Die Institute Institut für Molekulare Virologie

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Die Institute
Institut für Molekulare Virologie
Institute of Molecular Virology
Neuherberg
(Direktor / Director: Prof. Dr. Volker Erfle)
D
ie Bedeutung von Infektionen im
allgemeinen, und besonders die von
Virusinfektionen, für bestimmte wichtige Erkrankungen des Menschen nimmt zu
als Folge der weitreichenden Veränderungen unserer Lebensumstände. Zum einen
handelt es sich um Infektionen mit neu
auftretenden Erregern wie AIDS und BSE.
Zum andern spielen veränderte Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirtsorganismus unter neuen Umweltbelastungen oder
bei der Anwendung neuer Therapien eine
Rolle. Die Schwerpunkte der Arbeiten liegen
daher in der Aufklärung von Mechanismen
der Virus-Persistenz, der Virus-Vermehrung
und der Krankheitsentstehung durch VirusInfektionen auf dem Hintergrund sich verändernder Belastungen des Wirtsorganismus.
Auf der Grundlage der gewonnenen Erkenntnisse werden neue diagnostische und
therapeutische Konzepte entwickelt. Das
Wissen um die Strategien, mit denen Viren
und Zellen interagieren und dabei den
zellulären Stoffwechsel und das Immunsystem beeinflussen, bietet zudem einen
Ausgangspunkt, Viren oder – Virus-Bestandteile- als Werkzeuge für die Immun- und
Gentherapie zu verwenden.
Ziele der derzeitigen Arbeiten sind
• Beschreibung der Einflüsse retroviraler
Kontrollgene und -elemente auf die Steuerung zellulärer Prozesse.
• Aufklärung zellulärer Mechanismen, die
die Replikation von Retroviren beeinflussen („antivirale Faktoren“).
• Entwicklung und Anwendung viraler Vektoren für Immunprophylaxe und Therapie
mit Schwerpunkt Vaccinia Virus-Vektoren.
• Untersuchung der spezifischen Immunantworten bei Virus-Infektion und nach Vakzi-
T
he importance of infections, particularly of viral infections, for the
development of major human diseases is increasing as a result of the farreaching changes taking place in our way of
life. Health problems not only result from
epidemics associated with new pathogenic
viruses or agents, like AIDS or BSE, but also
from changes in the interaction between
viruses and the host organisms as a result
of environmental pollution or the application of new therapies in medicine. Therefore, research in the Institute of Molecular
Virology is focused on the mechanism of
viral persistence, viral replication, and the
development of disease following virus
infections, with respect to the changing
burden on the host organism. The results
obtained will be used to develop new
diagnostic and therapeutic concepts. The
knowledge of the strategies with which
viruses infect cells and influence cellular
pathways and the immune system will
provide a basis for the use of viruses – or
parts of them – as tools for immune and
gene therapy.
Current research focuses on the following.
• Effects of retroviral control genes and
elements on cellular regulation processes
• Elucidation of the cellular mechanisms
that control retroviral replication (antiviral
factors)
• Development and application of viral
vectors in immunoprophylaxis and
therapy with special emphasis on
Vaccinia virus vectors
• Evaluation of specific immune responses
in viral infections and after vaccination
and immune therapy (immunomonitoring)
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The Institute is integrated into the programme ‘Infection and Immunity’ within
the Helmholtz (HGF) research area ‘Health’,
and collaborates with other HGF institutions in the areas of ‘Pathogenesis’,
‘Microorganisms’, and ‘Prevention and
Therapy’. There is further collaboration
with the programmes on ‘Comparative
Genomics’, ‘Environmental Health Disorders’, and ‘Cancer Research’ in the research
area ‘Health’. The research is coordinated
by PD Dr. Ruth Brack-Werner, Dr. I. Drexler,
Dr. E. Guenzi, Prof. Dr. C. Leib-Mösch, and
Prof. V. Erfle.
nierung und Immuntherapie (Immunmonitoring).
