizierte Goldstandardtiere Euterviertel 24 h p.i. Vielfaches der Expression1 CXCL8 53 ± 9 68641 ± 34572 1285 CCL20 78 ± 7 43155 ± 18257 554 11005 ± 1112 55979 ± 11763 5 CCL5 TNF-α α 264 ± 28 4750 ± 1935 18 TGF-β β 1178 ± 133 1317 ± 202 1 iNOS 276 ± 76 8205 ± 3995 30 31022 ± 6563 6 SAA3 LAP 1334 ± 198 23x10 148244 6 762 ± 63815 111 ± 6x10 Mittelwerte ± SEM der mRNA-Kopienzahl/75 ng RNA aus Milchdrüsengewebe. 1) Der Mittelwert in den E.-coli-infizierten Eutervierteln (n=5 Viertel) wurde zum Mittelwert in den GoldstandardtierProben (n=20 Viertel) in Bezug gesetzt. Verwendete Abkürzungen: CXCL8 = Interleukin 8, CCL20 = CC-Chemokin 20, CCL5 = CC-Chemokin 5, TNF-α = Tumor Nekrose Faktor alpha, TGF-β = Transforming Growth Factor-beta, iNOS = induzierbare Stickoxid Synthetase, SAA3 = Serum Amyloid A3, LAP = Lingual Antimicrobial Peptide. 119 200 *** 150 100 mRNA-Kopienzahl / 75 ng RNA 50 0 250 200 150 100 50 0 CXCL8 750 *** 500 *** 15000 *** 10000 5000 0 CCL20 1500 CCL5 400 300 1000 200 250 0 500 TNF- α 0 250000 200000 150000 100000 50000 0 100 0 TGF- β *** iNOS 5000 4000 3000 2000 1000 0 SAA3 * ** LAP Euterviertel von Goldstandardtieren Kontrollviertel E. coli-infizierter Tiere (6 h) Kontrollviertel E. coli-infizierter Tiere (24 h) Abb. 27 Expressionsmodulation ausgewählter Gene in Kontroll-Eutervierteln zu unterschiedlichen Zeiten nach Inokulation eines Viertels mit 500 KbE E. coli. Mittelwerte ± SEM der mRNA-Kopienzahl/75 ng RNA aus Milchdrüsengewebe nicht infizierter Goldstandardtiere (n=20), und Kontroll-Eutervierteln E.-coli-infizierter Tiere (6 h und 24 h p.i., jeweils n=5). *** = p<0,001, **= p<0,01; * =p<0,05. Nach Vergleich der Kontroll-Euterviertel E.-coli-infizierter Tiere mit den Eutervierteln der Goldstandardtiere ergab sich 6 h p.i. eine signifikant verminderte mRNA-Expression des Chemokins CCL5 und eine um die 3-fach höhere Expressionsstärke des Defensins linguales 120 antimikrobielle Peptid (LAP). Alle anderen Zytokine, Chemokine und Effektormoleküle wiesen keine Änderung der Expressionsstärke auf. 24 h p.i. konnten in den Kontroll-Eutervierteln E.-coli-infizierter Tiere signifikant 3-5-fach höhere mRNA-Expressionsstärken für CXCL8, CCL20, TNF-α, SAA3 und LAP im Vergleich zu Goldstandardtier-Eutervierteln gemessen werden (Abb. 27). Damit konnte gezeigt werden, dass die Infektion eines Euterviertels die Genexpression benachbarter Euterviertel beeinflusst. 4.2.4 Zytokingehalte des Milchserums Erfasst wurden die Zytokine IL1-β, IFN-γ und TNF-α. Die Etablierung eines ELISAVerfahrens, das eine quantitative Bestimmung dieser Zytokine ermöglichen sollte, war nicht erfolgreich. An einem Beispiel (Abb. 28) wird für TNF-α gezeigt, dass die erreichbaren optischen Dichten nach Zugabe definierter Mengen an TNF-α in unterschiedlichen MilchserumVerdünnungen unterschiedlich ausfielen. Damit war die Erfassung der TNF-α-Konzentration anhand einer Standardkurve nicht möglich. log (mOD) 3 2 in ELISA-Verdünnungspuffer in Milchserum (1:2 verd.) in Milchserum (1:8 verd.) in Milchserum (1:32 verd.) 1 0 0,5 1,0 1,5 log TNF-α α (ng/mL) Abb. 28 Vergleich von Standardkurven der Zytokine in Testpuffer und Milchseren in unterschiedlichen Verdünnungsstufen. Dargestellt sind die Werte der Standardkurve in log (OD) nach Subtraktion der Werte in den Kontrollansätzen zur Prüfung unspezifischer Bindungen. Zu ELISA-Verdünnungspuffer (3.2.8.6) und unterschiedlichen Verdünnungen des Milchserums einer Goldstandardkuh wurde TNF-α in Konzentrationen von 0,3 ng/mL bis 30 ng/mL zugesetzt. 121 Aus diesen Gründen, die vergleichbar für IL-1β und IFN-γ zutrafen, wurde für diese Zytokine eine semiquantitative Auswertung gewählt. Es wurde geprüft, ob die optischen Dichten des ELISAs mit Milchseren infizierter Tiere signifikant über denen nicht-infizierter Goldstandardtiere lagen. Hierfür wurden aus den Mittelwerten und den Standardfehlern (SEM) der optischen Dichten (OD) in den Milchseren der Goldstandardtiere die Grenze des oberen 95%-Konfidenzintervalls berechnet. Dieser Wert besagt, dass mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,95 (bzw. 95%) und einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p=0,05 in der Milch eutergesunder Goldstandardtiere die obere Konfidenzintervall-Grenze nicht überschritten wird. Somit können OD-Werte von Milchseren infizierter Kühe, die die obere Konfidenzintervall-Grenze (Tab. 15)überschreiten, eine Erhöhung der Zytokin-Gehalte aufweisen. Tab. 15 Bestimmung der oberen 95%-Konfidenzintervall-Grenzen für optische Dichten (OD) im IL-1β β - und IFN-γ− γ−Milchserum-ELISA nach Untersuchung von γ− Goldstandard-Milchseren. IL1-β β IFN-γγ Mittelwert der OD SEM Oberes 95%-Konfidenzintervall Stichprobengröße n 0h 0,206 0,012 0,230 5 12 h 0,229 0,013 0,254 5 24 h 0,225 0,009 0,243 5 0h 0,046 0,001 0,049 5 12 h 0,046 0,001 0,048 5 24 h 0,049 0,003 0,053 5 Zur Festlegung der oberen Konfidenzintervall-Grenze wurde das Milchserum eines Viertels von je fünf Kühen untersucht. 122 Tab. 16 Optische Dichten im IL-1β β - und IFN-γ− γ−Milchserum-ELISA der infizierten γ− Euterviertel nach Inokulation mit E. coli oder S. aureus. E. coli S. aureus M-08 M-12 M-15 M-16 M-19 M-20 M-23 M-28 M-29 M-30 0,150 0,167 0,091 0,108 0,233 0,217 0,176 0,286 0,177 0,226 IL1-β β 12 h 0,598 0,772 0,105 0,135 0,246 0,194 0,200 0,280 0,226 0,223 24 h 1,440 0,286 0,599 0,311 0,482 0,286 0,207 0,277 0,193 0,331 0,044 0,034 0,025 0,031 0,050 0,038 0,026 0,033 0,046 0,034 IFN-γγ 12 h 0,046 0,088 0,025 0,035 0,040 0,042 0,028 0,034 0,047 0,034 24 h 0,169 0,038 0,045 0,050 0,057 0,057 0,026 0,036 0,053 0,042 0h 0h Es wurden jeweils die Milchseren von Goldstandard-Kühen und infizierten Kühen, die zu identischen Untersuchungszeitpunkten gewonnen wurden, miteinander verglichen. Die grau unterlegten Felder kennzeichnen die Werte, welche die obere Grenze des 95%-Konfidenzintervalls überschreiten und folglich als erhöhte OD-Werte bzw. Zytokin-Gehalte interpretiert wurden. In zwei von fünf Milchseren E.-coli-infizierter Tiere konnten 12 h p.i. erhöhte IL-1β-Gehalte gemessen werden. Der Anteil an Tieren mit erhöhten Werten stieg 24 h p.i. auf vier von fünf. Eines der fünf mit S. aureus infizierten Tiere wies leicht erhöhte IL-1β-Werte auf, die sich jedoch im Infektionsverlauf nicht änderten. 24 h p.i. konnten bei drei von fünf Tieren marginal erhöhte optische Dichten im IL-1β-ELISA nachgewiesen werden. Die IFN-γ-Gehalte lagen bei nahezu allen untersuchten Milchseren auf dem Ausgangsniveau. Das Milchserum eines E.-coli-infizierten Tieres (M-08) wies deutlich erhöhte Werte 24 h p.i. auf. TNF-α-Gehalte wurden mittels eines Radioimmunoassays ermittelt. Die Daten wurden freundlicherweise von Prof. Bruckmaier Abteilung Veterinär-Physiologie der Vetsuisse Fakultät, (Universität Bern) für die Auswertung zur Verfügung gestellt. Dieses Verfahren wurde von KENISON et al. (1990) validiert. Das Prinzip dieses Verfahrens gleicht der HistaminBestimmung durch den RIA (3.3.14). Der Nachweis wurde mit einem Kaninchen-Antikörper gegen rekombinantes TNF-α (F314) durchgeführt. Für die Erstellung der Standardkurve wurde rekombinantes TNF-α an Iod gekoppelt und eine Verdünnungsreihe hergestellt. Die Nachweisgrenze lag bei 0,1 ng/mL. In Abb. 29 sind die Werte der Einzeltiere dargestellt. Nach Inokulation mit E. coli zeigte ein Tier (Abb. 29, A, Tier M-08) einen starken Anstieg des TNF-α-Gehaltes von basal 0,9 ± 0,2 ng/mL auf 32 ng/mL. Ein im Mittel signifikanter 123 Anstieg auf 10,9 ± 6,9 ng/mL konnte bei erheblichen individuellen Schwankungen 24 h p.i. festgestellt werden. In der Milch S. aureus-infizierter Tiere konnte zu keinem Zeitpunkt p.i. ein signifikant höherer TNF-α-Gehalt nachgewiesen werden. Einzelne Tier zeigten gleichwohl deutlich erhöhte Gehalte 24 h p.i. und 60 h p.i. (Abb. 29, B). A B M08 M12 M15 30 M16 M19 20 10 M20 6 TNF-α α (ng/mL) TNF-α α (ng/mL) 40 M23 5 M28 4 M29 M30 3 2 1 0 0 12 24 0 0 12 24 36 48 60 72 Zeit p.i. (h) Zeit p.i. (h) Abb. 29 Gehalte an TNF-α in Milchseren E.-coli- oder S.-aureusinfizierter Euterviertel. Dargestellt sind die TNF-α-Gehalte einzelner Tiere in den infizierten Eutervierteln nach Inokulation von 500 KbE E. coli (A) und 10.000 KbE S. aureus (B), die mittels Radioimmunoassay ermittelt wurden. 4.2.5 Histamingehalte der Milchseren Der Histamingehalt der Milchseren wurde mit einem Radioimmunoassay (3.3.14) bestimmt. Der Basisspiegel an Histamin in den Milchseren betrug 20 ± 2 ng/mL. Ein signifikanter Anstieg auf 47 ± 9 ng/mL (p>0,05) konnte 24 p.i. beobachtet werden (Abb. 30, A). In den Kontroll- und Placebo-Euterviertel lagen die Gehalte bei 17 ± 3 ng/mL und 23 ± 2 ng/mL. Eine signifikante Korrelation zwischen dem Histamingehalt und dem SCC bestand nicht (r=0,41, Daten nicht gezeigt). Eine Erhöhung des Histamingehaltes nach experimenteller E.-coliInfektion erfolgte 12 h nach dem Zelleinstrom (Abb. 30, B). Interessanterweise stieg der Histamingehalt nicht in den Kontroll-Eutervierteln, in denen eine Zunahme des Zellgehaltes festgestellt werden konnte (Kontrolle 1, Abb. 30, B). 124 A B 60 infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo 100000 10000 * PMN (x10³/mL) Histamin (ng/mL) 80 40 20 0 0 12 Zeit p.i. (h) 24 * 1000 100 10 1 0 0 12 24 Zeit p.i. (h) Abb. 30 Histamingehalte im Milchserum und Gehalte an neutrophilen Granulozyten nach Inokulation mit E.-coli. (A) Histamingehalte der Milchseren vor (0 h) und nach experimenteller Infektion mit E. coli in einem Euterviertel (infiziert) wurden mittels Radioimmunoassay bestimmt. Die Histamin-Konzentration ist 24 h p.i. in der Milch des infizierten Euterviertels signifikant gegenüber allen anderen Werten erhöht (p<0,05). (B) Zellzahlen neutrophiler Granulozyten (PMN) in der Milch infizierter Euterviertel sowie der Kontroll-Euterviertel und der Placebo-Euterviertel. Nach intrazisternaler Applikation von S. aureus stieg der Histamingehalt in den infizierten Eutervierteln von initial 25 ± 6 ng/mL auf 41 ± 15 ng/mL (nicht signifikant) an und lag im Folgenden zwischen 36 ± 11 und 47 ± 18 ng/mL (Abb. 31, A). Die Gehalte der infizierten Euterviertel unterschieden sich nicht von denen der Kontroll-Euterviertel und der PlaceboEuterviertel. Somit bestand keine Beziehung zwischen dem Histamingehalt und dem Anstieg der Zahlen neutrophiler Granulozyten in den infizierten Eutervierteln (Abb. 31, A, B). 125 A Histamin (ng/ml) Histamin (ng/mL) 80 60 infiziert Kontrolle 1 Kontrolle 2 Placebo 40 20 0 0 12 24 36 48 60 72 Zeit p.i. (h) B 10000 PMN (x10³/mL) * * * * 1000 100 10 1 0 12 24 36 48 60 72 Zeit p.i. (h) Abb. 31 Histamingehalte in der Milch und Gehalte an neutrophilen Granulozyten nach Inokulation mit S. aureus. (A) Histamingehalte der Milchseren wurden vor (0 h) und zu verschiedenen Zeiten nach experimenteller Infektion mit S. aureus in einem Euterviertel (infiziert) mittels Radioimmunoassay bestimmt. (B) Gehalte an neutrophilen Granulozyten (PMN) in der Milch infizierter Euterviertel sowie KontrollEutervierteln und einem Placebo-Euterviertel. 126 4.3 Funktionelle Beeinflussung der Überlebenszeit neutrophiler Granulozyten Zunächst wurden Voruntersuchungen zur durchflusszytometrischen Darstellung verschiedener Stadien des Zelltodes über den Nachweis des Mitochondrienmembranpotentials durchgeführt. Danach wurde geprüft, ob Milchinhaltsstoffe Einfluss auf die Apoptose von neutrophilen Granulozyten nehmen. 4.3.1 Etablierung des Apoptosenachweises Im gewählten Verfahren wurden depolarisierte Mitochondrienmembranen nachgewiesen (3.3.8). Um dies auszulösen, wurden PMN von 7 Tieren mit FCCP in Konzentrationen von 0 bis 10 µmol/L (3.3.16.1) inkubiert. In Abb. 32 ist beispielhaft abgebildet, wie sich die Population der PMN nach Stimulation mit verschiedenen Konzentrationen FCCP und Färbung mit JC-1 darstellt. Je nach FCCP-Konzentration ist ein unterschiedlich hoher Anteil der PMN– Mitochondrienmembranen depolarisiert. A JC-1-Floureszenz 10 4 10 10 10 0,29% 0,5 % 2,46% 3% 10 B FCCP 0 µmol/L 3 10 2 10 1 10 96,45% 98 % 10 0 10 4 10 0,78% 13,53% 14 % 10 2 10 1 10 1 2 10 3 10 4 10 10 0 10 31,91% 32 % 1,86% 64,56% 65 % 1,67% 2% 2% 3 2 1 1,63% 2% 84,06% 84 % 0 10 FCCP 10 µmol/L 4 1% 3 0,80% 1% 0 C FCCP 5 µmol/L 0 1 10 2 10 3 10 4 10 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 Propidiumjodid- Floureszenz Abb. 32 Unterschiedliche Grade der Mitochondrien-Depolarisation von neutrophilen Granulozyten. Dargestellt sind Granulozyten in der Rot-Fluoreszenz (Propidiumjodid, FL-3) gegen die GrünFluoreszenz (JC-1, FL-1) nach der Erfassung von 20.000 Ereignissen und nach dem Setzen eines Gates auf vitale Zellen kombiniert mit einem Gate auf Granulozyten. Im oberen linken Quadranten werden die apoptotischen Granulozyten erfasst und als Anteil der Propidiumjodid-negativen (nichtnekrotischen) Zellen quantifiziert. In diesen drei Abbildungen werden die Anteile der Granulozyten nach einem FCCP-Stimulus (15 Min. in vitro) von A) 0µmol/L, B) 1µmol/L und C) 5µmol/L gezeigt. 