Im Rahmen des Helmholtz (HGF)-Forschungsbereichs „Gesundheit“ integriert
sich das Institut in das Programm „Infektion
& Immunität“ und kooperiert mit anderen
HGF-Einrichtungen u.a. auf den Gebieten
„Pathogenese“, „Mikroorganismen“ und
„Prävention & Therapie“. Weitere Zusammenarbeiten bestehen im Rahmen der Programme „Vergleichende Genomforschung“,
„Umweltbedingte Störungen der Gesundheit“ und „Krebsforschung“ des HGF-Forschungsbereichs „Gesundheit“. Die Arbeiten im Institut werden federführend von
PD Dr. Ruth Brack-Werner, Dr. I. Drexler,
Dr. E. Guenzi, Prof. Dr. C. Leib-Mösch und
Prof. Dr. V. Erfle durchgeführt.
Zum Jahresende waren im Institut 16 Wissenschaftler/innen, 5 technische Mitarbeiter/
innen und 10 Doktoranden/innen beschäftigt. 9 der Mitarbeiter/innen wurden über
Drittmittel finanziert.
R. Brack-Werner
Bei jeder Virusinfektion einer Zelle interagieren virale und zelluläre Faktoren. So haben
Viren Mechanismen, ihre Zielzelle auf die
Virusvermehrung einzustellen. Andererseits
haben auch die Wirtszellen nach einer Infektion diverse Möglichkeiten, die Virusvermehrung abzuwehren. Astrozyten sind Beispiele für Zielzellen des humanen Immundefizienzvirus (HIV), die nach Infektion die
Virusproduktion streng kontrollieren und
kaum Nachkommenviren produzieren. Einer
der HIV-Faktoren, der eine wesentliche Rolle
für die Virusvermehrung spielt, ist das RevProtein, das den Transport von wichtigen
viralen mRNAs aus dem Zellkern in das
Zytoplasma aktiviert. In Astrozyten ist die
Aktivität von Rev stark gehemmt. Unsere
Untersuchungen zur Biologie von Rev in
Astrozyten sprechen für die Existenz von
Rev inhibierenden zellulären Faktoren.
Zur Isolierung von möglichen zellulären
Rev-Modulatoren haben wir eine menschli-
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che cDNA-Bank auf Rev-interagierende
Faktoren durchsucht. Dabei konnten wir
einen bisher unbekannten zellulären Faktor
identifizieren, der mit Rev interagiert
(„16.4.1“) . Wie Rev, benutzt 16.4.1 den
Transportrezeptor CRM1 für den Export aus
dem Zellkern ins Zytoplasma. Wir konnten
die für den Export verantwortliche Proteinregion sowie ein neues Transportsignal
100
100%
80
Relative Rev activity
Die Funktion des HIV-1 Rev-Proteins
wird durch ein zelluläres Protein
moduliert.
At the end of the year, there were
16 scientists, 5 technicians, and 10 postgraduate students at the Institute, 9 of them
supported by grant funds.
60
40
35,1%
20
0
12,8%
0,07%
+ Rev
– 16.4.1
+ Rev
+ 16.4.1
(0,5 µg)
+ Rev
+ 16.4.1
(1,0 µg)
– Rev
+ 16.4.1
Abb. 1: Beispiel für eine Dosis-abhängige Reduktion der HIV-1 Rev-Aktivität durch den zellulären
Faktor „16.4.1“.