127 Der Anteil an PMN mit depolarisierten Mitochondrien war abhängig von der eingesetzten JC1-Konzentration. Er stieg bei nicht-stimulierten PMN signifikant von 3 ± 1% (3,5 µmol/L JC1) auf 6 ±1% (7 µmol/L JC-1). Die Beziehung zwischen der eingesetzten JC-1-Konzentration und den Anteilen an Zellen mit depolarisierten Mitochondrien nach FCCP-Stimulation sind in Abb. 33, A dargestellt. Nach Stimulation mit der höchsten eingesetzten FCCP-Konzentration (10 µmol/L) war kein Unterschied zwischen den JC-1-Konzentrationnen zu erkennen, wohl aber nach Stimulation mit den Konzentrationen 1 und 5 µmol/L FCCP. Hier konnten mit 3,5 µmol/L JC-1 signifikant weniger apoptotische Zellen nachgewiesen werden. Ein Unterschied zwischen 7 µmol/L und 10 µmol/L JC-1 bestand nicht. Um zu prüfen, ob unterschiedliche JC-1-Konzentrationen selbst Einfluss auf die Zellvitalität nehmen, wurde der Anteil vitaler PMN bestimmt (Abb. 33, B). Hier zeigte sich, dass unstimulierte Zellen (0 µmol/L FCCP) nicht von JC-1 beeinflusst wurden, dies jedoch mit zunehmender FCCP-Konzentration in signifikanter Weise besonders bei hohen JC-1-Konzentrationen zu Tage trat. Um möglichst sensitiv die Apoptose neutrophiler Granulozyten nach Stimulation in vitro zu erfassen, ohne Nachweis-bedingt den Anteil apoptotische Zellen zu verfälschen, wurden für die nachfolgenden Versuche die Zellen mit 7 µmol/L JC-1 markiert. 128 A apoptotische PMN (%) 100 75 ** 50 25 * * 0 5 1 FCCP (µmol/L) 0 B ** vitale PMN (%) 100 Vitale PMN % * ** * 75 10 * * * 50 25 0 0µM 0 1µM 1 5 5µM 10µM 10 FCCP (µmol/L) 3,5 µmol/L JC-1 7 µmol/L JC-1 10 µmol/L JC-1 Abb. 33 Anteil der PMN mit depolarisiertem Mitochondrienmembranpotential und Anteile vitaler PMN nach Stimulation mit FCCP und Markierung mit dem Fluorochrom JC-1. Bovine PMN (n=7 Tiere) wurden in vitro 15 Min. mit FCCP stimuliert und das MitochondrienPotential mit JC-1 durchflusszytometrisch erfasst (*=p<0,05, **=p< 0,01). 129 4.3.2 Modulierender Einfluss von Zytokinen In diesem Versuchsabschnitt sollte der Einfluss dreier Zytokine auf die Vitalität von neutrophilen Granulozyten untersucht werden. Der Zusatz von Milchserum hatte in der Abwesenheit der Zytokine keinen signifikanten Einfluss auf die Vitalität der Zellen (Abb. 34, Kontrollen). TNF-α: α: Im Kulturmedium führte TNF-α nicht zu einer Reduktion der Zahl vitaler Zellen. In den Ansätzen mit Milchserum wurde die Zahl vitaler PMN durch 30 ng/mL TNF-α signifikant reduziert. IL-1β: β: Niedrige IL-1β Konzentrationen nahmen keinen Einfluss auf die Vitalität der PMN. Der Einsatz von 30 ng/mL IL-1β hingegen bewirkte eine signifikante Reduktion der Zellzahl (p<0,01) sowohl im Kulturmedium als auch in 1:7 verdünntem Milchserum. IFN-γγ: Auch dieses Zytokin zeigte erst in hohen Konzentrationen einen Vitalitäts-mindernden Effekt in den Kulturmedium-Ansätzen und den Ansätzen in 1:70 verdünntem Milchserum. Interessanterweise erwies es sich als deutlich Vitalitäts-mindernder, wenn die Ansätze in 1:7 verdünntem Milchserum durchgeführt wurden. Hier führten bereits 0,8 ng/mL IFN-γ zu einer signifikanten Reduktion der Zahl vitaler PMN. Um zu klären, ob die Reduktion der Zahl vitaler Zellen auf Nekrose und/oder ApoptoseInduktion beruht, wurde der Anteil Mitochondrienmembran depolarisierter PMN in Ansätzen bestimmt, denen neben den Zytokinen Milchserum in der Verdünnung 1:7 zugesetzt war. Es zeigte sich, dass keines der Zytokine den Anteil an PMN mit depolarisierten Mitochondrien zu erhöhen vermochte (Abb. 35, A). Die auffällige Reduktion dieses Anteils durch 30 ng/mL IL-1β und IFN-γ erwies sich als nicht signifikant. Die hohe Konzentration an IFN-γ steigerte jedoch signifikant den Anteil nekrotischer PMN von 4 ± 0,5% in der Mediumkontrolle auf 9 ± 1% (p<0,05) (Abb. 35, B). 130 150 ** 100 100 50 50 50 0 0 0 150 150 150 100 100 50 50 50 0 0 0 100 ** *** L 30 ng /m /m L L 8 0, ng lle ng 1 0, nt ro /m L ng /m Kontr. IFN-g IFN-g IFN-g /m 0 Ko 1 0, 30 ro nt Ko 150 L Kontr. IL-1b IL-1b IL-1b L L ng /m /m 30 ng 3 ro nt * 50 ng 0 100 100 lle 0 L 50 lle 50 Ko * /m 100 150 8 *** 0, 150 ng * 100 * Medium 150 150 vitale PMN (x10³/mL) IFN-γγ MS 1:70 IL-1β β MS 1:7 TNF-α α Abb. 34 Anzahl vitaler PMN nach Inkubation in Medium mit verschiedenen Milchserum-Anteilen und Zusatz von Zytokinen. Vitale PMN (n = 7 Tiere) wurden nach Inkubation in Kulturmedium sowie Medium mit einem Zusatz von Milchserum (1:7) bzw. Milchserum (1:70) nach 24 h in vitro durchflusszytometrisch quantifiziert. Durch die Referenzzellmethode wurde die Anzahl der Kulturzellen ermittelt und mit den Anteilen vitaler Zellen (JC-1-negativ, PJ-negativ) verrechnet. Parallele Ansätze enthielten TNF-α, IL-1β oder IFN-γ in den angegebenen Konzentrationen. Die PMN wurden aus dem Blut von 8 Tieren separiert. Es wurden 2 x105 PMN/well eingesetzt. 131 A TNF-α α 25 IL-1β β IFN-γγ 20 15 10 5 0 K on tr ol le 3 30 ng ng/mL /m 0, L 1 0, ng 8 / 30 ng mL ng /m /m L 0, L 1 0, ng 8 / 30 ng mL ng /m /m L L apoptotische PMN (%) 30 B nekrotische PMN (%) 15 TNF-α α IL-1β β IFN-γγ * 10 5 K on tr ol le 3 n 30 g ng/mL /m 0, L 1 0, ng 8 / 30 ng mL ng/m /m L 0, L 1 0, ng 8 / 30 ng mL ng /m /m L L 0 Abb. 35 Der Einfluss von TNF-α, IL-1β und IFN-γ auf die Apoptose und Nekrose von neutrophilen Granulozyten. PMN (2x105/well) von n = 7 Tieren wurden 24 h in Kulturmedium inkubiert dem Milchserum (1:7) zugesetzt war. A) Die Anteile von apoptotischen PMN mit depolarisiertem MMP sind in den Ansätzen mit 30 ng/mL IL-1β und IFN-γ reduziert (p>0,05). B) Hier ist der Anteil nekrotischer (PJ-positiver Zellen) PMN von der Gesamtheit der Kultur-PMN dargestellt. In den Ansätzen mit einem Zusatz von 30 ng/mL IFN-γ ist der Anteil nekrotischer Zellen signifikant erhöht (* = p<0,05). 132 4.3.3 Modulierender Einfluss von Milchseren und deren Inhaltsstoffen Hier sollte untersucht werden, ob Milchseren verschiedener Infektionsstadien der E.-coliMastitis die Vitalität und die Apoptose von Leukozyten beeinflussen (3.3.16.4). Einfluss von Milchseren nicht-infizierter Tiere auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten Im Kulturmedium stieg der Anteil apoptotischer PMN nach 24 h in vitro deutlich an (Abb. 36, A). In den Ansätzen mit Milchserum nicht (Goldstandard-Milchserum) bzw. noch nicht infizierter Euterviertel (Milchserum vor Infektion) lag der Anteil apoptotischer Zellen schon nach 2h Inkubationszeit höher, um über 12 h und 24 h in vitro signifikant gegenüber der Mediumkontrolle zu steigen (Abb. 36, A). Das Kulturmedium hatte keinen Zeiteinfluss auf den Anteil nekrotischer PMN (Abb. 36, B), während die Milchseren nicht bzw. noch nicht infizierter Euterviertel nach 12 h zu einem signifikanten Anstieg des Anteils nekrotischer PMN führten, der sich nach 24 h in vitro nicht oder nur marginal änderte (Abb. 36, B). A B 30 25 a 20 15 10 5 0 02 12 24 Goldstandard-Milchserum 35 b nekrotische PMN (%) apoptotische PMN (%) 35 Medium 30 25 c d 12 24 20 15 10 5 0 02 Inkubationszeit (h) Inkubationszeit (h) Medium Goldstandard-Milchserum Milchserum vor Infektion Abb. 36 Einfluss von unverdünntem Milchserum auf die Vitalität von neutrophilen Granulozyten im Vergleich zum Medium. Legende siehe folgende Seite. 133 Dargestellt sind die Anteile apoptotischer PMN (A) und nekrotischer PMN (B) zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach Inkubation in drei unterschiedlichen Medien: I10F+-Medium, Milchserum einer Goldstandard-Kuh und Milchserum der M-08 vor Inokulation von E. coli. Die Unterschiede zwischen den Medium-Ansätzen und den Milchserum-Ansätzen stellten sich nach 12 h und 24 h Inkubation signifikant dar. a Der Anteil apoptotischer PMN war signifikant höher (p<0,05). b Nach 24 h Inkubation war der Unterschied der Anteile apoptotischer Zellen zum Mediumansatz in den GoldstandardMilchserum signifikant (p<0,01) und in den Milchserum vor Infektion hochsignifikant (p<0,0001). c und d. Der Anteil nekrotischer Zellen in den Ansätzen mit Goldstandard-Milchserum war schwach signifikant (p<0,05) und in den Ansätzen mit Milchserum vor der Infektion signifikant höher (p<0,01). Die PMN wurden aus dem Blut von 8 Tieren gewonnen. Einfluss von Milchseren verschiedener E.-coli-Infektionsstadien auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten Hierfür wurden Milchseren der Kuh M-08 verwendet, die vor der Inokulation von E. coli (E.c 0 h) und die 12 h und 24 h nach intrazisternaler Applikation des Erregers (E.c 12 h und E.c 24 h) gewonnen wurden (3.3.16.4). Zusammengefasst in Abb. 37 ergab sich folgendes Bild. Der pro-apoptotische Effekt eines Milchserums vor Infektion verlor sich signifikant, wenn die Ansätze mit Milchseren durchgeführt wurden, die 12 h oder 24 h nach der Infektion gewonnen wurden (Abb. 37, A). Ein vergleichbares Bild ergab sich nach Betrachtung der nekrotischen Zellen. Auch hier reduzierte der Einsatz von Milchseren den Anteil signifikant gegenüber Ansätzen mit Milchseren, die vor der Infektion gewonnen wurden (Abb. 37, B). 134 A B 30 25 a 20 15 10 5 0 35 b nekrotische PMN (%) apoptotische PMN (%) 35 02 12 24 Inkubationszeit (h) 30 25 c d 12 12 24 20 15 10 5 0 02 Inkubationszeit (h) Milchserum vor Inokulation (E.c 0 h) Milchserum 12 h nach Inokulation (E.c 12 h) Milchserum 24 h nach Inokulation (E.c 24 h) Abb. 37 Einfluss von Milchseren E.-coli-infizierter Euterviertel auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten. Dargestellt sind die Anteile apoptotischer PMN (A) und nekrotischer PMN(B) zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach Inkubation in 3 verschiedenen unverdünnten Milchseren: Milchserum der M-08 vor Inokulation (E.c 0 h) sowie 12 h (E.c 12 h) und 24 h (E.c 24 h) nach Inokulation von 500 KbE E. coli. a In dem Milchserum E.c 0 h war der Anteil apoptotischer PMN schwach signifikant höher (p<0,05). b Nach 24 h Inkubation war der Unterschied der Anteile apoptotischer Zellen zum Milchserum E.c 0 h in den Milchseren E.c 12 h signifikant (p<0,01) und in den Milchseren E.c 24 h hochsignifikant (p<0,0001) höher. c und d Der Anteil nekrotischer Zellen war in den Ansätzen mit dem Milchserum E.c 12 h signifikant (p<0,01) und in den Ansätzen mit Milchserum E.c 24 h hoch signifikant erhöht (p<0,0001). Die PMN wurden aus dem Blut von 8 Tieren gewonnen. Die oben dargestellten Analysen wurden mit in vitro Kulturen reiner PMN durchgeführt. Um zu prüfen, ob mononukleäre Zellen auf die Absterbe-/Apoptoserate einen Einfluss nehmen, wurden identische Ansätze mit PMN/MNC-Mischkulturen durchgeführt. Dabei wurden vergleichbare Ergebnisse ermittelt (Daten nicht dargestellt). Daraus wurde geschlossen, dass der gezeigte Einfluss der Milchseren auf die PMN direkt und nicht indirekt über die Aktivierung/Modulation anderer leukozytärer Zellpopulationen erfolgt. 135 Einfluss des pH-Wertes Da die geprüften Milchseren einen unterschiedlichen pH-Wert aufwiesen, wurde das Kulturmedium auf entsprechende pH-Werte eingestellt, um den Einfluss des pH-Wertes beurteilen zu können. In der Tat stieg pH-Wert-abhängig der Anteil apoptotischer Zellen mit depolarisierten Mitochondrienmembranen signifikant an. Nach 24 h in vitro unterschieden sich alle Medien signifikant voneinander (Abb. 38). apoptotische PMN (%) 30 pH 6,5 pH 7 pH 7,5 20 ** ** * 10 0 * 02 12 24 Inkubationszeit (h) Abb. 38 Einfluss des pH-Wertes auf die Vitalität der PMN. Dargestellt ist der Anteil apoptotischer Zellen nach Inkubation in Kulturmedium mit verschiedenem pH für unterschiedliche Zeiten in vitro. Die PMN wurden aus dem Blut von 8 Tieren gewonnen. (*=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,0001) Überprüfung der Milchseren aus Infektionsversuchen mit E. coli und S. aureus Für das Milchserum des Tieres M-08 wurde ein protektiver Effekt auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten festgestellt. Im Folgenden wurde geprüft, ob dies ebenfalls für die Milchseren der anderen E.-coli-infizierten Tiere und diejenigen der S. aureus-infizierten Tiere zutraf. Alle Milchseren, die vor (0 h) und 24 h p.i. gewonnen wurden, kamen in einer Endverdünnung von 1:2 in vitro zum Einsatz und wurden mit den PMN zweier gesunder Tiere inkubiert. Der Einfluss der 0 h-Kontroll-Milchseren der Kühe aus den E.-coli- und aus den S.-aureusInfektionsversuchen auf die Zellvitalität war unterschiedlich stark. Während nach der Inkubation mit E.-coli–0 h-Milchserum 100 ± 5 x10³ vitale Zellen erfasst werden konnten, lag die Zahl vitaler PMN nach der Inkubation mit S.-aureus–0 h-Milchseren mit 85 ± 7 x10³ vitalen Zellen deutlich, aber nicht signifikant niedriger (Abb. 39). 136 A E. coli vitale PMN (x10³/mL) 125 125 * 100 S. aureus 100 75 75 50 50 25 25 B 30 30 20 20 10 10 (K 0h 24 h 0h on tr 24 ol le h ) (K on tr ol 24 le h ) (in fiz ie rt ) 40 on tr ol le ) (K on tr ol 24 le ) h (in fiz ie rt ) 40 (K apoptotische PMN (%) * Abb. 39 Der Einfluss der Milchseren aus den Infektionsversuchen auf die Vitalität der neutrophilen Granulozyten. A) Anzahl vitaler neutrophiler Granulozyten (Mittelwerte ± SEM) nach Inkubation in verschieden Milchseren (1:2 im Kulturmedium). B) Anteile apoptotischer PMN (Mittelwerte ± SEM). Je Ansatz wurden n=5 Milchseren aus den Infektionsversuchen mit E. coli und S. aureus mit PMN aus dem Blut von 2 Tieren geprüft, deren Werte gemittelt wurden. Milchseren der Kontroll-Euterviertel 24 h p.i. zeigten weder nach E.-coli- noch nach S.-aureus-Infektion signifikante Unterschiede zu den jeweiligen 0 h-Milchseren (Abb. 39, A). Die nach der Infektion gewonnenen Milchseren aus den E.-coli-infizierten Eutervierteln bewirkten eine signifikante Reduktion der vitalen PMN auf 61 ± 11 x10³ PMN (p<0,05) während die nach Infektion gewonnenen Milchseren aus den S.-aureus-infizierten Eutervierteln 137 keinen Vitalitäts-mindernden Effekt für die PMN aufwiesen (Abb. 39, A). Im Gegensatz zu den vitalen Zellen, führten die 0 h-Milchseren der S.-aureus-infizierten Tiere zu signifikant höheren Anteilen apoptotischer PMN als die 0 h-Milchseren der E.-coli-infizierten Tiere (Abb. 39, B). Auf die Anteile der apoptotischen Zellen in vitro hatte das Stadium der Infektion keinen signifikanten Einfluss (Abb. 39, B). 4.3.4 Regulation der Zellvitalität durch Histamin in vitro In Sekreten von gesunden Milchdrüsen war ein Gehalt von 20-25 ng/mL Histamin messbar (4.1.3.1 und 4.2.5). Individuell konnten in mit E.-coli-infizierten Eutervierteln Histamingehalte von bis zu 115 ng/mL und in S.-aureus-infizierten Eutervierteln bis zu 130 ng/mL erreicht werden (Einzeldaten nicht gezeigt). Im Folgenden galt es zu prüfen, ob Histamin einen Einfluss auf die Vitalität von neutrophilen Granulozyten nimmt. Histamin, welches bis zu 100 ng/mL dem Kulturmedium zugesetzt wurde, beeinflusste nicht die Zahl vitaler PMN in vitro (Abb. 40, A). In Vorversuchen konnte zudem gezeigt werden, dass Histamin selbst bei einer Konzentration von 1800 ng/mL im Zellkulturmedium keinen Einfluss auf die Zellvitalität nahm (Daten nicht gezeigt). Auch nach Zugabe von Histamin zu Zellen, die in Milchserum einer gesunden Kuh kultiviert wurden, zeigte der Mediator keinen signifikanten, Vitalitäts-mindernden Effekt (Abb. 40, B). Die Stimulation der Zellkulturen mit LPS in Abwesenheit von Histamin führte zu einer signifikanten Reduktion (p<0,05) der Zahl vitaler Zellen im Kulturmedium von 92 ± 5 x10³ auf 71 ± 9 x10³ und in den Ansätzen mit Milchserum von 71 ± 8 x10³ auf 44 ± 5 x10³ (Abb. 40, vergleiche A, C und B, D). Während im Kulturmedium das Histamin keinen Einfluss auf diesen LPS-Effekt nahm (Abb. 40, C), führten alle geprüften Histamin-Konzentrationen zu einer Steigerung der Zahl vitaler Zellen in den LPS-stimulierten Milchserum-Ansätzen und damit zu einer Hemmung des LPS-Effektes (Abb. 40, D). 138 A Medium B Milchserum 150 100 100 PMN x10 PMN (x10³/mL) 150 ohne LPS 50 50 0 0 0 10 50 100 C 0 10 50 100 D PMN (x10³/mL) 150 150 100 ** *** *** * 100 mit LPS 50 50 0 0 0 10 50 100 Histamin (ng/mL) 0 10 50 100 Histamin (ng/mL) Abb. 40 Der Einfluss von Histamin auf neutrophile Granulozyten in Abhängigkeit von dem Kulturmedium und einer LPS-Stimulation. Boxplots der Zahl vitaler neutrophiler Granulozyten (n=8 Tiere) nach In-vitro-Inkubation in Kulturmedium (A, C) oder in Milchserum (B, D) und Zusatz verschiedener Histamin-Konzentrationen. Die Ansätze erfolgten ohne (A, B) oder mit Zusatz von 1 µg/mL LPS. Histamin steigerte also die Überlebensrate der neutrophilen Granulozyten im Milchserum nach LPS-Stimulation. Allerdings konnte keine Modulation des Anteils der Zellen mit depolarisierten Mitochondrienmembranpotential beobachtet werden (nicht dargestellt), da der Anteil apoptotischer Zellen unverändert blieb. Betrachtete man die Anzahl apoptotischer Zellen, waren die Reduktionen der 10 und 50 ng/mL Histamin-Proben zur Kontrolle signifikant (p<0,05). 139 4.3.5 Die Rolle der Milchdrüsenepithelzelle In dieser Untersuchung sollte geklärt werden, ob Milchdrüsenepithelzellen (MEC) nach Erreger-Kontakt Faktoren sezernieren, die die Vitalität der neutrophilen Granulozyten modulieren. Hierfür wurden in einem In-vitro-Modell primäre bovine MEC (pbMEC)-Zellkulturen mit hitzegetöteten E.-coli-Bakterien (Stamm 1303), hitzegetöteten S.-aureus-Bakterien (Stamm 1027), LPS vom E.-coli-Stamm 1303 und LTA vom S.-aureus-Stamm 1027 für 6 h und 18 h inkubiert (3.3.17.1). Zur Kontrolle des Stimulationserfolges der pbMEC wurde die RNA-Expression von TNF-α, TGF-β, CXCL 8 und LAP in der qRT-PCR gemessen. Aus der Bestimmung von Triplikaten jedes Ansatzes wurden die Werte als vielfache Induktion in der Kontrolle erfasst (Abb. 41). TNF-α−mRNA wurde nach Stimulation mit E. coli oder LPS zwischen 27-fach und 47-fach stärker exprimiert. S. aureus und LTA induzierten eine 5- bis 6-fache Steigerung der KopienAnzahl. CXCL8-mRNA wurde durch E.-coli- und LPS-Stimulation 12-20-fach gesteigert, während hitzegetötete S.-aureus-Bakterien und das LTA eine vergleichsweise geringe Steigerung der Kopienzahl um das 2,5 bis 3-fache bewirkten. Auch die Kopienzahl der mRNA für LAP blieb nach der Stimulation mit S. aureus und LTA relativ unverändert im Vergleich zur 50-113-fachen Induktion nach Stimulation mit E. coli oder LPS. Die TGF-β−mRNAExpression wurde durch E.-coli-Bakterien und LPS maximal um das 2-fache erhöht. Die Überstände der pbMEC-Zellkulturen wurden im ELISA auf IL-1β- und IFN-γ-Gehalte und im RIA auf Histamin untersucht. Alle Werte lagen jedoch unterhalb der Nachweisgrenze (Daten nicht gezeigt). 140 40 2 20 1 0 0 30 CXCL8 TGF-β β 3 LAP 150 100 10 50 0 0 E. co li 20 13 0 S. LPS 3 au 1 re 30 us 3 10 27 LT A 10 27 TNF-α α E. co li 1 LP 303 S. S 13 au 0 re us 3 10 LT 27 A 10 27 mRNA-Kopienzahl / 75 ng RNA 60 6 h Stimulation 18 h Stimulation Abb. 41 Induktion von immunrelevanten Genen (mRNA) in primären bovinen Milchdrüsenepithelzellen nach differentieller Stimulation. Die pbMEC wurden mit hitzegetöteten E. coli und LPS vom Stamm 1303 sowie hitzegetöteten S. aureus und LTA vom Stamm 1027 für 6 oder 18 Stunden in vitro stimuliert und die mRNAKopienzahl der dargestellten Gene in der qRT-PCR vermessen. Die Kopienzahlen unstimulierter Kontrollansätze dienten als Basis. Dargestellt ist jeweils das Vielfache der Kopienzahl nach Stimulation (Mittelwerte ± Standardabweichung von Triplikaten). Um zu prüfen ob die Zellkulturüberstände stimulierter pbMEC Zelltod-modulierende Einflüsse auf PMN aufweisen wurden separierte PMN mit diesen in vitro für 24 h inkubiert. Auf die Zahl vitaler PMN nahm keiner der pbMEC-Überstände signifikant Einfluss (Abb. 42, A, B). Trotz hoher individueller Varianzen der apoptotischen Zellen in den Kontrollansätzen (Abb. 42, C, D) erwiesen sich die Überstände E.-coli- oder LPS-stimulierter pbMEC als signifikant Apoptose-hemmend (Abb. 42, C, D). Dies galt ebenso für die Überstände nach LTA- 141 Stimulation, nicht jedoch für diejenigen nach Stimulation mit hitzegetöteten S.-aureusBakterien. vitale PMN (x10³/mL) A B 200 200 150 150 100 100 50 50 Kontrolle E.c6h E.c18h LPS6h LPS18h D 30 30 20 20 10 * * * 0 K * * 10 0 K S. on a tro S. ure lle au us re 6h us 1 LT 8h LT A 6 A h 18 h * on t E. roll c e E. oli co 6h li 1 LP 8h S LP 6h S 18 h apoptotische PMN (%) C Kontrolle S.a6h S.a18h LTA6h LTA18h Abb. 42 Vitale und apoptotische neutrophile Granulozyten nach Kultivierung in Überständen stimulierter pbMEC. Nach der Stimulation der pbMEC mit hitzegetöteten E. coli oder LPS vom Stamm 1303 (A,C) sowie hitzegetöteten S. aureus oder LTA vom Stamm 1027 (B, D) für 6 und 18 Stunden wurden zellfreie Überstände gewonnen und mit PMN-Reinkulturen für 24 h in vitro inkubiert. Die Zahl vitaler Zellen wurde mittels Referenzzellmethode quantifiziert (A, B). Der Anteil apoptotischer Zellen (B, C) wurde mittels JC-1-Färbung bestimmt. Für die PMN-Kulturen wurde Zellen von 8 Tieren separiert. 142 5 Diskussion Die Mastitis gilt als eine der bedeutendsten Einzeltiererkrankung in der Milchviehwirtschaft. Staphylococcus aureus und Escherichia coli sind die häufigsten Erreger der gram-positiven bzw. gram-negativen Bakterien, die klinische Mastitiden verursachen. Um sehr frühe Erkennungs- und Immunmechanismen charakterisieren zu können, die bei der Infektion der Milchdrüse entscheidend für den weiteren Infektionsverlauf sind, wurde ein experimentelles Invivo-Infektionsmodell etabliert. Begleitend wurden im Rahmen von In-vitro-Studien frühe Erreger-Wirts-Interaktionen auf ihre Bedeutung für die Regulation der Vitalität von neutrophilen Granulozyten untersucht. 5.1 Das Tiermodell Modellhafte Untersuchungen zu pathogenetischen Fragestellungen sowie Erfolgsaussichten prophylaktischer und therapeutischer Ansätze bei Mastitis werden schon seit mehreren Jahrzehnten durchgeführt. Bei spontan erkrankten Patienten sind die Ausgangsbedingungen nur schwer kontrollierbar und interpretierbar. In Infektionsmodellen können diese bewusst vorgegeben werden. Entscheidend für die Güte des Tiermodells sind strenge Modellgrenzen. Bei der Analyse bisheriger Mastitismodelle fällt auf, dass die Voruntersuchungen und Auswahl der Tiere auf sehr unterschiedlichem Niveau stattfanden. In wenigen Fällen wurden die Versuchstiere streng nach Laktationszeitpunkt, Anzahl bisheriger Laktationen, niedriger Zellzahl und wiederholt bakteriologisch negativen Befunden ausgewählt (SCHUKKEN et al. 1999). Ziel dieses Tiermodells war es, ausschließlich allgemein- und eutergesunde Tiere gleichen Alters und Laktationsstadiums einzusetzen, die darüber hinaus auch im Zyklusstand vergleichbar waren. Der SCC ist ein wichtiger Parameter für die Eutergesundheit (PYÖRÄLÄ 2003). Ab einer Zellzahl von >50.000 Zellen/mL konnte eine Verschiebung des Zellbildes zu Gunsten der PMN-Population festgestellt werden. In dem Mastitis-Modell von PETZL (2005) wurden Probanden eingesetzt, die einen initialen Zellgehalt von 100.000 Zellen/mL nicht überschritten. Dennoch reagierten die Probanden individuell sehr unterschiedlich auf die Inokulation von Mastitiserregern. Folglich wurde im hier vorliegenden Mastitis-Modell ein maximaler Zellgehalt von 50.000 Zellen/mL auf Viertelgemelksebene vorausgesetzt. Da mit zunehmender Anzahl an Laktationen auch die Zellzahl im Mittel durch eine Zunahme der PMN steigt und mit fortschreitendem Laktationsstadium die Zellzahl aller Zellarten zunimmt, wurden die Probanden für das Tiermodell auch bezüglich dieser Parameter ausgewählt (DOGGWEILER u. HESS 1983; BURVENICH et al. 1994). Auch in dieser Arbeit wurden ausschließlich Kühe in der Mitte der ersten Laktation (3-5 Monate post partum) ausgewählt. 