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Altweltaffen
Hominoidea
Neuweltaffen
DNA-Unterschiede [%]
HERV-K(HML-2)
ERV9, HERV-H, HERV-K(HML-2)
ERV-9, HERV-H
Zeit [Millionen Jahre]
HERV-K
(HML-2)
Die Institute
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HERV-S, HERV-T, HERV-IP, HERV-W, ERV-9, HERVERI, HERV-K(HML-1, HML-2, HML-3, HML-4, HML-6,
HML-7, HML-8)
HERV-I, ERV-9, HERV-H, ERV-FRD,
HERV-F, HERV-K(HML-5), HERV-L
Abb.2: Integration und Amplifizierung endogener Retroviren in Primaten.
identifizieren. Experimente mit Zellen, die
gleichzeitig Rev und 16.4.1 exprimieren,
zeigen, dass HIV-1 Rev in der Lage ist, das
normalerweise zytoplasmatische 16.4.1 in
den Zellkern hineinzutragen. Außerdem
konnten wir zeigen, dass die Expression von
Rev-abhängigen Reportergenen durch 16.4.1
deutlich reduziert werden kann (Abb. 1).
Unsere Ergebnisse weisen darauf hin,
dass das bisher unbekannte zelluäre Protein
„16.4.1“ die Funktion von HIV-1 Rev und
somit indirekt die Virusproduktion modulieren kann. Von den Folgeuntersuchungen zur
weiteren Charakterisierung dieses zellulären
Faktors erwarten wir nicht nur Hinweise auf
die Kontrollmechanismen der Virusvermehrung in Gehirnzellen, sondern auch Hinweise
auf neue Wege zur Therapie der HIV-Infektion.
Ursprung und Evolution humaner
endogener Retroviren (HERV)
C. Leib-Mösch
Etwa 8–9% des humanen Genoms besteht
aus retroviralen Sequenzen (HERV). Rund
8100 dieser Elemente enthalten Polymerasebzw. Reverse Transkriptase-Sequenzen (pol),
3661 davon mit vollständigen oder partiellen offenen Leserahmen. Wir haben einen
Retrovirus-spezifischen Microarray entwickelt, der den gleichzeitigen Nachweis von
Vertretern der 20 wichtigsten HERV-Familien
anhand ihrer pol-Gene erlaubt. Mit Hilfe
dieses DNA-Chips haben wir die Genome
von Altwelt- und Neuweltaffen untersucht
und in einigen Beispielen mit Hilfe quantitativer Realtime-PCR die Kopienzahlen abgeschätzt. Wir konnten die Vermutung bestätigen, dass Klasse III HERVs, die auch als
ERV-L bezeichnet werden und die entfernt
mit Spumaretroviren verwandt sind, die
ältesten im Primatengenom vertretenen
endogenen Retroviren stellen. In Neuweltaffen kommen sie etwa mit der gleichen
Häufigkeit (ca. 200 Kopien) vor, wie im
Menschen. Man findet verwandte endogene
Retroviren auch in anderen Säugetieren,
unter anderem, wie unsere Untersuchungen
gezeigt haben, in Elefanten und ihren Verwandten. Interessanterweise kodieren ERVL- Elemente in einigen Mäusestämmen für
einen Resistenzfaktor gegen exogene Retroviren, Fv1.
Einige Familien der Klasse I HERVs (MLVVerwandte) und Klasse II HERVs (MMTVVerwandte) integrierten bereits vor Aufspaltung der Neuwelt- und Altweltaffen in das
Primatengenom; die weitaus meisten HERVFamilien beider Klassen sind jedoch erst
im Genom von Altweltaffen nachweisbar
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(Abb. 2). Es wird vermutet, dass es sich um
Neuintegrationen ursprünglich exogener
Retroviren, möglicherweise nach Transspezies-Übertragungen, handelt. Daneben
findet man jedoch auch HERV-Familien, die
zunächst wohl nur in geringen Kopienzahlen
(ca. 1–10 Kopien) vorkamen, jedoch zu
späteren Zeitpunkten der Primatenevolution
spontan expandierten. Diese Amplifikationen, z.B. der HERV-H- und ERV9-Familien,
haben oft zu mehr als 1000 Kopien im Genom geführt und wurden durch einen Mechanismus generiert, der als „Retrotransposition“ auch von nicht viralen Retrotransposons wie z.B. LINE-Elementen bekannt ist.