143 Außerdem wird vermutet, dass die Aktivität residenter Milchdrüsenepithelzellen oder Makrophagen möglicherweise über physiologische Faktoren (z.B. Hormone) gesteuert wird (SURIYASATHAPORN et al. 2000b). Da diese Zelltypen beide prinzipiell in der Lage sind immunologische Reaktionen zu modulieren, wurden die Probanden Zyklus-synchronisiert. Als weiteres wichtiges Kriterium für die Selektion der Probanden galt, dass vorgeschichtlich keine Mastitis vorlag. Durch exogene Stressfaktoren könnte hierdurch ein Anstieg der Zellzahlen bewirkt werden (WEGNER et al. 1976) und somit eine Vergleichbarkeit der Probanden gefährdet werden. Außerdem sollte vermieden werden, dass in der Milchdrüse zum Zeitpunkt der Infektion erregerspezifische Antikörper vorhanden sind, die ebenfalls über Immunkomplex-vermittelte Prozesse den Verlauf der experimentell gesetzten Infektion beeinflussen können. Der SCC-Wert gilt als wichtiger Parameter für die Eutergesundheit. Bei den Golstandardardtieren blieb dieser Wert mit einer Ausnahme unter dem geforderten 50.000 SCC/mL. Obwohl zum Zeitpunkt 12 h dieser Wert lediglich um 1.000 Zellen überschritten wurde, konnte im Mittel aller Einzelviertel eine Erhöhung der Zellzahl beobachtet werden. Diese konnte auf das Einzeltier M-31 zurückgeführt werden, deren SCC-Wert auf einen dreifach höheren Wert (siehe Abb. 13) stieg. Bei der Vorauswahl in den Betrieben und nach der Einstellung in die Klinik entsprach dieses Tier den Vorgaben der Modellgrenzen. Das Einzeltier M-14 konnte als Beispiel für ein stark unterschiedliches Zellzahlniveau zwischen den einzelnen Eutervierteln angeführt werden. Hier war der Zellgehalt zwar über die Zeit konstant, aber in einem Euterviertel lag dieser 3-fach höher als in den Vergleichs-Eutervierteln desselben Tieres. Vermutlich lag bei beiden Individuen ein exogener Stressfaktor vor, der zu einer Erhöhung des SCC führte. Laut WEGNER et al. (1976) lösen exogene Stressfaktoren in gesunden Eutervierteln keinen Zellanstieg aus, während in bereits vorgeschädigten Eutervierteln deutliche zytologische Reaktionen beobachtet werden können. Diese Erkenntnis lässt vermuten, dass vorgeschichtlich ein unerkanntes Mastitisgeschehen vorgelegen haben könnte. Der Anteil neutrophiler Granulozyten an den durchflusszytometrisch identifizierbaren MilchLeukozyten lag bei durchschnittlich 45%. Er bewegte sich damit, trotz niedriger SCC-Werte etwas über den in der Literatur angegebenen Werten von 0-37% für die gesunde Milchdrüse (PAAPE et al. 1981; CONCHA 1986; WEVER u. EMANUELSON 1989; LEITNER et al. 2000b). Hier ist zu bedenken, dass die sehr unterschiedlichen Nachweisverfahren für Zellen in der Milch diese Diskrepanzen verursachen können (Köß 2004). Die Lymphozytenpopulation in der Milch setzte sich überwiegend aus den drei Haupt-T-Zellsubpopulationen zusammen. CD4+-T-Zellen, CD8+-T-Zellen und γδ-T-Zellen machten zusammen im Mittel 96% der Lymphozyten aus. Den Goldstandardtieren fehlten demnach 144 B-Zellen in der Milch und dies mit einiger relativer Konstanz. TAYLOR et al. (1997) hingegen ermittelten einen Anteil von 67% T-Zellen unter den lymphoiden Zellen. Obgleich die Zusammensetzung der lymphoiden Zellen bei den Goldstandardtieren untypisch erscheint, kann dies jedoch als Maß für die Vergleichbarkeit unter den Probanden angesehen werden. Unter den lymphoiden Zellen dominierten die CD8+-Zellen, was sich in einem relativ niedrigen CD4+/CD8+-Verhältnis von etwa 0,35 ausdrückte (Abb. 16, A). Dies deckt sich mit publizierten Verhältnissen von unter 0,5 in der Milch gesunder Kühe (SHAFER-WEAVER et al. 1996). Interessanterweise blieb dieses Verhältnis – bei durchaus unterschiedlichen absoluten Zellzahlen/mL Milch - über den Beobachtungszeitraum relativ konstant und kann ebenfalls als Qualitätskriterium des hier vorgestellten Tiermodells gelten. In Phasen mit einem verringerten CD4+/CD8+-Verhältnis in der Milch scheinen Kühe ein höheres Mastitis-Risiko zu haben (PARK et al. 1992; TAYLOR et al. 1997). Die hier charakterisierten Goldstandardtiere zeigten bezüglich der klinischen Parameter wie Körpertemperatur, Euterpalpation und Sekretbeschaffenheit im Verlauf eine hohe Konstanz innerhalb physiologischer Grenzen (4.1.1). Auch die Milchleistung war über den Beobachtungszeitraum konstant (Abb. 11). Dennoch konnte festgestellt werden, dass die individuellen Unterschiede sowohl der absoluten PMN-Zahl als auch der Makrophagen und CD8+-T-Zellen trotz eng gesetzter Modellgrenzen relativ hoch waren (Abb. 14). Die Variabilität zwischen Goldstandardtieren und deren Eutervierteln wurde besonders deutlich als die Expression ausgewählter Kanditatengene analysiert wurde. Die Expression zeigte eine z.T. erhebliche Varianz (Tab. 14) und demonstriert, dass einzelne Euterviertel oder gar Tiere sehr schwer auf ein gemeinsames Ausgangsniveau (Genexpression, Zellzahl, Zellzusammensetzung) zu bringen sind. Eventuell sollten zukünftig noch engere Grenzen gezogen werden. So könnte die Zellzahl der Milch auf 20.000 Zellen/mL reduziert werden und, wie von HAMANN und KRÖMKER (1997) vorgeschlagen, die Zusammensetzung der somatischen Zellen in der Milch zur Standardisierung einbezogen werden, um die individuelle Variabilität noch weiter zu reduzieren. Die Verfeinerung des Tiermodells bezüglich dieser Kriterien würde allerdings einen erheblich höheren Arbeitsaufwand bei der Auswahl der Tiere bedeuten und die Auswahl möglicher Probanden stark reduzieren. Angaben über Infektions- und Versuchsdauer differieren in der Literatur von 96 Stunden (KORNALIJNSLIJPER et al. 2003) bis zu 21 Tagen (LOHUIS et al. 1990) für E. coli und 72 Stunden bis 48 Tage für S. aureus (SHOSHANI et al. 2000; MIDDLETON et al. 2004). In dem hier verwendeten Tiermodell sollte die frühe Phase analysiert werden. Obgleich dies ein sehr unscharfer Begriff ist, wurde die Zeitspanne bis 24 h nach Inokulation als frühe Phase 145 definiert. Allerdings wurde in den Infektionsversuchen von PETZL (2005) deutlich, dass nach Inokulation mit S. aureus nach 24 h p.i. z.T. noch keine klinischen Änderungen oder Änderungen der Milchzellzahl zu erfassen waren. Daher wurden die Tiere in dem vorliegenden Tiermodell 72 h beobachtet. 5.1.1 Zelluläre Reaktionen nach Inokulation von E. coli Die durch E. coli hervorgerufenen Mastitiden wiesen meist einen perakuten Verlauf mit deutlich ausgeprägten klinischen Symptomen auf (BURVENICH et al. 2003). Im vorliegenden Tiermodell konnte bei allen Probanden eine erfolgreiche Infektion anhand der klinischen Befunde bestätigt werden (4.2.1). Die infizierten Euterviertel zeigten einen vom 0 h-Wert stark abweichenden Palpationsbefund mit starker Schwellung. Auch das Milchsekret war sowohl in den infizierten als auch in den Kontroll- und Placebo-Eutervierteln stark verändert. Im Milchsekret der infizierten Euterviertel war bei allen Probanden eine hochgradige Flockenbildung zu beobachten und bei einem Tier sogar der Verlust des Milchcharakters (Tab. 13). Die Probanden reagierten einheitlich mit einer deutlichen Erhöhung der Körpertemperatur 12 h nach Inokulation des Erregers, die sich allerdings lediglich in einer geringgradigen Störung des Allgemeinbefindens (Daten nicht gezeigt) äußerte. Dies kann dadurch begründet werden, dass sich die Tiere in der Mitte ihrer ersten Laktation befanden. BURVENICH et al. (2003) beschrieben, dass die klinische Ausprägung mit fortgeschrittenem Laktationsstadium abnimmt und schwerwiegende Erkrankungen oft in der postpartalen Phase auftreten. Obwohl die klinischen Parameter der mit E. coli inokulierten Kühe bezüglich der Milchleistung, der Eutersekret- und Palpationsbefunde sehr vergleichbar waren, konnten auf Ebene der somatischen Zellen der Milch deutliche individuelle Unterschiede beobachtet werden (Abb. 20, B). Zwei von fünf Probanden, das Tier M-08 und M-11, reagierten nur mit einem moderaten Anstieg des SCC. Bei den drei anderen Tieren stieg der SCC bereits 12 h nach Inokulation signifikant auf das Siebenfache im Vergleich zu M-08 und M-11 an. Dies ist besonders bemerkenswert, da die Tiere M-08 und M-11 initial einen sehr geringen Zellgehalt aufwiesen. Dies scheint im Gegensatz zu der Beobachtung von SURIYASATHAPORN et al. (2000b) zu stehen, die beschrieben, dass durch einen geringen individuellen SCC das Risiko, an klinischen Mastitiden zu erkranken, erhöht ist. Jedenfalls konnte in dieser Arbeit kein augenfälliger Zusammenhang zwischen der initial vorhandenen Zahl an PMN in der Milch und der Stärke des zellulären Einstroms nach E.-coli-Inokulation hergestellt werden. Hier spielen wahrscheinlich Faktoren eine Rolle, die vor der Inokulation nicht oder nur unzureichend er- 146 fasst werden können (u. A. die Reaktionsfähigkeit residenter Sensorzellen wie Mastzellen, Makrophagen und Epithelzellen). Obwohl die Höhe des zellulären Einstroms sehr variabel war, konnte an der Zusammensetzung der Leukozyten in der Milch ein sehr einheitliches Reaktionsmuster festgestellt werden. Der Anteil der PMN unter den Leukozyten der Milch erhöhte sich invariant von ca. 40% auf über 90% 12 h p.i. (Abb. 22, B). Damit konnte die Aussage von LEITNER et al. (2000a) und RIOLET et al. (2000a) bestätigt werden, dass in der akuten Infektionsphase der Anteil neutrophiler Granulozyten auf über 86% bzw. 96% steigt. Die Einheitlichkeit dieses Parameters belegt zudem (wie auch die klinischen Daten, 4.2.1), dass sich die Zellen der Milchdrüse des inokulierten Tieren mit dem Pathogen auseinandergesetzt und Signale generiert haben, die zu einem koordinierten Einstrom hauptsächlich neutrophiler Granulozyten führten. 5.1.2 Zelluläre Reaktionen nach Inokulation von S. aureus Die mit S. aureus inokulierten Tiere reagierten insofern einheitlich, als sie nur geringfügige Anzeichen einer Euterentzündung aufwiesen. Ebenso wie bei den E.-coli-inokulierten Tieren sank die Milchleistung auf allen Eutervierteln. Die deutlich geringere klinische Ausprägung einer Infektion spiegelte sich in einem im Mittel deutlich geringeren Zelleinstrom bei hoher individueller Variabilität wider (Abb. 21, A, B). Damit konnte eine Zelleinstromkinetik, wie ihn BANNERMAN et al. (2004) nach S.-aureus-Infektion zeigten, nicht bestätigt werden: die Autoren beschrieben einen Peak des Einstroms etwa 40 h p.i. und schlossen daraus, dass nach S.-aureus-Infektion der Zelleinstrom generell später als nach E. coli-Infektion erfolgt. Die unterschiedlichen Reaktionen auf die Inokulation mit S. aureus, die sich im Vergleich mit dem Mastitis-Modell von BANNERMAN et al. (2004) ergaben, könnten zum einen darauf zurückzuführen sein, dass ein anderer Bakterien-Stamm eingesetzt wurde. Zum anderen wurden in der Studie von BANNERMAN et al. (2004) Probanden mit erheblich unterschiedlichen Auswahlkriterien z.B. bezüglich des SCC (<500.000 Zellen/mL) eingesetzt. Interessanterweise deckten sich die Veränderungen der Leukozytenzusammensetzung nach S.-aureus-Inokulation mit denen nach E.-coli-Inokulation. Auch hier konnte invariant 12 h p.i. ein signifikanter Anstieg des relativen PMN-Anteils festgestellt werden (von ca. 30% auf 77%, Abb. 22, D), der zudem über die 72 h-Beobachtungsdauer konstant und hoch-signifikant erhöht blieb. Solche signifikanten Veränderungen konnten für T-Zellsubpopulationen nicht beobachtet werden. Der zwar augenscheinliche Anstieg an CD4+-, CD8+-und γδ+ T-Zellen in der Milch nach S.-aureus-Inokulation (Abb. 26, A-C) belegt, dass nach Kontakt mit dem Erreger diese Zellen in die Milch migrieren können; allerdings waren die Unterschiede zu den Kontroll- 147 Eutervierteln nicht signifikant. Interessant war das beobachtete stetige Ansteigen des CD4+/CD8+-Verhältnisses in der Milch, sowohl der Kontroll- wie auch der inokulierten Viertel (Abb. 26, D), welches 72 h p.i. in den inokulierten Eutervierteln deutlich zunahm auf (CD4+/CD8+-Verhältnis = 0,84), während es in den Kontroll-Eutervierteln 72 h p.i. deutlich abnahm (ähnlich wie bei den Goldstandardtieren). Dies könnte in der Summe bedeuten, dass S.-aureus-abhängig, Signale zum differentiellen Einstrom von CD4+-T-Zellen generiert werden z.B. ein selektives Chemokinmuster. In anderen Modellen wurde ein weit stärkeres Einströmen von CD4+-T-Zellen in die Milch beobachtet. In der akuten Phase wurden von GRONLUND et al. (2006) ein CD4+/CD8+-Verhältnis von 2,7 und in der chronischen Phase ein Verhältnis von 1,8 beschrieben. Inwieweit dies auf eine erhöhte Durchlässigkeit der Blut-Euterschranke oder auf eine selektive Induktion von CD4+T-Zell-attraktiven Chemokinen im Gewebe zurückzuführen ist, muss dahingestellt bleiben. Ein Bruch der Blut-Euterschranke im vorliegenden Modell erscheint unwahrscheinlich, da sich dann die CD4+/CD8+-Verhältnisse weit stärker als beobachtet hätten ändern müssen. Eine weitere interessante Korrelation wurde zwischen dem Gehalt an γδ-T-Zellen und den somatischen Zellen in der Milch nach Infektion beobachtet. Bei der Analyse der somatischen Zellzahlen nach S.-aureus-Inokulation fiel auf, dass drei Tiere (M-20, M-23 und M-30) mit einem starken Zellinflux reagierten. Diese Tiere wiesen vor der Inokulation des Erregers eine geringe Anzahl γδ-T-Zellen in der Milch auf, die mindestens 50% unter der Anzahl der Probanden M-28 und M-29 lag, deren Anstieg der somatischen Zellzahlen moderat verlief. Ob tatsächlich eine höhere Anzahl dieser Zellen in der Milch vor Inokulation einen milderen Infektionsverlauf begünstigt, ist aufgrund der geringen Stichprobengröße nicht abschließend zu klären. Immerhin deckt es sich mit der Beobachtung, dass in Phasen erhöhter Mastitisempfänglichkeit der Anteil der γδ-T-Zellen im mammären Parenchym (und damit wahrscheinlich auch in der Milch) signifikant reduziert war (SHAFER-WEAVER et al. 1996). Insgesamt könnten die Befunde einen wichtigen Hinweis darauf geben, dass diese Zellen tatsächlich eine bisher hypothetische Sensorfunktion für Erregermuster und damit eine wichtige Rolle in der mammären Infektionsabwehr innehaben. Dies sollte in weiteren Studien näher analysiert werden. 