Mitglieder der HERV-K-Familie, des einzigen
HERV-Typs, von dem humanspezifische
Integrationen bekannt sind, waren vermutlich noch in der Linie des Homo sapiens als
infektöse exogene Retroviren aktiv.
Das Modifizierte Vaccina Virus
Ankara (MVA) als Vektorsystem zur
Expression heterologer Antigene
I. Drexler, G. Sutter
Der Transfer rekombinanter Vektoren auf
Basis des Modifizierten Vaccinia Virus Ankara
(MVA) in klinische Versuche als Impfstoffe
für die prophylaktische Anwendung oder für
immuntherapeutische Ansätze ist mittlerweile für eine ganze Reihe von infektiösen
und Tumorerkrankungen gelungen. So kam
ein von uns entwickelter MVA-Vektorimpfstoff, der für das Tumorantigen (TA) Tyrosinase kodiert, mittlerweile in zwei klinischen
Studien mit Melanompatienten zum einen
als direkt applizierte Lebendvakzine zum
anderen als Zellvakzine mit infizierten dendritischen Zellen (DC) zum Einsatz (Meyer et
al. 2004. Cancer Immunol Immunother, Dec
31, [Epub ahead of print]; Di Nicola et al.
2004. Clin Cancer Res. 10:5381-5390).
Daneben dient dieses Vektorsystem aber
auch als vielfältig einsetzbares Hilfsmittel
für die Beantwortung von grundlegenden
Fragestellungen in der Immunbiologie von
Tumoren. So konnten wir beispielsweise in
Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von
Barbara Seliger, Universität Halle-Wittenberg, unter Verwendung eines rekombinan-
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ten MVA, der das für u.a. Brustkrebs klinisch
relevante TA Her-2/neu produziert, zeigen,
dass dieses TA bestimmte Komponenten
der antigenpräsentierenden Maschinerie
(APM) in den Zellen beeinflusst (Cancer
Res. 64, 215-220, 2004). Dabei waren diese
Komponenten, zu denen TAP (Transporter
associated with antigen processing), die
Proteasom-Untereinheiten LMP-2 und -10,
die Proteasom-Aktivatoren PA28-α und -β
sowie Tapasin zählen, entweder herunter
reguliert oder in ihrer Funktion gestört.
Diese Abnormalitäten in der MHC-Klasse I
Antigenprozessierung der APM waren auch
mit einer geringeren Sensitivität für eine
Zerstörung Her-2/neu überexprimierender
Tumorzellen durch zytotoxische T-Zellen
verbunden. Dieser Befund könnte durchaus
das Design von Therapiestrategien, die auf
Her-2/neu beruhen, beeinflussen. In einer
weiteren Kooperation im Rahmen der KKG
„Vakzinologie“ konnten wir mit Hilfe eines
rekombinanten MVA-Vektors, der das Melanom-assoziierte TA Tyrosinase synthetisiert,
die Rolle von sog. Hitze-Schock-Proteinen
(hsp) in der Tumorimmuntherapie näher
untersuchen (J Immunol. 172, 162-169, 2004).
Hintergrund der Studien war die Annahme
aus der Literatur, dass Immunisierungen mit
hsp, die von Krebszellen isoliert wurden,
eine schützende Anti-Tumor-Immunität
bewirken können. Wir demonstrierten jedoch, dass Melanom-reaktive zytotoxische
T-Zellen von DC, die für die Generierung
von T-Zellantworten essentiell sind, nicht
von hsp-beladenen DC stimuliert werden
konnten. Damit deuten unsere Ergebnisse
darauf hin, dass zumindest ein Teil der
bisherigen Berichte von hsp-vermitteltem
Tumorschutz nicht auf den von diesen
Proteinen transportierten TA-Fragmenten
beruhen.