5.1.3 Lösliche Faktoren in der Milch Zytokin Für TNF- α wurden in den Milchseren infizierter Euterviertel Gehalte von 0,7 bis 32 ng/mL gemessen (4.2.4). Dies entsprach einem TNF-α-Konzentrationsbereich, wie sie von 148 BANNERMAN et al. (2004) für die Milch infizierter Euterviertel angegeben wurden. Die TNF- α Gehalte verliefen allerdings individuell äußerst unterschiedlich (Abb. 29), wodurch eine verallgemeinernde Interpretation sehr schwierig ist. Für IL-1β und IFN-γ fielen die Ergebnisse ebenfalls individuell sehr unterschiedlich aus (4.2.4). Bei allen Tieren wurde in den 24 h Milchseren aus den E.-coli-Infektionsversuchen ein erhöhter Gehalt für IL-1β aber nur vereinzelt erhöhte Werte für IFN-γ gemessen. In den Milchseren aus den S.-aureusInfektionsversuchen konnten kein erhöhter IFN-γ- und nur in einzelnen Milchseren ein leicht erhöhter Il-1β-Gehalt festgestellt werden. Es konnte nicht gezeigt werden, das Milchseren mit hohen IFN-γ-Gehalten auch erhöhte IL-1β-Gehalte aufwiesen. Dass der quantitative Nachweis von TNF-α zwar im Radioimmunoassay, nicht jedoch im ELISA möglich war (Abb. 28) könnte darauf beruhen, dass in der Milch lösliche TNF-α Rezeptoren vorlagen (JABLONSKA 1997), die mit den im ELISA eingesetzten TNF-α– Antikörpern konkurrierten. Dafür sprechen bspw. die auf unterschiedlichen Niveaus verlaufenden Titrationskurven mit rekombinanten TNF-α in verschieden verdünnten Milchseren. Da löslichen TNF-α-Rezeptoren eine erhebliche Bedeutung in der Regulation entzündlicher Prozesse zukommt, sollten sie in der Milch in Zukunft näher analysiert werden. Histamin Der E.-coli-Infektionsversuch zeigte deutlich, dass der Histamingehalt in der Milch Erregeranhängig signifikant ansteigt (Abb. 30). Der Anstieg auf 47 ± 9 ng/mL Milch machte nahezu das Doppelte des Ausgangswertes aus und erreichte nicht den Gehalt von 312 ng/mL, der nach einer klinischen Klebsiellen-Infektion beobachtet wurde (ZIA et al. (1987). Allerdings lagen in der zitierten Arbeit die Histaminkonzentrationen für die Kontroll-Euterviertel ebenfalls höher (72 ng/mL). Bemerkenswert ist der signifikante Anstieg erst 24 h p.i. (Abb. 30), während Zellzahlveränderungen nach Inokulation mit E. coli bereits nach 12 h zu beobachten waren. Es konnte somit kein ursächlicher Zusammenhang zwischen einer Histaminfreisetzung und dem Einstrom von Leukozyten hergestellt werden. Gleiches galt für die Infektionsversuche mit S. aureus. Der schwache und nicht-signifikante Anstieg des Histamingehaltes in der Milch war nicht vor dem Einstrom von Zellen zu beobachten (Abb. 31). Die Quelle in der Milch nachgewiesenen Histamins konnte in unseren Untersuchungen nicht eindeutig nachgewiesen werden. KIERSKA et al. (1997) geben als hauptsächliche Quelle des Histamins in der Milchdrüse Mastzellen und Milchdrüsenepithelzellen an. Die Milchdrüsenepithelzellen, die im Rahmen des In-vitro-Versuches mit Erregern und Erregermustern stimuliert wurden, produzierten kein Histamin (die Werte lagen alle unterhalb der Nachweisgrenzen, vgl. 5.2.5). Wenn Mastzellen 149 die hauptsächliche Quelle des Histamins sind, kann aus den Daten gefolgert werden, dass ihre Aktivierung – mit Degranulation und Histaminfreisetzung - erst nach initialen Erreger-WirtsKontakten und entsprechenden Folgeprozessen erfolgt. Die Rolle des Histamins und weiterer Mastzellmediatoren ist demnach eher in der Regulation als in der Induktion des inflammatorischen Geschehens zu suchen (siehe 5.2.4) 5.1.4 Beeinflussung benachbarter Euterviertel durch die Inokulation mit Erregern In der Untersuchung von PETZL (2005) wurde gezeigt, dass ein initial infiziertes Euterviertel Einfluss auf die Dynamik der Zellzahl-Entwicklung nachfolgend infizierter Euterviertel nahm. In diesem Modell wurden 3 von 4 Eutervierteln sequentiell im Abstand von 12 h mit der identischen Zahl an E.-coli-Bakterien infiziert. Diese Beobachtung legte nahe, dass sich die Euterviertel im Rahmen der Infektion gegenseitig durch Mediatoren beeinflussen. In dem hier vorliegenden Infektionsversuchen konnten nur in Folge einer E.-coli-Inokulation Anstiege des SCC in Kontroll-Eutervierteln beobachtet werden. Entsprechende Veränderungen blieben in den Kontroll-Eutervierteln S.-aureus-inokulierter Tiere aus (Abb. 22). Trotz individuell starker Varianzen wird auch in diesem Modell eine Beeinflussung von NachbarEutervierteln durch ein infiziertes Euterviertel belegt. Die Expression verschiedener immunrelevanter Gene in den jeweiligen Nachbar-Eutervierteln wurde daraufhin untersucht (Tab. 14). Bis auf das Gen für TGF-β wurden 24 h p.i. mit E. coli alle untersuchten Gene signifikant, z.T. drastisch hochreguliert. In den benachbarten Eutervierteln zeigten sich 6 h p.i. einzelne, leichte Erhöhungen der Genexpression, während in den Kontroll-Eutervierteln 24 h p.i. signifikante Expressionssteigerungen gegenüber den Goldstandardtieren zu verzeichnen waren. Die Modulation der Genexpression umfasste sowohl Zytokine, Chemokine als auch Effektormoleküle wie Serum-Amyloid A und iNOS. CCL20 (MIP-3-α, LARC und EXODUS-1) wird hauptsächlich in der Leber aber auch in Leukozyten nach LPS oder IL-1β-Stimulus produziert. In der Milchdrüse wird es vermutlich durch residente Makrophagen gebildet. Es ist hauptsächlich für Lymphozyten und weniger für Granulozyten chemotaktisch (SCHUTYSER et al. 2000). Dieses in den Kontroll-Eutervierteln auf Gen-Ebene verstärkt exprimierte Chemokin könnte somit zu einer Änderung der initialen Zellzusammensetzung führen. Gleiches gilt für das CCL5 (RANTES), ein Chemokin welches eine Vielzahl verschiedener Zellen anlocken kann und üblicherweise von T-Lymphozyten produziert wird. Es fördert zudem die Ausbildung einer Typ-1-polarisierten T-Zell-Antwort und damit eine pro-inflammatorische Antwort. In Untersuchungen von PAREEK et al. (2005) 150 an pbMEC-Kulturen konnte 6 h nach einer LPS-Stimulation eine 208-fache stärkere Expression der mRNA beobachtet werden. Somit könnten Milchdrüsenepithelzellen für die Expression dieses Chemokins in der Milchdrüse verantwortlich sein. Interessanterweise wurde die Expression dieses Gens nur transient (6 h p.i) in den Kontroll-Euterviertel reduziert. Die funktionelle Bedeutung dieser Beobachtung bleibt unklar. Auch TNF-α, eines der wesentlichen pro-inflammatorischen Zytokine, wurde in den Kontroll-Eutervierteln 24 h nach der Infektion signifikant hochreguliert. Vermutlich ist auch hier die Milchdrüsenepithelzelle maßgeblich an der Produktion dieses Zytokins beteiligt, da sowohl in dieser Arbeit (Abb. 41) als auch in mehreren Studien gezeigt werden konnte, dass Milchdrüsenepithelzellen die TNF-α-mRNA-Expression nach Stimulation mit LPS deutlich hochregulieren (OKADA et al. 1997; BOUDJELLAB et al. 1998; WELLNITZ u. KERR 2004). TGF-β ist hauptsächlich für seine anti-inflammatorische Wirkung bekannt, indem es die Produktion pro-inflammatorischer Chemokine, NO und ROS inhibiert. Allerdings gibt es auch Hinweise auf einen pro-inflammatorischen Effekt (LETTERIO u. BOTTINGER 1998; BONEWALD 1999). In der Milchdrüse wirkt es inhibierend auf das Wachstum von Epithelzellen und stimulierend auf Fibroblasten und Stroma-Zellen (DANIEL et al. 2001). In der Involution des Milchdrüsengewebes konnte ein apoptotischer Effekt auf die Epithelzellen nachgewiesen werden (ZARZYNSKA et al. 2007). Obwohl erhöhte Gehalte an TGF-β sowohl in der Milch E.-coli-infizierter Euterviertel als auch S.-aureus-infizierter Eutervierteln nachgewiesen wurde (CHOCKALINGAM et al. 2005; BANNERMAN et al. 2006), konnte in den KontrollEutervierteln E.-coli-infizierter Milchdrüsen keine Modulation der Genexpression dieses Zytokins beobachtet werden (Abb. 27). Dies könnte bedeuten, dass in der Zeit bis 24 h p.i. antiinflammatorische Gegenregulationsmaßnahmen, an denen dieses Zytokin beteiligt ist, noch nicht greifen. Serum Amyloid A (SAA) gehört zu den Akute-Phase-Proteinen und wird hauptsächlich in Hepatozyten gebildet. Lipopolysaccharide und Zytokine wie IL-1, IL-6 und TNF-α induzieren die SAA-Synthese. SAA induziert wiederum die Freisetzung von TNF-α, IL-1β und CXCL8 aus neutrophilen Granulozyten (FURLANETO u. CAMPA 2000) und wirkt auf Monozyten, neutrophile Granulozyten und T-Lymphozyten chemotaktisch (JENSEN u. WHITEHEAD 1998). Ein Milchdrüsen-assoziierter Isotyp ist das SAA3, das relativ hohe Gehalte im Kolostrum aufweist und auch in Milch nachzuweisen ist (MCDONALD et al. 2001). Außerdem liegen erhöhte Konzentrationen in der Milch von Kühen mit Mastitis vor (ECKERSALL et al. 2001; GRONLUND et al. 2003). In Milchdrüsenepithelzellkulturen konnten WELLNITZ und KERR (2004) 24 h nach der Stimulation mit LPS eine starke Aufregulation 151 der SAA3-mRNA-Expression aufzeigen. Insofern kann die signifikante Aufregulation dieses Gens in den Kontroll-Eutervierteln E.-coli-inokulierter Tiere als beteiligter Faktor für den veränderten Zellinflux in die Milch angesehen werden. Auch klassische Effektormoleküle werden in den Kontroll-Eutervierteln hochreguliert, wie man am Beispiel des LAP, einem ßDefensin sehen konnte. Es wird von Epithelzellen gebildet und wird durch die Stimulation mit E. coli deutlich aufreguliert (vgl. Tab. 14) (GOLDAMMER et al. 2004; PETZL et al. 2008). Da gezeigt werden konnte, dass pro-inflammatorische Faktoren einer Erreger-unabhängigen Regulation auf genetischer Ebene in den Kontroll-Eutervierteln unterlagen, kann postuliert werden, dass darüber die zelluläre Antwort nach möglichem Erregerkontakt moduliert wird. Dies könnte als Erklärung dafür dienen, dass in den Infektionsversuchen von PETZL (2005) nachfolgend infizierte Euterviertel eine moderatere zelluläre Reaktion aufwiesen als in den initial infizierten Eutervierteln. Die Prozesse könnten dem Schutz vor einer überschießenden Immunreaktion und einer gezieltere Elimination des Erregers dienen, um nachhaltigen Schäden im Gewebe von Nachbar-Eutervierteln vorzubeugen. Wie der Informationsaustausch zwischen inokuliertem Euterviertel und benachbarten Eutervierteln erfolgt ist noch unklar. Am wahrscheinlichsten gelten systemische Effekte in Form von Infektions-abhängig induzierten Mediatoren, die über die Blutzirkulation benachbarte Euterviertel erreichen. Dies könnte erklären, dass die beobachteten Effekte im Wesentlichen erst 24 h p.i. nachweisbar waren. Erst dann könnten zirkulierende Mediatoren einen Spiegel erreicht haben, der zu der veränderten Genexpression in den Kontroll-Eutervierteln geführt hat. 5.2 In-Vitro-Untersuchungen zur Klärung des Einflusses von Milchinhaltsstoffen auf die Vitalität von neutrophilen Granulozyten In Folge der Interaktion von Mastitiserregern und residenten immunologisch potenten Zellen in der Milchdrüse ändert sich die Zusammensetzung der somatischen Zellen in der Milch drastisch (SORDILLO u. STREICHER 2002; BURVENICH et al. 2003; BANNERMAN et al. 2004; PETZL et al. 2008). In der frühen Phase der Infektion werden überwiegend neutrophile Granulozyten aus dem Blut rekrutiert, die innerhalb weniger Stunden die dominierende Zellfraktion darstellen. Sie gelten als die Haupteffektorzellen während der Infektion der Milchdrüse. Entscheidend für die Funktion ist ihre Überlebenszeit vor Ort. Allerdings befassten sich nur wenige Studien mit dem Einfluss von Milch auf die Funktionalität und die Vitalität von PMN (VAN OOSTVELDT et al. 2001; PAAPE et al. 2003; BOUTET et al. 2004). 152 In der vorliegenden Arbeit wurde ein bisher nicht beschriebenes In-vitro-Modell angewendet, in dem die Wirkung von Milchseren gesunder und infizierter Milchdrüsen auf bovine BlutPMN geprüft wurde. Zur näheren Beleuchtung der ursächlichen Faktoren für die ApoptoseModulation wurde der Einfluss von ausgewählten Zytokinen (TNF-α, Il-1β und IFN-γ) und Mediatoren (Histamin) auf PMN alleine und in Gegenwart von Milchseren betrachtet. Zusätzlich wurde die Wirkung von Zellkulturüberständen stimulierter pbMEC auf die PMN untersucht, um die Interaktion dieser Zellen nach Erregerkontakt näher zu beleuchten. Zur Beurteilung wurde die Zellvitalität sowie die Nekrose- und Apoptoserate herangezogen. 