Die Rolle des Endothels bei Virusund Tumorerkrankungen
E. Guenzi, M. Stürzl
Das Endothel ist ein zentrales Regulatororgan im Rahmen zahlreicher pathophysiologischer Prozesse. Es reguliert bei Infektionskrankheiten die Immunantwort und die
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Ausbreitung der Erreger im Organismus, bei
Entzündungen die Einwanderung von Entzündungszellen und bei malignen Tumorerkrankungen das Tumorwachstum. Das Kaposi-Sarkom (KS), ein Virus-induzierter endothelialer Tumor, soll in diesem Vorhaben als
Modellsystem eingesetzt werden, um die
molekularen Mechanismen der Endothelzellaktivierung infolge von Virusinfektionen und
bei der Tumorangiogenese zu untersuchen.
Aufbauend auf den erzielten Ergebnissen
sollen neue Strategien zur anti-angiogenen
Behandlung chronischer Entzündungen und
Tumorerkrankungen entwickelt werden.
1) Hochdurchsatzanalyse Herpesvirus-8kodierter Gene auf tumorigene
Signalwege des Kaposisarkoms.
Das humane Herpesvirus-8 (HHV-8) ist
assoziiert mit der Pathogenese des Kaposi-
Sarkoms (KS). Der fortschreitende Krankheitsverlauf dieses endothelialen Tumors
korreliert mit einer steigenden Viruslast,
einem Anstieg der Proliferationsrate und
einer Unterdrückung von Apoptose der
betroffenen Gewebe. Die Modulation von
Proliferations- und Apoptose-Signalwegen
durch HHV-8 ist vermutlich unmittelbar an
der Tumorentstehung beteiligt. Systematische Untersuchungen, inwieweit die 90
bekannten Gene von HHV-8 allein oder in
Kombination untereinander welchen tumorigenen Signalweg aktivieren (NFkB, AP1, p53,
c-Myc, usw…), wurden bislang noch nicht
durchgeführt. Bereits für die Untersuchung
paarweiser Kombinationen aller HHV-8-Gene
sind mehr als 6000 Transfektionsexperimente
erforderlich. Um dieses leisten zu können,
wurde eine Methode etabliert, welche die
Durchführung von mehreren hundert Trans-
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HHV-8-Genom
4. Zell-Chip am Beispiel eGFPexprimierender HEK 293T-Zellen
HHV-8
ORFx
HHV-8
ORFy
Indikator
plasmid
1. Punktueller Aufdruck von
DNA/Gelatinelösung
2. Transfektionsreagenz
3. HEK 293T-Zellen
Abb. 3: Die Zell-Chip-Technologie zur systematischen Analyse von HHV-8-Genfunktionen: Expressionsplasmide werden in einer 0,2%-iger Gelatinelösung auf Glasobjektträger aufgedruckt (1), die Objektträger anschließend mit Transfektionsreagenz behandelt (2) und mit Zellen bewachsen (3). Die Fluoreszenzaufnahme des Zell-Chips mit eGFP-exprimierenden HEK 293T-Zellen (4) zeigt, dass durchschnittlich
300 Zellen über einem DNA-Aufdruckspunkt eGFP exprimierten.
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fektionsexperimenten auf einem Objektträger
ermöglicht (Abb. 3).
2) Etablierung einer transgenen LANA-1Maus
Histologische und molekularbiologische
Vorarbeiten legen nahe, dass das von
HHV-8 kodierte Protein latency-associated
nuclear antigen-1 (LANA-1) in HHV-8-infizierten Zellen den programmierten Zelltod
(Apoptose) unterbindet und so wesentlich
zur Entstehung des KS beiträgt. Desweiteren
besitzt LANA-1 das Potential, primäre
humane Endothelzellen zu immortalisieren
und zu lymphatischen Endothelzellen zu
differenzieren. Zudem gehört LANA-1 zu
den wenigen HHV-8-kodierten Genen, die
konstitutiv in HHV-8-infizierten Zellen exprimiert werden. In diesem Projekt soll anhand
einer bereits etablierten transgenen Mauslinie, die LANA-1 induzierbar und gewebsspezifisch in Endothelzellen exprimiert, die
pathogene Wirkung von LANA-1 in vivo
untersucht werden. Anhand des Tiermodells
soll untersucht werden, inwieweit LANA-1
tumorigen auf das Endothel der Maus wirkt
und somit zur KS-Pathogenese beitragen
könnte.
Zusammenarbeit
Der Leiter des Instituts ist o. Univ. Professor für Virologie
und Leiter des Instituts für Virologie der Technischen
Universität München. Mit der TU München bestehen
außerdem Kooperationen innerhalb des DFG-Sonderforschungsbereiches 456 („Zielstrukturen für selektive
Tumorinterventionen“). Mit der LMU München bestehen
Kooperationen im DFG-Sonderforschungsbereich SFB
Transregio 6007 („Chromatin: Aufbau und Vererbung von
Struktur und Genaktivität“ und der Med. Poliklinik
Innenstadt im Rahmen der Vakzinierungsstudien). Enge
Kooperationen bestehen darüber hinaus mit dem Klinikum Mannheim der Universität Heidelberg, dem PaulEhrlich-Institut (PEI) in Langen, dem Institut für Virologie
und Seuchenhygiene der Med. Hochschule Hannover,
dem McGill University AIDS Centre in Montreal/Kanada
und den Universitäten Edinburgh und Jerusalem.
Langjährige erfolgreiche Kooperationen im Rahmen von
EU-Projekten bestehen mit dem Istituto Superiore di
Sanità in Rom, dem Karolinska Institut in Stockholm und
FIT Biotech in Tampere. Außerdem engagiert sich das
Institut im Forschungsverbund FORPRION („The role of
activated retroviral genes as cofactors in prion-induced
spongiform encephalopathy“) des Bayerischen Staatsministeriums für Wissenschaft, Forschung und Kunst sowie
in verschiedenen EU-Projekten (“New vaccinia virus MVA
vaccines”, “New influenca virus vaccines”, “AIDS
vaccine integrated project (AVIP)”). Außerdem besteht
eine Kooperation mit Carl-Zeiss-Vision („Anpassung und
Optimierung von Imaging-Verfahren“) und eine enge
Zusammenarbeit mit Genomatix Software GmbH auf
dem Gebiet der Genom- und Promotoranalysen.
Ausgewählte Veröffentlichungen
Drexler, I., Staib, C., Sutter, G.: Modified vaccinia virus
Ankara as antigen delivery system: how can we best use
its potential? Curr Opin Biotechnol 15, 506-512 (2004)
Grimm, T., Schneider, S., Naschberger, E., Huber, J.,
Guenzi, E., Kieser, A., Reitmeir, P., Schulz, T.F., Morris,
C.A., Sturzl, M.: EBV latent membrane protein-1 protects
B-cells from apoptosis by inhibition of bax. Blood Dec 21;
[Epub ahead of print] (2004)
Rafalska, I., Zhang, Z., Benderska, N., Wolff, H., Hartmann, A.M., Brack-Werner, R., Stamm, S.: The intranuclear localization and function of YT521-B is regulated by
tyrosine phosphorylation. Human Molecular Genetics,
Vol. 13, No. 15, 1535-1549 (2004)
186 GSF
Patente
Brack-Werner, R., Brebeck, A., Wolff, H., Ziegler, M.:
Ein Verfahren zur simultanen Analyse der Expression,
Lokalisation und Interaktion von Proteinen in lebenden
Zellen. PLA 04 A 09. (2004)
Sutter, G., Staib, C., Erfle, V., Siccardi, A.: Green-red gene
swapping to speed up recombinant MVA production. EU
04020784.7. (2004)
Ehrungen und Preise
GSF-Doktorandenpreis an Dr. Clara Lubeseder-Martellato.