5.2.1 Methodischer Ansatz In In-vitro-Kulturen können apoptotische Zellen relativ schnell sekundär nekrotisch werden (WALSH et al. 1998) und stellen sich nach durchflusszytometrischer Analyse als Propidiumjodid-positiv dar (Abb. 4). Solche, noch als Zellen zu identifizierende Ereignisse desintegrieren jedoch sehr rasch (Membran-, Kernfragmente), so dass auch der Parameter (Propidiumjodid-positive Zellen) nur bedingt zum Nachweis eines induzierten Zelltodes geeignet schien. Dies wurde durch eigene Beobachtung gestützt, wonach in Ansätzen, in denen die absolute Zahl vitaler Granulozyten innerhalb der ersten 24 Stunden deutlich gesunken war, der Anteil Propidiumjodid-positiver Messereignisse selten sehr hoch lag (Daten nicht gezeigt). Auf diesen Überlegungen basierte die Auswahl des dargestellten quantitativen durchflusszytometrischen Referenzzellverfahrens zur Prüfung der Modulation der Zellvitalität (3.3.8). Prinzipiell wurden die, nach bestimmten Zeiten in vitro nachweisbaren, nicht-nekrotischen Zellen quantitativ erfasst und als verlässlicher Parameter der Zellvitalität in vitro angesehen. Ergänzend wurde die ermittelte Anzahl nicht-nekrotischer Zellen mit den Anteilen der vitalen und der apoptotischen Zellen verrechnet. Dies diente der Beurteilung, ob die Abnahme der Zellzahlen in den Kulturansätzen nach der Inkubationszeit auf eine primäre oder eine sekundäre Nekrose zurückzuführen sind. In bisherigen Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen wurde im bovinen System häufig die Bindung von Fluorochrom-markiertem Annexin V an das Phosphatidylserin in der Membran apoptotischer Zellen verwendet (VAN OOSTVELDT et al. 2001; SLADEK et al. 2005; SCALIA et al. 2006). Allerdings stellte sich diese Methode in den Untersuchungen von DAHNKE (2003) als fragwürdig heraus. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurde daher eine bisher noch nicht im bovinen System beschriebene Technik etabliert. Mit Hilfe des Fluorochroms 5, 5´, 6, 6´-Tetrachloro-1, 1´, 3, 3´-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid (JC-1) wurde der Nachweis des Verlustes des Mitochond- 153 rienmembranpotentials als Merkmal des frühen Stadiums der Apoptose ermöglicht (FOSSATI et al. 2003). Etablierung des Apoptose-Nachweises mit JC-1 im bovinen System Da dieses Verfahren bisher ausschließlich in humanen neutrophilen Granulozyten angewendet wurde, musste dieses System zunächst im bovinen System etabliert und für dieses modifiziert werden. Zunächst wurde eine geeignete Konzentration des Farbstoffes JC-1 ermittelt, da sich herausstellte, dass das Fluorochrom in höheren Konzentrationen (10 µmol/L) eine zelltoxische Wirkung aufweist. Für die weiterführenden Untersuchungen wurde eine JC-1Konzentration von 7 µmol/L gewählt, da mit dieser Konzentration der Anteil apoptotischer Zellen vollständig erfasst wurde und die graduelle Veränderung des Anteils vitaler und apoptotischer Zellen in Abhängigkeit der eingesetzten Stimulus-Konzentration signifikant dargestellt werden konnte (Abb. 33). Die Darstellung der vitalen und apoptotischen Zellen im Durchflusszytometer konnte auch mikroskopisch nachvollzogen werden (Abb. 4). In vitalen Zellen aggregierte das Fluorochrom in den Mitochondrien, welches durchflusszytometrisch durch eine schwache GrünFluoreszenzintensität zu ermitteln war und im Mikroskop das tubuläre Netzwerk dieser Zellorganellen darstellen ließ. Depolarisierten die Mitochondrienmembranen in Folge von Apoptose, diffundierte der Farbstoff ins Zytosol und lag hier in seiner stark grün-fluoreszierenden monomeren Form vor. Im Mikroskop betrachtet leuchtete das Zytosol diffus und im Durchflusszytometer stellte sich dieser Zellzustand mit einer deutlich erhöhten Grün-Fluoreszenz dar. 5.2.2 Einfluss von Milchseren gesunder und infizierter Milchdrüsen Die Inkubation von neutrophilen Granulozyten aus dem peripheren Blut mit Milchseren von eutergesunden Tieren zeigte einen deutlichen Anstieg der Apoptose- und Nekrose-Rate (Abb. 36). Ähnliche Beobachtungen machten VAN OOSTVELDT et al. (2001) an PMN aus der Milch, die im Vergleich zu den Blut-PMN einen deutlich erhöhten Anteil apoptotischer Zellen aufwiesen. Dieser Effekt wurde damit erklärt, dass die Phagozytose- und ROS-BildungsLeistung von PMN nach der Diapedese durch einen Monolayer von isolierten bovinen Milchdrüsenepithelzellen reduziert wurde (SMITS et al. 1999) und dies vermutlich eine Folge der Apoptose war (WHYTE et al. 1993). Eigene Untersuchungen legen hingegen die Vermutung nahe, dass Milchseren gesunder Euterviertel selbst einen pro-apoptotischen Effekt haben, da der Anteil apoptotischer Zellen hier vergleichbar mit den Anteilen apoptotischer PMN in der Milch von Kühen in der Mitte der Laktation ist. Während bei VAN OOSTEVELDT et al. (2001) 34 ± 2% der Milch-PMN apoptotisch war, liegt der Anteil in den eigenen Untersu- 154 chungen bei 30%. Bei den in eigenen Untersuchungen verwendeten Milchseren handelte es sich um entrahmte Milch, das hier vereinfacht Milchserum genannt wird. In PAAPE et al. (2003) wurde beschrieben, dass durch die Aufnahme von Fett und Kasein aus der Milch die funktionellen Eigenschaften der PMN reduziert waren. Spekulativ könnte postuliert werden, dass durch die Phagozytose von Kasein und anderer Proteine eine eingeschränkte Funktionalität zum Einleiten des Zelltodes durch Apoptose führte. Die Inkubation der peripheren PMN mit dem Milchserum eines experimentell mit E. coli infizierten Euterviertels (Versuchstier M-08) führte zu einer Reduktion des pro-apoptotischen und -nekrotischen Effekts auf die PMN aller untersuchten Tiere. Weitere Untersuchungen mit Milchseren von verschiedenen E. coli infizierten Kühen ergaben jedoch eine Reduktion der Anzahl vitaler PMN und einen Anstieg der Apoptoserate. Ebenso konnte ein Anstieg der Apoptoserate durch Milchseren von S. aureus infizierten Kühen gezeigt werden, ohne dass ein Einfluss auf die Anzahl der nicht-membrangeschädigten vitalen PMN zu erkennen war. In Abhängigkeit vom Erreger und Individuum ändert sich die Zusammensetzung des Milchserums. Wie sich in den Infektionsversuchen herausstellte, reagierten die Probanden individuell sehr unterschiedlich. Sowohl die Dynamik der Leukozyten als auch die Gehalte von den untersuchten Zytokinen (TNF-α, IL-1β und IFN-γ) und Histamin wiesen trotz der strengen Auswahlkriterien für die Probanden große Unterschiede auf. Dies könnte eine Erklärung für den gegensätzlichen Effekt von den Milchseren der Versuchs-Kuh M-08 und der Gesamtheit der Milchseren der infizierten Euterviertel aus den E.-coli-Infektionsversuchen bieten. Auch bei der Betrachtung der einzelnen Milchseren (Daten nicht gezeigt) waren Milchserenspezifisch gegensätzliche Reaktionen der Kultur-PMN zu ermitteln. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die pH-Werte voneinander abwichen, auch wenn vergleichbare Euterviertel bzw. Infektionsstadien miteinander verglichen wurden. (Daten nicht gezeigt). In den Milchseren des Tieres M-08 konnte die Aussage von HAMANN (2001) bestätigt werden, das Milch gesunder Euterviertel einen pH-Wert von 6,3 bis 6,7 aufweist und das dieser bei akuter Infektion der Milchdrüse mit der erhöhten Durchlässigkeit der Blut-Euter-Schranke sich dem pH-Wert des Blutes von 7,38 bis 7,43 angleicht. Interessanterweise konnte in den eigenen Untersuchungen festgestellt werden, dass der Anteil apoptotischer Zellen mit Zunahme des pHWertes steigt. Ob geringere pH-Werte tatsächlich die Vitalität steigern, oder ob die PMN in eine primäre Nekrose übergehen, konnte hier nicht geklärt werden. In der Literatur sind keine vergleichbaren Daten erhoben worden. Zur Erklärung dieses Effektes wurden die im Folgenden beschriebenen Untersuchungen durchgeführt. 155 5.2.3 Einfluss von Zytokinen Zytokine sind an der Regulation der Apoptose von neutrophilen Granulozyten beteiligt (LUO u. LOISON 2008). In den Milchseren der Infektionsversuche konnten erhöhte Zytokingehalte für TNF-α, IL-1β und IFN-γ festgestellt werden. Die Präsenz der hier untersuchten Zytokine in der Milch von infizierten Eutervierteln mit E. coli und S. aureus wurde auch in vorherigen Studien beschrieben (BANNERMAN et al. 2004). Dabei wurden in der Milch nach der Infektion für IL1-β und IFN-γ Konzentrationsbereiche von 0,1 bis 0,8 ng/mL und für TNF-α eine maximale Konzentration von 30 ng/mL festgestellt. Die Konzentrationen der in vitro eingesetzten Zytokine wurden anhand der Arbeit von BANNERMAN et al. (2004) gewählt. Zusätzlich wurden Ansätze mit 30 ng/mL IL-1β und IFN-γ vorbereitet, um eventuelle Proteineffekte ausschließen zu können. Durch die Inkubation der aus dem Blut generierten PMN mit den höchsten Konzentrationen von IL-1β und IFN-γ wurde die Anzahl vitaler Zellen signifikant reduziert. Dieser Effekt verstärkte sich in Gegenwart von Milchserum für IFN-γ und wurde hier auch für TNF-α beobachtet. Weiterhin konnte eine Reduktion der Apoptoserate durch die Inkubation mit IL-1β und IFN-γ sowie eine signifikante Erhöhung der Nekroserate festgestellt werden. Für Il-1β ist sowohl eine direkte als auch eine indirekte Einflussnahme auf neutrophile Granulozyten beschrieben. Es fördert die Diapedese von Neutrophilen durch die Aufregulation von ICAM-1 auf den Endothelzellen und stimuliert die Synthese von CXCL8 und IL-6 in neutrophilen Granulozyten. Für IL-1β ist allerdings keine apoptotische Wirkung auf Neutrophile bekannt. Auch eine indirekt pro-apoptotische Wirkung von CXCL8 und IL-6 kann ausgeschlossen werden, da für diese Mediatoren anti-apoptotische Wirkungen postuliert werden (BIFFL et al. 1996; KETTRITZ et al. 1998). Auch für IFN-γ wird keine direkte pro-apoptotische Wirkung auf Neutrophile beschrieben. IFN-γ stimuliert PMN zur Phagozytose (HOLLÄNDER 2006). Entweder kann das Absterben hier über eine gesteigerte ROS-Bildung in Folge der Phagozytose erklärt werden (LUO u. LOISON 2008) oder über eine indirekte Wirkung über Makrophagen. Die hier eingesetzten PMN enthielten einen kontaminierenden Anteil von 5% mononukleären Zellen. Obgleich ein Einfluss dieser Zellen auf das Stimulus-induzierte PMN-Absterben erst ab 10% beschrieben wurde (SCHUBERTH et al. 2000) kann es sein, dass das IFN-γ in diesen Zellen die Sekretion pro-apoptotischer Faktoren stimuliert hat. TNF-α fördert die Bildung und Freisetzung von neutrophile Granulozyten aus dem Knochenmark und aktiviert sie zur Bildung von Zytokinen wie IL-1β, IL-6, CXCL8 und TNF-α selbst (HOLLÄNDER 2006). Bezüglich der Apoptose konnte sowohl eine anti- 156 apoptotische (MURRAY et al. 1997; KILPATRICK et al. 2006) als auch eine proapoptotische Wirkung nachgewiesen werden (GON et al. 1996; RENSHAW et al. 2003). Darüber hinaus konnte in anderen Studien kein Effekt von TNF-α auf die Apoptose festgestellt werden (SULLIVAN et al. 1996; SCHUBERTH et al. 2000). Kürzlich wurde in Studien mit humanen PMN für TNF-α ein dualer Effekt gezeigt: in geringer Konzentration (<1 ng/mL) wurde Apoptose über die Stimulation eines anti-apoptotischen Proteins verzögert, wohingegen höhere Konzentrationen (>10 ng/mL) eine Caspase-abhängige Beschleunigung der Apoptose verursachten (VAN DEN BERG et al. 2001; LUO u. LOISON 2008; CROSS et al. 2008). Die Ergebnisse in den TNF-α−Ansätzen bestätigen jedoch prinzipiell die Erkenntnisse von CROSS et al. (2008), die bei hohen TNF-α−Konzentrationen (>10 ng/mL) ein vermehrtes Absterben über die Apoptose beobachtet haben. Im Gegensatz zu den bisherigen Erkenntnissen über IFN-γ und IL-1β, die in humanen Invitro-Modellen gewonnen wurden, verursachten diese Zytokine in bovinen PMN-Zellkulturen ein vermehrtes Absterben. Die gleichzeitig nachgewiesene geringere Apoptoserate lässt vermuten, dass unter den gewählten Bedingungen die Zellen beschleunigt oder direkt nekrotisch werden. Trotz sehr heterogener Gehalte an den hier untersuchten Zytokinen in den Milchseren nach Infektion zeigte sich, dass alle untersuchten Zytokine im ‚Kontext‘ Milchserum die Lebensspanne der neutrophilen Granulozyten verringern. Dies kann als Ausdruck einer Gegenregulation verstanden werden, die dafür sorgt, dass überschießende inflammatorische Reaktionen und potentiell schädliche Wirkungen einer zu großen Zahl aktivierter PMN für das Gewebe abgemildert werden. 5.2.4 Einfluss von Histamin In den untersuchten Milchseren aus den Infektionsversuchen konnten erhöhte Histamingehalte festgestellt werden (Abb. 30 und Abb. 31). In eigenen In-vitro-Versuchen konnte selbst bei hohen Konzentrationen Histamin von 1,8 µg/mL kein pro-apoptotischer und –nekrotischer Effekt festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Somit konnte im bovinen System die Aussage von HUR et al. (2003) nicht bestätigt werden, dass Histamin die Apoptose von humanen neutrophilen Granulozyten durch 10 mmol/L (1,8 µg/mL) beschleunigt. Diese Konzentration wäre zehnfach höher als jene, die in Milchproben infizierter Milchdrüsen gemessen wurde. Ähnlich wie bei den Zytokinen (siehe oben) ergab sich die Fragestellung, ob Histamin im Zusammenspiel mit Milchinhaltsstoffen einen Effekt auf die Vitalität der PMN hat. In dieser Untersuchung konnte gezeigt werden, dass der Zusatz von Histamin zu Milchseren gesunder 157 Euterviertel konzentrationsabhängig keine Steigerung der Anzahl vitaler PMN bewirkte. Auch der Anteil apoptotischer Zellen wurde nicht durch Histamin beeinflusst. Hingegen konnte ein protektiver, die Lebenszeit von PMN verlängernder Effekt nachgewiesen werden, wenn zu den Milchseren LPS als Stimulus gegeben wurde (Abb. 40). Das LPS führte zu einer signifikanten Reduktion der Zahl vitaler PMN, der Zusatz von Histamin konnte diesen Effekt Dosis-abhängig hemmen. Hieraus ist zu schließen, dass gesteigerte Histaminkonzentrationen in der Milch nach Einwirken von Erregern bzw. Erregerbestandteilen einen protektiven Einfluss auf neutrophile Granulozyten haben. Worauf dieser anti-apoptotische/nekrotische Effekt beruht, wurde nicht näher analysiert. In humanen Neutrophilen wurde nachgewiesen, dass die Funktionalität der PMN durch Histaminkonzentrationen von 6 ng/mL bis 180 ng/mL beeinträchtigt wird. Dies zeigte sich in einer reduzierten Phagozytoseleistung mit herabgesetzter lysosomaler Enzymfreisetzung und ROS-Bildung sowie einem erhöhten cAMP-Spiegel (KAI et al. 2003; FLAMAND et al. 2004). Dieses könnte indirekt zu einer Verzögerung der Apoptose geführt haben, da ROS-Bildung und geringe cAMP-Spiegel als pro-apoptotische Faktoren für neutrophile Granulozyten bekannt sind (LUO u. LOISON 2008). 5.2.5 Einfluss aktivierter Milchdrüsenepithelzellen Die physiologische Rolle der Milchdrüsenepithelzellen (MEC) bei der Immunantwort auf die verschiedenen Erreger ist noch immer nicht vollständig geklärt. Sie stellen für eindringende Pathogene nach der Überwindung des Strichkanals, der Milchgänge und nach den Makrophagen in der Milch, die erste Barriere direkt in den Organismus dar. In bisherigen In-vitroStudien wurde hauptsächlich der Einfluss von Mastitiserregern und ihrer PAMPs auf die Expression der mRNA untersucht (STRANDBERG et al. 2005, YANG et al. 2008, WELLNITZ und KERR 2004). Auch in den eigenen Untersuchungen wurden aus bovinen Milchdrüsen generierte primäre Milchdrüsenepithelzellen mit den im Infektionsversuch eingesetzten Erregern (E. coli Stamm 1303 und S. aureus Stamm 1027) und deren PAMPs LPS und LTA stimuliert und die Expression verschiedener Zytokin-mRNA-Spezies erfasst. In Übereinstimmung mit STRANDBERG et al. (2005) und YANG et al. (2008) wurde die RNA-Expression von TNF-α und CXCL8 durch die Stimulation mit E.-coli-Bakterien und deren LPS gesteigert. Des Weiteren konnte der Erfolg der Stimulation mit einer Aufregulation von TGF-β und dem β-Defensin LAB nachgewiesen werden. Die Stimulation mit S. aureus und seinem PAMP LTA war bezüglich der Erhöhung der RNA-Expression von TNF-α und CXCL8 weniger deutlich, aber es konnte bewiesen werden, dass der komplette Erreger oder LTA eine Modulation der mRNA-Expression bewirkt. Eine Erhöhung der Expression von CXCL8 wurde bereits von WELLNITZ und KERR (2004) beobachtet. 158 Im Folgenden stellte sich die Frage, ob im Überstand aktivierter pbMEC Produkte erscheinen, welche die Apoptose und Nekrose von bovinen PMN modulieren. Ohne die Produkte näher identifiziert zu haben, reduzierten die Überstände sowohl E. coli/LPS- wie auch LTAstimulierter pbMEC signifikant den Anteil apoptotischer PMN, ohne jedoch die Zahl vitaler PMN zu beeinflussen. Die Faktoren erschienen relativ rasch, bereits 6 h nach Beginn der Stimulation, im Kulturüberstand; eine länger andauernde Stimulation konnte die Konzentration oder die Wirksamkeit nicht signifikant erhöhen. Die Reduktion der Zahl apoptotischer PMN, bei gleichzeitiger Beibehaltung der Zahl vitaler Zellen in vitro, lässt sich als echte Hemmung der Apoptose unter Vermeidung der Nekrose begreifen. Insofern können Milchdrüsenepithelzellen nach Erregerkontakt in der Tat Einfluss auf die Lebensspanne dieser Zellen beim Durchtritt in das alveoläre Lumen nehmen. Die Regulation der Apoptose und Nekrose boviner neutrophiler Granulozyten erwies sich in der Summe als äußerst komplex. Neben Faktoren in der Milch gesunder wie auch infizierter Euterviertel, welche die Lebensspanne verlängern konnten auch solche identifiziert werden, die das exakte Gegenteil bewirken. Die Klärung der Frage, welche relative Bedeutung die einzelnen Faktoren auf der Zeitachse vom Eindringen des Erregers bis zur Ausbildung einer entzündlichen Reaktion haben, bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. Entscheidend für die Regulation scheint nicht der isoliert betrachtete Faktor sondern vielmehr sein Zusammenspiel mit anderen Faktoren und residenten Zellen zu sein. 159 6 Zusammenfassung Sonja Meyer Untersuchungen zur Beeinflussung funktioneller Eigenschaften von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten in der initialen Phase der bovinen Mastitis Die Mastitis ist die wirtschaftlich bedeutendste Einzeltiererkrankung in der Milchproduktion. Bisher konnten frühe Erreger-Wirts-Interaktionen nicht hinreichend geklärt werden, um zufrieden stellende Prophylaxe- und Therapiekonzepte zu entwickeln. Im Rahmen eines wissenschaftlichen Gesamtkonzeptes sollte diese Arbeit dazu beitragen, die Interaktion zwischen Erregern, Milchdrüsenepithelzellen und somatischen Zellen der Milch in der frühen Entzündungsphase vergleichend zu untersuchen. Dazu wurde ein experimentelles In-vivoInfektionsmodell für Staphylococcus aureus und Escherichia coli, den häufigsten Erregern klinischer Mastitiden beim Rind, etabliert. Begleitend wurden im Rahmen von In-vitroStudien frühe Erreger-Wirts-Interaktionen auf ihre Bedeutung für die Regulation der Vitalität von neutrophilen Granulozyten untersucht. Es wurde ein Mastitis-Modellsystem verwendet, in dem Tiere definierten Alters, Laktationsstadiums und Milchzellzahl eingesetzt wurden. Die Qualität des entwickelten MastitisModells begründete sich auf den strengen Auswahlkriterien (Rasse: Holstein Friesian, 1. Laktation, 3.-5. Laktationsmonat, Freiheit von Mastitiserregern sowie somatische Zellzahl in der Milch [SCC] <50.000 Zellen/mL über mindestens drei Wochen vor Versuchsbeginn). Damit sollten mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit initiale Signal- und Abwehrmechanismen in der frühen Phase (24 bzw. 72 h) einer akuten klinischen (E. coli) und einer subklinischen bis chronischen (S. aureus) Mastitis erfasst werden. Das Modell umfasste darüber hinaus die Analyse von nicht-infizierten Tieren (‚Goldstandardtiere‘), welche den Modellgrenzen entsprachen, um zu prüfen inwieweit sich Zellzusammensetzungen während einer 24und 72-stündigen Beobachtungszeit verändern. Im Zuge aller Untersuchungen wurden die immigrierenden Zellen hinsichtlich ihres Phänotyps charakterisiert sowie Änderungen der Konzentration löslicher Milchinhaltsstoffe (Zytokine und Histamin) bestimmt. Die Evaluierung der nicht-infizierten Tiere ergab für den gesamten Beobachtungszeitraum einen konstanten Gehalt somatischer Zellen in der Milch. Dagegen zeigten sich auf der Ebene der Zellpopulationen der neutrophilen Granulozyten, Monozyten und Makrophagen sowie der Subpopulationen der T-Lymphozyten (γδ-T-Zellen, CD4+- und CD8+-T-Zellen) trotz enger Modellgrenzen erhebliche Unterschiede. Im Mittel lag der Anteil an Granulozyten bei 30% 40%. Unter den T-Zellen wurde ein mittleres konstantes CD4+/CD8+-Verhältnis von 0,4 er- 160 mittelt. Die Tier- und Viertel-spezifischen Unterschiede legen nahe, in Zukunft die Auswahlgrenzen noch enger zu fassen und die Zellzusammensetzung in die Auswahl mit einzubeziehen. Nach erfolgreicher experimenteller Inokulation von E. coli (500 KbE) oder S. aureus (10.000 KbE) in ein Euterviertel wurde in den infizierten Eutervierteln 12 h p.i. (E. coli) oder 24 h p.i. (S. aureus) ein individuell sehr unterschiedlicher Zellanstieg beobachtet. Allerdings erwies sich der Anstieg des Anteils neutrophiler Granulozyten unter den Leukozyten der Milch als signifikanter, invarianter Parameter nach Inokulation mit E. coli oder S. aureus. Er stieg innerhalb von 12 h p.i. von 30% - 40% auf >90% an und blieb über den gesamten Beobachtungszeitraum auf diesem hohen Niveau. Gleichzeitig konnte eine stetige Zunahme des CD4+/CD8+-Verhältnisses unter den T-Zellen der Milch in den S.-aureus-inokulierten und den Kontroll-Eutervierteln beobachtet werden. 72 h p.i. nahm dieses Verhältnis in den Kontroll-Eutervierteln wieder ab, während es in den inokulierten Eutervierteln weiter anstieg. Die Milch E.-coli-infizierter Euterviertel enthielt individuell höchst unterschiedliche Gehalte der Zytokine TNF-α, IL-1β und IFN-γ. In der Milch S.-aureus-inokulierter Viertel waren sie kaum nachweisbar. Die Histamingehalte der Milch zeigten einen signifikanten Anstieg 24 h p.i. nach Inokulation mit E. coli, während sie in der Milch S.-aureus-infizierter Tiere nur leicht und nicht signifikant anstiegen. Der Anstieg der Histaminkonzentration erfolgte erst nach dem Anstieg der Milchzellzahl und konnte demnach nicht für den Zelleinstrom mitverantwortlich gemacht werden. Genexpressionsanalysen mittels quantitativer RT-PCR für immunrelevante Gene in Milchdrüsengewebe von Goldstandardtieren und Kontroll-Eutervierteln der Infektionsversuchstiere zeigten, dass Kontroll-Euterviertel durch die Inokulation von Mastitis-Erregern auf der Ebene der mRNA-Expression signifikant moduliert wurden. Expressionssteigerungen waren für das linguale anti-mikrobielle Peptid (LAP, ß-Defensin) 6 h p.i. zu beobachten. 24 h p.i. zeigten sich signifikante Expressionssteigerungen für TNF-α, die Chemokine CXCL8 und CCL20 sowie für das Akut-Phase-Protein Serum Amyloid A (SAA3). Im zweiten Teil der Arbeit wurde in vitro die Modulation der Apoptose und der Nekrose von neutrophilen Granulozyten geprüft. Von der Regulation der Lebensspanne dieser Effektorzellen hängt entscheidend ihre funktionelle Kapazität in der Milchdrüse ab. Durch die Etablierung eines durchflusszytometrischen Verfahrens zum Nachweis depolarisierter Mitochondrienmembranen konnte die Beurteilung der Vitalität differenziert betrachtet werden. Die Inkubation von neutrophilen Granulozyten aus dem peripheren Blut mit Milchseren von eutergesunden Tieren zeigte einen deutlichen Anstieg der Apoptose- und Nekrose-Rate. 161 Milchseren von E.-coli-infizierten Kühen führten ebenfalls zu einer Reduktion der Anzahl vitaler PMN und einem Anstieg der Apoptoserate. Demgegenüber führten Milchseren von S.-aureus-inokulierten Kühen zu einem Anstieg des Anteils apoptotischer PMN, ohne dass ein Einfluss auf die Anzahl der vitalen (Mitochondrienmembran-intakten) Zellen zu erkennen war. Die individuell z.T. sehr unterschiedlichen Effekte der Milchseren spiegelten sich in der Beeinflussung der PMN-Apoptose und -Nekrose durch Zytokine, Histamin und den Kulturüberständen Erreger-stimulierter Milchdrüsenepithelzellen wider. In hohen Konzentrationen förderten die Zytokine TNF-α, IL-1β und IFN-γ die Nekrose von PMN, während nur IFN-γ gleichzeitig den Anteil apoptotischer PMN erhöhte. Histamin allein zeigte selbst in sehr hohen Konzentrationen keinen Einfluss auf die PMNApoptose und -Nekrose, konnte aber in Anwesenheit von Milchserum die LPS-induzierte PMN-Nekrose signifikant hemmen. Der Überstand E.-coli-, LPS-, und LTA-stimulierter Milchdrüsenepithelzellen enthielt Faktoren, die ausschließlich die Apoptoserate der PMN senkten, ohne die Zahl membran-intakter vitaler PMN zu beeinflussen. Die Regulation der Apoptose und Nekrose boviner neutrophiler Granulozyten erwies sich damit in der Summe als äußerst komplex. Neben Faktoren in der Milch gesunder wie auch infizierter Euterviertel, welche die Lebenspanne verlängern, konnten auch solche identifiziert werden, die das exakte Gegenteil bewirken. Die Klärung der Frage, welche relative Bedeutung die einzelnen Faktoren und Mechanismen auf der Zeitachse vom Eindringen des Erregers bis zur Ausbildung einer entzündlichen Reaktion haben, bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. Zusammenfassend konnten anhand des im Rahmen dieser Studie etablierten In-vivoInfektionsmodells verschiedene Effektorzellen, insbesondere neutrophile Granulozyten, identifiziert werden, die eine Schlüsselrolle in der Frühphase E.-coli- und S.-aureus-induzierter Mastitiden einnehmen. In der Milch gesunder und infizierter Euterviertel konnte zudem eine Vielzahl von Faktoren ermittelt werden, die im In-vitro-Modell die Lebenspanne dieser Effektorzellen und damit ihre potentielle Reagibilität im Euter beeinflussen. Diese Erkenntnisse stellen eine wertvolle Grundlage für weitere Studien im Hinblick auf die Entwicklung effizienter Prophylaxe- und Therapiekonzepte der bovinen Mastitis dar. 162 7 Summary Sonja Meyer Studies on influencing functional properties of polymorphonuclear neutrophilic granulocytes during the initial phase of bovine mastitis. Mastitis is the economically most important illness afflicting single animals in dairy farming. The current knowledge about early stage pathogen-host interactions has been insufficient to develop successful concepts for prophylaxis and therapy so far. Forming part of a cumulative research project on mastitis the present study was designed to examine in a comparative manner interactions of pathogens, mammary gland epithelial cells and somatic cells during the early stages of inflammation. For that purpose an experimental in vivo infection model was established for Staphylococcus aureus and Escherichia coli, two of the most common pathogens causing clinical mastitis in cattle. Parallel in vitro studies were conducted to determine the impact of early pathogen-host-interactions on the regulation of PMN-viability. For the in vivo experiments only cows of a defined age, stage of lactation and somatic cell count (SCC) were used. The quality of the developed model system for mastitis was based on strict exclusion of any animals not meeting the demands (Breed: Holstein Friesian, 1. lactation, 3.-5. month of lactation, no evidence of mastitis related pathogens in the milk and a SCC <50.000 cells/ml at least three weeks before commencement of the trials). Thus it was possible to observe initial signal and defence mechanisms (24 respectively 72 h) of an acute clinical mastitis (E. coli) and a subclinical to chronic mastitis (S. aureus) with great accuracy and reproducibility. As controls the cell composition in the milk of non infected animals selected by the same strict exclusion criteria were analysed using the same time frame (‚gold standard animals’). The cells which migrated into the milk of infected and non infected animals were phenotyped and the concentration of histamine as well as a subset of cytokines was examined. Evaluation of non infected animals showed for the entire time span a constant over all concentration of somatic cells. However, even within the control group considerable differences occurred in the relative distribution of immune cell types such as neutrophilic granulocytes, monocytes und macrophages and a subpopulations of T-lymphocytes (γδ-T-cells, CD4+- and CD8+-T-cells). The milk leukocyte population of a healthy animal consisted on average of 30-40% neutrophilic granulocytes. The mean T-cell CD4+/CD8+-ratio amounted to 0.4. With regard to the large differences in composition of leukocyte subpopulations between clinically healthy animals and even single quarters it seems recommendable to include this criterion when choosing animals for future trials. 163 The experimental inoculation of E. coli (500 CFU) or S. aureus (10.000 CFU) was followed 12 h p.i. (E. coli) or 24 h p.i. (S. aureus) by a rise in leukocyte numbers in the infected quarter. Interestingly, the magnitude of the rise differed individually to a great extend. A very constant parameter however proved to be the upregulation of the granulocyte fraction within the leukocyte population 12 h p.i. from 30-40% up to 90%. The situation remained unchanged for the rest of observed time span. The S. aureus inoculated quarters as well the control quarters of the same cows showed additionally a turn in T-cell CD4+/CD8+-ratio in favour of the CD4+ cells. The ratio kept rising in the infected quarters, whereas it fell back to initial values in the control quarters 72 h p.i. Concerning cytokine production, the animals reacted very different to the two pathogens. E. coli elicited a significant rise in TNF-α, IL-1β and IFN-γ concentrations, even though the individual differences between animals remained considerable. In contrast, S. aureus inoculated quarters showed hardly any cytokine production at all. Similarly, the histamine content of the milk rose significantly after inoculation with E. coli. Such a reaction was not observed after confrontation with S. aureus. Since histamine levels started to raise after the influx of leukocytes it is unlikely that histamine acts as a trigger for leukocyte immigration. Gene expression analysis was performed by quantitative RT-PCR for immune-related genes using udder tissue of gold standard animals and infected animals as well as of control quarters of infected cows. It revealed that in infected animals the mRNA expression even of the control quarters was significantly modulated. A rise in mRNA-concentration was noted 6 h p.i. for the lingual anti-microbial peptide (LAP, a ß-Defensin). 24 h after inoculation the expression of TNF-α, CXCL8, CCL20 and the acute phase protein serum amyloid A (SAA3) was significantly up-regulated. The second part of the study consisted of in vitro trials examining the modulation of apoptosis and necrosis of neutrophilic granulocytes. The functional capacity of these classical phagocytes depends to a great extend on the regulation of their life span within the mammary gland. A method for flow cytometric evaluation of mitochondrial membrane potentials was established facilitating a differentiated assessment of PMN viability. Incubation of peripheral blood neutrophilic granulocytes with milk sera of healthy cows showed significant higher numbers of apoptotic as well as necrotic cells compared with controls. Similar results were noted after incubation of PMN with milk sera of E. coli inoculated quarters. Milk sera of S. aureus inoculated cows on the other hand only led to a rise in apoptotic cells, without a change in the number of membrane intact cells. The necrotic and apoptotic effect of milk sera on PMN, which differed considerably between individuals, was mir- 164 rored if neutrophilic granulocytes were incubated with cytokines, histamine or supernatants of pathogen-stimulated mammary gland epithelial cell cultures. The cytokines TNF-α, IL-1β and IFN-γ caused in high concentrations PMN necrosis. Only IFN-γ led to a parallel rise in numbers of apoptotic cells. Histamine alone showed even in high concentrations no influence on PMN necrosis or apoptosis. However, added to milk sera histamine significantly inhibited LPS-induced PMN necrosis. Supernatant of E. coli-, LPS- or LTA-stimulated mammary gland epithelial cell cultures contained factors which exclusively down-regulated PMN apoptosis without influencing the numbers of membrane intact cells. The described results suggest that the regulation of apoptosis and necrosis of bovine neutrophilic granulocytes is a rather complex process. Milk of healthy as well as infected udder quarters contained factors which lengthened the life span of PMN, but also some which appeared to cause the complete opposite. Further studies will be necessary to establish the importance of single factors and mechanisms on the timeline between initial pathogen contact and the development of an inflammatory reaction. In summary the in vivo infection model developed in the present study identified several effector cells which play a key role in the initial phase of E. coli- und S. aureus-induced mastitis. Neutrophilic granulocytes as the dominating leukocyte fraction seem to be of special importance. In the milk of healthy and infected quarters an abundance of factors were found which were able to influence in vitro the PMN viability and reactivity. The results represent a valuable basis for further studies with the aim of developing an efficient prophylaxis and therapy of bovine mastitis. 165 8 Literaturverzeichnis ADLER, B., H. ADLER, T. W. JUNGI u. E. PETERHANS (1995): Interferon-alpha primes macrophages for lipopolysaccharide-induced apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 215, 921-927 AKGUL, C. u. S. W. EDWARDS (2003): Regulation of neutrophil apoptosis via death receptors. Cell Mol Life Sci 60, 2402-2408 ALIPRANTIS, A. O., R. B. YANG, M. R. MARK, S. SUGGETT, B. DEVAUX, J. D. RADOLF, G. R. KLIMPEL, P. GODOWSKI u. A. ZYCHLINSKY (1999): Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science 285, 736-739 ALLISON, J. P. u. W. L. 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Am J Vet Res 48, 1617-1625 197 Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Untersuchungen zur Beeinflussung funktioneller Eigenschaften von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten in der initialen Phase der bovinen Mastitis“ selbständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen: 1. Materialien und Geräte wurden von der Arbeitsgruppe Immunologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. 2. Die Daten für die Genexpression in Eutervierteln und Milchdrüsenepithelzellen wurden von Prof. Dr. H. M. Seyfert, Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Fachbereich Molekularbiologie, Dummerstorf zur Verfügung gestellt. 3. Die klinischen Daten für die Kühe aus den Infektionsversuchen wurden von Prof. Dr. Holm Zerbe, Klinik für Wiederkäuer, Veterinärmedizinische Fakultät, LMU München, zur Verfügung gestellt. 4. Die Daten für die TNF-α-Gehalte in der Milch infizierter Euterviertel wurden von Prof. Dr. Bruckmaier Abteilung Veterinär-Physiologie, Vetsuisse Fakultät, Universität Bern (Schweiz) zur Verfügung gestellt. 5. Diese Arbeit wurde mit finanzieller Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft in Form von Personal- und Sachmittelspenden angefertigt (FOR585, Pathogen-spezifische Abwehrmechanismen in der Milchdrüse, SCHU 1108/3-2). Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation an folgender Institution angefertigt: Arbeitsgruppe Immunologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. Hannover, den 11.4.2008 Sonja Meyer 198 Danksagung: An erster Stelle danke ich Herrn Apl. Prof. Dr. H.-J. Schuberth für die Überlassung des Themas und für die zuverlässige und engagierte Betreuung. Jederzeit stand seine Tür für Fragen offen. Durch sein Ideenreichtum, seinen Humor und seine motivierenden Worte hat er maßgeblich zur Fertigstellung dieser Arbeit beigetragen. Ein großer Dank gilt auch den unermüdlichen Mitarbeitern aus dem Labor der Arbeitsgruppe Immunologie: Sonja Kordex, Silke Schöneberg und Udo Rabe. Sie standen jederzeit mit ihrem Wissen und Hilfsbereitschaft zur Seite und bewiesen eine schier unerschöpfliche Gedult beim Lösen mathematischer und praktischer Probleme. Sehr hilfreich waren auch Kathrin Langner und Jens Rohwer, die durch wertvolle Denkanstöße meine Arbeit bereicherten. Außerdem möchte ich mich bei den Mitarbeitern der Klinik für Wiederkäuer, insbesondere bei Heidi Mayrhofer, Frau Belicki und Frau Radloff bedanken, die durch ihr Engagement die Rahmenbedingungen für die „harten Tage“ in Oberschleißheim so angenehm wie möglich gestalteten. Bei Prof. Dr. Holm Zerbe, Dr. Wolfram Petzl und Daniel Mehne möchte ich mich für die gute Zusammenarbeit bedanken. Ein Dankeschön geht auch nach Dummerstorf an Angelika Deike und Anne Bernd, die mir bei allen Laborarbeiten mit Rat und vor allem Tat zur Seite standen sowie an Prof. Dr. HansMartin Seyfert, der mir die lehrreichen Aufenthalte ermöglichte. Durch meine Mitdoktoranden (und Leidensgefährten) war es eine schöne Zeit in der Arbeitsgruppe Immunologie. Auch wenn mein Gemüt mal weniger SONNIg war, haben sie mich stets wieder aufgebaut. Ich bedanke mich in aller Herzlichkeit für das angenehme Arbeitsklima, die offenen Ohren, die fachlichen Diskussion und Anregungen sowie für tolle gesellige Abende. Ich danke meinen Eltern dafür, dass sie es mir ermöglicht haben, meinen Weg zu gehen und damit den Grundstein für diese Arbeit und vieles mehr gelegt haben. Tim Drees möchte ich von Herzen für die seelische und tatkrätige Unterstützung danken. Du bist das Beste was mir je passiert ist! 199 Nicht zuletzt möchte ich mich ganz herzlich bei meinen Freunden bedanken, die mich während der Zeit motiviert und abgelenkt haben. Ich danke dem Verein SC Germania List und meiner Rugby-Mannschaft für eine tolle Zeit, denn der Rugby-Sport hat mich nicht nur sportlich sondern auch mental inspiriert. Schließlich gilt mein Dank sowohl meinen fleißigen Korrekturlesern Annika Mitzscherling und Fritz Behr-Heyder, die mit Beharrlichkeit die fertig gestellten Teile der Arbeit einforderten als auch Ulrike Taylor, die mich bei der Übersetzung der „Summary“ unterstützte.
